CN107964035B - 一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗 - Google Patents

一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗。本发明首先保护一种突变蛋白，是将流感病毒的NS1蛋白进行如下两个氨基酸残基的突变得到的：第38位氨基酸残基由精氨酸突变为丙氨酸，第41位氨基酸残基由赖氨酸突变为丙氨酸。本发明还保护一种重组病毒，是将流感病毒基因组中编码NS1蛋白的两个氨基酸残基的密码子进行如下突变得到的重组病毒：自N末端第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子突变为丙氨酸密码子，自N末端第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子突变为丙氨酸密码子。本发明还保护以上任一所述重组病毒在制备流感病毒疫苗中的应用。本发明对于流感病毒的防治具有重大应用价值。

Description

一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗
技术领域
本发明涉及一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗。
背景技术
流行性感冒病毒，是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流行性感冒病毒(Influenzavirus)属的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒。人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行，例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感。乙型流感病毒对人类致病性较低。丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。
甲型流感病毒的RNA由8个节段组成，第1、2、3个节段编码的是RNA多聚集酶，第4个节段负责编码血凝素；第5个节段负责编码核蛋白，第6个节段编码的是神经氨酸酶；第7个节段编码基质蛋白，第8个节段编码的是一种未知功能的能起到拼接RNA功能的非结构蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗。
本发明首先保护一种突变蛋白，命名为NS1R38A/K41A蛋白，是将流感病毒的NS1蛋白进行如下两个氨基酸残基的突变得到的：第38位氨基酸残基由精氨酸突变为丙氨酸，第41位氨基酸残基由赖氨酸突变为丙氨酸。
编码所述突变蛋白的基因(命名为NS1R38A/K41A基因)也属于本发明的保护范围。
NS1R38A/K41A基因具体可为将编码NS1蛋白的基因进行如下两组突变得到的：第112-114位核苷酸由“cga”突变为“GCA”，第121-123位核苷酸由“aag”突变为“GCA”。
编码NS1蛋白的基因具体如序列表的序列1所示。
含有NS1R38A/K41A基因的质粒也属于本发明的保护范围。所述质粒具体可为质粒pHH21-NS1R38A/K41A。质粒pHH21-NS1R38A/K41A为将NS1R38A/K41A基因插入载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)得到的重组质粒。
本发明还保护一种重组病毒，是将流感病毒基因组中编码NS1蛋白的两个氨基酸残基的密码子进行如下突变得到的重组病毒：自N末端第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子突变为丙氨酸密码子，自N末端第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子突变为丙氨酸密码子。
所述重组病毒具体可为：是将流感病毒基因组中编码NS1蛋白的两个氨基酸残基的密码子进行如下突变得到的重组病毒：自N末端第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子“cga”突变为丙氨酸密码子“GCA”，自N末端第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子“aag”突变为丙氨酸密码子“GCA”。
所述重组病毒具体可为：是将流感病毒基因组中序列表的序列1所示的编码NS1蛋白的基因进行如下两组突变得到的：第112-114位核苷酸由“cga”突变为“GCA”，第121-123位核苷酸由“aag”突变为“GCA”。
以上任一所述NS1蛋白为如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由其衍生的蛋白质。
本发明还保护一种重组病毒，其制备方法包括如下步骤：
将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS1R38A/K41A、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和质粒pcDNA3.0-NP共转染离体哺乳动物细胞后进行培养得到的重组病毒。
pHH21-PA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-PB1为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-PB2为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-HA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NP为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NA为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-M为在载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)插入序列表的序列9所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NS1R38A/K41A为将NS1R38A/K41A基因插入载体pHH21的多克隆位点(例如BsmBI酶切位点)得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PA为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PB1为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PB2为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-NP为在载体pcDNA3.0的多克隆位点(例如KpnI和XhoI酶切位点之间)插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
所述哺乳动物细胞具体可为293T RIG-I KO细胞。
所述培养条件具体可为37℃培养6-72小时。
本发明还保护一种制备流感病毒疫苗的方法，包括如下步骤：
第1次传代的方法如下：将所述重组病毒感染哺乳动物细胞，培养后收集上清，即为含有F1代病毒的病毒液；
第2次传代的方法如下：采用上一次传代得到的病毒液感染哺乳动物细胞，培养后收集的上清为含有F2代病毒的病毒液；
重复按照第2次传代的方法进行连续传代；
第N-1次传代中，收集的上清具有病毒复制能力；
第N次传代中，收集的上清不具有病毒复制能力；
N为3以上的自然数；
将第N-1次传代收集的上清作为流感病毒疫苗的活性成分。
本发明还保护一种制备流感病毒疫苗的方法(方法甲)，包括如下步骤：
(1)将所述重组病毒感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F1代病毒液；
(2)F1代病毒液感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F2代病毒液；
(3)F2代病毒液感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F3代病毒液；
(4)将F3代病毒液作为流感病毒疫苗的活性成分；
本发明还保护一种制备流感病毒疫苗的方法(方法乙)，包括如下步骤：
(1)将所述重组病毒感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F1代病毒液；
(2)F1代病毒液感染A549细胞，培养后收集上清，即F2代病毒液；
(3)将F2代病毒液作为流感病毒疫苗的活性成分。
以上任一所述方法制备得到的流感病毒疫苗也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种用于制备流感病毒疫苗的试剂盒，包括以上任一所述重组病毒。所述试剂盒还包括293T RIG-I KO细胞和/或MDCK细胞和/或A549细胞和/或Vero细胞。
本发明还保护以上任一所述重组病毒在制备流感病毒疫苗中的应用。
以上任一所述流感病毒具体可为A型流感病毒。
以上任一所述流感病毒具体可为动物感染的流感病毒。
以上任一所述流感病毒具体可为家禽感染的流感病毒或家畜感染的流感病毒。
所述A型流感病毒具体可为WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。
