DE602004010788T2

DE602004010788T2 - Hühner-rna-polymerase-i-promotor und deren verwendung

Info

Publication number: DE602004010788T2
Application number: DE602004010788T
Authority: DE
Inventors: Nadia Naffakh; Pascale Massin; Sylvie Van Der Werf
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Universite Paris Diderot Paris 7
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Universite Paris Diderot Paris 7
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2004-02-27
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2024-02-28
Also published as: BRPI0407855A; EP1597376A2; WO2004078912A3; HK1090663A1; CA2421086A1; DK1597376T3; PT1597376E; US20070134270A1; ES2295831T3; US7935807B2; WO2004078912A2; EP1597376B1; CN100465280C; WO2004078912A8; DE602004010788D1; CY1107186T1; CN1780916A; ATE381625T1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Polynukleotid, welches eine die Transkription fördernde Aktivität aufweist, Vektoren, die dieses Polynukleotid enthalten, und deren Verwendung für die Transkription von Sequenzen von Interesse, wie für die Herstellung von RNA von nicht-umhüllten Viren. Die Erfindung betrifft gleichfalls die Wirtszellen, vorzugsweise von Vogel-Ursprung, welche ein Polynukleotid oder einen Vektor der Erfindung enthalten.
Die Verhütung der Grippe beruht essentiell auf der Impfung, die stark empfohlen wird. Sie wird beispielsweise in Frankreich von der Caisse Nationale d'Assurance Maladie bei den Risikopatienten: im Wesentlichen die älteren Menschen von 65 Jahren und darüber und die an chronischen Erkrankungen (Atemwegs-, Herz-Kreislauf-, Nieren- oder Stoffwechselerkrankungen) leidenden Patienten, zu 100% übernommen. Die nach der Impfung bestehende Immunität wird durch die Produktion von Antikörpern, die gegen die Oberflächenglykoproteine, insbesondere gegen Hämagglutinin (HA), aber auch gegen die Neuraminidase (NA) gerichtet sind, verliehen.
I – Die gegenwärtigen Verfahren: Herstellung mittels embryonierter Hühnereier und Inaktivierung
Die Grippeimpfstoffe bestehen aus drei unterschiedlichen Virusstämmen, einem vom Typ A(H3N2), einem anderen vom Typ A(H1N1) und dem dritten vom Typ B. Die Wahl der Impfstämme wird jedes Jahr abhängig von den Daten aus der Überwachung der im Umlauf befindlichen Varianten erneut überprüft und bildet den Gegenstand einer Empfehlung, die durch die WHO gegen Mitte Februar für die Nordhalbkugel ergeht. Die seit etwa 30 Jahren üblicherweise eingesetzten Impfstoffe bestehen aus Viren, die mittels embryonierter Hühnereier vermehrt und inaktiviert werden (Manuguerra, 2001, Repéres sur les infections bronchopulmonaires, S. 328–342. Herausgegeben von P. Léophonte & Y. Mouton: PIL).
Für die Viren vom Typ A werden ergänzende Viren mit hohem Vermehrungsvermögen in embryonierten Eiern, und welche die HA und die NA der durch die WHO angegebenen Varianten aufweisen, hergestellt und an die industriellen Impfstoffproduzenten geliefert. Man muss ein bis zwei embryonierte Eier rechnen, um eine Dosis von trivalentem Impfstoff herzustellen. Die Reinigung erfolgt je nach Herstellungsfirma auf unterschiedliche Weise, aber indem dem gleichen Prinzip gefolgt wird: die Allantoisflüssigkeit wird entnommen und die Viren werden durch Behandlung mit Formaldehyd oder β-Propiolacton inaktiviert, bevor sie durch Ultrazentrifugation gereinigt werden. Sie können gegebenenfalls mit Hilfe von Lösemitteln von Lipiden und/oder Detergentien, wie Tween 80, fragmentiert werden. Die vollständigen oder fragmentierten Viren werden dann auf die übliche Dosis von 15 μg HA pro Impfstoffdosis für jeden der Stämme eingestellt. Ein Reinigungsschritt in Gegenwart von dialysierbarem Detergens erlaubt, einen Un tereinheiten-Impfstoff herzustellen, der im Wesentlichen nicht mehr als die Hüllglykoproteine (HA und NA) des Virus enthält. Aufgrund der stärkeren eine Reaktion hervorrufenden Eigenschaft des Impfstoffs auf Basis von vollständigen Viren sind es gleichwohl die fragmentierten und Untereinheiten-Impfstoffe, die künftig vertrieben werden. Die für die Herstellung und die Kontrolle der Qualität des Impfstoffs, bevor er in Übereinstimmung mit den europäischen Normen auf den Markt gebracht wird, erforderliche Zeitspanne liegt in der Größenordnung von 6 Monaten.
Da sie aus inaktivierten Viren bestehen, werden die Grippeimpfstoffe im Allgemeinen sehr gut vertragen und rufen lediglich sehr schwache unerwünschte Wirkungen hervor: lokale Reaktionen an der Injektionsstelle, Fieber- und Kopfreaktionen in den beiden Tagen nach der Injektion. Die Kontraindikationen der Grippeimpfung beschränken sich auf die Allergien gegen die Proteine des Eis, hauptsächlich Ovalbumin, und die Allergien gegen Herstellungsrückstände oder gegen Quecksilberthiolat. Aufgrund des Fehlens von Informationen über die Wirkung, die diese auf die Entwicklung des Fötus haben kann, wird von der Grippeimpfung bei schwangeren Frauen im ersten Trimester der Schwangerschaft abgeraten.
Die Wirksamkeit, mit welcher die aus inaktivierten Viren zusammengesetzten Impfstoffe gegen eine nachfolgende grippale Infektion schützen, ist schwierig auszuwerten, denn sie kann von einer Saison zur anderen enorm variieren, insbesondere abhängig von dem Grad von auf die Antigene bezogener Ähnlichkeit zwischen den zirkulierenden Viren und jenen, die in dem Impfstoff enthalten sind, und sie hängt gleichfalls von dem Immunitätsstatus des Geimpften ab. In Frankreich wird die Verbesserung der Impfversorgung zwischen 1979 und 1999 von einer Verringerung der mit der Grippe verbundenen Mortalität begleitet (etwa 20.000 Tote pro Jahr in 1979, 2500 Tote pro Jahr seit 1985), was, ohne dass dies bewiesen wurde, einen positiven Einfluss der Impfpolitik nahelegt. Außerdem hat das Zusammentragen von zahlreichen Untersuchungen erlaubt, abzuschätzen, dass die Impfung bei den älteren Menschen erlaubt, die Anzahl von viralen Pneumonien und Krankenhausaufenthalten in der Größenordnung von 50% und die Anzahl von Fällen von tödlich verlaufender Grippe in der Größenordnung von 70% zu verringern (Gross et al., 1995, Annals of Internal Medecine, 123, 518–527).
II – Die Entwicklungsperspektiven der Grippeimpfstoffe
Gegenwärtig werden mehrere Forschungswege erforscht mit dem Ziel, 1) die Intensität, die Qualität und die Dauer der durch den Grippeimpfstoff induzierten Reaktionen zu verbessern und deren Spezifität zu verbreitern; und 2) eine schnelle Reaktion zu ermöglichen im Notfall eines potentiell pandemischen Virus eines neuen Subtyps. Die Arbeiten, welche die Produktion von Lebendimpfstoffen einerseits und die Produktion von Impfviren mit Hilfe von Zellkultur andererseits betreffen, werden nachfolgend zusammengefasst. Unter den anderen erforschten Forschungswegen kann man gleichfalls die Verwendung von Adjuvantien, von rekombinanten Untereinheiten-Impfstoffen oder von Polynukleotid-Impfstoffen aufführen.
