ES2686168T3 - Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada - Google Patents

Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada Download PDF

Info

Publication number
ES2686168T3
ES2686168T3 ES07870468.1T ES07870468T ES2686168T3 ES 2686168 T3 ES2686168 T3 ES 2686168T3 ES 07870468 T ES07870468 T ES 07870468T ES 2686168 T3 ES2686168 T3 ES 2686168T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
protein
virus
nucleic acid
negative sense
sense strand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES07870468.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Frédéric Tangy
Pierre Charneau
Yves Jacob
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Pasteur de Lille filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Application granted granted Critical
Publication of ES2686168T3 publication Critical patent/ES2686168T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/16052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18422—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Una célula recombinante que comprende integrados en su genoma al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de los mismos, y al menos una copia de un ADN solapado asociado funcionalmente con dicho ácido o ácidos nucleicos y donde dicha ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), dichas proteínas N y P se expresan de manera estable, y donde dichos derivados funcionales de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) y/o la nucleoproteína (N) y/o la fosfoproteína (P) se definen como variantes de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) y/o de la proteína N y/o de la proteína P que mantienen actividad de la proteína a partir de la cual se obtienen, como un complejo de ribonucleoproteína (complejo RNP), funcional en transcripción y replicación en un genoma de virus, en un sistema de rescate que posibilita la producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada a partir de ADNc clonado, estando dichas variantes codificadas por un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en: a) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad (solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación del 50 % de formamida, 6X SSC a 42º C y condiciones de lavado a 68º C, 0,2X SSC y el 0,1 % de SDS) con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 y la proteína P de SEQ ID NO: 15 de una cepa o virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada; b) un ácido nucleico que presenta al menos el 80 %, preferentemente el 90 %, más preferentemente el 95 % o incluso el 99 % de similitud con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de SEQ ID NO: 15, calculándose dicha similitud a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias; y c) un ácido nucleico que difiere del ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de SEQ ID NO: 15 en al menos un nucleótido, opcionalmente sustitución conservativa, preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, en al menos una supresión o adición de nucleótido, preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 supresiones o adiciones de nucleótido; o, siendo un fragmento que representa al menos el 70 %, particularmente el 80 % y más particularmente el 90 % o incluso el 95 % de la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de SEQ ID NO: 15.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada
La presente invención se refiere a células recombinantes así como también a métodos para la generación de virus de ARN monocatenario de cadena de sentido negativo no segmentada (NNV o mononegavirales) a partir de ácido desoxirribonucleico clonado (ADNc), especialmente a partir del virus de sarampión y en particular a partir de cepas atenuadas tales como las aprobadas para la vacunación, en particular a partir del virus de sarampión atenuado Schwarz y varios virus en base a sarampión Schwarz recombinantes que expresan secuencias heterólogas. Tales virus de rescate pueden utilizarse, después de la amplificación, como vacunas para inmunización en contra de sarampión y/o en contra de péptidos heterólogos o proteínas expresadas.
Los virus de ARN atenuados vivos hacen vacunas muy eficaces. Entre éstas, la vacuna de sarampión se ha utilizado en cientos de millones de niños y se ha probado que es eficaz y segura. Esta vacuna induce inmunidad de por vida después de una o dos inyecciones. La misma se produce fácilmente a gran escala a bajos precios en la mayoría de los países. Estas ventajas hacen al virus de sarampión, especialmente cepas de vacuna atenuadas, un buen vector candidato para inmunizar niños pero incluso en algunas circunstancias las poblaciones adultas, frente a sarampión y/o patologías infecciosas, especialmente patologías virales tales como SIDA (retrovirus), enfermedades de flavivirus o coronavirus (SARS).
Los virus de sarampión atenuados se han utilizado como vacunas desde la década de 1960 puesto que es una de las vacunas humanas más eficaces y seguras. Las campañas de vacunación han sido muy eficaces para controlar el sarampión en los países desarrollados. Sin embargo, debido a la distribución inadecuada de la vacuna en los países en desarrollo, el sarampión aún infecta a aproximadamente 45 millones de individuos y es responsable de la muerte de 700.000 niños por año. Por lo tanto, la OMS ha incrementado su programa de vacunación global para los próximos 10-20 años (C.D.C., 2005). Tomando ventaja de las campañas de la OMS, el uso de vectores de vacuna obtenidos a partir de vacuna de sarampión permitirán en algunas regiones del mundo la inmunización simultánea de niños frente a sarampión y otras enfermedades infecciosas con nuevas vacunas pediátricas multivalentes, especialmente bivalentes que son tanto seguras como eficaces.
El virus de sarampión (MV) pertenece al género Morbillivirus en la familia Paramyxoviridae. Es un virus con envuelta con un genoma de ARN de cadena de polaridad negativa no segmentada (15.894 pb). El sarampión puede contraerse una vez que el sistema inmune muestra una fuerte respuesta específica y establece una memoria de por vida que protege frente a re-infección. Esta protección se basa tanto en la producción de anticuerpos como de linfocitos T CD8+ citotóxicos de memoria (CTL). Las cepas patógenas alteran de forma marcada la hematopoyesis (Arneborn y col., 1983; Kim y col., 2002; Okada y col., 2000) dando como resultado, por tanto, inmunosupresión transitoria responsable de la mayoría de las muertes debido a infección por sarampión en los países en desarrollo. Al contrario de las cepas primarias, las cepas atenuadas no inducen la inmunosupresión (Okada y col., 2001).
La cepa Edmonston de virus de sarampión fue aislada en 1954 mediante cultivo en células primarias humanas (Enders y col., 1954). La adaptación a fibroblastos embrionarios de pollo produjo semillas de vacuna que se atenuaron adicionalmente mediante pases posteriores en fibroblastos embrionarios de pollo (Schwarz y col., 1962). Las cepas Schwarz y Moraten que poseen secuencias de nucleótidos idénticas (Park y col., 2001a; Parks y col., 2001b) constituyen la vacuna de sarampión más frecuentemente usada. La vacunación con una o más inyecciones induce la inmunidad de por vida (Griffin y col., 2001; Hilleman y col., 2002). La persistencia de células CD8 y anticuerpos se ha demostrado hasta 25 años después de la vacunación (Ovsyannikova y col., 2003). La vacuna contra el sarampión se produce fácilmente a gran escala en la mayoría de los países y puede estar disponible a bajo coste. La atenuación del genoma viral se produce como resultado de una combinación ventajosa de varias mutaciones. Por tanto, la vacuna es muy estable y la reversión de las cepas de vacuna no se ha observado nunca hasta ahora (Hilleman y col., 2002). Además, el virus se replica solamente en el citoplasma, eliminando cualquier riesgo de integración en los cromosomas del genoma del hospedador. Estas características hacen de las vacunas de sarampión atenuadas vivas un excelente candidato para el desarrollo de un vector de vacuna multivalente. Con este fin, se ha clonado un ADNc infeccioso que corresponde al antigenoma de cepa de MV Edmonston B y se estableció una técnica de genética inversa que posibilita la producción del virus correspondiente (Radecke y col., 1995).
Los inventores han desarrollado previamente un vector utilizando Schwarz MV, la vacuna de sarampión más comúnmente utilizada en el mundo (Combredet y col., 2003). Este vector puede expresar una variedad de genes o combinación de genes grandes para más de 12 pasajes. Se produjeron vectores MV recombinantes que contienen 4.000-5.000 nucleótidos adicionales, que representan un 30 % adicional del genoma. Estos virus se produjeron en cultivo celular en títulos comparables con MV convencional. Después de 12 pasajes y un factor amplificador de 1020, más del 96 % de las células infectadas continúan expresando los genes adicionales. Esta expresión notablemente estable, observada también para otros miembros de Mononegavirales (Schnell y col., 1996) se debe probablemente a la ausencia de limitaciones geométricas en el tamaño del genoma por estos virus de nucleocápside helicoidal, al contrario de los virus con cápsides icosaédricas. Además, MV infecta células del sistema inmune (macrófagos y células dendríticas), suministrando de esta manera los antígenos de carga directamente a las células presentadoras
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de antígeno más eficaces, una ventaja principal para un vector de vacuna. Finalmente, el genoma de MV es pequeño, evitando de esta manera la respuesta al vector que abruma la respuesta a transgenes.
En base a la suposición de que la seguridad y eficacia de una cepa atenuada depende en última instancia de su secuencia del genoma, los inventores han clonado el ADNc infeccioso que corresponde al antigenoma del virus de sarampión Schwarz/Moraten a partir de partículas de virus purificadas a partir de una preparación industrial de la vacuna Schwarz con procedimientos óptimos para mantener la fidelidad (Combredet y col., 2003). Para optimizar el rendimiento del sistema de genética inversa, el ADNc viral antigenómico se colocó bajo el control del promotor de ARN polimerasa de fago T7 con un motivo GGG adicional requerido para eficacia óptima. Para permitir la escisión exacta del ARN viral, una ribozima cabeza de martillo se insertó entre el motivo GGG y el primer nucleótido viral y la ribozima de virus de hepatitis delta se colocó cadena abajo del último nucleótido viral. El plásmido pTM-MVSchw resultante habilitó la producción del virus correspondiente utilizando un sistema de genética inversa anteriormente descrita en base a la transfección de células auxiliares humanas (Radecke y col., 1995). Para prevenir la adaptación de la vacuna recombinante a células no certificadas, las células auxiliares transfectadas con ADNc se co-cultivaron con fibroblastos embrionarios de pollo, las células en las cuales los virus se seleccionaron originalmente y en las cuales se producen actualmente. Después de varios pasajes del virus recombinante, se observó que la secuencia de su genoma entero era idéntica a la secuencia original (Combredet y col., 2003). La inmunogenicidad del virus rescatado del plásmido pTM-MVSchw se evaluó en ratones y macacos transgénicos y se comparó con la vacuna Schwarz fabricada a nivel industrial. Todos los macacos vacunados desarrollaron anticuerpos anti-MV y respuestas celulares específicas. No se observaron diferencias entre el virus Schwarz producido a partir de ADNc y la vacuna original, indicando que el virus clonado tuvo la misma inmunogenicidad que la vacuna parental (Combredet y col., 2003). Este clon molecular permite la producción de vacuna de sarampión Schwarz sin depender de las reservas de semillas.
El plásmido pTM-MVSchw se modificó para la expresión en genes extraños mediante la introducción de unidades transcripcionales (ATU) en diferentes posiciones del genoma. Estas ATU son casetes de sitio de multiclonación insertados por ejemplo en una copia de la región N-P intergénica del genoma viral (que contiene las secuencias de actuación cis necesarias para la transcripción). El gen de la proteína verde fluorescente potenciada (GFPe) se insertó en este casete. La ATU se introdujo en el plásmido pTM-MVSchw en dos posiciones (entre los genes P y M y entre los genes H y L). Independientemente de la secuencia adicional, el número total de nucleótidos antigenómicos se tiene que mantener como un múltiplo de seis para cumplir con la “regla de 6 nucleótidos” que optimiza la replicación viral (Calain y col., 1993). El transgén GFP se expresó en todos los tipos de células infectadas, confirmando que el virus de sarampión Schwarz recombinante funciona como vector. Este vector permite el diseño de vacunas combinadas en base a una cepa de vacuna aprobada atenuada viva que es actualmente de uso global. Este trabajo es el objetivo de la solicitud internacional WO 2004/000876.
El uso de tales vacunas recombinantes vivas basadas en MV a gran escala depende de la posibilidad de cultivarlas de forma estable y en buenos títulos en células certificadas (tales como fibroblastos embrionarios de pollo primarios (CEF) o diploide humano MRC5). Estas células habitualmente producen MV en títulos moderados en comparación con las líneas de células de laboratorio, tales como células Vero del mono verde africano, que producen altos títulos. De esta manera la semilla inicial se tiene que obtener en un título relativamente alto. Esta semilla inicial se produce a partir de ADNc por genética inversa.
Mientras los virus de ARN o ADN de cadena de sentido positivo pueden fácilmente obtenerse in vitro después de la transfección de su ADNc o ADN infeccioso modificado por ingeniería genética en células apropiadas, los virus de ARN de cadena de sentido negativo no pueden rescatarse directamente por genética inversa a partir de su ADNc. El genoma de virus de ARN de cadena de sentido negativo no es capaz de iniciar un ciclo infeccioso in vitro a causa de que no codifica directamente proteínas. Tanto la transcripción como la replicación requieren un complejo enzimático de transcriptasa-polimerasa contenido en las nucleoproteínas que encapsulan el genoma viral (complejo RNP). De esta manera la generación de virus de ARN de cadena de sentido negativo recombinante a partir de ADNc implica la reconstitución de RNP activos a partir de componentes individuales: ARN y proteínas (Field B.N y col. - Lippincott Raven publishers 1996, págs. 1953-1977).
Durante los últimos 15 años, un extraordinario conjunto de trabajos de varios laboratorios ha permitido el establecimiento de diferentes sistemas para rescatar casi todos los virus de ARN de cadena de sentido negativo a partir de su ADNc (para revisión ver Conzelmann). A diferencia de los virus con genomas segmentados, los RNP de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada (Mononegavirales) están estructurados de manera rigurosa y contienen, además de la nucleoproteína (N), el conjunto y la fosfoproteína de co-factor de polimerasa (P) y la proteína grande de ARN polimerasa viral (L). El primer Mononegavirales infeccioso, el rhabdovirus de la rabia, se recuperó a partir de ADNc en 1994 (Schnell y col. 1994). El enfoque implicaba expresión intracelular de proteína de virus de rabia N, P y L junto con un ARN de longitud completa cuyo extremo 3' correcto se generó por la ribozima del virus delta de hepatitis (HDV). Un transcrito que corresponde al antigenoma viral (cadena de sentido positivo) en lugar del genoma (cadena de sentido negativo) se utilizó para evitar un problema de antisentido generado por la presencia de las secuencias N, P y L en ARN de longitud completa. En este sistema, las proteínas auxiliares esenciales se proporcionaron por un vector de vaccinia con capacidad de replicación que codifica la ARN polimerasa de fago T7 para dirigir transcripción específica de T7 de plásmidos que codifican las proteínas N, P y L requeridas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Sistemas similares permitieron la recuperación de virus de rabia infecciosos (Schnell y col., 1994; Ito y col. 001), VSV (Lawson y col.; Whelan y col. 1995) así como el virus Paramyxoviridae Sendai (Garcin y col. 1995; Kato y col. 1996; Leyrer y col. 1998; Gujii y col. 2002), HP1V-3 (Hoffman y Banerjee 199) y el virus de sarampión (Takeda y col. 2000; Fujii y col. 2002).
Para evitar el uso de vaccinia con capacidad de replicación, la cual requiere que el virus rescatado se separe del virus auxiliar, varios virus auxiliares sin capacidad de replicación se han adaptado para proporcionar proteínas auxiliares para rescatar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada. El virus vaccinia modificado altamente atenuado Ankara (MVA) que expresa la ARN polimerasa de T7 se ha utilizado para la recuperación del Pneumovirus RSV (Collins y col. 1995), el Rubulavirus, sV5 (He y col. 1997), HPIV-3 (Durbin y col. 1997), el virus de la peste bovina (Baron y Barrett 1997) y virus de sarampión (Schneider y col. 1997), virus de parotiditis (Clarke y col. 2000), CDV (Gassen y col. 2000), hPiV-2 (Kawano y col. 2001) y BPiV-3 (Schmidt y col. 2000). Se ha utilizado un virus de viruela aviar recombinante que expresa la ARN polimerasa de T7 para la recuperación del Paramyxoviridae aviar NDV (Peeters y col. 1999) y de un virus de peste bovina quimérico (Das y col. 2000).