本发明提供的流感病毒，采用Vero细胞传代可以多代保持复制能力，采用MDCK细胞传至4代失去复制能力，采用A549细胞传至3代失去复制能力。因此，可以采用Vero细胞传代，采用MDCK细胞或A549细胞制备疫苗(将失去复制能力的前一代病毒作为疫苗)，并且可以采用黏膜免疫。本发明对于流感病毒的防治具有重大应用价值。
附图说明
图1为实施例1中western blot结果。
图2为实施例2中F2细胞western blot结果。
图3为实施例2中F3细胞western blot结果。
图4为实施例2中F4细胞western blot结果。
图5为实施例3中F2细胞western blot结果。
图6为实施例3中F3细胞western blot结果。
图7为实施例3中F4细胞western blot结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7.2-7.4、0.01M的PBS缓冲液。
载体pHH21：Neumann,G.et al.,Generation of influenza A virusesentirelyfrom cloned cDNAs.P Natl Acad Sci Usa 96(16),9345(1999)。
载体pcDNA3.0：上海希匹吉生物技术有限公司,产品目录号CPC030。脂质体2000(Lipofectamine2000)：Invitrogen。293T RIG-I KO细胞：武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0001。MDCK细胞：ATCC，CCL-34。A549细胞：ATCC，CCL-185。Vero细胞：北京中科质检生物技术有限公司，货号V0180000。
病毒感染液：含2μg/ml TPCK处理的胰酶(胰酶是以胰酶母液的方式加入的，胰酶母液为用PBS缓冲液配制的胰酶浓度为0.25g/100mL的溶液)、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的无血清DMEM培养基。
噬斑鉴定的方法：(1)将MDCK细胞接种于12孔板中，每孔约1×105细胞，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12小时，吸弃上清并用PBS缓冲液清洗细胞；(2)将待测上清用病毒感染液梯度稀释后分别加入完成步骤(1)的各孔中，每个稀释度设置三个重复孔，37℃孵育1小时，吸弃上清并用PBS缓冲液清洗细胞；(3)完成步骤(2)后，每孔加入1毫升混合溶液(混合溶液的制备方法：将1体积份融化后降温至37℃左右的3g/100ml低熔点琼脂糖水溶液与1体积份预热到37℃的无酚红DMEM培养基等体积混合，且混合物中加入TPCK处理的胰酶、青霉素和链霉素，使得胰酶浓度为2μg/ml，青霉素和链霉素的浓度均为100U/ml)；(4)完成步骤(3)后，将12孔板4℃放置15分钟以上，待琼脂凝固后，将孔板翻转过来倒置在37℃培养箱中培养，在显微镜下观察细胞病变情况，培养3天后，将12孔板从培养箱中取出，计数空斑数。
病毒-血清中和抗体效价的检测方法：(1)将MDCK细胞接种于96孔板中，每孔约4×104细胞，培养12小时，吸弃上清并用PBS缓冲液清洗细胞；(2)1体积份血清与4体积份RDE酶(受体破坏酶)混合，37℃孵育16小时,然后置于56℃水浴锅中灭活30min，然后加入1体积份20％鸡红细胞并混匀，4℃孵育12小时，然后1000g离心并收集上清，即为预处理后的血清；(3)用DMEM培养液梯度稀释步骤(2)得到的预处理后的血清，得到各个抗体稀释液；(4)用DMEM培养液稀释实施例1制备的WT-F1代上清，得到病毒稀释液；(5)将抗体稀释液与病毒稀释液(病毒含量为100TCID50)等体积混匀，37℃孵育1h，然后加入完成步骤(1)的96孔板中，100μL/孔，静置孵育1h；(6)完成步骤(5)后，吸弃上清，用PBS缓冲液清洗细胞，加入含2μg/μl TPCK-胰酶的DMEM培养液，静置培养72h；(7)观察阳性感染细胞孔的数量，采用Reed-Muench法计算血清的中和效价。
NS1-R38A-F：5’-GACTTCTGATCTGCGCGAAGCCGAT-3’；
NS1-R38A-R：5’-ATTCCTTGATCGGCTTCGCGCAGAT-3’。
NS1-K41A-F：5’-TCCTCTTAGGGATGCCTGATCTCGG-3’；
NS1-K41A-R：5’-TTCGCCGAGATCAGGCATCCCTAAG-3’。
NS1-R38A/K41A-F：5’-CTCTTAGGGATGCCTGATCTGCGCG-3’；
NS1-R38A/K41A-R：5’-TTCGCGCAGATCAGGCATCCCTAAG-3’。
实施例1、突变体病毒的制备
一、构建重组质粒
NS1蛋白如序列表的序列2所示。编码NS1蛋白的基因命名为NS1基因。NS1基因cDNA中的开放阅读框如序列表的序列1所示。在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列1所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NS1。
以质粒pHH21-NS1为模板，采用NS1-R38A-F和NS1-R38A-R组成的引物对引入单点突变，得到质粒pHH21-NS1R38A。经测序，与质粒pHH21-NS1相比，质粒pHH21-NS1R38A的差异仅在于：将编码NS1蛋白自N末端第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子“cga”突变为了丙氨酸密码子“GCA”。
以质粒pHH21-NS1为模板，采用NS1-K41A-F和NS1-K41A-R组成的引物对引入单点突变，得到质粒pHH21-NS1K41A。经测序，与质粒pHH21-NS1相比，质粒pHH21-NS1K41A的差异仅在于：将编码NS1蛋白自N末端第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子“aag”突变为了丙氨酸密码子“GCA”。
以质粒pHH21-NS1为模板，采用NS1-R38A/K41A-F和NS1-R38A/K41A-R引入双点突变，得到质粒pHH21-NS1R38A/K41A。经测序，与质粒pHH21-NS1相比，质粒pHH21-NS1R38A/K41A的差异仅在于：将编码NS1蛋白的两个氨基酸残基的密码子进行了突变，分别为：自N末端第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子“cga”突变为了丙氨酸密码子“GCA”，自N末端第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子“aag”突变为了丙氨酸密码子“GCA”。
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列3所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PA。
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PB1。
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列5所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PB2。
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列6所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-HA。
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列7所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NP。
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列8所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NA。
在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列9所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-M。
在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列3所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PA。
在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PB1。
在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列5所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PB2。
在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列7所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-NP。
二、病毒拯救
1、将293T RIG-I KO细胞接种于60mm平皿，每皿1×106个细胞，培养12小时。
2、分组处理如下：
