DE69734199T2

DE69734199T2 - Menschliches netrin-1

Info

Publication number: DE69734199T2
Application number: DE69734199T
Authority: DE
Inventors: Candace Swimmer; Anne Shyian; David Leonardo; Yuan Zhang; Timothy Kennedy; Tito Serafini; Marc Tessier-Lavigne
Original assignee: University of California; Exelixis Inc
Current assignee: University of California; Exelixis Inc
Priority date: 1996-04-19
Filing date: 1997-04-19
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2017-04-20
Also published as: AU706565B2; EP0904283A1; EP0904283A4; CA2250263C; DE69734199D1; ATE304549T1; EP0904283B1; CA2250263A1; WO1997040064A1; JP2000516443A; US6218526B1; US5824775A; AU2675297A

Description

EINFÜHRUNG
Gebiet der Erfindung
Das Gebiet dieser Erfindung sind die humanen Netrinproteine und -gene.
Hintergrund
Im sich entwickelnden Nervensystem reichen Axone über beträchtliche Entfernungen entlang stereotyper Bahnen hinweg, um ihre Ziele zu erreichen. Axonwachstum und -führung hängen teilweise von der Erkennung von Richtzeichen auf Zelloberflächen und der extrazellulären Matrix entlang dieser Bahnen ab. Die Identifizierung derartiger Nervenzellenwachstums- und -führungsrichtzeichen stellt den heiligen Gral der Neurobiologie dar. Bei ihnen handelt es sich um die Verbindungen, welche Neuronen mitteilen, wann sie wachsen sollen, wo sie wachsen sollen und wann das Wachstum einzustellen ist. Die medizinischen Anwendungen solcher Verbindungen sind enorm und schließen das Modulieren der regenerativen Fähigkeit des neuronalen Wachstums, das Behandeln neurodegenerativer Erkrankungen und das Kartieren (z. B. Diagnostizieren) genetischer neurologischer Defekte ein.
Über Jahrzehnte konzentrierter Forschungen berief man sich auf verschiedene Hypothesen, welche chemische Lock- und Abschreckstoffe, markierte Bahnen, Zelladhäsionsmoleküle etc. beinhalten, um die Führung zu erklären. Von Molekülen, wie N-CAM und N-Cadherin, wird berichtet, dass sie günstige Substrate für das Axonwachstum liefern, und bestimmte sensorische Axone können auf NGF- und NGF-ähnliche Faktoren ansprechen. Jüngste Berichte deuten auf das Vorhandensein diffundierbarer chemotroper Molekül(e) hin, welche das Muster und die Orientierung des kommissuralen Axonwachstums beeinflussen.
Relevante Literatur
Ishii et al. (1992) Neuron 9, 873–881, offenbaren ein von C. elegans abgeleitetes Gen, unc-6, welches eine Sequenzähnlichkeit mit den offenbarten Netrinen aufweist. Serafini et al. (1994) Cell 78, 409–424, und Kennedy et al. (1994) Cell 78, 425–435, Seite 5, Spalte 1, beschreiben verwandte Wirbeltier-Netrine. Über die Arbeit wurde auch in The New York Times, Teil B7, Dienstag, 16. August 1994, berichtet und sie wurde vor kurzem (19. Mai 1995) in Science 268, 971–973, beschrieben (siehe auch die dort zitierten Referenzen).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bezüglich eines humanen Netrinproteins und -gens bereit. Netrine sind eine Klasse von Proteinen, die natürlicherweise an der neuralen Axon-Führung beteiligt sind. Die vorliegenden Zusammensetzungen schließen Nukleinsäuren, welche das spezifizierte Netrinprotein codieren, und Hybridisierungssonden und Primer, die zur Hybridisierung mit dem spezifizierten Netringen fähig sind, ein. Die Netrinproteine finden spezielle Verwendung bei der Modulierung des neuralen Axon-Auswachsens. Die offenbarten Zusammensetzungen finden auch auf verschiedene Weise beim Screening chemischer Bibliotheken hinsichtlich Regulatoren von Axon-Auswachsen und -Orientierung, bei der genetischen Kartierung, als Sonden für Netringene, als diagnostische Reagenzien für genetische neurologische Erkrankungen und bei der Herstellung