DE69634407T2 - DEM ANTI-GENOM VON NICHT-SEGMENTIERTEN MINUSSTRÄNGEN RNA-VIREN ENTSPRECHENDE cDNA UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG SOLCHER VIREN, WELCHE ZUSÄTZLICH ANTIGENISCH AKTIVE PROTEINE KODIEREN - Google Patents

DEM ANTI-GENOM VON NICHT-SEGMENTIERTEN MINUSSTRÄNGEN RNA-VIREN ENTSPRECHENDE cDNA UND VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG SOLCHER VIREN, WELCHE ZUSÄTZLICH ANTIGENISCH AKTIVE PROTEINE KODIEREN Download PDF

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Schweiz Serum und Impfinstitut und Institut zur Erforschung der Infektionskrankheiten
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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen eine Methode zur Herstellung von nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Viren (Pringle, 1991) von clonierter Desoxyribonucleinsäure (cDNA). Solche gewonnenen Viren sind für die Verwendung als Impfstoffe geeignet, oder andernfalls als Vektoren in somatischen Gentherapie-Anwendungen. Das Masernvirus (MV) wird als Modell für andere Vertreter der Mononegavirales, im Besonderen der Familie der Paramyxoviridae, verwendet.
  • Die Erfindung stellt die Technologie zur Konstruktion von rekombinanten Impfstoffstämmen bereit, im Besonderen Masernvirus-Impfstoffstämmen, welche codierende Regionen für die Expression von Epitopen oder des Gesamtprotein von anderen Viren, Bakterien oder Parasiten enthalten. Es zeigt auch, dass chimäre Masernvirus-Stämme, welche heterologe Hüllproteine enthalten, so konstruiert werden können, dass sie Zellen angreifen, die keine Masernvirus-Rezeptoren enthalten. Auf diese Weise können im Prinzip Plasmide konstruiert werden, die auf dem Genom des Masernvirus basieren und in Hüllen verpackt sind, die Proteine zum Angreifen von speziellen Zelltypen enthalten, welche Genprodukte codieren, die entweder in genetisch defekten Individuen fehlen oder die toxisch für die maligne Zellen sind, auf die sie abzielen.
  • Durch einfachen Austausch der Masernvirus-spezifischen Helferzelllinien, die in dieser Erfindung beschrieben werden, durch Zelllinien, welche die verwandten Proteine exprimieren, die von anderen Vertretern der Mononegavirales, welche gewonnen werden sollen, codiert werden, kann jeder andere Angehörige dieser viralen Ordnung, der in Vertebratenzellen repliziert, zum Zweck von Lebendimpfstoffen oder als Vektoren für Gentherapie, anstelle des Masernvirus, verwendet werden.
  • Hintergrundinformation
  • Masernvirus
  • Das Masernvirus ist ein Angehöriger der Familie der Paramyxoviridae. Seine genetische Information ist auf einem 15894 Nucleotide umfassenden einzelsträngigen RNA-Strang mit negativer Polarität codiert. Das Genom wird vom 3'-Ende sequentiell transkribiert, um zusätzlich zu einer Leader-RNA 6 Haupt-Messenger-Ribonucleinsäure (RNA)-Spezies mit „Cap" und Polyadenylierung zu erhalten, von denen jede ein Hauptprotein codiert. Die Genomkarte wird in 1 gezeigt, mit Hinweis auf die Gene, welche die Hauptprodukte bestimmen, N (Nucleocapsidprotein), P (Phosphoprotein), M (Matrixprotein), F (Fusionsprotein), H (Hämagglutinin) und L (großes Protein = Polymerase). Verschiedene weitere RNA- und Proteinspezies, welche teilweise in der Tabelle von 1 erwähnt werden, komplizieren dieses einfache Bild, sind aber hier nicht relevant.
  • Das Masernvirus ist die Hauptursache für akute fieberhafte Erkrankung in Säuglingen und kleinen Kindern. Laut Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sterben jährlich eine Million kleiner Kinder an den Masern. Dieses hohe Tribut zeigt sich hauptsächlich in den Entwicklungsländern, aber in den letzten Jahren sind, hauptsächlich durch lückenhafte Befolgung des Immunisierungsprogrammes auch industrialisierte Länder wie zum Beispiel die Vereinigten Staaten von Amerika wieder von Masernepidemien betroffen gewesen (Clements und Cutts, 1995). Zurzeit sind verschiedene lebende attenuierte Masernvirus-Impfstoffstämme in Verwendung (einschließlich der Schwarz-, Moraten- und Edmonston-Zagreb-Stämme), fast alle sind, durch mehrfache Passage in nicht-menschlichen Zellen (Enders, 1962), von dem ursprünglichen Edmonston-Stamm abgeleitet (Enders und Peebles, 1954). Siehe Norrby (1995) für eine neuere Diskussion über Masernvirus-Vakzinologie, einschließlich zukünftiger Entwicklungen. Der Masernimpfstoff wird gewöhnlich im Alter von 15 Monaten verabreicht oder, in den Entwicklungsländern, schon mit 6 Monaten und hat sich als hoch effektiv erwiesen, üblicherweise mit Schaffung einer lebenslangen Immunität gegen Masernvirus-Reinfektion, welche Morbidität hervorruft. Bis heute bleiben die genetischen Veränderungen unbekannt, die für die Abschwächung dieser Impfstoffstämme verantwortlich sind. Die erwiesene Gefahrlosigkeit des Masernimpfstoffes, verbunden mit seiner hohen und lang anhaltenden Wirksamkeit, prädestiniert ihn als ideales Plasmid für die Expression von heterologen Genen. Solch ein Impfstoff könnte sich bei der Hervorrufung von lang anhaltendem Immunschutz gegen andere pathogen Stoffe als genauso wirkungsvoll erweisen wie gegen das Vektorvirus selbst. Ein anderer möglicher Kandidat als Impfstoffvektor ist das Mumpsvirus, ein entfernter Verwandter des Masernvirus, welches als abgeschwächter Lebendimpfstoff, ebenfalls hoch effizient und sicher ist.
  • Gewinnung von RNA-Virus von clonierter DNA
  • Das Studium des Replikationszyklus einer Anzahl an RNA-Viren ist durch das Vorhandensein von DNA-Clonen, von welchen diese infektiösen Viren gewonnen werden können, und somit die Anwendung reverser Genetik ermöglichen, außerordentlich erleichtert worden. Zunächst wurde der Bakteriphage Qβ (Taniguchi et al., 1978) und das Poliovirus (Racaniello und Baltimore, 1981) und schließlich das Sindbisvirus (Rice et al., 1987) von clonierter cDNA exprimiert. Mittlerweile kann eine große Vielfalt an Positiv-Strang-RNA-Viren, die hauptsächlich Vertebraten und Pflanzen infizieren, von clonierter DNA gewonnen werden (siehe Boyer und Haenni, 1994, für eine neuere Übersicht). Außerdem ist die provirale DNA von Retroviren infektiös. Die Versuche infektiöse Viren von cDNA-Clonen von Minus-Strang RNA-Viren zu erhalten, sind jedoch auf große Schwierigkeiten gestoßen. Der Grund dafür sind zwei Eigenschaften dieser Viren: (i) weder genomische noch anti-genomische RNAs sind infektiös, weil sie nicht als mRNAs dienen; und (ii) benötigen sowohl Transkription als auch Replikation benötigen Ribonucleocapside, d.h. stabähnliche Nucleoprotein-Komplexe (RNPs), welche die genomische RNA und verschiedene Proteine mit struktureller und/oder enzymatischer Funktion enthalten.
  • Die Gewinnung von clonierter DNA ist vor einigen Jahren im Falle des Influenzavirus, eines Negativ-Strang-RNA-Virus, welches acht Genomsegmente enthält, erreicht worden. Deren RNPs, welche eine kleine Größe aufweisen und wie durch die Empfindlichkeit ihrer RNA-Komponente für RNase offenbart, locker strukturiert sind, können in vitro aus der RNA und den benötigten viralen Proteinen, N und den Polymerasekomponenten, zusammengelagert werden. Anfänglich wurde eine künstliche RNA verwendet, welche die codierende Sequenz der Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), eingebettet in die nicht-codierenden terminalen Segmente der Untereinheit eines Influenza-Virusgenoms (Luytjes et al., 1989) als Reporter trägt. Später wurden einzelne authentische oder veränderte RNAs von genomischen Untereinheiten verwendet, die in vitro von clonierter DNA transkribiert wurden (Enami und Palese, 1991). Wie jeweils durch CAT-Produktion und Gewinnung eines neu zusammengestellten Influenzavirus überwacht, replizierten und transkribierten die zusammengelagerten RNPs nach Transfektion in die mit Influenza infizierten Zellen. Die Reinigung des Virus, welches die eingeführte Untereinheit enthält, vom gewaltigen Überschuss an nicht neu zusammengestellten Virus, kann in manchen Fällen durch Selektion bewerkstelligt werden, zum Beispiel unter Verwendung eines spezifischen neutralisierendem Antikörpers, der gegen das Protein gerichtet ist, welches von der verwandten Untereinheit des Helfervirus codiert wird.
  • Im Gegensatz dazu waren bei den Viren mit einem nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Genom, welche in der Ordnung der Mononegavirales (Pringle, 1991) zusammengefasst werden, die viel dichter strukturierten und längeren RNPs, welche zusätzlich zum N-Protein das Assemblierungs- und Polymerasecofaktor- Phosphoprotein (P) und die virale RNA-Polymerase (großes Protein, L) enthalten, die funktionsfähige Zusammenstellung in vitro schwerer zu bewerkstelligen. Viele Labors haben sich der Gewinnung von Vertretern der Mononegavirales daher ausgehend von subgenomischen RNAs angenähert, welche nur essentielle Abschnitte des viralen Genoms enthielten, unter der Verwendung von Viren, welche die Helferproteine bereitstellten, die benötigt wurden, um diese Mini-Replicons intrazellulär in ein Capsid zu verpacken und zu replizieren. Zuerst wurden natürlich vorkommende subgenomische RNAs verwendet, welche mit der viralen Replikation konkurrierten und daher als defekte interferierende Partikel (DI) RNAs (Re, 1991) bekannt waren, sie wurden später durch künstliche DI-RNAs ersetzt, welche Reportergene enthielten und von entsprechend konstruierten Plasmiden transkribiert wurden. Diese Mini-Replicons, die zuerst von der Gruppe von M. Krystal (Park et al., 1991) gemäß dem Replicon erfunden wurden, welches für das anfängliche Influenza-Gewinnungsmodell (Luytjes et al., 1989) verwendet wurde, tragen eine CAT-Codierungssequenz, inseriert in virale, nicht-codierende terminate Regionen des Sendaivirus (SeV) und sind auch für das Respiratory Syncytial Virus (Collins et al., 1993; Collins et al., 1991), das menschliche Parainfluenzavirus 3 (Dimock und Collins, 1993) das Tollwutvirus (Conzelmann und Schnell, 1994) und das Masernvirus (Sidhu et al., 1995) verwendet werden.
  • In all diesen Systemen wurden die essentiellen Helferproteine entweder durch homologe Viren oder durch den Vacciniavektor vTF7-3, der die T7-Phagen RNA-Polymerase codiert (Fuerst et al., 1986), um die T7-spezifische Transkription von transfizierten Plasmiden zu treiben, welche die benötigten Proteine N, P und L codieren, die von Pattnaik et al. (1990) wegbereitend beschrieben wurden. Diese Untersuchungen, bei welcher Mini-Replicons verwendet wurden, haben wichtige Erkenntnisse in die nicht-codierenden regulatorischen Regionen der entsprechenden viralen Genome und Antigenome (siehe Wertz et al., 1994 für eine neuere Besprechung) ermöglicht. Durch Annahme des gleichen experimentellen Aufbaus wurde nun auch über die Gewinnung des Virus für vesikuläre Stomatitis (VSV), welches wie das Tollwutvirus ein Angehöriger der Rhabdoviridae ist, berichtet (Lawson et al., 1995).
  • Ein wichtiger Nachteil dieses Verfahrens (sowie des Verfahrens, welches für Negativ-Strang-RNA-Viren mit segmentiertem Genom angegeben worden ist) ist die Beteiligung eines Helfervirus, welches von dem gewonnenen Virus abgesondert werden muss und welches mit der Replikation des Virus, welches gewonnen werden soll, interferieren kann. Für das Tollwutvirus und VSV, welche beide zur Gruppe der starr strukturierten Rhabdoviridae zählen und in hohen Titern replizieren, ist das kein wichtiges Problem. Im Falle der locker strukturierten polymorphen Virionen jedoch, welche für die die Angehörigen der Familie der Paramyxoviridae typisch sind, und im Fall von Viren, die relativ niedrige Titer ergeben, würde die Anwesenheit eines Helfervirus die Gewinnung des gewonnenen Virus schwierig gestalten und könnte ihre Gewinnung vollkommen ausschließen.
  • Demgemäß war das technische Problem, welches der vorliegenden Erfindung zugrunde lag, Mittel und Verfahren bereitzustellen, welche für die Herstellung von nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Viren nützlich sind, vorzugsweise aus der Familie der Paramyxoviridae und am meisten bevorzugt vom Masernvirus, und ein System mit angemessener Effizienz zur Gewinnung von solchen Viren. Die Lösung zu diesem technischen Problem wird durch die Ausführungsformen bereitgestellt, welche in den Ansprüchen gekennzeichnet sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung eines infektiösen, nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus der Familie der Paramyxoviridae umfassend (a) das Einführen eines in einem Plasmid enthaltenen cDNA-Moleküls, wobei das cDNA-Molekül die gesamte (+)-Strangsequenz des Negativ-Strang-RNA-Virus umfasst, funktionell verknüpft mit einer Expressions-Kontrollsequenz, welche die Synthese von anti-genomischen RNA-Transkripten mit den authentischen 3'-Termini erlaubt, und wobei das cDNA-Molekül aus einem ganzzahligen Vielfachen von 6 Nucleotiden besteht, in eine Helferzelle, die eine RNA-Polymerase, vorzugsweise T7 RNA-Polymerase, ein N- und ein P-Protein, vorzugsweise des zu gewinnenden Virus, und des weiteren ein L-Protein exprimiert, vorzugsweise des zu gewinnenden Virus, codiert von einer entweder transient oder stabil in die Zelle eingeführten cDNA; und (b) das Gewinnen des zusammengelagerten infektiösen, nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus.
  • Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines beliebigen Negativ-Strang-RNA-Virus der Familie der Paramyxoviridae. Vorzugsweise tragen diese antigenomischen RNA-Transkripte auch die authentischen 5'-Termini.
  • Wie weiters gemäß der vorliegenden Erfindung herausgefunden wurde, wird die effektive Produktion des Masernvirus, welches ein Negativ-Strang-RNA-Virus der Familie der Paramyxoviridae ist, nur erhalten, wenn die Replicons, welche durch dieses cDNA-Molekül spezifisiert sind, aus einem ganzzahligen Vielfachen von sechs Nucleotiden bestehen. Dieses Phänomen wird auch überall in dieser Anmeldung als „Sechserregel" bezeichnet werden. Die cDNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können in geeigneter Weise für die Gewinnung der Negativ-Strang-RNA-Viren der Familie der Paramyxoviridae verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist die Expressions-Kontrollsequenz in diesem cDNA-Molekül ein RNA-Polymerase-Promotor.
  • Das vorstehend zitierte Plasmid ist zur Vermehrung und vorzugsweise auch zur Expression des cDNA-Moleküls der Erfindung als eine antigenomische RNA fähig.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Plasmid ein exprimierbares DNA-Fragment, welches eine vorzugsweise homologe DNA-Region dieses cDNA-Moleküls ersetzt, oder zusätzliche genetische Information bereitstellt.
  • Wie auch gemäß der vorliegenden Erfindung herausgefunden wurde, muss die Sechserregel im Falle der auf dem Masernvirus basierenden Replicons befolgt werden, wenn ein fremdes – homologes oder heterologes – exprimierbares DNA-Fragment in das Plasmid inseriert wird, welches die cDNA der Erfindung enthält. Mit anderen Worten wird jedes neu erzeugte Replicon, welches durch entsprechend konstruierte cDNA-Moleküle spezifisiert ist, nur dann im Stande sein, angemessene Mengen des gewünschten Produktes zu erbringen, wenn es die Sechserregel befolgt.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das Plasmid dadurch gekennzeichnet, dass das exprimierbare DNA-Fragment in oder neben eine Region dieser cDNA inseriert ist, welche ein virales Protein codiert, wobei diese Einfügung in einer solchen Weise durchgeführt wird, dass der Leseraster bestehen bleibt, um ein Fusionsprotein zu erzeugen und die Expression dieses DNA-Fragments unter der Kontrolle der Signalsequenzen des viralen Proteins zu ermöglichen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass in verschiedenen Fällen entsprechende C-terminale Verlängerungen der viralen Proteine nicht mit ihrer Funktionalität interferieren.
  • In Abänderung mit der vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsform und auch enthalten in der vorliegenden Erfindung, wird das exprimierbare DNA-Fragment in einer solchen Weise stromabwärts von einer viralen Protein-codierenden Region exprimiert, dass die Ausbildung eines Fusionsproteins vermieden wird, aber trotzdem die Expression der stromabwärts liegenden codierenden Sequenz ermöglicht wird, entweder durch einen Stopp-/Neustart-Mechanismus, in dem der letzte A-Rest des stromaufwärts liegenden Terminationstripletts mit dem Start-Codon der stromabwärts liegenden codierenden Region zusammenfällt, oder durch Platzieren einer internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES) zwischen die beiden codierenden Regionen; siehe Beispiel 12, zweiter Absatz.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist dieses Plasmid dadurch gekennzeichnet, dass das exprimierbare DNA-Fragment in einer nicht-codierenden Region der cDNA inseriert ist und durch virale Signalsequenzen oder heterologe Signalsequenzen flankiert ist, welche die Expression des RNA-Fragments kontrollieren, welches durch dieses DNA-Fragment spezifiziert ist; siehe Beispiel 12, erster Absatz.
  • Besonders bevorzugt wird das exprimierbare DNA-Fragment stromaufwärts vom N-Gen platziert. Wie gemäß der vorliegenden Erfindung herausgefunden worden ist, resultiert die Positionierung dieses exprimierbaren DNA-Fragments am 5' Ende der Masernvirus-Sequenz in einer besonders starken Expression hiervon; siehe auch Beispiel 14.
  • Beispiele dieser Ausführungsform, welche zusätzliche Transkriptionseinheiten erzeugen, werden durch die Plasmide bereitgestellt, die Masernviren spezifizieren, welche die in 10 gezeigten heterologen CAT-Leserahmen exprimieren.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Plasmid, welches eine genomische Ribozym-Sequenz gleich neben dem 3'-terminalen Nucleotid des cDNA-Moleküls und gegebenenfalls stromabwärts von dieser genomischen Ribozym-Sequenz mindestens einen Terminator, vorzugsweise den T7 – Terminator, umfasst.
  • Der Einschluss einer Ribozym-Sequenz in das Plasmid der Erfindung führt zu der genauen Spaltung des RNA-Transkripts und auf diese Weise zu einer großen Steigerung der Ausbeute an Transkripten, welche die 3'-Enden tragen, die im Falle des Masernvirus die Sechserregel befolgen müssen.
  • Der Fachmann ist natürlich in der Lage, andere Wege zu entwickeln, die in der Erzeugung der authentischen 3'-Termini resultieren. Solche Wege umfassen die Verwendung oder Inkorporierung von Restriktionsschnittstellen auf dem DNA-Niveau oder von dreifachhelicalen DNAs.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Plasmids der Erfindung ist diese genomische Ribozym-Sequenz die genomische Ribozym-Sequenz des Hepatitis-Delta-Virus.
  • Das Verfahren der Erfindung verwendet in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ein Plasmid, welches die cDNA trägt, die im Stande ist, sich in einem prokaryontischen Wirt zu vermehren. Ein bevorzugtes Beispiel eines solchen prokaryontischen Wirtes ist E. coli. Darstellungen dieses bevorzugten Beispieles sind alle cDNA-Konstrukte, welche zu modifizierten Masernviren führen, wie sie in den Plasmiden, welche in hoher Kopienzahl in E. coli replizieren, in 2 und 10 gezeigt werden.
  • Außerdem betrifft das Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Plasmid, welches die cDNA(s) trägt, die im Stande ist (sind), in einem eukaryontischen Wirt zu replizieren.
  • Die Erfindung sieht die Replikation und Expression (d.h. Transkription gefolgt von der Translation der gebildeten Transkripte) des gewonnenen Vektors vor, d.h. die verpackten RNA-Partikel (RNPs) in irgendeiner geeigneten eukaryontischen, vorzugsweise Vertebraten-Wirtszelle. Bevorzugte Wirtszellen sind jene mit einer hohen Replikations- und Expressionskapazität. Besonders bevorzugt sind jene Wirtszellen, die eine leichte Gewinnung der gewonnen Viren zur weiteren Replikation und anschließender Formulierung in Impfstoffen ermöglichen.
  • Das Verfahren der Erfindung betrifft in einer anderen bevorzugten Ausführungsform ein Plasmid, wobei das exprimierbare DNA-Fragment ein DNA-Fragment ist, welches homolog oder heterolog im Bezug auf das Negativ-Strang-RNA-Virus ist und mindestens ein immunogenes Epitop codiert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung codiert das exprimierbare DNA-Fragment des Plasmids mindestens ein immunogenes Epitop von mindestens einem Pathogen, vorzugsweise einem Hüllprotein, mindestens einem Genprodukt, welches in genetisch defekten Individuen nicht vorhanden ist oder für die angegriffenen malignen Zellen toxisch ist.
  • Diese besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ermöglicht die Konstruktion von Plasmiden als eine Basis für Impfstoffe, welche effektiv eine Immunantwort gegen ein, oder vorzugsweise viele verschiedene Pathogene induzieren. Für den Fall, dass das exprimierbare DNA-Fragment ein Hüllprotein eines anderen Virus als des Masernvirus, oder eines anderen Pathogens codiert, kann ein auf dem Masernvirus basierendes Plasmid verwendet werden, um spezifische Zelltypen anzugreifen, die üblicherweise vom Masernvirus nicht erkannt werden. Diese Zelltypen können dann gezielt durch gewonnene Viren, spezifiziert durch das Plasmid der Erfindung angegriffen werden und auf diesen Zelltyp beispielsweise ein Molekül übertragen, das dieser Zelltyp braucht, oder ein Toxin, falls dieser Zelltyp eliminiert werden soll. Natürlich soll dieses Molekül oder Toxin auch von diesem Plasmid codiert werden. Der Fachmann ist im Stande, weitere Anwendungen dieses einfachen Prinzips zu entwickeln, für die das Plasmid der Erfindung verwendet werden kann.
  • Das Plasmid kann auch ein Produkt codieren, welches in genetisch defekten Individuen fehlt. Das gewonnene Virus kann dann zur Gentherapie dieser genetisch defekten Individuen verwendet werden.
  • Weiters können maligne Zellen vom gewonnen Virus angegriffen werden, welches auf dem Plasmid der Erfindung basiert, und Moleküle, die für diese malignen Zellen toxisch sind, können transferiert werden.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die exprimierbare DNA in diesem Plasmid von einem Virus, einem Bakterium oder einem Parasiten abgeleitet.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung betrifft ein Plasmid, wobei das exprimierbare DNA-Fragment ein immunogenes Epitop codiert, das zum Hervorrufen einer schützenden Immunantwort geeignet ist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform basieren das cDNA-Molekül oder die Plasmide gemäß der Erfindung auf einem RNA-Virus, das entweder das Masernvirus oder das Mumpsvirus ist.
  • Ebenfalls hierin beschrieben ist eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, transformiert mit einem vorstehend beschriebenen Plasmid. Vorgesehene Wirtszellen sind vorstehend besprochen worden.
  • Außerdem ebenso hierin beschrieben ist eine Helferzelle, die im Stande ist, ein RNA-Replicon von einem cDNA-Molekül der Erfindung zu exprimieren, dieses cDNA- Molekül ist in dem Plasmid der Erfindung enthalten oder in einem Plasmid, umfassend ein cDNA-Molekül für die Produktion eines Negativ-Strang-RNA-Virus der Familie der Ordnung der Mononegavirales, welches kein Angehöriger der Familie der Paramyxovirales ist, dieses cDNA-Molekül umfasst die gesamte (+)-Strangsequenz, welche mit einer Expressions-Kontrollsequenz funktionell verknüpft ist und gegebenenfalls ein exprimierbares DNA-Fragment, welches eine vorzugsweise homologe DNA-Region dieses cDNA-Moleküls ersetzt oder zusätzliche genetische Information bereitstellt, dieses exprimierbare DNA-Fragment codiert vorzugsweise mindestens ein immunogenes Epitop von mindestens einem Pathogen, welches besonders bevorzugt geeignet ist, eine schützende Immunantwort hervorzurufen, diese Zelle ist weiter dafür geeignet, die für die Transkription, die Verpackung in Capside und Replikation dieser RNA notwendigen Proteine zu exprimieren.
  • Abgesehen von den vorstehend beschriebenen Merkmalen, kann das cDNA-Molekül für die Produktion von Negativ-Strang-RNA-Virus der Familie der Ordnung der Mononegavirales, welches kein Mitglied der Familie der Paramyxoviridae ist, in bestimmten Ausführungsformen auch Eigenschaften des cDNA-Moleküls der Erfindung aufweisen, welche hierin, gegebenenfalls in Zusammenhang mit den Plasmiden der Erfindung, vorstehend besprochen wurden.
  • In Anbetracht der Probleme bei der Gewinnung von nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Viren, mit welchen das Fachgebiet konfrontiert war, wurden gemäß der vorliegenden Erfindung paradigmatische Zelllinien entwickelt, welche als Helferfunktion T7 RNA-Polymerase und N- und P-Protein des Masernvirus bereitstellten. Die Gewinnung der Masernviren kann nach der Transfektion mit Plasmiden, die antigenomische RNAs und Masernvirus-L-mRNA spezifizieren, direkt überwacht werden. Im Prinzip können analoge Helferzelllinien für jeden dieser Viren erzeugt werden; folglich ist dieser Ansatz zur Gewinnung für alle Mononegavirales, die in Vertebratenzellen replizieren, anwendbar.
  • Vorgesehene Proteine der Helferzelllinie, welche für die Verpackung in Capside, Transkription und Replikation dieser RNA gebraucht werden, sind eine RNA-Polymerase, vorzugsweise T7 RNA-Polymerase und gegebenenfalls T3 RNA- Polymerase und das N- und P-Protein, vorzugsweise von dem Virus, das gewonnen werden soll. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden diese Proteine von stabil transfizierten Plasmiden exprimiert, von nun an als genomische Expression definiert.
  • Nachdem das jetzt entwickelte System zur Gewinnung, im Gegensatz zu dem, das für die Gewinnung des Tollwutvirus (Schnell et al., 1994), VSV (Lawson et al., 1995) und vor kurzem auch für SeV (D. Kolakofsky, persönliche Mitteilung) verwendet wird, nicht auf irgendein Helfervirus angewiesen ist, gibt es keine Notwendigkeit, das gewonnene Virus von dem enormen Überschuss irgendeines Helfervirus abzusondern. Die Beseitigung des Vacciniavirus vom gewonnenen Virus wird, im Falle der starr strukturierten Virionen der Rhabdoviridae, durch einen einfachen Filtrationsschritt erreicht, würde aber im Falle der pleomorphen Paramyxoviridae, im Besonderen jener, die wie das Masernvirus nicht mit hohen Titern replizieren, ein komplexeres Reinigungsschema zur Folge haben. Für Viren, die in der Replikation und/oder Sprossung durch das Vacciniavirus behindert sind, könnte die Gewinnung unter Verwendung der Systeme des Fachgebiets darüber hinaus gänzlich fehlschlagen. Ein anderer möglicher Nachteil der Systeme des Stands der Technik, welche auf dem Vaccinia-Helfervirus basieren, ist die hohe Frequenz der DNA-Rekombinationen, die im Cytoplasma der mit Vacciniavirus infizierten Zellen stattfinden und welche Rekombination des Plasmids verursachen könnte, das die antigenomische Sequenz mit den Plasmiden trägt, welche das für die Helferfunktion benötigte N-, P- und L-Protein codieren; das kann zur Gewinnung von Viren führen, welche N-, P- und L-Sequenzen enthalten; die teilweise eher vom Helfer-Plasmid abgeleitet sind als vom Plasmid, das die anti-genomischen Sequenzen trägt. Das Helferzellsystem verhindert all diese Probleme und sollte im Prinzip für die Gewinnung von jedem Mononegavirales angewendet werden können, das in Vertebratenzellen repliziert.