第一组：将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS1R38A、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和质粒pcDNA3.0-NP(每种质粒1μg)混合后通过脂质体2000共转染完成步骤1的细胞，37℃培养6小时，然后更换培养体系为病毒感染液，然后37℃培养72小时，分别收获上清和细胞。
第二组：与第一组的差异仅在于用质粒pHH21-NS1K41A代替质粒pHH21-NS1R38A。
第三组：与第一组的差异仅在于用质粒pHH21-NS1R38A/K41A代替质粒pHH21-NS1R38A。
第四组：与第一组的差异仅在于用质粒pHH21-NS1代替质粒pHH21-NS1R38A。
第五组：与第一组的差异仅在于不加入质粒pHH21-NS1R38A。
将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS1、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和质粒pcDNA3.0-NP共转染293T RIG-I KO细胞(即上述第四组)，培养后得到WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株。WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株又称WSN病毒野生型。相应的，将质粒pHH21-NS1R38A代替质粒pHH21-NS1后，得到的病毒为R38A单突变病毒。相应的，将质粒pHH21-NS1K41A代替质粒pHH21-NS1后，得到的病毒为K41A单突变病毒。相应的，将质粒pHH21-NS1R38A/K41A代替质粒pHH21-NS1后，得到的病毒为R38A/K41A双突变病毒。
第一组得到的上清命名为R38A-F0代上清。
第二组得到的上清命名为K41A-F0代上清。
第三组得到的上清命名为R38A/K41A-F0代上清。
第四组得到的上清命名为WT-F0代上清。
第五组得到的上清命名为NC-F0代上清。
3、盲传一代后检测上清滴度
①将MDCK细胞接种于直径为100mm的平皿，每皿7×106个细胞，培养12小时。
②完成步骤①后，每皿加入500μl步骤2收获的上清，然后培养72小时，然后收获上清。将收获的上清定义为F1代上清(其中含有初始拯救出的F1代重组病毒)。F1代上清进行噬斑鉴定，每毫升上清造成的噬斑数量以10为底的对数值即为滴度。
R38A-F0代上清进行步骤3得到的F1代上清命名为R38A-F1代上清。
K41A-F0代上清进行步骤3得到的F1代上清命名为K41A-F1代上清。
R38A/K41A-F0代上清进行步骤3得到的F1代上清命名为R38A/K41A-F1代上清。
WT-F0代上清进行步骤3得到的F1代上清命名为WT-F1代上清。
NC-F0代上清进行步骤3得到的F1代上清命名为NC-F1代上清。
R38A-F1代上清的滴度为4.1±0.1。K41A-F1代上清的滴度为4.5±0.2。R38A/K41A-F1代上清的滴度为3.3±0.1。WT-F1代上清的滴度为5.6±0.1。NC-F1代上清的滴度为0，即不能使MDCK产生噬斑。
4、取步骤2收获的细胞，先进行破碎再进行western blot(检测各主要病毒蛋白的表达)。western blot中，用于检测NP蛋白的一抗为抗NP蛋白的多抗；用于检测M1蛋白的一抗为抗M1蛋白的单抗。western blot结果见图1。第一组至第四组收获的细胞中流感病毒的两种重要蛋白(NP蛋白、M1蛋白)均能够正常表达。
实施例2、重组病毒的有限复制特性鉴定(在MDCK细胞上盲传)
分别将实施例1中制备得到的各个F1代上清(R38A-F1代上清、K41A-F1代上清、R38A/K41A-F1代上清、WT-F1代上清、NC-F1代上清)进行如下操作：
一、盲传
1、将200微升F1代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个MDCK细胞)，然后培养72小时，然后分别收获上清和细胞。将收获的上清定义为F2代上清。为便于描述，将收获的细胞命名为F2细胞。
2、将200微升F2代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个MDCK细胞)，然后培养72小时，然后分别收获上清和细胞。将收获的上清定义为F3代上清。为便于描述，将收获的细胞命名为F3细胞。
3、将200微升F3代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个MDCK细胞)，然后培养72小时，然后分别收获上清和细胞。将收获的上清定义为F4代上清。为便于描述，将收获的细胞命名为F4细胞。
R38A-F1代上清进行上述步骤得到的F2代上清、F3代上清和F4代上清依次命名为R38A-F2代上清、R38A-F3代上清、R38A-F4代上清。
K41A-F1代上清进行上述步骤得到的F2代上清、F3代上清和F4代上清依次命名为K41A-F2代上清、K41A-F3代上清、K41A-F4代上清。
R38A/K41A-F1代上清进行上述步骤得到的F2代上清、F3代上清和F4代上清依次命名为R38A/K41A-F2代上清、R38A/K41A-F3代上清、R38A/K41A-F4代上清。
WT-F1代上清进行上述步骤得到的F2代上清、F3代上清和F4代上清依次命名为WT-F2代上清、WT-F3代上清、WT-F4代上清。
NC-F1代上清进行上述步骤得到的F2代上清、F3代上清和F4代上清依次命名为NC-F2代上清、NC-F3代上清、NC-F4代上清。
二、F2代上清、F3代上清、F4代上清分别进行噬斑鉴定，每毫升上清造成的噬斑数量以10为底的对数值即为滴度。
R38A-F2代上清、R38A-F3代上清、R38A-F4代上清的滴度依次为4.0、3.8、3.6。
K41A-F2代上清、K41A-F3代上清、K41A-F4代上清的滴度依次为4.5、4.3、4.3。
R38A/K41A-F2代上清、R38A/K41A-F3代上清、R38A/K41A-F4代上清的滴度依次为2.5、2.0、0。
WT-F2代上清、WT-F3代上清、WT-F4代上清的滴度依次为6.0、6.2、6.1。
NC-F2代上清、NC-F3代上清、NC-F4代上清的滴度依次为0、0、0。
三、F2细胞、F3细胞、F4细胞分别进行如下步骤：先进行破碎再进行western blot(检测各主要病毒蛋白的表达)。western blot中，用于检测NP蛋白的一抗为抗NP蛋白的多抗；用于检测M1蛋白的一抗为抗M1蛋白的单抗。F2细胞western blot结果见图2。F3细胞western blot结果见图3。F4细胞western blot结果见图4。
以上结果表明，R38A/K41A双突变病毒在盲传至第4代时失去复制能力。
实施例3、双突变重组病毒的有限复制特性鉴定(在A549细胞上传代)
分别将实施例1中制备得到的各个F1代上清(R38A-F1代上清、K41A-F1代上清、R38A/K41A-F1代上清、WT-F1代上清、NC-F1代上清)进行如下操作：
1、将F1代上清加至60mm平皿中(平皿中已铺A549细胞，MOI＝0.001)，然后培养72小时，然后分别收获上清和细胞。将收获的上清定义为F2代上清。为便于描述，将收获的细胞命名为F2细胞。
2、将200微升F2代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个A549细胞)，然后培养72小时，然后分别收获上清和细胞。将收获的上清定义为F3代上清。为便于描述，将收获的细胞命名为F3细胞。
3、将200微升F3代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个A549细胞)，然后培养72小时，然后分别收获上清和细胞。将收获的上清定义为F4代上清。为便于描述，将收获的细胞命名为F4细胞。
R38A-F1代上清进行上述步骤得到的F2代上清、F3代上清和F4代上清依次命名为R38A-F2代上清、R38A-F3代上清、R38A-F4代上清。
K41A-F1代上清进行上述步骤得到的F2代上清、F3代上清和F4代上清依次命名为K41A-F2代上清、K41A-F3代上清、K41A-F4代上清。
R38A/K41A-F1代上清进行上述步骤得到的F2代上清、F3代上清和F4代上清依次命名为R38A/K41A-F2代上清、R38A/K41A-F3代上清、R38A/K41A-F4代上清。
WT-F1代上清进行上述步骤得到的F2代上清、F3代上清和F4代上清依次命名为WT-F2代上清、WT-F3代上清、WT-F4代上清。
NC-F1代上清进行上述步骤得到的F2代上清、F3代上清和F4代上清依次命名为NC-F2代上清、NC-F3代上清、NC-F4代上清。
二、F2代上清、F3代上清、F4代上清分别进行噬斑鉴定，每毫升上清造成的噬斑数量以10为底的对数值即为滴度。
R38A-F2代上清、R38A-F3代上清、R38A-F4代上清的滴度依次为3.7、3.4、3.3。
K41A-F2代上清、K41A-F3代上清、K41A-F4代上清的滴度依次为4.3、4.2、4.0。
R38A/K41A-F2代上清、R38A/K41A-F3代上清、R38A/K41A-F4代上清的滴度依次为2.2、0、0。
WT-F2代上清、WT-F3代上清、WT-F4代上清的滴度依次为5.8、5.5、5.3。
NC-F2代上清、NC-F3代上清、NC-F4代上清的滴度依次为0、0、0。
