CN1660421A - 预防流感病毒的截短的神经氨酸酶疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种预防流感病毒的截短的神经氨酸酶疫苗及其制备方法。本疫苗成分是截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因。A/PR/8/34流感病毒NA基因编码区全长1365核苷酸，编码一个大小为454个氨基酸的蛋白质产物，其中nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保护序列。用截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因代替全长A/PR/8/34流感病毒NA基因，制备本疫苗。本发明确定了A/PR/8/34流感病毒NA基因核苷酸全序列，并且确定了其中nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保护序列，从而为制备预防流感病毒的截短的神经氨酸酶疫苗找到了有效的途径。
Description
技术领域
本发明属于一种生物制品，特别是一种预防流感病毒的截短的神经氨酸酶疫苗及其制备方法。
背景技术
流行性感冒病毒(influenza virus)是引起人类死亡的主要原因之一。它能引起急性呼吸道感染，严重危害人类的健康和生命。神经氨酸酶(neuraminidase，NA)是锚定于流感病毒脂质双层膜表面的一种主要糖蛋白，在病毒膜上以四聚体的形式存在。NA是流感病毒主要抗原之一，能够诱导相应的抗体产生。虽然NA诱导产生的抗体没有中和作用，不能阻止病毒进入机体，但是能够干扰子代病毒的释放以及病毒的传播。
目前，人类预防流感唯一有效的方法是采用主动免疫方式，即接种流感灭活疫苗和包含有病毒表面糖蛋白的流感裂解疫苗。这些疫苗的主要有效成分是血凝素HA，由HA免疫产生的抗HA特异性抗体可中和病毒的感染力。但是，现有的流感疫苗存在着一大缺陷，那就是无论流感的灭活疫苗还是裂解疫苗，它们对预防同源毒株是非常有效的，而对于不同株的、乃至不同亚型的流感病毒不具保护力。这是由于病毒表面的HA要逃避宿主免疫压力，经常发生突变，从而使得本来有效的疫苗在流行季过后很快失效。事实上，WHO每年都要公布南北半球可能的流感流行毒株的型别及亚型，为制备流感灭活疫苗提供指导。这对于疫苗生产企业来说，无疑增加了流感疫苗的生产成本。如何才能研发出一种能预防所有的或大部分流感毒株感染的生物制品呢？核酸疫苗无疑为流感病毒的预防提供了一种良好的选择。
核酸疫苗，又称DNA疫苗，是近十几年发展起来的一种新型疫苗。DNA疫苗是指利用基因重组技术直接将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA)与真核表达载体重组后，直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。但是，流感病毒易突变，仍然无法克服DNA疫苗交叉保护能力较差的问题。如果找到NA基因抗流感病毒的关键序列，然后将各亚型流感病毒的截短片段构建成多价DNA疫苗，就能实现良好的交叉保护作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种预防流感病毒的截短的神经氨酸酶疫苗及其制备方法。该疫苗具有实用价值，它能够有效地诱导宿主机体产生持久和全面的免疫应答，同时引起细胞和体液免疫，以达到预防和治疗流感疾病的目的。该疫苗制备方法简单，便于生产、贮存和运输，利于今后推向市场。
本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供的预防流感病毒的截短的NA疫苗，其成分是截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，该基因编码区全长1365核苷酸，编码一个大小为454个氨基酸的蛋白质产物，其中nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保护序列。
本发明用截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因代替全长A/PR/8/34流感病毒NA基因，制备预防流感病毒的截短的NA疫苗。
本发明与现有技术相比，具有以下主要效果：
(1)确定了A/PR/8/34流感病毒NA基因的nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保护序列，从而为制备预防流感病毒的截短的神经氨酸酶疫苗(以下简称本疫苗)找到了有效的途径。
