CN101631798A - 产生非节段负链rna病毒的细胞和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从克隆的脱氧核糖核酸(cDNA)特别是从麻疹病毒,特别是从减毒株例如批准用于接种的减毒株,特别是从减毒的Schwarz麻疹病毒和各种基于重组Schwarz麻疹病毒且表达异源序列的病毒产生非节段单链负义RNA病毒(NNV或单分子负链RNA病毒目)的重组细胞以及方法。这些拯救的病毒可在扩增后用作免疫麻疹和/或免疫表达的异源肽或蛋白质的疫苗。
Description
本发明涉及从克隆的脱氧核糖核酸(cDNA)特别是从麻疹病毒,特别是从减毒株例如批准用于接种的减毒株,特别是从减毒的Schwarz麻疹病毒和各种基于重组Schwarz麻疹病毒且表达异源序列的病毒产生非节段单链负义RNA病毒(NNV或单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales))的重组细胞以及方法。这些拯救的病毒可在扩增后用作免疫麻疹和/或免疫表达的异源肽或蛋白质的疫苗。
减毒活RNA病毒可制备为高效疫苗。在这些疫苗当中,麻疹疫苗已应用于数亿儿童,并已证实是安全有效的。注射一到两次后,该疫苗可诱导终身免疫。它很容易在大多数国家以低成本大规模生产。这些优点使得麻疹病毒尤其是减毒疫苗株成为免疫儿童和(甚至在某些情况下)成人使其抵抗麻疹和/或其他感染性病原体尤其是病毒性病原体例如AIDS(反转录病毒)、黄病毒或冠状病毒(SARS)病的良好候选载体。
自20世纪60年代以来,减毒活麻疹病毒已被用作疫苗,是最有效和最安全的人疫苗之一。大规模接种疫苗在发达国家可有效地控制麻疹。但是,由于疫苗在发展中国家分布不足,仍有大约4500万人感染麻疹,每年导致700,000名儿童的死亡。因此WHO已加大其针对接下来10-20年的全球疫苗接种项目的投入力度(C.D.C.,2005)。利用WHO的活动,采用安全有效的新多价小儿疫苗特别是双价小儿疫苗,使用源自麻疹疫苗的疫苗载体可在世界上某些地区为儿童进行麻疹或其他传染性疾病的同时免疫。
麻疹病毒(MV)属于副粘病毒科麻疹病毒属。它是一种具有非节段负链RNA基因组(15,894bp)的包膜病毒。麻疹仅可感染一次,因为免疫系统启动了强特异应答,并建立了终身记忆,避免发生重新感染。这种保护基于抗体生成和记忆细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)。病原株强烈破坏血细胞生成(Arnebom等人,1983;Kim等人,2002;Okada等人,2000),从而形成短暂的免疫抑制,而后者是发展中国家因麻疹感染所引起的大多数死亡的原因。与原始毒株相比,减毒株不会诱导免疫抑制(Okada等人,2001)。
1954年通过人原代细胞培养分离得到麻疹病毒的Edmonston株(Enders等人,1954)。经改造用于鸡胚成纤维细胞后,通过随后在鸡胚成纤维细胞中传代,得到了毒性进一步减弱的疫苗毒种。具有相同核苷酸序列的Schwarz株和Moraten株组成了最常使用的麻疹疫苗(Parks等人,2001a;Parks等人,2001b)。经一到两次注射进行接种可诱导终身免疫(Griffin等人,2001;Hilleman等人,2002)。已证实CD8细胞和抗体可在接种后存在多达25年(Ovsyannikova等人,2003)。麻疹疫苗在大多数国家容易投入大规模生产,且可以低成本制备。病毒基因组的减毒源自多个突变的有利组合。因此,该疫苗非常稳定,至今从未观察到疫苗株的回复突变(Hilleman等人,2002)。此外,该病毒仅在细胞质内复制,避免了整合到宿主基因组染色体上的任何风险。这些特征使得减毒活的麻疹疫苗成为开发多价疫苗载体的出色候选物。出于该目的,已克隆出对应于Edmonston B MV株反基因组的感染性cDNA,并建立起可产生相应病毒的反求遗传学技术。
发明人之前使用世界上最常使用的麻疹疫苗Schwarz MV已开发出一种载体(Combredet等人,2003)。该载体可在12次以上的传代过程中稳定表达许多基因或大基因的组合。产生含4,000-5,000个附加核苷酸的重组MV载体,表示附加的30%基因组。通过细胞培养产生滴度堪比标准MV的这些病毒。传代12次和1020的扩增系数后,96%以上的感染细胞继续表达附加基因。同样在单分子负链RNA病毒目的其他成员中观察到的这种极为稳定的表达,很可能是因为没有这些螺旋核衣壳病毒对基因组大小的几何限制,这点不同于具有二十面体衣壳的病毒。而且,MC感染免疫系统的细胞(巨噬细胞和树突细胞),从而将货物抗原直接传递给最有效的抗原呈递细胞,而这是疫苗载体的主要优点。最后,MV基因组很小,因此避免对该载体的应答超过对转基因的应答。
基于减毒株的安全性和有效性最终取决于其基因组序列的假设,发明人克隆了对应于Schwarz/Moraten麻疹病毒反基因组的感染性cDNA,其中麻疹病毒来自于从工业制备的Schwarz疫苗纯化的病毒颗粒,其中该疫苗以最优步骤制备以保持保真性(Combredet等人,2003)。为了优化反求遗传学系统的产量,反基因组病毒cDNA置于T7噬菌体RNA聚合物启动子和实现最佳效应所需的附加GGG基序的控制下。为了实现病毒RNA的精确切割,在GGG基序和第一个病毒核苷酸之间插入锤头状核酶,而来自丁型肝炎病毒的核酶置于最后一个病毒核苷酸的下游。使用基于人辅助细胞转染的前述反求遗传学系统,形成的pTM-MVSchw质粒可产生对应的病毒(Radecke等人,1995)。为了防止重组疫苗适应非许可的细胞,以cDNA转染的辅助细胞与鸡胚成纤维细胞共培养,其中最初在鸡胚成纤维细胞中选择病毒,现在则在鸡胚成纤维细胞生成该病毒。重组病毒传代数次后,发现其整个基因组的序列与最初序列相同(Combredet等人,2003)。在转基因小鼠和猕猴上评价从pTM-MVSchw质粒拯救的病毒的免疫原性,并将其与工业生产的Schwarz疫苗进行比较。所有接种的猕猴均形成了抗MV的抗体并发生了特异细胞应答。没有观察到cDNA生成的Schwarz病毒与原疫苗之间的差异,这表明克隆的病毒具有与亲代疫苗相同的免疫原性(Combredet等人,2003)。这种分子克隆可产生Schwarz麻疹疫苗,而无需依赖病毒留种。
在基因组的不同位点引入附加的转录单位(ATU)对pTM-MVSchw质粒进行修饰,以用于表达外源基因。这些ATU是插入到例如病毒基因组的一个基因间N-P区的多克隆位点盒(含有转录所需的顺式作用元件)。增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因插入到该盒内。在pTM-MVSchw质粒的两个位置引入ATU(P基因和M基因之间以及H基因和L基因之间)。不考虑附加的序列,反基因组核苷酸的总数必须保持为6的倍数,以符合优化病毒复制的“6核苷酸规则”(Calain等人,1993)。GFP转基因在所有的受感染细胞类型中表达,从而证实重组Schwarz麻疹病毒发挥了载体的作用。该载体允许基于目前在全球使用的批准减毒活疫苗株来设计组合疫苗。这种工作是国际申请WO 2004/000876的目的,该申请通过引用的方式纳入本文。
大规模利用这类基于MV的重组活疫苗取决于它们在许可细胞(例如原代鸡胚成纤维细胞(CEF)或人二倍体MRC5)内稳定和高滴度生长的可能性。与产生高滴度病毒的实验细胞系例如非洲绿猴Vero细胞相比,这些细胞通常产生中等滴度的MV。因此,必须获得相对高滴度的初始毒种。以反求遗传学从cDNA产生这种初始毒种。
虽然在其改造的感染性cDNA或DNA转染适宜细胞后可容易在体外得到正链RNA或DNA病毒,负链RNA病毒却不能从其cDNA通过反向遗传学直接拯救得到。负链RNA病毒的基因组不能在体外启动感染周期,因为它不直接编码蛋白质。转录和复制均需要包装病毒基因组的核蛋白所包含的转录酶-聚合酶的酶复合物(RNP复合物)。因此,从cDNA产生重组负链RNA病毒包括从单个组分即RNA和蛋白质重新组成活性的RNP(Fields B.N,等人-Lippincott Raven publishers 1996,1953-1977页)。
过去15年来,来自许多实验室的大量出色工作已建立起从其cDNA拯救几乎所有负链RNA病毒的不同系统(参见Conzelmann的综述)。与具有分节段基因组的病毒相比,非节段负链RNA病毒(单分子负链RNA病毒目)的RNP结构紧密,除装配组件核蛋白(N)外还含有聚合酶辅因子磷蛋白(P)和病毒RNA聚合酶大蛋白(L)。1994年从cDNA回收了第一种感染性单分子负链RNA病毒目即狂犬杆状病毒(Schnell等人,1994)。该方法包括狂犬病毒N、P和L蛋白和全长RNA的细胞内表达,其中该全长RNA的正确3’末端由丁型肝炎病毒(HDV)核酶生成。使用对应于病毒反基因组(正链)而非基因组(负链)的转录物,以避免全长RNA中N、P和L序列的出现所带来的反义问题。在该系统中,必需的辅助蛋白由可复制的痘苗病毒载体提供,其中该痘苗病毒载体编码噬菌体T7 RNA聚合酶,以驱动编码所需的N、P和L蛋白的质粒的T7特异转录。类似的系统可回收感染性狂犬病毒(Schnell等人,1994;lto等人,2001)、VSV(Lawson等人,1995;Whelan等人.1995)以及副粘病毒科仙台株(Garcin等人,1995;Kato等人,1996;Leyrer等人,1998;Fujii等人,2002)、HP1V-3(Hoffman和Banerjee,1997)和麻疹病毒(Takeda等人,2000;Fujii等人,2002)。
为了避免使用需要拯救病毒同辅助病毒分离的可复制痘苗病毒,已改造了几种不可复制的辅助病毒以提供辅助蛋白来拯救非节段负链RNA病毒。这种表达T7 RNA聚合酶且毒性大为减弱的改造痘苗病毒Ankara(MVA)已被用于肺炎病毒属RSV(Collins等人,1995)、腮腺炎病毒属SV5(He等人,1997)、HPIV-3(Durbin等人,1997)、牛瘟病毒(Baron和Barrett,1997)、麻疹病毒(Schneider等人,1997)、腮腺炎病毒(Clarke等人2000)、CDV(Gassen等人,2000)、HPIV-2(Kawano等人,2001)和BPIV-3(Schmidt等人,2000)的回收。一种表达T7 RNA聚合酶的重组禽痘病毒已被用于禽副粘病毒NDV(Peeters等人,1999)和嵌合牛瘟病毒(Das等人,2000)的回收。
为了拯救没有被任何感染性或缺陷性病毒载体污染的单分子负链RNA病毒目,已生成表达T3或T7 RNA聚合酶的细胞系。在这种情况下,在细胞质内没有RNA加帽活性的情况下,使用来自脑心肌炎病毒(EMCV)位于编码区上游的IRES实现蛋白质表达。建立起表达T7 RNA聚合酶和麻疹病毒N蛋白和P蛋白的人胚肾细胞系(293-3-46),以回收麻疹病毒的Edmonston疫苗株(Radecke等人,1995)。转染特异表达MV反基因组RNA和L mRNA的质粒后,拯救该病毒。结果显示,转染培养物的热激处理和转染培养物在Vero细胞上的附加共培养增加了在这些细胞中原先极低的拯救效率(Parks等人,1999)。使用表达T7 RNA聚合酶(BSR T7/5)和基于幼仓鼠肾细胞(BHK)的另一种细胞系用于BRSV(Buchholz等人,2000)、狂犬病毒(Finke和Conzelmann,1999)、VSV(Harty等人,2001)、NDV(Romer-Oberdorfer等人,1999)和依波拉病毒(Volchkov等人,2001)的回收。
发明人已使用293-3-46细胞系来拯救Schwarz疫苗MV载体(Combredet等人,2003)。但是,他们发现即使对转染细胞使用热激方法(Parks等人,1999)以及在Vero细胞或CEF细胞上共培养转染细胞,这种拯救也无法复制,而且产率很低,甚至不可能拯救含有附加大序列的某些重组体。这是源于辅助细胞的不稳定性,因为据观察效率取决于其传代的数目。通过选择抗遗传霉素的293细胞克隆,生成这些细胞。其中293细胞克隆转染有分别编码处于CMV启动子和新霉素抗性基因控制下的MV N基因、P基因和T7 RNA聚合酶基因的pSC6-N、pSC6-P和pSC6-T7-NEO(Radecke等人,1995)。它们活性的稳定性取决于其在遗传霉素(G-418)下的连续选择以及转染和拯救实验期间抗生素的除去。在外源DNA以基于质粒的非常规方式重组到染色体上的过程中,质粒形成的多联体重组在一起,遗传霉素选择仅维持了很少的单个拷贝。这或许可以解释293-3-46细胞传代数次后所观察到的效率降低。
因此,本领域需要一种产生辅助细胞系的新方法,其中该辅助细胞系可高效率和可复制地从cDNA拯救重组的非节段负链RNA病毒,其中非节段负链RNA病毒被任选地修饰而且没有被其他任何辅助病毒例如痘苗病毒污染。
附图简述
图1:质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7(A)、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7(B)、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N(C)和HIV-1-TRIPΔU3.CMV-P(D)的示意图。Ψ:包装psi基序;RRE:Rev效应元件;cPPT:中央多聚嘌呤序列;CTS:中央终止序列;CMVie:巨细胞病毒立即早期启动子;ΔU3:缺失的U3部分。
图2:显示MV N蛋白和P蛋白在不同细胞裂解物中表达的蛋白质印迹;(A)未转导的293T细胞,处于两个不同传代(17和19)的前述293-3-46细胞系,慢病毒载体转导后产生的293nlsT7-NP细胞群和293T7-NP细胞群;(B)感染MV的Vero细胞,处于两个不同传代(17和27)的293-3-46细胞系,8个293T7-NP细胞克隆;(C)感染MV的Vero细胞,293-3-46细胞系(17代),8个293nlsT7-NP细胞克隆,未感染的Vero细胞。以抗MV NP的抗体(1/500)和HRP抗小鼠Ig的二抗(1/1000)探查印迹。
序列简述
各种反转录DNA瓣(DNA flap)的核苷酸序列在不同病毒中定义为:CAEV(SEQ ID NO:1)、EIAV(SEQ ID NO:2)、VISNA(SEQ ID NO:3)、SIVAGM(SEQ ID NO:4)、HIV-2 ROD(SEQ ID NO:5)、HIV-1 LAI(SEQ ID NO:6)和HIV-1(SEQ ID NO:7)T7 RNA聚合酶、nls T7 RNA聚合酶和MV病毒的N、P和L蛋白的核苷酸序列分别定义为SEQ ID NO:8、10、12、14和16,它们对应的蛋白质序列分别为SEQ ID NO:9、11、13、15和17。pTM-MVSchw质粒(CNCM I-2889)的完全核苷酸序列定义为SEQ IDNO:18。pEMC-LSchw质粒(CNCM I-3881)的完全核苷酸序列定义为SEQ IDNO:19。
具体实施方式
本发明涉及稳定产生至少RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)或它们的功能衍生物的细胞。在一个具体实施方式中,本发明所述细胞稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)或它们的功能衍生物。
本发明所述细胞是重组细胞,这表示这些细胞是导致细胞基因组序列与异源序列(即源自不同细胞或生物的序列)重组的体外目的性基因操作的结果。从分离的细胞开始制备重组细胞,其具有不同于起始细胞的遗传和/或表型特征,而且还提供至少RNA聚合酶、一种或几种非节段负链RNA病毒的N蛋白和P蛋白的稳定表达或生成。本发明的细胞作为人体以外的产品请求保护。
术语“稳定产生”是指细胞在等于或多于约65次细胞分裂(有利情况下只要细胞存活)后表达至少RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白。根据本发明的一个具体实施方式,重组细胞持续表达或产生至少三种蛋白,即至少RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白。根据本发明的一个具体实施方式,保留了这三种蛋白质的完整性即原始的氨基酸序列,以确保表达或产生的蛋白质始终是相同的。
RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白的稳定产生不依赖于细胞内携带这些蛋白质编码序列的质粒的存在。因此,即使可在体外或先体外后体内的细胞操作的某个具体步骤中使用质粒,稳定产生这三种蛋白质或至少这三种蛋白质的所形成的重组细胞不再含有质粒。通过这种方式,表达不依赖所述质粒,这点不同于蛋白质表达受质粒驱动的重组细胞。
在本发明的一个具体实施方式中,RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白的稳定表达不需要药物例如抗生素的存在,即稳定表达不需要选择压力。因此,稳定产生不需要质粒的强制性存在来维持生存,其中所述质粒携带待表达蛋白质的编码序列。
本发明的另一特征是所述的至少三种蛋白质即至少RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白中的每一种随时间变化以类似水平生成或表达。本文使用的“类似水平”是指所述三种蛋白质中每一种的表达在细胞生命期间是稳定的,即使在细胞分裂后也是稳定的,与细胞生命不同时期计算的平均表达相比,其表达水平的差异不超过约30%,特别是不超过约20%,优选不超过约10%。
本发明所述细胞表达或产生的RNA聚合酶是适合在拯救系统内合成源自cDNA克隆的非节段单链负义病毒RNA(vRNA)的任何聚合酶。聚合酶的性质基本取决于用于拯救系统(也称为反求遗传学或从克隆cDNA到负义RNA病毒的从头合成)且位于非节段单链负义RNA病毒的cDNA克隆中的RNA启动子聚合酶序列的性质。作为一个实例,RNA聚合酶是T7噬菌体RNA聚合酶或其核形式(nlsT7)。
术语“N蛋白”和“P蛋白”分别指非节段单链负股RNA病毒的核蛋白(N)和非节段单链负股RNA病毒的磷蛋白(P)。表1列出了可衍生出N蛋白和/或P蛋白的非节段单链负股RNA病毒的科、亚科、属或种。
在一个具体实施方式中,非节段负链RNA病毒的N蛋白和P蛋白来自相同的病毒,或来自相同的病毒株或来自不同的病毒株。在另一实施方式中,非节段负股RNA病毒的N蛋白和P蛋白来自不同的非节段负链RNA病毒。
表1:单分子负链RNA病毒目的几种非节段负链RNA病毒(NNV)的科、亚科、属和种。
在一个具体实施方式中,N蛋白和P蛋白源自单链负义病毒,优选为副粘病毒科病毒,优选为副粘病毒亚科病毒,最优选为麻疹病毒属病毒。麻疹病毒属的一个实例是麻疹病毒(MV),特别是减毒的非免疫抑制株,例如批准用于疫苗的毒株,尤其是Schwarz MV株或Edmonston(Ed)株,或来自这些毒株的衍生物。经严格审核实验数据和临床数据,FDA(美国食品和药品管理局)将批准用于疫苗的病毒株定义为具有下列属性:安全性、有效性、质量和可复制性(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm)。
本申请每次提及非节段负链RNA病毒时,其有可能特别指本文所列的具体病毒,特别指麻疹病毒,特别指Schwarz株。
术语“它们的功能衍生物”系指包括所述RNA聚合酶和/或N蛋白和/或P蛋白片段的任何功能变体,只要所述功能衍生物保留了其来源蛋白质的活性、至少作为核糖核蛋白复合物(RNP复合物)的活性,其中所述功能衍生物在病毒基因组的转录和复制中发挥作用并可在拯救系统内从克隆cDNA产生非节段负义RNA病毒。
功能变体定义为编码所述功能变体蛋白质的核酸,其具有至少一个下列特征:
-编码所述功能变体的核酸在高严格条件下与编码野生型(参比)RNA聚合酶的核酸或与编码鉴定为非节段负链RNA病毒株或病毒的N蛋白和P蛋白的核酸杂交。Sambrook等人在《分子克隆:实验手册》(1989)中定义了高严格条件。这些高严格条件包括:使用5X SSC,0.5%SDS,1.0mMEDTA(pH 8.0)的预洗液洗涤硝酸纤维素滤膜;杂交条件为50%甲酰胺,6XSSC,42℃;洗涤条件为68℃,0.2X SSC和0.1%SDS。本领域普通技术人员知晓各种方案。而且,技术人员应认识到,可根据实验限制因素按需要调节温度和洗涤液的盐浓度;
-编码所述功能变体的核酸与编码所述RNA聚合酶、N蛋白或P蛋白的天然核酸具有至少80%的相似性,优选为90%的相似性,更优选为95%或甚至99%的相似性,其中所述相似性按两条序列的全长进行计算;
-编码所述功能变体的核酸与编码所述RNA聚合酶、N蛋白或P蛋白的天然核酸的差异是至少一个核苷酸置换,优选为1、2、3、4或5个置换,任选为保守置换(不改变氨基酸序列的核苷酸置换),或至少一个核苷酸缺失或添加,优选为1、2、3、4或5个核苷酸缺失或添加。
片段在本申请中定义为全长RNA聚合酶、N蛋白或P蛋白的一部分,只要该片段具有与衍生出该片段的整个蛋白质相同的活性,其中该片段具有至少与本文公开的核糖核蛋白复合物(RNP复合物)相同的活性。在一个具体实施方式中,所述片段代表了至少70%、特别为80%、更特别为90%甚至95%的所述全长蛋白质。
因此,当提及RNA聚合酶、N蛋白或P蛋白或它们的编码序列时,其说明同样适用于本文定义的它们的功能衍生物。
根据一个具体实施方式,本发明的一种重组细胞包含整合到其基因组中的至少一个拷贝的编码RNA聚合酶的核酸,至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸。任选情况下,编码上述三种蛋白质的核酸的每一种或至少其中之一处于转录调控元件的控制之下。术语“整合到基因组中”是指处于转录调控元件控制下的至少一个拷贝的核酸位于重组细胞的基因组内,其中重组细胞处于可使所述细胞稳定表达所述核酸编码的蛋白质的条件下。在一个具体实施方式中,本发明所述重组细胞还包含整合到其基因组中的至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒L蛋白的核酸。
“至少一个拷贝”是指编码RNA聚合酶和/或N蛋白和/或P蛋白和/或L蛋白的核酸可以一个或数个拷贝存在,优选恰好为或至少为2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多拷贝,这取决于这些蛋白质中每一种所需的表达水平。
在本发明的一个具体实施方式中,本发明所述细胞还含有整合到细胞基因组中的至少一个拷贝的DNA瓣。DNA瓣是反转录病毒特别是慢病毒或反转录病毒样来源的核苷酸序列,其包含两个必需区域,即cPPT(中央多聚嘌呤序列)和CTS(顺式作用终止区),其中cPPT和CTS区在含有它们的DNA复制期间诱导出三链DNA结构(先前Zennou等人,2000和WO99/55892以及WO01/27300已进行阐述)。在一个具体实施方式中,所述DNA瓣紧挨内部启动子上游插入,可实现编码RNA聚合酶、N蛋白、P蛋白以及可能L蛋白的核酸的转录。DNA瓣(cPPT-CTS)以功能性定向插入到本发明源自反转录病毒的载体上,即cPPT区位于CTS区的5′(载体的5′部分对应于含有引物结合位点(PBS)的LTR,而载体的3′部分对应于含有3′PPT的区域)。
适合于本发明的DNA瓣可从反转录病毒特别是从慢病毒或反转录病毒样的生物例如反转录转座子得到,或合成制备(化学合成),或通过扩增来自任何反转录病毒特别是来自慢病毒核酸的DNA瓣经例如聚合酶链式反应(PCR)而得到。可从反转录病毒特别是慢病毒,特别是人反转录病毒或慢病毒,特别是从HIV反转录病毒、CAEV(山羊关节炎脑炎病毒)病毒、EIAV(马感染性贫血病毒)病毒、VISNA病毒、SIV(猴免疫缺陷病毒)病毒或FIV(猫免疫缺陷病毒)病毒得到DNA瓣。在一个更加优选的实施方式中,从HIV反转录病毒例如HIV-1或HIV-2病毒或这两种类型的任何不同分离物中得到DNA瓣。
优选的DNA瓣包含SEQ ID NO:1至7定义的序列或由SEQ ID NO:1至7定义的序列组成。值得注意的是,使用的DNA瓣是从其天然(病毒基因组)核苷酸背景中分离出来的,即从慢病毒中天然含有DNA瓣的pol基因分离出来的。因此,本发明使用的DNA瓣缺失了pol基因不必要的5′和3′部分,并与不同来源的序列重组。根据一个具体实施方式,DNA瓣具有约90至约150个核苷酸的核苷酸序列,特别具有约100至约140个核苷酸的核苷酸序列。
本发明还涉及可通过其基因组与(1)包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码RNA聚合酶的核酸的表达载体;(2)包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸的表达载体;以及(3)包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸的表达载体重组而得到的细胞。上述定义适用于这些细胞。
本发明还涉及可通过其基因组与(1)包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码RNA聚合酶的核酸的表达载体;(2)包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸的表达载体;(3)包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸的表达载体以及(4)包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒L蛋白的核酸的表达载体重组而得到的细胞。上述定义适用于这些细胞。上述定义适用于这些细胞。
本发明包括可通过其基因组与包含至少一个拷贝的编码RNA聚合酶的核酸、至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸、至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸和DNA瓣的表达载体重组而得到的细胞。上述定义适用于这些细胞。在一个具体实施方式中,表达载体还包含至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒L蛋白的核酸。
本发明还涉及源自反转录病毒的表达载体,其包含上述的DNA瓣和至少一种编码拯救非节段负链RNA病毒所必需的蛋白质的核酸。在本发明的一种具体载体中,所述核酸编码选自RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒N蛋白、非节段负链RNA病毒P蛋白和非节段负链RNA病毒L蛋白的蛋白质。
术语“基因组”系指任何核酸分子,其在细胞内的存在不依赖于压力选择,即其在细胞内的存在是永久的和/或不依赖于环境条件。术语“基因组”不包括质粒。术语“基因组”主要指存在于细胞核内的核酸分子(核基因组)而非存在于细胞质内的核酸分子,所述“基因组”包括例如染色体。在一个具体实施方式中,术语“基因组”还包括存在于特定细胞区室例如细胞器如线粒体(线粒体基因组)或叶绿体(叶绿体基因组)内的核酸分子。在一个具体实施方式中,所述基因组来自真核生物细胞。
源自反转录病毒的载体,特别是源自慢病毒的载体和更具体而言源自HIV-1的载体是包含反转录必需元件、特别是可能突变的LTR和有利地DNA瓣的病毒基因组,其中LTR含有下文图示的部分缺失区特别是U3缺失区。这些LTR和DNA瓣区域可以是源自反转录病毒的表达载体中反转录病毒特别是慢病毒来源的仅有的序列。源自反转录病毒的载体在任何情况下均不含有编码全长反转录病毒蛋白质的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中,源自反转录病毒的载体包含DNA瓣和至少一种编码拯救上述非节段负链RNA病毒所必需蛋白质的核酸以及相应病毒基因组的LTR或由DNA瓣和至少一种编码拯救上述非节段负链RNA病毒所必需蛋白质的核酸以及相应病毒基因组的LTR组成。
