DE69837600T2

DE69837600T2 - Aus einer menschlichen glial zelllinie-abgeleiteter promotor eines neurotrophischen faktors, diesen enthaltende vektoren und methoden zum screenen von verbindungen damit

Info

Publication number: DE69837600T2
Application number: DE69837600T
Authority: DE
Inventors: Preston Albert Los Altos BAECKER; Randolph Mellus Half Moon Bay JOHNSON; Walter Hom Campbell LEE; Adrian Neil Sunnyvale VERITY
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-08-05
Filing date: 1998-07-23
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2018-07-24
Also published as: ATE360066T1; JP2001512679A; JP3761152B2; DE69837600D1; AU737944B2; AU9067998A; WO1999007843A1; EP1002071A1; CA2299586A1; CA2299586C; EP1002071B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf neurotrophe Faktoren. Spezieller bezieht sich die Erfindung auf Promotoren des menschlichen Gliazellen-abgeleiteten neurotrophen Faktors (GDNF), auf Reportergenkonstrukte, enthaltend einen menschlichen GDNF-Promotor, und auf Verfahren zur Verwendung des Konstrukts zum Screenen von Verbindungen hinsichtlich therapeutischer Wirksamkeit beim Behandeln der Parkinson-Krankheit oder anderen zentralen und peripheren neurodegenerativen Krankheiten.
Die Parkinson-Krankheit ist eine progressive neurodegenerative Krankheit mit unbekannter Ätiologie, von der schätzungsweise 600.000 bis 1.000.000 Personen in den USA betroffen sind. Die Krankheit betrifft sowohl Männer als auch Frauen ohne offensichtliche Klassen- oder Rassenunterschiede. Die Parkinson-Krankheit ist durch Symptome wie Muskelzittern, Muskelschwäche, Starrheit, Bewegungsverlangsamung (Bradykinesie) mit Veränderungen in der Körperhaltung und im Gleichgewicht gekennzeichnet. Ohne Behandlung verschlechtern sich die betroffenen Personen allmählich über 5 bis 10 Jahre bis zu einem steifen, akinetischen Zustand, der konstante Pflege erforderlich macht. Der Tod resultiert häufig aus Komplikationen, die aus dem Mangel an Beweglichkeit hervorgehen. Derzeit gibt es keinen diagnostischen Test für Parkinson-Krankheit, und alle Behandlungen sind eher palliativ als heilend. Pathophysiologisch liegt die Parkinson-Krankheit als ein schwerer Verlust der pigmentierten, dopaminergen Neuronen innerhalb der Substantia nigra pars compacta und der Melanin-enthaltenden Neuronen des Locus caeruleus und des Nucleus dorsalis nervi vagi vor. Die wesentliche neuropathologische Läsion bei Parkinson-Krankheit ist der Verlust von dopaminergen Neuronen, was zur Depletion von dopaminergen Terminals in dem Striatum führt. Dieser selektive neuronale Verlust führt zu verringerten Niveaus des Neurotransmitterdopamins innerhalb des Striatums.
Derzeit ist die effektivste Behandlung zur Linderung der Symptome der Parkinson-Krankheit die orale Verabreichung von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) in Kombination mit einem peripher wirkenden Inhibitor von aromatischer L-Aminosäuredecarboxylase. Anders als Dopamin wird L-DOPA aktiv über die Blut-Hirn-Schranke und in präsynaptische Termi nals von dopaminergen Neuronen transportiert, in denen L-DOPA zu Dopamin decarboxyliert und in Speichervesikel durch ein Transportprntein isoliert wird. Die L-DOPA-Behandlung verringert alle Symptome der Parkinson-Krankheit, speziell wenn die Behandlung früh im Verlauf der Krankheit begonnen wird.
Giazellen-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF), ein entferntes Mitglied der Überfamilie des transformierten Wachstumsfaktors (TGF-^–), wurde ursprünglich aufgrund seiner Fähigkeit, die Dopaminaufnahme und das Zellüberleben in Kulturen von embryonalen ventralen dopaminergen Mittelhirn-Neuronen zu induzieren, isoliert. GDNF ist gereinigt und aus konditionierten Medien aus Ratte-B49-Gliazellen sequenziert worden (Lin et al. (1993), Science 260, 1130), und die Ratten-GDNF-cDNA ist geklont und verwendet worden, um die Proteinkodierenden Teile des Gens aus einer menschlichen Genbibliothek zu isolieren (internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/06116; GenBank-Hinterlegungsnummer L19062 und L19063).
GDNF ist ein ungefähr glykosyliertes 39 kD-Protein, das als ein Homodimer in seiner nativen Form existiert. Bei Menschen und Nagetieren führt ein einzelnes Gen zu alternativ gespleißten Formen. Beide Formen enthalten eine Consensus-Signalpeptidsequenz und eine Consensus-Sequenz zur proteolytischen Verarbeitung. Die proteolytische Spaltung ergibt identische, vollständig entwickelte Formen mit 134 Aminosäureresten.
GDNF weist eine signifikante Rolle bei der Entwicklung und Differenzierung des Säugernervensystems auf. GDNF beschleunigt die Dopaminaufnahme und das Zellüberleben von embryonalen, mesenzephalen, dopaminergen Neuronen sowie das Überleben und/oder die Differenzierung eines breiten Bereiches an zentralen und peripheren neuronalen und nicht-neuronalen Zellpopulationen. Innerhalb des Zentralnervensystems stützen In-vitro-Studien die Entwicklungsrolle von GDNF beim Überleben von dopaminergen Mittelhirn-Neuronen, zerebellären Purkinje-Neuronen und kranialen und Rückenmarks-Motoneuronen. In dem peripheren Nervensystem stützt GDNF die Entwicklung von mehreren neuronalen Populationen, einschließlich sympathischer, parasympathischer, Sinnes- und autonomer Neuronen.
Die Lokalisierung von GDNF-mRNA-Transkripten in GDNF-empfindlichen neuronalen Targetbereichen stimmt mit einer In-vivo-Funktion von GDNF als ein Target-abgeleiteter neurotropher Faktor überein. Außerdem bestätigten Studien unter Verwendung von GDNF-Null- Mäusen die pleiotropen Rollen von GDNF bei der peripheren neuronalen Entwicklung sowie seine lebenswichtige Rolle in der Nierenontogenie während der embryonalen Entwicklung.
Obwohl die Bedeutung von GDNF während der Entwicklung gut bestimmt worden ist, ist die Funktion von GDNF bei Erwachsenen weniger deutlich. Von klinischer Bedeutung ist, daß exogener GDNF mesenzephale dopaminerge Neuronen gegen Axotomie-induzierte Degeneration in dem erwachsenen Rattenhirn und 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)-induzierte Degeneration von Substantia nigra-dopaminergen Neuronen bei Nagetieren schützt. Außerdem erzeugt GDNF, der intrazerebral in Rhesusaffen injiziert wird, die MPTP-induzierte, Parkinson-Krankheit-artige Symptome zeigen, signifikante Verbesserungen hinsichtlich Bradykinesie, Starrheit und Haltungsinstabilität. Zumindest teilweise auf diesen Ergebnissen basierend, erfolgte die Gabe von rekombinantem GDNF in klinischen Versuchen zur Behandlung der Parkinson-Krankheit.
Es ist wenig über die zellulären und molekularen Vorgänge, die die GDNF-Expression regulieren, bekannt. Auf zellulärer Ebene ist GDNF-mRNA an sowohl neuronalen als auch astrozytischen Zellen lokalisiert worden, und wie viele neurotrophe Faktoren erhöht sich die Expression in beschädigten Geweben. Als Reaktion auf exzitatorische Aminosäuren erhöhen sich die GDNF-mRNA-Gehalte in Hippocampusneuronen und Hippocampus- und primären Striatumastrozyten.
Aufgrund seiner relativ großen Größe quert GDNF nicht die Blut-Hirn-Schranke, was die direkte Verabreichung in das Gehirn zum einzigen durchführbaren Mittel zur Gabe macht. Dies erfordert die stereotaktische Injektion von GDNF in das Gehirn oder die intrazerebroventrikuläre (ICV) Gabe von GDNF, was seinen therapeutischen Nutzen einschränkt. Andererseits wäre eine nicht-invasive Therapie zum Schutz von Substantia-nigra-Neuronen vor dem Zelltod bevorzugt, beispielsweise durch kleine Moleküle, die auf spezifisch zunehmende endogene GDNF-Gehalte abzielen, und/oder deren Freisetzung. Idealerweise kann ein solches kleines Molekül auf jede günstige Weise verabreicht werden, die Blut-Hirn-Schranke kreuzen und die lokale Synthese von GDNF erhöhen, wodurch die Zielpopulation an dopaminergen Neuronen bei einem Risiko der Parkinson-Krankheit geschont wird. Diese Therapie wäre weniger pulsierend und weniger invasiv als die intraparenchyme, ICV- oder intrathekale Injektion von GDNF.
Es besteht in der Technik der Bedarf an einem alternativen Mittel, durch das die Gewebegehalte von GDNF erhöht werden können. Ein solches Verfahren ist es, endogene GDNF-Gehalte durch Induzieren der GDNF-Genexpression auf der transkriptionalen Ebene zu erhöhen.
WO 98/46737 beschreibt die cDNA von menschlichem GDNF-Gen und eine Promotorsequenz. Die offenbarte Promotorsequenz ist unvollständig, es fehlt beispielsweise die TATAA-Box.
Folglich sind zunächst ein proximaler Promotor und ein distaler Promotor aus dem menschlichen GDNF-Gen identifiziert, sequenziert, charakterisiert und geklont worden. Die distalen und proximalen Promotoren enthalten Sequenzen, die für eukaryotische Gen-regulatorische Elemente charakteristisch sind. Beispielsweise umfassen die Promotoren Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen-Consensus-Sequenzen. Der distale Promotor umfaßt die Promotor-Nucleotidsequenz, dargestellt an den Positionen –62 bis –1 der 3A bis 3B (SEQ ID Nr. 1), die Promotor-Nucleotidsequenz, dargestellt an den Positionen –363 bis –1 der 3A bis 3B (SEQ ID Nr. 1), oder die Promotor-Nucleotidsequenz, dargestellt an den Positionen –1635 bis –1 der 3A bis 3B (SEQ ID Nr. 1).
Außerdem ist ein rekombinantes Konstrukt hergestellt worden, in dem der Promotor funktionell mit einem Reportergen gekoppelt ist, das ein Polypeptid kodiert, welches durch irgendeine von einer Vielzahl von Techniken, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind, detektierbar ist. Das Konstrukt ist in menschliche neuronale und Gliazellen transfektiert worden, durch die mögliche Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Expression eines Gens unter Kontrolle des Promotors zu stimulieren, gescreent werden können. In dieser Weise stellt die Erfindung ein Mittel und ein Verfahren bereit, wodurch Verbindungen, die die GDNF-Genexpression in vivo induzieren können, identifiziert werden können. Diese Verbindungen sind beim Behandeln von zentralen und peripheren neurodegenerativen Krankheiten sowie Nieren-, Harn- und Geschlechts- und Magen-Darm-Krankheiten, und neurodegenerativen Folgeerscheinungen von physischem Nerventrauma verwendbar, wenn sie an einen Säugerpatienten in einer akzeptablen pharmazeutischen Formulierung verabreicht werden.
Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung bereit, die die Expression von GDNF moduliert. Das Verfahren umfaßt (a) Einführen eines DNA-Fragments in eine Wirtszelle, umfassend einen menschlichen distalen GDNF-Promotor, der funktionell mit einem Reportergen gekoppelt ist; (b) Mischen einer Testverbindung mit der Wirtszelle und Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen das Reportergen exprimiert werden kann; (c) Vergleichen des Grades des exprimierten Reportergenproduktes, das in Gegenwart bzw. in Abwesenheit der Testverbindung erzeugt wurde; wobei die Veränderung des Expressionsgrades des Reportergenproduktes angibt, daß die Testverbindung den GDNF-Expressionsgrad modulieren kann.
Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden ohne weiteres für den Fachmann im Hinblick auf die Offenbarung hierin offensichtlich.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1A bis 1D stellen die Struktur der verschiedenen menschlichen GDNF-Promotoren dar. 1A stellt eine Karte des menschlichen GDNF-Gens dar, die die Lokation der Exons I, II, IIIa + IIIb und IV und der distalen, medialen und proximalen Promotoren zeigt.
Die 1B, 1C und 1D sind schematische Darstellungen, die GDNF-Gentranskripte veranschaulichen, die aus dem distalen GDNF-Promotor, dem medialen GDNF-Promotor bzw. dem proximalen GDNF-Promotor stammen.
2 ist ein Diagramm des Plasmids pRBSEco9.4#8.
Die 3A bis 3B (SEQ ID Nr. 1) zeigen die Nucleotidsequenz des menschlichen distalen GDNF-Promotors und einen Teil des ersten Introns. Exon I (beginnend bei nt Consensus-Sequenzen für Transkriptionsfaktoren werden über der DNA-Sequenz angegeben, und der abgekürzte Name des Transkriptionsfaktors wird in Kursivschrift über der Consensus-Sequenz gezeigt. Die Nucleotidnumerierung bezieht sich auf den Start von Exon I.
Die 4A bis 4C (SEQ ID Nr. 2) zeigen die Nucleotidsequenz des menschlichen proximalen GDNF-Promotors, wobei Exon II unterstrichen ist (das mediale Transkript), Exon III doppelt unterstrichen ist, der Beginn des proximalen Transkripts (ausgehend von Exon IIIa) fett angegeben ist und die Namen von mutmaßlichen Transkriptionsfaktoren über ihren Consensus-Bindungsstellen angegeben sind. Die Numerierung bezieht sich auf den Start von Exon II.
5 zeigt die Strategie zur Herstellung von Plasmid pGDNF-1635, wie in Beispiel 2 beschrieben.
Die 6A bis 6B zeigen die Strategie zur Herstellung von Plasmid pGDNFprox+dist, wie in Beispiel 5 beschrieben.
7 zeigt eine Karte des menschlichen distalen GDNF-Promotors und verschiedener 5'-Deletionen davon. Die obere Linie ist eine lineare Darstellung des vollständigen 5'-flankierenden Fragments mit Lokationen von einigen möglichen Bindungsstellen für angegebene Transkriptionsfaktoren. Jede darauffolgende Linie zeigt eine lineare Karte den Wert an 5'-flankierender Sequenz, die in einer Deletion verblieb, unter Angabe des Ausmaßes der größten 5'-Sequenz (wie in den 3A–3B gezeigt), die links von jedem Subklon angegeben ist. Alle Klone waren in dem Luciferasereportervektor, pGL3, wie in den Beispielen beschrieben. Relative Luciferasemittelwerte +/– SEM (n = 6), in zwei verschiedenen Wirten, werden für jede Deletion rechts angegeben.
Die 8A bis 8C stellen die RT-PCR-Ergebnisse für drei unterschiedliche GDNF-Transkripte dar, wie in Beispiel 7 beschrieben. 8A zeigt Kalibrierungsergebnisse mit geklonten cDNA-Matrizen: Spur 1, 100 Zeptomol proximaler Matrize plus alle Primer; Spur 2, 100 Zeptomol medialer Matrize plus alle Primer; Spur 3, 100 Zeptomol distaler Matrize plus alle Primer; Spur 4, keine Matrize; Spur 5, 100 Zeptomol jeder Matrize plus alle Primer; Spur 6, 10 Zeptomol jeder Matrize plus alle Primer; Spur 7, 1 Zeptomol jeder Matrize plus alle Primer. 8B zeigt U-87-MG-Zellergebnisse nach 12 Stunden unterschiedlicher Behandlungen: Spur 1, positive Kontrolle von 10 Zeptomol jeder geklonten Matrize plus alle Primer; Spur 2, 100 und 200 hp Marker; Spur 3, negative Kontrolle wie in Spur 4, aber ohne Umkehrtranskriptasebehandlung; Spur 4, Medien allein; Spur 5, IL-1^– (10 ng/ml); Spur 6, PDD (10 nM); Spur 7, BFGF (50 ng/ml); Spur 8, db-cAMP (1 mM); Spur 9, Dexamethason (1M); Spur 10, TNF^ (10 ng/ml). 8C zeigt die Ergebnisse aus menschlichen Geweben: Spur 1, positive Kontrolle von 10 Zeptomol jeder geklonten Matrize; Spur 2, 100 und 200 hp Marker; Spur 3, fetale Leber; Spur 4, adulte Leber; Spur 5, fetale Niere; Spur 6, adultes Gehirn; Spur 7, fetales Gehirn; und Spur 8, adulter Skelettmuskel.
Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, wenn nicht anders angegeben, konventionelle Techniken der Proteinchemie und Biochemie, Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinanter DNA-Technologie einsetzen, die innerhalb des Umfangs des Standes der Technik fallen. Diese Techniken werden vollständig in der Literatur erläutert. Siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage (1989); DNA Cloning, Bd. I und II (D.N. Glover Hrsg. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait Hrsg. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. 1984); Animal Cell Culture (R.K. Freshney Hrsg. 1986); Schleif et al., Practical Methods in Molecular Biology, (Springer-Verlag, NY, 1981); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); PCR: A Practical Approach (McPherson et al. Hrsg. (1991) IRL Press); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); die Reihe Methods In Enzymology (S. Colowick und N. Kaplan Hrsg, Academic Press, Inc.).
I. Definitionen und Nomenklatur
Bevor die vorliegende Erfindung ausführlich offenbart und beschrieben wird, ist es selbstverständlich, daß diese Erfindung nicht auf die spezielle Assayformate, Materialien oder Reagenzien, die als solche selbstverständlich variieren können, beschränkt ist. Es ist ebenso selbstverständlich, daß die hierin verwendete Terminologie nur für die Zwecke des Beschreibens spezieller Ausführungsformen dient und keine Einschränkung beabsichtigt ist.
Anzumerken ist, daß, wie in der Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen verwendet, die Einzahlformen „ein", „eine" und „der/die/das" auch Mehrzahlformen umfassen, wenn im Kontext nicht etwas anderes deutlich angegeben ist. Daher umfaßt der Verweis auf ein Plasmid oder einen Vektor, enthaltend „einen GDNF-Promotor" Plasmide oder Vektoren, die mehr als einen solchen Promotor enthalten, umfaßt der Verweis auf „eine menschliche Zellinie" mehr als eine solche Zellinie, umfaßt der Verweis auf „eine Transkriptionsinitiationsstelle" mehr als eine Transkriptionsinitiationsstelle und dergleichen.
In dieser Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen wird auf eine Anzahl an Ausdrücken verwiesen, die definitionsgemäß die folgenden Bedeutungen haben sollen:
Ein „GDNF-Promotor" ist eine DNA-Regulationsregion, die die RNA-Polymerase binden und die Transkription einer stromabwärts (3'-Richtung) kodierenden Sequenz initiieren kann. Ein GDNF-Promotor für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist im allgemeinen ein DNA-Fragment mit etwa 50 bis etwa 200 bp oder mehr in der 5'-flankierenden DNA stromaufwärts der Transkriptionsinitiationsstartstelle. Der Promotor bildet einen Initiationskomplex mit RNA-Polymerase, um die Transkription der stromabwärts Sequenz zu initiieren und anzutreiben. Der Initiationskomplex kann durch aktivierende Elemente, die „Enhancer" genannt werden, oder inhibierende Elemente, die „Suppressoren" genannt werden, modifiziert werden. Der Ausdruck „Promotor" umfaßt aktivierende und inhibierende Elemente, wenn im Kontext nicht etwas anderes deutlich angegeben ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Ende durch (eine) Transkriptionsinitiationsstelle(n) gebunden (umfaßt aber nicht notwendigerweise die Initiationsstelle, welche durch eine heterologe 5'-UTR bereitgestellt werden kann) und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), so daß sie Fragmente umfaßt, die eine minimale Anzahl an Basen oder Elementen umfassen, die notwendig sind, um die Transkription bei Niveaus, die über dem Hintergrund detektierbar sind, zu initiieren.
Außerdem bedeutet ein „GDNF-Promotor", wie hierin verwendet, Sequenzen, die Modifikationen, wie Deletionen, Additionen und Substitutionen, an der nativen Sequenz umfassen, so lange wie der Promotor die Fähigkeit aufrechterhält, die Transkription bei Niveaus, die über dem Hintergrund detektierbar sind, zu initiieren. Diese Modifikationen können beabsichtigt sein, wie durch ortsgerichtete Mutagenese, oder können zufällig sein, wie durch natürlich vorkommende Mutationsvorgänge oder Fehler aufgrund von PCR-Amplifikation.
Beispielsweise sind, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben und in den anhängenden Figuren gezeigt, Consensus-Bindungsstellen für eine Anzahl von Transkriptionsfaktoren in den hierin beschriebenen GDNF-Promotoren gefunden worden, einschließlich Bindungsstellen für epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptortranskriptionsfaktor (ETF), Anfangswachstumsreaktions-(egr-)-Familienmitglieder, wie egr1 und egr2 (siehe beispielsweise Liu et al. (1996), Crit. Rev. Oncogen. 7, 101), Sp1 (siehe beispielsweise Dynan et al. (1983) Cell 35, 79; Briggs et al. (1986), Science 234, 47; Hagen et al., EMBO J 13, 3843), Mitglieder der CREB/ATF-Familie (siehe beispielsweise Papavassiliou (1994), Anticancer Res. 14, 1801), AP-2 (siehe beispielsweise Mitchell et al. (1987), Cell 50, 847; Imagawa et al. (1987), Cell 51, 251; Williams et al. (1988), Genes Dev. 2, 1557) der nukleare Faktor kB (NF-κB) (siehe beispielsweise Baeuerle et al. (1996), Cell 87, 13; Baldwin et al. (1996), Ann. Rev. Immunol. 14, 649), yin-yang-1 (YY-1) und GC-Faktor (GCF). Mehrere dieser Faktoren, wie FTF, GCF und YY-1, unterdrücken die Transkription. Daher kann die Deletion oder Mutation von einer oder mehreren Regionen, die Bindungsstellen für diese Faktoren (angegeben in den 3A bis 3B und 4A bis 4C) umfassen, wünschenswert sein, um die Transkription eines Gens, das funktionell mit der Promotersequenz gekoppelt ist, zu verbessern.
Beispielsweise hält in bezug auf den distalen Promotor, wie in 7 gezeigt und in den Beispielen beschrieben, eine Promotorsequenz, geschnitten an Position –62, numeriert in bezug auf Exon I (z. B. umfassend die Sequenz an den Positionen –62 bis –1 von 7), eine hohe Aktivität aufrecht, wenn sie in menschlichen Neuroblastom-SK-N-AS-Zellen verwendet wird. Daher kann ein distaler GDNF-Promotor für die Zwecke der vorliegenden Erfindung jede der Deletionen, die in 7 angegeben sind, sowie dazwischenliegende Schnitte, wie z. B. Promotorsequenzen, geschnitten an den Position –63, –194, –308, –363, und so weiter umfassen, so lange wie der Promotor die Fähigkeit behält, die Transkription bei Niveaus, die über dem Hintergrund detektierbar sind, in einer gegebenen Zellinie zu initiieren. Speziell ausgeschlossen aus der hierin verwendeten Definition des „GDNF-Promotors" sind Sequenzen mit kompletter Identität zu dem Teil der Maus-GDNF-Sequenz, die der menschlichen GDNF-Sequenz entspricht, beginnend an Exon I und sich fortsetzend stromaufwärts von Exon I (siehe beispielsweise GenBank-Eintrag Nr. D8835051).
Ein „distaler" GDNF-Promotor ist ein GDNF-Promotor, der direkt nachbarständig zu und stromaufwärts von dem Exon I des menschlichen GDNF-Gens ist. Ein „medialer" GDNF-Promotor ist ein GDNF-Promotor, der stromabwärts von dem distalen GDNF-Promotor und direkt nachbarständig zu und stromaufwärts von dem Exon II des menschlichen GDNF-Gens ist. Ein „proximaler" GDNF-Promotor ist ein GDNF-Promotor, der stromabwärts von dem Exon II und stromaufwärts von Exon IIIa + IIIb (hierin alternativ als „Exon III" bezeichnet) des menschlichen GDNF-Gens ist. Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck „proximaler GDNF-Promotor" sowohl den medialen GDNF-Promotor als auch den proximalen GDNF- Promotor umfassen, solange die Bedeutung nicht deutlich anders ist. Das Mapping des menschlichen GDNF-Gens und der Promotoren wird nachstehend ausführlicher beschrieben.
Ein „Reportergen" ist ein Gen, das der Zelle, die das Reportergen exprimiert, bei der Expression einen Phänotyp verleiht, so daß die Zelle unter entsprechenden Bedingungen identifiziert werden kann. Beispielsweise kann das Reportergen ein Polypeptidprodukt herstellen, das in einem Routineassay leicht detektiert oder gemessen werden kann. Geeignete in der Technik bekannte Reportergene, die dieses Merkmal verleihen, umfassen die, die Chloramphenikolacetyltransferase (CAT-Aktivität), ^–-Galactosidase, Luciferase, alkalische Phosphatase, menschliches Wachstumshormon, fluoroszierende Proteine, wie grün fluoreszierendes Protein (GFP), und andere kodieren. Tatsächlich kann jedes Gen, das ein Protein oder Enzym kodiert, die ohne weiteres gemessen werden können, beispielsweise durch einen Immunassay, wie einen heterologen Enzym-Immunassay (ELISA), oder durch die enzymatische Umwandlung eines Substrats in ein detektierbares Produkt, und das im wesentlichen nicht in den Wirtszellen exprimiert wird (spezifische Expression ohne Hintergrund), als ein Reportergen zum Testen der Promotoraktivität verwendet werden. Andere Reportergene zur Verwendung hierin umfassen Gene, die die Selektion von Zellen erlauben, basierend auf ihrer Fähigkeit, sich in Gegenwart oder Abwesenheit eines chemischen oder anderen Mittels, das eine wesentliche Zellfunktion inhibiert, zu entwickeln. Geeignete Marker dafür umfassen Gene, die für Proteine kodieren, die Arzneimittelresistenz oder Empfindlichkeit darauf verleihen, oder die antigenen Eigenschaften der Zellen verändern, die das Reportergen exprimieren, wenn die Zellen in einem geeigneten selektiven Medium wachsen. Beispielsweise umfassen Reportergene: zytotoxische und Arzneimittelresistenzmarker, wobei die Zellen durch ihre Fähigkeit, auf Medien zu wachsen, die ein oder mehrere der Zytotoxine oder Arzneimittel enthalten, selektiert werden; auxotrophe Marker, durch die Zellen durch ihre Fähigkeit, auf definierten Medien mit oder ohne spezielle Nährstoffe oder Ergänzungsstoffe zu wachsen, selektiert werden; und metabolische Marker, durch die Zellen hinsichtlich beispielsweise ihrer Fähigkeit, auf definierten Medien, die den entsprechenden Zucker als die einzige Kohlenstoffquelle enthalten, zu wachsen, selektiert werden. Diese und andere Reportergene sind in der Technik allgemein bekannt.
Eine „Veränderung des Niveaus des Reportergenprodukts" wird gezeigt durch Vergleichen der Expressionsniveaus des Reportergenprodukts in einer Zelle, ausgesetzt einer möglichen Verbindung in bezug auf die Niveaus von Reportergenprodukt, exprimiert in einer Zelle, die der Testverbindung nicht ausgesetzt ist, und/oder einer Zelle, die einer Kontrollverbindung ausgesetzt ist. Die Veränderung des Niveaus kann quantitativ bestimmt werden, beispielsweise durch Messung unter Verwendung eines Spektrophotometers, Spektrofluorometers, Luminometers und dergleichen, and wird im allgemeinen eine statistisch signifikante Erhöhung oder Verringerung des Niveaus gegen den Hintergrund darstellen. Jedoch kann eine solche Veränderung ebenso ohne quantitative Messung beispielsweise einfach durch Visualisierung festgestellt werden, z. B. wenn das Reportergen eines ist, das den Zellen die Fähigkeit verleiht, gefärbte Kolonien auf chromogenen Substraten zu bilden.
Der Ausdruck „Expression", wie hierin verwendet, meint sowohl Transkriptions- als auch Translationsverfahren, d. h. die Produktion von Messenger-RNA und/oder die Produktion von dessen Protein.
„Parkinson-Krankheit-artige Symptome" umfassen Muskelzittern, Muskelschwäche, Starrheit, Bradykinesie, Veränderungen in der Körperhaltung und im Gleichgewicht, Demenz und ähnliche Symptome, die im allgemeinen mit der Parkinson-Krankheit oder anderen neurodegenerativen Krankheiten verbunden sind.
Der Ausdruck „Polynucleotid" oder „Oligonucleotid", wie hierin verwendet, bedeutet eine polymere Form von Nucleotiden mit jeder Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Dieser Ausdruck bezieht sich nur auf die primäre Struktur des Moleküls. Daher umfaßt der Ausdruck doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA. Er umfaßt ebenso Modifikationen, wie durch Methylierung und/oder durch Capping, und nicht-modifizierte Formen des Polynucleotids.
„Rekombinante Wirtszellen", „Wirtszellen", „Zellen", „Zellinien", „Zellkulturen" und andere derartige Ausdrücke, die Mikroorganismen oder höhere eukaryotische Zellinien angeben, die als einzellige Einheiten kultiviert werden, beziehen sich auf Zellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere Transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet worden sind, unabhängig von dem Verfahren, durch das die DNA in die Zelle eingeführt wird, oder dem anschließenden Zustand der Zelle. Die Ausdrücke umfassen die Nachkom menschaft der Ursprungszelle, die transfektiert worden ist. Zellen in primärer Kultur sowie Zellen, wie Oozyten, können ebenso als Empfänger verwendet werden.
Ein „Vektor" ist ein Replicon, in das ein anderes Polynucleotidsegment angelagert ist, damit so die Replikation und/oder Expression des angelagerten Segments hervorgebracht wird. Der Ausdruck umfaßt Expressionsvektoren, Klonierungsvektoren und dergleichen.
Eine „kodierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die in mRNA transkribiert und in ein Polypeptid translatiert wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Translationsstartcodon an dem 5'-Ende und ein Translationsstopcodon an dem 3'-Ende bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann mRNA-, cDNA-, synthetische DNA- und rekombinante Polynucleotidsequenzen umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Ebenso enthalten ist genomische DNA, bei der die kodierende Sequenz durch Introns unterbrochen ist.
„Funktionell gekoppelt" bezieht sich auf eine Situation, bei der die beschriebenen Komponenten in so einer Beziehung zueinander stehen, die ihnen erlaubt, in ihrer beabsichtigten Weise zu fungieren. Daher ist eine Kontrollsequenz, wie ein Promotor, der funktionell mit einer kodierenden Sequenz gekoppelt ist, in einer solchen Weise positioniert, daß die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind. Eine kodierende Sequenz kann funktionell mit Kontrollsequenzen gekoppelt sein, die die Transkription des Polynucleotids steuern, wodurch das Polynucleotid in einer Wirtszelle exprimiert wird. Die Kontrollsequenzen müssen nicht an die kodierende Sequenz angrenzen, so lange sie so fungieren, daß sie deren Expression steuern. Daher können beispielsweise dazwischenliegende untranslatierte, jedoch transkribierte Sequenzen zwischen einer Promotorsequenz und der kodierenden Sequenz vorliegen, und die Promotorsequenz kann dennoch als „funktionell gekoppelt" mit der kodierenden Sequenz angesehen werden. Ein funktionell gekoppelter GDNF-Promotor wird die Transkription eines Nukleinsäuremoleküls, das im geeigneten Leserahmen damit verbunden ist, steuern.
Der Ausdruck „Transfektion" bezieht sich auf die Einführung eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des Verfahrens, das für die Einführung verwendet wird, oder der molekularen Form des Polynucleotids, das eingeführt wird. Ebenfalls eingeschlossen sind die Einführung eines Polynucleotids per se und die Einführung eines Plasmids oder Vektors, die aus dem exogenen Polynucleotid bestehen. Das exogene Polynucleotid kann direkt durch die Zellen transkribiert und translatiert werden, beibehalten als ein nicht-integrierter Vektor, beispielsweise ein Plasmid, oder kann alternativ stabil in das Wirtsgenom eingeführt werden.
„Transfektion" wird im allgemeinen in bezug auf eine eukaryotische Zelle verwendet, während der Ausdruck „Transformation" für die Einführung eines Polynucleotids in eine prokaryotische Zelle verwendet wird.
