ES2239336T5 - cDNA correspondiente al antigenoma de virus RNA de cadena negativa no segmentada, y proceso para la producción de tales virus codificantes de proteínas antigénicamente activas adicionales - Google Patents

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Description

cDNA correspondiente al antigenoma de virus RNA de cadena negativa no segmentada, y proceso para la producción de tales virus codificantes de proteínas antigénicamente activas adicionales
Antecedentes de la invención
Campo técnico
La presente invención se relaciona, en general, con una metodología para la generación de virus de RNA no segmentado de cadena negativa (Pringle, 1991) a partir de ácido desoxiribonucleico clonado (cDNA). Estos virus rescatados son apropiados para su uso como vacunas, o alternativamente, como vectores para las aplicaciones de la terapia génica somática. El virus del sarampión (MV) se usa como modelo para otros virus representativos de los Mononegavirales, en particular la familia de los Paramyxoviridae.
La invención proporciona la tecnología para la construcción de cepas recombinantes de vacunas, en particular para cepas de vacuna MV que contengan regiones codificantes para la expresión de epítopos o la proteína entera de otros virus, bacterias, o parásitos. También demuestra que las cepas MV quiméricas que contienen proteínas heterólogas en el envoltorio pueden ser construidas de forma apropiada para ser dirigidas contra células que no contengan ningún receptor para MV. De esta manera, en principio, pueden ser construidos plásmidos basados en el genoma de MV, empaquetados en envueltas que contengan proteínas para que sean dirigidos contra tipos celulares especiales, codificando productos génicos ausentes en individuos genéticamente defectivos o tóxicos para ser dirigidos contra células malignas.
Por medio de la sencilla sustitución de las líneas celulares ayudantes MV específicas descritas en esta invención por líneas celulares que expresen proteínas comunes codificadas por otros representantes de los Mononegavirales para ser recuperadas, cualquier otro miembro de este Orden viral que se replique en células de vertebrado puede ser utilizado como vacuna viva o como vector para la terapia génica en lugar de MV.
Antecedentes
El virus del sarampión
MV es un miembro de la familia Paramyxoviridae. Su información genética se codifica en un RNA de cadena simple de polaridad negativa, comprendiendo 15894 nucleótidos. El genoma se transcribe de forma secuencial desde el extremo 3' para dar lugar, además de un RNA leader, 6 especies principales de ácidos ribonucléicos (RNA) mensajeros poliadenilados encapuchados, cada uno de los cuales codificando una proteína mayor. El mapa genómico se muestra en la Figura 1, se indican los genes especificando los productos principales N (proteína de nucleocápside), P (fosfoproteína), M (proteína de matriz), F (proteína de fusión), H (hemaglutinina) y L (proteína grande = polimerasa). Varios RNA adicionales así como especies proteicas, en parte mencionadas en la tabla de la Fig. 1 complican esta simple representación, aunque no son relevantes aquí.
MV es l a principal causa de enfermedad febril en bebés y niños de corta edad. De acuerdo con estimaciones de la Organización Mundial de la Salud (WHO), un millón de niños de corta edad mueren cada año a causa del sarampión. Este elevado número de muertes surge especialmente en países en desarrollo, aunque en los años recientes también en países industrializados como EE.UU. han sido afectados de nuevo por las epidemias de sarampión, principalmente a causa de la adherencia incompleta a los programas de inmunización (Clements y Cutts, 1995). Actualmente, se utilizan varias cepas de vacunas vivas atenuadas de MV (incluyendo las cepas Schwarz, Moraten y Edmonston-Zagreb), casi todas ellas se derivan de la cepa original Edmonston (Enders y Peebles, 1954) por cultivo repetido en células no humanas (Enders, 1962). Para una discusión reciente sobre las vacunas de MV incluyendo las tendencias futuras ver Norrby (1995). La vacuna del sarampión se administra normalmente a la edad de 15 meses o, en los países en desarrollo, a los 6 meses, y se ha demostrado que es elevadamente efectiva, proporcionando normalmente una inmunidad para toda la vida contra la reinfección de MV obtenida de la morbilidad. Hasta la fecha, las alteraciones genéticas responsables de la atenuación de estas cepas de vacuna permanecen desconocidas. La comprobada seguridad de la vacuna del sarampión, combinada con su elevada y larga eficiencia, la predestina como un plásmido ideal para la expresión de genes heterólogos. Esta vacuna puede ser probada respecto a su eficiencia para proporcionar protección inmune contra otros agentes patógenos así como contra el mismo virus vector. Otro posible candidato a ser vector de vacunación es el virus de las paperas, un familiar lejano del MV, el cual es también muy eficaz y seguro como vacuna viva atenuada.
Rescate del RNA vírico a partir del DNA clonado.
El estudio del ciclo de replicación de un número de virus de RNA ha sido facilitado en gran medida por la disponibilidad de clones de DNA a partir de los cuales estos virus infecciosos pueden ser rescatados, así permitiendo la aplicación de la genética reversa. Inicialmente, los bacteriófagos QD (Taniguchi et al., 1978) y el virus de la polio (Racaniello y Baltimore, 1981), y posteriormente el virus Sindbis (Rice et al., 1987) se expresaron a partir
de cDNA clonado. Hasta la fecha, una gran variedad de virus de RNA de cadena positiva, que principalmente infectan plantas y vertebrados, pueden ser rescatados a partir del ADN clonado (para una revisión reciente ver Boyer y Haenni, 1994). Además, el DNA proviral de los retrovirus es infeccioso. Sin embargo, los intentos para obtener virus infecciosos a partir de clones de cDNA de virus de RNA de cadena negativa se han encontrado con grandes dificultades. Esto se debe a dos propiedades de estos virus (i) ni los RNAs genómicos ni los antigenómicos son infecciosos, dado que no pueden servir como mRNA; y (ii) tanto la trascripción como la replicación requieren ribonucleocápsides, p.ej., los complejos de nucleoproteínas del tipo vara (RNPs), que contienen el RNA genómico y varias proteínas con función estructural y/o enzimática.
El rescate a partir de DNA clonado se ha conseguido hace varios años en el caso del virus de la gripe, un virus de RNA de cadena negativa que contiene ocho segmentos genómicos. Sus RNPs que son de tamaño pequeño y poco estructurados como se reveló por la susceptibilidad del RNA que los compone a la RNasa, puede ser ensamblado in vitro de a partir de RNA y las proteínas virales requeridas, y los componentes N y polimerasa. Inicialmente, se ha utilizado un RNA artificial para transportar como reportadora la secuencia codificante de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) embebida en los segmentos terminales no codificantes de una subinidad del genoma del virus de la gripe (Luytjes et al., 1989). Más tarde, se usaron subunidades simples de RNAs genómicos auténticos o alterados transcritas in vitro a partir de DNA clonado (Enami y Palese, 1991). Los RNPs ensamblados replicados y transcritos por transfección en células infectadas por virus de la gripe, como se monitorizó por producción de CAT y por rescate de virus de la gripe variados, respectivamente. La purificación de virus que contengan la subunidad introducida a partir del gran exceso de virus no variados en algunos casos se puede conseguir por medio de selección, por ejemplo, utilizando un anticuerpo neutralizante específico dirigido contra la proteína codificada por la subunidad común del virus ayudante.
En contraste, para los virus con genoma de RNA no segmentado de cadena negativa, agrupados conjuntamente en el orden Mononegavirales (Pringle, 1991) con RNPs más largos y mucho más gruesamente estructurados, conteniendo además de proteína N, la fosfoproteína cofactor para el ensamblaje y la polimerasa (P) y la RNA polimerasa viral (proteína grande, L) han resultado refractarios a la reasociación funcional in vitro. Por tanto, muchos laboratorios han abordado el rescate de Mononegavirales representativos empezando a partir de RNAs subgenómicos que contengan solamente las secciones esenciales de los genomas virales, utilizando virus para proporcionar las proteínas adyuvantes que se requieren en la encapsidación intracelular y la replicación de estos mini-replicones. En primer lugar, se usaron RNAs subgenómicos surgidos de forma natural, que compiten con la replicación viral y por lo tanto se conocen como RNAs partícula interferidores defectivos (DI) (Re, 1991), siendo sustituidos posteriormente por RNAs DI artificiales que contienen genes reportadores, transcritos a partir de plásmidos construidos de forma adecuada. Estos mini-replicones, primeramente concebidos por el grupo de M. Krystal (Park et al., 1991) de acuerdo con el replicón utilizado para el modelo inicial de rescate para el virus de la gripe (Luytjes et al., 1989), llevan una secuencia codificante para CAT insertada en las regiones terminales no codificantes virales del virus Sendai (SeV) y se han usado con éxito también para el virus respiratorio sincitial (Collins et al., 1993; Collins et al., 1991), el virus 3 de parainfluenza humano (Dimock y Collins, 1993), el virus de la rabia (RV) (Conzelmann y Schnell, 1994) y MV (Sidhu et al., 1995).
En todos estos sistemas, las proteínas adyuvantes esenciales fueron proporcionadas ya sea por virus homólogos o por el vector de vacuna vTF7-3 que codifica la RNA polimerasa del fago T7 (Fuerst et al., 1986) para llevar a cabo la trascripción específica de T7 de los plásmidos transfectados que codifican las proteínas N, P y L requeridas tal y como hicieron por primera vez Pattnaik et al., (1990). Estas investigaciones utilizando mini-replicones han permitido importantes avances en la comprensión de las regiones reguladoras no codificantes de los genomas y antigenomas virales correspondientes (para una discusión reciente ver Wertz et al., 1994). Adoptando la misma puesta en marcha experimental, el rescate de VSV, como RV un miembro de los Rhabdoviridae, ha sido ahora reportado (Lawson et al., 1995).
Un importante inconveniente de este método (así como para el método reportado para el rescate de virus RNA de cadena negativa con un genoma segmentado) es la implicación de un virus adyuvante el cual tiene que ser separado del virus rescatado y puede interferir en la replicación del virus a rescatar. Para RV y VSV, ambos pertenecientes a la los Phabdoviridae rígidamente estructurados y capaces de replicarse hasta elevadas cantidades, esto no es un problema importante. Sin embargo, en el caso de los viriones vagamente estructurados, polimórficos típicos de los miembros de la familia Paramyxoviridae y en el caso de los virus que se replican en baja cantidad, la presencia de virus adyuvantes haría que la recuperación de virus rescatados fuera difícil y puede impedir totalmente su rescate.
De acuerdo con esto, el problema técnico que subyace en la presente invención fue proporcionar medios y métodos útiles para la generación de RNA no segmentado de cadena negativa de la familia Paramyxoviridae y preferiblemente del virus del sarampión y un sistema para la recuperación de estos virus con una eficiencia razonable. La solución de este problema técnico se proporciona con las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Así, la presente invención se relaciona con un método para la producción de un virus de RNA no segmentado de cadena negativa de la familia Paramyxoviridae que comprenda (a) la introducción de una molécula de cDNA
contenida en un plásmido, donde esta molécula de cDNA comprenda la secuencia de la cadena (+)- completa del mencionado virus de RNA de cadena negativa ligado de forma operativa con una secuencia de control de expresión, la cual permita la síntesis de transcritos de RNA antigenómico que lleven el extremo 3' auténtico, y donde la mencionada molécula de cDNA este formada por un número de nucleótidos múltiplo de seis, y en el que el replicón especificado por dicha molécula de cDNA consiste de un número de nucleótidos múltiplo de seis y en el que el replicón especificado por dicha molécula de cDNA consiste de un número de nucleótidos múltiplo de seis, en una célula adyuvante que exprese una polimerasa de RNA, preferiblemente una RNA polimerasa de T7, una proteína N y una proteína P, preferiblemente del virus a ser rescatado, en el que dichas proteínas están expresadas a partir de plásmidos de expresión transfectados y, además, una proteína L, preferiblemente del virus a ser rescatado, codificados por un cDNA de forma transitoria o bien estable introducido en la mencionada célula; y (b) recubriendo el virus ensamblado infeccioso de RNA no segmentado de cadena negativa.
