BRPI0719469B1

BRPI0719469B1 - Vetores de expressão derivados de retrovírus e métodos para produzir um vírus infeccioso de sarampo

Info

Publication number: BRPI0719469B1
Application number: BRPI0719469-2A
Authority: BR
Inventors: Frédéric Tangy; Pierre Charneau; Yves Jacob
Original assignee: Institut Pasteur; Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date: 2006-12-22
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2019-07-02
Also published as: EP1939214B1; WO2008078198A2; ES2423518T3; KR101469007B1; ES2686168T3; JP2010512779A; US9499799B2; CN101631798A; EP2091962A2; WO2008078198A3; DK2091962T3; BRPI0719469C1; DK1939214T3; JP5902371B2; US20140051148A1; MX2009006755A; EP1939214A1; BRPI0719469A2; JP2015015955A; KR20090103922A

Abstract

vetores de expressão derivados de retrovírus e métodos para produzir um vírus infeccioso de sarampo a presente invenção refere-se a células recombinantes, bem como a métodos para a geração de um vírus de rna de fita simples, sentido negativo, não segmentado (nnv ou mononegavirales), a partir de ácido desoxirribonucléico clonado (cdna), em particular, a partir de vírus do sarampo e, de preferência, a partir de linhagens atenuadas, tais como as linhagens aprovadas para vacinação, particularmente, a partir de vírus do sarampo schwarz atenuado e vários vírus com base em schwarz de sarampo recombinante que expressa seqüências heterólogas. os mencionados vírus recuperados podem ser utilizados, após amplificação, como vacina para imunização contra sarampo e/ou contra os peptídeos ou proteínas heterólogos expressados.

Description

“VETORES DE EXPRESSÃO DERIVADOS DE RETROVÍRUS E MÉTODOS PARA PRODUZIR UM VÍRUS INFECCIOSO DE SARAMPO”

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a células recombinantes, e a métodos para gerar vírus de RNA de fita simples de sentido negativo, não segmentado (NNV ou mononegavirales), a partir de ácido desoxirribonucléico clonado (cDNA), particularmente a partir de vírus do sarampo (measles) e, em particular, a partir de linhagens atenuadas, tais como aquelas aprovadas para vacinação, mais particularmente, a partir de vírus de sarampo Schwarz atenuado, e vários vírus com base em sarampo Schwarz recombinantes que expressam seqüências heterólogas. Tais vírus obtidos podem ser utilizados, após amplificação, como vacinas para imunização contra sarampo e/ou contra os peptídeos heterólogos ou proteínas expressas.

Antecedentes da Invenção [002] Os vírus de RNA atenuado vivo produzem vacinas muito eficientes. Entre elas, a vacina contra sarampo tem sido utilizada em centenas de milhares de crianças e provou-se ser eficaz e segura. Esta vacina induz a imunidade por longa vida após uma ou duas injeções. É facilmente produzida em larga escala e a baixos custos em muitos países. As mencionadas vantagens fazem do vírus do sarampo, especialmente linhagens de vacinas atenuadas, um bom vetor candidato a imunizar crianças, e mesmo adultos em algumas circunstâncias, tanto contra sarampo quanto contra outras patologias infecciosas, especialmente patologias virais, tais como AIDS (retrovírus), e doenças de flavivírus ou coronavírus (SARS).

[003] Vírus de sarampo atenuado vivo tem sido utilizado como vacina desde 1960 e é uma das vacinas humanas mais seguras e eficazes. As campanhas de vacinação têm sido muito eficazes no controle de sarampo

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2/63 em países desenvolvidos. Entretanto, devido à inadequada distribuição da vacina em países em desenvolvimento, o sarampo ainda infecta aproximadamente 45 milhões de indivíduos e é responsável pela morte de 700.000 crianças por ano. A organização mundial de saúde (WHO) tem, portanto, desenvolvido seu programa de vacinação global para os próximos 10 a 20 anos (C.D.C., 2005). Tomando vantagem das campanhas da organização mundial de saúde (WHO), o uso de vetores de vacina derivados de vacina de sarampo permitiria, em certas regiões do mundo, a imunização simultânea de crianças contra sarampo e outras doenças infecciosas com novas vacinas pediátricas multivalentes, particularmente bivalentes, que são tanto seguras quanto eficazes.

[004] O vírus do sarampo (MV) pertence ao gênero Morbillivirus na família Paramyxoviridae. Ele é um vírus que apresenta envelope, com um genoma de RNA não-segmentado de polaridade negativa (15.894 bp). O sarampo pode apenas ser contraído uma vez, já que o sistema imune desenvolve uma resposta específica forte e estabelece uma memória de longa vida, protegendo contra uma nova infecção. A mencionada proteção é baseada tanto na produção de anticorpos quanto na produção de linfócitos T CD8⁺ citotóxicos de memória (CTL). Linhagens patogênicas quebram fortemente a hematopoiese (Arnebom et al., 1983; Kim et al., 2002; Okada et al., 2000), resultando, assim, em imunosupressão transitória responsável pela maioria das mortes por infecção de sarampo em países em desenvolvimento. Ao contrário das linhagens primárias, linhagens atenuadas não induzem a imunosupressão (Okada et al., 2001).

[005] A linhagem de Edmonston de vírus do sarampo foi isolada em 1954 por cultura em células humanas primárias (Enders et al., 1954). A adaptação para fibroblastos embrionários de frango produziu origens de vacina que foram adicionalmente atenuadas por passagens subseqüentes

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3/63 em fibroblastos embrionários de frango (Schwarz et al., 1962). As linhagens de Schwarz e Moraten que possuem seqüência nucleotídicas idênticas (Parks et al., 2001a; Parks et al., 2001 b) constituem a vacina de sarampo mais freqüentemente utilizada. A vacinação com uma ou duas injeções induz a imunidade de longa vida (Griffin et al., 2001; Hilleman et al., 2002). A persistência de células CD8 e anticorpos tem sido demonstrada mesmo 25 anos após a vacinação (Ovsyannikova et al., 2003). A vacina de sarampo é facilmente produzida em larga escala na maioria dos países e pode ser disponível a baixo custo. A atenuação do genoma viral resulta de uma combinação vantajosa de mutações múltiplas. Desta forma, a vacina é muito estável e até hoje nunca foi observado reversão das linhagens de vacina (Hilleman et al., 2002). Além disso, o vírus se replica apenas no citoplasma, eliminando qualquer risco de integração nos cromossomos do genoma hospedeiro. Estas características fazem da vacina de sarampo atenuada viva um excelente candidato para o desenvolvimento de um vetor de vacina multivalente. Para este fim, um cDNA infeccioso correspondente ao antigenoma da linhagem Edmonston B MV foi clonado e uma técnica genética de reversão, permitindo a produção do vírus correspondente, foi estabelecida (Radecke et al., 1995).

[006] Os inventores desenvolveram inicialmente um vetor utilizando o vírus do sarampo (MV) Schwarz, a vacina de sarampo mais comumente utilizada no mundo (Combredet et al., 2003). Este vetor pode expressar de forma estável uma série de genes ou combinação de vários genes por mais de 12 passagens. Vetores de vírus do sarampo (MV) recombinantes contendo 4.000-5.000 nucleotídeos adicionais foram produzidos, representando um adicional de 30% de genoma. Estes vírus foram produzidos em cultura celular a títulos comparáveis com MV padrão. Após 12 passagens e um fator de amplificação de 10²⁰, mais do que 96% das

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4/63 células infectadas continuaram a expressar os genes adicionais. Esta expressão consideravelmente estável, também observada para outros membros de Mononegavirales (Schnell et al., 1996) é provavelmente devido à ausência de obstáculos (constraints) geométricos no tamanho do genoma por estes vírus nucleocapsídicos helicoidais, ao contrário dos vírus com capsídeos icosahedral (icosahedral capsids). Ainda, o MV infecta células do sistema imune (macrófagos e células dendríticas), fornecendo, desta forma, a carga de antígenos diretamente para as células apresentadoras de antígeno mais eficazes, uma vantagem essencial para um vetor de vacina. Finalmente, o genoma do MV é pequeno, evitando assim que a resposta para o vetor destrua a resposta para transgenes.

