DE3990972C2 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Biotechnologie und betrifft insbesondere einen neuen Phagen-Vektor zur Substitution von λSK15 zwecks Konstruktion von Bibliotheken von kDNA-Strukturgenen gemäß Patentanspruch.

Die Konstruktion von Bibliotheken von kDNA-Strukturgenen ist eine der wichtigsten Stufen bei der Untersuchung der Struktur und Funktion von Genen sowohl in molekularbiologischer als auch in biotechnologischer Hinsicht. Bisher besonders bekannt geworden sind im Zusammenhang mit der Konstruktion von Bibliotheken von kDNA-Strukturgenen die λ-Vektoren λgt10 und λgt11 (Huynk T. V., Young R. A., Davis R. W., "DNA cloning", Ed. D. M. Glover, IRL Press, Oxford, 1985, S. 49- 78).

Neben einer Reihe von Vorteilen weisen diese Vektoren jedoch auch wesentliche Nachteile auf. Im Falle λgt11 ist es der hohe Grad nichtrekombinierter Phagen und im Falle von λgt10 das Fehlen der Expression. Der gemeinsame Nachteil dieser Vektoren besteht in der Konstruktion von Bibliotheken unter ausschließlicher Verwendung nur der Restriktase EcoRI. Das verhindert die Konstruktion von Bibliotheken unter Verwendung bequemerer und modernerer Techniken ohne Anwendung von Methylasen mit gerichteter Klonung 5′→3′ kDNA unter teilweisem Auffüllen der klebrigen Enden.

Zur Beseitigung dieser Nachteile wurden die Vektoren λgt18/19 (Han J. H., Stratowa C., Rutter W. J., Biochemistry, 1987, v. 26, S. 1617-1625) und λgt22 konstruiert (Han J. H., Rutter W. J., Nucl. Acids Res., 1987, 15, S. 6304). Diese Vektoren gehören jedoch zum klassischen, traditionellen Typ und es ist für die weitere Arbeit unter Insertion von kDNA (Restriktasekartierung, Sequenzierung) notwendig, diese zu Plasmid-Vektoren oder Vektoren auf der Grundlage von M13 zu subklonieren.

Ein neuer Typ von Vektoren, der es ermöglicht, die Vorteile der drei Haupttypen von Vektoren zu vereinen, die in der Gentechnik zur Anwendung kommen, und zwar der λ-Phagen, M13 und Plasmide, ist der Vektor λZAP (Werbung "Stratagene", USA).

Der Vektor λZAP ermöglicht die Konstruktion von Bibliotheken von kDNA-Genen unter Verwendung vieler Restriktasen, wobei für einen Teil von ihnen die Technik des teilweisen Auffüllens der klebrigen Enden angewandt werden kann.

Alle oben aufgezählten Vektoren weisen jedoch neben den einzelnen Vorteilen auch eine Reihe von gemeinsamen und äußerst wesentlichen Nachteilen auf.

Alle diese Vektoren sind Insertionsvektoren. Dies sind gut replizierbare und lebensfähige Vektoren. Inseriert man in sie kDNA-Inserte, führt dies zu einer Verlängerung des DNA- Phagen, wodurch die für die Vermehrung dieses Phagen optimale Struktur gestört wird. Dabei gilt, daß mit zunehmender Größe des kDNA-Inserts und mit zunehmender Annäherung der Größe der DNA eines rekombinierten Phagen an die maximal mögliche Größe des Phagen λ dessen Replizierbarkeit und Stabilität abnehmen. Dies hat zwei unerwünschte Erscheinungen zur Folge. Erstens kommt es bei der Amplifikation einer Bibliothek rasch zur Veränderung ihrer Repräsentanz, so daß viele Gene lediglich bei der ersten Aussaat der Bibliothek tatsächlich isoliert werden können. Dieser Umstand wirkt sich bei der kommerziellen Herstellung repräsentativer kDNA- Bibliotheken stark negativ aus. Zweitens kommt es bei der Konstruktion von kDNA-Bibliotheken zu einem starken Druck zugunsten kleinere Inserte enthaltender rekombinierter Phagen mit allen sich daraus ergebenden negativen Folgen. Mit diesem Umstand hängt noch das Problem der "falschen" Rekombinanten zusammen, d. h. von Ausgangsphagen, in die Linker-Sequenzen eingebaut wurden. Phänotypisch sehen diese "falschen" Rekombinanten wie echte aus und erschweren dadurch erheblich sowohl die Bewertung der Repräsentanz der erhaltenen Bibliothek als auch die weitere Arbeit mit ihr.

Keiner der vorliegenden Vektoren ermöglicht die Lösung dieses Problems. Die dafür verwendeten Techniken sind von rein biochemischer Art (sorgfältigere Reinigung der kDNA, Dephosphorylierung und teilweises Auffüllen der klebrigen Enden), sind mit zusätzlichen Prozeduren verbunden und weisen neben Vorteilen auch Nachteile auf. Sie ermöglichen daher keine grundsätzliche Lösung dieses Problems.

Alle oben erwähnten Vektoren, mit Ausnahme von λgt10 verhindern die Selektion gegenüber den Ausgangsphagen, was zu einem niedrigen Prozentsatz an rekombinierten Phagen in der erhaltenen Bibliothek mit den entsprechenden negativen Folgen führt (zusätzlicher Zeit-, Arbeits- und Materialaufwand). Andererseits ermöglicht der Phage λgt10 nicht die Expression von kDNA, was in bestimmten Fällen von entscheidender Bedeutung sein kann. Die in anderen Vektoren realisierbare Expression der kDNA ist jedoch deshalb von Nachteil, weil es dadurch in bestimmten Fällen zur Zerstörung der Zelle kommt und daher bestimmte kDNA-Sequenzen nur in nicht expremierbaren Vektoren geklont werden können. Dieser Umstand führt zwangsläufig zur Konstruktion der Bibliotheken von kDNA-Genen sowohl in exprimierbaren als auch nicht exprimierbaren Vektoren, da die Wirkung des zu klonenden Gens auf E. coli-Zellen nicht vorhersagbar ist. In keinem einzigen der vorliegenden Vektoren kann eine Bibliothek von kDNA-Genen unter Verwendung der Restriktase BamI hergestellt werden, weshalb es auch nicht möglich ist, die feinspaltenden Restriktasen Sau 3AI und MboI zu verwenden, die es in vielen Fällen gestatten würden, Bibliotheken ohne Anwendung von Linkern zu konstruieren. Außerdem ermöglicht die Klonung am BamI-Site die Vereinigung der Vorteile beider Methoden, und zwar unter Umgehung von Methylasen und unter teilweisem Auffüllen der klebrigen Enden. Außer dem genannten Vektor ermöglichen die Vektoren λgt18, λgt19, λgt22 und λZAP nicht die Bewertung des Prozentsatzes an rekombinierten Phagen in der erhaltenen Bibliothek aufgrund des Phänotyps oder die Bewertbarkeit ist sehr erschwert.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen Phagen- Vektor zu entwickeln, der die Selektion gegenüber nicht rekombinierten Phagen sowie gegenüber "falschen" Rekombinanten und Teilrekombinanten ermöglicht, im selben System eine Expression des vorliegenden Gens zu erzielen, beliebige Markierungen an den Enden des geklonten Gens einzuführen, das zu vermehrende Gen auf einfache Weise unter Anwendung der PCR-Technik zu amplifizieren, den Gehalt an Rekombinanten in der Gesamtpopulation zu bestimmen, schnell und effektiv einen Vektor aus der Phagen- in die Plasmid-Form bzw. die einsträngige Form zu überführen.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß ein Phagen-Vektor zur Substitution von λSK15 zwecks Konstruktion von Bibliotheken von kDNA-Strukturgenen beansprucht wird, der eine Größe von 51 200 Nukleotid-Paaren aufweist und zusammengesetzt ist aus:

• - Cos - Sal I-DNA-Fragment des Phagen λEMBL3 - linker Arm mit einer Größe von 20 300 Nukleotid-Paaren;
• - Sal I - Hind III - Fragment des Kanamyzin-Resistenzgens mit einer Größe von ca. 500 Nukleotid-Paaren;
• - Hind III - Hind III - Fragment des Phagen λ mit einer Größe von 2000 Nukleotid-Paaren;
• - Hind III - Sal I - Fragment des Kanamyzin-Resistenzgens, mit einer Größe von ca. 1000 Nukleotid-Paaren;
• - Sal I - Bgl II - Fragment eines DNA-Phasmids SK2A mit einer Größe von 3800 Nukleotid-Paaren, wobei durch Auffüllen der EcoRI-Site zerstört wird; das erwähnte Phasmid SK2A wurde aus dem Vektor SK18 konstruiert, der aus DNA- Fragmenten des Phagen λ, des Phagen M13 und dem Kosmid pH C79 gewonnen wurde;
• - Bam I - Bam I - des DNA-Fragments des Phagen λEMBL3 mit einer Größe von 13 700 Nukleotid-Paaren;
• - Bam I - Bgl II - DNA-Fragment des erwähnten Phasmids SK2A mit einer Größe von 700 Nukleotid-Paaren, wobei durch Auffüllen der Sal I-Site zerstört wird;
• - Sal I - cos - des DNA-Fragments des Phagen λEMBL3 - linker Arm mit einer Größe von 9200 Nukleotid-Paaren;
• - Stellen der möglichen Insertion einer Fremd-DNA nach den Erkennungs-Sites für die Restriktasen EcoRI und BamI; die Vektorengröße beträgt 200 bis 15 400 Nukleotid-Paare; weist das Spektrum der Wirte der Stämme von Escherichia coli auf:
  LE392=F; hsd R 514 (r , m ), sup E44, sup F58, lac YI Oz (lac I ZY) 6, gal K2, gal T22, met B1, trpR55, j.M.109= recA1, ΔIac pro, end A1, gyr A96, thi-1, hsd R17, sup E44, rel AI, F′, tra D D36, pro Ab⁺, lac I^q, Z ΔM15, Q359=hsd R_k-, hsd M_k+, sup F, ⌀ 80, P2; hinterlegt am 21.07.1989 bei der all-Unionssammlung für industrielle Mikroorganismen des USSR-Forschungsinstitutes für Genetik und industrielle Mikroorganismen-Züchtung und eingetragen unter pH Nr. 688.

Der beanspruchte Vektor ermöglicht die Erzielung von Bibliotheken von kDNA-Strukturgenen anhand der Restriktasen EcoRI und BamI, und zwar insbesondere zur Klonung an den Erkennungssites für die Restriktase BamI. Dies ist der einzige unter den weitverbreiteten λ-Vektoren, die zur Konstruktion von kDNA-Bibliotheken verwendet werden können, welcher die Verwendung dieser Restriktase ermöglicht.

Der beanspruchte Vektor ermöglicht unter Verwendung der biochemischen und genetischen Selektion die wirksame Eliminierung der Ausgangsphagen und nichtrekombinierten Phagen bei der Konstruktion von kDNA-Bibliotheken. Der vorliegende Vektor ist der einzige unter den derzeit vorhandenen, der eine Selektion der echten Rekombinanten gegenüber den "falschen", die lediglich Linker-Sequenzen enthalten, ermöglicht.

Der erfindungsgemäße Vektor ermöglicht die Expression von kDNA und Translation von mRNA in den Zellen von E. coli, welche die Mutation von sup C und/oder sup G, sup Δ, sup B ("Ocker") tragen. In diesem Vektor kann man Bibliotheken sowohl nach der traditionellen Methode als auch nach modifizierten Methoden konstruieren, darunter auch unter teilweiser Auffüllung der klebrigen Enden und ohne Anwendung von Methylasen. Der Anteil an Rekombinanten kann bei Überimpfung von Plaques des Phagen λ auf den Rasen der Zellen vom E. coli- Stamm Q359 oder unter Verwendung eines Doppelrasens, der die Zellen der Stämme K803 (LE392) und Q359 enthält, ermitteln. Im Gegesatz zu den echten Rekombinanten vermehren sich der Ausgangsphage und die falschen Rekombinanten in den Zellen Q359 nicht.

Der erfindungsgemäße Vektor erlaubt es, das zu vermehrende Gen unter Verwendung der PCR-Technik leicht zu amplifizieren.

Der beanspruchte Vektor λSK15 ermöglicht es, die "Arme" des Phagen λ auf einfache Weise abzuwerfen und das Insert in die Plasmid-Form überzuführen, wobei bei der Infizierung der ein Plasmid enthaltenden E. coli-Zellen das Plasmid durch den Hilfsphagen M13 in dessen Proteine gepackt und in die einkettige Form übergeführt wird. Der neue Vektor ist der längste unter den bekannten Vektoren, die für die Konstruktion von kDNA-Bibliotheken in Fage kommen. Seine Länge (bis zu 15 400 Nukleotid-Paaren) reicht aus für die Klonung vollständiger mRNA-Kopien praktisch sämtlicher Gene.

Obwohl einzelne der oben aufgezählten Eigenschaften die bekannten im Handel erhältlichen Vektoren aufweisen, ist ihre Kombination nur dem beanspruchten Vektor eigen.

Nachstehend wird die Erfindung anhand einer ausführlichen Beschreibung der Ausführungsbeispiele unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Darin zeigt

Fig. 1 (a, b) das Schema für die Konstruktion des Diphasmids Sk18′;

Fig. 2 das Schema der Konstruktion des Diphasmids SK18;

Fig. 3 das Schema der Konstruktion des λgES7-Vektors aus Phasmid gSR;

Fig. 4 das Schema der Konstruktion des Phagen-Vektors λSK15;

Fig. 5 das Schema der Konstruktion einer Bibliothek von kDNA-Genen in λSK15 unter Verwendung der Restriktase BamI;

Fig. 6 das Schema der Konstruktion einer Bibliothek von kDNA in λSK15 unter teilweiser Auffüllung der klebrigen Enden;

Fig. 7 das Schema der Konstruktion einer Bibliothek von kDNA in λSK15 unter Anwendung von speziellen Linkern.

Der beanspruchte Phagen-Vektor λSK15 wurde nach folgendem Schema konstruiert:

Zunächst wird der Vektor SK18 konstruiert (Fig. 1a, b und Fig. 2).

Aus der DNA des Phagen M13mp18 wird mit Hilfe der Restriktasen Bam I und Bgl II ein Fragment mit einer Größe von 1860 Nukleotid-Paaren ausgeschnitten und mittels Elektrophorese in leichtschmelzender Agarose gereinigt. Dieses Fragment enthält außer dem Abschnitt ori des Phagen M13 auch einen Operator, eine Promotor, die Gene lac i und lac z eines Laktose-Operons, eine Polylinker-Sequenz und einen Abschnitt, der zum standardisierten Oligonukleotid-Primer für die Sequenz in den Phagen der Serie mp komplementär ist. Gleichzeitig wird mit den Restriktasen EcoRI und Sal I das Kosmid pH C79 hydrolysiert. Dann werden mit Hilfe des Klenow- Fragments der DNA-Polymerase I aus E. coli die klebrigen Enden des gereinigten Fragments, das einen Abschnitt ori des Phagen M13 enthält, und der hergestellten Fragmente des Kosmids pH C79 geglättet, wonach ligiert wird. Unter Anwendung der üblichen Verfahren wird dann die ligierte DNA in den E. coli-Stamm j. M. 109 eingeführt, wonach nach dem Standardverfahren die DNA isoliert und mit den Restriktasen EcoRI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II und Sal I analysiert wird. Das erhaltene Diphasmid SK1 wird dann für die weiteren Operationen verwendet. Zur Verringerung der Größe von SK1 wird dann mit Hilfe der Restriktasen Hind III und Bgl I hydrolysiert, wonach das das Ampizillin-Resistenzgen enthaltende Fragment gereinigt wird. Gleichzeitig wird mit denselben Restriktasen die DNA des Phagen M13mp18 behandelt und das niedermolekulare Fragment isoliert. Dann werden beide Fragmente ligiert, wonach mit der erhaltenen Lösung die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 transformiert werden. Anschließend beimpft man mit den transformierten Zellen ein Nährmedium, das Ampizillin, X-gal und IPTG enthält, und isoliert daraus die DNA, die man mit den Restriktasen EcoRI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II und Sal I spaltet und dann analysiert. Danach isoliert man das Phasmid SK2, das dann auf der nächsten Stufe verwendet wird.

Die DNA des Kosmids pH C79 spaltet man dann mit der Restriktase Bgl II und isoliert das einen cos-Abschnitt enthaltendes Fragment. Dann wird die DNA des SK2 hydrolysiert und zusammen mit dem den cos-Abschnitt enthaltenden Fragment ligiert. Danach werden mit der erhaltenen Lösung die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 transformiert, mit denen dann ein Ampizillin enthaltendes Nährmedium beimpft wird. Von den gezüchteten Kolonien macht man Abdrücke auf Nitrocellulosefilter und hybridisiert mit dem Fragment Bgl II des Kosmids pH C79, der den cos-Abschnitt enthält, den man durch nick- Translation mit ³²P markiert. Zellen aus den Kolonien, die sich mit dem cos-Fragment hybridisieren lassen, züchtet man auf einem Ampizillin enthaltenden Nährmedium und isoliert die DNA, die man mit den Restriktasen EcoRI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II und Sal I spaltet und analysiert. Eines der isolierten Diphasmide, und zwar das Diphasmid SK6 wird auf der nächsten Stufe verwendet.