– Produktion von Lebendimpfstoffen
Ein Grippe-Lebendimpfstoff ist in der Lage, eine breitere und dauerhaftere Immunität zu induzieren, insbesondere aufgrund der Stimulation der zellvermittelten Immunität, und durch die allgemeine Bevölkerung besser akzeptiert zu werden, denn er wird auf nasalem Wege und nicht auf parenteralem Wege verabreicht. Heute können zwei Arten von Lebendimpfstoffen ins Auge gefasst werden: die attenuierten Lebendimpfstoffe und die rekombinanten Lebendimpfstoffe.
Attenuierte Lebendimpfstoffe
Die attenuierten Stämme werden erhalten durch Ergänzung der zirkulierenden Wildstämme mit einem durch Kälteadaptierung attenuierten Donorstamm, dessen Genotyp gut charakterisiert ist, ohne dass gleichwohl die Beziehungen zwischen den beobachteten Mutationen und dem Phänotyp (der Attenuierung, der Kälteadaptierung, der Wärmeempfindlichkeit) perfekt ermittelt sind (Keitel et al., 1998, Textbook of Influenza, S. 373–390. Herausgegeben von K. G. Nicholson, R. G. Webster & A. J. Hay. Oxford, England: Blackwell Science, Ltd.).
Das Verfahren zur Herstellung von attenuierten Impfstoffen mittels eines embryonierten Hühnereis ist analog zu jenem, das oben beschrieben worden ist, wobei der Inaktivierungsschritt des Virus selbstverständlich weggelassen wird. Die Ergebnisse von klinischen Versuchen, die unlängst durch amerikanische Laboratorien ausgeführt worden sind, weisen darauf hin, dass aus attenuierten Stämmen zusammengesetzte trivalente Impfstoffe, welche auf intranasalem Wege verabreicht werden, beim Erwachsenen, bei den älteren Menschen und den Kindern ungefährlich sind, mit als einzigen Nebenwirkungen der Reizung des Rachens und einem Laufen der Nase während den beiden Tagen nach der Impfung. Sie könnten eine schützende Wirkung haben, die jener der inaktivierten Impfstoffe überlegen ist, insbesondere aufgrund der Induktion einer mukosalen Antikörperantwort vom Typ IgA, aber ihr Transmissions- und Reversionspotential muss noch dokumentiert werden. Die Impfung mit Hilfe von attenuierten lebenden Viren wird seit mehreren 10 Jahren in großem Maßstab in Russland praktiziert, es ist aber schwierig, überzeugende globale Ergebnisse daraus abzuleiten aufgrund einer sehr großen Streuung der eingesetzten Bedingungen.
Rekombinante Lebendimpfstoffe
Die unlängst erfolgte Entwicklung von inverse Genetik-Systemen für die Grippeviren (Neumann et al., 2001, Virology 287, 243–50) erlaubt, die Herstellung von rekombinanten Viren ins Auge zu fassen, in das Genom von welchen genetische Modifizierungen speziell eingeführt worden sein könnten, um ihnen adäquate Attenuierungs- und Immunogenitätseigenschaften zu verleihen. Dieser Ansatz würde eine erhöhte Sicherheit (aufgrund des Fehlens von verunreinigenden Agentien vom Typ von jenen, die in den Proben, welche von Virusstämmen herstammen, vorhanden sein können, und der Möglichkeit, die Reversionsrisiken des Impfvirus leichter minimieren und steuern zu können) aufweisen und erlauben, auf spezifischere Weise auf unterschiedliche Epidemiesituationen zu reagieren. Die inverse Genetik-Systeme, die heutzutage existieren, beruhen auf der Verwendung des humane RNA-Polymerase I-Transkriptionssystems. Aufgrund der engen Speziesspezifität der RNA-Polymerase I ist deren Verwendung auf Zellen von humaner Herkunft oder von Primaten beschränkt. Sie könnten für die Produktion von rekombinanten Impfviren mit Hilfe von Zellkultur, aber nicht mit Hilfe von embryonierten Hühnereiern eingesetzt werden.
– Produktion von Impfviren mit Hilfe von Zellkultur
Die hauptsächlichen Vorteile der embryonierten Hühnereier als Träger für die Produktion von Grippe-Impfviren sind: i) eine sehr hohe Virusausbeute; und ii) das geringere Risiko einer Verunreinigung durch für den Menschen pathogene Agentien, was insbesondere unter der Perspektive der Herstellung von nicht-inaktivierten Impfstoffen zu berücksichtigen ist. Die Möglichkeit, Impfviren mit Hilfe von kultivierten Zellen in serumfreiem Medium zu produzieren, ist auch erforscht worden. Die Firmen Baxter und Solvay haben unlängst Homologe der Banken von von den Linien Vero bzw. MDCK abgeleiteten Zellen für die Produktion von Impfviren erstellt. Ein mit Hilfe von MDCK hergestellter und inaktivierter Impfstoff hat 2001 die Marktzulassung erhalten, ist aber noch nicht kommerzialisiert worden.
In der Zukunft werden auf dem Markt wahrscheinlich mehrere Arten von Grippeimpfstoffen, inaktivierten oder Lebendimpfstoffen, produziert mittels embryonierter Hühnereier oder mittels Zellkultur, coexistieren, wobei sich unter diesen bestimmte vielleicht als besonders angezeigt für die Impfung einer bestimmten Kategorie von Individuen und weniger angezeigt für eine andere erweisen werden. Im Falle einer Pandemie müssen alle verfügbaren Produktionsmittel, mittels embryonierter Eier und mittel Zellkultur, mobilisiert werden.
Die Erfindung entspricht diesen Bedürfnissen und anderen Bedürfnissen, wie sie einem Fachmann auf diesem Gebiet beim Lesen der vorliegenden Beschreibung der Erfindung ersichtlich sein werden.
Die Erfindung betrifft ein Polynukleotid, rekombinante DNAs, welche dieses Polynukleotid enthalten, und deren Verwendung, vorzugsweise für die Herstellung von nicht-umhüllten RNA-Viren zu Impfzwecken.
Spezieller hat die Erfindung ein isoliertes oder gereinigtes Polynukleotid zum Gegenstand, welches aus der in 1 aufgeführten Sequenz SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment von dieser besteht und welches eine die Transkription fördernde Aktivität aufweist.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein isoliertes oder gereinigtes Polynukleotid, welches aus der in 2 aufgeführten Sequenz SEQ ID NO: 2 oder einem Fragment von dieser besteht und welches eine die Transkription fördernde Aktivität aufweist.
Die Erfindung betrifft außerdem eine rekombinante DNA, umfassend eines der Polynukleotide der Erfindung oder ein Fragment davon; einen Vektor, umfassend eines der Poly nukleotide der Erfindung oder eine rekombinante DNA oder ein Fragment von jener; eine Wirtszelle und ein embryoniertes Ei von Vogel-Ursprung, welche den Vektor enthalten.
Die Erfindung erstreckt sich gleichfalls auf die Verwendung von mindestens einem der folgenden Elemente für die Herstellung einer Sequenz von Interesse, wie beispielsweise ein rekombinantes nicht-umhülltes RNA-Virus:

– ein Polynukleotid gemäß der Erfindung;
– eine rekombinante DNA gemäß der Erfindung;
– ein Vektor gemäß der Erfindung;
– eine Wirtszelle gemäß der Erfindung; und
– ein embryoniertes Ei von Vogel-Ursprung gemäß der Erfindung.

Bei einer besonderen Ausführung betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten nicht-umhüllten Viren durch inverse Genetik, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) Einführung in eine Vogelzelle oder in ein embryoniertes Ei von Vogel-Ursprung von einem oder mehreren Vektoren, wobei der oder die Vektoren eine rekombinante DNA gemäß der Erfindung und die DNAs, die die für die Transkription/Replikation der viralen RNA erforderlichen Proteine exprimieren, umfassen;
b) Anwendung von Bedingungen, welche die Expression von rekombinanten Viren erlauben, bei der Zelle oder bei dem Ei, die bzw. das in a) erhalten worden ist; und
c) Gewinnung der in b) erhaltenen rekombinanten Viren.