(2)根据本疫苗的技术，我们预见可将截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因与其它亚型流感病毒株截短的NA基因构建成预防流感病毒多价DNA疫苗。
(3)根据本疫苗的技术，我们可以预见将截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因表达成蛋白，制备预防流感病毒的蛋白疫苗。
(4)流感病毒NA DNA疫苗在不同遗传背景的小鼠体内都能提供较好的免疫保护。
研究表明：用编码A/PR/8/34流感病毒HA或NA的真核表达载体免疫小鼠，能有效抵抗同源病毒株攻击。将HA、NA和NP三种DNA疫苗分别免疫BALB/c(H-2d)、B10(H-2b)和C3H(H-2k)三种不同遗传背景的小鼠，比较各自的免疫应答水平。研究结果显示：NADNA疫苗在所有三种小鼠中均表现出很高的保护水平，而HA DNA疫苗只在BALB/c小鼠中有效，NP DNA疫苗则全无效果，只引发低滴度的抗体反应。由此说明，NA能够作为一个有效的预防流感的抗原成分。
(5)流感病毒NA基因相对HA不易突变，具有较好的同亚型交叉保护能力。
众所周知，流感病毒的NA基因较HA基因更为保守。在过去的100多年里，NA基因中只有N1和N2感染过人类，而流感病毒的HA中有H1、H2、H3、H5和H9共5个亚型感染过人类。即便是在同一亚型内的毒株，HA也比NA更易发生自发点突变。研究显示，流感病毒H1N1亚型的两个变异株A/India/80和A/Chile/83在1980～1983的三年间，其NA抗原决定簇的蛋白序列仅有8％的改变，而两者的HA决定簇序列却发生了高达93％的大改变。
由于NA有着较好的稳定性，其诱导交叉保护应答的能力就成为了关注的热点。本发明人曾从A/Guizhou/54/89(H3N2)、A/Aichi/2/68(H3N2)和A/PR/8/34(H1N1)3个流感毒株中分别制备获得了3条NA基因，并以此构建了3种NA DNA疫苗。对BALB/c小鼠分别免疫这3种重组真核表达载体，加强免疫后用致死量的A/Guizhou/54/89攻击。结果显示，免疫A/Guizhou NA真核表达载体的小鼠能完全抵抗同源毒株的攻击，免疫A/Aichi NA真核表达载体的小鼠对同亚型变异株(A/Guizhou)的攻击也有很高的存活率，而接种PR8 NA真核表达载体的小鼠则无法抵抗不同亚型病毒株(A/Guizhou)的攻击。NA对于同亚型毒株的交叉保护效果得到了很好的验证。
基于上述效果，本发明为开发出预防流感病毒的截短的神经氨酸酶疫苗提供了一条有希望的途径。
附图说明
图1是A/PR/8/34流感病毒NA基因5′端、3′端缺失示意图。
图2是真核表达载体pCAGGSP7结构示意图。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步说明。
本疫苗是预防流感病毒的截短的NA疫苗，其成分是截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因。A/PR/8/34流感病毒NA基因核苷酸全序列，该基因编码区全长1365个核苷酸，编码一个大小为454个氨基酸的蛋白质产物，该基因中nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保护序列。
本疫苗包括：(1)预防流感病毒的截短的神经氨酸酶核酸疫苗，即预防流感病毒的截短的NA DNA疫苗。(2)预防流感病毒的截短的神经氨酸酶蛋白疫苗。
一.预防流感病毒的截短的NA DNA疫苗
用截短后的A/PR/8/34流感病毒NA基因代替全长A/PR/8/34流感病毒NA基因制得。
二.预防流感病毒的截短的神经氨酸酶蛋白疫苗
根据预防流感病毒的截短的NA DNA疫苗的技术，我们可以预见将截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因表达成蛋白，以制备预防流感病毒的蛋白疫苗。
三.预防流感病毒多价DNA疫苗
根据预防流感病毒的截短的NA DNA疫苗的技术，我们可以预见将截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因与其它亚型流感病毒株截短的NA基因构建成预防流感病毒多价DNA疫苗。
四.截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因