spezifischer zellulärer und tierischer Systeme für die Entwicklung einer Therapie bei neurologischen Erkrankungen Verwendung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bezüglich eines humanen Netrin-1-Proteins und -Gens bereit, einschließlich Verfahren und Zusammensetzungen zum Identifizieren, Reinigen, Charakterisieren und Herstellen der vorliegenden Proteine und zum Identifizieren, Charakterisieren, Klonieren, Exprimieren, Inhibieren der Expression und Amplifizieren der betreffenden Nukleinsäuren. Die vorliegenden Proteine können unvollständige Translate der offenbarten Netrin-cDNA-Sequenz oder Deletionsmutanten der entsprechenden konzeptionellen Translate sein, wobei die Translate oder Deletionsmutanten die hierin beschriebene Bindungsaktivität und Spezifität von humanem Netrin-1 besitzen. Die Netrine sind isoliert, teilweise rein oder rein und werden typischerweise rekombinant hergestellt. Ein "isoliertes" Protein wird zum Beispiel von wenigstens einem Teil des Materials nicht begleitet, mit welchem es in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist; wobei es im Allgemeinen mindestens etwa 0,5 Gew.-%, vorzugsweise mindestens etwa 2 Gew.-%, und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 10 Gew.-% des Gesamtproteins in einer gegebenen Probe ausmacht; und ein reines Protein macht mindestens etwa 50 Gew.-%, vorzugsweise mindestens etwa 90 Gew.-%, und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 99 Gew.-% des Gesamtproteins in einer gegebenen Probe aus. Es steht eine breite Vielfalt an molekularen und biochemischen Verfahren für die Erzeugung und Exprimierung der vorliegenden Zusammensetzungen zur Verfügung; siehe z. B. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Aktuelle Protokolle in der Molekularbiologie) (Hrsg.: Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) oder die ansonsten im Fachbereich bekannten.
Die offenbarten Netrinzusammensetzungen können verwendet werden, um für humanes Netrin-1 spezifische Antikörper zu erzeugen, um das/die Axon-Auswachsen oder -Führung in situ oder in vivo etc. zu modulieren. Für in-vivo-Anwendungen werden die Zusammensetzungen einer zurückgehaltenen physiologischen Flüssigkeit, wie Blut oder Synovialflüssigkeit, hinzugefügt. Für die ZNS-Verabreichung stehen eine Vielzahl an Techniken zur Förderung des Transfers des Therapeuktikums über die Blut-Hirn-Barriere zur Verfügung, einschließlich der Disruption durch Chirurgie oder Injektion, Arzneistoffen, welche vorübergehend den Adhäsionskontakt zwischen ZNS-Gefäß-Endothelzellen öffnen und Verbindungen, welche die Translokation durch solche Zellen erleichtern. Netrine können auch für die direkte Injektion oder Infusion, die topische, intratracheale/nasale Verabreichung, z. B. durch Aerosol, intraokular oder innerhalb/auf Implantaten, z. B. Fasern, z. B. Kollagen, osmotische Pumpen, Transplantate, welche geeignet transformierte Zellen etc. umfassen, verwendbar sein. Ein spezielles Verfahren der Verabreichung beinhaltet das Beschichten, Einbetten oder Derivatisieren von Fasern, wie Kollagenfasern, Proteinpolymeren etc. mit therapeutischen Proteinen. Andere nützliche Vorgehensweisen sind bei Otto et al. (1989), J. Neuroscience Research 22, 83–91, und Otto und Unsicker (1990), J. Neuroscience 10, 1912–1921, beschrieben.
Allgemein wird die verabreichte Menge empirisch ermittelt, typischerweise im Bereich von etwa 10 bis 1000 μg/kg des Rezipienten, und die Konzentration liegt allgemein im Bereich von etwa 50 bis 500 μg/ml in der verabreichten Dosis. Andere Additive können eingeschlossen werden, wie Stabilisatoren, Bakterizide etc., und liegen in den herkömmlichen Mengen vor.