Bei einer bevorzugten Ausführung schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Grippeviren durch inverse Genetik vor, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) Einführung in eine Vogelzelle oder in ein embryoniertes Hühnerei von wenigstens einem Vektor, welcher eine rekombinante DNA gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung umfasst, und von Vektoren, welche die Proteine PA, PB1, PB2 und NP eines Grippevirus exprimieren;
b) Anwendung von Bedingungen, welche die Expression von rekombinanten Grippeviren erlauben, bei der Zelle oder bei dem Ei, die bzw. das in a) erhalten worden ist; und
c) Gewinnung der in b) erhaltenen rekombinanten Grippeviren.

Die Klonierung des Promotors der RNA-Polymerase I vom Huhn erlaubt in vorteilhafter Weise, ein inverse Genetik-System zu entwickeln, das für die Herstellung von rekombinanten Impfviren mit Hilfe von embryovierten Hühnereiern angepasst ist, das sich als für die Herstellung von Lebendimpfstoffen besonders angepasst erweisen könnte.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die 1 zeigt eine Sequenz (SEQ ID NO: 1), welche dem AgeI-SacI-Fragment der genomischen DNA vom Huhn, welches den Promotor der RNA-Polymerase I vom Huhn enthält, entspricht.
Die 2 zeigt ein zweites Fragment von genomischer DNA vom Huhn (BsaI-SacI) mit der Sequenz SEQ ID NO: 2, welches den Promotor der RNA-Polymerase I vom Huhn enthält.
Die 3 zeigt das Protokoll, das eingesetzt wurde, um die Transkriptionseffizienz der CAT-Sequenz ausgehend von Sequenzen, die von dem Cosmid C13–18 abgeleitet sind, zu analysieren.
Die 4 zeigt die Ergebnisse der wiederholten Analyse von Restriktionsfragmenten, die von dem von dem Cosmid C13–18 abgeleiteten PacI/NotI-Fragment abgeleitet sind.
Die 5 zeigt das Ergebnis von parallel ausgeführten Sequenzierungs- und Primer-Extension (Primerverlängerungs)-Reaktionen, die innerhalb des AgeI/SacI-Fragments, das in der 1 beschrieben ist, die hauptsächliche Startstelle der Transkription durch die RNA-Polymerase I vom Huhn nachweisen.
Die 6 ist ein Schema, welches die CAT-Konzentrationen zeigt, die gemessen wurden in den zytoplasmatischen Extrakten von Zellen, die mit Plasmiden transfiziert sind, die Pseudo-Grippe-RNAs unter der Kontrolle des humanen PolI-Promotors oder des PolI-Promotors vom Huhn kodieren (in ng/10⁶ transfizierte Zellen und 24 h nach der Transfektion).
Die Neuartigkeit der Erfindung beruht auf einer Polynukleotidsequenz, die vorzugsweise eine die Transkription fördernde Aktivität, hauptsächlich in den Vogelzellen, aufweist. Die Erfinder haben identifiziert, dass diese fördernde Sequenz (Promotorsequenz) der Promotor der RNA-Polymerase I vom Huhn ist.
Die Erfindung betrifft auch die Beteiligung dieses Polynukleotids an der Herstellung von Sequenzen von Interesse, wie beispielsweise rekombinanten Grippeviren gemäß dem System der inversen Genetik.
1. Polynukleotid und rekombinante DNA
Gemäß einem ersten Aspekt zielt die Erfindung auf ein isoliertes oder gereinigtes Polynukleotid ab, bestehend aus der in der 1 dargestellten Sequenz SEQ ID NO: 1 oder aus der in der 2 dargestellten Sequenz SEQ ID NO: 2 oder einem Fragment von jenen. Dieses Polynukleotid oder eines von seinen Fragmenten weist eine die Transkription fördernde Aktivität auf.
Unter Fragmenten bevorzugt man die Fragmente, deren Sequenz mindestens 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75 oder 100 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 umfasst und welche eine die Transkription fördernde Aktivität aufweisen.
Obgleich das Polynukleotid oder der Promotor der Erfindung vorzugsweise dadurch gekennzeichnet ist, dass es bzw. er eine die Transkription fördernde Aktivität in den Vogelzellen aufweist, weist dieser Promotor insbesondere die Fähigkeit auf, die Transkription in den Geflügelzellen und noch spezieller in den Hühnerzellen zu fördern.
Mit Nukleotidsequenz, Nukleinsäure, Nukleinsequenz oder Nukleinsäuresequenz, Polynukleotid, Polynukleotidsequenz, Begriffe, die in der vorliegenden Anmeldung unterschiedslos eingesetzt werden, soll eine präzise Aneinanderreihung von Nukleotiden, die modifiziert sind oder nicht, bezeichnet werden, die erlaubt, ein Fragment oder eine Region eines Polynukleotids, welches nicht-natürliche Nukleotide umfasst oder nicht umfasst und ebenso gut einer doppelsträngigen DNA oder einer einzelsträngigen DNA entsprechen kann, zu definieren. Dies umfasst gleichfalls die DNA-Moleküle, die RNA-Moleküle, die cDNAs, die künstlichen Sequenzen und alle Fragmente von jenen. Es versteht sich von selbst, dass die Definitionen „abgeleitet von", „Variante" und „mutiert" gleichfalls auf die erfindungsgemäßen Polynukleotide Anwendung finden. Ein jegliches Polynukleotid, das chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifiziert worden ist, das aber die Eigenschaften des ursprünglichen Polynukleotids beibehalten hat, d. h. die die Transkription fördernde Aktivität in den Vogelzellen, wird von dem Umfang der Erfindung umfasst.
Es muss sich verstehen, dass die Erfindung keine Nukleotidsequenzen in ihrer natürlichen chromosomalen Umgebung betrifft, d. h. im natürlichen Zustand. Es handelt sich um Sequenzen, die isoliert und/oder gereinigt worden sind, d. h. die direkt oder indirekt, beispielsweise durch Klonierung, Amplifizierung und/oder chemische Synthese entnommen worden sind, wodurch ihre Umgebung zumindest teilweise modifiziert worden ist. Es muss sich verstehen, dass ein Polynukleotid, das in einen Organismus durch Transformation, genetische Manipulation oder durch welche andere Rekombinationsmethode auch immer eingeführt wird, „isoliert" ist, selbst wenn es in dem Organismus vorliegt.
Die erfindungsgemäßen Promotorsequenzen weisen vorzugsweise eine DNA-Sequenz auf, die einen Identitätsprozentsatz von mehr als 70% mit der einen oder der anderen der Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, die in den 1 und 2 beschrieben werden, aufweist. Insbesondere weisen die Promotorsequenzen der Erfindung einen Identitätsprozentsatz von mehr als 80% und noch mehr bevorzugt von 90% mit der einen oder der anderen der Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, die in den 1 und 2 beschrieben werden, oder einem Fragment von jenen auf. Unter „Identitätsprozentsatz" versteht man einen Prozentsatz, der das Identitätsausmaß zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen entlang der Sequenzen in ihrer Gesamtheit angibt. Wenn die betreffenden Sequenzen unterschiedliche Größe aufweisen, wird der Identitätsprozentsatz ausgedrückt abhängig von der gesamten Länge der kürze ren Sequenz. Um den Identitätsprozentsatz zu berechnen, werden die beiden Sequenzen derart übereinandergelegt, dass die Anzahl von identischen Basen maximiert wird, wobei Intervalle zugelassen werden, dann wird die Anzahl von identischen Basen durch die gesamte Anzahl von Basen der kürzeren Sequenz geteilt.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft eine rekombinante DNA, welche ein Polynukleotid, wie vorstehend definiert, umfasst.