  • Es muss für die Gewinnung jedes einzelnen Vertreters der Mononegavirales nicht nötig sein, eine Helfervirus-Zelllinie zu etablieren, welche das verwandte N- und P-Protein (zusätzlich zur T7-Polymerase) exprimiert. Mini-Replicon-Konstrukte, die nicht-codierende terminale Regionen (NCTs) des Hundestaupevirus (CDV) exprimieren, welches wie das Masernvirus ein Morbillivirus ist und sich vom Masernvirus in 35% der Nucleotide in den nicht-codierenden terminalen Regionen unterscheidet, replizieren in den Masernvirus-spezifischen Helferzellen bei einer Effizienz annähernd der des homologen Masernvirus Mini-Replicons. Demnach könnte das Hundestaupevirus möglicherweise mit den 293-3-46-Zellen gewonnen werden, welche gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelt wurden, und im Allgemeinen könnte jede Helferzelllinie im Stande sein, eine ganze Menge an nicht zu entfernt verwandten Mononegavirales zu gewinnen. Das wird wahrscheinlich von der Kompatibilität der durch die verwandten Viren erzeugten Proteine abhängen, was, wie gezeigt wurde, bei den SeV-spezifischen N- und P-Proteinen und PIV3-spezifischem L-Protein nicht der Fall war (Curran und Kolakofsky, 1991).
  • Für die Etablierung einer neuen Helferzelllinie für andere Viren, welche auch von der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, können die folgenden Überlegungen hilfreich sein. Die konstitutive Expression der T7 RNA-Polymerase und der N- und P-Proteine des Masernvirus haben, wie in den in der Anlage erwähnten Beispielen, die Langzeit-Stabilität der 293-3-46-Zelllinie nicht beeinflusst. Eine induzierbare Expression dieser Proteine, zum Beispiel durch die von der Gruppe von Bujard beschriebenen Ansätze (für eine Review siehe Gossen et al., 1993), wird wahrscheinlich nicht nötig sein, obwohl nicht ausgeschlossen werden kann, dass die N- und P-Proteine anderer Viren schädlicher für das Zellwachstum sind als die des Masernvirus. Die Titration der Plasmide, die zur Transfektion verwendet wurden, hat sich als unerlässlich erwiesen, es wurde gezeigt, dass eine Rate von jeweils etwa 1:1000 L-codierendem und Antigenom-produzierendem Plasmid optimal waren, in Übereinstimmung mit dem von Schubert et al., (1985) bemerkten schädlichen Effekt von hoher VSV L-Expression für die Replikation von VSV. Eine alternativer Ansatz, L unter Verwendung eines Plasmids transient bereitzustellen, welches einen Promotor/Enhancer und ein Intron enthält, das besser stromabwärts als stromabwärts von der L-codierenden Region liegt, um einigen Export der langen mRNA aus dem Zellkern zu ermöglichen, war auch in der Gewinnung erfolgreich, aber die Effizienz war nicht besser als mit dem Standardverfahren von cytoplasmatischer T7-abhängiger L-Expression und mehr als hundertmal mehr L-codierendes Plasmid war optimal für die Gewinnung. In Anbetracht dieser Erfahrungen war die Entscheidung, kein L-codierendes Plasmid für die Herstellung von Helferzellen einzusetzen und folglich die Expression von L in regulierbarem Verhältnis zu ermöglichen, wahrscheinlich vorteilhaft. Trotzdem sollte erwähnt werden, dass eine Zelllinie beschrieben worden ist (Willenbrink und Neubert, 1994), die von SeV abgeleitetes N, P und L stabil exprimiert und welche Langzeitreplikation von natürlichem SeV-Dls vermittelt. Es ist wichtig zu erwähnen, dass sich diese Zelllinie durch das Fehlen von T7-Polymerase grundlegend von den Helferzellen unterscheidet, welche in der vorliegenden Erfindung definiert sind. Als Folge davon ist mit dieser Zelllinie keine Gewinnung an Virus und nicht einmal eines Mini-Replicons von clonierter DNA durchführbar.
  • Die Helferzelle kann mit mindestens einem der vorstehend beschriebenen Plasmide transfiziert werden, wobei diese Plasmide abweichende genomische cDNA eines Vertreters der Mononegavirales enthalten, und sie ist außerdem mit einem Plasmid stabil transfiziert, welches DNA umfasst, die für das verwandte virale L-Protein codiert.
  • Folglich wird, statt auf eine Helferzelle zu selektieren, die auch an sich die virale Polymerase codiert (L-Protein), dieses L-Protein auf einem anderen Plasmid, vorzugsweise durch Co-Transfektion, in diese Helferzelle transfiziert. Ferner ist ein Fachmann unter Verwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung in der Lage, eine geeignete Helferzelllinie zu gestalten, die auch L-Protein exprimiert, in welchem Falle eine Co-Transfektion nicht nötig ist.
  • Die Gene der Helferzelle, die diese N-, P- und L-Proteine codieren, können vom Masern oder Mumpsvirus abgeleitet sein.
  • Die Helferzelle kann von der menschlichen embryonalen Nierenzelllinie 293 (ATCC CRL 1573) abgeleitet sein. Ein bevorzugtes Beispiel einer solchen Zelle ist der in den Beispielen beschriebene Clon 293-3-46.
  • Auch hierin beschrieben ist ein infektiöser Negativ-Strang-RNA-Virus-Stamm, isoliert von der Helferzelle, welcher zur Ordnung der Mononegavirales gehört.
  • Man muss sich wieder ins Gedächtnis rufen, dass vor fünf Jahren unter Verwendung des gleichen Grundprinzips in einer fehlerhaften Beschreibung, von der Gewinnung des Masernvirus durch unser Labor berichtet wurde (Ballart et al., 1990 und EP-A 0 440 219). Zu dieser Zeit basierten die Experimente auf Mikroinjektion von Initiationskomplexen, welche aus T7 RNA-Polymerase und Plasmiden bestanden, welche Masernvirusgenome oder Antigenome spezifizierten, in eine bestimmte Zelllinie, die fehlerhafte aber replizierende Masernvirusgenome enthielt. Die Gewinnung durch Mikroinjektionsexperimente, die leider nur von einem Mitarbeiter durchgeführt wurde, konnte jedoch nicht wiederholt werden und, wie in einem Kommentar zu diesen außerordentlich schlimmen und verheerenden Vorfällen zusammengefasst (Aldhous, 1992), enthielt keiner der angeblich gewonnenen Viren den genetischen Marker („Tag"). Es ist jetzt klar, dass die Gewinnung des Masernvirus mit diesem experimentellen Ansatz aus verschiedenen Gründen, besonders aufgrund von zusätzlichen Nucleotiden an beiden Enden der erzeugten RNAs und aufgrund von Clonierungsfehlern, welche die RNA mit der Sechserregen inkompatibel machen (Calain und Roux, 1993; die vorliegende Erfindung), nicht erwartet werden konnte.
  • Die Effizienz der Gewinnung ist im Vergleich mit der Gewinnung von Positiv-Strang-RNA-Viren niedrig (Perrotta und Been, 1990), da nur 1 bis 6 von 106 transfizierten Zellen, jede durchschnittlich etwa 2,5 × 105 Molekülen antigenomischer und 80 bis 800 Molekülen an L-codierendem Plasmid ausgesetzt, die Bildung von Syncytien einleiten. Im Vergleich mit dem für das Tollwutvirus und VSV beschriebenen Gewinnungs-Verfahren, wo etwa 2 × 107 Zellen transfiziert werden, um ein Gewinnungs-Ereignis zu erzielen (Lawson et al., 1995; Schnell et al., 1994), hält die Gewinnung des Masernvirus einem Vergleich trotzdem gut stand, besonders im Hinblick auf die Tatsache, dass die Genomgröße des Masernvirus ungefähr 4,5 kb größer ist und daher im Prinzip schwerer zu gewinnen. Die niedrige Effizienz sollte im Wesentlichen keine Schwierigkeit für die Gewinnung der Masernvirusvarianten darstellen, die nur bis zu Titer-Niveaus replizieren, welche sogar Größenordnungen unter dem der Edmonston-B-Stämme liegen, da der Engpass der Gewinnung am wahrscheinlichsten durch ein frühes Ereignis gebildet wird. Es ist wichtig zu erwähnen, dass auf Zellen, die zu verschiedenen Zeiten nach der Transfektion fixiert wurden, Immunfluoreszenz, welche die Expression des H oder M-Gens kennzeichnet, ausschließlich in Syncytien überwacht wurde und es keinen Hinweis darauf gab, dass die Gewinnung auf einzelne Zellen beschränkt war. Sobald die Gewinnung direkt durch Syncytienbildung sichtbar ist, sind schon tausende von Genomen von Virusabkömmlingen entstanden; beeinträchtigte und dadurch langsamer replizierende Virusvarianten bilden zunächst möglicherweise keine sichtbaren Syncytien, sollten sich aber nach Passagieren der transfizierten Zellkultur oder nach dem Überimpfen auf frische Vero-Zellen erkennen lassen.
  • Außerdem ist hierin ein Verfahren zur Herstellung eines infektiösen Negativ-Strang-RNA-Virus beschrieben, welches zur Ordnung der Mononegavirales gehört, umfassend die Schritte von
    • (a) Transfektion der Helferzellen der Erfindung mit einem der vorstehend beschriebenen Plasmide und umfassend die antigenomische DNA von einem Virus, welches zur Ordnung der Mononegavirales (erster Vektor) gehört und wahlweise einem Plasmid, welches DNA enthält, die das virale L-Protein codiert (zweiter Vektor); und
    • (b) Gewinnung der assemblierten infektiösen Negativ-Strang-RNA-Viren.
  • Die Transfektion mit dem zweiten Vektor ist nicht nötig, falls die Helferzellen das virale L-Protein genomisch exprimieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das Verhältnis des ersten Vektors und des zweiten Vektors etwa 1000:1.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass das vorstehende Verhältnis optimal für die Effizienz der Transfektion ist.
  • In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens der Erfindung wird diese Gewinnung entweder direkt durch die transfizierte Helfer-Zellkultur nach der Syncytienbildung bewirkt oder, nach dem Mischen der abgelösten Helferzellen mit irgendwelchen anderen Zellen, die kompetent sind, infiziert zu werden und die assemblierten RNA-Viren zu replizieren.
  • Außerdem ist hierin ein Impfstoff beschrieben, umfassend das RNA-Virus gemäß der Erfindung, welches gegebenfalls durch das vorstehend beschriebene Verfahren der Erfindung erhalten werden kann, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  • Die Vorteile des Impfstoffes werden nachstehend kurz besprochen werden.
  • In der Vergangenheit wurden eine Reihe an DNA-Viren und Positiv-Strang-RNA-Viren als Träger verwendet, um die Expression von heterologen Genen oder Gensegmenten in Wirtszellen zu steuern, hauptsächlich mit dem Ziel, einen Immunschutz gegen Pathogene auszulösen, von welchen das heterologe genetische Material abgeleitet war. Der Hauptvorteil der Verwendung solcher Lebendimpfstoffe ist ihre Fähigkeit, sich zu vervielfachen und typischer Weise eine Vielzahl an unterschiedlichen Zelltypen zu infizieren, wobei sie die Antigene von Interesse intrazellulär erzeugen, die auf diese Weise dem Immunsystem effizient präsentiert werden können und dadurch die Induktion sowohl der Hilfe als auch der Cytotoxizität der T-Zellen erleichtern. Im Gegensatz dazu sind abgetötete Impfstoffe oder Proteine, hergestellt durch rekombinante DNA-Technologie, viel weniger wirksam, selbst bei Verabreichung in verschiedenen partikulären Formen, welche in letzter Zeit entwickelt wurden, die wirksamer sind als herkömmlich verwendete Hilfsmittel. Außerdem induzieren solche Impfstoffe üblicherweise keine Schleimhaut-Immunität, die für den Schutz gegen Pathogene, welche über den Atem- oder Darmweg eindringen, sehr wichtig ist. Für den Immunisierungsansatz, bei welchem Injektion von nackter DNA, die Antigene codiert, verwendet wird, ist es auch typisch, dass die Induktion der Schleimhaut-Immunität scheitert.
  • Andererseits, auch wenn sie sich nicht vermehren, stellen die meisten replizierenden Impfstoffe eine mögliche Gefahr dar, wie zum Beispiel Avipox-Vektoren in Menschen (Baxby und Paoletti, 1992). Komplexe virale Vektoren (z.B. basierend auf dem Vacciniavirus und verwandten Pockenviren, Adenoviren oder Herpesviren) und bakterielle Vektoren (z.B. basierend auf den Abkömmlingen der Erreger, die Tuberkulose und Cholera erzeugen) lösen selbst viele laterale unnötige und/oder unerwünschte Immunantworten aus. Zusätzlich trägt die DNA-Integration in das Genom von infizierten oder transfizierten Zellen mindestens das Potential für eine maligne Transformation in sich. Beurteilungen verschiedener Arten von Impfstoffen durch mehrere Autoren, sind vor kurzem veröffentlicht worden (Impfstoffe und die öffentliche Gesundheit; Internat. J. of techn. Ass. in Health care 10, 1–196 1994; Science 265, 1371–1451, 1994), von welchen die besonderen Vorteile kleiner, auf RNA basierender Lebendimpfstoffe offensichtlich werden.
