CN109957014B

CN109957014B - 抗诺如病毒gii.3鼠源单克隆抗体的制备和应用

Info

Publication number: CN109957014B
Application number: CN201711424081.8A
Authority: CN
Inventors: 黄忠; 王晓黎; 熊佩; 王淑侠; 刘庆伟
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Immunology and Infection, Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2037-12-25
Also published as: CN109957014A

Abstract

本发明提供了抗诺如病毒GII.3鼠源单克隆抗体的制备和应用，具体地，本发明意外的获得4种抗诺如病毒GII.3鼠源单克隆抗体(3A3、8D1、8C7和9B8)，实验结果表明，本发明的单克隆抗体具有极高的对诺如病毒GII.3的中和活性，并且本发明的单抗可特异灵敏地检测到诺如病毒GII.3。本发明还提供了上述单克隆抗体的用途。

Description

抗诺如病毒GII.3鼠源单克隆抗体的制备和应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及抗诺如病毒GII.3鼠源单克隆抗体的制备和应用。

背景技术

诺如病毒(NoVs)是导致急性肠胃炎的散发病例和大暴发的主要的病原体之一。诺如病毒可以感染各个年龄段的人。尽管，诺如病毒感染后引起的症状一般比较温和，病程有自限性(持续1-3天左右)，但是在儿童、老人以及免疫功能不全的人中仍可引起较为严重的症状，甚至引起死亡。根据VP1衣壳蛋白的氨基酸序列，诺如病毒可以分为6个基因型(GI-GVI)和多重基因型，但只有GI，GII和GIV可以感染人类。人诺如病毒的感染主要由诺如病毒GII所引起，大多数爆发的诺如病毒感染是诺如病毒GII.4引起，而GII.3是与诺如病毒的散发感染中最常见的基因型之一。据报道，儿童的散发感染主要是GII.3导致的。在儿童感染的病例中常检测到重组菌株，特别是由GII.3衣壳蛋白基因与GII.b的RaRp基因重组的菌株。GII.3在发达国家和发展中国家均有流行，非洲、日本、泰国、越南、澳大利亚和中国等地近年来均有诺如病毒GII.3型的检出，其中某些国家诺如病毒相关的病例中GII.3的发病率高达50％。2003-2012年，Zhirakovskaia等收集了1098份儿童急性腹泻病例样本，其中NoVs的检出率为13.1％，在NoVs的检出病例中，GII.3型占51％。在我国云南昆明自2014年6月至2015年7月对四家医院里的118例诺如病毒II型腹泻病例进行研究发现主要为GII.4感染(46.6％)，其次为GII.3(23.7％)感染。因此诺如病毒GII.3正逐渐成为主要流行株。

诺如病毒在发达国家和发展中国家均有流行，给各国带来了严重的经济损失，给儿童、老人的健康造成了很大的威胁。目前仍没有上市的预防性疫苗和特效的治疗性药物。诺如病毒缺少简单细胞培养模型，也没有强效的小动物模型，这严重阻碍了诺如病毒疫苗和抗病毒药物研发。人源化鼠源单克隆抗体是一个开发预防和治疗病毒感染药物的有效方法，同时单克隆抗体也可用于病毒感染的诊断。目前尚未有针对GII.3型诺如病毒的单克隆抗体。

因此，本领域技术人员致力于开发具有良好临床应用前景的抗诺如病毒药物，以及治疗性人源化单抗的可靠候选者和开发诊断方法的有用试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有良好临床应用前景的抗诺如病毒药物，以及治疗性人源化单抗的可靠候选者和开发诊断方法的有用试剂。

本发明第一方面提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.1所示的CDR1，

SEQ ID NO.2所示的CDR2，和

SEQ ID NO.3所示的CDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代1个氨基酸并能够保留诺如病毒GI I.3特异抗原结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述的CDR3的氨基酸序列包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代1个氨基酸并能够保留诺如病毒GII.3特异抗原结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述诺如病毒GII.3特异抗原包括诺如病毒GII.3的结构蛋白。

在另一优选例中，所述诺如病毒GII.3特异抗原包括人工合成的病毒样颗粒、和/或天然存在的病毒样颗粒。

在另一优选例中，所述诺如病毒GII.3特异抗原包括诺如病毒GII.3的衣壳蛋白。

在另一优选例中，所述重链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

本发明第二方面提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明第一方面所述的重链可变区。

在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。

在另一优选例中，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示。

本发明第三方面提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的CDR1’，

SEQ ID NO.5所示的CDR2’，和

SEQ ID NO.6所示的CDR3’。

在另一优选例中，所述轻链可变区还包括人源的FR区或鼠源的FR区。

在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

本发明第四方面提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述的抗体的轻链还包括轻链恒定区。

在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。

在另一优选例中，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。

本发明第五方面提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗诺如病毒GII.3特异抗原的抗体。

在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。

在另一优选例中，所述抗体对诺如病毒GII.3特异抗原与PGM结合抑制的EC₅₀为100-300ng/ml，较佳地，150-250ng/ml。

在另一优选例中，所述抗体选自：动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或其组合。

在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗体是部分或全人源化的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.7所示；并且所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:8所示。