三、F2细胞、F3细胞、F4细胞分别进行如下步骤：先进行破碎再进行western blot(检测各主要病毒蛋白的表达)。western blot中，用于检测NP蛋白的一抗为抗NP蛋白的多抗；用于检测M1蛋白的一抗为抗M1蛋白的单抗。F2细胞western blot结果见图5。F3细胞western blot结果见图6。F4细胞western blot结果见图7。
以上结果表明，R38A/K41A双突变病毒在盲传至第3代时失去复制能力。
实施例4、双突变重组病毒感染小鼠
一、体重和死亡率
体重约16g的5周龄BALB/c小鼠经过乙醚麻醉后，分成5组，每组10只，分别处理如下：
第一组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl实施例2制备的WT-F3代上清(病毒含量为103PFU)，然后每日观察小鼠体重和死亡率。
第二组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl实施例2制备的R38A/K41A-F3代上清(病毒含量为103PFU)，然后每日观察小鼠体重和死亡率。
第三组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl实施例3制备的WT-F2代上清(病毒含量为103PFU)，然后每日观察小鼠体重和死亡率。
第四组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl实施例3制备的R38A/K41A-F2代上清(病毒含量为103PFU)，然后每日观察小鼠体重和死亡率。
第五组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50微升灭菌后的PBS缓冲液。
相对体重＝某一天的体重÷试验第0天的体重×100％。
相同体重和死亡率的结果见表1。
表1
Figure BDA0001496638800000101
Figure BDA0001496638800000111
二、病毒-血清中和抗体效价和肺脏病毒滴度
体重约16g的5周龄BALB/c小鼠经过乙醚麻醉后，分成5组，每组9只，分别处理如下：
第一组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl实施例2制备的WT-F3代上清(病毒含量为103PFU)；
第二组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl实施例2制备的R38A/K41A-F3代上清(病毒含量为103PFU)，然后每日观察小鼠体重和死亡率。
第三组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl实施例3制备的WT-F2代上清(病毒含量为103PFU)，然后每日观察小鼠体重和死亡率。
第四组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl实施例3制备的R38A/K41A-F2代上清(病毒含量为103PFU)，然后每日观察小鼠体重和死亡率。
第五组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl灭菌后的PBS缓冲液。
分别于试验第3天、试验第7天和试验第14天每组处死3只小鼠。试验第3天、第7天和第14天处死的小鼠取血清检测病毒-血清中和抗体效价(简称效价)。试验第3天和第7天处死的小鼠取肺脏，用研磨器将1g肺脏进行组织匀浆于1毫升冰浴PBS缓冲液中,匀浆液离心5000g×10min，收集上清，进行噬斑鉴定(每毫升上清造成的噬斑数量以10为底的对数值即为滴度)。
结果见表2。
表2
Figure BDA0001496638800000112
三、攻毒试验
体重约16g的5周龄BALB/c小鼠经过乙醚麻醉后，分成3组，每组6只，分别处理如下：
第一组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl实施例2制备的R38A/K41A-F3代上清(病毒含量为103PFU)；试验第17天，利用鼻吸法吸入50μl实施例1制备的WT-F1代上清(病毒含量为103.88PFU，用DMEM培养液调整体积)，试验第32天统计存活率。
第二组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl实施例3制备的R38A/K41A-F2代上清(病毒含量为103PFU)；试验第17天，利用鼻吸法吸入50μl实施例1制备的WT-F1代上清(病毒含量为103.88PFU，用DMEM培养液调整体积)，试验第32天统计存活率。
第三组：试验第0天，利用鼻吸法吸入50μl灭菌后的PBS缓冲液；试验第17天，利用鼻吸法吸入50μl实施例1制备的WT-F1代上清(病毒含量为103.88PFU，用DMEM培养液调整体积)，试验第32天统计存活率。
第一组和第二组的存活率均为100％。
第三组的存活率为0％。
实施例5、大批量制备
1、将200微升实施例1中制备得到的R38A/K41A-F1代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个Vero细胞)，然后培养72小时，然后收获上清。将收获的上清定义为F2代上清。
2、将200微升F2代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个Vero细胞)，然后培养72小时，然后收获上清。将收获的上清定义为F3代上清。
3、将200微升F3代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个Vero细胞)，然后培养72小时，然后收获上清。将收获的上清定义为F4代上清。
4、将200微升F4代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个Vero细胞)，然后培养72小时，然后收获上清。将收获的上清定义为F5代上清。
5、将200微升F5代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个Vero细胞)，然后培养72小时，然后收获上清。将收获的上清定义为F6代上清。
6、将200微升F6代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个Vero细胞)，然后培养72小时，然后收获上清。将收获的上清定义为F7代上清。
7、将200微升F7代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个Vero细胞)，然后培养72小时，然后收获上清。将收获的上清定义为F8代上清。
8、将200微升F8代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个Vero细胞)，然后培养72小时，然后收获上清。将收获的上清定义为F9代上清。
9、将200微升F9代上清加至60mm平皿中(每皿中已铺1×106个Vero细胞)，然后培养72小时，然后收获上清。将收获的上清定义为F10代上清。
将F2代上清、F3代上清、F4代上清、F5代上清和F10代上清分别作为待测上清，进行噬斑鉴定，每毫升上清造成的噬斑数量以10为底的对数值即为滴度。
F2代上清的滴度为3.34。
F3代上清的滴度为4.84。
F4代上清的滴度为4.34。
F5代上清的滴度为5.18。
F10代上清的滴度为4.51。
结果表明，采用Vero细胞，可以传代并制备病毒液。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一种用于流感病毒的有限复制型黏膜免疫疫苗
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 693
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa 60
agagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag 120
aagtccctaa gaggaagagg cagcactctc ggtctggaca tcgaaacagc cacccgtgct 180
ggaaagcaaa tagtggagcg gattctgaag gaagaatctg atgaggcact caaaatgacc 240
atggcctctg tacctgcatc gcgctaccta actgacatga ctcttgagga aatgtcaagg 300
cactggttca tgctcatgcc caagcagaaa gtggcaggcc ctctttgtat cagaatggac 360
caggcgatca tggataagaa catcatactg aaagcgaact tcagtgtgat ttttgaccgg 420
ctggagactc taatattact aagggccttc accgaagagg ggacaattgt tggcgaaatt 480
tcaccactgc cctctcttcc aggacatact gatgaggatg tcaaaaatgc agttggggtc 540
ctcatcggag gacttgaatg gaataataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600
ttcgcttgga gaagcagtaa tgagaatggg agacctccac tcactccaaa acagaaacgg 660
aaaatggcgg gaacaattag gtcagaagtt tga 693
<210> 2
