CN108118085A - 重组酶链置换活性检测方法及试剂盒 - Google Patents

重组酶链置换活性检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组酶链置换活性检测方法，包括：制备链置换反应体系并进行链置换反应以生成链置换复合体，所述反应体系包括待测重组酶，单链DNA分子，双链DNA片段，ATP或ATP类似物，以及适宜所述待测重组酶发挥活性的缓冲液，所述单链DNA分子上包含第一序列，所述第一序列与双链DNA片段上部分序列同源互补；终止链置换反应，分离提纯所述链置换复合体；分离去除链置换复合体中的单链DNA分子以获得分离产物，检测分离产物，确定重组酶的链置换活性。本发明还公开了一种重组酶链置换活性检测试剂盒。本发明的重组酶链置换活性检测方法操作简单、对仪器要求低，不会对环境造成污染。

Description

重组酶链置换活性检测方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种重组酶链置换活性检测方法及试剂盒。
背景技术
重组酶是一类蛋白质酶，它可以结合单链DNA分子并能入侵其同源的双链DNA片段，使单链DNA分子与双链DNA片段在同源区域互补结合，形成稳定复合物结构。重组酶参与DNA修复和紫外线诱导的突变，在生物体中是不可缺少的。
目前对重组酶链置换活性的检测方法常见的有：例如采用同位素标记单链M13噬菌体或Phi x174噬菌体，同位素标记的方法虽然简便灵敏度高，但该方法的试剂成本高，一般的科研机构和企业单位都无法开展。此外，文献报道采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测重组酶的链置换活性，当发生同源重组时，单链DNA会将同源的双链DNA的一条链完全置换下来，产生具有缺口的环状DNA产物，可以在单链DNA琼脂糖电泳图上方发现该链置换的产物，但采用该方法的噬菌体DNA的长度基本都在5000bp以上，产生完全链置换的产物对体系的要求较高，产生足够的产物才能检测到，这就需要反复地调节体系。
因此，需要一种对体系要求低，检测成本低的重组酶链置换活性检测方法及试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组酶链置换活性检测方法及试剂盒、旨在解决现有技术中重组酶链置换活性检测对反应体系要求高，成本高的问题。
为了实现发明目的，本发明提供了一种重组酶链置换活性检测方法，包括以下步骤：
A、制备链置换反应体系并进行链置换反应以生成链置换复合体，所述反应体系包括待测重组酶，单链DNA分子，双链DNA片段，ATP或ATP类似物，以及适宜所述待测重组酶发挥活性的缓冲液，所述单链DNA分子上包含第一序列，所述第一序列与双链DNA片段上部分序列同源互补；
B、终止链置换反应，分离提纯所述链置换复合体；
C、分离去除链置换复合体中的单链DNA分子以获得分离产物，检测分离产物，确定重组酶的链置换活性。
优选的，所述单链DNA分子的3’末端固定在磁珠上。
优选的，检测所述分离产物中含有双链DNA结构，确定重组酶具有链置换活性。
优选的，所述待测重组酶为RecA或uvsX。
优选的，所述第一序列的长度为16bp至100bp。
优选的，步骤B结束后，还包括以下步骤：热处理所述链置换复合体，所述热处理的步骤为将链置换复合体置于65至80℃条件下孵育5至20分钟。
优选的，步骤C中用于检测分离产物的方法为：电泳法，荧光检测法，紫外吸光值检测方法以及荧光染料法中的任意一种方法。
优选的，所述链置换反应体系中还包括单链结合蛋白。
本发明还提供了一种重组酶链置换活性检测试剂盒，包括单链DNA分子，双链DNA片段；所述单链DNA分子上包含第一序列，所述第一序列与双链DNA片段上部分序列同源互补。
优选的，所述单链DNA分子上与双链DNA片段同源互补的序列长度为16bp至100bp。
单链DNA分子能够在具有链置换活性的重组酶的作用下，入侵与其具有同源互补序列的双链DNA片段并获得链置换复合体，重组酶失活或变性后，单链DNA分子脱落后从而重新获得双链DNA片段，因此，本发明通过检测到双链DNA片段，即可表明待测重组酶具有链置换活性。本发明的重组酶链置换活性检测方法操作简单、对仪器要求低，不会对环境造成污染。