  • Mehrere veränderte Positiv-Strang RNA-Viren sind zur möglichen Verwendung als Vektoren für Immunisierungszwecke beschrieben worden; frühere Beispiele umfassen das Poliovirus (Burke et al., 1988) und Sindbis-Virus (Xiong et al., 1989) und aus mehreren neueren Berichten, welche größere Polypeptidfragmente einschließen, die von verschiedenen Vertretern der Picornaviridae exprimiert werden, soll hier nur eines erwähnt werden (Andino et al., 1994).
  • Es muss jedoch betont werden, dass die Verwendung von RNA-Viren als Vektoren für Impfungszwecke entscheidend von der Stabilität des fremden genetischen Materials während der Replikation des Virus abhängt. Das ist kein triviales Problem, da diese Viren auf eine Polymerase angewiesen sind, welcher die Aktivität des Korrekturlesens fehlt. Dieses Problem wurde vorteilhafterweise durch die vorliegende Erfindung gelöst: Im Vergleich zu den wie vorstehend erwähnten Impfstoffvektoren, die auf Positiv-Strang RNA-Viren basieren, zeigt der Impfstoff der Erfindung, wie durch auf dem Masernvirus basierenden bi- oder multivalenten-Impfstoffen veranschaulicht, mehrere wichtige Vorteile, welche im Prinzip für alle anderen Mitglieder der Paramyxoviridae, wie zum Beispiel das Mumpsvirus, gelten. Erstens ist die Größe der Insertionen nicht von vornherein durch die Voraussetzung, in eine ikosaedrische Proteinhülle passen zu müssen, beschränkt. Zweitens erübrigt die dichte Verpackung der Genome der Mononegavirales eine RNA-Sekundärstruktur, was im Falle von Positiv-Strang RNA-Viren über die gesamte Genomlänge sehr wichtig ist, um eine ordentliche Replikation ohne Anlagerung des Produktes an den Matrizenstrang zu ermöglichen; RNA-Segmente, die Fremdantigene codieren, sind nicht entwickelt, um solche Erfordernisse zu erfüllen. Drittens sind, aufgrund der modulären Aufbau des Genoms, verschiedene Insertionsstellen und Expressionsarten vorgesehen, entweder als zusätzliche Transkriptionseinheiten oder als Verlängerung der bestehenden Transkriptionseinheiten, welche die stromabwärts inserierten Leserahmen durch Stopp/Restart oder durch interne Ribosomeneintrittsstellen exprimieren und ermöglichen auf diese Weise eine große Auswahl an verschieden Expressionshöhen je nach der Position innerhalb des Masernvirus-Transkriptionsgradienten. Viertens kann von Mononegavirales aufgrund extrem niedriger Rekombinations-Frequenzen erwartet werden, dass sie nicht-essentielles genetisches Material stabiler bewahren als Positiv-Strang RNA-Viren. Schließlich sollte die Sechserregel, die für das Masernvirus, wie gemäß der vorliegenden Erfindung herausgefunden wurde, und für andere Paramyxovirinae gültig ist (Calain und Roux, 1993), aber wie durch verwandte Mini- und Midi-Replicons beurteilt, nicht für Rhabdoviridae (Conzelmann und Schnell, 1994) oder für Pneumovirinae (Collins et al., 1993), die genaue Beibehaltung von fremden codierenden Regionen, die in Paramyxovirinae inseriert sind, im Vergleich mit anderen Mononegavirales sogar erhöhen. Es kann mit solch einer zusätzlichen genetische Stabilität gerechnet werden, da nur von einer aus sechs zufällig entstehenden großen Deletionen und keiner kleinen Insertionen oder Deletionen von 1 bis 5 Nucleotiden in einer Region, die für die virale Replikation nicht essentiell ist, erwartet wird, dass sie zu lebensfähigen Abkömmlingen führt.
  • Ferner wird die Kenntnis der Nucleotidsequenz-Varianten, welche Attenuierung verleihen, es ermöglichen, die codierenden Sequenzen zu verändern, die in Übereinstimmung mit der Evolution der Viren über die Jahre hinweg nicht mit den attenuierenden Eigenschaften in Verbindung gebracht wurden, und folglich erlauben, die Impfstoffe auf den neuesten Stand zu bringen, ohne Gefahr zu laufen, die Eigenschaft der Attenuierung zu verlieren.
  • Außerdem ist hierin die Verwendung des vorstehend beschriebenen Plasmids in somatischer Gentherapie beschrieben.
  • Nachdem virale Hüllenproteine unter verschiedenen Vertretern der Mononegavirales ausgetauscht werden können, wie hier durch den Austausch der Masernvirus-Hüllproteine mit dem VSV-Glycoprotein gezeigt wurde, scheint es durchführbar, das Replicon basierend auf dem Replikationsapparat der Mononegavirales auf bestimmte Zelltypen hin auszurichten; auf diese Weise können bestimmte Anwendungen in der somatischen Gentherapie in Aussicht genommen werden. Vorteile im Vergleich mit bestehenden Vektoren für Gentherapie umfassen ihre kleine Größe, auf diese Weise werden Antigenreaktionen auf einige wenige Proteine beschränkt, und ihre vollkommene Unfähigkeit, in DNA zu integrieren und so Zellen zu transformieren.
  • Zusätzlich wird die Verwendung des Plasmids der Erfindung für den Angriff auf bestimmte Zelltypen beschrieben. Eine Kurzfassung solcher Angriffsmodelle und Anwendungen wurde vorstehend bereitgestellt.
  • Außerdem ist hierin die Verwendung des Plasmids der Erfindung zur funktionellen Beurteilung von Mutationen beschrieben, die üblicherweise in Masernvirus-Varianten gefunden werden, die für die tödliche subakute sklerosierende Panenzephalitis verantwortlich sind, oder zur Identifizierung von Mutationen, die für die Attenuierung von Stämmen der Paramyxoviridae, vorzugsweise Stämmen des Masernvirus, verantwortlich sind.
  • Schließlich wird eine diagnostische Zusammensetzung in Erwägung gezogen, umfassend mindestens ein hierin beschriebenes cDNA-Molekül und/oder ein Plasmid.
  • DIE FIGUREN ZEIGEN:
  • 1: Karte des Masernvirusgenoms
  • 2: Plasmidvektoren, die RNAs mit den korrekten Masernvirus-spezifischen Enden spezifizieren. Die Zahlen unter den Plasmidnamen bezeichnen die Länge der RNAs in Nucleotiden, welche nach dem Ribozym-„Self-Cleavage" erzeugt wurden. Der genomische- oder antigenomische Sinn der spezifizierten RNAs ist jeweils durch (–) und (+) gekennzeichnet. Es ist zu beachten, dass die in diesen Plasmiden vorhandene Masernvirus-Nucleotidsequenzen in 30 Positionen von der EMBL-Zugangsnummer K01711 abweichen, vor allem durch die Deletion eines A-Restes auf Position 30, ausgeglichen durch eine Insertion von einem A auf Position 3402. Siehe Radecke und Billeter (1995), für einen kommentierten Überblick über eine Masernvirus-Konsensussequenz.
  • 3: Western-Blot, der jeweils die Expression der N- und P-Proteine des Masernvirus in mit Masernvirus infizierten 293-Zellen, nicht infizierten 293-Zellen und in den Zelllinien-Clonen 293-3-46 und 293-3-64 zeigt. Die Pfeile kennzeichnen die Position der strukturellen N- und P-Proteine des Masernvirus, sowie das nichtstrukturelle V-Protein, welches sich durch Transkript-Aufbereitung aus dem P-Gen des Masernvirus ergibt.
  • 4: Überblick der experimentellen Komponenten und Verfahren für die Gewinnung. A: Mini-Replicon-Gewinnung, welche die Transfektion von in vitro-transkribierter RNA und Co-Infektion mit Masernvirus zur Folge hat und die Helferproteine N, P und L (und für spätere Stadien auch M, F und H sowie auch die nichtstrukturellen Proteine C und V) liefert. B: Gewinnung des Masernvirus, mit der Folge der Transfektion der Plasmid DNAs in Helferzellen und Vermittlung von sowohl künstlicher T7-Transkription und N- und P-Funktionen. Siehe 2 zur Erläuterung der meisten Symbole. Das L-codierende Plasmid pEMC-La enthält eine interne Ribosomen- Eintrittsstelle, welche vom Encephalomyocarditisvirus (getüpfelt, oval EMC IRES) abgeleitet ist, welches so mit der L-codierend Region fusioniert ist, dass sich das Initiations-AUG des Encephalomyocarditisvirus und des L-Proteins decken; ein stromabwärts gelegener poly-dA-Teil (etwa 40 dAs) wird als pdA gekennzeichnet. Diese beiden Einheiten gewährleisten die Transkriptstabilität sowie auch die effiziente Translation von den im Cytoplasma hergestellten Transkripten.
  • 5: Test der CAT-Aktivität, die in 293-3-46 Helferzellen durch die Transfektion der Plasmidkonstrukte p107MV(–):CAT und p107MV(+):CAT, die Mini-Replicons spezifizieren, und des Konstruktes p(+)NP:CAT, das ein Midi-Replicon spezifiziert, ausgelöst wird. Die Grundkomponente des Plasmids pT7P2lacZ ist ähnlich wie in Pelletier und Sonenberg beschrieben (1988). Der CAT-Leserahmen des ursprünglichen Plasmids ist durch den lacZ-Leserahmen ersetzt.
  • 6: Die Sichtbarmachung der in den 293-3-46 Helferzellen gebildeten Syncytien. A: Gewinnungsexperiment, betrachtet durch Phasenkontrast-Mikroskopie 4 Tage nach der Transfektion. B, C: Zellen, die auf Deckgläsern gezüchtet, 3 Tage nach der Transfektion fixiert und mittels Phasenkontrast- (B) oder indirekter Immunfluoreszenz-Mikroskopie unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers betrachtet wurden, der gegen das M-Protein des Masernvirus gerichtet ist (C). Ähnliche Ergebnisse wurden mit einem Antikörper gegen erhalten. Die Balkenlänge repräsentiert 100 μm.
  • 7: Sequenzbestimmung von Plaque-gereinigten Viren, durchgeführt mittels RT-PCR, gefolgt von Zyklus-Sequenzierung, wie in den Beispielen beschrieben. Die linken Spuren der maßgeblichen Bereiche, die von einem Sequenzgel reproduziert wurden, beziehen sich auf unseren Edmonston-B-Laborstamm, die rechten Spuren auf das gewonnene Virus. Gekennzeichnete Nucleotidpositionen entsprechen, wie in 2 definiert, jenen in der Masernvirus-Konsensussequenz.
  • 8: Das Replikationsverhalten der Plaque-gereinigten Viren, bewertet durch eine Überlagerungstechnik, wie in den Beispielen beschrieben. Die Derivate der Gewinnungsversuche, der Standard Masernvirus-Marker („Tag") EdB und die 504 Nucleotid-Deletionsmutante MVΔ5F EdB werden mit einem Clon von unserem Edmonston-B-Laborvirusstamm verglichen. Die Ergebnisse von zwei unabhängigen Versuchen, welche einen charakteristischen Clon jeder Virusspezies verwenden, werden gezeigt.
  • 9: Northern-Blots, die mRNAs des gewonnenen Masernvirus, welches von p(+)MV abgeleitet ist, und der Masernvirus-Deletionsmutante zeigen, die von p(+)MVΔ5F (2) abgeleitet ist. Die monocistronischen F-, M- und H-mRNA-Spezies (offene Dreiecke) und die bicistronischen MF- und FH-mRNAs (schwarze Dreiecke) werden durch M-, F- und H-spezifische Sonden deutlich gemacht. Die F-spezifischen mono- und bicistronischen RNAs, welche durch die Deletionsmutante induziert werden, sind eindeutig kleiner als die entsprechenden RNAs, die durch das gewonnene Standard-Masernvirus (ΔF, 1869 anstatt der 2372 berechneten Nucleotide, ohne Berücksichtigung des poly-A-Schwanzes; MΔF, 3338 anstatt der 3842 Nucleotide, und ΔFH, 3830 anstatt der 4334 Nucleotide) induziert werden.
  • 10(a): Plasmide für die Herstellung von Standard- und deletierten Masernviren und Hybrid-Masernviren, welche zusätzliche Gene oder ausgetauschte Hüllproteine enthalten.
  • Es ist zu beachten, dass zwei chimäre Clone des Masernvirus, die von p(+)MPCATV und von p(+)MHCATV gewonnen wurden, nach 10 Infektionszyklen noch immer CAT-Aktivität exprimierten, welche durch die zusätzliche Transkriptionseinheit in jedem der 10 Clone, entnommen vom zehnten getesteten Zyclus, codiert wurde.
  • 10(b): Plasmide für die Herstellung von Standard und Varianten der Edmonston-B-Masernviren.
    p(+)MV: Die RNA-Polymerase stellt eine antigenomische Masernvirus RNA mit zwei Sequenzmarkern in den Positionen 1702 (A) und 1805 (AG) bereit.
    p(+)MVC-: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass der offene Leserahmen des C-Proteins durch die Einführung von zwei Punktmutationen in Position 1830 (C) und 1845 (A), funktionsuntüchtig gemacht wurde.
    p(+)MVV-: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass der offene Leserahmen des V-Proteins durch die Mutation der konservierten „Editing-Stelle", funktionsuntüchtig gemacht wurde.
    p(+)MVΔM: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass der gesamte offene Leserahmen des M-Gens (Δ320 Aminosäuren), mit der Ausnahme von 15 Aminosäuren, deletiert worden ist.
    p(+)MVΔ5F: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass eine Deletion von 504 Nucleotiden (Nucleotide 4926–5429 fehlen) in das F-Gen eingebracht wurde.
    p(+)MVFΔcyt: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass die Sequenz, welche den cytoplasmatischen Teil des F-Proteins codiert, durch ein anderes Fragment ausgetauscht wurde, welches den cytoplasmatischen Teil des F-Proteins, abgeleitet von einem SSPE-Fall, codiert. Ein vorzeitiges Stopp-Codon resultiert in einer Deletionsmutante, welche eine Deletion in der cytoplasmatischen Domäne des F-Proteins aufweist.
    p(+)MVFxcSeV: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass die Sequenz, welche die cytoplasmatische Domäne des F-Proteins codiert, durch eine entsprechende Sequenz des Sendaivirus ersetzt wurde.
    p(+)MVHΔcyt: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass die Sequenz, welche die cytoplasmatische Domäne des H-Proteins codiert, durch ein Fragment ersetzt wurde, welches eine Deletion trägt.
