JP6224645B2 - ワクチンおよび遺伝子療法用の組換えインフルエンザウイルス - Google Patents

ワクチンおよび遺伝子療法用の組換えインフルエンザウイルス Download PDF

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Description

本発明は、感染性インフルエンザウイルスの作製方法および該ウイルスの調製物に関する。
クローン化したcDNAから感染性のRNAウイルスを作成する能力は、このような病原体の生物学的な理解に大きく寄与し、疾患の制御の改善法に大きく寄与ししてきた（Palese et al.,1996）。しかしこの過程は、ゲノムウイルスRNA（vRNA）も（−）−センスRNAウイルスのアンチゲノミック相補的RNA（cRNA）も、タンパク質合成の直接の鋳型として役立つことができないので、（＋）−センスRNAウイルスに比べて（−）−センスは比較的限定されてきた。それどころかvRNAはウイルス核タンパク質（NP）によるカプシド化の後に、ウイルスRNAポリメラーゼ複合体により（＋）−センスmRNAに転写されなければならない。すなわち最小複製単位は、NPおよびポリメラーゼタンパク質と複合化したゲノムvRNAにより形成される。このような障害物にもかかわらず、非分離（または「非分節」ともいう）（−）センスRNAウイルスを生産するために、狂犬病ウイルス（Snell et al.,1994）、水疱性口内炎ウイルス（Lawson et al.,1995)； Whelan et al.,1995)、はしかウイルス（Radecke et al.,1995)、ＲＳウイルス（respiratory syncytial virus）（Collins et al.,1995）、センダイウイルス（Garcin et al.,1995；Kato et al.,1996）、牛疫ウイルス（Baron et al.,1997）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（Hoffman et al.,1997）およびＳＶ５（He et al.,1997）を含む逆遺伝学手法が確立された。
オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、アレナウイルス科（Arenaviridae）およびブンヤウイルス科（Bunyaviridae）のファミリーは、分離（または「分節」ともいう）した（−）鎖RNAゲノムを含み、そして数種のヒトおよび動物病原体、例えばインフルエンザウイルスＡ、ＢおよびＣ型（オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae））、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）（アレナウイルス科（Arenaviridae））、および脳炎および出血性熱ウイルス（ブンヤウイルス科（Bunyaviridae）、アレナウイルス科（Arenaviridae））を含む。それらのゲノムは２つ（アレナウイルス科（Arenaviridae））、３つ（ブンヤウイルス科（Bunyaviridae））、または６〜８つ（オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae））の負の極性の１本鎖RNA分子から成る（mRNAに相補的）。vRNAはNPおよびウイルスRNA-依存的RNA-ポリメラーゼと相互作用して、リボ核タンパク質複合体（RNP)を形成する。このRNPは宿主細胞に由来する脂質二重層に囲まれている。このエンベロップに挿入されているのが糖タンパク質であり、これらはレセプターの結合および宿主細胞への侵入に必須である。このように分離された（−）−センスRNAウイルスをクローン化されたcDNAから生成することは、各遺伝子セグメントについて分離したvRNAを生成しなければならないので、おそろしく難しい問題を提起する。
Bridgen および Elliott（1996）は、アンチゲノムな（＋）−センスRNAの３つのセグメントをコードするクローン化cDNAからブンヤウエラウイルス（ブンヤウイルス科（Bunyaviridae）)を生産した。しかしウイルス回収の効率は低かった。（−）−センスRNAの６つ（トゴトウイルス：thogotovirus）、７つ（インフルエンザＣ型ウイルス）または８つ（インフルエンザＡおよびＢ型ウイルス）のセグメントを含むオルトミクソウイルスのいずれも、クローン化されたcDNAから完全に生産されなかった。この進行におけるずれが、インフルエンザウイルス感染を制御するための努力の中で最も急がれている。
Paleseおよび共同研究者は（Enami et al.,1990）、インフルエンザＡ型ウイルスに関する逆遺伝のヘルパーウイルス−依存的系の開拓した（図１Ａ）。彼らの取り組みでは、
RNP複合体を精製されたポリメラーゼおよびNPタンパク質の存在下でインビトロvRNA合成により生成し、そして次いでそれらを使用して真核細胞を感染させる。続いてインフルエンザＡ型ヘルパーウイルスの感染により、クローン化cDNAから誘導された遺伝子を保有するウイルスの作成をもたらす。Neumann et al.,(1994)により開発された第２の方法は、RNAポリメラーゼI（5'キャップおよび3'ポリAテイルの両方を欠くリボゾームRNAを転写する細胞性酵素）によるvRNAのインビトロ合成に基づく。インフルエンザウイルスに感染し、そしてクローン化されたインフルエンザウイルスcDNA（マウスRNAポリメラーゼIプロモーターおよび終結配列に挟まれている）を含むプラスミドでトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクション体ウイルスの生産を導いた。しかし両方法とも、トランスフェクション体は膨大な数のヘルパーウイルスのバックグラウンドから選択されなければならず、これは強力な選択系を必要とし、そして成長−欠損性ウイルスの作成を複雑にする。
複製−できない（incompetent）ウイルス様粒子(VLP)を生成するための系は、Mena et al.(1996)により開発され、ここでレポーター遺伝子をコードするインフルエンザウイルス−様vRNAがインビトロで転写され、そして真核細胞中にトランスフェクトされる。すべての１０個のインフルエンザウイルスタンパク質は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下でプラスミドから発現する。トランスフェクトされた細胞を、T7 RNAポリメラーゼを発現した組換えワクシニアウイルスに感染させる時、細胞はインフルエンザVLPを生産した。しかしこの系の効率は低く；実験の25％で、研究者はレポーター遺伝子発現を検出できなかった。さらに、ワクシニアウイルスは80以上のタンパク質を発現し、そのいずれもがインフルエンザウイルスの生活環に影響を及ぼし得る。
このように、必要とされているのは分離された（または「分節型」ともいう）（−）鎖RNAウイルス、例えばインフルエンザＡ型ウイルスのようなオルトミクソウイルスを、クローン化されたcDNAから完全に調製するための方法である。
本発明は、以下の少なくとも１つの単離され、そして精製されたベクターを提供する：転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPA cDNAに機能的（以下、「操作可能」という場合あり）に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスHA cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNA cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスM cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクターおよび転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNS cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター。cDNAはプロモーターに対してセンスまたはアンチセンス方向でよい。すなわち本発明のベクターは、オルトミクソウイルスタンパク質（センス）またはvRNA（アンチセンス）をコードすることができる。ウイルスタンパク質を発現するために任意のプロモーターを使用することができる。vRNAをコードするベクターに好適なプロモーターは限定するわけではないが、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ３プロモーターである。さらにRNAポリメラーゼIプロモーターはヒトRNAポリメラーゼIプロモーターが好ましい。vRNAをコードするベクターに好適な転写終結配列は限定するわけではないが、RNAポリメラーゼI転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列またはRNAポリメラーゼIII転写終結配列、あるいはリボザイムである。好ましくはベクターはインフルエンザcDNA、例えばインフルエンザＡ型（例えば15HAまたは9NAサブタイ
プを含む任意のインフルエンザＡ型遺伝子）、ＢまたはＣ型 DNA（FieldsのVirology( et
al.,(編集)、リッピンコット−ラベン出版（Lippincott-Raven Publ.)、フィラデルフィア、ペンシルバニア州(1996)第45および46章を参照にされたい。これは引用により本明細書に編入する）を含むが、任意のウイルスの遺伝子（１つまたは複数）を本発明のベクターまたは方法に使用できると想定される。
本発明は、本発明の複数のオルトミクソウイルスベクターを含んで成る組成物を提供する。本発明の１つの態様では、組成物は：ａ）転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスPA cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスHA cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNA cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスM cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクターおよび転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNS cDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成るベクターから選択される少なくとも２つのベクター；およびｂ）インフルエンザ ウイルスPAをコードするベクター、インフルエンザ ウイルスPB1をコードするベクターおよびインフルエンザ ウイルスPB2をコードするベクターおよびインフルエンザ ウイルスNPをコードするベクターから選択される少なくとも２つのベクター、を含んで成る。好ましくはウイルスタンパク質をコードするベクターはさらに、転写終結配列を含んで成る。インフルエンザウイルスcDNAを含んで成るベクター用のプロモーターは、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ３プロモーターを含むことが好ましい。またインフルエンザウイルスcDNAを含んで成る各ベクターは、RNAポリメラーゼI転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列またはRNAポリメラーゼIII転写終結配列、あるいはリボザイムのような転写終結配列を含んで成ることが好ましい。好ましくは、ベクターはインフルエンザDNA、例えばインフルエンザＡ型、Ｂ型またはＣ型 DNAを含んで成る。