附图说明
图1是本发明第一实施例重组酶链置换活性检测示意图。
图2是本发明第三实施例分离产物Page胶电泳检测图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明第一实施例，提出了一种重组酶链置换活性检测方法，包括以下步骤：
A、制备链置换反应体系并进行链置换反应以生成链置换复合体，所述反应体系包括待测重组酶，单链DNA分子，双链DNA片段，ATP或ATP类似物，以及适宜所述待测重组酶发挥活性的缓冲液，所述单链DNA分子上包含第一序列，所述第一序列与双链DNA片段上部分序列同源互补；
B、终止链置换反应，分离提纯所述链置换复合体；
C、分离去除链置换复合体中的单链DNA分子以获得分离产物，检测分离产物，确定重组酶的链置换活性。
重组酶具有单链DNA结合活性，当体系中存在与单链DNA分子具有同源互补的靶序列的双链DNA片段时，在ATP或ATP类似物提供能量的情况下，具有链置换活性的重组酶可以与单链DNA分子结合形成稳定的复合体，复合体寻找并入侵与单链DNA分子序列同源互补的双链DNA区域，在重组酶的作用下，发生链置换反应。本发明中，由于单链DNA分子上包含与部分双链DNA片段同源互补的序列，因此，在双链DNA片段上，发生部分链置换反应。
如图1所示，在具备链置换活性的重组酶1的作用下，单链DNA分子2入侵部分双链DNA片段3发生链置换反应，形成链置换复合体4；提纯链置换复合体4，并对其进行处理使重组酶变性或失活，可以使单链DNA分子2脱落，从体系中分离出单链DNA分子2后，得到分离产物；检测分离产物，其中含有双链DNA结构，则确定待测重组酶具有链置换活性；分离产物中不含双链DNA结构，则确定待测重组酶不具有链置换活性。
优选的，所述单链DNA分子3’末端包含生物素标记，并通过生物素标记固定在包含链霉亲和素的磁珠上。本方案使得在步骤B的操作过程中，可以通过分离磁珠的方法很方便的将固定在磁珠上的链置换复合体提纯出来；同时还可以保证在步骤C的操作过程中，分离单链DNA分子的步骤简单。
优选的，所述单链DNA分子上的第一序列的长度为16bp至100bp。本方案使得固定在固相载体上的单链DNA分子在重组酶的作用下，入侵双链DNA片段后能够牢固地结合在双链DNA片段上形成稳定的链置换复合体。
需要说明的是，所述第一序列可以是单链DNA分子的部分序列，也可以是单链DNA分子的全部序列。
优选的，所述第一序列为单链DNA分子的全部序列。本方案在保证了单链DNA分子入侵双链DNA片段后连接稳定的基础上，降低了单链DNA分子的合成难度。
优选的，所述双链DNA片段的长度为50至200bp。本方案的双链DNA片段设计简单，合成简单。
优选的，所述双链DNA片段的长度不小于200bp。本方案的双链DNA片段被单链DNA分子部分置换后，仍然能够保证未被入侵的双链之间通过氢键稳定地结合，从而保证链置换复合体结构的稳定性。
步骤B结束后，还包括使待测重组酶失活或变性的步骤，所述使待测重组酶失活或变性的步骤可以是向链置换复合体中加入蛋白质分解酶分解重组酶，也可以是对链置换复合体进行热处理。
优选的，所述使待测重组酶失活或变性的步骤为：热处理所述链置换复合体，所述热处理的步骤为将链置换复合体置于65至80℃条件下孵育5至20分钟。采用热处理法使重组酶变性，操作简单，不会引入其他杂质，且本方案的温度范围可以使重组酶变性，从而使固定在固相载体上的单链DNA分子分离脱落并重新形成双链DNA，但不会导致双链DNA形成单链。
优选的，所述缓冲液包括以下组分：20至100mM Tris-HCl，5至14 mM MgCl2，0.1至1.0 mM DTT，pH为7.5至8.0。本方案的缓冲液，适用于多种重组酶发挥作用。
优选的，步骤C中用于检测分离产物的方法为：电泳法，荧光检测法，紫外吸光值检测方法以及荧光染料法。本发明采用的检测分离产物的方法，操作简便，对仪器要求低，不会产生环境污染。
优选的，所述待测重组酶为RecA或uvsX。
优选的，所述链置换反应体系中还包括单链结合蛋白。当双链DNA片段上一部分被单链DNA分子置换后，被置换出的单链部分与单链结合蛋白结合，能够防止进一步对链置换复合体中被置换的部分重新进行替换。