本发明第六方面提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区的序列、如本发明第二方面所述的重链的序列、如本发明第三方面所述的轻链可变区的序列、如本发明第四方面所述的轻链的序列、或如本发明第五方面所述的抗体的序列；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合诺如病毒GII.3特异抗原。

本发明第七方面提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：

(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；或

(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.11-20所示的序列。

本发明第八方面提供了一种载体，它含有本发明第七方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

本发明第九方面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。

本发明第十方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

本发明第五方面所述的抗体。

在另一优选例中，所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。

本发明第十一方面提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：

(a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、或如本发明第六方面所述的重组蛋白；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明第十二方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十一方面所述的免疫偶联物；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗诺如病毒感染的药物。

本发明第十三方面提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十一方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中诺如病毒GII.3特异抗原；

所述药剂用于治疗或预防表达诺如病毒感染。

在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。

本发明第十四方面提供了一种检测样品中诺如病毒GII.3特异抗原的方法，所述方法包括步骤：

(1)将样品与本发明第五方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在诺如病毒GII.3特异抗原。

本发明第十五方面提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化的抗GII.3单抗。4种纯化的抗体分别上样到12％的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，并以考马斯亮蓝染色显示蛋白条带。M,蛋白分子量标准；1，8D1单抗；2，9B8单抗；3，3A3单抗；4，8C7单抗。

图2显示了酶联免疫吸附试验(Elisa)鉴定单抗与不同抗原的结合能力。在Elisa板上每孔分别包被50ng(A)GI.1,(B)GII.3,(C)GII.4或者(D)GII.17病毒样颗粒，每孔分别加不同浓度的纯化的单抗后于37℃孵育2小时，接着用HRP标记的抗鼠二抗进行孵育。抗乙肝表面抗原(HBsAg)单抗被用来做无关对照。图中每个点显示了三个重复样品测定的OD450nm平均值和标准差。

图3显示了病毒样颗粒经处理后，上样到12％的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，接着转移到PVDF膜上，用纯化的单抗进行杂交。M,蛋白分子量标准；1，GI.1；2，GII.3；3，GII.4；4，GII.17病毒样颗粒。抗乙肝表面抗原(HBsAg)单抗被用来做无关对照。

图4显示了夹心Elisa检测GII.3病毒样颗粒。在Elisa板上每孔分别包被50ul 1:2000稀释的兔抗GII.3，每孔分别加不同浓度的GII.3病毒样颗粒后于37℃孵育2小时，接着每孔加入50ng的纯化的单抗，最后用HRP标记的抗鼠二抗进行孵育。抗乙肝表面抗原(HBsAg)单抗被用来做无关对照。图中每个点显示了三个重复样品测定的OD450nm平均值和标准差。

图5显示了中和替代实验检测纯化后单抗抑制GII.3病毒样颗粒与PGMIII作用的活性。在Elisa板上每孔包被50ul 10ug/ml PGMII，将不同浓度的单抗与0.5ug/ml GII.3病毒样颗粒在室温孵育1小时后加入Elisa板中，接着加入兔抗GII.3，最后用HRP标记的抗兔二抗进行孵育。抗乙肝表面抗原(HBsAg)单抗被用来做无关对照。图中每个点显示了三个重复样品测定的平均值和标准差。

图6显示了基因重组表达的单克隆抗体的鉴定。在Elisa板上每孔分别包被50ngGII.3病毒样颗粒，每孔分别加不同浓度的纯化的单抗37℃孵育2小时，接着用HRP标记的抗鼠二抗进行孵育。未转染质粒的细胞的培养上清作为空白对照。图中柱状图显示了三个重复样品测定的OD450nm平均值和标准差。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，通过大量的筛选，从几百种抗诺如病毒GII.3鼠源单克隆抗体中意外的获得4种抗诺如病毒GII.3鼠源单克隆抗体(3A3、8D1、8C7和9B8)，实验结果表明，本发明的单克隆抗体具有极高的对诺如病毒GII.3的中和活性，并且本发明的单抗可特异灵敏地检测到诺如病毒GII.3，其中，与其他三种单克隆抗体相比，8D1和8C7单克隆抗体的综合性能较好(比如中和活性很高、灵敏度高、且交叉反应性很低)。本发明还提供了上述单克隆抗体的用途。