より好ましくは、組成物は：ａ）RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPB1 cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスPB2 cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスHA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNP cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNA cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーターを含んで成るベクター、RNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスM cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーターを含んで成るベクター、およびRNA ポリメラーゼI転写終結配列に連結されたインフルエンザ ウイルスNS
cDNAに操作可能に連結されたRNA ポリメラーゼIプロモーターを含んで成るベクターから選択される少なくとも２つのベクター；およびｂ）インフルエンザ ウイルスPAをコードするベクター、インフルエンザ ウイルスPB1をコードするベクター、インフルエンザ ウイルスPB2をコードするベクター、インフルエンザ ウイルスNPをコードするベクター、イ
ンフルエンザ ウイルスHAをコードするベクター、インフルエンザ ウイルスNAをコードするベクター、インフルエンザ ウイルスM1をコードするベクター、インフルエンザ ウイルスM2をコードするベクターおよびインフルエンザ ウイルスNS2をコードするベクターから選択される少なくとも２つのベクター、を含んで成る複数のオルトミクソウイルス ベクターを含んで成る。
本発明の別の態様は、転写終結配列に連結された3'オルトミクソウイルス非-コード配列に所望する連結された5'オルトミクソウイルス非-コード配列に連結されたプロモーターを含んで成るベクターをさらに含んで成る上記の本発明の組成物を含んで成る。そのような組成物のオルトミクソウイルス複製を許容する宿主細胞への導入は、3'オルトミクソウイルス非-コード配列に連結されたcDNAに連結された5'オルトミクソウイルス非-コード配列を含んで成るベクターの配列に対応するvRNAを含んで成る組換えウイルスをもたらす。好ましくは、cDNAはアンチセンス方向である。また好ましくは、プロモーターはRNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ３プロモーターである。また転写終結配列は、RNAポリメラーゼI転写終結配列、RNAポリメラーゼII転写終結配列またはRNAポリメラーゼIII転写終結配列、またはリボザイムである。例えばcDNAは、ガン治療またはワクチンに有用なエピトープのような免疫原性エピトープをコードすることができる。
本発明の複数のベクターは物理的に結合しているか、あるいは各ベクターは個々のプラスミド上、あるいは他の例えば直線状の核酸送達媒介物上に存在することができる。
本発明はまた、インフルエンザウイルスの調製法を提供する。この方法は、細胞を本発明の複数のベクターと、例えば連続的または同時に、例えば本発明の組成物を使用して、感染性インフルエンザウイルスを生産するために効果的な量で接触させることを含んで成る。本発明はまた、組成物と接触した細胞からウイルスを単離することを含む。すなわち本発明は、単離されたウイルスならびに本発明の組成物または単離されたウイルスと接触した宿主細胞をさらに提供する。
これから記載するように、インフルエンザＡウイルスはクローン化されたcDNAから完全に調製された。本明細書に記載する逆遺伝法は高度に効率的であり、そして突然変異を任意の遺伝子セグメントに導入し、そしてインフルエンザウイルスに基づいた遺伝子送達系を開発するために使用することができる。例えばヒトの胚性腎細胞（293Ｔ）を、ヒトRNAポリメラーゼIプロモーターおよびマウスRNAポリメラーゼターミネーターで挟まれた各々がA/WSN/33(HIN)またはA/PR/8/34(H1N1)ウイルスのウイルスRNAをコードする８つのプラスミドで、ウイルス核タンパク質およびPB2、PB1およびPAウイルスポリメラーゼをコードするプラスミドと一緒にトランスフェクトした。この方法はトランスフェクションから48
時間後の上清１mlあたり、１×103より高いウイルスのプラーク形成単位（pfu）を生じる。作成されたウイルスに依存して、残りのすべてのウイルス構造タンパク質を発現するプラスミドを加えることにより、ウイルス生産に実質的な増加＞３×104pfu/mlを導いた。逆遺伝は、A/WSN/33を表すすべての他の遺伝子を持つA/PR/8/34ウイルスのPB1遺伝子を含む再集合(reassortant）ウイルスを作成するためにも使用した。さらに本発明の方法により生産されたウイルスは、PA遺伝子に突然変異を持つか、またはノイラミニダーゼタンパク質の頭に外来エピトープを保有した。
さらに非分離（−）鎖RNAウイルス（すなわちパラミクソウイルス科：Paramyxoviridae、ラブドウイルス科：Rhabdoviridae、およびフィロウイルス科：Filoviridae）、または他の分離（−）鎖RNAウイルス、例えばアレナウイルス科（Arenaviridae）およびブンヤウイルス科（Bunyaviridae）をクローン化cDNAから完全に生成するために、同じ方法を他のウイルスに使用することができる。さらにvRNAの代わりに細胞中のcRNAの発現は、ウイルス生成の効率を向上させることができる。
本発明の方法は、例えば弱毒化突然変異のウイルスゲノムへの導入によりインフルエンザウイルスの容易な操作を可能とする。さらにインフルエンザウイルスは強力な体液性および細胞性免疫を誘導するので、本発明はウイルスの自然な変異体の利用可能性といった観点からワクチンベクターとしてこのようなウイルスを大いに強化し、これは連続して遺伝子療法のために繰り返し利用することを可能とする。
すなわち本発明は、インフルエンザウイルスタンパク質を発現またはコードする、あるいはインフルエンザvRNA、天然または組換えvRNAの両方を発現またはコードする、単離され、そして精製されたベクターまたはプラスミドを提供する。すなわち本発明のベクターまたはプラスミドは、目的の遺伝子またはオープンリーディングフレーム、例えばワクチンとして有用な免疫原性ペプチドまたはタンパク質をコードする外来遺伝子を含んで成ることができる。好ましくはインフルエンザvRNAを発現するベクターまたはプラスミドは、特定の宿主細胞、例えば鳥類またはイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジのような哺乳動物またはヒトの細胞を含む霊長類細胞での発現に適するプロモーター、例えばRNAポリメラーゼIを含んで成る。また好ましくは、インフルエンザvRNAを調製するために有用なDNAを含んで成るベクターまたはプラスミドは、RNAポリメラーゼI転写終結配列を含んで成る。目的の遺伝子またはオープンリーディングフレームを含んで成るベクターまたはプラスミドには、遺伝子またはオープンリーディングフレームがインフルエンザウイルスの5'および3'非コード配列により挟まれていることが好ましく、そして遺伝子またはオープンリーディングフレームがRNAポリメラーゼIプロモーターおよびRNAポリメラーゼI転写終結配列に操作可能に連結されていることがさらに一層好ましい。
これから記載するように、293ＴはインフルエンザウイルスＡ型構造タンパク質をコードするプラスミドで、RNAポリメラーゼIプロモーターおよびターミネーターで挟まれた緑色の蛍光タンパク質（GFP）レポーター遺伝子を含むプラスミドと一緒にトランスフェクトした。RNAポリメラーゼIによる後者の構築物の細胞内の転写は、インフルエンザウイルス-様粒子にパッケージングされるGFP vRNAを生成した。上清１mlあたり104以上の感染粒子を生産するこの系は、インフルエンザウイルスの複製および粒子形成の研究に有用となり得る。またワクチン生産および改善された遺伝子療法用ベクターの開発にも有益な試みとなるかもしれない。
したがって本発明は、ゲノムに少なくとも１つの組換えDNA分子が安定に加えられた宿主細胞も提供する。組換えDNA分子は、少なくとも１つの以下の：インフルエンザウイルスHA コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止（stop）または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的
なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスNA コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスM1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスNS2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスM2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスPA コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスPB1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスPB2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；またはインフルエンザウイルスNP コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止または終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子、を含む。
好ましくは、宿主細胞はインフルエンザウイルスHA コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスNA コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスM1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスNS2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；およびインフルエンザウイルスM2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子が加えられている。好ましくは、lox部位はloxP部位である。
