DE60035778T2 - Rekombinante influenzaviren zur vakzinherstellung und gentherapie - Google Patents

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Description

  • Die Fähigkeit infektiöse RNA-Viren aus clonierten cDNAs zu erzeugen hat in hohem Maße zum biologischen Verständnis dieser Pathogene und somit zu verbesserten Methoden der Krankheitsbekämpfung beigetragen (Palese et al., 1996). Dieser Fortschitt ist jedoch bei RNA-Viren mit Negativorientierung im Vergleich zu RNA-Viren mit Positivorientierung relativ beschränkt gewesen, da weder die genomische virale RNA (vRNA) noch die antigenomische komplementäre RNA (cRNA) von RNA-Viren mit Negativorientierung als eine direkte Matrize für Proteinsynthese dienen kann. Vielmehr muss die vRNA nach ihrer Einkapselung durch virales Nucleoprotein (NP) durch den viralen RNA-Polymerase-Komplex in mRNA mit Positivorientierung transkribiert werden. Demnach wird die minimale Replikationseinheit durch die genomische vRNA gebildet, die mit NP und den Polymerase-Proteinen komplexiert ist. Trotz dieser Hindernisse sind reverse Genetik-Verfahren etabliert worden, um nicht-segmentierte Negativstrang-RNA-Viren herzustellen, wozu das Tollwutvirus (Snell et al., 1994), das vesikuläre Stomatitisvirus (Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995), das Masernvirus (Radecke et al., 1995), das respiratorische Syncytialvirus (Collins et al., 1995), das Sendaivirus (Garcin et al., 1995; Kato et al., 1996), das Rinderpestvirus (Baron et al., 1997), das menschliche Parainfluenzavirus vom Typ 3 (Hoffman et al., 1997) und SV5 (He et al., 1997) gehören.
  • Die Familien Orthomyxoviridae, Arenaviridae und Bunyaviridae enthalten segmentierte Negativstrang-RNA-Genome und umfassen mehrere menschliche und tierische Pathogene, zum Beispiel die Influenzaviren vom Typ A, B und C (Orthomyxoviridae), das lymphocytäre Choriomeningitisvirus (LCMV) (Arenaviridae) und die encephalitischen und hämorrhagischen Fieberviren (Bunyaviridae, Arenaviridae). Deren Genome bestehen aus zwei (Arenaviridae), drei (Bunyaviridae) oder sechs bis acht (Orthomyxoviridae) einzelsträngigen RNA-Molekülen mit negativer Polarität (komplementär zur mRNA). Die vRNAs interagieren mit NP und viraler RNA-abhängiger RNA-Polymerase, um Ribonucleoprotein-Komplexe (RNPs) zu bilden. Die RNPs sind von einer Lipid-Doppelschicht umgeben, die von der Wirtszelle stammt. In diese Hülle sind virale Glycoproteine eingesetzt, welche für die Rezeptorbindung und den Eintritt in die Wirtszelle notwendig sind. Somit stellt die Herstellung segmentierter Negativstrang-RNA-Viren aus clonierten cDNAs eine enorme Herausforderung dar, da man für jeden Genabschnitt eine separate vRNA erzeugen muss.
  • Bridgen und Elliott (1996) stellten einen Bunyamwera-Virus (Familie Bunyaviridae) aus clonierten cDNAs her, die drei Abschnitte antigenomischer vRNA in Positivorientierung codierten. Die Effizienz der Virusausbeute war jedoch gering. Keiner der Orthomyxoviren, die sechs (Thogotovirus), sieben (Influenza C-Virus) oder acht (Influenza A und B-Viren) Abschnitte von RNA in Negativorientierung enthalten, sind vollständig aus clonierten cDNAs hergestellt worden. Diese Verzögerung beim Fortschritt ist am schärfsten bei den Bemühungen zu spüren gewesen, Infektionen mit Influenzaviren zu bekämpfen.
  • Palese und Kollegen (Enami et al., 1990) haben Pionierarbeit in dem Helfervirus-abhängigen reversen Genetik-System für Influenza A-Virus (1A) geleistet. In deren Ansatz werden RNP-Komplexe durch in vitro-vRNA-Synthese in Gegenwart von aufgereinigter Polymerase und NP-Proteinen erzeugt und dann dazu verwendet, um eukaryontische Zellen zu transfizieren. Eine anschließende Infektion mit Influenza A-Helfervirus hat die Erzeugung von Viren zur Folge, die ein von der clonierten cDNA abgeleitetes Gen besitzen. Ein zweites Verfahren, das von Neumann et al. (1994) entwickelt worden ist, basiert auf der in vivo-Synthese von vRNA durch RNA-Polymerase I (1B), einem zellulären Enzym, das ribosomale RNA transkribiert, der sowohl eine 5'-Kappenstruktur als auch ein 3'-Polyadenylierungs-Schwanz fehlt. Zellen, die mit Influenzavirus infiziert und mit einem Plasmid transfiziert wurden, das clonierte Influenzavirus-cDNA enthielt, die von murinen RNA-Polymerase I-Promotor- und Terminator-Sequenzen flankiert war, führten zur Erzeugung von Virustransfektanten. Bei beiden Verfahren müssen jedoch Transfektanten aus einem riesigen Hintergrund von Helferviren selektiert werden, was ein starkes Selektionssystem erfordert und die Erzeugung von Wachstumsdefizienten Viren erschwert.
  • Von Mena et al. (1996) wurde ein System zur Erzeugung von replikations inkompetenten Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) entwickelt, in dem eine Influenzavirus-ähnliche vRNA, die ein Reportergen codiert, in vitro transkribiert und in eukaryontische Zellen transfiziert wird. Alle zehn Influenzavirus-Proteine werden unter der Kontrolle eines T7-RNA-Polymerase-Promotors von Plasmiden exprimiert. Wenn die transfizierten Zellen mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert werden, das T7-Polymerase exprimiert, stellen diese Influenza-VLPs her. Die Effizienz des Systems ist jedoch niedrig: in 25% der Experimente gelang es den Forschern nicht, die Expression des Reportergens nachzuweisen. Zudem exprimiert Vaccinia-Virus mehr als 80 Proteine, von denen jedes den Lebenszyklus des Influenzavirus beeinflussen könnte.
  • Pleschka et al. (1996) offenbaren ein reverse Genetik-System zur Herstellung eines einzelnen vRNP, welches eine CAT-cDNA enthält, vollständig aus in 293-Zellen transfizierten Plasmiden, aber eine Erzeugung von ganzen Viren (ohne Helfer) wurde nicht gezeigt.
  • Somit wird ein Verfahren benötigt, um segmentierte Negativstrang-RNA-Viren, z.B. Orthomyxoviren wie z.B. Influenza A-Viren, vollständig aus clonierten cDNAs zu erzeugen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Ein Verfahren zur Herstellung infektiöser Influenzaviren in der Abwesenheit eines Helfervirus, umfassend die Schritte:
    • (a) Einbringen in Wirtszellen, in der Abwesenheit eines Helfervirus, einer Zusammensetzung, umfassend eine Vielzahl von Orthomyxovirus-Vektoren, umfassend: (i) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (ii) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PB1-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (iii) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PB2-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (iv) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus HA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (v) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NP-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (vi) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (vii) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus M-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (viii) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NS-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (ix) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenzavirus PA-Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (x) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenzavirus PB1-Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (xi) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenzavirus PB2-Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (ix) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenzavirus NP-Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, und
    • (b) Isolieren der infektiösen Influenzaviren aus den Wirtszellen.
  • Die Erfindung stellt mindestens einen der folgenden isolierten und aufgereinigten Vektoren bereit: einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PB1-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminations-Sequenz verbunden ist, einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PB2-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus HA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NP-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus M-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, und einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NS-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist. Die cDNA kann relativ zum Promotor in der Sense- oder in der Antisense-Orientierung vorliegen. Somit kann ein Vektor, wie hierin beschrieben, ein Orthomyxovirus-Protein (Sense) oder vRNA (Antisense) codieren. Es kann ein beliebiger Promotor verwendet werden, um ein virales Protein zu exprimieren. Bevorzugte Promotoren für die vRNA codierenden Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf einen RNA-Polymerase I-Promotor, einen RNA-Polymerase II-Promotor, einen RNA-Polymerase III-Promotor, einen T7-Promotor und einen T3-Promotor. Es ist ferner bevorzugt, dass es sich bei dem RNA-Polymerase I-Promotor um einen menschlichen RNA-Polymerase I-Promotor handelt. Bevorzugte Transkriptionsterminationssequenzen für die vRNA codierenden Vektoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf eine RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz, eine RNA-Polymerase II-Transkriptionsterminationssequenz, eine RNA-Polymerase III-Transkriptionsterminationssequenz oder ein Ribozym. Bevorzugt umfassen die Vektoren Influenza-cDNA, z.B. Influenza A- (z.B. ein beliebiges Influenza A-Gen, einschließlich eines beliebigen der 15 HA- oder der 9 NA-Subtypen), B- oder C-DNA (siehe Kapitel 45 und 46 von Fields Virology (Fields et al. (Hrsg.), Lippincott-Raven Publ. Philadelphia, PA (1996)), obwohl es vorgesehen ist, dass das Gen (die Gene) eines beliebigen Virus in den Vektoren oder den Verfahren der Erfindung benutzt werden kann (können).
  • Des Weiteren ist hierin eine Zusammensetzung beschrieben, die eine Vielzahl der hierin beschriebenen Orthomyxovirus-Vektoren umfasst. Dementsprechend umfasst die Zusammensetzung Vektoren, die ausgewählt sind von einem Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einem Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PB1-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminations-Sequenz verbunden ist, einem Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PB2-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einem Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus HA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einem Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NP-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einem Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einem Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus M-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, und einem Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NS-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist und Vektoren, die das Influenzavirus PA codieren, einen Vektor, der das Influenzavirus PB1 codiert, einen Vektor, der das Influenzavirus PB2 codiert, und einen Vektor, der das Influenzavirus NP codiert. Bevorzugt umfassen die Vektoren, die virale Proteine codieren, ferner eine Transkriptionsterminationssequenz. Es ist bevorzugt, dass ein Promotor für die Vektoren, die Influenzavirus cDNA umfassen, einen RNA-Polymerase I-Promotor, einen RNA-Polymerase II-Promotor, einen RNA-Polymerase III-Promotor, einen T7-Promotor und einen T3-Promotor einschließt. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass jeder Vektor, der eine Influenzavirus-cDNA umfasst, eine Transkriptionsterminationssequenz wie z. B. eine RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz, eine RNA-Polymerase II-Transkriptionsterminationssequenz oder eine RNA-Polymerase III-Transkriptionsterminationssequenz oder ein Ribozym umfasst. Bevorzugt umfassen die Vektoren Influenza-DNA, z.B. Influenza A-, B- oder C-DNA. Stärker bevorzugt umfasst die hierin beschriebene Zusammensetzung, die in dem Verfahren zur Herstellung infektiöser Influenzaviren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, eine Vielzahl von Orthomyxovirus-Vektoren, umfassend einen Vektor, der einen RNA-Polymerase I-Promotor umfasst, der funktionell mit einer Influenzavirus PA-cDNA verbunden ist, die mit einer RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, der einen RNA-Polymerase I-Promotor umfasst, der funktionell mit einer Influenzavirus PB1-cDNA verbunden ist, die mit einer RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, der einen RNA-Polymerase I-Promotor umfasst, der funktionell mit einer Influenzavirus PB2-cDNA verbunden ist, die mit einer RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, der einen RNA-Polymerase I-Promotor umfasst, der funktionell mit einer Influenzavirus HA-cDNA verbunden ist, die mit einer RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, der einen RNA-Polymerase I-Promotor umfasst, der funktionell mit einer Influenzavirus NP-cDNA verbunden ist, die mit einer RNA-PoLymerase I-Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, der einen RNA-Polymerase I-Promotor umfasst, der funktionell mit einer Influenzavirus NA-cDNA verbunden ist, die mit einer RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, einen Vektor, der einen RNA-Polymerase I-Promotor umfasst, der funktionell mit einer Influenzavirus M-cDNA verbunden ist, die mit einer RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, und einen Vektor, der einen RNA-Polymerase I-Promotor umfasst, der funktionell mit einer Influenzavirus NS-cDNA verbunden ist, die mit einer RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist; und Vektoren, die das Influenzavirus PA codieren, einen Vektor, der das Influenzavirus PB1 codiert, einen Vektor, der das Influenzavirus PB2 codiert, und einen Vektor, der das Influenzavirus NP codiert, oder einen Vektor, der das Influenzavirus HA codiert, einen Vektor, der das Influenzavirus NA codiert, einen Vektor, der das Influenzavirus M1 codiert, einen Vektor, der das Influenzavirus MMP-2 codiert, und einen Vektor, der das Influenzavirus NS2 codiert.