Para rescatar los Mononegavirales sin contaminación por cualquier vector viral infeccioso o sin capacidad de infección, se han generado líneas de células que expresan ARN polimerasa de T3 o T7. En este caso, en ausencia de actividad de protección de ARN en el citoplasma, se consiguió expresión de proteína utilizando IRES de virus de la encefalomiocarditis (EMCV) localizado cadena arriba de las regiones codificantes. Una línea de células de riñón embrionario humano (293-3-46) que expresa ARN polimerasa de T7 y proteínas N y P del virus de sarampión se estableció para recuperar la cepa de vacuna Edmonston de virus de sarampión (Radecke y col. 1995). El virus se rescató después de la transfección de plásmidos especificando ARN antigenómico de MV y ARN L. Se demostró que la eficacia de rescate en estas células, la cual fue muy baja inicialmente, se aumentó por tratamiento de choque de calor de cultivos transfectados y co-cultivo adicional de células transfectadas en células Vero (Parks y col., 1999). Otra línea de células que expresa ARN polimerasa de T7 (BSR T7/5) y basada en células de riñón de hámster bebé (BHK) se utilizó para la recuperación de BRSV (Buchholz y col. 2000), virus de rabia (Finke y Conzelmann 1999), VSV (Harty y col., 2001), NdV (Romer-Oberdorfer y col. 1999) y virus de Ébola (Volchkov y col., 2001).
Los inventores han utilizado la línea de células 293-3-46 para rescatar el vector MV de vacuna Schwarz (Combredet y col., 2003). Sin embargo, ellos han descubierto que, aún utilizando el método de choque de calor en células transfectadas (Parks y col., 1999) y su co-cultivo en células Vero o CEF, el rescate no se pudo reproducir y tuvo muy bajo rendimiento o fue incluso imposible para algunos recombinantes que tienen secuencias adicionales grandes. Esto se debió a la inestabilidad de células auxiliares puesto que se observó que la eficacia depende del número de sus pasajes. Estas células se han generado seleccionando clones resistentes a geneticina de células 293 transfectadas con pSC6-N, PSC6-P y pSC6-T7-NEO que codifican respectivamente los genes MV N y P y el gen de ARN polimerasa de T7 bajo control del promotor CMV y un gen de resistencia de neomicina (Radecke y col., 1995). La estabilidad de su actividad depende de su selección continua bajo geneticina (G-418) y la eliminación de antibiótico durante los experimentos de transfección y de rescate. Durante la recombinación ilícita basada en plásmido de ADN extraño en ADN cromosómico, los concatémeros formados por plásmidos se recombinan y la selección de geneticina mantiene solamente las copias individuales, que son muy pocas. Esto puede explicar la reducción de eficacia observada con las células 293-3-46 después de algunos pasajes. El documento WO97/06270 se refiere también a la línea de células 293-3-46 para la producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo, la cual se transfecta de forma estable con plásmidos que codifican la proteína P, la proteína N y la polimerasa de T7, en la cual se asegura la transfección de forma estable mediante la aplicación de una presión de selección con el antibiótico G418.
Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un método nuevo para generar líneas de células auxiliares capaces de rescatar, de manera reproducible y con gran eficacia, virus de ARN recombinantes de cadena de sentido negativo no segmentada, a partir de ADNc, opcionalmente modificados y sin contaminación de ningún otro virus auxiliar tal como virus vaccinia.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: representación esquemática de los plásmidos HIV-1-TRIPAU3.CMV-T7 (A), HIV-1-TRIPAU3.CMV- nlsT7 (B), HIV-1-TRIPAU3.CMV-N (C) y HIV-1-TRIPAU3.CMV-P (D). Y: motivo psi de envuelta: RRE; elemento sensible a Rev; cPPT: tracto de polipurina central, CTS: secuencia de terminación central, CMVie promotor inmediato temprano de citomegalovirus; AU3: eliminación de partes de U3.
Figura 2: transferencia de Western que muestra la expresión de proteínas N y P de MV en diferentes lisados celulares; (A) 293T no transducida, línea de células 293-3-46 descrita anteriormente en dos diferentes pasajes (17 y 19), poblaciones celulares 293nlsT-NP y 293T7-NP generadas después de transducción con vectores lentivirales; (B) células Vero infectadas con MV, línea de células 293-3-46 en dos diferentes pasajes (17 y 27), ocho clones de células 293T7-NP; (C) células Vero infectadas con MV, línea de células 293-3-46 (pasaje 17), ocho clones de células 283nlsT7-NP, células Vero no infectadas. Las transferencias se sondearon con anticuerpo NP anti-MV (1/500) y anticuerpo secundario anti-lg de ratón HRP (1/1000).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Breve descripción de las secuencias
Las secuencias de nucleótidos de diversos retrovirus ADN SOLAPADO se definen en diferentes virus: CAEV (SEQ ID NO: 1), EIAV (SEQ ID NO: 2), VISNA (SEQ ID NO: 3), SIV AGN (SEQ ID NO: 4), VIH-2 RID (SEQ ID NO: 5), VIH- 1 LAI (sEq ID NO: 6) y VIH-1 (SEQ ID NO: 7). Las secuencias de nucleótidos de la ARN polimerasa de T7, la ARN polimerasa de nls T7 y las proteínas N, P y L del virus MV se definen respectivamente en SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14 y 16 así como sus respectivas secuencias de proteína correspondientes en SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 y 17. La secuencia de nucleótidos completa del plásmido pTM-MVSChw (CNCM I-2889) se define en la SEQ ID nO: 18. La secuencia de nucleótidos completa del plásmido pEMC-LSchw (CNCM I-3881) se define en la SEQ ID NO: 19.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a una célula recombinante que comprende, integrados en su genoma, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de los mismos, y al menos una copia de un ADN solapado asociado funcionalmente con dicho ácido o ácidos nucleicos y donde dicha ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), dichas proteínas N y P se expresan de una manera estable,
y donde dichos derivados funcionales de la aRn polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) y/o la nucleoproteína (N) y/o la fosfoproteína (P) se definen como variantes de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) y/o de la proteína N y/o de la proteína P que mantienen actividad de la proteína a partir de la cual se obtienen, como un complejo de ribonucleoproteína (complejo RNP), funcional en transcripción y replicación en un genoma de virus, en un sistema de rescate que posibilita la producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada a partir de ADNc clonado, estando dichas variantes codificadas por un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en:
a) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad (solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación del 50 % de formamida, 6X SSC a 42° C y condiciones de lavado a 68° C, 0,2X SSC y el 0,1 % de SDS) con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 y la proteína P de SEQ ID NO: 15 de una cepa o virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada;
b) un ácido nucleico que presenta al menos el 80 %, preferentemente el 90 %, más preferentemente el 95 % o incluso el 99 % de similitud con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de SEQ ID NO: 15, calculándose dicha similitud a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias; y
c) un ácido nucleico que difiere del ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de SEQ ID NO: 15 en al menos un nucleótido, opcionalmente sustitución conservativa, preferentemente 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones, en al menos una supresión o adición de nucleótido, preferentemente 1,2, 3, 4 o 5 supresiones o adiciones de nucleótido;
o siendo un fragmento que representa al menos el 70 %, particularmente el 80 % y más particularmente el 90 % o incluso el 95 % de la aRn polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de SEQ ID NO: 15.
Las células de la presente invención son células recombinantes, lo que significa que estas células son el resultado de manipulación genética in vitro intencional que da como resultado recombinación de secuencias genómicas de las células con secuencias heterólogas, es decir, secuencias que se originan de una célula o un organismo diferente. Partiendo de células aisladas, se preparan células recombinantes que tienen características genéticas y/o fenotípicas diferentes de las células de partida y también proporcionan la expresión o producción estable de al menos una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N y la proteína P de uno o varios virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada. Las células de la invención se reivindican como producto, externo al cuerpo de un ser humano.
La expresión “producir de forma estable" significa que las células expresan o producen al menos la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N y la proteína P en un número de divisiones de célula iguales a o superiores a aproximadamente 65, provechosamente durante el tiempo que las células sobreviven. De acuerdo con una realización particular de la invención, las células recombinantes expresan o producen las al menos tres proteínas, es decir al menos la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N y la proteína P, continuamente en el tiempo. De acuerdo con una realización particular de la invención, la integridad, es decir, la secuencia de aminoácidos primaria, de estas tres proteínas se mantiene, asegurando que las proteínas expresadas o producidas sean siempre las mismas.
5
10
15
20
25
30
35
40
La producción estable de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N y la proteína P es independiente de la presencia en la célula, de plásmido o plásmidos que portan la secuencia codificante de estas proteínas. Por lo tanto, aunque los plásmidos pueden utilizarse en un paso particular de manipulación de células in vitro o ex vivo, las células recombinantes resultantes, que producen de forma estable las tres o las al menos tres proteínas, no contienen más plásmidos. De esta manera, la expresión se dice que es independiente de plásmido, al contrario de las células recombinantes en las cuales la expresión de proteína se dirige por plásmido o plásmidos.
En una realización particular de la invención, la expresión estable de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), de la proteína N y de la proteína P, no requieren la presencia de un fármaco, tal como un antibiótico, es decir, la expresión estable no requiere una presión de selección. Por lo tanto, la producción estable no requiere la presencia obligatoria de plásmido o plásmidos para supervivencia, dicho plásmido tiene la secuencia codificante de la proteína o proteínas que se tienen que expresar.
Otra característica de la invención es que cada una de las tres proteínas, es decir, al menos la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N y la proteína P se producen o expresan a nivel similar a lo largo del tiempo. “Nivel similar’ como se usa en el presente documento significa que la expresión de cada una de las tres proteínas es constante durante la vida de la célula, incluso después de la división de la célula, con una variación en el nivel de expresión que no es más de aproximadamente el 30 %, particularmente no mayor de aproximadamente el 20 % y preferentemente no mayor de aproximadamente el 10 %, en comparación con la expresión media calculada en diferentes momentos de la vida de la célula.
La ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) expresada o producida por las células de la invención es cualquier polimerasa adecuada para sintetizar ARN viral monocatenario de cadena de sentido negativo no segmentada (ARNv) obtenida a partir de un clon de ADNc en un sistema de rescate. La naturaleza de la polimerasa depende esencialmente de la naturaleza de la secuencia de polimerasa de promotor de ARN ubicada en el clon de ADNc del virus de ARN monocatenario de cadena de sentido negativo no segmentada, utilizado para el sistema de rescate (también denominado genética inversa o síntesis de novo de virus de ARN de cadena de sentido negativo a partir de ADNc clonado).
Las expresiones “proteína N’ y “proteína P se refieren respectivamente a la nucleoproteína (N) de virus de ARN monocatenario de cadena de sentido negativo no segmentada y la fosfoproteína (P) de virus de ARN monocatenario de cadena de sentido negativo no segmentada. Ejemplos de familias, subfamilias, géneros o especies de virus de ARN monocatenario de cadena de sentido negativa no segmentada a partir de los cuales se puede obtener la proteína N y/o P se enumeran en la Tabla 1.
En una realización particular, las proteínas N y P de un virus de ARN monocatenario de cadena de sentido negativo no segmentada son del mismo virus, bien de la misma cepa de virus o de cepas de virus diferentes. En otra realización, las proteínas N y P de un virus de ARN monocatenario de cadena de sentido negativo no segmentada son de diferentes virus de aRn de cadena de sentido negativo no segmentada.
Tabla 1: Familia, subfamilia, género y especie de varios virus de ARN de cadena de sentido negativo no ___________________ segmentada (NNV) del orden Mononegavirale.______________________
Familia
Subfamilia Género Especies Abreviatura
Vesiculovirus Virus de estomatitis vesicular VSV
Lyssavirus Virus de rabia RV
Virus de sarampión MV
Virus de la peste bovina RPV
Virus de moquillo canino CDV
Virus Sendai SeV
Virus de parainfluenza humana tipo 3 hPIV3
Virus de parainfluenza bovina tipo 3 bPIV3
Virus de simio de tipo 5 SV5
Virus de parotiditis
Virus de parainfluenza humana tipo 2 hPIV2
Virus de la enfermedad de Newcastle NDV
Virus sincitial respiratorio humano hRSV
Virus sincitial respiratorio bovino bRSV
Filoviridae
/ Virus parecidos a Ébola Virus Ébola /
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En una realización particular, las proteínas N y P se obtienen a partir de un Mononegavirus, preferentemente un virus Paramyxoviridae, preferentemente un virus Paramyxovirinae y más preferentemente un virus Morbillivirus. Un ejemplo de Morbillivirus es el virus de sarampión (MV), en particular una cepa no inmunosupresora atenuada, por ejemplo, una cepa aprobada para una vacuna y especialmente la cepa MV Schwarz o la cepa Edmonston (Ed) o un derivado de estas cepas. Una cepa aprobada para una vacuna se define por la FDA (US Food and drug administration) como que tiene las siguientes provisiones: seguridad, eficacia, calidad y reproducibilidad, después de revisiones rigurosas de laboratorio y datos clínicos (
www.fda.gov/cber/vaccine/vacapor.htm).
Cada vez que se hace referencia en la presente solicitud, a un virus de ARN de cadena negativa no segmentada, posiblemente se aplique en particular a los virus específicos listados en el presente documento y, especialmente, a un virus del sarampión, en particular a la cepa Schwarz.
La expresión “derivados funcionales de los mismos" se refiere a cualquier variante funcional incluyendo fragmentos de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) y/o la proteína N y/o la proteína P, siempre que los derivados funcionales mantengan la actividad de la proteína a partir de la cual se obtienen, al menos como un complejo de ribonucleoproteína (complejo RNP), funcional en transcripción y replicación en un genoma de virus, en un sistema de rescate que posibilita la producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada a partir de ADNc clonado.
Una variante funcional se define mediante un ácido nucleico que codifica dichas proteínas de variante funcionales, teniendo al menos una de las siguientes características:
- el ácido nucleico que codifica la variante funcional se hibrida en condiciones de rigurosidad elevada con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre (referencia) o su forma nuclear (nlsT7) o con la proteína N y la proteína P de una cepa o virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada identificado. Las condiciones de rigurosidad elevada se definen por Sambrook y col. en Molecular Cloning: un manual de laboratorio (1989). Estas condiciones de rigurosidad elevada abarcan: uso de una solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8.0), condiciones de hibridación de formamida al 50 %, 6X SSC a 42° C y condiciones de lavado de 68° C, 0,2X SSC y SDS al 0,1 %. Los protocoles se conocen por los que tienen conocimientos ordinarios en la técnica. Además, los expertos en la materia reconocerán que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado pueden ajustarse según sea necesario de acuerdo con las limitaciones experimentales;
- el ácido nucleico que codifica la variante funcional presenta al menos el 80 %, preferentemente el 90 %, más preferentemente el 95 % o incluso el 99 % de similitud con un ácido nucleico nativo que codifica la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N o la proteína P, calculándose la similitud a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias;
- el ácido nucleico que codifica la variante funcional difiere del ácido nucleico nativo que codifica la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N o la proteína P en al menos una sustitución de nucleótido, preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, opcionalmente sustituciones conservativas (sustituciones de nucleótido que no alteran la secuencia de aminoácidos), en al menos una supresión o adición de nucleótido, preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 supresiones o adiciones de nucleótido o nucleótidos.
