JP2015015955A

JP2015015955A - 非分節型マイナス鎖ｒｎａウイルスを作出するための細胞及び方法

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Publication number: JP2015015955A
Application number: JP2014169418A
Authority: JP
Inventors: タンジー，フレデリック; Tangy Frederic; シャルノー，ピエール; Pierre Charneau; ジャコブ，イブ; Jacob Yves
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2014-08-22
Publication date: 2015-01-29
Also published as: US9499799B2; CN104745533A; EP2091962B1; DK2091962T3; WO2008078198A3; CN101631798A; BRPI0719469A2; EP2091962A2; ES2686168T3; KR20090103922A; KR101469007B1; BRPI0719469B1; JP2010512779A; WO2008078198A2; EP1939214B1; US20140051148A1; EP1939214A1; ES2423518T3; BRPI0719469C1; DK1939214T3

Abstract

【課題】クローニングされたデオキシリボ核酸（cDNA）から、特に麻疹ウイルスから、とりわけ弱毒化された株、例えばワクチン接種に関して承認されたものから、特に弱毒化Schwarz麻疹ウイルス及び様々な異種配列を発現する組換えSchwarz麻疹系ウイルスから、非分節型マイナス鎖一本鎖RNAウイルス（NNV又はモノネガウイルス目）を作出するための組換え細胞及び方法の提供。【解決手段】少なくともRNAポリメラーゼ、NNVの核タンパク質（N）及びNNVのリン酸化タンパク質（P）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞。かかる細胞及び方法による救出ウイルスを増幅すれば、麻疹に対する、及び／又は、発現された異種ペプチド又はタンパク質に対する、免疫感作のためのワクチンとして使用することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、クローニングされたデオキシリボ核酸（cDNA）から、特に麻疹ウイルスから、とりわけ弱毒化された株、例えばワクチン接種に関して承認されたものから、特に弱毒化Schwarz麻疹ウイルス及び様々な異種配列を発現する組換えSchwarz麻疹系ウイルスから、非分節型マイナス鎖一本鎖RNAウイルス（NNV又はモノネガウイルス目）を作出するための組換細胞及び方法に関する。かかる救出ウイルスを増幅すれば、麻疹に対する、及び／又は、発現された異種ペプチド又はタンパク質に対する、免疫感作のためのワクチンとして使用することができる。

生存弱毒化RNAウイルスは、非常に効率的なワクチンを製造する。中でも麻疹ワクチンは、何億もの小児に使用され、有効性及び安全性が証明されている。このワクチンは１、２回の注射後に、生涯免疫を誘導する。このワクチンは殆どの国で、安価で容易に大規模製造される。かかる利点から、麻疹ウイルス、特に弱毒化ワクチン株は、小児を、状況によっては成人群を、麻疹及び／又は他の感染性病理、特にAIDS（レトロウイルス）疾患、フラビウイルス疾患又はコロナウイルス（SARS）疾患等のウイルス病理に対して免役感作するための、良好な候補ベクターとなっている。

生存弱毒化麻疹ウイルスは、1960年代からワクチンとして使用され、最も有効かつ安全なヒト用ワクチンの１種である。ワクチン接種キャンペーンは、開発途上国において麻疹を制御するのに非常に有効である。しかし、開発途上国における不適切なワクチン配布のために、麻疹は依然、およそ4500万人が感染し、かつ年間700,000名の小児が死亡する原因となっている。従ってWHOは、今後10〜20年間にわたるグローバルワクチン接種計画に力を入れている(C.D.C., 2005)。このWHOのキャンペーンを活用することにより、麻疹ワクチン由来ワクチンベクターの使用は、世界の一部地域において、安全かつ有効な新規の多価、特に二価小児用ワクチンによる、麻疹及び他の感染症に対する小児の同時免疫感作を可能にしている。

麻疹ウイルス（MV）はパラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属する、マイナス極性非分節型RNAゲノム（15,894bp）を有するエンベロープ型ウイルスである。免疫系に強力な特異反応を誘導し、再感染に対する生涯記憶防御を確立するので、麻疹への罹患を一回のみに抑えることが可能となる。かかる防御は、抗体産生及び細胞傷害性CD8⁺ Ｔリンパ球（CTL）の記憶の両方に基づく。病原株は造血系を強力に破壊し(Arnebomら、1983；Kimら、2002；Okadaら、2000)、その結果として一過性免疫抑制を生じる。これが、開発途上国における麻疹感染由来死の殆どの原因となっている。初代株とは対照的に、弱毒化株は免疫抑制を誘導しない(Okadaら、2001)。

麻疹ウイルスのEdmonston株は、1954年に、初代ヒト細胞の培養により単離された(Endersら、1954)。ニワトリ胚線維芽細胞への適応(adaptation)は、ニワトリ胚線維芽細胞における引き続きの継代により更に弱毒化されたワクチン種を作製した(Schwarzら、1962)。Schwarz株及びMoraten株は、同じヌクレオチド配列を有し(Parksら、2001a；Parksら、2001b)、これらは最も頻用される麻疹ワクチンを構成している。１回又は２回の注射によるワクチン接種は、生涯免疫を誘導する(Griffinら、2001；Hillemanら、2002)。ＣＤ８細胞及び抗体の持続は、ワクチン接種後最長２５年間示されている(Ovsyannikovaら、2003)。麻疹ワクチンは、ほとんどの国において大規模に容易に製造され、少ない経費で入手可能である。このウイルスゲノムの弱毒化は、複数の変異の有利な組合せの結果である。従ってこのワクチンは、非常に安定しており、かつワクチン株の復帰変異は、これまで認められていない(Hillemanら、2002)。加えて本ウイルスは、細胞質においてのみ複製し、宿主ゲノムの染色体への組込みのリスクを排除する。これらの特徴は、弱毒化された生麻疹ワクチンを、多価ワクチンベクターの開発のための優れた候補としている。この目的のために、Edmonston B MV株アンチゲノムに対応する感染性cDNAは、クローニングされ、かつ対応するウイルスの作出を可能にする逆遺伝学技術が確立された(Radeckeら、1995)。

本発明者らは先に、世界中で最も一般的に使用される麻疹ワクチンであるＳｃｈｗａｒｚＭＶを用い、ベクターを開発した(Combredetら、2003)。このベクターは、様々な遺伝子又は大きい遺伝子の組合せを12回よりも多い継代にわたり安定して発現することができる。4,000〜5,000の追加ヌクレオチドを含み、ゲノムの追加の30％を提示する組換えMVベクターが作出された。これらのウイルスは、標準MVと同等の力価で、細胞培養において産生される。12回継代後及び増幅因子10²⁰で、96％よりも多い感染細胞は、これらの追加遺伝子の発現を継続した。この著しく安定した発現は、モノネガウイルス目の他のメンバーについても認められ（Schnellら、1996）、これは正二十面体カプシドを伴うウイルスとは対照的に、これらの螺旋状ヌクレオキャプシドウイルスによるゲノムのサイズに対する幾何学的制約が恐らくは存在しないためであろう。更にMVは、免疫系細胞（マクロファージ及び樹状細胞）に感染し、その結果このカーゴ抗原をほとんどの有効な抗原提示細胞へ直接送達し、これはワクチンベクターの大きな利点である。最後に、MVゲノムは小さく、従ってベクターに対する反応が導入遺伝子に対する反応を圧倒することは避けられる。

弱毒化された株の安全性及び有効性は最終的にそのゲノム配列によって左右されるという仮定を基に、本発明者らは、忠実度を維持する最適な手順によるSchwarzワクチンの産業的調製から精製されたウイルス粒子由来のSchwarz/Moraten麻疹ウイルスのアンチゲノムに対応する感染性cDNAをクローニングした(Combredetら、2003)。逆遺伝学システムの産出量を最適化するために、このアンチゲノムウイルスcDNAを、最適有効性に必要とされる追加のGGGモチーフを伴うT7ファージRNAポリメラーゼプロモーターの制御下に配置した。このウイルスRNAの正確な切断を可能にするために、ハンマーヘッド型リボザイムを、GGGモチーフと第一のウイルスヌクレオチドの間に挿入し、並びにデルタ肝炎ウイルス由来のリボザイムを、最後のウイルスヌクレオチドの下流に配置した。得られるpTM-MVSchwプラスミドは、ヒトヘルパー細胞のトランスフェクションを基にした先に説明された逆遺伝学システムを使用し、対応するウイルスを作出することが可能であった(Radeckeら、1995)。非認可細胞(noncertified cell)への本組換えワクチンの適応を防止するために、cDNAでトランスフェクションされたヘルパー細胞は、その中でウイルスが最初に選択されかつその中で現在作出される細胞である、ニワトリ胚線維芽細胞と共存培養された。組換えウイルスの数回の継代後、そのゲノム全体の配列は、当初の配列と同一であることがわかった(Combredetら、2003)。pTM-MVSchwプラスミドからレスキューされたウイルスの免疫原性は、トランスジェニックマウスにおいて評価され、かつ産業的に製造されたSchwarzワクチンと比較された。ワクチン接種されたマカクザルは全て、抗−MV抗体及び特異的細胞反応を呈した。本cDNAから作出されたＳｃｈｗａｒｚウイルスと当初のワクチンの間で、差異は認められず、このことは、このクローニングされたウイルスは、非経口ワクチンと同じ免疫原性を有することを示している(Combredetら、2003)。この分子クローンは、接種用ストックに左右されないSchwarz麻疹ワクチンの製造を可能にする。

本pTM-MVSchwプラスミドは、ゲノムの異なる位置への追加転写ユニット（ATU）の導入により、外来遺伝子の発現のために修飾される。これらのATUは、例えば、ウイルスゲノムの遺伝子間のＮ−Ｐ領域のコピー（転写に必要なシス作用性配列を含む）内に挿入された、マルチクローニングサイトカセットである。増強された緑色蛍光タンパク質（eGFP）遺伝子が、このカセットに挿入された。ATUは、ふたつの位置（Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間及びＨ遺伝子とＬ遺伝子の間）で、pTM-MVSchwプラスミドに導入された。この追加配列とは関わりなく、アンチゲノムヌクレオチドの合計数は、ウイルス複製を最適化する「６ヌクレオチドルール」を満たすために６の倍数として維持されなければならない(Calainら、1993)。GFP導入遺伝子は、全ての感染された細胞型において発現され、このことは本組換えSchwarz麻疹ウイルスはベクターとして働くことを確認する。このベクターは、現在世界的に使用されている承認された弱毒化生ワクチン株を基にした組合せワクチンのデザインを可能にする。この研究は、国際出願WO 2004/000876の目的であり、この出願は参照により本明細書に組み入れられる。

そのようなＭＶ系生存組換えワクチンの大規模使用は、それらが安定して増殖する可能性、及び認定細胞（例えば初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）又はヒト二倍体ＭＲＣ５）の良好な力価に左右される。これらの細胞は通常、高力価で作出するアフリカミドリザルベロ（Vero）細胞などの実験用株化細胞と比べ、中等度の力価でＭＶを作出する。従って最初の種は、比較的高力価で得られなければならない。この最初の種は、逆遺伝学によりｃＤＮＡから作出される。

プラス鎖RNA又はDNAウイルスは、好適な細胞におけるそれらの操作された感染性cDNA又はDNAのトランスフェクション後、インビトロにおいて容易に得ることができるが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、それらのcDNAから逆遺伝学により直接レスキューすることができない。マイナス鎖RNAウイルスのゲノムは、感染サイクルをインビトロにおいて開始することができず、その理由は、これはタンパク質を直接コードしていないからである。転写及び複製は両方とも、ウイルスゲノムをキャプシド被包している核タンパク質に含まれた転写酵素−ポリメラーゼ酵素複合体（RNP複合体）を必要とする。従ってcDNAからの組換えマイナス鎖RNAウイルスの作製は、RNA及びタンパク質の個別の成分からの活性RNPの再構成に関連している(Fields B.N.ら、-Lippincott Raven publishers 1996, p.1953-1977)。