  • Außerdem umfasst eine wie vorstehend beschriebene Zusammensetzung ferner einen Vektor, umfassend einen Promotor, der mit 5'-nicht-codierenden Sequenzen von Orthomyxovirus verbunden ist, die mit einem gewünschten verbunden sind, verbunden mit 3'-nicht-codierenden Sequenzen von Orthomyxovirus die mit Transkriptionsterminationssequenzen verbunden sind. Das Einbringen einer solchen Zusammensetzung in eine Wirtszelle, die permissiv für die Replikation von Orthomyxoviren sind, führt zu einem rekombinanten Virus, das vRNA enthält, die Sequenzen des Vektors entspricht, die 5'-nicht-codierende Sequenzen von Orthomyxovirus umfassen, die mit einer cDNA verbunden sind, die mit 3'-nicht-codierenden Sequenzen von Orthomyxovirus verbunden sind. Bevorzugt liegt die cDNA in einer Antisense-Orientierung vor. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass es sich bei dem Promotor um einen RNA-Polymerase I-Promotor, einen RNA-Polymerase II-Promotor, einen RNA-Polymerase III-Promotor, einen T7-Promotor und einen T3-Promotor handelt. Es ist auch bevorzugt, dass es sich bei der Transkriptionsterminationssequenz um eine RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz, eine RNA-Polymerase II-Transkriptionsterminationssequenz oder eine RNA-Polymerase III-Transkriptionsterminationssequenz oder ein Ribozym handelt. Zum Beispiel kann die cDNA ein immunogenes Epitop codieren, wie z.B. ein Epitop, das bei einer Krebstherapie oder als ein Vakzin nützlich ist.
  • Eine Vielzahl von Vektoren können, wie hierin beschrieben, physisch verbunden werden oder jeder Vektor kann auf einem getrennten Plasmid vorliegen oder auf einem anderen, z.B. linearen Nucleinsäure-Transportvehikel.
  • Wie vorstehend erwähnt, stellt die Erfindung auch ein Verfahren zum Herstellen von Influenzavirus bereit. Das Verfahren umfasst Inkontaktbringen einer Zelle mit einer Vielzahl der hierin beschriebenen Vektoren, z.B. aufeinanderfolgend oder gleichzeitig, zum Beispiel indem man eine Zusammensetzung, wie hierin beschrieben, in einer Menge verwendet, die wirksam ist, infektiöses Influenzavirus zu ergeben. Die Erfindung umfasst auch das Isolieren von Virus aus einer Zelle, die mit der Zusammensetzung in Kontakt gebracht wird. Somit wird hierin ein isoliertes Virus ebenso wie eine Wirtszelle beschrieben, die mit der Zusammensetzung oder einem isolierten Virus in Kontakt gebracht wird, wie hierin beschrieben.
  • Wie hierin nachfolgend beschrieben ist, wurden Influenza A-Viren vollständig aus clonierten cDNAs hergestellt. Der hierin beschriebene reverse Genetik-Ansatz ist hoch effizient und kann dazu verwendet werden, um Mutationen in jedes Gen segment einzuführen und Influenzavirus-basierte Gentransportsysteme zu entwickeln. Zum Beispiel wurden menschliche embryonale Nierenzellen (293T) mit acht Plasmiden wobei jedes eine virale RNA des A/WSN/33 (H1N1)- oder des A/PR/8/34 (H1N1)-Virus codiert, flankiert von dem menschlichen RNA-Polymerase I-Promotor und dem RNA-Polymerase I-Terminator der Maus, zusammen mit Plasmiden transfiziert, die virales Nucleoprotein und die viralen Polymerasen PB2, PB1 und PA codieren. Diese Strategie liefert 48 Stunden nach Transfektion > 1 × 103 Plaquebildende Einheiten (pfu) Virus pro ml Überstand. Je nach dem erzeugten Virus führte die Zugabe von Plasmiden, die alle übrigen viralen Strukturproteine exprimierten, zu einer erheblichen Steigerung der Virusproduktion auf > 3 × 104 pfu/ml. Reverse Genetik wurde auch dazu verwendet, um ein neu angeordnetes Virus zu erzeugen, welches das PB1-Gen des A/PR/8/34-Virus enthält, während alle anderen Gene A/WSN/33 repräsentieren. Weitere Viren, die mittels dieses Verfahrens hergestellt wurden, wiesen Mutationen in dem PA-Gen auf oder besaßen ein fremdes Epitop im Kopf des Neuraminidase-Proteins.
  • Darüber hinaus kann derselbe Ansatz für andere Viren verwendet werden, um nicht-segmentierte Negativstrang-RNA-Viren (d.h. Paramyxoviridae, Rhabdoviridae und Filoviridae) oder andere segmentierte Negativstrang-RNA-Viren, z.B. Arenaviridae und Bunyaviridae, vollständig aus clonierter cDNA zu erzeugen. Ferner kann die Expression von cRNA statt vRNA in Zellen die Effizienz der Virusherstellung verbessern.
  • Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die einfache Manipulation von Influenzaviren, beispielsweise durch Einführen von attenuierenden Mutationen in das Virusgenom. Da Influenzaviren eine starke humorale und zelluläre Immunität induzieren, wertet die Erfindung diese Viren des Weiteren sehr als Vakzinvektoren auf, insbesondere im Hinblick auf die Verfügbarkeit natürlicher Varianten des Virus, die nacheinander verwendet werden können, was einen wiederholten Einsatz für Gentherapie ermöglicht.
  • Daher sind hierin isolierte und aufgereinigte Vektoren oder Plasmide beschrieben, die Influenzavirus-Proteine exprimieren oder codieren oder Influenza-vRNA exprimieren oder codieren, sowohl native als auch rekombinante vRNA. Somit kann ein Vektor oder Plasmid, wie hierin beschrieben, ein Gen oder einen offenen Leserahmen von Interesse umfassen, z.B. ein fremdes Gen, das ein immunogenes Peptid oder Protein codiert, das als ein Vakzin nützlich ist. Bevorzugt umfasst der Vektor oder das Plasmid, das eine Influenza-vRNA exprimiert, einen Promotor, z.B. einen RNA-Polymerase I-Promotor, der für die Expression in einer bestimmten Wirtszelle geeignet ist, z.B. von Vogel oder Säugerwirtszellen wie z.B. Hunde-, Katzen-, Pferde-, Rinder-, Schaf- oder Primatenzellen einschließlich menschlicher Zellen. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die Vektoren oder Plasmide, welche DNA umfassen, die nützlich ist Influenza-vRNA zu erzeugen, Transkriptionsterminationssequenzen von RNA-Polymerase I umfassen. Für Vektoren oder Plasmide, die ein Gen oder einen offenen Leserahmen von Interesse umfassen, ist es bevorzugt, dass das Gen oder der offene Leserahmen von den 5'- und 3'-nicht-codierenden Sequenzen von Influenzavirus flankiert ist, und noch stärker bevorzugt, dass das Gen oder der offene Leserahmen funktionell mit einem RNA-Polymerase I-Promotor und einer RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist.
  • Wie hierin nachfolgend beschrieben, wurden 293T mit Plasmiden, welche die Strukturproteine des Influenza A-Virus codieren, zusammen mit einem Plasmid transfiziert, das das grün fluoreszierende Protein (GFP)-Reportergen enthielt, das von einem RNA-Polymerase I-Promotor und -Terminator flankiert war. Intrazelluläre Transkription des letzteren Konstrukts durch RNA-Polymerase I erzeugte GFP-vRNA, die in Virus-ähnliche Partikel verpackt war. Dieses System, das mehr als 104 infektiöse Partikel pro ml Überstand produzierte, kann bei Studien zur Influenzavirus-Replikation und Bildung von Partikeln nützlich sein. Es könnte sich auch positiv auf Bemühungen zur Herstellung von Vakzinen und bei der Entwicklung von verbesserten Gentherapievektoren auswirken.
  • Deshalb ist hierin eine Wirtszelle beschrieben, deren Genom mit mindestens einem rekombinanten DNA-Molekül stabil angereichert ist. Das rekombinante DNA-Molekül schließt mindestens eines der folgenden ein: ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstopp- oder Transkriptionsterminationssequenz umfasst und mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region für Influenzavirus HA verknüpft ist; ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstop- oder Transkriptionsterminationssequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus NA verknüpft ist; ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstop- oder Transkriptionsterminationssequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus M1 verknüpft ist; ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstop- oder Transkriptionsterminationssequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus NS2 verknüpft ist; ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstopp- oder Transkriptionsterminationssequenz umfasst und mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region für Influenzavirus M2 verknüpft ist; ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten loxP-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstop- oder Transkriptionsterminationssequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus PA verknüpft ist; ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstop- oder Transkriptionsterminationssequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus PB1 verknüpft ist; ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstop- oder Transkriptionsterminationssequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus PB2 verknüpft ist; oder ein rekombinantes DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstop- oder Transkriptionsterminationssequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus NP verknüpft ist.
  • Bevorzugt ist die Wirtszelle angereichert mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus HA verknüpft ist; einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus NA verknüpft ist; einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus M1 verknüpft ist; einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus NS2 verknüpft ist; und einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus M2 verknüpft ist. Bevorzugt handelt es sich bei den lox-Stellen um loxP-Stellen.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von infektiösem replikationsdefizientem Influenzavirus bereit. Das Verfahren umfasst Inkontaktbringen einer Wirtszelle, die mit den rekombinanten DNA-Molekülen, wie hierin beschrieben, angereichert ist, die z.B. HA, NA, M1, M2, NS2, PA, PB1, PB2 oder NP codieren, mit einem rekombinanten Influenzavirus, umfassend: vRNA, die einen offenen Leserahmen für Cre umfasst, und vRNAs, die Influenza-Gene umfassen, die von der Wirtszelle nicht exprimiert werden. Aus der Wirtszelle, die mit dem Virus in Kontakt gebracht worden war, wird dann Virus gewonnen. Bevorzugt umfasst das rekombinante Virus ferner vRNA, die einen gewünschten offenen Leserahmen umfasst. Alternativ wird die angereicherte Wirtszelle mit einem Vektor, der einen Promotor umfasst, der in der Wirtszelle funktioniert und funktionell mit einem DNA-Segment verknüpft ist, das Cre codiert, und einer Vielzahl von Vektoren in Kontakt gebracht, von denen jeder einen Promotor umfasst, der funktionell mit einer Influenzavirus-cDNA verknüpft ist, die in der Wirtszelle nicht vorliegt. Virus wird dann gewonnen.
  • Hierin ist eine Wirtszelle beschrieben, deren Genom angereichert ist mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen in der Wirtszelle funktionierenden Promotor umfasst, der mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verbunden ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region für ein die Oberfläche der Wirtszelle bindendes Protein verbunden ist; einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen in der Wirtszelle funktionierenden Promotor umfasst, der mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verbunden ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region für ein Fusionsprotein verbunden ist; einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen in der Wirtszelle funktionierenden Promotor umfasst, der mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verbunden ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus M1 verbunden ist; einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen in der Wirtszelle funktionierenden Promotor umfasst, der mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verbunden ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus NS2 verbunden ist; einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen in der Wirtszelle funktionierenden Promotor umfasst, der mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verbunden ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus M2 verbunden ist. Bevorzugt handelt es sich bei den lox-Stellen um loxP-Stellen.
  • Ebenfalls ist hierin noch eine Wirtszelle beschrieben, deren Genom angereichert ist mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen in der Wirtszelle funktionierenden Promotor umfasst, der mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verbunden ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region für ein die Oberfläche der Wirtszelle bindendes Protein und ein Fusionsprotein verbunden ist; einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen in der Wirtszelle funktionierenden Promotor umfasst, der mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verbunden ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region für Influenzavirus M1 verbunden ist; einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen in der Wirtszelle funktionierenden Promotor umfasst, der mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verbunden ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region von Influenzavirus NS2 verbunden ist; und einem rekombinanten DNA-Molekül, das einen in der Wirtszelle funktionierenden Promotor umfasst, der mit einer ersten lox-Stelle verbunden ist, die mit einem DNA-Segment verbunden ist, das eine Transkriptionsstopsequenz umfasst, die mit einer zweiten lox-Stelle verbunden ist, welche mit einer codierenden Region für Influenzavirus M2 verbunden ist. Bevorzugt handelt es sich bei den lox-Stellen um loxP-Stellen.