本发明的表达载体包含DNA瓣和编码RNA聚合酶或其功能部分的核酸。这类载体可为2006年12月14日以编号I-3702保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7,它是一种HIV-1表达载体,其包含DNA瓣(TRIP)、缺失U3区启动子和增强子的LTR、CMV启动子和编码T7噬菌体RNA聚合酶的核酸,特别是具有序列SEQ ID NO:8的核酸;或是2006年12月14日以编号I-3703保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7,它是一种HIV-1表达载体,其包含DNA瓣(TRIP)、缺失U3区启动子和增强子的LTR、CMV启动子和编码T7噬菌体聚合酶核形式的核酸,特别是具有序列SEQ ID NO:10的核酸。
本发明的表达载体包含DNA瓣和编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸。这种载体可为2006年12月14日以编号I-3700保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N,它是一种HIV-1表达载体,其包含DNA瓣(TRIP)、缺失U3区启动子和增强子的LTR、CMV启动子和编码MV Schwarz的N蛋白的核酸,特别是具有序列SEQ ID NO:12的核酸。
本发明的表达载体包含DNA瓣和编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸。这种载体可为2006年12月14日以编号I-3701保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-P,它是一种HIV-1表达载体,其包含DNA瓣(TRIP)、缺失U3区启动子和增强子的LTR、CMV启动子和编码MV Schwarz的P蛋白的核酸,特别是具有序列SEQ ID NO:14的核酸。
本发明的另一表达载体包含编码非节段负链RNA病毒L蛋白的核酸。这类载体可为2007年12月18日以编号I-3881保藏在CNCM的pEMC-LSchw质粒。一种编码L蛋白的具体核酸是具有SEQ ID NO:19的核酸。
上述引用的载体CNCM I-3700至3703均包含在大肠杆菌(JM109)菌株内,其中在37℃下添加氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上振荡培养大肠杆菌。
本发明涉及插入到本文提及的保藏质粒内的多核苷酸所包含的每种核苷酸片段和任何核苷酸片段,特别涉及依据本公开内容适合设计插入物的每个区域和任何区域。本发明还涉及这些片段用于构建本发明质粒的用途。
上述四种质粒是可用于细胞重组以得到本发明重组细胞的载体的实例。但是,这些实例并不构成对本发明的限制;因此正如上述,N蛋白和P蛋白(或其功能衍生物)可源自任何非节段负链RNA病毒,T7 RNA聚合酶可为任何RNA聚合酶,CMV启动子可为任何启动子,TRIP DNA瓣可为任何DNA瓣,HIV-1表达载体可为任何载体,特别是任何病毒载体。
本发明的其他表达载体包含DNA瓣和编码非节段负链RNA病毒L蛋白的核酸,或包含DNA瓣和编码RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒N蛋白、非节段负链RNA病毒P蛋白和任选地非节段负链RNA病毒L蛋白的核酸。
术语“表达载体”是指除了明确提及的元件外,载体包含驱动编码目的蛋白的核酸表达所必需的所有元件(表达调控元件),特别是转录调控元件。“转录调控元件”定义为参与整合到基因组中的核酸的转录调控的任何DNA区域,其包括启动子例如CMV、EF1-α或mPGK(鼠磷酸甘油激酶),或更宽泛包括任何适合于插入到反转录病毒载体特别是慢病毒载体的启动子、增强子或顺式作用调控元件。根据重组细胞的性质选择这些元件,特别是启动子。根据需要的表达水平或重组细胞来确定适宜的启动子是本领域技术人员所知晓的。值得指出的是,当重组细胞含有几种编码目的蛋白的异源核酸(也称为多核苷酸)时,所述转录调控元件可能对于所有的核酸是唯一的,或可能被其中部分核酸共享,或相比之下每种核酸可能与特定的转录调控元件结合。在后一种情况下,几种转录调控元件可以是相似或不同的。
DNA瓣在重组步骤中使用的所有载体中的存在导致在DNA瓣位置处形成DNA三链体结构(三条链)(三链体结构由位于cPPT和CTS区之间且包含CTS区的区域组成),使得携带DNA瓣的核酸输入细胞的细胞核(通过核膜孔)并进一步整合到该细胞的基因组内。DNA瓣起着载体核输入的顺式决定因子的作用。第一方面,DNA瓣的存在对于核酸重组到并整合到非分裂细胞内部具有重要的意义,因为没有细胞分裂(以及膜解体)时,输入(以及核酸由此整合到细胞基因组内)仅具有残余活性;因此含有DNA瓣的载体是可转导非分裂细胞的非复制型反转录病毒载体。第二方面,通过极大地提高整合有含DNA瓣的核酸的细胞百分比,DNA瓣的存在对于核酸重组到并整合到分裂细胞内部也具有重要的意义。正如本说明书描述,通过刺激载体DNA的核输入,DNA瓣在表达载体内的插入大大提高了体外和体内基因转移(Sirven等人,2001;Zennou等人,2001)。含有DNA瓣的HIV载体(TRIP载体)可转导原代的B细胞和T细胞、巨噬细胞、树突细胞等,其效率比缺乏DNA瓣的其他HIV载体高10倍。通常80-90%的细胞可被转导。
以含有DNA瓣和编码至少三种目的蛋白的核酸的载体进行重组以及这些核酸整合到基因组后,重组细胞稳定地产生RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白。
用于得到本发明重组细胞的本发明表达载体是病毒载体,特别是病毒表达载体,例如源自反转录病毒特别是源自慢病毒的载体例如源自HIV、FIV或SIV的载体。更具体而言,源自慢病毒的载体是源自人慢病毒的载体,例如HIV表达载体,特别是源自HIV-1或HIV-2的载体。在一个优选的实施方式中,病毒载体是含有上述DNA瓣和编码至少三种目的蛋白的至少一种核酸的HIV表达载体。HIV载体是经典的置换型反转录病毒载体,其中整个病毒编码序列基本上被置换为待转移的序列。HIV载体因此仅表达位于两个HIV LTR之间或突变LTR之间且处于DNA瓣控制下的异源核酸。这些载体因此可容纳多达5-6kb的大的多核苷酸。本发明的一个具体实施方式是一种上述的HIV表达病毒,特别是一种HIV-1表达载体,其中HIV-1 LTR中U3区的启动子和增强子被缺失(ΔU3)。以前已表明这种特定的缺失可增加载体所含的核酸的表达,特别是当核酸与启动子结合时。
在一个具体实施方式中,本发明的重组细胞可通过其基因组或与质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N 和HIV-1-TRIPΔU3.CMV-P,或与质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N和HIV-1-TRIPΔU3.CMV-P进行重组得到。
本发明的细胞可为原核细胞或真核细胞,特别是动物细胞或植物细胞,更具体是哺乳动物细胞例如人细胞或非人的哺乳动物细胞。在一个具体实施方式中,在细胞基因组重组前,从原代培养物或细胞系分离得到细胞。本发明的细胞可为分裂细胞或非分裂细胞。可重组以提供本发明重组细胞的细胞实例是HEK 293(人胚肾)细胞,其中细胞系293以编号CRL-1573保藏在ATCC。在一个具体实施方式中,人细胞不是生殖细胞和/或胚胎干细胞。
本发明的重组细胞可为2006年6月14日以编号I-3618保藏在CNCM(法国巴黎)的293-T7-NP细胞系,即与质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N 和HIV-1-TRIPΔU3.CMV-P重组的HEK-293细胞。本发明重组细胞的另一实例是2006年8月4日以编号I-3662保藏在CNCM的293-nlsT7-NP MV细胞系,即与质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N和HIV-1-TRIPΔU3.CMV-P重组的HEK-293细胞。
在本发明的另一实施方式中,本发明的重组细胞进一步与表达载体进行重组,其中该表达载体包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸。L蛋白的表达可为暂时性的,且受不含DNA瓣的质粒驱动,或相比之下为稳定的,且受含有上述DNA瓣的载体驱动。携带至少一个拷贝的编码L蛋白的核酸的质粒或载体的重组可与含有RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白编码序列的载体的重组同时发生或发生在其之后。
因此,本发明还涉及稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒N蛋白和非节段负链RNA病毒P蛋白或它们的功能衍生物,并且稳定产生或不稳定产生非节段负链RNA病毒L蛋白的细胞。
L蛋白源自表1引用的任何非节段负链RNA病毒。在一个具体实施方式中,L蛋白来自与N蛋白和/或P蛋白相同的非节段负链RNA病毒,特别是来自相同的病毒株。在另一实施方式中,L蛋白来自与N蛋白和/或P蛋白不同的非节段负链RNA病毒。
在一个具体实施方式中,L蛋白来自副粘病毒科病毒,优选为副粘病毒亚科病毒,最优选为麻疹病毒属病毒。麻疹病毒属的一个实例是麻疹病毒(MV),特别是减毒的非免疫抑制株,例如批准用于疫苗的毒株,特别是Schwarz MV株或甚至是Edmonston(Ed)株。一种具体的L蛋白是MV病毒的L蛋白(SEQ ID NO:16)或插入到pEMC-LSchw质粒的序列所编码的L蛋白,特别是位于SEQ ID NO:19中1425至7976位核苷酸之间的序列所编码的L蛋白。
在一个具体实施方式中,相对于野生型L蛋白,L蛋白的序列不可进行修饰,而且必须具有功能,即当L蛋白反式互补宿主细胞内的N蛋白、P蛋白和T7聚合酶时,可实现颗粒或病毒的生成。以编码N蛋白、P蛋白和T7(或nlsT7)聚合酶的载体、编码待检测L蛋白的载体和包含前导序列、启动子、报道基因(例如GFP)和尾随序列的微型基因组转染感受态细胞,进行检测,以测定携带L蛋白的克隆的有效功能。表达报道基因的颗粒的生成揭示了L克隆的功能。
本发明还描述了依据本说明书进一步与非节段负链RNA病毒的非节段负链cDNA克隆即病毒基因组的反基因组RNA(+)链重组的细胞。用于描述本发明分子的核苷酸序列的“cDNA”仅涉及这一事实,即通过非节段负链RNA病毒的病毒颗粒的基因组(-)RNA,特别是麻疹病毒的病毒颗粒的基因组(-)RNA,最优选为非节段负链RNA病毒的病毒颗粒的全长基因组(-)RNA的反转录得到最初的所述分子。这不应视为用于制备该cDNA克隆的方法的限制。本发明因此在表达“cDNA”内包括每种DNA,只要其具有以上定义的核苷酸序列。包括DNA的纯化核酸或质粒因此包含在本发明cDNA的含义内,只要所述核酸特别是DNA符合以上给出的定义。
在一个具体实施方式中,非节段负链RNA病毒的cDNA克隆在病毒序列的上游含有转录调控元件。在一个优选的实施方式中,这些元件与位于包含上述N蛋白、P蛋白和/或L蛋白的表达载体中的元件相同。在一个更加优选的实施方式中,所述元件是T7 RNA聚合酶启动子。
在一个实施方式中,非节段负链RNA病毒的cDNA克隆来自于与N蛋白和/或P蛋白和/或L蛋白相同的非节段负链RNA病毒,特别是来自相同的病毒株。在另一个实施方式中,非节段负链RNA病毒的cDNA克隆来自于与N蛋白和/或P蛋白和/或L蛋白不同的非节段负链RNA病毒。
在一个具体实施方式中,cDNA克隆来自非节段负链RNA病毒,例如副粘病毒科病毒,优选为副粘病毒亚科病毒,最优选为麻疹病毒属病毒。麻疹病毒属的一个实例是麻疹病毒(MV),特别是减毒的非免疫抑制株,例如批准用于疫苗的毒株,特别是Schwarz MV株或Edmonston(Ed)株。而且,与下文定义的野生型毒株或病毒相比,可改变非节段负链RNA cDNA克隆的核苷酸序列。
本发明还涉及细胞培养物,其中所述细胞是整篇说明书所定义的细胞,特别涉及稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)或它们的功能衍生物的细胞培养物。在另一实施方式中,本发明还涉及稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒N蛋白和非节段负链RNA病毒P蛋白或它们的功能衍生物,并且稳定产生或瞬时产生非节段负链RNA病毒L蛋白的细胞培养物。
在一个实施方式中,待重组的细胞培养物是原代培养物,即以直接从动物(任选为非人类)或植物获得的细胞或组织制备的培养物。在另一实施方式中,待重组的细胞培养物是细胞系,即原代培养物的第一次传代或细胞随后连续传代所形成的细胞群体。
另一方面,本发明还涉及使用本发明所述细胞产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒的各种方法。
第一种产生感染性的重组的非节段负链病毒的方法包括下列步骤或由下列步骤组成:
a.将稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒聚合酶辅因子磷蛋白(P)的细胞或细胞培养物与非节段负链RNA病毒的cDNA克隆和包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的载体进行重组,
b.将所述重组细胞或重组细胞的培养物转移到可维持非节段负链RNA病毒的复制和产生的细胞上,以及
c.回收来自步骤b的共培养物的感染性的重组的非节段负链RNA病毒。
依据本发明的第二种方法是一种产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒的方法,其包括下列步骤或由下列步骤组成:
a.将稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒聚合酶辅因子磷蛋白(P)的细胞或细胞培养物与非节段负链RNA病毒的cDNA克隆和包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的载体进行重组;以及
b.回收来自所述重组细胞或重组细胞培养物的感染性的重组的非节段负链RNA病毒。
本文使用的“重组”是指向细胞引入例如载体形式的至少一种多核苷酸,其中所述多核苷酸整合到(全部或部分)或不整合到细胞的基因组中(例如上述定义)。根据一个具体实施方式,可以第一种多核苷酸得到重组,其中第一种多核苷酸是非节段负链RNA病毒的cDNA克隆,本说明书其他地方讨论了其定义、性质和任选修饰。重组还可包括或者可选地包括引入一种多核苷酸,其是编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的载体,本文已描述了其定义、性质和表达的稳定性。
在这些方法中,稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒聚合酶辅因子磷蛋白(P)的细胞或细胞培养物是本说明书所定义的细胞或本说明书所定义的细胞培养物,即这些细胞或细胞培养物也是重组细胞,原因是已通过引入一种或多种上述定义的多核苷酸对它们进行了修饰。在本发明的一个具体实施方式中,稳定产生RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白的细胞或细胞培养物不产生非节段负链RNA病毒L蛋白或不稳定产生非节段负链RNA病毒L蛋白,例如使其瞬时表达或产生。
本文使用的“转移”系指重组细胞被铺板到不同类型的细胞上,特别是被铺板到单层的不同类型的细胞上。后面的这些细胞是感受态细胞,既能够维持感染性的重组的非节段负链RNA病毒的复制和产生,即分别在细胞内部形成感染性病毒,又可能将这些感染性病毒释放到细胞外部。这种转移导致本发明的重组细胞与上一句定义的感受态细胞的共培养。当重组细胞不是有效的产生病毒的培养物即不能有效地从这些重组细胞中回收感染性病毒时,上述转移可为附加步骤即任选步骤。本发明重组细胞进一步与非节段负链RNA病毒的cDNA克隆和任选地包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的载体进行重组后,引入该步骤。
在本发明的一个具体实施方式中,需要一个转移步骤,因为通常因其易于重组的能力而选择的重组细胞不能足够有效地维持和产生重组的感染性病毒。在所述实施方式中,上述定义方法的步骤a的细胞或细胞培养物是依据本发明的重组细胞或重组细胞的培养物,特别是重组的HEK-293细胞,例如2006年6月14日以编号I-3618保藏在CNCM的293-T7-NP细胞系或2006年8月4日以编号I-3662保藏在CNCM的293-nlsT7-NP MV细胞系。
能够维持非节段负链RNA病毒复制和产生的细胞可以是可与本发明重组细胞共培养的任何细胞类型,但不一定是相同的界、门、纲、目、科、属或种的细胞。感受态细胞的实例是Vero(非洲绿猴肾)细胞或CEF(鸡胚成纤维细胞)细胞。可从得自EARL Morizeau(8 rue Moulin,28190 Dangers,France)的鸡受精卵或从鸡受精卵的其他生产商或从MRC5细胞(ATCCCCL171;肺成纤维细胞)制备CEF细胞。
在本发明的另一实施方式中,不需要转移步骤,因而没有进行该步骤。提供一种产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒的方法,这是本发明的优点之一。该方法容易进行,比常规方法更快更低廉,而且可回收没有污染物的重组感染性病毒。这一点可使用具有下列特征的本发明重组细胞实现:
-稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒的核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒的磷蛋白(P),以及
-可从这些重组细胞有效回收感染性重组病毒,而没有不需要的病毒和/或其他类型细胞的污染。
本文使用的“感染性重组病毒的回收”系指将细胞之前产生的感染性病毒从细胞中释放出来并将其与培养细胞分离开来的任何方法。当从本发明的重组细胞回收感染性重组病毒而无其他细胞类型的参与时,这种回收被称为是“直接的”。相反,当通过不同于本发明重组细胞的另一种细胞类型来回收感染性重组病毒时,这种回收被称为“间接的”。正如先前提及,本发明第一次报道了感染性的重组的非节段负链RNA病毒的直接回收。
在本发明的具体方法中,重组步骤不包括将稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒聚合酶辅因子磷蛋白(P)的细胞或细胞培养物与包含编码非节段负链RNA病毒聚合酶大蛋白(L)的核酸的载体进行重组的步骤。在这种情况下,本发明重组细胞经选择具有表达L蛋白的能力,特别是本发明重组细胞之前已与包含编码RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的载体进行了重组,其中编码L蛋白的核酸整合或未整合到细胞的基因组中。
在适当的情况下,携带辅助蛋白(非P蛋白、非L蛋白或非N蛋白,或非RNA聚合酶)的载体可任选用于本发明所述方法,特别是在使用缺失这些蛋白质的基因组或cDNA克隆时。这类辅助蛋白是C蛋白、V蛋白、NS1蛋白、NS2蛋白、M蛋白、M2蛋白和/或SH蛋白。携带这些辅助蛋白编码序列的载体可任选包含上述定义的cDNA瓣。
根据本领域以前描述的方法,RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白在本发明重组细胞中生成的稳定性产生一些优点:
-本发明所述方法不必需包括转移步骤;
-所述方法不包括Parks等人(1999)报道的热激步骤。事实上,已表明该步骤可提高病毒N蛋白和P蛋白以及RNA聚合酶的合成效率,这些蛋白是以质粒上携带的核酸合成的。但是在本发明中,核酸被整合到细胞基因组中,已表明这些蛋白质的表达是稳定的,而且/或者它们的水平适合启动从头衣壳化。
-所述方法产生了大量的感染性病毒,因为RNA聚合酶、N蛋白和P蛋白的产生是稳定的,而且不依赖它们来自质粒的表达。因此,重组后106个重组细胞中有约100-400个传播了感染性病毒(拯救事件的数目)。这比以Radecke等人(1995)的方法从106个转染细胞得到1-6个要好得多。(1995).在所述方法的一个具体实施方式中,106个重组细胞的拯救事件的数目在20以上、50以上、100以上、200以上、300以上、400以上或500以上。
最后,本发明的另一个优点是可重组和可用于实施本发明的种类繁多的细胞。事实上,重组细胞可为任何真核细胞,特别是任何哺乳动物细胞,或是非人类细胞或是人细胞。在一个具体实施方式中,本发明的重组细胞是人成纤维细胞,特别是MRC5细胞系(人肺成纤维细胞)。本发明特别适用于不分裂的细胞。
根据本发明,非节段负链RNA病毒的cDNA克隆来自MV病毒,特别是减毒病毒,特别是减毒的非免疫抑制株,例如批准用于疫苗的毒株,例如Schwarz MV株。cDNA克隆是编码非节段负链RNA病毒的全长反基因组的DNA序列。
在本发明的一个具体实施方式中,N蛋白、P蛋白和L蛋白以及cDNA克隆均来自相同的病毒,其可为表1中的任何病毒,特别是上文公开的MV病毒例如麻疹病毒的Schwarz MV株。WO 98/13505已经公开了EdmonstonB.株和Schwarz株的核苷酸序列。RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶,而与非节段负链RNA病毒的N蛋白、P蛋白和L蛋白的性质无关。一种具体的cDNA序列是SEQ ID NO:18所定义的Schwarz株cDNA的序列。这种cDNA可从pTM-MVSchw得到,其是一种源自Bluescript的质粒,其含有处于T7RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒疫苗株Schwarz的完全序列。其大小是18967nt。
或者,非节段负链RNA病毒的cDNA克隆源自表1的任何病毒。一种衍生出cDNA克隆的具体重组麻疹病毒是Schwarz株,特别是获批的Schwarz疫苗株,例如Aventis Pasteur(法国)以商品名Rouvax生产的Schwarz疫苗株。
“减毒株”在本文定义为在相同宿主体内无毒或比亲株毒性小但在施用给宿主时仍保持免疫原性和可能的佐剂性的毒株,即保留T细胞和B细胞优势免疫表位和可能的佐剂性,例如诱导产生T细胞共刺激蛋白或细胞因子IL-12。在一个具体实施方式中,减毒株是“批准的疫苗株”,即国家卫生部门或地方卫生部门授予该产品上市许可(法律指定)用于疫苗生产的毒株。因此,已表明“批准的疫苗株”安全稳定而且可提供有效保护(免疫原性和佐剂性)。评估毒株在相同的许可细胞系上许多次传代后仍基本保留的属性,以此衡量毒株的稳定性。
本文使用的“源自”是指与野生型病毒或毒株之一相比其核苷酸序列被修饰的任何cDNA克隆。这种修饰可为核苷酸序列内特别是病毒或病毒株蛋白质编码序列内的至少一个置换、缺失或插入。在另一实施方式中,通过插入至少一种异源核酸来修饰核苷酸序列,其中异源核酸是病毒或毒株中非天然存在的序列,其中病毒或毒株中插入了至少一种该核酸或不源自麻疹病毒抗原的序列。而且,可通过缺失部分野生型病毒基因组和插入异源核酸来修饰cDNA克隆。
在一个优选实施方式中,指出由一种或几种异源核酸组成或包含一种或几种异源核酸的衍生cDNA克隆,符合所谓的6个核苷酸的规则。因此,衍生的cDNA克隆具有多六聚体的长度,即6的倍数。对于源自副粘病毒科和特别是源自麻疹病毒的cDNA克隆,特别实现了该要求。正如本领域技术人员所知晓,一些非节段负链RNA病毒不符合该规则。
任何异源核酸可插入到cDNA克隆的核苷酸序列内,只要这种插入不妨碍感染性的重组的非节段负链病毒的产生(容许位点)。在一个具体实施方式中,天然病毒基因组的插入或缺失提供了长度是6的倍数的多核苷酸。因此,即使基因组长度不是6的倍数,修饰由6个或6的倍数个的缺失和/或插入组成。
因此,异源核酸序列可编码一种或多种可在确定的宿主体内激发体液免疫应答和/或细胞免疫应答(例如CTL或CD4应答)的肽,以抵抗源自细菌或寄生虫的生物或特别是病原生物,例如病毒,特别是反转录病毒、黄病毒或冠状病毒。因此,这类肽的氨基酸序列是包含抗原至少一个表位特别是保守表位的氨基酸序列,其中表位天然暴露于抗原上,或是通过抗原的突变或修饰或组合而得到或暴露的表位。可插入到cDNA克隆的异源核酸特别编码病毒的结构抗原(包括结构抗原的抗原性片段或所述抗原或片段的衍生物),其中结构抗原包括反转录病毒,例如人反转录病毒,特别是慢病毒,特别是HIV-1或HIV-2、黄病毒或冠状病毒的包膜,例如包膜抗原或衣壳抗原。具体而言,这类抗原是特别来自包括HIV-1或HIV-2在内的AIDS病毒的包膜,来自HIV的衣壳或来自黄热病病毒的包膜或来自西尼罗病毒的包膜,或来自登革病毒(DV)的包膜,日本脑炎病毒(JEV)的包膜或SARS相关冠状病毒的包膜。但可有利地使用其他的反转录病毒抗原、黄病毒抗原或冠状病毒抗原,以得到可激发抗所述反转录病毒或黄病毒的抗体和/或可激发抗反转录病毒或黄病毒的中和抗体的重组麻疹病毒。在另一实施方式中,由异源核酸序列编码或包含的肽是肿瘤抗原或癌细胞的细胞表面特异表达的抗原。根据本发明的另一实施方式,这些序列编码多表位或抗原,它们或者激发或还激发抗反转录病毒或黄病毒的细胞免疫应答。
有利地,由本发明所述方法产生的重组麻疹病毒还可激发抗麻疹病毒的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。但这种应答不是必须的,只要确实得到了抗上文公开的表位或多表位或抗原的免疫应答。
在本发明的一个优选实施方式中,异源核酸编码来自HIV反转录病毒的蛋白质,特别是HIV的包膜抗原,特别是源自HIV-1或HIV-2包膜蛋白或糖蛋白的肽。这方面的目的抗原特别是HIV-1的gp160、gp120和gp41或者HIV-1的gp140、GAG或TAT。在本发明的一个具体实施方式中,异源氨基酸序列是源自HIV-1的重组gp160、gp120或者HIV-1的重组gp140、GAG或TAT。
在另一实施方式中,单个或联合地缺失或部分缺失gp120(或gp160)抗原的V1、V2和/或V3环,使得保守表位暴露于得到的重组gp120抗原上。Fields virology(Fields B.N等人.Lippincott Raven publishers 1996,1953-1977页)已具体公开了HIV-1的gp120(或gp160)抗原的V1、V2和/或V3环。
在另一实施方式中,异源核酸编码源自HIV-1的gp120(或gp160)抗原的肽,其中gp120(或gp160)抗原的V1、V2和/或V3环被单个或联合地置换或部分置换,使得保守表位暴露于得到的重组gp120(或gp160)抗原上。
在另一实施方式中,异源核酸编码源自HIV-1包膜抗原特别是源自gp120抗原的肽,使得V1和V2环被缺失,且V3环被置换为序列AAELDKWASAA。
在另一实施方式中,异源核酸编码肽gp160ΔV3、gp160ΔV1V2、gp160ΔV1V2V3、gp140ΔV3、gp140ΔV1V2、gp140ΔV1V2V3。
含有来自HIV、WNV、YFV、DV或JEV表位的优选cDNA克隆是保藏在CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes-lnstitutPasteur-Paris France)由表II定义的载体,下文给出了它们的特征。