具体地，本发明以GII.3病毒样颗粒作为免疫原制备了能特异性识别GII.3的单克隆抗体(如3A3、8D1、8C7和9B8)。Elisa和替代中和实验等方法说明本发明的抗体可以用来灵敏检测和分析GII.3，更重要的是其还具有强大的中和活性。在此基础上，本发明人完成了本发明。

诺如病毒GII.3

诺如病毒GII.3属于诺如病毒属GII型，是引起诺如病毒暴发流行的主要病原体。诺如病毒在发达国家和发展中国家均有流行，给各国带来了严重的经济损失，儿童、老人的健康造成了很大的威胁。到目前为止，没有上市的预防性疫苗和特效的治疗性药物。

本发明利用重组GII.3病毒样颗粒作为免疫原制备了GII.3单克隆抗体。本发明制备的抗体不仅可以用作实验室检测用工具，而且是制备治疗性人源化单抗的可靠候选者和开发诊断方法的有用试剂。

本发明通过毕赤酵母表达系统，获取高纯度病毒样颗粒作为免疫原制备抗GII.3单克隆抗体，制备的抗体能特异性的识别GII.3。ELISA和替代中和实验等方法说明这些抗体可以用来灵敏检测和分析GII.3，更重要的是有些单抗还具有强大潜在的中和活性。

在一优选实施方式中，本发明中使用诺如病毒GII.3衣壳蛋白(如VP1)制备了病毒样颗粒，其氨基酸序列为：

诺如病毒GII.3特异抗原

在本发明中，所述诺如病毒GII.3特异抗原包括(但不限于)，衣壳蛋白(如VP1蛋白)、多肽、P颗粒、病毒样颗粒、病毒颗粒。

在一优选实施方式中，诺如病毒GII.3特异抗原包括诺如病毒GII.3的衣壳蛋白。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本发明还包括具有所述的抗GII.3病毒单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗GII.3病毒单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗GII.3病毒单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗GII.3病毒单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')₂片段；抗体重链；抗体轻链。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

CDR1，其氨基酸序列为GYTFSTYL(SEQ ID NO:1)，其编码核苷酸序列为，GGATACACATTCAGTACTTATCTT(SEQ ID NO.:13)；

CDR2，其氨基酸序列为INPYNDGP(SEQ ID NO.:2)，其编码核苷酸序列为，ATTAATCCTTATAATGATGGTCCT(SEQ ID NO.:14)；

CDR3，其氨基酸序列为ARRYDYDGDWFAY(SEQ ID NO.:3)，其编码核苷酸序列为，GCAAGACGGTATGATTACGACGGGGAC(SEQ ID NO.:15)。

在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFSTYLIHWVKQKPGRGLEWIGYINPYNDGPKYEQKFKGRATLTSDRSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARRYDYDGDWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO.:7)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。

在另一优选例中，所述抗体的重链氨基酸序列为：

MEWSWIFLFLLSGTAGVHSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFSTYLIHWVKQKPGRGLEWIGYINPYNDGPKYEQKFKGRATLTSDRSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARRYDYDGDWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO.:9)

如本文所用，术语“轻链可变区”与“V_L”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：

CDR1'，其氨基酸序列为QNIGTS(SEQ ID NO.:4)，其编码核苷酸序列为，CGGGCAAGTCATGACATTGGTAGTAACTTAGAC(SEQ ID NO.:17)；

CDR2'，其氨基酸序列为ATSTLDS(SEQ ID NO:15)，其编码核苷酸序列为，CAGAACATTGGCACAAGC(SEQ ID NO.:16)；

CDR3'，其氨基酸序列为QQTNSWPYT(SEQ ID NO.:6)，其编码核苷酸序列为，CAACAAACTAATAGCTGGCCGTACACG(SEQ ID NO.:18)。

在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：

DILLTQSPAILSVSPGKRVSFSCRASQNIGTSIHWYQHRTNGSPRLLIKYASESISGTPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQTNSWPYTFGGGTKLEI(SEQ ID NO.：8)

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。

在另一优选例中，所述抗体的轻链氨基酸序列为：

MVSTPQFLVFLLFWIPASRGDILLTQSPAILSVSPGKRVSFSCRASQNIGTSIHWYQHRTNGSPRLLIKYASESISGTPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQTNSWPYTFGGGTKLEIIRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQID NO.:10)

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合抗GII.3病毒的抗体，例如具有重链(如SEQ ID NO.:9的氨基酸序列)和/或轻链(如SEQ ID NO.:10的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

在另一优选例中，所述的抗体为抗抗GII.3病毒的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有抗GII.3病毒结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:11-20所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.:11-20所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:7和/或SEQ ID NO.:8所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancerresearch)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合GII.3病毒样颗粒，因而可用于预防和治疗诺如病毒(NoVs)是导致急性肠胃炎。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