  • Wirtszellen, die, wie hierin vorstehend beschrieben, mit rekombinanten DNA-Molekülen angereichert sind, sind nützlich, um infektiöses replikationsdefizientes Influenzavirus zu erzeugen. Zum Beispiel wird eine Wirtszelle, die stabil mit rekombinanten DNA-Molekülen transfiziert ist, die HA, NA, M1, M2 und NS2 codieren, mit einer Vielzahl von Vektoren in Kontakt gebracht, d.h. Vektoren, die vRNA, die einen offenen Leserahmen für Cre umfassen, vRNA, die PA umfasst, vRNA, die NP umfasst, vRNA, die PB1 umfasst, vRNA, die PB2 umfasst, und wahlweise vRNA exprimieren, die ein Gen von Interesse umfasst; und Vektoren, die PA, PB1, PB2 und NP codieren.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Virus, welche keine Infektion mit einem Helfervirus erfordern, sind nützlich bei Virusmutagenesestudien und bei der Herstellung von Vakzinen (z.B. für AIDS, Influenza, Hepatitis B, Hepatitis C, Rhinovirus, Filoviren, Malaria, Herpes und Maul- und Klauenseuche) und Gentherapievektoren (z.B. für Krebs, AIDS, Adenosindesaminase, Muskeldystrophie, Ornithintranscarbamylase-Defizienz und Tumoren des zentralen Nervensystems).
  • Deshalb ist hierin ein Virus zur Verwendung in der medizinischen Therapie (z.B. für ein Vakzin oder eine Gentherapie) beschrieben. Zum Beispiel wird hierin ein Verfahren beschrieben, um ein Individuum gegen ein Pathogen zu immunisieren, z.B. gegen ein Bakterium, ein Virus oder einen Parasiten oder einen malignen Tumor. Das Verfahren umfasst Verabreichen einer Menge von mindestens einem isolierten Virus der Erfindung an das Individuum, wahlweise in Kombination mit einem Adjuvans, welches wirksam ist, das Individuum zu immunisieren. Das Virus umfasst vRNA, welche ein Polypeptid, das von dem Pathogen codiert wird, oder ein Tumor-spezifisches Polypeptid umfasst.
  • Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren, die Expression eines endogenen Proteins in einem Säuger zu steigern oder zu erhöhen, bei dem eine Indikation oder eine Krankheit vorliegt, welche durch eine verminderte Menge oder das Fehlen eines endogenen Proteins gekennzeichnet ist. Das Verfahren umfasst Verabreichen einer Menge eines isolierten Virus der Erfindung an den Säuger, welche wirksam ist, die Menge des endogenen Proteins in dem Säuger zu steigern oder zu erhöhen. Bevorzugt handelt es sich bei dem Säuger um einen Menschen.
  • Ebenfalls hierin beschrieben sind Vektoren und Verfahren für die rekombinante Herstellung von Positivstrangviren, z.B. Positivstrang-RNA-Viren. Demnach ist hierin ein Vektor beschrieben, der ein DNA-Segment umfasst, das RNA-Polymerase I-Transkriptionsinitiationssequenzen umfasst, die funktionell mit einem zweiten DNA-Segment verbunden sind, welches Sequenzen von einem Positivstrang-RNA-Virus umfasst und gegebenenfalls funktionell mit einem dritten DNA-Segment verbunden ist, das RNA-Polymerase I-Transkriptionsterminationssequenzen umfasst. Es wird auch ein Verfahren bereitgestellt, den Vektor (die Vektoren) dazu zu verwenden, rekombinantes Virus herzustellen. Das Verfahren ist besonders nützlich, da es clonierte DNA und Transfektionsmethoden verwendet und so die Handhabung von RNA umgeht. Darüber hinaus ist die RNA-Polymerase I-Transkription hoch effizient und weist eine hohe Genauigkeit auf. Für Positivstrang-RNA-Viren, deren genomische RNA keine Kappen-Struktur aufweist (z.B. Pestiviren, Hepatitis C-Viren und Picornaviridae, einschließlich Poliovirus, Rhinoviren, Hepatitis A-Virus und Maul- und Klauenseuche-Virus) wird eine das Volllängen-Genom codierende cDNA in der genomischen Sense-Orientierung zwischen den RNA-Polymerase I-Promotor- und -Terminatorsequenzen eingeführt. Transfektion des so erhaltenen Plasmids in permissive Wirtszellen ergibt genomische RNA für die Virusreplikation. Eine Reihe von Positivstrang-RNA-Viren enthalten genomische RNAs mit einer Kappen-Struktur (z.B. Flaviviren, einschließlich Dengue-Fieber-Virus und mehrerer Encephalitisviren). Während RNA-Polymerase I-Transkripte keine Kappen-Struktur enthalten, wird eine das Volllängen-Genom codierende cDNA von RNA-Viren, die genomische RNAs mit einer Kappen-Struktur aufweisen, in der antigenomischen Sense-Orientierung in einen RNA-Polymerase I-Transkriptionsvektor eingeführt. Nach der Transfektion des so erhaltenen Plasmids transkribiert die zelluläre RNA-Polymerase I eine antigenomische (nicht mit einer Kappen-Struktur versehene) RNA. Darüber hinaus führt eine Cotransfektion mit Proteinexpressionsplasmiden für die für die Replikation benötigten Proteine zu einer Replikation der antigenomischen RNA, was somit genomische RNA und schlussendlich infektiöses Virus ergibt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1. Schematische Darstellung etablierter reverse Genetik-Systeme. Bei dem RNP-Transfektionsverfahren (A) werden aufgereinigtes NP und Polymeraseproteine unter Verwendung von in vitro-synthetisierter vRNA in RNPs zusammengesetzt. Zellen werden mit RNPs transfiziert, gefolgt von einer Infektion mit Helferviren. Bei dem RNA-Polymerase I-Verfahren (B) wird ein Plasmid, das den RNA-Polymerase I-Promotor, eine die zu rettende vRNA codierende cDNA und den RNA-Polymerase I-Terminator enthält, in Zellen transfiziert. Intrazelluläre Transkription durch RNA-Polymerase I ergibt synthetische vRNA, die bei Infektion mit Helfervirus hin in Nachkommen-Viruspartikel verpackt wird. Bei beiden Verfahren werden Virustransfektanten (d.h. diejenigen Viren, die RNA enthalten, die von der clonierten cDNA abgeleitet ist) mittels Selektion aus der Population von Helferviren erhalten.
  • 2. Schematische Darstellung der Herstellung von RNA-Polymerase I-Konstrukten. Von Influenzavirus abgeleitete cDNAs wurden mittels PCR amplifiziert, mit BsmBI verdaut und in die BsmBI-Stellen des Vektors pHH21 (E. Hoffmann, Doktorarbeit, Justus-Liebig-Universität, Gießen, Deutschland) cloniert, welcher den menschlichen RNA-Polymerase I-Promotor (P) und den RNA-Polymerase I-Terminator der Maus (T) enthält. Das Thymidinnucleotid stromaufwärts von der Terminator-Sequenz (*T) stellt das 3'-Ende der Influenzavirus-RNA dar. Sequenzen von Influenzavirus A sind in fett gedruckten Buchstaben dargestellt.
  • 3. Vorgeschlagenes reverse Genetik-Verfahren zur Herstellung segmentierter Negativstrang-RNA-Viren. Plasmide, die den RNA-Polymerase I-Promotor, der mit einer cDNA für jedes der acht viralen RNA-Segmente verbunden ist, und den RNA-Polymerase I-Terminator enthalten, werden zusammen mit Proteinexpressionsplasmiden in Zellen transfiziert. Obwohl infektiöse Viren mit den Plasmiden hergestellt werden können, die PA, PB1, PB2 und NP exprimieren, erhöht die Expression aller übrigen Strukturproteine (in Klammern angegeben) je nach dem hergestellten Virus die Effizienz der Virusproduktion.
  • 4. Nachweis des FLAG-Epitops in Zellen, die mit einer Virustransfektante infiziert worden sind. Es wurde eine Antikörperfärbung verwendet, um das NA in MDCK-Zellen, die entweder mit PR8-WSN-FL79-(A, D) oder mit A/WSN/33-Wildtyp-Virus (B, E) infiziert waren oder in zum Schein infizierten MDCK-Zellen (C, F) zu identifizieren. Neun Stunden nach Infektion wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert, mit Triton X-100 behandelt und mit entweder monoclonalen Anti-FLAG-(A-C) oder Anti-WSN NA-(D-F) Antikörpern inkubiert. Eine intensive Färbung des Golgi (rot) ist in den positiven Proben zu erkennen (A, D und E).
  • 5. Gewinnung von PA-Mutanten. Das PA-Gen von jedem Virus wurde durch RT-PCR mit Primern amplifiziert, die ein 1226 bp großes Fragment ergeben (Position 677 bis 1903 der mRNA, Spuren 1, 3, 5), welches dann mit dem Restriktionsenzym Bsp120l (an Position 846 der mRNA, Spuren 4, 7) oder Pvu II (an Position 1284 der mRNA, Spuren 2, 6) verdaut wurde. Die Anwesenheit von Bsp120I oder Pvu II-Stellen in den PCR-Produkten ergab entweder 169 bp und 1057 bp große oder 607 bp und 619 bp große Fragmente. MW = Molekulargewichtsmarker.
  • 6. Zum Amplifizieren von Influenza-Sequenzen verwendete Primer.
  • 7. Das Plasmid pPolI-GFP zum Herstellen von Influenzavirus-ähnlicher RNA, welche das GFP-Protein codiert. Dieses Plasmid enthält das GFP-Gen (abgeleitet von pEGFP-N1, Clontech, Palo Alto, KA) in Antisense-Orientierung zwischen den 5'- und 3'-nichtcodierenden Regionen des Segments 5 von Influenzavirus A, flankiert von dem menschlichen RNA-Polymerase I-Promotor und dem RNA-Poly merase I-Terminator der Maus.
  • 8. Schematische Darstellung der Strategie zur Herstellung von VLP. Einzelne Proteinexpressionsplasmide und ein Plasmid, das den RNA-Polymerase I-Promotor, eine das GFP-Reportergen codierende cDNA und den RNA-Polymerase I-Terminator enthält, werden in 293T-Zellen transfiziert. Intrazelluläre Transkription durch RNA-Polymerase I ergibt GFP-vRNA negativer Polarität, wie es durch die umgedrehten Buchstaben angegeben ist. Überstände, die VLPs enthalten, werden geerntet, mit Influenza-Helfervirus gemischt und damit werden MDCK-Zellen angeimpft.
  • 9. Die PA-, PB1-, PB2- und NP-Proteine von Influenza A-Virus verpacken GFP-vRNA, die von RNA-Polymerase I hergestellt wird, was zur Expression von GFP führt. 293T-Zellen wurden mit Plasmiden, die PB2-, PB1-, PA- und NP-Proteine exprimieren (A), oder mit allen Plasmiden außer demjenigen, das das NP-Protein exprimiert (B), zusammen mit dem RNA-Polymerase I-GFP-Gen-Plasmid für die intrazelluläre Synthese von Reportergen-vRNA transfiziert. Zellen wurden 48 h nach Transfektion fixiert und die GFP-Expression wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt.
  • 10. Herstellung von Influenzavirus-VLPs. 293T-Zellen wurden zusammen mit dem RNA-Polymerase I-GFP-Gen-Plasmid mit neun Plasmiden, wobei jedes ein anderes virales Strukturprotein exprimiert (A), oder mit acht Plasmiden, wobei das Konstrukt für NP weggelassen wurde (B), transfiziert. 48 Stunden nach Transfektion wurden VLP-enthaltende Überstände gesammelt, mit A/WSN/33-Helfervirus gemischt und in MDCK-Zellen angeimpft. Zellen wurden 10 Stunden nach Infektion fixiert und die Expression von GFP wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt.
  • 11. Schematische Darstellung der Verwendung von Cre-Rekombinase, um das Influenza-Protein NS2 in einer Zelle zu exprimieren, deren Genom mit einem rekombinanten DNA-Molekül angereichert ist. Das Genom der Zelle umfasst ein rekombinantes DNA-Molekül, welches einen Promotor umfasst, der mit einer ortsspezifischen Rekombinationsstelle (z.B. loxP) verbunden ist, die mit einer Transkriptionsstopsequenz verbunden ist, die mit einer zweiten ortsspezifischen Rekombinationsstelle in derselben Orientierung wie die erste ortsspezifische Rekombinationsstelle verbunden ist, die mit dem NS2-Gen verbunden ist.