Der Ausdruck „isoliert", wenn er sich auf ein Polynucleotid oder ein Polypeptid bezieht, gibt an, daß das angegebene Molekül in weitgehender Abwesenheit von anderen ähnlichen biologischen Makromolekülen vorliegt. Der Ausdruck „isoliert", wie hierin verwendet, bedeutet, daß mindestens 75 Gew.-%, stärker bevorzugt mindestens 85 Gew.-%, noch stärker bevorzugt mindestens 95 Gew.-% und am stärksten bevorzugt mindestens 98 Gew.-% einer Zusammensetzung das isolierte Polynucleotid oder Polypeptid sind. Ein „isoliertes Polynucleotid", das ein spezielles Polypeptid kodiert, bezieht sich auf ein Polynucleotid, das im wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuremolekülen ist, die das betreffende Polypeptid nicht kodieren; jedoch kann das Molekül funktionell und/oder strukturell konservative Mutationen umfassen, wie hierin definiert.
Zwei Polynucleotidsequenzen oder zwei Fragmente oder Segmente einer Polynucleotidsequenz sind „im wesentlichen homolog", wenn sich mindestens etwa 65 %, bevorzugt mindestens etwa 75 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 80 bis 85 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 90 % bis 95 % oder mehr der Nucleotide über eine definierte Länge des Moleküls entsprechen. Wie hierin verwendet, bezieht sich im wesentlichen homolog ebenso auf Sequenzen, die Identität mit der spezifizierten Polynucleotidsequenz zeigen. Polynucleotidsequenzen, die im wesentlichen homolog sind, können in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter beispielsweise stringenten Bedingungen identifiziert werden, wie für dieses spezielle System definiert. Das Definieren der entsprechenden Hybridsierungsbedingungen liegt innerhalb des Umfangs der Technik. Siehe beispielsweise Sambrook et al., oben; DNA Cloning, Bd. I & II, oben; Nucleic Acid Hybridization, oben.
Andere Techniken zum Bestimmen der Nukleinsäuresequenzidentität sind in der Technik allgemein bekannt und unfassen das Bestimmen der Nucleotidsequenz des Polynucleotids von Interesse und das Vergleichen dieser mit einer zweiten Nucleotidsequenz. Programme, erhältlich in dem Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (erhältlich von Genetics Computer Group, Madison, WI), beispielsweise die BESTFIT-, FASTA- und GAP-Programme, können die Identität zwischen zwei Polynucleotiden berechnen. Außerdem kann das Datenbank-Suchwerkzeug, BLAST (Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol. 215, 403–410), eingesetzt werden, um Gendatenbanken zu durchsuchen und die prozentuale Identität zwischen einer gegebenen Sequenz und einer Sequenz, die in der Datenbank vorliegt, zu bestimmen. Andere Programme zum Berechnen der Identität oder Ähnlichkeit zwischen Sequenzen sind in der Technik bekannt.
Eine Sequenz, die „funktionell äquivalent" mit einer GDNF-Promotorsequenz ist, ist eine, die in derselben Weise fungiert wie der entsprechende GDNF-Promotor. Daher ist eine Promotersequenz, die „funktionell äquivalent" mit beispielsweise einem hierin beschriebenen distalen GDNF-Promotor ist, eine, die die Transkription eines Nukleinsäuremoleküls, das in dem geeigneten Leserahmen damit verbunden ist, über Hintergrundniveaus hinaus steuern kann.
II. Allgemeine Verfahren
Isolierte DNA, umfassend einen menschlichen distalen GDNF-Promotor und proximalen GDNF-Promotor, und ein Reportergenkonstrukt, umfassend einen GDNF-Promotor, werden hierin bereitgestellt. Die Erfindung umfaßt ebenso ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen für GDNF-Promotor-induzierende Aktivität unter Verwendung der Konstruktzellen, die mit den Konstrukten transformiert oder transfektiert worden sind.
Wie in Beispiel 1 ausführlicher beschrieben, können das Exon I des menschlichen GDNF-Gens (siehe 1) und der distale Promotor stromaufwärts davon gemäß dem folgenden allgemeinen Schema identifiziert, amplifiziert, geklont und sequenziert werden. Die Gegenwart von GDNF-mRNA in menschlichen Geweben wird durch Umkehrtranskriptase-Polymerase-Kettenreaktion („RT-PCR") unter Verwendung von Oligonucleotidprimern, basierend auf dem 5'-Ende von Ratten-GDNF-cDNA, gezeigt. Die PCR-Identifikation einer menschlichen GDNF-Gensequenz umfaßt die Amplifikation von Sequenzen aus einer menschlichen genomischen oder cDNA-Bibliothek. Degenerierte oder nicht-degenerierte Oligonucleotidprimer für PCR können, basierend auf der Sequenz von Ratten-GDNF oder jeder Säuger-GDNF-Sequenz, von der gezeigt worden ist, daß sie im wesentlichen homolog zu einem Teil des menschlichen GDNF ist, hergestellt werden. Die Produkte von solchen PCR-Reaktionen können gemäß der Größe durch Gelelektrophorese selektiert, in einen entsprechenden Vektor geklont und die geklonte DNA sequenziert werden, um die GDNF-Promotorsequenz zu identifizieren.
Spezieller setzt PCR kurze Oligonucleotidprimer ein (im allgemeinen 10 bis 20 Nucleotide in der Länge), die gegenüberliegenden Enden einer gewünschten Sequenz innerhalb eines DNA-Moleküls entsprechen. Die Sequenz zwischen den Spezieller setzt PCR kurze Oligonucleotidprimer ein (im allgemeinen 10 bis 20 Nucleotide in der Länge), die gegenüberliegenden Enden einer gewünschten Sequenz innerhalb eines DNA-Moleküls entsprechen. Die Sequenz zwischen den Primern muß nicht bekannt sein. Die anfängliche Matrize kann entweder RNA oder DNA sein. Wenn RNA verwendet wird, wird sie zunächst zu cDNA umkehrtranskribiert. Die cDNA wird dann unter Verwendung allgemein bekannter Techniken, wie Wärme, denaturiert, und entsprechende Oligonucleotidprimer werden in molarem Überschuß zugegeben.
Primer hybridisieren mit dem komplementären Zielpolynucleotid, und die Primerextension wird unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten oder Nucleotidanaloga bewirkt. Das resultierende Produkt umfaßt die jeweiligen Primer an ihren 5'-Enden, die kovalent an die neu synthetisierten Komplemente der ursprünglichen Stränge gebunden sind. Das replizierte Molekül wird erneut denaturiert, mit Primern hybridisiert und so weiter, bis das Produkt ausreichend amplifiziert ist. Diese PCR-Verfahren werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4,965,188; 4,800,159; 4,683,202; 4,683,195 beschrieben. Das Produkt der PCR wird geklont und die Klone, enthaltend die amplifizierte DNA, abgeleitet durch Segregation des Primer-verlängerten Strangs, selektiert. Die Selektion kann unter Verwendung des ursprünglichen Primers als Hybridisierungssonde erreicht werden.
Unter Verwendung der obigen Verfahren wurde festgestellt, daß die Sequenz des menschlichen Gens direkt stromaufwärts der Translationsstartstelle von dem Teil des Gens, das hierin als „Exon III" bezeichnet wird, bis zu einem Punkt, an dem eine Spleißstelleakzeptorstelle gefunden wurde, mit Ratten- und Maus-cDNAs homolog ist. Jedoch gibt die Divergenz der menschlichen cDNA-Sequenz stromaufwärts der Spleißstelleakzeptorstelle die Gegenwart von (einem) anderen Exon(s) an, das/die hierin als „Exon I" bezeichnet wird/werden. Es wur de durch PCR festgestellt, daß die Lokation von Exon I etwa 5 kb stromaufwärts des Starts von Exon III ist. Unter Verwendung von Southern-Blot-Analyse wurde ein EcoRI-Fragment von etwa 9,4 kb identifiziert, das sowohl Exon I als auch Exon III enthält. Das 9,4 kb EcoRI-Fragment wurde geklont und in dem Vektor pBK-CMV vermehrt, und wurde daraus exzidiert und sequenziert. Die Analyse der Nucleotidsequenz des Fragments zeigte (1) die Gegenwart einer Exon-I-Sequenz, die zu mehr als 90 % homolog zu dem 5'-Ende von Ratten-GDNF-cDNA war; (2) eine 5'-Spleißdonorstelle an dem 3'-Ende der Exon-I-Sequenz; (3) daß das Exon I etwa 5 kb stromaufwärts des Starts von Exon III betrug; und (4) daß das Fragment eine Region stromaufwärts von Exon I aufwies, die ungefähr 79 % identisch mit einer eingeschränkten Region des Maus-GDNF-Gens war (Exon I bis 140 bp stromaufwärts von Exon I, GenBank-Eintrag Nr. D8835051). Die GDNF-Promotor-Transkriptionsstartstelle wurde durch die 5'-Endanalyse von GDNF-cDNAs bestimmt.
Die DNA des menschlichen proximalen GDNF-Promotors kann in ähnlicher Weise isoliert werden wie der oben beschriebenen. Insbesondere kann eine cDNA, die aus dem proximalen Promotor stammt, aus polyA+RNA von menschlicher fetaler Nieren, Gehirn oder Skelettmuskel durch RT-PCR-Analyse unter Verwendung von Oligonucleotidprimern, basierend auf der menschlichen GDNF-kodierenden DNA identifiziert und amplifiziert werden, wie in Beispiel 4 ausführlich beschrieben.
Sobald hergestellt, kann die DNA dann in einen Vektor zur Replikation in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden. Der menschliche distale GDNF-Promotor, der menschliche proximale GDNF-Promotor und sowohl der menschliche distale als auch proximale GDNF-Promotor können in einem geeigneten Vektor stromaufwärts von einem Reportergen, wie beispielsweise einem Luciferasegen, geklont werden. Die GDNF-Promotor-Luciferase-Konstrukte werden jeweils in eine menschliche Zellinie transfektiert, die anschließend verwendet werden kann, um die Promotor-regulierte Luciferaseexpression zu analysieren und um mögliche Verbindungen hinsichtlich menschlicher GDNF-Promotor-induzierender Aktivität zu screenen, wie durch die Herstellung von Luciferase angegeben. Natürlich können auch andere Weisen der Vektorkonstruktion sowie jeder der verschiedenen Reporter und Zelinien verwendet werden, um die Promotoraktivität der vorliegenden Erfindung zu analysieren.
Insbesondere setzt die Vektorkonstruktion Verfahren ein, die in der Technik allgemein bekannt sind. Im allgemeinen wird die ortsgerichtete DNA-Spaltung durch Behandeln mit geeigneten Restriktionsenzymen unter Bedingungen durchgeführt, die im allgemeinen durch den Hersteller dieser kommerziell erhältlichen Enzyme angegeben werden. Nach der Inkubation mit dem Restriktionsenzym wird das Protein denaturiert und extrahiert und die DNA durch Ausfällung gewonnen. Die gespaltenen Fragmente können beispielsweise unter Verwendung von Polyacrylamid- oder Agarosegel-Elektrophoreseverfahren gemäß den Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, getrennt werden.
Spaltungsfragmente mit klebrigen Enden können unter Verwendung von E.-coli-DNA-Polymerase 1 (Klenow) in Gegenwart der entsprechenden Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs), die in dem Gemisch vorliegen, mit glatten Enden versehen werden. Die Behandlung mit S1-Nuclease kann ebenso verwendet werden, was zur Hydrolyse von jeglichen einzelsträngigen DNA-Teilen führt.
Ligationen werden unter Verwendung von Standardpuffer- und Temperaturbedingungen unter Verwendung von T4-DNA-Ligase und ATP durchgeführt. Alternativ kann die Restriktionsenzymdigestion von unerwünschten Fragmenten verwendet werden, um die Ligation zu verhindern. Ligationsgemische werden zu einem geeigneten Wirt transformiert oder transfektiert und erfolgreiche Transfektanten/Transformanten durch Arzneimittelresistenz oder andere Marker selektiert.
Beispielsweise umfassen Standardvektorkonstrukte im allgemeinen Reporter und/oder selektierbare Markerelemente. Diese Elemente sind Gene, die einer Zelle, die den Marker exprimiert, so einen Phänotyp verleihen, daß die Zelle unter entsprechenden Bedingungen identifiziert werden kann. Im allgemeinen erlauben Reportergene und selektierbare Marker die Selektion von transformierten Zellen, basierend auf ihrer Fähigkeit, in Gegenwart oder Abwesenheit eines chemischen oder anderen Mittels, das eine wesentliche Zellfunktion inhibiert, zu gedeihen. Geeignete Marker umfassen daher Gene, die für Proteine kodieren, welche Arzneimittelresistenz oder Empfindlichkeit darauf verleihen, Farbe verleihen oder die antigenen Eigenschaften von den Zellen, die den selektierbaren Marker exprimieren, verändern, wenn die Zellen in einem entsprechenden selektiven Medium wachsen. Beispielsweise umfassen selektierbare Marker: zytotoxische, antibiotische und Arzneimittelresistenzmarker, wobei die Zellen durch ihre Fähigkeit, auf Medien zu wachsen, die ein oder mehrere der Zytotoxine, Antibiotika oder Arzneimittel enthalten, selektiert werden; auxotrophe Marker, durch die Zellen durch ihre Fähigkeit, auf definierten Medien mit oder ohne spezielle Nährstoffe oder Ergänzungsstoffe zu wachsen, selektiert werden; metabolische Marker, durch die Zellen beispielsweise hinsichtlich ihrer Fähigkeit, auf definierten Medien, die den entsprechenden Zucker als die einzige Kohlenstoffquelle enthalten, zu wachsen, selektiert werden, oder Marker, die Zellen die Fähigkeit verleihen, gefärbte Kolonien auf chromogenen Substraten zu bilden oder das Fluoreszieren der Zellen verursachen.
Plasmide aus den Transfektanten/Transformanten können dann gemäß den Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden, normalerweise gemäß einer Chloramphenicolamplifikation, wie von Clewell et al. (1972), J. Bacteriol. 110, 667, berichtet. Die DNA wird normalerweise durch Restriktionsenzymanalyse und/oder Sequenzieren isoliert und analysiert. Das Sequenzieren kann durch das allgemein bekannte Dideoxy-Verfahren von Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463) erfolgen, wie weiter von Messing et al. (1981), Nucleic Acid Res. 9, 309, beschrieben, oder durch das Verfahren, berichtet von Maxam et al. (1980), Meth. Enzymol. 65, 499.
Wirtszellen werden dann mit den Vektoren dieser Erfindung transformiert oder transfektiert. Der Vektor kann in Form eines Plasmids, eines Viruspartikels, eines Phagen usw. vorliegen. Die Wirtszellen können in konventionellen Nährstoffmedien kultiviert werden, die, wenn geeignet, zum Aktivieren von Promotoren, Selektieren von Transformanten/Transfektanten oder dergleichen modifiziert sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH und dergleichen, sind im allgemeinen ähnlich denen, die zuvor mit der selektierten Wirtszelle verwendet wurden, und werden dem Fachmann bekannt sein.
Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Wirtszellen können zum Klonen der gewünschten Oligonucleotidfragmente verwendet werden. Beispielsweise wird unter prokaryotischen Wirten häufig Escherichia coli verwendet; jedoch können andere prokaryotische Wirte, wie Stämme von Bacillus, Pseudomonas oder dergleichen, wenn gewünscht, verwendet werden. Transfervektoren, die mit prokaryotischen Wirten kompatibel sind, können beispielsweise von dem Plasmid pBR322, das Operons enthält, die Ampicillin- und Tetracyclinresistenz verleihen, und den verschiedenen pUC-Vektoren, die ebenso Sequenzen enthalten, die Antibiotikaresistenzmarker verleihen, abgeleitet werden. Diese Marker können verwendet werden, um erfolgreiche Transformanten durch Selektion zu erhalten.
Eukaryotische Wirte umfassen Hefe- und Säugerzellen in Kultursystemen. Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae und S. carlsbergensis sind üblicherweise verwendete Hefewirte. Hefe-kompatible Vektoren tragen Marker, die die Selektion von erfolgreichen Transformanten durch Verleihen von Prototrophie an auxotrophe Mutanten oder Resistenz gegen Schwermetalle bei Wildtyp-Stämmen erlauben. Hefe-kompatible Vektoren können den 2-_-Replikationsursprung (Broach et al. (1983), Meth. Enzymol. 101, 307), die Kombination von CEN3 und ARSI oder andere Mittel zum Sichern der Replikation, wie Sequenzen, die zur Einführung eines geeigneten Fragments in das Wirtszellengenom führen, einsetzen.
