CN1200675A - 流感疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种流感疫苗,它包含一种无福尔马林和B－丙醇酸内酯(BPL)的热灭活的完整流感病毒。
Description
本发明涉及一种流感疫苗。
更具体地说，本发明涉及一种灭活完整流感病毒疫苗并且涉及其制备方法。
流感病毒感染每一年还对全球继续构成威胁。这种感染可以是无症状的或者可以是轻度上呼吸道感染直至并发有可导致死亡的肺炎的重症。尽管重症常见于年幼者、慢性病患者和老年人，但即使是轻度的疾病，其经济负担(以损失工作日衡量)也是巨大的。
控制该疾病的优选方案仍旧是一年一度的常规免疫接种。二十多年来一直建议的是，给所有高危状态的人每年施用流感疫苗。隐含在这一建议之后的首要原理是降低流行性感冒的死亡率、发病率并防止并发症。
目前，灭活病毒疫苗仍然是用于抗流感接种的主要手段。
目前使用的疫苗是完整病毒颗粒的灭活疫苗，其中灭活作用是采用福尔马林或B-丙醇酸内酯(BPL)实现的。亚单位疫苗或分裂疫苗同样用于肌内(i.m.)或皮下(s.c.)免疫接种。
活的减毒疫苗(即温度敏感型突变体)被推荐用于通过滴注法、烟雾或喷雾法进行的鼻内(i.n.)应用。不过，这些疫苗中的大部分还只是实验性的。
通过连续流动离心而在蔗糖梯度上纯化的常规使用的疫苗大部分利用福尔马林灭活，而且是完整病毒颗粒、分裂或亚单位(后者特别是针对儿童使用)，通过i.m.或s.c.注射施用。疫苗的效力主要是通过血清转化或通过体液抗体、主要是血凝抑制抗体的×4倍增高来估价。
流感病毒的血凝素是主要表面糖蛋白(中和抗体是针对它而被激发的)，不过，由各种方法获得的分离糖蛋白(亚单位、遗传工程化或合成的)在产生体液抗体应答方面比完整病毒的抗原性差，所以可能需要佐剂。此外，该分离的抗原并不适于IgA是主要保护性抗体的场合，正如呼吸道场合中。
在呼吸道感染中，分泌性IgA类型的抗体在抵御感染中起主要作用，因为它在病毒进入位置处中和该病毒。
所述的灭活疫苗(完整的或亚单位)根本就不能诱导局部抗体产生或只能诱导少量抗体。该病毒的亚单位疫苗至多能触发再次应答，而且只有当它在第一次施用活病毒而不是灭活的或亚单位病毒之后时才能触发。因此，尚未得到令人满意的局部免疫接种，因为这主要是由于存在活抗原，而且尚未得适当的、安全的活疫苗。
除体液抗体之外，还激发了细胞免疫应答(CMI)。在那方面，完整病毒疫苗也是重要的。最近，已收集到越来越多的有关CMI在防止流感病毒感染方面的重要性的资料。细胞免疫是重要的，因为与抗体应答的株特异性大不相同，细胞免疫在A组的不同株之中表现出交叉反应性。这一现象取决于几种病毒蛋白如基质和核蛋白的存在。与表面糖蛋白(血凝素和神经氨酸苷酶)每年的变化相比，前述几种病毒蛋白在几十年中是保守的，它们主要是决定抗体的产生。
对当前的死疫苗的安全性和效力有很多争论。由于过去用于灭活的BPL的致癌力，现在已禁止使用BPL。仍然广泛应用的福尔马林是造成一部分副作用的原因，最近还对其安全性提出一些疑问。
考虑到现有技术水平，本发明提供了一种包含无福尔马林和B-丙醇酸内酯、热灭活的完整流感病毒的流感疫苗。
本发明还提供了一种用于灭活完整流感病毒的方法，它包括：在大约45℃-59℃的温度下把收集的含流感病毒的尿囊液加热约25-180分钟，由此产生无福尔马林和BPL的、热灭活的完整流感病毒，所述病毒至少被99％灭活。
在本发明的一个优选实施方案中，把所述病毒与非致癌性灭活剂组合以补充所述热灭活作用来灭活所有残留病毒。
所述灭活剂最好是与乙醚组合的乙基汞硫代水杨酸钠。在把病毒热灭活时或之后，可以将乙基汞硫代水杨酸钠与病毒组合。
本发明的灭活方法排除了依赖于使用生物危害化学品的灭活方法。象BPL和/或福尔马林这样的化学品降低了疫苗的安全性，也可能是反应原性的。因此，由于不使用BPL、福尔马林或任何其它致癌性化学品，通过改进的区带纯化法高度纯化的本发明灭活疫苗更为安全。而且，本发明的灭活疫苗在i.m.或i.p.注射给小鼠之后能引起体液抗体，这类似于通过同一途径注射的福尔马林灭活的疫苗。更为重要的是(与其它灭活抗原相反)，热灭活的疫苗仍能引起抗表面糖蛋白的局部抗体应答。同样以高的保护性水平引起体液抗体，其保持很长时间。这种热灭活的抗原还能诱导低水平的干扰素。而由福尔马林处理的抗原不能诱导干扰素。