  • 10(c): Plasmide für die Herstellung von Chimären und Vektoren des Edmonston-B-Masernvirus
    p(+)MGFPNV: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass ein zusätzliches Cistron stromaufwärts des offenen Leserahmens von N des Masernvirus inkorporiert wurde, welches die Masernvirus-abhängige Expression eines Reportergens, welches grün fluoreszierendes Protein (GFP) codiert, erlaubt; dieser offene Leserahmen ist in eine „multiple Clonierungsstelle" inseriert.
    p(+)MPCATV: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass ein zusätzliches Cistron stromabwärts des offenen Leserahmens von P inkorporiert wurde, welches die Expression des CAT-Gens ermöglicht.
    p(+)MPGFPV: Das Konstrukt entspricht p(+)MPCATV, mit der Ausnahme, dass die codierende Sequenz für CAT durch die codierende Sequenz für GFP ersetzt wurde, welche wiederum in eine „multiple Clonierungsstelle" inseriert wurde.
    p(+)MHCATV: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass ein zusätzliches Cistron stromabwärts des offenen Leserahmens von H inkorporiert wurde, welches die Expression des CAT-Gens ermöglicht.
    p(+)MG/FV: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass die F- und H-Gene des Masernvirus durch ein Gen ersetzt wurden, welches ein VSV-G-Protein codiert, dessen cytoplasmatischer Anteil durch den cytoplasmatischen Anteil des Masernvirus F-Proteins ersetzt wurde.
    p(+)MGV: Die antigenomische RNA entspricht jener, welche von p(+)MV erhalten werden kann, mit der Ausnahme, dass die F- und H-Gene des Masernvirus durch ein Gen ersetzt wurden, welches ein VSV-G-Protein codiert.
  • 11: Elektronenmikroskopie von BHK-Zellen, die mit einem replizierendem Erreger indiziert sind, der von p(+)MGV gewonnen wurde.
  • Große Bereiche an RNPs, typisch für mit Masernvirus infizierte Zellen, sind sichtbar und zeigen ein unvermindertes Replikationsvermögen der chimären viralen RNA.
  • 12: Elektronenmikroskopie von BHK-Zellen, die mit einem replizierendem Erreger infiziert sind, der von p(+)MGV gewonnen wurde.
  • Pleomorphe Partikel, welche Masernvirus-Virionen ähnlich sind, werden trotzt der Tatsache gebildet, dass in diesen infizierten Zellkulturen ausschließlich VSV-G-Protein und keine Spuren der Masernviren-Hüllproteine F und H durch Western-Blotting nachweisbar waren.
  • 13: Elektronenmikroskopie von BHK-Zellen, die mit VSV infiziert sind: VSV Virion-Partikel.
  • Die typischen projektilförmigen VSV-Virionen unterscheiden sich gänzlich von den pleomorphen Masernvirus-ähnlichen Partikeln, die in 12 gezeigt werden.
  • Die Beispiele erläutern die Erfindung:
  • BEISPIEL 1: ZELLEN UND VIREN
  • Die Zellen wurden als Zellrasen in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) gehalten, welches für Vero-Zellen (Nieren von der Afrikanischen grünen Meerkatze) mit 5% fötalem Kälberserum, für 293-Zellen (menschliche embryonale Nieren) mit 10% fötalem Kälberserum und für stabil transfizierte, von 293 abgeleiteten Zellclonen mit 10% fötalem Kälberserum und 1,2 mg/ml G418 ergänzt war.
  • Um Masernvirusbestände mit Titern züchten, die bis zu 107 PBE/ml erreichen, wurden rekombinante Viren in Vero-Zellen vermehrt und der Impfstoffstamm Edmonston-B wurde in Vero- oder 293-Zellen gezüchtet. Eine Runde der Plaquereinigung wurde durchgeführt, indem ein Syncytium in eine 35 mm Vero-Zellkultur transferiert wurde, die auf eine 175 cm2 Schale erweitert wurde. Virusbestände wurden von 175 cm2-Kulturen hergestellt, nachdem die Syncytienbildung deutlich ausgeprägt war. Die Zellen wurden in 3 ml OptiMEM I (GIBCO BRL) zusammengekratzt, gefolgt von einer Runde an Einfrieren und Auftauen. Die Virus-Titrierungen wurden auf 35 mm Vero-Zellkulturen durchgeführt. Nach 2–3 Stunden der Adsorption der Viren wurde das Inoculum entfernt und die Zellen mit 2 ml DMEM überlagert, das 5% fötales Kälberserum und 1% SeaPlaque-Agarose enthielt. Nach 4–5 Tagen wurden die Kulturen mit 1 ml 10% Trichloressigsäure (TCA) für eine Stunde fixiert und dann für 30 Minuten mit Hilfe von UV vernetzt. Nach Entfernung des Agarose-Überzugs wurden die Zellrasen mit Kristallviolett, aufgelöst in 4% Ethanol, gefärbt und die Plaques wurden gezählt.
  • BEISPIEL 2: HERSTELLUNG DER ZELLLINIE 293-3-46
  • Vor der Transfektion wurden alle Plasmide durch Spaltung mit SfiI linearisiert und durch Ethanolpräzipitation sterilisiert. Die Zellen wurden wie nachstehend beschrieben für die Transfektion innerhalb von 13 Stunden in eine 35 mm Vertiefung überimpft. Das Transfektionsgemisch enthielt 5 μg pSC6-N, 4 μg pSC6-P und 1 μg pSC6-T7-NEO. Dann wurden die Zellen gewaschen und einmal mit 2 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) gewaschen und DMEM, welches 10% fötales Kälberserum enthielt, wurde hinzugefügt. Nach 2 Tagen in Kultur, wurden die Zellen der 35 mm Vertiefung in zwei 75 cm2 Schalen aufgeteilt und die Selektion mit 1,2 mg/ml G418 wurde begonnen, das Medium wurde an jedem zweiten Tag gewechselt. Nach ~2 Wochen wurden die ersten Clone einer Gesamtsumme von ~100 Clonen in 5 mm-Vertiefungen transferiert. Sobald sich ein Clon auf eine 21 mm oder 35 mm Vertiefung ausgeweitet hatte, wurden die Zellen zum Screening überimpft. Die Expression der N- und P-Proteine des Masernvirus wurde durch Western-Blotting (siehe auch nachstehend) unter Verwendung von ~1/3 bis 1/10 des gesamten Lysats einer konfluenten 21 mm-Vertiefung analysiert. Um die Funktionalität der T7 RNA-Polymerase zu überwachen, wurde eine 35 mm-Zellkultur mit 4 μg pEMC-Luc transfiziert (Deng et al., 1991) und die Luciferase-Aktivität wurde in 1/125 des gesamten, geklärten Lysats (Promega Protokoll; Ernte 1 Tag nach der Transfektion) in einem Luminometer gemessen. Clone, welche die N- und P-Proteine des Masernvirus vergleichbar mit den gleichen Zahlen an 293-Zellen, die mit Masernvirus infiziert waren, exprimierten und eine höchst mögliche T7 RNA-Polymeraseaktivität zeigten; wurden ausgewählt, um ihre Leistung bei der Ermöglichung der CAT-Expression in Masernvirus-DI-RNAs zu überprüfen. Hierbei wurden 5 μg der Plasmide p107MV(+):CAT, p107MV(–):CAT oder p(+)NP:CAT mit oder ohne 100 ng von pEMC-La transfiziert. Nach 1 Tag wurden die Zellen lysiert und 1/4 des geklärten Lysats wurde auf CAT-Aktivität getestet.
  • BEISPIEL 3: PLASMIDKONSTRUKTIONEN
  • Alle Clonierungsvorgänge wurden im Grunde genommen wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben durchgeführt. PCR-Amplifikationen wurden unter Verwendung der „Proofreading"-Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene) und Primern mit einer 3'-terminalen Phosphorthioatbindung statt einer Phosphodiesterbindung (Skerra, 1992) durchgeführt. DNA-Sequenzen der synthetischen Oligonucleotide werden im unteren Fall für Nicht-Masernviren-Nucleotide gegeben und im oberen Fall für die Masernvirus-Nucleotide; Sequenzen relevanter Restriktionsendonucleasen-Erkennungsstellen sind unterstrichen. Die Konstruktion des Plasmids p107MV(–):CAT kann in Sidhu et al., 1995 gefunden werden. Das Plasmid p107MV(+):CAT ist das Analog des Plasmids p107MV(–):CAT. Die zusätzliche intracistronische Region von p(+)NP:CAT, welche dem N-P-intergenischen Übergang ähnlich ist, wurde durch Insertion von
    (5'-ctaGCCTACCCTCCATCATTGTTATAAAAAACTTAGGAACCAGGTC CACACAGCCGCCAGCCCATCAACgcgtatcgcgata-3', MV(+) 1717–1782)
    und des intern komplementären Oligonucleotids in die SpeI-Stelle des P-Gens konstruiert. Die PCR-amplifizierte CAT-codierende Region wurde, wie in 2 dargestellt, inseriert.
  • Die Beschreibung der Zusammensetzung der ersten Gesamtlängen-DNA des Masernvirus, der Ursprung der Masernvirus-Nucleotide 2044–14937 in späteren Versionen der Gesamtlängen-Clone wie zum Beispiel peuT7MV(–) (siehe nachstehend) wird in Ballart et al., 1990 angeführt. Die Hauptmerkmale des Plasmids p(+)MV (2) sind wie folgt: Der T7-Promotor ermöglicht die Synthese der antigenomischen RNA des Masernvirus, beginnend genau mit dem ersten Nucleotid. Das genomische Hepatitis-Delta-Virus-Ribozym (δ) setzt nach Selbst-Spaltung das korrekte 3'-terminale Nucleotid des Masernvirus frei. Unmittelbar stromabwärts vom δ-Ribozym stoppt der T7 RNA-Polymerase Terminator T⌀ die meisten der transkribierenden Polymerasen. Das gewährleistet, dass die angrenzenden Sequenzen, welche von der Vektorgrundstruktur abgeleitet sind, nicht mit der Spaltungsaktivität interferieren. Die Clonierung von p(+)MV begann mit der Anlagerung von zwei intern komplementären Oligonucleotiden #191 (5'-ggggaaccatcgatggataagaatgcggccgcaggtac-3) und #192 (5'-ctgcggccgcattcttatccatcgatggttccccgc-3),
    die einen kurzen Polylinker ergeben, der die Reststriktionsschnittstellen für SacII, ClaI, NotI und KpnI trägt. Dieser neue Polylinker ersetzt das SacII-KpnI-Fragment in pBloT7, abgeleitet von Bluescript KS(+) (Stratagene); welcher den T7-Promotor verbunden mit einer NsiI-Stelle (Kaelin, 1989) enthält und auf diese Weise das Plasmid pBloT7NSCNK bildet. Um in den 5'-terminalen 2041 Bp des Masernvirusgenoms zu clonieren, wurde eine NsiI-Spaltung von einer Behandlung mit Klenow-Polymerase in der Anwesenheit aller vier dNTPs gefolgt. Das erzeugte eine mit glatten Enden versehene Clonierungsstelle, direktglatt anschließend an den nicht-transkribierten Bereich der T7-Promotorsequenz. Ein Masernvirusfragment, umfassend die Nucleotide 1–2078, wurde aus dem 3351 Bp-PvuI-Fragment von peuMV(–) durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer #182 (5'-ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGATAG-3' MV(+) 1–25), und #183 (5'-CAGCGTCGTCATCGCTCTCTCC-3', MV(–) 2077–2056) hergestellt.
  • Es sollte beachtet werden, dass der zusätzliche A-Rest auf Position MV(+) 30 (Sidhu et al., 1995), abgeleitet von der Masernvirussequenz von peuMV(–), später durch Mutations-PCR entfernt wurde. Nach der Behandlung mit SacII wurde das Masernvirusfragment in den Vektor ligiert, um pT7MV(+)5' zu erzeugen. Als Nächstes wurde der 3'-Terminus des Antigenoms mit der Sequenz von δ verbunden, stromabwärts gefolgt von T⌀. Das Masernvirus 3'-Fragment (Nucleotide 14907–15894) wurde von dem 14046 Bp-PvuI-Fragment von peuMV(–) durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer
    #186 (5'-GAGAAGCTAGAGGAATTGGCAGCC-3'; MV(+) 14907–14930) und #187 (5'-ttctgaagactcACCAGACAAAAGCTGGG-3', MV(–) 15894–15879) hergestellt.