本发明第二实施例提出了一种重组酶链置换活性检测试剂盒，所述试剂盒包括单链DNA分子，双链DNA片段；所述单链DNA分子上包含第一序列，所述第一序列与双链DNA片段上部分序列同源互补。
优选的，所述试剂盒还包括适于重组酶发挥活性的缓冲液，所述缓冲液包括以下组分：20至100mM Tris-HCl，5至14 mM MgCl2，0.1至1.0 mM DTT，pH为7.5至8.0。
优选的，所述试剂盒还包括ATP或ATP类似物。所述ATP或其类似物为链置换反应提供能量。
优选的，所述单链DNA分子的3’末端上包括生物素标记，且通过生物素标记固定在含链霉亲和素的磁珠上。本方案的试剂盒，在后续反应过程中能够快速、简单的对链置换复合体进行分离提纯。
优选的，所述单链DNA分子上的第一序列的长度为16bp至100bp。本方案使得固定在固相载体上的单链DNA分子在重组酶的作用下，入侵双链DNA片段后能够牢固地结合在双链DNA片段上形成稳定的链置换复合体。
需要说明的是，所述第一序列可以是单链DNA分子的部分序列，也可以是单链DNA分子的全部序列。
优选的，所述第一序列为单链DNA分子的全部序列。本方案在保证了单链DNA分子入侵双链DNA片段后连接稳定的基础上，降低了单链DNA分子的合成难度。
优选的，所述双链DNA片段的长度为50至200bp。本方案的双链DNA片段设计简单，合成简单。
优选的，所述双链DNA片段的长度不小于200bp。本方案的双链DNA片段被单链DNA分子部分置换后，仍然能够保证未被入侵的双链之间通过氢键稳定地结合，从而保证链置换复合体结构的稳定性。
本发明的第三实施例，提出了一种重组酶链置换活性检测方法。
建立两个链置换反应体系分别检测RecA和uvsX的链置换活性，以及一个未添加重组酶的空白对照组：
A、链置换反应体系：1μL浓度为6mM的ATPɣS溶液；2μg待测重组酶；2μL 10×重组酶缓冲液：700mM Tris-HCl，100mM MgCl2，5mM DTT，pH为7.6；7.0μL预先固定在磁珠上的单链DNA分子（每μL含106个磁珠）；4μL浓度为10ng/μL的双链DNA片段；将反应体系混匀，并于37℃孵育20分钟。其中两个链置换反应体系中的待测重组酶分别为RecA和uvsX；单链DNA分子序列为SEQ ID NO:1；双链DNA片段由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成；
建立一个空白对照组，空白对照组中不含待测重组酶，其余组分与链置换反应体系组分相同；
B、终止链置换反应，去除上清，使用1×重组酶缓冲液洗涤磁珠一次，得到固定在磁珠上的链置换复合体；
C、在65℃条件下孵育15min后，吸取上清得到分离产物，对两个反应体系及对照组的分离产物分别使用12%的Page胶检测。
检测结果如图2所示，泳道0为分子大小标记物，1为空白对照组，2为含RecA的链置换反应体系的分离产物，3为含uvsX的链置换反应体系的分离产物。从图中可以看出，未添加重组酶的链置换反应体系的分离产物中无法检测到双链DNA，在含RecA和uvsX的链置换反应体系的分离产物均在464bp处观察到电泳条带，这说明RecA和uvsX均具备链置换活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州康昕瑞基因健康科技有限公司
<120> 重组酶链置换活性检测方法及试剂盒
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catgatgcgt ctggaggacc tgcaggaaga gctgaagaaa gacgtgttca 50
<210> 2
<211> 464
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac catgatgcgt ctggaggacc 60
tgcaggaaga gctgaagaaa gacgtgttca tcgatagcac caagctgcaa tacgaagcgg 120
cgaacaacgt tatgctgtat agcaagtggc tgaacaaaca cagcagcatc aagaaagaga 180
tgctgcgtat tgaagcgcag aagaaagtgg cgctgaaagc gcgtctggac tactatagcg 240