本疫苗更为安全、有效，是一种灭活的区带纯化的完整病毒疫苗，它可替代常规使用的用于肌内和皮下应用的疫苗，同样可用作局部鼻内应用的新型疫苗。在改进流感疫苗的尝试中，这是一项重要的进步。该疫苗将大大扩展以死疫苗为目标的组。
该纯化方法可得到含低浓度蛋白质的疫苗，它使有害的副作用减小到几乎为零。
用于灭活流感病毒的本发明方法非常重要，这是因为先前使用的BPL因其致癌力而被禁止继续使用。近来已对仍广泛使用的福尔马林的安全性提出疑问。
因此，与正在使用的常规灭活疫苗相比，本灭活方式具有很大优势。
该疫苗可替代i.m.或s.c.注射的常规使用的福尔马林灭活的疫苗，产生相似水平的体液抗体。
该疫苗可鼻内施用。采用这种应用途径可激发相似的保护水平的体液抗体以及局部抗体。
虽然现在将结合下列实施例中某些优选实施方案来描述本发明从而更彻底地理解本发明，但并不是想把本发明局限于这些特定实施方案。相反，是要覆盖所有的替代、改进和等同物，它们正如所附权利要求书限定的本发明范围中所包括的那样。所以，包括优选实施方案的下列实施例的作用将是阐述本发明的实施，应理解的是，所示细节只是通过实例、为了阐述性地讨论本发明的优选实施方案，只是为了提供被认为是本发明制剂方法以及原理和构思方面的最有用和容易理解的描述。
实施例完整病毒颗粒灭活流感疫苗的制备和纯化
过夜冷冻或-20℃下冷冻45分钟后，收集得自感染40-60小时后的受感染胚胎卵(10-12天龄)的尿囊液，并进行浓缩和纯化。
在水浴中，在约55-56℃的温度下对收集的澄清尿囊液进行热灭活。在浓度为1∶20,000的硫柳汞(乙基汞硫代水杨酸钠)存在下或不存在硫柳汞的条件下进行灭活。灭活后纯化抗原并将纯化过的抗原悬浮于pH7.2-4的缓冲液中。最终的抗原含有6-7％蔗糖、0.01％乙基汞硫代水杨酸钠和1％-2％乙醚。对胚胎卵进行检验时，发现残留病毒被乙基汞硫代水杨酸钠和乙醚灭活。
最终产品：60-80ug蛋白质
5-6％蔗糖
PO4 0.1μ 0.15NaCl pH7.8-7.9
10-3μ EDTA
0.01％乙基汞硫代水杨酸钠
0.05％Tween 80
0.01％-0.02％乙醚
将下列流感病毒株热灭活：
A/Taiwan/86(NIB-16)(H1N1)
A/PR8/34(H1N1)
A-/Leningrad 360/86(H3N2)
B/Ann Arbor
选择A/Taiwan/1/86(H1N1)是因为它是目前的疫苗中最新的病毒株。
选择A/PR8/34(H1N1)株是因为它的作用是为制备疫苗而设计的许多重组体中的亲代病毒株，并且该病毒株对小鼠具有致病性，因而可以在免疫接种的动物中进行攻击实验。把A/Leningrad 360/86选作A/H3N2株的代表，而把B/Ann Arbor选作BN型病毒株的代表。
表1
热处理后感染性的灭活
尿囊液(澄清后)
55-56°-30′
55-56° +1/20000病毒株/处理 none 30′ 硫柳汞 45°-3h.59°30′A/Taiwan 1/86 108.5 104.5 n.d. 105.0 n.d.(未做)(H1N1) 108.5 103.7 n.d. n.d.A/PR8/34 109.0 102.0 101.0 n.d. n.d.(H1N1) 108.0 103.5 102.8
108.5 103.5 103.0 101.24B/Ann Arbor 109.5 104.5 n.d. n.d. n.d.A/Leningrad 107.5 102.5 n.d. n.d. n.d.(H3N2)360/86
a感染性通过在胚胎卵的尿膜囊中滴度来量度，以EID50/0.2ml形式测定。
从表1可以看到，对所有这四种代表性病毒株在55°-56℃下加热30分钟，会导致感染性下降99％以上。
在热灭活过程中添加乙基汞硫代水杨酸钠可以使检验的APR8病毒株的感染性进一步下降。
在45℃下加热3小时和在59℃下加热30分钟也都能有效地使感染性降低99％以上。