Säugerzellinien, verfügbar als Wirte zum Klonen, sind in der Technik bekannt und sind von Hinterlegungsstellen, wie American Type Culture Collection, erhältlich. Diese umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, menschliche Glioblastomzellen, Neuroblastomzellen, HeLa-Zellen, menschliche embryonale Nieren-Zellen (HEK-Zellen), Ovarialzellen vom chinesischen Hamster (CHO), Babyhamsternierenzellen (BHK-Zellen) und andere. Gene, die in Säugerzellen exprimiert werden, können ebenso Transkriptionsterminationssequenzen und Polyadenylierungssequenzen erfordern, wie die, die von SV40 abgeleitet sind, wie in Sambrook et al., oben, beschrieben, sowie eine Rinderwachstumshormon-Terminatorsequenz. Enhancer-Sequenzen, die die Expression erhöhen, können ebenso einbezogen werden, und Sequenzen, die die Amplifikation des Reportergens verursachen, können auch wünschenswert sein. Diese Sequenzen sind in der Technik bekannt und umfassen beispielsweise das Maus-Dihydrofolatreduktase-Gen (dhfr-Gen), das nachbarständig zu der kodierenden Sequenz plaziert ist. Zellen können dann für Methotrexatresistenz in dhfr-Mangel-Zellen selektiert werden. Siehe beispielsweise Urlaub et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216–4220; Ringold et al. (1981), J. Mol. and Appl. Genet. 1, 165–175. Vektoren, die zur Replikation in Säugerzellen geeignet sind, können ebenso virale Replicons oder Sequenzen umfassen, die die Integration der entsprechenden Sequenzen, umfassend einen GDNF-Promotor, und eine Sequenz, die das Reportergen in dem Wirtsgenom kodiert, sichern.
Andere eukaryotische Systeme sind ebenfalls bekannt, wie die Verfahren zum Einführen von Polynucleotiden in diese Systeme, wie Amphibienzellen unter Verwendung von Verfahren, die in der Technik allgemein bekannt sind, Insektenzellen unter Verwendung von Verfahren, beschrieben in Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987), und dergleichen.
Transformation oder Transfektion kann durch irgendein Verfahren zum Einführen von Polynucleotiden in eine Wirtszelle erfolgen, einschließlich Verpacken des Polynucleotids in ein Virus und Transduzieren einer Wirtszelle mit dem Virus, durch direkte Aufnahme des Polynucleotids durch die Wirtszelle und dergleichen, wobei die Verfahren dem Fachmann bekannt sind. Diese Verfahren umfassen DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphatausfällung, Polylysin- oder Polyornithin-vermittelte Transfektion oder Ausfällung unter Verwendung anderer unlöslicher anorganischer Salze, wie Strontiumphosphat, Aluminiumsilicate, einschließlich Bentonit und Kaolin, Chromoxid, Magnesiumsilicat, Talk und dergleichen, Elektroporation, Sonoporation, Protoplastfusion, Lipofection, Peptoidabgabe oder Mikroinjektion. Siehe beispielsweise Sambrook et al., oben, für eine Erläuterung von Techniken zum Transformieren und Transfektieren von Zellen. Die ausgewählten Transformations- oder Transfektionsverfahren hängen teilweise von der verwendeten Wirtszelle ab und können durch den Fachmann routinemäßig bestimmt werden.
Menschliche GDNF-Promotor-Reportergenkonstrukte, die in einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert oder daraus isoliert werden, können verwendet werden, um mögliche Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Reportergenproduktexpression zu stimulieren, und ihres Potentials, die Expression in vivo von GDNF zu stimulieren, zu screenen. Ein bevorzugtes Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die menschliche GDNF-Promotorkontrollierte Reportergenexpression stimulieren, umfassen das Einführen in eine Zelle eines DNA-Konstrukts, das einen GDNF-Promotor umfaßt, der funktionell mit einem Reportergen gekoppelt ist, das Mischen einer Testverbindung mit der Zelle und das Messen des Niveaus an Expression des Reportergenprodukts. Eine Veränderung des Niveaus an Expression des Reportergenprodukts gibt an, daß die Verbindung das GDNF-Expressionsniveau modulieren kann. Das Reportergenkonstrukt wird bevorzugt stabil in die chromosomale DNA der Zelle integriert, ist aber ebenso für die hierin offenbarten Zwecke in Form eines extrachromosomalen Elements funktionell. Die Zelle kann eine eukaryotische Zelle sein, bevorzugt eine Säugerzelle, stärker bevorzugt eine menschliche Zelle, noch stärker bevorzugt eine menschliche Zelle, die GDNF exprimiert, oder jede Zelle, die die Elemente enthält, die benötigt werden, um ein strukturelles Gen unter dem regulatorischen Einfluß eines Säugergenpromotors zu exprimieren. In den hierin bereitgestellten Beispielen wurden menschliche Glioblastom-U-87-MG- und menschliche Neuroblastom-SK-N-AS-Zellen als Wirte für Promotor/Reporter-Konstrukte verwendet, da diese Zellen GDNF, wie durch ELISA bestimmt, produzieren und daher GDNF-mRNA, wie durch RT-PCR bestätigt, produzieren.
Daher wird beispielsweise eine Testverbindung hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Luciferaseexpression zu modulieren, oder hinsichtlich ihrer Fähigkeit, mit der Modulation der Reportergenexpression durch eine menschliche GDNF-Inducer-Verbindung, z. B. Forskolin, zu interferieren oder diese zu verstärken, oder dergleichen, in einer Säugerwirtszelle bewertet, die mit einem menschlichen GDNF-Promotor-Luciferase-Genkonstrukt transfektiert wurde.
Obwohl intakte Zellen bevorzugt sind, um mögliche Verbindungen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zu bewerten, Reportergenexpression durch Erzeugung eines intrazellulären Signals zu induzieren, das zur Aktivierung des menschlichen GDNF-Promotors führt, der funktionell mit dem Reportergen gekoppelt ist, können permeabilisierte Zellen verwendet werden, um die Wirksamkeit von möglichen Verbindungen zu testen. Die Permeabilisierung von Wirtszellen, die das menschliche GDNF-Promotor-Reportergenkonstrukt beherbergen, wird durch in der Technik allgemein bekannte Verfahren bewirkt.
Mögliche Verbindungen können ebenso hinsichtlich der Modulation der GDNF-Expression unter Verwendung des GDNF-Promotorgenkonstrukts in einem In-vitro-Transkriptionsassay bewertet werden, wie von Sierra et al. „In vitro transcription with nuclear extracts from differentiated tissues", in Hames et al. (Hrsg.) Gene Transcription: A Practical Approach (IRL Press, 1993), S. 125–152, beschrieben.
Verbindungen, die die GDNF-Expression durch Binden an den GDNF-Promotor oder Fragmente davon modulieren, können unter Verwendung von Techniken bewertet werden, die beispielsweise in Gottesfeld et al. (1997), Nature 387, 202–205, und Heguy et al. (1995), Gene Expression 4, 337–344, beschrieben sind.
Folglich werden Mittel, bei denen festgestellt wurde, daß sie die Expression des Reportergenprodukts in Zellen, transfektiert mit einem menschlichen GDNF-Promotor-Reportergen konstrukt, stimulieren, als potentielle therapeutische Mittel bei mehreren neurodegenerativen Störungen betrachtet, einschließlich und ohne Einschränkung Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Epilepsie, Alzheimer-Krankheit oder andere Zustände oder Krankheiten, bei denen die Abwesenheit oder ein verringertes Niveau von natürlich vorkommenden GDNF ein ätiologischer Faktor sein kann. Außerdem sind diese Mittel potentielle therapeutische Mittel zur Unterstützung der pränatalen peripheren neuronalen Entwicklung sowie der Nierenontogenie während der embryonalen Entwicklung. Die Wirksamkeit des therapeutischen Mittels wird in irgendeiner Anzahl von Tiermodellen der obigen Krankheiten, die in der Technik bekannt sind, getestet.
Beispielsweise replizieren die am häufigsten verwendeten Tiermodelle für die Parkinson-Krankheit die Neurodegeneration von dopaminergen Neuronen normalerweise durch Verabreichung von Toxinen. Die unilaterale Injektion von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) in Substantia nigra von Mäusen oder Ratten führt zum neuronalen Verlust in dem ipsilateralen Striatum und der Substantia nigra pars compacta mit geringer Veränderung in der kontralateralen Hemisphäre. Ebenso führt die Methamphetamin-induzierte Neurotoxizität zur Neurodegeneration von dopaminergen und serotoninergen Neuronen, und der Fachmann nimmt an, daß dies eng mit dem menschlichen Zustand zusammenhängt. Die Wirksamkeit von Arzneimitteln wird durch die Verhaltensergebnisse unter Verwendung des Apomorphin-induzierten rotatorischen Verhaltens bewertet.
Ein anderes Modell für die Parkinson-Krankheit wird unter Verwendung des Neurotoxins N-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) konstruiert. MPTP wird an Mäuse, Ratten und Affen verabreicht. Die Verabreichung von MPTP an Affen führt nicht nur zum Verlust von dopaminergen und serotoninergen Neuronen in Substantia nigra pars compacta und Striatum, sondern ebenso zu Verhaltensmanifestationen ähnlich denen, die bei menschlichen Parkinson-Patienten gesehen werden, wie Akinesie und steife Körperhaltung.
Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Tiermodellen der Parkinson-Krankheit ist eine Vielzahl von Inzuchtstämmen von Mäusen erhältlich, in denen es nachweislich einen allmählichen Rückgang der dopaminergen Zellanzahl gibt. Beispielsweise wird eine Maus mit D2-Rezeptor-Mangel durch homologe Rekombination erzeugt, deren Verhaltensmerkmale denen von Patienten ähneln, die von der Parkinson-Krankheit betroffen sind. Fitzgerald et al. (1993), Brain Res. 608, 247–258. Ein zweites Beispiel ist die Weaver-Mutanten-Maus, die einen allmählichen Rückgang der Zahl an mesenzephalen dopaminergen Neuronen über die Zeit hinweg von bis zu 40 % zeigt; Verina et al. (1997), Exp. Brain Res. 113, 5–12; Adelbrecht et al. (1996), Mol. Brain Res. 43, 291–300; Mitsumoto et al. (1994), Science 265, 1107–1110.
Tiermodelle von anderen neurodegenerativen Krankheiten wurden beschrieben und sind zum Bewerten der therapeutischen Wirkung von Mitteln verwendbar, bei denen festgestellt wurde, daß sie die Expression des Reportergens in Zellen, tranfektiert mit einem menschlichen GDNF-Promotor-Reportergenkonstrukt, modulieren, wie hierin beschrieben. Beispielsweise beschreiben Martin et al. (1995), Brain Res. 683, 172–178, ein Tiermodel für Epilepsie, beschreiben Matheson et al. (1997), Neuro Report 8, 1739–1742, und Oppenheim et al. (1995), Nature 373, 344–346, Modelle der Neurodegeneration, die aus einem physischen Trauma resultiert, und Sagot et al. (1996), J. Neurosci. 16, 2335–2341, beschreiben ein Modell für die Motoneurondegeneration bei Tieren.
Die so identifizierten Mittel können zu therapeutischen Zusammensetzungen in einer Vielzahl von Dosierungsformen formuliert werden, wie, aber nicht darauf beschränkt, flüssige Lösungen oder Suspensionen, Tabletten, Pillen, Pulver, Salben, Zäpfchen, polymere Mikrokapseln oder Mikrovesikel, Liposomen und injizierbare oder infusionsfähige Lösungen. Die bevorzugte Form hängt von der Verabreichungsweise und dem Krankheitstyp, auf den abgezielt werden soll, ab. Die Zusammensetzungen umfassen ebenso bevorzugt pharmazeutisch akzeptable Vehikel, Träger oder Hilfsmittel, die in der Technik allgemein bekannt sind, wie humanes Serumalbumin, Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Lecithin, Puffersubstanzen, wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, und Salze oder Elektrolyte, wie Protaminsulfat. Geeignete Vehikel sind beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder dergleichen und Kombinationen davon. Konkrete Verfahren zum Herstellen solcher Zusammensetzungen sind bekannt oder werden dem Fachmann offensichtlich sein. Siehe beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18. Auflage, 1990.
Die obigen Zusammensetzungen können unter Verwendung konventioneller Verabreichungsweisen verabreicht werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, intravenöser, intramuskulärer, intraperitonealer, oraler, intralymphatischer oder subkutaner Verabreichung.
Therapeutisch wirksame Dosierungen können durch den Fachmann leicht bestimmt werden und werden von der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, der Gesundheit des Patienten und dessen Reaktion auf die Behandlung und der Beurteilung des behandelnden Arztes abhängen.
Zusätzlich zur Verwendung einer menschlichen GDNF-Promotor-DNA in einem Reportergenkonstrukt, um Mittel zu identifizieren, die zum Behandeln von neurodegenerativen Krankheiten, wie der Parkinson-Krankheit, verwendbar sind, kann der menschliche GDNF-Promotor verwendet werden, um Oligonucleotidsonden zu konstruieren und so Mutationen zu detektieren, die die Expression von menschlichem GDNF beispielsweise für diagnostische Zwecke beeinflussen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Sonde" auf eine Struktur, die aus einem Polynucleotid besteht, wie oben definiert, und eine Nukleinsäuresequenz enthält, die zu einer Nukleinsäuresequenz, die in einem Zielpolynucleotid vorliegt, komplementär ist. Die Polynucleotidregionen von Sonden können aus DNA, und/oder RNA und/oder synthetischen Nucleotidanaloga bestehen. Diese Sonden sind in In-vitro-Hybridisierungsassays verwendbar, um einen menschlichen GDNF-Wildtyp-Promotor von einer Variante davon zu unterscheiden und hinsichtlich Defekten in dem GDNF-Promotor zu screenen, die für die Parkinson-Krankheit oder andere zentrale und periphere neurodegenerative Krankheiten diagnostisch sein können.
Eine Sonde wird im allgemeinen etwa 6–8 bis etwa 75 angrenzende Nukleinsäuren des Referenzpolynucleotids, im allgemeinen etwa 10–12 bis etwa 50 angrenzende Nukleinsäuren und bevorzugt etwa 15–20 bis etwa 30 angrenzende Nukleinsäuren der Referenzsequenz umfassen. Insbesondere weisen die Sonden für GDNF-Promotoren eine Länge auf, die die Detektion von einmaligen Sequenzen durch Hybridisierung erlaubt.
Daher können unter Verwendung eines bestimmten Teils des isolierten menschlichen distalen GDNF-Promotors oder des isolierten menschlichen proximalen GDNF-Promotors Oligomere von ungefähr 6 bis 8 oder mehr Nucleotiden, die mit dem Promotor hybridisieren, unter Ver wendung von routinemäßigen Standardverfahren, wie Exzision, oder beispielsweise durch automatisierte Oligonucleotidsyntheseverfahren hergestellt werden. Diese Oligomere sind beispielsweise zum Screenen auf die Gegenwart eines abweichenden GDNF-Promotors in einem Individuum, das hinsichtlich der Entwicklung der Parkinson-Krankheit gefährdet sein kann, oder als ein pränataler Screen auf Föten, die ebenso hinsichtlich einer abnormalen peripheren neuronalen Entwicklung oder Nierenontogenie gefährdet sein können, nützlich.
Wenn die Oligonucleotidsonden als diagnostische Reagenzien verwendet werden sollen, kann die zu analysierende Testprobe, wie Blut, Serum oder Fruchtwasser, so behandelt werden, daß eine Nukleinsäurefraktion davon extrahiert wird. Die resultierende Nukleinsäure aus der Probe kann der Gelelektrophorese oder anderen Größentrennungsverfahren unterzogen werden, oder die Nukleinsäureprobe kann ohne Größentrennung der Dot-Blot-Analyse unterzogen werden. Die Probe wird dann einer Oligonucleotidsonde ausgesetzt, die detektierbar markiert ist. Geeignete Markierungen und Verfahren zum Anbringen von Markierungen an Sonden sind in der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, radioaktive Markierungen, eingeführt durch Nick-Translation oder Kinasierung, Biotin, fluoreszierende und chemilumineszierende Sonden, Enzyme, die die Produktion eines detektierbaren Produktes katalysieren, wie Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase und dergleichen. Die Nukleinsäuren, die aus der Probe extrahiert wurden, werden dann mit der markierten Sonde unter Bedingungen mit geeigneter Hybridisierungsstringenz behandelt.