Un fragmento se define en la presente solicitud como una parte de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) de longitud completa, de la proteína N o de la proteína P, siempre y cuando el fragmento tenga la misma actividad que la proteína completa a partir de la cual se obtiene, al menos como un complejo de ribonucleoproteína (complejo RNP) como se describe en el presente documento. En una realización particular, el fragmento representa al menos el 70 %, particularmente el 80 % y más particularmente el 90 o incluso el 95 % de la proteína de longitud completa.
Por consiguiente, cuando se hace referencia a la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), las proteínas N o P o a sus secuencias codificantes, la descripción se aplica de forma similar a sus derivados funcionales como se define en el presente documento.
Una célula recombinante de la invención comprende, integrada en su genoma, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada. Opcionalmente, los ácidos nucleicos que codifican las tres proteínas anteriores están, cada uno o al menos uno de los mismos, bajo el control de elemento o elementos reguladores de la transcripción. La expresión “integrado en el genoma” significa que la al menos una copia de un ácido nucleico bajo el control de elemento o elementos reguladores de la transcripción está ubicada dentro del genoma de las células recombinantes, en condiciones que permiten que las células expresen de forma estable la proteína codificada por el ácido nucleico. En una realización particular, la célula recombinante de la invención comprende además, integrada en su genoma, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
“Al menos una copia" significa que el ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) y/o la proteína N y/o la proteína P y/o la proteína L puede estar presente en una o varias copias, preferentemente exactamente o al menos en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 copias o más, dependiendo del nivel de expresión necesario para cada una de estas proteínas.
Las células de la invención también contienen al menos una copia de ADN solapado integrada en el genoma celular. Un ADN solapado es una secuencia de nucleótidos de origen retroviral, especialmente lentiviral o similar a retroviral que comprende dos regiones esenciales, es decir, el TPPc (tracto de polipurina central) y la CTS (región de terminación de acción en cis), en donde las regiones TPPc y CTS inducen una estructura de ADN de tres cadenas durante la replicación del ADN que las contiene (previamente definido en Zennou y col., 2000; y en las solicitudes WO99/55892 y WO02/27300). En una realización particular, el ADN solapado se inserta inmediatamente cadena arriba del promotor interno que posibilita la transcripción de los ácidos nucleicos que codifican la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N, la proteína P y posiblemente la proteína L. El ADN solapado (TPPc-CTS) se inserta en los vectores derivados de retrovirus de la invención en una orientación funcional, es decir, la región TPPc está en 5' con respecto a la región CTS (correspondiendo la parte 5' del vector al LTR que contiene el sitio de unión a cebador (PBS) y correspondiendo la parte 3' del vector a la región que contiene el 3'TPP).
Un ADN solapado adecuado para la invención puede obtenerse a partir de un retrovirus especialmente a partir de un lentivirus u organismo similar a retrovirus tal como retrotransposón, sintéticamente preparado (síntesis química) o por amplificación del ADN solapado de cualquier retrovirus especialmente de un ácido nucleico de lentivirus tal como mediante reacción en cadena de la Polimerasa (PCR). El ADN solapado puede obtenerse a partir de un retrovirus, especialmente un lentivirus, especialmente un retrovirus o lentivirus humano y en particular a partir de un retrovirus de VIH, el virus CAEV (Virus de Artritis Encefalitis Caprina), el virus EIAV (Virus de Anemia Infecciosa Equina), el virus VISNA, el virus SIV (Virus de Inmunodeficiencia de Simio) o el FIV virus (Virus de Inmunodeficiencia Felina). En una realización más preferida, el ADN solapado se obtiene a partir de un retrovirus de VIH, por ejemplo VIH-1 o VIH- 2 o cualquier aislado diferente de estos dos tipos.
El ADN solapado preferido comprende o consiste en las secuencias como se define en SEQ ID NO: 1 a 7. Se debe de mencionar que el ADN solapado se utiliza aislado de su contexto de nucleótido natural (genoma viral), es decir aislado del gen pol en el cual está contenido naturalmente en un lentivirus. Por lo tanto, el ADN solapado se utiliza, en la presente invención, con las partes 5' y 3' que no son necesarias del gen pol suprimidas y se recombina con secuencias de diferentes orígenes. De acuerdo con una realización particular, un ADN solapado tiene una secuencia de nucleótidos de aproximadamente 90 a aproximadamente 150 nucleótidos, en particular de aproximadamente 100 a aproximadamente 140 nucleótidos.
La invención también se refiere a una célula que se puede obtener por recombinación de su genoma con (1) un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago t7 o su forma nuclear (nlsT7), (2) un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y (3) un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada. Las definiciones proporcionadas anteriormente se aplican a estas células.
La invención también se refiere a una célula que se puede obtener por recombinación de su genoma con (1) un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago t7 o su forma nuclear (nlsT7), (2) un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, (3) un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y (4) un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada. Las definiciones proporcionadas anteriormente se aplican a estas células.
La invención abarca una célula que se puede obtener por recombinación de su genoma con un vector de expresión que comprende al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y un ADN solapado. Las definiciones proporcionadas anteriormente se aplican a estas células. En una realización particular, el vector de expresión comprende además al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
La invención también se dirige a un vector de expresión derivado de retroviral que comprende un ADN solapado como se ha descrito anteriormente y al menos un ácido nucleico que codifica una proteína que se selecciona entre el grupo que consiste en una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, una proteína P de un virus de aRn de cadena de sentido
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
negativo no segmentada y una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
El término “genoma" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico cuya presencia en la célula no depende de la selección de presión, es decir cuya presencia en la célula es permanente y/o no depende de las condiciones ambientales. El término “genoma" no incluye los plásmidos. Principalmente, el término ‘‘genoma" se refiere a moléculas de ácido nucleico presentes en el núcleo de la célula (genoma nuclear), al contrario de moléculas de ácido nucleico presentes en el citoplasma, e incluye, por ejemplo, los cromosomas. En una realización particular, el término “genoma" también incluye moléculas de ácido nucleico presentes en compartimentos celulares particulares, tales como organelas, por ejemplo mitocondria (genoma mitocondrial) o cloroplastos (genoma de cloroplasto). En una realización particular, el genoma es de una célula eucariota.
Un vector derivado de retroviral y particularmente un vector derivado de lentiviral y más particular un vector derivado de VIH-1, es un genoma viral que comprende los elementos necesarios para la retrotrascripción, particularmente las LTR posiblemente mutadas que incluyen supresión en parte especialmente supresión en la región U3, como se ilustra a continuación y provechosamente el ADN solapado. Estas regiones de lTr y ADN solapado pueden ser las únicas secuencias de origen retroviral, especialmente lentiviral en el vector de expresión derivado de retroviral. En ningún caso, el vector derivado de retroviral contiene las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas retrovirales de longitud completa. En una realización particular de la invención, el vector derivado de retroviral comprende o consiste en un ADN solapado y al menos un ácido nucleico que codifica una proteína necesaria para el rescate de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada como se describe en el presente documento, así como las LTR del genoma viral correspondiente.
Un vector de expresión de la invención comprende un ADN solapado y un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) o parte funcional de la misma. Un vector de este tipo puede ser el plásmido HIV-1-TRIPAU3.CMV-T7 depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006, con el número I-3702, el cual es un vector de expresión de VIH-1 que comprende un ADN solapado (TRIP), una LTR suprimida en el promotor y el potenciador del dominio U3, un promotor CMV y un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa de fago T7, especialmente una que tiene la secuencia SEQ ID NO: 8, o el plásmido HIV-1-TRIPAU3.CMV-nlsT7 depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006 con el número I-3703, el cual es un vector de expresión de VIH- 1 que comprende un ADN solapado (TRIP), una LTR suprimida en el promotor y el potenciador del dominio U3, un promotor CMV y un ácido nucleico que codifica la forma nuclear de la ARN polimerasa de fago T7, especialmente una que tiene la secuencia SEQ ID NO: 10.
Un vector de expresión de la invención comprende un ADN solapado y un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada. Un vector de este tipo puede ser el plásmido HIV-1-TRIPAU3.CMV-N depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006 con el número I-3700, el cual es un vector de expresión de VIH-1 que comprende un ADN solapado (TRIP), una LTR suprimida en el promotor y el potenciador del dominio U3, un promotor CMV y un ácido nucleico que codifica la proteína N de MV Schwarz, especialmente una que tiene la secuencia SEQ ID NO: 12.
Un vector de expresión de la invención comprende un ADN solapado y un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada. Un vector de este tipo puede ser el plásmido HIV-1-TRIPAU3-CMV-P depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006, con el número I-3701, el cual es un vector de expresión de VIH-1 que comprende un ADN solapado (TRIP), una LTR suprimida en el promotor y el potenciador del dominio U3, un promotor CMV y un ácido nucleico que codifica la proteína P de MV Schwarz, especialmente una que tiene la secuencia SEQ ID NO: 14.
Otro vector de expresión de la invención comprende un ácido nucleico que codifica una proteína L de un virus de ARN de cadena negativa no segmentada. Dicho vector puede ser el plásmido pEMC-LSchw, depositado en el CNCM el 18 de diciembre de 2007, bajo el número I-3881. Un ácido nucleico particular que codifica una proteína L es el uno que tiene SEQ ID NO: 19.
Los vectores CNCM I-3700 a 3703 mencionados anteriormente se contienen en la cepa de E. coli (JM109), cultivada en medio LB complementado con ampicilina (100 |ig/ml) a 37° C con agitación.
La divulgación describe cada uno y cualquier fragmento de nucleótido contenido en los polinucleótidos insertados en los plásmidos depositados a los que se hace referencia en el presente documento y especialmente cada una y cualquier región adecuada para diseñar el inserto, de acuerdo con la presente divulgación. La divulgación también describe el uso de estos fragmentos para la construcción de plásmidos de la invención.
Los cuatro plásmidos anteriores son ejemplos de vectores que pueden utilizarse en la recombinación de células para obtener células recombinantes de la invención. Sin embargo, estos ejemplos no constituyen limitaciones de la invención; por lo tanto y como se ha descrito anteriormente, las proteínas N y P (o sus derivados funcionales) pueden obtenerse a partir de cualquier virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, la polimerasa de T7 puede ser cualquier ARN polimerasa, el promotor CMV puede ser cualquier promotor, el ADN solapado TRIP
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
puede ser cualquier ADN solapado y el vector de expresión de VIH-1 puede ser cualquier vector y particularmente cualquier vector viral.
Otros vectores de expresión de la invención comprenden un ADN solapado y un ácido nucleico que codifica una proteína L de un virus de ARN cadena de sentido negativo no segmentada o comprenden un ADN solapado y ácido o ácidos nucleicos que codifican una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y opcionalmente una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
El término “vector de expresión” indica que, además de los elementos mencionados explícitamente, el vector comprende todos los elementos necesarios para dirigir la expresión del ácido o ácidos nucleicos que codifican las proteínas de interés (elementos reguladores de la expresión) y particularmente elementos reguladores de trascripción. “Elemento regulador de trascripción” define cualquier región de ADN implicada en la regulación de trascripción del ácido o ácidos nucleicos integrados en el genoma, e incluye un promotor, tal como CMV, EF1alfa o mPGK (fosfoglicerato quinasa murina) o más generalmente cualquier promotor adecuado para la inserción en un vector retroviral, especialmente un vector lentiviral, potenciador o elementos reguladores de acción en cis. Estos elementos y particularmente el promotor se eligen dependiendo de la naturaleza de las células recombinantes. La determinación del promotor adecuado, de acuerdo con el nivel de expresión buscado o con la célula recombinada, es parte del conocimiento del experto en la materia. Se ha de mencionar que, cuando la célula recombinante contiene varios ácidos nucleicos heterólogos (también polinucleótidos designados) que codifican las proteínas de interés, dichos elemento o elementos reguladores de trascripción pueden ser únicos para todos los ácidos nucleicos o compartidos por alguno de ellos o por el contrario cada ácido nucleico puede estar asociado con un elemento regulador de trascripción. En el último caso, los elementos reguladores de trascripción pueden ser similares o diferentes.
La presencia del ADN solapado, en todos los vectores utilizados en la etapa de recombinación, lleva a la formación de una estructura triple de ADN (de tres cadenas) en la posición del aDn solapado (la estructura de tríplex que consiste en la región entre los dominios cPPT y CTS incluyendo el dominio CTS), posibilitando la importación del ácido nucleico que porta el ADN solapado en los núcleos de la células (a través del poro de la membrana del núcleo) y además la integración en el genoma de esta célula. El ADN solapado actúa como un determinante de cis de la importación nuclear del vector. En un primer aspecto, la presencia del ADN solapado es de gran interés para la recombinación y la integración del ácido o ácidos nucleicos en células que no se dividen, puesto que en ausencia de división celular (y desintegración de membrana), la importación (y por tanto la integración de ácido(s) nucleicos en el genoma de la célula) es identifica únicamente como actividad residual; por lo tanto, los vectores que contienen el ADN solapado son vectores retrovirales no replicativos capaces de transducir células que no se dividen. En un segundo aspecto, la presencia del ADN solapado es también de gran interés para la recombinación y la integración de ácido nucleico en las células que se dividen, mejorando considerablemente el porcentaje de células en las cuales se integra el ácido nucleico que contiene el ADN solapado. La inserción de la secuencia de ADN solapado en un vector de expresión, como se describe en la presente memoria descriptiva, aumenta de forma marcada la transferencia de genes in vitro e in vivo mediante la estimulación de la importación nuclear del vector de ADN (Sirven y col., 2001, Zennou y col., 2001). Los vectores de VIH que incluyen la secuencia de ADN solapado (vectores TRIP) son capaces de transducir las células B y T primarias, macrófagos, células dendríticas, etc. con una eficacia diez veces más elevada que otros vectores de VIH que carecen del ADN solapado. Puede obtenerse una transducción del 80-90 % de células de forma rutinaria.
A continuación de la recombinación por el vector o vectores que contienen un ADN solapado y ácido o ácidos nucleicos que codifican las al menos tres proteínas de interés y la integración de estos ácidos nucleicos en el genoma, las células recombinantes producen de manera estable la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N y la proteína P.