Die Erfindung sieht Netrin-spezifische Binde-Agentien, einschließlich isolierte Bindungsziele, wie Membran-gebundene Netrinrezeptoren und Netrin-spezifische Antikörper, und Binde-Agentien, welche in Screens von natürlichen und synthetischen chemischen Bibliotheken identifiziert werden, und Verfahren zur Identifizierung und Herstellung solcher Agentien und deren Verwendung in der Diagnose, Therapie und pharmazeutischen Entwicklung vor. Allgemein zeigt sich die Netrin-Spezifität des Binde-Agens durch Bindungs-Gleichgewichtskonstanten. Solche Agentien sind zum selektiven Binden des spezifizierten Netrins, d. h. mit einer Gleichgewichtskonstante von mindestens etwa 10⁷ M^–1, vorzugsweise mindestens etwa 10⁸ M^–1, stärker bevorzugt mindestens etwa 10⁹ M^–1, fähig. Eine breite Vielzahl an zellbasierten und zellfreien Assays kann zum Nachweis der Netrin-spezifischen Bindung verwendet werden; bevorzugt sind schnelle in-vitro-, zellfreie Assays, wie das Vermitteln oder Inhibieren der Netrin-Zell/Protein-Bindung, Immunoassays etc.
Die Erfindung stellt auch Nukleinsäuren, welche die vorliegenden Proteine codieren, wobei die Nukleinsäuren ein Teil der Netrin-Expressionsvektoren sein können und in rekombinante Zellen zur Expression und zum Screening eingebunden werden können, transgene Tiere für funktionelle Studien (z. B. die Wirksamkeit von Kandidaten-Arzneistoffen für neurale Erkrankungen oder Verletzungen) etc. und Nukleinsäure-Hybridisierungssonden und Replikations-/Amplifikations-Primer mit einer offenbarten Netrin-cDNA-spezifischen Sequenz bereit. Die Hybridisierungssonden enthalten eine Sequenz, die gemeinsam mit dem entsprechenden Netringen ist oder zu diesem komplementär ist, welche ausreichend ist, um die Sonde zur spezifischen Hybridisierung an das entsprechende Netringen, und nur an das entsprechende Netringen, in Gegenwart anderer Netringene zu befähigen. Daher sind die vorliegenden Sonden und Primer in einzigartiger Weise für die offenbarte cDNA spezifisch. Hybridisierungssonden mit mehr als 100 fortlaufenden Basen von Netringensequenz sind allgemein dazu in der Lage, an die entsprechende Netrin-cDNA zu hybridisieren und bei einer reduzierten Endwaschungs-Stringenz von 0,2 × SSC (0,9 M Kochsalzlösung/0,09 M Natriumcitrat) und 0,1% SDS-Puffer bei einer Temperatur von 65°C gebunden zu bleiben.
Die vorliegenden Nukleinsäuren werden isoliert, was bedeutet, dass sie eine Sequenz umfassen, die mit einem Nukleotid verbunden ist, das verschieden von jenem ist, mit welchem es auf einem natürlichen Chromosom verbunden ist, und machen gewöhnlich mindestens etwa 0,5 Gew.-%, vorzugsweise mindestens etwa 2 Gew.-%, und stärker bevorzugt mindestens etwa 5 Gew.-% der in einer bestimmten Fraktion vorhandenen Gesamtnukleinsäure aus. Eine reine Nukleinsäure macht mindestens etwa 50 Gew.-%, vorzugsweise mindestens etwa 90 Gew.-%, und stärker bevorzugt mindestens etwa 95 Gew.-% der in einer bestimmten Fraktion vorhandenen Gesamtnukleinsäure aus. Die vorliegenden Nukleinsäuren finden eine breite Vielzahl an Anwendungen, einschließlich der Verwendung als translatierbare Transkripte, Hybridisierungssonden, PCR-Primer, therapeutische Nukleinsäuren etc; der Anwendung beim Nachweis des Vorhandenseins von Netringenen und Gentranskripten, z. B. die Anwendung als Allel-spezifische Oligonukleotid-(ASO)-Sonden zur Identifizierung von Wildtyp- und Mutanten-Netrinallelen in klinischen und Laborproben, beim Nachweisen oder Amplifizieren von andere Netrine codierenden Nukleinsäuren und bei Gentherapieanwendungen, z. B. Antisense-Oligonukleotide, die zur Inhibierung der intrazellulären Expression eines Netrin-Zieltranskripts fähig sind.