Diese rekombinante DNA kann beispielsweise die in der 1 dargestellte Promotorsequenz SEQ ID NO: 1 oder die in der 2 dargestellte Promotorsequenz SEQ ID NO: 2 oder ein Derivat von jenen, in welches eine Klonierungsstelle, welche so die Verwendung von dieser Sequenz als „mobiler" Promotor erleichtert, inseriert ist, enthalten. Gemäß einem bevorzugten Modus enthält die rekombinante DNA der Erfindung außerdem eine zu transkribierende Sequenz. Unter "zu transkribierende Sequenz" oder „Sequenz von Interesse" versteht man eine Sequenz, die als Matrix für das Synthetisieren von RNA-Molekülen, wie vRNA, dienen kann. Vorzugsweise ist die zu transkribierende Sequenz eine cDNA eines nicht-umhüllten RNA-Virus, d. h. dass die Enden des Transkriptionsprodukts keine ergänzenden Nukleotide enthalten dürfen. Mehr bevorzugt ist die zu transkribierende Sequenz eine cDNA eines RNA-Virus mit negativer Polarität, wie eines Orthomyxovirus oder eines Paramyxovirus. Als Beispiel ist das Orthomyxovirus ein Influenzavirus, vorzugsweise vom Typ A, wohingegen das Paramyxovirus vorzugsweise unter der Gattung der Rubulaviren (vorzugsweise dem Mumpsvirus und dem Newcastle-disease-Virus), der Gattung der Morbilliviren (vorzugsweise dem Masernvirus), der Gattung der Pneumoviren (vorzugsweise dem Respiratory Syncytial Virus) oder der Gattung der Metapneumoviren ausgewählt wird. Gemäß einem bevorzugten Modus der Erfindung ist die rekombinante DNA dadurch gekennzeichnet, dass sie eine vRNA eines Orthomyxovirus, wie eines Grippevirus, und vorzugsweise eine vRNA, welche unter den vRNA-Segmenten 1 bis 8 des Influenzavirus ausgewählt ist, exprimiert. Die „zu transkribierende Sequenz" oder die „Sequenz von Interesse" kann gleichfalls für die Produktion von Antisinn-RNA dienen, d. h. deren Struktur durch Hybridisierung mit der Zielsequenz (beispielsweise einem RNA-Virus von negativer Polarität) eine Inhibition der Replikation oder Transkription einer viralen RNA oder eine Inhibition der Expression eines entsprechenden Proteinprodukts sicherstellt.
Die Erfindung betrifft gleichfalls Vektoren, welche rekombinante DNAs, wie zuvor beschrieben, enthalten. Diese Vektoren erlauben die Einführung und gegebenenfalls die Expression der zu transkribierenden Sequenz in einer Wirtszelle. Als Beispiel von Vektoren kann man die plasmidischen Expressionsvektoren, die viralen Vektoren, die integrativen Vektoren und die autosomalen Vektoren aufführen. Insbesondere ist ein Vektor gemäß der Erfindung das Plasmid pGEM-ChPolI-C15. Dieses Plasmid ist in dem Stamm pGEM-ChPolI-C15-E. coli 1305 enthalten, der gemäß dem Budapester Vertrag bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) Institut Pasteur, 28, rue du Dr. Roux, 75724 PARIS (Frankreich) am 24. Februar 2003 unter der Nummer 1–2976 hinterlegt worden ist. Das Plasmid pGEM-ChPolI-C15 ist von dem Plasmid pGEM52F+ (Promega) abgeleitet. Ein Eael-Restriktionsfragment von 524 bp, welches von der die bakterielle Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierenden Sequenz abgeleitet ist, wurde in die NotI-Stelle von pGEM52F+ kloniert. Ein AgeI-SacI-Restriktionsfragment, welches von dem Cosmid C13–18 abgeleitet ist, wurde auf der Höhe der EcoRI-Stelle von pGEM5F+ strangaufwärts von dem CAT-Insert kloniert. Dieses Fragment von 1260 bp enthält den Minimalpromotor der RNA-Polymerase I vom Huhn der Erfindung.
Die Erfindung betrifft auch die Herstellung von transgenen Vögeln, welche unter der Kontrolle des PolI-Promotors RNAs exprimieren, welche eine Resistenz gegen Infektionen durch pathogene Mikroorganismen, insbesondere gegen die Vögel-Grippeviren, verleihen.
2. Zelle und embryoniertes Ei von Vogel-Ursprung
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung durch einen Vektor, wie zuvor beschrieben, transformierte Zellen. Vorzugsweise ist die so transformierte Wirtszelle von Vogel-Ursprung. Gemäß einer bevorzugten Variante der Erfindung ist die Wirtszelle eine Geflügelzelle und noch mehr bevorzugt eine Hühnerzelle. Es versteht sich, dass im Sinne der Erfindung die transformierten Wirtszellen dies vorzugsweise auf stabile Weise sind. Gleichwohl ist es vorstellbar, auf vorübergehende Weise transformierte Zellen bereitzustellen.
Gemäß einem damit verbundenen Aspekt betrifft die Erfindung gleichfalls „transfizierte" embryonierte Eier von Vogel-Ursprung (vorzugsweise vom Huhn). Insbesondere umfassen die embryonierten Eier der Erfindung einen Vektor, wie zuvor beschrieben.
Die Verfahren, die eingesetzt werden, um einen Vektor, wie zuvor beschrieben, in eine Wirtszelle oder in ein embryoniertes Ei gemäß der Erfindung einzuführen, beruhen auf den allgemeinen Kenntnissen eines Fachmanns auf dem Gebiet der Zelltransfektion und der Inkubation von Eiern und werden folglich nicht detaillierter beschrieben.
3. Verfahren und Verwendungsverfahren
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Herstellung von Sequenzen von Interesse, wie beispielsweise von rekombinanten Impfviren und insbesondere die Herstellung eines rekombinanten nicht-umhüllten RNA-Virus. Unter einem ergänzenden Aspekt zielt die Erfindung auf die Verwendung von mindestens einem der folgenden Elemente für die Herstellung einer Sequenz von Interesse, beispielsweise eines rekombinanten nicht-umhüllten RNA-Virus, ab:

In einem damit verbundenen Aspekt schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten nicht-umhüllten Viren vor. Eine solche Herstellung basiert auf dem System zur Herstellung von rekombinanten Viren durch inverse Genetik, wie zuvor beschrieben. Insbesondere umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Schritte:

a) Einführung in eine Zelle oder in ein embryoniertes Ei von Vogel-Ursprung von einem oder mehreren Vektoren, wobei der oder die Vektoren eine rekombinante DNA gemäß der Erfindung und die DNAs, die die für die Transkription/Replikation der viralen RNA erforderlichen Proteine (wie beispielsweise die Proteine PA, PB1, PB2 und NP eines Grippevirus) exprimieren, umfassen;
b) Anwendung von Bedingungen, welche die Expression von rekombinanten Viren erlauben, bei der Zelle oder bei dem Ei, die bzw. das in a) erhalten worden ist; und
c) Gewinnung der in b) erhaltenen rekombinanten Viren.

Es wird sich verstehen, dass sich in Schritt a) alle DNAs (rekombinante DNA gemäß der Erfindung und die DNAs, welche die Proteine exprimieren, welche für die Transkription/Replikation der viralen RNA erforderlich sind) auf einem einzigen Vektor oder auf zwei Vektoren oder mehr befinden können.