Los vectores de expresión de la invención, utilizados para obtener las células recombinantes de la presente invención, son vectores virales y particularmente vectores de expresión viral, tales como derivados retrovirales, especialmente vectores derivados de lentivirales, tales como vectores derivados de VIH-, FIV- o SIV-. Más particularmente, el vector derivado de lentiviral es un vector derivado de lentiviral humano tal como un vector de expresión de VIH, particularmente vector derivado de VIH-1 o VIH-2. En una realización preferida, el vector viral es un vector de expresión de VIH que comprende un ADN solapado como se ha descrito anteriormente y al menos un ácido nucleico que codifica las al menos tres proteínas de interés. Los vectores de VIH son vectores retrovirales de reemplazo clásicos en los cuales sustancialmente las secuencias virales codificantes completas se reemplazan por la secuencia que se tiene que transferir. Por lo tanto, los vectores de VIH expresan solamente los ácidos nucleicos heterólogos contenidos entre las dos LTR de VIH o LTR mutadas y bajo el control del ADN solapado. Por tanto, estos vectores pueden alojar polinucleótidos grandes que tienen hasta 5-6 kb. Una realización particular de la invención es un virus de expresión de VIH como se ha descrito anteriormente y más particularmente un vector de expresión de VIH-1, donde una LTR de VIH-1 se elimina para el promotor y el potenciador del dominio U3 (AU3). Se ha demostrado previamente que esta supresión particular aumenta la expresión de los ácidos nucleicos contenidos en el vector y particularmente cuando se asocian con un promotor.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En una realización particular, la célula recombinante de la invención se puede obtener por recombinación de su genoma con los plásmidos HIV-1-TRIPAU3.CMV-T7, HIV-1-TRIPAU3.CMV-N y HIV-1-TRIPAU3.CMV.P o con los plásmidos HIV-1-TRIPAU3.CMV-nlsT7, HIV-1-TRIPAU3.CMV-N y HIV-1-TRIPAU3.CMV-P.
Las células de la invención pueden ser células procariotas o eucariotas, particularmente células de animales o plantas y más particularmente células de mamífero tales como células humanas o células de mamífero no humanas. En una realización particular, las células, antes de la recombinación de su genoma, se aíslan bien sea a partir de un cultivo primario o de una línea de células. Las células de la invención pueden ser células que se dividen o células que no se dividen. Un ejemplo de células que pueden recombinarse para proporcionar las células recombinantes de la invención son las células HEK 293 (riñón embrionario humano), línea de células 293 que está depositada en la ATCC con el número CRL-1573. En una realización particular, las células humanas no son células germinales y/o células madre embriónicas.
Las células recombinantes de la invención pueden ser la línea de células 293-T7-NP depositada en el CNCM (París, Francia) el 14 de junio de 2006 con el número I-3618, es decir, células HEK-293 recombinadas con los plásmidos HIV-1-TRIPAU3.CMV-T7, HIV-1-TRIPAU3.CMV-N y HIV-1-TRIPAU3.CMV-P. Otro ejemplo de células recombinantes de la invención es la línea de células 293-nlsT7-NP MV depositada en el CNCM el 4 de agosto de 2006, con el número I-3662, es decir las células HEK-293 recombinadas con plásmidos HIV-1-TRIPAU3.CMV-nlsT7, HIV-1- TRIPAU3.CMV-N y HIV-1-TRIPAU3.CMV-P.
En una realización adicional de la invención, las células recombinantes de la invención se recombinan adicionalmente por un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada. La expresión de la proteína L puede ser temporal y dirigida por un plásmido que no contiene un ADN solapado o al contrario puede ser estable y dirigida por un vector que contiene un ADN solapado como se ha definido anteriormente. La recombinación por un plásmido o vector que porta la al menos una copia del ácido nucleico que codifica la proteína L puede ser simultánea o posterior a la recombinación por el vector o vectores que contienen la secuencia o secuencias codificantes de la aRn polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N y la proteína P.
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a una célula recombinante de la invención que comprende también integrada en su genoma al menos una copia de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
La proteína L se obtiene a partir de cualquier virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada mencionado en la Tabla 1. En una realización particular, la proteína L es del mismo virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada que la proteína N y/o la proteína P y particularmente de la misma cepa de virus. En otra realización, la proteína L es de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada diferente a la proteína N y/o proteína P.
En una realización particular, la proteína L es de un virus Paramyxoviridae, preferentemente un virus Paramyxovirinae y más preferentemente un virus Morbillivirus. Un ejemplo de Morbillivirus es el virus de Sarampión (MV), en particular una cepa no inmunosupresora atenuada, por ejemplo una cepa aprobada para una vacuna y especialmente la cepa Schwarz MV o incluso la cepa Edmonston (Ed). Una proteína L particular es la del virus MV (SEQ ID NO: 16) o la una codificada por la secuencia insertada en el plásmido pEMC-LSchw y especialmente la secuencia encontrada entre los nucleótidos 1425 y 7976 de SEQ ID NO: 19.
En una realización particular, la secuencia de la proteína L no debe estar modificada con relación a la proteína L de tipo silvestre y debe ser funcional, es decir permitir la producción de partículas o virus cuando se transcomplementa con las proteínas N y P y una polimerasa de T7 en una célula hospedadora. Una prueba para determinar la funcionalidad eficaz de un clon que porta la proteína L se lleva a cabo por transfección de una célula competente con vector o vectores que codifican la proteína N, la proteína P y polimerasa de T7 (o nlsT/), un vector que codifica la proteína L que se tiene que ensayar y un minigenoma que comprende un líder, un promotor, un gen informador (tal como GFP) y un remolque. La funcionalidad del clon L se revela por la producción de partículas que expresan el gen informador.
La presente invención también describe el genoma de una célula recombinante de acuerdo con la presente memoria descriptiva recombinada adicionalmente con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, es decir la cadena (+) de ARN antigenómica del genoma de virus. “ADNc” utilizado para la descripción de la secuencia de nucleótidos de la molécula de la invención se refiere simplemente al hecho de que originalmente dicha molécula se obtiene por trascripción inversa del genoma de ARN genómico (-) de partículas virales de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, particularmente del virus de sarampión y más preferentemente el genoma de ARN genómico (-) de longitud completa de partículas virales de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada. Esto no debe considerarse una limitación de los métodos utilizados para la preparación de este clon de ADNc. Por tanto, la invención abarca, dentro del término “ADNc”, cualquier ADN siempre que tenga la secuencia de nucleótidos definida anteriormente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los ácidos nucleicos purificados, incluyendo el ADN o plásmidos están dentro del significado de ADNc de acuerdo con la invención, siempre que el ácido nucleico especialmente ADN cumpla con las definiciones definidas anteriormente.
En una realización particular, el clon de ADNc de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada contiene, cadena arriba de las secuencias virales, elementos reguladores de trascripción. En una realización preferida, estos elementos son los mismos que los ubicados en el vector o vectores de expresión que comprenden las proteínas N, P y/o L descritas anteriormente. El elemento es un promotor de ARN polimerasa de T7.
En una realización, el clon de ADNc de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada es del mismo virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada que la proteína N y/o la proteína P y/o la proteína L y particularmente de la misma cepa de virus. En otra realización, el clon de ADNc de un virus de aRn de cadena de sentido negativo no segmentada es de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada diferente que la proteína N y/o la proteína P y/o la proteína L.
En una realización particular, el clon de ADNc es de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, tal como un virus Paramyxoviridae, preferentemente un virus Paramyxovirinae y más preferentemente un virus Morbillivirus. Un ejemplo de Morbilllivirus es el virus de Sarampión (MV), en particular una cepa no inmunosupresora atenuada, por ejemplo una cepa aprobada para una vacuna y especialmente la cepa Schwarz MV o la cepa Edmonston (Ed). Además, la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada puede modificarse en comparación con la cepa o virus de tipo silvestre, tal como se define más adelante.
La invención también se refiere a cultivos de células en donde dichas células son las que se definen en las reivindicaciones y particularmente cultivos de células que producen de manera estable una aRn polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de las mismas como se define en la reivindicación 1. En otra realización, la invención también se refiere a cultivos de células que producen de manera estable una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de las mismas como se define en la reivindicación 1 y que producen, de manera estable o transitoria una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
En una realización, el cultivo de células que se tienen que recombinar es un cultivo primario, es decir un cultivo preparado a partir de células o tejidos obtenidos directamente de un animal (opcionalmente no humano) o una planta. En otra realización, el cultivo de células que se tienen que recombinar es una línea celular, es decir una población de células que se producen como resultado del primer sub-cultivo de un cultivo primario o de un pasaje en serie posterior de las células.
En otro aspecto, la presente invención también se refiere a diversos métodos para producir virus infeccioso, recombinante, de cadena de sentido negativo no segmentada, utilizando las células de la invención.
Un primer método para producir virus de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante comprende o consiste en:
a. recombinación adicional del genoma de una célula recombinante o cultivo de células como se define en las reivindicaciones, con un clon de ADNc de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada,
b. transferencia de una célula recombinante o cultivo de células recombinantes en células con capacidad para mantener la replicación y producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y
c. recuperación del virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante a partir del co-cultivo de la etapa b.
Un segundo método de acuerdo con la invención es un método para producir un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante, que comprende o consiste en:
a. recombinación adicional del genoma de una célula recombinante o cultivo de células como se define en las reivindicaciones, con un clon de ADNc de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y
b. recuperación del virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante a partir de la célula recombinante o cultivo de células recombinantes.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Como se usa en el presente documento, “recombinar’ significa introducir al menos un polinucleótido en una célula, por ejemplo en forma de vector, integrándose dicho polinucleótido (completamente o parcialmente) o sin integrarse en el genoma de la célula (como se ha definido anteriormente). De acuerdo con una realización particular la recombinación puede obtenerse con un primer polinucleótido el cual es un clon de ADNc de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, cuya definición, naturaleza y modificaciones opcionales se describen en otra parte en la presente memoria descriptiva. La recombinación puede, también o como alternativa, incluir introducir un polinucleótido el cual es un vector que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, cuya definición, naturaleza y estabilidad de expresión se han descrito en el presente documento.
En estos métodos, la célula recombinante o un cultivo de células recombinantes que producen de manera estable una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína de co-factor de polimerasa (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada es una célula como se define en las reivindicaciones o un cultivo de células como se define en las reivindicaciones, es decir, son células recombinantes en la medida en que se han modificado mediante la introducción de uno o más polinucleótidos como se ha definido anteriormente. En una realización particular de la invención, la célula o cultivo de células, que producen de manera estable la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), las proteínas N y P, no producen la proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o no producen de manera estable la proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, por ejemplo, que posibilita la expresión o producción transitoria.
“Transferencia" como se usa en el presente documento se refiere a la siembra en placas de las células recombinantes en un tipo de célula diferente y particularmente en monocapas de un tipo de célula diferente. Estas células tienen capacidad para mantener tanto la replicación como la producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante, es decir, respectivamente la formación de virus infecciosos dentro de la célula y posiblemente la liberación de estos virus infecciosos fuera de las células. Esta transferencia da como resultado el co-cultivo de las células recombinantes de la invención con células competentes como se define en la frase anterior. La transferencia puede ser un paso adicional, es decir un paso opcional, cuando las células recombinantes no son cultivos eficaces productores de virus, es decir que los virus infecciosos no se pueden recuperar eficazmente de estas células recombinantes. Este paso se introduce después de la recombinación adicional de células recombinantes de la invención con un clon de ADNc de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y opcionalmente un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
En una realización particular de la invención, se requiere una etapa de transferencia puesto que las células recombinantes, habitualmente elegidas por su capacidad de recombinarse fácilmente no son lo suficientemente eficaces para el mantenimiento y la producción de virus infecciosos recombinantes. En dicha realización, la célula o cultivo de células de la etapa a. de los métodos definidos anteriormente es una célula recombinante o cultivo de células recombinantes de acuerdo con la invención, particularmente células HEK-293 recombinantes tales como la línea de células 293-T7-NP depositada en el CNCM el 14 de junio de 2006 con el número I-3618 o la línea de células 293-nlsT7-NP MV depositada en el CNCM el 4 de agosto de 2006 con el número I-3662.
Las células competentes para mantener la replicación y producción de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada pueden ser cualquier tipo de células que se pueden co-cultivar con las células recombinantes de la invención pero no necesariamente células del mismo Reino, Phylum, Clase, Orden, Familia, Género o Especie. Los ejemplos de células competentes son las células Vero (riñón de mono verde africano) o células CEF (fibroblastos embrionarios de pollo). Las células CEF pueden prepararse a partir de huevos de pollo fertilizados como se obtienen por EARL Morizeau (8, rue Moulin, 28190 Dangers, Francia) o de cualquier otro productor de huevos de gallina fertilizados o a partir de células MRC5 (ATCC CCL171, fibroblasto de pulmón).
En otra realización de la invención, la etapa de transferencia no es necesaria y por lo tanto no se lleva a cabo. Esta es una de las ventajas de la presente invención para proporcionar un método para producir virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infecciosos, recombinantes que es fácil de llevar a cabo, más rápido y más barato que los métodos convencionales que permiten la recuperación de virus infecciosos recombinantes libres de contaminantes. Esto se puede conseguir con las células recombinantes de la invención que tienen las características de:
- producir de manera estable una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada como se define en las reivindicaciones, y
- a partir de los cuales se pueden recuperar de manera eficaz los virus infecciosos recombinantes, sin contaminaciones por virus no deseados y/u otros tipos de células.
La “recuperación de virus recombinantes infecciosos" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier medio, por el cual los virus infecciosos, producidos por las células, se liberan a partir de las células y se aíslan a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
partir de las células cultivadas. La recuperación se dice que es “directa” cuando los virus recombinantes infecciosos se recuperan a partir de las células recombinantes de la invención, sin involucrar otro tipo de célula o células. Por el contrario, la recuperación se dice que es “indirecta” cuando los virus infecciosos recombinantes se recuperan a través de otros tipos de células diferentes a las células recombinantes de la invención. Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención es la primera en informar la recuperación directa del virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante.
En métodos particulares de la invención, la etapa de recombinación no comprende las etapas de recombinación de una célula o un cultivo de células que producen de manera estable una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína de co-factor de polimerasa (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada como se define en la reivindicación 1, con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada. En este caso, las células recombinantes de la invención se han seleccionado por su capacidad de expresar la proteína L y especialmente se han recombinado previamente con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L), integrándose el ácido nucleico que codifica la proteína L en el genoma de célula o no.
Cuando los vectores adecuados que portan proteínas complementarias (no-P, no-L o no-N o no ARN polimerasa) pueden opcionalmente utilizarse en los métodos de la invención, particularmente cuando se utiliza un genoma o un clon de ADNc donde se han suprimido estas proteínas. Tales proteínas accesorias son la proteína C, la proteína V, la proteína NS1, la proteína NS2, la proteína M, la proteína M2 y/o las proteínas SH. El vector o vectores que contienen las secuencias codificantes de estas proteínas accesorias pueden opcionalmente comprender un ADNc solapado como se ha definido anteriormente.
La estabilidad de la producción de ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), la proteína N y la proteína P en las células recombinantes de la invención tiene algunas ventajas de acuerdo con los métodos anteriormente descritos en la técnica:
- el método de la invención no necesariamente comprende una etapa de transferencia;
- el método no comprende la etapa de choque de calor como se informa en Parks y col. (1999). De hecho, se ha demostrado que esta etapa mejora la eficacia de la síntesis de las proteínas N o P virales, así como ARN polimerasa, proteínas que son sintetizadas a partir de ácidos nucleicos portados por plásmidos. En la presente invención, sin embargo, los ácidos nucleicos se integran en el genoma celular y se ha demostrado que la expresión de estas proteínas es estable, y/o a un nivel adecuado para iniciar la encapsidación de novo.
- el método produce grandes cantidades de virus infecciosos, puesto que la producción de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), proteína N y proteína P es estable y no depende de su expresión a partir de los plásmidos. Por lo tanto, aproximadamente 100-400 de 106 células recombinadas transmiten virus infecciosos después de la recombinación (número de acontecimientos de rescate). Esto es mucho mayor a 1-6 de 106 células transfectadas obtenidas con el método de Radecke y col (1995). En una realización particular del método, el número de acontecimientos de rescate, para 106 células recombinadas es más de 20, más de 50, más de 100, más de 200, más de 300, más de 400 o más de 500.