杂交瘤细胞株

本发明还提供了可生产本发明针对抗GII.3病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株；优选的，本发明提供了高效价的针对抗GII.3病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在获得生产本发明的抗GII.3病毒单克隆抗体的杂交瘤之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。

单克隆抗体的制备

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。

对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

本发明提供了一种针对GII.3病毒的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，10天左右可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。

标记的免疫球蛋白(抗体)

在本发明的一个优选例中，所述免疫球蛋白带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、辣根过氧化物酶标记、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗GII.3病毒的单克隆抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单克隆抗体。

本发明的抗GII.3病毒单克隆抗体具有很好的特异性，很高的效价。

检测板及其材料

本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料，采用常规的检测板制备方法制成。

本发明检测GII.3病毒的免疫检测板，包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金标记或有色标记的抗GII.3病毒单克隆抗体或多克隆抗体，优选被胶体金标记的抗GII.3病毒单克隆抗体，硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；

在一个优选的方案中：层析材料上预包被胶体金标记的抗GII.3病毒单克隆抗体是采用浓度为0.5-1.5mg/ml胶体金标记的抗GII.3病毒单克隆抗体溶液进行预包被的，包被量为50μl/cm²；优选的浓度为0.5或1.5mg/ml，50μl/cm²；

检测方法与结果判定

平放检测板，将试样滴在滤样纸上，试样约120μl，3～5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。

阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；

阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；

无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。

方法和样本

本发明涉及用于在以细胞和/或组织溶解的样本检测诺如病毒的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中GII.3病毒的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本，正如在液基细胞检测法中所使用的。

试剂盒

本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明进一步设计用于检测GII.3病毒水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别抗GII.3病毒的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

本发明进一步设计开发用于对来自溶液样本的GII.3病毒感染相关情况诊断评估的试剂盒，该试剂盒可以检测存在于样本溶液中的GII.3病毒，其中保存样本的细胞保存液可以是诸如液基细胞检测法中的细胞保存液。

本发明的抗GII.3病毒单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点，可广泛应用在制备GII.3病毒的检测领域，如检测试剂或检测设备的制备领域等，在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法或检测试剂具有显著的优势。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的单克隆抗体(如8D1和8C7)能够特异性的识别诺如病毒特异抗原。

(2)本发明的单克隆抗体(如8D1和8C7)能够特异性的结合诺如病毒GII.3，从而实现对诺如病毒GII.3的鉴定。

(3)本发明的单克隆抗体(如8D1和8C7)对诺如病毒具有强大的中和活性，EC50分别为0.1875ug/ml和0.2430ug/ml。

(4)本发明经过大量筛选，意外筛到了四株能够结合GII.3的单克隆抗体：3A3、8D1、8C7和9B8。ELISA结果显示，3A3、8D1、8C7和9B8均可识别GII.3特异抗原(如GII.3衣壳蛋白)。

(5)本发明的单克隆抗体(如8D1和8C7)可灵敏的检测到GII.3特异抗原，最低检测限度分别为0.625ng和0.3125ng。

(6)本发明的单克隆抗体(如8D1何8C7)可特异的检测到GII.3特异抗原，且与其他亚型的诺如病毒(如GI.1、GII.4和GII.17)无交叉反应。

(7)本发明经过大量筛选，从上述四株单克隆抗体中意外发现其中8D1和8C7单克隆抗体的综合性能较好(比如中和活性很高、灵敏度高、且交叉反应性很低)。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

材料与方法

1.抗原制备及小鼠免疫

利用毕赤酵母表达系统，通过表达诺如病毒GII.3VP1制备了病毒样颗粒。将5ug的病毒样颗粒(50ul体积)与等体积的铝佐剂(500ug)混合后腹腔免疫6周雌性Balb/c小鼠，在0周、2周、4周各免疫一次。在第6周时，采取小鼠血清检测中和滴度。第7周时，中和滴度最高的一只小鼠通过尾静脉加强免疫10ug GII.3病毒样颗粒。3天后，取小鼠脾脏用于制备杂交瘤细胞。

2.杂交瘤细胞株的制备和筛选

小鼠尾静脉加强免疫3天后，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG1500融合，制备杂交瘤细胞。9天之后，通过酶联免疫吸附试验筛选特异性分泌针对GII.3病毒样颗粒的抗体。简言之，GII.3病毒样颗粒包被96孔板，每孔50ng，4℃包被过夜，用含有5％脱脂牛奶的PBST封闭，每孔加50ul杂交瘤培养液在37℃孵育2小时，接着用HRP标记的二抗孵育1小时，最后进行显色反应，读取OD450的吸光值。

