JP5620048B2 - インフルエンザウイルスの救済(rescue) - Google Patents
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Description
る(すなわち、交差反応性である)かどうかを決定するために使用される。一般にフェレットで生産される分類血清を一連の2倍希釈物でウェルに添加し、実験室作業員は凝結赤血球細胞に対する懸濁赤血球細胞を検出することによりアッセイウェルを評価する。大部分の状況において、ワクチンに対する試料株と対照株を一致させるために血清のパネルを使用し、任意の特定のインフルエンザ流行期間中は、大部分の試料株がHIアッセイによりうまく一致される。WHOは指針を提供し、WHO協力センターは個々のウイルス株の抗原特徴の識別に対する指針を提供し、それらを入手希望の人々にこれらの株を提供することができる。試料株はA/Moscow/10/99(H3N2)−様ウイルス、A/New Caledonia/20/99(H1N1)−様ウイルス、及びB/Beijing/184/93−様ウイルスのような免疫学的系図に従って分類される。HIアッセイで特徴を調べることができない試料株に対しては、実験室作業員はそれらをフェレット中に接種して、株特異的抗血清を製造しなければならない。新規抗血清が準備されると、HIアッセイを前記のように再度実施する。新規の血清が交差反応において有意な差異(通常、試料とワクチン株間の4倍の差異と定義される)を示す場合は、定常実験室パネルに取り込まれて、新規の流行株を探索するために使用される。従って、HIアッセイはワクチン株選択のためのインフルエンザウイルス監視努力において極めて重要であり、抗原ドリフトを測定するためのもっとも一般に使用される方法である。
3 9389 1881,web site:http//www.influenza centre,org)、WHO Collaboratin Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute of Infectious Diseases(国立感染症研究所),Gakuen 4−7−1,Musashi−Murayama,Tokyo 208−0011,Japan(fax:+81 425610812又は+81 42 5652498)、WHO Collaborating Centre for Surveillance, Epidemiology and Control of Influenza,Centers for Dissease Control and Prevention,1600 Clifton Road,Mail stop G16, Atlanta,GA 30333,United States of America(fax:+1 404 639 23 34)あるいはWHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute for Medical Research,The Ridgeway, Mill Hill,London NW7 1AA,England(fax:+44 208 906 4477)宛てに照会することができる。最近の伝染病学的情報はWHOのhttp://www.who.int/influenzaのウェブサイト及びhttp://www.who.int/flunetの地理的情報システム、FluNet,で利用可能である。
Traubenberger and Layne,Molecular Diagnosis Vol.6 No.4 2001
序文
長い間、インフルエンザAウイルスの基礎的研究は有効な逆遺伝学的系の利用可能性の欠如により妨げられてきた。マイナス鎖RNAウイルスのもっとも初期の逆遺伝学法は事実、インフルエンザAウイルスに対して開発されたが(7、18)、組換えDNAから独占的のこのウイルスの救済はごく最近達成された(9、20)。
効率で、ゲノム及び抗ゲノムベクトル双方から救済することができた。
細胞及びウイルス
Madin−Darby犬腎(MDCK)細胞を10%FCS、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2mMのグルタミン、1.5mg/mlの重炭酸ナトリウム、10mMのHepes及び非必須アミノ酸を補給されたEMEM(BioWhittaker)中で培養した。293T細胞を10%FCS、100IU/mlのペニシリン、10μg/mlのストレプトマイシン、2mMのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム及び非必須アミノ酸を補給されたDMEM(BioWhittaker)中で培養した。BSR−T7細胞はT7RNAポリメラーゼを安定に発現する新生児ハムスター腎臓細胞株である。BSR−T7細胞を10%FCS、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2mMのグルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム及び0.5mg/mlのG418(Life Technologies,Breda,オランダ)を補給されたDMEM中で増殖させた。発育鶏卵中で複製するようになっており、哺乳動物細胞培養液中では好ましくは、複製することができないインフルエンザウイルスA/PR/8/34を、10IU/mlのペニシリン及び10μg/mlのストレプトマイシンを補給されたEpiserf培地(Gibco BRL)中で増殖されたMDCK細胞中で感染の低い多重度において7回通過させた。7回目の通過後、108のTCID50/mlのウイルス滴定濃度を定常的に得た。