[007] Baseado no fato de que a segurança e eficácia de uma linhagem atenuada depende, ultimamente, de sua seqüência genômica, os inventores clonaram o cDNA infeccioso correspondente ao anti-genoma do vírus de sarampo Schwarz/Moraten a partir de partículas virais purificadas a partir de uma preparação industrial de vacina Schwarz com procedimentos ótimos para manter a fidelidade (Combredet et al., 2003). Para aperfeiçoar o produto (output) do sistema genético reverso, o cDNA viral anti-genômico foi colocado sob o controle do promotor de RNA polimerase de fago T7 com uma unidade GGG adicional necessária para uma eficácia ideal. Para permitir a clivagem exata do RNA viral, uma ribozima do tipo cabeça de martelo (hammerhead) foi inserida entre a unidade GGG e o primeiro nucleotídeo viral, e a ribozima do vírus hepatitis delta foi colocada a jusante (downstream) do último nucleotídeo viral. O plasmídeo pTM-MVSchw resultante permitiu a produção do vírus correspondente utilizando um sistema genético de reversão anteriormente descrito, com base na transfecção de células auxiliares humanas (Radecke et al., 1995). Para prevenir a adaptação da vacina recombinante às células não certificadas, as células auxiliares transfectadas com cDNA foram

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5/63 co-cultivadas com fibroblastos embrionários de frango, células nas quais o vírus foi originalmente selecionado e em que é atualmente produzido. Após diversas passagens do vírus recombinante, foi verificado que a seqüência do seu genoma completo era idêntica à seqüência original (Combredet et al., 2003). A imunogenicidade do vírus recuperado a partir do plasmídeo pTMMVSchw foi avaliada em camundongos transgênicos e macacos, e comparada com a vacina Schwarz produzida industrialmente. Todos os macacos vacinados desenvolveram anticorpos anti-MV e respostas celulares específicas. Nenhuma diferença foi observada entre o vírus Schwarz produzido a partir do cDNA e a vacina original, indicando que o vírus clonado possui a mesma imunogenicidade que a vacina parental (Combredet et al., 2003). Este clone molecular permite a produção de vacina de sarampo Schwarz sem depender dos estoques de semeadura.

[008] O plasmídeo pTM-MVSchw foi modificado para a expressão de genes exógenos através da introdução de unidades transcricionais adicionais (ATU) em diferentes posições no genoma. Estas ATUs são cassetes de sítio para multi-clonagem, inseridos, por exemplo, em uma cópia da região intergênica N-P do genoma viral (contendo as seqüências de ação cis necessárias para a transcrição). O gene da proteína verde fluorescente amplificado (eGFP) foi inserido neste cassete. A ATU foi introduzida no plasmídeo pTM-MVSchw em duas posições (entre os genes P e M e entre os genes H e L). Independente da seqüência adicional, o número total de nucleotídeos anti-genômicos deve ser mantido como um múltiplo de seis para satisfazer a regra de 6 nucleotídeos que otimiza a replicação viral (Calain et al., 1993). O transgene GFP foi expresso em todos os tipos celulares infectados, confirmando que o vírus de sarampo Schwarz recombinante trabalha como um vetor. Este vetor permite o desenvolvimento de vacinas combinadas com base em uma linhagem de vacina aprovada atenuada viva

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6/63 que está atualmente em uso global. Este trabalho é o objeto do depósito internacional WO 2004/000876 que está incorporado ao presente como referência.

[009] O uso destas vacinas recombinantes vivas com base em vírus do sarampo (MV) em larga escala depende da possibilidade de crescimento das mesmas de forma estável e a bons títulos em células certificadas (tais como fibroblastos embrionários de frango primários (CEF) ou diplóide humano MRC5). Estas células produzem normalmente MV a títulos moderados, quando comparadas a linhagens celulares de laboratório, tais como células Vero de macacos verdes africanos (African green monkey Vero cells), que produzem altos títulos. Desta forma, a semeadura inicial deve ser obtida a títulos relativamente altos. Esta semeadura inicial é produzida a partir de cDNA por genética reversa.

[010] Enquanto vírus de RNA ou DNA de fita positiva podem ser facilmente obtidos in vitro após transfecção de seus cDNA ou DNA infecciosos modificados por engenharia genética em células apropriadas, os vírus de RNA de fita negativa não podem ser recuperados diretamente de genética reversa a partir de seu cDNA. O genoma do vírus de RNA de fita negativa não é capaz de iniciar in vitro um ciclo de infecção, uma vez que não codifica diretamente para proteínas. Tanto a transcrição quanto a replicação requerem um complexo enzimático de transcriptase-polimerase contido nas nucleoproteínas que encapsulam o genoma viral (complexo RNP). Desta forma, a geração de vírus de RNA de fita negativa recombinante a partir de cDNA envolve a reconstituição de RNPs ativos a partir de componentes individuais: RNA e proteínas (Fields B.N. et al - editores Lippincott Raven 1996, p. 1953-1977).

[011] Nos últimos 15 anos, um conjunto importante de trabalho de diversos laboratórios permitiu o estabelecimento de diferentes sistemas para a recuperação de quase todos os vírus de RNA de fita

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7/63 negativa a partir de seu cDNA (vide Conzelmann para revisão). Ao contrário dos vírus com genoma segmentado, os RNPs de vírus de RNA de fita negativa não-segmentada (Mononegavirales) são fortemente estruturados e contem, além da nucleoproteína (N), o conjunto e fosfoproteína co-fator de polimerase (P) e a RNA polimerase viral de proteína grande (L). O primeiro Mononegavirales infeccioso, o rhabdovírus da raiva, foi recuperado a partir de cDNA em 1994 (Schnell et al. 1994). O desenvolvimento envolveu expressão intracelular de vírus da raiva de proteína N, P, e L, juntamente com um RNA de comprimento total, cuja extremidade 3' correta foi gerada pela ribozima do vírus delta da hepatite (HDV). Um transcrito correspondente ao anti-genoma viral (fita positiva), ao invés do genoma (fita negativa), foi utilizado para evitar um problema antisense desenvolvido pela presença de seqüências N, P, e L nos RNAs de comprimento total. Neste sistema, as proteínas auxiliares essenciais foram fornecidas por um vetor de varíola capaz de replicação que codifica RNA polimerase do fago T7, para dirigir a transcrição T7-específica de plasmídeos que codificam as proteínas N, P e L necessárias. Sistemas similares permitiram a recuperação de vírus da raiva infeccioso (Schnell et al. 1994; Ito et al. 2001), vírus da estomatite vesicular (VSV) (Lawson et al. 1995; Whelan et al. 1995), bem como o vírus Paramyxoviridae Sendai (Garcin et al. 1995; Kato et al. 1996; Leyrer et al. 1998; Fujii et al. 2002), HP1V-3 (Hoffman e Banerjee 1997) e vírus do sarampo (Takeda et al. 2000; Fujii et al. 2002).

[012] Para evitar o uso de varíola capaz de replicação, que requer que o vírus recuperado seja separado do vírus auxiliar, diversos vírus auxiliares não-replicativos foram adaptados para fornecer proteínas auxiliares para recuperar vírus de RNA de fita negativa não-segmentado. O vírus de varíola Ankara modificado altamente atenuado (MVA) que expressa a RNA polimerase T7 tem sido utilizado para a recuperação de Pneumovírus RSV

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8/63 (Collins et al. 1995), do Rubulavírus, SV5 (He et al. 1997), HPIV-3 (Durbin et al. 1997), vírus da gafeira (rinderpest) (Baron e Barrett 1997), e vírus do sarampo (Schneider et al. 1997), vírus da caxumba (Clarke et al. 2000), CDV (Gassen et al. 2000), HPIV-2 (Kawano et al. 2001), e BPIV-3 (Schmidt et al. 2000). Um vírus avipox (fowlpox) recombinante que expressa a RNA polimerase T7 foi utilizado para recuperação de Paramyxoviridae do vírus da doença de Newcastle (Newcastle disease virus - NDV) de aves (Peeters et al. 1999) e de um vírus da gafeira quimérico (Das et al. 2000).

[013] Para a recuperação de Mononegavirales sem a contaminação por qualquer vetor viral infeccioso ou defeituoso, foram geradas linhagens celulares que expressam RNA polimerase T3 ou T7. Neste caso, na ausência da atividade de encapsulação do RNA no citoplasma, expressão protéica foi alcançada utilizando o IRES (sítio interno de entrada do ribossomo) de um vírus de encefalomiocardite (EMCV) localizado a montante (upstream) das regiões de codificação. Uma linhagem celular de rim embrionária humana (293-3-46) que expressa RNA polimerase T7 e proteínas N e P do vírus de sarampo foi estabelecida para recuperar a linhagem de vacina Edmonston do vírus de sarampo (Radecke et al. 1995). O vírus foi recuperado após transfecção de plasmídeos que especificam RNA e L mRNA anti-genômico de MV. Demonstrou-se que a eficiência de recuperação nestas células, que foi inicialmente muito baixa, foi aumentada pelo tratamento de choque térmico das culturas transfectadas e co-cultivo adicional das células transfectadas em células Vero (Parks et al., 1999). Outra linhagem celular que expressa RNA polimerase T7 (BSR T7/5), e baseada em células de rim de filhote de hamster (BHK), foi utilizada para recuperar Vírus Respiratório Sincicial dos Bovinos (BRSV) (Buchholz et al. 2000), vírus de raiva (Finke e Conzelmann 1999), vírus da estomatite vesicular (VSV) (Harty et al. 2001), vírus da doença de Newcastle

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9/63 (Newcastle disease virus - NDV) (Romer-Oberdorfer et al. 1999), e vírus Ebola (Volchkov et al. 2001).

