PT1820853E - Vírus recombinante da gripe para vacinas e terapia genética - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
VÍRUS RECOMBINANTE DA GRIPE PARA VACINAS E TERAPIA
GENÉTICA
Antecedentes da Invenção A capacidade para gerar virus infecciosos de ARN a partir de ADNc clonado tem contribuído em grande medida para a compreensão biológica destes agentes patogénicos e, por isso, tem contribuído para melhorar os processos de controlo da doença (Palese et al., 1996) . Contudo, este progresso tem estado relativamente limitado para os vírus com ARN com sentido negativo, quando comparados com os vírus com ARN com sentido positivo, porque nem o ARN virai genómico (ARNv) nem o ARN complementarmente anti-genómico (ARNc) dos vírus de ARN de sentido negativo, podem servir como uma matriz directa para a síntese de proteínas. Em vez disso, o ARNv, após a sua encapsidação pelas nucleoproteínas virais (NP), deve ser transcrito num ARNm de sentido positivo, por meio do complexo de polimerase de ARN virai. Assim, a unidade mínima de replicação é formada pelo ARNv genómico complexado com NP e as proteínas de polimerase. Apesar destes obstáculos, têm sido estabelecidos processos genéticos inversos para produzir vírus de ARN de sentido negativo, não segmentado, incluindo vírus da raiva (Snell et al., 1994), vírus da estomatite vesicular (Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995), vírus do sarampo (Radecke et al., 1995), vírus respiratórios sincitiais (Collins et al., 1995), vírus de Sendai (Garcin et al., 1995; Kato et al., 1996), vírus da peste bovina (Baron et al., 1997), vírus humana da para-gripe do tipo 3 (Hoffman et al., 1997) e SV5 (He et al., 1997) . 1
As famílias de Orthomyxoviridae, Arenaviridae e Bunyaviridae contêm genomas de ARN de hélice negativa, segmentado e incluem vários agentes patogénicos humanos e de animais, por exemplo, vírus da gripe dos tipos A, B e C (Orthomyxoviridae), vírus de coriomeningite linfocítica (VCML) (Arenaviridae) e vírus da febre encefalítica e hemorrágica (Bunyaviridae, Arenaviridae) . Os seus genomas consistem em duas (Arenaviridae), três (Bunyaviridae) ou seis a oito (Orthomyxoviridae) moléculas de ARN de hélices simples de polaridade negativa (complementar de ARNm). Os ARNv interagem com NP e com a polimerase de ARN dependente de ARN virai para formar complexos de ribonucleoproteínas (RNP). As RNP estão rodeadas por uma camada dupla de lípidos derivadas da célula hospedeira. Inseridas neste envelope estão as glicoproteínas virais, que são essenciais para a ligação do receptor e a entrada na célula hospedeira. Assim, a possibilidade de gerar vírus de ARN de sentido negativo, segmentados, a partir de ADNc clonado, é um enorme desafio, dado que se pode produzir um ARNv separado para cada segmento de gene.
Bridgen e Elliott (1996) produziram um vírus de Bunyamwera (família Bunyaviridae) a partir de ADNc clonados codificando três segmentos de ARNv anti-genómico de sentido positivo. Contudo, a eficiência da recuperação do vírus foi baixa. Nenhum dos ortomixovírus, que contêm seis (togotovírus) , sete (vírus da gripe C) ou oito (vírus da gripe A e B) segmentos de ARN de sentido negativo, foi completamente produzido a partir do ADNc clonado. Este atraso no progresso tem sido sentido de uma forma mais aguda nos esforços para controlar as infecções por vírus da gripe.
Palese e os colegas (Enami et al., 1990) foram pioneiros da genética inversa, o sistema dependente de vírus auxiliares 2 para o virus da gripe A (figura IA) . Na sua abordagem, geraram-se complexos de RNP por meio da síntese de ARNv in vitro, na presença de polimerase purificada e de proteínas NP e depois foram utilizados para transfectar células eucarióticas. A infecção subsequente com vírus auxiliares da gripe A resulta na geração de vírus que têm um gene derivado do ADNc clonado. Um segundo processo, desenvolvido por Neumann et al. (1994), baseia-se na síntese, in vivo, de ARNv por polimerase I de ARN (figura 1B) , uma enzima celular que transfere o ARN ribossómico a que falta a extremidade 5' e uma causa poli A de 3' . As células infectadas com vírus da gripe e transf ectadas com um plasmido contendo o ADNc do vírus da gripe, flanqueadas por um promotor de polimerase I de ARN de murino e sequências terminadoras levaram à produção de vírus transfectantes. Contudo, em ambos os métodos, os transfectantes têm de ser seleccionados a partir de um vasto conjunto anterior de vírus auxiliares, o que requer um sistema poderoso de selecção e complica a geração de vírus com defeitos de crescimento.
Um sistema para gerar partículas semelhantes a vírus (PSV) incompetentes no que respeita à replicação foi desenvolvido por Mena et al. (1996), em que um ARNv semelhante ao vírus da gripe, codificando um gene repórter é transcrito in vitro e transfectado em células eucarióticas. As dez proteínas do vírus da gripe são expressas a partir de plasmidos sob o controlo de um promotor de polimerase de ARN de T7. Quando as células transfectadas são infectadas com um vírus vaccínia recombinante, que expressa a polimerase de ARN de T7, produzem as PSV da gripe. Contudo, a eficácia do sistema é baixa: em 25 % das experiências, os investigadores não conseguiram detectar a expressão do gene repórter. Além disso, o vírus vaccínia expressa mais do que 80 proteínas, 3 sendo que cada uma delas pode afectar o ciclo de vida do vírus da gripe.
Assim, é necessário um processo para preparar vírus de ARN de hélice negativa, segmentado, por exemplo, orto-mixovírus, tal como vírus da gripe A, inteiramente a partir dos ADNc clonados. A presente invenção tem por objecto uma preparação de vírus infeccioso recombinante da gripe preparada na ausência de um vírus auxiliar, a partir de células que contactam com uma composição que contém uma variedade de vectores de vírus ortomixo que compreende: (i) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da PA de vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, (ii) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da PB1 de um vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, (iii) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da PB2 de um vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, (iv) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da HÁ de um vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, (v) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da NP de um vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, (vi) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da NA de um vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, 4 (vii) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da M de um virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, (viii) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da NS de um virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, (ix) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um segmento de ADN que codifica um polipéptido da PA do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, (x) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um segmento de ADN que codifica um polipéptido da PB1 do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, (xi) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um segmento de ADN que codifica um polipéptido da PB2 do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, e (xii) um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um segmento de ADN que codifica um polipéptido da NP do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de uma transcrição, em que a referida preparação é isolada das referidas células. Outras modalidades desta preparação de um virus recombinante infeccioso da gripe estão caracterizadas nas reivindicações. A principal diferença na comparação com as preparações de virus da gripe obtidas de amostras originais, tal como estão descritas em Suárez et al. (1992), é que a preparação do virus da gripe da presente invenção tem uma excelente homogeneidade. 5
Sumário da Invenção A presente memória descritiva providencia pelo menos um dos vectores isolados e purificados que se seguem: um vector que compreende um promotor, ligado operacionalmente a um ADNc de PA do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um vírus da gripe. 0 ADNc de PB1 ligado a uma sequência de terminação de transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc de PB2 do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da HA do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da NP do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da NA do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da M do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de transcrição e um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc da NS do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação de transcrição. 0 ADNc pode ter uma orientação paralela ou anti-paralela relativamente ao promotor. Assim, um vector da presente invenção pode codificar uma proteína de ortomixovírus (paralela) ou um ARN (anti-paralelo). Qualquer promotor pode ser utilizado para expressar uma proteína virai: os promotores preferidos para os vectores que codificam o ARNv incluem, mas não se limitam, a um promotor de polimerase I de ARN, a um promotor de polimerase II de ARN, a um promotor de polimerase III de ARN, a um promotor de T7; e a um promotor de T3. É preferível ainda que o promotor da polimerase I de ARN seja um promotor 6 de polimerase I de ARN humano. As sequências de terminação da transcrição preferidas para os vectores que codificam o ARNv incluem, mas não se limitam a uma sequência de terminação da transcrição de polimerase I de ARN, uma sequência de terminação de transcrição da polimerase II de ARN ou uma sequência de terminação de transcrição da polimerase III de ARN ou uma ribozima. Preferencialmente, os vectores compreendem ADNc da gripe, por exemplo, ADN A (por exemplo, qualquer gene da gripe A incluindo qualquer um dos subtipos 15 HA ou 9 NA) , B ou C da gripe (ver capítulos 45 e 46 de Fields Virology (Fields et al. (eds.), Lippincott-Raven Publ., Philadelphia. PA (1996), que foram aqui especialmente incorporados como referência), embora se suponha que os genes de quaisquer vírus possam ser utilizados nos vectores ou nos processos da presente invenção. A memória descritiva providencia uma composição que compreende vários vectores de ortomixovírus da presente invenção. Numa modalidade da presente invenção, a composição compreende: a) pelo menos dois vectores seleccionados a partir de um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc de PA do vírus da gripe, ligado a uma sequência de germinação da transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc de PB1 do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc de PB2 do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc de HA do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc de NP do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc de 7 NA do virus da gripe, ligado a uma seguência de terminação da transcrição, um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc de M do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição e um vector que compreende um promotor ligado operacionalmente a um ADNc de NS do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição; e b) pelo menos dois vectores seleccionados a partir de um vector que codifica PA do virus da gripe, um vector que codifica PB1 do virus da gripe, um vector que codifica PB2 do virus da gripe e um vector que codifica NP do virus da gripe. Preferencialmente, os vectores que codificam proteínas virais compreendem ainda uma sequência de terminação da transcrição. Prefere-se que um promotor para os vectores que compreendem o ADNc do vírus da gripe e inclui um promotor de polimerase I de ARN, um promotor de polimerase II de ARN, um promotor de polimerase III de ARN, um promotor de T7 e um promotor de T3. Também se prefere que cada vector que compreende o ADNc do vírus da gripe compreenda uma sequência da terminação da transcrição, tal como, uma sequência de germinação da transcrição de polimerase I de ARN, uma sequência de terminação da transcrição da polimerase II de ARN ou uma sequência de terminação da transcrição da polimerase III de ARN ou uma ribozima. Preferencialmente, os vectores compreendem o ADN do vírus da gripe, por exemplo, o ADN do vírus da gripe A, B ou C.