I-2883(pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P)是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Edmonston B株)的完全序列且含有插入到位置2(位于麻疹病毒N基因和P基因之间)ATU的SVIH毒株89.6P的gp160ΔV3+ELDKWAS基因。质粒的大小是21264nt。
I-2884(pMV2(EdB)gp160HIV89.6P)是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Edmonston B株)的完全序列且含有插入到位置2(位于麻疹病毒N基因和P基因之间)ATU的SVIH毒株89.6P的gp160基因。质粒的大小是21658nt。
I-2885(pMV2(EdB)gp140HIV89.6P)是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Edmonston B株)的完全序列且含有插入到位置2(位于麻疹病毒N基因和P基因之间)ATU的SVIH毒株89.6P的gp140基因。质粒的大小是21094nt。
I-2886(pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P)是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Edmonston B株)的完全序列且含有插入到位置2(位于麻疹病毒N基因和P基因之间)ATU的SVIH毒株89.6P的gp140ΔV3(ELDKWAS)基因。质粒的大小是21058nt。
I-2887(pMV2(EdB)-NS1YFV17D)是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Edmonston B株)的完全序列且含有插入到位置2(位于麻疹病毒N基因和P基因之间)ATU的黄热病病毒(YFV 17D)的NS1基因。质粒的大小是20163nt。
I-2888(pMV2(EdB)-EnvYFV17D)是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Edmonston B株)的完全序列且含有插入到位置2(位于麻疹病毒N基因和P基因之间)ATU的黄热病病毒(YFV 17D)的Env基因。质粒的大小是20505个核苷酸。
I-3033(pTM-MVSchw2-Es(WNV))是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Edmonston B株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到ATU的西尼罗病毒(WNV)的分泌包膜(E)的基因。
I-3034(pTM-MVSchw2-GFPbis)是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到ATU的GFP基因。
I-3035(pTM-MVSchw2-p17p24[delta]myr(HIVB))是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到ATU的编码HIVB病毒p17p24Δmyr蛋白的gag基因。
I-3036(pTMVSchw3-Tat(HIV89-6p))是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到ATU的毒株89.6P的Tat基因。
I-3037(pTM-MVSchw3-GFP)是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到具有1个核苷酸缺失的ATU的GFP基因。
I-3038(pTM-MVSchw2-Es)(YFV)是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到ATU的黄热病病毒(YFV)的分泌蛋白的基因。
I-3054(pTM-MVSchw2-gp140[delta]V1 V2 V3(HIV89-6))是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到ATU的编码gp140[delta]V1 V2(HIV 89-6)的基因。
I-3055(pTM-MVSchw2-gp140[delta]V3(HIV89-6))是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到ATU的编码gp14[delta]V3(HIV 89-6)的基因。
I-3056(pTM-MVSchw2-gp160[delta]V1 V2 V3(HIV89-6))是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到ATU的编码gp160[delta]V1 V2 V3(HIV 89-6)的基因。
I-3057(pTM-MVSchw2-gp160[delta]V1 V2(HIV89-6))是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到ATU的编码gp160[delta]V1 V2(HIV 89-6)的基因。
I-3058(pTM-MVSchw2-Gag SIV239 p17-p24[delta] myr-3-gp140(HIV89-6))是源自Bluescript的质粒,其含有处于T7 RNA聚合酶启动子控制下的麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列且表达插入到ATU的编码Gag SIV239 p17-p24[delta]myr-3-gp140(HIV89-6)的基因。
I-3440(pTM-MvSchw2-[EDIII+M1-40]WNV(IS-98-ST1))是源自PTM的质粒,其含有麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列和位于P基因和M基因之间的附加表达单元,其中该单元含有融合到膜蛋白M序列1-40的来自西尼罗病毒(WNV)包膜蛋白结构域III的核苷酸序列(WNV)(WNV IS-98-ST1)。
I-3442(pTM-MvSchw2-[EDIII+ApoptoM]DV1(FGA89))是源自PTM的质粒,其含有麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列和位于P基因和M基因之间的附加表达单元,其中该单元含有融合到膜蛋白M凋亡序列的来自1型登革病毒(FGA89株)包膜蛋白结构域III的核苷酸序列。
I-3441(pTM-MvSchw2-[EDIII]JEV(Nakayama))是源自PTM的质粒,其含有麻疹病毒(Schwarz株)完全感染性基因组的cDNA序列和位于P基因和M基因之间的附加表达单元,其中该单元含有来自日本脑炎病毒(JEV)Nakayama株包膜蛋白结构域III的核苷酸序列。
在一个具体实施方式中,异源核酸编码源自黄热病病毒抗原的肽,其中抗原选自包膜蛋白(Env)、NS1蛋白或它们的免疫原性突变体。当本发明重组麻疹病毒载体中的异源DNA序列源自于黄热病病毒(YFV)时,有利地其选自于Aventis Pasteur以商标销售的YFV 17D 204。
在另一个具体实施方式中,异源核酸编码源自西尼罗病毒抗原的肽,其中抗原选自包膜蛋白(E)、膜前蛋白(preM)或它们的免疫原性突变体。当本发明重组麻疹病毒载体中的异源DNA序列源自西尼罗病毒(WNV)时,有利地其选自于神经毒性株IS 98-ST1。
异源核酸可编码肿瘤特异抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。
本发明的另一优点是有可能向非节段负链RNA病毒的cDNA克隆插入长的异源核酸或大量的异源核酸。因此,可通过插入总序列至少为5kb的一个或多个异源核酸来修饰cDNA克隆。
本发明涉及插入到本文提及的保藏质粒内的多核苷酸所包含的每个核苷酸片段和任何核苷酸片段,特别涉及依据本公开内容适合设计插入物的每个区域和任何区域。本发明还涉及这些片段用于构建本发明质粒的用途。
本发明还涉及产生重组细胞的方法,其中重组细胞稳定表达下列三种蛋白质或至少下列三种蛋白质即RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)或它们的功能衍生物,该方法包括下列步骤或由下列步骤组成:
a.将细胞与至少下列表达载体进行重组:
-包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码RNA聚合酶的核酸的表达载体,
-包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸的表达载体,以及
-包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸的表达载体,以及
b.选择稳定产生至少RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)或它们的功能衍生物的细胞。
或
a.将细胞与至少一种包含下列核酸的表达载体进行重组:
-至少一个拷贝的编码处于启动子控制下的RNA聚合酶的核酸,
-至少一个拷贝的编码处于启动子控制下的非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸,
-至少一个拷贝的编码处于启动子控制下的非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸,以及
-DNA瓣,以及
b.选择稳定产生至少RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)或它们的功能衍生物的细胞。
在本发明的一个具体实施方式中,产生重组细胞的方法还包括将以上方法步骤a得到的重组细胞与包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)或其功能衍生物的核酸的载体进行重组,并选择稳定产生至少RNA聚合酶、非节段负链RNA病核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)的细胞和产生非节段负链RNA病毒大蛋白(L)或其功能衍生物的细胞。
正如本说明书描述,本发明还涉及本发明重组细胞作为辅助细胞的用途,特别是作为辅助细胞在产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒中的用途。
定义的本发明其他实施方式和特征见于下列实施例和附图。
实施例
本发明将在下列实施例中得到进一步地描述,而这些实施例并没有限制权利要求书所记载的本发明范围。
细胞和病毒
Vero(非洲绿猴肾)细胞作为单层培养在添加了5%胎牛血清(FCS)的杜尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中。人肾293(HEK-293)细胞培养在添加了10%FCS的DMEM培养基中。人二倍体MRC5细胞作为单层培养在添加了10%FCS的DMEM培养基中。鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备如下:鸡受精卵(Morizeau,Dangers,France)在38℃下温育9天。无菌条件下收集胚胎。除去头、肢翼和内脏,剪碎胚胎,随后在37℃下以胰蛋白酶消化5-10分钟(胰蛋白酶/EDTA 2.5g/L)。过滤(70μm)以及数次以DMEM高葡萄糖/10%FCS洗涤后,接种细胞(5-7 106个细胞/培养皿),37℃温育过夜,随后用于病毒感染。
质粒构建
为了便于使用重组系统(Invitrogen)进行附加序列的重组,Smal消化HIV-1-TRIP-ΔU3-BSX质粒载体(Zennou等人,2000),使其线性化,随后通过连接反应引入盒(attb1/attb2 Seq)。使用PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene)和含有重组序列(以下划线标示)的下列引物经PCR从pAR-1173质粒(Brookhaven National Laboratory,ref)扩增出T7RNA聚合酶:
AttB1-T7Pol:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGG
AATTCTCTGACATCGAACTGGCT-3′
AttB2-retourT7Pol:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCAC
GCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3′
使用含有核定位信号(粗体)和重组序列(以下划线标示)的下列引物同时从pAR-3288质粒(Brookhaven National Laboratory,ref)扩增出T7RNA聚合酶的核形式(nlsT7):
AttBI-SV40nls:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATG
GCACCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3′
AttB2-retourT7Pol:5′-GGGGACCACTTTGACAAGAAAGCTGGGTTATCACG
CGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3′
采用相同的方法从pTM-MVSchw质粒经PCR扩增Schwarz MV的N基因和P基因,其中该质粒含有全长的感染性Schwarz MV反基因组(Combredet等人,2003)。使用了含有重组序列(以下划线标示)的下列引物:
AttB1-N:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCCACAC
TTTTAAGGAGCTTAGCA-3′
AttB2-N:5′-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTGTACTAGTCTAG
AAGATTTCTGTCATTGTA-3′
AttB1-P:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCAGAAG
AGCAGGCACGCCAT-3′
AttB2-P:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACTACTTCAT
TATTATCTTCATCAGCATCTGGTGGA-3′
编码T7 RNA聚合酶、nlsT7 RNA聚合酶和MV N蛋白和P蛋白的不同PCR片段随后被引入到pDONRTM207进入质粒(Invitrogen),并在修饰的HIV-1-TRIP-ΔU3-BSX质粒中使用重组系统(Invitrogen)进行重组。得到的不同重组载体质粒(HIV-1-TRIP delta U3.CMV-T7、HIV-1-TRIPdelta U3.CMV-nlsT7、HIV-1-TRIP delta U3.CMV-N和HIV-1-TRIP deltaU3.CMV-P)进行完全测序。2006年12月14日这些载体分别以编号I-3702、I-3703、I-3700和I-3701保藏在CNCM。
按照类似于Radecke等人(1995)描述的方式,构建表达来自SchwarzMV的大聚合酶(L)蛋白的质粒pEMC-LSchw。从pTM-MVSchw质粒取出Schwarz L基因中6552个核苷酸长的序列,使用经典克隆步骤将其插入到Radecke等人(1995)以前描述的pEMC-La质粒。2007年12月18日该质粒以编号I-3881保藏在CNCM。
载体颗粒的产生
使用磷酸钙方法或以HIV-1-TRIP delta U3.CMV-T7、HIV-1-TRIP deltaU3.CMV-nlsT7、HIV-1-TRIP delta U3.CMV-N或以HIV-1-TRIP deltaU3.CMV-P载体质粒、表达HIV-1 gag基因和pol基因的衣壳化质粒和Zennou等人(2000)描述的表达VSV-G包膜糖蛋白的质粒(pHCMV-G)共转染HEK-293细胞,产生载体颗粒。使用HIV-1 p24 ELISA(Perkin ElmerLifeSciences)测量经超速离心浓缩的载体颗粒储备中Gag p24抗原的含量。
细胞系293-T7-MV的产生
以TRIP-T7和TRIP-nlsT7慢病毒载体进行转导的前一天,细胞(HEK-293)接种到35mm培养孔内。载体(500ng/ml p24)加入到添加10%FCS的DMEM培养基中。8天期间,每天重复向细胞加入相同量的载体。细胞每两天扩增一代。每次传代后,测定细胞的T7 RNA聚合酶活性。使用磷酸钙方法以5μg pEMC-Luc转染35mm细胞培养物,随后以光度计测量转染后1天收集的1/20澄清细胞裂解物中荧光素酶的活性。每增加一次转导后荧光素酶的活性均升高,到第7次和第8次转导之间仍保持最大值。使用台盼蓝排斥方法和与未转导细胞的比较,通过在每次转导后定量测量细胞活力,证实T7 RNA聚合酶的表达没有细胞毒性。转导8次后,产生了具有很高细胞质T7 RNA聚合酶(293-T7)活性或核T7 RNA聚合酶(293-nlsT7)活性的两个细胞群体。
随后以TRIP-N载体和TRIP-P载体同时共转导这两个细胞群体(293-T7和293-nlsT7)。载体(TRIP N:390ng/ml p24和TRIP P:330ng/ml p24)加入到接种在35mm培养孔内的细胞上。10天中,每天重复向细胞加入相同量的两种载体。细胞每两天扩增一代。转导10轮后,使用35mm培养孔1/20的总裂解物以蛋白质印迹法分析总细胞群体中MV N蛋白和P蛋白的表达。两种蛋白质的表达与类似数目的感染Vero细胞中的这两种蛋白质表达相当(图2)。随后以有限稀释法克隆转导细胞。细胞以1/3细胞/孔的稀释度接种到96孔平板上。2周后,选择第一批克隆。293-T7-NP细胞和293-nlsT7-NP细胞各约100个克隆被扩增到24孔平板上,随后又被扩增到35mm培养孔内。使用35mm培养孔1/20的总裂解物经蛋白质印迹法分析20个克隆中MV N蛋白和P蛋白的表达。两种蛋白质的表达与类似数目的感染Vero细胞中的这两种蛋白质表达相当(图2)。按上述方法测量每个克隆的T7 RNA聚合酶活性。选择具有很高荧光素酶活性和类似表达水平的MVN蛋白和P蛋白的大量克隆。扩增下文列出的克隆,随后以107个细胞/ml的密度冷冻在-180℃的DMEM/30%FCS/10%DMSO中:293-T7-NP1、293-T7-NP3、293-T7-NP5、293-T7-NP7、293-T7-NP8、293-T7-NP10、293-T7-NP13、293-T7-NP14、293-T7-NP20、293-T7-NP28、293-T7-NP31、293-T7-NP33、293-nlsT7-NP1、293-nlsT7-NP5、293-nlsT7-NP6、293-nlsT7-NP13、293-nlsT7-NP14、293-nlsT7-NP15、293-nlsT7-NP30和293-nlsT7-NP40。
使用293-T7-NP和293-NLST7-NP辅助细胞拯救SCHWARZ MV
为了评价产生的不同的辅助细胞克隆293-T7-NP和293-nlsT7-NP从cDNA有效拯救MV的能力,我们使用了质粒pTM-MVSchw-eGFP(Combredet等人,2003)来拯救表达绿色荧光蛋白(eGFP)的重组SchwarzMV。我们使用了与以前描述(Radecke等人,1995;Parks等人,1999;Combredet等人,2003)类似的系统。使用磷酸钙方法以pTM-MVSchw-eGFP(5μg)和表达Schwarz MV聚合酶(L)基因的质粒pEMC-LSchw(20-100ng)转染辅助细胞293-T7-NP或293-nlsT7-NP。37℃过夜温育后,转染培养基被替换为新鲜培养基,细胞在43℃下热激3小时,随后温度降至37℃(22)。37℃温育两天后,转染细胞被转移到单层的Vero、CEG或MRC5细胞上,并在10cm培养皿内37℃下温育,除CEF在32℃下温育以外。在Vero、CEF或MRC5细胞上共培养2-3天后,很快出现了荧光细胞。感染细胞在局部快速扩增。重组病毒在Vero细胞中形成许多合胞体,而在CEF和MRC5细胞中不形成合胞体。单个合胞体或感染灶被转移到Vero、CEF或MRC5细胞的35mm培养孔内,随后加入新细胞,使其扩增到更大的培养皿内。CEF或MRC5细胞感染5天后或当Vero细胞的合胞体包括80-90%的培养物时(通常在两天后),通过刮擦感染细胞、冻融细胞和培养基以及离心除去细胞碎片来收集病毒。使用TCID50滴定方法滴定这类病毒产物。简而言之,Vero细胞接种到96-孔平板上(7500个细胞/孔),随后以配制于DMEM/5%FCS中的病毒样品的连续1∶10稀释液感染Vero细胞。37℃下温育7天后,细胞以结晶紫染色,测定导致50%测试单位感染的病毒稀释度。以方法(3)计算描述为组织培养感染剂量的50%终点(TCID50)。在Vero细胞内拯救和生长的重组病毒的滴度是107-108TCID50/ml,在CEF或MRC5细胞内拯救和生长的病毒的滴度是更低的104-106TCID50/ml。
本发明提供了构建和产生重组载体、特别是表达处于巨细胞病毒(CMV)启动子控制下的T7 RNA聚合酶和麻疹病毒Schwarz N蛋白和P蛋白的人免疫缺陷病毒(HIV)-TRIP慢病毒载体的技术。这些载体可用于几乎所有细胞特别是人细胞或哺乳动物细胞的有效体外高水平转导。以上文定义的全长感染性病毒反基因组cDNA或修饰的cDNA克隆进行转导后,这类细胞可用作能从头产生重组麻疹病毒的辅助细胞/反式互补细胞。
本发明允许从(任选地被修饰的)cDNA拯救任何非节段负链RNA病毒例如麻疹病毒,而无任何其他辅助病毒例如痘苗病毒的污染。由于慢病毒的高转导效率,该方法允许产生表达极高水平辅助蛋白的细胞。由于与基于质粒的非常规重组相比,基于反转录病毒将外源DNA重组到染色体DNA,特别是基于慢病毒将外源DNA重组到染色体DNA是真性的,该方法产生的辅助细胞非常稳定,多次连续传代后它们仍保持了从cDNA拯救非节段负链RNA病毒的高效率。
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序列表
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<130>B6773A-AD/LV/KN
<150>EP06292025.1
<151>2006-12-22
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>200
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>CAEV FLAP
<400>1
gttccagcca caatttgtcg ctgtagaatc agccatagca gcagccctag tcgccataaa 60
tataaaaaga aagggtgggc tggggacaag ccctatggat atttttatat ataataaaga 120
acagaaaaga ataaataata aatataataa aaattctcaa aaaattcaat tctgttatta 180
cagaataagg aaaagaggac 200
<210>2
<211>200
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
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cttgtaacaa agggagggaa agtatgggag gacagacacc atgggaagta tttatcacta 60
atcaagcaca agtaatacat gagaaacttt tactacagca agcacaatcc tccaaaaaat 120
tttgttttta caaaatccct ggtgaacatg attggaaggg acctactagg gtgctgtgga 180
agggtgatgg tgcagtagta 200
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<211>200
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>VISNA FLAP
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ggaccctcat tactctaaat ataaaaagaa agggtgggct agggacaagc cctatggata 60
tatttatatt taataaggaa caacaaagaa tacagcaaca aagtaaatca aaacaagaaa 120
aaattcgatt ttgttattac agaacaagaa aaagagggca tccaggagag tggcaaggac 180
caacacaggt actttggggc 200
<210>4
<211>200
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>SIV AGM FLAP
<400>4
tactgatggc ttgcatactt cacaatttta aaagaaaggg aggaataggg ggacagactt 60
cagcagagag actaattaat ataataacaa cacaattaga aatacaacat ttacaaacca 120
aaattcaaaa aattttaaat tttagagtct actacagaga agggagagac cctgtgtgga 180
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<220>
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tgcatgaatt ttaaaagaag ggggggaata ggggatatga ctccatcaga aagattaatc 60
aatatgatca ccacagaaca agagatacaa ttcctccaag ccaaaaattc aaaattaaaa 120
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ctgtggaaag gagaaggagc 200
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<213>Artificial
<220>
<223>HIV-1 LAI FLAP
<400>6
cagtattcat ccacaatttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa 60
gaatagtaga cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa 120
aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg acagcagaga tccactttgg aaaggaccag 180
caaagctcct ctggaaaggt 200
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>HIV-1 FLAP