De acuerdo con esto, la presente invención se relaciona con un método para la producción de cualquier virus de RNA de cadena negativa de la familia Paramyxoviridae. Preferiblemente los mencionados transcritos de RNA antigenómico también llevan el extremo 5' auténtico.
Como además se ha descubierto de acuerdo con la presente invención, la producción efectiva del virus del sarampión el cual es un virus de RNA de cadena negativa de la familia Paramyxoviridae, se obtiene solamente si los replicones especificados por la mencionada molécula de cDNA están formados por un número múltiplo de seis nucleótidos. Este fenómeno será también referido como la “regla del seis” a lo largo de esta aplicación. Las moléculas de cDNA de la presente invención pueden ser utilizadas de forma conveniente para el rescate de virus de ARN de cadena negativa de la familia Paramyxoviridae.
En una realización preferible de la presente invención, en dicha molécula de cDNA, la secuencia para el control de la expresión es un promotor de RNA polimerasa.
El plásmido es capaz de propagarse y preferiblemente también de expresar la molécula de cDNA de la invención como un RNA antigenómico.
En una realización preferible, el mencionado plásmido contiene un fragmento de DNA expresable el cual sustituye preferiblemente una región de DNA homóloga de la mencionada molécula de cDNA, o proporciona una información genética adicional.
Como también se ha descubierto de acuerdo con la presente invención, en el caso de replicones basados en MV la regla del seis debe de ser seguida, si un fragmento expresable de DNA foráneo homólogo o heterólogo se inserta en el plásmido que contiene el cDNA de la invención. En otras palabras, cualquier nuevo replicón especificado por moléculas de cDNA construidas de forma apropiada será solamente capaz de proporcionar cantidades razonables del producto deseado, si sigue la regla del seis.
En una realización más preferible del método de la invención, este plásmido se caracteriza por que el fragmento expresable de DNA está insertado dentro o en una región adyacente del mencionado cDNA codificante para la proteína viral, esta inserción realizada de forma que se mantenga la pauta de lectura para crear una proteína de fusión y permitiendo la expresión de este fragmento de DNA bajo el control de secuencias señal de la mencionada proteína viral. De acuerdo con la presente invención se anticipa que en varios casos las extensiones C-terminales adecuadas de las proteínas virales no interferirán con su funcionalidad.
Como una variación de la realización preferible descrita más arriba y también comprendida dentro de la presente invención, el fragmento expresable de DNA se expresa posteriormente a la región codificante de la proteína viral para evitar la formación de la proteína de fusión, pero sin embargo permitir la expresión de la secuencia codificante posterior ya sea por medio de un mecanismo de paro/reinicio donde el último residuo A del triplete de terminación anterior coincide con el del codón de inicio de la región codificante posterior, o por el posicionamiento de un lugar de entrada de ribosoma (IRES) entre las dos regiones codificantes; ver el ejemplo 12, segundo párrafo.
En una realización más preferible del método de la invención, el mencionado plásmido se caracteriza porque el fragmento expresable de DNA está insertado en una región no codificante del mencionado cDNA y flanqueado por secuencias señal virales o señales heterólogas que controlen la expresión del fragmento de RNA especificado por el mencionado fragmento de DNA; ver ejemplo 12, primer párrafo.
De forma más preferible, el fragmento expresable de DNA está localizado previamente al gen N. Como se ha descubierto de acuerdo con la presente invención, el posicionamiento del mencionado fragmento expresable de DNA en el extremo 5’ de la secuencia MV resulta en una expresión particularmente fuerte del mismo; ver también el Ejemplo 14.
Ejemplos de esta realización, creando unidades de trascripción adicionales se proporcionan por los plásmidos que especifican MVs que expresan la pauta de lectura CAT heteróloga mostrada en la Figura 10.
Otra realización preferible de la invención se relaciona con un plásmido que comprenda una secuencia genómica de ribozima inmediatamente adyacente al nucleótido del extremo 3' terminal de la mencionada molécula de cDNA y opcionalmente posterior de la mencionada secuencia genómica de ribozima al menos un terminador, preferiblemente el terminador de T7.
La inclusión de una secuencia de ribozima en el plásmido de la invención lleva a la fiel digestión del tránscrito de RNA, de esta manera potenciando en gran medida la producción de tránscritos que llevan el extremo 3' correcto el cual, en el caso de MV, debe de seguir la regla del seis.
Los que son entendidos en la materia, naturalmente, son capaces de concebir otros medios que den lugar a la generación de extremos 3' auténticos. Tales medios incluyen el uso o la incorporación de dianas de restricción a nivel de DNA, o DNAs de triple hélice.
En una realización más preferible del plásmido de la invención, la mencionada secuencia genómica de ribozima es la secuencia genómica del ribozima del virus de la hepatitis delta.
El método de la invención utiliza en una realización preferible un plásmido que lleva el mencionado cDNA el cual es capaz de replicarse en un huésped procariota. Un ejemplo preferible de tal huésped procariota es E. coli. Ilustraciones de este ejemplo preferible son todos los constructos de cDNA que dan lugar a MVs modificados como se expone en las Figuras 2 y 10 que muestran plásmidos que se replican a un número elevado de copias en in E. coli.
De forma adicional, el método de la presente invención en una realización preferible se relaciona con un plásmido que lleva el mencionado cDNA (s)el cual es capaz de replicarse en un huésped eucariota.
La invención prevé la replicación y la expresión (p. ej. trascripción, seguida de traducción de los transcritos formados) de los vectores rescatados, p . ej. las partículas de RNA empaquetadas (RNPs), en cualquier célula huésped eucariota apropiada, preferiblemente ¬de vertebrado. Las células huésped preferibles son aquellas que tengan una alta capacidad de replicación y expresión. Son más preferibles aquellas células huésped que permitan una recuperación sencilla de los virus rescatados para una posterior replicación y subsiguiente formulación de vacunas.
El método de la invención se relaciona en otra realización preferible con un plásmido donde el mencionado fragmento expresable de DNA es un fragmento de DNA que es homólogo o heterólogo respecto al virus de RNA de cadena negativa y codifica como mínimo un epítopo inmunogénico.
En otra realización preferible de la presente invención en el mencionado plásmido el mencionado fragmento expresable de DNA codifica como mínimo un epítopo inmunogénico de cómo mínimo un patógeno, preferiblemente una proteína del envoltorio, como mínimo un producto de un gen que falte en individuos genéticamente defectivos o tóxico para células malignas.
Esta realización preferible de la invención permite la construcción de plásmidos como base para vacunas que inducen de forma efectiva una respuesta inmune contra uno o preferiblemente varios patógenos diferentes. En el caso de que el fragmento expresable de DNA codifique una proteína del envoltorio de un virus diferente al virus del sarampión o de otro patógeno, un plásmido basado en el virus del sarampión puede ser utilizado para dirigir hacia tipos celulares específicos usualmente no reconocidos por el virus del sarampión. Los mencionados tipos celulares pueden ser una diana selectiva para los virus rescatados especificados por el plásmido de la invención y conferir al mencionado tipo celular, por ejemplo una molécula que necesite el mencionado tipo celular o una toxina, si el mencionado tipo celular tiene que ser eliminado. Naturalmente, la mencionada molécula o toxina es también codificada por el mencionado plásmido. Los que sean expertos en esta materia serán capaces de idear más aplicaciones de este principio básico por el que el plásmido de la invención puede ser utilizado.
También, el mencionado plásmido puede codificar un producto que sea ausente en individuos genéticamente defectivos. El virus rescatado puede entonces ser usado para la terapia génica de los mencionados individuos genéticamente defectivos.
Además, las células malignas pueden ser dianas selectivas de los virus rescatados los cuales se basan en el plásmido de la invención y moléculas tóxicas para las mencionadas células malignas pueden ser liberadas.
En otra realización preferible de la presente invención, en el mencionado plásmido el mencionado fragmento expresable de DNA es derivado a partir de un virus, una bacteria, o un parásito.
Otra realización preferible del método de la presente invención se relaciona con un plásmido en el que el mencionado fragmento expresable de DNA codifica un epítopo inmunogénico que es capaz de inducir una respuesta inmune protectora.
En otra realización preferible, la molécula de cDNA o los plásmidos de acuerdo con la invención se basan en un RNA vírico el cual procede del virus del sarampión o un virus de las paperas.
También se describe aquí una célula huésped procariota o eucariota transformada con un plásmido. Las células huésped previstas han sido comentadas más arriba.
En vista de los problemas que surgieron primeramente en este campo a la hora de rescatar virus de RNA de cadena negativa no segmentada, se desarrollaron de acuerdo con la presente invención líneas celulares paradigmáticas que proporcionan funciones adyuvantes RNA polimerasa T7 y proteínas MV, N y P. El rescate de MVs puede ser directamente monitorizado después de la transfección con plásmidos que especifican RNAs antigenómicos y MV L mRNA. En principio, líneas celulares adyuvantes análogas pueden ser generadas para cualquiera de estos virus; así esta aproximación al rescate es aplicable a todos los Paramyxoviridae que se repliquen en células de vertebrados.
Las proteínas de las células adyuvantes previstas para la encapsidación, trascripción y replicación del mencionado RNA son una RNA polimerasa, preferiblemente RNA polimerasa T7 y opcionalmente RNA polimerasa T3, y proteínas N y P, preferiblemente del virus a ser rescatado. De acuerdo con la presente invención, las mencionadas proteínas son expresadas a partir de plásmidos de expresión transfectados de forma estable, de ahora en adelante definidas como expresión genómica.
Dado que el sistema de rescate está ahora desarrollado, en contraste con el utilizado para el rescate de RV (Schnell et al., 1994), VSV (Lawson et al., 1995) y muy recientemente también para el SeV (D. Kolakofsky, comunicación personal), no depende de ningún virus adyuvante, no es necesario separar el virus rescatado a partir del elevado exceso de cualquier virus adyuvante. La eliminación del virus de la viruela a partir del virus rescatado se consigue por un simple paso de filtración en el caso de los viriones rígidamente estructurados de Rhabdoviridae aunque implica esquemas de purificación más complejos en el caso de los Paramyxoviridae pleomórficos, particularmente aquellos que se replican a altas cantidades tales como MV. Además, para los virus dañados en su replicación y/o en ciernes para el virus de la viruela, el rescate utilizando el sistema previo podría fallar completamente. Otro posible inconveniente del sistemas previos basados en un virus adyuvante de la vacuna es la elevada frecuencia de recombinaciones del DNA que tienen lugar en el citoplasma de las células infectadas por el virus de la viruela la cual pueda causar la recombinación del plásmido que lleva la secuencia antigenómica con los plásmidos que codifican las proteínas N, P y L que se requieren para la función adyuvante; esto puede llevar al rescate del virus que contengan secuencias N, P y L derivadas a partir de los plásmidos adyuvantes más que de a partir del plásmido que lleva la secuencia antigenómica. El sistema de la célula adyuvante solventa todos estos problemas y debe de ser en principio aplicable para el rescate de cualquiera de los Paramyxoviridae que se repliquen en células de vertebrados.
El establecimiento de una línea celular adyuvante que exprese las proteínas comunes N y P (además de la polimerasa T7) no es necesario para el rescate de cualquier representante simple de los Paramyxoviridae. Los constructos mini replicones que contienen las regiones no codificantes terminales (NCTs) del virus del moquillo canino (CDV) el cual es como el MV un morbilivirus, que se diferencia de MV en un 35% de los nucleótidos en los NCTs, se replican en las células adyuvantes específicas para MV con una eficiencia cercana a la de los mini replicones homólogos MV. Así, CDV podría ser posiblemente rescatado con las células 293-3-46, las cuales fueron desarrolladas de acuerdo con la presente invención y de forma más general, con cualquier línea celular adyuvante puede ser posible el rescate de varios Paramyxoviridae no muy cercanamente relacionados. Esto dependerá probablemente de las proteínas obtenidas por el virus relacionado, se ha demostrado que este no es el caso para N y P específicas de SeV y L específica de PIV3 (Curran y Kolakofsky, 1991).