Gemäß einer bevorzugten Ausführung schlägt die Erfindung gleichfalls ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Grippeviren vor, welches die folgenden Schritte umfasst:

a) Einführung in eine Vogelzelle oder in ein embryoniertes Ei von Vogel-Ursprung von wenigstens einem Vektor, welcher vorzugsweise eine rekombinante DNA, welche eine vRNA eines Grippevirus exprimiert, umfasst, und von Vektoren, welche die Proteine PA, PB1, PB2 und NP eines Grippevirus, wie des Influenzavirus, vorzugsweise vom Typ A, exprimieren;
b) Anwendung von Bedingungen, welche die Expression von rekombinanten Grippeviren erlauben, bei der Zelle oder bei dem Ei, die bzw. das in a) erhalten worden ist; und
c) Gewinnung der in b) erhaltenen rekombinanten Grippeviren.

Es versteht sich, dass der Schritt c) der Verfahren der Erfindung, d. h. die Gewinnung der rekombinanten Viren, direkt an den Zellen nach Zelllyse oder ebenso gut ausgehend von dem Überstand stattfinden kann. In dem Falle, wo embryonierte Eier eingesetzt werden, wird ein Fachmann auf diesem Gebiet die Verfahren, die einzusetzen sind, um die so hergestellten rekombinanten Viren zu gewinnen, kennen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele dienen dazu, den Umfang der Verwendung der Erfindung zu veranschaulichen, und nicht, ihren Umfang zu beschränken. Obgleich man andere Verfahren oder äquivalente Produkte zu jenen, auf die man nachfolgend stößt, einsetzen kann, um die Erfindung zu testen oder zu realisieren, werden das Material und die Verfahren, die bevorzugt sind, beschrieben.
Die Systeme von inverser Genetik, die eingesetzt werden, um rekombinante Grippeviren ausgehend von klonierten cDNAs zu erhalten, beruhen allesamt auf der Transfektion von Plasmiden, welche die viralen RNAs (vRNAs) kodieren, unter der Kontrolle des Promotors der humanen RNA-Polymerase I (Neumann et al., PNAS 96: 9345–50, 1999; Fodor et al., J. Virol. 73: 9679–82, 1999; Hoffman et al., PNAS 97: 6108–13, 2000). Die Verwendung dieses Promotors rechtfertigt sich durch die Tatsache, dass die Enden des Transkriptionsprodukts keine ergänzenden Nukleotide enthalten dürfen (wenn dies der Fall ist, sind die Transkriptions/Replikationssignale, die sich im Bereich der nicht-kodierenden 5'- und 3'-Enden der vRNAs befinden, nicht mehr funktionsfähig).
Die Verwendung des Promotors der humanen RNA-Polymerase I stellt die Initiation der Transkription an einer sehr präzisen Stelle und folglich die Genauigkeit des 5'-Endes der in den transfizierten Zellen synthetisierten vRNAs sicher. Diese Art von System kann aber lediglich an Zellen von humanem oder Affen-Ursprung angewendet werden aufgrund der sehr engen Speziesspezifität der Promotoren der RNA-Polymerasen I (Heix und Grummt, Curr. Op. Gent. Dev. 5: 652–56, 1995).
Indessen könnte das Verfügen über ein System von inverser Genetik, welches an Vogel-Zellen anwendbar ist, den Weg für die Herstellung von rekombinanten Grippeimpfstoffen mittels embryonierter Hühnereier, dem einzigen gegenwärtig für die Herstellung des Grippeimpfstoffs in den Vereinigten Staaten zugelassenen Träger, eröffnen. Die Impfung bildet bis zum heutigen Tag das einzige Präventionsmittel gegen die Grippe und sie wird bei bestimmten Kategorien von Risikopatienten stark empfohlen. Die Herstellung des Impfstoffs beruht auf der Vermehrung von Impfstämmen mittels embryonierter Eier und erfordert bei jeder erneuten Aktualisierung der Impfzusammensetzung, ergänzende Viren, welche die repräsentativen HA- und NA-Segmente der zirkulierende Stämme aufweisen, zu selektieren, wobei sich die anderen Segmente von einem Donorstamm, welcher an die Vermehrung mittels Eier angepasst ist, ableiten. Es könnte vorteilhaft sein, dieses lange und aleatorische Verfahren durch die Produktion von ergänzenden Viren durch inverse Genetik mittels embryonierter Eier zu ersetzen.
So haben die Erfinder mit der Perspektive, ein System für die Herstellung von rekombinanten Grippeviren durch inverse Genetik mittels Vogelzellen zu entwickeln, es unternommen, den Promotor der RNA-Polymerase I vom Huhn zu klonieren. Eine Klonierung durch PCR, die auf den Homologien zwischen Nukleotidsequenzen der bis zum heutigen Tage klonierten PolI-Promotoren basiert, konnte nicht ins Auge gefasst werden, denn die PolI-Transkriptionssysteme sind von einer Spezies zur anderen extrem unterschiedlich. Sie haben folglich ein Screening der Gesamtheit oder eines Teils des Genoms vom Huhn vorgenommen.
1) Gewinnung des Cosmids C13–18
Die Kartierung des Hühnergenoms hatte darauf hingewiesen, dass die die ribosomalen RNAs kodierenden Gene (NOR-Genort) sich auf dem Chromosom 16 in der Nähe des Genorts der Gene des Histokompatibilitätskomplexes befanden (Schmid et al., Cytogenet. Cell Genet., 90: 169–218, 2000). Das Labor von Pr. H. Auffray, von welchem ein Teil der Arbeiten am Institut Gustave Roussy in Villejuif auf den Haupthistokompatibilitätskomplex gerichtet war, hat 1988 Daten betreffend ein rekombinantes Cosmid (C13–18), welches 30 kb von genomischer DNA vom Huhn, darunter die Gene des Haupthistokompatibilitätskomplexes, aber auch mehrere Transkriptionseinheiten des NOR-Genorts und folglich mindestens ein Exemplar des PolI-Promotors, enthielt, veröffentlicht (Guillemot et al., EMBO J., 7: 2775–85, 1988). Dieses Cosmid ist freundlicherweise von R. Zoorob zur Verfügung gestellt worden.
2) Analyse des Cosmids C13–18 durch Southern Blot
Das Cosmid C13–18 wurde durch Southern Blot nach Verdau durch die Restriktionsenzyme NotI, PacI und SfiI getrennt oder in Kombination und unter Verwendung von Oligonukleotiden, ausgewählt auf der Grundlage der Daten aus einer partiellen Sequenzierung der ribosomalen RNAs vom Huhn, die in den Banken verfügbar sind:
Oligonukleotid 28S/+/2: 5'-GAGTCAGCCCTCGACACAAGCTTTTG-3* (SEQ ID NO: 3);
Oligonukleotid 18S/–/1.5: 5'-CTACTGGCAGGATCAACCAGGT-3' (SEQ ID NO: 4); und
Oligonukleotid 18S/–/4: 5'-TAGAGGAGAACGCGACCTCGAGAC-3' (SEQ ID NO: 5)
als Sonde analysiert.
Diese Analyse hat erlaubt, eine grobe Restriktionskarte des Cosmids C13–18 zu rekonstituieren und die ribosomalen 18S- und 28S-RNAs bezogen auf die verschiedenen, auf dem Cosmid lokalisierten Restriktionsstellen zu positionieren. Sie hat zur Identifizierung eines PacI-NotI-Fragments von etwa 16 kb, welches dem Hauptteil einer intergenischen Region entspricht und folglich sehr gut eine Kopie der Sequenz des PolI-Promotors enthalten könnte, geführt.
3) Klonierung des PacI-NotI-Restriktionsfragments in einen „Reporter"-Vektor und Nachweis des Vorhandenseins eines transkriptionellen Promotors innerhalb des PacI-NotI-Fragments
Um das Vorhandensein der Sequenz des PolI-Promotors innerhalb des PacI-NotI-Restriktionsfragments zu testen, haben die Erfinder danach gestrebt, dieses Letztere strangaufwärts von einer Reportersequenz zu klonieren.