Die Erfindung stellt wirksame Verfahren zur Identifizierung pharmakologischer Mittel oder Leitverbindungen für Mittel bereit, die zur Nachahmung oder Modulierung der Netrinfunktion imstande sind (z. B. bioaktive Netrin-Deletionsmutanten und Netrinpeptide). Eine breite Vielzahl an Screens kann zur Anwendung kommen; zum Beispiel können zellbasierte Assays zum Überwachen der Netrinfunktion angewandt werden, und In-vitro-Bindungs-Assays können zur Identifizierung von Netrin-spezifischen Binde-Agentien angewandt werden. Kennedy et al. (1994) Cell 78, 425–435, beschreiben einen besonders zweckmäßigen COS-Zellen-basierten Netrin-Expressionsassay. Bevorzugte Verfahren sind für ein automatisiertes, kostengünstiges Screening mit hohem Durchsatz von natürlichen und synthetischen chemischen Bibliotheken hinsichtlich Leitverbindungen geeignet. Identifizierte Reagenzien finden in der pharmazeutischen In dustrie für Tier- und Menschenversuche Anwendung; zum Beispiel können die Reagenzien derivatisiert und erneut in In-vitro- und In-vivo-Assays gescreent werden, um die Aktivität zu optimieren und die Toxizität für die pharmazeutische Entwicklung zu minimieren.
BEISPIELE
Humanes Netrin 1 (SEQ ID Nr.: 2) und cDNA (SEQ ID Nr.: 1)
Wir isolierten Netrin 1- und 2-cDNAs von Hühnern, wie bei Serafini et al. (1974) Cell 78: 409–424, beschrieben. Auf Basis der Netrin-1- und -2-cDNA-Sequenzen von Hühnern entwarfen wir degenerierte Oligonukleotid-Primer und verwendeten diese Primer, um eine Maus-Netrin 1 codierende cDNA aus einer Mäuse-cDNA-Bibliothek zu amplifizieren. Wir isolierten dann eine humane Netrin-cDNA unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotid-Primern, die unter Verwendung von Aminosäuresequenzen als Richtlinie konstruiert wurden, die in Hühner- und Mäuse-Netrinsequenzen konserviert sind.
Das Ausgangsmaterial für PCR war 100 ng humane genomische DNA. Es wurden zwei Runden der PCR-Amplifikation verwendet. In der ersten Runde wurden das folgende Programm und die folgenden Bedingungen angewandt: 1. 94°C 30 s; 2. 50°C 45 s; 3. 72°C 1 Minute; 4. gehe zu 1, 30-mal; 5. 4°C; 6. Ende. In der zweiten Runde der PCR-Amplifikation wurden eine verschachtelte PCR und folgende Bedingungen und Programmierung verwendet: 1. 94°C 1 Minute; 2. 42°C 1 Minute; 3. Anstiege von 1°C alle 5 Sekunden bis 72°C; 4. 72°C während 3 Minuten; 5. gehe zu 1, 2-mal; 6. 94°C während 1 Minute; 7. 46°C während 1 Minute; 8. Anstiege von 1°C alle 6 Sekunden bis 72°C; 9. 72°C 2 Minuten; 10. gehe zu 6, 7-mal; 11. 94°C für 1 Minute; 12. 55°C für 1 Minute; 13. 72°C 2 Minuten; 14. gehe zu 11, 24-mal; 15. 94°C für 1 Minute; 16. 55°C für 1 Minute; 17. 72°C während 10 Minuten; 18. 4°C; 19. Ende. PCR-Produkte wurden subkloniert und einzelne Klone, die humaner Netrinsequenz entsprechende Inserts enthielten, wurden mit Hilfe eines Grunstein- und Hogness-Screens isoliert (Sambrook, 1989). ³²P wurde mit Hilfe von PCR mit einem Teil des Maus-Netrin-1-cDNA-Klons als Matrize in eine Sonde eingebaut. Die Endwaschung der Filter erfolgte bei einer reduzierten Stringenz von 1 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C (Sambrook et al., 1989). Dieser Screen isolierte einen humanen Netrin-cDNA-Klon von ungefähr 140 Basenpaaren. Dieses cDNA- Fragment wurde zur Isolierung einer längeren humanen Netrin-cDNA aus einer fötalen humanen Gehirn-cDNA-Bibliothek (Stratagene Kat.-Nr.: 936206) verwendet. Die ~140 Basenpaare große humane Netrin-cDNA-Sonde wurde als Matrize verwendet, und ³²P wurde in eine humane Netrin-cDNA-Sonde unter Anwendung von PCR eingebunden. 1 × 10⁶ Klone wurden bei hoher Stringenz gescreent (Sambrook et al., 1989), wobei eine einzelne, etwa 7 kb große Netrin-cDNA identifiziert wurde (HBC-1, hinterlegt bei der ATCC am 7. Juni 1995 als Plasmid HN-1, Hinterlegungsnummer 97204).