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ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttc 119
<210>8
<211>2640
<212>DNA
<213>Bacteriophage T7
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2640)
<223>T7 RNA polymerase gene
<220>
<221>CDS
<222>(10)..(2637)
<400>8
ggctccacc atg gaa ttc tct gac atc gaa ctg gct gct atc ccg ttc aac 51
Met Glu Phe Ser Asp Ile Glu Leu Ala Ala Ile Pro Phe Asn
1 5 10
act ctg gct gac cat tac ggt gag cgt tta gct cgc gaa cag ttg gcc 99
Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu Ala Arg Glu Gln Leu Ala
15 20 25 30
ctt gag cat gag tct tac gag atg ggt gaa gca cgc ttc cgc aag atg 147
Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu Ala Arg Phe Arg Lys Met
35 40 45
ttt gag cgt caa ctt aaa gct ggt gag gtt gcg gat aac gct gcc gcc 195
Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val Ala Asp Asn Ala Ala Ala
50 55 60
aag cct ctc atc act acc cta ctc cct aag atg att gca cgc atc aac 243
Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys Met Ile Ala Arg Ile Asn
65 70 75
gac tgg ttt gag gaa gtg aaa gct aag cgc ggc aag cgc ccg aca gcc 291
Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg Gly Lys Arg Pro Thr Ala
80 85 90
ttc cag ttc ctg caa gaa atc aag ccg gaa gcc gta gcg tac atc acc 339
Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu Ala Val Ala Tyr Ile Thr
95 100 105 110
att aag acc act ctg gct tgc cta acc agt gct gac aat aca acc gtt 387
Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser Ala Asp Asn Thr Thr Val
115 120 125
cag gct gta gca agc gca atc ggt cgg gcc att gag gac gag gct cgc 435
Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala Ile Glu Asp Glu Ala Arg
130 135 140
ttc ggt cgt atc cgt gac ctt gaa gct aag cac ttc aag aaa aac gtt 483
Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys His Phe Lys Lys Asn Val
145 150 155
gag gaa caa ctc aac aag cgc gta ggg cac gtc tac aag aaa gca ttt 531
Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His Val Tyr Lys Lys Ala Phe
160 165 170
atg caa gtt gtc gag gct gac atg ctc tct aag ggt cta ctc ggt ggc 579
Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser Lys Gly Leu Leu Gly Gly
175 180 185 190
gag gcg tgg tct tcg tgg cat aag gaa gac tct att cat gta gga gta 627
Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp Ser Ile His Val Gly Val
195 200 205
cgc tgc atc gag atg ctc att gag tca acc gga atg gtt agc tta cac 675
Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr Gly Met Val Ser Leu His
210 215 220
cgc caa aat gct ggc gta gta ggt caa gac tct gag act atc gaa ctc 723
Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp Ser Glu Thr Ile Glu Leu
225 230 235
gca cct gaa tac gct gag gct atc gca acc cgt gca ggt gcg ctg gct 771
Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr Arg Ala Gly Ala Leu Ala
240 245 250
ggc atc tct ccg atg ttc caa cct tgc gta gtt cct cct aag ccg tgg 819
Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val Val Pro Pro Lys Pro Trp
255 260 265 270
act ggc att act ggt ggt ggc tat tgg gct aac ggt cgt cgt cct ctg 867
Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala Asn Gly Arg Arg Pro Leu
275 280 285
gcg ctg gtg cgt act cac agt aag aaa gca ctg atg cgc tac gaa gac 915
Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala Leu Met Arg Tyr Glu Asp
290 295 300
gtt tac atg cct gag gtg tac aaa gcg att aac att gcg caa aac acc 963
Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile Asn Ile Ala Gln Asn Thr
305 310 315
gca tgg aaa atc aac aag aaa gtc cta gcg gtc gcc aac gta atc acc 1011
Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala Val Ala Asn Val Ile Thr
320 325 330
aag tgg aag cat tgt ccg gtc gag gac atc cct gcg att gag cgt gaa 1059
Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile Pro Ala Ile Glu Arg Glu
335 340 345 350
gaa ctc ccg atg aaa ccg gaa gac atc gac atg aat cct gag gct ctc 1107
Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp Met Asn Pro Glu Ala Leu
355 360 365
acc gcg tgg aaa cgt gct gcc gct gct gtg tac cgc aag gac agg gct 1155
Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val Tyr Arg Lys Asp Arg Ala
370 375 380
cgc aag tct cgc cgt atc agc ctt gag ttc atg ctt gag caa gcc aat 1203
Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe Met Leu Glu Gln Ala Asn
385 390 395
aag ttt gct aac cat aag gcc atc tgg ttc cct tac aac atg gac tgg 1251
Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe Pro Tyr Asn Met Asp Trp
400 405 410
cgc ggt cgt gtt tac gcc gtg tca atg ttc aac ccg caa ggt aac gat 1299
Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe Asn Pro Gln Gly Asn Asp
415 420 425 430
atg acc aaa gga ctg ctt acg ctg gcg aaa ggt aaa cca atc ggt aag 1347
Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys Gly Lys Pro Ile Gly Lys
435 440 445
gaa ggt tac tac tgg ctg aaa atc cac ggt gca aac tgt gcg ggt gtc 1395
Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly Ala Asn Cys Ala Gly Val
450 455 460
gat aag gtt ccg ttc cct gag cgc atc aag ttc att gag gaa aac cac 1443
Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys Phe Ile Glu Glu Asn His
465 470 475
gag aac atc atg gct tgc gct aag tct cca ctg gag aac act tgg tgg 1491
Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro Leu Glu Asn Thr Trp Trp
480 485 490
gct gag caa gat tct ccg ttc tgc ttc ctt gcg ttc tgc ttt gag tac 1539
Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu Ala Phe Cys Phe Glu Tyr
495 500 505 510
gct ggg gta cag cac cac ggc ctg agc tat aac tgc tcc ctt ccg ctg 1587
Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Leu Pro Leu
515 520 525
gcg ttt gac ggg tct tgc tct ggc atc cag cac ttc tcc gcg atg ctc 1635
Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln His Phe Ser Ala Met Leu
530 535 540
cga gat gag gta ggt ggt cgc gcg gtt aac ttg ctt cct agt gag acc 1683
Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn Leu Leu Pro Ser Glu Thr
545 550 555
gtt cag gac atc tac ggg att gtt gct aag aaa gtc aac gag att cta 1731
Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys Lys Val Asn Glu Ile Leu
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caa gca gac gca atc aat ggg acc gat aac gaa gta gtt acc gtg acc 1779
Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn Glu Val Val Thr Val Thr
575 580 585 590
gat gag aac act ggt gaa atc tct gag aaa gtc aag ctg ggc act aag 1827
Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys Val Lys Leu Gly Thr Lys
595 600 605
gca ctg gct ggt caa tgg ctg gct cac ggt gtt act cgc agt gtg act 1875
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aga gtc aga tac atg tgg aaa ctg ata gat ggt ttc ttc cct gca ctc 816
Arg Val Arg Tyr Met Trp Lys Leu Ile Asp Gly Phe Phe Pro Ala Leu
260 265 270
ggg aat cca act tat caa att gta gcc atg ctg gag cct ctt tca ctt 864
Gly Asn Pro Thr Tyr Gln Ile Val Ala Met Leu Glu Pro Leu Ser Leu
275 280 285
gct tac ctg cag ctg agg gat ata aca gta gaa ctc aga ggt gct ttc 912
Ala Tyr Leu Gln Leu Arg Asp Ile Thr Val Glu Leu Arg Gly Ala Phe
290 295 300
ctt aac cac tgc ttt act gaa ata cat gat gtt ctt gac caa aac ggg 960
Leu Asn His Cys Phe Thr Glu Ile His Asp Val Leu Asp Gln Asn Gly
305 310 315 320
ttt tct gat gaa ggt act tat cat gag tta act gaa gct cta gat tac 1008
Phe Ser Asp Glu Gly Thr Tyr His Glu Leu Thr Glu Ala Leu Asp Tyr
325 330 335
att ttc ata act gat gac ata cat ctg aca ggg gag att ttc tca ttt 1056
Ile Phe Ile Thr Asp Asp Ile His Leu Thr Gly Glu Ile Phe Ser Phe
340 345 350
ttc aga agt ttc ggc cac ccc aga ctt gaa gca gta acg gct gct gaa 1104
Phe Arg Ser Phe Gly His Pro Arg Leu Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu
355 360 365
aat gtt agg aaa tac atg aat cag cct aaa gtc att gtg tat gag act 1152
Asn Val Arg Lys Tyr Met Asn Gln Pro Lys Val Ile Val Tyr Glu Thr
370 375 380
ctg atg aaa ggt cat gcc ata ttt tgt gga atc ata atc aac ggc tat 1200
Leu Met Lys Gly His Ala Ile Phe Cys Gly Ile Ile Ile Asn Gly Tyr
385 390 395 400
cgt gac agg cac gga ggc agt tgg cca ccg ctg acc ctc ccc ctg cat 1248
Arg Asp Arg His Gly Gly Ser Trp Pro Pro Leu Thr Leu Pro Leu His
405 410 415
gct gca gac aca atc cgg aat gct caa gct tca ggt gaa ggg tta aca 1296
Ala Ala Asp Thr Ile Arg Asn Ala Gln Ala Ser Gly Glu Gly Leu Thr
420 425 430
cat gag cag tgc gtt gat aac tgg aaa tct ttt gct gga gtg aaa ttt 1344
His Glu Gln Cys Val Asp Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Val Lys Phe
435 440 445
ggc tgc ttt atg cct ctt agc ctg gat agt gat ctg aca atg tac cta 1392
Gly Cys Phe Met Pro Leu Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr Leu
450 455 460
aag gac aag gca ctt gct gct ctc caa agg gaa tgg gat tca gtt tac 1440
Lys Asp Lys Ala Leu Ala Ala Leu Gln Arg Glu Trp Asp Ser Val Tyr
465 470 475 480
ccg aaa gag ttc ctg cgt tac gac cct ccc aag gga acc ggg tca cgg 1488
Pro Lys Glu Phe Leu Arg Tyr Asp Pro Pro Lys Gly Thr Gly Ser Arg
485 490 495
agg ctt gta gat gtt ttc ctt aat gat tcg agc ttt gac cca tat gat 1536
Arg Leu Val Asp Val Phe Leu Asn Asp Ser Ser Phe Asp Pro Tyr Asp
500 505 510
gtg ata atg tat gtt gta agt gga gct tac ctc cat gac cct gag ttc 1584
Val Ile Met Tyr Val Val Ser Gly Ala Tyr Leu His Asp Pro Glu Phe
515 520 525
aac ctg tct tac agc ctg aaa gaa aag gag atc aag gaa aca ggt aga 1632
Asn Leu Ser Tyr Ser Leu Lys Glu Lys Glu Ile Lys Glu Thr Gly Arg
530 535 540
ctt ttt gct aaa atg act tac aaa atg agg gca tgc caa gtg att gct 1680
Leu Phe Ala Lys Met Thr Tyr Lys Met Arg Ala Cys Gln Val Ile Ala
545 550 555 560
gaa aat cta atc tca aac ggg att ggc aaa tat ttt aag gac aat ggg 1728
Glu Asn Leu Ile Ser Asn Gly Ile Gly Lys Tyr Phe Lys Asp Asn Gly
565 570 575
atg gcc aag gat gag cac gat ttg act aag gca ctc cac act cta gct 1776
Met Ala Lys Asp Glu His Asp Leu Thr Lys Ala Leu His Thr Leu Ala
580 585 590
gtc tca gga gtc ccc aaa gat ctc aaa gaa agt cac agg ggg ggg cca 1824
Val Ser Gly Val Pro Lys Asp Leu Lys Glu Ser His Arg Gly Gly Pro
595 600 605
gtc tta aaa acc tac tcc cga agc cca gtc cac aca agt acc agg aac 1872
Val Leu Lys Thr Tyr Ser Arg Ser Pro Val His Thr Ser Thr Arg Asn
610 615 620
gtg aga gca gca aaa ggg ttt ata ggg ttc cct caa gta att cgg cag 1920
Val Arg Ala Ala Lys Gly Phe Ile Gly Phe Pro Gln Val Ile Arg Gln
625 630 635 640
gac caa gac act gat cat ccg gag aat atg gaa gct tac gag aca gtc 1968
Asp Gln Asp Thr Asp His Pro Glu Asn Met Glu Ala Tyr Glu Thr Val
645 650 655
agt gca ttt atc acg act gat ctc aag aag tac tgc ctt aat tgg aga 2016
Ser Ala Phe Ile Thr Thr Asp Leu Lys Lys Tyr Cys Leu Asn Trp Arg
660 665 670
tat gag acc atc agc ttg ttt gca cag agg cta aat gag att tac gga 2064
Tyr Glu Thr Ile Ser Leu Phe Ala Gln Arg Leu Asn Glu Ile Tyr Gly
675 680 685
ttg ccc tca ttt ttc cag tgg ctg cat aag agg ctt gag acc tct gtc 2112
Leu Pro Ser Phe Phe Gln Trp Leu His Lys Arg Leu Glu Thr Ser Val
690 695 700
ctg tat gta agt gac cct cat tgc ccc ccc gac ctt gac gcc cat atc 2160
Leu Tyr Val Ser Asp Pro His Cys Pro Pro Asp Leu Asp Ala His Ile
705 710 715 720
ccg tta tat aaa gtc ccc aat gat caa atc ttc att aag tac cct atg 2208
Pro Leu Tyr Lys Val Pro Asn Asp Gln Ile Phe Ile Lys Tyr Pro Met
725 730 735
gga ggt ata gaa ggg tat tgt cag aag ctg tgg acc atc agc acc att 2256
Gly Gly Ile Glu Gly Tyr Cys Gln Lys Leu Trp Thr Ile Ser Thr Ile
740 745 750
ccc tat cta tac ctg gct gct tat gag agc gga gta agg att gct tcg 2304
Pro Tyr Leu Tyr Leu Ala Ala Tyr Glu Ser Gly Val Arg Ile Ala Ser
755 760 765
tta gtg caa ggg gac aat cag acc ata gcc gta aca aaa agg gta ccc 2352
Leu Val Gln Gly Asp Asn Gln Thr Ile Ala Val Thr Lys Arg Val Pro
770 775 780
agc aca tgg ccc tac aac ctt aag aaa cgg gaa gct gct aga gta act 2400
Ser Thr Trp Pro Tyr Asn Leu Lys Lys Arg Glu Ala Ala Arg Val Thr
785 790 795 800
aga gat tac ttt gta att ctt agg caa agg cta cat gat att ggc cat 2448
Arg Asp Tyr Phe Val Ile Leu Arg Gln Arg Leu His Asp Ile Gly His
805 810 815
cac ctc aag gca aat gag aca att gtt tca tca cat ttt ttt gtc tat 2496
His Leu Lys Ala Asn Glu Thr Ile Val Ser Ser His Phe Phe Val Tyr
820 825 830
tca aaa gga ata tat tat gat ggg cta ctt gtg tcc caa tca ctc aag 2544
Ser Lys Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Leu Leu Val Ser Gln Ser Leu Lys
835 840 845
agc atc gca aga tgt gta ttc tgg tca gag act ata gtt gat gaa aca 2592
Ser Ile Ala Arg Cys Val Phe Trp Ser Glu Thr Ile Val Asp Glu Thr
850 855 860