最近15年間にわたる多数の研究室での注目に値する一連の研究によって、ほぼ全てのマイナス鎖RNAウイルスをそのcDNAから救済するための種々のシステムの確立が可能となった(総説についてはConzelmann参照)。分節型ゲノムを有するウイルスとは対照的に、非分節型マイナス鎖RNAウイルス（モノネガウイルス目）のRNPは、しっかりと構成され、かつ該核タンパク質（Ｎ）に加え、その集成体及びポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）及びウイルスRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）を含む。最初の感染性モノネガウイルス目である狂犬病ラブドウイルスは、1994年にcDNAから回収された(Schnellら、1994)。この方法は、その正確な３’末端がデルタ肝炎ウイルス（HDV）リボザイムにより作出された完全長RNAと一緒の、狂犬病ウイルスＮ、Ｐ及びＬタンパク質の細胞内発現に関連した。このウイルスのゲノム（マイナス鎖）ではなくアンチゲノム（プラス鎖）に相当する転写物を使用し、完全長RNA中のＮ、Ｐ及びＬ配列の存在により生じるアンチセンスの問題を回避した。このシステムにおいて、必須のヘルパータンパク質は、必要なＮ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドのT7−特異的転写を駆動するために、ファージT7 RNAポリメラーゼをコードする複製−コンピテントなワクシニアベクターにより提供された。同様のシステムは、感染性狂犬病ウイルス(Schnellら、1994；Itoら、2001)、ＶＳＶ(Lawsonら、1995；Whelanら、1995)、更にはパラミクソウイルス科センダイウイルス(Garcinら、1995；Katoら、1996；Leyrerら、1998；Fujiiら、2002)、ＨＰ１Ｖ−３(Hoffman及びBanerjee、1997)及び麻疹ウイルス(Takedaら、2000；Fujiiら、2002)の回収を可能にした。

レスキューされたウイルスがヘルパーウイルスから分離されることを必要とする複製コンピテントなワクシニアの使用を避けるために、いくつかの非−複製ヘルパーウイルスが、非分節型マイナス鎖RNAウイルスをレスキューするためのヘルパータンパク質を提供するように適合された。T7 RNAポリメラーゼを発現する高度に弱毒化された修飾されたワクシニアウイルスアンカラ（MVA）が、肺炎ウイルスＲＳＶ(Collinsら、1995)、ルブラウイルスSV5(Heら、1997)、HPIV-3(Durbinら、1997)、牛疫ウイルス(Baron及びBarrett、1997)、及び麻疹ウイルス(Schneiderら、1997)、ムンプスウイルス(Clarkeら、2000)、CDV(Gassenら、2000)、HPIV-2(Kawanoら、2001)、及びBPIV-3(Schmidtら、2000)の回収のために使用されている。T7 RNAポリメラーゼを発現する組換え鶏痘ウイルスは、トリパラミクソウイルス科NDV(Peetersら、1999)及びキメラ牛疫ウイルス(Dasら、2000)の回収に使用されている。

感染性又は欠損性のウイルスベクターによる夾雑を伴わないモノネガウイルス目をレスキューするために、T3又はT7 RNAポリメラーゼを発現する株化細胞が作出された。この場合、細胞質におけるＲＮＡ−キャッピング活性が存在しない場合には、タンパク質発現は、コード領域の上流に位置した脳心筋炎ウイルス（EMCV）由来のIRESを用いて実現された。T7 RNAポリメラーゼ並びに麻疹ウイルスタンパク質Ｎ及びＰを発現するヒト胎児腎株化細胞（293-3-46）は、麻疹ウイルスのEdmonstonワクチン株を回収するために確立された(Radeckeら、1995)。このウイルスは、MVアンチゲノムRNA及びL mRNAを特定するプラスミドのトランスフェクション後にレスキューされた。これらの細胞におけるレスキュー効率は、最初は非常に低く、トランスフェクションされた培養物の熱ショック処理及びトランスフェクションされた細胞のベロ細胞上での追加の共存培養により増大したことが示された(Parksら、1999)。T7 RNAポリメラーゼを発現し（BSR T7/5）かつベビーハムスター腎細胞（BHK）を基にした別の株化細胞を、BRSV(Buchholzら、2000)、狂犬病ウイルス(Finke及びConzelmann、1999)、ＶＳＶ(Hartyら、2001)、NDV(Romer-Oberdorferら、1999)、及びエボラウイルス(Volchkovら、2001)の回収に使用した。

本発明者らは、SchwarzワクチンMVベクターをレスキューするために、293-3-46株化細胞を使用している(Combredetら、2003)。しかし本発明者らは、トランスフェクションされた細胞における熱ショック法(Parksら、1999)及びそれらのベロ細胞又はCEF細胞上での共存培養を使用したとしても、そのレスキューは、かなり再生不可能でありかつ収量が依然非常に低いか、又は大きい追加配列を含む一部の組換え体については不可能でさえあることを経験した。その効率は、それらの継代数に左右されることが認められたので、このことはヘルパー細胞の不安定性に起因していた。これらの細胞は、CMVプロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子の制御下にMV N遺伝子及びＰ遺伝子並びにT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を各々コードしているpSC6-N、pSC6-P及びpSC6-T7-NEOによりトランスフェクションされた293細胞のゲネチシン−耐性クローンの選択により作出される(Radeckeら、1995)。それらの活性の安定性は、ゲネチシン（G-418）下でのそれらの連続選択、並びにトランスフェクション及びレスキュー実験時の抗生物質の除去により左右される。外来DNAの染色体DNAへの不正な(illicit)プラスミド-ベースの組換え時に、プラスミドにより形成された鎖状体は組換えられ、かつゲネチシン選択は、非常に少数の個々のコピーのみを維持する。このことは、数回の継代後の293-3-46細胞により認められた効率の低下を説明することができる。

従って当該技術分野において、いずれか他のヘルパーウイルス、例えばワクシニアウイルスなどによる夾雑を伴わずに、任意に修飾されたcDNAから、組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを再現性及び高い効率でレスキューすることができるヘルパー株化細胞を作出する新規な方法が必要とされている。

本発明は、少なくともRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞に関する。特定の実施態様によれば、本発明の細胞は、ＲＮＡポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する。

本発明の細胞は、組換細胞であり、これはこれらの細胞は、その細胞のゲノム配列の、異種配列、すなわち異なる細胞もしくは生物に起源をもつ配列による組換えを生じる目的にかなうインビトロ遺伝子操作の結果であることを意味する。組換細胞は、単離された細胞から出発し、調製され、出発細胞のものとは異なる遺伝子及び／又は表現型の特徴を有し、かつ少なくともRNAポリメラーゼ、１種又は数種の非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質及びＰタンパク質の安定した発現又は産生も提供する。本発明の細胞は、ヒトの体の外部の生成物として請求される。

プラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7（Ａ）、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7（Ｂ）、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N（Ｃ）、及びHIV-1-TRIPΔU3.CMV-P（Ｄ）の概略を示す。ψ：パッケージングプサイモチーフ；RRE：Rev−反応性エレメント；cPPT：セントラルポリプリントラクト；CTS：セントラル終結配列；CMVie：サイトメガロウイルス極初期プロモーター；ΔU3:U3部分の欠失。

異なる細胞溶解液中のMVのN及びＰタンパク質の発現を示すウェスタンブロット；（Ａ）形質導入されない293Ｔ、ふたつの異なる継代（17及び19）の先に説明された293-3-46株化細胞、レンチウイルスベクターによる形質導入後作出された293nlsT7-NP及び293T7-NP細胞集団；（Ｂ）MV感染ベロ細胞、ふたつの異なる継代（17及び27）の293-3-46株化細胞、８種の293T7-NP細胞クローン；（Ｃ）MV感染ベロ細胞、293-3-46株化細胞（継代17）、８種の293nlsT7-NP細胞クローン、非感染ベロ細胞。ブロットは、抗−MV NP抗体（1/500）及びHRP抗−マウスIg二次抗体（1/1000）でプロービングした。

配列の簡単な説明
様々なレトロウイルスDNAフラップのヌクレオチド配列を、異なるウイルスで定義する：CAEV（配列番号１）、EIAV（配列番号２）、VISNA（配列番号３）、SIV AGM（配列番号４）、HIV-2 ROD（配列番号５）、HIV-1 LAI（配列番号６）、及びHIV-1（配列番号７）。MVウイルスのT7 RNAポリメラーゼ、nls T7 RNAポリメラーゼ、並びにＮ、Ｐ及びＬタンパク質のヌクレオチド配列は、各々、配列番号８、10、12、14、及び16に定義し、更にそれらの各々の対応するタンパク質配列を、配列番号９、11、13、15及び17に定義した。pTM-MVSchwプラスミド（CNCM I-2889）の完全ヌクレオチド配列は、配列番号18に定義した。pEMC-LSchwプラスミド（CNCM 1-3881）の完全ヌクレオチド配列は、配列番号19に定義した。

表現「安定した産生」とは、有利なことに細胞が生存している限りは、細胞が、約65と等しいか又はこれを超える多くの細胞分裂にわたり、少なくともRNAポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質を発現又は産生することを意味する。本発明の特定の実施態様に従い、組換細胞は、少なくともこれら３種のタンパク質、すなわち少なくともＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質をやがては継続して発現又は産生する。本発明の特定の実施態様に従い、これら３種のタンパク質の完全性、すなわちアミノ酸の一次配列は維持され、発現又は産生されたこれらのタンパク質は常に同じであることを確実にする。

ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質の安定した産生は、これらのタンパク質のコード配列を保持する（１又は２以上の）プラスミドの細胞内の存在とは無関係である。従って例えプラスミドがインビトロ又はエクスビボ細胞操作の特定の工程で使用されるとしても、これら３種の又は少なくとも３種のタンパク質を安定して産生する得られた組換細胞は、最早プラスミドを含まない。タンパク質発現が（１又は２以上の）プラスミドにより駆動される組換細胞とは対照的に、この方法において、発現は該プラスミドとは無関係である。

本発明の特定の実施態様によれば、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質の安定した発現は、抗生物質などの薬物の存在を必要とせず、すなわち安定した発現は、選択圧を必要としない。従ってこの安定した産生は、生存のための（１又は２以上の）プラスミドの強制的な存在を必要とせず、該プラスミドは（１又は２以上の）タンパク質を発現するためのコード配列を有する。

本発明の別の特徴は、少なくともこれら３種のタンパク質の各々、すなわち少なくともRNAポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質は、経時的に同様のレベルで産生又は発現されることである。本明細書において使用される「同様のレベル」とは、細胞寿命の期間中、例え細胞分裂後であっても、これら３種のタンパク質の各々の発現が安定していることを意味し、発現レベルの変動は、細胞寿命の異なる時点で算出された平均発現と比べ、約３０％を超えず、特に約20％を超えず、好ましくは約10％を超えない。

本発明の細胞により発現又は作出されたＲＮＡポリメラーゼは、レスキューシステムにおける、cDNAクローン由来の非分節型マイナスセンス一本鎖ウイルスRNA（vRNA）の合成に適している、任意のポリメラーゼである。このポリメラーゼの性質は本質的に、レスキューシステム（同じくクローニングされたcDNA由来のマイナス−センスRNAウイルスの逆遺伝学、又はデノボ合成と称される）において使用される、非分節型マイナス鎖一本鎖RNAウイルスのcDNAクローンに位置したRNAプロモーターポリメラーゼ配列の性質により左右される。例として本RNAポリメラーゼは、Ｔ７ファージRNAポリメラーゼ、又はその核型（nlsT7）である。

「Ｎタンパク質」及び「Ｐタンパク質」の表現は、各々、非分節型マイナス鎖一本鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖一本鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）を意味する。Ｎ及び／又はＰタンパク質が由来することができる非分節型マイナス鎖一本鎖RNAウイルスの科、亜科、属又は種の例は、表Ｉに列記されている。

特定の実施態様によれば、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮ及びＰタンパク質は、同じウイルスに由来するか、同じウイルス株に由来又は異なるウイルス株に由来するかのいずれかである。別の実施態様によれば、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮ及びＰタンパク質は、異なる非分節型マイナス鎖RNAウイルスに由来する。

特定の実施態様によれば、Ｎ及びＰタンパク質は、モノネガウイルス、好ましくはパラミクソウイルス科ウイルス、好ましくはパラミクソウイルス亜科ウイルス、最も好ましくはモルビリウイルス科ウイルスに由来する。モルビリウイルスの例は、麻疹ウイルス（MV）、特に弱毒化された非免疫抑制株、例えばワクチンのために承認された株、特にSchwarz MV株又はEdmonston（Ed）株又はこれらの株に由来する誘導体である。ワクチンのために承認された株は、FDA(米国食品医薬品局)により、実験室データ及び臨床データの厳密な検証後の安全性、有効性、品質及び再現性に規定を有するものとして定義されている(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm)。