Para el establecimiento de nuevas líneas celulares adyuvantes para otros virus que son también previstos por la presente invención, las siguientes consideraciones pueden ser de ayuda. La expresión constitutiva de la RNA polimerasa T7 y de las proteínas N y P de MV no perjudicó la estabilidad a largo plazo de la línea celular 293-3-46, tal y como se ha mencionado en los ejemplos aquí adjuntos. Así, la expresión inducible de estas proteínas, por ejemplo, por medio de las aproximaciones descritas por el grupo de Bujard (para una revisión ver Gossen et al., 1993) probablemente no será necesario, aunque no se puede descartar que las proteínas N y P de otros virus sean más deletéreas para el crecimiento de la célula que las de MV. La titulación de los plásmidos utilizada para la transfección se mostró esencial, mostrando que una proporción de cerca de 1:1000 de plásmido L-codificante y plásmido productor de antigenoma, respectivamente, fue la óptima, de acuerdo con el efecto deletéreo de la elevada expresión de L de VSV en la replicación de VSV detectada por Schubert et al. (1985). Un modo alternativo de proporcionar L de forma transitoria, utilizando un plásmido que contenga un promotor/potenciador de CMV y un intrón de forma anterior a la región codificante de L más que posterior a la región codificante de L para permitir alguna exportación del mRNA largo de L a partir del núcleo, resultó también exitoso en el rescate, aunque la eficiencia no fue mejor que con el método estándar de expresión citoplasmática de L dependiente de T7 y más de cien veces más óptimo para el rescate de plásmido codificante para L. A la vista de estas experiencias, la decisión de no incluir un plásmido que codifique L para la generación de células adyuvantes, permitiendo así la expresión de L en tasas ajustables, fuera probablemente ventajoso. Sin embargo, se debe mencionar que una línea celular que exprese de forma estable las proteínas N, P y L derivadas de SeV que median la replicación a largo plazo de los Dis de SeV ha sido descrita (Willenbrink y Neubert, 1994). Es importante resaltar que esta línea celular se diferencia de forma fundamental de las células adyuvantes identificadas en la presente invención por su falta de polimerasa T7.
Como consecuencia, no es posible el rescate de un virus y menos todavía de un mini replicón a partir de DNA clonado con esta línea celular.
La mencionada célula adyuvante puede ser transfectada con al menos uno de los plásmidos mencionados más arriba, conteniendo estos plásmidos variantes del cDNA antigenómico de un representante de los Paramyxoviridae, y que es adicionalmente transfectado de forma estable con un plásmido que contiene un DNA codificante para la proteína viral L común.
Así, en lugar de la selección de una célula adyuvante que también codifique por si misma la polimerasa viral (proteína L), la mencionada proteína L se transfecta en la mencionada célula adyuvante en un plásmido diferente, preferiblemente por cotransfección. Más adelante, los que son expertos en esta materia utilizando las enseñanzas de la presente invención serán capaces de crear una línea celular adyuvante adecuada también para la expresión de proteína L, en este caso no sería necesaria la cotransfección.
En la célula adyuvante, los genes que codifican las mencionadas proteínas N, P y L pueden derivar de los virus del sarampión o de las paperas.
Las mencionadas células adyuvantes pueden ser derivadas de la línea celular de riñón embrionario 293 (ATCC CRL 1573). Un ejemplo preferible de tal célula es el clon 293¬3-46 descrito en los ejemplos.
También se describe aquí una cepa de virus infecciosos de RNA de cadena negativa que pertenecen al orden de los Mononegavirales aislados a partir de la célula adyuvante.
Debe de ser recordado que hace cinco años, en una cuenta errónea fue informado un rescate de MV en nuestro laboratorio (Ballart et al., 1990 y EP-A 0 440 219), utilizando el mismo principio básico. Hasta ese momento, los experimentos se basaron en la microinyección de complejos de iniciación, que consistían en RNA polimerasa T7 y plásmidos que especificaban genomas o antigenomas MV, en una línea celular particular que contenía genomas MV defectuosos aunque capaces de replicarse. Sin embargo, el rescate por experimentos de microinyección, desafortunadamente llevados a cabo por solamente un colaborador, no pudo repetirse, y todos los virus que aparentemente se habían rescatado no contenían la etiqueta genética, tal y como se resumió en un comentario de este extremadamente lamentable y devastador acontecimiento (Aldhous, 1992). Ahora está claro que el rescate de MV no debe de ser esperado con esta puesta a punto experimental por muchas razones, en particular debido a los nucleótidos adicionales a ambos extremos de los RNAs generados y debido los errores de clonación que dan lugar a RNA incompatible con la regla del seis (Calain y Roux, 1993; la presente invención).
La eficiencia del rescate, en comparación con el rescate de virus de RNA de cadena positiva (Perrotta y Been, 1990), es baja, dado que solamente de 1 a 6 de cada 106 células transfectadas, cada una de ellas expuestas a una media de cerca de 2,5x105 moléculas de plásmido antigenómico y de 80 a 800 moléculas de plásmido codificante L, desencadenó la formación de sincitios. Sin embargo, en comparación con el método de rescate descrito para RV y VSV, en los que cerca de 2x107 células son transfectadas para obtener un suceso de rescate (Lawson et al., 1995; Schnell et al., 1994), el rescate de MV se compara bien, particularmente en vistas del hecho de que el tamaño del genoma de MV es cercano a un tamaño de 4,5 kb y por lo tanto en principio es más difícil de rescatar. De forma importante, la baja eficiencia no debe de constituir una dificultad para el rescate de variantes MV que se repliquen solamente en cantidades algunos ordenes de magnitud por debajo de las cepas Edmonston B; dado que el cuello de botella del rescate se encuentra muy probablemente en un acontecimiento temprano. Es importante resaltar que en las células fijadas a diferentes tiempos después de la transfección, la inmunofluorescencia que indica la expresión del gen H o el gen M se monitorizó exclusivamente en sincitios y no hubo indicación de que el rescate estuviera confinado a las células simples. Cuando el rescate es visible de forma directa por la formación de sincitios, ya han surgido miles de genomas MV de la progenie; las variantes víricas dañadas y de esta manera con una replicación más lenta pueden no formar sincitios visibles inicialmente, aunque deberían de ser reveladas por medio de la disgregación del cultivo celular transfectado o por medio del siembra en células Vero frescas.
También descrito aquí se encuentra un método para la producción de un virus infeccioso de RNA de cadena negativa perteneciente al orden de los Mononegavirales, comprendiendo los pasos de
(a)
transfección de la célula adyuvante de la invención con cualquiera de los plásmidos descritos más arriba y comprendiendo DNA obtenido a partir de a virus que pertenecen al orden de los Mononegavirales (primer vector) y de forma opcional un plásmido que comprenda un DNA que codifique la proteína viral L (segundo vector); y
(b)
recuperación de los virus infecciosos de RNA de cadena negativa ensamblados.
La transfección con el segundo vector no es necesaria si la célula adyuvante expresa en su genoma la proteína viral
L.
En una realización preferible del método de la invención la proporción entre el primer vector y el segundo vector está cerca de 1000:1.
De acuerdo con la presente invención se ha mostrado que la proporción mostrada arriba es óptima para la eficiencia de la transfección.
En otras realizaciones preferibles del método de la invención, el mencionado rescate se realiza directamente en el cultivo de células adyuvantes transfectadas después de la formación de sincitios o después de la mezcla de las células adyuvantes separadas con cualquiera otras células competentes para ser infectadas y repliquen los virus de RNA ensamblados.
También descrito aquí se encuentra una vacuna que comprende el virus de acuerdo con la invención que opcionalmente es obtenible por el método de la invención descrito más arriba, opcionalmente en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
Las ventajas de la vacuna serán brevemente discutidas más abajo.
En el pasado, una variedad de virus de DNA y de RNA de cadena positiva han sido utilizados como portadores para dirigir la expresión de genes heterólogos o segmentos de genes en células huésped, principalmente con la finalidad de dar lugar a una protección inmune contra el patógeno a partir del cual el material genético heterólogo se derivó. La principal ventaja del uso de tales vacunas vivas es su capacidad para multiplicarse y típicamente infectar una variedad de diferentes tipos celulares, dando lugar a los antígenos de interés intracelularmente los cuales por lo tanto pueden ser presentados de forma eficiente al sistema inmune, de esta manera facilitando la inducción tanto de las células T helper como de la citotoxicidad. En contraste, las vacunas inactivadas o las proteínas fabricadas mediante tecnología de DNA recombinante son mucho menos eficientes, aún por administración en varias formas particuladas de desarrollo reciente, las cuales son más eficientes que los adyuvantes utilizados de forma tradicional. Además, estas vacunas de forma típica no inducen la inmunidad mucosal, la cual es muy importante para la protección contra los patógenos que entran por vía respiratoria o intestinal. El fallo en la inducción de la inmunidad mucosal también es típico de la inmunización a través de inyección del DNA desnudo que codifica los antígenos.
Por otra parte, muchas de las vacunas replicantes constituyen una amenaza, aunque no sean proliferativas, como es el caso de los vectores avipox en humanos (Baxby y Paoletti, 1992). Los vectores virales complejos (p.ej. basados en el virus de la viruela y otros poxvirus relacionados, adenovirus de herpesvirus) y vectores bacterianos (p.ej. basados en derivados de los agentes causantes de la tuberculosis o el cólera) de forma inherente dan lugar a muchas respuestas inmunes laterales, innecesarias y/o no deseadas. Además, la integración de DNA en el genoma de las células infectadas o transfectadas conlleva como mínimo de forma potencial una transformación maligna. Valoraciones realizadas por varios autores acerca de varios tipos de vacunas se han publicado de forma reciente (vaccines and public health; Internat. J. de techn. Ass. in Health care 10, 1-196 1994; Science 265, 1371-1451, 1994), a partir de las cuales los particulares son evidentes los beneficios de las vacunas vivas basadas en RNA pequeño.
Se han descrito varios virus de RNA de cadena positiva diseñados para su uso potencial como vectores con finalidades de inmunización; Los ejemplos más tempranos incluyen el poliovirus (Burke et al., 1988) y el virus Sindbis (Xiong et al., 1989) y varios más recientes, que implican fragmentos polipeptídicos de mayor tamaño expresados a partir de varios representantes de los Picornaviridae, uno se menciona aquí (Andino et al., 1994).