本発明は、感染性の複製欠損性インフルエンザウイルスの調製法も提供する。この方法は、例えばHA、NA、M1、M2、NS2、PA、PB1、PB2またはNPをコードする本発明の組換えDNA分子の少なくとも１つが加えられた宿主細胞を；Creオープンリーディングフレームを含んで成るvRNAおよび宿主細胞により発現されないインフルエンザ遺伝子を含んで成るvRNAを含んで成る組換えインフルエンザウイルスと接触させることを含んで成る。ウイルスは次に接触した宿主細胞から回収する。好ましくは、組換えウイルスはさらに、所望のオープンリーディングフレームを含んで成るvRNAを含んで成る。あるいは加えられた宿主細胞は、CreをコードするDNAセグメントに操作可能に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成るベクター、および各々が宿主細胞中には存在しないインフルエンザウイルスcDNAに操作可能に連結されたプロモーターを含んで成る複数のベクターと接触させる。次いでベクターを回収する。
本発明はまた、ゲノムに、宿主細胞表面結合タンパク質コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；融合タンパク質 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスM1 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスNS2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；およびインフルエンザウイルスM2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子が加えられた宿主細胞を提供する。好ましくはlox部位はloxP部位である。
さらに宿主細胞の別の態様は、そのゲノムに宿主細胞表面結合タンパク質および融合タンパク質 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスM1 コード領域に連結された第２loxP部位に連結された転写終結配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；インフルエンザウイルスNS2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子；およびインフルエンザウイルスM2 コード領域に連結された第２lox部位に連結された転写停止配列を含んで成るDNAセグメントに連結された第１lox部位に連結された、宿主細胞中で機能的なプロモーターを含んで成る組換えDNA分子が加えられた宿主細胞である。好ましくは、lox部位はloxP部位である。
上記の組換えDNA分子が加えられた宿主細胞は、感染性の複製欠損性インフルエンザウイルスの調製法に有用である。例えば、HA、NA、M1、M2およびNSをコードする組換えDNA分子で安定に形質転換した宿主細胞を、複数のベクター、すなわちCreオープンリーディングフレームを含んで成るvRNA、PAを含んで成るvRNA、NPを含んで成るvRNA、PB1を含んで成るvRNA、PB2を含んで成るvRNA、および場合により目的遺伝子を含んで成るvRNAを発現するベクター；そしてPA、PB1、PB2およびNPをコードするベクターと接触させる。
ヘルパーウイルスの感染を必要としない本明細書に記載するウイルスの生産法は、ウイルスの突然変異誘発法に有用であり、そしてワクチン（例えばAIDS、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ライノウイルス、フィロウイルス、マラリア、ヘルペスおよび脚および口の疾患用に）および遺伝子療法ベクター（例えば、ガン、AIDS、アデノシンデアミナーゼ、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼおよび中枢神経系の腫瘍）に有用である。
すなわち、医学療法（例えば、ワクチンまたは遺伝子療法）に使用するためのウイルスが提供される。例えば本発明は、病原体、例えばバクテリアまたは寄生体または悪性腫瘍に対して個体を免疫感作するための方法を提供する。この方法は、個体に個体を免疫感作するための量で本発明の少なくとも１つの単離されたウイルスを、場合によりアジュバントと組み合わせて投与することを含んで成る。ウイルスは病原体または腫瘍に特異的なポリペプチドによりコードされるポリペプチドを含んで成るvRNAを含んで成る。
また、内因性タンパク質の量の低下または欠失が特徴である指標または疾患を有する哺乳動物における内因性タンパク質の発現を加えるか、または増すための方法を提供する。この方法は、哺乳動物の内因性タンパク質の量を加えるか、または増加するために、効果的な量の本発明の単離されたウイルスを哺乳動物に投与することを含んで成る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本発明はまた、（＋）鎖ウイルス、例えば（＋）センスRNAウイルスの組換え生産のためのベクターおよび方法を提供する。すなわち本発明は、場合によりRNAポリメラーゼI転写終結配列を含んで成る第３DNAセグメントに操作可能に連結された、（＋）−センスRNAウイルスからの配列を含んで成る第２DNAセグメントに操作可能に連結されたRNAポリメラーゼI転写開始配列を含んで成るDNAセグメントを含んで成るベクターを提供する。また組換えウイルスを調製するために、ベクター（１つまたは複数）の使用法も提供する。この方法は、クローン化DNAおよびトランスフェクション法を使用する時に得に有用であり、すなわちRNAの取り扱いを包含する。さらにRNAポリメラーゼI転写は高度に効率的であり、そして高い忠実度を有する。ゲノムRNAがキャップ形成していない（＋）−センスRNAウイルス（例えばペスチウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス；およびポリオウイルス、リノウイルス、Ａ型肝炎ウイルスを含むピコナウイルス、および脚および口の疾患）について、完全長のゲノムをコードするcDNAをゲノムのセンス方向で、RNAポリメラーゼIプロモーターとターミネーター配列との間に挿入する。生成したプラスミドの許容宿主細胞へのトランスフェクションにより、ウイルス複製のためのゲノムRNAを生じる。多数の（＋）−センスRNAウイルスがキャップ形成されたゲノムRNA（例えばデング熱ウイルスおよび数種の脳炎ウイルスを含むフラビウイルス）を含む。RNAポリメラーゼI転写物はキャップ形成されていないが、キャップ形成したゲノムRNAを有するRNAウイルスの完全長ゲノムをコードするcDNAは、アンチゲノム−センス方向でRNAポリメラーゼI転写ベクターに導入される。生成したプラスミドのトランスフェクション後、細胞性RNAポリメラーゼIはアンチゲノム（キャップ形成されていない）RNAを転写する。さらに複製に必要なタンパク質用のタンパク質発現プラスミドとのコトランスフェクション（cotransfection）により、アンチゲノムRNAの複製をもたらし、すなわちゲノムRNAおよび最終的には感染性ウイルスを生産する。
＜発明の詳細な記述＞
定義
本明細書で使用する用語「単離および／または精製された」とは、インビボの物質を付随しないか、またはインビトロの物質から実質的に精製されるように、本発明のウイルスまたはプラスミドのインビトロの調製、単離および／または精製を称する。本明細書で使用する用語「組換え核酸」または「組換えDNA配列またはセグメント」とは、その配列が自然には存在しないか、または天然のゲノムに位置するようには配置されていない自然に存在する配列に相当するように、インビトロで後に化学的に改変された、供給源から誘導または単離された核酸、例えばDNAを称する。供給源から「誘導された」DNAの例は、有用なフラグメントであると確認され、そして次いで本質的に純粋な形態に化学的に合成されるDNA配列である。そのような供給源から「単離」されたDNAの例は、遺伝子工学の方法論により本発明の方法に使用するためにさらに操作、例えば増幅できるように、該供給源から化学的手段、例えば制限エンドヌクレアーゼを使用することにより切り出されるか、または取り出される有用なDNA配列である。
本明細書で使用する「部位特異的組換え」は、以下の３つの事象を含むことを意図する：１）部位特異的組換え部位または配列、例えばloxP部位により挟まれた標的DNAセグメントの欠失；２）部位特異的組換え部位または配列、例えばlox部位により挟まれた標的DNAセグメントのヌクレオチド配列の逆転；および３）異なるDNA分子に位置する部位特異的組換え部位または配列、例えばlox部位に近い標的DNAセグメントの相互交換。部位特異的組換え酵素系には限定する訳ではないが、バクテリオファージP1のCre/loxP系を含む（米国特許第5,658,772号明細書）。
部位特異的組換え反応の可逆性を改善するために、組換え系の構造を改変することができる。この部位特異的組換え配列は、組換え反応の生成物が逆反応の基質としてもはや認識されず、これにより組込みまたは切り出しの事象を安定化させる様式で突然変異させることができる。例えば望ましくない配列を除去するために、同じ方向のlox部位は、望ましくない配列を挟むように配置される。
他のlox部位は、大腸菌（E.coli）から単離されたヌクレオチド配列であるloxB、loxLおよびloxR部位を含む（Hoess et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,3398(1982))。lox部位は、当該技術分野で知られている種々の合成法により生成することもできる。例えばlox部位を生成するための合成法は、Ito et al.によりNuc.Acids Res.10,1755(1982)およびOgilvie et al.,Science,214、270(1981)に記載されている。
本明細書で使用する表現「lox部位」は、cre遺伝子の遺伝子産物が部位特異的組換えを触媒できるヌクレオチド配列を意味する。LoxPはバクテリオファージP1から当該技術分野で既知の方法により単離することができる34塩基対の配列である（例えばHoess et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,3398(1982)を参照にされたい）。LoxPは、８塩基対のスペーサー領域により分けられた２つの13塩基対の逆方向反復配列から成る。
本明細書で使用するように発現「cre遺伝子」とは、lox部位で真核細胞中のDNAの部位特異的組換えを行う酵素的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を意味する。cre遺伝子はクテリオファージP1から当該技術分野で既知の方法により単離することができる（Abremaid et al.,Cell,32,1301-1311(1983)を参照にされたい）。
インフルエンザウイルスの複製