从下文的表2可以看到，本发明的灭活方法不会破坏病毒的血凝活性，这就保证了应用灭活病毒仍会形成所需的免疫力，包括形成抗体。
应注意，在所做检验中，就连59℃下加热30分钟所达到的活性降低也不被视为显著的。
表2
加热对尿囊液血凝滴度的影响
55-56°-30′
55-56° +1/20000病毒株/处理 none 30′ 硫柳汞 45°-3h.59°30′A/Taiwan 1/86 1000-2000 1000-2000 n.d. 1000(H1N1) 2000-4000 2000-4000 n.d. n.d.A/PR8/34 1024 1024 n.d. n.d.(H1N1) 2000 2000 2000
1024 1024 1024 n.d. 512B/Ann Arbor 1024 1024A/Leningrad 1000 512-1000(H3N2)360/86
进一步对上述病毒株中的两种的纯化悬浮液(每种各两批)进行纯化，在细菌学试验中发现是无活性的和无菌的，并检验其免疫原性。
表3
浓缩纯化的材料的不反应性病毒株/处理 硫柳汞和乙醚A/Taiwan 1/86 104.2 阴性(H1N1) 103.5 阴性A/PR8/34 104.0 阴性(H1N1) 103.7 阴性
从表3可见，用终浓度1∶10000的乙基汞硫代水杨酸钠和1-2％乙醚进一步处理，完全削弱了纯化浓缩的病毒悬浮液中尿囊酸中的残留感染性。
II.免疫学研究
通过腹膜内(i.p.)(0.5ml)或i.n.施用0.05-0.1ml对小鼠进行免疫接种。在几个时间间隔，检验血凝抑制HI抗体的滴度。
按照被接受的方案，在用i.p.或i.n.法给小鼠免疫接种21天后评估本发明的疫苗。
结果列于表4中。从表4可以看到，试验的小鼠大体上100％产生了高的保护性水平的体液抗体。
如表5所示，免疫接种两个月后抗体仍然存在，保护性水平的体液抗体还在认为能提供保护作用的范围和量度之内。
表4用热灭活的疫苗给小鼠免疫接种21天后体液血凝抑制抗体(HI)
病毒株 免疫接种途径 疫苗稀释率 应答小鼠 HI 抗体 *
的数目A/Taiwan 1/86(H1N1) i.p. 1∶10 9/9 380
i.p. 1∶10 9/9 100
i.n. 1∶5* 7/7 60A/PR8/34 i.p. 1∶25 7/8 365(H1N1) i.n. 1∶5 14/14 240
i.m. 1∶5 10/10 160*血凝抑制抗体的平均交互滴度。每只小鼠单独试验。
表5
用加热过的A/PB8/34免疫接种两个月后体液抗体的存留
免疫接种途径 应答小鼠的数目 HI 抗体a
i.p. 14/16 28.4
i.n. 9/14 30.0
i.n.×2b 4/4 91.0
i.n.c 9/9 55.5
aHI抗体的平均交互滴度。
b免疫接种之间12天的间隔对小鼠进行两次免疫接种。
c为进行对照，用活病毒给小鼠接种。
对比例A
按照本发明的灭活方法制备A/PB8/34病毒株疫苗，采用现有技术的用福尔马林灭活的方法制备类似的疫苗。
给不同的两个组的小鼠鼻内施用这两种疫苗，免疫接种10天和20天后分别检验这些小鼠。
正如表6中所示结果看到的那样，按本发明灭活的疫苗激发的体液抗体应答明显要高，只有本发明的疫苗还在肺中激发局部抗体应答。
表6
用A/PB8/34鼻内免疫接种后体液和局部抗体
疫苗 加热的 福尔马林处理的
天 体液的 肺中局部的 体液的 肺中局部的
10 160 16 40 阴性
20 160 32 40 阴性对比例B
用按本发明灭活的疫苗给小鼠免疫接种，所述疫苗是鼻内施用。另一组没有免疫接种的小鼠作为对照。免疫21天后攻击小鼠，对免疫小鼠和对照小鼠所做的所述攻击实验的结果示于表7。会注意到，在第一组实验中，免疫接种的小鼠没有一只发现患病或死亡，而发现对照小鼠有75％患病，25％死亡。在第二组实验中，发现14只免疫小鼠中有一只死亡，而29只对照小鼠中有21只死亡。
表7
用加热过的A/PR8/34鼻内免疫接种后的攻击实验
疫苗 小鼠数目 患病 死亡7a A/PR8 8 0 0
对照 8 6/8(75％) 2/8(25％)7b A/PR8 14 0 1/14(1％)
对照 29 0 21/29(72.4％)