Die Stringenz der Hybridisierung wird durch eine Anzahl von Faktoren während des Waschverfahrens, einschließlich Temperatur, Ionenstärke, Zeitdauer und Konzentration an Formamid, bestimmt. (Sambrook et al., oben). Die Hybridisierung kann durch eine Vielzahl von Techniken durchgeführt werden. Die Amplifikation der Probennukleinsäure kann, wenn erforderlich, durchgeführt werden, beispielsweise durch Ligase-Kettenreaktion (LCR), Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Q-beta-Replicase oder andere Verfahren, die in der Technik allgemein bekannt sind. Die amplifizierten Nukleinsäuren können dann unter Verwendung eines Hybridisierungsassays detektiert werden, der ebenso in der Technik allgemein bekannt ist.
GDNF-Promotor-Polynucleotide oder Teile davon können in diagnostischen Kits bereitgestellt werden. Beispielsweise können Oligomersonden, die spezifisch mit einem GDNF-Promotor-Polynucleotid hybridisieren können, in diagnostischen Kits verpackt werden, die die Sondennukleinsäuresequenz umfassen, die markiert sein kann. Alternativ kann die Sonde unmarkiert bereitgestellt werden, und die Bestandteile zum Markieren könnten in dem Kit enthalten sein. Der Kit kann ebenso andere geeignet verpackte Reagenzien und Materialien enthalten, die für das spezielle Hybridisierungsprotokoll benötigt oder gewünscht sind, beispielsweise Standards sowie Instruktionen für die Durchführung des Assays.
Es ist selbstverständlich, daß, obwohl die Erfindung zusammen mit ihren bevorzugten speziellen Ausführungsformen beschrieben worden ist, die obige Beschreibung sowie die folgenden Beispiele den Umfang der Erfindung veranschaulichen, aber nicht einschränken sollen.
III. Experimenteller Teil
In den folgenden Beispielen wurde sich bemüht, Genauigkeit in bezug auf die verwendeten Zahlen (beispielsweise Mengen, Temperatur usw.) zu gewährleisten, aber gewisse experimentelle Fehler und Abweichungen sollten berücksichtigt werden. Die Temperatur wird immer in Grad Celsius angegeben, wenn nicht anders angegeben, der Druck liegt bei oder nahe dem Atomsphärendruck.
Die folgenden Einbuchstaben-Nucleotid-Abkürzungen werden die ganze Zeit verwendet, um die optionale Gegenwart eines Nucleotids von einem Paar von Nucleotiden an einer gegebenen Lokation in einem Polynucleotid anzugeben: R = G oder A; Y = C oder T; S = C oder G; W = A oder T; M = A oder C; und K = G oder T.
Beispiel 1
Klonen des menschlichen distalen GDNF-Promotors
A. Darstellung von GDNF-cDNA aus menschlichen Geweben.
Menschliche GDNF-cDNA wurde durch PCR aus cDNA-Bibliotheken aus fetalem Gehirn, fetaler Niere und adultem Skelettmuskel unter Verwendung eines Primerpaars, basierend auf der Ratten-GDNF-cDNA-Sequenz, gemäß dem Verfahren amplifiziert, das in Schaar et al. (1994), Exp. Neurol. 130, 387–393, beschrieben ist. Das Paar aus Sense- und Antisense-Primer war:
5'-GGT CTA CGG AGA CCG GAT CCG AGG TGC-3' (SEQ ID Nr.3) bzw.
5'-TCT CTG GAG CCA GGG TCA GAT ACA TC-3' (SEQ ID Nr.4)
Diese Ergebnisse zeigen, daß mindestens eine menschliche GDNF-cDNA ein 5'-Ende aufwies, das im wesentlichen homolog zu dem von Ratten-GDNF-cDNA war.
Eine solche PCR-amplifizierte cDNA aus menschlicher fetaler Niere (huGDNF) wurde in pCR II (Invitrogen) geklont und sequenziert, wodurch die nachstehend gezeigte Sequenz erhalten wurde.
Nucleotidsequenzen 1 bis 27 und 675 bis 700 sind homolog zu den Primersequenzen. Die Sequenz zwischen Nucleotiden 50 bis 674 ist mit den GenBank-Einträgen L19062 und L19063 identisch.
B. PCR-Walking von menschlicher genomischer DNA.
DNA-Walking von menschlicher genomischer DNA wurde mit einem PromoterFinder DNA-Walking-Kit (Clontech Laboratories, Palo Alto, Calif., USA) unter Verwendung der Primer outGDNF1 (5'-CAG CAC CAG GCA GAC AGC-3' (SEQ ID Nr. 6)) und inGDNF1 (5'-GCC ACG ACA TCC CAT AAC TT-3' (SEQ ID Nr. 7)) als genspezifische Primer 1 bzw. 2 durchgeführt. PCR wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers in Gegenwart von 5 % Dimethylsulfoxid durchgeführt. Amplifizierte DNA wurde in pCR II (Invitrogen, San Diego, Calif., USA) geklont und sequenziert. Die Nucleotidsequenz des amplifizierten Segments wird nachstehend gezeigt.
Nucleotide 699–721 (in fetter Schrift) stellen eine translatierte Sequenz dar, und Nucleotide 702–721 sind homolog zu Primer inGDNF1. Nucleotide 671–721 sind stark homolog zu denen, die in Ratten- und Maus-GDNF-cDNAs gefunden werden (GenBank-Einträge L15305 bzw. U37372). Die Sequenz weicht stromaufwärts von Nucleotid 671 ab. Eine potentielle Spleißstelleakzeptorstelle, gezeigt unter der Sequenz (YYYYYYYNY AGG) (SEQ ID Nr. 9), wurde in der Umgebung stromaufwärts von Nucleotid 671 gefunden, wo die Sequenz von Ratten- und Maus-cDNAs abweicht, was zeigt, daß ein anderes Exon dieser Sequenz vorausgeht.
C. Klonen und Identifikation von Exon I von menschlichem GDNF und dem GDNF-Promotor.
Eine menschliche Genbibliothek in dem P1-Bacteriophagenvektor pAd10sacBII (menschliche Vorhaut-Fibronlasten-P1-Bibliothek Nr. 1 von Du Pont Merck Pharmaceutical Company; Sternberg (1992), Trends in Genetics 8, 11–16) wurde in Pools durch PCR unter Verwendung der Primer GDNFg246F (5'-TAT GCC AGA GGA TTA TCC TGA TCA G-3' (SEQ ID Nr. 10)) und GDNFg246R (5'-TAG CCC AGA CCC AAG TCA GTG AC-3' (SEQ ID Nr. 11), wie von Schindelhauer et al. (1995), Genomics 28, 605–607 beschrieben), gescreent, um menschliche genomische Klone, enthaltend Exon IV des menschlichen GDNF-Gens, zu identifizieren.
Die Klone DMPC-HFF#1-0575-F3, DMPC-HFF#1-0994-A6 und DMPC-HFF#1-1332-H5 wurden identifiziert und in E.-coli-Stamm NS3516 transformiert. Nach der Isolation von DNA aus diesen Klonen wurde die Gegenwart von Exon III darin durch PCR unter Verwendung von Primer Nr. 5188 (5'-CCC TGC TTG AAA CTC TGA CC-3' (SEQ ID Nr. 12), Nucleotide 400–419 der Sequenz, die in Beispiel 1B gezeigt ist) und Primer inGDNF1 (Beispiel 1B, oben) folgendermaßen bestätigt. Reaktionsgemische enthielten 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 20 °C), 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, 1 μM von jedem Primer und 50 U/ml Taq-DNA-Polymerase (Boehringer/Mannheim). Matrizen-DNA zur Amplifikation wurde durch Inokulieren von jeweils 50 μl Reaktionsgemisch mit Bakterien aus isolierten Kolonien auf Platten mit Luria-Bertani (LB) Agar plus 25 μg/ml Kanamycin, wo die Bakterien das P1-Klon von Interesse enthielten, bereitgestellt. Reaktionsgemische wurden mit Mineralöl überlagert und unter Verwendung des folgenden Schemas amplifiziert: anfänglicher Denaturierungsschritt, 4 min bei 94 °C; 30 Zyklen des Denaturierens für 1 min bei 94 °C, Annealing für 1 min bei 60 °C, und Primerextension für 1 min bei 72 °C; Endextensionsschritt von 10 min bei 72 °C. Jeder Klon ergab das erwartete Produkt mit etwa 322 bp bei Agarosegelelektrophorese. Bakterien mit dem Vektor allein ergaben kein Signal dieser Größe, was die Gegenwart von Exon III in jedem Klon bestätigt.
Die DNAs aus genomischen Klonen DMPC-HFF#1-0575-F3, DMPC-HFF#1-0994-A6 und DMPC-HFF#1-1332-H5 wurden einzeln mit den Restriktionsenzymen SmaI, NarI, EcoRI, SalI, BamHI und BglII (jeweils von Boehringer/Mannheim) in Gegenwart des Puffers, der vom Lieferanten empfohlen wird, digeriert und die folgenden Fragmente auf einem 0,5%igen Agarose-Tris/Borat/EDTA-gepufferten Gel getrennt und mit Ethidiumbromid eingefärbt. Die DNA in dem Gel wurde denaturiert, neutralisiert und auf eine Nylonmembran durch Kapillartransfer über Nacht transferiert. Nach dem Vernetzen der DNA mit der Nylonmembran unter Verwendung von UV-Licht und Prähybridisierung für 16 h bei 42 °C in einem Puffer mit der Zusammensetzung von 2 % Gew./Vol. Blockierungsreagens (Boehringer/Mannheim, 5 × SSC-Puffer (20 × SCC-Puffer ist 175 g NaCl und 88 g NaCitrat in 1 l Wasser), 0,1 % N-Lauroylsarcosin, 0,02 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 50 % Formamid, wie vom Lieferanten (Boehringer/Mannheim) empfohlen, wurde Southern-Blot für 16 h bei 42 °C mit 10 ng/ml Digoxigenin-markierter menschlicher GDNF-cDNA, wie in Beispiel 1A beschrieben, in einem Puffer ähnlich dem Prähybridisierungspuffer hybridisiert. Die Membran wurde zweimal für 15 min in 2 × SSC, enthaltend 0,1 % Natriumdodecylsulfat („SDS"), bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einer 30minütigen Wäsche bei 60 °C in 0,1 × SSC, enthaltend 0,1 % SDS. Die spezifische Hybridisierung wurde mit Reagenzien und Protokollen detektiert, die vom Lieferanten (Boehringer/Mannheim) bereitgestellt werden. Es wurde beobachtet, daß EcoRI-Bänder von etwa 9,4 kb, 2,7 kb und 0,7 kb mit der menschlichen GDNF-cDNA-Sonde hybridisieren.
PCR-Primer wurden konstruiert, basierend auf der von Schaar et al., oben, beschriebenen GDNF-Sense-Sequenz und der Sequenz stromaufwärts von Exon III (siehe Beispiel 1B), um die Position des mutmaßlichen Exons I in bezug auf Exon III zu kartieren. Primer Nr. 5231 (5'-GGT CTA CIG AGA CCG GAT CCG AGG T-3' (SEQ ID Nr. 13)) ist eine geschnittene Form der GDNF-Sense-Sequenz, die so konstruiert ist, daß sie einen Teil einer Consensus-Spleißstelle-Donorstelle an ihrem 3'-Ende umfaßt und einen einzelnen 2'-Deoxyinosinrest enthält, um eine vorhergesagte stabile Schlaufe zu destabilisieren, die sich andernfalls innerhalb des Primers bilden würde. Primer Nr. 5230 (5'-CGG CCC AAG CAA GGA CGG TGT TTC T-3' (SEQ ID Nr. 14)) ist homolog zu Nucleotiden 191–215 in der Sequenz, die in Beispiel 1B gezeigt ist, etwa 480 bp stromaufwärts von dem Start von Exon III. PCR-Amplifikationsreaktionsgemische enthielten 0,2 mM dNTPs, 0,6 M jedes der Primer Nr. 5230 und 5231, 52,5 U/ml Expand-DNA-Polymerase und eine 1 × Konzentration des gesetzlich geschützten Puffers, der durch den Lieferanten der Polymerase (Boehringer/Mannheim) bereitgestellt wird. Matrizen-DNA zur Amplifikation war entweder 200 ng menschliche genomische DNA (Boehringer/Mannheim), 0,1 ng Klon DMPC-HFF#1-0575-F3 oder 0,1 ng einer SalI-Deletion dieses Klons, die etwa die Hälfte der eingeführten DNA, ausgehend von einer SalI-Stelle etwa 1,75 kb stromabwärts von der EcoRI-Stelle innerhalb des Exons IV des menschlichen GDNF-Gens, entfernt. Reaktionsgemische von jeweils 50 μl wurden mit Mineralöl überdeckt und unter Verwendung des folgenden Schemas amplifiziert: anfänglicher Denaturierungsschritt, 3 min bei 95 °C; 20 Zyklen Denaturieren für 1 min bei 95 °C, ein 30sekündiger Abstieg auf 60 °C, Annealing für 1 min bei 60 °C, ein 30sekündiger Anstieg auf 72 °C und Primerextension für 4 min bei 72 °C; 15 Zyklen mit ähnlichen Zeiten und Temperaturen, außer daß die Verlängerungszeit bei jedem Zyklus stufenweise um 15 Sekunden erhöht wurde; Endextensionsschritt, 10 min bei 72 °C. Elektrophorese eines aliquoten Teils aus jedem PCR-Reaktionsgemisch zeigte Produkte mit ungefähr 4,5 kb in jeder Spur, wo Matrizen-DNA vorlag, aber keine Produkt, wo keine Matrizen-DNA vorlag. Diese Ergebnisse zeigen, daß Exon I etwa 4,5 kb stromaufwärts von der Position der Hybridisierung von Primer Nr. 5230 oder etwa 5,0 kb stromaufwärts von dem Start des Exons III vorliegt.
Das PCR-Amplifikationsprodukt aus Primern 5230/5231 wurde gereinigt und etwa 100 ng des Produktes mit ^{^32}P-dCTP markiert (Pharmacia Biotech Oligomarkierungskit). Der Southern-Blot, zuvor hybridisiert mit Digoxigenin-markierter menschlicher GDNF-cDNA, wurde über Nacht bei 42 °C mit 1 × 10⁶ CPM/ml des radioaktiv markierten Produktes in Puffern ähnlich denen, die zuvor beschrieben sind, hybridisiert. Nach den Wäschen, wie zuvor beschrieben, wurde nur das EcoRI-Fragment mit etwa 9,4 kb von jedem P1-genomischen Klon durch Autoradiographie detektiert. Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl Exon I als auch Exon III des menschlichen GDNF-Gens innerhalb desselben EcoRI-Fragments mit etwa 9,4 kb vorliegen, wobei die Exons durch etwa 5,0 kb getrennt sind.
Das EcoRI-Fragment mit etwa 9,4 kb wurde in den Vektor pBK-CMV durch anfängliches Klonen in mit EcoRI und alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelten Zap-Express-Vektorarme (Stratagene) geklont. Zehn Mikrogramm des menschlichen genomischen P1-Klons DMPC-HFF#1-0575-F3 wurden zur Beendigung mit EcoRI gespalten. Die Fragmente wurden auf einem 0,5%igen Agarosegel getrennt und aus dem Gel gereinigt. Das EcoRI-Fragment wurde in mit EcoRI und alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase behandelte Zap-Express-Vektorarme ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in Bakteriophage-lambda-Teilchen mit Gigapack II Gold-Verpackungsextrakten (Stratagene) verpackt. Die verpackte DNA wurde mit XL-1-blue-MRF'-Wirtszellen in 0,7 % NZY-Top-Agar auf NZY-Agarplatten gemäß den Anweisungen des Lieferanten plattiert (Stratagene). Elf isolierte Plaques wurden mit Kern versehen, die Phagenteilchen über Nacht in 0,25 ml SM-Puffer eluiert und aus lambda-Phage durch Coinfektion von XL-1 blauen MRF'-Zellen mit rekombinanter lambda-Phage und ExAssist-f1-Helferphage gemäß den Anweisungen des Lieferanten plasmidexzidiert. Exzidierte Phagemide wurden aus filamentösen Phagenteilchen durch Inkubieren von XLOLR-Zellen mit dem wärmebehandelten exzidierten pBK-CMV-Phagemid, verpackt als filamentöse Phagenteilchen, und Plattieren auf LB-Agar + 50 μg/ml Kanamycinagarplatten gewonnen. Nach der Übernachtinkubation der Platten bei 37 °C wurden isolierte Kolonien ausgewählt und Plasmid-DNA, hergestellt aus Kulturen, wuchs in LB + 50 μg/ml Kanamycin. Ein Plasmid, pRBSEco9.4#8, wurde weiter charakterisiert.
