CN103906843B

CN103906843B - 双质粒哺乳动物表达系统

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Publication number: CN103906843B
Application number: CN201280038895.7A
Authority: CN
Inventors: 维什瓦斯·乔希
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2032-06-08
Also published as: CN103906843A; IN2013MN02050A

Abstract

反向工程提供了研究RNA病毒感染的病理学的新方法、合成重组病毒和开发疫苗的新的更有效的手段，并且还证明了RNA依赖性RNA聚合酶RDRP系统作为表达系统的通用性和效率。然而，目前使用的方法需要全套复杂的、难以使用的工具。本发明描述了一种基于更简单质粒的哺乳动物的表达系统，其利用RDRP酶活性用于表达重组蛋白或来自病毒小基因组的RNA以及从编码负链RNA病毒的整个基因组的cDNA拯救重组病毒。该系统将可用于表达重组蛋白、包括反义RNA和/或选择性干扰RNA的治疗性RNA分子和核酶。该系统还可用于基因治疗以及制备用于生产新疫苗的重组病毒。

Description

双质粒哺乳动物表达系统

技术领域

本发明涉及双质粒哺乳动物表达系统。此外，本发明涉及重组蛋白和病毒的生产。此外，本发明涉及结合用于重构负链RNA病毒的核糖核酸(RNA)依赖性RNA聚合酶的方法的哺乳动物表达系统以及其作为用于生产蛋白、RNA分子和重组病毒的哺乳动物表达系统的开发。

背景技术

分子生物学和基因工程的进步推动了“反向遗传学”的发展，其为一种由病毒基因组的克隆的互补DNA(cDNA)拷贝产生重组病毒的方法。它有助于理解涉及病毒减毒、组织嗜性毒力因子(tissue tropism virulence factors)的分子决定因素，并且近年来，通过操纵其cDNA能够易于修饰病毒基因组加快了病毒疫苗的开发。反向遗传学使生产具有减毒突变的重组病毒或表达外源性基因的嵌合病毒用于作为新病毒疫苗或治疗剂使用成为可能。

麻疹病毒(麻疹病毒和牛瘟病毒)

MV和RPV是副粘病毒科麻疹病毒属的成员。它们的遗传信息编码在反义极性的单链RNA基因组上并分别包含15894(MV)个和15882(RPV)个核苷酸。它们的基因组具有分别称为前导和尾随的独特的高度保守的3’端和5’端并编码由相似保守的基因间序列分隔的6个基因——N(核壳体蛋白)、P(磷蛋白)、M(基质蛋白)、F(融合蛋白)、H(血凝素)、和L(大蛋白＝聚合酶)。在被感染的细胞中，病毒RNA依赖性RNA聚合酶(RDRP)由其存在于前导序列中的启动子起始转录基因组RNA并产生信使核糖核酸(mRNA)分子，该mRNA分子由细胞核糖体翻译成相应的蛋白。在病毒生命周期的某些点(时刻)处以及合成足够汇集的病毒蛋白后，RDRP酶转变模式并从存在于基因组RNA的前导序列中的另一个启动子起始复制。虽然对调节转录的起始或病毒RNA的复制以及在基因边界处的转录开始和停止的确切机制知之甚少，但是一般在大多数负链RNA病毒并且特别是在MV和RPV的情况下，用作用于转录和复制的启动子的保守序列以及在各基因边界指示转录开始和停止的序列被明确定义。公认的是将这些序列添加到任何不相关的RNA分子形成可以由其同源RDRP转录和复制的“病毒基因组样复制子”。

MV引起婴幼儿急性发热疾病。可通过接种疫苗有效控制其流行。包括Schwartz、Moraten和Edmonston-Zagreb株在内的大多数目前使用的活减毒疫苗通过非人体细胞中的多个通道(Enders，1962)衍生自原始的Edmonston株(Enders和Peebles，1954)。然而，根据世界卫生组织(WHO)估计，每年一百万主要在发展中国家的幼儿死于麻疹。但是近年来未完全遵守疫苗接种的发达国家如美国已出现麻疹相关死亡例(Clements和Cutts，1995)。对于包括未来趋势的MV疫苗学的最近讨论参见Norrby(1995)。在过去的60多年里，已有超过7亿儿童接种过麻疹疫苗，且麻疹疫苗被证明是高效的，通常提供对于MV再感染的终身免疫。

RPV引起牛瘟——一种牛、水牛或其他野生物种的病毒性传染病，主要发生在印度、非洲和其他热带国家。其特征为发热、口腔糜烂、腹泻、淋巴坏死及高死亡率。两种疫苗——Plowright(Plowright和Ferris，1962)和Lapinized(Scot 1963)已被广泛用于保护对抗牛瘟。由RPV的RBOK株的减毒衍生出的Plowright疫苗被证明是最有效的(Baron等人，2005)。到2000年，广泛使用这些疫苗帮助包括印度在内的几个国家根除了RPV。然而，其在2003年的再度出现导致牛和其他易感动物重新开始大规模接种疫苗(Kock等人，2006)。

这些疫苗安全性和有效性的证明支持它们作为用于表达外源性基因的理想的载体。反向遗传学提供用于开发在人或动物内用作潜在对抗不相关疾病的疫苗和/或治疗剂的重组MV或RPV的有效手段。