Sin embargo, debe decirse que el uso de virus de RNA como vectores con vistas a la vacunación depende de forma crucial de la estabilidad del material genético externo durante la replicación del virus. Este no es un problema trivial, porque estos virus dependen de una polimerasa desprovista de actividad correctora. El mencionado problema ha sido solventado de forma ventajosa por la presente invención: en comparación con los vectores de vacuna basados en virus de RNA de cadena positiva como se ha mencionado más arriba, la vacuna de la invención como se ha ejemplificado por las vacunas bivalentes o polivalentes basadas en MV muestran varias ventajas importantes que en principio son válidas para cualquier otro miembro de los Paramyxoviridae tales como el virus de las paperas. Primero, el tamaño de los insertos no esta limitado a priori por el requerimiento de encajar en una cápside proteica eicosahédrica. Segundo, la gruesa encapsidación de los genomas de los Mononegavirales obvia la estructura secundaria del RNA la cual es muy importantes en el caso de los virus de RNA de cadena positiva por encima de la longitud total del genoma para permitir una correcta replicación sin que se de anillamiento del producto a la cadena de RNA plantilla; los segmentos de RNA que codifican los antígenos foráneos no han evolucionado para cumplir estos requerimientos. Tercero, dada la organización modular del genoma, diferentes lugares de inserción y modos de expresión, así como unidades de trascripción adicionales o de elongación unidades de trascripción existentes, expresando las pautas abiertas de lectura insertadas insertadas más abajo por parada/reinicio o por un lugar interno para la entrada de ribosomas puede ser ideado, permitiendo así un amplio rango de diferentes niveles de expresión de acuerdo con la posición en el gradiente de trascripción de MV. Cuarto, dada la extremadamente baja frecuencia de recombinación, en los Mononegavirales se puede esperar que retengan material genético no esencial de forma mucho más estable que los virus de RNA de cadena positiva. Finalmente, la regla del seis, válida para MV tal y como se ha descubierto de acuerdo con la presente invención y para otros Paramyxovirinae (Calain y Roux, 1993),
pero conocida a partir de los mini y midi replicones comunes, no para Rhabdoviridae (Conzelmanin y Schnell, 1994)
o para Pneumovirinae (Collins et al. 1993), deberán incrementar aún más la fiel retención de regiones codificantes foráneas insertadas en Paramyxovirinae en comparación a otros Mononegavirales. Esta estabilidad genética adicional puede ser prevista porque solamente una de cada seis grandes deleciones ocurridas y no las pequeñas inserciones de 1 a 5 nucleótidos en una región no esencial para la replicación viral se espera que lleven a una progenie viable.
Adicionalmente, el conocimiento de la secuencia de nucleótidos de las variantes que confieren la atenuación permitirá cambiar las secuencias codificantes que no están implicadas en las propiedades atenuantes de acuerdo con la evolución del virus a lo largo de los años permitiendo así la "actualización" de las vacunas sin incurrir en el peligro de perder la calidad de la atenuación.
También se describe aquí el uso del plásmido arriba descrito en terapia génica somática.
Dado que las proteínas de la envuelta vírica pueden ser cambiadas entre los diferentes representantes de los Mononegavirales, tal y como se muestra aquí por medio de recambio de las proteínas de la envuelta de MV por las glucoproteína de VSV, parece ser factible dirigir el replicón basado en la maquinaria de replicación de los Mononegavirales hacia un particular tipo celular; así, pueden ser ideadas ciertas aplicaciones en terapia somática. Las ventajas respecto a los vectores existentes para la terapia génica incluyen su pequeño tamaño, de esta forma limitan las reacciones del antígeno hacia varias proteínas, y su completa incapacidad para integrarse en el DNA y así transformar las células.
Adicionalmente, se describe el uso del plásmido de la invención para dirigirlo hacia tipos celulares especiales. Un esbozo de estos esquemas de direccionamiento y sus aplicaciones se han proporcionado más arriba
También se describe aquí el uso del plásmido de la invención para la evaluación funcional de las mutaciones que se encuentran de forma típica en las variantes de MV que son responsables de la panencefalitis esclerótica subaguda fatal o para la identificación de mutaciones responsables de la atenuación de las cepas de Paramyxoviridae, preferiblemente de las cepas del virus del sarampión.
Finalmente, se considera una composición para diagnóstico que incluya como mínimo una molécula de cDNA y/o como mínimo un plásmido descrito aquí.
LAS FIGURAS MUESTRAN
Figura l: Mapa genómico del virus del sarampión
Figura 2: Vectores plásmidos que especifican RNAs con terminaciones específicas de MV correctas. Los números de abajo del plásmido indican la longitud en nucleótidos de los RNAs generados después de la auto digestión por ribozima. El sentido genómico o antigenómico de los RNAs especificados se indica con (-) y (+), respectivamente. Se hace notar que las secuencias de nucleótidos de MV presentes en estos plásmidos derivan en 30 posiciones del número de acceso EMBL K01711, de forma más notable por una deleción de un residuo A en la posición 30, compensada por una inserción de una A en la posición 3402. Para una revisión comentada de la secuencia consenso de MV ver Radecke y Billeter (1995).
Figura 3: Western blot que muestra la expresión de proteínas MV, N y P en células 293 infectadas por MV, células 293 no infectadas y en los clones de línea celular 293-3-46 y 293-3-64, respectivamente. Las flechas indican la posición de las proteínas estructurales MV, N y P así como de la proteína no estructural V que surge a partir de la edición del tránscrito del gen P de MV.
Figura 4: Visión general de los componentes experimentales y de los procedimientos para el rescate. A: rescate de un mini replicón, implicando la transfección de un RNA transcrito in vitro y la coinfección con MV, proporcionando proteínas adyuvantes N, P y L (y para estadíos posteriores también M, F y H, así como las proteínas no estructurales C y V). B: rescate de MV, implicando la transfección de plásmido de DNAs en las células adyuvantes mediando tanto la trascripción artificial T7 como las funciones N y P. Para la explicación de más símbolos ver Figura 2. El plásmido codificante de L pEMC-La contiene un lugar interno para la entrada de ribosomas derivado del virus de la encefalomiocarditis (ovalo punteado, EMC IRES), fusionado con la región codificante L de tal forma que el iniciador AUG del EMCV y L coincidan; un segemento poli dA posterior (cerca de 40 dAs) se indica como pdA. Estos dos aparatos aseguran la estabilidad del tránscrito así como una traducción eficiente a partir de los tránscritos generados en el citoplasma.
Figura 5: Ensayo de actividad CAT obtenido en las células adyuvantes 293-3-46 por transfección del plásmidos constructos pl07MV(-) :CAT y p107MV(-):CAT, especificando mini replicones, y constructo p(+)NP:CAT, especificando un midireplicón. La estructura del plásmido pT7P2lacZ es similar a la que se describe en Pelletier y Sonenberg (1988). La pauta de lectura de CAT del plásmido original esta sustituida por la pauta de lectura de lacZ.
Figura 6: Visualización de los sincitios formados en células adyuvantes 293-3-46. A: experimento de rescate, visto a través de microscopio de contraste de fase 4 días después de la transfección. B, C: Células que han crecido en placas de cristal cubiertas, fijadas tres días después de la transfección y vistas por contraste de fase (B) o por microscopía de inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína M de MV (C). Resultados similares se obtuvieron con un anticuerpo contra H. La longitud de la barra representa 100Dm.
Figura 7: determinación de la secuencia de los virus purificados a partir de las placas, desarrollada por RT-PCR seguida de secuenciación cíclica como se describe en los ejemplos. Los carriles de la izquierda del área relevante reproducida a partir del gel de secuenciación se relacionan con la cepa Edmonston B de nuestro laboratorio, los carriles de la derecha con los virus rescatados. Las posiciones de los nucleótidos indicados corresponden con los que se encuentran en la secuencia consenso de MV tal y como se define en la Figura 2.
Figura 8: Comportamiento de la replicación de los virus purificados a partir de las placas, evaluado por una técnica de revestimiento descrita en los Ejemplos. Los derivados de los experimentos de rescate, las etiquetas EdB del MV estándar y la el mutante MVD5F EdB son comparados con un clon a partir de la cepa del virus Edmonston B de nuestro laboratorio. Se muestran los resultados de dos experimentos independientes utilizando un clon representativo de cada especie de virus.
Figura 9: Northern blots revelando los mRNAs de los MV rescatados derivados a partir de p(+)MV, y el mutante de MV por deleción derivado a partir de p(+)MVD5F (Figura 2). Las especies de mRNA monocistrónicas F, M y H (triángulos abiertos) y los mRNA bicistrónicos MF y FH (triángulos negros) son reveladas por sondas específicas M, F, y H. Los RNA F-específicos mono- y bicistrónicos inducidos por el mutante deleccionado son claramente más pequeños que los correspondientes RNA inducidos por el MV estándar rescatado (LF, 1869 en lugar de los 2372 nt. calculados, sin considerar colas de poli A; MLF, 3338 en lugar de 3842 nt., y LFH, 3830 en lugar de 4334 nt.).
Figura 10 (a) Plásmidos para la producción de MV estándar y deleccionado e híbridos de MV que contienen genes adicionales o proteínas de la cubierta intercambiadas.
Nótese que dos clones quiméricos MV recuperados a partir de p (+) MPCATV y a partir de p (+) MHCATV después de 10 ciclos de infección aún expresaban actividad CAT codificada por la unidad de trascripción adicional en cada uno de los 10 clones tomadas a partir del décimo ciclo analizado.
Figura 10 (b) Plásmidos para la producción de virus del sarampión Edmonston B estándar y variante
p(+)MV: La RNA polimerasa proporciona RNA MV antigenómico con dos marcadores de secuencia en las posiciones 1702 (A) y 1805(AG)
p(+)MV C : El RNA antigenómico corresponde a aquél obtenible a partir de p(+)MV con la excepción que el ORF de la proteína C se transforma en no-funcional por la introducción de dos mutaciones puntuales en las posiciones 1830
(C) y 1845 (A).
p(+)MV V-: El RNA antigenómico corresponde a aquél obtenible a partir de p(+)MV con la excepción de que el ORF de la proteína V se transforma en no-funcional mutando el "lugar de edición" conservado.
p(+)MV LM: El RNA antigenómico corresponde a aquél obtenible a partir de p(+)MV con la excepción que el ORF completo del gen M (L320 aminoácidos) con la excepción de 15 aminoácidos han sido deleccionados.
p(+)MV L5F: El RNA antigenómico corresponde a aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que una delección de 504 nucleótidos (nucleótidos 4926-5429 están ausentes) se ha introducido en el gen F.
p(+)MV FLcyt: El RNA antigenómico corresponde a aquél obtenible a partir de p(+)MV con la excepción que la secuencia codificante de la parte citoplasmática de la proteína F ha sido intercambiada por un fragmento diferente codificante de la parte citoplasmática de la proteína F proteína derivado a partir de un caso SSPE. Un codón de parada prematuro resulta en un mutante deleccionado que tienen una delección en el dominio citoplasmático de la proteína F.
p(+)MV Fxc SeV: El RNA antigenómico corresponde a aquél obtenible a partir de p(+)MV con la excepción que la secuencia codificante para el dominio citoplasmático de la proteína F ha sido sustituido por la correspondiente secuencia a partir del virus Sendai.
p(+)MV HLcyt: El RNA antigenómico corresponde a aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que la secuencia codificante para el dominio citoplasmático de la proteína H ha sido sustituido por un fragmento que lleva una delección.
Figura 10 (c) Plásmidos para la producción de quimeras del virus del sarampión Edmonston B y vectores.
p(+) M GFPNV: El RNA antigenómico corresponde a aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que se incorpora un cistrón adicional corriente arriba del N-ORF MV que permite la expresión MV dependiente del gen marcador codificante de la proteína de fluorescencia verde; dicho ORF está insertado en un sitio de clonaje múltiple.
p(+)MPCATV: El RNA antigenómico RNA corresponde a aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que un cistrón adicional ha sido incorporado corriente abajo del ORF P permitiendo la expresión del gen CAT.
p(+) MPGFPV: El constructo corresponde a p(+)MPCATV con la excepción que la secuencia de codificación CAT ha sido sustituida por la secuencia de codificación GFP que es, otra vez, clonada en el sitio de clonaje múltiple.
p(+) MHCATV: El RNA antigenómico RNA corresponde a aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que un cistrón adicional ha sido introducido corriente abajo del ORF H que permite la expresión del gen CAT.
p(+)MG/FV: El RNA antigenómico corresponde a aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que los genes MV F y H han sido sustituidos por un gen que codifica una proteína G VSV, la parte citoplasmática de la cual ha sido sustituida por la parte citoplasmática de la proteína F MV.
p(+)MGV: El RNA antigenómico corresponde a aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que los genes MV F y H han sido sustituidos por un gen codificante de la proteína G VSV.
Figura 11: Microscopia electrónica de células BHK infectadas con agente de replicación rescatado a partir de p(+)MGV.