Finalmente, otra ventaja de la invención es la gran variedad de células que pueden recombinarse y utilizarse para llevar a cabo la invención. De hecho, las células recombinantes pueden ser cualquier célula eucariota, particularmente cualquier célula de mamífero, bien sea una célula no-humana o una célula humana. En una realización particular, las células recombinantes de la invención son fibroblastos humanos, especialmente la línea de células MRC5 (fibroblastos de pulmón humano). La invención es particularmente útil para células que no se dividen.
De acuerdo con la invención, el clon de ADNc de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada es de un virus MV, en particular un virus atenuado en particular una cepa no inmunosupresora atenuada, por ejemplo, una cepa aprobada para una vacuna, tal como la cepa Schwarz MV. Un clon de ADNc es una secuencia de ADN que codifica el antigenoma de longitud completa de un virus de ARN de cadena negativa no segmentada.
En una realización particular de la invención, las proteínas N, P y L, así como el clon de ADNc son del mismo virus, que puede ser cualquier virus de la Tabla I, particularmente un virus MV como se ha descrito anteriormente, tal como la cepa Schwarz MV del virus de sarampión. Las secuencias de nucleótidos de la cepa Edmonston B. y la cepa Schwarz se han descrito en el documento WO98/13505. Independientemente de la naturaleza de las proteínas N, P y L y el clon de ADNc del virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, la ARN polimerasa es la ARN polimerasa de T7. Una secuencia de ADNc particular es la secuencia del ADNc de la cepa Schwarz como se define en la SEQ ID NO: 18. Un ADNc de este tipo puede obtenerse a partir de pTM-MVSchw, que es un plásmido obtenido a partir de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus de sarampión, cepa Schwarz de vacuna, bajo el control del promotor de la ARN polimerasa de T7. Su tamaño es de 18967nt.
Como alternativa, el clon de ADNc de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada se obtiene a partir de cualquier virus de la Tabla I. Un virus de sarampión recombinante particular a partir del cual se obtiene un
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
clon de ADNc es la cepa Schwarz y especialmente una cepa Schwarz de vacuna aprobada, tal como la producida bajo la marca Rouvax, disponible de Aventis Pasteur (Francia).
Una “cepa atenuada" se define en el presente documento como una cepa que no es virulenta o menos virulenta que la cepa parental en el mismo hospedador, manteniendo la inmunogenicidad y posiblemente la adyuvanticidad cuando se administra en un hospedador, es decir, preservando los epítopos de linfocitos T y B inmunodominantes y posiblemente la adyuvanticidad tal como la inducción de proteínas coestimuladoras de linfoctitos B o la citocina IL- 12. En una realización particular, la cepa atenuada es una “cepa vacuna aprobada’’, es decir, una cepa certificada para su uso en la producción de vacunas por una autoridad de la salud nacional o regional que tiene garantizada una aprobación de mercado para este producto (designación legal). En consecuencia, una “cepa vacuna aprobada" se ha demostrado ser segura, estable y capaz de proporcionar protección eficaz (inmunogenicidad y adyuvanticidad). La estabilidad de una cepa se mide evaluando que las propiedades de la cepa se mantengan sustancialmente sin cambios tras numerosos pasajes en la misma línea celular certificada.
“Obtenido a partir de" como se usa en el presente documento significa cualquier clon de ADNc cuya secuencia de nucleótidos está modificada en comparación con un virus o cepa de tipo silvestre. Esta modificación puede ser al menos una sustitución, supresión o inserción en la secuencia de nucleótidos y particularmente en la secuencia codificante de una proteína del virus o cepa. En otra realización, la secuencia de nucleótidos se modifica mediante la inserción de al menos un ácido o ácidos nucleicos heterólogos, es decir, una secuencia que no está presente naturalmente en el virus o la cepa en la cual se inserta el al menos un ácido o ácidos nucleicos o una secuencia que no se obtiene a partir de los antígenos del virus de sarampión. Además, el clon de ADNc se puede modificar mediante la supresión de parte o partes del genoma viral de tipo silvestre y la inserción de ácidos nucleicos heterólogos.
En una realización preferida, se señala que el clon de ADNc obtenido, que consiste o que comprende uno o varios ácido o ácidos nucleicos heterólogos, cumple con la denominada regla de 6. Por lo tanto, el clon de ADNc obtenido es de longitud polihexamérica, es decir múltiplo de seis. Este requisito se logra especialmente para clones de ADNc derivados de Paramyxoviridae, en particular virus del sarampión. Algunos virus de ARN de cadena negativa no segmentada no cumplen esta regla, como se sabe a partir de la persona experta en la materia.
Cualquier ácido nucleico heterólogo se puede insertar en la secuencia de nucleótidos del clon de ADNc, siempre y cuando la inserción no evite la producción de virus de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso (sitios permisivos). En una realización particular, la inserción o eliminación del genoma viral nativo proporciona un polinucleótido el cual es un múltiplo de seis. De esta manera, aún si la longitud del genoma no es un múltiplo de seis, la modificación consiste en seis o un múltiplo de seis supresiones y/o inserciones.
Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico heterólogo pueden codificar uno o varios péptidos capaces de provocar una respuesta inmune humoral y/o celular (tal como la respuesta CTL o CD4) en un huésped determinado, frente al organismo u organismos especialmente los organismos patógenos, por ejemplo el virus, especialmente retrovirus, flavivirus o coronavirus, de la bacteria o parásitos a partir de los cuales se originan. Por consiguiente, la secuencia de aminoácidos de este péptido es una que comprende al menos un epítopo de un antígeno, especialmente un epítopo conservado, epítopo que está expuesto de forma natural en un antígeno o se obtiene o está expuesto como resultado de una mutación o modificación o combinación de antígenos. Los ácidos nucleicos heterólogos, que pueden insertarse en los clones de ADNc, codifican especialmente antígenos estructurales (incluyendo fragmentos antigénicos de los mismos o derivados de dichos antígenos o fragmentos) de virus que incluyen retrovirus tales como retrovirus humanos especialmente lentivirus, en particular VIH-1 o VIH-2, flavivirus o envuelta de coronavirus, tal como un antígeno de envuelta o cápside. Particularmente, tales antígenos son especialmente de envueltas de virus de SIDA que incluyen VIH-1 o VIH-2, de la cápside de VIH o de envueltas del Virus de la Fiebre Amarilla o envueltas del Virus del Nilo Occidental o de envueltas del virus de Dengue (DV), envueltas del virus de encefalitis japonesa (JEV) o envuelta del coronavirus asociado con SARS. Sin embargo, otros antígenos retrovirales, flavivirales o de coronavirus se pueden utilizar de forma provechosa, con el fin de obtener virus de sarampión recombinantes capaces de provocar anticuerpos frente a dichos retrovirus o flavivirus, y/o capaces de provocar la producción de anticuerpos neutralizados frente a retrovirus o flavivirus. En otra realización, el péptido codificado o incluido por las secuencias de ácido nucleico es antígeno tumoral o un antígeno expresado específicamente en la superficie de célula de las células de cáncer. De acuerdo con otra realización de la invención, las secuencias codifican multiepítopos o antígenos que como alternativa o adicionalmente provocan una respuesta inmune celular frente a retrovirus o flavivirus.
Provechosamente, los virus de sarampión recombinantes producidos por el método de la invención pueden también provocar una respuesta inmune humoral y/o celular frente a virus de sarampión. Sin embargo esta respuesta es no obligatoria siempre que se obtenga, de hecho, la respuesta inmune frente al epítopo o multiepítopos o antígenos descritos anteriormente.
En una realización preferida de la invención, el ácido nucleico heterólogo codifica una proteína a partir de un retrovirus de VIH, particularmente un antígeno de envuelta de VIH y especialmente un péptido derivado de una proteína o glicoproteína de envuelta de VIH-1 o VIH-2. Los antígenos de interés a este respecto son especialmente
5
10
15
20
25
30
gp160, gp120 y gp41 de VIH-1 o gp140, GAG o TAT de VIH-1. En una realización particular de la invención, la secuencia de aminoácidos heteróloga se obtiene a partir de un gp160, gp120 de VIH-1 o gp140, GAG o TAT de VIH- 1 recombinantes.
En otra realización, los bucles V1, V2 y/o V3 del antígeno gp120 (o gp160) se suprimen o se suprimen parcialmente, individualmente o en combinación de manera que los epítopos conservados se exponen en el antígeno gp120 recombinante obtenido. Los bucles V1, V2 y V3 del antígeno gp120 (o gp160) de VIH-1 se han descrito especialmente en Fields virology (Fields B.N. y col. Lippincott Raven publishers 1996, págs. 1953-1977).
En otra realización, el ácido nucleico heterólogo codifica un péptido que se obtiene a partir del antígeno gp120 (o gp160) de VIH-1, en donde los bucles V1, V2 y/o V3 del antígeno gp120 (o gp160) se sustituyen o se sustituyen en parte, individualmente o en combinación, de manera que los epítopos conservados se exponen en el antígeno gp120 (o gp160) recombinante obtenido.
En otra realización, el ácido nucleico heterólogo codifica un péptido que se obtiene a partir de un antígeno de envuelta de VIH-1, especialmente se obtiene a partir del antígeno gp120 de manera que los bucles V1 y V2 se suprimen y el bucle V3 se sustituye por la secuencia AAELDKWASAA.
En otra realización, el ácido nucleico heterólogo codifica un péptido que es gp160AV3, gp160AV1V2, gp160AV1V2V3, gp140AV3, gp140AV1V2, gp140AV1V2V3.
Los clones de ADNc preferidos que contienen epítopos de VIH, WNV, YFV, DV o JEV son vectores definidos en la Tabla II depositados en el CNCm (Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos - Institut Pasteur-París, Francia) y cuyas características se proporcionan a continuación.
Tabla II: Cepa a partir de la cual se obtiene la secuencia
Nombre del vector Número de depósito Fecha de depósito
pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P CNCM I-2883
pMV2(EdB)gp160HIV89.6P CNCM I-2884
pMV2(EdB)gp140HIV89.6P CNCM I-2885
pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P CNCM I-2886
pMV2(EdB)-NS1YFV17D CNCM I-2887
pMV2(EdB)-EnvYFV17D CNCM I-2888
pTM-MVSchw2-Es(WNV) CNCM I-3U33
pTM-MVSchw2-GFPbis CNCM I-3U34
pTM-MVSchw2- p17p24[delta]myr(HIVB) CNCM I-3U35
pTM-MVSchw3-Tat(HIV89-6p) CNCM I-3U36
pTM-MVSchw3-GFP CNCM I-3U37
pTM-MVSchw2-Es(YFV) CNCM I-3U38
pTM-MVSchw2- gp140[delta]V1V2V3(HIV89-6) CNCM I-3U54
pTM-MVSchw2-gp14U[delta]V3(HIV89- 6) CNCM I-3U55
pTM-MVSchw2- gp160[delta]V1V2V3(HIV89-6) CNCM I-3U56
pTM-MVSchw2- gp160[delta]V1V2(HIV89-6) CNCM I-3U57
pTM-MVSchw2-GagSIV239p17- p24[delta]myr-3-gp140(HIV89-6) CNCM I-3U58
pTM-MVSchw2[EDIN+M'-4U]WNV(IS- 98-ST1) CNCM I-344U
pTM- MVSchw2[EDIII+apoptoM]DV1(FGA89) CNCM I-3442
pTM-MVSchw2[EDIII]JEV(Nakayama) CNCM I-3441
I-2883 (pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus de sarampión (cepa B Edmonston), bajo el control del promotor de aRn polimerasa de T7 y que contiene el gen del gp160AV3+ELDKWAS de la cepa 89.6P del virus SVIH insertado en un ATU en posición 2 (entre los genes N y P del virus de sarampión). El tamaño del plásmido es 21264 nt.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
I-2884 (pMV2(EdB)gp160HIV89.6P) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus de sarampión (cepa B Edmonston), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que contiene el gen de gp160 de la cepa 89.6P del virus SVIH insertado en un ATU en posición 2 (entre los genes N y P del virus de sarampión). El tamaño del plásmido es 21658 nt.
I-2885 (pMV2(EdB)gp140HIV89.6P) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus de sarampión (cepa B Edmonston), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que contiene el gen de gp140 de la cepa 89.6P del virus SVIH insertado en un ATU en posición 2 (entre los genes N y P del virus de sarampión). El tamaño del plásmido es 21094 nt.
I-2886 (pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus de sarampión (cepa B Edmonston), bajo el control del promotor de aRn polimerasa de T7 y que contiene el gen de gp140AV3(ELDKWAS) de la cepa 89.6P del virus SVIH insertado en un ATU en posición 2 (entre los genes N y P del virus de sarampión). El tamaño del plásmido es 21058 nt.
I-2887 (pMV2(EdB)-NS1YFV17D) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus de sarampión (cepa B Edmonston), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que contiene el gen NS1 del virus de fiebre amarilla (YFV 17D) insertado en un ATU en posición 2 (entre los genes N y P del virus de sarampión). El tamaño del plásmido es 20163 nt.
I-2888 (pMV2(EdB)-EnvYFV17D) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene la secuencia completa del virus de sarampión (cepa B Edmonston), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que contiene el gen Env del virus de la fiebre amarilla (YFV 17D) insertado en un ATU en posición 2 (entre los genes N y P del virus de sarampión). El tamaño del plásmido es 20505 nucleótidos.
I-3033 (pTM-MVSchw2-Es(WNV) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen de la envuelta secretada, (E) del virus del Nilo Occidental (WNV), insertado en un ATU.
I-3034 (pTM-MVSchw2-GFPbis) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen del GFP insertado en un ATU.
I-3035 (pTM-MVSchw2-p17p24[delta]myr(HIVB)) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen del gen gag que codifica proteínas p17p24Amyr del virus HIVB insertado en un ATU.
I-3036 (pTMVSchw3-Tat(HIV89-6p) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen del gen Tat de la cepa del virus 89.6P insertado en un ATU.
I-3037 (pTM-MVSchw3-GFP) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen del gen GFP insertado en un ATU que tiene una supresión de un nucleótido.
I-3038 (pTM-MVSchw2-Es) (YFV) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen de la proteína secretada del virus de Fiebre Amarilla (YFV) insertado en un ATU.
I-3054 (pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6)) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen que codifica gp140 [delta] V1 V2 (HIV 89-6) insertado en un ATU.
I-3055 (pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V3 (HIV89-6)) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen que codifica gp140[delta]V3(HIV89-6) insertado en un ATU.
I-3056 (pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6)) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen que codifica gp160[delta]V1 V2 V3(HIV89-6) insertado en un ATU.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
I-3057 (pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 (HIV89-6)) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen que codifica gp160 [delta] V1 V2 (HIV 89-6) insertado en un ATU.
I-3058 (pTM-MVSchw2-Gag SIV239 p17-p24 [delta] myr-3-gp140 (HIV89-6)) es un plásmido obtenido de Bluescript que contiene una secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz), bajo el control del promotor de ARN polimerasa de T7 y que expresa el gen que codifica Gag SIV239 p-17-p24 [delta] myr-3-gp140 (HIV89-6) insertado en un ATU.