在1981年在脊髓灰质炎病毒的案例中由Racaniello和Baltimore首次将反向遗传学用于产生RNA病毒。随后，使用由T7或T3 RNA聚合酶(Racaniello,V.R.&Baltimore,D.,1981)从克隆的cDNA生产的合成RNA产生数个其他的正义RNA病毒。然而，证明更难产生负链RNA病毒。与正链RNA病毒不同，负义(反义，negative sense)病毒的基因组不能被宿主细胞翻译且无传染性。它必须以包含核蛋白质和病毒RDRP蛋白的核蛋白(RNP)复合体的形式提供以容许其转录和复制以及随后的病毒形成。Enami等人(1990)开发了第一个反向遗传学系统来生产流感病毒(其由9个基因组RNA亚单元组成)。它的RNP尺寸小且可在体外由RNA和所需的病毒蛋白(N和聚合酶组件)组装。最初，使用携带报告基因——嵌入流感病毒基因组亚单元的病毒非编码末端序列的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)序列的人工RNA(Luytjes等人，1989)。随后，也使用在体外从克隆的DNA转录的单个真实的(authentic)或改变的基因组亚单元RNA(Enami和Palese，1991)。由于分别被CAT产量和流感病毒的拯救监控，组装的RNP在转染到流感感染的细胞中时复制并转录。在一些情况下可以通过选择实现从大量过量的非再分类病毒(non-reassorted virus)纯化包含引入的亚单元的病毒，例如，使用直接抵抗由辅助病毒的同源亚单元编码的蛋白的特异性中和抗体。

非节段(non-segmented)负链RNA病毒(单股反链病毒目，Mononegavirales)的RNP除N蛋白外还包含组装和聚合酶辅因子磷蛋白(P)以及病毒RNA聚合酶(大蛋白L)，并更难以在体外由合成RNA和单独的蛋白质组装。因此，许多研究员倾向于使用包含病毒生命周期期间产生的病毒基因组必要序列的更小的亚基因组RNA(病毒小基因组)。然后它们被人工转录的RNA分子替代，该RNA分子来自包含报告基因和病毒必要非编码序列(复制子)的DNA结构。对于仙台病毒(Park等人，1991)、仙台病毒(SeV)、呼吸道合胞体病毒(Collins等人，1993；Collins等人，1991)、人类副流感病毒3(Dimock和Collins，1993)、狂犬病病毒(RV)(Conzelmann和Schnell，1994)和MV(Sidhu等人，1995)实现了此类携带CAT编码序列和病毒必需非编码末端序列的复制子的复制。

使用类似的系统来从在T7RNA聚合酶启动子控制下的病毒基因组的全长cDNA的克隆彻底拯救水泡性口炎病毒(VSV)(Lawson等人，1995；Schnell等人，1994)和狂犬病病毒(RV)。由被T7RNA聚合酶启动子控制的蛋白质表达质粒提供包括核蛋白质(NP)的病毒聚合酶复合体组件。不久，对于水泡性口炎病毒(Whelan等人，1995)、麻疹病毒(Radecke等人，1995)、呼吸道合胞体病毒(Collins等人，1995)、仙台病毒(Garcin等人，1995；Kato等人，1996)、牛瘟病毒(Baron&Barrett，1997)、人类副流感病毒(Hoffman等人，1997；Durbin等人，1997)、猿猴病毒(simianvirus)(He等人，1997)、新城疫病毒(Peeters等人，1999)和人类严重急性呼吸综合征冠状病毒(Yount等人，2003)，其他研究员也报道了从克隆的基因组cDNA产生非节段负义RNA病毒。

这些验证以及RNA依赖性RNA聚合酶(RDRP)的酶活性的重构和其拯救相关RNA病毒或来自小复制子的非病毒报告蛋白的能力的其他研究已经确立了RDRP酶作为用于亦或单独亦或作为获救病毒的完整部分表达重组蛋白的强大的多功能系统。

用于此目的的最常用的方法使用多个质粒的转染——一个质粒表达底物RNA(编码病毒基因组的cDNA或人工复制子)而其他质粒表达病毒RDRP复合体蛋白质——即，核壳体(N或NP蛋白)、磷蛋白(P)和大聚合酶(L)蛋白以及外部T7RNA聚合酶(T7RNAP)以容许从这些质粒的表达。出于多种原因使用T7RNAP——(1)其高效性，(2)其合成具有病毒基因组相同的正确的5’端的RNA的能力，以及(3)其在细胞质内转录DNA分子从而消除由RNA剪接、多腺苷酸化或其他机制修饰vRNA的能力。

T7RNAP不是哺乳动物酶。因此Pattnaik等人(1990)使用重组减毒牛痘病毒(VV)(如MVA/T7)。它被用于恢复VSV(Lawson等人，1995)和狂犬病病毒(Conzelman，美国专利号US 6,033,886)、RSV(Collins等人，1995)；SV5(He等人，1997)、HPIV-3(Durbin等人，1997)、牛瘟病毒(Barn和Barrett 1997)和麻疹病毒(Schneider等人，1997)、腮腺炎病毒(Clarke等人，2000)、CDV(Gassen等人，2000)、HPIV-2(Kawano等人，2001)以及BPIV-3(Schmidt等人，2000)。类似地，表达T7RNAP的重组禽痘病毒也已被用于提供用于恢复新城疫病毒(NDV)(Peeters等人，1999)和嵌合牛瘟病毒(Das等人，2000)的T7RNAP。