インフルエンザＡ型ウイルスは、全部で10種のタンパク質をコードする８つの１本鎖（−）−センスウイルスRNA（vRNA）のゲノムを保有する。このインフルエンザウイルスの生活環は、赤血球凝集素（HA)の宿主細胞の表面上のシアル酸を含有するレセプターへの結合から始まり、レセプターが媒介するエンドサイトーシスが続く。後期エンドソーム内の低pHがHAの構造的ずれを誘発し、これによりHA2サブユニットのN-末端が露出する（いわゆる融合ペプチド）。融合タンパク質はウイルスおよびエンドソーム膜の融合を開始し、そしてマトリックスタンパク質（M1）およびRNP複合体が細胞質に放出される。RNPはvRNAをカプシド化する核タンパク質(NP)およびウイルスポリメラーゼ複合体（PA、PB1およびPB2タンパク質により形成される）から成る。RNPは核に輸送され、ここで転写および複製が起こる。RNAポリメラーゼ複合体は３つの異なる反応を触媒する：5'キャップおよび3'ポリA構造を持つmRNAの合成、完全長の相補的RNA（cRNA）の合成および鋳型としてcDNAを使用したゲノムvRNAの合成。新たに合成されたvRNA、NPおよびポリメラーゼタンパク質は次いでRNAに集成され、核から輸出され、そして細胞質膜へ輸送され、ここで子孫ウイルス粒子の分離（budding）が起こる。ノイラミニダーゼ(NA)タンパク質は、シアリルオリゴ糖からシアル酸の除去により感染の後期に重要な役割を演じ、これにより新たに集成されたビリオンが細胞表面から放出されウイルス粒子自体の凝集を防ぐ。ウイルス集成体はタンパク質−タンパク質およびタンパク質−vRNA相互作用に関与するが、このような相互作用の性質は、大部分が未知である。
トゴソウイルス（thogotovirus）
トゴソウイルス（THOV）は、オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）のファミリーの新しい属である。それらはダニにより伝播し、そしてラクダ、ヤギおよび家禽のような家畜動物で見いだされた。この結果、THOVはダニおよび脊椎動物の細胞中で複製できる。THOVのゲノムは１本鎖の（−）−センスRNAの６セグメントから成る。３つの最大セグメントによりコードされるタンパク質は、インフルエンザウイルスのポリメラーゼタンパク質PB2、PB2およびPAと有意な相同性を示す。セグメント５はインフルエンザウイルスNPに関連するタンパク質をコードする。セグメント４によりコードされるTHOVの糖タンパク質は、インフルエンザHAまたはNAとも相同的ではないが、バキュロウイルスの糖タンパク質と類似する配列を表す。最小のセグメントはマトリックスタンパク質をコードすると考えられ、そしてインフルエンザウイルスのタンパク質のいずれにも似ていない。インフルエンザウイルスのように、vRNAの3'および5'末端の両方がプロモーター活性に必要であり、そしてこの活性はvRNAの3'および5'末端の末端14および15ヌクレオチドにそれぞれ位置する。
THOVのmRNA合成は、宿主細胞に由来するキャップ構造により始められる(primed）。しかしインフルエンザウイルスとは対照的に、キャップ構造のみ（さらなるヌクレオチド無し）で細胞性mRNAから開裂される（Albo et al.,1996;Leahy et al.,1997;Weber et al.,1996)。インビトロの開裂アッセイでは、vRNAの5'および3'の両方にエンドヌクレアーゼ活性が必要であることが明らかとなったが（Leahy et al.,1998）、インフルエンザウイルスで示されたように（Cianci et al.,1995;Hagen et al.,1994）、モデルcRNAプロモーターの付加はエンドヌクレアーゼ活性を刺激しない（Leahy et al.,1998)。THOVについては「ホック」構造が提案され（Leahy et al.,1997;Weber et al.,1997)、これはインフルエンザウイルスについて提案されたコルクスクリュー構造に類似する（Fick et al.,1996)。しかしこの「ホック」構造は、THOV vRNAプロモーターでのみ見いだされる。cRNAプロモーター配列はcRNAの5'末端で２と９位との間、および３と８位との間の塩基対を形成させない。代わりの３または８位ではこのようなヌクレオチド間の塩基対を可能とし、エンドヌクレアーゼ活性を刺激し、これは提案された「ホック」構造の証拠を強力に支持している（Leahy et al.,1998)。さらにこの構造はTHOVの生活環の調節に重要であるかもしれない；「ホック」構造を形成するvRNAプロモーターは、PB2エンドヌクレアーゼ活性を刺激し、これにより転写を可能とする。対照的にcRNAプロモーターは「ホック」構造を形成できず、したがってエンドヌクレアーゼ活性を刺激することができず、すなわち複製をもたらす。
ブンヤウイルス科（Bunyavirisae)
ブンヤウイルス科（Bunyavirisae)ファミリーには、ヒトの出血性および脳炎熱（例えば、リフトバレー、ハンターン(Hantaan)、ラクロス（La Crosse）およびクリミア−コンゴ出血性熱）を引き起こす数種のウイルスが含まれる。球状で、しかもエンベロープに包まれたビリオンは、１本鎖の（−）−センスRNA（Elliot,1997を参照にされたい）の３つのセグメントを含む。最大のセグメント（Ｌ）はウイルスRNAポリメラーゼタンパク質（Ｌタンパク質）をコードし、Ｍセグメントは２つのウイルス糖タンパク質G1およびG2、および非構造タンパク質（NSm)をコードする。最小のセグメント（Ｓ）は、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）および第２非構造タンパク質（NSs)をコードする。ウイルスの複製および転写は細胞質で起こり、そして新しく集成したビリオンは、ゴルジ装置の膜を通って出芽する（bud）。
Bridgen & Elliott(1996)は、クローン化されたcDNAから感染性のブンヤウエラウイルスを完全に作成するための逆遺伝系を確立した。彼らは最初に、狂犬病ウイルスに関してSchnell et al.(1994）により記載された方法に従った；（＋）−センスアンチゲノムRNA（（−）−センスゲノムRNAではなく）をコードするcDNAの、ウイルスポリメラーゼおよび核タンパク質を発現している細胞中での細胞内転写。Bridgen & Elliott(1996)は、HeLaT4+細胞を、Ｔ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスで感染させ、そしてこれらの細胞をＳ、ＭおよびＬセグメントによりコードされるタンパク質を発現しているプラスミドを用いてトランスフェクトした。次いで彼らはこれらの細胞を、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターおよび肝炎デルタウイルスリボザイムにより挟まれた完全長のアンチ−ゲノムcDNAをコードする３つのプラスミドで感染させた。ワクシニアウイルス粒子数に対してブンヤウイルス粒子数を増すために、著者らは、ブンヤウエラは複製するがワクシニアウイルスはしない蚊の細胞を使用した。このプロトコールはブンヤウイルス科（Bunyaviridae)を遺伝子的に操作するだけでなく、異なるブンヤウイルス科（Bunyaviridae)の株で細胞を混合感染させる事によっては容易に得ることができない再集合（reassortant)ウイルスを生成するためにも使用することができる。
転写および複製に必要なブンヤウイルスのプロモーター要素およびウイルスタンパク質を研究するために、Dunn et al.,(1995)はブンヤウエラ S RNAセグメントの5'と3'非翻訳領域の間に（−）−センス方向でCAT遺伝子をクローン化した。細胞はＬおよびＳセグメントによりコードされたタンパク質を発現する構築物でトランスフェクトし、そして次いでインビトロにてCAT活性をもたらす転写されたRNAでトランスフェクトした。ブンヤウイルスＳセグメントは重複するリーディングフレームにある２つのタンパク質、ＮおよびNSsをコードする。これらのタンパク質の両方が転写および複製に必要であるのかどうかを決定するために、ＮまたはNSsのみを発現している構築物を、CAT活性について試験した。Ｎタンパク質発現はＬタンパク質と一緒にCAT活性を生じるが、CAT活性はNSs発現構築物では検出されなかった。すなわちＬおよびＮタンパク質は、ブンヤウイルス−様RNAの転写および複製に十分である。
インフルエンザウイルスのように、ブンヤウイルスRNAの末端配列は相補的であり、しかも高度に保存されている。したがってこれらの配列セグメント要素がブンヤウイルスのプロモーターを定め、そしてプロモーター活性に決定的であると推測された。ウイルスRNAの3'末端での５個のヌクレオチドの欠失で、CAT発現は劇的に減少する（Dunn et al.,1995）。対照的に、5'末端に２個のヌクレオチドを、または3'末端に11または35個のヌクレオチドを付加しても、CAT発現が廃止されない（Dunn et al.,1995）。したがってインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体のように、ブンヤウイルスポリメラーゼタンパク質は、明らかに転写および／または複製を内部で開始することができる。
確立された逆遺伝系の該略図である。RNAトランスフェクション法（Ａ）では、精製したNPおよびポリメラーゼタンパク質が、インビトロ−合成したvRNAの使用によりRNPに集成される。細胞をRNPでトランスフェクトし、続いてヘルパーウイルス感染を行う。RNAポリメラーゼI法（Ｂ）では、RNAポリメラーゼIプロモーター、vRNAをコードするcDNAを含むプラスミドはレスキューされ、そしてRNAポリメラーゼIターミネーターを細胞にトランスフェクトする。RNAポリメラーゼIによる細胞内転写で合成vRNAを生じ、これはヘルパーウイルスの感染で子孫ウイルス粒子にパッケージングされる。両方法により、トランスフェクション体ウイルス（すなわちクローン化されたcDNAに由来するRNAを含むもの）がヘルパーウイルス群から選択される。 RNAポリメラーゼI構築物の作成の該略図である。インフルエンザウイルスに由来するcDNAをPCRにより増幅し、BsmIで消化し、そしてpHH21ベクター（E.Hoffmann博士論文、ジャスタス、リービッヒ−大学、ゲッセン、独国）のBsmI部位でクローン化し、これはヒトRNAポリメラーゼIプロモーター（Ｐ）およびマウスRNAポリメラーゼIターミネーター（Ｔ）を含む。ターミネーター配列（＊Ｔ）のチミジンヌクレオチド上流は、インフルエンザウイルスRNAの3'末端を表す。インフルエンザＡ型ウイルス配列は、肉太活字文字で示す。 分離した（−）−センスRNAウイルスを作成するために提案された逆遺伝法。RNAポリメラーゼIプロモーター、８つの各ウイルスRNAセグメントのcDNA、およびRNAポリメラーゼIターミネーターを含むプラスミドを、タンパク質発現ベクターと一緒に細胞にトランスフェクトする。感染性ウイルスはPA、PB1、PB2およびNPを発現するプラスミドを用いて作成することができるが、残りのすべての構造タンパク質（角型カッコで示す)の発現は、生成するウイルスに依存してウイルス生産の効率を上げる。 トランスフェクション体ウイルスに感染した細胞中のFLAGエピトープの検出。抗体染色を使用してPR-WSN-FL79（Ａ、Ｄ）またはA/WSN/33野生型ウイルス（Ｂ、Ｅ）またはmock-感染MDCK細胞（Ｃ、Ｆ）のいずれかに感染したMDCK細胞中のNAを同定した。感染から９時間後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、TritonX-100で処理し、そして抗-FLAG（Ａ〜Ｃ）または抗-WSN NA（Ｄ〜Ｆ）モノクローナル抗体のいずれかとインキューベーションした。徹底的なゴルジ染色（赤）が陽性サンプルで見られる（Ａ、ＤおよびＥ）。 PA突然変異体の回収。各ウイルスのPA遺伝子は、RT-PCRにより1226bpフラグメントを生じるプライマーを用いて増幅させ（mRNAの677〜1903位、レーン１、３、５）、次いでこれを制限酵素Bsp120I（mRNAの846位、レーン４、７）またはPvuII（mRNAの1284位、レーン２、６）で消化した。PCR生成物中のBsp120IまたはPvuII部位の存在は、169bpおよび1057bpまたは607bpおよび619bpフラグメントをそれぞれ生じた。