1.本专利A型流感病毒NA基因即截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，其最短保护序列的分析是通过如下步骤实现的：PCR的方法分别从5’端或3’端对A/PR/8/34流感病毒NA基因(全长1365bp)进行了部分缺失，构建了一系列部分缺失真核表达载体，将这些真核表达载体免疫小鼠，用致死量A/PR/8/34流感病毒攻击，并且观察小鼠的存活率、血清中抗NA抗体的效价和肺部病毒量。
2.具体制备方法：
包括以下步骤：
(1)从10日龄鸡胚中增殖得到A/PR/8/34病毒，从中提取RNA，RNA经逆转录反应得到单链cDNA。
(2)根据A/PR/8/34流感病毒NA基因全长核苷酸序列，在其两个末端设计PCR引物，正向引物含有XhoI酶切位点，反向引物含有SmaI酶切位点，以cDNA为模板，对目的片段进行PCR扩增，将PCR产物用XhoI酶与SmaI酶酶切，酶切片段克隆入真核表达载体pCAGGSP7(见图1)中，构建成重组真核表达载体pCAGGSP7/NA。
正向引物为5’gcgctcgagggggtttaaaatgaatcca-3’。
反向引物为5’aagcccgggtttgaacagactacttgtc-3’。
(3)对所得pCAGGSP7/NA进行末端测序，确定是长度为1365个核苷酸的A/PR/8/34流感病毒NA基因，
(4)用PCR的方法以pCAGGSP7/NA为模板，构建一系列真核表达载体(引物见表1)，其中包含了从5’端或者3’端连续缺失的A/PR/8/34流感病毒NA基因，即得到截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，例如：A/PR/8/34流感病毒NA基因从5′端缺失21～114个核苷酸(见图1)；A/PR/8/34流感病毒NA基因从3′端缺失42～99个核苷酸(见图1)。图1中黑色椭圆点为起始密码子，黑色方块为终止密码子。
表1中：NA-5′-d-21表示在NA序列5′端缺失21个核苷酸，真核表达载体编码的是全长NA基因的片段nt22-nt1365，表中NA基因其它5’端缺失构建的真核表达载体以此类推；NA-3′-d-42表示在NA序列3′端缺失42个核苷酸，真核表达载体编码的是全长NA基因的片段nt1-nt1320，表中NA基因其它3’端缺失构建的真核表达载体以此类推。
(5)用QIAGEN纯化试剂盒纯化，用紫外分光光度法测定真核表达载体的浓度和纯度，DNA的浓度和纯度通过OD260、OD280确定，选取OD260/OD280比值在1.8～2.0的真核表达载体。测序验证所获得的截短的NA基因。经测序确认无误后免疫小鼠，以鉴定本疫苗效果。
扩增5’端缺失片段时，在目的片段5’端设置起始密码子ATG。扩增5’端缺失片段方法是：以起始密码子ATG为起点，从A/PR/8/34流感病毒NA基因的5′端缺失21～114个核苷酸共7个连续位点，1个缺失为3个核苷酸的倍数。5’端的7个连续位点所对应的截短的片段是：nt22～nt1365、nt52～nt1365、nt55～nt1365、nt58～nt1365、nt61～nt1365、nt64～nt1365和nt115～nt1365。
扩增3’端缺失片段时，在目的片段5’端设置终止密码子TAG。扩增3’端缺失片段方法是：以终止密码子TAG为起点，从A/PR/8/34流感病毒NA基因3’端缺失42～99个核苷酸共8个连续位点，1个缺失为3个核苷酸的倍数。3’端的8个连续缺失位点所对应的截短的片段是：nt1～1320、nt1～1308、nt1～1302、nt1～1299、nt1～1296、nt1～1293、nt1～1275和nt1～1263。
NA基因即A/PR/8/34流感病毒NA基因，以下同。
3.真核表达载体pCAGGSP7来源：
由Niwa et al(Niwa H et al.Gene 1991，108：103-200.)构建(见图2)。其方法是：将多克隆位点KpnI、XhoI、ClaI、EcoRI、SmaI、NotI和SacI插入pCAGGS的EcoRI位点得到pCAGGSP7。真核表达载体pCAGGS含鸡的β-肌动蛋白启动子成分，SV40的复制起始部位(Ori)，氨苄青霉素抗性基因，CMV瞬时增强子，牛生长激素基因(BGH)多聚A。
五.实验材料和方法
1.免疫和病毒攻击
每10只4～6周龄的雌性BALB/C小鼠为一组，表达全长NA基因的表达载体和表达截短NA基因的真核表达载体以每只每次剂量30μg/30μl TE免疫小鼠。采用股四头肌肌肉注射法，并在接种位点两侧5mm加入正反各3次的电击(100V电压，电击时间为50ms)。初次免疫后第3周再以相同剂量的真核表达载体加强免疫一次。以未免疫的小鼠作为阴性对照组，以免疫全长NA基因的小鼠作为阳性对照组。第二次免疫后第7天，用致死量(40×LD50)的A/PR/8/34(H1N1)病毒悬液通过滴鼻法攻击小鼠。这种感染能够引起病毒在小鼠肺部快速、广泛的复制，使未免疫小鼠6～8天内死亡。病毒攻击后3～21天内定期观测小鼠的体重变化和死亡(见表2)。