  • 12. Erzeugung von replikationsdefizientem Influenzavirus.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Begriffserklärungen
  • Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „isoliert und/oder aufgereinigt" auf die in vitro-Herstellung, Isolierung und/oder Aufreinigung eines Vektors oder eines Plasmids der Erfindung, so dass er (es) nicht mit in vivo-Substanzen assoziiert ist oder im Wesentlichen von in vitro-Substanzen gereinigt ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „rekombinante Nucleinsäure" oder „rekombinante DNA-Sequenz oder rekombinantes DNA-Segment" auf eine Nucleinsäure, z.B. auf DNA, welche von einer Quelle abgeleitet oder isoliert worden ist und anschließend in vitro chemisch verändert werden kann, so dass ihre Sequenz nicht natürlich vorkommt, oder die natürlich vorkommenden Sequenzen entspricht, die nicht so angeordnet sind, wie sie in dem nativen Genom angeordnet wären. Ein Beispiel für eine DNA, die von einer Quelle „abgeleitet" ist, wäre eine DNA-Sequenz, die als ein nützliches Fragment identifiziert wird und die dann chemisch in im Wesentlichen reiner Form synthetisiert wird. Ein Beispiel einer solchen DNA, die aus einer Quelle „isoliert" ist, wäre eine nützliche DNA-Sequenz, welche durch chemische Mittel von dieser Quelle ausgeschnitten oder entfernt worden ist, z.B. durch die Verwendung von Restriktionsendonucleasen, so dass sie weiter durch Verfahren der Gentechnologie für die Verwendung in der Erfindung bearbeitet, z.B. amplifiziert werden kann.
  • Wie hierin verwendet, soll „ortsspezifische Rekombination" die folgenden drei Ereignisse einschließen: 1) Deletion eines Ziel-DNA-Segments, das von ortsspezifischen Rekombinationsstellen oder -sequenzen, z.B. loxP-Stellen, flankiert ist; 2) Inversion der Nucleotidsequenz des Ziel-DNA-Segments, das von ortsspezifischen Rekombinationsstellen oder -sequenzen, z.B. lox-Stellen, flankiert ist, und 3) wechselseitiger Austausch der Ziel-DNA-Segmente, die den ortsspezifischen Rekombinationsstellen oder -sequenzen, z.B. lox-Stellen, benachbart sind und die auf verschiedenen DNA-Molekülen liegen. Ortsspezifische Rekombinase-Systeme umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das Cre/loxP-Systems des Bakteriophagen P1 ( US-Patent Nr. 5,658,772 ).
  • Um die Reversibilität der ortsspezifischen Rekombinationsreaktion zu behe ben, kann die Struktur des Rekombinationssystems verändert werden. Die ortsspezifische Rekombinationssequenz kann auf eine Weise mutiert werden, so dass das Produkt der Rekombinationsreaktion nicht mehr als ein Substrat für die Rückwärts-Reaktion erkannt wird, wodurch das Integrations- oder Excisionsereignis stabilisiert wird. Z.B. werden, um unerwünschte Sequenzen zu entfernen, die lox-Stellen in derselben Orientierung angeordnet, um die unerwünschten Sequenzen zu flankieren.
  • Andere lox-Stellen schließen loxB-, loxL- und loxR-Stellen ein, bei denen es sich um Nucleotidsequenzen handelt, die aus E. coli isoliert worden sind (Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 3398 (1982)). Lox-Stellen können auch mittels einer Vielzahl von synthetischen Verfahren hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Zum Beispiel werden synthetische Verfahren zur Herstellung von lox-Stellen von Ito et al., Nucl. Acids Res. 10: 1755 (1982) und Ogilvie et al., Science 214: 270 (1981) offenbart.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „lox-Stelle" eine Nucleotidsequenz, an welcher das Genprodukt des Cre-Gens eine ortsspezifische Rekombination katalysieren kann. LoxP ist eine 34 Basenpaare lange Nucleotidsequenz, die mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren aus dem Bakteriophagen P1 isoliert werden kann (siehe zum Beispiel Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79: 3398 (1982)). loxP besteht aus zwei 13 Basenpaare langen umgekehrten Wiederholungen, die durch eine 8 Basenpaare lange Spacer-Region getrennt sind.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Cre-Gen" eine Nucleotidsequenz, die ein Enzym-Genprodukt codiert, welches in eukaryontischen Zellen die ortsspezifische Rekombination von DNA an lox-Stellen bewirkt. Ein Cre-Gen kann mittels auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren aus dem Bakteriophagen P1 isoliert werden (siehe Abremaid et al., Cell 32: 1301–1311 (1983)).
  • Replikation von Influenzaviren
  • Influenza A-Viren besitzen ein Genom aus acht einzelsträngigen viralen Negativstrang-RNAs (vRNAs), welche insgesamt zehn Proteine codieren. Der Lebenszyklus von Influenzaviren beginnt mit der Bindung von Hämagglutinin (HA) an Sialinsäure enthaltende Rezeptoren auf der Oberfläche der Wirtszelle, gefolgt von Rezeptor-vermittelter Endocytose. Der niedrige pH-Wert in späten Endosomen löst eine Konformationsänderung in dem HA aus, wodurch der N-Terminus der HA2- Untereinheit freigelegt wird (das sogenannte Fusionspeptid). Das Fusionspeptid leitet die Fusion der viralen und der endosomalen Membran ein, und das Matrixprotein (M1) und RNP-Komplexe werden in das Cytoplasma freigesetzt. RNPs bestehen aus dem Nucleoprotein (NP), welches vRNA verkapselt, und dem viralen Polymerase-Komplex, welcher von den Proteinen PA, PB1 und PB2 gebildet wird. RNPs werden in den Kern transportiert, wo Transkription und Replikation stattfinden. Der RNA-Polymerase-Komplex katalysiert drei unterschiedliche Reaktionen: die Synthese einer mRNA mit einer 5'-Kappen- und einer 3'-polyA-Struktur, einer komplementären Volllängen-RNA (cRNA) und einer genomischen vRNA, wobei die cDNA als Matrize verwendet wird. Neu synthetisierte vRNAs, NP und Polymeraseproteine werden dann zu RNPs zusammengesetzt, aus dem Kern exportiert und zur Plasmamembran transportiert, wo das Knospen von Nachkommen-Viruspartikeln stattfindet. Das Neuraminidase (NA)-Protein spielt spät in der Infektion eine wichtige Rolle, indem es die Sialinsäuren von Sialyloligosacchariden entfernt und so die neu zusammengebauten Virionen von der Zelloberfläche freisetzt und die Autoaggregation der Viruspartikel verhindert. Obwohl der Zusammenbau der Viren Protein-Protein- und Protein-vRNA-Wechselwirkungen einbezieht, ist die Natur dieser Wechselwirkungen weitgehend unbekannt.
  • Thogotovirus
  • Thogotoviren (THOV) stellen eine neue Gattung in der Familie der Orthomyxoviridae dar. Sie werden durch Zecken übertragen und sind in Haustieren gefunden worden, wozu Kamele, Ziegen und Rinder gehören. Demzufolge können THOV in Zecken- und Wirbeltierzellen replizieren. Das THOV-Genom umfasst sechs Segmente von einzelsträngigen Negativstrang-RNAs. Die von den drei größten Segmenten codierten Proteine weisen eine signifikante Homologie mit den Influenzavirus-Polymeraseproteinen PB2, PB1 und PA auf. Segment 5 codiert ein Protein, das mit Influenzavirus NP verwandt ist. Das THOV-Glycoprotein, das von Segment 4 codiert wird, ist weder mit Influenzavirus HA noch NA homolog, zeigt aber Sequenzähnlichkeit mit dem Baculovirus-Glycoprotein. Man nimmt an, dass das kleinste Segment ein Matrixprotein codiert, und es ähnelt keinem der Influenzavirus-Proteine. Wie bei Influenzavirus sind sowohl die 3'- als auch 5'- Enden der vRNA für die Promotoraktivität erforderlich, und diese Aktivität ist in den terminalen 14 und 15 Nucleotiden der 3'- bzw. 5'-Enden der vRNA gelegen.
  • Die mRNA-Synthese von THOV wird an von der Wirtszelle stammenden Kappen-Strukturen gestartet. Im Gegensatz zu Influenzavirus werden jedoch nur die Kappen-Strukturen (ohne zusätzliche Nucleotide) von den zellulären mRNAs abgespalten (Albo et al., 1996; Leahy et al., 1997, Weber et al., 1996). In vitro-Spaltungsassays haben gezeigt, dass sowohl die 5'- als auch die 3'-Enden der vRNA für die Endonucleaseaktivität erforderlich sind (Leahy et al., 1998), aber das Hinzufügen eines Modell-cRNA-Promotors stimuliert keine Endonucleaseaktivität (Leahy et al., 1998), wie es für Influenzavirus gezeigt worden ist (Cianci et al., 1995; Hagen et al., 1994). Man hat eine „Haken"-Struktur für THOV vorgeschlagen (Leahy et al., 1997; Weber et al., 1997), die ähnlich der Korkenzieher-Struktur ist, die für Influenzavirus vorgeschlagen worden ist (Flick et al., 1996). Diese „Haken"-Struktur findet man jedoch nur in dem THOV-vRNA-Promotor. Die cRNA-Promotorsequenz erlaubt keine Bildung von Basenpaaren zwischen den Positionen 2 und 9 und zwischen 3 und 8 am 5'- Ende der cRNA. Veränderungen an den Positionen 3 oder 8, um Basenpaarung zwischen diesen Nucleotiden zu erlauben, stimuliert Endonucleaseaktivität, was ein starkes unterstützendes Indiz für die vorgeschlagene „Haken"-Struktur darstellt (Leahy et al., 1998). Darüber hinaus könnte diese Struktur wichtig für die Regulation des Lebenszyklus von THOV sein; der vRNA-Promotor, welcher die „Haken"-Struktur ausbildet, kann die Endonucleaseaktivität von PB2 stimulieren und dadurch Transkription ermöglichen. Im Gegensatz dazu kann der cRNA-Promotor die „Haken"-Struktur nicht bilden und kann daher nicht in der Lage sein, Endonucleaseaktivität zu stimulieren, was Replikation zur Folge hat.
  • Bunyaviridae
  • Die Familie Bunyaviridae umfasst mehrere Viren, die hämorrhagisches oder encephalitisches Fieber bei Menschen verursachen (z.B. Rift Valley-Fieber, hämorrhagisches Hanta-, La Crosse- und Krim-Kongo-Fieber). Die kugelförmigen und umhüllten Virionen enthalten drei Segmente von einzelsträngiger Negativstrang-RNA (in einem Übersichtsartikel von Elliott, 1997 beschrieben). Das größte Segment (L) codiert das virale RNA-Polymerase-Protein (Protein L), wohingegen das M-Segment die zwei viralen Glycoproteine G1 und G2 sowie ein nicht-strukturelles Protein (NSm) codiert. Das kleinste Segment (S) codiert das Nucleocapsid-Protein (N) und ein zweites nicht-strukturelles Protein (NSs). Virale Replikation und Transkription finden im Cytoplasma statt, und neu zusammengesetzte Virionen knospen durch die Membranen des Golgi-Apparats.
  • Bridgen & Elliott (1996) haben ein reverse Genetik-System etabliert, um infektiöses Bunyamwera-Virus vollständig aus clonierten cDNAs zu erzeugen. Sie folgten einer Strategie, die zuerst von Schnell et al. (1994) für das Tollwutvirus beschrieben worden ist: intrazelluläre Transkription einer cDNA, welche die antigenomische Positivstrang-RNA (aber nicht die genomische Negativstrang-RNA) codiert, in Zellen, welche die virale Polymerase und Nucleoprotein exprimieren. Bridgen & Elliott (1996) infizierten HeLaT4+-Zellen mit Vacciniavirus, das T7-Polymerase exprimiert und transfizierten dieses Zellen mit Plasmiden, welche die Proteine exprimierten, die von den S-, M- und L-Segmenten codiert wurden. Sie transfizierten diese Zellen dann mit drei Plasmiden, welche die antigenomischen Volllängen-cDNAs codierten, flankiert vom T7-Polymerase-Promotor und dem Hepatitis Delta-Virus-Ribozym. Um die Zahl der Bunyavirus-Partikel relativ zur Zahl der Vacciniavirus-Partikel zu erhöhen, verwendeten die Autoren Moskitozellen, in denen Bunyamwera-, aber nicht Vacciniavirus repliziert. Dieses Protokoll kann nicht nur dazu verwendet werden, um Bunyaviridae gentechnologisch herzustellen, sondern auch um ungeordnete Viren zu erzeugen, die sich durch Coinfizieren von Zellen mit verschiedenen Bunyaviridae-Stämmen nur schwierig gewinnen lassen.