Durch Sequenzanalyse wurde bestimmt, dass ein EcoRI-Subklon des 7-kb-HBC-1-Klons einer Splice-Variante von humanem Netrin-1 entsprach. Die ersten 1086 Basenpaare der Sequenz zeigen eine hohe Homologie zu Mäuse-Netrin-1, und die restlichen 626 Basenpaare sind hoch divergent. Eine potenzielle Splice-Donor-Stelle wird an der Verbindungsstelle des Netrin und der divergenten Sequenz identifiziert. Ein Klon, der dem 3'-Ende von humanem Netrin-1 entspricht, wurde mit Hilfe von reverser Transkriptase und von PCR mit einem 5'-Primer an der Position 999 der humanen Sequenz und einem degenerierten 3'-Primer gegen die letzten 15 Basenpaare der Mäuse-Netrinsequenz isoliert. Drei zusätzliche unabhängige Klone wurden isoliert, um die Sequenz des PCR-Reaktionsprodukts zu bestätigen. Die Region der Überlappung zwischen diesem neuen Klon und dem HBC-1 Eco-Klon beläuft sich auf 46 Basenpaare und besitzt eine identische Sequenz. Um die Überlappung zu verifizieren, wurde ein zusätzlicher Klon mit Hilfe eines 5'-Primers an der Position 818 und eines 3'-Primers an der Position 1582 der humanen Netrin-1-Sequenz isoliert. Zwei unabhängige Klone, die unter Verwendung dieser Primer isoliert wurden, bestätigen die Struktur der cDNA. Schließlich wurde die Sequenz, welche die C-terminalen 5 Aminosäuren codiert, bestätigt. Ein Primer wurde gegen eine Region innerhalb der untranslatierten 3'-Region entworfen, die zwischen Hühner- und Mäuse-Netrin-1 konserviert ist. Ein PCR-Produkt wurde mit Hilfe dieses Primers und eines 5'-Primers in der humanen Sequenz an der Position 1568 erzeugt, und die Sequenz wurde bestätigt.
Die RT-PCR-Prozeduren waren folgende: fötale Hirn-RNA (19–23 Wochen) wurde von Clontech erhalten. RT-PCR wurde mit Hilfe des "GeneAmp-Thermostable-rTth-Reverse-Transcriptase-RNA-PCR"-Kits von Perkin Elmer durchgeführt. Eine Warmstarttechnik wurde angewandt, um die RNA durch Mischen von 50 ng mit 30 pmol degene riertem Primer deg-1, 1 μl 10 × rTth-Reverse-Transkriptase-Puffer (Perkin Elmer) und Wasser in einem Gesamtvolumen von 7,2 μl zu denaturieren; diese Mischung wurde 2 Minuten lang auf 95°C erwärmt, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation bei 70°C. Die Reaktion wurde auf 60°C gekühlt und die reverse Transkription wurde durch Hinzufügen einer Mischung, die 1 μl 10 mM MnCl₂, 1 μl rTth-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, 2,5 U) und 0,2 μl jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP enthielt, begonnen. Die 60°C-Inkubation wurde 5 Minuten fortgesetzt, gefolgt von zwei 5-minütigen Inkubationen bei 65°C und 70°C. Die Reaktion wurde dann auf Eis gekühlt.
Um das humane Netrin-1-Fragment durch PCR zu amplifizieren, wurde eine Mischung, die 2 μl DMSO, 3 μl 25 mM MgCl₂, 4 μl 10 ×-Chelatisierungspuffer (Perkin Elmer) und 34,5 μl Wasser enthielt, der reversen Transkriptionsreaktion zugegeben. 30 pmol eines für humanes Netrin spezifischen Primers, h-net-5'999, wurden der Mischung zugegeben (0,5 μl) und PCR wurde in einem MJ Research PTC-200-Pettier-Thermocycler unter Verwendung des "berechneten" Temperatursteuerungsverfahrens und der folgenden Bedingungen durchgeführt: 1) 95°C während 2 Minuten; 2) 55°C während 25 Sekunden; 3) 95°C während 10 Sekunden; 4) Wiederholung der Schritte 2–3, 34-mal; 5) 60°C während 7 Minuten; und 6) Halten bei 4°C.