3.腹水制备和抗体纯化

雌性Balb/c小鼠腹腔注射500ul液体石蜡油，两周后，每只小鼠腹腔注射30万个杂交瘤细胞。7天后，12号针头收集腹水，12,000rpm离心5min，去除上层油脂和下层沉淀，取澄清的腹水进行抗体纯化。根据说明书，利用HiTrap HiTrapTM Protein G亲和柱(GE healthcare)纯化腹水获得抗体。

4.酶联免疫吸附实验鉴定单克隆抗体

用每孔50ngGI.1或GII.3或GII.4或GII.17病毒样颗粒4℃过夜包被96孔Elisa板，鉴定单抗的结合能力。Elisa板经含5％脱脂牛奶的PBST在37℃封闭2个小时后，按每孔50ul将不同浓度(5ug/ml、1ug/ml、0.2ug/ml、0.04ug/ml和0.008ug/ml)加入单抗37℃孵育2小时，接着用HRP标记的抗鼠二抗进行孵育，最后读取吸光值OD450。

5.聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析

蛋白样品与SDS-PAG上样缓冲液混合后，煮沸处理10min，经12％聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。通过考马斯亮蓝染色显示蛋白条带或者将蛋白转移到PVDF膜上进行Western blot分析。单克隆抗体按最终浓度1ug/ml稀释到含1％脱脂牛奶的PBST中。兔抗GII.3多克隆抗体1:1000稀释使用，接着用HPR标记的二抗进行孵育，最后用LAS-400发光图像分析仪进行记录。

6.夹心Elisa检测GII.3病毒样颗粒

用兔抗GII.3病毒样颗粒的多抗血清1:2000稀释度(50ul/孔)4℃过夜包被96孔Elisa板，Elisa板经含5％脱脂牛奶的PBST在37℃封闭2个小时后，将病毒样颗粒加入Elisa板中，40ng/50ul/孔始起，2倍比稀释12个浓度，37℃孵育2个小时，然后将病毒样颗粒特异的单抗50ng/50ul/孔37℃孵育1小时，接着用HPR标记的鼠二抗进行孵育，最后读取吸光值OD450。

7.体外替代中和实验

用10ug/ml的PGMIII(50ul/孔)室温包被96孔Elisa板，Elisa板经含5％脱脂牛奶的PBST在4℃封闭过夜后备用。将GII.3病毒样颗粒特异性单抗4ug/ml始起，2倍比稀释，与等体积(50ul)0.5ug/ml的GII.3病毒样颗粒室温孵育1个小时后加到包被有PGMIII的96孔Elisa板上，室温孵育1个小时，然后加入兔抗GII.3 VLP多抗血清1:2000稀释液37℃孵育1小时，接着用HPR标记的兔二抗进行孵育，最后读取吸光值OD450。

实施例1分泌GII.3特异抗体的杂交瘤细胞的筛选

免疫了GII.3病毒样颗粒小鼠的脾脏细胞用来制备杂交瘤细胞。通过Elisa实验筛选杂交瘤细胞上清，从而获得能够分泌具有结合病毒能力的杂交瘤细胞株。最终，四株单抗被筛选出来，他们都能够结合GII.3病毒样颗粒。亚型鉴定显示，3A3、8D1,8C7和9B8的重链均为IgG1，轻链为kappa。

表1 分泌单抗的杂交瘤细胞株鉴定

用于分析的样品均为50ul杂交瘤培养细胞上清。

*,+：OD450＞0.15；++：OD450＞0.3；+++：OD450＞0.5。

实施例2抗GII.3单抗的特异性分析

首先通过SDS-PAGE鉴定从腹水中纯化的GII.3单抗的纯度和完整性。图1显示了四种单抗的重链和轻链分别为50KD和25KD左右。接着，通过Elisa方法检测了单抗与不同抗原的反应活性，包括GI.1，GII.3，GII.4和GII.17病毒样颗粒。图2显示8D1和8C7可以特异性识别GII.3病毒样颗粒，而3A3可以同时识别GII.3病毒样颗粒和GII.4病毒样颗粒，9B8可以同时识别GII.3病毒样颗粒和GII.17病毒样颗粒。最后，通过Western blot分析单抗与GII.4的结合情况，图3显示，四种抗体中：8D1和8C7不能识别变性后的病毒样颗粒，而3A3可以识别变性后的GII.3和GII.4，9B8可以识别变性后的GII.3和GII.17，提示8D1和8C7识别的表位可能是构象表位，而3A3和9B8识别的表位可能是线性表位。