表2是NA基因5’端和3’端缺失真核表达载体时，免疫小鼠抵抗致死量病毒感染的能力。表2中：(1)病毒攻击后第3天采集小鼠心血同时，取器官和肺，用2mlPBS(0.1％BSA)洗两次；用MDCK细胞测肺洗液中病毒的TCID50。(2)每组小鼠的TCID50表示为平均值+SD、.*p＜0.05。(3)NA-5’-d-21表示从5’端缺失21个核苷酸，NA-3’-d-42表示从3’端缺失42个核苷酸，依此类推。
2.样本采集
病毒攻击后第3天，将每组15只实验小鼠分为两部分：其中5只处死用来采集心血测抗体及取肺测肺部病毒量。另外10只用来观测小鼠的体重变化和死亡情况，以判断真核表达载体的保护效果。攻击后用于采血的小鼠用氯仿麻醉，平放在实验桌上，从剑状软骨下方微偏左处以15～20°角插入注射器针头，缓慢地抽取心血直至血流停止。将收集到的血液置于室温1小时左右，使血液凝固并析出血清，然后以5000rpm离心10min，吸出血清，-20℃冰箱保存。收集的血清用来检测真核表达载体诱导产生的IgG抗体量。采完血的小鼠，从小鼠的剑突至颏部腹向切开，取出气管和肺，注入2ml PBS(含0.1％BSA)漂洗3次，并将漂洗液离心去细胞碎片用于测病毒滴度。
3.抗体测定
抗NA抗体测定采用抗体对神经氨酸酶活性的抑制分析(NI assay)的方法采用2’-(4-methylumbelliferyl)-α-D-N-acetyl neuraminic acid(简称4-MU)作为底物，按照Potier和Deroo等的方法进行。在荧光酶标仪(GENios，TECAN)上检测4-MU分解后的产物在激发光波长为365nm和吸收光波长为460nm的条件下的荧光强度。NI效价以抑制酶活性的最高血清稀释度来反映。A/PR/8/34流感病毒NA5’端缺失和3’端缺失真核表达载体免疫小鼠所诱导的抗体效价见表3。
表3说明：(1)病毒攻击后第3天采集小鼠心血，采用NI assay测定抗体效价。(2)每组小鼠的平均值±SD。(3)“+”表示能够提供保护，“-”表示不能提供保护。
4.病毒滴度测定
将气管和肺洗液作系列10倍稀释，用每个稀释度感染培养于24孔板中的MDCK细胞，并将感染细胞置于CO2培养箱中。37℃培养48小时后，观察细胞病变。以引起细胞病变的最低稀释度计算出每个样本的病毒滴度(以TCID50表示)，每个实验组病毒滴度是用每组所有5只小鼠样本的病毒滴度的平均值±SD来表示。
5.统计学分析
用Student’s test对实验组间的数据进行评定；P＜0.05定为显著。小鼠存活率结果是否有意义用Fisher’s exact test比较实验组和对照组来确定。
6.实验结果
NA基因5′端缺失57个核苷酸仍然具有保护效果；缺失60个核苷酸不具有保护效果。NA基因从3′端缺失63个核苷酸仍然具有保护效果；缺失66个核苷酸不具有保护效果。
(1)A/PR/8/34流感病毒截短的NA基因真核表达载体的构建
用PCR的方法从模板中扩增得到HA基因部分缺失片段，引物见表1。使用限制性内切酶Xho I和Sma I双酶切HA基因部分缺失片段，定向插入到同样用Xho I和Sma I双酶切过的pCAGGSP7表达载体中。所有构建的NA基因部分缺失真核表达载体经377DNA测序仪测序证实没有发生点突变和阅读框改变。构建的NA基因缺失真核表达载体如图1所示(只表示出各真核表达载体所编码的NA基因部分缺失片段，载体部分略去)。
(2)NA基因5’端缺失的真核表达载体所提供的抗流感保护力
我们构建了一系列从NA基因5’端连续缺失的真核表达载体，见图1。用这些真核表达载体免疫BALB/c小鼠，间隔3周后以相同的剂量加强免疫一次，二次免疫后第7天以40×LD50攻击小鼠。病毒攻击后第3天取肺洗液测肺部病毒量。小鼠存活率一直观察到病毒攻击后第3周，以确定不同真核表达载体的保护效果。结果见表2。真核表达载体pCAGGSP7/NA-5’-d-21、pCAGGSP7/NA-5’-d-51、pCAGGSP7/NA-5’-d-54、pCAGGSP7/NA-5’-d-57免疫小鼠能完全保护小鼠抵抗病毒的攻击，小鼠肺部病毒量比阴性对照组的小鼠(即未免疫真核表达载体的小鼠)要低，但是高于阳性对照组(即免疫全长NA基因的小鼠)。而真核表达载体pCAGGSP7/NA-5’-d-60、pCAGGSP7/NA-5’-d-63、pCAGGSP7/NA-5’-d-114免疫小鼠不能保护小鼠抵抗病毒的攻击，小鼠肺部病毒量与阴性对照相近。随着从5’端缺失的核苷酸数增多，NA清除病毒的能力降低。由此可见从NA的5’端缺失57个核苷酸还不影响NA基因抗流感病毒的攻击，但是缺失60个核苷酸时，NA基因的保护作用就失去了。