Una gran colección de RNP típicos para células infectadas MV son visibles, mostrando capacidad de replicación inalterada del RNA viral quimérico.
Figura 12: Microscopia electrónica de células BHK infectadas con agente de replicación rescatado a partir de p(+)MGV.
Se forman partículas pleomórficas parecidas a viriones MV a pesar del hecho que en estos cultivos de células infectadas exclusivamente se detectó proteína G VSV y no sin restos de proteínas F y H de la cápsula de MV por Western Blotting.
Figura 13: Microscopia electrónica de células BHK infectadas con VSV: partículas viriónicas VSV
Los típicos viriones VSV con forma de bala difieren completamente de las partículas pleomórficas tipo MV mostradas en la Fig. 12.
Los ejemplos ilustran la invención:
EJEMPLO 1: CÉLULAS y VIRUS
Las células se mantuvieron como monocapas en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 5% suero de ternera fetal (FCS) para células Vero (riñón de mono verde africano), con 10% FCS para células 293 (riñón embriónico humano) y con 10% FCS y 1,2 mg/ml G418 para los clones celulares derivados de 293 transfectados de forma estable.
Para crecer reservas de virus MV que alcancen títulos de alrededor de 107 pfu/ml, los virus recombinantes se propagaron en células Vero, y la vacuna de la cepa Edmonston B se creció en células Vero o 293. Se llevó a cabo una ronda de purificación en placa transfiriendo un sincitio a un cultivo de células Vero de 35 mm que se expandió en un plato de 175 cm2. Las reservas de virus se hicieron a partir de cultivos de 175 cm2 en dónde la producción de sincitios era pronunciada. Las células se rasparon en 3 ml de OptiMEM I (GIBCO BRL) seguido de una ronda de congelación y descongelación. La titulación de virus se llevo a cabo en cultivos de 35 mm de células Vero. Después de 2-3 h de adsorción vírica, se eliminó el inóculo y las células se cubrieron con 2 ml de DMEM que contiene FCS 5% y agarosa SeaPlaque 1%. Después de 4-5 días, los cultivos se fijaron con 1 ml de TCA 10% durante 1h, luego se hizo entrecruzamiento UV durante 30 min. Después de retirar la capa de agarosa, las monocapas de células se tiñeron con cristal violeta diluido en etanol 4%, y se contaron las placas.
EJEMPLO 2 : GENERACIÓN de la LÍNEA CELULAR 293-3-46
Antes de la transfección, todos los plásmidos se linealizaron por digestión con SfiI y se esterilizaron por precipitación con etanol. Las células se sembraron en un pocillo de 35 mm para la transfección durante 13 h como se describe más adelante. La mezcla de transfección contenía 5 Dg de pSC6-N, 4 Dg de pSC6-P, y 1 μg de pSC6-T7-NEO. Luego, las células se lavaron una vez con 2 ml de salino tamponado con fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2P04), y se añadió DMEM que contenía 10% FCS. Después de 2 días en cultivo, las células del pocillo de 35 mm se separaron en dos placas de 75 cm2, y se empezó la selección bajo 1,2 mg/ml G418
cambiando el medio cada dos días. Después de D2 semanas, los primeros clones de un total de D100 clones se transfirieron a pocillos de 5 mm. Cuando un clon se hubo expandido a un pocillo de 21 mm - o 35 mm, se sembraron las células para el cribaje. La expresión de las proteínas MV N y P se analizó por Western blotting (ver también más adelante) utilizando ~1/3 a 1/10 del lisado total de un confluente de pocillo de 21 mm. Para monitorizar la funcionalidad de la RNA polimerasa T7, un cultivo de células de 35 mm se transfectó con 4 μg de pEMC-Luc (Deng et al., 1991), y la actividad luciferasa en 1/125 del lisado total clarificado (protocolo Promega; recoger 1 día después de la transfección) se midió en un luminómetro. Los clones expresando las proteínas MV N y P comparables con el mismo número de células 293 infectadas con MV y mostrando una actividad RNA polimerasa T7 tan alta como sea posible se escogieron para evaluar su funcionamiento permitiendo a los RNA MV DI expresar CAT. Aquí, se transfectaron 5 Dg de los plásmidos p107MV(+):CAT, pl07MV(-):CAT, o p(+)NP:CAT con o sin 100 ng de pEMC-La. Después de 1 día, las células se lisaron, y 1/4 de los lisados clarificados se ensayaron para actividad CAT.
EJEMPLO 3: CONSTRUCCIONES PLASMÍDICAS
Todos los procedimientos de clonaje fueron básicamente como se describen en Sambrook et al. (1989). Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo utilizando la corrección de prueba Pfu DNA polimerasa (Stratagene) y los cebadores con un enlace fosforotioato 3' terminal en lugar de un enlace fosfodiéster (Skerra, 1992). Las secuencias DNA de los oligonucleótidos sintéticos son dadas en pocos casos para nucleótidos no-MV y en más casos para los nucleótidos MV; se subrayan secuencias con sitios de reconocimiento por endonucleasas de restricción relevantes. La construcción del plásmido pl07MV(-):CAT se puede encontrar en Sidhu et al., 1995. El plásmido p107MV(+):CAT es el análogo del plásmido p107MV(-):CAT. La región intercistrónica adicional de p (+) NP :CAT que es similar a la del límite intergénico N-P se construyó insertando (5'-ctaGCCTACCCTCCAT CATTGTTATAAAAAACTTAGGAACCAGGTCCACACAGCCGCAGCCCATCAACgcgtatcgcgata-3', MV(+) 1717-1782) y el oligonucleótido complementario internamente al sitio SpeI del gen P. La región codificante CAT amplificada por PCR se insertó como se ilustra en la Figura 2.
La descripción del ensamblaje del primer DNA MV de longitud completa, la fuente de nucleótidos MV 2044-14937 en versiones posteriores de clones de longitud completa tales como peuT7MV(-) (ver más adelante), se da en Ballart et al., 1990. Las principales características del plásmido p(+)MV (Figura 2) son como siguen: El promotor T7 permite la síntesis del RNA antigenómico de MV de forma precisa empezando por el primer nucleótido. El ribozima genómico del virus delta de la hepatitis (D) libera bajo auto-fraccionamiento (auto-cleavage) el nucleótido 3' terminal MV correcto. Directamente corriente abajo del ribozima D, el terminador TØ de la RNA polimerasa T7 detiene la mayoría de polimerasas de transcripción. Esto asegura que las secuencias adyacentes derivadas a partir del esqueleto del vector no interferirán con la actividad de fraccionamiento (cleavage). El clonaje de p(+)MV empezó por hibridación de dos oligonucleótidos complementarios internamente #191 (5'-ggggaaccatcgatggataagaatgcggccgcaggtac-3') y #192 (5'-ctgcggccgcattcttatccatcgatggttccccgc-3') proporcionando un polienlazante corto que lleva los sitios de restricción para SacII, ClaI, NotI, y KpnI. Este nuevo polienlazante reemplazó el fragmento SacII-KpnI en pBloT7 derivado a partir de pBluescript KS (+) (Stratagene) conteniendo el promotor T7 fusionado con el sitio NsiI (Kaelin, 1989) así formando el plásmido pB1oT7NSCNK. Para clonar en el 5'-terminal 2041 pb del antigenoma MV (hasta el sitio SacII), una digestión NsiI se siguió con tratamiento con la polimerasa Klenow en presencia de todos los cuatro dNTP. Esto creó un sitio de clonaje de extremo romo limpiando la parte no transcrita de la secuencia del promotor T7. Un fragmento MV conteniendo nucleótidos 1-2078 se generó a partir del fragmento de 3351 pb PvuI de peuMV(-) por amplificación en PCR utilizando los cebadores #182 (5'-ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGATAG-3', MV(+) 1-25), y #183 (5'-CAGCGTCGTCATCGCTCTCTCC-3 MV(-) 2077-2056). Nótese que el residuo A adicional en posición MV(+) 30 (Sidhu et al., 1995) derivado a partir de la secuencia MV de peuMV(-) se suprimió posteriormente por PCR mutacional. Después de tratamiento con SacII, el fragmento MV se ligó en el vector para proporcionar pT7MV (+) 5' . A continuación, el extremo 3’ del antigenoma se unió a la secuencia de D seguido corriente abajo por TØ. El fragmento 3’ MV (nucleótidos 14907-15894) se generó a partir del fragmento PvuI de 14046 pb de peuMV(-) por amplificación con PCR utilizando los cebadores #186 (5'-GAGAAGCTAGAGGAATTGGCAGCC-3'; MV(+) 1490714930) y #187 (5'-ttctgaagactcACCAGACAAAGCTGGG-3', MV(-) 15894-15879). Otra amplificación por PCR en el plásmido peu3aDTØ con los cebadores #184 (5'-ataagaatgcggccgcatccggatatagttcctcc-3') y #FR4 (5'ttctgaagactcTGGTggccggcatggtcccag-3', MV(+) 15891-15894) proporcionó el ribozima genómico HDV unido al TØ. Ambos cebadores #FR4 y #187 contienen próxima a su extremo 5' la secuencia de reconocimiento para BbsI que crea un extremo cohesivo en ambos fragmentos comprendiendo los cuatro nuclótidos MV 3'-terminales (MV(+) TGGT). Después de las digestiones del fragmento 3' MV con ClaI y BbsI, del fragmento D/TØ con Bbsl y NotI, y de pT7MV (+) 5' con ClaI y NotI, una ligación de tres vías proporcionó el plásmido pT7MV(+)5'3'DTØ. El último paso para generar p(+)MV fue rellenar los nucleótidos 2044-14937 MV antigenómico restantes con una ligación a tres vías. El fragmento SacII-PacI (nucleótidos MV(+)2044-7242) y el fragmento Pacl-ClaI (nucleótidos MV 7243-14937 se liberaron del plásmido peuT7MV (-). Estos dos fragmentos se ligaron en el pT7MV(+)5'3'DTØ del cual se había retirado el polienlazante restante (SacII-ClaI). El plásmido p(-)MV (Figura 2) se construyó de forma similar. La actividad de auto-fraccionamiento de D se demostró detectando los fragmentos pequeños 3’ esperados in vitro hechos RNA en un gel de 5% poliacrilamida/7M urea. Para generar p(+)MVL5F que lleve una delección en el nt-504 (MV (+)4926-5429) en la región no codificante 5' del gen F, primero se hizo una PCR del plásmido pAeFl (Huber, 1993) utilizando los cebadores #88 (5'-CcGAATCAAGACTCATCCAATGTCCATCATGG-3', MV(+) 5430-5461) y #89 (5'-AGAGAGATTGCCCCAATGGATTTGACCG-3', MV(-) 5550-5523). El fragmento PCR digerido con HpaI
reemplazó el fragmento NarI-HpaI en pAeFl. El fragmento NarI-PacI de este vector luego reemplazo el correspondiente fragmento en p(+)MV.
El esqueleto del vector pEMC-La está basado en pTM1 (Moss et al., 1990) en el que un sitio NcoI se sobrepone con un trinucleótido ATG. Utilizando este ATG como codón de inicio, un marco abierto de lectura insertado en el sitio NcoI es controlado traduccionalmente por el sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (EMC). La secuencia de codificación L de MV unida a una cola de poli(dA) artificial se cogió a partir del vector pAeL (Huber, 1993) en dos pasos: primero, un fragmento de 450 pb conteniendo los nucleótidos 9234-9530 de MV generado por PCR utilizando los cebadores #194 (5'-gtggatccATGGACTCGCTATCTGTCAACC3', MV(+) 9234-9255) y #195 (5'-AGTTAGTGTCCCTTAAGCATTGGAAAACC-3', MV(-) 9630-9602); segundo, un fragmento de 6265 pb comprendiendo los nucleótidos 9572-15835 de la secuencia del gen L MV unida a la cola de poli(dA) se extirpó con EcoRI. Después de retirar la parte NcoI-EcoRI del polilinker en pTM1 y digerir el fragmento PCR también con NcoI y EcoRI, una ligación de tres vías incluyendo el fragmento EcoRI de 6265 pb proporcionó pEMC-La.