实施例3基于单抗的夹心Elisa可以特异灵敏地检测到GII.3病毒样颗粒

通过夹心Elisa测定对单抗对病毒样颗粒的最低检出限度(当OD450＞0.15时，判为阳性)。图4显示了8D1和8C7单抗均可特异灵敏地检测到GII.3病毒样颗粒，并且具有较低的检出限度，其中，8D1和8C7的单抗的最低检出限度分别为：0.625ng和0.3125ng。

此外，实验结果进一步表明，3A3和9B8单抗在GII.3病毒样颗粒400ng的条件下没有显示明显的结合活性，说明3A3和9B8单抗的灵敏度比8D1和8C7单抗较差。

实施例4单克隆抗体的潜在中和活性

组织血型抗原(HBGA)是表达与粘膜组织和红细胞上的糖类，是诺如病毒感染所需的受体(9,10)。HBGA的结合抑制试验被广泛用作为抗体介导的诺如病毒的替代中和试验(11-13)。猪胃粘液素III中含有HBGA(14-16)，已经被验证可以用于替代中和试验(17)。通过替代中和试验分别对3A3、8D1,8C7和9B8四种单抗的潜在中和活性进行检测。图5显示，8D1和8C7对GII.3具有一定的潜在中和活性，它们阻止病毒样颗粒与PGMIII结合的EC50(达到50％抑制率时抗体的最低浓度)分别是：0.1875ug/ml和0.2430ug/ml，8D1和8C7的中和活性没有显著差异，均较好，而3A3和9B8单抗在4ug/ml的条件下没有显示明显的中和活性，说明3A3和9B8单抗中和活性较差。

与3A3、8C7和9B8单抗的中和活性相比，优选8D1单抗进行进一步研究。

实施例5单克隆抗体的基因序列分析

克隆出来的8D1的单抗的重链和轻链序列如下(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，

为恒定区序列)：

8D1单抗重链核苷酸序列：

GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCAGTACTTATCTTATACACTGGGTGAAACAGAAACCTGGGCGGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTATAATGATGGTCCTAAGTACGAACAGAAGTTCAAAGGCAGGGCCACACTGACTTCAGACAGATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACGGTATGATTACGACGGGGACTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO.:19)

8D1单抗重链氨基酸序列：

8D1单抗轻链核苷酸序列：

GACATCTTGCTGACTCAGTCTCCAGCCATCCTGTCTGTGAGTCCAGGAAAAAGAGTCAGTTTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAACATTGGCACAAGCATCCACTGGTATCAGCACAGAACAAATGGTTCTCCAAGGCTTCTCATAAAGTATGCTTCTGAGTCTATCTCTGGGACCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGGACAGATTTTACTCTTAGCATCAACAGTGTGGAGTCTGAAGATATTGCAGATTATTACTGTCAACAAACTAATAGCTGGCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTAGAAATA(SEQ ID NO.:20)

8D1单抗轻链氨基酸序列：

进一步分析8D1单抗重链可变区和轻链可变区序列，8D1单抗重链可变区氨基酸如下(下划线标注的为重链CDR区)：

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFSTYLIHWVKQKPGRGLEWIGYINPYNDGPKYEQKFKGRATLTSDRSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARRYDYDGDWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO.:7)

上述重链可变区属于IGHV1亚群。

8D1单抗轻链可变区氨基酸如下(下划线标注的为重链CDR区)：

上述轻链可变区属于IGKV5亚群。

各CDR区氨基酸序列和核苷酸序列总结于表2。

表2

实施例6单克隆抗体基因的重组表达及鉴定

为了验证所克隆出的8D1单抗的基因是否正确，将重链和轻链的编码序列分别插入到pcDNA3.1中，构建表达载体pcDNA3.1-m8D1H和pcDNA3.1-m8D1L，然后共转染293T细胞，并通过ELISA检测细胞上清中是否有特异性结合GII.3病毒样颗粒的抗体存在。图6显示，表达8D1单抗序列的细胞上清有很高的结合信号，而且与上清的稀释倍数相关；而没有转染相关质粒的对照细胞的上清不管是否稀释都没有结合信号。该结果说明了所扩增和表达的序列确实为8D1单抗的基因。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 抗诺如病毒GII.3鼠源单克隆抗体的制备和应用

<130> P2017-2163

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr Leu

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Pro

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Ala Arg Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Gln Asn Ile Gly Thr Ser

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Tyr Ala Ser

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Leu Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Pro Lys Tyr Glu Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Lys Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Thr Ser

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln His Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn Ser Trp Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105

<210> 9

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Ser Thr Tyr Leu Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Arg Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Pro Lys Tyr Glu

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Arg Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Trp Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro

130 135 140

Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser

145 150 155 160

Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala

210 215 220

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp

225 230 235 240

Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val

245 250 255

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr

260 265 270

Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu

275 280 285

Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln

290 295 300

Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser

305 310 315 320

Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys

325 330 335

Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro

355 360 365

Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met

370 375 380

Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr

405 410 415

Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn

420 425 430

Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu

435 440 445

His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 10

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Met Val Ser Thr Pro Gln Phe Leu Val Phe Leu Leu Phe Trp Ile Pro