Die Reaktion wurde durch Gel-Elektrophorese analysiert und auf eine Nylon-Membran übertragen. Netrin-spezifische Produkte wurden durch Southern-Hybridisierung mit Hilfe einer Maus-Netrin-Sonde, entsprechend der Sequenz von Position 1342 bis Position 1875 von Maus-Netrin, nachgewiesen. Ein Agarose-Pfropfen, entsprechend dem kreuzhybridisierenden Fragment (das bei ungefähr 850 bp wandert), wurde mit einer Pasteur-Pipette extrahiert und wie folgt erneut amplifiziert: der Agarose-Pfropfen wurde mit einer Reaktionsmischung, die 1,25 μl Formamid, 5 μl 10 ×-PCR-Puffer II (Perkin Elmer), 5 μl 25 mM MgCl₂, 30 pmol für humanes Netrin spezifischen Primer h-net-5'999, 30 pmol degenerierten Netrin-Primer deg-1, 5 U AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) und steriles Wasser in einem Gesamtvolumen von 49 μl enthielt, vereinigt. PCR wurde in einem MJ Research PTC-200-Peltier-Thermocycler unter Anwendung des "Block"-Temperatursteuerungsverfahrens und der folgenden Bedingungen durchgeführt: 1) 95°C während 2 Minuten; 2) 50°C während 1 Minute; 3) 75°C während 1 Minu te, 30 Sekunden; 4) 95°C während 20 Sekunden; 5) Wiederholung der Schritte 2–4, 39-mal; 6) 75°C während 10 Minuten; und 7) Halten bei 4°C.
Die Reaktion wurde durch Gel-Elektrophorese analysiert und eine DNA-Bande bei ungefähr 850 bp wurde mit Hilfe des "Prep-A-Gene"-Systems von BioRad gereinigt, mit dem TA-Klonierungsvektor (InVitroGen) ligiert und in kompetente DH5α-Bakterienzellen transformiert. Kolonien wurden auf ein Insert der korrekten Größe durch Kolonie-PCR getestet, die über Nacht bei 37°C in LB-Medien, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, gezüchtet, und DNA wurde aus der Kultur unter Verwendung einer Tip-100-Säule von Qiagen präpariert. Die Inserts wurden durch Restriktionsverdau bestätigt und die Sequenz wurde mit Hilfe eines automatischen ABI 377-Sequenzierers erstellt.
Um die letzten 15 Nukleotide des humanen Netrin-1-Klons nachzuweisen, wurde das 3'-Ende des Klons von Erststrang-cDNA unter Verwendung eines 5'-Primers gegen bekannte Sequenz und eines 3'-Primers gegen Sequenz in der untranslatierten 3'-Region des Mäuse-Netrin-1-Klons amplifiziert. Zuerst wurde cDNA, wie in "Rapid Amplification of cDNA Ends" (Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden) von Michael Frohman (in: PCR Primer: A Laboratory Manual, Hrsg.: C. W. Dieffenbach und G. S. Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) beschrieben, unter Verwendung des im Abschnitt "3'-End cDNA Amplification" (S. 388–389) beschriebenen Protokolls und von 1 μg fötaler Hirn-PolyA⁺-RNA (Clontech) synthetisiert. 