Das Diphasmid SK6 hydrolysiert man mit der Restriktase EcoRI, füllt dann die klebrigen Enden mit dem Klenow-Fragment in Gegenwart von dNTP auf, reinigt die lineare Form des Diphasmids, ligiert und transformiert mit der erhaltenen Lösung die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109, und beimpft damit ein Ampizillin, X-gaI und IPTG enthaltendes Nährmedium. Aus den Kolonien züchtet man dann im Ampizillin enthaltenden Medium Zellen und isoliert die DNA des Diphasmids. Diese spaltet man dann mit den Restriktasen EcoRI, PstI, Hind III, Bam I, Bgl II, Sal I und analysiert.

Aus den analysierten DNA′s isoliert man das Diphasmid SK18′, das man mit der Restriktase Acc I hydrolysiert, wonach man die klebrigen Enden des Abschnitts AccI, der außerhalb des Polylinkers liegt, mit dem Klenow-Fragment in Gegenwart von dATP und dTTP auffüllt. Dieses Präparat behandelt man dann mit DNA-Lipase des Phagen T4 in einer Pufferlösung, wonach man die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 mit der erhaltenen Lösung transformiert und beimpft damit ein Ampizillin, X-gaI und IPT6 enthaltendes Nährmedium. Aus den Kolonien züchtet man Zellen auf dem Ampizillin enthaltenden Nährmedium und isoliert die DNA. Diese spaltet man mit AccI und analysiert sie. Dann isoliert man das Diphasmid SK18, das lediglich einen Abschnitt AccI enthält.

Dann werden die DNA′s des Diphasmids SK18 mit der Restriktase Bgl I hydrolysiert und autoligiert, wonach man mit der ligierten DNA die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109, mit denen man ein Ampizillin enthaltendes Nährmedium beimpft, transformiert. Aus den auf dem Ampizillin enthaltenden Nährmedium gezüchteten Kolonien züchtet man Zellen, aus denen man die DNA durch Alkalilyse isoliert. Danach spaltet man die DNA mit den Restriktasen EcoRI, Bam I, Sal I, Bgl II und analysiert. Aus den analysierten Phasmiden isoliert man das Phasmid SK2A. Das Phasmid SK2A unterscheidet sich von dem Phasmid SK2 durch Fehlen der Erkennungssites für die Restriktasen EcoRI imd AccI, die außerhalb des Polylinkers liegen. Dann entfernt man den Erkennungssite für die Restriktase Sal I im Phasmid SK2A. Hierfür wird die DNA des Phasmids SK2A mit der Restriktase Sal I hydrolysiert, wonach man mit Hilfe des Klenow-Fragments DNA und Polymerase I die klebrigen Enden glättet. Dann wird autoligiert, wonach die ligierte DNA in die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 eingebaut wird. Aus den Kolonien werden nach den üblichen Verfahren die DNA isoliert und mit den Restriktasen EcoRI, BamI und Sal I analysiert. Danach isoliert man das Phasmid SK2ΔS, das EcoRI, Bam I enthält, aber keine Sal I-Erkennungssites für die Restriktasen enthält. Danach entfernt man die Erkennungssites für die Restriktase EcoRI im Phasmid SK2ΔS. Hierfür wird die DNA des Phasmids SK2ΔS mit der Restriktase EcoRI hydrolysiert, dann werden mit Hilfe des Klenow-Fragments die klebrigen Enden geglättet. Danach erfolgt die Autoligierung der DNA. Die ligierte DNA spaltet man mit der Restriktase EcoR I und baut sie in die Zellen des E. coli- Stammes j. M. 109 ein. Aus den Kolonien werden nach den üblichen Verfahren die DNA isoliert und mit den Restriktasen EcoRI, BamI und Sal I analysiert. Danach isoliert man das Phasmid SK2ΔS, das BamI enthält, aber keine EcoRI- und Sal I-Erkennungsabschnitte für die Restriktasen enthält. Danach erfolgt die Konstruktion des rekombinierten Phasmids gSR. Dann wird die DNA des Phagen λgt11 mit der Restriktase Bam I hydrolysiert und das Ferment inaktiviert. Danach erfolgt das "Annealing" der klebrigen Enden des Phagen λ, wonach das zentrale BamI-Fragment mit einer Größe von etwa 6500 Nukleotid-Paaren gereinigt wird. Die DNA des erwähnten SK2ΔSR hydrolysiert man mit Restriktase BamI und nach der Inaktivierung des Ferments ligiert man mit Präparat A, wonach die ligierte DNA in die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 eingebaut wird, wonach ein Ampizillin enthaltender L-Agar beimpft wird.

Von den gezüchteten Kolonien macht man Abdrücke auf Nitrocellulosefilter und hybridisiert mit dem Präparat A, dessen DNA man mit Hilfe der nick-Translation mit ³²P markiert. Zellen aus den Kolonien, die sich mit dem Präparat A hybridisieren lassen, züchtet man und isoliert die DNA nach dem üblichen Verfahren. Die Analyse der DNA mit den Restriktasen EcoRI, Bam I und Sal I bestätigt die Klonung des Abschnitts λgt11 im Phasmid SK2ΔSR. Das erhaltene Phasmid gSR wird dann auf der nächsten Stufe verwendet. Danach erfolgt die Konstruktion des Phagenvektors λgES 7 (Fig. 3). Hierfür hydrolysiert man die DNA des Phasmids gSR mit der Restriktase Bgl II und das Ferment wird inaktiviert. Die DNA des Phagen λEMBL3 hydrolysiert man mit der Restriktase Bam I und das Ferment wird inaktiviert. Beide DNA-Präparate werden in äquimolaren Verhältnissen vermischt und ligiert. Die ligierte DNA verpackt man in die Proteine des Phagen in vitro und mit den angefallenen Phagenartikeln beimpft man einen 0,1% X-gaI enthaltenden Rasen aus Zellen des E. coli-Stammes LE392. Aus 10 blauen Plaques züchtet man einen Phagen, isoliert die DNA und analysiert mit Hilfe der Restriktasen EcoRI, BamI und Sal I. Man isoliert den Phagen λgES7, der dann auf der nächsten Stufe verwendet wird.

Ferner wird das Plasmid p4KL-I hergestellt. Hierfür wird die DNA des Plasmids pUC4K mit Restriktase Hind III hydrolysiert und durch Erwärmung bei einer Temperatur von 65°C innerhalb von 15 Minuten wird die Reaktion eingestellt. Dann wird mit der DNA des Phagen λ auch Hind III gespaltet, und ein Fragment mit einer Größe von ca. 2000 Nukleotid-Paaren wird durch Gel-Elektrophorese in einer 0,7%igen leichtschmelzbaren Agarose gereinigt. Das gereinigte Fragment vermischt man in äquimolaren Konzentrationen mit pUC4K, das mit Hind III zerschnitten wurde, wonach man ligiert. Mit der ligierten DNA transformiert man dann die Zellen des E. coli- Stammes j. M. 109, mit denen man dann den das Antibiotikum Ampizillin enthaltenden L-Agar beimpft. Von den gezüchteten Kolonien macht man Abdrücke auf Nitrocellulosefilter und hybridisiert mit der ³²P markierten DNA des Phagen λ. Aus 6 hybridisierbaren Kolonien züchtet man Zellen in 10 ml L-Nährboden mit Ampizillin und isoliert die DNA durch Alkalilyse. 0,5 µg DNA spaltet man mit den Restriktasen EcoRI, BamI, Sal I und Hind III und analysiert mittels Elektrophorese in einem 1%igen Agarose-Gel.

Eines der Plasmide, das über eine prognostizierbare Restriktase- Karte (Fig. 4) verfügt, die p4KL-I genannt wird, verwendet man auf der nächsten Stufe, auf der die Konstruktion des Phagen λgSK5 erfolgt. Die DNA des Plasmids p4KL-I hydrolysiert man mit den Restriktasen EcoRI und Sal I und die Reaktion wird durch Erwärmung bei einer Temperatur von 65°C innerhalb von 15 Minuten eingestellt. Die DNA des Phagen λgES7 spaltet man mit der Restriktase Sal I und das Ferment wird durch Erwärmung auf 65°C innerhalb von 15 Minuten inaktiviert. Beide Präparate vermischt man in äquimolaren Verhältnissen und ligiert. Die ligierte DNA verpackt man in Proteine des Phagen in vitro und mit den erhaltenen Phagenpartikeln wird ein Rasen von Zellen des E. coli-Stammes LE392 beimpft. Von der Petrischale macht man einen Abdruck auf ein Nitrocellulosefilter und hybridisiert mit dem mit ³²P markierten Fragment DNA pUC4K, das ein Kanamyzin- Resistenzgen enthält und das aus dem Plasmid mit der Restriktase Sal I ausgeschnitten wurde. Aus 6 hybridisierbaren Plaques züchtet man dann einen Phagen, isoliert die DNA und analysiert diese mit Hilfe der Restriktasen EcoRI, Bam I und Sal I. Alle Phagen enthalten ein inaktiviertes Kanamyzin- Resistenzgen und einer davon (λgSK5), der die in Fig. 4 abgebildete Struktur aufweist, wird zur Konstruktion von λSK15 verwendet. Hierfür wird die DNA des Phagen λLEMBL3 mit der Restriktase Bam I hydrolysiert und das inserierte Fragment mit einer Größe von 13 700 Nukleotid-Paaren wird mittels Gel-Elektrophorese in 0,7%iger leichtschmelzender Agarose gereinigt. Die DNA des Phagen λgSK5 hydrolysiert man mit Restriktase Bam I und das Ferment wird durch Erwärmung bei einer Temperatur von 65°C innerhalb von 15 Minuten inaktiviert. Beide Präparate vermischt man in äquimolaren Verhältnissen und ligiert. Die ligierte DNA verpackt man in vitro und mit den erhaltenen Phagenpartikeln wird ein Rasen von Zellen des E. coli-Stammes LE392 beimpft. Die gezüchteten Plaques überimpft man auf einen Rasen der Zellen Q359, die in Bezug auf den Phagen P2 lysogen sind.