gtcgtggcga cggtgatgag ttcagcatgg atcgttacga gaagagcgaa atgaaaaccg 300
ttctgagcgc ggacaaggat gtgctgaaag ttgacaccag cctgcagtat tggggcatcc 360
tgctggactt ttgcagcggt gcgctggatg cgattaagag ccgtggcttc gcgatcaaac 420
acattcaaga tatgcgtgcg tttgaagcgg gcaagtaact cgag 464
<210> 3
<211> 464
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcgagttac ttgcccgctt caaacgcacg catatcttga atgtgtttga tcgcgaagcc 60
acggctctta atcgcatcca gcgcaccgct gcaaaagtcc agcaggatgc cccaatactg 120
caggctggtg tcaactttca gcacatcctt gtccgcgctc agaacggttt tcatttcgct 180
cttctcgtaa cgatccagtc tgaactcatc accgtcgcca cgaccgctat agtagtccag 240
acgcgctttc agcgccactt tcttctgcgc ttcaatacgc agcatctctt tcttgatgct 300
gctgtgtttg ttcagccact tgctatacag cataacgttg ttcgccgctt cgatttgcag 360
cttggtgcta tcgatgaaca cgtctttctt cagctcttcc tgcaggtcct ccagacgcat 420
catggtatat ctccttctta aatgtaaaca aaattatttc taga 464

Claims (10)

1.一种重组酶链置换活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备链置换反应体系并进行链置换反应以生成链置换复合体，所述反应体系包括待测重组酶，单链DNA分子，双链DNA片段，ATP或ATP类似物，以及适宜所述待测重组酶发挥活性的缓冲液，所述单链DNA分子上包含第一序列，所述第一序列与双链DNA片段上部分序列同源互补；
B、终止链置换反应，分离提纯所述链置换复合体；
C、分离去除链置换复合体中的单链DNA分子以获得分离产物，检测分离产物，确定重组酶的链置换活性。
2.根据权利要求1所述的重组酶链置换活性检测方法，其特征在于，所述单链DNA分子的3’末端固定在磁珠上。
3.根据权利要求1所述的重组酶链置换活性检测方法，其特征在于，检测所述分离产物中含有双链DNA结构，确定待测重组酶具有链置换活性。
4.根据权利要求1所述的重组酶链置换活性检测方法，其特征在于，所述待测重组酶为RecA或uvsX。
5.根据权利要求1所述的重组酶链置换活性检测方法，其特征在于，所述第一序列的长度为16bp至100bp。
6.根据权利要求1所述的重组酶链置换活性检测方法，其特征在于，步骤B结束后，还包括以下步骤：热处理所述链置换复合体，所述热处理的步骤为将链置换复合体置于65至80℃条件下孵育5至20分钟。
7.根据权利要求1所述的重组酶链置换活性检测方法，其特征在于，步骤C中用于检测分离产物的方法为：电泳法，荧光检测法，紫外吸光值检测方法以及荧光染料法中的任意一种方法。
8.根据权利要求1所述的重组酶链置换活性检测方法，其特征在于，所述链置换反应体系中还包括单链结合蛋白。
9.一种重组酶链置换活性检测试剂盒，其特征在于，包括单链DNA分子，双链DNA片段；所述单链DNA分子上包含第一序列，所述第一序列与双链DNA片段上部分序列同源互补。
10.根据权利要求9所述的重组酶链置换活性检测试剂盒，其特征在于，所述单链DNA分子上与双链DNA片段同源互补的序列长度为16bp至100bp。
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