1 5 10 15

Ala Ser Arg Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser

20 25 30

Val Ser Pro Gly Lys Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn

35 40 45

Ile Gly Thr Ser Ile His Trp Tyr Gln His Arg Thr Asn Gly Ser Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Thr Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn

85 90 95

Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

100 105 110

Ser Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Ile Arg

115 120 125

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

130 135 140

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

165 170 175

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

195 200 205

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

210 215 220

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230

<210> 11

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

atggaatgga gttggatatt tctctttctc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccactctgag 60

gtccagctgc agcagtctgg acctgaactg gtaaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggatacac attcagtact tatcttatac actgggtgaa acagaaacct 180

gggcggggcc ttgagtggat tggatatatt aatccttata atgatggtcc taagtacgaa 240

cagaagttca aaggcagggc cacactgact tcagacagat cctccagcac agcctacatg 300

gagctcagca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag acggtatgat 360

tacgacgggg actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc 420

aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 480

atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 540

aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 600

tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 660

tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 720

tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 780

ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 840

gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 900

cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 960

gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1020

agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1080

gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1140

ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1200

gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1260

ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1320

tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1380

cctggtaaa 1389

<210> 12

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

atggtatcca cacctcagtt ccttgtattt ttgcttttct ggattccagc ctccagaggt 60

gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaaa aagagtcagt 120

ttctcctgca gggccagtca gaacattggc acaagcatcc actggtatca gcacagaaca 180

aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gaccccttcc 240

aggtttagtg gcagtgggtc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 300

gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa actaatagct ggccgtacac gttcggaggg 360

gggaccaagc tagaaataat acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480

cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540

aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600

ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 702

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

ggatacacat tcagtactta tctt 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

attaatcctt ataatgatgg tcct 24

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

gcaagacggt atgattacga cggggactgg tttgcttac 39

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

cagaacattg gcacaagc 18

<210> 17

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

tatgcttct 9

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

caacaaacta atagctggcc gta 23

<210> 19

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggata cacattcagt acttatctta tacactgggt gaaacagaaa 120

cctgggcggg gccttgagtg gattggatat attaatcctt ataatgatgg tcctaagtac 180

gaacagaagt tcaaaggcag ggccacactg acttcagaca gatcctccag cacagcctac 240

atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagacggtat 300

gattacgacg gggactggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360

<210> 20

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

gacatcttgc tgactcagtc tccagccatc ctgtctgtga gtccaggaaa aagagtcagt 60

ttctcctgca gggccagtca gaacattggc acaagcatcc actggtatca gcacagaaca 120

aatggttctc caaggcttct cataaagtat gcttctgagt ctatctctgg gaccccttcc 180

aggtttagtg gcagtgggtc agggacagat tttactctta gcatcaacag tgtggagtct 240

gaagatattg cagattatta ctgtcaacaa actaatagct ggccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tagaaata 318

<210> 21

<211> 548

<212> PRT

<213> 诺如病毒(Norovirus)

<400> 21

Met Lys Met Ala Ser Asn Asp Ala Thr Pro Ser Asn Asp Gly Ala Ala

1 5 10 15

Gly Leu Val Pro Glu Ile Asn Asn Glu Ala Met Ala Leu Asp Pro Val

20 25 30

Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ala Pro Leu Thr Gly Gln Gln Asn Ile Ile

35 40 45

Asp Pro Trp Ile Met Asn Asn Phe Val Gln Ala Pro Gly Gly Glu Phe

50 55 60

Thr Val Ser Pro Arg Asn Ser Pro Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Glu