Das inserierte Fragment aus λEMBL3 gewährleistet den Phänotyp spi⁺, d. h. die Unmöglichkeit, sich auf Zellen von E. coli zu vermehren, die in Bezug auf den Phagen P2 lysogen sind. Deshalb züchtet man aus 6 Plaques, die nicht auf Q359 gezüchtet wurden, den Phagen, isoliert die DNA und analysiert mit Hilfe der Restriktasen EcoRI, Bam I und Sal I. Einer der Phagenvektoren hat die zu erwartende Struktur (Fig. 4) und wird als λSK15 bezeichnet.

Den beanspruchten Phagenvektor λSK15 kann man für die Herstellung von kDNA-Bibliotheken nach dem üblichen Verfahren unter Verwendung des EcoRI-Abschnitts verwenden.

Für die Eliminierung der Nichtrekombinanten und "falschen" Rekombinanten genügt es, einen Rasen von E. coli Q359 mit den Phagen zu beimpfen, da weder die Ausgangsphagen noch die Phagen, die ein mit dem Linker verbundenes Insert enthalten, sich auf diesen Zellen vermehren lassen. Andererseits sind die durch die Vereinigung der "Arme" von λSK15 mit dem Linker (ami) gebildeten Phagen aufgrund der geringen Länge der DNA auf keiner der E. coli-Stämme lebensfähig. Die minimale DNA-Größe, die lebensfähige Partikel des Phagen λ zu produzieren vermag, beträgt 37 700 Nukleotid-Paare und die Größe des Arms λSK15 beträgt 37 500 Nukleotid-Paare, was um 200 Nukleotid-Paare unter der minimalen Größe liegt, wobei klar ist, daß sogar die Insertion mehrerer Linkerkopien nicht zu einer wesentlichen Änderung der DNA-Länge und zur Bildung lebensfähiger "falscher" Rekombinanten führt. Dies verhindert praktisch auch die Bildung teilweiser Rekombinanten, d. h. von Phagen, die sowohl das Ausgangsinsert als auch das kDNA-Insert enthalten, da die Größe von λSK15 (etwa 51 200 Nukleotid-Paare) an die maximale Größe des Phagen λ herankommt (etwa 52 900 Nukleotid-Paare). Die Effektivität dieser Methode kann man noch dadurch erhöhen, daß man die "Arme" von λSK15 durch Elektrophorese oder Zentrifugieren von Insertfragment vorgängig reinigt. Für die Konstruktion von kDNA-Bibliotheken am EcoRI-Abschnitt ist SK15 nicht in Form eines Phagen λ zu verwenden, sondern in Form eines Diphasmids, das nur die "Arme" von λSK15 enthält und daher zu einer wirksamen Verpackung in Proteine des Phagen λ infolge der unzureichenden Länge nicht befähigt ist. Zur Herstellung des Diphasmids genügt es, die DNA von λSK15 mit der Restriktase EcoRI zu spalten und die Autoligierung bei einer niedrigen Konzentration an DNA durchzuführen, welche vorwiegend die Bildung zirkulärer und nicht konkatemerer Formen gewährleistet. Mit dieser DNA ist die Transformation der Zellen von E. coli durchzuführen, die es verhindern, daß der Phage λ (z.B. Stamm HB 101) den gesamten lytischen Zyklus durchläuft. Ofensichtlich sind bei der Konstruktion der Genbibliothek in diesem Diphasmid alle lebensfähigen Phagen rekombinierte Phagen. In dieser Form erinnert λSK15 an die Phasmidvektoren λpMYF131 und λpSL51.

Es ist jedoch noch bequemer, den beanspruchten Vektor λSK15 zur Konstruktion von kDNA-Bibliotheken mit Hilfe des Bam I- Abschnitts (Fig. 5) zu verwenden. Zweisträngige DNA′s werden nach dem üblichen Verfahren synthetisiert, wobei jedoch nicht mit EcoRI, sondern mit Bam I-Methylase (oder dam- Methylase) behandelt wird. Danach heftet man die BamI-Linker an und behandelt mit der Restriktase BamI (oder MboI). Die DNA des Vektors λSK15 hydrolysiert man gleichzeitig mit den Restriktasen Bam I und EcoRI. Nach der Einstellung der Reaktion durch Erwärmung bei 65°C innerhalb von 15 Minuten führt man die Reinigung von Oligonukleotid-Linkern BamI - EcoRI durch Ausfällung mit Polyethylenglykol-6000 durch.

Auf diese Weise enthalten die "Arme" schließlich die klebrigen Enden von BamI und das Insertfragment EcoRI. Die Bildung des Ausgangsphagen bie der Ligierung ist daher nur mit den Restlinkern BamI - EcoRI möglich, wobei diese Reaktion von höherer Ordnung ist als die Bildung eines rekombinierten Phagen. Deshalb kann man bei der Herstellung von kDNA-Bibliotheken nach diesem Verfahren die Passage der Bibliothek auf E. coli Q359 weglassen. Es ist klar, daß in diesem Fall die "falschen" Rekombinanten nicht lebensfähig sind.

Die Verwendung des Abschnitts BamI in λSK15 zur Herstellung der kDNA-Bibliotheken ermöglicht es, die Vorteile der beiden Verfahren, d. h. unter Verwendung der Technik der teilweisen Auffüllung der klebrigen Enden sowie der Konstruktion der Bibliotheken ohne Verwendung von Methylasen miteinander zu vereinen.

Nach diesem Schema (Fig. 6) werden ohne vorgängige Behandlung mit Methylase die Linker Sal I (oder Xhol) an die kDNA- Linker angeheftet. Da die Restriktase Sal I die eukaryotische DNA nur an wenigen Stellen spaltet (ein Erkennungsabschnitt pro ca. 50 000 Nukleotid-Paare) und das vorwiegend in Regulatorbereichen, die in der kDNA nicht vertreten sind, führt die anschließende Hydrolyse der kDNA mit der Restriktase Sal I zu keiner wesentlichen Änderung der Größen der kDNA. Nach der Inaktivierung des Ferments nimmt man in einem entsprechenden Inkubierungsmedium die Auffüllung der klebrigen DNA-Enden mit dem Klenow-Fragment (oder mit Revertase) in Gegenwart von dCTP und dTTP vor. Danach hydrolysiert man die DNA von λSK15 mit den Restriktasen EcoRI und BamI und nimmt dann die teilweise Auffüllung der klebrigen DNA-Enden mit dem Klenow-Fragment oder mit Revertase in Gegenwart von dATP und dGTP vor. Beide Präparate vermischt man und ligiert sie, wobei die Ligierung in diesem Fall nur in einer Richtung erfolgen kann; die kDNA läßt sich mit einer Vektor-DNA ligieren, da weder die Autoligierung der Vektor-DNA noch der kDNA möglich ist. Unter Verwendung der üblichen Verfahren verpackt man dann die ligierte DNA in vitro in proteine des Phagen λ und mit den erhaltenen Phagenpartikeln infiziert man die Zellen des E. coli-Stammes LE392. Der Vergleich dieses Verfahrens mit der Konstruktion der kDNA- Bibliotheken unter Verwendung der teilweisen Auffüllung der klebrigen Enden in den anderen Vektoren λgt18/19, λgt22 und λZAP läßt erkennen, daß λSK15 besonders geeignet ist.

Die Synthese des speziellen Linkers ermöglicht es, ohne Methylierung der kDNA und ihre weitere Hydrolyse mit Restriktase auszukommen, was die Konstruktion einer Bibliothek noch weiter erleichtert.