(3)NA基因3’端缺失的真核表达载体所提供的抗流感保护力
将NA基因按照5’端连续缺失的方法从3’端作连续缺失，见图1，构建一系列截短真核表达载体，用以免疫小鼠，观察其保护效果。结果见表3：pCAGGSP7/NA-3’-d-42、pCAGGSP7/NA-3’-d-54、pCAGGSP7/NA-3’-d-60、pCAGGSP7/NA-3’-d-63免疫小鼠能完全保护小鼠抵抗病毒的攻击，小鼠肺部病毒量比阴性对照鼠要低，但高于阳性对照鼠。而pCAGGSP7/NA-3’-d-66、pCAGGSP7/NA-3’-d-69、pCAGGSP7/NA-3’-d-87免疫小鼠不能保护小鼠抵抗病毒的攻击，小鼠肺部病毒量与阴性对照相近。肺部病毒滴度随着从3’端或5’端连续缺失的核苷酸数增多而增高但低于阴性对照。不具有保护作用的真核表达载体的肺部病毒量与阴性对照相近。结果表明NA基因从3’端连续缺失63个核苷酸时，NA基因还能抵抗流感病毒的攻击，但连续缺失66个核苷酸时，NA基因的保护作用就失去了。
(4)NA基因5’端和3’端缺失真核表达载体所诱导的抗体应答
血清来自于第2次免疫后第10天采集的小鼠心血，采用NI assay方法检测抗NA抗体。表3显示了所有NA基因缺失片段真核表达载体在小鼠体内所诱导产生的抗体效价。所有截短的NA基因诱导产生的抗体效价明显低于全长NA基因。随着NA基因从5’端或3’端缺失的核苷酸数目的增多，NA基因诱导产生的抗体效价下降。
六.附表
表1 NA基因5’、3’端缺失所用引物
| PrimerForward Reverse | DNA in pCAGGSP7 |
| ccactcgagaaaatgataaccattggatc aagcccgggtttgaacagactacttgtctgtctcgagatgggactaattagc aagcccgggtttgaacagactacttgtcatgctcgagatgctaattagcctaata aagcccgggtttgaacagactacttgtcgtactcgagatgattagcctaatattgc aagcccgggtttgaacagactacttgtcgtcctcgagatgagcctaatattgcaa aagcccgggtttgaacagactacttgtcggactcgagatgctaatattgcaa aagcccgggtttgaacagactacttgtctatctcgaggccattcaatgcaaactgga aagcccgggtttgaacagactacttgtcgcgctcgagggggtttaaaatgaatcca gccccgggctagattgtgttttctttagcgctcgagggggtttaaaatgaatcca agacccgggctacgcactagtccagagcgctcgagggggtttaaaatgaatcca actcccgggctaacaaaaagaaatgctggcgctcgagggggtttaaaatgaatcca atccccgggctagccacaaaaagaaatggcgctcgagggggtttaaaatgaatcca agtcccgggctacacgccacaaaaagagcgctcgagggggtttaaaatgaatcca taccccgggctaattcacgccacaaagcgctcgagggggtttaaaatgaatcca ccacccgggctaatcactattcacgcgctcgagggggtttaaaatgaatcca gtccccgggctaccaatctacagtatc | NA-5’-d-21 |
| NA-5’-d-51 | |
| NA-5’-d-54 | |
| NA-5’-d-57 | |
| NA-5’-d-60 | |
| NA-5’-d-63 | |
| NA-5’-d-114 | |
| NA-3’-d-42 | |
| NA-3’-d-54 | |
| NA-3’-d-60 | |
| NA-3’-d-63 | |
| NA-3’-d-66 | |
| NA-3’-d-69 | |
| NA-3’-d-87 | |
| NA-3’-d-99 |
表2.表达NA基因截短片段真核表达载体免疫小鼠抵抗致死量病毒感染的能力