293T細胞の一過性のリン酸カルシウム−媒介トランスフェクションを本質的に記載の通りに実施した(24)。50パーセントの密集単層を得るために、トランスフェクションの前日に、細胞をゼラチン状にした100mmの直径の培養皿中に入れた。1晩のトランスフェクション後、トランスフェクション培地を、ウイルス産生に対しては2%FCS又はすべての他のトランスフェクションに対しては10%FCSを補給された新鮮培地で置き換えた。細胞を30〜72時間インキュベートし、その後上澄みを回収し、適当な場合には細胞を蛍光染色分析した。プラスミドpEGFP−N1(Clontech,BDBiosciences,Amsterdam,オランダ)をすべての実験において平行にトランスフェクションし、蛍光染色細胞の百分率をFACSCalibur(Becton Dickinson)フロー・サイトメーターで測定して、トランスフェクション効率が95〜100パーセントの範囲にあることを確認した。ウイルス含有上澄みを300×gで10分間の遠心分離により透明にした。上澄み中のウイルス滴定濃度を直接又は1週間未満に対しては4℃で保存時に、又は1週間を超える時は−80℃で決定した。
MDCK細胞の一時的トランスフェクションを本質的に前記の通りに実施した(1)。端的には、240μlのOptimemI培地(GibcoBRL)を10μlのLipofectamin2000に添加し、室温で5分間インキュベートした。この混合物に、Optimem I培地を使用して50μlの容量に調整された、意図された量のDNAを添加した。この混合物を室温で20分間インキュベートした。インキュベート後、ペニシリン及びストレプトマイシンを含まない200μlのMDCK培養培地(前記参照)を添加し、この混合物を6−ウェルプレート中の懸濁物中の1×106MDCK細胞に添加した。5時間のインキュベート後、細胞をPBSで2回洗浄し、ペニシリン及びストレプトマイシンを含まない2mlのMDCK培養培地中で培養した。1晩のインキュベート後にこの培地を2%FCS含有MDCK培養培地と置き換えた。
BSR−T7細胞の一時的トランスフェクションのために、トランスフェクションの前日に6−ウェル培養皿中に400.000細胞を入れて、50〜70%の密集単層を得た。血清を含まないDMEM(240μl)を10μlのLipofectamin2000に添加し、室温で4分間インキュベートした。この混合物に血清を含まないDMEMで50μlに調整したDNAを添加し、室温で20分間インキュベートした。トランスフェクション前に、培地を2mlの血清を含まないDMEMで置き換えた。インキュベート後、トランスフェクション混合物を細胞に滴下し、37℃で5時間インキュベートした。トランスフェクション後、細胞をPBSで1回洗浄し、ウイルス産生のためには2%FCS又はFACS分析のためには10%FCSを補給された2mlのDMEMを添加した。
T7polをコードする真核細胞発現ベクトル(pAR3126及びpAR3132)を使用した。プラスミドpAR3126は野生型T7polをコードするが、プラスミドpAR3132はT7polを細胞核に有効に命中にさせる核局在化シグナル(NLS)を含有するT7polを発現する。それからインフルエンザAウイルスのポリメラーゼタンパク質が発現される真核細胞発現プラスミドはマウスのヒドロキシ−メチルグルタリル−補酵素A還元酵素プロモーターのpHMG−PB1、pHMG−PB2、pHMG−PA及びpHMG−NPを使用する(25)。
293T細胞を、前記のように、PR/8/34の遺伝子セグメントを含有する単方向性プラスミドそれぞれから5μg、それぞれ5μgの発現プラスミドHMG−PB2、HMG−PB1、HMG−PA、HMG−NP及び15μgのpAR3132によりトランスフェクションした。あるいはまた、我々はPR/8/34の遺伝子セグメントを含有する双方向性プラスミドそれぞれから5μg及び15μgのpAR3132をトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後に上澄みを回収し、1mlを使用してMDCK細胞の密集単層を感染させた。