Mais preferencialmente, a composição descrita compreende uma variedade de vectores de ortomixovírus, que compreende: a) pelo menos dois vectores seleccionados num vector que compreende um promotor de polimerase I de ARN ligado operacionalmente a um ADNc da PA do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição de polimerase I de ARN, um vector que compreende um promotor de polimerase I de ARN, ligado operacionalmente a um ADNc da PB1 do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição de polimerase I de ARN, um vector que compreende um promotor de polimerase I de ARN, ligado operacionalmente a um ADNc de PB2 do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição de polimerase I de ARN, um vector que compreende um promotor de polimerase I de ARN, ligado operacionalmente a um ADNc de HA do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição de polimerase I de ARN, um vector que compreende um promotor de polimerase I de ARN, ligado operacionalmente a um ADNc de NP do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição de polimerase I de ARN, um vector que compreende um promotor de polimerase I de ARN, ligado operacionalmente a um ADNc de NA do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição de polimerase I de ARN, um vector que compreende um promotor de polimerase I de ARN, ligado operacionalmente a um ADNc de M do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição de polimerase I de ARN, um vector que compreende um promotor de polimerase I de ARN, ligado operacionalmente a um ADNc de NS do virus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição de polimerase I de ARN; e b) pelo menos dois vectores seleccionados num vector que codifica PA do virus da gripe, um vector que codifica PB1 do virus da gripe, um vector que codifica PB2 do virus da gripe, um vector que codifica NP do virus da gripe, um vector que codifica HA do virus da gripe, um vector que codifica NA do virus da gripe, um vector que codifica Ml do virus da gripe, um vector que codifica M2 do virus da gripe e um vector que codifica NS2 do virus da gripe.
Outra modalidade da descrição compreende uma composição, tal como descrita antes, compreende ainda um vector que compreende um promotor ligado às sequências não codificantes do ortomixovirus de 5' ligadas às desejadas sequências não 9 codificantes de ortomixovírus 3' , ligadas às sequências de terminação de transcrição. A introdução de uma tal composição numa célula hospedeira permissiva para a replicação do ortomixovírus, resulta num vírus recombinante que compreende o ARNv correspondente às sequências do vector, que contém as sequências 5' não codificantes de ortomixovírus ligadas a um ADN ligado às sequências não codificantes de 3' de ortomixovírus. Preferencialmente, o ADNc está numa orientação anti-paralela. Também preferencialmente, o promotor é um promotor de polimerase I de ARN, um promotor de polimerase II de ARN, um promotor de polimerase III de ARN, um promotor de T7 e um promotor de T3. Também é preferível que a sequência de terminação da transcrição seja uma sequência de terminação da transcrição de polimerase I de ARN, uma sequência de terminação da transcrição de polimerase II de ARN ou uma sequência de terminação da transcrição de polimerase III de ARN ou uma ribozima. Por exemplo, o ADNc pode codificar um epitopo imunogénico, tal como um epitopo útil na terapia de cancro ou numa vacina. Vários dos vectores descritos podem estar fisicamente ligados ou cada vector pode estar presente num plasmido individual ou noutro veículo, por exemplo, um veículo de libertação de ácido nucleico linear. A memória descritiva também providencia um processo para preparar o vírus da gripe. 0 processo compreende o contacto de uma célula com uma variedade de vectores da presente invenção, por exemplo, sequencialmente ou simultaneamente, por exemplo, utilizando uma composição da presente invenção, numa quantidade eficaz para produzir o vírus infeccioso da gripe. A presente invenção também inclui o isolamento do vírus a partir de uma célula que contacta com a composição. Assim, a presente invenção ainda tem por objecto um vírus 10 isolado, assim como, uma célula hospedeira que contacta com a composição ou o virus isolado da presente invenção.
Tal como descrito aqui a seguir, os virus da gripe A foram preparados inteiramente a partir de ADNc clonado. A abordagem da genética inversa aqui descrita é altamente eficaz e pode ser utilizada para introduzir mutações em qualquer segmento de gene e para desenvolver sistemas de libertação de genes à base de virus da gripe. Por exemplo, as células embrionárias de rins humanos (293T) foram transfectadas com oito plasmidos, cada um deles codificando um ARN virai do virus A/WSN/33 (H1N1) ou A/PR/8/34 (H1N1), flanqueado pelo promotor da polimerase I de ARN humano e o terminador da polimerase I de ARN de murganho, em conjunto com plasmidos que codificam a nucleoproteina virai e as polimerases virais PB2, PB1 e PA. Esta estratégia origina > 1 x 103 unidades de formação de placas (ufp) de virus por mL do sobrenadante, 48 horas após a transfecção. Consoante o vírus gerado, a adição de plasmidos que expressam todas as proteínas estruturais, virais, remanescentes, levam a um aumento substancial na produção do vírus > 3 x 104 ufp/mL. A genética inversa foi também utilizada para gerar um vírus de reagrupamento contendo o gene PB1 do vírus A/PR/8/34, com todos os outros genes representando A/WSN/33. Outros vírus produzidos por este processo tinham mutações no gene PA ou tinham um epítopo exógeno no topo da proteína neuraminidase.
Além disso, a expressão de ARNc em células em vez do ARNv pode melhorar a eficiência da geração de vírus. 0 processo descrito permite uma manipulação fácil dos vírus da gripe, por exemplo, por introdução de mutações de atenuação virai. Além disso, dado que os vírus da gripe induzem uma forte imunidade humoral e celular, a presente 11 invenção potência enormemente este vírus como vector de vacinas, particularmente tendo em vista a disponibilidade de variantes naturais do vírus, que podem ser utilizadas sequencialmente, permitindo a utilização repetitiva da terapia genética.
Assim, a presente invenção providencia vectores ou plasmidos isolados e purificados, que expressam ou codificam as proteínas do vírus da gripe ou que expressam ou codificam 0 ARNv da gripe, tanto o ARNv natural como o recombinante. Assim, um vector ou um plasmido da presente invenção pode conter um gene ou um quadro de leitura aberta de interesse, por exemplo, um gene exógeno que codifica um péptido imunogénico ou uma proteína úteis como vacinas. Preferencialmente, o vector ou o plasmido que expressam o ARNv da gripe compreendem um promotor, por exemplo, uma polimerase I de ARN, apropriado para a expressão numa célula hospedeira particular, por exemplo, em células hospedeiras de aves ou de mamíferos, tais como, células de caninos, felinos, equinos, bovinos, ovinos ou primatas, incluindo células de seres humanos. Também preferencialmente os vectores ou os plasmidos que compreendem o ADN útil para preparar o ARNv da gripe compreendem sequências de terminação da transcrição de polimerase I de ARN. Para os vectores ou os plasmidos que compreendem um gene ou um quadro de leitura aberta de interesse, é preferível que o gene ou o quadro de leitura aberta sejam flanqueados pelas sequências de não codificação 5' e 3' do vírus da gripe e, ainda mais preferencialmente, que o gene ou o quadro de leitura aberta estejam operacionalmente ligados a um promotor de polimerase I de ARN e a uma sequência de terminação da transcrição da polimerase 1 de ARN. 12
Tal como descrito aqui a seguir, as células 293T foram transfectadas com plasmidos que codificam as proteínas estruturais do vírus da gripe A, em conjunto com um plasmido que continha o gene repórter das proteínas de fluorescência verde (PFV) flanqueado por um promotor e um terminador de polimerase I de ARN. A transcrição intercelular desta última estrutura pela polimerase I de ARN gerada pelo ARNv da PFV, que foi empilhada em partículas semelhantes ao vírus da gripe. Este sistema, que produziu mais do que 104 partículas infecciosas por mL de sobrenadante, pode ser útil nos estudos da replicação do vírus da gripe e da formação de partículas. Também podem ser esforços benéficos na produção de vacinas e no desenvolvimento de melhores vectores da terapia de genes.
Por isso, a memória descritiva também providencia uma célula hospedeira, cujo genoma é aumentado de uma forma estável com pelo menos uma molécula de ADN recombinante. A molécula de ADN recombinante inclui pelo menos uma das seguintes: uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligado a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN que compreende uma sequência de paragem da transcrição ou uma sequência de terminação, ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de HA do vírus da gripe; uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na linha de células hospedeiras, ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ou uma sequência de terminação ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de NA do vírus da gripe; uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ou uma sequência de terminação ligada a um segundo sítio lox ligado 13 a uma região de codificação de Ml do vírus da gripe; uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ou uma sequência de terminação ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de NS2 do vírus da gripe; uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ou uma sequência de terminação ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de M2 do vírus da gripe; uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligada a um primeiro sítio loxP ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ou uma sequência de terminação ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de PA do vírus da gripe; uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ou uma sequência de terminação ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação do vírus PBl da gripe; uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ou uma sequência de terminação ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação do vírus PB2 da gripe; ou uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ou uma 14 sequência de terminação ligada a um segundo sitio lox ligado a uma região de codificação de NP do virus da gripe.
Preferencialmente, a célula hospedeira é aumentada com uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligado a um primeiro sitio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sitio lox ligado a uma região de codificação do virus HA da gripe; uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligado a um primeiro sitio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sitio lox ligado a uma região de codificação do virus NA da gripe; uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligado a um primeiro sitio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sitio lox ligado a uma região de codificação do virus Ml da gripe; uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligado a um primeiro sitio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sitio lox ligado a uma região de codificação do virus NS2 da gripe; e uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira, ligado a um primeiro sitio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sitio lox ligado a uma região de codificação do virus HA da gripe M2. Preferencialmente, os sítios lox são sítios loxP. A presente patente também providencia um processo para preparar vírus infeccioso da gripe defeituoso na replicação. 0 processo compreende o contacto de uma célula hospedeira que 15 é aumentada com, pelo menos, uma molécula de ADN recombinante da presente invenção, por exemplo, codificando HA, NA, Ml, M2, NS2, PA, PB 1, PB2 ou NP, com um virus recombinante da gripe que compreende: ARNv que compreende um quadro de leitura aberta de Cre e ARNv que compreendem genes da gripe não expressos pela célula hospedeira. 0 virus é então recuperado a partir do contacto com a célula hospedeira. Preferencialmente, o virus recombinante ainda compreende ARNv contendo um quadro de leitura aberta desejado. Alternativamente, a célula hospedeira aumentada contacta com o vector que compreende um promotor funcional na célula hospedeira ligada operacionalmente a um segmento de ADN que codifica Cre e uma variedade de vectores, cada um deles contendo um promotor ligado operacionalmente ao ADNc do virus da gripe não presente na célula hospedeira. Recupera-se então depois o virus. A memória descritiva também providencia uma célula hospedeira, cujo genoma é aumentado com uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira ligada a um primeiro sitio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sitio lox ligado à região de codificação da proteína de ligação à superfície da célula hospedeira; uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação da proteína de fusão; uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de Ml 16 do virus da gripe; uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira ligada a um primeiro sitio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de NS2 do vírus da gripe; e uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de M2 do vírus da gripe. Preferencialmente, os sítios lox são sítios loxP.