[014] Os inventores utilizaram a linhagem celular 293-3-46 para resgatar o vetor de vírus do sarampo (MV) de vacina Schwarz (Combredet et al., 2003). Entretanto, observou-se que mesmo utilizando o método de choque térmico nas células transfectadas (Parks et al., 1999) e efetuando seu cocultivo em células Vero ou CEF, o resgate foi irreprodutível e ainda de muito baixo rendimento, ou mesmo impossível para alguns recombinantes contendo muitas seqüências adicionais. Isto se deu devido à instabilidade das células auxiliares uma vez que foi observado que a eficácia depende do número de suas passagens. Estas células têm sido geradas através de seleção de clones resistentes a geneticina, de 293 células transfectadas com pSC6-N, pSC6-P e pSC6-T7-NEO codificando, respectivamente, os genes MV N e P e o gene da RNA polimerase T7 sob controle do promotor CMV e um gene de resistência a neomicina (Radecke et al., 1995). A estabilidade de suas atividades depende da sua contínua seleção sob geneticina (G-418), e a remoção de antibiótico durante os experimentos de transfecção e resgate. Durante a ilícita recombinação com base em plasmídeo do DNA exógeno em DNA cromossômico, os concatâmeros formados pelos plasmídeos são recombinados são recombinados e a seleção por geneticina mantém apenas as cópias individuais, que são muito poucas. Isto deve explicar a redução de eficácia observada com células 293-3-46 após algumas passagens.

[015] Portanto, há uma necessidade no estado da técnica por um novo método para gerar linhagens de células auxiliares capazes de resgatar, de forma reprodutível e com alta eficácia, vírus recombinante de RNA de fita negativa não segmentado a partir de cDNA, opcionalmente modificado, e sem contaminação por qualquer outro vírus auxiliar, tal como vírus da varíola.

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Breve Descrição das Figuras [016] Figura 1: representação esquemática dos plasmídeos HIV-1-TRIPÁU3.CMV-T7 (A), HIV-1-TRIPÁU3.CMV-nlsT7 (B), HIV-1TRIPÁU3.CMV-N (C) e HIV-1-TRIPÁU3.CMV-P (D). ip : unidade psi de empacotamento: RRE : elemento responsivo a Rev; cPPT: região polipurina central, CTS : seqüência de terminação central, CMVie: promotor imediatamente anterior do citomegalovírus (cytomegalovirus immediateearly promoter); AU3: deleção de partes de U3.

[017] Figura 2: Western blot mostrando a expressão das proteínas MV N e P em diferentes lisatos celulares; (A) 293T nãotransduzido, linhagem celular 293-3-46 previamente descrita em duas passagens diferentes (17 e 19), populações celulares 293nlsT7-NP e 293T7-NP geradas após transdução com vetores lentivirais; (B) células Vero infectadas com MV, linhagem celular 293-3-46 em duas diferentes passagens (17 e 27), oito clones celulares 293T7-NP ; (C) células Vero infectadas com MV, linhagem celular 293-3-46 (passagem 17), oito clones celulares 293nlsT7-NP, células Vero não-infectadas. Blots experimentados com anticorpo anti-MV NP (1/500) e um anticorpo HRP secundário anti-Ig de camundongo (1/1000).

Breve Descrição da Listagem de Seqüências [018] Seqüências nucleotídicas de vários retrovírus DNA FLAP são definidos em diferentes vírus: CAEV (SEQ ID NO:1), EIAV (SEQ ID NO:2), VISNA (SEQ ID NO:3), SIV AGM (SEQ ID NO:4), HIV-2 ROD (SEQ ID NO:5), HIV-1 LAI (SEQ ID NO:6) e HIV-1 (SEQ ID NO:7). As seqüências nucleotídicas da RNA polimerase T7, a RNA polimerase T7 nls e as proteínas N, P e L do vírus MV são definidas, respectivamente, na SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14 e 16, bem como suas respectivas seqüências protéicas correspondentes em SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15 e 17. A seqüência

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11/63 nucleotídica completa do plasmídeo pTM-MVSchw (CNCM I-2889) é definida na SEQ ID NO: 18. A seqüência nucleotídica completa do plasmídeo pEMC-LSchw (CNCM I-3881) é definida na SEQ ID NO: 19.

Descrição da Invenção [019] A presente invenção refere-se a uma célula que produz de forma estável, pelo menos uma RNA polimerase, uma nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e uma fosfoproteína (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou derivados funcionais dos mesmos. Em uma realização particular, a célula da presente invenção produz, de forma estável, uma RNA polimerase, uma nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e uma fosfoproteína (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou derivados funcionais dos mesmos.

[020] As células da presente invenção são células recombinantes, o que significa que estas células são resultados de uma manipulação genética in vitro intencional que resulta na recombinação de seqüências genômicas das células com seqüências heterólogas, tais como seqüências originadas de uma célula ou organismo diferente. Iniciando pelas células isoladas, as células recombinantes são preparadas, possuem características fenotípicas e/ou genotípicas diferentes das células de partida, e também fornecem expressão ou produção estável de pelo menos uma RNA polimerase, a proteína N e a proteína P de um ou mais vírus de RNA de fita negativa, não segmentado. As células de acordo com a presente invenção são reivindicadas como produto, externo ao corpo de um ser humano.

[021] A expressão “produção estável” significa que as células expressam ou produzem pelo menos a RNA polimerase, a proteína N e a proteína P por uma série de divisões celulares iguais ou maiores do que 65, vantajosamente, enquanto a célula viver. De acordo com uma realização

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12/63 particular da presente invenção, as células recombinantes expressam ou produzem pelo menos três proteínas, quais sejam, pelo menos a RNA polimerase, a proteína N e a proteína P, de forma continuada no tempo. De acordo com uma realização específica da presente invenção, a integridade, ou seja, a seqüência de aminoácido primária, das três proteínas é mantida, garantindo que as proteínas expressadas ou produzidas sejam sempre as mesmas.

[022] A produção estável da RNA polimerase, proteína N e proteína P, é independente da presença na célula de plasmídeo(s) contendo a seqüência codificante destas proteínas. Desta forma, embora os plasmídeos possam ser utilizados em uma etapa particular da manipulação celular in vitro ou ex vivo, as células recombinantes resultantes, que produzem de forma estável as três ou pelo menos três proteínas, não contém mais plasmídeos. Neste sentido, a expressão é denominada “independente de plasmídeo”, ao contrário das células recombinantes nas quais a expressão protéica é dirigida pelo(s) plasmídeo(s).

[023] Em uma realização específica da presente invenção, a expressão estável da RNA polimerase, da proteína N e da proteína P, não requer a presença de uma droga, tal como antibiótico, ou seja, a expressão estável não requer uma pressão seletiva. Portanto, a produção estável não requer a presença obrigatória de plasmídeo(s) para a sobrevivência, sendo que os mencionados plasmídeos influenciam a seqüência codificante da(s) proteína(s) a serem expressas.

[024] Outra característica da presente invenção é que cada uma das pelo menos três proteínas, quais seja, pelo menos a RNA polimerase, a proteína N e a proteína P, são produzidas ou expressadas a um nível similar no tempo. “Nível similar”, da forma utilizada pela presente invenção, indica que a expressão de cada uma das três proteínas é estável durante a vida celular,

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13/63 mesmo após a divisão, com uma variação no nível de expressão que não é maior do que cerca de 30%, particularmente, não é maios do que cerca de 20% e, mais preferencialmente, não é maior do que cerca de 10%, conforme comparação com a expressão média calculada em diferentes momentos da vida celular.

[025] A RNA polimerase expressada ou produzida pelas células da presente invenção é qualquer polimerase apropriada para sintetizar um RNA viral de fita simples de sentido negativo, não segmentado (vRNA), derivado de um clone de cDNA, em um sistema de resgate. A natureza da polimerase depende essencialmente da natureza da seqüência promotora da RNA polimerase localizada no clone de cDNA do vírus de RNA de fita simples negativa, não segmentado, utilizado para o sistema de resgate (também denominado como genética reversa ou síntese de novo de vírus de RNA de sentido negativo a partir de cDNA clonado). Como um exemplo, a RNA polimerase é a RNA polimerase de fago T7, ou sua forma nuclear (nlsT7).

[026] As expressões “proteína N” e “proteína P” referem -se, respectivamente, à nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita simples negativa, não segmentado, e a fosfoproteína (P) de um vírus de RNA de fita simples negativa, não segmentado. Exemplos de famílias e subfamílias, gêneros ou espécies de um vírus de RNA de fita simples negativa, não segmentado, a partir do qual as proteínas N e/ou P podem ser derivadas, são listados na tabela 1.

[027] Em uma realização particular, as proteínas N e P do vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, são do mesmo vírus, tanto da mesma linhagem de vírus quanto de linhagens de vírus diferentes. Em outra realização, as proteínas N e P do vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, são de diferentes vírus de RNA de fita negativa, não segmentado.

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Tabela 1

Família, Subfamília, Gênero E Espécies De Diversos Virus De RNA De Fita

Negativa, Não-Segmentado (NNV) Da Ordem Mononegavirale.