Andere Varianten der Verwendung spezielle Linker sind in Fig. 7 abgebildet. Darin zeigen:

• A′, A′′, B, C - die Verwendung verschiedener Linker für kDNA;
• A - die Klonierung in λSK15 am BamI-Abschnitt ohne Auffüllung;
• A′ - mit einem Kodon ATG;
• A′′ - mit drei Kodonen ATG in unterschiedlichem Rahmen;
• B - die Klonierung in λSK15 am BamI-Abschnitt unter Auffüllung von 2 Nukleotiden;
• C - die Klonierung in λSK15 am BamI-Abschnitt unter Auffüllung von einem Nukleotid.

Besonders günstig sind die Varianten B und C, da dadurch die Notwendigkeit der teilweisen Auffüllung der klebrigen kDNA- Enden entfällt und die Möglichkeit der Autoligierung sowohl der kDNA als auch des Vektors ausgeschlossen ist.

In den erfindungsgemäßen Vektor λSK15 kann man auch die "gerichteten" kDNA-Bibliotheken unter Verwendung von zwei Restriktasen einbauen (Paare EcoRI-XbaI, SacI-BamI u. a.).

Die Expression der kDNA in λSK15 erfolgt wie auch bei anderen Vektoren unter Verwendung eines lac-Promotors (λgt11, λZAP usw.), eine effektive Translation dieser mRNA kann jedoch nur unter streng kontrollierten Bedingungen bei Anwesenheit (oder Einführung eines Plasmids, das ein entsprechendes Gen trägt) in den Zellen E. coli der Mutation sup C und/oder sup G, sup B und sup V erfolgen. Das hängt damit zusammen, daß 6 Tripletts nach dem Initiierungskodon AYG der Anmelder ein Terminierungskodon YAA ("Ocker") eingebaut hat, dessen Wirkung durch die Mutationen sup C, sup G, sup V und sup B supprimiert wird.

Die Konstruktion der kDNA-Bibliothek in λSK15 verhindert somit eine unkontrollierte Expression der kDNA, was zur Steigerung der Repräsentanz dieser Bibliothek führt. Folglich stellt λSK15 in dieser Hinsicht einen neuen Typ von Vektoren für die Herstellung von Bibliotheken der kDNA- Strukturgene dar, da je nach dem verwendeten E. coli-Stamm dieser Vektor sowohl exprimierende als auch nichtexprimierende Funktion aufweisen kann und deshalb die Vorteile beider Arten von Vektoren in sich vereinigt.

Bei der Konstruktion der kDNA-Bibliotheken in λSK15 kann man wie auch in anderen Espressionsvektoren eine unkontrollierte Expression durchführen. Hierfür genügt es, in den an die kDNA angefügten Linker das Kodon ATG einzubauen (Fig. 7). Dabei wird das zu translierende Protein praktisch keine zusätzlichen fremden Aminosäuren enthalten.

Das kDNA-Insert in λSK15 läßt sich leicht in die Plasmidform überführen. Dabei wird ein anderes Prinzip als bei λZAP angewendet. Die DNA des rekombinierten Vektors λSK15 wird teilweise mit der Restriktase Sal I hydrolysiert (man kann auch Cla I verwenden), wonach man das Enzym durch einen dreifachen Einfrier-Auftau-Zyklus inaktiviert. Beide Restriktasen spalten nur an relativ wenigen Stellen die eukaryotische DNA, wobei diese Abschnitte hauptsächlich in Regulatorbereichen konzentriert sind, die in der kDNA fehlen. Danach wird die DNA verdünnt und autoligiert. Die ligierte DNA wird dann in kompetente E. coli-Zellen eingebaut, mit denen man Ampizillin enthaltendes L-Agar beimpft. Die gezüchteten Kolonien enthalten das kDNA-Insert in Plasmidform, wobei das Plasmid entweder überhaupt keine Nukleotid-Sequenzen des Phagen (im Falle Sal I) enthält oder nur einen geringen Teil davon (im Falle Cla I). Die Überführung in die Plasmidform läßt sich rasch durchführen (3 bis 4 Stunden) und ist effektiv. 0,1 µg der rekombinierten DNA ergeben mehrere hundert bzw. tausend Kolonien. Gegebenenfalls können für spezielle Experimente sowohl der Phage λSK15 als auch seine Rekombinanten auch nach einer anderen Methode in die Plasmidform überführt werden. In diesem Fall braucht man nur einen Phagen an E. coli-Zellen zu adsorbieren, die gegenüber der Vermehrung des Phagen λ (beispielsweise HBIOI, j. M. 109) innerhalb von 5 bis 10 Minuten bei einer Temperatur von 0 bis 37°C resistent sind, und mit den Zellen einen Ampizillin enthaltenden Rasen zu beimpfen. In diesem Fall wird jedoch das Plasmid auch alle Nukleotid-Sequenzen des Phagen λ enthalten, die in λSK15 vorhanden sind. Andererseits läßt sich ein derartiges Plasmid leicht in die Form des Phagen λ überführen, was für spezielle Ziele von Nutzen sein kann.

Bei der Superinfektion der E. coli-Zellen, die das Plasmid enthalten, mit dem Phagen M13 lassen sich die DNA-Plasmide in Proteine des Phagen in einsträngiger Form verpacken, wie sie für die Sequenzierung nach der bekannten Sanger-Methode geeignet ist. Ein weiterer, damit in Zusammenhang stehender Vorteil von λSK15 besteht darin, daß bei der Konstruktion von kDNA-Bibliotheken in diesem Substitutionsvektor der Selektionsdruck auf die Klonung größerer kDNA-Inserte gerichtet ist (2000 bis 8000 Nukleotid-Paare) und nicht auf die kleineren wie bei allen übrigen Insertionsvektoren darstellenden Vektoren dieser Klasse. Die Länge von λSK15 beträgt 15 400 Nukleotid-Paare, was für die Klonung vollständiger mRNA-Kopien praktisch sämtlicher Gene ausreicht.

Der Prozentsatz an Rekombinanten in einer Bibliothek, die in λSK15 hergestellt wird, läßt sich leicht aufgrund des Phänotyps durch Überimpfen von Plaques auf den Rasen Q359 oder durch Verwendung eines Doppelrasens LE392/Q359 ermitteln. Bei der Überimpfung auf den Rasen Q359 werden sich nämlich dann im Gegensatz zu den rekombinierten Phagen die nichtrekombinierten nicht vermehren. Das Überimpfen ist jedoch ein arbeitsaufwendiger Vorgang und die direkte Beimpfung des Rasens Q359 kann zu Artefakten führen.

Die erfindungsgemäße Technik des Doppelrasens ermöglicht die Beseitigung dieser Nachteile. In diesem Fall werden die zu analysierenden Phagen mit Zellen vom E. coli-Stamm LE392 inkubiert und nach dem Zusatz eines 0,6%igen L-Agars in Petri-Schalen überimpft. Über diesem Rasen impft man einen Rasen der Zellen Q359 ebenfalls in 0,6%igem L-Agar. Dabei ergeben die rekombinierten Phagen durchsichtige Plaques und die nichtrekombinierten trübe, was sich visuell leicht nachweisen läßt.

Der beanspruchte Phagenvektor λSK15 stellt somit den einzigen Substitutionsvektor dar, der sich für die Konstruktion von kDNA-Bibliotheken verwenden läßt.

Der beanspruchte Vektor ermöglicht:

• - die Herstellung von Bibliotheken sowohl nach den allgemein üblichen als auch nach neuen Verfahren, darunter auch unter teilweiser Auffüllung der klebrigen Enden, ohne die Verwendung von Methylasen;
• - die Verwendung der Restriktase Bam I für die Klonung;
• - die Vereinigung der Vorteile von Expressions- und Nichtexpressionsvektoren und ihre Verwendung, je nach dem E. coli-Stamm als Expressions- oder Nichtexpressionsvektoren;
• - Bestimmung des Anteils an rekombinierten Phagen aufgrund des phänotypischen Merkmals, was die Qualitätskontrolle der Bibiothek ermöglicht;
• - biochemische genetische Selektion gegenüber den Ausgangs- und nichtrekombinierten Phagen;
• - Selektion gegenüber "falschen" und teilweisen Rekombinaten;
• - die rasche und wirksame Überführung eines Inerts in die Plasmidform, die frei von den "Armen" des Phagen ist;
• - Überführung des Inserts in die einsträngige Form zur Ermittlung der Primärstruktur nach der Sanger-Methode;
• - garantierte Verhinderung einer unkontrollierten Überführung des kDNA-Inserts im Phagen λSK15 in die einstängige Form;
• - die spezifische Markierung sowohl der 5′- als auch der 3′-Enden des kDNA-Inserts unter Verwendung der üblichen im Handel erhältlichen Primer-Präparate.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachfolgend Beispiele für die Konstruktion des beanspruchten Vektors und seine Verwendung angeführt.

Beispiel 1

Zunächst wird das Diphasmid SK18 konstruiert.