Ainda noutro enquadramento, providencia-se uma célula hospedeira, cujo genoma é aumentado com uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na célula hospedeira ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação da proteína de fusão e de ligação à superfície da célula hospedeira; uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor funcional na célula hospedeira ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de Ml do vírus da gripe; uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de NS2 do vírus da gripe; e uma molécula de ADN recombinante, que compreende um promotor funcional na célula hospedeira ligada a um primeiro sítio lox ligado a um segmento de ADN, que compreende uma sequência de paragem da transcrição ligada 17 a um segundo sítio lox ligado a uma região de codificação de M2 do vírus da gripe. Preferencialmente, os sítios lox são sítios loxP.
As células hospedeiras aumentadas com as moléculas de ADN recombinante, tal como descrito aqui antes, são úteis para preparar vírus da gripe defeituosos quanto à replicação infecciosa. Por exemplo, uma célula hospedeira transformada de uma forma estável com moléculas de ADN recombinante que codificam HA, NA, Ml, M2 e NS2 contacta com uma pluralidade de vectores, isto é, vectores que expressam ARNv que compreende um quadro de leitura aberta Cre, ARNv que compreende PA, ARNv que compreende NP, ARNv que compreende PB1, ARNv que compreende PB2 e, opcionalmente, ARNv que compreende um gene de interesse; e vectores que codificam PA, PB1, PB2 e NP.
Os processos de produção de vírus aqui descritos, que não requerem uma infecção por vírus auxiliares, são úteis em estudos de mutagénese virai e na produção de vacinas (por exemplo, para a SIDA, a gripe, a hepatite B, a hepatite C, rinovírus, filovírus, malária, herpes e febre aftosa) e vectores de terapia genética (por exemplo, para o cancro, SIDA, adenosina-desaminase, distrofia muscular, deficiência de ornitina-transcarbamilase e tumores do sistema nervoso central).
Assim, a presente invenção providencia um vírus para ser utilizado na terapia médica (por exemplo, para uma vacina ou para uma terapia de genes). Por exemplo, a presente invenção providencia um processo para imunizar um indivíduo contra um agente patogénico, por exemplo, uma bactéria, vírus ou parasita ou um tumor maligno. 0 processo compreende a administração, a um indivíduo, de uma certa quantidade de 18 vírus pelo menos um vírus isolado da presente invenção, eventualmente em conjugação com um adjuvante eficaz para imunizar o indivíduo. 0 vírus compreende ARNv, que contém um polipéptido codificado por um agente patogénico ou um polipéptido específico do tumor.
Também se providencia um processo para aumentar a expressão de proteínas endógenas do ar num mamífero que tenha uma indicação ou uma doença caracterizadas por um decréscimo de quantidade ou por uma ausência da proteína endógena. 0 processo compreende a administração, a um mamífero, de uma quantidade de um vírus isolado da presente invenção, eficaz para aumentar a quantidade de proteína endógena num mamífero. Preferencialmente, o mamífero é um ser humano. A presente memória descritiva também providencia vectores e processos para a produção recombinante de vírus de estirpes positivas, por exemplo, vírus de ARN de sentido positivo. Assim, a presente invenção providencia um vector que compreende um segmento de ADN, que compreende sequências de iniciação da transcrição da polimerase I de ARN, ligadas operacionalmente a um segundo segmento de ADN, que compreende sequências de um vírus de ARN de sentido positivo, eventualmente ligado operacionalmente a um terceiro segmento de ADN, que compreende sequências de terminação da transcrição da polimerase I do ARN. Também se providencia um processo para utilizar os vectores para preparar vírus recombinantes. 0 processo é particularmente útil dado que utiliza ADN clonado e técnicas de transfecção, circunscrevendo assim o manuseamento do ARN. Além disso, a transcrição da polimerase I de ARN é altamente eficaz e tem uma elevada fidelidade. Para os vírus de ARN de sentido positivo, cujo ARN genómico está desprotegido (por exemplo, pestivírus; vírus da hepatite C; e Picomaviridae, incluem 19 poliovirus, rinovírus, vírus da hepatite A e vírus da febra aftosa), introduz-se um ADNc que codifica todo o comprimento do genoma com uma orientação paralela ao genoma entre o promotor da polimerase I de ARN e as sequências terminadoras. A transfecção dos plasmidos resultantes em células hospedeiras permissíveis origina um ARN genómico para a replicação do vírus. Um certo número de vírus de ARN de sentido positivo contém ARN genómicos protegidos (por exemplo, flavivírus, incluindo o vírus da febre do dengue e vários vírus de encefalite). Embora os transcritos da polimerase I de ARN não estejam protegidos, introduz-se um ADNc que codifica todo o genoma de comprimento completo dos vírus de ARN que tenham ARN genómico protegido, com uma orientação paralela, anti-genómica, num vector de transcrição de polimerase I de ARN. No seguimento da transfecção dos plasmidos resultantes, a polimerase I do ARN celular transcreve um ARN anti-genómico (não protegido). Além disso, a co-transfecção com plasmidos de expressão de proteínas para as proteínas necessárias para a replicação resulta na replicação do ARN anti-genómico, dando origem a ARN genómico e, em última análise, ao vírus infeccioso.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1. Diagrama esquemático dos sistemas estabelecidos de genética inversa. No processo de transfecção de RNP (A), as proteínas de NP e de polimerase purificadas são reunidas em RNP com a utilização do ARNv sintetizado in vitro. As células são transfectadas com RNP, seguida da infecção com o vírus auxiliar. No processo da polimerase I de ARN (B), transfecta-se um plasmido contendo um promotor de polimerase I de ARN, um ADNc que codifica o ARNv a ser recuperado e um terminador de polimerase I de ARN nas 20 por meio de células. A transcrição intracelular, polimerase I de ARN, origina o ARNv sintético, que é empilhado em partículas do vírus de progenia após a infecção com vírus auxiliares. Em ambos os processos, os vírus transfectantes (isto é, os que contêm ARN derivado do ADNc clonado) são seleccionados da população de vírus auxiliares.
Figura 2. Diagrama esquemático da geração de estruturas de polimerase I de ARN. Os ADNc derivados do vírus da gripe foram amplificados por RCP, estimulados com BsmBI e clonados em sítios de BsmBI do vector pHH21 (E. Hoffmann, tese de doutoramento, Justus, Liebig-University, Giessen, Alemanha), que contém o promotor de polimerase I de ARN humano (P) e o terminador (T) de polimerase I de ARN de murganho. 0 nucleótido de timidina a montante da sequência do terminador (*T) representa a extremidade 3' do ARN virai da gripe. As sequências do vírus da gripe A estão ilustradas em letras a negro.
Figura 3. 0 processo de genética inversa proposto para gerar vírus de ARN de sentido negativo e segmentado. Os plasmidos contendo um ADNc de promotor de polimerase I de ARN para cada um dos oito segmentos de ARN virai e o terminador de polimerase I de ARN são transfectados em células em conjunto com os plasmidos de expressão de proteínas. Embora os vírus infecciosos possam ser gerados com plasmidos que expressam PA, PB1, PB2 e NP, a expressão de todas as proteínas estruturais remanescentes (mostradas entre parêntesis) aumenta a eficácia da produção do vírus consoante o vírus gerado. Figura 4. A detecção do epítopo FLAG em células infectadas com um vírus transfectante. Utilizou-se a coloração do anticorpo para identificar NA em células MDCK quer com vírus do tipo selvagem PR8-TSN-FL79 (A, D) 21 ou A/TSN/33 (B, E) ou células MDCK infectadas de forma simulada (C, F) . Nove horas após a infecção, fixaram-se as células com paraformaldeido, trataram-se com Triton X-100 e incubaram-se quer com anticorpos monoclonais anti-FLAG (A-C) ou anticorpos monoclonais anti-TSN NA (D-F) . A coloração Golgi (vermelho) intensa é evidente nas amostras positivas (A, D e E).
Figura 5. Recuperação de mutantes de PA. Amplificou-se o gene PA de cada virus por RCP-TI com iniciadores que originam fragmentos de 1.226 pb (posição 677 a 1.903 do ARNm, colunas 1, 3, 5) , que foi então estimulado com a enzima de restrição Bspl20I (na posição 846 do ARNm, colunas 4, 7) ou PvuII (na posição 1.284 do ARNm, colunas 2, 6). A presença dos sítios de Bspl20I ou PvuII nos produtos de RCP originaram fragmentos de 169 pb e 1.057 pb ou 607 pb e 619 pb, respectivamente. PM = marcadores de peso molecular.
Figura 6. Iniciadores utilizados para amplificar as sequências do vírus da gripe.
Figura 7. 0 plasmido pPolI-PFV para a geração de ARN semelhante ao vírus da gripe codificando a proteína PFV. Este plasmido contém o gene PFV (derivado de pEPFV-Nl; Clontech, Paio Alto, CA), numa orientação anti-paralela entre as regiões de não codificação 5' e 3' do segmento 5 do vírus da gripe A, flanqueado pelo promotor da polimerase I de ARN humano e o terminador de polimerase I de ARN de murganho.
Figura 8. Diagrama esquemático da estratégia de geração de PSV. Transfectou-se, em células 293T, plasmidos de expressão individual de proteínas e um plasmido contendo o promotor da polimerase I de ARN, um ADNc codificando o gene repórter PFV e o terminador de polimerase I de ARN. A transcrição intracelular por polimerase I de ARN originou ARNv de PFV, de polaridade negativa, conforme 22 indicado pelas letras invertidas. Os sobrenadantes contendo PSV são colhidos, misturados com vírus auxiliares de gripe inoculados em células MDCK.