使用该手段生产的重组病毒与牛痘病毒混合且难以纯化，其可以是主要问题——特别是如果该重组病毒需要制备免疫原性组合物或基因治疗载体。此外，该辅助牛痘病毒杀死宿主细胞限制了重组病毒生产的效率。因此，期望消除提供T7RNA聚合酶的辅助病毒的使用。三种不同的手段已被用于完全消除外部提供的T7RNAP的使用。

Radecke等人(1995)生产了组成型表达T7RNAP和麻疹病毒(MV)N蛋白和P蛋白(WO97/06270)的辅助细胞系，并且引入编码连接到T7RNAP启动子的MV基因组的完整(+)链序列的质粒和另一个单独编码MV L蛋白的质粒就足以拯救重组MV。然而，该辅助细胞系的效率通常受到限制且需要通过给予热休克(Parks等人，1999)来加强。而且，该细胞系只可用于拯救MV。相比之下，辅助BHK-21细胞系(BSR T7/5)仅稳定表达T7RNAP并且可用于拯救不同病毒如BRSV(Buchholz等人，2000)、狂犬病病毒(Finke和Conzelmann 1999)、VSV(Harty等人，2001)、NDV(Romer-Oberdorfer等人，1999)和埃博拉病毒(Volchkov等人，2001)。它可以用于通过用编码合适的N、P和L蛋白的质粒共转染来重构任何病毒的RDRP。

第二种手段涉及使用RNA聚合酶I(RNAPI)。RNAPI通常参与转录哺乳动物细胞中核糖体基因。由RNAPI合成的RNA不包含5’甲基帽子结构和3’多聚-A尾巴。精确地限定RNAPI的转录起始和终止信号并且通过将病毒基因组或基因组样cDNA分子插入到rRNA启动子和终止子信号之间产生的RNA分子拥有真实的病毒5’端和3’端，不需要进一步加工并且如果表达可以直接被病毒RDRP用作底物。(Zobel等人，1993，Nucleic acids research，21:3607-3612；Flick和Petterson，2001，J.Virol.75:1643-1655；)。因此，RNAPI转录已被用于从质粒合成病毒基因组或基因组样cDNA并且在流感病毒(Neumann等人，1999)、博尔纳病病毒和MV(Martin等人，2006，J Virol.80:5708-5715)的情况下用于拯救病毒。

最近，Martin等人(2006)已使用第三种策略来从由RNA聚合酶II(RNAP II)产生的转录本表达病毒基因组RNA。他们将锤头状核酶放置在病毒基因组序列的直接上游并且将基因组丁型肝炎病毒核酶放置在病毒基因组序列的直接下游。这些核酶从由RNAP II转录的RNA剪切具有真实的3’端和5’端的基因组RNA。

这些策略消除了对辅助病毒的需要，但仍需要表达病毒N、P和L蛋白的单独的辅助质粒。在细胞中同时转染如此多的质粒并且确保用于有效重构RDRP所需蛋白质的表达的可用水平是困难的。通过确保所有转染的细胞能够接受对于重构RDRP酶活性所必需的辅助蛋白质的整个补体，表达全部所需基因的单一辅助质粒的有效性(availability)将有助于提高病毒拯救的效率。

对多种质粒的需求也限制了使用基于RDRP的系统来拯救病毒，然而使用编码报告蛋白质的人工复制子的研究已表明RDRP介导的表达系统可以容许高水平表达重组蛋白质。单辅助质粒/试剂提供所需N、P和L蛋白质的有效性将有助于扩展使用RDRP酶用于大规模表达重组蛋白质的范围。因此，现有技术中出现对新的更简单的方法和试剂需要，该方法和试剂将容许有效重构RDRP活性和其用于表达重组蛋白质、RNA分子和/或拯救重组病毒的开发。

这里，本申请人描述了简单的易于操作的质粒载体系统的制备和使用，这些系统可用于重构RDRP酶活性以及它的拯救用于表达重组蛋白质、RNA分子以及拯救重组病毒。为此，本申请人已使用两种病毒——麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)的RDRP系统作为模型。这些质粒可被容易地修改来表达亦或非病毒蛋白质、RNA分子亦或整个病毒基因组。该载体系统在一些应用的开发利用中是有用的，这些应用涉及蛋白质表达和/或产生表达另外的蛋白质的重组修改病毒(病毒拯救)和/或可用于疫苗或其他治疗目的的RNA分子。

发明目的

本发明的主要目的是提供用于生产重组蛋白质和病毒的双质粒哺乳动物表达系统。

另一个目的是提供用于重构RNA依赖性RNA聚合酶及其作为哺乳动物表达系统的开发利用的方法。

本发明进一步的目的是提供用于表达重组蛋白质、核酸、病毒、RNA分子的哺乳动物表达系统。

本发明更进一步的目的是提供用于细胞内表达RNA分子样适体、反义RNA、miRNA、siRNA、核酶等的哺乳动物表达系统。

本发明的又一个目的是提供用于生产可用作疫苗或治疗剂的重组病毒的试剂。

本发明的另一个目的是描述制备这样的哺乳动物表达系统的方法。

发明内容

本发明特征在于在哺乳动物细胞中使用麻疹病毒的RNA依赖性RNA聚合酶用于表达蛋白质、RNA分子和生产重组病毒。一方面这提供了表达MV的N、P和L蛋白质的质粒DNA分子。本发明另一方面提供了表达易于操纵的RDRP的RNA底物的另一种质粒，该RNA底物可用于生产任何蛋白质、RNA或修改的病毒。这些质粒可以被用作用于表达蛋白质或RNA分子或生产重组病毒或它们的组合的试剂盒。本发明进一步提供了使用这些质粒用于细胞内表达RNA分子的方法，这些RNA分子可以用于调节细胞基因表达。可以以克隆试剂盒的形式使用这些质粒。