Família	Subfamília	Gênero	Espécie	Abreviação
Rhabdoviridae	/	Vesiculovírus	Vírus da estomatite vesicular	VSV
		Lyssavírus	Vírus da raiva	RV
Paramyxoviridae	Paramyxovirinae	Morbillivírus	Vírus do sarampo	MV
Vírus da gafeira	RPV
Vírus de raiva canina	CDV
Respirovírus	Vírus sendai	SeV
Vírus da parainfluenza humana tipo 3	hPIV3
Vírus da parainfluenza bovina tipo 3	bPIV3
Rubulavírus	Vírus símios tipo 5	SV5
Vírus da caxumba
Vírus da parainfluenza humana tipo 2	hPIV2
Vírus da doença de Newcastle	NDV
Pneumovirinae	Pneumovírus	Vírus sincicial respiratório humano	hRSV
Vírus sincicial respiratório bovino	bRSV
Filoviridae	I	Vírus similares a Ebola	Vírus Ebola	/

[028] Em uma realização particular, as proteínas N e P são derivadas de um Mononegavírus, preferencialmente um vírus Paramyxoviridae, de preferência um vírus Paramyxovirinae, e particularmente um vírus Morbillivirus. Como exemplo de Morbillivirus pode-se citar o vírus do sarampo

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15/63 (MV), em particular uma linhagem não-imunossupressora atenuada, tal como uma linhagem aprovada para uma vacina, e particularmente, a linhagem Schwarz de MV ou a linhagem Edmonston (Ed), ou um derivado destas linhagens. Uma linhagem aprovada para vacina é definida pelo FDA (administração Americana de drogas e alimentos) como possuindo as seguintes características: segurança, eficácia, qualidade e reprodutibilidade, após rigorosas revisões de dados clínicos e laboratoriais (www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm).

[029] Cada referência temporal realizada no presente pedido, para vírus de RNA de fita negativa, não-segmentado, aplica-se, possivelmente, em particular a vírus específicos listados no presente, de preferência, a vírus do sarampo, particularmente, linhagem Schwarz.

[030] A expressão “derivados funcionais do mesmo” refere-se a qualquer variante funcional, incluindo fragmentos de RNA polimerase e/ou proteína N e/ou proteína P, desde que os derivados funcionais mantenham a atividade da proteína da qual são derivados, pelo menos como um complexo ribonucleoprotéico (complexo RNP), funcional na transcrição e replicação no genoma do vírus, em um sistema de resgate que permite a produção de vírus de RNA de sentido negativo, não segmentado, a partir de cDNA clonado.

[031] Uma variante funcional é definida por um ácido nucléico que codifica as mencionadas proteínas variantes funcionais, que possuem pelo menos uma das seguintes características:

- o ácido nucléico que codifica a variante funcional hibridiza em condições de alta estringência com um ácido nucléico que codifica a RNA polimerase do tipo selvagem (referência) ou com a proteína N e a proteína P de um vírus ou linhagem de RNA de fita negativa, não segmentado, identificado. Condições de alta estringência são definidas por Sambrook et al. em Molecular Cloning: a laboratory manual (1989). Estas condições de alta estringência

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16/63 englobam: o uso de uma solução de pré-lavagem para os filtros de nitrocelulose 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), condições de hibridização de 50% formamida, 6X SSC a 42°C e condições de lavagem a 68°C, 0,2X SSC e 0,1% SDS. Protocolos são conhecidos pelos técnicos no assunto. Adicionalmente, o técnico no assunto reconhecerá que a temperatura e a concentração de sal da solução de lavagem poderão ser ajustadas conforme necessário, de acordo com experiências desfavoráveis;

- o ácido nucléico que codifica a variante funcional apresenta pelo menos 80%, de preferência 90%, mais particularmente 95%, ou mesmo 99% de similaridade com um ácido nucléico nativo que codifica a RNA polimerase, a proteína N ou a proteína P, em que a mencionada similaridade é calculada sob o comprimento total de ambas as seqüências;

- o ácido nucléico que codifica a variante funcional difere de um ácido nucléico nativo que codifica a RNA polimerase, a proteína N ou a proteína P por pelo menos uma substituição de nucleotídeo, de preferência, 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições, opcionalmente, substituições conservativas (substituições de nucleotídeos que não alteram a seqüência de aminoácido), por pelo menos uma deleção ou adição de nucleotídeo, de preferência, 1, 2, 3, 4 ou 5 deleções ou adições de nucleotídeos.

[032] Um fragmento é definido na presente invenção como uma parte da RNA polimerase de comprimento total, da proteína N ou da proteína P, desde que o fragmento possua a mesma atividade da proteína inteira da qual é derivada, pelo menos como um complexo ribonucleoprotéico (complexo RNP), conforme descrito no presente documento. Em uma realização particular, o fragmento representa pelo menos 70%, em particular 80%, e mais particularmente, 90% ou mesmo 95% da proteína de comprimento total.

[033] Assim, onde a presente invenção faz referência à RNA polimerase, proteína N, proteína P ou suas seqüências codificantes, a

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17/63 referência se aplica aos derivados funcionais das mesmas, conforme aqui descrito.

[034] De acordo com uma realização particular, uma célula recombinante da presente invenção compreende, integrada ao seu genoma, pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma RNA polimerase, pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína N de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentada, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína P de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentada. Opcionalmente, os ácidos nucléicos que codificam as três proteínas acima estão, cada um ou pelo menos um deles, sob o controle de elementos regulatórios da transcrição. A expressão “integrado ao genoma” indica que a pelo menos uma cópia de um ácido nucléico sob o controle de elementos regulatórios da transcrição está localizada no genoma das células recombinantes, sob condições que permitem que as mencionadas células expressem de forma estável a proteína codificada pelo ácido nucléico. Em uma realização particular, a célula recombinante de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente, integrada ao seu genoma, pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína L de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado.

[035] “Pelo menos uma cópia” indica que o ácido nucléico que codifica a RNA polimerase e/ou a proteína N e/ou a proteína P e/ou a proteína L pode estar presente em uma ou mais cópias, preferencialmente, exatamente ou pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 cópias ou mais, dependendo do nível de expressão necessário para cada uma destas proteínas.

[036] Em uma realização particular da presente invenção, as células de acordo com o presente pedido contém ainda pelo menos uma cópia de uma alça (flap) de DNA integrada ao genoma da célula. Uma alça de DNA é uma seqüência nucleotídica de origem retroviral, especialmente lentiviral, ou

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18/63 uma origem similar a retroviral, que compreende duas regiões essenciais, quais sejam, as regiões cPPT (trato de polipurina central) e CTS (região de terminação de atuação cis), em que as regiões cPPT e CTS incluem uma estrutura de DNA tridimensional durante a replicação do DNA que as contém (anteriormente descrito em Zennou et al., 2000; e nos documentos W099/55892 e WO01/27300). Em uma realização particular da presente invenção, a alça de DNA é inserida imediatamente a montante do promoter interno, permitindo a transcrição de ácidos nucléicos que codificam a RNA polimerase, a proteína N, a proteína P e, possivelmente, a proteína L. A alça de DNA (cPPT-CTS) é inserida nos vetores derivados de retrovírus de acordo com a presente invenção, em uma orientação funcional, tal como, a região cPPT está a 5' com relação à região CTS (a parte 5' do vetor correspondendo a LTR contendo o sítio de ligação do primer (PBS), e a parte 3' do vetor correspondendo à região contendo o 3'PPT).

[037] Uma alça de DNA apropriada para a presente invenção pode ser obtida a partir de um retrovírus, em particular, a partir de lentivírus ou organismo similar a retrovírus, tais como retrotransposon, preparado de forma sintética (síntese química) ou por amplificação da alça de DNA a partir de qualquer retrovírus, de preferência, a partir de um ácido nucléico de lentivírus, tais como por reação em cadeia de polimerase (PCR). A alça de DNA pode ser orientada a partir de um retrovírus, em particular, um lentivírus, de preferência um retrovírus ou lentivírus humano, e mais particularmente, um retrovírus HIV, o vírus CAEV (vírus da artrite-encefalite caprina), o vírus EIAV (vírus da anemia infecciosa de eqüinos), o vírus VISNA, o vírus SIV (vírus da imunodeficiência de símios) ou o vírus FIV (vírus da imunodeficiência dos felinos). Em uma realização mais particular, a alça de DNA é obtida a partir de um retrovírus HIV, por exemplo, vírus HIV-1 ou HIV-2, ou qualquer tipo isolado diferente destes dois.

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19/63 [038] Alças de DNA preferidas compreendem ou consistem em seqüências conforme definidas nas SEQ ID NOs: 1 A 7. Nota-se que a alça de DNA é utilizada de forma isolada a partir do contexto de seu nucleotídeo natural (genoma viral), ou seja, isolado a partir do gene pol no qual ele é contido naturalmente em um lentivírus. Portanto, a alça de DNA é utilizada, na presente invenção, deletada a partir de porções 5' e 3' desnecessárias do gene pol e é recombinada com seqüências de diferentes origens. De acordo com uma realização particular da presente invenção, uma alça de DNA possui uma seqüência nucleotídica de cerca de 90 a cerca de 150 nucleotídeos, em particular, de cerca de 100 a cerca de 140 nucleotídeos.

[039] A presente invenção refere-se ainda a uma célula que pode ser obtida a partir de recombinação do seu genoma com (1) um vetor de expressão que compreende uma alça de DNA, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma RNA polimerase, (2) um vetor de expressão que compreende uma alça de DNA, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína N de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e (3) um vetor de expressão que compreende uma alça de DNA, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína P de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado. As definições dadas acima se aplicam a estas células aqui descritas.