  • Eine weitere PCR-Amplifikation auf Plasmid peu3aδT⌀, mit den Primern
    #184 (5'-ataagaatgcggccgcatccggatatagttcctcc-3') und #FR4 (5'-ttctgaagactcTGGTggccggcatggtcccag-3', MV(+) 15891–15894)
    ergab das genomische Hepatitis-Delta-Virus-Ribozym verknüpft mit der T⌀. Beide Primer, #FR4 und #187, enthalten nahe ihrer 5'-Enden die Erkennungssequenz für BbsI, welches an beiden Fragmenten überhängende Enden erzeugt, umfassend die vier 3'-terminalen Masernvirus-Nucleotide (MV(+) TGGT). Nach der Spaltung des Masernvirus 3'-Fragments mit ClaI und BbsI, des δ/T⌀-Fragments mit BbsI und NotI und des pT7MV(+)5' mit ClaI und NotI, ergab eine Dreiwegligation das Plasmid pT7MV(+)5'3'δT⌀. Der letzte Schritt zur Herstellung von p(+)MV war, die verbleibenden antigenomischen Nucleotide 2044–14937 durch eine Dreiwegligation einzufügen. Das SacI-PacI-Fragment (MV(+) Nucleotide 2044–7242) und das PacI-ClaI-Fragment (MV Nucleotide 7243–14937) wurden von Plasmid peuT7MV(–) freigesetzt. Diese beiden Fragmente wurden in pT7MV(+)5'3'δT⌀ ligiert, von welchem der verbleibende Polylinker (SacII-ClaI) entfernt worden war. Das Plasmid p(–)MV (2) wurde in ähnlicher Weise konstruiert. Die Selbstspaltungs-Aktivität von δ wurde durch Nachweis der erwarteten kleinen 3'-Fragmente von in vitro hergestellten RNAs auf einem 5% Polyacrylamid/7M Harnstoff-Gel bewiesen. Um p(+)MVΔ5F herzustellen, welches eine Deletion von 504 Nucleotiden (MV(+) 4926–5429) in der 5' nicht-codierenden Region des F-Gens trägt, wurde zuerst eine PCR an Plasmid pAeF1 (Huber, 1993) unter Verwendung der Primer #88 (5'-CcGAATCAAGACTCATCCAATGTCCATCATGG-3', MV(+) 5430–5461) und #89 (5'-AGAGAGATTGCCCCAATGGATTTGACCG-3', MV(–) 5550–5523 durchgeführt.
  • Das PCR-Fragment, welches mit HpaI verdaut wurde, ersetzte das NarI-HpaI-Fragment in pAeF1. Das NarI-PacI-Fragment dieses Vektors ersetzte dann das entsprechende Fragment in p(+)MV.
  • Die Vektorgrundstruktur von pEMC-La basiert auf pTM1 (Moss et al., 1990) in welchem eine NcoI-Stelle mit dem ATG-Trinucleotid überlappt. Unter Verwendung von diesem ATG als Start-Codon, wird ein offener Leserahmen, der in diese NcoI-Stelle inseriert ist, üblicherweise durch die interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) des Encephalomyocarditisvirus (EMC) gesteuert. Die L-codierende Sequenz des Masernvirus, welche mit einem künstlichen poly(dA)-Teil verbunden ist, wurde vom Vektor pAeL (Huber, 1993) in zwei Schritten übernommen: erstens wurde ein 405 Bp-Fragment, welches die Masernvirus-Nucleotide 9234 – 9630 enthält; durch PCR unter Verwendung der Primer #194 (5'-gtggatccATGGACTCGCTATCTGTCAACC-3', MV(+) 9234–9255) und #195 (5'-AGTTAGTGTCCCTTAAGCATTGGAAAACC-3', MV(–) 9630–9602 hergestellt.
  • Zweitens wurde ein 6265 Bp-Fragment, umfassend die Nucleotide 9572–15835 der L-Gensequenz des Masernvirus, welches mit einem poly(dA)-Teil verbunden war, mit EcoRI herausgeschnitten. Nach Entfernung des NcoI-EcoRI-Teils des Polylinkers in pTM1 und Spaltung des PCR-Fragments ebenfalls mit NcoI und EcoRI, ergab eine Dreiwegligation, umfassend das 6265 Bp EcoRI-Fragment, pEMC-La.
  • Um den T7 Promotor zu entfernen, der in den Vektoren pSC-N und pSC-P (Huber et al., 1991) 5' vom CMV Promotor/Enhancer liegt, wurden pSC6-N und pSC6-P durch Austausch eines PvuI-EcoRI-Fragments mit dem entsprechenden Fragment von pSC65 (Promega) konstruiert. pSC6-T7 wurde durch Austausch des N-Gen-Inserts von pSC6-N mit dem Fragment, welches das T7 RNA-Polymerasegen von pAR 1173 (Davanloo et al., 1984) enthält, hergestellt. pSC6-T7-NEO wurde durch Ligation der Phosphoglycerin-Kinase-Promotor-Neomycin-Resistenzkassette (Soriano et al., 1991) in die einmalige AvrII-Stelle von pSC6-T7 unter Verwendung der entsprechenden Linker-Oligdesoxyribonucleotide konstruiert. Alle Clonierungsstellen wurden durch Sequenzierung überprüft.
  • BEISPIEL 4: TRANSFEKTION DER PLASMIDE UND ERNTE DER PRODUKTE DER REPORTERGENE
  • Die Zellen wurden in eine 35 mm-Vertiefung überimpft, um ~50–70% Konfluenz zur Zeit der Transfektion zu erreichen. 3–8 Stunden vor der Transfektion wurde das Medium durch 3 ml DMEM ersetzt, welches 10% fötales Kälberserum enthielt. G418 wurde, aufgrund seiner schädlichen Wirkung während der Transfektion, von nun an weggelassen. Alle Plasmide wurden gemäß des QUIAGEN Plasmid-Herstellungskits erzeugt. Das Protokoll für die Ca2+ Phosphat-Copräcipitation der DNA basierte auf Rozenblatt et al., (1979). Die Plasmide (2–10 μg pro 35 mm-Vertiefung) wurden mit 300 μl 1 × Transfektionspuffer (137 mM NaCl, 4,96 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4, 5,5 mM Dextrose, 21 mM HEPES pH 7,03) verdünnt. 1 M CaCl2-Lösung wurde bis zu einer Endkonzentration von 125 mM Ca2+ hinzugefügt und das Gemisch wurde bei 20°C für 30–120 Minuten inkubiert. Die Copräzipitate wurden tropfenweise zu der Kultur hinzugefügt und die Transfektion wurde bei 37°C und 5% CO2 für ~15 Std. durchgeführt. Dann wurde das Transfektionsmedium durch 3 ml DMEM, welches 10% fötales Kälberserum enthielt, ersetzt. Die Produkte der Reportergene wurden 24–37 Std. nach der Transfektion geerntet. Die Zellen wurden gewaschen und mit Reporter-Lysepuffer (Promega) lysiert und CAT- und Luciferase-Assays in Befolgung des Herstellerprotokolls durchgeführt.
  • BEISPIEL 5: VERSUCHSAUFBAU ZUR GEWINNUNG DES MASERNVIRUS
  • 293-3-46 Zellen, wie vorstehend auf die Transfektion vorbereitet, wurden mit 5 μg des Plasmids, welches die antigenomische DNA des Masernvirus beherbergt, in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1–100 ng des Plasmids, welches die L-mRNA des Masernvirus bestimmt, transfiziert. Syncytien traten zuerst etwa 2–3 Tage nach der Transfektion auf, während die Zellen noch subkonfluent waren. Um die Syncytienbildung zu erleichtern, wurden dann fast konfluente Zellrasen von jeder 35 mm-Vertiefung in eine 75 cm2-Schale transferiert. Sobald diese Kulturen Konfluenz erreicht hatten, wurden die Zellen in das Medium zusammengekratzt und einmal einem Gefrier- und Auftauvorgang unterzogen. Geklärte Überstände wurden verwendet, um Zellrasen von Vero-Zellen zu infizieren, entweder um Virusbestand zu züchten oder um Gesamt-RNA zur Analyse zu ernten.
  • BEISPIEL 6: RT-PCT, ZYKLUS-SEQUENZIERUNG, NORTHERN-BLOT, WESTERN-BLOT, IMMUNFLUORESZENZ
  • Für RT-PCR gefolgt von Zyklus-Sequenzierung wurden Vero-Zellen mit geklärten Virussuspensionen, welche entweder von den Gewinnungskulturen oder von späteren Passagen geerntet wurden, infiziert und Gesamt-RNA gemäß Chomczynski und Sacchi (1987) isoliert. 2 μg der Gesamt-RNAs wurden zuerst hybridisiert und mit 10 pmol oder 1 nmol von zufälligen Hexamer-Primern durch Erhitzen auf 80°C für 1 Minute und anschließender schneller Abkühlung auf Eis, hybridisiert. Reverse Transkriptionen wurden mit 200 Einheiten von MMLV-RT (GIBCO BRL) in Anwesenheit von 1 mM dNTPs in einem Puffer durchgeführt, der 20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin und 1 Einheit RNAsin (Promega), enthielt. Die Gemische wurden für 10 Minuten bei 20°C aufbewahrt, bei 42°C für 1 Std. inkubiert und durch Erhitzen auf 95°C für 10 Minuten beendet. 1/10 der Reaktionsvolumen wurde als Matrizen für die PCR-Amplifikation mit den Primern #59 (5'-ACTCGGTATCACTGCCGAGGATGCAAGGC-3', MV(+) 1256–1284) und #183 (5'-CAGCGTCGTCATCGCTCTCTCC-3' MV(–) 2077–2056 verwendet.
  • Nach 40 Zyklen wurden die 822 Bp-Fragmente unter Verwendung des QIAquickgel-Extraktionskits (QIAGEN) isoliert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden gemäß dem linearem Amplifikationsprotokoll (Adams und Blakesley, 1991) durchgeführt. Der Primer #76 (5'-ctaGCCTACCCTCCATCATTGTTATAAAAAACTTAG-3', MV(+) 1717–1749)
    wurde für die Markierung in der 5' nicht-codierenden Region des P-Gens verwendet, und Primer #6 (5'-ccggTTATAACAATGATGGAGGG-3', MV(–) 1740–1722)
    für die Markierung in der 3' nicht-codierenden Region des N-Gens.
  • Die zelluläre Gesamt-RNA für die Northern-Blotanalyse wurde aus Vero-Zellen unter Verwendung des TRI REAGENT® (Molecular Research Center, Inc.) isoliert und poly(A)-RNA wurde unter Verwendung von mit oligo(dT)25-beschichteten Super-Paramagnetischen-Polystyrolperlen (Dynal) und einem magnetischen Partikel-Konzentrator gereinigt. Die RNA wurde auf einem 1% Agarosegel in einem Laufpuffer elektrophoretisiert, der 6% Formaldehyd enthielt, und durch Kapillarelution in 20 × SSC auf eine Hybond-N+-Membran (Amersham) transferiert. Die Filter wurden bei 42°C für 4 Std. vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 42°C in 50% (Vol./Vol.) Formamid, 1 M NaCl, 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat, 1% SDS, Hefe-tRNA (0,1 mg/ml), welches 2 × 106 cpm/ml einer [α-32P] mit dATP markierten DNA-Sonde einhielt, die mit Prime-It II (Stratagene) hergestellt wurde. Die folgenden DNA-Fragmente wurden zum zufälligen Primen verwendet: das 1,4 kb SalI-BamHI-Fragment von pSC-M (Huber et al., 1991), das 1,7 kb HpaI-PacI-Fragment von pCG-F und das 1,6 kb SmaI-XbaI-Fragment von pSC-H (Huber et al., 1991). pCG, ein eukaryontischer Expressionsvektor, welcher einen Replikationsursprung von SV40 enthält und einen CMV-Promotor/Enhancer, wurde durch Deletion des L-Gens sowie der stromabwärts gelegenen β-Globin-Spleißstelle von pSC-L (Huber et al., 1991; Severne et al., 1988) und anschließender Insertion der β-Globin-Spleißstelle (von pSG5 Stratagene) stromaufwärts von einem neuen Polylinker konstruiert. Das auf pCG basierende Plasmid pCG-F enthält eine Insertion, bestehend aus dem gesamten F-Gen. Die Filter wurden in 2 × SSC bei 20°C für 10 Minuten und zweimal in 2 × SSC, 1% SDS bei 65°C für 30 Minuten gewaschen. Die Banden wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • Um die Expression der N- und P-Proteine des Masernvirus durch Western-Blotting zu analysieren, wurden die Zellen mit PBS gewaschen und cytoplasmatische Extrakte unter Verwendung von 300 μl Lysepuffer (50 nM Tris-HCl pH 8,0, 62,5 mM EDTA, 1% NP-40, 0,4% Desoxycholat, 100 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid und 1 μg/ml Aprotinin) hergestellt. Etwa 1/60 des gesamten Lysats wurde auf SDS-8%PAGE laufen gelassen und auf Immobilon-P-Membranen übertragen. Als erste Antikörper wurden entweder der polyclonale Kaninchen-anti-N-Antikörper #179 (freundlicherweise von C. Oervell zur Verfügung gestellt und hergestellt gemäß den Standardverfahren), in einer 6000-fachen Verdünnung in TBST (10 mM Tris-HCl pH 7,2–8, 150 nM NaCl, 0.05% Tween 20) oder der polyclonale Kaninchen-anti-P-Antikörper #178 (Oervell und Norrby, 1980) in einer 3000-fachen Verdünnung in TBST verwendet. Der zweite Antikörper war ein Schweine-anti-Kaninchen-Antikörper, gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase, welcher eine Sichtbarmachung der Banden durch den verstärkten Chemiluminescenz-Kit (ECLTM Amersham Life Science, RPN 2106) ermöglichte.
  • Für Immunfluoreszenzmikroskopie wurden 293-3-46-Zellen für ein Gewinnungsexperiment auf 24 mm × 24 mm-Deckgläsern in 35 mm Vertiefungen überimpft, über Nacht gezüchtet und wie vorstehend beschrieben transfiziert. 3 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit Aceton:Methanol (1:1) durchlässig gemacht und indirekte Immunfluoreszenz im Wesentlichen wie beschrieben (Hancock et al., 1990; Oervell und Norrby, 1980) durchgeführt außer, dass PBS durch 1 mM MgCl2 und 0,8 mM CaCl2 ersetzt wurde, und dass p-Phenylendiamin aus dem Fixierungsmittel für das Deckglas weggelassen wurde. Die viralen M- und H-Proteine wurden unter Verwendung der monoclonalen Maus-anti-M-16BB2- und anti-H-129-Antikörper (Shesheradaran et al., 1983) und der Kaninchen-anti-Maus-IgG [F(ab')2]-Antikörper, gekoppelt an Rhodamin (Pierce, 31666), nachgewiesen.