1 μl der verdünnten cDNA wurde in einer 50-μl-Reaktion amplifiziert, die 67 mM Tris HCl, pH-Wert 9,0, 6,7 mM Magnesiumchlorid, 16,6 mM Ammoniumsulfat, 0,17 mg/ml BSA, 10% DMSO, 1,5 mM jedes dNTP, 30 pmol 5'-Primer "h-net 5'1449" und 30 pmol 3'-Primer "m-net 3' UT 2238" enthielt. Der Primer "h-net 5'1449" entspricht der Sequenz, die an der Position 1449 im humanen Netrin-1-Klon beginnt. Der Primer "m-net 3' UT 2238" entspricht der Sequenz in der untranslatierten 3'-Region von Mäuse-Netrin-1, unter Hinzufügung einer XbaI-Restriktionsstellensequenz am 5'-Ende. Taq-DNA-Polymerase, 1 μl, (Perkin Elmer) wurde mit 0,5 μl TaqStart-Antikörper (ClonTech) und 2,5 μl TaqStart-Antikörper-Verdünnungspuffer vereinigt, bei Raumtemperatur 10 Minuten lang inkubiert und zu der PCR-Reaktionsmischung zugegeben. Die Reaktion wurde in einem MJ Research PTC-200-Peltier-Thermocycler unter Verwendung des "berechneten" Temperatursteuerungsverfahrens und der folgenden Bedingungen durchgeführt: 1) 95°C während 2 Minuten; 2) 62°C während 30 Sekunden; 3) 57°C während 30 Sekunden; 4) 52°C während 10 Sekunden; 5) 72°C während 40 Minuten; 6) 94°C während 10 Sekunden; 7) 62°C während 1 Minute; 8) 72°C während 3 Minuten; 9) Wiederholung der Schritte 6–8, 4-mal; 10) 94°C während 10 Sekunden; 11) 57°C während 1 Minute; 12) 72°C während 3 Minuten; 13) Wiederholung der Schritte 10–12, 4-mal; 14) 94°C während 10 Sekunden; 15) 52°C während 1 Minute; 16) 72°C während 3 Minuten; 17) Wiederholung der Schritte 14–16, 24-mal; 18) 75°C während 10 Minuten; 19) bei 4°C Halten.
Die Reaktion wurde 1:20 in TE verdünnt, und 1 μl wurde in einer 50-μl-Reaktion, die 67 mM Tris HCl, pH-Wert 9,0, 6,7 mM Magnesiumchlorid, 16,6 mM Ammoniumsulfat, 0,17 mg/ml BSA, 10% DMSO, 1,5 mM von jedem dNTP, 30 pmol des 5'-Primers "h-net 5'1702", 30 pmol des 3'-Primers "m-net 3' UT 2238" und 0,25 μl Taq-DNA-Polymerase enthielt, erneut amplifiziert. Der Primer "m-net 5' 1702" entspricht der Sequenz, die an der Position 1568 im humanen Netrin-1-Klon beginnt. Die Reaktion wurde in einem MJ Research PTC-200 Peltier-Thermocycler unter Verwendung des "berechneten" Temperatursteuerverfahrens und der folgenden Bedingungen durchgeführt: 1) 95°C für 2 Minuten; 2) 94°C für 10 Sekunden; 3) 58°C für 1 Minute; 4) 72°C für 3 Minuten; 5) Wiederholung der Schritte 2–4, 4-mal; 6) 94°C für 10 Sekunden; 7) 54°C für 45 Sekunden; 8) 72°C für 3 Minuten; 9) Wiederholung der Schritte 6–8, 4-mal; 10) 94°C für 10 Sekunden; 11) 50°C für 30 Sekunden; 12) 72°C für 3 Minuten; 13) Wiederholung der Schritte 10–12, 24-mal; 14) 75°C für 5 Minuten; und 15) Halten bei 4°C.
Die Reaktion wurde durch Gel-Elektrophorese analysiert und ein Produkt von 530 bp wurde aus dem Gel mit Hilfe des Prep-A-Gene-Systems (BioRad) isoliert. Das Produkt wurde in pCR 2.1 (InVitroGen) über Nacht bei 14°C ligiert. Transformanten wurden über Nacht in LB-Medien, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, gezüchtet und DNA wurde aus Kulturen unter Verwendung von "Easy Pure Plasmid Preps" (Super Mini, Primm Labs) gereinigt. Die DNA-Sequenz wurde mit Hilfe eines automatischen ABI 377-Sequenzierers erstellt.