Die Konstruktion ist in Fig. 1 und 2 schematisch dargestellt.

Aus 5 µg DNA des Phagen M13mp18 schneidet man mit Hilfe der Restriktasen Bal I und Bgl II (je 10 E Aktivität) ein Fragment mit einer Größe von 1800 Nukleotid-Paaren aus und reinigt dasselbe mittels Elektrophorese in leichtschmelzbarer Agarose. Dieses Fragment enthält außer dem Abschnitt ori des Phagen M13 auch einen Operator, einen Promotor, die Gene lac i und lac z des Laktose-Operons, eine Polylinker-Sequenz und einen Abschnitt, der zum Standard-Oligonukleotid-Primer für die Sequenz in den Phagen der Serie mp komplementär ist. Parallel dazu wird das Kosmid pH C79 (2 µg) unter Standardbedingungen mit den Restriktasen EcoRI und Sal I (je 20 E Aktivität) hydrolysiert.

In der zweiten Stufe werden mit Hilfe des Klenow-Fragments DNA-Polymeriase I aus E. coli (5 E Aktivität) in 50 µ einer Pufferlösung, die 20 mMol tris-HCl (pH 7,4), 5 mMol MgCl₂, 10 mMol 2-Mercaptoethanol, 50 mMol NaCl, 50 µg/ml DNA in Gegenwart aller 4 Desoxynukleotidtriphosphate (15 M) die klebrigen Enden sowohl des gereinigten Fragments, das den Abschnitt ori des Phagen M13 enthält, als auch der Fragmente des Kosmids pH C79, das mit den Restriktasen EcoRI und Sal I gespaltet wurde, geglättet. Die Ligierung erfolgt bei äquimolarem Verhältnis der Fragmente, die ori M13 und einen cos-Abschnitt des Phagen λ in einem Volumen von 100 µl aufweisen, das 50 mMol tris-HCl (pH 7,5), 10 mMol MgCl₂, 10 mMol Dithiothreit, 3 mMol Adenosintriphosphat, 25 E Aktivität der DNA-Ligase des Phagen T4 und 50 µg/ml Gesamt-DNA enthält. Unter Anwendung der üblichen Verfahren wird die ligierte DNA in E. coli Stamm j. M. 109 eingeführt. Die Beimpfung mit Bakterien erfolgt in Petrischalen mit 2%igem L-Agar, der 25 µg/ml Ampizillin, 0,1% IPTG und 0,1% eines Farbstoffes X-gal enthält. Aus 10 blauen Kolonien wird nach den üblichen Methoden die DNA (∼10 µg) isoliert und mit den Restriktasen EcoRI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II und Sal I analysiert. Die Konstruktion, die über die prognostizierte Restriktasenkarte (Fig. 1) verfügt und die als Diphasmid SK1 bezeichnet wird, wird für die weiteren Operationen verwendet.

Zur Verringerung der Größe werden 5 µg SK1 mit den Restriktasen Hind III und Bgl II (je 5 E Aktivität) hydrolysiert, wonach das das Ampizillin-Resistenzgen enthaltende Fragment durch Elektrophorese in leichtschmelzbarer Agarose gereinigt wird. Parallel dazu werden 5 µg DNA des Phagen M13mp18 mit den gleichen Restriktasen behandelt, wonach ebenfalls durch Elektrophorese ein niedermolekulares Fragment aus leichtschmelzbarer Agarose isoliert wird. Beide Fragmente werden in 0,1 ml einer Lösung ligiert, die 50 mMol tris-HCl (pH 7,5), 10 mMol MgCl₂, 10 mMol Dithiothreit, 3 mMol Adenosintriphosphat, 5 E Aktivität der DNA-Ligase des Phagen T4 bei einer Gesamtkonzentration an DNA-Fragmenten von 50 µg/ml enthält. Mit 10 µl dieser Lösung werden dann die Zellen des E. coli Stammes j. M. 109 transformiert, mit denen man dann 25 µg/ml Ampizillin sowie 0,1% X-gal und IPTG enthaltenden L-Agar beimpft. Aus den blauen Kolonien züchtet man dann Zellen auf 10 ml 100 µg/ml Ampizillin enthaltendem L-Nährmedium und isoliert mit Alkali-Lysat die DNA (∼10 µg). 0,5 µg DNA spaltet man dann mit den Restriktasen EcoRI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II und Sal I und analysiert mittels Elektrophorese im Agarose-Gel. Die Konstruktion, die über die prognostizierte Restriktasenkarte (Fig. 1) verfügt und die als SK2 bezeichnet wird, verwendet man dann auf der nächsten Stufe. 5,0 µg DNA des Kosmids pH C79 spaltet man mit der Restriktase Bgl II und das Fragment, das einen cos-Abschnitt aufweist, eluiert man nach der Elektrophorese aus der leichtschmelzbaren Agarose. 2 µg DNA von SK2 hydrolysiert man auch mit Bgl II. Dieses Präparat wird dann mit einem Fragment ligiert, das einen cos-Abschnitt enthält, in einer Pufferlösung, die 50 mMol tris-HCl (pH 7,5) 10 mMol MgCl₂, 10 mMol Dithiothreit, 3 mMol Adenosintriphosphat, 5 E. Aktivität der DNA-Ligase der Phagen T4 bei zweifachem molarem Überschuß des Fragments und bei einer Gesamtkonzentration an DNA von ∼50 µg/ml aufweist. Mit 10 µl dieser Lösung transformiert man die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109, mit denen man dann 25 µg/ml Ampizillin enthaltenden L-Agar beimpft. Von den gezüchteten Kolonien macht man Abdrücke auf Nitrocellulose-Filter und hybridisiert mit dem Fragment Bgl II des Kosmids pH C79, der den cos-Abschnitt enthält, den man durch nick-Translation mit ³²P markiert. Die Zellen aus 5 Kolonien, die sich mit dem cos-Fragment hybridisieren lassen, züchtet man in 10 ml eines ca. 100 µg < 7 ml Ampizillin L-Nährmediums und isoliert die DNA mit Alkalilysat (∼10 µg). 0,5 µg DNA spaltet man mit den Restriktasen EcoRI, PstI, Hind III, Bam I, Bgl I und Sal I und analysiert mittels Elektrophorese im Agarose-Gel. Alle 5 Phasmide verfügen über die prognostizierte Restriktasenkarte (Fig. 1), von denen eine (SK6) auf der nächsten Stufe verwendet wird.

5 µg DNA von SK6 werden teilweise mit der Restriktase EcoRI hydrolysiert, wonach man die lineare Form des Diphasmids elektrophoretisch in leichtschmelzbarer Agarose reinigt. Das erhaltene Präparat behandelt man dann in 45 µl einer Lösung, die 20 mMol tris-HCl (pH 7,4), 5,0 mMol MgCl₂, 10 mMol 2-Mercaptoethanol, 50 mMol NaCl, je 15 µMol aller 4 Desoxynukleosid-Triphosphate und 5 E Aktivität des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I enthält, innerhalb von 20 Minuten bei einer Temperatur von 20°C. Dann setzt man der Lösung 5 µl einer Pufferlösung aus 500 mMol tris-HCl (pH 7,5), 100 mMol MgCl₂, 100 mMol Dithiothreit, 30 mMol Adenosintriphosphat und 20 E Aktivität der DNA-Ligase des Phagen T4 zu. Die Ligierung führt man bei einer Temperatur von 16°C innerhalb von 14 Stunden durch. Mit 10 µl dieser Lösung werden die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 transformiert, mit denen man dann einen 25 µg/ml Ampizillin sowie 0,1% X-gal und 0,1% IPTG enthaltenden L-Agar beimpft. Aus 5 blauen Kolonien züchtet man dann Zellen auf 10 ml 100 µl/ml Ampizillin enthaltendem L-Nährmedium und isoliert die DNA des Diphasmids (10 µg). Die DNA spaltet man dann mit den Restriktasen EcoRI, Pst I, Hind III, Bam I, Bgl II, Sal I und analysiert mittels Elektrophorese im Agarose-Gel. Von den 5 analysierten DNA erwiesen sich zwei als identisch mit der Ausgangs-DNA von SK6 und drei enthielten keinen EcoRI-Abschnitt vor dem Tetracyclin-Promotor und verfügten deshalb über eine prognostizierte Restriktasenkarte (Fig. 1).