| Protection against PR8 virus challenge | ||
| DNA in pCAGGSP7 3ControlNANA-5’-d-21NA-5’-d-51NA-5’-d-54NA-5’-d-57NA-5’-d-60NA-5’-d-63NA-5’-d-114NA-3’-d-42NA-3’-d-54NA-3’-d-60NA-3’-d-63NA-3’-d-66NA-3’-d-69NA-3’-d-87NA-3’-d-99 | Lung virus titers(log10TCID50/ml)1，25.5±0.72.0±0.73.0±0.73.65±0.52.5±0.73.25±0.54.75±0.44.4±0.144.75±0.43.15±0.22.7±0.422.5±0.712.75±0.354.9±0.854.4±0.144.25±0.75.0±0.2 | No.of survivors/no.tested(3weeks)0/66/6*6/6*6/6*6/6*6/6*0/60/60/66/6*6/6*6/6*6/6*0/60/60/60/6 |
表3.表达NA基因截短片段真核表达载体免疫小鼠诱导的抗体效价
| DNA in pCAGGSP7 | Serum IgG titers1 | Protection3 |
| NI assay(2n)2 | ||
| NANA-5’-d-21NA-5’-d-51NA-5’-d-54NA-5’-d-57NA-5’-d-60NA-5’-d-63NA-5’-d-114NA-3’-d-42NA-3’-d-54NA-3’-d-60NA-3’-d-63NA-3’-d-66NA-3’-d-69NA-3’-d-87NA-3’-d-99 | 8.3±0.587.1±0.506.7±0.546.5±0.576.6±0.456.4±0.326.3±0.786.0±1.007.3±1.507.2±0.966.3±0.585.5±0.895.3±1.155.4±0.585.0±1.054.3±1.20 | +++++---++++---- |
七.A/PR/8/34流感病毒NA基因核苷酸全序列
ATGAATCCAAATCAGAAAATAATAACCATTGGATCAATCTGTATGGTAGTCGGACTAAT
TAGCCTAATATTGCAAATAGGGAATATATCTCAATATGGATTAGCCATTCAATTCAAAC
TGGAAGTCAAAACCATACTGGAATATGCAACCAAAACATCATTACCTATAAAAATAGC
ACCTGGGTAAAGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAGTTCATCTCTTTGTCCCA
TCCGTGGGTGGGCTATATACAGCAAAGACAATAGCATAAGAATTGGTTCCAAAGGAG
ACGTTTTTGTCATAAGAGAGCCCTTTATTTCATGTTCTCACTTGGAATGCAGGACCTTT
TTTCTGACCCAAGGTGCCTTACTGAATGACAAGCATTCAAATGGGACTGTTAAGGACA
GAAGCCCTTATAGGGCCTTAATGAGCTGCCCTGTCGGTGAAGCTCCGTCCCCGTACAA
TTCAAGATTTGAATCGGTTGCTTGGTCAGCAAGTGCATGTCATGACGGCATGGGCTGG
CTAACAATCGGAATTTCAGGTCCAGATAATGGAGCAGTGGCTGTATTAAAATACAACG
GCATAATAACTGAAACCATAAAAAGTTGGAGGAAGAAAATATTGAGGACACAAGAGT
CTGAATGTGCCTGTGTAAATGGTTCATGTTTTACTATAATGACTGATGGCCCGAGTGAT
GGGCTGGCCTCGTACAAAATTTTCAAGATCGAAAAGGGGAAGGTTACTAAATCAATA
GAGTTGAATGCACCTAATTCTCACTATGAGGAATGTTCCTGTTACCCTGATACCGGCA
AAGTGATGTGTGTGTGCAGAGACAATTGGCATGGTTCGAACCGGCCGTGGGTGTCTT
TCGATCAAAACCTGGATTATCGAATAGGATACATCTGCAGTGGGGTTTTCGGTGACAA
CCCGCGTCCCAAAGATGGAACAGGCAGCTGTGGTCCAGTGTATGTTGATGGAGCAAA
CGGAGTAAAGGGATTTTCATATAGGTATGGTAATGGTGTTTGGATAGGAAGGACCAAA