本出願において、非分節型マイナス鎖RNAウイルスに言及する度に、特に本明細書に列記された特定のウイルス、特に麻疹ウイルス、特にSchwarz株に適用することが可能である。

「それらの機能誘導体」の表現は、RNAポリメラーゼ及び／又はＮタンパク質及び／又はＰタンパク質の断片を含んでなる、任意の機能変種をいい、但し該機能誘導体は、クローニングされたcDNAからの非分節型マイナス−センスRNAウイルスの作出を可能にするレスキューシステムにおいて、ウイルスゲノムの転写及び複製において機能する少なくともリボ核タンパク質複合体（RNP複合体）としての、それらが由来するタンパク質の活性を維持していることを条件とする。

機能変種は、下記の特徴の少なくとも１種を有する、該機能変種タンパク質をコードする核酸により定義される：
−機能変種をコードする核酸は、高ストリンジェンシー条件で、野生型（参照）ＲＮＡポリメラーゼ又は同定された非分節型マイナス鎖RNA株もしくはウイルスのＮタンパク質及びＰタンパク質をコードする核酸とハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件は、Sambrookらにより、「Molecular Cloning: a laboratory manual」(1989)において定義されている。これらの高ストリンジェンシー条件は、以下を包含する：ニトロセルロースフィルター用の予備洗浄液５×SSC、0.5％ SDS、1.0mM EDTA（pH8.0）の使用、50％ホルムアミド、６×SSC、42℃のハイブリダイゼーション条件、並びに68℃、0.2×SSC及び0.1％ SDSの洗浄条件。プロトコールは、当業者に公知である。更に当業者は、温度及び洗浄液の塩濃度は、実験の制約に従い必要に応じて調節することができることを認めるであろう；
−機能変種をコードする核酸は、RNAポリメラーゼ、Ｎタンパク質又はＰタンパク質をコードする未変性の核酸と、少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％又は更には99％の類似性を示し、該類似性は、両方の配列の全長にわたり算出される；
−機能変種をコードする核酸は、RNAポリメラーゼ、Ｎタンパク質又はＰタンパク質をコードする未変性の核酸と、少なくとも１個のヌクレオチド置換、好ましくは１、２、３、４又は５個の置換により異なり、任意に保存的置換（アミノ酸配列を変更しない（１又は２以上の）ヌクレオチド置換）は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失又は付加、好ましくは１、２、３、４又は５個のヌクレオチドの欠失又は付加により異なる。
断片は、本出願において、その断片が、本明細書において開示された少なくともリボ核タンパク質複合体（RNP複合体）として、それが誘導されるタンパク質全体と同じ活性を有する限りは、完全長RNAポリメラーゼの、Ｎタンパク質の又はＰタンパク質の一部として定義される。特定の実施態様によれば、この断片は、完全長タンパク質の少なくとも70％、特定すると80％、より特定すると90％又は更には95％を表す。

従って、ここでRNAポリメラーゼ、ＮもしくはＰタンパク質又はそれらのコード配列を説明し、その説明は本明細書において定義されたそれらの機能誘導体に同様に適用される。

特定の実施態様に従い、本発明の組換細胞は、そのゲノム内に組み込まれた、RNAポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピー、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含む。任意に、前述の３種のタンパク質をコードする核酸は、これらの各々又は少なくとも１種が、（１又は２以上の）転写調節エレメントの制御下にある。「ゲノムに組込まれた」の表現は、（１又は２以上の）転写調節エレメントの制御下の核酸の少なくとも１種のコピーが、該細胞が該核酸によりコードされたタンパク質を安定して発現することができる条件下で、組換細胞のゲノム内に配置されていることを意味する。特定の実施態様によれば、本発明の組換細胞は、そのゲノムに組込まれた、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを更に含む。

「少なくとも１種のコピー」は、RNAポリメラーゼ及び／又はＮタンパク質及び／又はＰタンパク質及び／又はＬタンパク質をコードする核酸は、これらの各タンパク質に必要とされる発現レベルに応じて、１種又は数種のコピーで、好ましくは正確に又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、10種のコピー又はそれよりも多くで、存在してよいことを意味する。

本発明の特定の実施態様によれば、本発明の細胞は、細胞ゲノムに組込まれたDNAフラップの少なくとも１種のコピーも含む。DNAフラップは、レトロウイルス、特にレンチウイルスの、又はふたつの必須領域、すなわちcPPT（セントラルポリプリントラクト）及びCTS（シス−作用性終結領域）領域を含むレトロウイルス様起源のヌクレオチド配列であり、ここでcPPT領域及びCTS領域は、それらを含むDNAの複製時に、３本鎖ＤＮＡ構造を誘導する(先にZennouら、2000；及び、出願WO 99/55892及びWO 01/27300において定義されている)。特定の実施態様によれば、DNAフラップは、ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質及び恐らくＬタンパク質をコードする核酸の転写を可能にする内部プロモーターの直ぐ上流に挿入される。DNAフラップ（cPPT-CTS）は、本発明のレトロウイルス由来ベクターに機能性配向で挿入され、すなわち、cPPT領域は、CTS領域に関して５’側である（LTRに相当するベクターの５’側部分は、プライマー結合部位（PBS）を含み、その領域に相当するベクターの３’側部分は、３’PPTを含む）。

本発明に適したDNAフラップは、レトロウイルスから、特にレンチウイルス又はレトロウイルス−様生物体、例えばレトロトランスポゾンから得られるか、合成的に調製されるか（化学合成）又はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などにより、任意のレトロウイルスから、特にレンチウイルス核酸からのDNAフラップの増幅により調製することができる。本DNAフラップは、レトロウイルス、特にレンチウイルス、特にヒトレトロウイルス又はレンチウイルス、及び特定するとHIVレトロウイルス、CAEV（ヤギ関節炎脳炎ウイルス）、EIAV（ウマ感染性貧血症ウイルス）、VISNAウイルス、SIV（サル免疫不全ウイルス）又はFIV（ネコ免疫不全ウイルス）から得ることができる。より好ましい実施態様によれば、本DNAフラップは、HIVレトロウイルス、例えばHIV-1もしくはHIV-2ウイルスから、又はこれら２つの形の任意の異なる単離株から得ることができる。

好ましいDNAフラップは、配列番号１から７に定義された配列を含んでなるか又はこれらの配列からなる。その天然の（ウイルスゲノム）ヌクレオチドの状況(context)から単離された、すなわちレンチウイルス中に天然に含まれるpol遺伝子から単離されたDNAフラップが使用されることは、注目に値する。従って本発明において、pol遺伝子の不要な５’及び３’部分が欠失され、かつ異なる起源の配列で組換えられたDNAフラップが使用される。特定の実施態様に従い、DNAフラップは、約90〜約150個のヌクレオチド、特に約100〜約140個のヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。

本発明は、そのゲノムの、（１）DNAフラップ、及びRNAポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、（２）DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、並びに（３）DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクターによる組換えにより得ることができる細胞にも関する。先に示された定義は、これらの細胞に適用される。

本発明は、そのゲノムの、（１）DNAフラップ、及びRNAポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、（２）DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、（３）DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、並びに（４）DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクターによる組換えにより得られた細胞にも関する。先に示された定義は、これらの細胞に適用される。

本発明は、そのゲノムの、RNAポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピー、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、及びDNAフラップを含んでなる発現ベクターによる組換えにより得ることができる細胞を包含している。先に示された定義は、これらの細胞に適用される。特定の実施態様によれば、発現ベクターは、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを更に含む。

本発明は、先に説明されたようなDNAフラップ及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのレスキューに必要なタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を含んでなる、発現レトロウイルス由来ベクターにも関する。本発明の特定のベクターに関して、核酸は、RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする。

用語「ゲノム」は、その細胞への存在は、選択圧に左右されない、すなわち細胞へのその存在が永久であるか及び／又は環境条件に左右されない任意の核酸分子をいう。用語「ゲノム」は、プラスミドを包含していない。主に用語「ゲノム」は、細胞質に存在する核酸分子に対し、細胞核に存在する核酸分子（核ゲノム）をいい、かつ例えば染色体を包含している。特定の実施態様によれば、用語「ゲノム」は、細胞小器官、例えばミトコンドリア（ミトコンドリアゲノム）又は葉緑体（葉緑体ゲノム）などのような特定の細胞コンパートメント内に存在する核酸分子も含む。特定の実施態様によれば、ゲノムは真核細胞に由来する。

レトロウイルス由来ベクター、特にレンチウイルス−由来ベクター及びより特定するとHIV-1−由来ベクターは、レトロ転写に必要なエレメント、特に以下に例示されるように一部欠失、特にＵ３領域の欠失を含む変異された可能性があるLTR及び有利なことにDNAフラップを含むウイルスゲノムである。これらのLTR領域及びDNAフラップ領域は、レトロウイルス由来の発現ベクターにおける、レトロウイルスの、特にレンチウイルス起源の唯一の配列であってよい。いかなる場合であっても、レトロウイルス由来ベクターは、完全長レンチウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明の特定の実施態様によれば、レトロウイルス由来ベクターは、DNAフラップ及び本明細書に説明されたような非分節型マイナス鎖RNAウイルスのレスキューに必要なタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸、更には対応するウイルスゲノムのLTRを含むか又はこれらからなる。

本発明の発現ベクターは、DNAフラップ及びRNAポリメラーゼ又はそれらの機能部分をコードする核酸を含む。このようなベクターは、DNAフラップ（TRIP）、U3ドメインのプロモーター及びエンハンサーが欠失されたLTR、CMVプロモーター並びにＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含んでなる、HIV-1発現ベクターである、2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3702により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7、特に配列番号８の配列を有するもの、又は、DNAフラップ（TRIP）、U3ドメインのプロモーター及びエンハンサーが欠失されたLTR、CMVプロモーター並びにT7ファージRNAポリメラーゼをコードする核酸を含んでなる、HIV-1発現ベクターである、2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3703により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7、特に配列番号10の配列を有するものである。

本発明の発現ベクターは、DNAフラップ及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸を含む。このようなベクターは、DNAフラップ（TRIP）、U3ドメインのプロモーター及びエンハンサーが欠失されたLTR、CMVプロモーター並びにMV SchwarzのＮタンパク質をコードする核酸を含んでなる、HIV-1発現ベクターである、2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3700により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-N、特に配列番号12の配列を有するものである。

本発明の発現ベクターは、DNAフラップ及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸を含む。このようなベクターは、DNAフラップ（TRIP）、U3ドメインのプロモーター及びエンハンサーが欠失されたLTR、CMＶプロモーター並びにMV SchwarzのＰタンパク質をコードする核酸を含んでなる、HIV-1発現ベクターである、2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3701により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-P、特に配列番号14の配列を有するものである。

別の本発明の発現ベクターは、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質をコードする核酸を含む。このようなベクターは、2007年12月18日にCNCMに寄託番号Ｉ-3881により寄託されたプラスミドpEMC-LSchwであることができる。Ｌタンパク質をコードする核酸の特定のひとつは、配列番号19を有するものである。

先に引用されたベクターCNCM I-3700から3703は全て、アンピシリン（100μg/ml）を補充したＬＢ培地で、37℃で振盪培養された、大腸菌（JM109）株に含まれる。

本発明は、本明細書において言及された寄託されたプラスミドに挿入されたポリヌクレオチドに含まれたヌクレオチド断片の各々又はいずれかに関し、特に本開示に従い挿入をデザインするのに適した各々又はいずれかの領域に関する。これは、本発明のプラスミドの構築のための、これらの断片の使用にも関する。

前記４種のプラスミドは、本発明の組換細胞を得るために細胞の組換えにおいて使用することができるベクターの例である。しかしこれらの例は、本発明の限定を構成するものではなく；従って先に説明されたように、Ｎ及びＰタンパク質（又はそれらの機能誘導体）は、任意の非分節型マイナス鎖RNAウイルスに由来することができ、T7ポリメラーゼは任意のRNAポリメラーゼであることができ、CMVプロモーターは任意のプロモーターであることができ、TRIP DNAフラップは任意のDNAフラップであることができ、かつHIV-1発現ベクターは任意のベクター及び特に任意のウイルスベクターであることができる。

本発明の他の発現ベクターは、DNAフラップ及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質をコードする核酸を含むか、又はDNAフラップ並びにRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質及び任意に非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質をコードする核酸（１又は２以上の）を含む。