  • Um Bunyavirus-Promotorelemente und die viralen Proteine zu untersuchen, die für Transkription und Replikation erforderlich sind, clonierten Dunn et al. (1995) das CAT-Gen in der Negativsinn-Orientierung zwischen die 5'- und 3'-nicht-translatierten Regionen des RNA-Segments S von Bunyamwera. Zellen wurden mit Konstrukten transfiziert, die die Proteine exprimierten, die von den Segmenten L und S codiert werden, und wurden dann mit in vitro-transkribierter RNA transfiziert, was CAT-Aktivität zur Folge hatte. Das Bunyavirus-Segment S codiert zwei Proteine, N und NSs, in überlappenden Leserahmen. Um festzustellen, ob alle beide Proteine für für Transkription und Replikation erforderlich sind, wurden Konstrukte auf CAT-Aktivität getestet, die nur N oder NSs exprimierten. Expression von Protein N zusammen mit Protein L ergab CAT-Aktivität, wohingegen keine CAT-Aktivität mit dem NSs Expressionskonstrukt nachgewiesen wurde. Demnach sind die Proteine L und N ausreichend für Transkription und Replikation einer Bunyavirus-ähnlichen RNA.
  • Wie bei Influenzavirus sind die terminalen Sequenzen der Bunyavirus-RNAs komplementär und hoch konserviert. Man hat daher angenommen, dass diese Sequenzelemente den Bunyavirus-Promotor definieren und für die Promotoraktivität wichtig sind. Deletion von 5 Nucleotiden am 3'-Ende der viralen RNA vermindert die CAT-Expression dramatisch (Dunn et al., 1995). Im Gegensatz dazu hebt Hinzufügen von zwei Nucleotiden am 5'- Ende oder von 11 oder 35 Nucleotiden am 3'-Ende die CAT-Expression nicht auf (Dunn et al., 1995). Daher kann das Bunyamwera-Polymeraseprotein wie der Influenzavirus-Polymerase-Komplex Transkription und/oder Replikation offenbar intern starten.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Material und Methoden
  • Zellen und Viren. Menschliche embryonale 293T-Nierenzellen und Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) wurden in nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gezüchtet, das mit 10% fötalem Kälberserum supplementiert war, bzw. in modifiziertem Eagle-Medium (MEM), das 5% Serum von neugeborenen Kälbern enthielt. Alle Zellen wurden bei 37°C in 5% CO2 gehalten. Die Influenzaviren A/WSN/33 (H1N1) und A/PR/8/34 (H1N1) wurden in 10 Tage alten Eiern vermehrt.
  • Konstruktion von Plasmiden. Um RNA-Polymerase I-Konstrukte zu erzeugen, wurden clonierte cDNAs, die von viraler A/WSN/33- oder A/PR/8/34-RNA abgeleitet waren, zwischen die Promotor- und Terminator-Sequenzen von RNA-Polymerase I eingeführt. In Kürze, die clonierten cDNAs wurden durch PCR mit Primern amplifiziert, die BsmBI-Stellen enthielten, mit BsmBI verdaut und in die BsmBI-Stellen des Vektors pHH21 cloniert, welcher den menschlichen RNA-Polymerase I-Promotor und den RNA-Polymerase I-Terminator der Maus enthielt, getrennt durch BsmBI-Stellen (2). Die PB2-, PB1-, PA-, HA-, NP-, NA-, M- und NS-Gene des Stamms A/WSN/33 wurden mit Hilfe der folgenden Plasmide PCR-amplifiziert: pSCWPB2, pGW-PB1 und pSCWPA (alle von Dr. Debi Nayak an der University of California Los Angeles erhalten) bzw. pWH17, pWNP152, pT3WNA15 (Castrucci et al., 1992), pGT3WM und pWNS1. Das PB1-Gen von Influenzavirus A/PR/8/34 wurde unter Verwendung von pcDNA774 (PB1) (Perez et al., 1998) als Matrize amplifiziert. Siehe 6 für die Sequenzen der Primer. Um sicherzustellen, dass die Gene keine unerwünschten Mutationen enthielten, wurden die PCR-abgeleiteten Fragmente mit einem automatischen Sequenziergerät (Applied Biosystems Inc., KA, USA) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll sequenziert. Die cDNAs, welche die HA-, NP-, NA- und M1-Gene des Virus A/WSN/33 codierten, wurden, wie beschrieben, cloniert (Huddleston et al., 1982) und in den eukaryontischen Expressionsvektor pCAGGS/MCS (kontrolliert durch den β-Actin-Promotor vom Huhn) (Niwa et al., 1991) subcloniert, was zu pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0-14, pCAGGS-WNA15 bzw. pCAGGS-WSN-M1-2/1 führte. Die MMP-2- und NS2-Gene von dem Virus A/PR/8/34 wurden mittels PCR amplifiziert und in pCAGGS/MCS cloniert, was pEP24c und pCA-NS2 ergab. Schließlich wurden pcDNA774(PB1), pcDNA762(PB2) und pcDNA787(PA) verwendet, um die Proteine PB2, PB1 und PA unter der Kontrolle des Cytomegalievirus-Promotors zu exprimieren (Perez et al., 1998).
  • Erzeugung infektiöser Influenza-Partikel. 293T-Zellen (1 × 106) wurden mit einem Maximum von 17 Plasmiden in verschiedenen Mengen unter Verwendung von Trans IT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) gemäß den Vorschriften des Herstellers transfiziert. In Kürze, DNA und Transfektionsreagenz wurden gemischt (2 μl Trans IT LT-1 pro μg DNA), für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und zu den Zellen hinzugegeben. Sechs Stunden später wurde das DNA-Transfektionsreagenz-Gemisch durch Opti-MEM (Gibco-BRL, Gaithersburgh, Maryland) ersetzt, das 0,3% Rinderserumalbumin und 0,01% fötales Kälberserum enthielt. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transfektion wurden Viren aus dem Überstand geerntet und auf MDCK-Zellen titriert. Da für diese Prozedur kein Helfervirus erforderlich war, wurden die gewonnenen Virustransfektanten ohne Plaque-Aufreinigung analysiert.
  • Bestimmung des prozentualen Anteils der Plasmid-transfizierten Zellen, die Viren produzierten. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die 293T-Zellen mit 0,02% EDTA in Einzelzellen dispergiert. Die Zellsuspension wurde dann 10-fach verdünnt und in Platten mit 24 Vertiefungen auf konfluente Einzelschichten von MDCK-Zellen transferiert. Viren wurden mit dem Hämagglutinin-Assay nachgewiesen.
  • Immunfärbungs-Assay. Neun Stunden nach der Infektion mit Influenzavirus wurden die Zellen zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 3,7% Paraformaldehyd (in PBS) fixiert. Als nächstes wurden sie mit 0,1% Triton X-100 behandelt und wie, von Neumann et al. (1997) beschrieben, weiterverarbeitet.
  • Ergebnisse
  • Erzeugung von infektiösem Virus durch plasmidgesteuerte Expression von viralen RNA-Segmenten, drei Polymerase-Untereinheiten und NP-Protein. Obwohl Transfektion von Zellen mit einem Gemisch von RNPs, die aus aufgereinigten Virionen extrahiert worden sind, zu infektiösen Influenza-Partikeln führt, ist diese Strategie wahrscheinlich nicht wirksam, wenn sie mit acht verschiedenen in vitro-erzeugten RNPs verwendet wird. Um infektiöse Influenzaviren vollständig aus cDNAs zu erzeugen, wurden acht virale RNPs in vivo erzeugt. So wurden Plasmide hergestellt, die cDNAs für die viralen Volllängen-RNAs des Virus A/WSN/33 enthalten, flankiert von dem menschlichen RNA-Polymerase I-Promotor und dem RNA-Polymerase I-Terminator der Maus. Im Prinzip sollte eine Transfektion dieser acht Plasmide in eukaryontische Zellen zur Synthese aller acht Influenza-vRNAs führen. Die PB2-, PB1-, PA- und NP-Proteine, die durch Cotransfektion von Proteinexpressionsplasmiden erzeugt worden sind, sollten dann die vRNAs zu funktionellen vRNPs zusammenfügen, die repliziert und transkribiert werden, wodurch schlussendlich infektiöse Influenzaviren gebildet werden (3). 1 × 106 293T-Zellen wurden mit Proteinexpressionsplasmiden transfiziert (1 μg pcDNA762(PB2), 1 μg pcDNA774(PB1), 0,1 μg pcDNA787(PA) und 1 μg pCAGGS-WSN-NPO/14) und jeweils 1 μg der folgenden RNA-Polymerase I-Plasmide (pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PB1, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-NA, pPolI-WSN-M und pPolI-WSN-NS). Die Entscheidung, eine verringerte Menge von pcDNA787(PA) zu verwenden, basierte auf früheren Beobachtungen (Mena et al., 1996) und auf Daten über die optimalen Bedingungen zur Erzeugung von Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) (Daten nicht gezeigt). 24 Stunden nach Transfektion der 293T-Zellen wurden 7 × 103 pfu Virus pro ml im Überstand gefunden (Experiment 1, Tabelle 1), was zum ersten Mal die Fähigkeit von reverser Genetik zeigte, Influenza A-Virus vollständig aus Plasmiden zu erzeugen. Tabelle 1. Verwendete Plasmid-Sätze, um Influenzavirus aus clonierter cDNA* zu erzeugen
    Experiment
    RNA-Polymerase I-Plasmide für:† 1 2 3 4 5 6 7 8
    PB1 + + – – – – – –
    PR8-PB1 – – + + + + + +
    PB2 + + + + + + + +
    PA + + + + + + + +
    HA + + + + + + + +
    NP + + + + + + + +
    NA + + + + + + + +
    M + + + + + + + +
    NS + + + + + + + +
    Proteinexpressions-Plasmide für:†
    PB1 + + + + – + + +
    PB2 + + + + + – + +
    PA + + + + + + – +
    NP + + + + + + + –
    HA – + – + + + + +
    NA – + – + + + + +
    M1 – + – + + + + +
    M2 – + – + + + + +
    NS2 – + – + + + + +
    Virus titer (pfu/ml) 7 × 103 7 × 103 1 × 103 3 × 104 0 0 0 0
    • * 293T-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. 24 (Experimente 1 und 2) oder 48 Stunden (Experimente 3–8) später wurde der Virustiter im Überstand auf MDCK-Zellen bestimmt.
    • † Sofern nicht anderweitig angegeben, wurden die Plasmide mit cDNAs konstruiert, welche die RNAs des Virus A/WSN/33 darstellen.
  • Effizienz der Herstellung von Influenzavirus mit Coexpression aller viralen Strukturproteine. Obwohl die Expression der viralen NP- und Polymerase-Proteine für die Plasmid-gesteuerte Herstellung von Influenzaviren ausreichend ist, war es möglich, dass die Effizienz verbessert werden konnte. In früheren Studien führte die Expression von allen Strukturproteinen von Influenzavirus (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M-2 und NS2) zu VLPs, die eine künstliche vRNA enthielten, die ein Chloramphenicol-Acetyltransferase-Reportergen codierte (Mena et al., 1996). Demnach könnte die Verfügbarkeit des vollständigen Komplements von Strukturproteinen statt nur denen, die für die virale RNA-Replikation und -Transkription erforderlich sind, die Effizienz der Virusproduktion verbessern. Zu diesem Zweck wurden 293T-Zellen mit optimalen Mengen von viralen Proteinexpressionsplasmiden transfiziert (beurteilt anhand der VLP-Produktion; nicht veröffentlichte Daten): 1 μg pcDNA762(PB2) und pcDNA774(PB1), 0,1 μg pcDNA787(PA); 1 μg pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0/14 und pCAGGS-WNA15; 2 μg pCAGGS-WSN-M1-2/1; 0,3 μg pCA-NS2; und 0,03 μg pEP24c (für M2), zusammen mit 1 μg von jedem RNA-Polymerase I-Plasmid (Experiment 2, Tabelle 1). Ein zweiter Satz von Zellen wurde mit dem gleichen Satz von RNA-Polymerase I-Plasmiden mit Ausnahme des PB1-Gens, für das pPolI-PR/8/34-PB1 in dem Bestreben substituiert wurde, ein umgeordnetes Virus zu erzeugen, zusammen mit Plasmiden, die nur PA, PB1, PB2 und NP exprimieren (Experiment 3, Tabelle 1), oder denjenigen transfiziert, die alle Influenza-Strukturproteine exprimierten (Experiment 4, Tabelle 1). Die Ausbeuten an WSN-Virus unterschieden sich nach 24 Stunden (Experimente 1 und 2, Tabelle 1) oder nach 36 Stunden post Transfektion (Daten nicht gezeigt) nicht nennenswert. Es wurde jedoch ein mehr als 10-facher Anstieg in den Ausbeuten des Virus mit PR/8/34-PB1 festgestellt, wenn alle Influenzavirus-Strukturproteine bereitgestellt wurden (Experimente 3 und 4, Tabelle 1). Negativkontrollen, denen eines der Plasmide für die Expression von PA-, PB1-, PB2- oder NP-Proteinen fehlte, lieferten überhaupt kein Virus (Experimente 5–8, Tabelle 1). Somit verbesserte die Expression aller Strukturproteine des Influenza A-Virus, je nach dem erzeugten Virus, die Effizienz des reverse Genetik-Verfahrens deutlich.
