CN112574297A - 抗神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
抗神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抗神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用。具体地,本发明提供了一种抗禽流感N9亚型神经氨酸酶抗原的单克隆抗体D3。本发明的抗体具有高亲和力和强神经氨酸酶活性抑制能力,能抑制病毒空斑形成,能有效的预防和保护小鼠免于感染致死剂量的H7N9病毒的攻击,同时能够识别神经氨酸酶上的高度保守位点,在今后禽流感H7N9预防、治疗、检测和疫苗设计中有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种抗禽流感N9亚型的神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)抗原的单克隆抗体。此外,本发明还涉及该抗体在预防、治疗、检测中的应用。
背景技术
2013年3月29日,中国疾病预防控制中心确认了首例人感染禽流感H7N9病毒的病例。至此,H7N9在中国连续六年流行,死亡率接近30%,以严重的肺部疾病和急性呼吸窘迫综合征(ARD)为特征。
研究结果表明,H7N9病毒在哺乳动物和人类呼吸道细胞中具有高效的复制能力。因为大多数人类感染都与直接接触活禽相关,中国地方政府已经实施控制措施以减少H7N9病毒在家禽市场的流行,如开展家禽市场的环境抽样并进行实验室检测。每年春季,一些城市的活禽市场会被关闭。这一措施在降低H7N9病毒传播风险方面卓有成效。
目前使用的大多数流感疫苗是灭活的流感疫苗裂解疫苗,含有流感病毒蛋白混合物,包括血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA),病毒表面糖蛋白负责病毒的附着和从宿主细胞的释放。NA是流感病毒表面的第二个主要糖蛋白。在A型流感病毒中,NA有9种亚型,可分成三组:N1,N5和N8为一组;N7和N9为一组;N2为一组。组间同源性在40-46%,组内同源性在54-68%,同一亚型同源性可达90%以上。研究证明NA依靠在宿主细胞受体中裂解唾液酸从而使受感染的细胞膜释放生成新的病毒。它还可以通过裂解病毒糖蛋白上的唾液酸残基来阻止病毒粒子的聚集。
单克隆抗体也已越来越多的被用于预防或治疗病毒感染。抗流感病毒单抗多是针对HA或是基质蛋白2(M2)。此外,抗NA单抗也被证明在小鼠模型中有保护效果。然而,本领域目前关于抗流感病毒单抗的研究还有很多不足,本领域仍然需要开发新的、结合效果好、特异性强的抗NA单抗。
发明内容
本发明的目的在于提供抗禽流感N9亚型神经氨酸酶抗原的单克隆抗体及其应用。
具体地,本发明要解决的技术问题之一是提供一种抗禽流感H7N9神经氨酸酶抗原的单克隆抗体。
本发明要解决的技术问题之二是提供该抗禽流感H7N9神经氨酸酶抗原的单克隆抗体的制备方法。
本发明要解决的技术问题之三是提供该抗禽流感H7N9神经氨酸酶抗原的单克隆抗体的应用。
在本发明的第一方面,提供了一种抗体的重链可变区,所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
SEQ ID NO.:5所示的CDR1,
SEQ ID NO.:6所示的CDR2,和
SEQ ID NO.:7所示的CDR3。
在另一优选例中,所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面,提供了一种抗体的重链,所述的重链具有本发明第一方面所述的重链可变区。
在另一优选例中,所述的抗体的重链还包括重链恒定区。
在另一优选例中,所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
在本发明的第三方面,提供了一种抗体的轻链可变区,所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
SEQ ID NO.:8所示的CDR1,
SEQ ID NO.:9所示的CDR2,和
SEQ ID NO.:10所示的CDR3。
在另一优选例中,所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面,提供了一种抗体的轻链,所述的轻链具有本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中,所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。
在另一优选例中,所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
在本发明的第五方面,提供了一种抗体,所述抗体具有:
(1)本发明第一方面所述的重链可变区;和/或
(2)本发明第三方面所述的轻链可变区;
或者,所述抗体具有:本发明第二方面所述的重链;和/或本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中,所述抗体具有:
(1)具有SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的重链可变区;和/或
(2)具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的轻链可变区;
其中,上述氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留神经氨酸酶结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中,所述的神经氨酸酶为N9亚型病毒神经氨酸酶,较佳地为H7N9病毒神经氨酸酶。