[040] A presente invenção também se refere a uma célula que pode ser obtida por recombinação de seu genoma com (1) um vetor de expressão que compreende uma alça de DNA, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma RNA polimerase, (2) um vetor de expressão que compreende uma alça de DNA, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína N vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, (3) um vetor de expressão que compreende uma alça de DNA, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína P de

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20/63 um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e (4) um vetor de expressão que compreende uma alça de DNA, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína L de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado. As definições dadas acima se aplicam a estas células.

[041] A presente invenção compreende também uma célula que pode ser obtida pela recombinação de seu genoma com um vetor de expressão que compreende pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma RNA polimerase, pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína N de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína P de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma alça de DNA. As definições dadas acima se aplicam a estas células. Em uma realização particular, o vetor de expressão compreende ainda pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína L de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado.

[042] A presente invenção refere-se ainda a um vetor de expressão derivado de um retroviral que compreende uma alça de DNA conforme descrita acima e pelo menos um ácido nucléico que codifica uma proteína necessária para o resgate de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado. Em um vetor específico da presente invenção, o ácido nucléico codifica uma proteína uma proteína que é selecionada a partir do grupo que consiste de RNA polimerase, uma proteína N de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, uma proteína P de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma proteína L de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado.

[043] O termo “genoma” refere-se a qualquer molécula de ácido nucléico, cuja presença na célula não é dependente mediante seleção por

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21/63 pressão, ou seja, cuja presença na célula é permanente e/ou não depende de condições ambientais. O termo “genoma” não engloba plasmídeos. Particularmente, o termo “genoma” refere-se a moléculas de ácido nucléico presente no núcleo celular (genoma nuclear), por oposição a moléculas de ácido nucléico presentes no citoplasma, e engloba, por exemplo, cromossomos. Em uma realização particular da presente invenção, o termo “genoma” inclui ainda moléculas de ácido nucléico presentes em compartimentos celulares específicos, tais como organelas, por exemplo, mitocôndria (genoma mitocondrial) ou cloroplastos (genoma de cloroplasto). Em uma realização mais particular, o genoma é selecionado a partir de uma célula eucariótica.

[044] Um vetor derivado de retroviral, e particularmente um vetor derivado de lentiviral, em particular um vetor derivado de HIV-1, é um genoma viral que compreende os elementos necessários para a retro transcrição, em particular, as LTRs possivelmente mutada incluindo porções deletadas, de preferência deletadas na região U3, conforme descrito abaixo e vantasojamente, a alça de DNA. Estas regiões de LTR e alça de DNA podem ser as únicas seqüências de retroviral, especialmente origem lentiviral no vetor de expressão derivado de retroviral. Em nenhum caso, o vetor derivado de retroviral contém as seqüências nucleotídicas que codificam as proteínas retrovirais de comprimento total. Em uma realização específica da presente invenção, o vetor derivado de retroviral compreende ou consiste de uma alça de DNA e pelo menos um ácido nucléico que codifica uma proteína necessária para o resgate de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, conforme descrito na presente invenção, bem como as LTRs do genoma viral correspondente.

[045] Um vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende uma alça de DNA e um ácido nucléico que codifica uma

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RNA polimerase ou suas partes funcionais. O mencionado vetor pode ser o plasmídeo HIV-1-TRIPZU3.CMV-T7 depositado com CNCM em 14 de dezembro de 2006, sob o número I-3702, que é um vetor de expressão de HIV1 que compreende uma alça de DNA (TRIP), uma LTR deletada no promotor e o amplificador do domínio U3, um promotor CMV e um ácido nucléico que codifica RNA polimerase de fago T7, em particular, um que possui a seqüência SEQ ID NO: 8, ou o plasmídeo HIV-1-TRIPZU3.CMV-nlsT7 depositado com CNCM em 14 de dezembro de 2006, sob o número I-3703, que é um vetor de expressão de HIV-1 que compreende uma alça de DNA (TRIP), uma LTR deletada no promotor e o amplificador do domínio U3, um promotor CMV e um ácido nucléico que codifica a forma nuclear da RNA polimerase de fago T7, em particular que possui a seqüência SEQ ID NO: 10.

[046] Um vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende uma alça de DNA e um ácido nucléico que codifica uma proteína N de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado. O mencionado vetor pode ser o plasmídeo HIV-1-TRIPZU3.CMV-N depositado com CNCM em 14 de dezembro de 2006, sob o número I-3700, que é um vetor de expressão de HIV-1 que compreende uma alça de DNA (TRIP), uma LTR deletada no promotor e o amplificador do domínio U3, um promotor CMV e um ácido nucléico que codifica a proteína N do MV Schwarz, de preferência, que possui a seqüência SEQ ID NO: 12.

[047] Um vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende uma alça de DNA e um ácido nucléico que codifica uma proteína P de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado. O mencionado vetor pode ser o plasmídeo HIV-1-TRIPZU3.CMV-P depositado com CNCM em 14 de dezembro de 2006, sob o número I-3701, que é um vetor de expressão de HIV-1 que compreende uma alça de DNA (TRIP), uma LTR deletada no promotor e o amplificador do domínio U3, um promotor CMV e um

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23/63 ácido nucléico que codifica a proteína P do MV Schwarz, de preferência, que possui a seqüência SEQ ID NO: 14.

[048] Outro vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína L de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado. O mencionado vetor pode ser o plasmídeo pEMC-LSchw depositado com CNCM em 18 de dezembro de 2007, sob o número I-3881,. Um ácido nucléico específico que codifica uma proteína L é o que possui a SEQ ID NO:19.

[049] Os vetores CNCM I-3700 a 3703 descritos acima estão todos contidos na linhagem E. coli (JM109), cultivada em meio LB suplementado com ampicilina (100ug/ml) a 37°C com agitação.

[050] A presente invenção refere-se a cada um e qualquer fragmento de nucleotídeo contido nos polinucleotídeos inseridos nos plasmídeos depositados referenciados no presente, e especialmente a cada e qualquer região apropriada para desenhar o inserto, de acordo com a presente descrição. A presente invenção refere-se ainda ao uso destes fragmentos para a construção dos plasmídeos da presente invenção.

[051] Os quatro plasmídeos acima são exemplos de vetores que podem ser utilizados na recombinação de células para a obtenção das células recombinantes da presente invenção. Entretanto, estes exemplos não constituem limitações da invenção em questão; portanto, e conforme descrito acima, as proteínas N e P (ou seus derivados funcionais) podem ser derivadas de qualquer vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, a T7 polimerase pode ser qualquer RNA polimerase, o promotor CMV pode ser qualquer promotor, a alça de DNA TRIP pode ser qualquer alça de DNA e o vetor de expressão de HIV-1 pode ser qualquer vetor, em particular, qualquer vetor viral.

[052] Outros vetores de expressão de acordo com a presente invenção compreendem uma alça de DNA e um ácido nucléico que codifica

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24/63 uma proteína L de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou compreende uma alça de DNA e ácidos nucléicos que codificam uma RNA polimerase, uma proteína N de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, uma proteína P de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e opcionalmente uma proteína L de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado.

[053] O termo “vetor de expressão” indica que, além dos elementos explicitamente mencionados acima, o vetor compreende todos os elementos necessários para dirigir a expressão dos ácidos nucléicos que codificam as proteínas de interesse (elementos regulatórios de expressão), e particularmente, elementos regulatórios de transcrição. “Elemento regulatório da transcrição” define qualquer região do DNA envolvida na regulação da transcrição de ácidos nucléicos integrados no genoma, e compreende um promotor, tal como CMV, alfa EF1 ou mPGK (fosfoglicerato quinase de murino) ou, em geral, qualquer promotor apropriado para inserção em um retroviral, em particular, vetor lentiviral, amplificador ou elementos regulatórios de atuação cis. Estes elementos e particularmente o promotor são escolhidos de forma dependente da natureza das células recombinantes. A determinação do promotor adequado, de acordo com o nível de expressão desejado ou de acordo com a célula recombinada, faz parte do conhecimento do técnico no assunto. Nota-se que, quando a célula recombinante contém diversos ácidos nucléicos heterólogos (também designados polinucleotídeos) que codificam as proteínas de interesse, os mencionados elementos regulatórios podem ser únicos para todos os ácidos nucléicos, ou compartilhados por alguns deles ou, em contraste, cada ácido nucléico pode ser associado com um elemento regulatório de transcrição específico. No último caso, os diversos elementos regulatórios de transcrição podem ser similares ou diferentes.