  • BEISPIEL 7: GENOMISCHE UND ANTIGENOMISCHE PLASMIDE, DIE MINI-, MIDI- UND GESAMTLÄNGEN-REPLICONS SPEZIFIZIEREN
  • 2 zeigt die Plasmidkonstrukte, die in dieser Studie verwendet wurden. p107MV(–):CAT und p107MV(+):CAT spezifizieren jeweils RNAs mit genomischen und antigenomischer Richtung, in welchen alle Masernvirus-codierenden Sequenzen genau durch die CAT-codierende Region ersetzt sind. In mit Masernvirus infizierten Zellen oder in Helferzellen (siehe nachstehend) führen sie zu Mini-Replicons und einer CAT-mRNA mit „Cap" und Poly(A), umfassend die 5'N- und 3'L-nicht-codierende Region. p(+)NP:CAT, das zusätzlich auch die N- und P-codierenden Regionen des Masernvirus in ihrem normalen Masernvirussequenz-Kontext enthält, führt zu Midi-Replicons.
  • Gesamtlänge oder teilweise deletierte antigenomische oder genomische RNAs sind durch p(+)MVΔ5F, p(+)MV und p(–)MV spezifiziert: Für alle diese Plasmide ergibt die Transkription mit T7 RNA-Polymerase RNAs, welche jeweils die authentischen Nucleotide der viralen genomischen und antigenomischen Termini tragen (Sidhu et al., 1995). Die korrekte Initiation wurde durch direkte Fusion des T7 Promotors (ohne seinen transkribierten Teil) an die genomische und antigenomische Sequenz erreicht. Wie durch in vitro-Transkriptionsstudien unter Verwendung von Vorläufer-Plasmidkonstrukten gezeigt wurde, ist die RNA-Ausbeute um mehr als eine Größenordnung reduziert, wenn alle Transkripte mit den Masernvirus-spezifischen Nucleotiden ACC beginnen, statt mit den T7-spezifischen GGG. Um die Bildung der korrekten 3'-Enden zu vermitteln, wurde die genomische Ribozym-Sequenz des Hepatitis-Delta-Virus (Perrotta und Been, 1990) gleich neben die 3'-terminalen Nucleotide des Masernvirus cloniert; die Einführung von T7-Terminatoren verstärkte die Effizienz der Selbstspaltung.
  • BEISPIEL 8: HELFERZELLEN, DIE DIE N- UND P-PROTEINE DES MASERNVIRUS SOWIE DIE T7 RNA-POLYMERASE STABIL EXPRIMIEREN
  • Die menschliche embryonale Nieren-Zelllinie 293 wurde ausgewählt, weil sie für das Masernvirus höchst durchlässig ist. Außerdem können diese Zellen durch das Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren effizient transfiziert werden; 30 bis 60% der Zellen färbten sich 24 Stunden nach der Transfektion mit einem Plasmid, welches β-Glactosidase codiert, blau.
  • Nach der Co-Transfektion der 293-Zellen mit pSC6-N, pSC6-P und pSC6-T7-NEO, wie in den Beispielen beschrieben, wurden etwa 100 Kolonien unter Selektion auf Neomycin erweitert. Die Expression von N und P wurde mittels Western-Blotting gescreent und die Aktivität der T7 RNA-Polymerase wurde durch Transfektion mit einem Reporterplasmid, welches die codierende Region der Glühwürmchen-Luciferase unter der Kontrolle des T7-Promotors enthielt, ausgewertet. Viele Clone exprimierten hohe Mengen an P, aber nur wenige co-exprimierten ausreichend N. 3 zeigt die Expression von N und P von zwei ausgewählten Zelllinien auf Höhen, welche mit denen mit Masernvirus infizierten 293-Zellen vergleichbar sind; die in Clon 293-3-46 nachgewiesene T7 RNA-Polymeraseaktivität war unter den höchsten aller Clone, wohingegen sie in Clon 293-3-64, von welchem sich herausstellte, dass er das Masernvirus nicht gewonnen hat, etwa 100 Mal niedriger war. Eine dritte Zelllinie 293-3-43, welche die drei Proteine mit vergleichbaren Mengen wie 293-3-46 exprimierte, war auch bei der Gewinnung wirksam.
  • Die Expression der eingeführten Gene hat die Empfänglichkeit für die Masernvirusinfektion nicht vermindert. Die Helfer-Zelllinie 293-3-46, welche hauptsächlich zur Gewinnung des Masernvirus verwendet wurde, obwohl sie, im Vergleich mit der Elternlinie 293, 2–3 Mal langsamer wuchs, hat sich nach mehr als 80 Passagen bei Verdünnungen von 1:4 und 1:8, als sehr stabil und völlig funktionell erwiesen.
  • BEISPIEL 9: VON DER GEWINNUNG VON MASERNVIRUS-MINI-REPLICONS UNTER VERWENDUNG VON HELFER-MASERNVIREN ZUR GEWINNUNG VON MASERNVIREN UNTER VERWENDUNG DER HELFER-ZELLEN 293-3-46
  • Das Masernvirus-Gewinnungsystem wurde schrittweise entwickelt, um die funktionelle Überprüfung aller Komponenten zu ermöglichen. Auf der einen Seite wurde die Gewinnung von Masernvirus-abhängigen Mini- und später nachfolgenden längeren Midi-Replicons, durch CAT-Reporterassays sichergestellt. In ähnlicher Weise wurde andererseits die Funktionalität der 293-3-46-Zellen mit der der vorstehend beschriebenen (Sidhu et al., 1995), auf Masernviren basierenden Hilfe, verglichen.
  • Die Überprüfung der Mini-Replicon-Gewinnung wird in 4A schematisch gezeigt. Kleine Transkripte von p107MV(–):CAT, p107MV(+):CAT (Sidhu et al., 1995) und später längere Transkripte, z.B. hergestellt von p(+)NP:CAT (2), verhielten sich jeweils wie Mini- und Midi-Replicons. Sie wurden in ein Capsid verpackt, transkribiert, um CAT zu erzeugen, repliziert und in Virionenpartikel verpackt, um neue Zellen zu infizieren. Während der ersten 2 bis 4 Infektionszyklen vermehrten sie sich massiv, wohingegen die Replikation von sowohl Masernvirus aus auch der Mini-Replicons, wie in natürlich vorkommenden DI-RNAs (Re, 1991) beobachtet, in spätern Zyklen eingeschränkt war. Die Analysen der amplifizierten RNAs zeigten dass die in Capside verpackten Replicons und die CAT-Transkripte die jeweiligen verschiedenen Masernvirus-spezifischen terminalen Regionen enthielten (Sidhu et al., 1995). Als Wichtigstes stellte sich heraus, dass für ein einwandfreies Funktionieren die Gesamtzahl der Nucleotide des Replicons ein Vielfaches von Sechs sein musste, eine Voraussetzung – bezeichnet als Sechserregel – die früher für natürliche und leicht veränderte SeV DI RNAs vom „Copyback"-Typ, als essentiell erkannt wurde (Cailain und Roux, 1993). Die Einhaltung dieser Regel war ausschlaggebend für die Konstruktion von Plasmiden, welche eine Vielzahl von Mini- und Midi-Replicons wie jene, die in 2 gezeigt werden, spezifizieren. Das war auch bei Clonen mit gesamter Länge der Fall.
  • Die Helferfunktionen von stabil transfizierten Zellclonen wurde mit der in 4B dargestellten Einrichtung überprüft, allerdings entweder unter Verwendung von Plasmid p107MV(–):CAT, p107MV(+):CAT oder p(+)NP:CAT (2) anstatt von p(+)MV. Wie in 5 gezeigt, entstand CAT-Aktivität in den transfizierten Zellen, wenn auch in erheblich geringeren Mengen als in 293-Zellen, welche mit Masernvirus infiziert und direkt mit einer Mini- oder Midi-Replicon-RNA co-transfiziert waren. Die Co-Transfektion des Plasmids pEMC-La, welches das L-Protein des Masernvirus codiert, war eine unbedingte Voraussetzung.
  • Eine schwache CAT-Hintergrungsaktivität wurde wie erwartet festgestellt, wenn das Plus-Sense-Mini-Repliconkonstrukt verwendet wurde. Die beiden Konstrukte, die nur die CAT-Leserahmen in Plus- und Minus-Sense enthielten, lösten etwa gleiche Mengen an CAT-Aktivität aus; die Midi-Replicons erzeugten ungefähr 100 Mal weniger CAT-Aktivität als die Mini-Replicons.
  • Das Transfektionsprotokoll wurde im Hinblick auf maximal erreichbare CAT-Aktiviät unter Verwendung von Mini- und Midi-Replicon-Plasmiden optimiert. Dann wurden die Gesamtlängenkonstrukte, p(+)MV und p(–)MV, getestet. Etwa 106 Zellen, die in jeder 35 mm-Vertiefung vorhanden waren, wurden transfiziert und wir schätzten, dass etwa ein Zehntel dieser tatsächlich die Gesamtlänge sowie die L-codierenden Plasmide aufnahm. Üblicherweise entwickelten sich 2 bis 3 Tagen nach der Co-Transfektion von p(+)MV und pEMC-La, 1 bis 6 Syncytien, in jeder Vertiefung. Es wurden keine Syncytien gefunden, wenn das letztere weggelassen wurde, oder wenn das Plasmid p(–)MV verwendet wurde. Die Gewinnungsexpermiente wurden von verschiedenen Experimentatoren unter Verwendung von unterschiedlichen DNA-Präparationen durchgeführt. Die Effizienz hat leicht variiert, aber mindestens 30% der transfizierten Vertiefungen ließen eine Gewinnung erkennen. 6 zeigt typische, in diesen Experimenten gebildete Syncytien, entweder direkt betrachtet (Phasenkontrast, 6A) oder nach Fixierung der Zellen, die auf einem Deckglas (Phasenkontrast, 6B, oder Immunfluoreszenz des gleichen Gebietes, 6C) gezüchtet wurden.
  • BEISPIEL 10: CHARAKTERISIERUNG DES GEWONNENEN MASERNVIRUS
  • Zuerst musste sichergestellt werden, dass das gewonnene Virus den genetischen Marker enthielt, welcher in die Gesamtlängen-Plasmidclone des Masernvirus eingeführt worden war. Der in 2 abgebildete 3 Nucleotide lange Marker, stammt von einer 175 Nt. langen N/P nicht- codierenden Genübergangsregionsvariante (NCGB), welche von dem von SSPE abgeleiteten Masernvirus, das in IP-3-Ca Zellen repliziert (Ballart et al., 1990) abstammt. Gewonnene Viren wurden in Vero-Zellen, entweder direkt von den transfizierten Zellen oder nach Plaquereinigung, amplifiziert; Die durch Reverse Transkription gefolgt von Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) erhaltenen Produkte, wurden durch Zyklus-Sequenzierung analysiert. 7 zeigt ein Beispiel dieser Analysen, wobei der AG-Marker statt des CA im Edmonston-B-Stamm gezeigt wird, der in unserem Labor gezüchtet wird.
  • Wir haben nicht die gesamte Sequenz der gewonnenen Masernviren analysiert, um jeden möglichen Fehler auszuschließen, der entweder während der Zusammensetzung der antigenomischen Plasmidclone oder während der Transkription der T7 RNA-Polymerase im Gewinnungsschritt eingeführt wurde. Bedeutende schädliche Veränderungen konnten jedoch durch Analyse des Replikationsverhaltens der gewonnenen Viren, im Vergleich mit dem des Edmonston-B-Stammes, ausgeschlossen werden. 8 zeigt, dass sowohl die Geschwindigkeit der Replikation, als auch die endgültigen Titer, die in wiederholten Experimenten erreicht wurden, zwischen einzelnen Plaquegereinigten normalen- (Masernvirus EdB) und gewonnenen- (Masernvirus-Tag-EdB) Viren nicht zu unterscheiden waren. Der offensichtliche, am 1. Tag nach der Infektion festgestellte Unterschied war keine gleich bleibende Beobachtung. Virusbestände, die nicht Plaque-gereinigt waren, ergaben ähnliche Ergebnisse.
  • BEISPIEL 11: MASERNVIRUS, WELCHEM 504 NUCLEOTIDE IN DER 5' NICHT-CODIERENDEN REGION DES F-GENS FEHLEN
  • Als eine erste Anwendung des reversen Genetiksystems haben wir 504 Nucleotide deletiert und auf diese Weise ein verkürztes Genom erzeugt, welches mit der vorstehend erwähnten Sechserregel kompatibel ist. Das hat fast das gesamte F-Gensegment der langen rätselhaften nicht-codierenden M/F Genübergangsregion (NCGB) entfernt, welches für das Masernvirus und andere Morbilliviren typisch ist, wohingegen die anderen beiden Gattungen der Unterfamilie der Paramyxovirinae, Paramyxovirus und Rubulavirus, nur eine kurze nicht-codierende Genübergangsregion enthalten. Bemerkenswerterweise war es lebensfähig und replizierte darüber hinaus in der Zellkultur mit einer Rate, die von der des Edmonston-B-Stammes und der gewonnenen nicht-deletierten Masernvirusstämme nicht zu unterscheiden war (8, MVΔ5F EdB). Um die Größe der vom F-Gen abgeleiteten RNAs zu bestimmen, wurden die durch diese Plaque-gereinigten Viren induzierten Masernvirus-spezifischen mRNAs unter Verwendung von Sonden analysiert, die für das F- und für die M- und H-Gene, welche jeweils stromauf- und stromabwärts des F-Gens liegen, spezifisch sind. In der Tat sind wie in 9 gezeigt die F-mRNA, sowie auch die MF und FH-bicistronischen RNAs, in Zellen, die mit der MVΔ5F EdB-Variante infiziert sind, durchwegs kürzer.