Um die Sequenz des 3'-Endes zu bestätigen, wurden zwei zusätzliche Fragmente, die das 3'-Ende des humanen Netrins überspannen, durch PCR unter Verwendung des Primers m-net 5' 1702 und eines 3'-Primers, h-net 3' 1959, entsprechend der Sequenz in der untranslatierten 3'-Region von humanem Netrin-1, erzeugt. Die Amplifikation mit diesen Primern erzeugte Produkte von ungefähr 390 Basenpaaren in Duplikat-Reaktionen. Die Fragmente wurden in einem MJ Research PTC-200-Pettier-Thermocycler unter Verwendung des "berechneten" Temperatursteuerungsverfahrens und der folgenden Bedingungen durchgeführt: 1) 95°C während 2 Minuten; 2) 94°C während 10 Sekunden; 3) 58°C während 1 Minute; 4) 72°C für 3 Minuten; 5) Wiederholung der Schritte 2–4, 4-mal; 6) 94°C für 10 Sekunden; 7) 54°C für 45 Sekunden; 8) 72°C für 3 Minuten; 9) Wiederholung der Schritte 6–8, 4-mal; 10) 94°C für 10 Sekunden; 11) 50°C für 30 Sekunden; 12) 72°C für 3 Minuten; 13) Wiederholung der Schritte 10–12, 19-mal; 14) 75°C für 5 Minuten; und 15) Halten bei 4°C. Die Reaktionen wurden durch Gel-Elektrophorese analysiert, um ihre Größe zu bestätigen, und direkt unter Verwendung eines automatischen ABT 377-Sequenzierers sequenziert.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes Netrin, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr.: 2.
Isolierte Nukleinsäure, codierend ein Netrin gemäß Anspruch 1.
Isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 2, welche die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr.: 1 aufweist.
Isolierte Hybridisierungssonde mit Komplementarität zu einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 3, welche ausreicht, um mit der Nukleinsäure in Gegenwart von anderen Netringenen spezifisch zu hybridisieren.
Isolierte Hybridisierungssonde, umfassend mehr als 100 fortlaufende Basen von SEQ ID Nr.: 1.
Verfahren zur Modulierung des Wachstums, der Differenzierung oder der Morphologie eines Neurons, wobei das Verfahren das Kontaktieren des Neurons in vitro mit einem Netrin gemäß Anspruch 1 umfasst.
Verfahren zur Modulierung des Wachstums, der Differenzierung oder der Morphologie eines Neurons, wobei das Verfahren das Kontaktieren des Neurons in vitro mit einer Sonde gemäß Anspruch 4 unter Bedingungen umfasst, unter denen die Sonde mit einem endogenen humanen Netrin-codieren Gen oder Transkript in dem Neuron hybridisiert.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines humanen Netringens in einer eine Nukleinsäure umfassenden Probe, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Probe mit einer Sonde gemäß Anspruch 4 und das Nachweisen des Vorliegens von spezifischer Hybridisierung der Sonde an die Nukleinsäure umfasst.
Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart eines humanen Netrins mit der Aminosäure-Sequenz von SEQ ID Nr.: 2 in einer Probe, wobei das Verfahren das Kontaktieren der Probe mit einem Mittel, welches spezifisch das Netrin bindet, und das Nachweisen des Vorliegens der spezifischen Bindung des Mittels an das Netrin umfasst.
Verfahren zum Screenen nach Kandidaten-Arzneimitteln, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: das Kontaktieren eines prospektiven Mittels mit einer Mischung, umfassend ein Netrin gemäß Anspruch 1 und ein Netrin-Bindungs-Ziel, unter Bedingungen, bei welchen, außer bei Vorliegen des prospektiven Mittels, das Netrin und das Netrin-Bindungs-Ziel eine erste Assoziation aufweisen; das Nachweisen einer zweiten Assoziation zwischen dem Netrin und dem Netrin-Bindungs-Ziel; das Vergleichen der ersten und der zweiten Assoziation; wobei ein Unterschied zwischen der ersten und der zweiten Assoziation das prospektive Mittel als eine pharmazeutische Lead- bzw. Leitverbindung identifiziert, welche die Wechselwirkung des Netrins und des Netrin-Bindungs-Ziels moduliert.
Netrin gemäß Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren zur Modulierung des Wachstums, der Differenzierung oder der Morphologie eines Neurons, wobei das Verfahren das Kontaktieren des Neurons mit dem Netrin in vivo umfasst.
Sonde gemäß Anspruch 4 zur Verwendung in einem Verfahren zur Modulierung des Wachstums, der Differenzierung oder der Morphologie eines Neurons, wobei das Verfahren das Kontaktieren des Neurons in vivo mit der Sonde unter Bedingungen umfasst, unter denen die Sonde mit einem endogenen humanen Netrin-codieren Gen oder Transkript in dem Neuron hybridisiert.