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25/63 [054] A presença da alça de DNA, em todos os vetores utilizados na etapa de recombinação, leva a formação de uma estrutura de DNA tripla (três fitas) na posição da alça do DNA (a estrutura tripla consiste da região entre os domínios cPPT e CTS, incluindo o domínio CTS), permitindo a importação do ácido nucléico que acompanha a alça de DNA ao núcleo da célula (através dos poros da membrana nuclear) e a integração adicional no genoma desta célula. As alças de DNA atuam como um determinante cis da importação nuclear do vetor. Em um primeiro aspecto, a presença da alça de DNA é de grande interesse para a recombinação e integração de ácidos nucléicos em células que não realizam divisão, uma vez que na ausência da divisão celular (e desintegração da membrana), a importação (e desta forma a integração dos ácidos nucléicos no genoma celular) é apenas identificada como uma atividade residual; portanto, os vetores que contem a alça de DNA são vetores retrovirais não-replicáveis capazes de transduzir células que não realizam divisão. Em um segundo aspecto, a presença da alça de DNA é também de grande interesse para a recombinação e a integração de ácido nucléico em células em divisão, por aprimorar consideravelmente a porcentagem de células nas quais o ácido nucléico que contem a alça de DNA é integrado. A inserção da seqüência da alça de DNA em um vetor de expressão, conforme descrito na presente invenção, aumenta fortemente a transferência gênica in vitro e in vivo através de estímulo da importação nuclear do DNA de vetor (Sirven et al, 2001; Zennou et al, 2001). Vetores de HIV, incluindo a seqüência da alça de DNA (vetores TRIP) são capazes de transduzir células B e T primárias, macrófagos, células dendríticas, etc, com uma eficácia dez vezes maior do que outros vetores de HIV que não possuem a alça de DNA. Uma transdução de 80 a 90 % das células pode ser rotineiramente obtida.

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26/63 [055] Seguindo a recombinação por vetor que contém uma alça de DNA e ácidos nucléicos que codificam pelo menos as três proteínas de interesse e integração destes ácidos nucléicos no genoma, as células recombinantes produzem de forma estável a RNA polimerase, a proteína N e a proteína P.

[056] Os vetores de expressão do presente, utilizados para a obtenção das células recombinantes de acordo com a presente invenção, são vetores virais, e particularmente, vetor de expressão viral, tal como derivado de retroviral, em particular vetores derivados de lentiviral, tal como vetores derivados de HIV, FIV ou SIV. Mais particularmente, o vetor derivado de lentiviral é um vetor derivado de lentiviral humano tal como um vetor de expressão de HIV, em particular, vetor derivado de HIV-1 ou HIV-2. Em uma realização preferida, o vetor viral é um vetor de expressão de HIV que compreende uma alça de DNA conforme descrito acima, e pelo menos um ácido nucléico que codifica pelo menos as três proteínas de interesse. Os vetores de HIV são vetores retrovirais de substituição clássicos nos quais substancialmente todas as seqüências virais de codificação são substituídas pela seqüência a ser transferida. Os vetores de HIV expressam, portanto, apenas os ácidos nucléicos heterólogos contidos entre LTRs de HIV ou LTRs mutados, e sob o controle da alça de DNA. Estes vetores podem então acomodar polinucleotídeos grandes, que possuem de até 5 a 6 kb. Uma realização particular da presente invenção é um vírus de expressão de HIV conforme descrito acima, e mais particularmente, um vetor de expressão de HIV-1, em que um LTR de HIV-1 é deletado para o promotor e o amplificador do domínio U3 (AU3). Esta deleção específica foi anteriormente demonstrada como capaz de aumentar a expressão dos ácidos nucléicos contidos no vetor, e particularmente quando associados com um promotor.

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27/63 [057] Em uma realização particular, a célula recombinante de acordo com a presente invenção é obtida por recombinação de seu genoma com os plasmídeos HIV-1-TRIPAU3.CMV-T7, HIV-1-TRIPAU3.CMV-N e HIV1-TRIPAU3.CMV-P, ou com plasmídeos HIV-1-TRIPAU3.CMV-nlsT7, HIV-1TRIPAU3.CMV-N e HIV-1 -TRIPAU3.CMV-P.

[058] As células de acordo com a presente invenção podem ser células procarióticas ou eucarióticas, em particular células animais ou vegetais, e de preferência, células de mamíferos, tais como células humanas ou células de mamíferos não-humanas. Em uma realização particular da presente invenção, as células, antes da recombinação de seu genoma, são isoladas de uma cultura primária ou uma linhagem celular. As células de acordo com a presente invenção podem células que realizam divisão ou não. Como um exemplo de célula que pode ser recombinada para fornecer as células recombinantes da presente invenção, são células HEK 293 (rim embrionário humano), das quais a linhagem celular 293 é depositada com o ATCC sob o número CRL-1573. Em uma realização particular, as células humanas não são células germinativas e/ou células tronco embrionárias.

[059] As células recombinantes de acordo com a presente invenção podem ser a linhagem celular 293-T7-NP depositada com CNCM (Paris, France) em 14 de junho de 2006, sob o número I-3618, ou seja, células HEK-293 recombinadas com os plasmídeos HIV-1-TRIPAU3.CMV-T7, HIV-1TRIPAU3.CMV-N E HIV-1 -TRIPAU3.CMV-P. Outro exemplo de células recombinantes de acordo com a presente invenção são células da linhagem celular 293-nlsT7-NP MV depositada com CNCM em 4 de agosto de 2006, sob o número I-3662, ou seja, células HEK-293 recombinadas com plasmídeos HIV-1-TRIPAU3.CMV-nlsT7, HIV-1-TRIPAU3.CMV-N e HIV-1TRIPAU3.CMV-P.

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28/63 [060] Em uma realização adicional da presente invenção, as células recombinantes são adicionalmente recombinadas por um vetor de expressão que compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína grande de RNA polimerase (L) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado. A expressão da proteína L pode ser temporária e dirigida por um plasmídeo que não contem alça de DNA ou, em contraste, ser estável e dirigida por um vetor que contém uma alça de DNA, conforme definido acima. A recombinação por um plasmídeo ou vetor que contém pelo menos uma cópia do ácido nucléico que codifica a proteína L pode ser simultaneamente ou seqüencialmente a recombinação pelos vetores que contém a seqüência de codificação da RNA polimerase, a proteína N e a proteína P.

[061] Portanto, a presente invenção também se refere a uma célula que produz de forma estável uma RNA polimerase, uma proteína N de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e uma proteína P de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou derivados funcionais destes, e que produz, de forma estável ou não, uma proteína L de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado.

[062] A proteína L é derivada de qualquer vírus de RNA de fita negativa, não segmentado descrito na tabela 1. Em uma realização particular da presente invenção, a proteína L é derivada do mesmo vírus de RNA de fita negativa, não segmentado da proteína N e/ou P, e particularmente, a partir da mesma linhagem viral. Em uma realização, a proteína L é derivada de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado diferente da proteína N e/ou P.

[063] Em uma realização particular, a proteína L é derivada de vírus Paramyxoviridae, de preferência, vírus Paramyxovirinae, e mais preferencialmente, um vírus Morbillivirus. Como um exemplo de Morbillivirus pode-se citar o virus do sarampo (MV), em particular uma linhagem nãoimunosupressiva atenuada, ou seja, uma linhagem aprovada para uma vacina,

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29/63 e particularmente, a linhagem Schwarz de MV, ou mesmo a linhagem Edmonston (Ed). Uma proteína L particular é uma do vírus MV (SEQ ID NO: 16) ou codificada pela seqüência inserida no plasmídeo pEMC-LSchw, e essencialmente a seqüência encontrada entre os nucleotídeos 1425 e 7976 da SEQ ID NO: 19.

[064] Em uma realização particular, a seqüência da proteína L não deve ser modificada com relação à proteína L do tipo selvagem, e deve ser funcional, ou seja, permitindo a produção de partículas ou vírus quando transcomplementada com as proteínas N e P, e uma T7 polimerase na célula hospedeira. Um teste para a determinação da funcionalidade eficaz de um clone que contém a proteína L é realizado através da transfecção de uma célula competente com vetores que codificam a proteína N, a proteína P e a T7 (ou nlsT7) polimerase, um vetor que codifica a proteína L a ser testada, e um mini genoma que compreende um gene líder, um promotor, um gene repórter (tal como GFP) e um gene trailer. A funcionalidade do clone L é revelada pela produção de partículas que expressam o gene repórter.

[065] A presente invenção também descreve uma célula conforme aqui descrita, adicionalmente recombinada com um clone de cDNA de fita negativa, não segmentado, de um vírus de RNA de fita negativa não segmentado, ou seja, a fita de RNA antigenômica (+) do genoma viral. O termo “cDNA” utilizado para descrever a seqüência de nucleotídeos da molécula da presente invenção refere-se meramente ao fato de que a mencionada molécula é obtida originalmente por transcrição reversa do genoma do RNA genômico (-) das partículas virais de um vírus de RNA de fita negativa não segmentado, em particular, de um vírus de sarampo, e mais particularmente, o genoma de RNA (-) genômico de comprimento total de partículas virais de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentada. Este método não deve ser considerado como uma limitação para os métodos utilizados para a preparação deste clone de

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30/63 cDNA. Desta forma, a presente invenção engloba, dentro da expressão “cDNA”, qualquer DNA que possua a seqüência de nucleotídeos descrita acima. Ácidos nucléicos purificados, incluindo DNA, ou plasmídeos, são também englobados dentro da definição de cDNA dada pela presente invenção, desde que o mencionado ácido nucléico, especialmente DNA, cumpra com as definições dadas acima.

[066] Em uma realização particular, o clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, contém, a montante das seqüências virais, elementos regulatórios de transcrição. Em uma realização preferida, estes elementos são os mesmos localizados nos vetores de expressão que compreendem as proteínas N, P e/ou L descritas acima. Em uma realização mais preferencial, o elemento é um promotor T7 de RNA polimerase.