Figura 9. As proteínas PA, PB1, PB2 e NP do vírus da gripe A encapsidaram o ARNv de PFV, produzido pela polimerase I de ARN, levando à expressão de PFV. Transfectaram-se células 293T com plasmidos que expressam as proteínas PB2, PB1, PA e NP (A) ou com todos os plasmidos excepto aquele que expressa a proteína NP (B), em conjunto com o plasmido do gene PFV-de polimerase I de ARN para a síntese intracelular de ARNv do gene repórter. Fixaram-se as células 48 h após a transfecção e determinou-se a expressão de PFV com um microscópio de fluorescência.
Figura 10. Geração de PSV infeccioso da gripe. Transfectaram-se células 293T com nove plasmidos, cada um deles expressando uma proteína (A) estrutural, virai, diferente, ou com oito plasmidos omitindo a estrutura para NP (B) , em conjunto com o plasmido do gene PFV de polimerase I de ARN. Quarenta e oito horas após a transfecção, recolheram-se os sobrenadantes contendo PSV, misturaram-se com o vírus auxiliar A/TSN/33 e inocularam-se em células MDCK. Fixaram-se as células 10 horas após a infecção e determinou-se a expressão de PFV com um microscópio de fluorescência.
Figura 11. Esquema da utilização de Cre recombinase para expressar a proteína NS2 do vírus da gripe numa célula, cujo genoma é aumentado com uma molécula de ADN recombinante. O genoma da célula compreende uma molécula de ADN recombinante que compreende um promotor ligado a um sítio de recombinação específico do sítio (por exemplo, loxP) ligado a uma sequência de paragem da transcrição ligada a um segundo sítio de recombinação específico do sítio, na mesma orientação que o primeiro 23 sitio de recombinação especifico do sitio ligado ao gene NS2 .
Figura 12. Preparação do virus da gripe defeituoso na replicação.
Descrição Detalhada da Invenção Definições
Tal como se utilizam aqui, os termos "isolado e/ou purificado" referem-se à preparação, isolamento e/ou purificação in vitro de um vector ou de um plasmido da presente especificação, para que não se j a associado a substâncias in vivo ou que seja praticamente purificado a partir de substâncias in vitro. Tal como se utiliza aqui, a expressão "ácido nucleico recombinante" ou "sequência ou segmento de ADN recombinante" refere-se a um ácido nucleico, por exemplo, ADN, que tenha derivado ou que tenha sido isolado de uma fonte, que pode ser em seguida quimicamente alterada in vitro, de modo que a sua sequência não seja de origem natural ou que corresponda a sequências de origem natural que não estão posicionadas como se estivessem posicionadas no genoma natural. Um exemplo de ADN "derivado" de uma fonte será uma sequência de ADN que é identificada como um fragmento útil e que é então quimicamente sintetizada numa forma praticamente pura. Um exemplo desse ADN "isolado" de uma fonte será uma sequência de ADN útil que seja excisada ou removida da referida fonte, por meios químicos, por exemplo, por meio da utilização de endonucleases de restrição, de modo que possa ser depois manipulada, por exemplo, amplificada, para ser utilizada na presente invenção, pela metodologia da engenharia genética. 24
Tal como se utiliza aqui, "recombinação especifica do sítio" entende-se que inclui os três eventos seguintes: 1) eliminação de um segmento alvo de ADN flanqueado pelos sítios de recombinação específicos do sítio ou as sequências, por exemplo, os sítios loxP; 2) inversão da sequência de nucleótidos de um segmento alvo de ADN flanqueado pelos sítios de recombinação específicas do sítio ou as sequências, por exemplo, os sítios lox; e 3) permuta recíproca de segmentos alvo de ADN próximos dos sítios de recombinação específicas do sítio ou das sequências, por exemplo, sítios lox localizados em diferentes moléculas de ADN. Os sistemas de recombinase específicos do sítio incluem, mas não se limitam, ao sistema de Cre/loxP do bacteriófago PI (patente norte-americana N°. 5.658.772).
Para remediar a reversibilidade de uma reacção de recombinação específica do sítio, a estrutura do sistema de recombinação pode ser alterada. A sequência de recombinação específica do sítio pode ser mutada de tal forma que o produto da reacção de recombinação já não seja reconhecido como um substrato para a reacção inversa, estabilizando assim o evento de integração ou de excisão. Por exemplo, para eliminar sequências indesejadas, os sítios lox na mesma orientação, estão posicionados para flanquear as sequências indesej adas.
Outros sítios lox incluem os sítios loxB, loxL e loxR que são sequências de nucleótidos isoladas de E. coli (Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 3398 (1982)). Os sítios lox também podem ser produzidos por uma variedade de técnicas de síntese que são conhecidas da técnica. Por exemplo, as técnicas de síntese para produzir os sítios lox estão descritas por Ito et al., Nuc. Acid Res., 10, 1755 (1982) e Ogilvie et al., Science, 214, 270 (1981). 25
Tal como se utiliza aqui, a expressão "sítio lox" significa uma sequência de nucleótidos na qual o produto do gene cre pode catalisar uma recombinação específica do sítio. LoxP é uma sequência de nucleótidos de 34 pares de bases, que pode ser isolada do bacteriófago PI por processos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79, 3398 (1982)). LoxP consiste em 13 repetições invertidas de pares de bases separadas por uma região espaçadora de 8 pares de bases.
Tal como se utiliza aqui, a expressão "gene cre" significa uma sequência de nucleótidos que codifica para um produto de gene enzimático, que efectua uma recombinação específica do sítio de ADN em células eucarióticas em sítios lox. Pode-se isolar um gene cre a partir do bacteriófago PI por processos conhecidos na técnica (ver Abremaid et al., Cell, 32, 1301-1311 (1983)).
Replicação do vírus da gripe 0 vírus da gripe A possui um genoma de oito ARN virai (ARNv) de hélice simples, de sentido negativo, que codifica um total de dez proteínas. O ciclo de vida do vírus da gripe começa com a ligação da hemaglutinina (HA) a receptores contendo ácido siálico na superfície da célula hospedeira, seguido da endocitose mediada por um receptor. O baixo pH nos últimos endossomas provoca um deslocamento da conformação em HA, expondo assim o terminal N da subunidade HA2 (o chamado péptido de fusão) . O péptido de fusão inicia a fusão da membrana virai e endossómica e libertam-se as proteínas da matriz (Ml) e os complexos de RNP no citoplasma. Os RNP consistem em nucleoproteínas (NP), que encapsidam ARNv e o complexo de polimerase virai, que é formado pelas proteínas PA, PB1 e PB2. Os RNP são transportados para os núcleos, onde 26 tem lugar a transcrição e a replicação. 0 complexo de polimerase de ARN catalisa três reacções diferentes: síntese de um ARNm com uma extremidade protegida 5' e uma estrutura de poliA de 3' De um ARN complementar (ARNc) de comprimento completo e de ARNv genómico utilizando o ADNc como matriz. Os ARNv recentemente sintetizados, a NP e as proteínas de polimerase, são então aglomeradas em RNP, exportadas do núcleo e transportadas para a membrana do plasma onde ocorre o desenvolvimento das partículas do vírus da progenia. A proteína neuraminidase (NA) desempenha um papel crucial no fim da infecção, por meio da eliminação do ácido siálico dos sialiloligossacáridos, libertando assim os viriões recentemente reunidos da superfície das células e evitando a auto-agregação das partículas de vírus. Embora a agregação do vírus envolva interacções proteína-proteína e proteína-ARNv, a natureza destas interacções é bastante desconhecida. A presente invenção irá ser descrita pelos exemplos que se seguem.
Exemplo 1
Materiais e Processos Células e vírus. Mantiveram-se células embrionárias de rim humano 293T e células de rins de caninos Madin-Darby (MDCK) em meio de Eagle modificado por Dulbecco (MEMD), complementado com soro bovino fetal a 10 % e em meio de Eagle modificado (MEM), contendo soro bovino de recém-nascido a 5 %, respectivamente. Mantiveram-se todas as células a 37 °C, em CO2 a 5 %. Os vírus da gripe A/TSN/33 (H1N1) e A/PR/8/34 (H1N1) propagaram-se em ovos com 10 dias. 27
Preparação dos plasmidos. Para gerar as estruturas de polimerase I de ARN, introduziram-se ADNc clonados, derivados de ARN virai de A/TSN/33 ou A/PR/8/34, entre as sequências do promotor e do terminador da polimerase I de ARN. Em resumo, os ADNc clonados foram amplificados por RCP com iniciadores contendo sítios BsmBI, digeridos com BsmBI e clonados nos sítios BsmBI do vector pHH21 que contém o promotor da polimerase I de ARN humano e o terminador da polimerase I de ARN de murganho, separados pelos sítios BsmBI (figura 2). Os genes PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M e NS da estirpe A/WSN/33 foram amplificados por RCP utilizando os seguintes plasmidos: pSCWPB2, pGW-PBl e pSCWPA (todos obtidos do Dr. Debi Kayak da Universidade da Califórnia, Los Angeles) e pWH17, pWN152, pT3WNA15 (Castrucci et al., 1992), pGT3WM, e pWNSl, respectivamente. 0 gene PB1 do vírus da gripe A/PR/8/34 foi amplificado utilizando pADNc774 (PB1) (Perez et al., 1998) como matriz. Ver a figura 6 para as sequências dos iniciadores. Para assegurar que os genes estavam isentos de mutações não desejadas, os fragmentos derivados da RCP foram sequenciados com um auto-sequenciador (Applied Biosystem Inc., CA, USA) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Os ADNc codificando os genes HA, NP, NA e Ml do vírus A/WSN/33 foram clonados conforme descrito (Huddleston et al., 1982) e subclonados num vector de expressão eucariótica pCAGGS/MCS (controlado pelo promotor de β-actina de aves) (Niwa et al., 1991), resultando em pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NPO-14, pCAGGS-WNA15 e pCAGGS-WSN-Ml-2/1, respectivamente. Os genes M2 e NS2 do vírus A/PR/8/34 foram amplificados por RCP e clonados no pCAGGS/MCS, originando pEP24c e pCA-NS2. Finalmente, utilizou-se pADNc774 (PB1), pADNc762 (PB2) e pADNc787 (PA) para expressar as proteínas PB2, PB1 e PA, sob o controlo do promotor de citomegalovírus (Perez et al., 1998) . 28
Geração de partículas infecciosas da gripe. Transfectaram-se células 293T (1 x 106) com um máximo de 17 plasmidos em diferentes quantidades utilizando o Trans IT LT-1 (Panvera, Madison, Wisconsin) de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, misturou-se ADN e o reagente de transfecção (2 pL de Trans IT-LT-1 por pg de ADN), incubou-se à temperatura ambiente, durante 45 minutos e adicionou-se às células. Seis horas mais tarde, a mistura do reagente de transfecção do ADN foi substituída por Opti-MEM (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland) contendo albumina de soro bovino a 0,3 % e soro bovino fetal a 0,01 %. Em diferentes momentos, após a transfecção, recolheram-se os vírus do sobrenadante e titularam-se em células MDCK. Dado que não foram necessários vírus auxiliares para este processo, os vírus transfectantes recuperados foram analisados sem purificação da placa.