Mit diesem Ziel wurde das Cosmid pTCF (Grosveld et al., 1982, Nucleic Acids Res., 10, 6715–32), welches eine einmalig vorkommende SalI-Klonierungsstelle aufweist, durch Insertion einer synthetischen Sequenz, welche Mehrfachklonierungsstellen (StuI-PacI-NotI-PmeI) enthält, auf der Höhe der SalI-Stelle modifiziert.
Das PacI-NotI-Fragment von 16 kb, welches von C13–18 abgeleitet ist, wurde in das modifizierte pTCF-Cosmid auf der Höhe der neu eingeführten PacI- und NotI-Stellen kloniert. Es wurden zwei Klone von rekombinanten Cosmiden pTCF-(PacI-NotI) selektiert (Nr. 2.5 und 2.7). Dann wurde ein Eael-Restriktionsfragment von 500 bp, welches von dem bakteriellen Gen der Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) abgeleitet war, auf der Höhe der NotI-Stelle der Cosmide pTCF-(PacI-NotI) in der einen und der anderen Orientierung kloniert. Es wurden vier Klone von rekombinanten Cosmiden selektiert: Nr. 2.5.3 und Nr. 2.7.13 (CAT in +-Orientierung), Nr. 2.5.4. und Nr. 2.7.16 (CAT in –-Orientierung).
Um das Vorhandensein der Sequenz des PolI-Promotors innerhalb des PacI-NotI-Restriktionsfragments zu testen, wurden Zellen der Linie QT6 (Fibrosarkom von der Wachtel) mit den Cosmiden pTCF-(PacI-NotI-)CAT(+) und pTCF-(PacI-NotI)-CAT(–) transfiziert. Die RNAs wurden aus den Zellen 24 h nach der Transfektion mit Hilfe des „TriZol"-Reagens (Gibco-BRL) extrahiert und mit DNase (RNase-freie DNase, Ambion) behandelt, um die Cosmid-Moleküle, welche die RNA-Präparationen verunreinigten, zu entfernen. Die RNAs wurden auf eine Nylon-Membran (Hybond N+, Amersham) in einer Menge von 5 μg pro Punkt abgeschieden und mit einer mit ³²P markierten Ribosonde, welche der CAT(+)-Sequenz entsprach, hybridisiert. Positive Signale wurden mit den RNAs erhalten, die aus mit den Cosmiden pTCF-(PacI-NotI)-CAT(–) Nr. 2.5.4 und 2.7.16 transfizierten Zellen präpariert worden waren, was das Vorhandensein eines transkriptionellen Promotors in dem PacI-NotI-Restriktionsfragment nahelegt. In diesen ersten Experimenten war das Signal-Rausch-Verhältnis trotzdem ziemlich niedrig. Es wurde in den folgenden Experimenten nach Optimierung der Behandlungsbedingungen der RNAs mit der DNase (während zweimal 1 h bei 37°C in Gegenwart von 8 Einheiten Enzym) und der Hybridisierungs- und Waschbedingungen der Membranen (Hybridisation über Nacht bei 65°C in einem Puffer mit 50% Formamid, 5X SSC, 5X Denhart, 0,5% SDS; 2 Wäschen von 10 min bei Umgebungstemperatur in einem Puffer aus 2X SSC, 0,1% SDS, gefolgt von 2 Wäschen von 10 min bei 65°C in einem Puffer aus 0,2X SSC, 0,1% SDS) verbessert. Die Methodik, die dann wiederholt angewendet wurde, um das Vorhandensein eines transkriptionellen Promotors in von dem PacI-NotI-Fragment abgeleiteten Restriktionsfragmenten zu untersuchen, wird in 3 rekapituliert. Die erhaltenen Ergebnisse werden nachfolgend detailliert erläutert und in 4 rekapituliert.
4) Erzeugung von partiellen Deletionen innerhalb des in den Reportervektor klonierten PacI-NotI-Restriktionsfragments und Nachweis des Vorhandenseins eines transkriptionellen Promotors in einem SfiI-NotI-Fragment von etwa 6 kb
Um genauer die Region des PacI-NotI-Fragments, welche den Promotor enthält, zu identifizieren, wurden partielle Deletionen des PacI-NotI-Fragments durch Verdau der Cosmide pTCF-(PacI-NotI)-CAT(–) Nr. 2.7.16 und pTCF-(PacI-NotI)-CAT(+) Nr. 2.7.13 mit den Enzymkombinationen PacI-SfiI oder SfiI-NotI (wobei die SfiI-Stelle sich innerhalb des PacI-NotI-Fragments befindet), Auffüllen der Enden mit Hilfe der Klenow-Untereinheit der DNA-PolI von E. coli und Religation der erhaltenen Moleküle miteinander erhalten. Das Vorhandensein eines transkriptionellen Promotors innerhalb der deletierten Cosmide wurde getestet, indem die oben beschriebene Methodik (Transfektion von QT6-Zellen und Analyse der aus den transfizierten Zellen extrahierten RNAs durch Hybridisierung mit einer CAT-Sonde) eingesetzt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse haben nahegelegt, dass ein transkriptioneller Promotor in den Cosmiden, welche den SfiI-NotI-Abschnitt (von etwa 6 kb) des PacI-NotI-Fragments behalten hatten, vorhanden war.
5) Wiederholte Analyse von von dem SfiI-NotI-Fragment abgeleiteten Restriktionsfragmenten und Nachweis des Vorhandenseins eines transkriptionellen Promotors in einem AgeI-SacI-Fragment von 1200 bp
Für diesen Schritt und um die Analyse von von dem SfiI-NotI-Fragment abgeleiteten Restriktionsfragmenten gemäß derselben Methodik weiterzuverfolgen, wurde ein neuer Reportervektor konstruiert. Tatsächlich hatten die analysierten Restriktionsfragmente nunmehr eine ausreichend verringerte Größe, um in ein Plasmid kloniert werden zu können.
Dieser neue Reportervektor wurde ausgehend von dem Plasmid pGEM-5-zf+ (Promega), in welches das von dem bakteriellen CAT-Gen abgeleitete Eael-Fragment von 500 bp in (+)-Orientierung auf der Höhe der einmalig vorkommenden NotI-Stelle kloniert worden war, konstruiert. Nur diese Orientierung der CAT-Sequenz in dem Reportervektor wurde eingesetzt, denn die vorangegangenen Experimente hatten gezeigt, dass das Paar Reportersequenz CAT (+)/Ribosonde CAT (–) spezifischere und reproduzierbarere Ergebnisse als das Paar CAT-Reportersequenz(–)/Ribosonde CAT (+) lieferte.
Das SfiI-SacI-Restriktionsfragment (in der Praxis ein StuI-SacI-Fragment, welches das SfiI-SacI-Fragment umfasste) und das SacI-NotI-Restriktionsfragment, die von dem SfiI-NotI-Fragment abgeleitet worden waren, wurden in der Höhe der EcoRV-Stelle des Vektors pGEM-CAT(+) (Klon Nr. 9,), die sich strangaufwärts von der CAT-Reportersequenz befand, subkloniert. Durch die oben beschriebene Methodik wurde das Vorhandensein eines transkriptionellen Promotors in dem StuI-SacI-Fragment, kloniert in das Plasmid pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+) (Klon Nr. 12), nachgewiesen.