在另一优选例中,所述抗体选自:动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。
在另一优选例中,所述的动物为非人哺乳动物,较佳地为鼠、羊、兔。
在另一优选例中,所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
在另一优选例中,所述的抗体为单克隆抗体。
在另一优选例中,所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。
在另一优选例中,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量,不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40%,较佳地为20%,更佳地为10%。
在另一优选例中,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-7个,较佳地为1-3个,更佳地为1个。
在另一优选例中,所述经过添加、缺失、修饰和/或取代的至少一个氨基酸序列为同源性为至少80%,较佳地90%的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述衍生序列对NA活性抑制IC50为1-10μg/ml,较佳地为4-6μg/ml,如5.22μg/ml。
在本发明的第六方面,提供了一种重组蛋白,所述的重组蛋白具有:
(i)如本发明第五方面所述的抗体;以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中,所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中,所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中,所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
在本发明的第七方面,提供了一种抗体药物偶联物,所述的抗体药物偶联物含有:
(a)如本发明第五方面所述的抗体;和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分,所述偶联部分选自下组:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
在另一优选例中,所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在本发明的第八方面,提供了一种活性成分的用途,所述活性成分选自下组:本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第七方面所述的抗体药物偶联物、或其组合,所述活性成分用于(a)制备检测试剂、检测板或试剂盒;(b)制备预防和/或治疗N9亚型禽流感的药物;和/或(c)针对N9亚型禽流感的疫苗。
在另一优选例中,所述的N9亚型禽流感选自下组:
H5N9亚型禽流感、H7N9亚型禽流感、H9N9亚型禽流感、H11N9亚型禽流感、或其组合。
在另一优选例中,所述检测试剂、检测板或试剂盒用于:
(1)检测样品中的N9亚型禽流感病毒的神经氨酸酶;和/或
(2)检测样品中的N9亚型禽流感病毒。
在另一优选例中,所述的检测试剂、检测板或试剂盒用于诊断N9亚型禽流感。
在本发明的第九方面,提供了一种药物组合物,所述的药物组合物含有:
(i)活性成分,所述活性成分选自下组:本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、本发明第七方面所述的抗体药物偶联物、或其组合;以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中,所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中,所述的药物组合物包括疫苗组合物。
在本发明的第十方面,提供了一种多核苷酸,所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的重链可变区、本发明第二方面所述的重链、本发明第三方面所述的轻链可变区、本发明第四方面所述的轻链、本发明第五方面所述的抗体、或本发明第六方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十一方面,提供了一种载体,所述的载体含有本发明第十方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的载体包括:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第十二方面,提供了一种遗传工程化的宿主细胞,所述的宿主细胞含有本发明第十一方面所述的载体、或基因组中整合有本发明第十方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十三方面,提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中N9亚型禽流感病毒的方法,所述方法包括步骤:
(1)在体外,将所述样品与本发明第五方面所述的抗体接触;
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在神经氨酸酶。
在本发明的第十四方面,提供了一种检测板,所述的检测板包括:基片(支撑板)和测试条,所述的测试条含有本发明第五方面所述的抗体。
在本发明的第十五方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒中包括:
(1)第一容器,所述第一容器中含有本发明第五方面所述的抗体;和/或