[067] Em uma realização, o clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado é selecionado do mesmo vírus de RNA de fita negativa, não segmentado da proteína N e/ou proteína P e/ou proteína L, e particularmente, da mesma linhagem viral. Em outra realização, o clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado é selecionado de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado diferente da proteína N e/ou proteína P e/ou proteína L.

[068] Em uma realização particular, o clone de cDNA é selecionado de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, tal como vírus Paramyxoviridae, preferencialmente um vírus Paramyxovirinae e, mais particularmente, um vírus Morbillivirus. Como um exemplo de Morbillivirus pode-se citas o vírus de sarampo (MV), em particular, uma linhagem atenuada não-imunosupressiva, ou seja, uma linhagem aprovada para vacina e, de preferência, linhagem Schwarz de MV ou linhagem Edmonston (Ed). Ainda, a seqüência de nucleotídeo do clone de cDNA de fita negativa, não segmentado,

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31/63 pode ser modificada conforme comparado com a linhagem ou vírus do tipo selvagem, tal como definido abaixo.

[069] A presente invenção também se refere a culturas de células em que as mencionadas células são aquelas definidas no presente relatório descritivo, e particularmente culturas de células que produzem, de forma estável, uma RNA polimerase, uma nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma fosfoproteína (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou derivados funcionais dos mesmos. Em outra realização, a presente invenção refere-se a culturas de células que produzem, de forma estável, uma RNA polimerase, uma proteína N de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma proteína P de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou derivados funcionais dos mesmos, e produzindo, de forma estável ou transitória, uma proteína L de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou seus derivados funcionais.

[070] Em uma realização, a cultura de células a ser recombinada é uma cultura de células primária, ou seja, uma cultura preparada a partir de células ou tecidos diretamente obtidos de um animal (opcionalmente não humano) e plantas. Em outra realização, a cultura de células a ser recombinada é uma linhagem celular, ou seja, uma população de células que resulta da primeira subcultura de uma cultura primária ou a partir de passagens em série subseqüentes das células.

[071] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se ainda a vários métodos para produzir vírus de fita negativa, não segmentado, infeccioso, recombinante, utilizando as células de acordo com a presente invenção.

[072] Um primeiro método de acordo com a presente invenção para produzir vírus de fita negativa, não segmentado, infeccioso, recombinante compreende ou consiste de:

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a) recombinar uma célula ou uma cultura de células que produzem de forma estável uma RNA polimerase, uma nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma fosfoproteína cofator de polimerase (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, com um clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e com um vetor que compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína grande de RNA polimerase (L) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado,

b) transferir a mencionada célula recombinante ou cultura de células recombinantes em células competentes para sustentar a replicação e produção de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e

c) recuperar o vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, recombinante, infeccioso a partir da co-cultura da etapa (b).

[073] Um segundo método de acordo com a presente invenção é um método para produzir vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, recombinante, infeccioso, que compreende ou consiste de:

a) recombinar uma célula ou uma cultura de células que produzem de forma estável uma RNA polimerase, a nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e a fosfoproteína co-fator de polimerase (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, com um clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e com um vetor que compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína grande de RNA polimerase (L) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e

b) recuperar o vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, recombinante, infeccioso, a partir das mencionadas células recombinantes ou cultura de células recombinantes.

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33/63 [074] Da forma utilizada no presente pedido, “recombinação” indica a introdução de pelo menos um polinucleotídeo em uma célula, por exemplo, sob a forma de um vetor, dito polinucleotídeo sendo integrado (inteiramente ou parcialmente) ou não integrado ao genoma celular (tal como definido acima) De acordo com uma realização particular a recombinação pode Sr obtida com um primeiro polinucleotídeo que é um clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, cuja definição, natureza, e modificações opcionais são discutidas pela presente invenção. A recombinação pode, adicional ou alternativamente, compreender a introdução de um polinucleotídeo que é um vetor que codifica uma proteína grande de RNA polimerase (L) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, cuja definição, natureza e estabilidade de expressão são descritos no presente pedido.

[075] Nestes métodos, a célula ou a cultura de células que produzem, de forma estável, uma RNA polimerase, uma nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma fosfoproteína cofator de polimerase (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, é uma célula conforme definida na presente invenção ou uma cultura de células conforme aqui descrita, ou seja, são ainda células recombinantes que sejam modificadas pela introdução de um ou mais polinucleotídeos conforme descrito acima. Em uma realização particular da presente invenção, a célula ou cultura de células, que produzem de forma estável a RNA polimerase, as proteínas N e P, não produzem a proteína L de um de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado ou não produzem de forma estável a proteína L de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou seja, permitindo sua expressão ou produção transitória.

[076] Da forma utilizada no presente, “transferência” refere-se ao plaqueamento das células recombinantes em um tipo diferente de células, e

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34/63 particularmente, em monocamadas de um tipo diferente de células. Estas últimas células são competentes para sustentar tanto a replicação quanto a produção de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentada, recombinante, infeccioso, ou seja, respectivamente, a formação de vírus infecciosos dentro das células e possivelmente, a liberação destes vírus infecciosos para fora das células. Esta transferência resulta na co-cultura das células recombinantes de acordo com a presente invenção com células competentes conforme definidas acima. A transferência acima pode ser uma etapa adicional, ou seja, opcional, quando as células recombinantes não são uma cultura produtora de vírus de forma eficiente, ou seja, que vírus infecciosos não podem ser recuperados de forma eficiente a partir destas células recombinantes. Esta etapa é introduzida após recombinação adicional das células recombinantes da invenção com um clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e opcionalmente, um vetor que compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína grande de RNA polimerase (L) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado.

[077] Em uma realização particular da presente invenção, a etapa de transferência é necessária uma vez que as células recombinantes, normalmente selecionadas pela sua capacidade de ser facilmente recombinada, não são suficientemente eficiente na sustentação e produção de vírus infeccioso recombinante. Na mencionada realização, a célula ou cultura de células da etapa (a) dos métodos descritos acima, é uma célula recombinante ou uma cultura de células recombinantes de acordo com a presente invenção, em particular, células HEK-293 recombinantes, tal como a linhagem celular 293-T7-NP depositada com CNCM em 14 de junho de 2006, sob o número I-3618 ou a linhagem celular de vírus de sarampo (MV) 293nlsT7-NP depositada com CNCM em 4 de agosto de 2006, sob o número I3662.

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35/63 [078] Células competentes para sustentar a replicação e produção de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado pode ser qualquer tipo de célula que pode ser co-cultivada com as células recombinantes de acordo com a presente invenção, mas não necessariamente células do mesmo reino, filo, classe, ordem, família, gênero ou espécie. Exemplos de células competentes são células Vero (rim de macaco verde africano) ou células CEF (fibroblasto de embrião de frango). Células CEF podem ser preparadas a partir de ovos de frango fertilizados, conforme obtidos a partir de EARL Morizeau (8 rue Moulin, 28190 Dangers, France), qualquer outro produtor de ovos de frango fertilizados ou a partir de células MRC5 (ATCC CCL171; fibroblasto de pulmão).

[079] Em outra realização da presente invenção, a etapa de transferência não é necessária e, desta forma, não realizada. Esta é uma das vantagens da presente invenção para fornecer um método para produzir um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, recombinante, infeccioso, que é fácil de ser executado, mais rápido e mais barato do que métodos convencionais e permite a recuperação de vírus infecciosos recombinantes livres de contaminantes. Estas características podem ser alcançadas com as células recombinantes da presente invenção que possuem as seguintes características:

- produção estável de uma RNA polimerase, uma nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma fosfoproteína (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e

- a partir das quais virus recombinantes infecciosos podem ser recuperados de forma eficiente, sem contaminações por vírus indesejados e/ou outros tipos de células.

[080] A “recuperação de vírus recombinante infeccioso”, da forma utilizada na presente invenção, refere-se a qualquer meio pelo qual os

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36/63 vírus infecciosos, previamente produzidos pelas células, são liberados pelas células e isolados das células cultivadas. A recuperação é chamada de “direta” quando o vírus recombinante infeccioso é recuperado a partir das células recombinantes da presente invenção, sem envolvimento de outros tipos celulares. Em contraste, a recuperação é denominada “indireta” quando o vírus recombinante infeccioso é recuperado via outro tipo celular, diferente das células recombinantes da presente invenção. Conforme mencionado anteriormente, a presente invenção é a primeira a descrever a recuperação direta de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, recombinante, infeccioso.

[081] Nos métodos particulares da presente invenção, a etapa de recombinação não compreende as etapas de recombinação de uma célula ou uma cultura de células capazes de produzir, de forma estável, uma RNA polimerase, uma nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma fosfoproteína co-fator de polimerase (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, com um vetor que compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína grande de RNA polimerase (L) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado. Neste caso, as células recombinantes da presente invenção foram selecionadas pela sua capacidade de expressar a proteína L proteína e, em particular, foram previamente recombinadas com um vetor que compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína grande de RNA polimerase (L), em que o ácido nucléico que codifica a proteína L é integrado no genoma celular ou não.