I-3440 (pTM-MVSchw2-[EDIII+M1'40]WNV (IS-98-ST1)) es un plásmido obtenido a partir de PTM que contiene la secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz) y una unidad de expresión adicional ubicada entre los genes P y M, conteniendo esta unidad la secuencia de nucleótidos del dominio III de la proteína de envuelta del virus del Nilo Occidental (WNV) (WNV IS-98-ST1) fusionada a la secuencia 1-40 de la proteína de membrana M.
I-3442 (pTM-MvSchw2-[EDIII+ApoptoM] DV1 (FGA89)) es un plásmido obtenido a partir de PTM que contiene la secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz) y una unidad de expresión adicional ubicada entre los genes P y M, conteniendo esta unidad la secuencia de nucleótidos del dominio III de la proteína de envuelta del virus de dengue-1 (cepa FGA89) fusionada a una secuencia apoptótica de la proteína de membrana M.
I-3441 (pTM-MvSchw2-[EDIII] JEV (Nakayama) es un plásmido obtenido a partir de PTM que contiene la secuencia de ADNc del genoma infeccioso completo del virus de sarampión (cepa Schwarz) y una unidad de expresión adicional ubicada entre los genes P y M, conteniendo esta unidad la secuencia de nucleótidos del dominio III de la proteína de envuelta del virus de encefalitis japonesa (JEV), cepa Nakayama.
El ácido nucleico heterólogo puede codificar un péptido que se obtiene a partir de un antígeno del Virus de Fiebre Amarilla seleccionado entre la envuelta (Env), las proteínas NS2 o mutantes inmunogénicos del mismo. Cuando la secuencia de ADN heteróloga presente en el virus de sarampión recombinante de la invención se obtiene a partir del Virus de Fiebre Amarilla (YFV), el mismo se selecciona provechosamente entre YFV 17D 204 comercializado por Aventis Pasteur bajo la marca Stamaril®.
El ácido nucleico heterólogo puede codificar un péptido que se obtiene a partir de un antígeno del Virus del Nilo Occidental seleccionado entre la envuelta (E), la pre-membrana (preM) o los mutantes inmunogénicos de los mismos. Cuando la secuencia de ADN heteróloga presente en el virus de sarampión recombinante de la invención se obtiene a partir del Virus del Nilo Occidental (WNV), el mismo se selecciona provechosamente entre la cepa neurovirulenta IS 98-ST1.
El ácido nucleico heterólogo puede codificar un antígeno específico tumoral (TSA) o un antígeno relacionado con el tumor (TAA).
Otra ventaja de la invención es la posibilidad de insertar en el clon de ADNc de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, ácido nucleico heterólogo largo o un gran número de ácidos nucleicos heterólogos. De esta manera, el clon de ADNc puede modificarse por inserción de uno o varios ácidos heterólogos cuya secuencia total es de al menos 5 kb.
La divulgación describe cada y cualquier fragmento de nucleótido contenido en los polinucleótidos insertados en los plásmidos depositados a los que se hace referencia en el presente documento y especialmente cada y cualquier región adecuada para diseñar el inserto, de acuerdo con la presente divulgación. La divulgación también describe el uso de estos fragmentos para la construcción de los plásmidos de la invención.
La invención también se refiere a métodos para producir células recombinantes que expresan de manera estable las tres o al menos las tres siguientes proteínas, una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de los mismos como se define en la reivindicación 1, que comprenden o consisten en:
a. recombinar el genoma de una célula con al menos:
- un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7),
- un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y
b. seleccionar las células que producen de manera estable al menos una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de los mismos como se define en la reivindicación 1.
o
a. recombinar el genoma una célula con al menos un vector de expresión que comprende:
- al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) bajo el control de un promotor.
- al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada bajo el control de un promotor,
- al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada bajo el control de un promotor y
- un ADN solapado y
b. seleccionar las células que producen de manera estable al menos una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de los mismos como se define en la reivindicación 1.
En una realización particular de la invención, el método para producir células recombinantes comprende adicionalmente recombinar el genoma de las células recombinantes en la etapa a. del método anterior con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) o un derivado funcional de la misma de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y seleccionar las células que producen de manera estable al menos una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y que producen una proteína larga (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de los mismos como se define en la reivindicación 1.
Las células recombinantes de la invención, como se describe en la presente memoria descriptiva, también se pueden usar como células auxiliares, especialmente como células auxiliares en la producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infecciosos, recombinantes.
Realizaciones y características adicionales de la invención definida se encuentran en los siguientes ejemplos y figuras.
Ejemplos
La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrito en las reivindicaciones.
CÉLULAS Y VIRUS
Células Vero (riñón de mono verde africano) se cultivaron como monocapas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero fetal bovino al 5 % (FCS). Células de riñón humano 293 (HEK-293) se cultivaron en DMEM complementado con FCS al 10 %. Células fibroblásticas de embrión de pollo (CEF) se prepararon de la siguiente forma: huevos de pollo fertilizados (Morizeau, Dangers, Francia) se incubaron a 38° C durante 9 días. Los embriones se recogieron en condiciones estériles. La cabeza, los miembros y las vísceras se retiraron y los embriones se cortaron y después se trataron con tripsina durante 5-10 minutos a 37° C (Tripsina/EDTA 2,5 g/l). Después de filtración (70 |im) y varios lavados en DMEM con alto contenido de glucosa/FCS al 10 %, las células se sembraron (5-7 106 células por placa de Petri) y se incubaron durante una noche a 37° C antes del uso para infección con virus.
CONSTRUCCIONES DE PLÁSMIDO
Para permitir la fácil recombinación de secuencias adicionales utilizando el sistema de recombinación Gateway® (Invitrogen), el casete Gateway® (attbl/attb Seq) se introdujo por ligamiento en el vector de plásmido HIV-1-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
TRIPAU3-BSX (Zennou y col., 2000) linearizado mediante digestión con Smal. El gen de ARN polimerasa de T7 se amplificó a partir del plásmido pAR-1173 (Brookhaven National Laboratory, ref) por PCR utilizando ADN polimerasa PfuTurbo (Stratagene) y los siguientes cebadores que contienen las secuencias de recombinación Gateway® (subrayado):
AttB1-T7Pol : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGG AATTCTCTGACATCGAACTGGCT-
3'
AttB2-retourT7Pol : 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCAC GCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3'
Una forma nuclear de ARN polimerasa de T7 (nlsT7) también se amplificó a partir del plásmido pAR-3288 (Brookhaven National Laboratory, ref) utilizando los siguientes cebadores que contienen una señal de localización nuclear (en negrita) y las secuencias de recombinación Gateway® (subrayadas):
AttBI-SV40nls : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATG GCACCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3'
AttB2-retourT7Pol: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCACG CGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3'
Utilizando el mismo enfoque, los genes N y P de Schwarz MV se amplificaron por PCR a partir del plásmido pTM- MCSchw, que contiene un antigenoma Schwarz MV infeccioso de longitud completa (Combredet y col., 2003). Se utilizaron los siguientes cebadores que contienen las secuencias de recombinación Gateway® (subrayadas):
AttB1-N : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCCACAC TTTTAAGGAGCTTAGCA-3' AttB2-N : 5'-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTGTACTAGTCTAG AAGATTTCTGTCATTGTA-3' AttB1-P : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCAGAAG AGCAGGCACGCCAT-3'
AttB2-P: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACTACTTCAT TATTATCTTCATCAGCATCTGGTGGA-3'
Los diferentes fragmentos de PCR que codifican la ARN polimerasa de T7, la ARN polimerasa de nlsT7 y las proteínas N y P de MV se introdujeron posteriormente en el plásmido de entrada pDONRTM207 (Invitrogen) y recombinaron en el plásmido HIV-1-TRIP-AU3-BSX utilizando el sistema de recombinación Gateway® (Invitrogen). Los plásmidos de vector recombinante diferentes obtenidos (HIV-1-TRIP delta U3.CMV-T7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-nlsT7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-N y HIV-1-TRIP delta U3.CMV-P) se secuenciaron completamente. Estos vectores se depositaron en el CNCM el 14 de diciembre de 2006, con los números I-3702, I-3703, I-3700 e I-3701 respectivamente.
El plásmido pEMC-LSchw que expresa la proteína de polimerasa larga (L) a partir de Schwarz MV se construyó de manera similar a como se describe en Radecke y col. (1995). La secuencia de 6552 nucleótidos de largo del gen Schwarz L se tomó del plásmido pTM-MVSchw (Combredet y col., 2003) y se insertó en el plásmido pEMC-La descrito previamente en Radecke y col (1995), utilizando procedimientos clásicos de clonación. Este plásmido se depositó con el CNCM el 18 de diciembre de 2007, bajo el número I-3881.
PRODUCCIÓN DE PARTÍCULAS DE VECTOR
Las partículas de vector se produjeron por co-transfección de células HEK-293 utilizando procedimiento de calcio- fosfato con los plásmidos de vector HIV-1-TRIP delta U3.CMV-T7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-nlsT7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-N, o HIV-1-TRIP delta U3.CMV-P, un plásmido de encapsidación que expresa genes gag y pol de VIH -1 y un plásmido que expresa la glicoproteína de envuelta VSV-G (pHCMV-G) como se describe en (Zennou y col., 2000). La cantidad de antígeno Gag p24 en reservas de partículas de vector concentradas por ultracentrifugación se determinó utilizando ELISA de p24 de VIH-1 (Perkin Elmer LifeSciences).
GENERACIÓN DE LÍNEAS DE CÉLULAS 293-T7-MV
Las células (HEK-293) se sembraron en pocillos de 35 mm un día antes de la transducción por vectores lentivirales TRIP-T7 y TRIP-nlsT7. Los vectores (500 ng/ml p24) se agregaron en DMEM complementado con FCS al 10 %. Durante 8 días, la misma cantidad de vector se agregó repetidamente cada día sobre las células. Las células se expandieron cada dos días. Después de cada pasaje, se determinó la actividad de la ARN polimerasa de T7 de las células. Un cultivo celular de 35 mm se transfectó con 5 |ig de pEMC-LUC utilizando el procedimiento de calcio- fosfato y la actividad de luciferasa en 1/20 del lisado de células aclarado recolectado un día después de la transfección se midió en un luminómetro. La actividad de luciferasa aumentó después de cada transducción adicional y permaneció máxima entre la séptima y octava transducción. La ausencia de citotoxicidad de la expresión de ARN polimerasa de T7 se demostró después de cada transducción cuantificando la viabilidad celular utilizando el método de exclusión con azul de tripano y comparación con células no transducidas. Después de 8 etapas de transducción, se generaron dos poblaciones celulares con una actividad de ARN polimerasa de T7 muy alta, bien citoplasmática (293-T7) o nuclear (293-nlsT7).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las dos poblaciones celulares (293-T7 y 293-nlsT7) se sometieron a co-transducción posteriormente simultáneamente por los vectores TRIP-N y tR|P-P. Los vectores (TRIP N: 390 ng/ml p24 y TRIP P: 330 ng/ml p24) se agregaron a células sembradas en pocillos de 35 mm. Durante 10 días, la misma cantidad de ambos vectores se agregó repetidamente cada día en las células. Las células se expandieron cada dos días. Después de 10 rondas de transducción, la expresión de las proteínas N y P de MV se analizó en las poblaciones celulares totales mediante transferencia de western usando 1/20 del lisado total de un pocillo de 35 mm. La expresión de ambas proteínas fue comprable con la del número similar de células Vero infectadas (Figura 2), Las células transducidas se clonaron posteriormente por dilución limitante. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una dilución de 1/3 célula por pocillo. Después de dos semanas, se seleccionaron los primeros clones. Aproximadamente 100 clones de cada una de las células 293-T7-NP y 293-nlsT7-NP se expandieron a placas de 24 pocillos, después a pocillos de 35 mm. La expresión de las proteínas N y P de MV se analizó en 20 clones por transferencia de western utilizando 1/20 del lisado total de un pocillo de 35 mm. La expresión de ambas proteínas fue comparable a la del número similar de células Vero infectadas (Figura 2). La actividad de ARN polimerasa de T7 se midió para cada clon como se ha descrito anteriormente. Se seleccionaron varios clones con una actividad de luciferasa muy alta y un nivel similar de expresión de N y P de MV. Los clones, enumerados a continuación, se amplificaron y congelaron a -180° C en DMEM/FCS al 30 %/DMSO al 10 % con una densidad de 107 células/ml: 293-T7-NP1, 293-T7-NP3, 293-T7-NP5, 293-T7-NP7, 293-T7-NP8, 293-T7-NP10, 293-T7-NP13, 293-T7-NP14, 293-T7-NP20, 293-T7-NP28, 293-T7-NP31, 293-T7- NP33, 293-nlsT7-NP1, 293-nlsT7-NP5, 293-nlsT7-NP6, 293-nlsT7-NP13, 293-nlsT7-NP14, 293-nlsT7-NP15, 293-nlsT7-NP30 y 293-nlsT7-NP40.
RESCATE DE SCHWARZ MV UTILIZANDO CÉLULAS AUXILIARES 293-T7-NP Y 293-NLST7-NP
Para evaluar la capacidad de diferentes clones de células auxiliares 293-T7-NP y 293-nlsT7-NP generados de rescatar eficazmente MV a partir de ADNc, se usó el plásmido pTM-MVSchw-eGFP (Combredet y col., 2003) para rescatar un Schwarz MV recombinante que expresa la proteína verde fluorescente (eGFP). Se usó un sistema similar al que se ha descrito anteriormente (Radecke y col., Parkc y col., 1999; Combreder y col., 2003). Las células auxiliares 293-T7-NP o 293-nlsT7-NP se transfectaron utilizando el procedimiento de calcio fosfato con pTM- MVSchw-eGFP (5 |ig) y el plásmido pEMC-LSchw que expresa el gen de polimerasa (L) Schwarz MV (20-100 ng). Después de incubación durante una noche a 37° C, el medio de transfección se reemplazó con medio fresco y las células se sometieron a choque térmico a 43° C durante 3 horas, después se regresaron a 37° C (22). Después de dos días de incubación a 37° C, las células transfectadas se transfirieron a monocapas de células Vero, CEF o MRC5 y se incubaron a 37° C en placas de 10 cm, excepto para CEF, las cuales se incubaron a 32° C. Las células fluorescentes aparecieron rápidamente después de 2-3 días de co-cultivo en células Vero, CEF o MRC5. Las células infectadas se expandieron rápidamente en focos. El virus recombinante fue altamente sincitial en células Vero y no sincitial en células CEF y mRC5. Los sincitios únicos o focos infecciosos se transfirieron a pocillos de 35 mm de células Vero, CEF o MRC5, después se expandieron a placas más grandes agregando células frescas. El virus se recogió a partir de las células CEF o MRC5 después de 5 días de infección y a partir de las células Vero cuando los sincitios implicaron el 80-90 % del cultivo (habitualmente después de 2 días) mediante el raspado de las células infectadas, la congelación-descongelación de las células y el medio y la centrifugación para remover los desechos celulares. Tales producciones virales se titularon utilizando el método de titulación TCID50. Brevemente, las células Vero se sembraron en placa de 96 pocillos (7500 células/pocillo) y se infectaron mediante diluciones en serie 1:10 de muestra de virus en DMEM/FCS al 5 %. Después de la incubación a 37° C durante 7 días, las células se tiñeron con violeta cristal y se determinó la dilución del virus que dio como resultado infección en el 50 % de la unidad de ensayo. El punto final del 50 % descrito como dosis infecciosa de cultivo de tejido (TCID50) se calculó por el método Kraber (3). El virus recombinante rescatado y cultivado en células Vero tuvo títulos de 107-108 TCID50/ml y el virus rescatado y cultivado en células CEF o MRC5 tuvo títulos más bajos de 104-106 TCID50/ml.