Para eliminar el promotor T7 localizado a 5' del promotor CMV /potenciador en los vectores pSC-N y pSC-P (Huber et al., 1991), pSC6-N y pSC6-P se construyeron sustituyendo un fragmento PvuI-EcoRI con el correspondiente fragmento de pSP65 (Promega). pSC6-T7 se generó por intercambio del gen N inserto en pSC6-N por el fragmento que lleva el gen de la RNA polimerasa T7 de pAR 1173 (Davanloo et al., 1984). pSC6-T7-NEO se construyó por ligación del cassette promotor fosfoglicerolquinasa – resistencia a neomicina (Soriano et al., 1991) en el único sitio AvrII de pSC6-T7 utilizando oligodeoxiribonucleótidos de unión apropiados. Todos los sitios de clonaje se verificaron por secuenciación.
EJEMPLO 4: TRANSFECCIÓN de PLÁSMIDOS y RECOGIDA de PRODUCTOS del GEN MARCADOR
Las células se sembraron en un pocillo de 35 mmm para conseguir ~50-70% de confluencia cuando son transfectados. 3-8 h antes de la transfección, el medio se reemplazó con 3 ml de DMEM que contenía 10% FCS. G418 se omitió de aquí en adelante debido a su efecto tóxico durante la transfección. Todos los plásmidos se prepararon de acuerdo con el kit de preparación de plásmido QIAGEN. El protocolo para la coprecipitación Ca2+ con fosfato del DNA se adaptó a partir de Rozenblatt et al. (1979). Los plásmidos (2-10 μg por pocillo de 35 mm) se diluyeron con 300 Dl de tampón de transfección 1x (137 mM NaCl, 4,96 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4, 5,5 mM dextrosa, 21 mM HEPES pH 7,03). Se añadió solución CaCl2 1M a una concentración final de Ca2+ de 125 mM, y la mezcla se incubó a 20°C durante 30-120 min. Los coprecipitados se añadieron gota a gota al cultivo y la transfección se llevó a cabo a 37°C y CO2 5% durante ~15 h. Luego, el medio de transfección se reemplazó con 3 ml de DMEM que contenía 10% FCS. Los productos de los genes marcadores se recogieron 24-37 h después de la transfección. Las células se lavaron y se lisaron con tampón de lisis Reporter (Promega), y se hicieron ensayos CAT y luciferasa siguiendo el protocolo del proveedor.
EJEMPLO 5: DESARROLLO EXPERIMENTAL PARA RESCATAR MV
Células 293-3-46 preparadas para la transfección como se describe anteriormente se transfectaron con 5 μg del plásmido que aloja el DNA MV antigenómico en presencia o ausencia de 1-100 ng del plásmido especificando el mRNA L MV. Los primeros sincitios aparecieron alrededor de los 2-3 días después de la transfección cuando las células eran aún subconfluentes. Para permitir que la formación de sincitios progrese más rápidamente, monocapas de células casi confluentes de cada pocillo de 35 mm se transfirieron en una placa de 75 cm2. Cuando estos cultivos alcanzaron la confluencia, las célula se rasparon en el medio y se sometieron una vez a congelación y descongelación. Los sobrenadantes clarificados se utilizaron para infectar monocapas de células Vero ya sea por crecer reservas de virus o para recoger RNA total para análisis.
EJEMPLO 6: RT-PCR, SECUENCIACIÓN, NORTHERN BLOT, WESTERN BLOT, INMUNOFLUORESCENCIA
Para RT-PCR seguida de secuenciación, las células Vero se infectaron con suspensiones víricas clarificadas ya sea recogidas a partir de cultivos de rescate o a partir de pases posteriores, y el RNA total se aisló de acuerdo con Chomczynski y Sacchi (1987). 2 μg de RNA total se hibridaron primero con 10 pmol o 1 nmol de cebadores hexaméricos al azar calentando hasta 80°C durante 1 min y luego rápidamente enfriados en hielo. Se llevaron a cabo transcripciones reversas con 200 U de MMLV-RT (GISCO BRL) en presencia de dNTP 1mM en un tampón que contiene Tris-HCl 20 mM pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, albúmina de suero bovino 0,1 mg/ml, y 1 U RNAsin (Promega). Las mezclas se mantuvieron a 20°C durante 10 min, se incubaron a 42°C durante 1 h, y se terminaron calentando a 95°C durante 10 min. 1/10 de los volúmenes de reacción se utilizó como patrón para la amplificación por PCR con los cebadores #59 (5'-ACTCGGTATCACTGCCGAGGATGCAAGGC-3', MV(+) 1256-1284) y #183 (5'-CAGCGTCGTCATCGCTCTCTCC-3', MV(-) 2077-2056). Después de 40 ciclos, los fragmentos de 822 pb se aislaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN). Las reacciones de secuencia se hicieron de acuerdo con el protocolo de amplificación lineal (Adams y Blakesley,
1991). El cebador #76 (5'-ctaGCCTACCCTCCATCATTGTTATA AAAAACTTAG-3', MV(+)1717-1749) se utilizó para el marcaje de la región 5' no codificante del gen P y el cebador #6 (5'-ccggTTATAACAATGATGGAGGG-3', MV()1740-1722) para el marcaje de la región 3' no codificante del gen N.
El RNA celular total para análisis Northern blot se aisló a partir de células Vero utilizando el TRI REAGENT® (Molecular Research Center, Inc.) y RNA poli(A) se purificó utilizando cuentas recubiertas de poliestireno paramagnético super-oligo(dT)25 (Dynal) y un concentrador de partícula magnética. El RNA se sometió a electroforesis en un gel de agarosa 1% en formaldehído conteniendo tampón de desplazamiento 6% y se transfirió a una membrana Hybond-N+ (Amersham) por elusión capilar en 20x SSC. Los filtros se prehibridaron a 42°C durante 4 h. La hibridación se llevó a cabo durante toda la noche a 42°C en 50% (v/v) formamida, NaCl 1M, sulfato dextrano 10% (p/v), 1% SDS, tRNA de levadura (0,1 mg/ml) conteniendo 2x106 c.p.m./ml de una sonda de DNA dATPmarcado [D-32P] preparada con Prime-It II (Stratagene). Los siguientes fragmentos de DNA se utilizaron para cebar al azar: el fragmento SalI-BamHI de 1,4 kb a partir de pSC-M (Huber et al., 1991), el fragmento HpaI-PacI 1,7 kb a partir de pCG-F, y el fragmento 1,6 kb SmaI-XbaI a partir de pSC-H (Huber et al., 1991). pCG, un vector de expresión eucariota que contiene un origen de replicación SV40 y un promotor CMV /potenciador, se construyó por delección del gen L así como el sitio de empalme D-globina corriente abajo de pSC-L. (Huber et al., 1991; Severne et al., 1988) y subsiguiente inserción del sitio de empalme D-globina (a partir de pSGS Stratagene) corriente arriba del nuevo polilinker. El plásmido basado en pCG pCG-F contiene un inserto que consiste en el gen entero F. Los filtros se lavaron en SSC 2x a 20°C durante 10 min y dos veces en SSC 2x, SDS 1% a 65°C durante 30 min. Las bandas se visualizaron por autoradiografia.
Para analizar la expresión de las proteínas N y P de MV por Western blot, las células se lavaron con PBS y los extractos citoplasmáticos se prepararon utilizando 300 μl de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8, 62,5 mM EDTA, 1% NP-40, 0,40 deoxicolato, 100 μg/ml fenilmetilsulfonilfluoruro, y 1 Dg/ml Aprotinina). Alrededor de 1/60 de los lisados totales se corrieron en SDS-8%PAGE y se transfirieron en membranas Immobilon-P. Como primeros anticuerpos, se utilizó ya sea el anticuerpo policlonal de conejo anti-N #179 (gentilmente aportado por C. Oervell preparado de acuerdo con los procedimientos estándar) en una dilución de 6000 veces en TBST (10 mM Tris-HCl pH 7,2-8, 150 mM NaCl, 0,05 Tween 20) o el anticuerpo anti-P policlonal de conejo #178 (Oervell y Norrby, 1980) en una dilución de 3000 veces en TBST. El segundo anticuerpo fue un anticuerpo porcino anti-conejo acoplado con la peroxidasa del rábano picante permitiendo la visualización de las bandas por el kit de quimioluminiscencia potenciada (ECLTM Amersham Life Science, RPN 2106).
Por microscopia inmunofluorescente, células 293-3-46 se sembraron para un experimento de rescate en pocillos de 35 mm con cubiertas de cristal de 24 mm x 24 mm, se cultivaron toda la noche y se transfectaron como se describe anteriormente. 3 días después de la transfección, las células permeabilizaron con acetona: metanol (1:1) y se llevó a cabo inmunofluorescencia indirecta esencialmente como se describe (Hancock et al., 1990; Oervell y Norrby, 1980), excepto que el PBS se suplementó con 1 mM MgCl2 y 0,8 mM CaCl2 y que se omitió el p-fenilendiamina a partir del mountant. Proteínas virales M y H se detectaron utilizando anticuerpos monoclonales murinos anti-M-16BB2 y antiH-I29 (Sheshberadaran et al., 1983) y anticuerpos de conejo anti-IgG [F(ab')2] de ratón acoplados a rodamina (Pierce, 31666).
EJEMPLO 7: PLÁSMIDOS GENÓMICOS y ANTIGENÓMICOS ESPECIFICANDO REPLICONES MINI-, MIDI-, y DE LONGITUD COMPLETA
Los constructos plasmídicos utilizados en este estudio se muestran en la Figura 2. p107MV(-) :CAT y p107MV(+): CAT especifican los RNA sentido genómico y antigenómico, respectivamente, en los que todas las regiones codificantes MV son remplazadas de forma precisa por la región codificante CAT. En células infectadas MV o en células adyuvantes (ver más adelante), dan lugar a los mini-replicones y al mRNA CAT poliadenilado y encapuchado comprendiendo la región no codificante 5'N y la 3'L. p(+)NP:CAT, conteniendo además también las regiones codificantes MV N y P en su contexto de secuencia MV ordinario, da lugar a los midi-replicones. Los RNA genómicos
o antigenómicos de longitud completa o parcialmente deleccionada están especificados por p(+)MVL5F, p(+)MV y p(-)MV : Para todos estos plásmidos, la transcripción con la RNA polimerasa T7 proporcionó RNA conllevando los auténticos nucleótidos del terminal viral genómico y antigenómico, respectivamente (Sidhu et al., 1995). La correcta iniciación se consiguió por fusión directa del promotor T7 (desprovisto de su parte transcrita) con la secuencia genómica y antigenómica. Empezando todos los transcritos con los nucleótidos ACC específicos de MV en lugar de GGG específicos de T7 reduce el RNA proporcionado en alrededor de un orden de magnitud, como se revela en estudios de transcripción in vitro utilizando constructos plasmídicos precursores. Para mediar la formación del termini 3’ MV correcto, la secuencia del ribozima genómico del virus hepatitis delta (Perrotta y Been, 1990) se clonó inmediatamente adyacente a los nucleótidos 3' terminales MV; la introducción de los terminadores T7 incrementó la eficiencia del auto-fraccionamiento.
EJEMPLO 8: CÉLULAS ADYUVANTES EXPRESANDO DE FORMA ESTABLE PROTEÍNA N y P de MV ASÍ COMO RNA POLIMERASA T7
La línea celular 293 de riñón embriónico humano se escogió porqué es altamente permisiva con MV. Además, estas células pueden ser eficientemente transfectadas por el método de la coprecipitación calcio fosfato; del 30 al 60% de
las células se tiñeron de azul a las 24 horas después de la transfección con un plásmido codificante para Dgalactosidasa.