Es wurde eine Restriktionskarte des StuI-SacI-Fragments, welche auf Verdauen des Plasmids pGEM-(StuI-SacI)-CAT(+) Nr. 12 mit den Restriktionsenzymen SmaI und AgeI beruhte, erstellt. Zwei SmaI-SmaI-Restriktionsfragmente, ein AgeI-AgeI-Restriktionsfragment und das StuI-SacI-Fragment, das aus diesem AgeI-AgeI-Restriktionsfragment deletiert worden ist, wurden in den Vektor pGEM-CAT(+) Nr. 9 auf der Höhe der EcoRV-Stelle subkloniert. Das Vorhandensein eines transkriptionellen Promotors wurde in dem StuI-SacI-Fragment, welches aus dem AgeI-AgeI-Fragment deletiert worden war, kloniert in das aus Bequemlichkeitsgründen als V12-AgeI (Klon Nr. 29) bezeichnete Plasmid, nachgewiesen.
Das deletierte StuI-SacI-Fragment wurde in zwei StuI-AgeI- und AgeI-SacI-Fragmente, die durch Verdau des Plasmids V12-AgeI Nr. 29 durch die Restriktionsenzyme NcoI + AgeI ei nerseits (für das StuI-AgeI-Fragment) und AgeI + NotI andererseits (für das AgeI-SacI-Fragment) erhalten wurden, geschnitten. Jedes der beiden Fragmente wurde in den Vektor pGEM-CAT(+) auf der Höhe der EcoRV-Stelle subkloniert. Das Vorhandensein eines transkriptionellen Promotors wurde in dem AgeI-SacI-Fragment von 1200 bp, kloniert in das Plasmid pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) (Klon Nr. 15), nachgewiesen.
6) Sequenzierung des AgeI-SacI-Fragments und Bestimmung der Initiationsstelle der Transkription durch die Primer-Extension-Technik
Das in das Plasmid pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) Nr. 15 klonierte AgeI-SacI-Fragment wurde sequenziert. Die Sequenz ist in der 1 (SEQ ID NO: 1) dargestellt.
Die distalen 800 bp von dieser Sequenz enthalten 8 Wiederholungen einer Sequenz von etwa 90 Nukleotiden, was für die PolI-Promotoren charakteristisch ist: tatsächlich wurde das Vorhandensein von wiederholten Aktivierungssequenzen strangaufwärts von der Initiationsstelle der Transkription für mehrere PolI-Promotoren, die von anderen Spezies abgeleitet worden waren, beschrieben (Paule M., 1998, Promoter Structure of Class I Genes. In Transcription of Ribosomal RNA Genes by Eukaryotic RNA Polymerase I. Herausgegeben von M. R. Paule: Springer-Verlag und R. G. Landes Company).
Die genaue Stelle der Initiation der Transkription des PolI-Promotors vom Huhn wurde folglich in den proximalen 400 bp des AgeI-SacI-Fragments durch die Primer-Extension-Technik gesucht. Ein zu der ausgehend von dem Plasmid pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) transkribierten CAT-Sequenz komplementäres Oligonukleotid (Sequenz SEQ ID NO: 6: 5'-ATGTTCTTTACGATGCGATTGGG-3') wurde an seinem 5'-Ende mit Hilfe der Polynukleotidkinase des Phagen T4 (Biolabs) mit ³²P markiert und parallel in zwei Reaktionen eingesetzt: 1) als Primer für die Verlängerung einer zu den aus mit dem Plasmid pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) Nr. 15 transfizierten QT6-Zellen extrahierten CAT-RNAs komplementären DNA in Gegenwart von inverser Transkriptase (SuperScript II, Invitrogen) und 2) als Primer für die Sequenzierung des Plasmids pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) Nr. 15 mit Hilfe des Kits „T7 Sequencing Kit" (Pharmacia Biotech). Ein einziges Transkriptionsprodukt wurde in der Primer-Extension-Reaktion bzw. Primer-Verlängerungsreaktion nachgewiesen, welches die Existenz einer sehr präzisen Transkriptionsstartstelle bestätigt. Diese Letztere wurde in einer an A und T reichen Region lokalisiert in Übereinstimmung mit den für die von anderen Spezies abgeleiteten PolI-Promotoren verfügbaren Daten, gelegen etwa 200 bp von dem als Primer eingesetzten Oligonukleotid.
Parallel dazu wurde die Analyse von von dem AgeI-SacI-Fragment abgeleiteten Restriktionsfragmenten verfolgt, um den Minimalpromotor (welcher einer Region in der Größenordnung von 250 bp für die PolI-Promotoren von anderen Spezies entspricht) einzugrenzen (siehe 5). Das AgeI-SacI-Fragment wurde in drei AgeI-BsaI-, BsaI-BsaI- und BsaI-SacI-Fragmente, erhalten durch Verdau des Plasmids pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) Nr. 15 durch die Restriktions enzyme NcoI + BsaI einerseits (für die AgeI-BsaI- und BsaI-BsaI-Fragmente) und BsaI + NotI andererseits (für das BsaI-SacI-Fragment), geschnitten. Jedes der beiden Fragmente war in den Vektor pGEM-CAT(+) in der Höhe der EcoRV-Stelle subkloniert worden. Nur das BsaI-SacI-Fragment von etwa 600 bp (2), kloniert in das Plasmid pGEM-(BsaI-SacI)-CAT(+) (Klon Nr. 16), erlaubt die Transkription der CAT-Reportersequenz, was perfekt übereinstimmt mit der Tatsache, dass es sich um das proximale Fragment handelt, in welchem die Initiationsstelle der Transkription lokalisiert worden war.
Das Nukleotid +1 von der Initiationsstelle der Transkription war durch die Primer-Extension-Technik bestimmt worden unter Verwendung eines Oligonukleotids, welches ca. 50 Basenpaare strangabwärts von der Initiationsregion gelegen war (siehe 5). Dieses Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID NO: 7 (5'-GGCCGGTCAACCCTGCTC-3') wurde an seinem 5'-Ende mit Hilfe der Polynukleotidkinase des Phagen T4 (Biolabs) mit ³²P markiert und parallel in zwei Reaktionen eingesetzt: 1) als Primer für die Verlängerung einer zu den aus mit dem Plasmid pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) Nr. 15 transfizierten QT6-Zellen extrahierten CAT-RNAs komplementären DNA in Gegenwart von inverser Transkriptase (SuperScript II, Invitrogen) und 2) als Primer für die Sequenzierung des Plasmids pGEM-(AgeI-SacI)-CAT(+) Nr. 15 mit Hilfe des Kits „T7 Sequencing Kit" (Pharmacia Biotech). Es wurde ein hauptsächliches Transkriptionsprodukt nachgewiesen, was einer Initiationsstelle entspricht, die eine für die nach den Sequenzen von PolI-Promotoren von anderen Sequenzen ermittelte Consensus-Sequenz charakteristische Nukleotidumgebung (nachfolgend unterstrichene Nukleotide) aufweist:
Es muss indessen angemerkt werden, dass drei andere Arten von Transkriptionsprodukten, in geringeren Mengen, in diesem Primer-Extension-Experiment nachgewiesen wurden, welche einer Initiation an den Nukleotiden –1, +13 und +14 (vorstehend mit einem Stern markierte Nukleotide) entsprachen.
Es wurden Plasmide, die dazu bestimmt waren, eine Pseudo-Grippe-RNA, welche die Sequenz des CAT-Reportergens unter der Kontrolle des PolI-Promotors vom Huhn trägt, zu exprimieren, konstruiert anhand des Modells des Plasmids pPolI-CAT-Rz, das von Pleschka et al. mit Hilfe des humanen PolI-Promotors ersonnen worden ist (1996, J. Virol., 70: 4188–92): diese Plasmide (pPR7-C16-CAT-Rz und pPR7-ΔC16-CAT-Rz) enthalten die Sequenzen, welche das CAT-Gen kodieren, kloniert im Antisinn und flankiert von nicht-kodierenden 5'- und 3'-Sequenzen, die von dem genomischen NS-Segment eines humanen Grippevirus vom Typ A abgeleitet sind; die Positionierung des nicht-kodierenden 5'-Endes exakt strangabwärts von dem Nukleotid –1 des PolI-Promotors vom Huhn einerseits und die Insertion der Ribozymse quenz des Hepatitis δ-Virus an dem nicht-kodierenden 3'-Ende andererseits sind dazu bestimmt, die Genauigkeit der Enden des Transkriptionsprodukts sicherzustellen. Das Plasmid pPR7-C16-CAT-Rz enthält die nt –1 bis –425 des PolI-Promotors vom Huhn, wohingegen das Plasmid pPR7-ΔC16-CAT-Rz lediglich die nt –1 bis –246 enthält (für andere Spezies wurde die Größe des PolI-Minimalpromotors auf etwa 250 nt geschätzt).