(2)第二容器,所述第二容器中含有抗本发明第五方面所述的抗体的二抗;
或者,所述试剂盒含有本发明第十四方面所述的检测板。
在本发明的第十六方面,提供了一种重组多肽的制备方法,所述方法包括:
(a)在适合表达的条件下,培养本发明第十二方面所述的宿主细胞;
(b)从培养物中分离出重组多肽,所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。
在本发明的第十七方面,提供了一种预防或治疗N9亚型禽流感的方法,所述方法包括:给需要的对象施用本发明第五方面所述的抗体、本发明第七方面所述的抗体药物偶联物、或其组合。
在另一优选例中,所述的方法还包括:给需要的对象施用其他药物或治疗方法进行联合治疗。
在本发明的另一方面,提供一种在N9型流感病毒中具有高度保守性的神经氨酸抗原表位位点,即第248位和第249位氨基酸。
在本发明的另一方面,提供该单克隆抗体的用途,即在抑制H7N9病毒神经氨酸酶活性中的应用,在抑制H7N9病毒空斑形成中的应用,在筛选H7N9逃逸突变株中的应用,在鉴定识别神经氨酸酶抗原表位中的应用,以及在检测N9亚型病毒中的应用。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明实施例2中单克隆抗体D3的SDS-PAGE鉴定图。
图2显示了本发明实施例5中在不同浓度单克隆抗体D3下,H7N9病毒形成的空斑示意图。细胞仅接种病毒,覆盖无单克隆抗体琼脂作为对照。
图3显示了本发明实施例6中单克隆抗体D3识别H7N9 NA表位的示意图。
图4显示了本发明实施例8中不同给予量的单克隆抗体D3对于感染致死剂量的H7N9病毒的小鼠的预防实验。其中,图4A显示了生存曲线示意图;图4B显示了体重丢失示意图。
图5显示了本发明实施例8中不同给予量的单克隆抗体D3对于感染致死剂量的H7N9病毒的小鼠的保护实验。其中,图5A显示了生存曲线示意图;图5B显示了体重丢失示意图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究,首次意外地发现一种抗禽流感H7N9神经氨酸酶抗原的单克隆抗体D3。本发明的抗体具有高亲和力和强神经氨酸酶活性抑制能力,能抑制病毒空斑形成,能有效的预防和保护小鼠免于感染致死剂量的H7N9病毒的攻击,同时能够识别神经氨酸酶上的高度保守位点,在今后禽流感H7N9预防、治疗、检测和疫苗设计中有广泛的应用前景。
研究表明,NA特异性免疫应答可以保护机体抵抗流感病毒的攻击。采用NA-DNA免疫可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体反应,并能很好地保护小鼠免于感染致死剂量的流感病毒。
本发明制备的H7N9流感病毒NA单克隆抗体D3能抑制病毒空斑形成,在小鼠攻毒模型中显示了预防和治疗效果,同时能够识别神经氨酸酶上的高度保守位点,在今后禽流感H7N9预防、治疗、检测及药物靶点和疫苗设计中有广泛的应用前景。
术语
为了可以更容易地理解本公开,首先定义某些术语。如本申请中所使用的,除非本文另有明确规定,否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成,其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
本文所用的术语“单克隆抗体”由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
本文所用的术语“抗体”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本文所用的术语“神经氨酸酶”表示分布于流感病毒被膜上的一种糖蛋白,它具有抗原性,可以催化唾液酸水解,协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞。在甲型流感病毒中,神经氨酸酶的抗原性会发生变异,这成为划分甲型流感病毒亚型的依据,在目前已知的甲型流感病毒中共有9种不同的神经氨酸酶抗原型。
抗体
本发明提供了一种抗禽流感H7N9神经氨酸酶抗原的单克隆抗体,该抗体特异性结合禽流感H7N9神经氨酸酶抗原,并且,该抗体具有:SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区;和SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链可变区。
利用Kabat编码系统对本发明优选单克隆抗体D3的序列进行分析,重链CDR1、CDR2和CDR3区和轻链CDR1、CDR2和CDR3区如下所示:
重链
CDR1:Gly Tyr Tyr Met His(SEQ ID NO.:5)
CDR2:Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe LysAsp(SEQ ID NO.:6)
CDR3:Ser Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr(SEQ ID NO.:7)
轻链
CDR1:Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His(SEQID NO.:8)
CDR2:Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser(SEQ ID NO.:9)
CDR3:Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser(SEQ ID NO.:10)