D. Sequenzieren des geklonten 9,4-kb-EcoRI-Fragments.
Plasmid pRBSEco9.4#8 (siehe 2) wurde anfänglich unter Verwendung von Primer Nr. 5231 sequenziert. Weiteres Sequenzieren wurde unter Verwendung anderer Primer durchgeführt, die, basierend auf der abgeleiteten Sequenz, synthetisiert wurden. Anfängliches Sequenzieren offenbarte die nachstehend gezeigte Sequenz.
Intensiveres Sequenzieren offenbarte die Sequenz, die in den 3A bis 3B (SEQ ID Nr. 1) gezeigt ist. Diese Sequenz war zu 79 % identisch mit einer eingeschränkten Region des Maus-GDNF-Gens (Exon I bis 140 bp stromaufwärts von Exon I, GenBank-Eintrag Nr. D8835051), unter Verwendung des BESTFIT-Programms (Wisconsin Sequence Analysis Package, Genetics Computer Group, Madison, WI) mit den Standardparametern, die vom Hersteller vorgeschlagen werden.
E. Bestimmung der Transkriptionsstartstelle des distalen GDNF-Promotors durch 5'-Enden-Analyse von GDNF-cDNAs.
Ein CapFinder PCR-cDNA-Synthesekit (Clontech Laboratories) wurde verwendet als der Ausgangspunkt eines modifizierten RACE-Verfahrens (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden) (Frohman (1989) in PCR Protocols (Academic Press, San Diego) S. 28–38), um cDNA-Bibliotheken zu erzeugen, angereichert an GDNF-cDNA-5'-Enden. Die Synthese des ersten cDNA-Strangs auf 0,5 μg von entweder polyA⁺-RNA von menschlicher fetaler Niere, Gehirn oder adultem Skelettmuskel (Clontech Laboratories) wurde durchgeführt, wie beschrieben (CapFinder Kit, Clontech Laboratories), außer die cDNA-Synthese mit 1 μl (50 ng/μl) zufälliger Hexamere (Gibco/BRL) gestartet wurde. PCR wurde, wie beschrieben, durchgeführt, außer daß die Primer jeweils 0,4 μM des gelieferten CapFinder PCR-Primers und des GDNF-Anti-sense waren, mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 °C für 3 min und 24 Zyklen mit Denaturierung für 1 min bei 94 °C, Annealing für 1 min bei 58 °C und Primerextension für 1 min bei 72 °C, mit einer Endextension bei 72 °C für 10 min.
Die primären PCR-Reaktionen wurden 1000fach in sterilem destilliertem Wasser verdünnt, und ein aliquoter Teil von 1 μl wurde der sekundären Amplifikation in ähnlichen Reaktionsgemischen wie den zuvor verwendeten unterzogen, außer in Gegenwart von 0,2 μM CapFinder PCR-Primer und 0,4 μM Primer Nr. 5191 (5'-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3' (SEQ ID Nr. 16)) für 25 Zyklen desselben Temperaturprogramms. Ein Southern-Blot von aliquoten Teilen der PCR-Reaktionen, getrennt durch Agarosegelelektrophorese und sondiert mit ³²P-ATP-markiertem outGDNF1 (Beispiel 1B, oben), zeigte mehrere Bänder mit einer Länge von 600 bis 1.100 bp. PCR-Produkte in diesem Größenbereich wurden durch Agarosegelelektrophorese gereinigt, die DNA gewonnen und in pCR 2.1 (Invitrogen) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in ElectroMAX DH10B-Zellen (Gibco/BRL) elektroporiert und auf Platten mit LB-Agar + 50 mg/ml Ampicillin + 50 mg/ml Kanamycin plattiert. Nach der Übernachtinkubation bei 37 °C wurden die Kolonien auf Nylon-Membranen plaziert, die DNA denaturiert, neutralisiert und durch Standardverfahren UV-vernetzt. Die Filter wurden mit einer markierten cDNA-Sonde hybridisiert, wie in Beispiel 1A beschrieben, DNA aus den Hybridisierungs-positiven Kolonien hergestellt und sequenziert.
Die Sequenz einer distalen Promotor-abgeleiteten cDNA aus menschlicher fetaler Niere wird nachstehend gezeigt, wobei die Nucleotide 1 bis 174 dem Exon I entsprechen, wie in 1 gezeigt (Nucleotide 1–174 in 3B), die Nucleotide 175 bis 351 dem Exon IIIb entsprechen, wie in 1 gezeigt, die Nucleotide 352 bis 763 dem Exon IV entsprechen, wie in 1 gezeigt, die Nucleotide 740 bis 762 durch Primer Nr. 5191 beigetragen werden und die Nucleotide 175 bis 762 mit den Nucleotiden 24 bis 611 der Sequenz, die in Beispiel 1A, oben, angegeben ist, identisch sind.
Beispiel 2
Herstellung eines menschlichen distalen GDNF-Promotor-Reportergenkonstrukts und Transfektion des Konstrukts in E. coli.
Um die Promotoraktivität zu bestimmen, wurde ein Reportergenplasmid unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Plasmids pGL3-Basic (Promega, Madison, WI, GenBank-Eintrag U47295), das ein Glühwurm-Luciferasereportergen beherbergt, aufgrund der Empfindlichkeit und Linearität als Antwort auf Luciferase, die daraus exprimiert wird, hergestellt. Der distale GDNF-Promotor, enthalten innerhalb des Plasmids pRBSEco9.4#8, hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde in einem Zweischrittverfahren in die einzigartige NheI- Restriktionsstelle von pGL3-Basic, stromaufwärts von dem Luciferasegen des Vektors, wie in 5 dargestellt, bewegt.
Im ersten Schritt wurde Plasmid pGL3-Basic mit Restriktionsendonuclease NheI gespalten. Das Enzym wurde durch Inkubation bei 65 °C für 20 Minuten inaktiviert, anschließend mit alkalischer Garnelen-Phosphatasc behandelt, um die Selbst-Ligation des Vektors zu verhindern, und dieses Enzym wurde bei 65 °C für 15 Minuten wärmeinaktiviert. Zwischenzeitlich wurde pRBSEco9.4#8 mit AvrII, gefolgt von NheI digeriert. Ein 740-bp-Fragment wurde durch Elektrophorese auf einem 0,5%igen Agarosegel getrennt und das Band aus dem Gel gewonnen. Das gewonnene AvrII/NheI-Fragment des Promotors wurde dann in das NheI-gespaltene pGL3-Basic ligiert. Das ligierte Gemisch wurde in INVaF'-kompetente E. coli-Zellen (Invitrogen) transformiert und auf LB-Ampicillin-Agarplatten plattiert. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37 °C wurde die Plasimd-DNA aus einzelnen Kolonien, die in kleinen Kulturen von flüssigen LB-Ampicillin-Medien wuchsen, hergestellt. Die Orientierung des AvrII/NheI-Promotorfragments in pGL3-Basic wurde durch Digestion von Plasmid-DNA-Präparationen mit XbaI und durch Sequenzieren der Verbindungssequenz an der Verbindung, die dem Luciferase-Gen am nächsten ist, bestimmt. Das Zwischenplasmid mit dem NheI/AvrII-Teilpromotorfragment wurde pNhe-GDNF genannt.
Im zweiten Schritt des Transfers des distalen GDNF-Promotors in pGL3-Basic wurde das Zwischenplasmid pNhe-GDNF nacheinander mit den Restriktionsenzymen NheI und PstI gespalten, das Gemisch mit Phenol/CHCl₃ extrahiert und Ethanol-präzipitiert. Plasmid pRBSEco9.4#8 wurde mit SpeI (das in dem Polylinker spaltet, der die EcoRI-Insertionsstelle für das genomische DNA-Insert flankiert) und PstI gespalten. Das SpeI- bis PstI-Fragment mit etwa 1095 bp wurde getrennt und durch Elektrophorese auf einem 0,5 % Agarosegel gereinigt. Das SpeI/PstI-Promotor-Fragment wurde dann in das mit NheI und PstI gespaltene pNhe-GDNF-Plasmid ligiert. Das Fragment wurde in INVaF'-kompetente E. coli-Zellen (Invitrogen) transformiert, die auf Platten mit LB + Ampicillin plattiert wurden und über Nacht bei 37 °C wuchsen. Plasmid-DNA wurde aus isolierten Kolonien hergestellt und die Insertion des Promotors durch Restriktionsdigestion und Sequenzieren bestätigt. Das Luciferasepromotorplasmid, enthaltend den menschlichen GDNF-Promotor, wurde pGDNF-1635 genannt.
Kontrollierte Deletionen von pGDNF-1635 werden zur Bewertung der Bedeutung von verschiedenen Promotor- oder Enhancerregionen des menschlichen distalen GDNF-Promotors ohne weiteres vorgenommen. Plasmid pNhe-GDNF bildet eine solche Deletion der 5'-terminalen etwa 1.040 bp des distalen GDNF-Promotors vom pGDNF-1635. Eine Deletion der 5'-terminalen etwa 255 bp des Promotors wird durch Digestion von pGDNF-1635 mit der Restriktionsendonuclease SacI, Inaktivierung des Enzyms und Religation des Vektorteils bei niedrigen DNA-Konzentrationen erreicht, wodurch pSac-GDNF hergestellt wird. Weitere Deletionen können entweder durch Manipulation mit Restriktionsenzymen oder durch kontrollierte Deletionen vorgenommen werden, erzeugt mit Exonucleasen, wie von Henikoff (1984), Gene 28, 357 beschrieben. Eine Karte des menschlichen distalen GDNF-Promotors voller Länge und bildliche Darstellungen mehrerer 5'-geschnittener Promotorkonstrukte werden in 7 gezeigt.
Beispiel 3
Transfektion von pGDNF-1635 in menschliche Zellen und Analysieren der Aktivität des menschlichen distalen GDNF-Promotors
Menschliche Glioblastom-U-87-MG-Zellen (ATCC Nummer HTB-14) oder Neuroblastom-SK-N-AS-Zellen (ATCC Nummer CRL-2137) wurden mit dem Plasmid pGDNF-1635, hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, unter Verwendung des Lipofektionsverfahrens transfektiert (Felgner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413–7417).
U-87-MG-Zellen wuchsen zu etwa 40 % Konfluenz in einer Schale mit einem Durchmesser von 8,5 cm, beschichtet mit Rattenschwanzkollagen, Typ I (Collaborative Research, Kat.-Nr. 40450). Das Medium wurde entfernt, und die Zellen wurden einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und vorsichtig mit einer Lösung, enthaltend 15 μg DNA plus 100 μg lipofectAMINE (Gibco/BRL Nummer 18324-012) in 6,4 ml OptiMEM (Gibco/BRL Nummer 31985), hergestellt gemäß den Anweisungen des Lieferanten, überlagert. Die Zellen wurden für 5 h, oder bis zu 24 h, bei 37 °C in einer Feuchtatmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Die Transfektionslösung wurde dann entfernt und durch 10 ml Minimalmedium (Gibco/BRL Nummer 11095-080), enthaltend 10 % fetales Rinderserum, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1 % Glutamin, 1 % Natriumpyruvat, ersetzt. Nach 48 h Inkubation bei 37 °C wurden die Zellen gesammelt, ein Zellextrakt hergestellt und mit Luciferaseassayreagenzien (Promega Katalognummer E1501) analysiert.
SK-N-AS-Zellen wuchsen zu etwa 50 % Konfluenz in einer Schale mit einem Durchmesser von 8,5 cm, wurden einmal mit PBS gewaschen und vorsichtig mit einer Lösung, bestehend aus 10 μg DNA plus 80 μg lipofectAMINE (Gibco/BRL Nummer 18324-012) in 6,4 ml OptiMEM (Gibco/BRL Nummer 31985), hergestellt, wie oben beschrieben, überlagert. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer Feuchtatmosphäre mit 5 % CO₂ für 5 h inkubiert. Die Transfektionslösung wurde dann entfernt und durch 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco/BRL Nummer 11965-092), enthaltend 10 % fetales Rinderserum und 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, ersetzt. Nach 48 h wurden die Zellen gesammelt, ein Zollextrakt hergestellt und mit Luciferaseassayreagenzien (Promega Katalognummer E1501) analysiert.
Die Wirkung von verschiedenen Promotordeletionen auf die Reportergenexpression wurde durch geringe Modifikationen der vorhergehenden Transfektionsverfahren bestimmt. Wenn die Expression eines Promotorkonstrukts mit einem anderen verglichen wird, ist es wichtig, die Variabilität der Transfektionseffizienz zwischen den zwei separaten Transfektionen zu berücksichtigen. Dies wurde hier durch Co-Transfektion mit einem anderen Kontrollplasmid erreicht, das geringe Mengen eines zweiten, unabhängig analysierten Reporterenzyms exprimiert. Nach der Co-Transfektion mit einem Gemisch aus dem GDNF-Promotor-Deletionskonstrukt, das Glühwurm-Luciferase und das interne Kontrollreporterplasmid exprimiert, werden beide Reporter unabhängig analysiert und die Glühwurm-Luciferase-Aktivität wird durch die Aktivität des Kontrollreporterenzyms normalisiert. Die Variation der Transfektionseffizienz zwischen Experimenten wird dadurch beseitigt. Das Kontrollreporterplasmid, das hier verwendet wurde, war pRL-TK (Promega #E2241), das ein geringes Niveau an Expression einer zweiten unabhängig analysierbaren Luciferase bereitstellt, abgeleitet von dem Meeresorganismus Renilla, unter Kontrolle des Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-Promotors. Zellysate werden nacheinander hinsichtlich der zwei unterschiedlichen Luciferasen unter Bedingungen der separaten Substratzugabe und Pufferzusammensetzung analysiert, so daß es kein Spill-over zwischen Glühwurm- und Renilla-Luciferase-Enzymaktivität gibt.
Menschliche Glioblastom-U-87-MG-Zellen wurden mit einem Gemisch aus 13,5 μg der Reporterplasmide, gezeigt in 7, und 1,5 μg pRL-TK internem Kontrollplasmid in Gegen wart von 100 μg lipofectAMINE, wie zuvor beschrieben, für 24 h transfektiert. Nach der Transfektion wurden die Zellen in den Inkubator für 20 h in U-87-MG-Medium rückgewonnen (MEM, enthaltend 10 % fetales Rinderserum, 1 % nicht-essentielle Aminosäuren, 1 % Glutamin und 1 % Natriumpyruvat), bevor sie aus Platten mit einem Durchmesser von 8,5 cm entfernt und auf Rattenschwanzkollagen-beschichteten 12-Lochplatten (Becton Dickinson Labware #40500) in demselben Medium dispergiert wurden. Die Platten wurden für 9 h inkubiert, wonach U-87-MG-Medium entfernt und durch OptiMEM ersetzt wurde. Die Zellen wurden für 18 h bei 37 °C inkubiert, Medien wurden entfernt, Zellen in abgekühlter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und ein Zellysat in situ durch Zugabe von 0,25 ml von 1 × passivem Lysepuffer (Promega #E194A) zu jedem Loch und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 Minuten unter vorsichtigem Schütteln von Platten hergestellt. SK-N-AS-Zellen wurden mit denselben Plasmiden transfektiert, wie zuvor beschrieben.
Aliquote Teile von 15 Mikrolitern von jedem Zellysat wurden hinsichtlich Glühwurm-Luciferase, gefolgt von Renilla-Luciferase, unter Verwendung von Reagenzien aus einem Dual-Luciferase-Reporterassaysystemkit analysiert (Promega #E1.910). Luciferaseaktivitäten wurden mit Hilfe eines 96-Loch-Formatluminometers (Dynex Technologies, Modell ML-3000), der im erweiterten Modus betrieben wird, quantitativ bestimmt. Assays für jedes Zellysat wurden dreimal wiederholt, während die Ergebnisse für jede gegebene Behandlung aus dem Durchschnitt von sechs Wiederholungen der Behandlung genommen wurden.