用語「発現ベクター」は、本ベクターは、明白に言及されたエレメントに加え、関心対象のタンパク質をコードする核酸（１又は２以上の）の発現を駆動するために必要な全てのエレメント（発現調節エレメント）、特に転写調節エレメントを含むことを示す。「転写調節エレメント」は、ゲノムに組込まれた核酸（１又は２以上の）の転写の調節に関連した任意のDNA領域を定義し、例えばCMV、EF1αもしくはmPGK（マウスホスホグリセリン酸キナーゼ）のようなプロモーター、より一般的にはレトロウイルス、特にレンチウイルスベクターの挿入に適した任意のプロモーター、エンハンサーもしくはシス−作用性調節エレメントを包含している。これらのエレメント及び特にプロモーターは、組換細胞の性質に応じて選択される。求められる発現レベル又は組換えられた細胞に応じた好適なプロモーターの決定は、当業者の知識の一部で行われる。組換細胞が関心対象のタンパク質をコードするいくつかの異種核酸（ポリヌクレオチドとも称される）を含む場合、該（１又は２以上の）転写調節エレメントは、それらの核酸全てについて独自であるか、もしくはそれらの一部により共有されるか、又は対照的に各核酸は、特定の転写調節エレメントと会合されることは注目に値する。後者の場合、いくつかの転写調節エレメントは、類似しているか又は異なってよい。

組換え工程において使用される全てのベクターにおけるDNAフラップの存在は、DNAフラップ位置でのDNA三重鎖構造（三本鎖）の形成につながり（三重鎖構造はCTSドメインを含むcPPTドメインとCTSドメインの間の領域からなる）、DNAフラップを有する核酸の細胞の核への（核膜孔を通じた）移行、更にはこの細胞のゲノムへの組込みを可能にする。本DNAフラップは、ベクター核内移行のシス−決定因子として作用する。第一の態様において、DNAフラップの存在は、核酸（１又は２以上の）の非分裂細胞への組換え及び組込みに関する大きな関心であり、その理由は細胞分裂（及び膜崩壊）の非存在下で、移行（及び従って核酸の細胞ゲノムへの組込み）は、残効性としてのみ同定され；従って、このDNAフラップを含むベクターは、非分裂細胞の形質導入を可能にする非複製的レトロウイルスベクターである。第二の態様において、DNAフラップの存在は、その中にDNAフラップを含む核酸が組込まれている細胞の割合をかなり改善することにより、核酸の分裂細胞への組換え及び組込みに関する大きな関心でもある。本明細書において説明されるような、発現ベクターにおけるDNAフラップ配列の挿入は、ベクターDNAの核移行を刺激することにより、インビトロ及びインビボにおける遺伝子導入を強力に増大する(Sirvenら、2001；Zennouら、2001)。DNAフラップ配列を含むHIVベクター（TRIPベクター）は、初代Ｂ細胞及びＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞などを、DNAフラップを欠いている他のＨＩＶベクターよりも10倍高い効率で、形質導入することができる。細胞の80〜90％の形質導入は、慣習的に得ることができる。

DNAフラップ及び少なくとも３種の関心対象のタンパク質をコードする核酸（１又は２以上の）を含むベクター（１又は２以上の）による組換え、並びにゲノム内のこれらの核酸の組込み後に、この組換細胞は、RNAポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質を安定して産生する。

本発明の組換細胞を得るために使用される本発明の発現ベクターは、ウイルスベクター、特にウイルス発現ベクター、例えばレトロウイルス由来の、特にレンチウイルス−由来ベクター、例えばHIV−、FIV−又はSIV−由来ベクターである。より特定すると、レンチウイルス−由来ベクターは、ヒトレンチウイルス−由来ベクター、例えばHIV発現ベクター、特にHIV-1又はHIV-2−由来ベクターである。好ましい実施態様によれば、ウイルスベクターは、先に説明されたようなDNAフラップ及び関心対象の少なくとも３種のタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を含むHIV発現ベクターである。HIVベクターは、その中で実質的に全てのコードウイルス配列が、導入された配列により置換されている、古典的置換レトロウイルスベクターである。従ってHIVベクターは、ふたつのHIV LTR又は変異されたLTRの間に含まれ、かつDNAフラップの制御下の異種核酸（１又は２以上の）のみ発現する。その結果これらのベクターは、最大５〜６kbを有する巨大なポリヌクレオチドを収容することができる。本発明の特定の実施態様は、先に説明されたようなHIV発現ウイルスであり、最も特定するとHIV-1発現ベクターであり、ここでHIV-1 LTRは、Ｕ３ドメインのプロモーター及びエンハンサーが欠失されている（ΔU3）。この特定の欠失は、そのベクターに含まれた核酸（１又は２以上の）の発現を、特にプロモーターと会合された場合に、増加することが先に示されている。

特定の実施態様によれば、本発明の組換細胞は、プラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N及びHIV-1-TRIPΔU3.CMV-Pによるか、又はプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N及びHIV-1-TRIPΔU3.CMV-Pのいずれかによる、そのゲノムの組換えにより入手可能である。

本発明の細胞は、原核細胞又は真核細胞、特に動物細胞又は植物細胞、より特定するとヒト細胞もしくは非ヒト哺乳類細胞などの哺乳類細胞であることができる。特定の実施態様によれば、細胞は、そのゲノムの組換え前に、初代培養物又は株化細胞のいずれかから単離される。本発明の細胞は、分裂細胞又は非細胞であってよい。本発明の組換細胞を提供するために組換えることができる細胞の例として、HEK 293（ヒト胎児腎）細胞があり、この株化細胞293は、ATCCに寄託番号CRL-1573により寄託されている。特定の実施態様によれば、ヒト細胞は、生殖細胞及び／又は胚性幹細胞ではない。

本発明の組換細胞は、2006年６月14日にCNCM（パリ、仏国）に寄託番号Ｉ−3618により寄託された293-T7-NP株化細胞、すなわちプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N及びHIV-1-TRIPΔU3.CMV-Pにより組換えられたHEK-293細胞であることができる。別の本発明の組換細胞の例は、2006年８月４日にCNCMに寄託番号Ｉ−3662により寄託された293-nlsT7-NP MV株化細胞、すなわちプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N及びHIV-1-TRIPΔU3.CMV-Pにより組換えられたHEK-293細胞であることができる。

更なる本発明の実施態様によれば、本発明の組換細胞は、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含む発現ベクターにより、更に組換えられる。このＬタンパク質の発現は、一過性であり、かつDNAフラップを含まないプラスミドにより駆動されるか、又は対照的に安定しており、かつ先に定義されたようなDNAフラップを含むベクターにより駆動されてよい。Ｌタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを有するプラスミド又はベクターによる組換えは、RNAポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質の（１又は２以上の）コード配列を含む（１又は２以上の）ベクターにより同時に又は引き続き組換えられてよい。

従って本発明は、RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質、又はそれらの機能誘導体を安定して産生し、かつ非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質を安定してもしくは安定せずに産生する細胞も説明する。

本Ｌタンパク質は、表Ｉに提示された任意の非分節型マイナス鎖RNAウイルスに由来する。特定の実施態様によれば、Ｌタンパク質は、Ｎタンパク質及び／又はＰタンパク質と同じ非分節型マイナス鎖RNAウイルスに由来し、特に同じウイルス株に由来する。別の実施態様によれば、Ｌタンパク質は、Ｎタンパク質及び／又はＰタンパク質とは異なる非分節型マイナス鎖RNAウイルスに由来する。

特定の実施態様によれば、Ｌタンパク質は、パラミクソウイルス科ウイルス、好ましくはパラミクソウイルス亜科ウイルス、最も好ましくはモルビリウイルスのウイルスに由来する。モルビリウイルスの例は、麻疹ウイルス（MV）、特に弱毒化された非免疫抑制株、例えばワクチンのために承認された株であり、特にSchwarz MV株、又は更にはEdmonston（Ed）株である。特定のＬタンパク質は、MVウイルスのもの（配列番号16）、又はpEMC-LSchwプラスミドに挿入された配列及び特に配列番号19のヌクレオチド１４２５と７９７６の間に認められる配列によりコードされたものである。

特定の実施態様によれば、Ｌタンパク質の配列は、野生型Ｌタンパク質に関して修飾されてはならず、かつ宿主細胞においてＮ及びＰタンパク質並びにT7ポリメラーゼによりトランスに相補される(transcomplement)場合に、機能性である、すなわち粒子又はウイルスを作出することが可能でなければならない。Ｌタンパク質を有するクローンの効果的機能性を決定する試験は、コンピテント細胞を、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質及びＴ７（又はnlsT7）ポリメラーゼをコードする（１又は２以上の）ベクター、試験されるＬタンパク質をコードするベクター、並びにリーダー、プロモーター、レポーター遺伝子（GFPなど）及びトレーラーを含むミニゲノムによりトランスフェクションすることにより実行される。このＬクローンの機能性は、レポーター遺伝子を発現している粒子の作出により明らかにされる。

本発明は、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの非分節型マイナス鎖cDNAクローン、すなわち本ウイルスゲノムのアンチゲノムRNA（＋）鎖により更に組換えられた、本明細書の細胞も説明する。本発明の分子のヌクレオチド配列の説明に使用される「cDNA」は、当初、該分子は、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの、特に麻疹ウイルスのウイルス粒子のゲノム（−）RNAゲノム、及び最も好ましくは非分節型マイナス鎖RNAウイルスのウイルス粒子の完全長ゲノム（−）RNAゲノムの逆転写により得られるという事実にのみに関する。このことは、本cDNAクローンの調製に使用される方法に関する限定とみなされてはならない。従って本発明は、「cDNA」の表現の中に、それが先に定義されたヌクレオチド配列を有することを条件として、各DNAを包含している。従ってDNA又はプラスミドを含む精製された核酸は、該核酸、特にDNAが前述の定義を満たすことを条件として、本発明のcDNAの意味に包含される。

特定の実施態様によれば、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのcDNAクローンは、該ウイルス配列の上流に、転写調節エレメントを含む。好ましい実施態様によれば、これらのエレメントは、先に説明されたＮ、Ｐ及び／又はＬタンパク質を含む発現ベクター（１又は２以上の）に位置したもの（１又は２以上の）と同じである。より好ましい実施態様によれば、このエレメントは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターである。

ある実施態様によれば、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのcDNAクローンは、Ｎタンパク質及び／又はＰタンパク質及び／又はＬタンパク質と同じ非分節型マイナス鎖RNAウイルスに由来、特に同じウイルス株に由来する。別の実施態様によれば、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのcDNAクローンは、Ｎタンパク質及び／又はＰタンパク質及び／又はＬタンパク質とは異なる非分節型マイナス鎖RNAウイルスに由来する。

特定の実施態様によれば、cDNAクローンは、非分節型マイナス鎖RNAウイルス、例えばパラミクソウイルス科ウイルス、好ましくはパラミクソウイルス亜科ウイルス、最も好ましくはモルビリウイルスのウイルスに由来する。モルビリウイルスの例は、麻疹ウイルス（MV）、特に弱毒化された非免疫抑制株、例えばワクチンのために承認された株であり、特にSchwarz MV株又はEdmonston（Ed）株である。更に非分節型マイナス鎖cDNAクローンのヌクレオチド配列は、以下に定義されるように、野生型株又はウイルスと比べ修飾されてよい。

本発明は、細胞が、本明細書を通じて定義されたものであるような該細胞培養物、特にRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞培養物にも関する。別の実施態様によれば、本発明は、RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質、又はそれらの機能誘導体を安定して産生し、かつ非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質又はそれらの機能誘導体を安定して又は一過性に産生する、細胞培養物にも関する。

ある実施態様によれば、組換えられた細胞培養物は、初代培養物、すなわち動物（任意に非ヒト）又は植物から直接得られた細胞又は組織から調製された培養物である。別の実施態様によれば、組換えられた細胞培養物は、株化細胞、すなわち初代培養物の最初の継代培養から、又は該細胞の引き続きの連続継代から得られた細胞の集団である。

別の態様において、本発明は、本発明の細胞を使用し、感染性組換え非分節型マイナス鎖ウイルスを作出する様々な方法にも関する。

感染性組換え非分節型マイナス鎖ウイルスを作出する第一の方法は：
ａ．RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生する細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのcDNAクローンにより、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターにより組換える工程、
ｂ．非分節型マイナス鎖RNAウイルスの複製及び作出を維持するのにコンピテントな細胞上に、該組換細胞又は組換細胞培養物を移送する工程、並びに
ｃ．工程ｂの共培養物から、感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスを回収する工程：を含んでなる。