65 70 75 80

Leu Gly Pro Glu Ile Asn Pro Tyr Leu Ala His Leu Ala Arg Met Tyr

85 90 95

Asn Gly Tyr Ala Gly Gly Phe Glu Val Gln Val Val Leu Ala Gly Asn

100 105 110

Ala Phe Thr Ala Gly Lys Ile Ile Phe Ala Ala Ile Pro Pro Asn Phe

115 120 125

Pro Ile Asp Asn Leu Ser Ala Ala Gln Ile Thr Met Cys Pro His Val

130 135 140

Ile Val Asp Val Arg Gln Leu Glu Pro Val Asn Leu Pro Met Pro Asp

145 150 155 160

Val Arg Asn Asn Phe Phe His Tyr Asn Gln Gly Ser Asp Ser Arg Leu

165 170 175

Arg Leu Val Ala Met Leu Tyr Thr Pro Leu Arg Ala Asn Asn Ser Gly

180 185 190

Asp Asp Val Phe Thr Val Ser Cys Arg Val Leu Thr Arg Pro Ser Pro

195 200 205

Glu Phe Ser Phe Asn Phe Leu Val Pro Pro Thr Val Glu Ser Lys Thr

210 215 220

Lys Pro Phe Thr Leu Pro Ile Leu Thr Ile Ser Glu Met Ser Asn Ser

225 230 235 240

Arg Phe Pro Val Pro Ile Asp Ser Leu His Thr Ser Pro Thr Glu Asn

245 250 255

Ile Val Val Gln Cys Gln Asn Gly Arg Val Thr Leu Asp Gly Glu Leu

260 265 270

Met Gly Thr Thr Gln Leu Leu Pro Ser Gln Ile Cys Ala Phe Arg Gly

275 280 285

Val Leu Thr Arg Ser Thr Ser Arg Ala Ser Asp Gln Ala Asp Thr Ala

290 295 300

Thr Pro Arg Leu Phe Asn Tyr Tyr Trp His Ile Gln Leu Asp Asn Leu

305 310 315 320

Asn Gly Thr Pro Tyr Asp Pro Ala Glu Asp Ile Pro Gly Pro Leu Gly

325 330 335

Thr Pro Asp Phe Arg Gly Lys Val Phe Gly Val Ala Ser Gln Arg Asn

340 345 350

Pro Asp Ser Thr Thr Arg Ala His Glu Ala Lys Val Asp Thr Thr Ala

355 360 365

Gly Arg Phe Thr Pro Lys Leu Gly Ser Leu Glu Ile Ser Thr Glu Ser

370 375 380

Gly Asp Phe Asp Gln Asn Gln Pro Thr Arg Phe Thr Pro Val Gly Ile

385 390 395 400

Gly Val Asp His Glu Ala Asp Phe Gln Gln Trp Ser Leu Pro Asp Tyr

405 410 415

Ser Gly Gln Phe Thr His Asn Met Asn Leu Ala Pro Ala Val Ala Pro

420 425 430

Asn Phe Pro Gly Glu Gln Leu Leu Phe Phe Arg Ser Gln Leu Pro Ser

435 440 445

Ser Gly Gly Arg Ser Asn Gly Ile Leu Asp Cys Leu Val Pro Gln Glu

450 455 460

Trp Val Gln His Phe Tyr Gln Glu Ser Ala Pro Ala Gln Thr Gln Val

465 470 475 480

Ala Leu Val Arg Tyr Val Asn Pro Asp Thr Gly Arg Val Leu Phe Glu

485 490 495

Ala Lys Leu His Lys Leu Gly Phe Met Thr Ile Ala Lys Asn Gly Asp

500 505 510

Ser Pro Ile Thr Val Pro Pro Asn Gly Tyr Phe Arg Phe Glu Ser Trp

515 520 525

Val Asn Pro Phe Tyr Thr Leu Ala Pro Met Gly Thr Gly Asn Gly Arg

530 535 540

Arg Arg Val Gln

545

Claims

1.一种特异性结合诺如病毒GII.3的抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.1所示的CDR1，

SEQ ID NO.2所示的CDR2，

SEQ ID NO.3所示的CDR3；和

(2)轻链可变区，所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO.4所示的CDR1’，

SEQ ID NO.5所示的CDR2’，和

SEQ ID NO.6所示的CDR3’。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体具有：重链，所述重链具有重链可变区和重链恒定区；和轻链，所述轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。

3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.:9所示。

6.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.:10所示。

7.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体对诺如病毒GII.3特异抗原与PGM结合抑制的EC₅₀为100-300ng/ml。

8.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.7所示；并且所述抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.:8所示。

9.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的抗体的序列；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

10.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：

(1)如权利要求1所述的抗体；或

(2)如权利要求9所述的重组蛋白。

11.一种载体，其特征在于，它含有权利要求10所述的多核苷酸。

12.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求11所述的载体或基因组中整合有权利要求10所述的多核苷酸。

13.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：

(a)如权利要求1所述的抗体、或如权利要求9所述的重组蛋白；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、或酶。

14.如权利要求13所述的免疫偶联物，其特征在于，所述可检测标记物包括放射性核素。

15.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：

(i)如权利要求1所述的抗体、如权利要求9所述的重组蛋白、或如权利要求13所述的免疫偶联物；以及

(ii)药学上可接受的载体。

16.如权利要求1所述的抗体、如权利要求9所述的重组蛋白、或如权利要求13所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

所述药剂用于治疗或预防诺如病毒感染。

17.一种非诊断的检测样品中诺如病毒GII.3特异抗原的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)将样品与权利要求1所述的抗体接触；

18.一种重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求12所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求1所述的抗体或权利要求9所述的重组蛋白。