MW＝分子量マーカー。 インフルエンザ配列を増幅するために使用したプライマー。 GFPタンパク質をコードするインフルエンザウイルス-様RNAを作成するためのpPolII-GFPプラスミド。このプラスミドはGFP遺伝子（pEGFP-N1に由来する、クローンテック（Clontech）、パロ アルト、カリフォルニア州）を、ヒトRNAポリメラーゼIプロモーターおよびマウスRNAポリメラーゼIターミネーターにより挟まれたインフルエンザＡ型ウイルスセグメント５の5'および3'非コード領域の間にアンチセンス方向で含む。 VLP作成法の該略図。個々のタンパク質発現プラスミドおよびRNAポリメラーゼIプロモーター、GFPレポーター遺伝子コードするcDNAおよびRNAポリメラーゼIターミネーターを含むプラスミドを、293T細胞に感染させる。RNAポリメラーゼIによる細胞内の転写は、逆転文字に示すような負の極性のGFP vRNAを生じる。VLPを含む上清を回収し、インフルエンザヘルパーウイルスと混合し、そしてMDCK細胞に接種する。 インフルエンザＡ型ウイルスのPA、PB1、PB2およびNPタンパク質は、RNAポリメラーゼIにより生産されたGFP vRNAをカプシド化し、GFP発現を導く。293T細胞はPB2、PB1、PAおよびNPタンパク質を発現するプラスミド(Ａ)で、あるいはNPタンパク質除くすべてのプラスミドで(Ｂ)で、レポーター遺伝子vRNAの細胞内合成用のRNAポリメラーゼI-GFP遺伝子プラスミドと一緒にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションから48時間後に固定し、そしてGFP発現を蛍光顕微鏡で測定した。 感染性インフルエンザVLPの作成。293T細胞は、それぞれが異なるウイルス構造タンパク質を発現する９つのプラスミドで（Ａ）、またはNPに関する構築物を省く８つのプラスミドで（Ｂ）、RNAポリメラーゼI-GFP遺伝子プラスミドと一緒にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後にVLPを含有する上清を回収し、A/WSN/33ヘルパーウイルスと混合し、そしてMDCK細胞に接種した。細胞を感染から10時間後に固定し、そしてGFP発現を蛍光顕微鏡で測定した。 ゲノムには組換えDNA分子が加えられている細胞中のインフルエンザNS2タンパク質を発現するために、Creリコンビナーゼの使用の概略。細胞のゲノムは、NS2遺伝子に連結された第１の部位特異的組換え部位と同じ方向に、第２の部位特異的組換え部位に連結された転写停止配列に連結された部位特異的組換え部位（例えばloxP）に連結されたプロモーターを含んで成る組換えDNA分子を含んで成る。 複製欠損性インフルエンザウイルスの調製。
本発明を以下の実施例によりさらに記載する。
例１：
材料および方法
細胞およびウイルス 293Tヒト胚性腎細胞およびMadin-Darbyイヌ腎細胞（MDCK）は、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコの改良イーグル培地（DMEM）および５％ウシ新生児血清を含む改良イーグル培地でそれぞれ維持した。すべての細胞は５％CO2中にて37℃で維持した。インフルエンザウイルスA/WSN/33(H1N1)およびA/PR/8/34(H1N1)を、10日齢の卵中で増殖させた。
プラスミドの構築 RNAポリメラーゼI構築物を作成するために、A/WSN/33(H1N1)またはA/PR/8/34ウイルスRNAに由来するクローン化したcDNAを、RNAポリメラーゼIのプロモーターとターミネーター配列との間に導入した。簡単に説明すると、クローン化したcDNAはBsmBIで消化したBsmBI部位を含むプライマーを用いてPCRにより増幅し、そしてBsmBI部位により分けられたヒトRNAポリメラーゼIプロモーターおよびマウスRNAポリメラーゼIターミネーターを含むpHH21ベクターのBsmBI部位にクローン化した（図２）。A/WSN/33株のPB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MおよびNS遺伝子は、以下のプラスミドを使用することによりPCR増幅した：それぞれpSCWPB2、pGW-PB1およびpSCWPA（すべてカリフォルニア大学ロサンゼルス校のDebi Nayak博士から得た)、およびpWH17、pWNP152、pT3WNA15(Castrucci et al.,1992）、pGT3WMおよびpWNS1。インフルエンザA/PR/8/34ウイルスのPB1遺伝子は、鋳型としてpcDNA774(PB1)を使用することにより増幅させた（Perez et al.,1998)。プライマーの配列に関しては図６を参照にされたい。遺伝子に望ましくない突然変異が無いことを確認するために、PCRで誘導したフラグメントを自動シークエンサーを用いて製造元により推薦されるプロトコールに従い配列決定した(アプライドバイオシステムズ社(Applied Biosystems Inc.、カリフォルニア州、米国）。A/WSN/33ウイルスのHA、NP、NAおよびM1遺伝子を記載されているようにクローン化し（Huddleston et al.,1982)、そして真核細胞発現ベクターpCAGGS/MCS（ニワトリβ-アクチンプロモーターにより制御される)にサブクローン化し(Niwa et al.,1991）、それぞれpEWSN-HA、pCAGGS-WSN-NPO-14、pCAGGS-WNA15およびpCAGGS-WSN-M1-2/1を得た。A/PR/8/34ウイルスからのM2およびNS2遺伝子をPCRにより増幅し、そしてpCAGGS/MCSにクローン化し、pEP24cおよびpCA-NS2を得た。最後にpcDNA774(PB1）、pcDNA762(PB2）およびpcDNA787(PA）を使用して、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下にPB2、PB1およびPAタンパク質を発現させた（Perez et al.,1998)。
感染性インフルエンザ粒子の作成 293T細胞(1×106)を、製造元の指示に従いTrans IT LT-1（パンベラ:Panvera，マジソン、ウィスコンシン州）を使用して、異なる量で最大17個のプラスミドでトランスフェクトした。簡単に説明すると、DNAおよびトランスフェクション試薬を混合し（１μgのDNAあたり２μlのTrans IT-LT-1）、室温で45分間インキューベーションし、そして細胞に加えた。６時間後、DNA−トランスフェクション試薬混合物を0.3％のウシ血清アルブミンおよび0.01％ウシ胎児血清を含有するOpi-MEM（ギブコ（Gibco)/BRL、ゲチスバーグ、メリーランド州）と交換した。トランスフェクションから様々な時間で、ウイルスを上清から回収し、そしてMDCK細胞上で滴定した。ヘルパーウイルスにはこの手順が必要ではないので、回収したトランスフェクション体ウイルスはプラーク形成無しで分析した。
ウイルスを生産するプラスミド−トランスフェクト細胞の割合の決定 トランスフェクションから24時間後、293T細胞を0.02％EDTAを用いて単一細胞に分散させた。次いで細胞懸濁液を10倍に希釈し、そして24-ウェルプレート中でMDCK細胞のコンフルエントな単層に移した。ウイルスは赤血球凝集アッセイにより検出した。
免疫染色アッセイ インフルエンザウイルスの感染から９時間後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS)で２回洗浄し、そして3.7％パラホルムアルデヒド（PBS中)で室温にて20分間固定した。次いで細胞を0.1％ Triton X-100で処理し、そしてNeumann et al.,(1997)に記載されているように処理した。
結果
ウイルスRNAセグメント、３つのポリメラーゼサブユニットおよびNPタンパク質のプラスミド-駆動発現による感染性ウイルスの作成 精製したビリオンから抽出したRNPの混合物を用いた細胞のトランスフェクションは感染性のインフルエンザ粒子を生じたが、この方法はインビトロで生成された８種の異なるRNPを用いて使用した時に効率的ではないようである。cDNAから感染性インフルエンザウイルスを完全に生産するために、８つのウイルスRNPsをインビボで作成した。すなわちヒトRNAポリメラーゼIプロモーターおよびマウスRNAポリメラーゼIターミネーターにより挟まれたA/WSN/33ウイルスの完全長ウイルスRNAに関するcDNAを含むプラスミドを調製した。原理的にはこのような８つのプラスミドの真核細胞へのトランスフェクションは、８つのインフルエンザvRNAの合成をもたらすはずである。タンパク質発現プラスミドのコ−トランスフェクションにより生成したPB2、PB1、PAおよびNPタンパク質は、次いで複製し、そして転写され、最終的には感染性インフルエンザウイルスを形成する機能的vRNAに集成するはずである（図３）。１×106の293T細胞をタンパク質発現プラスミド（１μgのpcDNA762(PB2)、１μgのpcDNA774(PB1)、0.1μgのpcDNA787(PA)および１μgのpCAGGS-WSN-NP0/14)および各１μgの以下のRNAポリメラーゼIプラスミド（pPo1I-WSN-PB2、pPo1I-WSN-PB1、Po1I-WSN-PA、Po1I-WSN-HA、Po1I-WSN-NP、Po1I-WSN-NA、Po1I-WSN-MおよびPo1I-WSN-NS)を用いてトランスフェクトした。pcDNA787(PA)の量を下げて使用することの決定はこれまでの考察（Mena et al.,1996)およびウイルス−様粒子（VLPs)の作成に関する最適条件に関するデータ(データは示さず)に基づいた。293T細胞のトランスフェクションから24時間後、１mlあたり７×103pfuウイルスが上清に見いだされ（実験１、表１）、初めてインフルエンザＡ型ウイルスを完全にプラスミドから生産するための逆遺伝学の能力が示された。
Figure 0006224645
＊293T細胞は示したプラスミドでトランスフェクトした。24時間（実験１および２）または48時間（実験３〜８）後、上清のウイルス力価をMDCK細胞を用いて測定した。
†特に示さない限り、プラスミドはA/WSN/33ウイルスのRNAを表すcDNAを用いて構築した。