Um mögliche Enhancer- und Silencer-Elemente sowie den Grundpromotor selbst positionell zu kartieren, wurden 5'-Deletionsmutanten von pGDNF-1635 konstruiert, transfektiert und Luciferaseaktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Bei U-87-MG-Glioblastomzellen führte die Deletion der äußersten 5' 120 bp (–1516) zu einer 30%igen Verringerung der Promotoraktivität, was die Gegenwart eines Enhancer-Elements zwischen –1635 und 1516 zeigt. Weitere Deletion bis –1304 verursachte eine 2fache Erhöhung der Promotoraktivität, was auf ein Silencer-Element zwischen –1378 und –1304 schließen läßt. Deletion der nächsten 170 bp bis –1134 hatte keine offensichtliche Wirkung in U-87-MG-Zellen. Weitere Deletion von –1134 bis –366 führte zum zunehmenden Verlust der Promotoraktivität, was einen breiten Bereich an Enhancer-Elementen zeigt. Interessanterweise führte die Deletion innerhalb dieser Region von –744 bis –593, eine Region, enthaltend Consensus-Bindungsstellen für egr2 und AP-2, zu einer deutlicheren Verringerung der Promotoraktivität, was darauf schließen läßt, daß egr2 und/oder AP-2 für die regulatorische Aktivität wichtig sind. Im Gegensatz dazu führte die Deletion zwischen –366 und –307, eine Region, enthaltend eine Consensus-NF-κB-Bindungsstelle, zu keiner Veränderung der Promotoraktivität in U-87-MG-Zellen. Schließlich führte die Deletion von –307 bis –193 zu einer etwa 5fachen Erhöhung der Promotoraktivität, während weitere Deletion bis –62 zu leicht erhöhter Aktivität führt, was für (ein) starke(s) Silencer-Element(e) in dieser Region indikativ ist.
Deletionen der regulatorischen Region in SK-N-AS-Neuroblastomzellen erzeugten beträchtliche Unterschiede im Vergleich zu dem Ergebnis, das mit U-87-MG-Zellen erhalten wird. 7 zeigt die Gegenwart eines Enhancers in den ersten 120 bp, gefolgt von einem Silencer bei –1378 bis –1304 in SK-N-AS-Zellen, ähnlich den Ergebnissen, die zuvor für U-87-MG-Zellen beschrieben wurden. Jedoch führt die Deletion in der Region –1304 bis –1134, die keine Wirkung auf U-87-MG-Zellen aufwies, zu einer Verringerung in SK-N-AS-Zellen, was auf die Gegenwart eines Zelltyp-spezifischen Enhancers in dieser Region schließen läßt; ein Paar von Consensus-Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor AP-2 wurde in dieser Region gefunden. Ein anderer Unterschied zwischen diesen zwei Zellinien wurde zwischen –1134 und –852 gefunden. Die Deletion dieser Region, von der zuvor gezeigt wurde, daß sie ein Enhancer in U-87-MG-Zellen ist, verursachte eine Erhöhung der Luciferaseexpression in SK-N-AS-Zellen; eine Consensus-Bindungsstelle für CREB wurde innerhalb dieser Region gefunden. Proximale Deletionen zwischen –852 und –593 offenbarten eine Region an Enhancern in SK-N-AS-Zellen, die hinsichtlich der Wirkung zu denen ähnlich sind, die in U-87-MG-Zellen gefunden werden. Weitere Deletion zwischen –593 bis –366 und –366 bis –307 verursachte eine 3- bzw. 2fach erhöhte Luciferaseaktivität in SK-N-AS-Zellen, was für einen Silencer in dieser Zellinie indikativ ist. Im Gegensatz dazu zeigten U-87-MG-Zellen, daß die Region –593 bis –366 scheinbar als ein Enhancer fungiert, während –366 bis –307, eine Region, enthaltend eine offensichtliche NF-KB-Bindungsstelle, keine Wirkung aufwies. Zusammengenommen lassen die Ergebnisse darauf schließen, daß Zelltyp-spezifische Elemente die Aktivität in diesem Promotor modifizieren können.
Beispiel 4
Klonen und Charakterisierung der menschlichen medialen und proximalen GDNF-Promotoren
A. Mediale Promotor-abgeleitete cDNA aus menschlicher fetaler Niere
Ein CapFinder PCR-cDNA-Synthesekit (Clontech Laboratories) wurde als Ausgangspunkt in einem modifizierten RACE-Verfahren verwendet, um cDNA-Bibliotheken zu erzeugen, angereichert an GDNF-cDNA-5'-Enden. cDNA-Synthese des ersten Stranges auf 0,5 _g polyA+-RNA entweder von menschlicher fetaler Niere, fetalem Gehirn oder adultem Skelettmuskel (Clontech Laboratories) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (CapFinder Kit, Clontech Laboratories), außer daß die cDNA-Synthese mit 1 μl (50 ng/μl) zufälliger Hexamere gestartet wurde (Gibco/BRL). PCR wurde gemäß den Anweisungen durchgeführt, außer daß Primer der gelieferte Caphinder PCR-Primer und GDNF-Anti-sense waren, jeweils bei 0,4 μM vorliegend. Das PCR-Programm bildete eine anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 3 min und 24 Zyklen der Denaturierung für 1 min bei 94 °C, Annealing für 1 min bei 58 °C und Primerextension für 1 min bei 72 °C, mit einer Endextension bei 72 °C für 10 nun.
Die primären PCR-Reaktionen wurden 1000fach in sterilem destilliertem Wasser verdünnt. Ein aliqunter Teil von 1 μl von jeder der verdünnten Reaktionen wurde der sekundären Amplifikation in ähnlichen Reaktionsgemischen wie den zuvor verwendeten unterzogen, außer in Gegenwart von 0,2 μM CapFinder PCR-Primer und 0,4 μM Primer Nr. 5191 (5'-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3' (SEQ ID Nr. 18)) für 25 Zyklen desselben Temperaturprogramms. Ein Southern-Blot von aliquoten Teilen der sekundären PCR-Reaktionen, getrennt durch Agarosegelelektrophorese und mit ³²P-ATP-markierten outGDNF1 (Beispiel 1B, oben) sondiert, zeigte mehrere Bänder mit einer Länge von 600 bis 1.100 bp. PCR-Produkte in diesem Größenbereich wurden durch Agarosegelelektrophorese gereinigt, die DNA gewonnen und zu pCR 2.1 (Invitrogen) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in ElectroMAX DH10B-Zellen (Gibco/BRL) elektroporiert und auf Platten mit LB-Agar + 50 μg/ml Ampicillin + 50 μg/ml Kanamycin plattiert. Nach der Übernachtinkubation bei 37 °C wurden durch Standardverfahren die Kolonien auf Nylon-Membranen planiert, die DNA denaturiert, neutralisiert und auf der Membran unter Einwirkung von UV-Licht vernetzt. Die Filter wur den mit einer markierten cDNA-Sonde hybridisiert (huGDNF aus Beispiel 1A, oben), und DNA wurde aus den Hybridisierungs-positiven Kolonien hergestellt und sequenziert. Die Sequenz einer solchen cDNA, abgeleitet von menschlicher fetaler Niere, wird nachstehend gezeigt.
Bei der obigen Sequenz werden die Nucleotide 585 bis 607 durch den Primer Nr. 5191 beigetragen, die Nucleotide 1 bis 97 (Exon II, siehe 1) und die Nucleotide 98 bis 146 sind homolog mit den Nucleotiden 5 bis 101 bzw. den Nucleotiden 673 bis 721 des PCR-Walking-Fragments von menschlicher genomischer DNA, beschrieben in Beispiel 1B, und die Nucleotide 98 bis 607 sind homolog mit den Nucleotiden 24 bis 611 in der cDNA-Sequenz, beschrieben in Beispiel 1A, mit einer 78-bp-Deletion zwischen deren Nucleotiden 122 bis 201.
B. Proximale Promotor-abgeleitete cDNA aus menschlichem fetalem Gehirn
5'-RACE wurde mit einem 5'-AmpliFINDER RACE Kit (Clontech Laboratories) unter Verwendung von zufällig geprimter menschlicher fetaler Gehirn-polyA⁺-RNA (Clontech Laboratories) und zwei Runden der PCR-Amplifikation unter Verwendung von ineinandergeschachtelten Gruppen von Primern durchgeführt. Die primäre PCR-Amplifikation wurde mit Ankerprimer (5'-CCT CTG AAG GTT CCA GAA TCG ATA G-3' (SEQ ID Nr. 20)) und genspezifischem Primer 1 (5'-GGT CAT CAT CAA AGG CGA TGG GT-3' (SEQ ID Nr. 16)) gemäß den vom Lieferanten vorgeschlagenen Bedingungen für 40 Zyklen unter Verwendung einer Annealingtemperatur von 54 °C durchgeführt. Nach 100facher Verdünnung in destilliertem Wasser wurde 1 μl des verdünnten primären PCR-Produktes weiter für 30 Zy klen mit Primer Nr. 3442 (5'-GGA ACC TCG AGA ATC GAT AGT GAA TTC GTG-3' (SEQ ID Nr. 21)) und entweder genspezifischem Primer 2 (5'-TCG TAC GTT GTC TCA GCT GCA TC-3' (SEQ ID Nr. 22)) oder genspezifischem Primer 3 (5'-ACC TTT TCC TCT GGA ATT CTC TG-3' (SEQ ID Nr. 23)) PCR-amplifiziert. PCR-Bedingungen waren ähnlich der primären PCR-Amplifikation, außer daß eine Annealingtemperatur von 57 °C verwendet wurde. Amplifizierte PCR-Produkte wurden in dem Vektor pCR2.1 (Invitrogen) geklont und sequenziert. Ein Produkt aus der sekundären Amplifikation mit Primer Nr. 3442 und genspezifischem Primer 2 wird nachstehend gezeigt.
Bei der obigen Sequenz werden die Nucleotide 1 bis 30 und 513 bis 535 durch Primer Nr. 3442 bzw. genspezifischen Primer 2 beigetragen, sind die Nucleotide 33 bis 166 homolog mit den Nucleotiden 588 bis 721 des PCR-Walking-Fragments der menschlichen genomischen DNA, beschrieben in Beispiel 1B, und sind die Nucleotide 118 bis 535 homolog mit den Nucleotiden 24 bis 519 in der cDNA-Sequenz von Beispiel 1A, mit einer 78-bp-Deletion zwischen den Nucleotiden 122 bis 201.
C. Sequenz des proximalen Promotors
Die Sequenz des PCR-Walking-Fragments von menschlicher genomischer DNA, beschrieben in Beispiel 1B, wurde unter Verwendung des Plasmids pRBSEco9.4#8 als Matrize verlängert, um die Promotorsequenz des proximalen Promotors zu erhalten, gezeigt in den 4A bis 4C (SEQ ID Nr. 2).
Die Positionen +6 und +67 in der Sequenz, gezeigt in 4B, scheinen in verschiedenen genomischen DNAs variabel zu sein; Position +6 kann entweder A oder G sein, und Position +67 kann entweder T oder C sein.
Beispiel 5
Konstruktion eines Luciferase-Reporterplasmids, enthaltend sowohl menschliche distale als auch proximale GDNF-Promotoren
Ein Reportergenplasmid, enthaltend die menschlichen proximalen und distalen GDNF-Promotoren und die Gen-kodierende Luciferase, die funktionell damit gekoppelt ist, wurde gemäß der Strategie hergestellt, die in den 6A bis 6B angegeben ist. Die proximalen und distalen GDNF-Promotoren, die innerhalb des Plasmids pRBSEco9.4#8 enthalten sind, wurden in zwei Schritten in die einmaligen EcoRI- und HindIII-Stellen des pGL3-Basic-Reporterplasmidderivats, pGDNF-1635, bewegt. Das Verfahren wird zunächst kurz beschrieben, gefolgt von einer ausführlicheren Beschreibung.
Zunächst wurde die Region zwischen den Nucleotides –10 und +705 in der proximalen Promotorsequenz, gezeigt in den 4A bis 4C, durch PCR modifiziert, um die Translationsinitiationsstelle bei bp 696 bis 698 zu entfernen. Das PCR-Produkt wurde dann in Plasmid pKS bluescript II geklont. Das Insert wurde aus einem Klon entfernt, unter Nutzung des Vorteils einer benachbarten HindII-Stelle in dem Polylinker des Plasmids sowie der einmaligen EcoRV-Stelle innerhalb des Inserts. Das HindIII- bis EcoRV-Insertfragment wurde dann in EcoRV- und HindIII-gespaltenes pRBSEco9.4#8 geklont, wodurch das Plasmid pRBSEco9.4proxmod erhalten wurde. Das Insert aus Plasmid pRBSEco9.4proxmod wurde durch Spaltung an den einmaligen EcoRI- und HindIII-Stellen entfernt und in EcoRI- und HindIII-gespaltenes pGDNF-1635 geklont, hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben, wodurch das Plasmid pGDNFprox+dist erhalten wurde.
Die Translationsinitiationsstelle in Exon III wurde durch PCR mit dem Primer Nr. 5361 (5'-CCA GAT ATC CCA TAC AGG CCA A-3' (SEQ ID Nr. 25)) und 5363 (5'-ATA ACT AGA TCT TAA AGT CCC GTC C-3' (SEQ ID Nr. 26)) modifiziert. PCR-Reaktionen enthielten 0,2 mM dNTPs, 0,4 M jedes Primers Nr. 5361 und 5363, 70 U/ml Expand DNA-Polymerase und eine 1 × Konzentration des rechtlich geschützten Puffers, der durch den Lie feranten der Polymerase (Boehringer/Mannheim) bereitgestellt wurde. Die DNA-Matrize für die Amplifikation betrug 0,1 ng Plasmid pRBSEco9.4#8. Reaktionen von jeweils 50 μl wurden mit Mineralöl überlagert, anfänglich bei 94 °C für 3 min denaturiert und 5 mal unter Denaturierung für 1 min bei 94 °C, Annealing für 1 min bei 42 °C und Primerextension für 1 min bei 72 °C zyklisiert, gefolgt von weiteren 30 Zyklen mit ähnlichen Zeiten und Temperaturen, außer daß die Annealingtemperatur auf 53 °C erhöht wurde, und mit einer Endextension bei 72 °C für weitere 10 min beendet. Elektrophorese eines aliquoten Teils aus der PCR-Reaktion zeigte das erwartete Produkt von etwa 700 bp. Nach der Reinigung des PCR-Produktes (Promega MagicPrep) wurde es in EcoRV-gespaltenes Plasmid pBluescript II KS geklont. Das etwa 700-bp-Insert aus einem resultierenden Plasmid wurde durch Digestion mit EcoRV und HindIII freigesetzt und das Insert gelgereinigt. Dies wurde in pRBSEco9.4#8 geklont, das mit EcoRV und HindIII gespalten worden war. Nach der Selektion auf Kanamycin-enthaltenden Platten und Screenen hinsichtlich der Gegenwart einer zusätzlichen BglII-Stelle, die in das Plasmid via PCR eingeführt wurde, wurde ein resultierendes Produktplasmid, p.Eco9.4proxmod, hinsichtlich des Sequenzierens und weiterer Manipulation ausgewählt.
Plasmid pEco9.4proxmod wurde mit EcoRI und HindIII gespalten, um das Insert von etwa 6,8 kb freizusetzen. Dies wurde ohne Gelreinigung des Fragments in EcoRI und HindIII-gespaltenem pGDNF-1635 ligiert (dieses pGL3-Basic-Derivat wurde verwendet, da eine einmalige EcoRI-Stelle, direkt im Inneren des stromaufwärts Polylinkersegments, während seiner Konstruktion eingeführt worden war). Transformanten wurden auf Ampicillinenthaltenden Platten selektiert. Ein Plasmid, pGDNFprox+dist, mit dem gewünschten Insert wurde zur weiteren Arbeit verwendet.