本発明の第二の方法は、感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作出する方法であり：
ａ．RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生する細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのcDNAクローンにより、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターにより組換える工程、並びに
ｂ．該組換細胞又は組換細胞培養物から、感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスを回収する工程：を含んでなる又はからなる。

本明細書において使用される「組換え」は、例えばベクターの形の下での、少なくとも１種のポリヌクレオチドの細胞への導入を意味し、該ポリヌクレオチドは、細胞ゲノム（先に定義されたような）に組込まれる（全体又は一部が）か、又は組込まれない。特定の実施態様に従い、組換えは、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのcDNAクローンである第一のポリヌクレオチドで得ることができ、その定義、性質及び任意の修飾は、本明細書において別所記載されている。組換えは、同じく又は代わりに、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードするベクターであるポリヌクレオチドを導入することを包含することができ、その定義、性質及び発現の安定性は、本明細書において別所記載されている。

これらの方法において、RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生する細胞又は細胞培養物は、本明細書に定義された細胞又は本明細書に定義された細胞培養物であり、すなわち、先に定義された１種又は複数のポリヌクレオチドの導入により修飾されている程度（extent）までの組換細胞でもある。特定の本発明の実施態様によれば、RNAポリメラーゼ、Ｎ及びＰタンパク質を安定して産生する細胞又は細胞培養物は、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質を産生しないか、又は非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質を安定して産生せず、例えばその一過性の発現又は産生が可能である。

本明細書において使用される「移送」は、組換細胞の、異なる細胞型上の、特に異なる細胞型の単層上の配置をいう。これらのうち後者の細胞は、感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスの複製及び作出の両方、すなわち細胞内の感染性ウイルスの形成及び可能性のあるこれらの感染性ウイルスの細胞外への放出の各々を維持するためにコンピテントである。この移送は、本発明の組換細胞の、前文で定義されたようなコンピテント細胞との共培養を生じる。前記移送は、組換細胞が効率的にウイルス産生する培養でない、すなわちその感染性ウイルスはこれらの組換細胞から効率的に回収することができない場合の、追加の、すなわち任意の工程であってよい。この工程は、本発明の組換細胞の、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのcDNAクローン、及び任意に非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターによる更なる組換え後に導入される。

本発明の特定の実施態様によれば、通常容易に組換えられるそれらの能力について選択される組換細胞は、組換え感染性ウイルスの維持及び作出において十分に効率的でないので、導入工程が必要である。該実施態様によれば、先に定義した方法の工程ａの細胞又は細胞培養物は、本発明の組換細胞又は組換細胞の培養物、特に例えば2006年６月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3618により寄託された293-T7-NP株化細胞、又は2006年８月４日にCNCMに寄託番号Ｉ−3662により寄託された293-nlsT7-NP MV株化細胞などの、組換えHEK-293細胞である。

非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの複製及び作出を維持するためにコンピテントである細胞は、本発明の組換細胞と共存培養することができるが、必ずしも同じ界、門、綱、目、科、属又は種の細胞ではない、任意の細胞型であることができる。コンピテント細胞の例は、ベロ（アフリカミドリザル腎）細胞又はCEF（ニワトリ胚線維芽細胞）細胞である。CEF細胞は、EARL Morizeau (8 rue Moulin, 28190 Dangers, 仏国)から入手できるような受精した鶏卵から、任意の他の生産者の受精した鶏卵から、又はMRC5細胞（ATCC CCL171；肺線維芽細胞）から調製することができる。

本発明の別の実施態様によれば、導入工程は不要であり、従って実行されない。このことは、実行が容易であり、常法よりも迅速かつ安価であり、かつ夾雑を伴わない組換え感染性ウイルスの回収が可能である、感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスを作出する方法を提供するための、本発明の利点のひとつである。これは、下記の特徴を有する本発明の組換細胞により実現することができる：
−RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生すること、
−それから感染性組換えウイルスを、望ましくないウイルス及び／又は他の細胞型による夾雑を伴わずに、効率的に回収すること。

本明細書において使用される「感染性組換えウイルスの回収」とは、それにより該細胞により先に作出された感染性ウイルスが、該細胞から放出され、かつ培養された細胞から単離される任意の手段をいう。この回収は、他の細胞型（１又は２以上の）の関与を伴わずに、感染性組換えウイルスが本発明の組換細胞から回収される場合には、「直接」であると称される。対照的に、感染性組換えウイルスが、本発明の組換細胞以外の別の細胞型から回収される場合には、この回収は「間接的」と称される。先に言及したように、本発明は、最初に感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスの直接回収を報告する。

特定の本発明の方法において、組換え工程は、RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生する細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターで組換える工程を含まない。この場合、本発明の組換細胞は、Ｌタンパク質を発現するそれらの能力について選択され、かつ特にRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターで予め組換えられ、このＬタンパク質をコードする核酸は、該細胞ゲノムに組込まれるか又は組込まれない。

適当な場合、アクセサリータンパク質（非−Ｐ、非−Ｌもしくは非−Ｎタンパク質、又は非−RNAポリメラーゼ）を有するベクターが、本発明の方法において任意に使用されてよく、特にこれらのタンパク質を欠失したゲノム又はcDNAクローンが使用される場合である。このようなアクセサリータンパク質は、Ｃタンパク質、Ｖタンパク質、NS1タンパク質、ＮＳ２タンパク質、Ｍタンパク質、M2タンパク質及び／又はSHタンパク質である。これらのアクセサリータンパク質のコード配列を有するベクター（１又は２以上の）は、任意に先に定義されたcDNAフラップを含んでよい。

本発明の組換細胞におけるRNAポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質の産生の安定性は、下記の当該技術分野において先に説明された方法のいくつかの利点につながる：
−本発明の方法は必ずしも導入工程を含まない；
−本方法は、Parksらの論文(1999)に報告されたような熱ショック工程を含まない。実際この工程は、ウイルスのＮ及びＰタンパク質、更にはRNAポリメラーゼの合成の効率を改善することが示されており、このタンパク質は、プラスミド上に有された核酸から合成される。しかし本発明において、本核酸は、細胞ゲノムへ組込まれ、かつこれらのタンパク質の発現は、安定し、及び／又は新たにキャプシド形成を始めるのに適したレベルであることが示されている。
−本方法は、RNAポリメラーゼ、Ｎタンパク質及びＰタンパク質の産生は安定しており、かつプラスミド由来のそれらの発現に左右されないので、大量の感染性ウイルスを生じる。従って10⁶個の組換細胞中の約100〜400個が、組換え後に感染性ウイルスを伝達する（レスキュー事象の数）。これは、Radeckeらの方法(1995)により得られた10⁶個のトランスフェクションされた細胞の中の１〜６個よりも概して優れている。本方法の特定の実施態様によれば、10⁶個の組換細胞に関するレスキュー事象の数は、20個超、50個超、100個超、200個超、300個超、400個超、又は500個超である。

最後に、本発明の別の利点は、組換えることができ、かつ本発明を実行するために使用される多種多様な細胞である。実際本組換細胞は、任意の真核細胞、特に非ヒト細胞又はヒト細胞のいずれかの哺乳類細胞であることができる。特定の実施態様によれば、本発明の組換細胞は、ヒト線維芽細胞、特にMRC5株化細胞（ヒト肺線維芽細胞）である。本発明は特に、分裂しない細胞に有用である。

本発明に従い、RNAウイルスの非分節型マイナス鎖のcDNAクローンは、MVウイルス、特に弱毒化されたウイルス、特定すると弱毒化された非免疫抑制株、例えばワクチンのために承認された株、例えばSchwarz MV株に由来する。cDNAクローンは、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの完全長アンチゲノムをコードするDNA配列である。

本発明の特定の実施態様によれば、Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質に加えcDNAクローンは、同じウイルスに由来し、これは、表Ｉの任意のウイルス、特に先に明らかにされたＭＶウイルス、例えば麻疹ウイルスのSchwarz MV株であることができる。Edmonston B.株及びSchwarz株のヌクレオチド配列は、WO 98/13505に開示されている。非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮ、Ｐ及びＬタンパク質並びにcDNAクローンの性質とは無関係に、RNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼである。特定のcDNA配列は、配列番号18に定義されたようなSchwarz株のcDNAの配列である。このようなcDNAは、T7 RNAポリメラーゼのプロモーターの制御下で、麻疹ウイルス、Schwarzワクチン株の完全配列を含むBluescript由来のプラスミドである、pTM-MVSchwから得ることができる。そのサイズは18967ntである。

あるいは、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのcDNAクローンは、表Ｉの任意のウイルスに由来する。それからcDNAクローンが由来する特定の組換え麻疹ウイルスは、Schwarz株であり、特に承認されたワクチンSchwarz株、例えばAventis Pasteur(仏国)から入手可能な商標Rouvaxで製造されているものである。

「弱毒化された株」とは、本明細書において、同じ宿主において非病原性であるか又は親株よりも病原性が低いが、宿主へ投与した場合に免疫原性及び恐らくはアジュバント活性を維持している株、すなわち免疫優性のＴ及びＢ細胞エピトープ並びに恐らくはＴ細胞共刺激タンパク質又はサイトカインＩＬ−１２の誘導のようなアジュバント活性を保存している株として定義される。特定の実施態様によれば、弱毒化された株は、「認可されたワクチン株」、すなわちワクチン製品の市販承認を交付する国又は地域の保健当局によりワクチン製造における使用が認可された株（法的指定）である。従って「承認されたワクチン株」は、安全で、安定しておりかつ有効な保護（免疫原性及びアジュバント活性）を提供することができることが示されている。株の安定性は、同じ認可された株化細胞上での多くの継代後に、株の特性が、実質的に変化せずに保持されることを評価することにより、測定される。

本明細書において使用される「由来する」とは、そのヌクレオチド配列が、野生型ウイルス又は株のひとつと比べて修飾されている任意のcDNAクローンを意味する。この修飾は、ウイルス又は株のタンパク質のヌクレオチド配列中の及び特にコード配列中の、少なくとも１個の置換、欠失又は挿入であってよい。別の実施態様によれば、ヌクレオチド配列は、少なくとも１個の異種核酸（１又は２以上の）、すなわち少なくとも１個の核酸（１又は２以上の）が挿入されたウイルスもしくは株において天然には存在しない配列の、又は麻疹ウイルスの抗原に由来しない配列の挿入により修飾される。更にｃＤＮＡクローンは、野生型ウイルスゲノムの（１又は２以上の）部分の欠失、又は異種核酸の挿入により修飾されてよい。

好ましい実施態様によれば、１種又は数種の異種核酸からなる、或いはかかる異種核酸を含む、この誘導cDNAクローンは、いわゆる６ルールに合致することが指摘される。従って、この誘導cDNAクローンは、多六量体長、すなわち６の倍数である。この必要要件は、パラミクソウイルス科、特定すると麻疹ウイルスに由来したcDNAクローンについて特に達成される。当業者に公知のように、一部の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、この規則に従わない。

挿入によって感染性組換え非分節型マイナス鎖ウイルスの作出が妨害されない限りは（許容部位）、cDNAクローンのヌクレオチド配列に任意の異種核酸を挿入することができる。特定の実施態様によれば、未変性のウイルスゲノムの挿入又は欠失は、６の倍数であるポリヌクレオチドを提供する。従って、例えゲノム長が６の倍数でなくとも、この修飾は、６又は６の倍数個の欠失及び／又は挿入からなる。