播種の前に、MDCK細胞をPBSで2回洗浄し、1mlの293T上澄みを使用して6−ウェルのプレート中のMDCK細胞の密集単層を播種し、感染中に40μgのトリプシン(2.5%、Bio Whittaker)を添加した。プレートを37℃で1時間保存し、PBSで2回洗浄し、その後、4%BSA、100IU/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2mMのグルタミン、1.5mg/mlの重炭酸ナトリウム、10mMのHepes、非必須アミノ酸及び20μg/mlのトリプシン((感染媒質)を補給された2mlのEMEM(BioWhittaker)を添加した。感染3日後に、培養物の上澄みを回収し、細胞の感染の指標としてのHA活性を試験した。前記のようにウイルス滴定を実施した(26)。端的には、トランスフェクション細胞の上澄みの10倍連続希釈物を感染媒質中に調製した。播種の前に、細胞をPBSで2回洗浄した。100μlの希釈培養物上澄みを使用して96ウェルプレート中のMDCK細胞の密集単層に播種した。37℃で1時間後に、細胞を再度PBSで洗浄し、200μlの新鮮な感染媒質を各ウェルに添加した。感染3日後に、培養物の上澄みを個々のウェル中の細胞の感染の指標としてのHA活性を試験した。感染滴定濃度はSpearman−Karberの方法に従って10回の反復から計算した(26)。
単方向性のT7polに基づく逆遺伝学的系によるGFPミニゲノムアッセイ
pT7、HδVrib及びtT7を含有する単方向性ベクトルを構成した。インフルエンザウイルスA/PR/8/34のセグメント5の非コード領域(NCR)を隣にもつGFPオープンリーディングフレームを0、2又は3個の更なるG残基をもつセンス(S)及びアンチセンス(AS)配置のpSP72−pT7−HδVrib−tT7中でクローンさせた(図1及び別図2及び3)。これらの構築物はそれぞれS−0G、S−2G、S−3G、AS−0G、AS−2G及びAS−3Gと名付けた。我々はこれらの選択肢のどれが最良の効果をもたらしたかを試験した。
我々が解決する必要がある可能性がある1つの問題はT7polの発現であった。パラミキソウイルスの逆遺伝学に対しては、パラミキソウイルスの複製はまた細胞質内で起るために、望ましい、主として細胞質内で発現されたT7polが使用される。インフルエンザウイルスは細胞核内で複製し、従って細胞質内のT7polの発現は最良の選択ではないかも知れない。従って我々は、T7polの細胞質バージョン(プラスミドAR3126)又は、核局在化シグナルを含有するT7pol(NLS、プラスミドpAR3132)のいずれかが使用された時のGFP発現レベルを比較することを所望した。
幾つかのパラミキソウイルスの逆遺伝学的系に対して、T7polはプラスミドトランスフェクションにより供給されず、T7polの安定な発現を許す細胞株の使用によって供給された。この目的のために、新生児ハムスターの腎臓細胞(BSR−T7)が利用できる。我々はBSR−T7細胞が、次にインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体により複製されて、GFP発現をもたらすことができる、インフルエンザウイルスGFPミニゲノムの転写のために使用することができるかを試験した(図4)。
次にインフルエンザウイルスA/PR/8/34の遺伝子セグメントを組換えインフルエンザウイルスA/PR/8/34の産生のために、ベクトルpSP72−pT7−HδVrib−tT7中でクローン化させた。
次に我々はpT7の制御下で双方向性逆遺伝学的系を開発することを所望した。pSP72−pT7−HδVrib−tT7中でpCMVをクローン化させることによりプラスミドベクトルを産生して、ベクトルpSP72−pT7−HδVrib−tT7−pCMVをもたらした(図1)。インフルエンザウイルスA/PR/8/34のセグメント5の非コード領域(NDR)を隣にもつGFPオープンリーディングフレームを2個の更なるG残基をもつアンチセンス配置におけるpSP72−pT7−HδVrib−tT7−pCMV中でクローン化させた。我々はこのプラスミドがインフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体によるミニゲノム複製の必要なしにGFP発現を引き起こすであろうと期待したので(pCMVはミニゲノムに対してセンス配置にある)、我々は更に、pT7に対してセンス配置にある(従ってpCMVに対してアンチセンス)ミニゲノム(0のG残基)を含有する同様な構築物を作製した。ミニゲノムプラスミドを核T7pol及びpHMG−PB1、pHMG−PB2、pHMG−PA及びpHMG−NPを発現するプラスミドと一緒に293T細胞中でトランスフェクションした。30時間後に細胞をFACSにより分析した(図5)。
次にインフルエンザウイルスA/PR/8/34の遺伝子セグメントを組換えインフルエンザウイルスA/PR/8/34の作製のためにベクトルpSP72−pT7−HδVrib−tT7−pCMV中でクローン化させた。