AGTCACAGTTCCAGACATGGGTTTGAGATGATTTGGGATCCTAATGGATGGACAGAGA
CTGATAGTAAGTTCTCTGTGAGGCAAGATGTTGTGGCAATGACTGATTGGTCAGGGTA
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TTCTGGGTTGAATTAATCAGGGGACGACCTAAAGAAAACACAATCTGGACTAGTGCG
AGCAGCATTTCTTTTTGTGGCGTGAATAGTGATACTGTAGATTGGTCTTGGCCAGACG
GTGCTGAGTTGCCATTCACCATTGACAAGTAG
Claims (10)
1.一种预防流感病毒的疫苗，其特征是预防流感病毒的截短的神经氨酸酶疫苗即预防流感病毒的截短的NA疫苗，该疫苗成分是截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，A/PR/8/34流感病毒NA基因核苷酸全序列如下：ATGAATCCAAATCAGAAAATAATAACCATTGGATCAATCTGTATGGTAGTCGGACTAATTAGCCTAATATTGCAAATAGGGAATATAATCTCAATATGGATTAGCCATTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGGAATATGCAACCAAAACATCATTACCTATAAAAATAGCACCTGGGTAAAGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAGTTCATCTCTTTGTCCCATCCGTGGGTGGGCTATATACAGCAAAGACAATAGCATAAGAATTGGTTCCAAAGGAGACGTTTTTGTCATAAGAGAGCCCTTTATTTCATGTTCTCACTTGGAATGCAGGACCTTTTTTCTGACCCAAGGTGCCTTACTGAATGACAAGCATTCAAATGGGACTGTTAAGGACAGAAGCCCTTATAGGGCCTTAATGAGCTGCCCTGTCGGTGAAGCTCCGTCCCCGTACAATTCAAGATTTGAATCGGTTGCTTGGTCAGCAAGTGCATGTCATGACGGCATGGGCTGGCTAACAATCGGAATTTCAGGTCCAGATAATGGAGCAGTGGCTGTATTAAAATACAACGGCATAATAACTGAAACCATAAAAAGTTGGAGGAAGAAAATATTGAGGACACAAGAGTCTGAATGTGCCTGTGTAAATGGTTCATGTTTTACTATAATGACTGATGGCCCGAGTGATGGGCTGGCCTCGTACAAAATTTTCAAGATCGAAAAGGGGAAGGTTACTAAATCAATAGAGTTGAATGCACCTAATTCTCACTATGAGGAATGTTCCTGTTACCCTGATACCGGCAAAGTGATGTGTGTGTGCAGAGACAATTGGCATGGTTCGAACCGGCCGTGGGTGTCTTTCGATCAAAACCTGGATTATCGAATAGGATACATCTGCAGTGGGGTTTTCGGTGACAACCCGCGTCCCAAAGATGGAACAGGCAGCTGTGGTCCAGTGTATGTTGATGGAGCAAACGGAGTAAAGGGATTTTCATATAGGTATGGTAATGGTGTTTGGATAGGAAGGACCAAAAGTCACAGTTCCAGACATGGGTTTGAGATGATTTGGGATCCTAATGGATGGACAGAGACTGATAGTAAGTTCTCTGTGAGGCAAGATGTTGTGGCAATGACTGATTGGTCAGGGTATAGCGGAAGTTTCGTTCAACATCCTGAGCTAACAGGGCTAGACTGTATAAGGCCGTGCTTCTGGGTTGAATTAATCAGGGGACGACCTAAAGAAAACACAATCTGGACTAGTGCGAGCAGCATTTCTTTTTGTGGCGTGAATAGTGATACTGTAGATTGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAGTTGCCATTCACCATTGACAAGTAG
上述A/PR/8/34流感病毒NA基因编码区全长1365核苷酸，编码一个大小为454个氨基酸的蛋白质产物；该基因中nt58～nt1365或者nt1～nt1299片段是最短的保护序列。