表8
用3个月的疫苗(A/PR8)给小鼠免疫接种
(贮存期限检验)
免疫途径 抗原稀释率 应答小鼠的数目 HI 滴度*
i.p. 1∶10 9/10 180
i.p. 1∶25 8/9 240
i.n. 1∶5 10/10 68
* HI的平均交互滴度
对本领域技术人员而言显而易见的是，本发明不局限于前文阐述性实施例的各个细节而且本发明还可体现在不背离本发明基本特征的其它特定形式中，所以希望本实施方案和实施例在各个方面都视为阐述性的而非限制性的，所以根据所附权利要求书而不是前述的说明书，落入权利要求书等同性的定义和范围内的所有变化形式都包括在内。
Claims (13)
1.一种流感疫苗，它包含无福尔马林和B-丙醇酸内酯(BPL)的热灭活的、完整流感病毒。
2.根据权利要求1的疫苗，进一步包含乙基汞硫代水杨酸钠。
3.根据权利要求1的疫苗，进一步包含乙醚。
4.根据权利要求1的疫苗，还有鼻内施用该疫苗的说明书。
5.一种用于灭活完整流感病毒的方法，该方法包括：
在大约45°-59℃的温度下，把收集的含流感病毒的尿囊液加热大约25-180分钟，由此产生无福尔马林和BPL的、热灭活的完整流感病毒，所述病毒至少被99％灭活。
6.根据权利要求5的方法，它包括：把所述病毒与非致癌性灭活剂组合以补充所说的热灭活作用来灭活所有残留病毒。
7.根据权利要求6的方法，其中所述灭活剂是乙基汞硫代水杨酸钠。
8.根据权利要求6的方法，其中所述灭活剂是与乙醚组合的乙基汞硫代水杨酸钠。
9.一种流感接种方法，它包括：鼻内施用一种包含无福尔马林和B-丙醇酸内酯(BPL)的热灭活完整流感病毒的流感疫苗。
10.根据权利要求9的流感接种方法，其中所述疫苗通过喷雾法鼻内施用。
11.根据权利要求9的流感接种方法，其中所述疫苗通过滴剂鼻内施用。
12.一种流感接种方法，它包括：肌内施用一种包含无福尔马林和B-丙醇酸内酯(BPL)的热灭活完整流感病毒的流感疫苗。
13.一种流感接种方法，它包括：皮下施用一种包含无福尔马林和B-丙醇酸内酯(BPL)的热灭活完整流感病毒的流感疫苗。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN95197990A CN1200675A (zh) | 1995-10-20 | 1995-10-20 | 流感疫苗 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN95197990A CN1200675A (zh) | 1995-10-20 | 1995-10-20 | 流感疫苗 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1200675A true CN1200675A (zh) | 1998-12-02 |
Family
ID=5083481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN95197990A Pending CN1200675A (zh) | 1995-10-20 | 1995-10-20 | 流感疫苗 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1200675A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101851636B (zh) * | 1999-04-06 | 2015-11-25 | 威斯康星校友研究基金会 | 用于疫苗和基因治疗的重组流感病毒 |
-
1995
- 1995-10-20 CN CN95197990A patent/CN1200675A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101851636B (zh) * | 1999-04-06 | 2015-11-25 | 威斯康星校友研究基金会 | 用于疫苗和基因治疗的重组流感病毒 |
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