agg gca gca tgc agt aat att gct aca aca atg gct aaa agc atc gag 2640
Arg Ala Ala Cys Ser Asn Ile Ala Thr Thr Met Ala Lys Ser Ile Glu
865 870 875 880
aga ggt tat gac cgt tac ctt gca tat tcc ctg aac gtc cta aaa gtg 2688
Arg Gly Tyr Asp Arg Tyr Leu Ala Tyr Ser Leu Asn Val Leu Lys Val
885 890 895
ata cag caa att ctg atc tct ctt ggc ttc aca atc aat tca acc atg 2736
Ile Gln Gln Ile Leu Ile Ser Leu Gly Phe Thr Ile Asn Ser Thr Met
900 905 910
acc cgg gat gta gtc ata ccc ctc ctc aca aac aac gac ctc tta ata 2784
Thr Arg Asp Val Val Ile Pro Leu Leu Thr Asn Asn Asp Leu Leu Ile
915 920 925
agg atg gca ctg ttg ccc gct cct att ggg ggg atg aat tat ctg aat 2832
Arg Met Ala Leu Leu Pro Ala Pro Ile Gly Gly Met Asn Tyr Leu Asn
930 935 940
atg agc agg ctg ttt gtc aga aac atc ggt gat cca gta aca tca tca 2880
Met Ser Arg Leu Phe Val Arg Asn Ile Gly Asp Pro Val Thr Ser Ser
945 950 955 960
att gct gat ctc aag aga atg att ctc gcc tca cta atg cct gaa gag 2928
Ile Ala Asp Leu Lys Arg Met Ile Leu Ala Ser Leu Met Pro Glu Glu
965 970 975
acc ctc cat caa gta atg aca caa caa ccg ggg gac tct tca ttc cta 2976
Thr Leu His Gln Val Met Thr Gln Gln Pro Gly Asp Ser Ser Phe Leu
980 985 990
gac tgg gct agc gac cct tac tca gca aat ctt gta tgt gtc cag agc 3024
Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Ala Asn Leu Val Cys Val Gln Ser
995 1000 1005
atc act aga ctc ctc aag aac ata act gca agg ttt gtc ctg atc 3069
Ile Thr Arg Leu Leu Lys Asn Ile Thr Ala Arg Phe Val Leu Ile
1010 1015 1020
cat agt cca aac cca atg tta aaa gga tta ttc cat gat gac agt 3114
His Ser Pro Asn Pro Met Leu Lys Gly Leu Phe His Asp Asp Ser
1025 1030 1035
aaa gaa gag gac gag gga ctg gcg gca ttc ctc atg gac agg cat 3159
Lys Glu Glu Asp Glu Gly Leu Ala Ala Phe Leu Met Asp Arg His
1040 1045 1050
att ata gta cct agg gca gct cat gaa atc ctg gat cat agt gtc 3204
Ile Ile Val Pro Arg Ala Ala His Glu Ile Leu Asp His Ser Val
1055 1060 1065
aca ggg gca aga gag tct att gca ggc atg ctg gat acc aca aaa 3249
Thr Gly Ala Arg Glu Ser Ile Ala Gly Met Leu Asp Thr Thr Lys
1070 1075 1080
ggc ttg att cga gcc agc atg agg aag ggg ggg tta acc tct cga 3294
Gly Leu Ile Arg Ala Ser Met Arg Lys Gly Gly Leu Thr Ser Arg
1085 1090 1095
gtg ata acc aga ttg tcc aat tat gac tat gaa caa ttc aga gca 3339
Val Ile Thr Arg Leu Ser Asn Tyr Asp Tyr Glu Gln Phe Arg Ala
1100 1105 1110
ggg atg gtg cta ttg aca gga aga aag aga aat gtc ctc att gac 3384
Gly Met Val Leu Leu Thr Gly Arg Lys Arg Asn Val Leu Ile Asp
1115 1120 1125
aaa gag tca tgt tca gtg cag ctg gcg aga gct cta aga agc cat 3429
Lys Glu Ser Cys Ser Val Gln Leu Ala Arg Ala Leu Arg Ser His
1130 1135 1140
atg tgg gcg agg cta gct cga gga cgg cct att tac ggc ctt gag 3474
Met Trp Ala Arg Leu Ala Arg Gly Arg Pro Ile Tyr Gly Leu Glu
1145 1150 1155
gtc cct gat gta cta gaa tct atg cga ggc cac ctt att cgg cgt 3519
Val Pro Asp Val Leu Glu Ser Met Arg Gly His Leu Ile Arg Arg
1160 1165 1170
cat gag aca tgt gtc atc tgc gag tgt gga tca gtc aac tac gga 3564
His Glu Thr Cys Val Ile Cys Glu Cys Gly Ser Val Asn Tyr Gly
1175 1180 1185
tgg ttt ttt gtc ccc tcg ggt tgc caa ctg gat gat att gac aag 3609
Trp Phe Phe Val Pro Ser Gly Cys Gln Leu Asp Asp Ile Asp Lys
1190 1195 1200
gaa aca tca tcc ttg aga gtc cca tat att ggt tct acc act gat 3654
Glu Thr Ser Ser Leu Arg Val Pro Tyr Ile Gly Ser Thr Thr Asp
1205 1210 1215
gag aga aca gac atg aag ctt gcc ttc gta aga gcc cca agt cga 3699
Glu Arg Thr Asp Met Lys Leu Ala Phe Val Arg Ala Pro Ser Arg
1220 1225 1230
tcc ttg cga tct gct gtt aga ata gca aca gtg tac tca tgg gct 3744
Ser Leu Arg Ser Ala Val Arg Ile Ala Thr Val Tyr Ser Trp Ala
1235 1240 1245
tac ggt gat gat gat agc tct tgg aac gaa gcc tgg ttg ttg gct 3789
Tyr Gly Asp Asp Asp Ser Ser Trp Asn Glu Ala Trp Leu Leu Ala
1250 1255 1260
agg caa agg gcc aat gtg agc ctg gag gag cta agg gtg atc act 3834
Arg Gln Arg Ala Asn Val Ser Leu Glu Glu Leu Arg Val Ile Thr
1265 1270 1275
ccc atc tca act tcg act aat tta gcg cat agg ttg agg gat cgt 3879
Pro Ile Ser Thr Ser Thr Asn Leu Ala His Arg Leu Arg Asp Arg
1280 1285 1290
agc act caa gtg aaa tac tca ggt aca tcc ctt gtc cga gtg gcg 3924
Ser Thr Gln Val Lys Tyr Ser Gly Thr Ser Leu Val Arg Val Ala
1295 1300 1305
agg tat acc aca atc tcc aac gac aat ctc tca ttt gtc ata tca 3969
Arg Tyr Thr Thr Ile Ser Asn Asp Asn Leu Ser Phe Val Ile Ser
1310 1315 1320
gat aag aag gtt gat act aac ttt ata tac caa caa gga atg ctt 4014
Asp Lys Lys Val Asp Thr Asn Phe Ile Tyr Gln Gln Gly Met Leu
1325 1330 1335
cta ggg ttg ggt gtt tta gaa aca ttg ttt cga ctc gag aaa gat 4059
Leu Gly Leu Gly Val Leu Glu Thr Leu Phe Arg Leu Glu Lys Asp
1340 1345 1350
acc gga tca tct aac acg gta tta cat ctt cac gtc gaa aca gat 4104
Thr Gly Ser Ser Asn Thr Val Leu His Leu His Val Glu Thr Asp
1355 1360 1365
tgt tgc gtg atc ccg atg ata gat cat ccc agg ata ccc agc tcc 4149
Cys Cys Val Ile Pro Met Ile Asp His Pro Arg Ile Pro Ser Ser
1370 1375 1380
cgc aag cta gag ctg agg gca gag cta tgt acc aac cca ttg ata 4194
Arg Lys Leu Glu Leu Arg Ala Glu Leu Cys Thr Asn Pro Leu Ile
1385 1390 1395
tat gat aat gca cct tta att gac aga gat gca aca agg cta tac 4239
Tyr Asp Asn Ala Pro Leu Ile Asp Arg Asp Ala Thr Arg Leu Tyr
1400 1405 1410
acc cag agc cat agg agg cac ctt gtg gaa ttt gtt aca tgg tcc 4284
Thr Gln Ser His Arg Arg His Leu Val Glu Phe Val Thr Trp Ser
1415 1420 1425
aca ccc caa cta tat cac att tta gct aag tcc aca gca cta tct 4329
Thr Pro Gln Leu Tyr His Ile Leu Ala Lys Ser Thr Ala Leu Ser
1430 1435 1440
atg att gac ctg gta aca aaa ttt gag aag gac cat atg aat gaa 4374
Met Ile Asp Leu Val Thr Lys Phe Glu Lys Asp His Met Asn Glu
1445 1450 1455
att tca gct ctc ata ggg gat gac gat atc aat agt ttc ata act 4419
Ile Ser Ala Leu Ile Gly Asp Asp Asp Ile Asn Ser Phe Ile Thr
1460 1465 1470
gag ttt ctg ctc ata gag cca aga tta ttc act atc tac ttg ggc 4464
Glu Phe Leu Leu Ile Glu Pro Arg Leu Phe Thr Ile Tyr Leu Gly
1475 1480 1485
cag tgt gcg gcc atc aat tgg gca ttt gat gta cat tat cat aga 4509
Gln Cys Ala Ala Ile Asn Trp Ala Phe Asp Val His Tyr His Arg
1490 1495 1500
cca tca ggg aaa tat cag atg ggt gag ctg ttg tca tcg ttc ctt 4554
Pro Ser Gly Lys Tyr Gln Met Gly Glu Leu Leu Ser Ser Phe Leu
1505 1510 1515
tct aga atg agc aaa gga gtg ttt aag gtg ctt gtc aat gct cta 4599
Ser Arg Met Ser Lys Gly Val Phe Lys Val Leu Val Asn Ala Leu
1520 1525 1530
agc cac cca aag atc tac aag aaa ttc tgg cat tgt ggt att ata 4644
Ser His Pro Lys Ile Tyr Lys Lys Phe Trp His Cys Gly Ile Ile
1535 1540 1545
gag cct atc cat ggt cct tca ctt gat gct caa aac ttg cac aca 4689
Glu Pro Ile His Gly Pro Ser Leu Asp Ala Gln Asn Leu His Thr
1550 1555 1560
act gtg tgc aac atg gtt tac aca tgc tat atg acc tac ctc gac 4734
Thr Val Cys Asn Met Val Tyr Thr Cys Tyr Met Thr Tyr Leu Asp
1565 1570 1575
ctg ttg ttg aat gaa gag tta gaa gag ttc aca ttt ctc ttg tgt 4779
Leu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Glu Phe Thr Phe Leu Leu Cys
1580 1585 1590
gaa agc gac gag gat gta gta ccg gac aga ttc gac aac atc cag 4824
Glu Ser Asp Glu Asp Val Val Pro Asp Arg Phe Asp Asn Ile Gln
1595 1600 1605
gca aaa cac tta tgt gtt ctg gca gat ttg tac tgt caa cca ggg 4869
Ala Lys His Leu Cys Val Leu Ala Asp Leu Tyr Cys Gln Pro Gly
1610 1615 1620
acc tgc cca cca att cga ggt cta aga ccg gta gag aaa tgt gca 4914
Thr Cys Pro Pro Ile Arg Gly Leu Arg Pro Val Glu Lys Cys Ala
1625 1630 1635
gtt cta acc gac cat atc aag gca gag gct atg tta tct cca gca 4959
Val Leu Thr Asp His Ile Lys Ala Glu Ala Met Leu Ser Pro Ala
1640 1645 1650
gga tct tcg tgg aac ata aat cca att att gta gac cat tac tca 5004
Gly Ser Ser Trp Asn Ile Asn Pro Ile Ile Val Asp His Tyr Ser
1655 1660 1665
tgc tct ctg act tat ctc cgg cga gga tcg atc aaa cag ata aga 5049
Cys Ser Leu Thr Tyr Leu Arg Arg Gly Ser Ile Lys Gln Ile Arg
1670 1675 1680
ttg aga gtt gat cca gga ttc att ttc gac gcc ctc gct gag gta 5094
Leu Arg Val Asp Pro Gly Phe Ile Phe Asp Ala Leu Ala Glu Val
1685 1690 1695
aat gtc agt cag cca aag atc ggc agc aac aac atc tca aat atg 5139
Asn Val Ser Gln Pro Lys Ile Gly Ser Asn Asn Ile Ser Asn Met
1700 1705 1710
agc atc aag gct ttc aga ccc cca cac gat gat gtt gca aaa ttg 5184
Ser Ile Lys Ala Phe Arg Pro Pro His Asp Asp Val Ala Lys Leu
1715 1720 1725
ctc aaa gat atc aac aca agc aag cac aat ctt ccc att tca ggg 5229
Leu Lys Asp Ile Asn Thr Ser Lys His Asn Leu Pro Ile Ser Gly
1730 1735 1740
ggc aat ctc gcc aat tat gaa atc cat gct ttc cgc aga atc ggg 5274
Gly Asn Leu Ala Asn Tyr Glu Ile His Ala Phe Arg Arg Ile Gly
1745 1750 1755
ttg aac tca tct gct tgc tac aaa gct gtt gag ata tca aca tta 5319
Leu Asn Ser Ser Ala Cys Tyr Lys Ala Val Glu Ile Ser Thr Leu
1760 1765 1770
att agg aga tgc ctt gag cca ggg gag gac ggc ttg ttc ttg ggt 5364
Ile Arg Arg Cys Leu Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Phe Leu Gly
1775 1780 1785
gag gga tcg ggt tct atg ttg atc act tat aaa gag ata ctt aaa 5409
Glu Gly Ser Gly Ser Met Leu Ile Thr Tyr Lys Glu Ile Leu Lys
1790 1795 1800
cta aac aag tgc ttc tat aat agt ggg gtt tcc gcc aat tct aga 5454
Leu Asn Lys Cys Phe Tyr Asn Ser Gly Val Ser Ala Asn Ser Arg
1805 1810 1815
tct ggt caa agg gaa tta gca ccc tat ccc tcc gaa gtt ggc ctt 5499
Ser Gly Gln Arg Glu Leu Ala Pro Tyr Pro Ser Glu Val Gly Leu
1820 1825 1830
gtc gaa cac aga atg gga gta ggt aat att gtc aaa gtg ctc ttt 5544
Val Glu His Arg Met Gly Val Gly Asn Ile Val Lys Val Leu Phe
1835 1840 1845
aac ggg agg ccc gaa gtc acg tgg gta ggc agt gta gat tgc ttc 5589
Asn Gly Arg Pro Glu Val Thr Trp Val Gly Ser Val Asp Cys Phe
1850 1855 1860
aat ttc ata gtt agt aat atc cct acc tct agt gtg ggg ttt atc 5634
Asn Phe Ile Val Ser Asn Ile Pro Thr Ser Ser Val Gly Phe Ile
1865 1870 1875
cat tca gat ata gag acc ttg cct gac aaa gat act ata gag aag 5679
His Ser Asp Ile Glu Thr Leu Pro Asp Lys Asp Thr Ile Glu Lys
1880 1885 1890
cta gag gaa ttg gca gcc atc tta tcg atg gct ctg ctc ctg ggc 5724
Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ile Leu Ser Met Ala Leu Leu Leu Gly
1895 1900 1905
aaa ata gga tca ata ctg gtg att aag ctt atg cct ttc agc ggg 5769
Lys Ile Gly Ser Ile Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Phe Ser Gly
1910 1915 1920
gat ttt gtt cag gga ttt ata agt tat gta ggg tct cat tat aga 5814
Asp Phe Val Gln Gly Phe Ile Ser Tyr Val Gly Ser His Tyr Arg
1925 1930 1935
gaa gtg aac ctt gta tac cct aga tac agc aac ttc atc tct act 5859
Glu Val Asn Leu Val Tyr Pro Arg Tyr Ser Asn Phe Ile Ser Thr
1940 1945 1950
gaa tct tat ttg gtt atg aca gat ctc aag gct aac cgg cta atg 5904
Glu Ser Tyr Leu Val Met Thr Asp Leu Lys Ala Asn Arg Leu Met
1955 1960 1965
aat cct gaa aag att aag cag cag ata att gaa tca tct gtg agg 5949
Asn Pro Glu Lys Ile Lys Gln Gln Ile Ile Glu Ser Ser Val Arg
1970 1975 1980
act tca cct gga ctt ata ggt cac atc cta tcc att aag caa cta 5994
Thr Ser Pro Gly Leu Ile Gly His Ile Leu Ser Ile Lys Gln Leu
1985 1990 1995
agc tgc ata caa gca att gtg gga gac gca gtt agt aga ggt gat 6039
Ser Cys Ile Gln Ala Ile Val Gly Asp Ala Val Ser Arg Gly Asp
2000 2005 2010
atc aat cct act ctg aaa aaa ctt aca cct ata gag cag gtg ctg 6084
Ile Asn Pro Thr Leu Lys Lys Leu Thr Pro Ile Glu Gln Val Leu
2015 2020 2025
atc aat tgc ggg ttg gca att aac gga cct aag ctg tgc aaa gaa 6129
Ile Asn Cys Gly Leu Ala Ile Asn Gly Pro Lys Leu Cys Lys Glu
2030 2035 2040
ttg atc cac cat gat gtt gcc tca ggg caa gat gga ttg ctt aat 6174
Leu Ile His His Asp Val Ala Ser Gly Gln Asp Gly Leu Leu Asn
2045 2050 2055
tct ata ctc atc ctc tac agg gag ttg gca aga ttc aaa gac aac 6219
Ser Ile Leu Ile Leu Tyr Arg Glu Leu Ala Arg Phe Lys Asp Asn
2060 2065 2070
caa aga agt caa caa ggg atg ttc cac gct tac ccc gta ttg gta 6264
Gln Arg Ser Gln Gln Gly Met Phe His Ala Tyr Pro Val Leu Val
2075 2080 2085
agt agc agg caa cga gaa ctt ata tct agg atc acc cgc aaa ttc 6309
Ser Ser Arg Gln Arg Glu Leu Ile Ser Arg Ile Thr Arg Lys Phe
2090 2095 2100
tgg ggg cac att ctt ctt tac tcc ggg aac aaa aag ttg ata aat 6354
Trp Gly His Ile Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Lys Lys Leu Ile Asn
2105 2110 2115
aag ttt atc cag aat ctc aag tcc ggc tat ctg ata cta gac tta 6399
Lys Phe Ile Gln Asn Leu Lys Ser Gly Tyr Leu Ile Leu Asp Leu
2120 2125 2130
cac cag aat atc ttc gtt aag aat cta tcc aag tca gag aaa cag 6444
His Gln Asn Ile Phe Val Lys Asn Leu Ser Lys Ser Glu Lys Gln
2135 2140 2145