Dieses Diphasmid erhielt die Bezeichnung SK18′. 0,5 µg DNA von SK18′ wird vollständig mit der Restriktase AccI hydrolysiert, wonach man die klebrigen Enden des AccI-Abschnitts, der außerhalb des Polylinkers liegt, mit dem Klenow-Fragment in Gegenwart von dATP und dTTP auffüllt. Dieses Präparat behandelt man dann über Nacht mit DNA-Ligase des Phagen T4 (5 E Aktivität) in 50 µl einer Lösung, die 50 mMol tris-HCl (pH 7,5), 10 mMol MgCl₂, 10 mMol Dithiothreit und 3 mMol ATP enthält, bei einer Temperatur von 16°C. Mit 10 µl dieser Lösung werden die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 transformiert, mit denen man dann einen 25 µg/ml Ampizillin sowie 0,1% X-gal und 0,1% IPTG enthaltenden L-Agar beimpft. Aus 6 blauen Kolonien züchtet man dann Zellen auf 10 ml eines 100 µg/ml Ampizillin enthaltenden L-Nährmediums und isoliert die DNA (∼10 µg) durch Alkalilyse. 0,5 µg DNA spaltet man mit der Restriktase AccI und analysiert mittels Elektrophorese in Agarose-Gel. 4 Plasmide erwiesen sich mit SK18′ identisch, zwei enthielten nur einen AccI-Abschnitt. Dieses Diphasmid, das als SK18 (Fig. 2) bezeichnet wurde, verwendet man auf der nächsten Stufe.

Die DNA des Diphasmids SK18 hydrolysiert man mit der Restriktase Bgl II und stellt die Reaktion durch Erwärmung bei einer Temperatur von 65°C innerhalb von 15 Minuten ein. Dann verdünnt man die DNA dreimal und führt die Autoligierung durch.

Mit der ligierten DNA werden dann die Zahlen des E. coli-Stammes j. M. 109 transformiert, mit denen man den Ampizillin enthaltenden L-Agar beimpft. Aus 10 gezüchteten Kolonien züchtet man dann Zellen auf 10 ml eines Ampizillin enthaltenden L-Nährmediums und isoliert die DNA durch Alkalilyse. 0,5 µg DNA spaltet man dann mit den Restriktasen EcoRI, Bam I, Sal I und Bgl II und analysiert mittels Elektrophorese in einem 1%igen Agarose-Gel. 6 Phasmide verfügen über die prognostizierte Restriktasenkarte. Eine davon, die als SK2A bezeichnet wird, verwendet man auf der nächsten Stufe. Das Phasmid SK2A unterscheidet sich vom Phasmid SK2 durch das Fehlen von Erkennungs-Sites für die Restriktasen EcoRI und AccI, die außerhalb des Polylinkers liegen. Deshalb enthält das Phasmid SK2A ein Fragment des Plasmids pBR322 mit einem Abschnitt des Replikationsbeginns und mit einem Ampizillin-Resistenzgen, ein Fragment des Phagen M13mp18 mit einem Polylinker, einem Gen lac z und einem Abschnitt, der für die Verpackung der einsträngigen DNA in Proteine des Phagen M13 verantwortlich ist. Die Größe von SK2A beträgt etwa 4500 Nukleotid-Paare.

Dann wird der Erkennungs-Site für die Restriktase Sal I im Phasmid SK2A entfernt. Die DNA des Phasmids SK2A wird mit der Restriktase Sal I hydrolysiert und die Reaktion wird durch Erwärmung bei einer Temperatur von 65°C innerhalb von 15 Minuten eingestellt. Mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I aus E. coli in Gegenwart aller 4 Desoxynukleosidtriphosphate werden die klebrigen Enden geglättet. Dann wird die DNA-Lösung dreimal verdünnt und man führt die Autoligierung durch. Die ligierte DNA führt man in die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 ein. Die Beimpfung mit den Bakterien erfolgt in Petrischalen mit einem 25 µg/l Ampizillin, 0,1% IPTG und 0,1% X-gal enthaltenden 2%igen L-Agar. Aus 10 weißen Kolonien wird nach der üblichen Methode die DNA isoliert und mit den Restriktasen EcoRI, Bam I und Sal I analysiert. Das Phasmid, das EcoRI und Bam I enthält, jedoch kein Sal I, d. h. keine Erkennungs-Sites für die Restriktasen aufweist, das als SK2ΔS bezeichnet wird, verwendet man auf der nächsten Stufe, auf der man die Erkennungs-Sites für die Restriktase EcoRI im Phasmid SK2ΔS entfernt. Hierfür wird die DNA des Phasmids SK2ΔS mit der Restriktase EcoRI hydrolysiert, wonach man die Reaktion durch Erwärmung bei einer Temperatur von 65°C innerhalb von 15 Minuten einstellt. Mit Hilfe des Klenow-Fragments werden in Gegenwart aller 4 Desoxynukleosidtriphosphate die klebrigen Enden geglättet. Dann wird die DNA dreimal verdünnt und man führt die Autoligierung durch. Die ligierte DNA spaltet man mit der Restriktase EcoRI und führt sie in die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 ein. Die Beimpfung mit den Bakterien erfolgt auf einem 25 µg/ml Ampizillin enthaltenden L-Agar. Aus 10 Kolonien wird nach den üblichen Methoden die DNA isoliert und mit den Restriktasen EcoRI, Bam I, Sal I analysiert. Das Phasmid, das Bam I enthält, jedoch keine EcoRI- und Sal I-Abschnitte aufweist (als SK2ΔSR bezeichnet), verwendet man zur Konstruktion des rekombinanten Phasmids λgSR. Die DNA des Phagen λgt11 hydrolysiert man mit der Restriktase Bam I, wonach das Ferment durch Erwärmung inaktiviert wird. Dann erfolgt das Annealing der klebrigen Enden des Phagen λ durch Halten der DNA-Lösung bei einer Temperatur von 42°C innerhalb 1 Stunde, wonach das zentrale Bam I-Ferment mit einer Größe von etwa 6500 Nukleotid-Paaren mittels Gel-Elektrophorese in 0,7%iger leichtschmelzbarer Agarose (Präparat A) gereinigt wird. Die DNA des Phasmids SK2ΔSR hydrolisiert man mit der Restriktase Bam I und nach Inaktivierung des Ferments durch Erwärmung ligiert man mit dem Präparat A. Die ligierte DNA führt man in die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 ein und beimpft einen 25 µg/ml Ampizillin enthaltenden L-Agar. Von den gezüchteten Kolonien macht man Abdrücke auf Nitrocellulosefilter und hybridisiert mit dem Präparat A, dessen DNA durch nick-Translation mit ³²P markiert wird.

Die Zellen aus 5 mit dem Präparat A hybridisierten Kolonien züchtet man auf 10 ml eines 100 µg/ml Ampizillin enthaltenden L-Nährmediums und isoliert die Plasmid-DNA nach einer der üblichen Methoden. Die Analyse der erhaltenen DNA mit den Restriktasen EcoRI, Bam I und Sal I bestätigt die Klonung des Abschnitts λgt11 im Phasmid SK2ΔSR. Dieses Phasmid, das als gSR bezeichnet wird, verwendet man zur Konstruktion des Phagenvektors λgES7 (Fig. 3). 0,5 µg DNA des Phasmids gSR hydrolysiert man mit der Restriktase Bgl II, wonach man das Ferment durch Erwärmung inaktiviert. 3 µg DNA des Phagen λEMBL3 hydrolysiert man mit der Restriktase Bam I, wonach man das Ferment inaktiviert. Beide DNA-Präparate werden in äquimolaren Verhältnissen vermischt und ligiert. Die ligierte DNA verpackt man in Proteine des Phagen λ in vitro und mit 1/100 der angefallenen Phagenpartikel beimpft man einen 0,1% X-gal enthaltenden Rasen der Zellen des E. coli-Stammes LE392. Aus 10 blauen Plaques züchtet man den Phagen, isoliert die DNA und analysiert sie mit Hilfe der Restriktasen EcoRI, Bam I, Sal I. Einer der Phagen, der als λgES7 bezeichnet wird, hat die zu erwartende Struktur (Fig. 3). Dieser wird auf der nächsten Sufe verwendet.

0,5 µg DNA des Plasmids pUC4K hydrolysiert man mit der Restriktase Hind III und stellt dann die Reaktion durch Erwärmung bei einer Temperatur von 65°C innerhalb von 15 Minuten wieder ein. Dann spaltet man 4 µg DNA des Phagen λ mit Hind III und das Fragment mit einer Größe von etwa 2000 Nukleotid-Paaren und reinigt mittels Gel-Elektrophorese in 0,7%iger leichtschmelzbarer Agarose. Das gereinigte Fragment vermischt man in äquimolarer Konzentrationen mit pUC4K, das mit Hind III geschnitten wurde, und ligiert. Mit der ligierten DNA werden dann die Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 transformiert, mit denen man einen ∼25 µg/ml Ampizillin enthaltenden L-Agar beimpft. Von den gezüchteten Kolonien macht man Abdrücke auf Nitrocellulosefilter und hybridisiert mit der mit ³²P markierten DNA des Phagen λ. Aus 6 hybridisierten Kolonien züchtet man auf 10 ml eines Ampizillen enthaltenden L-Nährmediums Zellen und isoliert die DNA durch Alkalilyse (∼10 µg). 0,5 µg der DNA spaltet man mit den Restriktasen EcoRI, Bam I, Sal I, Hind III und analysiert durch Elektrophorese in 1%igem Agarose-Gel. Eines der Plasmide, das über prognostizierte Restriktasenkarte verfügt und als p4KL-I bezeichnet wird, wird auf der nächsten Stufe verwendet.