在本发明中使用的以下术语/缩写具有如下所述的含义。

MV：麻疹病毒，RPV：牛瘟病毒，RNA：核糖核酸，DNA：脱氧核糖核酸，RDRP：RNA依赖性RNA聚合酶，cDNA：互补DNA，-VRNA：反义病毒RNA，RNP：核蛋白，P：磷蛋白质，L：大聚合酶蛋白质，N：核壳体，CMV：巨细胞病毒，IRES：内部核糖体进入位点，CHO Cell Line：中国仓鼠卵巢细胞系，RNA Pol I-RNA聚合酶I，MOI：多重感染，siRNA：选择性干扰RNA，miRNA：微RNA，GFP：绿色荧光蛋白，HGH：人生长激素。

附图说明

图1：编码麻疹小复制子的克隆质粒的示意图，该麻疹小复制子编码2个报告基因。

A：基本复制子设计

B：构建体1：HH-复制子-HDV

C：构建体2：PIP-复制子-PIT

图2：创建的克隆质粒的图示

克隆质粒1：载体pUC57被用于克隆PIP_复制子_PIP构建体。

克隆质粒2：载体pIRES被用于制备pIRES_PIP_复制子_PIT构建体。

克隆质粒3：载体pIRES被用于制备pIRES_HH_复制子_HDV。

图3：合成整个MV-E基因组的cDNA

图3a：产生编码MV-E的整个反基因组的cDNA：使用Genejet RNA纯化试剂盒(Fermentas)纯化病毒RNA并使用Superscript II和随机六聚体引物逆转录。这被用于用Superscript III和特异性引物扩增七个相互重叠的片段并克隆到pCDNA3.1中，其中用NheI_Not I_Pac_Pme I接头替换多克隆位点。

图3b：编码MV-E基因组的cDNA的质粒：通过组装七个相互重叠的PCR扩增片段合成编码MV-E的整个反基因组的cDNA并克隆在pCDNA3.1(-)的Not I和Pme I位点中.

图4：创建的辅助质粒的两个变异体的图示。

辅助质粒1：载体pBiCMV-1被用于制备pBiCMV_MV-N_MV-P_IRES_MV-L。

辅助质粒2：载体pIRES被用于制备pIRES_MV-N_p2A_MV-P_MV-L。

图5：用编码eGFP和HGH和HPV1或HPV2的克隆质粒共转染Vero细胞，在37℃孵育48小时并观察荧光和HGH。A：仅PUC 18；B：pGFP(阳性对照)；C：仅pUC_PIP-复制子-PIT；D：pUC-PIP-复制子-PIT和辅助HPV；E：仅pIRES-HH-复制子-HDV；F：pIRES-HH-复制子-HDV和HPV。注意：辅助质粒1和辅助质粒2均能提供N、P和L蛋白质。由于它们是相似的，只示出了HPV1的代表图。

图6：拯救分段的MV：使用Xfect将等量的质粒pCDNA_MV基因组、克隆质粒1(pIRES_HH-复制子-HDV)和HPV1共转染到Vero细胞中，在37℃孵育并每天观察合胞体(syncytia)的形成。在合胞体形成物覆盖＞80％-90％后从培养上清液收获MV-E，并使用TCID50滴定。同时对于EGFP质粒的表达观察细胞。

A：用pUC-PIP-复制子-PIT、pCDNA-MV基因组和辅助质粒变异体1转染的Vero细胞；

B：用pIRES-HH-复制子-HDV、pCDNA-MV基因组和辅助质粒变异体1转染的Vero细胞。

具体实施方式

本发明涉及可以容易地用于细胞内重构RDRP酶活性用于表达重组蛋白或病毒拯救的表达系统。它包含两种质粒——1.表达MV病毒的N、P和L蛋白质的辅助质粒和2.表达易于操纵的病毒RNA或病毒样RNA分子(小复制子)的克隆质粒。克隆质粒包含用于容易地插入编码待表达的靶分子的DNA的多克隆位点(MCS)。这里将MV和RPV用作模型系统。

实施例

将在以下实施例中进一步描述本发明，这不会限制在权利要求中描述的本发明的范围。

1.细胞和病毒

在用5％胎牛血清(FCS)补充的达尔伯克氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)中以单层生长Vero(非洲绿猴肾脏)细胞。在用10％FCS补充的DMEM中以单层生长MRC5细胞。麻疹病毒(Edmonston)(MV-E)株购自印度血清研究所(Serum Institute of India)(MVAC，10³TCID50/小瓶)。为了制备接种原液(seed stock)，以10⁵细胞/瓶在25sq.cm瓶中接种Vero细胞或MRCS细胞并孵育36小时。接着用HBSS洗涤细胞并以0.1的MOI用MV-E接种并用无血清DMEM补充。在24小时间隔时收获病毒。在72小时期间(over)采集的病毒被汇集到一起、定量并用作接种原液。