Determinação das percentagens das células transfectadas com plasmido que produzem vírus. Vinte e quatro horas após a transfecção, dispersaram-se células 293T com EDTA a 0,02 % em células simples. Depois, diluiu-se a suspensão de células 10 vezes e transferiu-se para monocamadas confluentes de células MDCK em placas de 24 poços. Detectaram-se os vírus por meio do ensaio de hemaglutinação.
Ensaio de imunocloração. Nove horas após a infecção com vírus da gripe, lavaram-se as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (STF) e fixaram-se com para-formaldeído a 3,7 % (em STF), durante 20 minutos, à temperatura ambiente. Em seguida, trataram-se com Triton X-100 a 0,1 % e transformaram-se tal como descrito por Neumann et al. (1997). 29
Resultados
Geração de vírus infeccioso por expressão orientada por plasmidos dos segmentos de ARN virai, três subunidades de polimerase e proteína NP. Embora a transfecção das células com uma mistura de RNP extraído de viriões purificados resulte em partículas infecciosas da gripe, esta estratégia provavelmente não será eficiente quando utilizada com oito RNP diferentes gerados in vitro. Para produzir vírus infecciosos da gripe inteiramente a partir de ADNc, geraram-se oito RNP virais in vivo. Assim, prepararam-se os plasmidos que continham ADNc para os ARN virais de comprimento completo do vírus A/WSN/33, flanqueados pelo promotor da polimerase I de ARN humano e o terminador da polimerase I de ARN de murganho. Em princípio, a transfecção destes oito plasmidos em células eucarióticas deverá resultar na síntese dos oito ARNv da gripe. As proteínas PB2, PBl, PA e NP geradas pela co-transfecção dos plasmidos de expressão de proteínas, devem então reunir-se ao ARNv em RNPv funcionais, que são replicados e transcritos formando, em última análise, vírus infecciosos da gripe (figura 3). Transfectou-se 1 x 106 células 293T com plasmidos de expressão de proteína (1 pg de pADNc762 (PB2) , 1 pg de pADNc774 (PBl), 0,1 pg de pADNc787 (PA) e 1 pg de pCAGGS-WSN-NPO/14) e 1 pg de cada um dos seguintes plasmidos de polimerase I de ARN (pPolI-WSN-PB2, pPolI-WSN-PBl, pPolI-WSN-PA, pPolI-WSN-HA, pPolI-WSN-NP, pPolI-WSN-NA, pPolI-WSN-M e pPolI-WSN-NS). A decisão de utilizar uma quantidade reduzida de pADNc787 (PA) baseou-se em observações anteriores (Mena et al., 1996) e nos dados sobre as condições óptimas para gerar partículas semelhantes a vírus (PSV) (dados não mostrados). Vinte e quatro horas após a transfecção das células 293T, encontrou-se 7 x 103 ufp de vírus por mL no sobrenadante (experiência 1, quadro 1), demonstrando, pela primeira vez, a capacidade da genética 30 inversa para produzir vírus da gripe A inteiramente a partir de plasmidos.
Quadro 1. Conjuntos de plasmidos utilizados para produzir o vírus da gripe a partir de ADNc* clonado
Experiência Plasmidos de polimerase I de ARN para+ 1 2 3 4 5 6 7 8 PB1 + + - - - - - - PR8-PB1 - - + + + + + + PB2 + + + + + + + + PA + + + + + + + + HA + + + + + + + + NP + + + + + + + + NA + + + + + + + + M + + + + + + + + NS + + + + + + + + Plasmidos de expressão de proteínas para: PB1 + + + + + + + PB2 + + + + + - + + PA + + + + + + - + NP + + + + + + + - HA - + — + + + + + NA - + - + + + + + Ml - + - + + + + + M2 - + - + + + + + NS2 - + - + + + + + Título do vírus (ufp/mL) 7xl03 7xl03 lxlO3 3xl04 0 0 0 0 *As células 293T foram transfectadas com os plasmidos indicados. Vinte e quatro (experiência 1 e 2) ou quarenta e oito horas (experiências 3-8) mais tarde, determinou-se o título do vírus no sobrenadante em células MDCK. +A menos que seja indicado de outra forma, os plasmidos foram preparados com ADNc representando o ARN do vírus A/WSN/33. 31
Eficiência da produção do vírus da gripe com co-expressão de todas as proteínas estruturais virais. Embora a expressão das proteínas NP virai e polimerase seja suficiente para a geração de vírus da gripe orientada por plasmidos, é também possível aumentar a eficiência. Em estudos anteriores, a expressão de todas as proteínas estruturais do vírus da gripe (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, Ml, M2 e NS2) resultou em PSV que continham um ARNv artificial que codificava um gene repórter de cloranfenicol-acetiltransferase (Mena et al., 1996) . Assim, a disponibilidade de todo o complemento das proteínas estruturais, em vez de apenas as necessárias para a replicação e a transcrição de ARN virai, pode aumentar a eficiência da produção do vírus. Com esta finalidade, transfectaram-se células 293T com quantidade optimizadas de plasmidos de expressão da proteína virai (tal como se avaliou pela produção de PSV; dados não publicados): 1 pg de pADNc762 (PB2) e pADNc774 (PBl); 0,1 pg de pADNc787 (PA); 1 pg de pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NPO/14 e pCAGGS-WNA15; 2 pg de pCAGGS-WSN-MI-2/1; 0,3 pg de pCA-NS2; e 0,03 pg de pEP24c (para M2), em conjunto com 1 pg de cada plasmido de polimerase I de ARN (experiência 2, quadro 1). Transfectou-se um segundo conjunto de células com o mesmo conjunto de plasmidos de polimerase I de ARN, com a excepção do gene de PB 1, para o qual se substituiu pPolI-PR/8/34-PBl num esforço para gerar um vírus reagrupado, em conjunto com os plasmidos que expressam apenas PA, PBl, PB2 e NP (experiência 3, quadro 1) ou os que expressam todas as proteínas estruturais da gripe (experiência 4, quadro 1) . Os rendimentos dos vírus WSN não diferiram significativamente 24 horas (experiências 1 e 2, quadro 1) ou 36 horas (dados não mostrados) após a transfecção. Contudo, verificou-se um aumento superior a 10 vezes nos rendimentos dos vírus com PR/8/34-PB1 quando foram providenciadas todas as proteínas estruturais do vírus da gripe (experiências 3 e 4, quadro 1). Os controlos negativos, 32 a que faltavam os plasmidos para a expressão das proteínas de PA, PB1, PB2 de NP, não produziram quaisquer vírus (experiências 5-8, quadro 1). Assim, consoante o vírus gerado, a expressão de todas as proteínas estruturais do vírus da gripe A aumentou apreciavelmente a eficiência do processo da genética inversa.
Em seguida, determinou-se a cinética da produção do vírus após a transfecção das células utilizando o conjunto de plasmidos utilizado para gerar um vírus com o gene A/PR/8/34-PB1. Em duas das três experiências, detectou-se o primeiro vírus 24 horas após a transfecção. 0 título medido nesse momento, > 103 ufp/mL, tinha aumentado > 106 ufp/mL, 48 horas após a transfecção (quadro 2). Para estimar a percentagem de células transfectadas com plasmido que estavam a produzir vírus, trataram-se células 293T com EDTA (0,02 %) , 24 horas após a transfecção, para dispersar as células e depois fizeram-se alguns estudos com uma diluição limitada. Nesta experiência não se encontrou nenhum vírus, nesse momento, no sobrenadante da cultura. Os resultados indicaram que 1 em 103'3 células estavam a gerar partículas de vírus infeccioso.
Quadro 2. Cinética da produção de vírus após a transfecção do plasmido em células 293T*
Horas após a transfecção do plasmido Títulos do vírus no sobrenadante da cultura (ufp/mL) Experiência 1 2 3 6 0 ND ND 12 0 ND 0 18 0 ND 0 24 0 2 x 103 6 x 103 30 ND 5 x 104 9 x 104 33
Horas após a transfecção do plasmido Títulos do vírus no sobrenadante da cultura (ufp/mL) Experiência 36 6 x 102 >1 x 10b 7 x 10b 42 ND >1 x 10b 5 x 10b 48 8 x 104 >1 x 10b 1 x 10';
As células 293T foram transfectadas com oito plasmidos de polimerase I de ARN codificando os genes do vírus A/WSN/33 com a excepção do gene PB1, que derivou do vírus A/PR/8/34 e nove plasmidos de expressão de proteínas tal como descrito no texto. Em diferentes momentos, titularam-se os vírus no sobrenadante da cultura em células MDCK. ND = não determinado.
Recuperação do vírus da gripe contendo o epítopo FLAG na proteína NA. Para verificar que o novo sistema de genética inversa permitia a introdução de mutações no genoma do vírus da gripe A, gerou-se um vírus contendo o epítopo FLAG (Castrucci et al., 1992) na proteína NA. Transfectaram-se células 293T com um plasmido de polimerase I de ARN (pPolI-WSN-NA/FL79) que continha um ADNc que codificava tanto para proteína NA como para um epítopo FLAG, no fundo da parte superior da proteína, em conjunto com os plasmidos de expressão de polimerase I de ARN e da proteína necessários. Para confirmar que o vírus recuperado (PR8-WSN-FL79) expressou, de facto, a proteína NA-FLAG, realizaram-se ensaios de imunocoloração das células infectadas com os vírus de tipo selvagem PR8-WSN-FL79 ou A/WSN/33. Um anticorpo monoclonal do epítopo FLAG detectou células infectadas com PR8-WSN-FL79, mas não infectadas com o vírus do tipo selvagem (figura 4) . A recuperação dos vírus PR8-WSN-FL79 foi tão eficiente como a dos vírus do tipo selvagem não marcados (dados não mostrados). Estes resultados indicam que o novo 34 sistema de genética inversa permite introduzir mutações no genoma do vírus da gripe A.