本文所用的术语“抗体”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)。其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些还可进一步分成亚类(同种型),如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般,抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述,称为可变区域(CDR),将该段间隔成4个框架区域(FR),4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构,通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近,重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明不仅包括完整的抗体,还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本发明中,抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体,例如嵌合的和人源化的单克隆抗体,包括人的和非人的部分,可以通过标准的DNA重组技术获得,它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子,其中不同的部分来自不同的动物种,例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区,和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子,具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089,在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
在本发明中,抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本发明中,本发明的抗体还包括其保守性变异体,指与本发明抗体的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明的抗体可以是双链或单链抗体,并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人-动物嵌合抗体、优选为人源化抗体,更优选为全人源化抗体。
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段,如:Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等,以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
其中,所述动物优选为哺乳动物,如鼠。
抗体的制备
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术,比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外,还可将轻链和重链的编码序列融合在一起,形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于):CHO-S、HEK-293细胞。
通常,在适合本发明抗体表达的条件下,培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤,如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如,单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
检测用途和试剂盒
本发明的抗体可用于检测应用,例如用于检测样本,从而提供诊断信息。
本发明中,所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒,在本发明的一个优选例中,所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中,本发明的抗体可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中,所述的组合物是药物组合物或疫苗组合物,它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白,以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):静脉内给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合禽流感病毒神经氨酸酶,因而可用于预防和治疗禽流感。此外,还可同时使用其他治疗剂。
本发明的疫苗组合物能够预防和保护受试者免受N9亚型病毒的攻击。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的抗体施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括:
(a)抗禽流感H7N9神经氨酸酶抗原的单克隆抗体D3具有高亲和力和强神经氨酸酶活性抑制能力;
(b)单克隆抗体D3能有效的预防和保护小鼠免于感染致死剂量的H7N9病毒的攻击;
(c)单克隆抗体D3能够识别神经氨酸酶上的高度保守位点。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1单克隆抗体筛选