2.质粒构建体

2.1克隆质粒

2.1.1设计复制子构建体

MV前导(ntds 1至107)、MV尾随(ntds 15786至15894)和MV-N和MV-P蛋白质的蛋白质编码区之间的基因间区域(ntd.号1686至1806)选自Genbank的AY486084.1序列(Baricevic等人，2005)。分别自U55762.1和NM-000515.3分离被用作报告蛋白的绿色荧光蛋白(eGFP)和人生长激素(HGH)的编码区。所有这些序列由电脑模拟(in silico)组装为包含2个基因盒的MV-E基因组样复制子。将对应于Afe I、Age I、Asc I、Mlu I、Nru I、Pci I、Sac II、Xho I、Eco RI、Pac I、Pme I、Pml I、Sbf I和Xba I的识别位点的核苷酸序列排列为2个寡核苷酸以合成2个多克隆位点(MCS1和MCS2)并插入EGFP和HGH基因附近的复制子。结果是，EGFP蛋白质似乎已经被克隆在MCS1区域中Asc I位点处而HGH蛋白质被克隆在MCS2中Pac I位点处(图1)。在Seq ID NO.1中给出没有报告基因的复制子的序列。

由Combredet等人(2003)重构对应于5’锤头状核酶的序列并连接在复制子的5’端。类似地，自Walker等人(2003)获取3’丁型肝炎病毒核酶的序列并附连在复制子的3’端以产生HH-复制子-HDV构建体(图1B；Seq ID NO.2)。

编码中国仓鼠RNA聚合酶I(PIP)启动子的序列选自Tower等人(1989)而鼠科动物RNA聚合酶I终止子(PIT)的终止子序列在由Grummt等人(1985，1986)描述的序列的基础上选择。将PIP序列添加到复制子的5’端(直接上游)的直接上游而将PIT序列附连到复制子的3’端的直接下游以创建PIP-复制子-PIT构建体(图1C；Seq ID NO.3)。

2.1.2合成克隆质粒

使用Young和Dong(2004)的基因合成方法合成的对应于HH-复制子-HDV(Eco RI和Hind III位点间)和PIP-复制子-PIT(Sac I和Hind III位点间)的序列，并分别克隆至pUC57中以产生pUC_HH-复制子-HDV和pUC_PIP复制子-PIT。

然后将它们亚克隆至Clonetech的pIRES载体的Nhe I和Not I位点间以产生pIRES_HH-复制子-HDV和pIRES_PIP-复制子-PIT质粒。这些质粒被用于测试哺乳动物细胞中RNA依赖性RNA聚合酶(RDRP)介导的GFP和HGH蛋白质的表达。

在证实这些质粒在RDRP的控制下表达GFP和HGH后，通过顺序消化除去EGFP和HGH的基因并与Asc I和Pac I连接以产生克隆质粒的3个变异体——克隆质粒变异体1(HH-复制子-HDV)和克隆质粒变异体2(PIP-复制子-PIT)以及克隆质粒变异体3(pUC_PIP-复制子-PIT)。在表1中列出产生的不同质粒。

表1：产生的不同的小复制子质粒

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2.1.3合成整个MV-E基因组的cDNA

从纯化自购自印度血清研究所，浦那(Pune)，印度的一批MV-E疫苗的病毒颗粒克隆ME-V cDNA。根据制造商的RNA纯化试剂盒按照制造商的方案使用GeneJet RNA纯化试剂盒(Fermentas)从10⁵裂解的病毒颗粒提取病毒RNA。使用随机六聚物和Superscript IIDNA聚合酶将病毒RNA逆转录为cDNA。覆盖整个病毒基因组的七个相互重叠的cDNA片段(如图3a所示)是使用PfuTurbo DNA聚合酶和以下引物通过PCR产生的：

(1)5'-GCGGCCGCACCAAAC-3'；

(2)5'-CCTGACCGCGGATGC-3'；

(3)5'-ACCTCGCATCCGCGG-3'；

(4)5'-CCTCCAGAGTAATCGATTAAGG-3'；

(5)5'-AATCGATTACTCTGGAGGAGCAG-3'；

(6)5'-CTTGCACCCTAAGTTTTAATTAACTAC-3'；

(7)5'-GAACAATATCGGTAGTTAATTAAAAC-3'；

(8)5'-TGAGGGACTCGAGCATACTC-3'；

(9)5'-ATAAGATAGTAGCCATCCTGGAGTAT-3'；

(10)5'-GTAGGGCCATGTGCTGGG-3'；

(11)5'-CATAGCCGTAACAAAAAGGGTAC-3'；

(12)5'-GAGCATCAAGTGAAGGACCATG-3'；

(13)5'-GCATTGTGGTATTATAGAGCCTATC-3'；

(14)5'-CGGTTTAAACCAGACAAAGCTG-3'