Geração de vírus infecciosos de gripe contendo mutações no gene PA. Para produzir vírus que possuam mutações no gene PA, introduziram-se duas mutações silenciosas criando novas sequências de reconhecimento para as endonucleases de restrição (Bsp 1201 na posição 846 e PvuII na posição 1.284 do ARNm) . Previamente, não era possível modificar este gene por genética inversa, por causa da falta de um sistema de selecção fiável. Recuperaram-se os vírus transfectantes, PA-T846C e PA-A1284. Os vírus transfectantes recuperados foram clonados biologicamente por meio de duas diluições consecutivas limitadas. Para verificar que os vírus recuperados eram na verdade transfectantes com mutações no gene PA, obteve-se o ADNc para o gene PA por RCP transcriptase inversa. Tal como se mostra na figura 5, os vírus PA-T846C e PA-A1284C tinham as mutações esperadas no gene PA, como foi demonstrado pela presença dos sítios de restrição recentemente introduzidos. A RCP das mesmas amostras virais e os iniciadores sem a etapa de transcrição inversa não conseguiram produzir quaisquer produtos (dados não mostrados), indicando que, na verdade, o ADNc de PA teve origem no ARNv em vez do plasmido utilizado para gerar os vírus. Estes resultados ilustram como se podem produzir e recuperar genes mutados sem utilizar os vírus auxiliares.
Discussão
Os sistemas de genética inversa aqui descritos permitem produzir com eficácia o vírus da gripe A, inteiramente clonados, a partir de ADNc. Bridgen e Elliott (1996) também utilizaram a genética inversa para gerar um vírus de Bunyamwera (família Bunyaviridae), mas contém apenas três 35 segmentos de ARN de sentido negativo e a eficiência da sua produção foi baixa, 102 ufp/107 células. Embora o virus produzido seja diferente entre as várias experiências, observou-se, consistentemente, > 103 ufp/106 células para o virus da gripe, que contém oito segmentos. Há várias explicações para a elevada eficácia do sistema da genética inversa aqui descrito antes. Em vez da produção de RNP in vitro (Luytjes et al., 1989), os RNP foram gerados in vivo através da síntese intracelular de ARNv utilizando polimerase I de ARN e a partir da expressão orientada por plasmidos das proteínas da polimerase virai e de NP. Também a utilização de células 293T, que são facilmente transfectadas com plasmidos (Goto et al., 1997), assegurou que uma grande população de células recebesse todos os plasmidos necessários para a produção do vírus. Além disso, o grande número de transcriptos produzidos pela polimerase I de ARN, que está entre as enzimas abundantemente expressas nas células em crescimento, provavelmente contribuiu para a eficácia global do sistema. Estas características levaram a um número correspondentemente abundante de transcriptos de ARNv e a quantidades adequadas da proteína virai para a encapsidação de ARNv, a formação de RNP no núcleo e a exportação destes complexos para a membrana celular, onde os novos vírus foram reunidos e libertados.
Os sistemas de genética inversa anteriormente estabelecidos (Enami et al., 1990; Neumann et al., 1994; Luytjes et al., 1989; Pleschka et al., 1996) requerem a infecção por vírus auxiliares e, por isso, a selecção de processos que permitam recuperar um pequeno número de transfectantes a partir de um grande número de vírus auxiliares. Essas estratégias têm vindo a ser utilizadas para gerar vírus da gripe, que possui um dos genes que se seguem, derivados de ADNc: PB2 (Subbarao et al., 1993), HA (Enami et 36 al., 1991: Horimoto et al., 1994), NP (Li et al., 1995), NA (Enami et al., 1990), M (Castrucci et al., 1995; Yasuda et al., 1994) e NS (Enami et al., 1991). A maior parte dos processos de selecção, excepto os que se aplicam aos genes HA e NA, baseiam-se na temperatura de crescimento, no intervalo de restrição do hospedeiro ou na sensibilidade ao fármaco, limitando assim a utilidade da genética inversa para a análise funcional dos produtos genéticos. Mesmo com os genes HA e NA, para os quais estão disponíveis sistemas de selecção fiáveis com base em anticorpos, é difícil produzir vírus com defeitos de crescimento proeminentes. Ao contrário, o sistema de genética inversa aqui descrito não necessita de vírus auxiliares e permite gerar transfectantes com mutações em qualquer segmento do gene ou com defeitos graves de crescimento. Esta vantagem está demonstrada na figura 5, que mostra a recuperação dos vírus transfectantes com um gene PA mutado. Tendo a tecnologia para introduzir qualquer mutação viável no genoma do vírus da gripe A, vai permitir aos investigadores resolver um certo número de questões que duram há muito tempo, tais como, a natureza das sequências reguladoras nas regiões não traduzidas do genoma virai, as relações entre a estrutura e a função das proteínas virais e a base molecular das restrições da gama dos hospedeiros e a patogenicidade virai.
Embora estejam disponíveis vacinas inactivadas da gripe, a sua eficácia é sub-óptima devido parcialmente à sua capacidade limitada para provocar respostas locais de IgA e das células T citotóxicas. Os ensaios clínicos de vacinas vivas da gripe adaptadas ao frio que estão agora em curso sugerem que essas vacinas são atenuadas de uma forma optimizada, de modo que não vão causar sintomas da gripe, mas irão ainda induzir imunidade protectora (revista por Keitel e Piedra, 1998). Contudo, os resultados preliminares indicam 37 que estas vacinas de vírus vivo não são significativamente mais eficazes do que as melhores vacinas inactivadas (revisão em Keitel e Piedra, 1998), deixando ainda espaço para fazer melhorias. Uma possibilidade será modificar uma vacina adaptada ao frio com o sistema de genética inversa descrito antes. Alternativamente, pode-se começar do início utilizando a genética inversa para produzir uma estirpe "matriz" da gripe A com várias mutações de atenuação nos genes que codificam as proteínas internas. A aplicação mais intrigante do sistema de genética inversa aqui descrita pode levar a uma produção rápida de vacinas de vírus vivos atenuada em casos de suspeita de pandemias que envolvam novos subtipos HA ou NA do vírus da gripe.
Este novo sistema de genética inversa irá provavelmente aumentar a utilização de vírus da gripe como vectores de vacinas. Os vírus podem ser tratados por engenharia genética para expressar proteínas exógenas ou epítopos imunogénicos para além das proteínas dos vírus da gripe. Pode-se, por exemplo, gerar vírus com proteínas exógenas com um nono segmento (Enami et al., 1991) e utilizá-los como vacinas vivas. Isso fará não só com que os vírus da gripe estimulem respostas imunitárias, humorais, fortes, mediadas pelas células, mas também vai originar uma larga série de proteína HA e NA das superfícies dos viriões (por exemplo, os subtipos 15 HA e 9 NA e as suas variantes epidémicas), permitindo uma imunização repetida da mesma população alvo.
Os PSV da gripe possuem um ARNv artificial que codifica um gene repórter que tenha sido produzido pela expressão das proteínas estruturais virais e ARNv com o sistema de vaccínia-polimerase T7 (Mena et al., 1996). Utilizando a genética inversa, pode-se agora gerar PSV contendo ARNv, que codifica as proteínas necessárias para a transcrição e a 38 replicação de ARNv (isto é, PA, PB1, PB2 e NP), assim como os ARNv que codificam as proteínas de interesse. Esses PSV podem ser veículos úteis para a libertação dos genes. É importante referir que a falta de genes que codificam as proteínas estruturais virais vai assegurar que os vírus infecciosos não sejam produzidos após a terapia de genes da PSV. Dado que o genoma do vírus da gripe não está integrado em cromossomas hospedeiros, o sistema de PSV será apropriado para a terapia genética em situações que requerem apenas uma transdução de curto prazo das células (por exemplo, para o tratamento do cancro). Ao contrário dos vectores de adenovírus (Kovesdi et al., 1997), as PSV da gripe poderão conter tanto as variantes HA como NA, permitindo o tratamento repetido das populações alvo. A família Orthomyxoviridae compreende os vírus da gripe A, B e C, assim como os togotovírus recentemente classificados. A estratégia aqui descrita para gerar vírus infecciosos da gripe A, totalmente a partir de ADNc clonado, aplicar-se-á a qualquer ortomixovírus e talvez a outros vírus segmentados de ARN de sentido negativo (por exemplo, Bunyavírídae, Arenaviridae) . A capacidade para manipular o genoma virai sem limitações técnicas tem implicações profundas no estudo dos ciclos de vida dos vírus e na sua regulação, na função das proteínas virais e nos mecanismos moleculares na patogenicidade virai.
Exemplo 2 A expressão das proteínas do vírus da gripe PB2, PB1, PA e NP leva à replicação e à transcrição de um ARN virai artificial. Para gerar PSV, utilizou-se o sistema da polimerase I de ARN para a síntese intracelular de ARN virai da gripe in vivo (figura 7) . Neste sistema, Um ADNc que 39 codifica um gene repórter numa orientação anti-paralela é flanqueado pelas regiões de não codificação 5' e 3' de um ARN do vírus da gripe. Insere-se esta cassete entre o promotor e o terminado de polimerase I de ARN. A transfecção destas estruturas em células eucarióticas leva à transcrição do gene repórter pela polimerase I de ARN celular, gerando assim ARN semelhante ao vírus da gripe (Neumann et al., 1994) . Após infecção com o vírus da gripe, os ARNv artificiais são replicados e transcritos pelo complexo da polimerase virai, resultando na expressão do gene repórter.
Para determinar se a expressão das proteínas PB2, PB1, PA e NP levam à expressão do gene repórter codificado pelo transcripto derivado da polimerase I de ARN, transfectaram-se plasmidos (1 pg cada) que expressam a proteína NP do vírus A/WSN/33 (H1N1) sob o controlo do promotor de β-actina de galinhas (pCAGGS-WSN-NPO/14), as proteínas de polimerase do vírus A/PR/8/34 sob o controlo do promotor do citomegalovírus [pADNc7 62 (PB2) , pADNc774 (PB1) e pADNc787 (PA)] e uma estrutura de gene repórter de polimerase I de ARN (pPolI-PFV) em células humanas de rim embrionário (293T) . Quarenta e oito horas mais tarde, 30 %-40 % das células estavam a expressar PFV (figura 9) . Ao contrário, não se detectou a expressão de PFV nas células transfectadas a que faltava polimerase ou proteínas NP. Estes resultados indicam que NP e as três proteínas da polimerase do vírus da gripe tinham formado um complexo funcional, que replicou e transcreveu o ARNv de PFV derivado da polimerase I de ARN.