0,5 µg der DNA des Plasmids p4KL-I hydrolisiert man mit den Restriktasen EcoRI und Sal I und stellt dann die Reaktion durch Erwärmung bei einer Temperatur von 65°C innerhalb von 15 Minuten wieder ein. Dann spaltet man 2 µg DNA des Phagen λgES7 mit der Restriktase Sal I und inaktiviert durch Erwärmung auf 65°C innerhalb von 15 Minuten. Beide Präparate vermischt man in äquimolaren Verhältnissen und ligiert. Die ligierte DNA verpackt man in Proteine des Phagen in vitro und mit 1/500 der angefallenen Phagenpartikel beimpft man einen Rasen der Zellen des E. coli-Stammes LE392.

Von der Petrischale macht man einen Abdruck auf ein Nitrocellulosefilter und hybridisiert mit dem mit ³²P markierten Fragment DNA pUC4K, das ein Kanamyzin-Resistenzgen aufweist und aus dem Plasmid mit der Restriktase Sal I ausgeschnitten wird. Aus 6 hybridisierten Plaques züchtet man in 10 ml des L-Nährmediums mit Zellen des E. coli-Stammes LE392 die Phagen, isoliert die DNA und analysiert sie mit Hilfe der Restriktasen EcoRI, Bam I und Sal I. Alle Phagen enthalten ein inaktiviertes Kanamyzin-Resistenzgen und eines davon (λgSK5) verwendet man zur Konstruktion von λSK15.

10 µg des Phagen λEMBL3 hydrolysiert man mit der Restriktase BAM I, wonach man das Insertionsfragment mit einer Größe von etwa 13 700 Nukleotid-Paaren mittels Gel-Elektrophorese in 0,7%iger leichtschmelzbarer Agarose reinigt. 2 µg DNA des Phagen λgSK5 hydrolysiert man mit der Restriktase Bam I und inaktiviert durch Erwärmung bei einer Temperatur von 65°C innerhalb von 15 Minuten.

Beide Präparate vermischt man in äquimolaren Verhältnissen und ligiert. Die ligierte DNA verpackt man in vitro in Proteine des Phagen und mit 1/100 der angefallenen Phagenpartikel beimpft man einen Rasen der Zellen des E. coli Stammes LE392. Die gezüchteten Plaques überimpft man auf einen Rasen der Zellen Q359, die für den Phagen P2 lysogen sind. Das Insertionsfragment aus λEMBL3 gewährleistet den spi⁺-Phänotyp, d. h. die Unmöglichkeit, sich auf Zellen von E. coli zu vermehren, die für den Phagen P2 lysogen sind. Deshalb züchtet man aus 6 Plaques, die nicht auf Q359 gewachsen sind, einen Phagen, isoliert die DNA und analysiert sie mit Hilfe der Restriktasen EcoRI, Bam I und Sal I. Einer der Phagen weist die zu erwartende Struktur auf und wird als λSK15 bezeichnet.

Beispiel 2 Klonung der Fragmente der Genom-DNA eines Menschen in λSK15

3 µg DNA des Menschen spaltet man mit der Restriktase Bam I unter üblichen Bedingungen und inaktiviert das Ferment durch Erwärmung bei einer Temperatur von 65°C während 15 Minuten.

3 µg DNA von λSK9 werden mit den Restriktasen Bam I und EcoRI hydrolysiert und die Fermente durch Erwärmung inaktiviert und von Oligonukleotid-Linkern durch Fällung mit Polyethylenglykol-6000 gereinigt.

Beide Präparate vermischt man (das Gewichtsverhältnis DNA des Vektors zur Genom-DNA beträgt 2 : 1) und nimmt die Ligierung bei einer Gesamtkonzentration an DNA von 250 µg/ml vor.

1.10^-2 µg ligierter DNA verpackt man in Proteine in vitro und mit 1/500 der erhaltenen Phagenpartikel beimpft man einen Rasen des E. coli-Stammes LE392. Bei der Überimpfung von Plaques auf den Rasen Q359 wächst nur eines nicht, weshalb die rekombinanten Phagen über 95% betragen. Von den 6 zufällig ausgewählten Plaques vom Rasen LE 392 züchtete man in 10 ml des L-Nährmediums mit LE392 Phagen und isolierte die DNA. Die elektrophoretische Analyse der DNA zeigte, daß sie alle Rekombinanten darstellen und ein DNA-Insert von 4000 bis 7000 Nukleotid-Paaren enthalten. 0,5 µg DNA davon (Phagen Nr. 1) werden innerhalb von 30 Minuten mit einer Einheit der Restriktase Sal I hydrolysiert. Das Ferment inaktiviert man durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen. Die DNA verdünnt und ligiert man bei Raumtemperatur während einer Stunde. 0,1 µg ligierter DNA setzt man den kompetenten Zellen des E. coli-Stammes j. M. 109 zu, inkubiert innerhalb von 10 Minuten bei 0°C, wonach man innerhalb von 3 Minuten bei einer Temperatur von 38°C und nach Zusatz von 1 ml des L-Nährmediums noch weitere 45 Minuten bei einer Temperatur von 37°C inkubiert. Dann wird ein 25 µg/ml Ampizillin enthaltender L-Agar mit 0,2 ml Zellen beimpft. Aus 3 Kolonien züchtet man in 10 ml des 50 µg/ml Ampizillin enthaltenden L-Nährmediums Zellen und isoliert die DNA durch Alkalilyse. Die elektrophoretische Analyse der DNA zeigt, daß die Plasmide das gleiche DNA-Insert enthalten wie auch der Ausgangsphage Nr. 1.

Der Vektor λSK15 findet Anwendung bei der Konstruktion von Bibliotheken der kDNA-Strukturgene und bei der Klonung interessierender Gene aus diesen Bibliotheken.

Claims (2)

1. Phagen-Vektor zur Substitution von λSK15 zwecks Konstruktion von Bibliotheken von kDNA-Strukturgenen, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Größe von 51 200 Nukleotid-Paaren aufweist und zusammengesetzt ist aus:

   • - Cos-Sal I-DNA-Fragment des Phagen λEMBL3 - linker Arm mit einer Größe von 20 300 Nukleotid-Paaren;
   • - Sal I-Hind III-Fragment des Kanamyzin-Resistenzgens mit einer Größe von ca. 500 Nukleotid-Paaren;
   • - Hind III-Hind III-Fragment des Phagen λ mit einer Größe von 2000 Nukleotid-Paaren;
   • - Hind III-Sal I-Fragement des Kanamyzin-Resistenzgens mit einer Größe von ca. 1000 Nukleotid-Paaren;
   • - Sal I-Bgl II-DNA-Fragment des Phasmids SK2A mit einer Größe von 3800 Nukleotid-Paaren, wobei durch Auffüllen der EcoRI-Site zerstört wird; das erwähnte Phasmid SK2A wurde aus dem Vektor SK18 konstruiert, der aus DNA-Fragmenten des Phagen λ, des Phagen M13 und dem Kosmid pH C79 gewonnen wurde;
   • - Bam I-Bam I-DNA-Fragment des Phagen λEMBL3 mit einer Größe von 13 700 Nukleotid-Paaren;
   • - Bam I-Bgl II-DNA-Fragment des erwähnten Phasmids SK2A mit einer Größe von 700 Nukleotid-Paaren, wobei durch Auffüllen der Sal I-Site zerstört wird;
   • - Sal I-Cos-DNA-Fragment des Phagen λEMBL3 - linker Arm mit einer Größe von 9200 Nukleotid-Paaren;
   • - Stellen der möglichen Insertion einer Fremd-DNA an den Erkennungs-Sites für die Restriktasen EcoRI und Bam I; die Vektorengröße beträgt 200 bis 15 400 Nukleotid-Paare;
     er weist das Spektrum der Wirte der Stämme von Escherichia coli auf:
     LE392=F′, hsd R 514 (r , m ), supE44, supF58, lac Y10Z (lacIZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55, j.M.109=recΔ1, ΔIac pro, end A1, gyr A96, thi-1, hds R17, sup E44, rel A1, F′, tra D36, pro AB⁺, lac I^qZΔM15, Q359=hsdR_k ^-, hsdM_k⁺, sup F, ⌀ 80, P2;
2. hinterlegt am 21. 07. 1989 bei der all-Unionssammlung für industrielle Mikroorganismen des USSR-Forschungsinstituts für Genetik und industrielle Mikroorganismen-Züchtung und eingetragen unter PH Nr. 688.