att att atg acg ggg ggt ttg aaa cgt gag tgg gtt ttt aag gta 6489
Ile Ile Met Thr Gly Gly Leu Lys Arg Glu Trp Val Phe Lys Val
2150 2155 2160
aca gtc aag gag acc aaa gaa tgg tat aag tta gtc gga tac agt 6534
Thr Val Lys Glu Thr Lys Glu Trp Tyr Lys Leu Val Gly Tyr Ser
2165 2170 2175
gcc ctg att aag gac taa 6552
Ala Leu Ile Lys Asp
2180
<210>17
<211>2183
<212>PRT
<213>Measles virus
<400>17
Met Asp Ser Leu Ser Val Asn Gln Ile Leu Tyr Pro Glu Val His Leu
1 5 10 15
Asp Ser Pro Ile Val Thr Asn Lys Ile Val Ala Ile Leu Glu Tyr Ala
20 25 30
Arg Val Pro His Ala Tyr Ser Leu Glu Asp Pro Thr Leu Cys Gln Asn
35 40 45
Ile Lys His Arg Leu Lys Asn Gly Phe Ser Asn Gln Met Ile Ile Asn
50 55 60
Asn Val Glu Val Gly Asn Val Ile Lys Ser Lys Leu Arg Ser Tyr Pro
65 70 75 80
Ala His Ser His Ile Pro Tyr Pro Asn Cys Asn Gln Asp Leu Phe Asn
85 90 95
Ile Glu Asp Lys Glu Ser Thr Arg Lys Ile Arg Glu Leu Leu Lys Lys
100 105 110
Gly Asn Ser Leu Tyr Ser Lys Val Ser Asp Lys Val Phe Gln Cys Leu
115 120 125
Arg Asp Thr Asn Ser Arg Leu Gly Leu Gly Ser Glu Leu Arg Glu Asp
130 135 140
Ile Lys Glu Lys Val Ile Asn Leu Gly Val Tyr Met His Ser Ser Gln
145 150 155 160
Trp Phe Glu Pro Phe Leu Phe Trp Phe Thr Val Lys Thr Glu Met Arg
165 170 175
Ser Val Ile Lys Ser Gln Thr His Thr Cys His Arg Arg Arg His Thr
180 185 190
Pro Val Phe Phe Thr Gly Ser Ser Val Glu Leu Leu Ile Ser Arg Asp
195 200 205
Leu Val Ala Ile Ile Ser Lys Glu Ser Gln His Val Tyr Tyr Leu Thr
210 215 220
Phe Glu Leu Val Leu Met Tyr Cys Asp Val Ile Glu Gly Arg Leu Met
225 230 235 240
Thr Glu Thr Ala Met Thr Ile Asp Ala Arg Tyr Thr Glu Leu Leu Gly
245 250 255
Arg Val Arg Tyr Met Trp Lys Leu Ile Asp Gly Phe Phe Pro Ala Leu
260 265 270
Gly Asn Pro Thr Tyr Gln Ile Val Ala Met Leu Glu Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Ala Tyr Leu Gln Leu Arg Asp Ile Thr Val Glu Leu Arg Gly Ala Phe
290 295 300
Leu Asn His Cys Phe Thr Glu Ile His Asp Val Leu Asp Gln Asn Gly
305 310 315 320
Phe Ser Asp Glu Gly Thr Tyr His Glu Leu Thr Glu Ala Leu Asp Tyr
325 330 335
Ile Phe Ile Thr Asp Asp Ile His Leu Thr Gly Glu Ile Phe Ser Phe
340 345 350
Phe Arg Ser Phe Gly His Pro Arg Leu Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu
355 360 365
Asn Val Arg Lys Tyr Met Asn Gln Pro Lys Val Ile Val Tyr Glu Thr
370 375 380
Leu Met Lys Gly His Ala Ile Phe Cys Gly Ile Ile Ile Asn Gly Tyr
385 390 395 400
Arg Asp Arg His Gly Gly Ser Trp Pro Pro Leu Thr Leu Pro Leu His
405 410 415
Ala Ala Asp Thr Ile Arg Asn Ala Gln Ala Ser Gly Glu Gly Leu Thr
420 425 430
His Glu Gln Cys Val Asp Asn Trp Lys Ser Phe Ala Gly Val Lys Phe
435 440 445
Gly Cys Phe Met Pro Leu Ser Leu Asp Ser Asp Leu Thr Met Tyr Leu
450 455 460
Lys Asp Lys Ala Leu Ala Ala Leu Gln Arg Glu Trp Asp Ser Val Tyr
465 470 475 480
Pro Lys Glu Phe Leu Arg Tyr Asp Pro Pro Lys Gly Thr Gly Ser Arg
485 490 495
Arg Leu Val Asp Val Phe Leu Asn Asp Ser Ser Phe Asp Pro Tyr Asp
500 505 510
Val Ile Met Tyr Val Val Ser Gly Ala Tyr Leu His Asp Pro Glu Phe
515 520 525
Asn Leu Ser Tyr Ser Leu Lys Glu Lys Glu Ile Lys Glu Thr Gly Arg
530 535 540
Leu Phe Ala Lys Met Thr Tyr Lys Met Arg Ala Cys Gln Val Ile Ala
545 550 555 560
Glu Asn Leu Ile Ser Asn Gly Ile Gly Lys Tyr Phe Lys Asp Asn Gly
565 570 575
Met Ala Lys Asp Glu His Asp Leu Thr Lys Ala Leu His Thr Leu Ala
580 585 590
Val Ser Gly Val Pro Lys Asp Leu Lys Glu Ser His Arg Gly Gly Pro
595 600 605
Val Leu Lys Thr Tyr Ser Arg Ser Pro Val His Thr Ser Thr Arg Asn
610 615 620
Val Arg Ala Ala Lys Gly Phe Ile Gly Phe Pro Gln Val Ile Arg Gln
625 630 635 640
Asp Gln Asp Thr Asp His Pro Glu Asn Met Glu Ala Tyr Glu Thr Val
645 650 655
Ser Ala Phe Ile Thr Thr Asp Leu Lys Lys Tyr Cys Leu Asn Trp Arg
660 665 670
Tyr Glu Thr Ile Ser Leu Phe Ala Gln Arg Leu Asn Glu Ile Tyr Gly
675 680 685
Leu Pro Ser Phe Phe Gln Trp Leu His Lys Arg Leu Glu Thr Ser Val
690 695 700
Leu Tyr Val Ser Asp Pro His Cys Pro Pro Asp Leu Asp Ala His Ile
705 710 715 720
Pro Leu Tyr Lys Val Pro Asn Asp Gln Ile Phe Ile Lys Tyr Pro Met
725 730 735
Gly Gly Ile Glu Gly Tyr Cys Gln Lys Leu Trp Thr Ile Ser Thr Ile
740 745 750
Pro Tyr Leu Tyr Leu Ala Ala Tyr Glu Ser Gly Val Arg Ile Ala Ser
755 760 765
Leu Val Gln Gly Asp Asn Gln Thr Ile Ala Val Thr Lys Arg Val Pro
770 775 780
Ser Thr Trp Pro Tyr Asn Leu Lys Lys Arg Glu Ala Ala Arg Val Thr
785 790 795 800
Arg Asp Tyr Phe Val Ile Leu Arg Gln Arg Leu His Asp Ile Gly His
805 810 815
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820 825 830
Ser Lys Gly Ile Tyr Tyr Asp Gly Leu Leu Val Ser Gln Ser Leu Lys
835 840 845
Ser Ile Ala Arg Cys Val Phe Trp Ser Glu Thr Ile Val Asp Glu Thr
850 855 860
Arg Ala Ala Cys Ser Asn Ile Ala Thr Thr Met Ala Lys Ser Ile Glu
865 870 875 880
Arg Gly Tyr Asp Arg Tyr Leu Ala Tyr Ser Leu Asn Val Leu Lys Val
885 890 895
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900 905 910
Thr Arg Asp Val Val Ile Pro Leu Leu Thr Asn Asn Asp Leu Leu Ile
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945 950 955 960
Ile Ala Asp Leu Lys Arg Met Ile Leu Ala Ser Leu Met Pro Glu Glu
965 970 975
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
Ile Ile Val Pro Arg Ala Ala His Glu Ile Leu Asp His Ser Val
1055 1060 1065
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Gly Leu Ile Arg Ala Ser Met Arg Lys Gly Gly Leu Thr Ser Arg
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Gly Met Val Leu Leu Thr Gly Arg Lys Arg Asn Val Leu Ile Asp
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1130 1135 1140
Met Trp Ala Arg Leu Ala Arg Gly Arg Pro Ile Tyr Gly Leu Glu
1145 1150 1155
Val Pro Asp Val Leu Glu Ser Met Arg Gly His Leu Ile Arg Arg
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Ser Leu Arg Ser Ala Val Arg Ile Ala Thr Val Tyr Ser Trp Ala
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Leu Gly Leu Gly Val Leu Glu Thr Leu Phe Arg Leu Glu Lys Asp
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Arg Lys Leu Glu Leu Arg Ala Glu Leu Cys Thr Asn Pro Leu Ile
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Tyr Asp Asn Ala Pro Leu Ile Asp Arg Asp Ala Thr Arg Leu Tyr
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Thr Gln Ser His Arg Arg His Leu Val Glu Phe Val Thr Trp Ser
1415 1420 1425
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Met Ile Asp Leu Val Thr Lys Phe Glu Lys Asp His Met Asn Glu
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Ser Arg Met Ser Lys Gly Val Phe Lys Val Leu Val Asn Ala Leu
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1535 1540 1545
Glu Pro Ile His Gly Pro Ser Leu Asp Ala Gln Asn Leu His Thr
1550 1555 1560
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Leu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Glu Phe Thr Phe Leu Leu Cys
1580 1585 1590
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Leu Arg Val Asp Pro Gly Phe Ile Phe Asp Ala Leu Ala Glu Val
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Ile Arg Arg Cys Leu Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Phe Leu Gly
1775 1780 1785
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1820 1825 1830
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1835 1840 1845
Asn Gly Arg Pro Glu Val Thr Trp Val Gly Ser Val Asp Cys Phe
1850 1855 1860
Asn Phe Ile Val Ser Asn Ile Pro Thr Ser Ser Val Gly Phe Ile
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His Ser Asp Ile Glu Thr Leu Pro Asp Lys Asp Thr Ile Glu Lys
1880 1885 1890
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Lys Ile Gly Ser Ile Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Phe Ser Gly
1910 1915 1920
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1925 1930 1935
Glu Val Asn Leu Val Tyr Pro Arg Tyr Ser Asn Phe Ile Ser Thr
1940 1945 1950
Glu Ser Tyr Leu Val Met Thr Asp Leu Lys Ala Asn Arg Leu Met
1955 1960 1965
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Thr Ser Pro Gly Leu Ile Gly His Ile Leu Ser Ile Lys Gln Leu
1985 1990 1995
Ser Cys Ile Gln Ala Ile Val Gly Asp Ala Val Ser Arg Gly Asp
2000 2005 2010
Ile Asn Pro Thr Leu Lys Lys Leu Thr Pro Ile Glu Gln Val Leu
2015 2020 2025
Ile Asn Cys Gly Leu Ala Ile Asn Gly Pro Lys Leu Cys Lys Glu
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2060 2065 2070
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Ile Ile Met Thr Gly Gly Leu Lys Arg Glu Trp Val Phe Lys Val
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Ala Leu Ile Lys Asp
2180
<210>18
<211>18967
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>pTM-MVSchw plasmid
<400>18
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acgaaacccg gagtcccggg tcaccaaaca aagttgggta aggatagttc aatcaatgat 120
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ccacccatta catcaggatc cggtggagcc atcagaggaa tcaaacacat tattatagta 300
ccaatccctg gagattcctc aattaccact cgatccagac ttctggaccg gttggtgagg 360
ttaattggaa acccggatgt gagcgggccc aaactaacag gggcactaat aggtatatta 420
tccttatttg tggagtctcc aggtcaattg attcagagga tcaccgatga ccctgacgtt 480
agcataaggc tgttagaggt tgtccagagt gaccagtcac aatctggcct taccttcgca 540
tcaagaggta ccaacatgga ggatgaggcg gaccaatact tttcacatga tgatccaatt 600
agtagtgatc aatccaggtt cggatggttc gggaacaagg aaatctcaga tattgaagtg 660
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ctcgcaaagg cggttacggc cccagacacg gcagctgatt cggagctaag aaggtggata 780
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gtggtgagga acaggattgc cgaggacctc tccttacgcc gattcatggt cgctctaatc 900
ctggatatca agagaacacc cggaaacaaa cccaggattg ctgaaatgat atgtgacatt 960
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gaaactatgt atcctgctct tggactgcat gaatttgctg gtgagttatc cacacttgag 1080
tccttgatga acctttacca gcaaatgggg gaaactgcac cctacatggt aatcctggag 1140
aactcaattc agaacaagtt cagtgcagga tcataccctc tgctctggag ctatgccatg 1200
ggagtaggag tggaacttga aaactccatg ggaggtttga actttggccg atcttacttt 1260
gatccagcat attttagatt agggcaagag atggtaagga ggtcagctgg aaaggtcagt 1320
tccacattgg catctgaact cggtatcact gccgaggatg caaggcttgt ttcagagatt 1380
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aggagggtca aacagagtcg aggagaagcc agggagagct acagagaaac cgggcccagc 1560
agagcaagtg atgcgagagc tgcccatctt ccaaccggca cacccctaga cattgacact 1620
gcaacggagt ccagccaaga tccgcaggac agtcgaaggt cagctgacgc cctgcttagg 1680
ctgcaagcca tggcaggaat ctcggaagaa caaggctcag acacggacac ccctatagtg 1740
tacaatgaca gaaatcttct agactaggtg cgagaggccg agggccagaa caacatccgc 1800
ctaccatcca tcattgttat aaaaaactta ggaaccaggt ccacacagcc gccagcccat 1860
caaccatcca ctcccacgat tggagccaat ggcagaagag caggcacgcc atgtcaaaaa 1920
cggactggaa tgcatccggg ctctcaaggc cgagcccatc ggctcactgg ccatcgagga 1980
agctatggca gcatggtcag aaatatcaga caacccagga caggagcgag ccacctgcag 2040
ggaagagaag gcaggcagtt cgggtctcag caaaccatgc ctctcagcaa ttggatcaac 2100
tgaaggcggt gcacctcgca tccgcggtca gggacctgga gagagcgatg acgacgctga 2160
aactttggga atccccccaa gaaatctcca ggcatcaagc actgggttac agtgttatta 2220
cgtttatgat cacagcggtg aagcggttaa gggaatccaa gatgctgact ctatcatggt 2280
tcaatcaggc cttgatggtg atagcaccct ctcaggagga gacaatgaat ctgaaaacag 2340
cgatgtggat attggcgaac ctgataccga gggatatgct atcactgacc ggggatctgc 2400
tcccatctct atggggttca gggcttctga tgttgaaact gcagaaggag gggagatcca 2460
cgagctcctg agactccaat ccagaggcaa caactttccg aagcttggga aaactctcaa 2520
tgttcctccg cccccggacc ccggtagggc cagcacttcc gggacaccca ttaaaaaggg 2580
cacagacgcg agattagcct catttggaac ggagatcgcg tctttattga caggtggtgc 2640
aacccaatgt gctcgaaagt caccctcgga accatcaggg ccaggtgcac ctgcggggaa 2700
tgtccccgag tgtgtgagca atgccgcact gatacaggag tggacacccg aatctggtac 2760
cacaatctcc ccgagatccc agaataatga agaaggggga gactattatg atgatgagct 2820
gttctctgat gtccaagata ttaaaacagc cttggccaaa atacacgagg ataatcagaa 2880
gataatctcc aagctagaat cactgctgtt attgaaggga gaagttgagt caattaagaa 2940
gcagatcaac aggcaaaata tcagcatatc caccctggaa ggacacctct caagcatcat 3000
gatcgccatt cctggacttg ggaaggatcc caacgacccc actgcagatg tcgaaatcaa 3060
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gaaacccgtt gccagccgac aactccaagg aatgacaaat ggacggacca gttccagagg 3180
acagctgctg aaggaatttc agctaaagcc gatcgggaaa aagatgagct cagccgtcgg 3240
gtttgttcct gacaccggcc ctgcatcacg cagtgtaatc cgctccatta taaaatccag 3300
ccggctagag gaggatcgga agcgttacct gatgactctc cttgatgata tcaaaggagc 3360
caatgatctt gccaagttcc accagatgct gatgaagata ataatgaagt agctacagct 3420