従って、（１又は２以上の）異種核酸配列は、そ（れら）の起源である（１又は２以上の）細菌又は寄生体生物、特に（１又は２以上の）病原性生物、例えばウイルス、特にレトロウイルス、フラビウイルスもしくはコロナウイルスなどに対し、決定された宿主において体液性及び／又は細胞性免疫応答（CTL又はCD4反応など）を誘発することができる１種又は数種のペプチドをコードすることができる。従ってそのようなペプチドのアミノ酸配列は、抗原の少なくとも１種のエピトープ、特に保存されたエピトープを含むものであり、そのエピトープは、天然に抗原上に露出されているか、又は抗原の変異もしくは修飾もしくは組合せの結果として得られるかもしくは露出される。cDNAクローンに挿入することができる異種核酸は、レトロウイルス、例えばヒトレトロウイルス、特にレンチウイルス、特定するとHIV-1もしくはHIV-2、フラビウイルスもしくはコロナウイルスのエンベロープ、例えばエンベロープもしくはキャプシド抗原を含んでなる、特にウイルスの構造抗原（それらの抗原性断片又は該抗原もしくは断片の誘導体を含む）をコードする。特にそのような抗原は、を含むAIDHIV-1又はHIV-2Sウイルスのエンベロープに、HIVのキャプシドに、又は黄熱病ウイルスのエンベロープに、又は西ナイルウイルスのエンベロープに、又はデング熱ウイルス（DV）のエンベロープに、又は日本脳炎ウイルス（JEV）のエンベロープに、又はSARS−関連コロナウイルスのエンベロープに特別に由来する。しかし有利なことにその他のレトロウイルス又はコロナウイルス抗原が、該レトロウイルスもしくはフラビウイルスに対する抗体を誘発することが可能であるか、及び／又はレトロウイルスもしくはフラビウイルスに対する中和抗体の作出を誘発することが可能である組換え麻疹ウイルスを誘導するために使用されてよい。別の実施態様によれば、異種核酸配列によりコードされた又は包囲されたペプチドは、腫瘍抗原又は癌細胞の細胞表面に特異的に発現された抗原である。本発明の別の実施態様に従い、これらの配列は、代わりに又は加えて、レトロウイルス又はフラビウイルスに対する細胞性免疫応答も誘発するマルチエピトープ又は抗原をコードする。

有利なことに、本発明の方法により作出された組換え麻疹ウイルスは、麻疹ウイルスに対する体液性及び／又は細胞性免疫応答も誘発することができる。しかしこの反応は必須ではなく、但し、先に明らかにされたエピトープ又はマルチエピトープもしくは抗原に対する免疫応答が実際に得られることを条件とする。

本発明の好ましい実施態様によれば、異種核酸は、HIVレトロウイルス由来のタンパク質、特にHIVのエンベロープ抗原、及び特別にはHIV-1もしくはHIV-2のエンベロープタンパク質もしくは糖タンパク質由来のペプチドをコードする。これに関して関心対象の抗原は、特別にHIV-1のgp160、gp120及びgp41又はHIV-1のgp140、GAGもしくはTATである。本発明の特定の実施態様によれば、異種アミノ酸配列は、組換えHIV-1のgp160、gp120又はHIV-1のgp140、GAGもしくはTATに由来する。

別の実施態様によれば、gp120（又はgp160）抗原のV1、V2及び／又はV3ループは、保存されたエピトープが得られた組換えgp120抗原上に露出されるような方式で、個別に、又は組合せて、欠失又は一部欠失されている。HIV-1のgp120（又はgp160）抗原のV1、V2及びV3ループは、特に「Fields virology」(Fields B.N.ら、Lippincott Raven publishers 1996, p.1953-1977)に明らかにされている。

別の実施態様によれば、異種核酸は、HIV-1のgp120（又はgp160）抗原に由来しているペプチドをコードしており、ここでgp120（又はgp160）抗原のV1、V2及び／又はV3ループは、保存されたエピトープが得られた組換えgp120（又はgp160）抗原上に露出されるそのような方式で、個別に、又は組合せて、置換又は一部置換されている。

別の実施態様によれば、異種核酸は、HIV-1のエンベロープ抗原に由来するペプチド、特にV1及びV2ループが欠失されかつV3ループが配列AAELDKWASAAにより置換されているような方式でgp120抗原に由来するペプチドをコードする。

別の実施態様によれば、異種核酸は、gp160ΔV3、gp160ΔV1V2、gp160ΔV1V2V3、gp140ΔV3、gp140ΔV1V2、gp140ΔV1V2V3であるペプチドをコードする。

HIV、WNV、YFV、DV又はJEV由来のエピトープを含む好ましいcDNAクローンは、表IIに定義されたベクターであり、これらはCNCM（Collection Nationale de Culture de Microorganismes-Institut Pasteur-パリ、仏国）に寄託され、かつその特徴は以下に示されている。

Ｉ−2883（pMV2（EdB）gp160［Δ］V3HIV89.6P）は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Edmonston株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のATUに挿入されたウイルスSVIH株89.6Pのgp160ΔV3+ELDKWAＳの遺伝子を含んでなる、Bluescript由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、21264ntである。

Ｉ−2884（pMV2（EdB）gp160HIV89.6P）は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Edmonston株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のATUに挿入されたウイルスSVIH株89.6Pのgp160の遺伝子を含んでなる、Bluescript由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、21658ntである。

Ｉ−2885（pMV2（EdB）gp140HIV89.6P）は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Edmonston株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のATUに挿入されたウイルスSVIH株89.6Pのgp140の遺伝子を含んでなる、Bluescript由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、21094ntである。

Ｉ−2886（pMV3（EdB）gp140［Δ］V3HIV89.6P）は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Edmonston株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のATUに挿入されたウイルスSVIH株89.6Pのgp140ΔV3（ELDKWAS）の遺伝子を含んでなる、Bluescript由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、21058ntである。

Ｉ−2887（pMV2（EdB）-NS1YFV17D）は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Edmonston株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のATUに挿入された黄熱病ウイルス（YFV 17D）のNS1遺伝子を含んでなる、Bluescript由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、20163ntである。

Ｉ−2888（pMV2（EdB）-EnvYFV17D）は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Edmonston株Ｂ）の完全配列を含み、かつ２位（麻疹ウイルスのＮ遺伝子とＰ遺伝子の間）のATUに挿入された黄熱病ウイルス（YFV 17D）の遺伝子Envを含んでなる、Bluescript由来のプラスミドである。このプラスミドのサイズは、20505ヌクレオチドである。

Ｉ−3033（pTM-MVSchw2-Es（WNV））は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのｃDNA配列を含み、かつATUに挿入された、西ナイルウイルス（WNV）の分泌型エンベロープ（Ｅ）の遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−3034（pTM-MVSchw2-GFPbis）は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列を含み、かつATUに挿入された、GFPの遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−3035（pTM-MVSchw2-p17p24［Δ］myr（HIVB））は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列を含み、かつＡＴＵに挿入された、HIVBウイルスのp17p24Δmyrタンパク質をコードする遺伝子であるgag遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−3036（pTMVSchw3-Tat（HIV89-6p））は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列を含み、かつATUに挿入された、ウイルス株89.6Pの遺伝子であるTat遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−3037（pTM-MVSchw3-GFP）は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列を含み、かつ１個のヌクレオチドの欠失を有する、ATUに挿入された遺伝子であるGFP遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−3038（pTM-MVSchw2-Es）（YFV）は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列を含み、かつATUに挿入された熱病ウイルス（YFV）の分泌型タンパク質の遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−3054（pTM-MVSchw2-gp140［Δ］V1 V2 V3 （HIV89-6））は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムcDNA配列を含み、かつATUに挿入されたgp140［Δ］V1V2 (HIV 89-6）をコードする遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−3055（pTM-MVSchw2-gp140［Δ］V3 （HIV89-6））は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列を含み、かつＡＴＵに挿入されたgp14［Δ］V3（HIV 89-6）をコードする遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−3056（pTM-MVSchw2-gp160［Δ］V1 V2 V3 （HIV89-6））は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列を含み、かつATUに挿入されたgp160[Δ]V1 V2 V3 （HIV89-6）をコードする遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−3057（pTM-MVSchw2-gp160［Δ］V1 V2 （HIV89-6））は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列を含み、かつATUに挿入されたgp160［Δ］V1 V2 （HIV89-6）をコードする遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−3058（pTM-MVSchw2-Gag SIV239 p17-p24［Δ］myr-3-gp140 （HIV89-6））は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下に麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列を含み、かつATUに挿入されたGag SIV239 p17-p24[Δ]myr-3-gp140 (ＨＩＶ８９−６）をコードする遺伝子を発現している、Bluescript由来のプラスミドである。

Ｉ−３440（pTM-MvSchw2-[EDIII+M^1-40］ WNV （IS-98-ST1））は、麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列及びＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に位置した追加の発現ユニットを含み、かつこのユニットは、膜タンパク質Ｍの配列1-40に融合された西ナイルウイルス（WNV）（WNV IS-98-ST1）のエンベロープタンパク質由来のドメインIIIのヌクレオチド配列を含んでなる、PTM由来のプラスミドである。

Ｉ−3442（pTM-MvSchw2-[EDIII+ApoptoM］ DV1 （FGA89））は、麻疹ウイルス（Schwarz株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列及びＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に位置した追加の発現ユニットを含み、かつこのユニットは、膜タンパク質Ｍのアポトーシス配列に融合されたデング−１ウイルス（FGA89株）のエンベロープタンパク質由来のドメインIIIのヌクレオチド配列を含んでなる、PTM由来のプラスミドである。

Ｉ−3441（pTM-MvSchw2-[EDIII] JEV （Nakayama））は、麻疹ウイルス（Ｓｃｈｗａｒｚ株）の完全感染性ゲノムのcDNA配列及びＰ遺伝子とＭ遺伝子の間に位置した追加の発現ユニットを含み、かつこのユニットは、日本脳炎ウイルス（JEV）Nakayama株のエンベロープタンパク質由来のドメインIIIのヌクレオチド配列を含んでなる、PTM由来のプラスミドである。

特定の実施態様によれば、本異種核酸は、エンベロープ（Env）、NS1タンパク質又はそれらの免疫原性変異体から選択された、黄熱病ウイルスの抗原に由来するペプチドをコードする。本発明の組換え麻疹ウイルスベクター内に存在する異種DNA配列が黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）に由来する場合、これは好都合なことにAventis Pasteurにより商標Stamaril（登録商標）で市販されているYFV 17D 204の中から選択される。

別の特定の実施態様によれば、本異種核酸は、エンベロープ（Ｅ）、プレ膜（preM）又はそれらの免疫原性変異体から選択された、西ナイルウイルスの抗原に由来するペプチドをコードする。本発明の組換え麻疹ウイルスベクター内に存在する異種DNA配列が西ナイルウイルス（WNV）に由来する場合、これは好都合なことに神経毒株IS 98-ST1の中から選択される。

本異種核酸は、腫瘍特異抗原（TSA）又は腫瘍関連抗原（TAA）をコードするものでもよい。

本発明の別の利点は、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのcDNAクローン、長い異種核酸又は多数の異種核酸を挿入する可能性である。従って、本cDNAクローンは、その総配列は少なくとも５kbである異種核酸の１種又は複数の挿入により修飾されてよい。

本発明は、本開示に従い、本明細書において言及された寄託されたプラスミド中に挿入されたポリヌクレオチドに含まれた各々及び任意のヌクレオチド断片に、特に挿入をデザインするのに適した各々及び任意の領域に関する。これは、本発明のプラスミドの構築のためのこれらの断片の使用にも関する。

本発明は、RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体のタンパク質の３種又は少なくとも３種を安定して発現する組換細胞を作出する方法にも関し、これは：
ａ．細胞を、少なくとも：
−DNAフラップ、及びRNAポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる、発現ベクター、
−DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる、発現ベクター、
−DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる、発現ベクター
で組換える工程：並びに
ｂ．少なくともRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞を選択する工程：
もしくは
ａ．細胞を、少なくとも：
−プロモーターの制御下で、RNAポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピー、
−プロモーターの制御下で、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、
−プロモーターの制御下で、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、及び
−DNAフラップ
を含む発現ベクターで組換える工程：並びに
ｂ．少なくともRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞を選択する工程：
のいずれか含んでなるか、或いはこれらからなる。

本発明の特定の実施態様によれば、組換細胞を作出する本方法は、前記方法の工程ａにおいて得られた組換細胞を、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）又はそれらの機能誘導体をコードする核酸を含む発現ベクターにより組換える工程、並びに少なくともRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生し、かつ非分節型マイナス鎖RNAウイルスのラージタンパク質（Ｌ）又はそれらの機能誘導体を産生する細胞を選択する工程を更に含む。

本発明は、ヘルパー細胞としての、特に感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスの作出におけるヘルパー細胞としての、本明細書に説明されたような、本発明の組換細胞の使用にも関する。