Die Plasmide pPolI-CAT-Rz (humaner PolI-Promotor), pPR7-C16-CAT-Rz oder pPR7-ΔC16-CAT-Rz (PolI-Promotor aus Vögeln) wurden durch Transfektion in QT6-Vogelzellen oder in COS-1-Primatenzellen gleichzeitig mit Plasmiden, welche die Proteine PB1, PB2, PA und NP eines Grippevirus kodieren, eingeschleust. Wenn die transfizierten Zellen im Bereich der nicht-kodierenden 5'- und 3'-Enden korrekte Pseudo-Grippe-RNAs und gleichzeitig die Proteine PB1, PB2, PA und NP exprimieren, können die Pseudo-Grippe-RNAs transkribiert und repliziert werden und die Wirksamkeit des Transkriptions/Replikationsverfahrens kann durch das Messen der Konzentration von CAT-Protein in den transfizierten Zellen abgeschätzt werden. Die Konzentrationen von CAT-Protein wurden folglich durch ELISA in den zytoplasmatischen Extrakten der transfizierten Zellen, hergestellt 24 h nach der Transfektion, gemessen.
Die in Gegenwart des Plasmids pPolI-CAT-Rz gemessenen CAT-Konzentrationen lagen in der Größenordnung von 200 ng/10⁸ transfizierte Zellen, wenn es sich um COS-1-Zellen handelte, wohingegen sie sehr gering waren (< 0,06 ng/10⁶ transfizierte Zellen), wenn es sich um QT6-Zellen handelte (6).
Im Gegenteil waren die in Gegenwart der Plasmide pPR7-C16-CAT-Rz und pPR7-ΔC16-CAT-Rz gemessenen CAT-Konzentrationen in den COS-1-Zellen sehr gering (< 0,06 ng/10⁶ transfizierte Zellen), sie lagen aber in der Größenordnung von 200 bzw. 100 ng/10⁶ Zellen in den QT6-Zellen (6).
Diese Ergebnisse weisen nach, dass die Sequenzen des PolI-Promotors vom Huhn, die in die Plasmide pPR7-C16-CAT-Rz und pPR7-ΔC16-CAT-Rz kloniert worden sind, nach Einschleusung in Zellen von Vogel-Ursprung durch Transfektion die in vivo-Transkription von Mini-Replikons, welche die Replikationssignale eines Grippevirus vom Typ A umfassen, erlauben. Sie bereiten folglich den Weg für die Entwicklung von Systemen von inverser Genetik, welche erlauben, rekombinante Grippeviren mit Hilfe von Vogelzellen in Kultur oder direkt mit Hilfe von embryonierten Hühnereiern zu erhalten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes oder gereinigtes Polynukleotid, bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment von dieser, welches aus wenigstens 10 aufeinander folgenden Nukleotiden der Sequenz SEQ ID NO: 1 gebildet wird und eine die Transkription fördernde Aktivität aufweist.
Isoliertes oder gereinigtes Polynukleotid, bestehend aus der Sequenz SEQ ID NO: 2 oder einem Fragment von dieser, welches aus wenigstens 10 aufeinander folgenden Nukleotiden der Sequenz SEQ ID NO: 2 gebildet wird und eine die Transkription fördernde Aktivität aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine die Transkription fördernde Aktivität in Vogelzellen, vorzugsweise in Geflügelzellen und insbesondere in Hühnerzellen aufweist.
Rekombinante DNA, welche eines der in den Ansprüchen 1 bis 3 definierten Polynukleotide umfasst.
Rekombinante DNA nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie außerdem eine zu transkribierende Sequenz umfasst.
Rekombinante DNA nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zu transkribierende Sequenz eine cDNA eines nicht-umhüllten RNA-Virus ist.
Rekombinante DNA nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zu transkribierende Sequenz eine cDNA eines RNA-Virus von negativer Polarität ist.
Rekombinante DNA nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das RNA-Virus von negativer Polarität ein Orthomyxovirus oder ein Paramyxovirus ist.
Rekombinante DNA nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Orthomyxovirus ein Influenza-Virus, vorzugsweise vom Typ A, ist.
Rekombinante DNA nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine vRNA eines Orthomyxovirus, wie eines Grippevirus, und vorzugsweise eine vRNA, welche unter den vRNA-Segmenten 1 bis 8 des Influenzavirus ausgewählt wird, exprimiert.
Rekombinante DNA nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Paramyxovirus aus der Gattung der Rubulaviren, wie dem Mumpsvirus und dem Newcastle-disease-Virus, der Gattung der Morbilliviren, wie dem Masernvirus, der Gattung Pneumovirus, wie dem Respiratory Syncytial Virus, und der Gattung der Metapneumoviren ausgewählt wird.
Vektor, welcher ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder eine rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 4 bis 11 umfasst.
Wirtszelle, welche einen Vektor nach Anspruch 12 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie von Vogel-Ursprung ist.
Wirtszelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Geflügelzelle und insbesondere eine Hühnerzelle ist.
Embryoniertes Ei von Vogel-Ursprung, umfassend einen Vektor nach Anspruch 12.
Verwendung von wenigstens einem der folgenden Elemente für die Herstellung eines rekombinanten RNA-Virus von negativer Polarität: – ein Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3; – eine rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 4 bis 11; – ein Vektor nach Anspruch 12; – eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 13 bis 15; und – ein embryoniertes Ei nach Anspruch 16.
Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Grippeviren durch inverse Genetik, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Einführung in eine Vogelzelle oder in ein embryoniertes Ei von Vogel-Herkunft von wenigstens einem Vektor, welcher eine rekombinante DNA, wie in Anspruch 9 definiert, umfasst, und von Vektoren, welche die Proteine PA, PB1, PB2 und NP eines Grippevirus exprimieren; b) Anwendung von Bedingungen, welche die Expression von rekombinanten Grippeviren erlauben, bei der Zelle oder bei dem Ei, die bzw. das in a) erhalten worden ist; und c) Gewinnung der in b) erhaltenen rekombinanten Grippeviren.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Geflügelzelle und insbesondere eine Hühnerzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Grippevirus das Influenzavirus, vorzugsweise vom Typ A, ist.
Verfahren zur Herstellung von nicht-umhüllten rekombinanten Viren durch inverse Genetik, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Einführung in eine Vogelzelle oder in ein embryoniertes Ei von Vogel-Herkunft von einem oder mehreren Vektoren, wobei der oder die Vektoren eine rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 4 bis 11 umfasst bzw. umfassen und die DNAs die für die Transkription/Replikaton der viralen RNA erforderlichen Proteine exprimieren; b) Anwendung von Bedingungen, welche die Expression von rekombinanten Viren erlauben, bei der Zelle oder bei dem Ei, die bzw. das in a) erhalten worden ist; und c) Gewinnung der in b) erhaltenen rekombinanten Viren.
Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es in dem Stamm pGEM-ChPolI-C15-E. coli 1305, der bei der CNCM am 24. Februar 2003 unter der Nummer 1– 2976 hinterlegt worden ist, enthalten ist.