Transcrição e replicação optimizada de ARNv. Para determinar as quantidades de ADN do plasmido necessárias para a expressão optimizada da PFV repórter, os requerentes modelaram a expressão das proteínas de polimerase e NP. Estudos anteriores tinham indicado que grandes quantidades de 40 PA reduzem a extensão da expressão do gene repórter nos sistemas de transcrição/replicação (Mena et al., 1996). Por isso, de uma maneira feita em etapas, a expressão de PA a partir do plasmido foi reduzida, identificando-se 0,1 pg de pADNc7 87 (PA) como a quantidade de matriz que deu origem à mais forte expressão de PFV. Com NP, a principal componente estrutural dos complexos de RNP, podem ser necessárias elevadas quantidades de plasmido de expressão da proteína. Contudo, quantidades mais elevadas do plasmido não afectaram apreciavelmente o número de células 293T positivas para PFV. Além disso, várias quantidades dos plasmidos de expressão das proteínas PB2 e PB1 (variando de 1,0 a 0,03 pg) não afectaram a expressão de PFV nas células 293T. Por isso, em todas as experiências subsequentes, utilizou-se 0,1 pg de pADNc787 (PA) e 1,0 pg de pADNc774 (PB1), pADNc762 (PB2) e pCAGGS-WSN-NPO/14 .
Formação de PSV da gripe a partir de ADNc clonados. Estudos anteriores com o sistema de polimerase de ARN T7 do vírus vaccínia mostraram que a formação das PSV da gripe requer nove proteínas do vírus da gripe: PB2, PB1, PA, HA, NA, NP, Ml, M2 e NS2 (Mena et al., 1996) . Pelo contrário, a proteína NS1 é dispensável para a formação de partículas (Mena et al., 1996). Para estabelecer um sistema eficiente para a geração de PSV, dirigido por plasmidos, geraram-se ADNc que codificam os genes HA, NA, Ml, M2 e NS2. Os ADNc foram clonados no vector de expressão eucariótica pCAGGS/MCS (controlado pelo promotor β-actina de galinhas), resultando em pEWSN-HA, pCAGGS-WNAl5, pCAGGS-WSN-Ml-2/1, pEP24c e pCA-NS2, respectivamente. A expressão de cada proteína foi confirmada por análise de "Western blot".
Para gerar PSV, transfectaram-se 106 células 293T com 1,0 pg de cada um dos plasmidos de expressão de proteínas 41 (com a excepção do pADNc787 (PA), para qual se utilizou 0,1 pg) e com 1 pg da estrutura do gene repórter pPolI-PFV. Recolheram-se os sobrenadantes das culturas 48 horas após a transfecção e misturaram-se com o virus A/WSN/33 para se obter as proteínas do vírus da gripe necessárias para a replicação e a transcrição do ARNv de PFV. Depois, inoculou-se a mistura em células MDCK. Dez horas após a incubação, detectaram-se células MDCK positivas para PFV, correspondendo a 450 partículas/mL de sobrenadante (quado 3) . Assim, a expressão originada por plasmidos das proteínas estruturais do vírus da gripe resultou na formação de PSV infecciosos da gripe contendo ARNv de PFV. Além disso, o ARNv de PFV foi libertado nas células MDCK.
Junção optimizada dos vírus da gripe. A formação de PSV foi também estudada em células que expressam diferentes quantidades da estrutura do gene repórter da polimerase I de ARN, assim como, ADN dos plasmidos HA, NA, Ml, M2 e NS2. Em experiencias com pPolI-PFV, 1,0 pg do ADN do plasmido foi altamente eficiente para gerar PSV, enquanto a eficiência foi significativamente reduzida para 2,0 pg ou 3,0 pg. Como as proteínas NS2 e M2 são expressas em quantidades baixas no final da infecção, seria provável que quantidades relativamente pequenas dos plasmidos de expressão pudessem ser necessárias para uma formação optimização de PSV. A redução da estrutura de expressão de M2 de 1,0 pg para 0,3 pg resultou num aumento superior a 10 vezes em relação ao número de células MDCK positivas para PFV (quadro 3) . Uma maior redução do plasmido para 0,03 pg não aumentou o número de PSV. Para NS2 associaram-se quantidades menores do plasmido ensaiado (0,1 pg) com uma formação menos eficiente de PSV (quadro 3) . 42 A proteína Ml é a principal componente estrutural do virião. Assim, níveis elevados de expressão de Ml são provavelmente necessários para a formação eficiente de PSV. Esta previsão foi ensaiada em experiências comparando a formação de PSV em células transfectadas com 1,0 pg ou 2,0 pg do ADN do plasmido Ml. Tal como se mostra no quadro 3, quantidades maiores do plasmido resultaram num aumento superior a dez vezes em relação ao número de células MDCK positivas para PFV. A comparação de duas quantidades diferentes d pg vs 2 pg) de plasmidos que expressam as proteínas HA e NA não revelou quaisquer diferenças apreciáveis na formação de PSV, levando à selecção de 1 pg de cada plasmido (pEWSN-HA, pCAGGS-WNA15) para ser utilizado em experiências subsequentes. No global, estes estudos resultaram num aumento > 100 vezes ma eficiência da formação de PSV, levanto em ultima análise à produção de mais do que 104 partículas de vírus infeccioso da gripe por mL de sobrenadante (figura 10).
Quadro 3. Quantidades optimizadas de ADN de plasmido para a formação de PSV infecciosas*
Quantidade (hg) de ADN de plasmido que expressa: Eficiência relativa PB2 PB1 PA HA NP NA Ml M2 NS2 ARNv PSV da formação de PSV+ 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 28 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 0,03 1,0 1,0 17 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 28 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,3 1,0 24 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 0,1 1,0 11 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 28 1,0 1,0 0,1 1,0 1,0 1,0 2,0 0,1 1,0 1,0 220
Transfectaram-se células 293T com plasmidos de expressão para nove proteínas estruturais de vírus da gripe com o plasmido do gene da PFV-polimerase I de ARN. Quarenta e oito horas após a transfecção, recolheram-se os sobrenadantes contendo PSV, misturaram-se com o vírus auxiliar A/WSN/33 e inocularam-se em células MDCK. Fixaram-se as células 10 h após a infecção e determinou-se a expressão de PFV com um microscópio de fluorescência. Só se fez variar as quantidades de plasmido Ml, 43 Μ2 e NS2 (letras a negro) para determinar as quantidades optimizadas para a expressão de PFV em células MDCK. TA eficácia relativa da formação de PSV foi determinada pela contagem do número de células positivas para PFV em cinco campos microscópicos. A amostra contendo 1 pg de cada plasmido (que originou 450 PSV infecciosas /mL de sobrenadante) foi escolhida como referência (valor de 1).
Autenticidade das PSV produzidas inteiramente a partir de plasmidos. Para verificar que as PSV iniciam a infecção da mesma maneira que os vírus da gripe autênticos, neutralizaram-se PSV com anticorpos para WSN HA. Os sobrenadantes contendo PSV, derivados das células 293T transfectadas com plasmido foram incubados com um conjunto de anticorpos monoclonais de HA anti-WSN ou com um anticorpo monoclonal da proteína G do vírus da estomatite vesicular (VEV) (controlo negativo), durante 1 hora, à temperatura ambiente. Adicionou-se um vírus auxiliar A/PR/8/34, que não é neutralizado pelo conjunto de anticorpos monoclonais de HA anti-WSN, à mistura e inoculou-se em células MDCK. Apenas o anticorpo monoclonal específico de HA anti-WSN neutralizou as PSV indicando que HA medeia a ligação e a entrada das PSV nas células.
Em seguida, identificou-se o conjunto mínimo de proteínas necessárias para a formação das PSV. Outras pessoas tinham estabelecido que as três polimerases do vírus da gripe e a NP eram essenciais para a replicação e transcrição do ARNv (Honda et al., 1988). Por isso, cada uma destas quatro proteínas foi incluída, mas HA, NA, Ml, M2 ou NS2 foram em seguida omitidas. A exclusão de qualquer um destes plasmidos não afectou a replicação/transcrição do ARNv de PFV em células 293T transfectadas. Os sobrenadantes derivados das células 293T transf ectadas a que faltava a proteína HA, NA, Ml ou NS2 não promoveram a expressão de PFV nas células MDCK infectadas, indicando a ausência de PSV infecciosas. Detectaram-se as PSV infecciosas com a omissão de M2 mas o 44 número era baixo (uma redução >500 vezes comparada com o conjunto total das proteínas estruturais. Assim, todas as proteínas estruturais do vírus da gripe são necessárias para a formação eficiente de PSV infecciosas, de acordo com os dados dos estudos dos sistemas do vírus vaccinia (Mena et al., 1996) . A glicoproteína VEV pode substituir as proteínas HA e NA na produção de PSV. As proteínas HA e NA do vírus da gripe foram substituídas pela proteína G de VEV, que funciona na ligação e fusão do receptor. Nas células 293T transfectadas com pPolI-PFV; quantidades óptimas das estruturas de expressão PB2, PB1, PA, NP, Ml, M2 e NS2; e 1 pg da estrutura de VEV-G (pCAGGS-VEV-G), substituição da proteína VEV-G por glicoproteínas do vírus da gripe não afectou adversamente a formação de PSV. Ao contrário, verificaram-se números mais elevados de células positivas para PFV quando VEV-R em vez de HA e NA serviram como a glicoproteína virai. Assim, a proteína G de VEV pode ser incorporada eficazmente nos viriões da gripe e pode funcionar também como HA e NA na libertação e na entrada do vírus.