既定の本発明の更なる実施態様及び特徴は、以下の実施例及び図面から明らかである。

本発明を更に以下の実施例により説明するが、これは「特許請求の範囲」に説明された本発明の範囲を限定するものではない。

細胞及びウイルス
ベロ（アフリカミドリザル腎）細胞を、５％ウシ胎仔血清（FCS）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）において、単層として増殖した。ヒト腎293（HEK-293）細胞は、10％FCSを補充したDMEMにおいて増殖した。ヒト二倍体MRC5細胞は、10％FCSを補充したDMEMにおいて、単層として増殖した。トリ胚線維芽細胞（CEF）を、以下のように調製した：受精した鶏卵(Morizeau、Dangers, 仏国)を、38℃で９日間インキュベーションした。胚を、無菌条件下で収集した。頭部、四肢及び内臓を除去し、胚を細断し、次に５〜10分間、37℃でトリプシン処理した（トリプシン／EDTA 2.5g／L）。濾過（70μm）及びDMEM高グルコース／10％FCS中で数回の洗浄後、細胞を播種し（５〜７×10⁶個細胞／ペトリ皿）、37℃で一晩インキュベーションし、その後ウイルス感染に使用した。

プラスミド構築
Gateway（登録商標）組換えシステム(Invitrogen)を使用する追加配列の容易な組換えを可能にするために、Gateway（登録商標）カセット(attb1/attb2 Seq)を、ＳｍａＩ消化により直線としたHIV-1-TRIP-ΔU3-BSXプラスミドベクター(Zennouら、2000)へライゲーションすることにより導入した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、PfuTurbo DNAポリメラーゼ(Stratagene)及びGateway（登録商標）組換え配列（下線）を含む下記プライマーを使用するPCRにより、pAR-1173プラスミド(Brookhaven National Laboratory, ref)から増幅した。

AttB1-T7Pol : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGGAATTCTCTGACATCGAACTGGCT-3'
AttB2-retourT7Pol : 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCACGCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3'

T7 RNAポリメラーゼの核型（nlsT7）も、核局在化シグナル（太字）及びGateway（登録商標）組換え配列（下線）を含む下記プライマーを使用し、pAR-3288プラスミド(Brookhaven National Laboratory, ref)から増幅した。

AttBl-SV40nls : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGGCACCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3'
AttB2-retourT7Pol: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCACGCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3'

同じ方法を使用し、Schwarz MVのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を、完全長感染性Schwarz MVアンチゲノムを含むpTM-MVSchwプラスミドから、PCRにより増幅した(Combredetら、2003)。Gateway（登録商標）組換え配列(下線)を含む下記プライマーを使用した。

AttB1-N : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCCACACTTTTAAGGAGCTTAGCA-3'
AttB2-N : 5'-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTGTACTAGTCTAGAAGATTTCTGTCATTGTA-3'
AttB1-P : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCAGAAGAGCAGGCACGCCAT-3'
AttB2-P: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACTACTTCATTATTATCTTCATCAGCATCTGGTGGA-3'

次にT7 RNAポリメラーゼ、nlsT7 RNAポリメラーゼ並びにMV Ｎ及びＰタンパク質をコードする様々なPCR断片を、pDONR（商標）207エントリープラスミド(Invitrogen)へ導入し、かつGateway（登録商標）組換えシステム(Invitrogen)を使用し、修飾されたHIV-1-TRIP-ΔU3-BSXプラスミドで組換えた。得られた様々な組換えベクタープラスミド（HIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT７、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N及びHIV-1-TRIPΔU3.CMV-P）を、完全に配列決定した。これらのベクターは、2006年12月14日にCNCMへ、それぞれ、寄託番号Ｉ−3702、I-3703、Ｉ−3700及びＩ−3701で寄託した。

Schwarz MV由来のラージポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質を発現しているプラスミドpEMC-LSchwを、Radeckeらの論文(1995)に説明されたものと同様の様式で構築した。Schwarz L遺伝子の6552ヌクレオチド長の配列を、pTM-MVSchwプラスミドから得(Combredetら、2003)、Radeckeらの論文(1995)において先に説明されたpEMC-La プラスミドに、古典的クローニング手順を用い挿入した。このプラスミドは、2007年12月18日にCNCMへ、寄託番号Ｉ−3881で寄託した。

ベクター粒子の作出
ベクター粒子は、Zennouらの論文(2000)に説明されたような、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7、HIV-1-TRIPΔU3.CMV-N、又はHIV-1-TRIPΔU3.CMV-Pベクタープラスミド、HIV-1 gag及びpol遺伝子を発現しているキャプシド形成プラスミド、並びにVSV-Gエンベロープ糖タンパク質を発現しているプラスミド（pHCMV-G）のいずれかによる、リン酸カルシウム法を用いる、HEK-293細胞の同時トランスフェクションにより作出した。超遠心により濃縮されたベクター粒子ストック中のGag p24抗原の量は、HIV-1 p24 ELISA(Perkin Elmer LifeSciences)を用いて決定した。

株化細胞293-T7-MVの作製
細胞（HEK-293）は、TRIP-T7及びTRIP-nlsT7レンチウイルスベクターによる形質導入の１日前に、35mmウェルに播種した。ベクター（500ng/ml p24）を、10％FCSを補充したDMEMに添加した。８日間、毎日細胞に同量のベクターを、繰り返し添加した。細胞を、２日おきに拡大した。各継代後に、細胞のT7 RNAポリメラーゼ活性を決定した。35mm細胞培養物を、リン酸カルシウム法を用い、pEMC-Luc 5μgでトランスフェクションし、トランスフェクション後１日目に収集した透明化された細胞溶解液の１／20中のルシフェラーゼ活性を、ルミノメーターで測定した。ルシフェラーゼ活性は、追加の形質導入の度に増大し、かつ７回目と８回目の形質導入の間は最大に留まった。T7 RNAポリメラーゼ発現の細胞傷害性の非存在は、トリパンブルー排除法を用いる細胞生存度の定量及び非形質導入細胞との比較により、各形質導入後、明らかになった。８工程の形質導入の後、細胞質型（293-T7）又は核型（293-nlsT7）のいずれかの、非常に高いT7 RNAポリメラーゼ活性を伴うふたつの細胞集団を作出した。

その後これらふたつの細胞集団（293-T7及び293-nlsT7）を、TRIP-N及びTRIP-Pベクターにより同時に共形質導入した。ベクター（TRIP N:390ng/ml p24及びTRIP P:330ng/ml p24）を、35mmウェル中に播種した細胞に添加した。10日間の間に、同量の両方のベクターを、毎日細胞に繰り返し添加した。細胞を、２日おきに拡大した。１０回形質導入した後、ＭＶのＮ及びＰタンパク質の発現を、３５ｍｍウェルの総溶解液の１／20を使用するウェスタンブロットにより、全細胞集団について分析した。両タンパク質の発現は、感染したベロ細胞の類似数のものと同等であった（図２）。次に形質導入した細胞を、限定希釈によりクローニングした。細胞を、96−ウェルプレートに、１／３細胞／ウェルの希釈で播種した。２週間後、最初のクローンを選択した。293-T7-NP及び293-nlsT7-NP細胞の各々約100クローンを、24−ウェルプレートに、その後35mmウェルに拡大した。MVのＮ及びＰタンパク質の発現を、20クローンについて、35mmウェルの総溶解液の１／20を使用するウェスタンブロットにより分析した。両タンパク質の発現は、感染したベロ細胞の類似数のものと同等であった（図２）。T7 RNAポリメラーゼ活性を、先に説明したように、各クローンについて測定した。非常に高いルシフェラーゼ活性並びに同等レベルのMV Ｎ及びＰ発現を伴う多くのクローンを選択した。以下に列記したクローンを、増幅し、かつDMEM/30％FCS/10％DMSO中で−180℃で、10⁷個細胞／ｍｌの密度で凍結した：293-T7-NP1、293-T7-NP3、293-T7-NP5、293-T7-NP7、293-T7-NP8、293-T7-NP10、293-T7-NP13、293-T7-NP14、293-T7-NP20、293-T7-NP28、293-T7-NP31、293-T7-NP33、293-nlsT7-NP1、293-nlsT7-NP5、293-nlsT7-NP6、293-nlsT7-NP13、293-nlsT7-NP14、293-nlsT7-NP15、293-nlsT7-NP30及び293-nlsT7-NP40。

293-T7-NP及び293-nlsT7-NPヘルパー細胞を使用するSchwarz MVのレスキュー
作出された異なるヘルパー293-T7-NP及び293-nlsT7-NP細胞クローンのcDNA由来のMVを効率的にレスキューする能力を評価するために、本発明者らは、プラスミドpTM-MVSchw-eGFP（Combredetら、2003)を使用し、緑色蛍光タンパク質（eGFP）を発現している組換えSchwarz MVをレスキューした。本発明者らは、先に説明されたものと同様のシステムを使用した(Radeckeら、1995；Parksら、1999；Combredetら、2003)。ヘルパー細胞293-T7-NP又は293-nlsT7-NPは、pTM-MVSchw-eGFP（５μg）及びSchwarz MVポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子を発現しているプラスミドpEMC-LSchw（20〜１00ng）による、リン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションした。37℃で一晩インキュベーションした後、トランスフェクション培地を、新鮮な培地と交換し、細胞を43℃で３時間熱ショック処理し、その後37℃（22）に戻した。37℃で２日間インキュベーションした後、トランスフェクションされた細胞を、単層のベロ、CEF又はMRC5細胞上に移し、CEFに関して32℃でインキュベーションした以外は、10cmの皿において37℃でインキュベーションした。蛍光細胞が、ベロ、CEF又はMRC5細胞上での２〜３日の共培養後、直ちに出現した。感染した細胞は、増殖巣において(in focuses)迅速に拡大した。本組換えウイルスは、ベロ細胞において高度にシンシチウムであり、かつCEF及びMRC5細胞において非シンシチウムであった。単独のシンシチウム又は感染性増殖巣は、ベロ、CEF又はMRC5細胞の35mmウェルに移し、その後新鮮な細胞を添加することにより、より大きい皿へ拡大した。感染細胞を掻き取り、細胞及び培地を凍結−融解し、遠心分離し、細胞デブリを除去することにより、ウイルスを、感染の５日後にCEF又はMRC5細胞から、及びシンシチウムが培養物の80〜90％に関与した時（通常２日後）にベロ細胞から収穫した。このようなウイルス作出は、TCID₅₀力価決定法を用いて、力価決定した。簡単に述べると、ベロ細胞を、96−ウェルプレート（7500個細胞／ウェル）に播種し、かつDMEM／５％FCS中のウイルス試料の連続１：10希釈により感染した。37℃で７日間インキュベーションした後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、かつ試験単位の50％感染を生じたウイルス希釈物を決定した。組織培養感染量（TCID₅₀）として説明される50％エンドポイントは、Karber法（３）により計算した。ベロ細胞上でレスキュー及び増殖された組換えウイルスは、力価10⁷〜l0⁸ TCID₅₀/mlを有し、CEF又はMRC5細胞上でレスキュー及び増殖されたウイルスは、より低い力価10⁴〜10⁶ TCID₅₀/mlを有した。

本発明は、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下でT7 RNAポリメラーゼ並びに麻疹Schwarz Ｎ及びＰタンパク質を発現している、組換えベクター、特にヒト免疫不全ウイルス（HIV）−TRIPレンチウイルスベクターを構築及び作出する技術を提供する。これらのベクターを使用し、ほぼ全ての細胞、特にヒトもしくは哺乳類の細胞で、高レベルでインビトロにおいて効率的に形質導入することができる。このような細胞は、完全長感染性ウイルスアンチゲノムcDNAによるか又は先に説明された修飾されたcDNAクローンによるトランスフェクション後に、新規の組換え麻疹ウイルスを作出することができる、ヘルパー細胞／トランスに相補する細胞として使用することができる。

本発明は、ワクシニアウイルスなどの他のヘルパーウイルスの夾雑を伴うことなく、任意に修飾されたcDNAから、麻疹ウイルスなどの任意の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスをレスキューすることを可能にする。レンチウイルスベクターの高い形質導入効率のために、本方法は、ヘルパータンパク質を非常に高いレベルで発現する細胞の作出を可能にする。外来DNAの染色体DNAへのレトロウイルス−ベースの組換え、特にレンチウイルス−ベースの組換えは、不正なプラスミド−ベースの組換えと比較して真であるので、この方法により作出されたヘルパー細胞は、非常に安定しており、かつ非分節型マイナス鎖RNAウイルスをcDNAからレスキューするそれらの高い効率は、複数回の連続継代後に維持される。