通过用Nhe I和Pme I消化除去来自质粒pCDNA3.1(-)的多克隆位点，并用包含NheI-Not I-Pac I-Pme I位点的接头pCDNA-Not_Pac_Pme替换它。通过使用不同的引物对7，8(Pac I，Xho I)；9，10(Xho I，Kpn I)；11，12(Kpn I，Nco I)和13，14(Nco I，Pme I)产生片段并且连入PacI-Pme I消化的pCDNA-Not_Pac_Pme以产生称为pCDNA_Not_Pac_MVg_Pme的具有从Pac I到MV-E反基因组的3’端的核苷酸的质粒。由另外三对引物——1，2(Not I，SacII)；3，4(Sac II，Cla I)；5，6(Cla I，Pac I)产生的片段连入Not I-Pac I消化的pCDNA_Not_Pac_MVg_Pme质粒以产生pCDNA_MV基因组(图3b)。

2.2辅助质粒

根据制造商的方案使用GeneJet RNA纯化试剂盒(Fermentas)由购自印度血清研究所，浦那(Pune)，印度的纯化的MV-E病毒制备RNA。使用随机六聚物逆转录1μg RNA，并使用对于N(F：5’-GCTAGCATGGCCACACTTTTAAGG-3’和R：5’-GCGGCCGCCTAGAAGATT-3’)、P(F：5’-GCTAGCATGGCAGAAGAGCAGG-3’；R：5’-GCGGCCGCCTACTTCATTATTATC-3’)和L(F：5’-GCTAGCATGGACTCGCTATCTGTCAAC-3；R：5-GCGGCCGCTTAGTCCTTAATCAG-3’)蛋白质编码区域特异性的引物使用由Martin等人(2006)和Combredet等人(2003)所描述的Superscript III(Invitrogen)使用标准分子克隆技术扩增。扩增的cDNA被克隆至pIRES载体(Clonetech)的Nhe I和Not I位点之间以产生pIRES_N、pIRES_P和pIRES_L质粒。

2.2.1合成辅助质粒变异体1

从pIRES_N扩增N蛋白质基因并亚克隆到pBiCMV1的Eco RI和PstI位点以产生pBiCMV_N质粒。随后扩增P蛋白质序列并克隆至Nhe I和Eag I位点以产生pBiCMV_NP构建体。然后将L蛋白质序列亚克隆至pBiCMV_NP质粒的Eag I和Sal I位点以产生pBiCMV_NPL质粒。该质粒包含双向CMV启动子并且可表达N和P蛋白质。然而，L序列将转录为具有P的双顺反子RNA且将不会被翻译。因此，由Chappell等人(2000)首次描述并且随后由Touzlet等人(2008)证实的促进有效翻译的哺乳动物β球蛋白IRES元件(ires)被插入到L编码区的直接上游。合成编码在5’端由Eag I位点和在3’端由L蛋白质的前10个核苷酸侧接的五聚体IRES元件的寡核苷酸(5’GGCCGTTCTG ACATCCGGCG GGTTTCTGAC ATCCGGCGGG TTTCTGACATCCGGCGGGTT TCTGACATCC GGCGGGTTTC TGACATCCGG CGGGTGACTC ACAACGGATC CAACAGACATATGGACTCGC 3')并通过位点指导的诱变插入pBiCMV_NPL以产生pBiCMV_NpiresL质粒，该质粒也被称为辅助质粒变异体1(HPV1)(Seq ID NO.8)。

2.2.2合成辅助质粒变异体2

扩增N蛋白质序列并亚克隆至Nhe I和Xho I位点之间以获得pIRES_N。随后从pIRES_P扩增P蛋白质序列并克隆至Eco RI和Mlu I位点之间以产生pIRES_NP。最后，从pIRES_L扩增L序列并克隆至pIRES_NP的Sal I和Not I位点之间以获得pIRES_NPL。以这种形式，该质粒将表达N和L蛋白质但不表达P。因此，基于最近描述的策略，2A肽载体被用于促进P蛋白质的表达(szymczak和Vignali(2005))。通过插入编码由Szymczak等人(2007)描述的猪捷申病毒(porcine teschovirus)2A肽的寡核苷酸(5'ATCTTCTAGA CGGCTCCGGAGCCACGAACT TCTCTCTGTT AAAGCAAGCA GGAGACGTGG AAGAAAACCC CGGTCCCATG GCAGAAGAGCA 3')融合来自pIRES_NPL的N和P开放阅读框，在寡核苷酸的5’端由紧接MV N蛋白质的终止密码子之前的密码子侧接而在3’端由MV P蛋白质的前几个密码子侧接，通过位点指导的诱变将N和P蛋白质区域融合为单个的N2AP融合蛋白并获得pIRES_N2AP质粒，该质粒也被称为辅助质粒变异体2(HPV2)(Seq ID No.9)。

在图4中示意性示出质粒HPV1(pBiCMV_NpiresL)和HPV2(pIRES_N2aP)。

2.2.3合成编码其他负链RNA病毒的N、P和L蛋白质的等价辅助质粒

随后测试用于产生这些辅助质粒的克隆策略对其他负链RNA病毒的适用性——其他负链RNA病毒主要是MV、牛瘟(RPV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、犬瘟热(CDV)、新城疫病毒(HDV)和仙台病毒(SeV)。对于限制性内切酶Eco RI、Pst I、Nhe I、Eag I、Sal I、XhoI、MluI和NotI的存在，分析了核壳体、磷蛋白和大蛋白的编码区。

MV和CDV的核壳体中缺少Eco RI和Pst I的位点。类似地，在MV和SeV的核壳体中缺少Nhe I和Xho I的位点。然而，在其他病毒的核壳体中检测到了不同数量的Eco RI、Pst I、Nhe I和Xho I酶的位点(表2)。