  • Als nächstes wurde die Kinetik der Virusproduktion nach Transfektion von Zellen bestimmt, wobei der Satz von Plasmiden eingesetzt wurde, der verwendet worden war, um ein Virus mit dem A/PR/8/34-PB1-Gen zu erzeugen. In zwei von drei Experimenten wurde Virus zuerst nach 24 Stunden nach Transfektion nachgewiesen. Der zu diesem Zeitpunkt gemessene Titer, > 103 pfu/ml, war nach 48 Stunden nach Transfektion auf > 106 pfu/ml angestiegen (Tabelle 2). Um den prozentualen Anteil an Plasmid-transfizierten Zellen zu schätzen, der Viren produzierten, wurden 293T-Zellen 24 Stunden nach Transfektion mit EDTA (0,02%) behandelt, um die Zellen zu dispergieren, und dann wurden Grenzverdünnungsstudien durchgeführt. In diesem Experiment wurde zu diesem Zeitpunkt kein freies Virus im Kulturüberstand gefunden. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass 1 von 103,3 Zellen infektiöse Viruspartikel erzeugte. Tabelle 2. Kinetik der Virusproduktion nach Plasmid-Transfektion in 293T-Zellen*
    Stunden nach Plasmid-Transfektion Virustiter im Kulturüberstand (pfu/ml)
    Experiment
    1 2 3
    6 0 ND ND
    12 0 ND 0
    18 0 ND 0
    24 0 2 × 103 6 × 103
    30 ND 5 × 104 9 × 104
    36 6 × 102 > 1 × 105 7 × 105
    42 ND > 1 × 106 5 × 106
    48 8 × 104 > 1 × 106 1 × 107
    • * 293T-Zellen wurden mit acht RNA-Polymerase I-Plasmiden, die Gene des A/WSN/33-Virus mit Ausnahme des PB1-Gens codierten, das von dem A/PR/8/34-Virus abgeleitet ist, und neun Proteinexpressionsplasmiden transfiziert, wie im Text beschrieben. Zu verschiedenen Zeitpunkten titrierten wir das Virus im Kulturüberstand auf MDCK-Zellen. ND = nicht durchgeführt.
  • Gewinnung von Influenzavirus, welches das FLAG-Epitop in dem NA-Protein enthält. Um zu bestätigen, dass das neue reverse Genetik-System die Einführung von Mutationen in das Genom von Influenza A-Virus ermöglicht, wurde ein Virus erzeugt, das ein FLAG-Epitop (Castrucci et al., 1992) in dem NA-Protein enthielt. 293T-Zellen wurden mit einem RNA-Polymerase I-Plasmid (pPolI-WSN-NA/FL79), das eine cDNA enthielt, die sowohl das NA-Protein als auch ein FLAG-Epitop unten am Kopfteil des Proteins codierte, zusammen mit der benötigten RNA-Polymerase I- und den Proteinexpressionsplasmiden transfiziert. Um zu bestätigen, dass das gewonnene Virus (PR8-WSN-FL79) tatsächlich das NA-FLAG-Protein exprimierte, wurden Immunfärbungs-Assays von Zellen durchgeführt, die mit PR8-WSN-FL79- oder mit A/WSN/33-Wildtyp-Virus infiziert worden waren. Ein monoclonaler Antikörper gegen das FLAG-Epitop wies Zellen nach, die mit PR8-WSN-FL79 infiziert worden waren, aber nicht diejenigen, die mit Wildtyp-Virus infiziert worden waren (4). Gewinnung des PR8-WSN-FL79-Virus war so effizient wie diejenige für das Wildtyp-Virus ohne Marker (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das neue reverse Genetik-System es einem ermöglicht, Mutationen in das Genom von Influenza A-Virus einzuführen.
  • Erzeugung von infektiösem Influenza-Virus, das Mutationen im PA-Gen enthält. Um Viren herzustellen, die Mutationen in dem PA-Gen besitzen, wurden zwei stille Mutationen eingeführt, die neue Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen schufen (Bsp120I an Position 846 und Pvu II an Position 1284 der mRNA). Zuvor war es aufgrund des Fehlens eines zuverlässigen Selektionssystems nicht möglich, dieses Gen durch reverse Genetik zu modifizieren. Es wurden die Virustransfektanten, PA-T846C und PA-Al284, gewonnen. Die gewonnenen Virustransfektanten wurden durch zwei aufeinanderfolgende Grenzverdünnungen biologisch cloniert. Um zu überprüfen, dass es sich bei den gewonnenen Viren in der Tat um Transfektanten mit Mutationen in dem PA-Gen handelte, wurde cDNA für das PA-Gen durch reverse Transkriptase-PCR gewonnen. Wie in 5 gezeigt ist, wiesen die Viren PA-T846C und PA-A1284C die erwarteten Mutationen in dem PA-Gen auf, wie durch das Vorliegen der neu eingeführten Restriktionsstellen gezeigt ist. Eine PCR derselben viralen Proben und Primer ohne den reverse Transkriptionsschritt erzeugte keinerlei Produkte (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die PA-cDNA in der Tat von der vRNA stammte anstatt von dem Plasmid, das verwendet worden war, um die Viren zu erzeugen. Diese Ergebnisse veranschaulichen, wie Viren mit mutierten Genen ohne die Hilfe von Helferviren hergestellt und gewonnen werden können.
  • Diskussion
  • Die hierin beschriebenen reverse Genetik-Systeme ermöglichen es einem, Influenza A-Viren effizient vollständig aus clonierten cDNAs zu erzeugen. Bridgen und Elliott (1996) haben ebenfalls reverse Genetik eingesetzt, um ein Bunyamwera-Virus (Familie Bunyaviridae) zu erzeugen, aber es enthält nur drei Segmente von Negativsinn-RNA und die Effizienz von dessen Produktion war niedrig, 102 pfu/107 Zellen. Obwohl die Virusausbeuten zwischen den Experimenten unterschiedlich waren, wurden für Influenzavirus, das acht Segmente enthält, durchweg > 103 pfu/106 Zellen beobachtet. Es gibt mehrere Erklärungen für die hohe Effizienz des hierin vorstehend beschriebenen reverse Genetik-Systems. Statt die RNPs in vitro zu erzeugen (Luytjes et al., 1989), wurden die RNPs in vivo durch intrazelluläre Synthese von vRNAs mittels RNA-Polymerase I sowie Plasmid-gesteuerte Expression der viralen Polymeraseproteine und NP erzeugt. Auch gewährleistete die Verwendung von 293T-Zellen, die leicht mit Plasmiden transfiziert werden (Goto et al., 1997), dass eine große Population von Zellen alle Plasmide erhielt, die für die Virusproduktion benötigt werden. Darüber hinaus trug die große Zahl von Transkripten, die durch RNA-Polymerase I erzeugt werden, die eines der am höchsten exprimierten Enzyme in wachsenden Zellen ist, wahrscheinlich zur Gesamt-Effizienz des Systems bei. Diese Eigenschaften führten zu einer entsprechend großen Zahl von vRNA-Transkripten und ausreichenden Mengen von viralem Protein für die Verpackung der vRNA, Bildung von RNPs im Kern und den Export dieser Komplexe zur Zellmembran, wo die neuen Viren zusammengesetzt und freigesetzt werden.
  • Früher etablierte reverse Genetik-Systeme (Enami et al., 1990; Neumann et al., 1994; Luytjes et al., 1989; Pleschka et al., 1996) benötigen eine Infektion mit Helferviren und deshalb Selektionsverfahren, die es gestatten, dass eine kleine Zahl von Transfektanten aus einer riesigen Zahl von Helferviren gewonnen werden kann. Solche Strategien sind dazu verwendet worden, Influenzaviren zu erzeugen, die eines der folgenden von cDNA abgeleiteten Gene besitzen: PB2 (Subbarao et al., 1993), HA (Enami et al., 1991; Horimoto et al., 1994), NP (Li et al., 1995), NA (Enami et al., 1990), M (Castrucci et al., 1995; Yasuda et al., 1994) und NS (Enami et al., 1991). Die mesiten Selektionsverfahren, außer denen, die für die HA- und NA-Gene anwendbar sind, beruhen auf Wachstumstemperatur, Einschränkung des Wirtsbereichs oder Sensitivität gegenüber Wirkstoffen und schränken daher die Nützlichkeit der reversen Genetik zur funktionellen Analyse der Genprodukte ein. Selbst bei den HA- und NA-Genen, für die verlässliche antikörpergesteuerte Selektionssysteme verfügbar sind, ist es schwierig, Viren mit ausgeprägten Wachstumsstörungen herzustellen. Im Gegensatz dazu benötigt das hierin beschriebene reverse Genetik-System keinen Helfervirus und erlaubt es einem, Transfektanten mit Mutationen in einem beliebigen Gensegment oder mit schweren Wachstumsstörungen zu erzeugen. Dieser Vorteil ist in 5 dargestellt, welche die Gewinnung von Virustransfektanten mit einem mutierten PA-Gen zeigt. Die Verfügbarkeit einer Technologie, um jede beliebige lebensfähige Mutation in das Genom von Influenzavirus A einzuführen, wird Forscher dazu befähigen, eine Vielzahl von seit langem bestehenden Fragen zu adressieren, wie z.B. die Beschaffenheit der regulatorischen Sequenzen in nicht-translatierten Bereichen des viralen Genoms, Struktur-Funktions-Beziehungen von viralen Proteinen und die molekulare Grundlage der Beschränkung des Wirtsbereichs und der viralen Pathogenität.
  • Obwohl inaktivierte Influenza-Vakzine zur Verfügung stehen, ist deren Wirksamkeit suboptimal, was teilweise auf deren beschränkte Fähigkeit zurückzuführen ist, lokale IgA- und cytotoxische T-Zell-Reaktionen auszulösen. Klinische Studien mit kälteadaptierten Influenza-Lebendvakzinen, die derzeit im Gange sind, legen den Schluss nahe, dass solche Vakzine optimal attenuiert sind, so dass sie keine Influenza-Symptome verursachen, aber dennoch eine protektive Immunität induzieren (beschrieben in einem Übersichtsartikel von Keitel & Piedra, 1998). Vorläufige Ergebnisse weisen jedoch darauf hin, dass diese Lebendvirusvakzine nicht wesentlich wirksamer sind als das beste inaktivierte Vakzin (beschrieben in einem Übersichtsartikel von Keitel & Piedra, 1998), was Raum für weitere Verbesserungen lässt. Eine Möglichkeit wäre es, ein kälteadaptierten Vakzin mit dem vorstehend beschriebenen reverse Genetik-System zu modifizieren. Alternativ könnte man ganz von vorne anfangen, indem man reverse Genetik verwendet, um einen „Master"-Stamm von Influenza A mit mehreren attenuierenden Mutationen in den Genen zu erzeugen, die innen liegende Proteine codieren. Die faszinierendste Anwendung des hierin beschriebenen reverse Genetik-Systems dürfte in der schnellen Produktion von attenuierten Lebendvirusvakzinen in Fällen von vermuteten Pandemien liegen, die mit neuen HA- oder NA-Subtypen von Influenzavirus verbunden sind.