すべてのウイルス構造タンパク質の同時発現（coexpression）を用いたインフルエンザウイルス生産の効率 ウイルスNPおよびポリメラーゼタンパク質の発現はプラスミドが駆動するウイルスの作成に十分であるが、効率を改善し得ることが可能であった。これまでの研究では、すべてのインフルエンザウイルスの構造タンパク質（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2およびNS2）の発現は、レポーターのクロラムフェニコール−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードする人工的vRNAを含んだVLPをもたらした（Mena et al.,1996）。すなわちウイルスRNAの複製および転写に必要なタンパク質だけに代わり、構造タンパク質の全補完物の利用性がウイルス生産の効率を改善するかもしれない。このために、293T細胞を最適な量のウイルスタンパク質発現プラスミド（VLP生産により判定；非公開データ）を用いてトランスフェクトした：１μgのpcDNA762(PB2)およびpcDNA774(PB1)；0.1μgのpcDNA787(PA)；１μgのpEWSN-HA、pCAGGS-WSN-NP0/14およびpCAGGS-WNA-15；２μgのpCAGGS-WSN-M1-2/1；0.3μgのpCA-NS2；および0.03μgのpEP24c(M2用)を、各１μgのRNAポリメラーゼIプラスミドと一緒に用いてトランスフェクトした（実験２、表１）。第２組の細胞は、PB1遺伝子については再集合ウイルスを生成するためにpPo1I-PR/8/34-PB1に代えて、PA、PB1、PB2およびNPのみを発現するプラスミドと一緒に（実験３、表１）またはすべてのインフルエンザ構造タンパク質を発現するプラスミドと一緒に（実験４、表１）用いて、同じRNAポリメラーゼIプラスミドの組でトランスフェクトした。WSNウイルスの収率、トランスフェクションから24時間後（実験１および２、表１）または36時間後（データは示さず)でそれほど変わらなかった。しかしすべてのインフルエンザウイルス構造タンパク質が提供された時、PR/8/34-PB1を含むウイルスの収率は10倍以上増加することが分かった（実験３および４、表１）。NPタンパク質のPA、PB1、PB2の発現について１つのプラスミドが欠けている陰性対照は、いかなるウイルスも生じなかった（実験５〜８、表１）。すなわち生成するウイルスに依存して、すべてのインフルエンザＡ型ウイルスの構造タンパク質の発現は逆遺伝学法の効率をかなり改善する。
次に細胞のトランスフェクション後のウイルス生産の動力学を、A/PR/8/34-PB1遺伝子を含むウイルスを生産するために使用したプラスミドの組を使用して測定した。３つのうちの２つの実験で、ウイルスは最初にトランスフェクションから24時間後に検出された。この時点で測定した力価＞103pfuは、トランスフェクションから48時間後までに＞106pfuに上昇した（表２）。ウイルス生産するプラスミド−トランスフェクト細胞の割合を予測するために、293T細胞をEDTA(0.02％)でトランスフェクションから24時間後に処理して細胞を分散させ、そして次いで限界希釈実験を行った。この実験では、この時点で培養上清中に遊離ウイルスが見られなかった。この結果は、103.3細胞中１つが感染性のウイルス粒子を生成していることを示した。
Figure 0006224645
＊293T細胞は、PB1遺伝子を除き(これはA/PR/8/34ウイルスに由来する)、A/WSN/33ウイルス遺伝子をコードする８つのRNAポリメラーゼIプラスミド、および９つのタンパク質発現プラスミドを用いて、明細書中に記載したようにトランスフェクトした。異なる時点で、MDCK細胞における培養上清中のウイルスを滴定した。ＮＤ＝行わず。
NAタンパク質中にFLAGエピトープを含むインフルエンザウイルスの回収 新規な逆遺伝学系がインフルエンザＡ型ウイルスのゲノムに突然変異の導入を可能としたことを確認するために、NAタンパク質にFLAGエピトープ（Castrucci et al.,1992）を含有するウイルスを作成した。293T細胞を、NAタンパク質およびFLAGエピトープの両方をタンパク質ヘッドの底にコードするcDNAを含むRNAポリメラーゼIプラスミド（Po1I-WSN-NA/FL79）で、必要なRNAポリメラーゼIおよびタンパク質発現プラスミドと一緒にトランスフェクトした。回収したウイルス（PR8-WSN-FL79)が実際にNA-FLAGタンパク質を発現したことを確認するために、PR8-WSN-FL79またはA/WSN/33野生型ウイルスに感染した細胞の免疫染色アッセイを行った。FLAGエピトープに対するモノクローナル抗体はPR8-WSN-FL79に感染した細胞を検出したが、野生型ウイルスに感染した細胞を検出しなかった（図４）。PR8-WSN-FL79ウイルスの回収は、標識していない野生型ウイルスの回収と同程度に効率的であった（データは示さず）。このような結果は、新たな逆遺伝学系がインフルエンザＡ型ウイルスのゲノムに突然変異を導入することを可能にすることを示す。
PA遺伝子中に突然変異を含む感染性インフルエンザウイルスの作成 PA遺伝子中に突然変異を保有する感染性ウイルスを生産するために、２つのサイレント突然変異を導入して、制限エンドヌクレアーゼに関する新規認識配列を作成した（mRNAの846位でBsp120Iおよび1284位でPvuII)。これまでは信頼できる選択系が無かったので、逆遺伝学系によりこの遺伝子を修飾することは可能ではなかった。トランスフェクション体ウイルス、PA-T846CおよびPA-A1284が回収された。回収されたトランスフェクション体ウイルスは、２つの連続する限界希釈により生物学的にクローン化した。回収したウイルスが正にPA遺伝子に突然変異を有するトランスフェクション体であることを確認するために、PA遺伝子のcDNAを逆転写酵素-PCRにより得た。図５に示すように、新たに導入された制限部位の存在により示されるように、PA-T846CおよびPA-A1284CウイルスはPA遺伝子中に期待された突然変異を有した。逆転写工程が無い同じウイルスサンプルおよびプライマーのPCRは、いかなる生成物も生産できず（テータは示さず）、PAcDNAがウイルスを作成するために使用したプラスミドに代わり正にvRNAに由来することを示している。このような結果は、突然変異した遺伝子をもつウイルスがヘルパーウイルスを使用することなくどのように生産でき、そして回収できるのかを具体的に説明している。
考察
本明細書に記載した逆遺伝学系は、インフルエンザＡ型ウイルスを完全にクローン化cDNAから効率よく生産することを可能にする。Bridgen および Elliott(1996)も、ブンヤウエラウイルスを作成するための逆遺伝学系を使用したが（ブンヤウイルス科(Bunyaviridae)のファミリー）、それは（−）−センスRNAのわずか３セグメントを含み、その生産の効率は低かった（102pfu/107細胞）。ウイルスの収率は実験間で異なったが、一環して＞103pfu/106細胞がインフルエンザウイルスについては観察され、これらは８つのセグメント含む。上記の高い効率の逆遺伝学系については、いくつかの説明がある。インビトロでRNPを生産する代わりに（Luytjes et al.,1989）、RNPはRNAポリメラーゼIを使用したvRNAの細胞内合成を通して、およびウイルスポリメラーゼタンパク質およびNPのプラスミドが駆動する発現を通してインビボで生成された。またプラスミドで容易にトランスフェクトされる293T細胞（Goto et al.,1997）の使用により、確実に大多数の細胞群がウイルス生産に必要なすべてのプラスミドを受容した。さらに成長している細胞の中でも最も豊富に発現されるRNAポリメラーゼIにより生成される多数の転写物が、系の全体的な効率に貢献しているようである。このような特徴は、対応して豊富な数のvRNA転写物およびvRNAのカプシド化に十分な量のウイルスタンパク質、核内のRNPの形成および細胞膜へのこれらの複合体の輸出（ここで新規ウイルスが集成され、そして放出される）を導いた。
これまでに確立された逆遺伝学系（Enami et al.,1990；Neumann et al.,1994；Luytjes et al.,1989；Pleschka et al.,1996）はヘルパーウイルスの感染、したがって膨大な数のヘルパーウイルスから少数のトランスフェクション体を回収することを可能とする選択法を必要とする。そのような方法は以下のcDNA−由来遺伝子の１つを保有するインフルエンザウイルスを生成するために使用された：pB2（Subbarao et al.,1993)、HA（Enami et al.,1991;Horimoto et al.,1994)、NP（Li et al.,1995)、NA（Enami et al.,1990)、M(Castrucci et al.,1995:Yasuda et al.,1994）およびNS(Enami et al.,1991）。HAおよびNA遺伝子に応用できるものを除きほとんどの選択法が、生育温度、宿主域の制限または薬剤感受性に依存し、すなわち遺伝子産物の機能的分析に関して逆遺伝の用途を限定する。たとえ信頼性のある抗体−駆動選択系を利用することが可能なHAおよびNA遺伝子を用いても、顕著な成長欠損を持つウイルスを生産することは難しい。対照的に本明細書に記載する逆遺伝系は、ヘルパーウイルスを必要とせず、そして突然変異を任意の遺伝子セグメントに持つ、または重度の成長欠損を持つトランスフェクション体を生成することを可能とする。この利点を図５に示し、これは突然変異したPA遺伝子を持つトランスフェクション体ウイルスの回収を示す。任意の実施可能な（viable）突然変異をインフルエンザＡ型ウイルスゲノムへ導入するための技法を有することにより、研究者達はウイルスゲノムの非翻訳領域中の調節配列の性質、ウイルスタンパク質の構造−機能の関係および宿主域の制限およびウイルスの病原性の分子学的基礎のような多数の長い間存在した問題に取り組むことを可能とするだろう。
不活性化されたインフルエンザワクチンは利用可能であり、それらの効力は部分的には局所的なIgAおよび細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する限られた能力により最適には及ばない。現在進行中の風邪に適合した生のインフルエンザワクチンの臨床試験では、ワクチンがインフルエンザの症状を引き起こさず、しかし防御免疫を誘導するように、そのようなワクチンが最適に弱毒化されることを示唆している（Keitel & Piedra、1998を参照にされたい）。しかし予備的な結果では、このような生のウイルスワクチンは最高に不活性化されたワクチンよりも有意に効果的ではなく（Keitel & Piedra、1998を参照にされたい）、さらなる改善の余地を残す。１つの可能性は、上記の逆遺伝学系を用いて風邪に適合したワクチンを修飾することである。あるいは内部タンパク質をコードする遺伝子中に多数の弱毒化突然変異を含む「マスター」インフルエンザＡ型株を作成するために、逆遺伝学系を使用することによるスクラッチ（scratch)から始めることができる。本明細書に記載する逆遺伝学系の最も興味のある応用は、インフルエンザウイルスの新たなHAまたはNAサブタイプが関与する流行が疑われる場合に、弱毒化した生のウイルスワクチンの迅速な生産にある。
この新規な逆遺伝学系は、ワクチンベクターとしてインフルエンザウイルスの使用を強化するだろう。ウイルスはインフルエンザウイルスタンパク質に加えて、外来タンパク質または免疫原性エピトープを発現するように操作することができる。例えば第９番目のセグメントとして外来タンパク質を含むウイルスを生成し（Enami et al.,1991）、そしてそれらを生ワクチンとして使用することができる。インフルエンザウイルスは強力な細胞性および体液性免疫応答を刺激するだけでなく、それらはビリオン表面のHAおよびNAタンパク質の広い配列も可能であり（例えば、15HAおよび9NAサブタイプおよびそれらの疫学的変異体)、同じ標的群の反復免疫感作を可能とする。
レポーター遺伝子をコードする人工的vRNAを保有するインフルエンザVLPは、ウイルスの構造タンパク質およびワクシニア−T7ポリメラーゼ系を持つvRNAにより生産された（Mena et al.,1996)。今、逆遺伝学系を使用して、vRNA転写および複製に必要なタンパク質（すなわちPA、PB1、PB2およびNP）コードするvRNAを、ならびに目的のタンパク質をコードするvRNAを含むVLPを作成することができる。そのようなVLPは遺伝子療法の媒介物として有用となる。重要なことは、ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子の欠失が、VLP−遺伝子療法の後に感染性のウイルスを確実に生産しないことである。インフルエンザウイルスのゲノムは宿主の染色体に組込まれないので、VLP系は細胞の短期の遺伝子導入（例えば、ガンの処置）のみが必要な状況において、遺伝子療法として適するだろう。アデノウイルスベクターとは対照的に（Kovesdi et al.,1997)、インフルエンザVLPはHAおよびNA変異体の両方を含むので、標的群の反復処置を可能とする。
オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）のファミリーは、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ型ウイルス、ならびに最近分類されたソゴトウイルスを含んで成る。本明細書に記載したクローン化cDNAからの完全な感染性のインフルエンザＡ型ウイルスの作成法は、オルソミクソウイルス、そして恐らく他の分離した（−）−センスRNAウイルス（例えばブニヤウイルス科（Bunyaviridae)、アレナウイルス科（Arenaviridae）にも応用できるだろう。技術的な限界無しでウイルスゲノムを操作する能力は、ウイルスの生活環およびそれらの調節、ウイルスタンパク質の機能およびウイルスの病原性の分子的機作の研究と深く関係する。
例２：
インフルエンザウイルスのタンパク質PB2、PB1、PAおよびNPの発現は、人工的ウイルスRNAの複製および転写を導く インフルエンザVLPを生成するために、インフルエンザウイルスRNAのインビボの細胞内合成にRNAポリメラーゼI系を使用した（図７）。この系では、レポーター遺伝子をアンチセンス方向にコードするcDNAが、インフルエンザウイルスRNAの5'および3'非翻訳領域により挟まれている。このカセットをRNAポリメラーゼIプロモーターとターミネーターとの間に挿入する。そのような構築物の真核細胞中へのトランスフェクションは、細胞性RNAポリメラーゼIによるレポーター遺伝子の転写を導き、これによりインフルエンザウイルス−様RNAを生成する（Neumann et al.,1994）。インフルエンザウイルスの感染で、この人工的vRNAはウイルスポリメラーゼ複合体により複製し、そして転写され、レポーター遺伝子の発現を導く。
PB2、PB1、PAおよびNPタンパク質の発現がRNAポーターI−由来転写物によりコードされるレポーター遺伝子の発現を導くのかどうかを決定するために、ニワトリβ-アクチンプロモーター(pCAGGS-WSN-NP0/14)の制御下のA/WSN/33(H1N1)ウイルスのNPタンパク質を発現するプラスミド(各１μg)、サイトメガロウイルスプロモーター[pcDNA762(PB2)、pcDNA774(PB1)およびpcDNA787(PA)]の制御下のA/PR/8/34ウイルスのポリメラーゼタンパク質、およびRNAポリメラーゼIレポーター遺伝子構築物（pPo1I-GFP)を、ヒトの胚性腎（293T）細胞にトランスフェクトした。48時間後、細胞の30％〜40％がGFPを発現していた（図９）。対照的にGFP発現はポリメラーゼまたはNPタンパク質を欠くトランスフェクト細胞では検出できなかった。これらの結果は、NPおよび３つのインフルエンザウイルスポリメラーゼタンパク質が、複製し、そしてRNAポリメラーゼI−由来GFP vRNAを転写する機能的複合体を形成したことを示していた。
最適なvRNA転写および複製 最適なレポーターGFP発現に必要なプラスミドDNAの量を決定するために、ポリメラーゼタンパク質およびNPの発現をモジュレートした。これまでの研究では、大量のPAが転写／複製系においてレポーター遺伝子発現の程度を下げたことを示した(Mena et al.,1996)。したがって段階的様式で、プラスミドからのPAの発現を減少させ、鋳型の量として0.1μgのpcDNA787(PA)が最強のGFP発現を生じることを確認した。RNP複合体の主要な構造成分であるNPを用いると、高量のタンパク質発現プラスミドが必要となるかもしれない。しかし高量のプラスミドはGFP-陽性293T細胞の数にそれほど影響を与えなかった。さらに様々な量のPB2およびPB1タンパク質発現プラスミド（1.0から0.03μgの範囲）では、293T細胞中のGFP発現に影響を与えなかった。したがってすべての後の実験では、0.1μgのpcDNA787(PA)および1.0μgのpcDNA774(PB1)、pcDNA762(PB2)およびpCAGGS-WSN-NP0/14を使用した。
クローン化したcDNAからのインフルエンザVLPの形成 ワクシニアウイルスT7 ポリメラーゼ系を用いたこれまでの研究では、インフルエンザVLPの形成に９つのインフルエン ザウイルスタンパク質:PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M1、M2およびNS2が必要であることが示された（Mena et al.,1996）。対照的にNS1タンパク質は粒子形成に必須ではない（Mena et al.,1996）。VLP作成のために効率的なプラスミド-駆動系を確立するために、HA、NA、M1、M2およびNS2遺伝子をコードするcDNAを作成した。このcDNAを真核発現ベクターpCAGGS/MCS（ニワトリβ-アクチンプロモーターにより制御される)にクローン化し、それぞれpEWSN-HA、pCAGGS-WNA-15、pCAGGS-WSN-M1-2/4を、pEp24cおよびpCA-NS2を生成した。各タンパク質の発現は、ウエスタンブロット分析により確認した。
VLPを生成するために、106の293T細胞を各1.0μgのタンパク質発現プラスミド（0.1μgを使用したpcDNA787(PA)を除く)、および１μgのレポーター遺伝子構築物pPo1I-GFPでトランスフェクトした。培養上清をトランスフェクションから48時間後に回収し、そしてA/WSN/33ウイルスと混合してGFP vRNAの複製および転写に必要なインフルエンザウイルスタンパク質を提供した。次いで混合物をMDCK細胞に接種した。10時間のインキューベーション後、GFP−陽性MDCK細胞を検出し、これは450粒子／上清(ml)に相当した（表３）。このように、すべてのインフルエンザウイルスの構造タンパク質のプラスミド−駆動発現が、GFP vRNAを含む感染性インフルエンザVLPの形成をもたらした。さらにGFP vRNAはMDCK細胞に送達された。
インフルエンザウイルスの最適な集成体 VLP形成も、異なる量のRNAポリメラーゼIレポーター遺伝子構築物ならびにHA、NA、M1、M2およびNS2プラスミドDNAを発現する細胞で実験した。pPo1I-GFPを用いた実験では、1.0μgのプラスミドDNAがVLPの生成に高度に効率的であるが、2.0μgまたは3.0μgに関する効率は有意に低下した。NS2およびM2タンパク質は感染の後期に低量で発現されるので、比較的少量の発現プラスミドが最適なVLP形成には必要であると思われた。M2発現構築物の1.0μgから0.3μgへの減少は、GFP−陽性MDCK細胞の数に10倍以上の増加をもたらした（表３）。さらにプラスミドを0.03μgに減少させると、VLPの数は増加しなかった。NS2に関しては、試験した低量のプラスミド（0.1μg）がVLPのより低い効率的形成と関連した（表３）。
M1タンパク質はビリオンの主構造成分である。すなわち高レベルのM1発現はVLPの効率的形成に必要なようである。この予測は1.0μgまたは2.0μgのM1プラスミドDNAを用いてトランスフェクトした細胞中のVLP形成を比較する実験で試験した。表３に示すように、
より高量のプラスミドでGFP-陽性MDCK細胞の数に10倍以上の増加をもたらした。HAおよびNAタンパク質を発現する２種類の量（１μg対２μg）のプラスミドを比較すると、VLP形成に認められる差異を表さず、１μgの各プラスミド(pEWSN-HA、pCAGGS-WNA15）を後の実験に使用する選択が導かれた。総じてこれらの実験はVLP形成の効率に100倍より多くの増加をもたらし、最終的には上清１mlあたり104より多くの感染性インフルエンザウイルス粒子の生産を導いた（図１０）。
Figure 0006224645
＊293T細胞は、９つのインフルエンザウイルス構造タンパク質用の発現プラスミドおよびRNAポリメラーゼI-GFP遺伝子プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、VLPを含有する上清を集め、A/WSN/33ヘルパーウイルスと混合し、そしてMDCK細胞に接種した。細胞は感染から10時間後に固定し、そしてGFP発現を蛍光顕微鏡で測定した。MDCK細胞中のGFP発現について、M1、M2およびNS2プラスミドの最適な量を決定するために、それらプラスミドの量のみを変動させた（太字)。
†VLP形成の相対的効率は、５つの顕微鏡視野でGFP-陽性細胞の数を計数することにより決定した。１μgの各プラスミドを含有するサンプル(これは450の感染性VLP／上清(ml)を生じた）を参照として選択した（１の値）。
プラスミドから完全に生産されたVLPの確実性 VLPが本物のインフルエンザウイルスのように感染を開始することを確認するために、VLPをWSN HAに対する抗体で中和した。プラスミドでトランスフェクトした293T細胞に由来するVLPを含有する上清を、抗−WSN HAモノクローナル抗体のプールまたは水疱性口内炎ウイルス(VSV)のＧタンパク質に対するモノクローナル抗体（陰性対照）と、室温で１時間インキューベーションした。抗−WSN HAモノクローナル抗体のプールにより中和されないA/PR/8/34ヘルパーウイルスを混合物に加え、そしてMDCK細胞に接種した。抗−WSN HAモノクローナル抗体のみがVSVを中和し、HAがVLPの細胞への付着および侵入を媒介することを示した。
次にVLPの形成に必要な最少組のタンパク質を同定した。他者は３つのインフルエンザウイルスポリメラーゼおよびNPがvRNAの複製および転写に必須であることを確立した（Honda et al.,1988)。したがってこれら４つの各タンパク質は含めるが、HA、NA、M1、M2またはN2を連続して省略した。これらのプラスミドの排除は、トランスフェクトした293T細胞におけるGFP vRNAの複製／転写に影響を及ぼさなかった。HA、NA、M1またはN2タンパク質を欠くトランスフェクトした293T細胞に由来する上清は、感染したMDCK細胞においてGFP発現を促進せず、感染性VLPの不存在を示していた。感染性VLPはM2の省略で検出されたが、その数は低かった（＞構造タンパク質の完全な組に比べて500倍の減少）。すなわちワクシニアウイルス系の研究からのデータと一致して、すべてのインフルエンザウイルス構造タンパク質が感染性VLPの効率的形成には必要である。
VLPの生産においてVSV糖タンパク質はHAおよびNAタンパク質と置き換えることができる。 インフルエンザウイルスHAおよびNAタンパク質を、レセプターの結合および融合に機能するVSV糖タンパク質と置き換えた。pPo1I-GFPでトランスフェクトした293T細胞；PB2、PB1、PA、NP、M1、M2およびNS2発現構築物の最適量；および１μgのVSV-G構築物(pCAGGS-VSV-G)では、インフルエンザウイルスの糖タンパク質のVSV-Gタンパク質への置換はVLP形成に悪い影響を及ぼさなかった。対照的に、ウイルス糖タンパク質としてHAおよびNAを提供するよりははむしろVSV-Gの時に高い数のGFP-陽性細胞が再生産的に見いだされた。すなわちVSV Gタンパク質はインフルエンザビリオン中に効率的に取り込まれることができ、そしてウイルスの放出および侵入においてHAおよびNAと同様に機能することができる。