<211> 230
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp
1 5 10 15
His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe
20 25 30
Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser
35 40 45
Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile
50 55 60
Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Met Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu
85 90 95
Glu Met Ser Arg His Trp Phe Met Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Ala
100 105 110
Gly Pro Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile
115 120 125
Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Asp Arg Leu Glu Thr Leu
130 135 140
Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Thr Ile Val Gly Glu Ile
145 150 155 160
Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn
165 170 175
Ala Val Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Glu Trp Asn Asn Asn Thr Val
180 185 190
Arg Val Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asn Glu
195 200 205
Asn Gly Arg Pro Pro Leu Thr Pro Lys Gln Lys Arg Lys Met Ala Gly
210 215 220
Thr Ile Arg Ser Glu Val
225 230
<210> 3
<211> 2202
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ctgattcaaa atggaagatt ttgtgcgaca atgcttcaat ccgatgattg tcgagcttgc 60
ggaaaaggca atgaaagagt atggagagga cctgaaaatc gaaacaaaca aatttgcagc 120
aatatgcact cacttggaag tgtgcttcat gtattcagat tttcacttca tcgatgagca 180
aggcgagtca atagtcgtag aacttggcga tccaaatgca cttttgaagc acagatttga 240
aataatcgag ggaagagatc gcacaatagc ctggacagta ataaacagta tttgcaacac 300
tacaggggct gagaaaccaa agtttctacc agatttgtat gattacaaga agaatagatt 360
catcgaaatt ggagtaacaa ggagagaagt tcacatatac tatctggaaa aggccaataa 420
aattaaatct gagaagacac acatccacat tttctcattc actggggagg aaatggccac 480
aaaggccgac tacactctcg atgaagaaag cagggctagg atcaaaacca ggctattcac 540
cataagacaa gaaatggcta gcagaggcct ctgggattcc tttcgtcagt ccgagagagg 600
cgaagagaca attgaagaaa gatttgaaat cacaggaaca atgcgcaagc ttgccgacca 660
aagtctcccg ccaaacttct ccagccttga aaattttaga gcctatgtgg atggattcga 720
accgaacggc tacattgagg gcaagctttc tcaaatgtcc aaagaagtaa atgctagaat 780
tgaacctttt ttgaaatcaa caccacgacc acttagactt ccggatgggc ctccctgttc 840
tcagcggtcc aaattcctgc tgatggatgc cttaaaatta agcattgagg acccaagtca 900
tgagggagag gggataccgc tatatgatgc aatcaaatgc atgagaacat tctttggatg 960
gaaggaaccc aatgttgtta aaccacacga aaagggaata aatccaaatt atcttctgtc 1020
atggaagcaa gtactggcag aactgcagga cattgagaat gaggagaaaa ttccaaggac 1080
taaaaatatg aagaaaacga gtcagttaaa gtgggcactt ggtgagaaca tggcaccaga 1140
aaaggtagac tttgacgatt gtaaagatgt aggcgatttg aagcaatatg atagtgatga 1200
accagaattg aggtcgcttg caagttggat tcagaatgag ttcaacaagg catgtgaact 1260
gaccgattca agctggatag agctcgatga gattggagaa gatgcggctc caattgaaca 1320
cattgcaagc atgagaagga attatttcac agcagaggtg tctcattgca gagccacaga 1380
atacataatg aagggggtgt acatcaatac tgccttgctt aatgcatcct gtgcagcaat 1440
ggatgatttc caattgattc caatgataag caagtgtaga actaaggagg gaaggcgaaa 1500
gaccaatttg tacggtttca tcataaaagg aagatcccac ttaaggaatg acaccgatgt 1560
ggtaaacttt gtgagcatgg agttttccct cactgaccca agacttgaac cacacaaatg 1620
ggagaagtac tgtgttcttg aggtaggaga tatgcttcta agaagtgcca taggccatgt 1680
gtcaaggcct atgttcttgt atgtgaggac aaatggaacc tcaaaaatta aaatgaaatg 1740
ggggatggaa atgaggcgtt gcctccttca gtcacttcaa caaatcgaga gtatgattga 1800
agctgagtcc tctgtcaagg agaaagacat gaccaaagag ttctttgaaa acaaatcaga 1860
aacatggccc gttggagagt cccccaaagg agtggaggaa ggttccattg ggaaggtctg 1920
cagaacttta ttggcaaagt cggtattcaa cagcttgtat gcatctccac aactggaagg 1980
attttcagct gaatcaagaa aactgcttct tatcgttcag gctcttaggg acaacctgga 2040
acctgggacc tttgatcttg gggggctata tgaagcaatt gaggagtgcc tgattaatga 2100
tccctgggtt ttgcttaatg cttcttggtt caactccttc ctcacacatg cattgagata 2160
gttgtggcaa tgctactatt tgctatccat actgtccaaa aa 2202
<210> 4
<211> 2303
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
atttgaatgg atgtcaatcc gactttactt ttcttaaaag tgccagcaca aaatgctata 60
agcacaactt tcccttatac tggagaccct ccttacagcc atgggacagg aacaggatac 120
accatggata ctgtcaacag gacacatcag tactcagaaa ggggaagatg gacaacaaac 180
accgaaactg gagcaccgca actcaacccg attgatgggc cactgccaga agacaatgaa 240
ccaagtggtt atgcccaaac agattgtgta ttggaagcaa tggccttcct tgaggaatcc 300