  • Dieses neue reverse Genetik-System wird wahrscheinlich die Verwendung von Influenzaviren als Vakzinvektoren fördern. Die Viren können so konstruiert werden, dass sie zusätzlich zu den Influenzavirus-Proteinen fremde Proteine oder immunogene Epitope exprimieren. Man könnte zum Beispiel Viren mit fremden Proteinen wie einem neunten Segment herstellen (Enami et al., 1991) und diese als Lebendvakzine einsetzen. Influenzaviren stimulieren nicht nur starke zellvermittelte und humorale Immunreaktionen, sondern bieten auch eine große Anzahl von Virionoberflächenproteinen HA und NA (z.B. 15 HA- und 9 NA-Subtypen und deren epidemischen Varianten), was eine wiederholte Immunisierung derselben Zielpopulation erlaubt.
  • Influenza-VLPs, die eine künstliche vRNA besitzen, die ein Reportergen codiert, sind hergestellt worden, indem man virale Strukturproteine und vRNA mit dem Vaccinia T7-Polymerase-System exprimiert hat (Mena et al., 1996). Mit Hilfe von reverser Genetik kann man nun VLPs erzeugen, die vRNAs, die Proteine codieren, die für die vRNA-Transkription und -Replikation benötigt werden (d.h. PA, PB1, PB2 und NP), ebenso wie vRNAs enthalten, die Proteine von Interesse codieren. Solche VLPs könnten nützliche Gentransportvehikel sein. Was wichtig ist, das Fehlen von Genen, die virale Strukturproteine codieren, würde gewährleisten, dass keine infektiösen Viren nach einer VLP-Gentherapie erzeugt werden. Da das Genom von Influenzavirus nicht in das Wirtschromosom integriert wird, wäre das VIP-System geeignet für eine Gentherapie in Situationen, die nur eine kurzfristige Transduktion von Zellen erfordern (z.B. für eine Krebsbehandlung). Im Gegensatz zu Adenovirus-Vektoren (Kovesdi et al., 1997) könnten Influenza-VLPs sowohl HA- als auch NA-Varianten enthalten, was eine wiederholte Behandlung von Zielpopulationen erlaubt.
  • Die Familie Orthomyxoviridae umfasst Influenza A-, B- und C-Viren ebenso wie den kürzlich klassifizierten Thogotovirus. Die hierin beschriebene Strategie zur Erzeugung von infektiösen Influenza A-Viren vollständig aus clonierten cDNAs würde auf jeden beliebigen Orthomyxovirus anwendbar sein und vielleicht auch auf andere segmentierte Negativsinn-RNA-Viren (z.B. Bunyaviridae, Arenaviridae). Die Fähigkeit, das virale Genom ohne technische Einschränkungen zu manipulieren, hat tief greifende Auswirkungen auf das Studium von viralen Lebenszyklen und deren Regulation, die Funktion von viralen Proteinen und die molekularen Mechanismen der viralen Pathogenität.
  • Beispiel 2
  • Expression der Influenzavirus-Proteine PB2, PB1, PA und NP führt zur Replikation und Transkription einer künstlichen viralen RNA. Um Influenza-VLPs zu erzeugen, wurde das RNA-Polymerase I-System zur intrazellulären Synthese von Influenzavirus-RNAs in vivo verwendet (7). In diesem System wird eine cDNA, die ein Reportergen in Antisense-Orientierung codiert, von den 5'- und 3'-nicht-codierenden Regionen einer Influenzavirus-RNA flankiert. Diese Kassette wird zwischen einen RNA-Polymerase I-Promotor und -Terminator eingesetzt. Eine Transfektion solcher Konstrukte in eukaryontische Zellen führt zur Transkription des Reportergens durch zelluläre RNA-Polymerase I, wodurch influenzavirusähnliche RNAs erzeugt werden (Neumann et al., 1994). Auf eine Infektion mit Influenzavirus hin werden die künstlichen vRNAs von dem viralen Polymerase-Komplex repliziert und transkribiert, was eine Expression des Reportergens zur Folge hat.
  • Um zu bestimmen, ob Expression der PB2-, PB1-, PA- und NP-Proteine zur Expression des Reportergens führt, das von dem von der RNA-Polymerase I stammenden Transkript codiert wird, wurden Plasmide (jeweils 1 μg), die das NP-Protein des A/WSN/33 (H1N1)-Virus unter der Kontrolle des β-Actin-Promotors vom Huhn (pCAGGS-WSN-NPO/14), die Polymeraseproteine des A/PR/8/34-Virus unter der Kontrolle des Cytomegalievirus-Promotors [pcDNA762(PB2), pcDNA774(PB1) und pcDNA787(PA)] exprimierten, und ein RNA-Polymerase I-Reportergenkonstrukt (pPolI-GFP) in menschliche embryonale Nierenzellen (293T) transfiziert. 48 Stunden später exprimierten 30%–40% der Zellen GFP (9). Im Gegensatz dazu konnte eine Expression von GFP nicht in transfizierten Zellen nachgewiesen werden, denen die Polymerase oder NP-Proteine fehlten. Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass NP und die drei Influenzavirus-Polymeraseproteine einen funktionellen Komplex gebildet hatten, der die von der RNA-Polymerase I stammende GFP-vRNA replizierte und transkribierte.
  • Optimale Transkription und Replikation von vRNA. Um die Mengen an Plasmid-DNA zu bestimmen, die für eine optimale Expression des GFP-Reporters erforderlich sind, modulierten wir die Expression der Polymeraseproteine und von NP. Frühere Studien hatten darauf hingewiesen, dass große Mengen an PA das Ausmaß der Expression des Reportergens in Transkription/Replikation-Systemen verringern (Mena et al., 1996). Daher wurde die Expression von PA von dem Plasmid schrittweise verringert, wodurch 0,1 μg von pcDNA787(PA) als die Matrizenmenge identifiziert wurde, die die stärkste Expression von GFP ergab. Bei NP, der Hauptstrukturkomponente von RNP-Komplexen, können große Mengen des Proteinexpressionsplasmids erforderlich sein. Höhere Mengen des Plasmids beeinflussten die Zahl der GFP-positiven 293T-Zellen jedoch nicht in nennenswertem Maß. Darüber hinaus beeinflussten unterschiedliche Mengen der PB2- und PB1-Proteinexpressionsplasmide (in einem Bereich von 1,0 bis 0,03 μg) die GFP-Expression in 293T-Zellen nicht. Daher wurde in allen folgenden Experimenten 0,1 μg pcDNA787(PA) und 1,0 μg pcDNA774(PB1), pcDNA762(PB2) und pCAGGS-WSN-NP0/14 eingesetzt.
  • Bildung von Influenza-VLPs aus clonierten cDNAs. Frühere Studien mit dem Vacciniavirus-T7-RNA-Polymerase-System zeigten, dass die Bildung von Influenza-VLPs neun Influenzavirus-Proteine benötigt: PB2, PB1, PA, HA, NA, NP, M1, M2 und NS2 (Mena et al., 1996). Im Gegensatz dazu ist das NS1-Protein für die Bildung von Partikeln entbehrlich (Mena et al., 1996). Um ein effizientes, plasmidgesteuertes System zur Bildung von VLPs zu etablieren, wurden cDNAs hergestellt, welche die HA-, NA-, M1-, M2- und NS2-Gene codierten. Die cDNAs wurden in den eukaryontischen Expressionsvektor pCAGGS/MCS (kontrolliert von dem β-Actin-Promotor vom Huhn) cloniert, was zu pEWSN-HA, pCAGGS-WNA15, pCAGGS-WSN-M1-2/1, pEP24c bzw. pCA-NS2 führte. Die Expression eines jeden Proteins wurde durch Western Blot-Analyse bestätigt.
  • Um VLPs zu erzeugen, wurden 106 293T-Zellen mit 1,0 μg von jedem der Proteinexpressionsplasmide (mit Ausnahme von pcDNA787(PA), bei dem 0,1 μg eingesetzt wurden) und mit 1 μg des Reportergenkonstrukts pPolI-GFP transfiziert. Die Kulturüberstände wurden 48 Stunden nach Transfektion geerntet und mit A/WSN/33-Virus gemischt, um die Influenzavirus-Proteine bereitzustellen, die für die Replikation und Transkription der GFP-vRNA erforderlich sind. Mit dem Gemisch wurden dann MDCK-Zellen angeimpft. Zehn Stunden nach der Inkubation wurden GFP-positive MDCK-Zellen nachgewiesen, was 450 Partikeln/ml Überstand entsprach (Tabelle 3). Somit führte Plasmid-gesteuerte Expression aller Strukturproteine von Influenzavirus zur Bildung von infektiösen Influenza-VLPs, die GFP-vRNA enthielten. Des Weiteren wurde GFP-vRNA in MDCK-Zellen transportiert.
  • Optimaler Zusammenbau von Influenzavirus. Die Bildung von VLPs wurde auch in Zellen untersucht, die unterschiedliche Mengen des RNA-Polymerase I-Reportergenkonstrukts ebenso wie HA-, NA-, M1-, M2- und NS2-Plasmid-DNAs exprimierten. In Experimenten mit pPolI-GFP war 1,0 μg der Plasmid-DNA hoch effizient für die Bildung von VLPs, wohingegen die Effizienz für 2,0 μg oder 3,0 μg signifikant verringert war. Da NS2- und M2-Proteine spät in der Infektion in geringen Mengen exprimiert werden, war es wahrscheinlich, dass relativ geringe Mengen der Expressionsplasmide für eine optimale Bildung von VLPs benötigt würden. Eine Verringerung des M2-Expressionskonstrukts von 1,0 μg auf 0,3 μg hatte einen mehr als 10-fachen Anstieg der Zahl der GFP-positiven MDCK-Zellen zur Folge (Tabelle 3). Eine weitere Verringerung des Plasmids auf 0,03 μg steigerte die Zahl der VLPs nicht. Bei NS2 waren geringere Mengen von getestetem Plasmid (0,1 μg) mit einer weniger effizienten Bildung von VLPs assoziiert (Tabelle 3).
  • Das M1-Protein ist die Haupt-Strukturkomponente des Virions. Demnach sind wahrscheinlich hohe Spiegel von M1-Expression für eine effiziente Bildung von VLPs erforderlich. Diese Vorhersage wurde in Experimenten getestet, in denen die Bildung von VLPs in Zellen verglichen wurde, die mit 1,0 μg oder 2,0 μg M1-Plasmid-DNA transfiziert wurden. Wie in Tabelle 3 gezeigt, hatten höhere Plasmidmengen einen mehr als zehnfachen Anstieg in der Zahl der GFP-positiven MDCK-Zellen zur Folge. Ein Vergleich von zwei unterschiedlichen Mengen (1 μg gegenüber 2 μg) von Plasmiden, welche die HA- und NA-Proteine exprimierten, zeigte keine nennenswerten Unterschiede in der Bildung von VLPs, was zur Auswahl von 1 μg von jedem Plasmid (pEWSN-HA, pCAGGS-WNA15) zur Verwendung in anschließenden Experimenten führte. Insgesamt hatten die Studien eine > 100-fachen Zunahme in der Effizienz der Bildung von VLPs zur Folge, was schlussendlich zur Produktion von mehr als 104 infektiösen Influenzavirus-Partikeln pro ml Überstand führte (10).
  • Figure 00380001
  • Authentizität der vollständig von Plasmiden erzeugten VLPs. Um zu bestätigen, dass VLPs eine Infektion auf dieselbe Weise in Gang setzen wie authentische Influenzaviren, wurden VLPs mit einem Antikörper gegen das WSN HA neutralisiert. VPL-enthaltende Überstände, die von Plasmid-transfizierten 293T-Zellen stammten, wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem Pool von monoclonalen Anti-WSN HA-Antikörpern oder mit einem monoclonalen Antikörper gegen das G-Protein des vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) (Negativkontrolle) inkubiert. A/PR/8/34-Helfervirus, das von dem Pool von monoclonalen Anti-WSN HA-Antikörpern nicht neutralisiert wird, wurde zu dem Gemisch hinzugegeben und damit wurden MDCK-Zellen angeimpft. Nur der Anti-WSN-HA-spezifische monoclonale Antikörper neutralisierte die VLPs, was darauf hinweist, dass das HA die Anheftung und den Eintritt von VLPs in Zellen vermittelt.