La invención proporciona la tecnología para la construcción y producción de vectores recombinantes, especialmente vectores lentivirales del Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)-TRIP, que expresa la ARN polimerasa de T7 y proteínas N y P Schwarz de sarampión bajo el control del promotor de citomegalovirus (CMV). Estos vectores pueden utilizarse para transducir eficazmente in vitro casi todas las células en un nivel alto, particularmente células humanas o de mamífero. Tales células pueden utilizarse como células auxiliares/transcomplementarias capaces de generas virus de sarampión recombinantes de novo después de la transfección por ADNc antigenómico viral infeccioso de longitud completa o por clones de ADN como se ha definido anteriormente.
La presente invención permite rescatar cualquier virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, tal como virus de sarampión, a partir de ADNc, opcionalmente modificado, sin contaminación por cualquier otro virus auxiliar tal como virus vaccinia. Debido a la alta eficacia de transducción de vectores lentivirales, este método permite generar células que expresan un nivel muy alto de proteínas auxiliares. Debido a que la recombinación basada en retrovirus, particularmente la recombinación basada en lentiviral, de ADN extraño en ADN cromosómico es genuina en comparación con la recombinación basada en plásmido ilícita, las células auxiliares generadas por este método son muy estables y su alta eficacia para rescatar los virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada a partir del ADNc se mantiene después de múltiples pasajes en serie.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Bibliografía
Arnebom, P., G. Biberfeld, M. Forsgren y L. V. von Stedingk. 1983. Specific and non-specific B cell activation in measles and varicella. Clin Exp Immunol 51: 165-72.
Baron, M. D. y T. Barrett. 1997. Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J Virol 71 :1265-71.
Buchholz, U. J., H. Granzow, K. Schuldt, S. S. Whitehead, B. R. Murphy y P. L. Collins. 2000. Chimeric bovine respiratory syncytial virus with glycoprotein gene substitutions from human respiratory syncytial virus (HRSV): effects on host range and evaluation as a live-attenuated HRSV vaccine. J Virol 74:1187-99.
C.D.C. 2005. Progress in reducing measles mortality-worldwide, 1999-2003. MMWR Morb Mortal WkIy Rep. 54:200-203.
Calain, P., and L. Roux. 1993. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J Virol 67:4822-30.
Clarke, D. K., M. S. Sidhu, J. E. Johnson y S. A. Udem. 2000. Rescue of mumps virus from cDNA. J Virol 74:4831-8.
Collins, P. L., M. G. Hill, E. Camargo, H. Grosfeld, R. M. Chanock, y B.R. Murphy. 1995. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5" proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. Proc Natl Acad Sci U.S.A 92:11563-7.
Combredet, C, V. Labrousse-Najburg, L. Mollet, C. Lorin, F. Delebecque, B. Hurtrel, H. McClure, M. Feinberg, M. Brahic y F. Tangy. 2003. A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgénic mice. Journal of Virology 77:11546-11554.
Das, S. C, M. D. Baron y T. Barrett. 2000. Recovery and characterization of a chimeric rinderpest virus with the glycoproteins of peste-des-petits-ruminants virus: homologous F and H proteins are required for virus viability. J Virol 74:9039-47.
Durbin, A. P., S. L. Hall, J. W. Siew, S. S. Whitehead, P. L. Collins, and B.R. Murphy. 1997. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology 235:323-32.
Enders, J. F. y T. C. Peebles. 1954. Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277-286.
Finke, S. y K. K. Conzelmann. 1999. Virus promoters determine interference by defective RNAs: selective amplification of mini-RNA vectors and rescue from cDNA by a 3' copy-back ambisense rabies virus. J Virol 73:3818-25.
Fujii, Y., T. Sakaguchi, K. Kiyotani, C. Huang, N. Fukuhara, Y. Egi, y T. Yoshida. 2002. Involvement of the leader sequence in Sendai virus pathogenesis revealed by recovery of a pathogenic field isolate from cDNA. J Virol 76:8540-7.
Garcin, D., P. Latorre, y D. Kolakofsky. 1999. Sendai virus C proteins counteract the interferon-mediated induction of an antiviral state. J Virol 73:6559-65.
Gassen, U., F. M. Collins, W. P. Duprex y B. K. Rima. 2000. Establishment of a rescue system for canine distemper virus. J Virol 74:10737-44.
Griffin, D. 2001. Measles virus, págs. 1401-1441. En D. Knipe y P. Howley (ed.), Field's Virology, 4a Edición, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Philadelphia.
Harty, R. N., M. E. Brown, F. P. Hayes, N. T. Wright y M. J. Schnell. 2001. Vaccinia virus-free recovery of vesicular stomatitis virus. J Mol Microbiol Biotechnol 3:513-7.
He, B., R. G. Paterson, C. D. Ward y R. A. Lamb. 1997. Recovery of infectious SV5 from cloned DNA and expression of a foreign gene. Virology 237:249-60.
Hilleman, M. 2002. Current overview of the pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practical implications. Vaccine 20:651-665.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Hoffman, M. A. y A. K. Banerjee. 1997. An infectious clone of human parainfluenza virus type 3. J Virol 71 :4272- 7.
Ito, N., M. Takayama, K. Yamada, M. Sugiyama y N. Minamoto. 2001. Rescue of rabies virus from cloned cDNA and identification of the pathogenicity-related gene: glycoprotein gene is associated with virulence for adult mice. J Virol 75:9121-8.
Kato, A., Y. Sakai, T. Shioda, T. Kondo, M. Nakanishi, e Y. Nagai. 1996. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells 1: 569-79.
Kawano, M., M. Kaito, Y. Kozuka, H. Komada, N. Noda, K. Nanba, M. Tsurudome, M. Ito, M. Nishio e Y. Ito. 2001. Recovery of infectious human parainfluenza type 2 virus from cDNA clones and properties of the defective virus without V-specific cysteine-rich domain. Virology 284:99- 112.
Kim, E. A., K. S. Lee, S. L. Primack, H. K. Yoon, H. S. Byun, T. S. Kim, G. Y. Suh, O. J. Kwon y J. Han. 2002. Viral pneumonias in adults: radiologic and pathologic findings. Radiographics 22 Spec N° S137-49.
Lawson, N. D., E. A. Stillman, M. A. Whitt, y J. K. Rose. 1995. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc Natl Acad Sci U.S.A 92:4477-81.
Leyrer, S., W. J. Neubert, y R. Sedlmeier. 1998. Rapid and efficient recovery of Sendai virus from cDNA: factors influencing recombinant virus rescue. J Virol Methods 75:47-58.
Okada, H., F. Kobune, T. A. Sato, T. Kohama, Y. Takeuchi, T. Abe, N. Takayama, T. Tsuchiya y M. Tashiro. 2000. Extensive lymphopenia due to apoptosis of uninfected lymphocytes in acute measles patients. Arch Virol 145:905-20.
Okada, H., T. A. Sato, A. Katayama, K. Higuchi, K. Shichijo, T. Tsuchiya, N. Takayama, Y. Takeuchi, T. Abe, N. Okabe y M. Tashiro. 2001. Comparative analysis of host responses related to immunosuppression between measles patients and vaccine recipients with live attenuated measles vaccines. Arch Virol 146:859-74.
Ovsyannikova, I., N. Dhiman, R. Jacobson, R. Vierkant y G. Poland. 2003. Frequency of measles virus-specific CD4+ and CD8+ T cells in subjects seronegative or highly seropositive for measles vaccine. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 10:411-416.
Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, M. S. Sidhu, y S. A. Udem. 1999. Enhanced measles virus cDNA rescue and gene expression after heat shock. J Virol 73:3560-6.
Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001a. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol 75:921-33.
Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001 b. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol 75:910-20.
Peeters, B. P., O. S. de Leeuw, G. Koch y A. L. Gielkens. 1999. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J Virol 73:5001-9.
Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, C. Dotsch, G. Christiansen, y M. A. Billeter. 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. Embo J 14:5773-84.
Romer-Oberdorfer, A., E. Mundt, T. Mebatsion, U. J. Buchholz y T. C. Mettenleiter. 1999. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J Gen Virol 80 (Pt 11 ):2987-95.
Schmidt, A. C, J. M. McAuliffe, A. Huang, S. R. Surman, J. E. Bailly, W. R. Elkins, P. L. Collins, B. R. Murphy, y M. H. Skiadopoulos. 2000. Bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3) fusion and hemagglutinin-neuraminidase glycoproteins make an important contribution to the restricted replication of BPIV3 in primates. J Virol 74:8922-9.
Schneider, H., P. Spielhofer, K. Kaelin, C. Dotsch, F. Radecke, G. Sutter y M. A. Billeter. 1997. Rescue of measles virus using a replication- deficient vaccinia-T7 vector. J Virol Methods 64:57-64.
Schnell, M. J., L. Buonocore, E. Kretzschmar, E. Johnson, y J. K. Rose. 1996. Foreign glycoproteins expressed from recombinant vesicular stomatitis viruses are incorporated efficiently into virus particles. Proc Natl Acad Sci U.S.A 93:11359-65.
Schnell, M. J., T. Mebatsion, y K. K. Conzelmann. 1994. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. Embo J 13:4195-203.

Claims (27)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Una célula recombinante que comprende integrados en su genoma al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de los mismos, y al menos una copia de un ADN solapado asociado funcionalmente con dicho ácido o ácidos nucleicos y donde dicha ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), dichas proteínas N y P se expresan de manera estable,
    y donde dichos derivados funcionales de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) y/o la nucleoproteína (N) y/o la fosfoproteína (P) se definen como variantes de la ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) y/o de la proteína N y/o de la proteína P que mantienen actividad de la proteína a partir de la cual se obtienen, como un complejo de ribonucleoproteína (complejo RNP), funcional en transcripción y replicación en un genoma de virus, en un sistema de rescate que posibilita la producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada a partir de ADNc clonado, estando dichas variantes codificadas por un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en:
    a) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad (solución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación del 50 % de formamida, 6X SSC a 42° C y condiciones de lavado a 68° C, 0,2X SSC y el 0,1 % de SDS) con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 y la proteína P de SEQ ID NO: 15 de una cepa o virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada;
    b) un ácido nucleico que presenta al menos el 80 %, preferentemente el 90 %, más preferentemente el 95 % o
    incluso el 99 % de similitud con un ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de
    SEQ ID NO: 15, calculándose dicha similitud a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias; y
    c) un ácido nucleico que difiere del ácido nucleico que codifica la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de
    SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de
    SEQ ID NO: 15 en al menos un nucleótido, opcionalmente sustitución conservativa, preferentemente 1,2, 3, 4 o
    5 sustituciones, en al menos una supresión o adición de nucleótido, preferentemente 1, 2, 3, 4 o 5 supresiones o adiciones de nucleótido;
    o, siendo un fragmento que representa al menos el 70 %, particularmente el 80 % y más particularmente el 90 % o incluso el 95 % de la ARN polimerasa del fago T7 de tipo silvestre de SEQ ID NO: 9 o su forma nuclear (nlsT7) de SEQ ID NO: 11, la proteína N de SEQ ID NO: 13 o la proteína P de SEQ ID NO: 15.
  2. 2. Una célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende integrado en su genoma:
    a. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) bajo el control de elemento o elementos reguladores de trascripción,
    b. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada bajo el control de elemento o elementos reguladores de trascripción, y
    c. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada bajo el control de elemento o elementos reguladores de trascripción.
  3. 3. Una célula recombinante que comprende integrada en su genoma, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de los mismos como se define en la reivindicación 1, y al menos una copia de un ADN solapado asociado funcionalmente con dicho ácido o ácidos nucleicos y donde dicha ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), dichas proteínas N y P se expresan de una manera estable, y siendo obtenible dicha célula recombinante por recombinación de su genoma con:
    a. un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7),
    b. un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, y
    c. un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
  4. 4. Una célula recombinante que comprende integrada en su genoma, al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una fosfoproteína (P) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    segmentada o derivados funcionales de los mismos como se define en la reivindicación 1, y al menos una copia de un ADN solapado asociado funcionalmente con dicho ácido o ácidos nucleicos y donde dicha ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), dichas proteínas N y P se expresan de una manera estable, y siendo obtenible dicha célula recombinante por recombinación de su genoma con un vector de expresión que comprende:
    a. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7).
    b. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de sentido negativo no segmentada.
    c. al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y
    d. un ADN solapado.
  5. 5. Una célula recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde las proteínas N y P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada son del mismo virus, preferentemente de la misma cepa de virus o de diferentes cepas de virus o son de diferentes virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
  6. 6. Una célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 5, donde las proteínas N y P de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada son de un virus MV atenuado, particularmente cepa Schwarz MV.
  7. 7. Una célula recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el ADN solapado se obtiene a partir de un lentivirus, tal como un virus CAEV, EIAV, VISNA, SIV o FIV, particularmente un lentivirus humano, tal como VIH preferentemente VIH-1 o VIH-2.
  8. 8. Una célula recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, donde dicho vector o vectores es o son vector o vectores de gen de transferencia derivados de VIH que comprenden dos LTR, uno de los LTR estando opcionalmente eliminado en la parte U3, y elementos reguladores de la expresión y la transcripción.
  9. 9. Una célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 3 o una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde los vectores son:
    a. el plásmido HIV-1-TRIPAU3.CMV-T7 depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006, con el número I- 3702 o el plásmido HIV-1-TRIPAU3.CMV-nlsT7, depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006 con el número I-3703.
    b. el plásmido HIV-1-TRIPAU3.CMV-N depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006 con el número I-3700, y
    c. el plásmido HIV-1-TRIPAU3.CMV-P depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006, con el número I- 3701.
  10. 10. Una célula recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 la cual es una célula eucariota, preferentemente una célula de mamífero, más preferentemente una célula humana.
  11. 11. Una célula recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que puede dividirse o que no se puede dividir.
  12. 12. Una célula recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 la cual es una célula HEK 293 (riñón embrionario humano), en particular la línea de células 293-T7-NP depositada en el CNCM el 14 de junio de 2006 con el número I-3618 o la línea de células 293-nlsT7-NP MV depositada en el CNCM el 4 de agosto de 2006, con el número I-3662.
  13. 13. Una célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende integrada en su genoma al menos una copia de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, opcionalmente bajo el control de elementos reguladores de trascripción.
  14. 14. Una célula recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, recombinada adicionalmente por un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, tal como el plásmido pEMC- LSchw depositado en el CNCM el 18 de diciembre de 2007, con el número I-3881.
  15. 15. Una célula recombinante de acuerdo con la reivindicación 14, donde el vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
  16. 16. Una célula recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, donde las proteínas N, P y L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada son del mismo virus, en particular de la misma cepa de virus o de cepas de virus diferentes, o son de diferentes virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada.
  17. 17. Una célula recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, donde la proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada es de un virus MV, particularmente de una cepa Schwarz MV.