感染性インフルエンザウイルス粒子を作成する効率的な系は、このウイルスを用いた研究で、ならびにワクチンおよび遺伝子療法用のベクターの生産に役立つ可能性がある。現存するワクシニアウイルス系とは対照的に、本明細書に記載するVLP生産法は初期の細胞の初期のトランスフェクションおよびVLPの収量（＞104感染性粒子／ml（上清））の両方において高度に効率的である。さらにインフルエンザウイルスタンパク質を発現するプラスミドにより完全に駆動され（すなわち任意の他のウイルスタンパク質の不存在）、これは結果の解釈を大いに単純化する。別の主な進歩は、ビリオン形成、RNP複合体のパッケージング、ウイルス複製物の出芽（budding)、および結合および融合プロセスにおける致死的突然変異の効果を研究するための能力である。さらに上記のシステムは他のウイルス、例えばパラミクソウイルスおよびラブドウイルスでも十分に操作される。
インフルエンザウイルスHAおよびNAタンパク質は、VSV糖タンパク質Ｇにより機能的に置き換えることができる。以前、インフルエンザウイルスは組換えSV40ウイルスにより提供された時に、VSV Ｇタンパク質を取り込めないと報告された（Naim et al.,1993)。本明細書に記載する結果はHAまたはNAのいずれもがVLPの形成に必須ではないが、これらの糖タンパク質が他のウイルスタンパク質との相互作用に役割を果たす可能性を除外することはできず、すなわち尾の少ないHA、NAまたは両方を発現するウイルスの細長い形状により示唆されるようなビリオンの構造に影響を及ぼすことを示唆している（Garcia-Sastre et al.,1995：Jin et al.,1994：Jin et al.,1997：Mitnaul et al.,1996)。
これまでに記載したプラスミドに基づく系は、治療用の遺伝子送達に特に有用となり得る。VLPは、転写および複製に必要なタンパク質（すなわちNPおよびポリメラーゼ)をコードするvRNA、ならびに目的のタンパク質をコードするvRNAを含むように調製することができる。これらの粒子は感染性であり、そして指定した遺伝子を標的細胞に送達することができ、ここで複製し、そして転写される。これらの粒子はウイルス遺伝子の完全な成分を含んでいないので、感染性の子孫ウイルスを生産することはできない。この特徴はウイルスゲノムの宿主染色体への組込みの欠如と一緒に、ヒトおよび非ヒト個体に遺伝子への送達の生物学的安全性を確実にするだろう。最後に、15HAおよび9NAサブタイプおよびそれらの変異体の利用可能性は、VLPの反復投与を可能とし、これによりアデノウイルスのような他のウイルスベクターの反復使用で直面する主要な障害の１つであるベクターが生成するタンパク質に対する免疫抵抗を克服する。プラスミドが駆動する系のさらなる利点は、ガンの処置のような外来タンパク質の短期発現だけを必要とする状況で実現されるだろう。
例３：
Cre-loxP系を使用することにより、複製−欠損性ウイルスの生産のためのパッケッージング細胞系を作成することができる。例えば２つのloxP部位により挟まれた転写停止カセット（例えばpBS302、ライフテクノロジーズ（Life Technologies)、ベセスダ、メリーランド州；およびSauer et al.,1993；Lasko et al.,1992；Pichel et al.,1993；Bolivar et al.,1977；Stuhl et al.,1981；Stuhl et al.,1985；Fiers et al.,1978)、およびウイルス遺伝子の１つを含むタンパク質発現ベクターを調製する。プロモーター配列で開始する転写を、転写停止部位で遮断する。すなわちウイルス遺伝子は停止および翻訳されない。そのようなベクターで安定にトランスフェクトされた細胞を、loxP系にクローン化された遺伝子をコードするvRNAを欠くインフルエンザウイルスに感染させる。このウイルスもCreタンパク質をコードするさらなるvRNAを含む。このウイルスはそのvRNAの１つが欠けているので正常な細胞では生存できない。しかしパッケージング細胞中ではvRNAから発現するCreタンパク質がloxP部位で組換えを生じ、転写停止部位の欠失をもたらす。このように個々のウイルス遺伝子（１つまたは複数）は今、転写そして発現され、ウイルスのこのような細胞中での増幅が可能となる（図１１）。
さらにパッケージング細胞系を、loxP系により制御される後期ウイルスタンパク質（すなわちHA、NA、M1、M2およびNS2）を発現するように調製する（図１２）。HAおよびNAは他のウイルスレセプター−結合および融合タンパク質（例えば、Ebola GP、Marburg GP、ブニヤウイルス科(Bunyaviridae)の糖タンパク質GP1およびGP2、ラブドウイルスおよびパラミクソウイルスのＧおよび／またはＦタンパク質、トゴトウイルスの糖タンパク質、および（＋）−鎖RNAウイルスの糖タンパク質）に置き換えることができる。複製／転写(すなわちポリメラーゼおよびNPタンパク質）に必要なタンパク質をコードするvRNA、目的遺伝子をコードするvRNA、およびCreをコードするvRNAを含むウイルス−様粒子が生成される。これらのvRNAはパッケージング細胞系のウイルス−様粒子中にパッケージングされる。
これらのウイルス−様粒子は、以下の理由によりワクチンおよび遺伝子療法の目的に使用できる；（i）それらがウイルス遺伝子の完全な補完物を含まず、そしてすなわち感染性の子孫粒子が形成されず、厳しい安全的関心事(concern）に合う；（ii）それらは外来タンパク質を高レベルで発現するだろう；（iii）それらは主要抗原であるウイルスの糖タンパク質（HA、NA)を発現しない、すなわちウイルスタンパク質に対する宿主免疫応答が限定されるはずである。
Figure 0006224645
Figure 0006224645
Figure 0006224645
すべての公報、特許および特許出願は、引用により本明細書に編入する。前述の明細書では本発明をそれらの特定の好適な態様に関して記載し、そして多くの詳細を具体的説明の目的で説明したが、当業者には本発明のさらなる態様も可能であり、そして本明細書に記載した特定の詳細は本発明の基本的理論から逸脱することなくかなり変動させることができることは明白である。

Claims (9)

  1. ワクチンを調製するためのリアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）インフルエンザウイルス粒子の生産方法であって、
    ｉ）（ａ）複数のゲノムインフルエンザｖＲＮＡ又は該ゲノムインフルエンザｖＲＮＡのアンチゲノムｃＲＮＡをコードする第一の発現ベクターセットであって、転写ターミネーターに連結したインフルエンザウイルスＰＡのｃＤＮＡと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクターと、
    転写ターミネーターに連結したインフルエンザウイルスＰＢ１のｃＤＮＡと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクターと、
    転写ターミネーターに連結したインフルエンザウイルスＰＢ２のｃＤＮＡと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクターと、
    転写ターミネーターに連結したインフルエンザウイルスＨＡのｃＤＮＡと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクターと、
    転写ターミネーターに連結したインフルエンザウイルスＮＰのｃＤＮＡと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクターと、
    転写ターミネーターに連結したインフルエンザウイルスＭのｃＤＮＡと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクターと、
    転写ターミネーターに連結したインフルエンザウイルスＮＡのｃＤＮＡと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクターと、
    転写ターミネーターに連結したインフルエンザウイルスＮＳのｃＤＮＡと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクター
    を含む第一の発現ベクターセット、並びに
    （ｂ）第二のタンパク質発現ベクターセットであって、
    インフルエンザウイルスＰＡポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクターと、
    インフルエンザウイルスＰＢ１ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクターと、
    インフルエンザウイルスＰＢ２ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクターと、
    インフルエンザウイルスＮＰポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントと機能的に連結されたプロモーターを含有するベクター
    を含む第二のタンパク質発現ベクターセット
    を含んでなる組成物を宿主細胞中に導入する工程、及び
    ｉｉ）該宿主細胞中で複数のゲノムインフルエンザｖＲＮＡを含有するリボ核タンパク質複合体が形成され、かつ、該宿主細胞中で該ゲノムインフルエンザｖＲＮＡを含むリアソータントインフルエンザウイルス粒子が集成されるように、該宿主細胞をヘルパーウイルスの不存在下で培養する工程、及び
    ｉｉｉ）該宿主細胞から該リアソータントインフルエンザウイルスを回収する工程
    を含んでなる、方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、該ウイルスがＡ型、Ｂ型又はＣ型のインフルエンザウイルスである、方法。
  3. 請求項１に記載の方法であって、該リアソータントインフルエンザウイルスが一つより多くの親ウイルスに由来するｖＲＮＡセグメントを含有する、方法。
  4. 請求項１に記載の方法であって、回収されたリアソータントインフルエンザウイルス粒子を弱毒化する工程をさらに含む、方法。
  5. 請求項１に記載の方法であって、第一及び第二のベクターセットがすべてプラスミドである、方法。
  6. 請求項１に記載の方法であって、該複数のゲノムインフルエンザｖＲＮＡ又は該ゲノムインフルエンザｖＲＮＡのアンチゲノムｃＲＮＡの各々が別々のベクター上にコードされている、方法。
  7. 請求項１に記載の方法であって、（ａ）の発現ベクターがＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌｌ）プロモーターとｐｏｌｌ終結配列を含む、方法。
  8. 請求項７に記載の方法であって、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターがヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターである、方法。
  9. 請求項１に記載の方法であって、各ゲノムインフルエンザｖＲＮＡ又は該ゲノムインフルエンザｖＲＮＡのアンチゲノムｃＲＮＡのコーディング配列が転写ターミネーターの上流である、方法。
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