2.根据权利要求1所述的预防流感病毒神经氨酸酶疫苗，其特征在于：预防流感病毒的截短的NA疫苗是预防流感病毒的截短的神经氨酸酶核酸疫苗，即预防流感病毒的截短的NADNA疫苗。
3.根据权利要求1所述的预防流感病毒神经氨酸酶疫苗，其特征在于：预防流感病毒的截短的NA疫苗是预防流感病毒的截短的神经氨酸酶蛋白疫苗。
4.一种预防流感病毒的疫苗，其特征在于：截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因代替全长A/PR/8/34流感病毒NA基因，制备预防流感病毒的截短的NA疫苗。
5.根据权利要求1或4所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于所述的截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，由以下步骤获得：
(1)从10日龄鸡胚中增殖得到A/PR/8/34病毒，从中提取RNA，RNA经逆转录反应得到单链cDNA，
(2)根据A/PR/8/34流感病毒NA基因全长核苷酸序列，在其两个末端设计PCR引物，正向引物含有XhoI酶切位点，反向引物含有SmaI酶切位点，以cDNA为模板，对目的片段进行PCR扩增，将PCR产物用XhoI酶与SmaI酶酶切，酶切片段克隆入真核表达载体pCAGGSP7中，构建成重组真核表达载体pCAGGSP7/NA，
(3)对所得pCAGGSP7/NA进行末端测序，确定是长度为1365个核苷酸的A/PR/8/34流感病毒NA基因，
(4)用PCR的方法以pCAGGSP7/NA为模板，构建一系列真核表达载体，其中包含了从5’端或者3’端连续缺失的A/PR/8/34流感病毒NA基因，即得到截短的A/PR/8/34流感病毒NA基因，其由下述步骤验证，
(5)用QIAGEN纯化试剂盒纯化，用紫外分光光度法测定真核表达载体的浓度和纯度，DNA的浓度和纯度通过OD260、OD280确定，选取OD260/OD280比值在1.8～2.0的真核表达载体，测序验证。
6.根据权利要求5所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于：在扩增5’端缺失片段时，在目的片段5’端设置起始密码子ATG；在扩增3’端缺失片段时，在目的片段的3’端设置终止密码子TAG。
7.根据权利要求6所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于：在扩增5’端缺失片段时，以起始密码子ATG为起点，从A/PR/8/34流感病毒NA基因的5′端缺失21～114个核苷酸共7个连续位点，1个缺失为3个核苷酸的倍数。
8.根据权利要求7所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于5’端的7个连续位点所对应的截短的片段是：nt22～nt1365、nt52～nt1365、nt55～nt1365、nt58～nt1365、nt61～nt1365、nt64～nt1365和nt115～nt1365。
9.根据权利要求6所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于：在扩增3’端缺失片段时，以终止密码子TAG为起点，从A/PR/8/34流感病毒NA基因3’端缺失42～99个核苷酸共8个连续位点，1个缺失为3个核苷酸的倍数。
10.根据权利要求9所述的预防流感病毒的疫苗，其特征在于：3’端的8个连续缺失位点所对应的截短的片段是：nt1～1320、nt1～1308、nt1～1302、nt1～1299、nt1～1296、nt1～1293、nt1～1275和nt1～1263。
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| WO2022166176A1 (zh) * | 2021-02-07 | 2022-08-11 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种用于表达外源蛋白的新型流感病毒载体及其构建方法 |
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2004
- 2004-12-10 CN CN 200410061317 patent/CN1660421A/zh active Pending
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