选用4周龄SPF级雌性BALB/c小鼠,每只小鼠注射50ul含50ug的NA质粒,或50ulPBS(对照组),随即在肌肉注射针孔的两侧进行电击。每隔2周用相同剂量相同体积的质粒溶液免疫一次,共免疫3次。免疫3次后的7天,断尾取血,检测血清中抗NA抗体滴度。抗体滴度较高的小鼠使用50ug的NA质粒直接进行尾静脉加强免疫,3天后取小鼠脾脏细胞用于细胞融合。将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合后,分装96孔细胞培养板,37℃,5%CO2培养箱内培养。在倒置显微镜下观察细胞状态,待长出杂交瘤细胞后吸出上清供抗体检测。选取分泌高滴度抗体的细胞进行亚克隆培养。采用有限稀释法进行亚克隆,根据ELISA结果,选取分泌高滴度抗体的原始孔细胞,计数后,用HT培养基稀释至每ml含10个细胞。每种杂交瘤细胞分装96孔板一块,每孔杂交瘤细胞数为1个。37℃、5%CO2培养箱中培养7~10天,筛选单个克隆的细胞孔,取上清进行ELISA检测抗体滴度。
结果显示,经过三次以上亚克隆后,得到了可以稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,将其进行保存用于后续实验。
实施例2单克隆抗体的制备和纯化
8周龄的BALB/C雌性小鼠,每只小鼠腹腔接种PBS或实施例1制备的杂交瘤细胞,每只小鼠注射1×107/0.5ml。间隔5天后,采集腹水。采用蛋白G亲和柱纯化腹水,将收集的洗脱液放入透析袋,于PBS溶液透析。
将透析过后的洗脱液测定浓度后分装,冻存于-70℃。纯化后的抗体经SDS-PAGE胶鉴定纯度。
12%的SDS-PAGE鉴定结果如图1所示,抗体纯度可达95%以上,在大约57kD和24kD处可见抗体的重链和轻链,其分子量大小与理论值相符。
实施例3单克隆抗体效价测定
采用ELISA的方法,检测实施例2制备的单克隆抗体的效价。用H7N9 NA抗原包被96孔酶标板上,100μl/孔,于2-8℃放置过夜。封闭液封闭后,将稀释不同浓度的单克隆抗体,以100μl/孔加样至96孔板中,37℃孵育2小时,洗净。加入稀释的酶标二抗(羊抗人IgG-HRP),37℃下1小时,彻底洗净。加入新鲜配制的TMB底物使用液100μl,室温放置5-10min,2MH2SO4终止反应,每孔50μl,在酶标仪上读取450nm下的OD值。与PBS孔相比,实验组OD450与阴性OD450的比值大于2为阳性,阳性反应的最低浓度为单克隆抗体的效价。
结果显示,单克隆抗体D3的效价为0.49ng/ml。
实施例4单克隆抗体NA活性抑制能力测定
采用96孔板的酶联凝集素法(ELLA)检测单克隆抗体对NA酶活性的抑制作用。将胎球蛋白抗原包被96孔酶标板,于2-8℃放置过夜。将实施例2制备的单克隆抗体稀释液与1%BSA稀释的H7N9病毒混合,37℃孵育1小时,随即转移到96孔板中。加入花生凝集素偶联HRP,在室温下室温孵育2小时,洗板3-6次,甩干。加入新鲜配制的TMB底物使用液100μl,室温放置5-10min;以2M H2SO4终止反应,每孔50μl,在酶标仪上读取450nm下的OD值。中位抑制浓度(IC50)计算为抗体反稀释,使NA活性抑制50%。
结果显示,单克隆抗体D3的NA活性抑制IC50为5.22μg/ml。
实施例5单克隆抗体的空斑减少实验
6孔板铺满MDCK细胞,接种约长30-40个空斑的H7N9病毒量,37℃孵化1小时,然后覆盖0.8%低熔点琼脂糖,琼脂糖含有不同浓度的单克隆抗体D3(2、20、200μg/ml)。细胞仅接种病毒,覆盖无单克隆抗体琼脂作为对照。病毒接种72h后,用结晶紫溶液染色细胞,观察空斑。
结果如图2所示,单克隆抗体D3在浓度20μg/ml时仅能形成微小的空斑,在浓度200μg/ml时能够完全抑制病毒空斑形成。
实施例6单克隆抗体的表位鉴定
将4mg的单克隆抗体D3与106PFU的H7N9病毒(A/Shanghai/2/2013)混合,在室温下孵育30分钟后,将混合物接种于8-10天的SPF级胚鸡胚蛋中。孵育3天后,收集尿囊液。将潜在的逃逸变异接种到MDCK细胞上,在含有单克隆抗体D3的条件下,进行空斑检测。将比亲代病毒形成的空斑大的空斑,重新在鸡胚中进行扩增。利用RT-PCR扩增NA基因,并对其测序。序列分析,以确定氨基酸的变化。
通过与亲本H7N9 NA氨基酸序列比对,发现第248位和第249位氨基酸与亲本不同。其中,第248位,A变成G,第249位,T变成N。
通过免疫荧光(IFA)复检了第248和249位是否为NA-抗体关键位点。构建突变NA质粒NAA248G,NAT249N,转染293T细胞,IFA结果显示NA突变体均失去了与单抗D3的结合能力。因此第248和249位氨基酸为单克隆抗体D3的识别表位,在NA上的位置如图3所示,将该表位在禽流感数据库中进行比对,发现这两个位点在H7N9中为高度保守位点。
实施例7单克隆抗体能广谱检测N9亚型禽流感病毒
对禽流感数据库中所有NA亚型进行比对,发现单抗D3识别的NAA248,NAT249能在N9亚型中广泛找到,因此单抗D3能广谱结合N9亚型的NA抗原,对N9亚型禽流感病毒的检测有重要的应用前景。
实施例8单克隆抗体对小鼠预防和治疗效果评价
1、预防效果
在预防实验中,6周龄BALB/c雌性小鼠在腹腔注射50、30或10mg/kg的纯化小鼠单克隆抗体D3,每组各5只。24小时后,滴鼻给予20μl的5LD50的H7N9病毒(A/Shanghai/2/2013)。对照组注射PBS。对于生存分析,每天监测小鼠的生存和体重减轻情况,直到感染后第20天。
结果显示,对照组小鼠感染H7N9病毒后3-4天病情明显加重,在14天全部死亡。相比之下,接种不同剂量单克隆抗体D3的各组小鼠在病毒攻击后均获得保护。如图4所示,单克隆抗体D3在30mg/kg和50mg/kg都能达到100%的保护效果。
2、治疗效果
在治疗实验中,6周龄BALB/c雌性小鼠滴鼻给予20μl的5LD50的H7N9病毒(A/Shanghai/2/2013),24小时后,在腹腔注射50、30或10mg/kg的纯化小鼠单克隆抗体D3,每组各5只。对照组注射PBS。对于生存分析,每天监测小鼠的生存和体重减轻情况,直到感染后第20天。