  • BEISPIEL 12: MASERNVIREN, DIE CAT-AKTIVITÄT EXPRIMIEREN
  • Um die Möglichkeit zu erforschen, Fremdprotein von konstruierten Masernviren zu exprimieren, haben wir einen CAT-Leserahmen, flankiert von intercistronischen Regionen, in die antigenomische cDNA-Sequenz des Masernvirus inseriert; zwei Positionen wurden überprüft, einerseits zwischen dem N- und dem P- und andererseits zwischen dem H- und dem L-Gen (10, jeweils p(+)MPCATV und p(+)MHCATV). Die intercistronische Region, welche den CAT-Leserahmen flankiert, wurde im Übereinstimmung mit der intercistronischen N/P-Genübergansregion entworfen, enthält aber zusätzliche, im gesamten Plasmid einzigartige Restriktionsstellen, welche für weitere Manipulationen geeignet sind. Von diesen Konstrukten wurden rekombinante Masernviren, welche CAT-Aktivität exprimieren, mit etwa der gleichen Effizienz gewonnen, wie jeweils von Standardviren und den deletierten Konstrukten p(+)MV und p(+)MΔ5FV. Wie vom natürlichen Transkriptionsgradienten erwartet, der typisch für alle Mononegavirales ist, exprimierte p(+)MHCATV etwas weniger CAT-Aktivität als p(+)MPCATV. Am bedeutendsten ist, dass die CAT-Expression der rekombinanten Viren außergewöhnlich stabil zu sein scheint, wie durch das in der Legende zu 12 erwähnte Experiment deutlich gemacht wird, in welchem eine gesamte Amplifikation der rekombinanten Viren von mindestens 1030 erreicht wurde. Wir hatten eigentlich erwartet, dass Viren, die von p(+)MPCATV gewonnen wurden, weniger stabil. sein würden als jene von p(+)MHCATV, da im Erstgenannten erwartet wird, dass die Transkription aller Gene, welche auf das inserierte CAT folgen, niedriger als normal ist, wohingegen im Letzteren nur die Transkription des L-Gens niedriger sein sollte. Offensichtlich beeinflusst die Position des Inserts die Lebensfähigkeit des gewonnen Virus nicht sehr. Es sind jedoch bis jetzt keine Kompetitionsexperimente mit Standard-Masernviren durchgeführt worden. Darüber hinaus muss davon ausgegangen werden, dass sich herausstellen wird, dass rekombinante Viren, welche Proteine exprimieren, die aktiv mit der Masernvirusreplikation interferierten, die inserierten Gene weniger getreu beibehalten.
  • Es sollte hier erwähnt werden, dass die Insertion einer fremden codierenden Sequenz innerhalb bestehender Masernvirusgene sogar weniger schädlich für die virale Replikation sein sollte, als die Schaffung neuer Transkriptionseinheiten wie in den vorstehend besprochenen Konstrukten. Das allgemeine Unvermögen der eukaryotischen Translationsmaschinerie, mehr als einen Leserahmen von einer mRNA zu exprimieren, kann im Prinzip durch (mindestens) zwei Einrichtungen überwunden werden: den Stopp/Start-Mechanismus und die interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES). Beide Mechanismen werden tatsächlich in speziellen Fällen für die natürliche Proteinexpression verwendet. Ein Beispiel des Ersten wird durch die Translation des M2-Polypeptids im Influenza B-Virus verkörpert (Horvath, C. M., Williams, M. A., und Lamb, R. A. (1990) Eucaryotic coupled translation of tandem cistrons; identification of the influenza B virus BM2 polypeptide. EMBO J. 9, 2639–2947). Für den zweiten Mechanismus bestehen viele anerkannte natürliche Beispiele, am bemerkenswertesten die interne Ribosomeneintrittsstelle der Picornaviridae (Sonenberg, N. (1990) Poliovirus translation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 161, 23–47), aber auch interne Ribosomeneintrittsstellen in zelluläre mRNAs, wie jene, die BiP spezifiziert (Sarnow, P. (1990) Die Translation der mRNA des durch Glucose-reguliertem Bindungsprotein 78/Immunoglobulin Bindungsprotein der schweren Kette ist in Zellen, die mit Poliovirus infiziert sind, erhöht zu einer Zeit, wenn die „Cap"-abhängige-Translation der cellulären RNA inhibiert ist). Alle diese zitierten Arten von Einrichtungen sind im Zusammenhang mit den N- und H-Genen des Masernvirus unter Verwendung jener codierenden Sequenzen stromabwärts von den N- und H-Leserahmen des Masernvirus, welche jeweils CAT und Glühwürmchen-Luciferase als Reporter ergeben, erforscht worden. Die gesamten bicistronischen Konstrukte wurden von herkömmlichen Expressionsplasmiden in Primatenzellen exprimiert und es wurden Erträge an Reporterproteinen erhalten, die sich im Vergleich mit den Proteinen, welche durch die stromaufwärts gelegenen Leserahmen codiert wurden, zwischen 10 und 100% erstreckt haben (Diplomarbeit, University of Zürich, verfasst von A. Cathomen (1991) und O. Peter (1992)).
  • BEISPIEL 13: MASERNVIRUS-CHIMERE, DIE DAS VSV-HÜLLPROTEIN TRAGEN
  • Um die Möglichkeit der Gewinnung genetisch stabiler chimärer Mononegavirales zu erforschen, in welchen die Hüllproteine eines Virus mit jenen eines anderen Virus ersetzt sind, wurden p(+)MGV und pMG/FV (10) konstruiert. Im ersteren Konstrukt wurden die gesamten F- und H-codierenden Regionen des Masernvirus durch jene ersetzt, die das G-Protein von VSV codiert, welches eine Rezeptorbindungs- und Fusionsfunktion erfüllt, analog jeweils zu jenen der H- und F-Proteine des Masernvirus. Das letztere Konstrukt wurde so entwickelt, dass ein Fusionsprotein erzeugt wird, welches den großen äußeren Teil und die Transmembranregion des G-Proteins von VSV verbunden mit dem cytoplasmatischen Rest des F-Proteins des Masernvirus enthält, von welchem angenommen wird, dass er spezifisch mit dem M-Protein des Masernvirus interagiert. In der Tat konnten chimäre Viren von beiden Konstrukten gewonnen werden, welche voneinander nur durch leicht unterschiedliche cytoplasmatische Effekte unterschieden werden konnten (welche sich beide drastisch von jenen unterscheiden, die durch das Masernvirus hervorgerufen werden) und durch die Tatsache, dass in Zellen, die mit dem Virus infiziert waren, welches von dem letzteren Konstrukt gewonnen wurde, das Fusionsprotein mittels Western-Blotting, nicht nur durch Antikörper, die gegen die G-Exodomäne von VSV gerichtet waren, erkannt werden konnte, sondern auch durch Antikörper, die gegen das cytoplasmatische Ende von F des Masernvirus gerichtet waren. Wie durch Endpunktverdünnungen festgestellt, replizierten beide Chimäre zu einigermaßen hohen Titern, nur etwa eine Größenordnung niedriger als die Titer, welche durch Masernviren erhalten werden. Außerdem zeigten sie die erwarteten biologischen Spezifitäten: sie infizierten Nagetierzellen leicht (welche keine Masernvirusrezeptoren exprimieren) wie zum Beispiel BHK (11, 12) wo sie reichlich cytoplasmatische und nucleäre, für Masernvirus typische, RNPs bilden (11), sowie auch pleomorphe Partikel, die Masernvirus-Virionen ähnlich sind (12), gänzlich unterschiedlich von den dichten Hülsen- oder Zigarren-ähnlichen VSV-Virionen (13), von denen angenommen wird, dass sie hauptsächlich durch das M-Protein von VSV gebildet werden.
  • Wenn man die Tatsache bedenkt, dass Masernviren und VSV nur sehr entfernt verwandte Mononegavirales sind und in der Tat zu verschiedenen Familien gehören (jeweils Paramyxoviridae und Rhabdoviridae), scheint es ziemlich wahrscheinlich, dass viele verschiedene Chimäre erzeugt werden können, die enger verwandte Mononegavirales einschließen und es erscheint nicht unrealistisch, dass auch Chimäre entwickelt werden können, die Hüllproteine enthalten, welche bestimmte Zellrezeptoren angreifen.
  • BEISPIEL 14: MASERNVIREN EXPRIMIEREN GRÜN FLUORESZIERENDES PROTEIN (GFP)
  • Um zu zeigen, dass andere Gene als das CAT-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung in einem rekombinanten Vektor exprimiert werden können, wurde die Sequenz, die GFP codiert (Chalfie et al. Science 263 (1994), 802–805) im Vektor p(+)MPCATV in die gleiche Position wie das CAT-Gen inseriert, resultierend im rekombinanten Vektor p(+)MPGFPV; siehe 10C.
  • Außerdem wurde die GFP-codierende Sequenz stromaufwärts vom N-Gen insersiert, wobei sichergestellt wurde, dass die Sechserregel nicht verletzt wurde, und unter Verwendung eines im Prinzip vergleichbaren Übergangs-ähnlichen Segment, wie es für die CAT-Konstrukte verwendet wurde, welches zum rekombinanten Vektor p(+)MGFPNV (10C) führte. Tatsächlich wurde auf diese Art eine besonders starke Expression des GFP erreicht, wie durch visuelle Evaluierung des exprimierten Proteins festgestellt werden konnte. Es war sogar möglich, zwei fremde codierende Sequenzen zur gleichen Zeit in einem rekombinanten Konstrukt zu exprimieren, wie mit dem Maservirus gezeigt werden konnte, welches zwei Kopien von GFP an verschieden Positionen exprimierte.
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Claims (21)

  1. Verfahren zur Herstellung eines infektiösen, nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus der Familie Paramyxoviridae, umfassend (a) das Einführen eines in einem Plasmid enthaltenen cDNA-Moleküls, wobei das cDNA-Molekül die gesamte (+)-Strangsequenz des Negativ-Strang-RNA-Virus umfasst, funktionell verknüpft mit einer Expressions-Kontrollsequenz, die die Synthese von anti-genomischen RNA-Transkripten mit den authentischen 3'-Termini erlaubt, und wobei das cDNA-Molekül aus einem ganzzahligen Vielfachen von 6 Nucleotiden besteht, in eine Helferzelle, die eine RNA-Polymerase, vorzugsweise T7 RNA-Polymerase, ein N- und ein P-Protein, vorzugsweise des zu gewinnenden Virus, und des weiteren ein L-Protein exprimiert, vorzugsweise des zu gewinnenden Virus, codiert von einer entweder transient oder stabil in die Zelle eingeführten cDNA; und (b) das Gewinnen des assemblierten infektiösen, nicht-segmentierten Negativ-Strang-RNA-Virus.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Expressions-Kontrollsequenz von 1(a) ein RNA-Polymerase-Promotor ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Plasmid ein exprimierbares DNA-Fragment enthält, das eine homologe DNA-Region des cDNA-Moleküls ersetzt.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Plasmid ein exprimierbares DNA-Fragment enthält, das zusätzliche genetische Information bereitstellt.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Plasmid ein exprimierbares DNA-Fragment enthält, das eine heterologe DNA-Region des cDNA-Moleküls ersetzt.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Plasmid dadurch gekennzeichnet ist, dass das exprimierbare DNA-Fragment in eine ein virales Protein codierende Region der cDNA eingefügt ist, wobei diese Einfügung in einer Weise durchgeführt wird, dass das Leseraster bestehen bleibt, vorzugsweise, um ein Fusionsprotein zu erzeugen, und dass Expression des DNA-Fragments unter der Kontrolle der Signalsequenzen des viralen Proteins möglich ist.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Plasmid dadurch gekennzeichnet ist, dass das exprimierbare DNA-Fragment in einer Weise stromabwärts von einer viralen protein-codierenden Region exprimiert wird, dass die Ausbildung eines Fusionsproteins vermieden wird, aber trotzdem die Expression der stromabwärts liegenden codierenden Sequenz ermöglicht wird, entweder durch einen Stopp-/Neustart-Mechanismus, in dem der letzte A-Rest des stromaufwärts liegenden Terminationstripletts mit dem des Start-Codons der stromabwärts liegenden codierenden Region zusammenfällt, oder durch Plazieren einer internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES) zwischen die beiden codierenden Regionen.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei das Plasmid dadurch gekennzeichnet ist, dass das exprimierbare DNA-Fragment in eine nicht-codierende Region der cDNA inseriert ist, vorzugsweise am 5'-Terminus oder der 5'-Region, und durch virale Signalsequenzen oder heterologe Signalsequenzen flankiert ist, die die Expression des RNA-Fragments kontrollieren, das durch das DNA-Fragment spezifiziert ist.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Plasmid eine genomische Ribozym-Sequenz unmittelbar angrenzend an das 3'-terminale Nucleotid des cDNA-Moleküls und gegebenenfalls stromabwärts zu der genomischen Ribozym-Sequenz mindestens einen Terminator, vorzugsweise den T7-Terminator, umfaßt.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die genomische Ribozym-Sequenz die genomische Ribozym-Sequenz des Hepatitis-Delta-Virus ist.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Plasmid zur Replikation in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt fähig ist.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei das exprimierbare DNA-Fragment des Plasmids ein DNA-Fragment ist, das homolog oder heterolog bezüglich des Negativ-Strang-RNA-Virus ist und mindestens ein immunogenes Epitop codiert.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das exprimierbare DNA-Fragment des Plasmids mindestens ein immunogenes Epitop von mindestens einem Pathogen, vorzugsweise ein Hüllprotein oder mindestens ein Genprodukt codiert, das in genetisch defizienten Individuen fehlt oder toxisch für die angegriffenen malignen Zellen ist.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das exprimierbare DNA-Fragment des Plasmids aus einem Virus, einem Bakterium oder einem Parasiten ist.
  15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 14, wobei das exprimierbare DNA-Fragment des Plasmids ein immunogenes Epitop codiert, das zum Hervorrufen einer schützenden Immunantwort geeignet ist.
  16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Negativ-Strang-RNA-Virus das Masern- oder Mumps-Virus ist.
  17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei in der Helferzelle die N-, P- und L-Protein-codierenden Gene aus dem Masern- oder Mumps-Virus abgeleitet sind.
  18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Helferzelle aus der menschlichen embryonalen Nierenzelllinie 293 (ATCC CRL 1573) ist.
  19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Verhältnis des Plasmids, wie definiert in einem der Ansprüche 1 bis 18, und des Plasmids, das das virale L-Protein codierende DNA umfasst, etwa 1000:1 ist.
  20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die Gewinnung des Virus direkt aus der transfizierten Helferzellkultur nach Syncytienbildung erfolgt.
  21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Gewinnung des Virus nach Mischen der transfizierten Helferzelle mit anderen Zellen erfolgt, die kompetent für Infektion und fähig zum Replizieren des Virus sind.
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