T7polに基づく逆遺伝学的系の普遍的性状の更なる証拠を提供するために、293T細胞でなくMDCK細胞中のGFPミニゲノムの複製を試験された。BSR−T7細胞による実験はすでに、T7pol逆遺伝学的系が霊長類以外の発生源の細胞中で有効であるという証明を提供したが(図4)、MDCKはインフルエンザウイルスの研究及びワクチンの生産により広範に利用される。
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Claims (23)
- 7または8の核酸でトランスフェクションされた細胞を培養する工程を含んでなる、ヘルパーウイルスを使用せずに複製型インフルエンザウイルス粒子を産生する方法であって、該核酸が各々インフルエンザ遺伝子セグメント及びバクテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなるか又は該核酸が各々インフルエンザ遺伝子セグメントの相補物及びバクテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなり、該方法に使用される細胞が更にバクテリオファージポリメラーゼを含んでなる、上記方法。
- 請求項1記載の方法であって、該方法に使用される核酸が、バクテリオファージポリメラーゼターミネーターを含まない、上記方法。
- 請求項1〜2のいずれか1項に記載の方法であって、該方法に使用される核酸が、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの隣に少なくとも1個の更なるグアニン残基を提供された、上記方法。
- 請求項3記載の方法であって、該方法に使用される核酸が、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターの隣に2個の更なるグアニン残基を提供された、上記方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法であって、該バクテリオファージポリメラーゼプロモーターが、T7ポリメラーゼプロモーターである、上記方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法であって、細胞のトランスフェクションが、インフルエンザ核タンパク質及びポリメラーゼタンパク質PA、PB1及びPB2のみならずまた、8種のインフルエンザvRNA核酸を発現する12種の単方向性プラスミドによる、上記方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法であって、該方法に使用される少なくとも1種の核酸が、ワクチンの目的のために世界保健機構により推奨されるインフルエンザウイルスから誘導されたインフルエンザ遺伝子セグメントを含んでなる、上記方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法であって、該方法に使用される少なくとも1種の核酸がインフルエンザA遺伝子セグメントを含んでなる、上記方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、該バクテリオファージポリメラーゼが、核局在化シグナルを含んでなる、上記方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法であって、該バクテリオファージポリメラーゼが、T7ポリメラーゼである、上記方法。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法であって、該方法に使用される細胞が、霊長類以外の細胞である、上記方法。
- 請求項11記載の方法であって、該方法に使用される細胞が、MDCK細胞又はCEF細胞である、上記方法。
- インフルエンザ遺伝子セグメントまたはその相補物及びT7バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを含んでなり、かつ、該プロモーターに接して少なくとも一つの追加のグアニン残基を備えた核酸。
- 請求項13記載の核酸であって、該プロモーターに接して2つの追加のグアニン残基を備えた、上記核酸。
- ワクチンの目的上WHOにより推薦されているインフルエンザウイルス由来の遺伝子セグメントを含んでなる請求項13又は14記載の核酸。
- インフルエンザAの遺伝子セグメントを含んでなる請求項13〜15のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項13〜16のいずれか1項に記載の核酸を含んでなる細胞。
- さらに、T7バクテリオファージポリメラーゼを含んでなる請求項17記載の細胞。
- 該ポリメラーゼが核局在化シグナルを含んでなる、請求項18記載の細胞。
- 請求項17〜19のいずれか1項に記載の非霊長目の動物細胞。
- MDCK細胞又はCEF細胞である請求項20記載の細胞。
- ヘルパーウイルスを含まない請求項17〜21のいずれか1項に記載の細胞。
- 医薬組成物の製造のための、請求項17に記載の細胞の使用。
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