catcctggta tctttgagac ctcgtgtctt gaaacgatgg aggttgttca gcaaacacga 360
gtggacaagc tgacacaagg ccgacagacc tatgactgga ctctaaatag gaaccagcct 420
gctgcaacag cattggccaa cacaatagaa gtgttcagat caaatggcct cacggccaat 480
gaatctggaa ggctcataga cttccttaag gatgtaatgg agtcaatgaa caaagaagaa 540
atggagatca caactcattt tcagagaaag agacgagtga gagacaatat gactaagaaa 600
atggtgacac agagaacaat aggtaaaagg aagcagagat tgaacaaaag gagttatcta 660
attagggcat taaccctgaa cacaatgacc aaagatgctg agagagggaa gctaaaacgg 720
agagcaattg caaccccagg gatgcaaata agggggtttg tatactttgt tgagacacta 780
gcaaggagta tatgtgagaa acttgaacaa tcaggattgc cagttggagg caatgagaag 840
aaagcaaagt tggcaaatgt tgtaaggaag atgatgacca attctcagga cactgaaatt 900
tctttcacca tcactggaga taacaccaaa tggaacgaaa atcagaaccc tcggatgttt 960
ttggccatga tcacatatat aaccagaaat cagcccgaat ggttcagaaa tgttctaagt 1020
attgctccaa taatgttctc aaacaaaatg gcgagactgg gaaaggggta catgtttgag 1080
agcaagagta tgaaacttag aactcaaata cctgcagaaa tgctagcaag catcgatttg 1140
aaatacttca atgattcaac tagaaagaag attgaaaaaa tccggccgct cttaatagat 1200
gggactgcat cattgagccc tggaatgatg atgggcatgt tcaatatgtt aagtactgta 1260
ttaggcgtct ccatcctgaa tcttggacaa aagagacaca ccaagactac ttactggtgg 1320
gatggtcttc aatcttctga tgattttgct ctgattgtga atgcacccaa tcatgaaggg 1380
attcaagccg gagtcaacag gttttatcga acctgtaagc tacttggaat taatatgagc 1440
aagaaaaagt cttacataaa cagaacaggt acatttgaat tcacaagttt tttctatcgt 1500
tatgggtttg ttgccaattt cagcatggag cttcccagct ttggggtgtc tgggatcaac 1560
gagtctgcgg acatgagtat tggagttact gtcatcaaaa acaatatgat aaacaatgat 1620
cttggtccag caaccgctca aatggccctt cagctgttca tcaaagatta caggtacacg 1680
taccggtgcc atagaggtga cacacaaata caaacccgaa gatcatttga aataaagaaa 1740
ctgtgggagc aaacccattc caaagctgga ctgctggtct ccgacggagg cccaaattta 1800
tacaacatta gaaatctcca cattcctgaa gtctgcttga aatgggaatt aatggatgag 1860
gattaccagg ggcgtttatg caacccactg aacccatttg tcaaccataa agacattgaa 1920
tcagtgaaca atgcagtgat aatgccagca catggtccag ccaaaaacat ggagtatgat 1980
gctgttgcaa caacacactc ctggatcccc aaaagaaatc gatccatctt gaatacaagc 2040
caaagaggaa tacttgaaga tgaacaaatg taccaaaagt gctgcaactt atttgaaaaa 2100
ttcttcccca gcagttcata cagaagacca gtcgggatat ccagtatggt ggaggctatg 2160
gtttccagag cccgaattga tgcacgaatt gatttcgaat ctggaaggat aaagaaagag 2220
gagttcactg agatcatgaa gatctgttcc accattgaag agctcagacg gcaaaaatag 2280
tgaatttagc ttgtccttca tga 2303
<210> 5
<211> 2290
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
atggaaagaa taaaagaact aaggaatcta atgtcgcagt ctcgcactcg cgagatactc 60
acaaaaacca ccgtggacca tatggccata atcaagaagt acacatcagg aagacaggag 120
aagaacccag cacttaggat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat tacagcagac 180
aagaggataa cggaaatgat tcctgagaga aatgagcagg gacaaacttt atggagtaaa 240
atgaatgacg ccggatcaga ccgagtgatg gtatcacctc tggctgtgac atggtggaat 300
aggaatggac cagtgacaag tacagttcat tatccaaaaa tctacaaaac ttattttgaa 360
aaagtcgaaa ggttaaaaca tggaaccttt ggccctgtcc attttagaaa ccaagtcaaa 420
atacgtcgaa gagttgacat aaatcctggt catgcagatc tcagtgccaa agaggcacag 480
gatgtaatca tggaagttgt tttccctaac gaagtgggag ccaggatact aacatcggaa 540
tcgcaactaa cgacaaccaa agagaagaaa gaagaactcc agggttgcaa aatttctcct 600
ctgatggtgg catacatgtt ggagagagaa ctggtccgca aaacgagatt cctcccagtg 660
gctggtggaa caagcagtgt gtacattgaa gtgttgcatt tgacccaagg aacatgctgg 720
gaacagatgt acactccagg aggggaggcg aggaatgatg atgttgatca aagcttaatt 780
attgctgcta gaaacatagt aagaagagcc acagtatcag cagatccact agcatcttta 840
ttggagatgt gccacagcac gcagattggt ggagtaagga tggtaaacat ccttaggcag 900
aacccaacag aagagcaagc cgtggatatt tgcaaggctg caatgggact gagaattagc 960
tcatccttca gttttggtgg attcacattt aagagaacaa gcggatcatc agtcaagaga 1020
gaggaagagg tgcttacggg caatcttcag acattgaaga taagagtgca tgagggatat 1080
gaagagttca caatggttgg gagaagagca acagctatac tcagaaaagc aaccaggaga 1140
ttgattcagc tgatagtgag tgggagagac gaacagtcga ttgccgaagc aataattgtg 1200
gccatggtat tttcacaaga ggattgtatg ataaaagcag ttagaggtga cctgaatttc 1260
gtcaataggg cgaatcagcg attgaatccc atgcaccaac ttttgagaca ttttcagaag 1320
gatgcaaagg tgctctttca aaattgggga attgaatcca tcgacaatgt gatgggaatg 1380
atcgggatat tgcccgacat gactccaagc accgagatgt caatgagagg agtgagaatc 1440
agcaaaatgg gggtagatga gtattccagc gcggagaaga tagtggtgag cattgaccgt 1500