Siguiendo la cotransfección de células 293 con pSC6-N, pSC6-P y pSC6-T7-NEO como se describe en los Ejemplos, alrededor de 100 colonias se expandieron bajo selección con neomicina. La expresión de N y P se cribó por Western blot, y la actividad de la RNA polimerasa T7 se evaluó por transfección con un plásmido marcador conteniendo la región codificante de la luciferasa de luciérnaga bajo control de un promotor T7. Muchos clones expresaron altos niveles de P, pero sólo algunos coexpresaron N eficientemente. La figura 3 muestra la expresión de N y P de dos líneas celulares seleccionadas a niveles comparables a los de células 293 infectadas con MV; la actividad RNA polimerasa T7 detectada en el clon 293-3-46 fue la más elevada entre todos los otros clones mientras que era alrededor de 100 veces inferior en el clon 293-3-64 que resultó no rescatar MV. Una tercera línea celular, 293-3-43, expresando las tres proteínas a niveles comparables con 293-3-46 también fue activa en el rescate.
La expresión de los genes introducidos no redujo la susceptibilidad para la infección MV. La línea celular adyuvante 293-3-46 utilizó principalmente rescate MV, aunque creciendo a una velocidad 2-3 veces más lenta en comparación con la línea 293 progenitora, que probó ser muy estable y completamente funcional después de más de 80 divisiones celulares en diluciones 1:4 a 1:8.
EJEMPLO 9: DESDE EL RESCATE MV MINI-REPLICON USANDO ADYUVANTE MV HASTA EL RESCATE MV USANDO CÉLULAS ADYUVANTES 293-3-46
El sistema de rescate MV se desarrolló paso a paso, permitiendo analizar funcionalmente todos los componentes. Por un lado, MV-dependiente de rescate de mini- y sucesivamente después midireplicones se verificaron por ensayos marcadores CAT. Similarmente, por otro lado, la funcionalidad de las células 293-3-46 se comparó con la ayuda basada en MV descrita antes (Sidhu et al., 1995).
El test de rescate de mini-replicones se muestra esquemáticamente en la Figura 4A. Pequeños transcritos a partir de p107MV(-): CAT, p107MV(+):CAT (Sidhu et al., 1995) y transcritos más largos posteriores, p.ej. generados a partir de p(+)NP:CAT (Figura 2), se comportaron como mini-y midi- replicones, respectivamente. Se encapsidaron, se transcribieron para producir CAT, se replicaron y se empaquetaron en partículas viriónicas para infectar nuevas células. Durante los 2 a 4 primeros ciclos de infección, se amplificaron masivamente mientras que en los ciclos de replicación posteriores de ambos MV y mini-replicones se redujo, como se observa en DI RNA de aparición natural (Re, 1991). Análisis de los RNA amplificados mostraron que los replicones encapsidados y los transcritos de CAT contenían las regiones respectivas terminales específicas MV diferentes (Sidhu et al., 1995). Lo más importante, resultó que para una función eficiente, el número total de nucleótidos de los replicones tenía que ser un múltiple de seis, un requerimiento – llamado como la norma de los seis- previamente encontrado como esencial para RNA SeV DI de tipo copia reversa naturales y ligeramente modificados (Calain y Roux, 1993). La adherencia a esta norma fue crucial para la construcción de plásmidos especificando una variedad de mini- y midi-replicones tales como aquellos mostrados en la Figura 2. Este también fue el caso para clones de longitud completa.
La función adyuvante de los clones celulares transfectados de forma estable se analizó con el proceso representado en la Figura 4B, utilizando sin embargo ya sea el plásmido p107MV(-):CAT, p107MV(+):CAT o p(+)NP:CAT (Figura 2) en lugar de p(+)MV. Como se muestra en la Figura 5, la actividad CAT ascendió en las células transfectadas, aunque en niveles considerablemente más bajos que en las células 293 infectadas con MV y cotransfectadas directamente con RNA mini o midi-replicones. La cotransfección de plásmido pEMC-La codificante de la proteína L MV fue un requerimiento absoluto. Como se esperaba, se detectó poca actividad CAT de fondo cuando se utilizó el constructo replicón de sentido positivo. Los dos constructos que contienen sólo el marco de lectura CAT en el sentido más- y menos- evocaron casi cantidades iguales de actividad CAT; el constructo midi-replicón dio aumento a aproximadamente 100 veces menos actividad CAT que el mini-replicón.
El protocolo de transfección se optimizó en términos de la máxima actividad CAT obtenible, utilizando plásmidos mini- y midi-replicón. Luego, se analizaron los constructos de longitud completa p(+)MV y p(-)MV. Alrededor de 106 células contenidas en cada pocillo de 35 mm se transfectaron y estimamos que alrededor de una decena de éstas realmente recibieron plásmidos de longitud completa así como los L codificantes. Normalmente, siguiendo a la cotransfección de p(+)MV y pEMC-La, de 1 a 6 sincitios se desarrollaron después de 2 a 3 días en cada pocillo. No se encontraron sincitios cuando el último se omitió o cuando se utilizó el plásmido p(-)MV. Los experimentos de rescate se llevaron a cabo por diferentes experimentadores utilizando diferentes preparaciones de DNA. La eficiencia fue ligeramente viable, pero como mínimo el 30% de los pocillos transfectados revelaron rescate. La figura 6 muestra sincitios típicos formados en estos experimentos, visualizados ya sea directamente (fase de contraste, 6A)
o después de la fijación de las células crecidas en cubreobjetos (fase de contraste, 6B, o inmunofluorescencia de la misma área, 6C).
EJEMPLO 10: CARACTERIZACIÓN DE MV RESCATADO
Primero, tiene que ser verificado que el MV rescatado contiene el marcador genético que ha sido introducido en los clones plasmídicos de longitud completa MV. El marcador de 3 nt indicado en la Figura 2 originado a partir de una
región limitante no codificante para el gen N/P una variante de 176 nt (NCGB) recuperado a partir del MV derivado de SSPE replicando en células IP-3-Ca (Ballart et al., 1990). Los virus de rescate se amplificaron en células Vero, ya sea directamente a partir de las células transfectadas o después de purificación en placa; los productos recuperados por transcripción reversa seguida por reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) se analizaron por secuenciación cíclica. La figura 7 muestra un ejemplo de estos análisis, revelando que el marcador AG en lugar de CA en la cepa Edmonston B pasado en nuestro laboratorio.
No se analizó la secuencia entera de los MV rescatados para excluir cualquier error introducido ya sea durante el ensamblaje de los clones plasmídicos antigenómicos o durante la transcripción de la RNA polimerasa T7 en la fase de rescate. Sin embargo, pudieron ser detectados mayores cambios nocivos analizando el comportamiento de replicación de los virus rescatados en comparación con el de la cepa Edmonston B. La Figura 8 muestra que tanto la velocidad de replicación así como los títulos finales conseguidos en experimentos repetidos fueron indistinguibles entre virus individuales normales purificados en placa (MV EdB) y rescatados (MV marcado EdB). La distinción aparente al día I después de la infección no fue una observación consistente. Reservas de virus no purificados en placa dieron resultados similares.
EJEMPLO 11: MV CARENTE DE 504 NUCLEÓTIDOS EN LA REGIÓN NO CODIFICANTE 5' DEL GEN F
Como primera aplicación del sistema genético reverso, nosotros deleccionamos 504 nucleótidos, así generando un genoma acortado compatible con la norma de los seis mencionada anteriormente. Esto eliminó casi por entero el segmento gen F de la enigmática NCGB M/F larga no codificante que es típica para MV y para otros morbillivirus, mientras que representantes de otros dos géneros de la subfamilia Paramyxovirinae, paramyxovirus y rubulavirus, contienen sólo una NCGB corta. Remarcablemente, fue viable y aún más se replicó en cultivos celulares a una velocidad indistinguible del de, Edmonston B y la cepa MV rescatada no deleccionada (Figura 8, MVL5F EdB). Para determinar el tamaño de RNA derivados del gen F, el mRNA específico de MV inducido por estos virus purificados en placa se analizó, utilizando sondas específicas para el gen F y para los genes M y H situados corriente arriba y corriente abajo de F, respectivamente. Ciertamente, como se muestra en la Figura 9, el mRNA F así como los RNA bicistrónicos de MF y FH son consistentemente más cortos en células infectadas con la variante MVL5F EdB.
EJEMPLO 12: MV expresando actividad CAT
Para explorar la factibilidad para expresar proteínas extrañas a partir de MV modificado, insertamos un marco de lectura CAT flanqueado por regiones intercistrónicas en la secuencia de cDNA antigenómica de MV; se analizaron dos posiciones, por un lado entre la N y la P y por el otro lado entre el gen H y el L (Figura 10, p(+)MPCATV y p(+)MHCATV, respectivamente). La región intercistrónica flanqueando el marco de lectura CAT se diseñó de acuerdo a la región limitante del gen N/P intercistrónica, pero contiene sitios de restricción únicos en el plásmido entero, adecuado para posteriores manipulaciones. A partir de estos constructos, MV recombinantes expresando actividad CAT se rescataron con casi la misma eficiencia que a partir de los constructos estándar y los deleccionados p(+)MV y p(+)MVL5F, respectivamente. Como se esperaba a partir del gradiente de transcripción natural típico para todos los Mononegavirales, p(+)MHCATV expresó de alguna forma menos actividad CAT que p(+)MPCATV. Más importante, la expresión CAT de los virus recombinantes parece ser remarcablemente estable como se reveló a partir de los experimentos mencionados en la leyenda de la Figura 12 en la que se consiguió una amplificación global de los virus recombinantes de cómo mínimo 1030. Nosotros realmente habíamos esperado que el virus rescatado a partir de p(+)MPCATV sería menos estable que aquellos a partir de p(+)MHCATV, porque en el primero la transcripción de todos los genes tras el CAT insertado se esperaba ser más baja mientras que en el último sólo la transcripción del gen L debería ser más baja. Aparentemente, la posición del inserto no afecta de forma importante la viabilidad de los virus rescatados. Sin embargo, no se han llevado a cabo aún experimentos comparativos con MV estándar. Además, se espera que los virus recombinantes que expresan proteínas que interfieren activamente con la replicación MV resultaran mantener el gen insertado de forma menos estable.
Debería ser mencionado aquí que la inserción de una secuencia codificante extraña dentro de los genes de MV existentes debería ser menos nociva para la replicación viral que por creación de nuevas unidades de transcripción como en los constructos discutidos anteriormente. La incapacidad general de la maquinaria de transcripción eucariótica para expresar más de un marco de lectura a partir de un mRNA puede en principio ser superada por (como mínimo) dos dispositivos: el mecanismo de parada/reinicio y sitios de entrada ribosomales internos (IRES). Ambos mecanismos son de hecho utilizados en casos especiales para la expresión de proteínas naturales. Un ejemplo del primero es representado por la traducción del polipéptido M2 en el virus Influenza B (Horvath, C.M., Williams, M.A., y Lamb, R. A. (1990) Eukaryotic coupled translation of tandem cistrons; identification of the Influenza B virus BM2 polypeptide. EMBO J. 9, 2639-2947). Para el segundo mecanismo, existen muchos precedentes naturales reconocidos, el más notable el IRES de Picornaviridae (Sonenberg, N. (1990) Poliovirus translation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1.61, 23-47), pero también IRES en mRNA celular tal como aquél especificando BiP (Sarnow, P. (1990) Translation of glucose-regulated protein 78/immunoglobulin heavy-chain binding protein mRNA is increased in poliovi-rus-infected cells at a time when capdependent translation of cellular RNA is inhibited). Todos estos tipos de dispositivos citados han sido explorados en el contexto de los genes MV N y H, utilizando regiones codificantes corriente abajo de los marcos de lectura N y H MV aquellos proporcionando CAT y luciferasa de luciérnaga, respectivamente, como marcadores. Los constructos bicistrónicos completos se expresaron a partir de
plásmidos de expresión convencional en células de primate y se obtuvieron rendimientos de las proteínas marcadoras en un rango entre 10 y 100% en comparación con las proteínas codificadas por el marco de lectura corriente arriba (Diploma theses, University de Zürich, composed by A. Cathomen(1991) y 0. Peter (1992)).