  • Als nächstes wurde der minimale Satz von Proteinen identifiziert, die für die Bildung von VLPs benötigt werden. Andere haben festgestellt, dass die drei Influenzavirus-Polymerasen und das NP für die Replikation und Transkription von vRNA unentbehrlich sind (Honda et al., 1988). Daher war jedes dieser vier Proteine eingeschlossen, aber HA, NA, M1, M2 oder NS2 wurden nacheinander weggelassen. Der Ausschluss eines beliebigen dieser Plasmide beeinflusste die Replikation/Transkription von GFP-vRNA in transfizierten 293T-Zellen nicht. Überstände, die von transfizierten 293T-Zellen stammten, denen das HA-, NA-, M1- oder NS2-Protein fehlte, unterstützten keine GFP-Expression in infizierten MDCK-Zellen, was auf die Abwesenheit von infektiösen VLPs hindeutete. Infektiöse VLPs wurden beim Weglassen von M2 nachgewiesen, aber die Zahl war gering (> 500-fache Verringerung verglichen mit dem vollständigen Satz von Strukturproteinen). Demnach sind alle Influenzavirus-Strukturproteine für die effiziente Bildung von VLPs erforderlich, in Übereinstimmung mit Daten von Studien des Vacciniavirus-Systems (Mena et al., 1996).
  • VSV-Glycoprotein kann die HA- und NA-Proteine bei der Produktion von VLPs ersetzen. Die Influenzavirusproteine HA und NA wurden durch das VSV-G-Protein ersetzt, das eine Funktion bei der Rezeptorbindung und der Fusion hat. In 293T-Zellen, die mit pPolI-GFP, optimalen Mengen der PB2-, PB1-, PA-, NP-, M1-, M2- und NS2-Expressionskonstrukte und 1 μg des VSV-G-Konstrukts (pCAGGS-VSV-G) transfiziert worden waren, beeinflusste die Substitution des VSV-G-Proteins für die Influenzavirus-Glycoproteine die Bildung von VLPs nicht negativ. Im Gegenteil, es wurden reproduzierbar höhere Zahlen von GFP-positiven Zellen gefunden, wenn VSV-G statt HA und NA als das virale Glycoprotein diente. Demnach kann das VSV-G-Protein effizient in Influenza-Virionen eingebaut werden und kann ebenso gut wie das HA und das NA bei der Virus-Freisetzung und dem Eintritt funktionieren.
  • Ein effizientes System zur Herstellung von infektiösen Influenzavirus-Partikeln wäre ein Gewinn bei der Forschung mit diesem Virus und möglicherweise bei der Herstellung von Vakzinen und Vektoren für die Gentherapie. Im Gegensatz zu dem existierenden Vacciniavirus-System ist die hier beschriebene Strategie zur Erzeugung von VLPs hoch effizient, sowohl bei der anfänglichen Transfektion von Zellen als auch bei der Ausbeute von VLPs (> 104 infektiöse Partikel/ml Überstand). Darüber hinaus wird es vollständig durch Plasmide gesteuert, die Influenzavirus-Proteine exprimieren (d.h. in Abwesenheit von allen anderen viralen Proteinen), was die Interpretation der Ergebnisse außerordentlich vereinfacht. Ein anderer wesentlicher Vorteil ist die Fähigkeit, die Auswirkungen von letalen Mutationen auf die Bildung von Virionen, die Verpackung von RNP-Komplexen, das Knospen von Viren, die Replikation und Bindungs- und Fusionsprozesse zu studieren. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass das hierin vorstehend beschriebene System geanusogut mit anderen Viren, z.B. Paramyxoviren und Rhabdoviren, funktioniert.
  • Die Influenzavirus-Proteine HA und NA können funktionell durch das VSV-Glycoprotein G ersetzt werden. Es ist früher berichtet worden, dass Influenzaviren VSV-G-Protein nicht einbauen konnten, wenn es von einem rekombinanten SV40-Virus bereitgestellt wurde (Naim et al., 1993). Die hierin beschriebenen Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass weder das HA noch das NA für die Bildung von VLPs unentbehrlich ist, obwohl es nicht ausgeschlossen werden kann, dass diese Glycoproteine eine Rolle bei Interaktionen mit anderen viralen Proteinen spielen und so die Struktur von Virionen beeinflussen, wie es durch die lang gezogenen Formen von Viren nahegelegt wird, die schwanzlose HAs, NAs oder beide exprimieren (Garcia-Sastre et al., 1995; Jin et al., 1994; Jin et al., 1997; Mitnaul et al., 1996).
  • Das hierin vorstehend beschriebene Plasmid-basierte System kann besonders nützlich für den Transport therapeutischer Gene sein. Es können VLPs hergestellt werden, welche die vRNA, die die für die Transkription und Replikation benötigten Proteine codiert (d.h. das NP und die Polymerasen), ebenso wie eine vRNA enthalten, die das Protein von Interesse codiert. Diese Partikel sind infektiös und können ein vorbestimmtes Gen in Zielzellen transportieren, wo es replizieren und transkribiert werden würde. Da diese Partikel kein vollständiges Komplement von viralen Genen enthalten, können sie keine infektiösen Nachkommen-Viren produzieren. Diese Eigenschaft, zusammen mit der fehlenden Integration des viralen Genoms in Wirtschromosomen, würde die biologische Sicherheit des Gentransfers in menschliche und nicht-menschliche Probanden gewährleisten. Schließlich würde die Verfügbarkeit von 15 HA- und 9 NA-Subtypen und deren Varianten die wiederholte Verabreichung von VLPs erlauben, wodurch die Immunresistenz gegenüber Vektorerzeugten Proteinen überwunden würde, einem der Haupthindernisse, denen man bei der wiederholten Verwendung von anderen viralen Vektoren wie z.B. Adenoviren gegenübersteht. Ein weiterer Vorteil des Plasmid-gesteuerten Systems würde in Situationen realisiert werden, die nur eine kurzfristige Expression von fremden Proteinen erfordern, wie bei der Krebsbehandlung.
  • Beispiel 3
  • Durch Verwendung des Cre-loxP-Systems kann man Verpackungszelllinien für die Produktion von replikationsdefizienten Viren herstellen. Beispielsweise wird ein Proteinexpressionsvektor hergestellt, der eine Transkriptionsstop-Kassette (z.B. pBS302 von Life Technologies, Bethesda, Maryland; und Sauer et al., 1993; Lasko et al., 1992; Pichel et al., 1993; Bolivar et al., 1977; Stuhl et al., 1981; Stuhl, 1985; Fiers et al., 1978), die von zwei loxP-Stellen flankiert ist, und eines der viralen Gene enthält. Transkription, die an der Promotorsequenz initiiert wird, wird an den Transkriptionsstoppstellen blockiert. Somit wird das virale Gen nicht transkribiert und translatiert. Eine Zelle, die mit einem solchen Vektor stabil transfiziert ist, wird mit einem Influenzavirus infiziert, dem die vRNA fehlt, die das in das loxP-System clonierte Gen codiert. Dieses Virus enthält auch eine zusätzliche vRNA, die das Cre-Protein codiert. Dieses Virus ist in normalen Zellen nicht lebensfähig, da ihm eine der vRNAs fehlt. In der Verpackungszelllinie führt das Cre-Protein, das von der vRNA exprimiert wird, jedoch zur Rekombination an der loxP-Stelle, was eine Deletion der Transkriptionsstopp-Stelle zur Folge hat. Somit wird (werden) das (die) jeweilige(n) virale(n) Gen(e) nun transkribiert und exprimiert, was es dem Virus ermöglicht, sich in diesen Zellen zu vermehren (11).
  • Außerdem werden Verpackungszelllinien hergestellt, die die späten viralen Proteine exprimieren (d.h. HA, NA, M1, M2 und NS2), die von dem loxP-System kontrolliert werden (12). Das HA und das NA können durch andere virale Rezeptor-bindende Proteine und Fusionsproteine ersetzt werden (z.B. Ebola GP, Marburg GP, Bunyaviridae-Glycoproteine GP1 und GP2, die G- und/oder F-Proteine von Rhabdovirus und Paramyxovirus, Thogotovirus-Glycoprotein und die Glycoproteine von Positivstrang-RNA-Viren). Es werden Virus-ähnliche Partikel erzeugt, welche die vRNAs, die die Proteine codieren, die für die Replikation/Transkription erforderlich sind (d.h. die Polymerase und die NP-Proteine), eine vRNA, die das Gen von Interesse codiert, und eine vRNA enthalten, die Cre codiert. Diese vRNAs werden in den Verpackungszelllinien in Virus-ähnliche Partikel verpackt.
  • Diese Virus-ähnlichen Partikel können für Vakzin- und Gentherapie-Zwecke eingesetzt werden, weil (i) sie nicht das vollständige Komplement von viralen Genen enthalten und somit keine infektiösen Nachkommen-Viren gebildet werden können, was den strikten Sicherheitsbedenken entgegen kommt; (ii) sie Fremdprotein wahrscheinlich in großen Mengen exprimieren werden; (iii) sie keine viralen Glycoproteine (HA, NA) exprimieren, die Hauptantigene sind; somit sollte die Immunantwort des Wirts gegen die viralen Proteine begrenzt sein.
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  • Obwohl die Erfindung in der vorangegangenen ausführlichen Beschreibung in Bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen davon beschrieben worden ist und viele Details zu Zwecken der Veranschaulichung angeführt worden sind, wird es Fachleuten offensichtlich sein, dass die Erfindung für weitere Ausführungsformen zugänglich ist und dass gewisse der hierin beschriebenen Details erheblich verändert werden können, ohne von den Grundprinzipien der Erfindung abzugehen.

Claims (15)

  1. Verfahren zur Herstellung infektiöser Influenzaviren in der Abwesenheit eines Helfervirus, umfassend die Schritte: (a) Einbringen in Wirtszellen, in der Abwesenheit eines Helfervirus, einer Zusammensetzung, umfassend eine Vielzahl von Orthomyxovirus-Vektoren, umfassend: (i) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influzenzavirus PA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (ii) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PB1-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (iii) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus PB2-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (iv) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus HA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (v) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NP-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (vi) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NA-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (vii) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus M-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (viii) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einer Influenzavirus NS-cDNA verbunden ist, die mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (ix) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenza PA Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (x) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenza PB1 Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (xi) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenza PB2 Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, und (xii) einen Vektor, umfassend einen Promotor, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenza NP Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, und (b) Isolieren der infektiösen Influenzaviren aus den Wirtszellen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in dem Verfahren mindestens 1 × 103 pfu/ml an infektiösen Influenzaviren hergestellt werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren zusätzlich umfasst das Einbringen in die Zelle: (xiii) eines Vektors, der einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenzavirus HA Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (xiv) eines Vektors, der einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenzavirus NA Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (xv) eines Vektors, der einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenzavirus M1 Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, (xvi) eines Vektors, der einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem DNA- Segment verbunden ist, das ein Influenzavirus M2 Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist, und (xvii) eines Vektors, der einen Promotor umfasst, der funktionell mit einem DNA-Segment verbunden ist, das ein Influenzavirus NS2 Polypeptid codiert und mit einer Transkriptionsterminationssequenz verbunden ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei in dem Verfahren mindestens 3 × 104 pfu/ml an infektiöser Influenzaviren hergestellt werden.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Promotor ein Promotor ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RNA-Polymerase I-Promotor, RNA-Polymerase II-Promotor, RNA-Polymerase III-Promotor, einem T7-Promotor und einem T3-Promotor.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Promotor ein RNA-Polymerase I-Promotor ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Promotor ein menschlicher RNA-Polymerase I-Promotor ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Transkriptionsterminationssequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Transkriptionsterminationssequenz, ausgewählt aus einer RNA-Polymerase I-Transkriptions-terminationssequenz, einer RNA-Polymerase II-Transkriptionsterminationssequenz, einer RNA-Polymerase III-Transkriptionsterminationssequenz und einem Ribozym.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei zwei oder mehrere Vektoren physisch miteinander verbunden sind.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei ein oder mehrere Vektoren auf getrennten Plasmiden sind.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, zusätzlich umfassend den Schritt des Einführens von mindestens einer Mutation in eine oder mehrere des Influenza PA-cDNA, Influenza PB1-cDNA, Influenza PB2-cDNA, Influenza HA-cDNA, Influenza NP-cDNA, Influenza NA-cDNA, Influenza M-cDNA oder Influenza NS-cDNA vor dem Einbringen des Vektors in die Wirtszellen.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, zusätzlich umfassend das Einführen von mindestens einer Mutation in die Influenza HA-cDNA vor dem Einbringen der Vektoren in die Wirtszellen.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei ein oder mehrere Vektoren zusätzlich eine 3'- und 5'-nicht-codierende Sequenz eines Influenzavirus umfasst/umfassen.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei ein Vektor ein immunogenes Peptid oder Protein codiert, das als Impfstoff nützlich ist.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Wirtszellen Säugerzellen sind.
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