caacttacct gccaacccca tgccagtcga cccaactagt acaacctaaa tccattataa 3480
aaaacttagg agcaaagtga ttgcctccca aggtccacaa tgacagagac ctacgacttc 3540
gacaagtcgg catgggacat caaagggtcg atcgctccga tacaacccac cacctacagt 3600
gatggcaggc tggtgcccca ggtcagagtc atagatcctg gtctaggcga caggaaggat 3660
gaatgcttta tgtacatgtt tctgctgggg gttgttgagg acagcgattc cctagggcct 3720
ccaatcgggc gagcatttgg gttcctgccc ttaggtgttg gcagatccac agcaaagccc 3780
gaaaaactcc tcaaagaggc cactgagctt gacatagttg ttagacgtac agcagggctc 3840
aatgaaaaac tggtgttcta caacaacacc ccactaactc tcctcacacc ttggagaaag 3900
gtcctaacaa cagggagtgt cttcaacgca aaccaagtgt gcaatgcggt taatctgata 3960
ccgctcgata ccccgcagag gttccgtgtt gtttatatga gcatcacccg tctttcggat 4020
aacgggtatt acaccgttcc tagaagaatg ctggaattca gatcggtcaa tgcagtggcc 4080
ttcaacctgc tggtgaccct taggattgac aaggcgatag gccctgggaa gatcatcgac 4140
aatacagagc aacttcctga ggcaacattt atggtccaca tcgggaactt caggagaaag 4200
aagagtgaag tctactctgc cgattattgc aaaatgaaaa tcgaaaagat gggcctggtt 4260
tttgcacttg gtgggatagg gggcaccagt cttcacatta gaagcacagg caaaatgagc 4320
aagactctcc atgcacaact cgggttcaag aagaccttat gttacccgct gatggatatc 4380
aatgaagacc ttaatcgatt actctggagg agcagatgca agatagtaag aatccaggca 4440
gttttgcagc catcagttcc tcaagaattc cgcatttacg acgacgtgat cataaatgat 4500
gaccaaggac tattcaaagt tctgtagacc gtagtgccca gcaatgcccg aaaacgaccc 4560
ccctcacaat gacagccaga aggcccggac aaaaaagccc cctccgaaag actccacgga 4620
ccaagcgaga ggccagccag cagccgacgg caagcgcgaa caccaggcgg ccccagcaca 4680
gaacagccct gacacaaggc caccaccagc caccccaatc tgcatcctcc tcgtgggacc 4740
cccgaggacc aacccccaag gctgcccccg atccaaacca ccaaccgcat ccccaccacc 4800
cccgggaaag aaacccccag caattggaag gcccctcccc ctcttcctca acacaagaac 4860
tccacaaccg aaccgcacaa gcgaccgagg tgacccaacc gcaggcatcc gactccctag 4920
acagatcctc tctccccggc aaactaaaca aaacttaggg ccaaggaaca tacacaccca 4980
acagaaccca gaccccggcc cacggcgccg cgcccccaac ccccgacaac cagagggagc 5040
ccccaaccaa tcccgccggc tcccccggtg cccacaggca gggacaccaa cccccgaaca 5100
gacccagcac ccaaccatcg acaatccaag acgggggggc ccccccaaaa aaaggccccc 5160
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aaaccagaac ccagaccacc ctgggccacc agctcccaga ctcggccatc accccgcaga 5280
aaggaaaggc cacaacccgc gcaccccagc cccgatccgg cggggagcca cccaacccga 5340
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cacacccgac gacactcaac tccccacccc taaaggagac accgggaatc ccagaatcaa 5520
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actgttaact ctccaaacac ccaccggtca aatccattgg ggcaatctct ctaagatagg 5640
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agaatacagg agactactga gaacagtttt ggaaccaatt agagatgcac ttaatgcaat 5820
gacccagaat ataagaccgg ttcagagtgt agcttcaagt aggagacaca agagatttgc 5880
gggagtagtc ctggcaggtg cggccctagg cgttgccaca gctgctcaga taacagccgg 5940
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ggaaactact aatcaggcaa ttgagacaat cagacaagca gggcaggaga tgatattggc 6060
tgttcagggt gtccaagact acatcaataa tgagctgata ccgtctatga accaactatc 6120
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gatcccgcga aattaatacg actcactata gggagaccac aacggtttcc ctctagcggg 840
atcaattccg cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat 900
aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg 960
tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc 1020
tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt 1080
cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg 1140
acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac 1200
cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg 1260
tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg 1320
ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc 1380
gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgataa taccatggac tcgctatctg 1440
tcaaccagat cttataccct gaagttcacc tagatagccc gatagttacc aataagatag 1500
tagccatcct ggagtatgct cgagtccctc acgcttacag cctggaggac cctacactgt 1560
gtcagaacat caagcaccgc ctaaaaaacg gattttccaa ccaaatgatt ataaacaatg 1620
tggaagttgg gaatgtcatc aagtccaagc ttaggagtta tccggcccac tctcatattc 1680
catatccaaa ttgtaatcag gatttattta acatagaaga caaagagtca acgaggaaga 1740
tccgtgaact cctcaaaaag gggaattcgc tgtactccaa agtcagtgat aaggttttcc 1800
aatgcttaag ggacactaac tcacggcttg gcctaggctc cgaattgagg gaggacatca 1860
aggagaaagt tattaacttg ggagtttaca tgcacagctc ccagtggttt gagccctttc 1920
tgttttggtt tacagtcaag actgagatga ggtcagtgat taaatcacaa acccatactt 1980
gccataggag gagacacaca cctgtattct tcactggtag ttcagttgag ttgctaatct 2040
ctcgtgacct tgttgctata atcagtaaag agtctcaaca tgtatattac ctgacatttg 2100
aactggtttt gatgtattgt gatgtcatag aggggaggtt aatgacagag accgctatga 2160
ctattgatgc taggtataca gagcttctag gaagagtcag atacatgtgg aaactgatag 2220
atggtttctt ccctgcactc gggaatccaa cttatcaaat tgtagccatg ctggagcctc 2280
tttcacttgc ttacctgcag ctgagggata taacagtaga actcagaggt gctttcctta 2340
accactgctt tactgaaata catgatgttc ttgaccaaaa cgggttttct gatgaaggta 2400
cttatcatga gttaactgaa gctctagatt acattttcat aactgatgac atacatctga 2460
caggggagat tttctcattt ttcagaagtt tcggccaccc cagacttgaa gcagtaacgg 2520
ctgctgaaaa tgttaggaaa tacatgaatc agcctaaagt cattgtgtat gagactctga 2580
tgaaaggtca tgccatattt tgtggaatca taatcaacgg ctatcgtgac aggcacggag 2640
gcagttggcc accgctgacc ctccccctgc atgctgcaga cacaatccgg aatgctcaag 2700
cttcaggtga agggttaaca catgagcagt gcgttgataa ctggaaatct tttgctggag 2760
tgaaatttgg ctgctttatg cctcttagcc tggatagtga tctgacaatg tacctaaagg 2820
acaaggcact tgctgctctc caaagggaat gggattcagt ttacccgaaa gagttcctgc 2880
gttacgaccc tcccaaggga accgggtcac ggaggcttgt agatgttttc cttaatgatt 2940
cgagctttga cccatatgat gtgataatgt atgttgtaag tggagcttac ctccatgacc 3000
ctgagttcaa cctgtcttac agcctgaaag aaaaggagat caaggaaaca ggtagacttt 3060
ttgctaaaat gacttacaaa atgagggcat gccaagtgat tgctgaaaat ctaatctcaa 3120
acgggattgg caaatatttt aaggacaatg ggatggccaa ggatgagcac gatttgacta 3180
aggcactcca cactctagct gtctcaggag tccccaaaga tctcaaagaa agtcacaggg 3240
gggggccagt cttaaaaacc tactcccgaa gcccagtcca cacaagtacc aggaacgtga 3300
gagcagcaaa agggtttata gggttccctc aagtaattcg gcaggaccaa gacactgatc 3360
atccggagaa tatggaagct tacgagacag tcagtgcatt tatcacgact gatctcaaga 3420
agtactgcct taattggaga tatgagacca tcagcttgtt tgcacagagg ctaaatgaga 3480
tttacggatt gccctcattt ttccagtggc tgcataagag gcttgagacc tctgtcctgt 3540
atgtaagtga ccctcattgc ccccccgacc ttgacgccca tatcccgtta tataaagtcc 3600
ccaatgatca aatcttcatt aagtacccta tgggaggtat agaagggtat tgtcagaagc 3660
tgtggaccat cagcaccatt ccctatctat acctggctgc ttatgagagc ggagtaagga 3720
ttgcttcgtt agtgcaaggg gacaatcaga ccatagccgt aacaaaaagg gtacccagca 3780
catggcccta caaccttaag aaacgggaag ctgctagagt aactagagat tactttgtaa 3840
ttcttaggca aaggctacat gatattggcc atcacctcaa ggcaaatgag acaattgttt 3900
catcacattt ttttgtctat tcaaaaggaa tatattatga tgggctactt gtgtcccaat 3960
cactcaagag catcgcaaga tgtgtattct ggtcagagac tatagttgat gaaacaaggg 4020
cagcatgcag taatattgct acaacaatgg ctaaaagcat cgagagaggt tatgaccgtt 4080
accttgcata ttccctgaac gtcctaaaag tgatacagca aattctgatc tctcttggct 4140
tcacaatcaa ttcaaccatg acccgggatg tagtcatacc cctcctcaca aacaacgacc 4200
tcttaataag gatggcactg ttgcccgctc ctattggggg gatgaattat ctgaatatga 4260
gcaggctgtt tgtcagaaac atcggtgatc cagtaacatc atcaattgct gatctcaaga 4320
gaatgattct cgcctcacta atgcctgaag agaccctcca tcaagtaatg acacaacaac 4380
cgggggactc ttcattccta gactgggcta gcgaccctta ctcagcaaat cttgtatgtg 4440
tccagagcat cactagactc ctcaagaaca taactgcaag gtttgtcctg atccatagtc 4500
caaacccaat gttaaaagga ttattccatg atgacagtaa agaagaggac gagggactgg 4560
cggcattcct catggacagg catattatag tacctagggc agctcatgaa atcctggatc 4620
atagtgtcac aggggcaaga gagtctattg caggcatgct ggataccaca aaaggcttga 4680
ttcgagccag catgaggaag ggggggttaa cctctcgagt gataaccaga ttgtccaatt 4740
atgactatga acaattcaga gcagggatgg tgctattgac aggaagaaag agaaatgtcc 4800
tcattgacaa agagtcatgt tcagtgcagc tggcgagagc tctaagaagc catatgtggg 4860
cgaggctagc tcgaggacgg cctatttacg gccttgaggt ccctgatgta ctagaatcta 4920
tgcgaggcca ccttattcgg cgtcatgaga catgtgtcat ctgcgagtgt ggatcagtca 4980
actacggatg gttttttgtc ccctcgggtt gccaactgga tgatattgac aaggaaacat 5040
catccttgag agtcccatat attggttcta ccactgatga gagaacagac atgaagcttg 5100
ccttcgtaag agccccaagt cgatccttgc gatctgctgt tagaatagca acagtgtact 5160
catgggctta cggtgatgat gatagctctt ggaacgaagc ctggttgttg gctaggcaaa 5220
gggccaatgt gagcctggag gagctaaggg tgatcactcc catctcaact tcgactaatt 5280
tagcgcatag gttgagggat cgtagcactc aagtgaaata ctcaggtaca tcccttgtcc 5340
gagtggcgag gtataccaca atctccaacg acaatctctc atttgtcata tcagataaga 5400
aggttgatac taactttata taccaacaag gaatgcttct agggttgggt gttttagaaa 5460
cattgtttcg actcgagaaa gataccggat catctaacac ggtattacat cttcacgtcg 5520
aaacagattg ttgcgtgatc ccgatgatag atcatcccag gatacccagc tcccgcaagc 5580
tagagctgag ggcagagcta tgtaccaacc cattgatata tgataatgca cctttaattg 5640
acagagatgc aacaaggcta tacacccaga gccataggag gcaccttgtg gaatttgtta 5700
catggtccac accccaacta tatcacattt tagctaagtc cacagcacta tctatgattg 5760
acctggtaac aaaatttgag aaggaccata tgaatgaaat ttcagctctc ataggggatg 5820
acgatatcaa tagtttcata actgagtttc tgctcataga gccaagatta ttcactatct 5880
acttgggcca gtgtgcggcc atcaattggg catttgatgt acattatcat agaccatcag 5940
ggaaatatca gatgggtgag ctgttgtcat cgttcctttc tagaatgagc aaaggagtgt 6000
ttaaggtgct tgtcaatgct ctaagccacc caaagatcta caagaaattc tggcattgtg 6060
gtattataga gcctatccat ggtccttcac ttgatgctca aaacttgcac acaactgtgt 6120
gcaacatggt ttacacatgc tatatgacct acctcgacct gttgttgaat gaagagttag 6180
aagagttcac atttctcttg tgtgaaagcg acgaggatgt agtaccggac agattcgaca 6240
acatccaggc aaaacactta tgtgttctgg cagatttgta ctgtcaacca gggacctgcc 6300
caccaattcg aggtctaaga ccggtagaga aatgtgcagt tctaaccgac catatcaagg 6360
cagaggctat gttatctcca gcaggatctt cgtggaacat aaatccaatt attgtagacc 6420
attactcatg ctctctgact tatctccggc gaggatcgat caaacagata agattgagag 6480
ttgatccagg attcattttc gacgccctcg ctgaggtaaa tgtcagtcag ccaaagatcg 6540
gcagcaacaa catctcaaat atgagcatca aggctttcag acccccacac gatgatgttg 6600
caaaattgct caaagatatc aacacaagca agcacaatct tcccatttca gggggcaatc 6660
tcgccaatta tgaaatccat gctttccgca gaatcgggtt gaactcatct gcttgctaca 6720
aagctgttga gatatcaaca ttaattagga gatgccttga gccaggggag gacggcttgt 6780
tcttgggtga gggatcgggt tctatgttga tcacttataa agagatactt aaactaaaca 6840
agtgcttcta taatagtggg gtttccgcca attctagatc tggtcaaagg gaattagcac 6900
cctatccctc cgaagttggc cttgtcgaac acagaatggg agtaggtaat attgtcaaag 6960
tgctctttaa cgggaggccc gaagtcacgt gggtaggcag tgtagattgc ttcaatttca 7020
tagttagtaa tatccctacc tctagtgtgg ggtttatcca ttcagatata gagaccttgc 7080
ctgacaaaga tactatagag aagctagagg aattggcagc catcttatcg atggctctgc 7140
tcctgggcaa aataggatca atactggtga ttaagcttat gcctttcagc ggggattttg 7200
ttcagggatt tataagttat gtagggtctc attatagaga agtgaacctt gtatacccta 7260
gatacagcaa cttcatctct actgaatctt atttggttat gacagatctc aaggctaacc 7320
ggctaatgaa tcctgaaaag attaagcagc agataattga atcatctgtg aggacttcac 7380
ctggacttat aggtcacatc ctatccatta agcaactaag ctgcatacaa gcaattgtgg 7440
gagacgcagt tagtagaggt gatatcaatc ctactctgaa aaaacttaca cctatagagc 7500
aggtgctgat caattgcggg ttggcaatta acggacctaa gctgtgcaaa gaattgatcc 7560
accatgatgt tgcctcaggg caagatggat tgcttaattc tatactcatc ctctacaggg 7620
agttggcaag attcaaagac aaccaaagaa gtcaacaagg gatgttccac gcttaccccg 7680
tattggtaag tagcaggcaa cgagaactta tatctaggat cacccgcaaa ttctgggggc 7740
acattcttct ttactccggg aacaaaaagt tgataaataa gtttatccag aatctcaagt 7800
ccggctatct gatactagac ttacaccaga atatcttcgt taagaatcta tccaagtcag 7860
agaaacagat tattatgacg gggggtttga aacgtgagtg ggtttttaag gtaacagtca 7920
aggagaccaa agaatggtat aagttagtcg gatacagtgc cctgattaag gactaattgg 7980
ttgaactccg gaaccctaat cctgccctag gtggttaggc attatttacc tcgagggggc 8040
cggatccact agttctagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8100
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa acgtcgcgca ggtgacaatg tcgagctagc tatgaattcc 8160
ccggggagct cactagtgga tccctgcagc tcgagaggcc taattaatta agtcgacgat 8220
ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa 8280
ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga 8340
actatatccg gatcgagatc aattctgtga gcgtatggca aacgaaggaa aaatagttat 8400
agtagccgca ctcgatggga catttcaacg taaaccgttt aataatattt tgaatcttat 8460
tccattatct gaaatggtgg taaaactaac tgctgtgtgt atgaaatgct ttaaggaggc 8520