MV、PPRV、CDV和NDV的L蛋白缺少Eag I、Sal I和Not I位点。RPV和SeV在它们的L蛋白中包含1个Sal I的位点。(表3)

然而，这些蛋白质的基因分别编码单一蛋白质。因此，可以容易在它们的蛋白质编码区进行同义突变并消除这些限制性内切酶的位点。因此，可以容易地使用相同的克隆策略以在类似于辅助质粒变异体1或辅助质粒变异体2的辅助质粒结构中克隆核壳体和大蛋白编码区。

与上述结果相似，这些病毒的磷蛋白编码区的分析显示存在不同数量的Nhe I、Eag I、Eco RI和Mlu I的位点(表4)。MV、CDV和NDV磷蛋白编码区不存在这些酶的位点。

虽然RPV(AB547190)的P蛋白质序列被Nhe I和Eag I消化，对应于这些酶的识别位点的区域在RPV的不同菌株(如Genbank中230697.2)中不同。另一方面，PPRV的P蛋白中的Eco RI位点似乎是在大多数PPRV菌株中高度保守的。然而，P蛋白编码序列的这个区域不与C和V蛋白的编码区域重叠，C和V蛋白也由P基因转录本编码。因此，可以在RPV和PPRV的P蛋白中引入同义突变以使得可以使用本申请人提出的策略用于制备MV、CDV、RPV、PPRV和NDV的辅助质粒。因此，相同的限制性内切酶可用于从其他负链RNA病毒核壳体(N或NP)、磷蛋白(P)和大(L)蛋白合成与所描述的那些如辅助质粒变异体1和辅助质粒变异体2等价的辅助质粒构建体。这些变异体将可用作辅助质粒用于重构相应的病毒RNA依赖性RNA聚合酶及其用于蛋白质或RNA表达的开发利用以及产生作为新颖的疫苗和/或治疗剂的重组病毒。

3.通过质粒编码的RDRP表达重组蛋白质

首先使用类似于由Martin等人描述的系统评价所克隆的质粒表达可以作为MVRNA依赖性RNA聚合酶(RDRP)的底物的RNA分子的能力。简单地说，根据制造商的方案，在脂质体(Invitrogen)中以1:1:1:0.5的比例用克隆的质粒，以及表达MV-E的N、P和L蛋白的单个质粒转染Vero细胞。在37℃下在5％CO2中孵育细胞48小时，并通过显微镜和使用微孔板检测仪(酶标仪，microplate reader)的荧光测量评价绿色荧光蛋白(eGFP)的表达。

在随后的实验中，用等比例的一个克隆质粒(pUC-PlP-复制子-PIT或pIRES-HH-复制子-HDV或pIRES-13113-复制子-131T)和一个辅助质粒(辅助变异体1或辅助变异体2)在脂质体(Invitrogen)或xfect(Clonetech)中转染Vero细胞并在37℃下5％CO₂中孵育48小时，并且通过显微镜和荧光评价绿色荧光蛋白(eGFP)的表达。

4.拯救MV-E

测试辅助质粒从cDNA拯救MV-E的能力。使用Xfect将质粒pCDNA_MV基因组与辅助质粒变异体1或辅助质粒变异体2共转染到Vero细胞中并在37℃下孵育过夜。由新鲜培养基替换转染培养基并孵育细胞另外两天。当合胞体占(involve)80％至90％的细胞层时，通过刮出(scrap)感染细胞、冻融细胞和培养基以及离心除去细胞碎片收获病毒。使用TCID50滴定法滴定采集到的病毒。简单地说，将Vero细胞接种到96孔板(7500细胞/孔)中并在含有5％DCS的DMEM中由病毒样本的连续的1:10稀释液感染。在37℃孵育7天后，用结晶紫染色细胞并确定导致感染50％的测试单元的病毒稀释液。通过Kaber法计算描述为组织培养感染剂量(TCID50)的50％终点。由pCDNA_MV基因组+辅助质粒拯救的病毒具有10⁶至10⁷ TCID50/mL的滴度。

5.使用质粒编码RDRP拯救分段的MV-E

测试辅助质粒从cDNA拯救重组分段的MV-E的能力。使用Xfect以相等比例用pCDNA_MV基因组、编码eGFP的克隆质粒和亦或HPV1亦或HPV2共转染Vero细胞并在37℃孵育过夜。由新鲜培养基替换转染培养基并继续孵育其中每天观察合胞体形成。当合胞体占80％至90％的细胞层时，通过刮出感染细胞、冻融细胞和培养基以及离心除去细胞碎片收获病毒。使用TCID50滴定法滴定采集到的病毒。简单地说，将Vero细胞接种到96孔板(7500细胞/孔)中并在含有5％DCS的DMEM中由病毒样本的连续的1:10稀释液感染。在37℃孵育7天后，用结晶紫染色细胞并确定导致感染50％的测试单元的病毒稀释液。通过Kaber法计算描述为组织培养感染剂量(TCID50)的50％终点。从最初转染的细胞拯救的病毒具有10⁶至10⁷TCID 50/mL的滴度。用从最初转染的Vero细胞收获的病毒感染的细胞也表达eGFP，说明将编码eGFP的小复制子连同MV-E基因组一起成功包装为病毒粒子以及它的转移到新鲜细胞。