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Claims

少なくともRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞。
安定した産生が、薬物選択の結果でない、請求項１記載の細胞。
そのゲノム内に組み込まれた、
ａ．（１又は２以上の）転写調節エレメントの制御下でＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピー、
ｂ．（１又は２以上の）転写調節エレメントの制御下で非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、及び
ｃ．（１又は２以上の）転写調節エレメントの制御下で非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー
を含んでなる、請求項１又は２記載の細胞。
そのゲノムに組み込まれたDNAフラップの少なくとも１種のコピーを更に含んでなり、少なくとも１種のDNAフラップが、（１又は２以上の）核酸と機能的に会合されている、請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞。
ａ．DNAフラップ、及びRNAポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、
ｂ．DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター、並びに
ｃ．DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクター：
によるそのゲノムの組換えにより入手可能な細胞。
そのゲノムを
ａ．RNAポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピー、
ｂ．非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、
ｃ．非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、及び
ｄ．DNAフラップ
を含んでなる発現ベクターで組み換えて得られる細胞。
非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮ及びＰタンパク質が、同じウイルスに由来する、請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞。
Ｎ及びＰタンパク質が、同じウイルス株又は異なるウイルス株に由来する、請求項７記載の細胞。
非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮ及びＰタンパク質が、異なる分節型マイナス鎖RNAウイルスに由来する、請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞。
非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮ及びＰタンパク質が、弱毒化MVウイルス、特にSchwarz MV株に由来する、請求項８記載の細胞。
RNAポリメラーゼが、T7ファージRNAポリメラーゼ又はその核型（nlsT7）である、請求項１〜10のいずれか１項記載の細胞。
DNAフラップが、レトロウイルスに由来する、請求項１〜11のいずれか１項記載の細胞。
DNAフラップが、レンチウイルス、特にヒトレンチウイルスに由来する、請求項12記載の細胞。
DNAフラップが、HIV、CAEV、EIAV、VISNA、SIV又はFIVウイルスに由来する、請求項13記載の細胞。
DNAフラップが、HIV-1又はHIV-2に由来する、請求項14記載の細胞。
前記（１又は２以上の）ベクターが、LTRの一方は任意にＵ３部分が欠失されている２個のLTR、並びに発現エレメント及び転写調節エレメントを含んでなる、HIV由来の（１又は２以上の）導入遺伝子ベクターである、請求項５〜15のいずれか１項記載の細胞。
ベクターが：
ａ．2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3702により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7、又は2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3703により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7、
ｂ．2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3700により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-N、並びに
ｃ．2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3701により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-P：
である、請求項５又は請求項７〜16のいずれか１項記載の細胞。
真核細胞である、請求項１〜17のいずれか１項記載の細胞。
哺乳類細胞である、請求項18記載の細胞。
ヒト細胞である、請求項19記載の細胞。
分裂能できる、請求項１〜20のいずれか１項記載の細胞。
HEK293（ヒト胎児腎）細胞である、請求項１〜21のいずれか１項記載の細胞。
2006年6月14日にCNCMに寄託番号Ｉ-3618により寄託された293-T7-NP株化細胞である、請求項22記載の細胞。
2006年8月4日にCNCMに寄託番号Ｉ-3662により寄託された293-nlsT7-NP MV株化細胞である、請求項22記載の細胞。
分裂できない、請求項１〜20のいずれか１項記載の細胞。
任意に転写調節エレメントの制御下で、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）又はそれらの機能誘導体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１種のコピーを、そのゲノム内に組込まれて含んでなる、請求項３記載の細胞。
2007年12月18日にCNCMに寄託番号Ｉ−３881により寄託されたpEMC-LSchwプラスミドのような、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含む発現ベクターにより更に組換えられた、請求項１〜25のいずれか１項記載の細胞。
発現ベクターが、DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる発現ベクターである、請求項27記載の細胞。
非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮ、Ｐ及びＬタンパク質が、同じウイルスに由来する、請求項26〜28のいずれか１項記載の細胞。
Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質が、同じウイルス株又は異なるウイルス株に由来する、請求項29記載の細胞。
非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮ、Ｐ及びＬタンパク質が、異なる非分節型マイナス鎖RNAウイルスに由来する、請求項26〜28のいずれか１項記載の細胞。
非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質が、MVウイルス、特にSchwarz MV株に由来する、請求項26〜31のいずれか１項記載の細胞。
非分節型マイナス鎖RNAウイルスの完全長アンチゲノムをコードするcDNAクローンにより更に組換えられる、請求項１〜32のいずれか１項記載の細胞。
前記非分節型マイナス鎖cDNAクローンの配列が、（１又は２以上の）異種核酸の（１又は２以上の）許容部位での挿入により修飾される、請求項33記載の細胞。
請求項１〜34のいずれか１項記載の細胞で構成される、細胞培養物。
初代培養である、請求項35記載の細胞培養物。
株化細胞である、請求項35記載の細胞培養物。
DNAフラップ及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのレスキューに必要なタンパク質をコードする核酸を少なくとも１種含んでなる、特にプラスミドである、発現レトロウイルス由来ベクター。
前記核酸が、RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項38記載の発現レトロウイルス由来ベクター。
FIV-又はSIV由来ベクターである、請求項38又は39記載の発現レトロウイルス由来ベクター。
HIV由来ベクター等のヒトレンチウイルスである、請求項38又は39記載の発現レトロウイルス由来ベクター。
HIV-1又はHIV-2由来ベクターである、請求項41記載の発現レトロウイルス由来ベクター。
2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3702により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-T7等の、DNAフラップ、及びRNAポリメラーゼの核型をコードする核酸を含んでなる、請求項38〜42のいずれか１項記載の発現レトロウイルス由来ベクター。
2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3703により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-nlsT7等の、DNAフラップ、及びRNAポリメラーゼをコードする核酸を含んでなる、請求項38〜42のいずれか１項記載の発現レトロウイルス由来ベクター。
2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ-3700により寄託されたHIV-1-TRIPΔU3.CMV-N等の、DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸を含んでなる、請求項38〜42のいずれか１項記載の発現レトロウイルス由来ベクター。
2006年12月14日にCNCMに寄託番号Ｉ−3701により寄託されたプラスミドHIV-1-TRIPΔU3.CMV-Ｐ等の、DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸を含んでなる、請求項38〜42のいずれか１項記載の発現レトロウイルス由来ベクター。
DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質をコードする核酸を含んでなる、請求項38〜42のいずれか１項記載の発現レトロウイルス由来ベクター。
DNAフラップ、並びにRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質及び任意に非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質をコードする（１又は２以上の）核酸を含んでなる、請求項38〜42のいずれか１項記載の発現レトロウイルス由来ベクター。
2007年12月18日にCNCMに寄託番号Ｉ-3881により寄託されたプラスミドpEMC-LSchwである、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＬタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター。
前記核酸が、プロモーター、例えばCMＶプロモーター等の（１又は２以上の）転写調節エレメントの制御下にある、請求項38〜49のいずれか１項記載の発現ベクター。
感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスを作出する方法であって、
ａ．RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生する細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖cDNAクローンにより、及び非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターにより組換える工程、
ｂ．非分節型マイナス鎖RNAウイルスの複製及び作出を維持するのにコンピテントな細胞上に、該組換細胞又は組換細胞培養物を移送する工程、並びに
ｃ．工程ｂの共培養物から、感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを回収する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。
感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作出する方法であって、
ａ．請求項１〜25のいずれか１項記載の細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖ｃDNAクローンにより、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含む発現ベクターにより組換える工程、
ｂ．非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの複製及び作出を維持するのにコンピテントな細胞上に、該組換細胞又は組換細胞培養物を移送する工程、並びに
ｃ．工程ｂの共培養物から、感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスを回収する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。
感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作出する方法であって、
ａ．請求項26〜32のいずれか１項記載の細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖cDNAクローンにより組換える工程、
ｂ．非分節型マイナス鎖RNAウイルスの複製及び作出を維持するのにコンピテントな細胞に、該組換細胞又は組換細胞培養物を導入する工程、並びに
ｃ．工程ｂの共培養物から、感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスを回収する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。
前記細胞培養物が、2006年6月14日にCNCMに寄託番号Ｉ-3618により寄託された293-T7-NP株化細胞、又は2006年8月4日にCNCMに寄託番号Ｉ-3662により寄託された293-nlsT7-NP MV株化細胞である、請求項51〜53のいずれか１項記載の方法。
前記工程ｂ．のコンピテント細胞が、ベロ（アフリカミドリザル腎）細胞、ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）細胞又はMRC5細胞である、請求項51〜54のいずれか１項記載の方法。
感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスを作出する方法であって、
ａ．RNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのポリメラーゼ補助因子リン酸化タンパク質（Ｐ）を安定して産生する細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの非分節型マイナス鎖cDNAクローンにより、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターにより組換える工程、並びに
ｂ．該組換細胞又は組換細胞培養物から、感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを回収する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。
感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを作出する方法であって、
ａ．請求項１〜25のいずれか１項記載の細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの非分節型マイナス鎖cDNAクローンにより、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）をコードする核酸を含むベクターにより組換える工程、並びに
ｂ．該組換細胞又は組換細胞培養物から、感染性組換え非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを回収する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。
感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスを作出する方法であって、
ａ．請求項26〜32のいずれか１項記載の細胞又は細胞培養物を、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの非分節型マイナス鎖cDNAクローンにより組換える工程、並びに
ｂ．該組換細胞又は組換細胞培養物から、感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスを回収する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。
前記細胞又は細胞培養物が、真核細胞培養物、特に哺乳類細胞培養物又はヒト細胞培養物である、請求項56〜58のいずれか１項記載の方法。
前記細胞培養物が、ヒト線維芽細胞、特にMRC5株化細胞（ヒト肺線維芽細胞）である、請求項59記載の方法。
前記非分節型マイナス鎖RNAウイルスの非分節型マイナス鎖cDNAクローンのヌクレオチド配列が、許容部位で、少なくとも１種の異種核酸の挿入により修飾されている、請求項51〜60のいずれか１項記載の方法。
前記異種核酸が、エピトープ又はポリエピトープをコードする、請求項51〜61のいずれか１項記載の方法。
前記非分節型マイナス鎖RNAウイルスの修飾された非分節型マイナス鎖cDNAクローンが、弱毒化ＭＶウイルス、特にMV Schwarz株に由来する、請求項51〜62のいずれか１項記載の方法。
請求項１〜２５のいずれか１項記載の組換細胞を作出する方法であって、
ａ．細胞を、少なくとも：
−DNAフラップ、及びRNAポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる、発現ベクター、
−DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる、発現ベクター、並びに
−DNAフラップ、及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピーを含んでなる、発現ベクター
により組換える工程：並びに
ｂ．少なくともRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞を選択する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。
請求項１〜25のいずれか１項記載の組換細胞を作出する方法であって、
ａ．細胞を、少なくとも：
−プロモーターの制御下で、RNAポリメラーゼをコードする核酸の少なくとも１種のコピー、
−プロモーターの制御下で、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＮタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、
−プロモーターの制御下で、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのＰタンパク質をコードする核酸の少なくとも１種のコピー、及び
−DNAフラップ
を含む発現ベクターにより組換える工程：並びに
ｂ．少なくともRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生する細胞を選択する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。
請求項26〜32のいずれか１項記載の組換細胞を作出する方法であって、
ａ．請求項64又は65記載の方法により、組換細胞を提供する工程、
ｂ．工程ａにおいて得られた組換細胞を、非分節型マイナス鎖RNAウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質（Ｌ）又はそれらの機能誘導体をコードする核酸を含む発現ベクターにより、更に組換える工程、並びに
ｃ．少なくともRNAポリメラーゼ、非分節型マイナス鎖RNAウイルスの核タンパク質（Ｎ）及び非分節型マイナス鎖RNAウイルスのリン酸化タンパク質（Ｐ）、又はそれらの機能誘導体を安定して産生し、かつ非分節型マイナス鎖RNAウイルスのラージタンパク質（Ｌ）又はそれらの機能誘導体を産生する細胞を選択する工程を含んでなる、或いはこれらの工程からなる方法。
ヘルパー株化細胞としての、請求項１〜34のいずれか１項記載の細胞の使用。
感染性組換え非分節型マイナス鎖RNAウイルスを作出するための、請求項１〜34のいずれか１項記載の細胞の使用。