Um sistema eficiente para gerar partículas infecciosas do vírus da gripe será um activo na investigação com este vírus e potencialmente na produção de vacinas e de vectores para a terapia genética. Ao contrário do sistema existente do vírus vaccinia, a estratégia de PSV aqui descrita é altamente eficiente, tanto na transfecção inicial das células como no rendimento das PSV (> 104 partículas infecciosas/mL de sobrenadante). Além disso, é conduzido inteiramente por plasmidos que expressam as proteínas do vírus da gripe (isto é na ausência de quaisquer outras proteínas virais) o que simplifica enormemente a interpretação dos resultados. Outra vantagem enorme é a capacidade de estudar os efeitos das 45 mutações letais na formação de viriões, o empacotamento dos complexos de RNP, o desenvolvimento da replicação de vírus e os processos de ligação e fusão. Além disso, é provável que o sistema aqui descrito antes seja igualmente operacional com outros vírus, por exemplo, paramixovírus e o rabdovírus.
As proteínas HA e NA do vírus da gripe podem ser substituídas funcionalmente pelas glicoproteínas G de VEV. Anteriormente tinha sido relato que os vírus da gripe não conseguiam incorporar a proteína G de VEV quando era fornecida pelo vírus recombinante SV40 (Naim et al., 1993) . Os resultados aqui descritos sugerem que nem a HA e nem a NA são essenciais para a formação de PSV, embora não se possa rejeitar que estas glicoproteínas desempenham um papel nas interacções com outras proteínas virais, afectando assim a estrutura de viriões, conforme é sugerido pelas formas alongadas tanto de HA e NA sem cauda que expressam os vírus (Garcia-Sastre et al., 1995; Jin et al., 1994; Jin et al., 1997; Mitnaul et al. , 1996) . 0 sistema à base de plasmidos, descrito aqui antes, pode ser particularmente útil para a libertação de genes terapêuticos. As PSv podem ser preparadas de modo a conterem ARNv que codifica as proteínas necessárias para a transcrição e a replicação (isto é a NP e as polimerases), assim como, um ARNv que codifica a proteína de interesse. Estas partículas são infecciosas e podem libertar um gene designado nas células alvo, onde ele irá ser replicado e transcrito. Como estas partículas não contêm um complemento completo dos genes virais, não podem produzir vírus infecciosos de progenia. Esta característica, em conjunto com a falta de integração do genoma virai nos cromossomas hospedeiros, irá assegurar a segurança biológica da libertação de genes em indivíduos humanos e não humanos. Finalmente a disponibilidade de 15 46 subtipos HA e 9 subtipos de NA e as suas variantes vai permitir a administração repetida das PSV, ultrapassando assim a imuno-resistência às proteínas geradas por vectores, um dos principais obstáculos enfrentados com a utilização repetida de outros vectores virais, tais como, os adenovírus. Um outro benefício do sistema conduzido por plasmidos será realizado em situações que requerem apenas uma expressão de curto prazo das proteínas exógenas, como no caso de tratamento de cancro.
Exemplo 3
Utilizando o sistema Cre-loxP, pode-se gerar linhas de células empilhadas para a produção de vírus com defeitos de replicação. Por exemplo, preparação um vector de expressão de proteínas que contém uma cassete de paragem da transcrição (por exemplo, pBS302 da Life Technologies, Bethesda, Maryland; e Sauer et al., 1993; Lasko et al., 1992; Pichei et al., 1993; Bolívar et al., 1977; Stuhl et al., 1981; Stuhl, 1985; Fiers et al., 1978), flanqueada por dois sítios loxP e um dos genes virais. A transcrição iniciada na sequência promotora é bloqueada nos sítios de paragem da transcrição. Assim, o gene virai não é transcrito nem traduzido. Uma célula que seja transfectada de uma forma estável com esse vector é infectada com um vírus da gripe a que falta o ARNv que codifica o gene clonado no sistema loxP. Este vírus também contém um ARNv adicional que codifica a proteína Cre. Este vírus não é viável em células normais porque lhe falta o seu ARNv. Contudo, nas linhas de células empilhadas a proteína Cre que é expressa a partir de ARNv resulta na combinação, no sítio de loxP, resultando na eliminação do sítio de paragem da transcrição. Assim, os respectivos genes virais são agora transcritos e expressos, permitindo que o vírus se amplifique nestas células (figura 11). 47
As linhas de células empacotadas são preparadas de forma a expressar as últimas proteínas virais (isto é, HA, NA, Ml, M2 e NS2) controladas pelo sistema loxP (figura 12). As HA e NA podem ser substituídas por outras proteínas de ligação ao receptor virai e proteínas de fusão (por exemplo, Ebola GP, Marburg GP, glicoproteínas de Bunyaviridae GP1 e GP2, as proteínas G e/ou F de rabdovírus e paramixovírus, glicoproteínas de togotovírus e as glicoproteínas dos viros de ARN de hélice positiva). As partículas semelhantes aos vírus são geradas e contêm os ARNv que codificam as proteínas necessárias para a replicação/transcriçãso (isto é, as proteínas de polimerase e NP), um ARNv que codifica o gene de interesse e um ARNv que codifica Cre. Estes ARNv são empacotados em partículas semelhantes a vírus nas linhas de células de empacotamento.
Estas partículas semelhantes a vírus podem ser utilizadas para fins de vacinação e terapia genética porque (i) não contêm o complemento completo dos genes virais e assim não se podem formar nenhumas partículas de progenia infecciosa, verificando assim as preocupações rigorosas da segurança; (ii) provavelmente expressam a proteína exógena em níveis elevados; (iii) não expressão as glicoproteínas virais (HA, NA) que são os antigénios principais; assim, a resposta imunitária do hospedeiro contra as proteínas virais deve ser limitada.
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Lisboa, 14 de Dezembro de 2011. 51

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Preparação de um vírus da gripe recombinante infeccioso, caracterizada pelo facto de se preparar na ausência de um vírus auxiliar, a partir de células que se colocam em contacto com uma composição, que compreende uma variedade de vectores de ortomixovírus compreendendo: (i) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um ADNc da PA do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, (ii) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um ADNc de PB1 do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, (iii) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um ADNc de PB2 do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, (iv) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um ADNc de HA do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, (v) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um ADNc de NP do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, (vi) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um ADNc de NA do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, (vii) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um ADNc de M do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, (viii) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um ADNc de NS do vírus da gripe, ligado a uma sequência de terminação da transcrição, (ix) um vector que compreende um promotor ligado de maneira operacional a um segmento de ADN que codifica 1 para um polipéptido de PA de vírus da gripe e ligado a uma sequência da terminação da transcrição, (x) um vector que compreende um promotor ligado de maneira operacional a um segmento de ADN que codifica para um polipéptido de PB1 de vírus da gripe e ligado a uma sequência da terminação da transcrição, (xi) um vector que compreende um promotor ligado de maneira operacional a um segmento de ADN que codifica para um polipéptido de PB2 de vírus da gripe e ligado a uma sequência da terminação da transcrição, (xii) um vector que compreende um promotor ligado de maneira operacional a um segmento de ADN que codifica para um polipéptido de NP de vírus da gripe e ligado a uma sequência da terminação da transcrição, em que a referida preparação é isolada a partir das referidas células.
  2. 2. Preparação de um vírus da gripe recombinante infeccioso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de, nessa preparação, as células produzirem pelo menos 1 x 103 ufp/mL de vírus recombinante da gripe.
  3. 3. Preparação de vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto as células serem ainda postas em contacto com: (xiii) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um segmento de ADN que codifica para um polipéptido de HA de vírus da gripe e ligado a uma sequência da terminação da transcrição, 2 (xiv) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um segmento de ADN que codifica para um polipéptido de NA de vírus da gripe e ligado a uma sequência da terminação da transcrição, (xv) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um segmento de ADN que codifica para um polipéptido de Ml de vírus da gripe e ligado a uma sequência da terminação da transcrição, (xvi) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um segmento de ADN que codifica para um polipéptido de M2 de vírus da gripe e ligado a uma sequência da terminação da transcrição, e (xvii) um vector que compreende um promotor ligado de maneira funcional a um segmento de ADN que codifica para um polipéptido de NS2 de vírus da gripe e ligado a uma sequência da terminação da transcrição.
  4. 4. Preparação de um vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo facto de, nessa preparação, as células produzirem pelo menos 3 x 104 ufp/mL de vírus recombinante da gripe.
  5. 5. Preparação de vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo facto de nessa preparação o promotor ser um promotor escolhido no grupo constituído por um promotor da polimerase I de ARN, um promotor de polimerase II de ARN, um promotor de polimerase III de ARN, um promotor de T7 e um promotor de T3. 3
  6. 6. Preparação de vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo facto de, nessa preparação, o promotor ser um promotor de polimerase I de ARN.
  7. 7. Preparação de um vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo facto de, nessa preparação, o promotor ser um promotor de polimerase I de ARN humano.
  8. 8. Preparação de vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo facto de a sequência de terminação da transcrição ser seleccionada no grupo que consiste numa sequência de terminação de transcrição seleccionada numa sequência de terminação de transcrição de polimerase I de ARN, uma sequência de terminação de transcrição de polimerase II de ARN, uma sequência de terminação de transcrição de polimerase III de ARN e uma ribozima.
  9. 9. Preparação de vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo facto de dois ou mais vectores estarem fisicamente ligados.
  10. 10. Preparação de vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo facto de um ou mais vectores estarem em plasmidos separados.
  11. 11. Preparação de vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo facto de o processo ainda compreender a etapa de introdução de pelo menos uma mutação em um ou 4 mais de ADNc de PA da gripe, ADNc de PB1 da gripe, ADNc de PB2 da gripe, ADNc de HA da gripe, ADNc de NP da gripe, ADNc de NA da gripe, ADNc de M da gripe ou ADNc de NS da gripe, antes da introdução do vector nas células hospedeiras.
  12. 12. Preparação de virus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo facto de se introduzir pelo menos uma mutação no ADNc de HA da gripe, antes da introdução dos vectores nas células hospedeiras.
  13. 13. Preparação de virus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo facto de um ou mais vectores compreenderem ainda a sequência de não codificação de 3' e 5' de um virus da gripe.
  14. 14. Preparação de vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo facto de um vector codificar um péptido imunogénico ou uma proteína úteis como vacinas.
  15. 15. Preparação de vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo facto de as células hospedeiras serem células de mamíferos.
  16. 16. Preparação de vírus recombinante infeccioso da gripe, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo facto de se utilizar na terapia clínica. 5
  17. 17. Preparação ou vírus, de acordo com a reivindicação 16, caracterizados pelo facto de a referida terapêutica clínica ser utilizada como vacina ou utilizada na terapia genética. Lisboa, 14 de Dezembro de 2011. 6
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