Claims

1.一种使用非节段负链RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶用于生产重组蛋白的双质粒系统，无需复制辅助牛痘病毒或外源性RNA聚合酶的帮助，包含：

a.一种克隆质粒，包含在两个用于插入可表达DNA片段的多克隆位点处的易于操作的复制子，所述克隆质粒是按照Seq ID NO.4或Seq ID NO.5或Seq ID NO.6或Seq ID NO.7，所述易于操作的复制子是按照Seq ID NO.1或Seq ID NO.2或Seq ID NO.3；

b.一种辅助质粒，包含分别表达N、P、L蛋白的N、P、L基因，所述辅助质粒是按照Seq IDNO.8或Seq ID NO.9。

2.根据权利要求1所述的双质粒系统，其中，所述易于操作的复制子包含至少两个在5’端由病毒前导序列侧接并且在3’端由病毒尾随序列侧接的用于插入可表达DNA片段的多克隆位点(MCS)，由病毒基因间序列分隔，操作地连接到RNA聚合酶(RNAP)I调控序列以容许合成带有真实的3’和5’病毒基因组末端的反义RNA转录本。

3.根据权利要求1所述的双质粒系统，其中，所述易于操作的复制子包括至少两个在5’端由病毒前导序列侧接并且在3’端由病毒尾随序列侧接的用于插入可表达DNA片段的多克隆位点(MCS)，由病毒基因间序列分隔，操作地连接到RNAP II调控序列和核酶以容许合成带有真实的3’和5’病毒基因组末端的反义RNA转录本。

4.一种使用非节段负链RNA病毒的RNA依赖性RNA聚合酶用于生产传染性非节段负链RNA病毒的双质粒系统，无需复制辅助牛痘病毒或外源性RNA聚合酶的帮助，包含：

a.一种病毒克隆质粒，包含编码麻疹病毒的整个病毒的基因组RNA的cDNA用于插入可表达的DNA片段；

5.根据权利要求4所述的双质粒系统，其中，所述编码病毒基因组RNA的cDNA被操作地连接到RNA聚合酶(RNAP)I调控序列以容许合成带有真实的3’和5’病毒基因组末端的反义RNA转录本。

6.根据权利要求4所述的双质粒系统，其中，所述编码病毒基因组RNA的cDNA可操作地连接到RNAP II调控序列以容许合成带有真实的3’和5’病毒基因组末端的反义RNA转录本。

7.根据权利要求1或权利要求4所述的双质粒系统，其中，所述可表达DNA片段编码RNA分子或蛋白或至少一个免疫原性表位或它们的组合。

8.根据权利要求1或权利要求4所述的双质粒系统，其中，通过将所述N基因和编码由IRES元件分隔的P和L基因的双顺反子盒在双向RNAP II启动子的控制下克隆合成所述辅助质粒。

9.根据权利要求1或权利要求4所述的双质粒系统，其中，通过将所述N、P和L基因在RNAP II启动子控制下克隆到单个双顺反子DNA盒中合成所述辅助质粒，所述双顺反子DNA盒包含编码由2A肽序列分隔的N和P的融合蛋白的基因和编码由IRES元件分隔的L蛋白的基因。

10.根据权利要求1或权利要求4所述的双质粒系统，其中，通过将所述N、P和L基因每一个作为在RNA聚合酶II启动子不同控制下的3个单独的基因克隆合成所述辅助质粒。

11.一种使用非节段负链RNA病毒的麻疹病毒RNA依赖性RNA聚合酶的用于生产重组蛋白的双质粒系统，无需复制辅助牛痘病毒或外源性RNA聚合酶的帮助，包含：

a.一种克隆质粒，包含在两个用于插入可表达DNA片段的多克隆位点处的易于操作的麻疹病毒复制子，所述克隆质粒是按照Seq ID NO.4或Seq ID NO.5或Seq ID NO.6或SeqID NO.7，所述易于操作的麻疹病毒复制子是按照Seq ID NO.1或Seq ID NO.2或Seq IDNO.3；

b.一种辅助质粒，包含分别表达麻疹病毒N、P、L蛋白的麻疹病毒N、P、L基因，所述辅助质粒是按照Seq ID NO.8或Seq ID NO.9。

12.一种用于生产感染性麻疹病毒的双质粒系统，无需复制辅助牛痘病毒或外源性RNA聚合酶的帮助，包含：

a.一种病毒克隆质粒，包含用于插入可表达DNA片段的编码整个麻疹病毒基因组RNA的cDNA，所述克隆质粒是按照Seq ID NO.4或Seq ID NO.5或Seq ID NO.6或Seq ID NO.7；

13.一种使用根据权利要求1和权利要求4所述的双质粒系统用于生产重组蛋白、RNA分子或传染性非节段负链RNA病毒的方法，包括，将克隆质粒和辅助质粒引入宿主细胞内并生产重组蛋白、RNA分子或传染性非节段负链RNA病毒而无需复制辅助牛痘病毒或外源性RNA聚合酶的帮助。

14.一种生产重组麻疹病毒的方法，包括(a)将在权利要求4中所述的病毒克隆质粒引入宿主细胞，(b)将在权利要求1中所述的克隆质粒引入宿主细胞，以及(c)将在权利要求1或权利要求4中所述的辅助质粒引入宿主细胞并生产重组麻疹病毒而无需复制辅助牛痘病毒或外源性RNA聚合酶的帮助。