tttttgagag ttagggacca acgtgggaat gtactactgt ctcccgagga ggtcagtgaa 1560
acacagggaa cagagaaact gacaataact tactcatcgt caatgatgtg ggagattaat 1620
ggtcctgaat cagtgttggt caatacctat cagtggatca tcagaaactg ggaaactgtt 1680
aaaattcagt ggtcccagaa tcctacaatg ctgtacaata aaatggaatt tgagccattt 1740
cagtctttag ttccaaaggc cgttagaggc caatacagtg ggtttgtgag aactctgttc 1800
caacaaatga gggatgtgct tgggacattt gataccgctc agataataaa acttcttccc 1860
ttcgcagccg ctccaccaaa gcaaagtgga atgcagttct cctcattgac tataaatgtg 1920
aggggatcag gaatgagaat acttgtaagg ggcaattctc cagtattcaa ctacaacaag 1980
accactaaaa gactcacagt tctcggaaag gatgctggcc ctttaactga agacccagat 2040
gaaggcacag ctggagttga gtccgcagtt ctgagaggat tcctcattct gggcaaagaa 2100
gacaggagat atggaccagc attaagcata aatgaactga gcaaccttgc gaaaggagag 2160
aaggctaatg tgctaattgg gcaaggagac gtggtgttgg taatgaaacg gaaacggaac 2220
tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggc catcaattag 2280
tgtcgaatag 2290
<210> 6
<211> 1725
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
ccaaaatgaa ggcaaaacta ctggtcctgt tatatgcatt tgtagctaca gatgcagaca 60
caatatgtat aggctaccat gcgaacaact caaccgacac tgttgacaca atattcgaga 120
agaatgtggc agtgacacat tctgttaacc tgctcgaaga cagacacaac gggaaactat 180
gtaaattaaa aggaatagcc ccactacaat tggggaaatg taacatcatc ggatggctct 240
tgggaaatcc agaatgcgac tcactgcttc cagcgagatc atggtcctac attgtagaaa 300
caccaaactc tgagaatgga gcatgttatc caggagattt catcgactat gaggaactga 360
gggagcaatt gagctcagta tcatcattag aaagattcga aatatttccc aaggaaagtt 420
catggcccaa ccacacattc aacggagtaa cagcatcatg ctcccatagg ggaaaaagca 480
gtttttacag aaatttgcta tggctgacga agaaggggga ttcataccca aagctgacca 540
attcctatgt gaacaataaa gggaaagaag tccttgtact atggggtgtt catcacccgt 600
ctagcagtga tgagcaacag agtctctata gtaatggaaa tgcttatgtc tctgtagcgt 660
cttcaaatta taacaggaga ttcaccccgg aaatagctgc aaggcccaaa gtaaaagatc 720
aacatgggag gatgaactat tactggacct tgctagaacc cggagacaca ataatatttg 780
aggcaactgg taatctaata gcaccatggt atgctttcgc actgagtaga gggtttgagt 840
ccggcatcat cacctcaaac gcgtcaatgc atgagtgtaa cacgaagtgt caaacacccc 900
agggatctat aaacagcaat ctccctttcc agaatataca cccagtcaca ataggagagt 960
gcccaaaata tgtcaggagt accaaattga ggatggttac aggactaaga aacatcccat 1020
ccattcaata cagaggtcta tttggagcca ttgctggttt tattgagggg ggatggactg 1080
gaatgataga tggatggtat ggttatcatc atcagaatga acagggatca ggctatgcag 1140
cggatcaaaa aagcacacag aatgccatta acgggattac aaacaaggtg aactctatta 1200
tcgagaaaat gaacactcaa ttcacagctg tgggtaaaga attcaacaac ttagaaaaaa 1260
ggatggaaaa tttaaataaa aaagttgatg atgggtttct ggacatttgg acatataatg 1320
cagaattgtt agttctactg gaaaatggaa gaactttgga tttccatgac ttaaatgtga 1380
agaatctgta cgagaaagta aaaagccaat taaagaataa tgccaaagaa atcggaaatg 1440
ggtgttttga gttctaccac aagtgtgaca atgaatgcat ggaaagtgta agaaatggga 1500
cttatgatta tccaaaatat tcagaagaat caaagttgaa cagggaaaag atagatggag 1560
tgaaattgga atcaatgggg gtgtatcaga ttctggcgat ctactcaact gtcgccagtt 1620
cactggtgct tttggtctcc ctgggggcaa tcagtttctg gatgtgttct aatgggtctt 1680
tgcagtgcag aatatgcatc tgagattagg atttcagaaa tataa 1725
<210> 7
<211> 1526
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
tcactcacag agtgacatcg aaatcatggc gaccaaaggc accaaacgat cttacgaaca 60
gatggagact gatggagaac gccagaatgc cactgaaatc agagcatctg tcggaaaaat 120
gattgatgga attggacgat tctacatcca aatgtgcacc gaacttaaac tcagtgatta 180
tgagggacgg ctgattcaga acagcttaac aatagagaga atggtgctct ctgcttttga 240
cgagaggagg aataaatatc tagaagaaca tcccagtgcg gggaaagatc ctaagaaaac 300
tggaggacct atatacagga gagtagatgg aaagtggagg agagaactca tcctttatga 360
caaagaagaa ataagacgaa tctggcgcca agctaataat ggtgacgatg caacggctgg 420
tctgactcac atgatgatct ggcactccaa tttgaatgat gcaacttacc agaggacaag 480
agctcttgtt cgcacaggaa tggatcccag gatgtgctca ctgatgcagg gttcaaccct 540
ccctaggagg tctggggccg caggtgctgc agtcaaagga gttggaacaa tggtgatgga 600
attgatcaga atgatcaaac gtgggatcaa tgatcggaac ttctggaggg gtgagaatgg 660
acggagaaca aggattgctt atgaaagaat gtgcaacatt ctcaaaggga aatttcaaac 720
agctgcacaa agaacaatgg tggatcaagt gagagagagc cggaatccag gaaatgctga 780
gttcgaagat ctcatctttt tagcacggtc tgcactcata ttgagagggt cagttgctca 840
caagtcctgc ctgcctgcct gtgtgtatgg atctgccgta gccagtggat acgactttga 900
aagagaggga tactctctag tcggaataga ccctttcaga ctgcttcaaa acagccaagt 960