结果如图5所示,单克隆抗体D3在50mg/kg能达到100%的保护效果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海生物制品研究所有限责任公司
<120> 抗神经氨酸酶的单克隆抗体及其应用
<130> P2019-0956
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
20 25 30
Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Ser Leu Gln Trp
35 40 45
Ile Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn
50 55 60
Phe Lys Asp Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Ser Arg Ser Asn
100 105 110
<210> 3
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attcaggtca aactgcagga gtctggacct gagctggtga agcctggggc ttcagtgaag 60
atatcctgca aggcttctgg ttactcattc actggctact acatgcactg ggtgaagcaa 120
agccatgtaa agagccttga gtggattgga cgtattaatc cttacaatgg tgctactagc 180
tacaaccaga atttcaagga caaggccagc ttgactgtag ataagtcctc cagcacagcc 240
tacatggagc tccacagcct gacatctgag gactctgcag tctattactg tgcaagatca 300
ggcaactatg ctatggacta ctggggccaa gggaccacgg tgaccgtctc ctca 354
<210> 4
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacattgagc tcacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120
caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300
tcggaggggg gaccaagctc gagatctaac 330
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser
1 5
Claims (10)
1.一种抗体的重链可变区,其特征在于,所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
SEQ ID NO.:5所示的CDR1,
SEQ ID NO.:6所示的CDR2,和
SEQ ID NO.:7所示的CDR3。
2.一种抗体的重链,其特征在于,所述的重链具有权利要求1所述的重链可变区。
3.一种抗体的轻链可变区,其特征在于,所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
SEQ ID NO.:8所示的CDR1,
SEQ ID NO.:9所示的CDR2,和
SEQ ID NO.:10所示的CDR3。
4.一种抗体的轻链,其特征在于,所述的轻链具有权利要求3所述的轻链可变区。
5.一种抗体,其特征在于,所述抗体具有:
(1)权利要求1所述的重链可变区;和/或
(2)权利要求3所述的轻链可变区;
或者,所述抗体具有:权利要求2所述的重链;和/或权利要求4所述的轻链。
6.如权利要求5所述的抗体,其特征在于,所述抗体具有:
(1)具有SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的重链可变区;和/或
(2)具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的轻链可变区;
其中,上述氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留神经氨酸酶结合亲和力的衍生序列。
7.一种重组蛋白,其特征在于,所述的重组蛋白具有:
(i)如权利要求5所述的抗体;以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
8.一种抗体药物偶联物,其特征在于,所述的抗体药物偶联物含有:
(a)如权利要求5所述的抗体;和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分,所述偶联部分选自下组:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
9.一种活性成分的用途,其特征在于,所述活性成分选自下组:权利要求5所述的抗体、权利要求7所述的重组蛋白、权利要求8所述的抗体药物偶联物、或其组合,所述活性成分用于(a)制备检测试剂、检测板或试剂盒;(b)制备预防和/或治疗N9亚型禽流感的药物;和/或(c)针对N9亚型禽流感的疫苗。
10.一种多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸编码权利要求1所述的重链可变区、权利要求2所述的重链、权利要求3所述的轻链可变区、权利要求4所述的轻链、权利要求5所述的抗体、或权利要求7所述的重组蛋白。
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