ttccttttct aaacgattgg gtgaggaaac cgagatagaa ataataggag gtaatgatat 8580
gtatcaatcg gtgtgtagaa agtgttacat cgactcataa tattatattt tttatctaaa 8640
aaactaaaaa taaacattga ttaaatttta atataatact taaaaatgga tgttgtgtcg 8700
ttagataaac cgtttatgta ttttgaggaa attgataatg agttagatta cgaaccagaa 8760
agtgcaaatg aggtcgcaaa aaaactgccg tatcaaggac agttaaaact attactagga 8820
gaattatttt ttcttagtaa gttacagcga cacggtatat tagatggtgc caccgtagtg 8880
tatataggat ctgctcccgg tacacatata cgttatttga gagatcattt ctataattta 8940
ggagtgatca tcaaatggat gctaattgac ggccgccatc atgatcctat tttaaatgga 9000
ttgcgtgatg tgactctagt gactcggttc gttgatgagg aatatctacg atccatcaaa 9060
aaacaactgc atccttctaa gattatttta atttctgatg tgagatccaa acgaggagga 9120
aatgaaccta gtacggcgga tttactaagt aattacgctc tacaaaatgt catgattagt 9180
attttaaacc ccgtggcgtc tagtcttaaa tggagatgcc cgtttccaga tcaatggatc 9240
aaggactttt atatcccaca cggtaataaa atgttacaac cttttgctcc ttcatattca 9300
gggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 9360
ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc 9420
cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcga cgcgccctgt agcggcgcat 9480
taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 9540
cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc 9600
aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 9660
ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 9720
ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa 9780
caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg 9840
cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat 9900
taacgtttac aatttcccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 9960
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 10020
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 10080
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 10140
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 10200
cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 10260
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 10320
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 10380
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 10440
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 10500
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 10560
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 10620
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 10680
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 10740
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 10800
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 10860
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 10920
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 10980
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 11040
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 11100
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 11160
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 11220
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 11280
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 11340
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 11400
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 11460
acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 11520
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 11580
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 11640
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 11700
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 11760
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 11820
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 11880
gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 11940
tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 12000
tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 12060
cagctatgac catgattacg cc 12082
<210>20
<211>61
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>AttB1-T7Pol primer
<400>20
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc caccatggaa ttctctgaca tcgaactggc 60
t 61
<210>21
<211>64
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>AttB2-retourT7Pol primer
<400>21
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt atcacgcgaa cgcgaagtcc gactctaaga 60
tgtc 64
<210>22
<211>61
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>AttBI-SV40nls primer
<400>22
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc caccatggca ccaaaaaaga agagaaaggt 60
a 61
<210>23
<211>58
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>AttB1-N primer
<400>23
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catggccaca cttttaagga gcttagca 58
<210>24
<211>60
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>AttB2-N primer
<400>24
gggaccactt tgtacaagaa agctgggtgt gtactagtct agaagatttc tgtcattgta 60
<210>25
<211>55
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>AttB1-P primer
<400>25
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catggcagaa gagcaggcac gccat 55
<210>26
<211>68
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>AttB2-P primer
<400>26
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg ttactacttc attattatct tcatcagcat 60
ctggtgga 68
Claims (68)
1.一种稳定产生至少RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)或它们的功能衍生物的细胞。
2.如权利要求1所述的细胞,其中所述稳定产生不是由药物选择引起的。
3.如权利要求1或2所述的细胞,其基因组中整合有:
a.至少一个拷贝的处于转录调控元件控制下编码RNA聚合酶的核酸,
b.至少一个拷贝的处于转录调控元件控制下编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸,以及
c.至少一个拷贝的处于转录调控元件控制下编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸。
4.如权利要求1至3任一项所述的细胞,其还包含整合到其基因组中的至少一个拷贝的DNA瓣(DNA flap),其中所述至少一个DNA瓣与所述核酸功能相关。
5.一种可通过其基因组与下列载体重组而得到的细胞:
a.包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码RNA聚合酶的核酸的表达载体,
b.包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸的表达载体,以及
c.包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸的表达载体。
6.一种可通过其基因组与包含下列核酸的表达载体重组而得到的细胞:
a.至少一个拷贝的编码RNA聚合酶的核酸,
b.至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸,
c.至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸,以及
d.DNA瓣。
7.如权利要求1至6任一项所述的细胞,其中非节段负链RNA病毒N蛋白和P蛋白来自相同的病毒。
8.如权利要求7所述的细胞,其中所述N蛋白和P蛋白来自相同的病毒株或不同的病毒株。
9.如权利要求1至6所述的细胞,其中非节段负链RNA病毒的N蛋白和P蛋白来自不同的非节段负链RNA病毒。
10.如权利要求8所述的细胞,其中非节段负链RNA病毒的N蛋白和P蛋白来自减毒的MV病毒,特别是Schwarz MV株。
11.如权利要求1至10任一项所述的细胞,其中所述RNA聚合酶是T7噬菌体RNA聚合酶或其核形式(nlsT7)。
12.如权利要求1至11任一项所述的细胞,其中所述DNA瓣源自反转录病毒。
13.如权利要求12所述的细胞,其中所述DNA瓣源自慢病毒,特别是人慢病毒。
14.如权利要求13所述的细胞,其中所述DNA瓣源自HIV、CAEV、EIAV、VISNA、SIV或FIV病毒。
15.如权利要求14所述的细胞,其中所述DNA瓣源自HIV-1或HIV-2。
16.如权利要求5至15任一项所述的细胞,其中所述载体是源自HIV的基因转移载体,其包含两个LTR、表达调控元件和转录调控元件,其中一个LTR任选地缺失U3部分。
17.如权利要求5或权利要求7至16任一项所述的细胞,其中所述载体是:
a.2006年12月14日以编号I-3702保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7或2006年12月14日以编号I-3703保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7,
b.2006年12月14日以编号I-3700保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N,以及
c.2006年12月14日以编号I-3701保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-P。
18.如权利要求1至17任一项所述的细胞,其是真核细胞。
19.如权利要求18所述的细胞,其是哺乳动物细胞。
20.如权利要求19所述的细胞,其是人细胞。
21.如权利要求1至20任一项所述的细胞,其可分裂。
22.如权利要求1至21任一项所述的细胞,其是HEK 293(人胚肾)细胞。
23.如权利要求22所述的细胞,其是2006年6月14日以编号I-3618保藏在CNCM的293-T7-NP细胞系。
24.如权利要求22所述的细胞,其是2006年8月4日以编号I-3662保藏在CNCM的293-nlsT7-NP MV细胞系。
25.如权利要求1至20任一项所述的细胞,其不可分裂。
26.如权利要求3所述的细胞,其包含整合到其基因组中的至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)或其功能衍生物的核苷酸序列,该核苷酸序列任选处于转录调控元件控制下。
27.如权利要求1至25任一项所述的细胞,其进一步与包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的表达载体重组,所述表达载体例如2007年12月18日以编号I-3881保藏在CNCM的pEMC-LSchw质粒。
28.如权利要求27所述的细胞,其中所述表达载体是包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒L蛋白的核酸的表达载体。
29.如权利要求26至28任一项所述的细胞,其中非节段负链RNA病毒的N蛋白、P蛋白和L蛋白来自相同的病毒。
30.如权利要求29所述的细胞,其中所述N蛋白、P蛋白和L蛋白来自相同的病毒株或不同的病毒株。
31.如权利要求26至28任一项所述的细胞,其中非节段负链RNA病毒的N蛋白、P蛋白和L蛋白来自不同的非节段负链RNA病毒。
32.如权利要求26至31任一项所述的细胞,其中非节段负链RNA病毒的L蛋白来自MV病毒,特别是Schwarz MV株。
33.如权利要求1至32任一项所述的细胞,其进一步与编码非节段负链RNA病毒全长反基因组的cDNA克隆重组。
34.如权利要求33所述的细胞,其中所述非节段负链cDNA克隆的序列通过在容许位点插入异源核酸而被修饰。
35.一种细胞培养物,其由权利要求1至34任一项所述的细胞组成。
36.如权利要求35所述的细胞培养物,其是原代培养物。
37.如权利要求35所述的细胞培养物,其是细胞系。
38.一种源于反转录病毒的表达载体,特别是质粒,其包含DNA瓣和至少一种编码拯救非节段负链RNA病毒所需蛋白质的核酸。
39.如权利要求38所述的源于反转录病毒的表达载体,其中所述核酸编码选自RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒N蛋白、非节段负链RNA病毒P蛋白和非节段负链RNA病毒L蛋白的蛋白质。
40.如权利要求38或39所述的源于反转录病毒的表达载体,其是源于FIV或SIV的载体。
41.如权利要求38或39所述的源于反转录病毒的表达载体,其是源于人慢病毒例如HIV的载体。
42.如权利要求41所述的源于反转录病毒的表达载体,其是源于HIV-1或HIV-2的载体。
43.如权利要求38至42任一项所述的源于反转录病毒的表达载体,其包含DNA瓣和编码RNA聚合酶的核酸,所述表达载体例如2006年12月14日以编号I-3702保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7。
44.如权利要求38至42任一项所述的源于反转录病毒的表达载体,其包含DNA瓣和编码RNA聚合酶的核形式的核酸,所述表达载体例如2006年12月14日以编号I-3703保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7。
45.如权利要求38至42任一项所述的源于反转录病毒的表达载体,其包含DNA瓣和编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸,所述表达载体例如2006年12月14日以编号I-3700保藏在CNCM的HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N。
46.如权利要求38至42任一项所述的源于反转录病毒的表达载体,其包含DNA瓣和编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸,所述表达载体例如2006年12月14日以编号I-3701保藏在CNCM的质粒HIV-1-TRIPΔU3.CMV-P。
47.如权利要求38至42任一项所述的源于反转录病毒的表达载体,其包含DNA瓣和编码非节段负链RNA病毒L蛋白的核酸。
48.如权利要求38至42任一项所述的源于反转录病毒的表达载体,其包含DNA瓣和编码RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒N蛋白、非节段负链RNA病毒P蛋白和任选地非节段负链RNA病毒L蛋白的核酸。
49.一种表达载体,其包含编码非节段负链RNA病毒L蛋白的核酸,该表达载体是2007年12月18日以编号I-3881保藏在CNCM的质粒pEMC-LSchw。
50.如权利要求38至49任一项所述的表达载体,其中所述核酸处于转录调控元件例如启动子例如CMV启动子的控制下。
51.产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒的方法,其包含下列步骤或由下列步骤组成:
a.将稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒聚合酶辅因子磷蛋白(P)的细胞或细胞培养物与非节段负链cDNA克隆和包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的载体进行重组,
b.将所述重组细胞或重组细胞的培养物转移到能够维持非节段负链RNA病毒的复制和产生的感受态细胞上,以及
c.回收来自步骤b的共培养物的感染性的重组的非节段负链RNA病毒。
52.产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒的方法,其包含下列步骤或由下列步骤组成:
a.将权利要求1至25任一项所述的细胞或细胞培养物与非节段负链cDNA克隆和包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的表达载体进行重组,
b.将所述重组细胞或重组细胞的培养物转移到能够维持非节段负链RNA病毒的复制和产生的感受态细胞上,以及
c.回收来自步骤b的共培养物的感染性的重组的非节段负链RNA病毒。
53.产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒的方法,其包含下列步骤或由下列步骤组成:
a.将权利要求26至32任一项所述的细胞或细胞培养物与非节段负链cDNA克隆进行重组,以及
b.将所述重组细胞或重组细胞的培养物转移到能够维持非节段负链RNA病毒的复制和产生的感受态细胞上,以及
c.回收来自步骤b的共培养物的感染性的重组的非节段负链RNA病毒。
54.如权利要求51至53任一项所述的方法,其中所述细胞培养物是2006年6月14日以编号I-3618保藏在CNCM的293-T7-NP细胞系或2006年8月4日以编号I-3662保藏在CNCM的293-nlsT7-NP MV细胞系。
55.如权利要求51至54任一项所述的方法,其中步骤b的所述感染态细胞是Vero(非洲绿猴肾)细胞、CEF(鸡胚成纤维细胞)细胞或MRC5细胞。
56.产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒的方法,其包含下列步骤或由下列步骤组成:
a.将稳定产生RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒聚合酶辅因子磷蛋白(P)的细胞或细胞培养物与非节段负链RNA病毒的非节段负链cDNA克隆和包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的载体进行重组;以及
b.回收来自所述重组细胞或重组细胞培养物的感染性的重组的非节段负链RNA病毒。
57.产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒的方法,其包含下列步骤或由下列步骤组成:
a.将权利要求1至25任一项所述的细胞或细胞培养物与非节段负链RNA病毒的非节段负链cDNA克隆和包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)的核酸的表达载体进行重组,以及
b.回收来自所述重组细胞或重组细胞培养物的感染性的重组的非节段负链RNA病毒。
58.产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒的方法,其包含下列步骤或由下列步骤组成:
a.将权利要求26至32任一项所述的细胞或细胞培养物与非节段负链RNA病毒的非节段负链cDNA克隆进行重组,以及
b.回收来自所述重组细胞或重组细胞培养物的感染性的重组的非节段负链RNA病毒。
59.如权利要求56至58任一项所述的方法,其中所述细胞或细胞培养物是真核细胞培养物,特别是哺乳动物细胞培养物或人细胞培养物。
60.如权利要求59所述的方法,其中所述细胞培养物是人成纤维细胞,特别是MRC5细胞系(人肺成纤维细胞)。
61.如权利要求51至60任一项所述的方法,其中通过在容许位点插入至少一种外源核酸来修饰非节段负链RNA病毒的所述非节段负链cDNA克隆的核苷酸序列。
62.如权利要求51至61任一项所述的方法,其中所述异源核酸编码表位或多表位。
63.如权利要求51至62任一项所述的方法,其中非节段负链RNA病毒的所述修饰的非节段负链cDNA来自减毒的MV病毒,特别是MVSchwarz株。
64.产生如权利要求1至25任一项所述的重组细胞的方法,其包含下列步骤或由下列步骤组成:
a.将细胞与至少下列表达载体进行重组:
-包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码RNA聚合酶的核酸的表达载体,
-包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸的表达载体,以及
-包含DNA瓣和至少一个拷贝的编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸的表达载体,以及
b.选择稳定产生至少RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)或它们的功能衍生物的细胞。
65.产生如权利要求1至25任一项所述的重组细胞的方法,其包含下列步骤或由下列步骤组成:
a.将细胞与至少一种包含下列核酸的表达载体进行重组:
-至少一个拷贝的处于启动子控制下编码RNA聚合酶的核酸,
-至少一个拷贝的处于启动子控制下编码非节段负链RNA病毒N蛋白的核酸,
-至少一个拷贝的处于启动子控制下编码非节段负链RNA病毒P蛋白的核酸,和
-DNA瓣,以及
b.选择稳定产生至少RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)或它们的功能衍生物的细胞。
66.产生如权利要求26至32任一项所述的重组细胞的方法,其包含下列步骤或由下列步骤组成:
a.通过权利要求64或65所述的方法提供重组细胞,
b.进一步以a得到的重组细胞与包含编码非节段负链RNA病毒RNA聚合酶大蛋白(L)或其功能衍生物的核酸的表达载体进行重组,以及
c.选择稳定产生至少RNA聚合酶、非节段负链RNA病毒核蛋白(N)和非节段负链RNA病毒磷蛋白(P)并产生非节段负链RNA病毒大蛋白(L)或其功能衍生物的细胞。
67.如权利要求1至34任一项所述的细胞作为辅助细胞系的用途。
68.如权利要求1至34任一项所述的细胞产生感染性的重组的非节段负链RNA病毒的用途。
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