  18. 18. Una célula recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, recombinada adicionalmente con un clon de ADNc que codifica el antigenoma de longitud completa de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, opcionalmente modificado mediante inserción en lugar o lugares permisivos de ácido o ácidos nucleicos heterólogos.
  19. 19. Un cultivo celular que está compuesto de células recombinantes como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en particular un cultivo primario o una línea celular.
  20. 20. Un vector de expresión derivado de retroviral, en particular un plásmido, que contiene un ADN solapado y al menos un ácido nucleico que codifica una proteína que se selecciona del grupo que consiste en una polimerasa de ARN del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativa no segmentada, una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativa no segmentada y una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativa no segmentada.
  21. 21. Un vector de expresión derivado de retroviral de acuerdo con la reivindicación 20 que es un vector derivado de FIV o SIF, un lentivirus humano tal como un vector derivado de VIH, preferentemente un vector derivado de VIH-1 o VIH-2.
  22. 22. Un vector de expresión derivado de retroviral de acuerdo con la reivindicación 20 o 21 elegido en el grupo que consiste en:
    a) un vector que comprende un ADN solapado y un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7, tal como el plásmido HIV-1-TRIPAU3.CMV-T7 depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006, con el número I-3702;
    b) un vector que comprende un ADN solapado y un ácido nucleico que codifica una forma nuclear de una ARN polimerasa del fago T7, tal como el plásmido HIV-1-TRIPAU3.CMV-nlsT7 depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006 con el número I-3703;
    c) un vector que comprende un ADN solapado y un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, tal como el HIV-1-TRIPAU3.CMV-N depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006 con el número I-3700;
    d) un vector que comprende un ADN solapado y un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, tal como el plásmido HIV-1-TRIPAU3-CMV-P depositado en el CNCM el 14 de diciembre de 2006, con el número I-3701;
    e) un vector que comprende un ADN solapado y un ácido nucleico que codifica una proteína L de un virus de ARN de cadena negativa no segmentada;
    f) un vector que comprende un ADN solapado y un ácido o ácidos nucleicos que codifican una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, una proteína P de un virus de aRn de cadena de sentido negativo no segmentada y opcionalmente una proteína L de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada; y
    g) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína L de un virus de ARN de cadena negativa no segmentada, que es el plásmido pEMC-LSchw, depositado en el CNCM el 18 de diciembre de 2007, bajo el número I-3881.
  23. 23. Un vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde dicho ácido nucleico está bajo el control de elemento o elementos reguladores de la transcripción, tales como un promotor, por ejemplo el promotor CMV.
  24. 24. Método para producir virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante que se elige en el o consiste en:
    (i) un método que comprende o que consiste en:
    a. recombinar adicionalmente el genoma de una célula recombinante o un cultivo de células como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en particular la línea celular 293-T7-NP depositada en el CNCM el 14 de junio de 2006 con el número I-3618 o la línea de células 293-nlsT7-NP MV depositada en el CNCM el 4 de agosto de 2006, con el número I-3662, con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada y con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada,
    b. transferir dicha célula recombinante o cultivo de células recombinantes a células con capacidad para mantener la replicación y producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, tales como células Vero (células de riñón de mono verde africano), células CEF (fibroblasto de embrión de gallina) o células MRC5 y
    c. recuperar el virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, infeccioso, recombinante a partir del co-cultivo de la etapa b;
    (ii) un método que comprende o consiste en:
    a. recombinar adicionalmente el genoma de una célula recombinante o un cultivo de células como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada y
    b. transferir dicha célula recombinante o cultivo de células recombinantes a células con capacidad para mantener la replicación y producción de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, tales como células Vero (células de riñón de mono verde africano), células CEF (fibroblasto embrionario de pollo) o células MRC5 y
    c. recuperar el virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante a partir del co-cultivo de la etapa b;
    (iii) un método que comprende o consiste en:
    a. recombinar adicionalmente el genoma de una célula recombinante o un cultivo de células como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en particular un cultivo de células eucariotas, más particularmente un cultivo de células de mamífero o un cultivo de células humanas tales como fibroblastos humanos, especialmente la línea celular MRC5 (fibroblastos de pulmón humanos), con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y
    b. recuperar el virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante a partir de la célula recombinante o cultivo de células recombinantes; y
    (iv) un método que comprende o consiste en:
    a. recombinar adicionalmente el genoma de una célula recombinante o de un cultivo de células como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, particular un cultivo de células eucariotas, más particularmente un cultivo de células de mamífero o un cultivo de células humanas tales como fibroblastos humanos, especialmente la línea celular MRC5 (fibroblastos de pulmón humanos), con un clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada; y
    b. recuperar el virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada infeccioso, recombinante a partir de la célula recombinante o cultivo de células recombinantes.
  25. 25. Método de acuerdo con la reivindicación 24, donde la secuencia de nucleótidos de dicho clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada se modifica mediante inserción, en lugares permisivos, de al menos un ácido o ácidos nucleicos heterólogos tales como un ácido nucleico heterólogo que codifica epítopos o poliepítopos.
  26. 26. Método de acuerdo con la reivindicación 24 o 25, donde dicho clon de ADNc de cadena de sentido negativo no segmentada modificado de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada es de un virus MV atenuado, particularmente la cepa MV Schwarz.
  27. 27. Método para producir células recombinantes elegidas en el grupo que consiste en:
    (i) un método para producir células recombinantes como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende o que consiste en:
    a. recombinar el genoma de una célula con al menos:
    - un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7),
    - un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y
    - un vector de expresión que comprende un ADN solapado y al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    b. seleccionar las células que producen de forma estable, a partir de ácido o ácidos nucleicos recombinados con su genoma, al menos una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína (P) de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, o derivados funcionales de las mismas como se define en la reivindicación 1;
    (ii) un método para producir células recombinantes como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende o que consiste en:
    a. recombinar el genoma de una célula con al menos un vector de expresión que comprende
    - al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7) bajo el control de un promotor,
    - al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína N de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada bajo el control de un promotor,
    - al menos una copia de un ácido nucleico que codifica una proteína P de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada bajo el control de un promotor y
    - un ADN solapado y
    b. seleccionar las células que producen de forma estable, a partir de ácido o ácidos nucleicos recombinados con su genoma, al menos una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína (P) de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada, o derivados funcionales de las mismas como se define en la reivindicación 1; y
    (iii) un método para producir células recombinantes como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 que comprende o que consiste en:
    a. proporcionar células recombinantes por un método de acuerdo con la opción (i) o (ii) anterior,
    b. recombinar adicionalmente el genoma de las células recombinantes obtenidas en a. con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína larga de ARN polimerasa (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y
    c. seleccionar las células que producen de forma estable al menos una ARN polimerasa del fago T7 o su forma nuclear (nlsT7), una nucleoproteína (N) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y una fosfoproteína (P) de virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada y que producen una proteína larga (L) de un virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada o derivados funcionales de las mismas como se define en la reivindicación 1.
ES07870468.1T 2006-12-22 2007-12-21 Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada Active ES2686168T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06292025.1A EP1939214B1 (en) 2006-12-22 2006-12-22 Cells and methodology to generate non-segmented negative-strand RNA viruses
EP06292025 2006-12-22
PCT/IB2007/004444 WO2008078198A2 (en) 2006-12-22 2007-12-21 Cells and methodology to generate non-segmented negative-strand rna viruses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2686168T3 true ES2686168T3 (es) 2018-10-16

Family

ID=37831098

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06292025T Active ES2423518T3 (es) 2006-12-22 2006-12-22 Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada
ES07870468.1T Active ES2686168T3 (es) 2006-12-22 2007-12-21 Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06292025T Active ES2423518T3 (es) 2006-12-22 2006-12-22 Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada

Country Status (11)

Country Link
US (2) US8586364B2 (es)
EP (2) EP1939214B1 (es)
JP (2) JP5902371B2 (es)
KR (1) KR101469007B1 (es)
CN (2) CN101631798A (es)
BR (1) BRPI0719469C1 (es)
CA (1) CA2673262C (es)
DK (2) DK1939214T3 (es)
ES (2) ES2423518T3 (es)
MX (1) MX2009006755A (es)
WO (1) WO2008078198A2 (es)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2427139T3 (es) 2002-06-20 2013-10-29 Institut Pasteur Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna
EP1375512B1 (en) 2002-06-20 2009-07-22 Institut Pasteur Infectious cDNA of an approved vaccine strain of measles virus. Use for immunogenic compositions
CA2432738A1 (en) 2003-02-26 2004-08-26 Philippe Despres New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications
WO2012038832A2 (en) * 2010-09-24 2012-03-29 Institut Pasteur Generation of replicating chimeric measles virus - retrovirus particles
CN103906843B (zh) * 2011-06-08 2016-12-07 维什瓦斯·乔希 双质粒哺乳动物表达系统
FR2994697B1 (fr) * 2012-08-24 2016-05-13 Centre De Coop Int En Rech Agronomique Pour Le Dev (Cirad) Souche vaccinale marquee du virus de la peste des petits ruminants, et son procede d'obtention
EP2712871A1 (en) 2012-09-27 2014-04-02 Institut Pasteur Recombinant Measles virus expressing Chikungunya virus polypeptides and their applications
EP2759301A1 (en) 2013-01-24 2014-07-30 Institut Pasteur Use of a genetically modified infectious measles virus with enhanced pro-apoptotic properties (MV-DeltaC virus)
US20140255447A1 (en) * 2013-03-05 2014-09-11 Biomune Company Production of avian embryo cells
WO2015092710A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Contralateral co-administration of vaccines
GB2583296A (en) 2015-01-05 2020-10-21 Seagull Biosolutions Pvt Ltd Dna molecules producing custom designed replicating and non-replicating negative stranded rna viruses and uses there of
EP3184119A1 (en) 2015-12-23 2017-06-28 Themis Bioscience GmbH Chromatography based purification strategies for measles scaffold based viruses
EP3255056A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-13 Commissariat À L'Énergie Atomique Et Aux Énergies Alternatives Method for producing self-assemblying paramyxoviral nucleocapsid-like particles and their uses
WO2018206512A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 Invectys Recombinant measles vaccine expressing htert
EP3412307A1 (en) 2017-06-07 2018-12-12 Institut Pasteur Recombinant measles virus expressing zika virus proteins and their applications
CN107557340A (zh) * 2017-09-26 2018-01-09 南京普菲科医药科技有限公司 一种可诱导性拯救弹状病毒的细胞系及其构建方法与应用
BR112020009157A2 (pt) 2017-11-09 2020-10-27 Institut Pasteur poliepítopo quimérico, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira e composição imunogênica
US11976305B2 (en) 2017-12-21 2024-05-07 Institut Pasteur Lassa vaccine
CA3106286A1 (en) * 2018-07-13 2020-01-16 Valneva Se Method for rescuing and producing a virus in avian cells
CN109355301A (zh) * 2018-08-22 2019-02-19 深圳大学 一种石斑鱼重组NNVcp的密码子优化的核酸序列、融合表达载体、制备方法及其本身
CN111218474A (zh) * 2018-11-23 2020-06-02 成都生物制品研究所有限责任公司 一种副粘病毒的拯救系统和副粘病毒拯救方法
EP3673917A1 (en) 2018-12-28 2020-07-01 Themis Bioscience GmbH Norovirus vaccines
CN109913423A (zh) * 2019-03-27 2019-06-21 扬州大学 一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系及应用
EP3865180A1 (en) 2020-02-13 2021-08-18 Institut Pasteur Live recombinant measles virus expressing coronavirus antigens - its use in eliciting immunity against coronaviruses
CA3166811A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Nicolas Robert Xavier Escriou Measles-vectored covid-19 immunogenic compositions and vaccines
WO2021222228A1 (en) * 2020-04-27 2021-11-04 Ohio State Innovation Foundation A live attenuated measles virus vectored vaccine for sars-cov-2
EP3936517A1 (en) * 2020-07-08 2022-01-12 Institut Pasteur An improved measles virus vaccine vector based on multiple tandem additional transcription units
CA3204201A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 Thierry Heidmann Measles-hiv or measles-htlv vaccine
WO2023230598A2 (en) * 2022-05-27 2023-11-30 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Reverse genetics system for feline morbillivirus

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69510207T3 (de) * 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
AU784910B2 (en) 1999-10-12 2006-07-27 Centre National De La Recherche Scientifique Lentiviral triplex DNA, and vectors and recombinant cells containing lentiviral triplex DNA
AU2001282388A1 (en) 2000-06-16 2001-12-24 Institut Pasteur Pro-apoptotic fragments of the dengue virus envelope glycoproteins
ES2427139T3 (es) 2002-06-20 2013-10-29 Institut Pasteur Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna
DE10234579A1 (de) * 2002-07-30 2004-02-12 Zf Friedrichshafen Ag Getriebe
KR100999316B1 (ko) * 2003-06-09 2010-12-10 와이어쓰 엘엘씨 ｃＤＮＡ로부터의 비분절 네가티브 쇄 ＲＮＡ 바이러스의회수를 위한 개선된 방법
CA2549594A1 (fr) 2003-12-02 2005-06-23 Institut Pasteur Nouvelle souche de coronavirus associe au sras et ses applications
FR2870126B1 (fr) 2004-05-17 2009-07-17 Pasteur Institut Vecteur lentiviral recombinant d'expression d'une proteine de flaviviridae et ses applications comme vaccin
CN101198353A (zh) * 2005-04-14 2008-06-11 昆士兰大学 免疫调节组合物和其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN101631798A (zh) 2010-01-20
KR101469007B1 (ko) 2014-12-05
WO2008078198A3 (en) 2008-10-30
US20140051148A1 (en) 2014-02-20
EP2091962B1 (en) 2018-07-04
CN104745533A (zh) 2015-07-01
JP2015015955A (ja) 2015-01-29
MX2009006755A (es) 2009-07-31
WO2008078198A2 (en) 2008-07-03
DK2091962T3 (en) 2018-10-08
US8586364B2 (en) 2013-11-19
EP1939214A1 (en) 2008-07-02
EP2091962A2 (en) 2009-08-26
ES2423518T3 (es) 2013-09-20
US20100144040A1 (en) 2010-06-10
BRPI0719469B1 (pt) 2019-07-02
EP1939214B1 (en) 2013-07-10
BRPI0719469C1 (pt) 2021-05-25
DK1939214T3 (da) 2013-10-14
CA2673262C (en) 2019-03-05
KR20090103922A (ko) 2009-10-01
JP2010512779A (ja) 2010-04-30
US9499799B2 (en) 2016-11-22
BRPI0719469A2 (pt) 2014-02-11
CA2673262A1 (en) 2008-07-03
JP5902371B2 (ja) 2016-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2686168T3 (es) Células y metodología para generar virus de ARN de cadena de sentido negativo no segmentada
US20210095315A1 (en) Recombinant measles viruses expressing epitopes of antigens of rna viruses - use for the preparation of vaccine compositions
EP1375512B1 (en) Infectious cDNA of an approved vaccine strain of measles virus. Use for immunogenic compositions
Radecke et al. Reverse genetics meets the nonsegmented negative-strand RNA viruses
AU2010200442A1 (en) Improved method for the recovery of non-segmented, negative-stranded RNA viruses from cDNA
Bremont Reverse genetics on fish rhabdoviruses: tools to study the pathogenesis of fish rhabdoviruses
Rennick et al. Modification of measles virus and application to pathogenesis studies