EJEMPLO 13: Quimera MV portando la proteína de cubierta VSV
Para explorar la factibilidad de rescatar quimeras Mononegavirales genéticamente estables en los que las proteínas de la cubierta de un virus son reemplazadas por las de otro virus se construyeron p(+)MGV y pMG/FV (Figura 10). En el constructo anterior las regiones codificantes enteras F y H de MV se reemplazaron por aquellas que codifican la proteína G VSV que satisface una unión a receptor y una función de fusión análogas a aquellas de les proteínas H y F de MV, respectivamente. El último constructo se diseñó tal como es creada una proteína de fusión conteniendo la parte exterior grande y la región transmembrana a partir de la proteína G VSV fusionada a la cola citoplasmática de la proteína F MV que se piensa que interacciona específicamente con la proteína M de MV. Ciertamente, podrían ser recuperados virus quiméricos a partir de ambos constructos que podrían ser distinguidos de cada uno sólo por efectos citopáticos ligeramente diferentes (que son ambos drásticamente diferentes de aquellos evocados por MV) y por el hecho que en células infectadas por el virus rescatado a partir del último constructo la proteína de fusión podría ser revelada por Western blot no sólo por anticuerpos dirigidos al exodominio G VSV sino también por anticuerpos dirigidos contra la cola citoplasmática de F MV. Ambas quimeras se replicaron, como se determinó por diluciones a punto final, hasta títulos razonablemente altos sólo alrededor de un orden de magnitud menor que los títulos obtenidos por MV. Además, mostraron las especificaciones biológicas esperadas: infectan fácilmente células de roedores (que no expresan receptores MV) tales como BHK (Figuras 11, 12) dónde forman abundantes RNP citoplasmáticos y nucleares típicos para MV (Figura 11) así como partículas pleomórficas parecidas a viriones MV (Figura 12) completamente diferentes de viriones VSV de tipo caparazon o cigarro (Figura 13) que se creen formados de forma primaria por la proteína M VSV.
Considerando el hecho que MV y VSV son Mononegavirales sólo relacionados a mucha distancia y además pertenecen a familias diferentes (Paramyxoviridae y Rhabdoviridae, respectivamente), parece posible que muchas quimeras diferentes que impliquen Mononegavirales relacionados de forma más próxima pueden ser creadas y no parece inverosimil que también pueden ser desarrolladas quimeras que contengan proteínas de cubierta con receptores celulares particulares como diana.
EJEMPLO 14: MV Expresando Proteína Fluorescente Verde (GFP)
Para demostrar que otros genes aparte del gen CAT pueden ser expresados en un vector recombinante de acuerdo con la presente invención, la secuencia codificante para GFP (Chalfie et al. Science 263 (1994), 802-805) se insertó en la misma posición que el gen CAT en el vector p(+)MPCATV, resultando en un vector recombinante p(+)MPGFPV; ver Fig. 10C.
Además, la secuencia codificante GFP se insertó corriente arriba del gen N dando lugar al vector recombinante P(+)MGFPNV (Fig. 10C) asegurándose que la norma de los seis no se violaba y utilizando en principio un segmento tipo gen limitante como para los constructos CAT. De hecho, de esta forma se consiguió una expresión particularmente fuerte de la GFP como se detectó por evaluación visual de la proteína expresada. Fue incluso posible expresar dos secuencias codificantes extrañas al mismo tiempo en un constructo recombinante como se ha demostrado con MV expresando dos copias de GFP en posiciones diferentes.
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LISTADO DE SECUENCIAS
(1)
INFORMACIÓN GENERAL:
(i)
SOLICITANTE:
(A)
NOMBRE: Suiza. Serum- & Impfininstitut Berna
(B)
CALLE: Postfach 2707
(C)
CIUDAD: Berna
(E)
PAIS: Suiza
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 3001
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: cDNA correspondiente al antigenoma de virus RNA de cadena negativa no segmentada, y proceso para la producción de tales virus codificantes de proteínas antigénicamente activas adicionales
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
(iv)
FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
(D)
PROGRAMAS: PatentIn Release #1.0, Versión #1.0 (EPO)
(v)
DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: NUMERO DE SOLICITUD: EP 95 11 2559.0
(2)
INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:1
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 82 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucléico
(A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 1
(2)
INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:2
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(2)
INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:3
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucléico
(A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 3
(2)
INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:4
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucléico
(A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 4
(2)
INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:5
(A) LONGITUD: 38 PARES DE BASES
5
(B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucléico
(A) DESCRIPCIÓN:
/ desc = “oligonucleótido”
15
(iii) HIPOTETICA: SI (iv) ANTI-SENTIDO: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 2
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 10 (A) LONGITUD: 22 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucléico 20 (A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 5
30 (2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:6
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple 40 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO 50 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 6
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:7
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases 60 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 7
15 (2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:8
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple 25 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO 35 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 8
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:9
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases 45 (B) TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico
(A)
DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido” 55 (iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 9
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:10
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 32 aminoácidos 5 (B) TIPO: aminoácido
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico
(A)
DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido” 15 (iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 10
(2)
INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:11 25 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal 35 (ii) TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 11
(2)
INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:12
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTISENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 12
(2)
INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:13
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 29 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico 15 (C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico
(A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI 25 (iv) ANTISENTIDO: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 13
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:14
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 35 (A) LONGITUD: 29 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico 45 A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTISENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 14
55 (2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:15
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA:simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico
60 5
A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI 10 (iv) ANTISENTIDO: NO
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 15
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:16
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 23 pares de bases
(B)
TIPO: ácido nucleico
(C)
CADENA: simple
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA : otro ácido nucleico 30 A) DESCRIPCIÓN: / desc = “oligonucleótido”
(iii) HIPOTETICA: SI
(iv)
ANTISENTIDO: NO
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 16

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para la producción de un virus RNA infeccioso de cadena negativa no segmentada de la familia Paramyxoviridae que comprende
    (a)
    introducir una molécula de cDNA contenida en un plásmido, en dónde dicha molécula de cDNA contiene la secuencia entera de la cadena (+) de dicho virus RNA de cadena negativa operativamente unido a una secuencia de control de expresión, que permite la síntesis de transcritos de RNA anti-genómicos que llevan la terminación 3' auténtica, y en dónde dicha molécula de cDNA consiste de un número entero múltiple de seis nucleótidos y en el que el replicón especificado por dicha molécula de cDNA contiene un número entero multiple de seis nucleótidos, en una célula adyuvante que expresa una polimerasa de RNA, preferiblemente RNA-polimerasa T7, una proteína N y una P, preferiblemente del virus a ser rescatado, en el que dichas proteínas están expresadas a partir de plásmidos de expression transfectados de forma estable y, además, una proteína L, preferiblemente del virus a ser rescatado, codificado por un cDNA ya sea introducido transitoriamente o de forma estable en dicha célula; y
    (b)
    recuperar el virus de RNA de cadena negativa no segmentada infeccioso ensamblado.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en dónde la secuencia de control de expresión de 1(a) es un promotor RNA polimerasa.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1 o 2, en dónde dicho plásmido contiene un fragmento de DNA expresable que reemplaza una región de DNA homóloga de dicha molécula de cDNA.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 1 o 2, en dónde dicho plásmido contiene un fragmento de DNA expresable que proporciona información genética adicional.
  5. 5.
    El método de la reivindicación 1 o 2, en dónde dicho plásmido contiene un fragmento de DNA expresable que reemplaza una región de DNA heteróloga DNA de dicha molécula cDNA.
  6. 6.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en dónde dicho plásmido es caracterizado en que el fragmento de DNA expresable es insertado en una región de dicho cDNA codificante para una proteína viral, siendo efectuada dicha inserción de forma que se mantenga el marco de lectura, preferiblemente para crear una proteína de fusión, y permitiendo la expresión de dicho fragmento de DNA bajo el control de las secuencias señales de dicha proteína viral.
  7. 7.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en dónde dicho plásmido es caracterizado en que el fragmento de DNA expresable se expresa de tal manera corriente abajo de una región codificante de proteína viral para evitar la formación de una proteína de fusión, pero a pesar de todo permitiendo la expresión de la secuencia codificante corriente abajo ya sea por un mecanismo parada/reinicio dónde el último residuo A del triplete de terminación corriente arriba coincide con aquella del codón de inicio de la región codificante corriente abajo, o colocando un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) entre las dos regiones codificantes.
  8. 8.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en dónde dicho plásmido es caracterizado en que el fragmento de DNA expresable es insertado en una región no codificante de dicho cDNA, preferiblemente en la región o terminación 5', y flanqueada por secuencias señales virales o secuencias señales heterólogas controlando la expresión del fragmento RNA especificado por dicho fragmento de DNA.
  9. 9.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en dónde dicho plásmido comprende una secuencia ribozima genómica inmediatamente adyacente al nucleótido terminal 3' de dicha molécula de cDNA y opcionalmente corriente abajo de dicha secuencia ribozima genómica como mínimo un terminador, preferiblemente el terminador T7.
  10. 10.
    El método de la reivindicación 9, en dónde dicha secuencia ribozima genómica es la secuencia ribozima genómica del virus delta de la hepatitis.
  11. 11.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en dónde dicho plásmido es capaz de replicarse en un huésped procariota o eucariota.
  12. 12.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, en dónde dicho fragmento DNA expresable de dicho plásmido es un fragmento DNA siendo homólogo o heterólogo con respecto al virus RNA de cadena negativa y codificante de como mínimo un epítope inmunogénico.
  13. 13.
    El método de la reivindicación 12, en dónde dicho fragmento de DNA expresable de dicho plásmido codifica como mínimo un epítope inmunogénico de como mínimo un patógeno, preferiblemente una proteína de cubierta, como mínimo un producto génico carente en individuos defectivos genéticamente o tóxico por células malignas diana.
  14. 14.
    El método de la reivindicación 13, en dónde dicho fragmento de DNA expresable de dicho plásmido es un virus, una bacteria, o un parásito.
    5 15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 14, en dónde dicho fragmento de DNA expresable de dicho plásmido codifica un epítope inmunogénico siendo capaz de promover una respuesta inmune protectiva.
  15. 16.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en dónde dicho virus RNA de cadena negativa es el virus del sarampión o el virus de las paperas.
  16. 17.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en dónde dicha célula adyuvante dichos genes codificantes de las proteínas N, P y L son derivados a partir del virus del sarampión o de las paperas.
  17. 18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en dónde dicha célula adyuvante es a partir de la línea 15 celular de riñón embriónico humano 293 (ATCC CRL 1573).
  18. 19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en dónde la proporción del plásmido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y el plásmido que contiene DNA codificante de la proteína viral L es alrededor de 1000:1.
  19. 20.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en dónde dicha recuperación de dicho virus se consigue directamente a partir del cultivo de célula adyuvante transfectada después de la formación de sinci-tios.
  20. 21.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en dónde dicha recuperación de dicho virus se consigue
    25 después de mezclar la célula adyuvante transfectada con otras células competentes de ser infectadas y capaces de replicar dicho virus.
    día post-infección
    sonda M sonda Fsonda H
    Fotografía al microscopio electrónico de células BHK infectadas con agente de replicación rescatado de p(+)MGV Fotografía al microscopio electrónico de células BHK infectadas con agente de replicación rescatado de p(+)MGV
    Fotografía al microscopio electrónico de células BHK infectadas con VSV: Partículas de virión VSV (magnificación 41.700x)
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