atacagccta atcagaccaa atgagaatcc agcacacaag agtcaactgg tgtggatggc 1020
atgccattct gctgcatttg aagatctaag agtatcaagc ttcatcagag ggacgaaagt 1080
ggtcccaaga gggaagcttt ccactagagg agttcaaatt gcttccaatg aaaacatgga 1140
gactatggaa tcaagtaccc ttgaactgag aagcagatac tgggccataa ggaccagaag 1200
tggagggaac accaatcaac agagggcttc ctcgggccaa atcagcatac aacctacgtt 1260
ctcagtacag agaaatctcc cttttgacag accaaccatt atggcagcat tcactgggaa 1320
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ataagagagc cttttatttc atgttctcac ttggaatgca ggaccttttt tctgactcaa 360
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gccttaatga gctgccctgt cggtgaagct ccgtccccgt acaattcaag gtttgaatcg 480
gttgcttggt cagcaagtgc atgtcatgat ggaatgggct ggctaacaat cggaatttct 540
ggtccagatg atggagcagt ggctgtatta aaatacaacg gcataataac tgaaaccata 600
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tcatgtttta ccataatgac cgatggccca agtgatgggc tggcctcgta caaaattttc 720
aagatcgaga aggggaaggt tactaaatca atagagttga atgcacctaa ttctcactac 780
gaggaatgtt cctgttaccc tgataccggc aaagtgatgt gtgtgtgcag agacaattgg 840
cacggttcga accgaccatg ggtgtccttc gaccaaaacc tagattataa aataggatac 900
atctgcagtg gggttttcgg tgacaacccg cgtcccaaag atggaacagg cagctgtggc 960
ccagtgtctg ctgatggagc aaacggagta aagggatttt catataagta tggtaatggt 1020
gtttggatag gaaggactaa aagtgacagt tccagacatg ggtttgagat gatttgggat 1080
cctaatggat ggacagagac tgatagtagg ttctctatga gacaagatgt tgtggcaatg 1140
actgatcggt cagggtacag cggaagtttc gttcaacatc ctgagctaac agggctagac 1200
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcgtcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcggggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgctc ttaatgggaa cggagatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctta agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatagcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgcgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ctagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg atattgctag tcaggccagg caaatggtgc aggcgatgag aaccgttggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctaaaa gatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacga ttcaagtgat cctctcgtca ttgcagcaaa 780
tatcattgga atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgtctttttt tcaaatgcat 840
ttatcgtcgc tttaaatacg gtttgaaaag agggccttct acggaaggag tgccagagtc 900
tatgagggaa gaatatcgaa aggaacagca gaatgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960
tgtcaacata gagctggagt aaaa 984

Claims (3)

1.一种制备流感病毒疫苗的方法，包括如下步骤：
（1）将重组病毒感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F1代病毒液；
（2）F1代病毒液感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F2代病毒液；
（3）F2代病毒液感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F3代病毒液；
（4）将F3代病毒液作为流感病毒疫苗的活性成分；
所述重组病毒为如下（a）或（b）：
（a）一种重组病毒，是将流感病毒基因组中编码NS1蛋白的两个氨基酸残基的密码子进行如下突变得到的重组病毒：第38位氨基酸残基的密码子由精氨酸密码子突变为丙氨酸密码子，第41位氨基酸残基的密码子由赖氨酸密码子突变为丙氨酸密码子；
（b）一种重组病毒，其制备方法包括如下步骤：
将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-M、质粒pHH21-NS1R38A/K41A、质粒pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和质粒pcDNA3.0-NP共转染离体哺乳动物细胞后进行培养得到的重组病毒；
pHH21-PA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-PB1为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-PB2为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-HA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NP为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NA为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-M为在载体pHH21的多克隆位点插入序列表的序列9所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pHH21-NS1R38A/K41A为将编码突变蛋白的基因插入载体pHH21的多克隆位点得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PA为在载体pcDNA3.0的多克隆位点插入序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PB1为在载体pcDNA3.0的多克隆位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-PB2为在载体pcDNA3.0的多克隆位点插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的重组质粒；质粒pcDNA3.0-NP为在载体pcDNA3.0的多克隆位点插入序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的重组质粒；
所述突变蛋白，是将流感病毒的NS1蛋白进行如下两个氨基酸残基的突变得到的：第38位氨基酸残基由精氨酸突变为丙氨酸，第41位氨基酸残基由赖氨酸突变为丙氨酸。
2.一种制备流感病毒疫苗的方法，包括如下步骤：
（1）将权利要求1中所述的重组病毒感染MDCK细胞，培养后收集上清，即F1代病毒液；
（2）F1代病毒液感染A549细胞，培养后收集上清，即F2代病毒液；
（3）将F2代病毒液作为流感病毒疫苗的活性成分。
3.权利要求1或2所述方法制备得到的流感病毒疫苗。
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