Beispiel 6
Konstruktion eines Luciferase-Reporterplasmids enthaltend den menschlichen proximalen GDNF-Promotor
Beseitigung von stromaufwärts Teilen der Promotoren in pGDNFprox+dist führte zu Reporterplasmiden mit den proximalen (d. h. medialen und proximalen) Promotoren allein, was die Expression von Luciferase antreibt. Dies wurde erreicht durch Spaltung von pGDNFprox+dist mit Restriktionsendonuclease MluI und Religation des restlichen Plasmids, wodurch pGDNFprox Mlu erhalten wurde. Weitere Deletionen werden durch Spaltung dieses Plasmids (oder pGDNFprox+dist) mit MluI und einem anderen Restriktionsenzym, das in dem proximalen Promotor, aber nicht im Rest des Plasmids spaltet, durchgeführt. Beispielsweise erzeugt die Spaltung mit MluI, gefolgt von der Spaltung mit NruI, die Umwandlung zu glatten Enden mit Klenow-Fragment plus dNTPs, und eine anschließende Religation erzeugt pGDNFprox Nru.
Beispiel 7
Ergebnisse der Umkehrtranskriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
RT-PCR wurde auf verschiedenen RNA-Präparaten unter Verwendung eines gemeinsamen stromabwärts Primers und von stromaufwärts Primern durchgeführt, die spezifisch für die distalen, medialen und proximalen GDNF-Transkripte sind, um die relative Häufigkeit der drei Transkripte in menschlichen Geweben oder U-87-MG-Zellen zu bestimmen. Der distale Primer, 5'-CCC AGG ATT GCG AAC TCT TGC-3' (SEQ ID Nr. 27) war identisch mit den Nucleotiden 35 bis 55 der Sequenz, die in Beispiel 1E gezeigt ist. Der mediale Primer, 5'-TCT CCA AGT CCC TGC TAA CTT CT-3' (SEQ ID Nr. 28) war identisch mit den Nucleotiden 16 bis 38 der Sequenz, die in Beispiel 4A gezeigt ist. Der proximale Primer, 5'-CGT GCA TTC TGC GGT TCT-3' (SEQ ID Nr. 29) war identisch mit den Nucleotiden 72 bis 89 der Sequenz, die in Beispiel 4E gezeigt ist. Der gemeinsame stromabwärts Primer, 5'-GAG CAG CAC CAG GCA GAC-3' (SEQ ID Nr. 30), wurde gewählt, um die Komplexität zu beseitigen, die aus dem alternativen Spleißen resultiert, das an der Exon II/Exon III-Verbindung stattfinden kann.
Die Gesamt-RNA wurde aus U-87-MG-Zellen hergestellt. U-87-MG-Zellen wuchsen zur Konfluenz in 8,5-cm-Schalen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Das Medium wurde dann zu OptiMEM (Gibco/BRL Nummer 31985), ergänzt mit 0,5 % Rinderserumalbumin, gewechselt und die Zellen für weitere 12 h in diesem Medium inkubiert, wonach 10 ng/ml IL-1^–, 10 nM Phorboldidecanoat, 50 ng/ml Grund-FGF, 1 mM Dibutyryl-cyclisches AMP, 1M Dexamethason, 10 ng/ml TNF^ oder keine Zugaben (Medien) durchgeführt wurden. Die Zellen wurden weitere 12 h inkubiert, und die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von RNA-zol^TM B gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX).
Um mögliche kontaminierende genomische DNA in den RNA-Proben zu beseitigen, wurden sie zunächst mit DNase I behandelt. Ein Mikrogramm polyA⁺-mRNA aus menschlicher fetaler Leber, adulter Leber, fetaler Niere, fetalem Gehirn, adultem Gehirn oder adultem Skelettmuskel (Clontech Laboratories) oder 3 μg Gesamt-RNA (U-87-MG-Zellen), wurde mit 1 Einheit DNase I (RQ1 RNase-freie DNase, Promega #M610A) bei 37 °C für 30 Minuten vorbehandelt, gefolgt von 20minütiger Wärmeinaktivierung bei 70 °C, vor der cDNA-Synthese des ersten Stranges. Erststrang-cDNA wurde entweder aus 3 μg Gesamt-RNA (U-87-MG-Zellen) oder 1 μg polyA ⁺RNA (menschliche Gewebe-RNAs) mit einem Gibco SuperScript^TM-Präamplifikationssystemkit (Gibco #18089011), wie vorgeschrieben, unter Verwendung von 50 ng zufälligen Primern synthetisiert. PCR wurde in 50 μl Reaktionsvolumen mit 0,2 mM dNTPs, 1 μM distalen, medialen, proximalen und gemeinsamen Primern, 1 μl cDNA als Matrize und 1 μl Advantage^TM KlenTaq-Polymerase-Mischung (Clontech #8417-1), in Gegenwart von Puffer, geliefert mit der Polymerase, durchgeführt. Positive Kontrollen wurden durch Substitution der 1-μl-cDNA-Matrize mit 1 μl, enthaltend entweder 0,1 Attomol, 0,01 Attomol oder 0,001 Attomol (1 Zeptomol = 1 × 10^–21 mol) von einer der distalen, medialen oder proximalen cDNAs (Beispiele 1E, 4A bzw. 4E), oder mit äquimolaren Mengen von jeder der obigen cDNAs bereitgestellt. Negative Kontrollen bestanden aus der Substitution der 1-μl-cDNA-Matrize mit 1 μl einer ähnlichen Reaktion, wo die Addition von Umkehrtranskriptase weggelassen wurde. Temperaturzyklusparameter bestanden aus anfänglicher Denaturierung bei 94 °C für 2 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung bei 94 °C für 30 Sekunden, Annealing bei 66 °C für 30 Sekunden und Extension bei 72 °C für 1 Minute, gefolgt von einer Endinkubation bei 72 °C für 10 Minuten. Zehn Mikroliter aliquote Teile der PCR-Reaktionen wurden auf 4 % NuSieve^® 3:1 Agarosegele in TBE-Puffer (FMC BioProducts #54906) aufgebracht und durch Elektrophorese getrennt.
Die Gele wurden visualisiert und mit Hilfe eines Transilluminators bei 302 nm fotografiert.
8A zeigt die Bewertungsergebnisse der RT-PCR. Spur 1 zeigt ein Band mit einer Größe, die mit dem vorhergesehenen 114 bp übereinstimmt, was das Ergebnis der Amplifikation von 0,1 Attomol des geklonten proximalen Transkripts aus Beispiel 4E mit einem Gemisch aus den Primern ist. Spur 2 zeigt ein Band, das mit dem vorhergesehenen 150-bp-Produkt übereinstimmt, was aus der Amplifikation von 0,1 Attomol des geklonten medialen Transkripts aus Beispiel 4A mit dem Primergemisch resultiert. Spur 3 zeigt ein Band, das eine mit dem vorhergesehenen 208-bp-Produkt übereinstimmt, was aus der Amplifikation von 0,1 Attomol des geklonten distalen Transkripts aus Beispiel 1E mit dem Primergemisch resultiert. Die Produktbänder in den Spuren 1, 2 und 3 sind von ungefähr gleicher Intensität, was darauf schließen läßt, daß die Amplifikation von jedem Produkt mit ähnlicher Wirksamkeit unter diesen Bedingungen stattfindet. Spur 4 zeigt, daß kein Produkt gefunden wurde, wenn keine Matrize zugegeben wurde. Spur 5 ist das Ergebnis der Amplifikation eines Gemisches aus 0,1 Attomol von jeder der proximalen, medialen und distalen Matrizen mit dem Primergemisch. Die Spuren 6 und 7 sind ähnlich der Spur 5, außer daß jede Matrize bei 0,01 Attomol (Spur 6) oder 0,001 Attomol (1 Zeptomol, Spur 7) vorlag. Die Spuren 5, 6 und 7 zeigen zusammengenommen, daß die Amplifikation von jedem Produkt mit ähnlicher Wirksamkeit stattfindet und daß die Empfindlichkeit des Assays 1 Zeptomol oder weniger für jede der drei Matrizen beträgt. Separate Experimente, wo 0,1 Attomol proximale Matrize in Gegenwart von nur medialen, distalen und gemeinsamen Primern zyklisiert wurde oder 0,1 Attomol der medialen Matrize in Gegenwart von nur proximalen, distalen und gemeinsamen Primern zyklisiert wurde oder 0,1 Attomol der distalen Matrize in Gegenwart von nur proximalen, medialen und gemeinsamen Primern zyklisiert wurde, zeigte keine Produkte, was eine Abwesenheit von Kreuzreaktivität zwischen unähnlichen Matrizen und Primern angibt (Ergebnisse nicht gezeigt).
8B zeigt die Ergebnisse von RT-PCR mit den proximalen, medialen und distalen Transkriptprimern auf RNA, isoliert aus U-87-MG-Zellen, nach verschiedenen Behandlungen. Spur 1 enthält die Produkte nach der Amplifikation von einem Gemisch aus 0,1 Attomol von jeder Matrize. Spur 4 zeigt die RT-PCR-Produkte aus der Amplifikation von RNA, isoliert aus U-87-MG-Zellen, in Gegenwart von Medien allein, während Spur 3 eine ähnliche Reaktion ist, außer daß Umkehrtranskriptase nicht zu der cDNA-Synthesereaktion hinzugefügt wurde (-RT-Kontrolle). Ungefähr gleiche Mengen an Produkten aus der distalen und proximalen Amplifikation wurden in Spur 4 gefunden, während Spur 3 keine Produkte zeigte, was angibt, daß die Bildung von Produkten von der Gegenwart von Umkehrtranskriptase abhängig ist. Die Spuren 5, 6, 7 und 8 zeigten, daß 12-h-Behandlung von U-87-MG-Zellen mit 10 ng/ml Interleukin-1^– (IL-1^–), 10 nM Phorboldidecanoat (PDD), 50 ng/ml basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) oder 1 mM Dibutyryl-cAMP (db-cAMP), Erhöhungen in bezug auf das Vehikel allein (Spur 4) der Menge von proximalen und distalen Transkripten von GDNF verursachte. In den Spuren 5 bis 8 ist der Anteil von proximalen und distalen Transkripten ungefähr äquivalent mit etwas mehr distalen als proximalen Produkten, die in jeder Spur offensichtlich sind. Spur 9 zeigt, daß 12-h-Behandlung von U-87-MG-Zellen mit 1 M Dexamethason die Menge an proximalen und distalen Transkripten von GDNF in bezug auf das Vehikel allein verringert. Schließlich zeigt Spur 10, daß 12-h-Behandlung von U-87-MG-Zellen mit 10 ng/ml Tumornekrosefaktor^ (TNF^) die Menge an proximalen und distalen Transkripten von GDNF in bezug auf das Vehikel allein erhöht. Daher sind sowohl proximale als auch distale Transkripte von GDNF, aber nicht das mediale Transkript, in U-87-MG-Zellen offensichtlich und die Mengen von diesen Transkripten kann durch Behandlung mit IL-1^–, PDD, bFGF, db-cAMP oder TNF^ erhöht werden, während Dexamethason die Transkripte verringert.
8C zeigt das Ergebnis von RT-PCR mit dem proximalen, medialen und distalen Primergemisch auf RNA, isoliert aus verschiedenen menschlichen Geweben. Die Spuren 3 bis 8, enthaltend die Produkte aus der Amplifikation von RNA aus fetaler Leber, adulter Leber, fetaler Niere, adultem Gehirn, fetalem Gehirn bzw. adultem Skelettmuskel, zeigen nur die Gegenwart des distalen Transkript-abgeleiteten Produkts. Fetale Niere (Spur 5) und adulter Skelettmuskel (Spur 8) zeigen eine ungefähr gleiche und die höchste Konzentration an Produkt, während fetales Gehirn (Spur 7), fetale Leber (Spur 3) und adulte Leber (Spur 4) progressiv weniger Produkt zeigen. Adultes Gehirn (Spur 6) zeigt ein noch detektierbares Produkt. Kontrollreaktionen, wo Umkehrtranskriptase aus der cDNA-Synthesereaktion weggelassen wurde, zeigten kein Produkt bei allen der obigen Gewebe (Ergebnisse nicht gezeigt). Daher enthalten im Gegensatz zu U-87-MG-Zellen diese Gewebe nur das distale Transkript von GDNF.
Die RT-PCR-Ergebnisse, die in 8A gezeigt sind, zeigen, daß dieser Assay für drei Transkripte von GDNF sowohl sensitiv als auch spezifisch ist. Die Ergebnisse aus 8B geben an, daß sowohl proximale als auch distale Transkripte in ungefähr gleichen Anteilen ohne weiteres in U-87-MG-Zellen, die auf unterschiedliche Weisen behandelt werden, detektiert werden. Jedoch detektierte RT-PCR von RNA, isoliert aus selektierten menschlichen Geweben, nahezu ausschließlich die Gegenwart des distalen Transkripts aufgrund der Aktivität des distalen Promotors. Es ist möglich, daß andere Transkripte in diesen menschlichen Geweben vorliegen, aber das distale Transkript liegt in weit höheren Konzentrationen vor, so daß es das einzige ist, das unter diesen Bedingungen der Amplifikation delektiert wurde. Außerdem können die U-87-MG-Zellen einen spezifischen Zelltyp oder eine Entwicklungsstufe darstellen, die in dieser eingeschränkten Probenentnahme von Geweben nicht vorliegen. Die hier dargestellten Ergebnisse lassen darauf schließen, daß der distale Promotor ein Hauptparameter der GDNF-Expression in vivo ist.
Daher wurden distaler und proximaler menschlicher GDNF-Promotor und Reportergenkonstrukte, umfassend ein, zwei oder drei Promotoren, offenbart. Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben wurden, ist es selbstverständlich, daß offensichtliche Änderungen ohne Abweichung vom Geist und Umfang der Erfindung, die durch die anhängenden Ansprüche definiert ist, gemacht werden können.
Biologisch reine Kulturen der E. coli-Transformante XLOLR/pRBSEco9.4#8, erhalten in Beispiel 1C, wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, am 15. Juli 1997, hinterlegt und erhielten die Hinterlegungsnummer 98498. Die Hinterlegung erfolgte gemäß den Bestimmung des Budapester Vertrags. Sollte es aufgrund von Routinesequenzierfehlern eine Abweichung zwischen der Sequenz, die in der vorliegenden Anmeldung dargestellt ist, und der Sequenz des Gens von Interesse in dem hinterlegten Plasmid geben, ist die Sequenz in dem hinterlegten Plasmid maßgeblich.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA, die eine Funktion als distaler Promoter des menschlichen Gliazellen-abgeleiteten neurotrophen Faktors (GDNF) aufweist und die Nucleotidsequenz, die in den Positionen –62 bis –1 oder –363 bis –1 oder –1635 bis –1 der 3A bis 3B (entsprechend jeweils den Nucleotiden 1575 bis 1636, 1274 bis 1636 oder 1 bis 1636 der SEQ-ID-Nr.: 1) dargestellt ist, umfaßt.
DNA nach Anspruch 1, die funktionell mit einem Reportergen gekoppelt ist.
DNA nach Anspruch 2, worin das Reportergen ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chloramphenikolacetyltransferase, β-Galactosidase, Luciferase, alkalischer Phosphatase, menschlichem Wachstumshormon und grünem fluoreszierenden Protein.
Vektor, umfassend eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Wirtszelle, umfassend einen Vektor nach Anspruch 4.
Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei die Wirtszelle GDNF exprimieren kann.
Wirtszelle nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert ist.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die die Expression eines menschlichen distalen Gliazellen-abgeleiteten neurotrophen Faktors (GDNF) modulieren kann, umfassend: (a) Einführen von DNA nach Anspruch 2 oder Anspruch 3 in eine Wirtszelle; (b) Mischen der Testverbindung mit der Wirtszelle und Kultivieren der Zellen unter Bedingungen, bei denen das Reportergen exprimiert werden kann; (c) Vergleichen des Grades des exprimierten Reportergenproduktes, das in Gegenwart bzw. in Abwesenheit der Testverbindung erzeugt wurde; wobei die Veränderung des Expressionsgrades des Reportergenproduktes angibt, daß die Testverbindung den GDNF-Expressionsgrad modulieren kann.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle ist, die GDNF exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Säugerzelle aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer U-87 MG-Zelle und einer SK-N-AS-Zelle.
Diagnostisches Testkit, umfassend ein Oligonucleotid, das DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 spezifisch hybridisieren kann.
Verwendung von DNA nach den Ansprüchen 2 oder 3 zur Identifizierung einer Verbindung, die die Expression eines menschlichen Gliazellen-abgeleiteten neurotrophen Faktors (GDNF) modulieren kann.