[082] Quando vetores apropriados que apresentam proteínas acessórias (proteínas não-P, não-N ou não-L ou não-RNA polimerase) podem ser opcionalmente utilizados nos métodos da presente invenção, particularmente quando um genoma ou um clone de cDNA, que são deletados para estas proteínas, é utilizado. Tais proteínas acessórias são a proteína C, a

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37/63 proteína V, a proteína NS1, a proteína NS2, a proteína M, a proteína M2 e/ou as proteínas SH. Os vetores que contem as seqüências codificantes das mencionadas proteínas acessórias podem opcionalmente compreender uma alça de cDNA conforme descrita acima.

[083] A estabilidade da produção da RNA polimerase, proteína N e proteína P nas células recombinantes de acordo com a presente invenção, leva a algumas vantagens com relação aos métodos descritos no estado da técnica:

- o método da presente invenção não compreende, necessariamente, uma etapa de transferência;

- o método da presente invenção não compreende uma etapa de choque térmico, conforme descrito por Parks et al. (1999). Realmente, esta etapa foi demonstrada como capaz de aprimorar a eficácia da sintase de proteínas N e P virais, bem como RNA polimerase, que são sintetizadas a partir de ácidos nucléicos desenvolvidos em plasmídeos. Na presente invenção, entretanto, os ácidos nucléicos são integrados no genoma celular, e a expressão destas proteínas mostrou-se estável, e/ou a um nível apropriado para iniciar a encapsidação de novo.

- o método da presente invenção produz grandes quantidades de vírus infecciosos, uma vez que a produção de RNA polimerase, proteína N e proteína P é estável, e não depende de sua expressão a partir de plasmídeos. Desta forma, cerca de 100 a 400 dentre as 10⁶ células recombinadas transmitem vírus infecciosos após a recombinação (número de eventos de resgate). Estes resultados são superiores do que o número de 1 a 6 dentre 10⁶células transfectadas obtidas com o método de Radecke et al. (1995). Em uma realização particular do método da presente invenção, o número de eventos resgatados, para 10⁶ células recombinadas, é maior do que 20, maior do que 50, maior do que 100, maior do que 200, maior do que 300, maior do que 400

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38/63 ou maior do que 500.

[084] Finalmente, outra vantagem da presente invenção, é a grande variedade de células que podem ser recombinadas, e utilizadas para a realização da presente invenção. Realmente, as células recombinantes podem ser qualquer célula eucariótica, particularmente, qualquer célula de mamífero, seja célula humana ou célula não-humana. Em uma realização particular, as células recombinantes de acordo com a presente invenção são fibroblastos humanos, especialmente linhagem celular MRC5 (fibroblasto de pulmão humano). A presente invenção é particularmente útil para células que não realizam divisão.

[085] De acordo com a presente invenção, o clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, é de vírus MV, particularmente um vírus atenuado, de preferência, uma linhagem atenuada não-imunosupressiva, ou seja, uma linhagem aprovada para uma vacina, tal como linhagem Schwarz de MV. Um clone de cDNA é uma seqüência de DNA que codifica o anti genoma completo de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado.

[086] Em uma realização particular da presente invenção, as proteínas N, P e L, bem como o clone de cDNA, são derivados do mesmo vírus, que pode ser qualquer vírus listado na tabela 1, particularmente, um vírus MV conforme descrito acima, tal como a linhagem Schwarz MV de vírus de sarampo. As seqüências de nucleotídeos da linhagem Edmonston B e da linhagem Schwarz foram descritas no documento WO 98/13505. Independente da natureza das proteínas N, P e L proteínas, e do clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, a RNA polimerase é a RNA polimerase T7. Uma seqüência de cDNA específica é a seqüência de cDNA da linhagem Schwarz, conforme descrita na SEQ ID NO: 18. O mencionado cDNA pode ser obtido a partir de pTM-MVSchw, que é um plasmídeo derivado de

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Bluescript contendo a seqüência completa de vírus de sarampo, linhagem de vacina Schwarz, sob o controle do promotor da RNA polimerase T7. Seu tamanho é 18967nt.

[087] Alternativamente, o clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, é derivado de qualquer vírus da tabela 1. Um vírus de sarampo recombinante específico do qual o clone de cDNA é derivado, é a linhagem Schwarz e, em particular, uma linhagem Schwarz de vacina aprovada, tal como aquela produzida sob a marca Rouvax, disponível pela Aventis Pasteur (France).

[088] Uma “linhagem atenuada” é definida no presente como uma linhagem que não é virulenta, ou é menos virulenta do que a linhagem parental, no mesmo hospedeiro, enquanto mantém sua imunogenicidade e potencial adjuvante quando administrada em um hospedeiro, ou seja, preservando os epítopos de células T e B imunodominantes e possibilitando o potencial adjuvante tal como a indução de proteínas co-estimulatórias de células T ou a citocina IL-12. Em uma realização particular, a linhagem atenuada é uma “linhagem de vacina aprovada”, ou seja, uma linhagem certificada para uso em produção de vacina por uma autoridade nacional ou regional que possui uma aprovação de mercado concedida para este produto (designação legal). Assim, uma “linhagem de vacina aprovada” é segura, estável e capaz de fornecer proteção eficaz (imunogenicidade e potencial adjuvante). A estabilidade de uma linhagem é medida através da determinação de se as propriedades da linhagem permanecem substancialmente sem modificação após várias passagens na mesma linhagem celular certificada.

[089] “Derivado de”, da forma utilizada no presente, indica qualquer clone de cDNA cuja seqüência de nucleotídeo é modificada, conforme comparada a seqüência de nucleotídeos do vírus ou linhagem do tipo selvagem. Esta modificação pode ser pelo menos uma substituição, deleção ou

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40/63 inserção na seqüência de nucleotídeos e, particularmente, na seqüência codificante de uma proteína da linhagem ou vírus. Em outra realização, a seqüência de nucleotídeos é modificada pela inserção de pelo menos um ácido nucléico heterólogo, ou seja, uma seqüência que não está naturalmente presente no vírus ou na linhagem na qual o pelo menos um ácido nucléico é inserido ou uma seqüência que não é derivada dos antígenos de vírus de sarampo. Adicionalmente, o clone de cDNA pode ser modificado por deleção de partes do genoma viral do tipo selvagem, e inserção de ácidos nucléicos heterólogos.

[090] Em uma realização preferencial, aponta-se que o clone de cDNA derivado, consistindo ou compreendendo um ou mais ácidos nucléicos heterólogos, cumpre com a regra dos 6. Portanto, o clone de cDNA derivado é um comprimento polihexamérico, ou seja, é um múltiplo de seis. Este requisito é particularmente alcançado pelos clones de cDNA derivados de Paramyxoviridae, e em particular vírus do sarampo. Alguns vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, não cumprem com a mencionada regra, conforme conhecido pelos técnicos no assunto.

[091] Qualquer ácido nucléico heterólogo pode ser inserido na seqüência de nucleotídeos do clone de cDNA, desde que a inserção não previna a produção de vírus de fita negativa, não segmentado, recombinante, infeccioso (sítios permissivos). Em uma realização particular, a inserção ou deleção do genoma viral nativo fornece um polinucleotídeo que é múltiplo de seis. Portanto, embora o comprimento do genoma não seja múltiplo de seis, a modificação consiste de seis deleções e/ou inserções, ou deleções e/ou inserções múltiplas de seis.

[092] Assim, as seqüências de ácido nucléico heterólogas podem codificar um ou mais peptídeos capazes de desenvolver uma resposta imune humoral e/ou celular (tal como resposta CTL ou CD4) em um hospedeiro

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41/63 determinado, contra o organismo ou organismos, particularmente organismos patogênicos, por exemplo, vírus, em particular, retrovírus, flavivírus ou coronavírus, de bactérias ou parasitas dos quais eles se originam. Conseqüentemente, a seqüência de aminoácidos deste peptídeo é uma que compreende pelo menos um epítopo de um antígeno, em particular, um epítopo conservado, em que este epítopo é naturalmente exposto ao antígeno ou é obtido ou exposto como um resultado de uma mutação ou modificação ou combinação de antígenos. Ácidos nucléicos heterólogos, que podem ser inseridos nos clones de cDNA, codificam particularmente antígenos estruturais (incluindo fragmentos antigênicos dos mesmos ou derivados destes antígenos ou fragmentos) de vírus incluindo retrovírus tais como retrovírus humano, em particular, lentivírus, de preferência, envelope de coronavírus ou flavivírus de HIV-1 ou HIV-2, tal como antígeno de envelope ou capsídeo. Particularmente, estes antígenos são, de preferência, de envelopes de vírus da AIDS, incluindo HIV-1 ou HIV-2, de capsídeo de HIV ou de envelopes de vírus da febre amarela, ou envelopes de vírus do Nilo ocidental (West Nile Virus), ou ainda de envelopes do vírus da dengue (DV), envelopes do vírus da encefalite japonesa (JEV) ou envelope de coronavírus associado à SARS. Outros antígenos retrovirais, flavivirais ou coronavirais podem, entretanto, ser vantajosamente utilizados de forma a fornecer vírus de sarampo recombinantes capazes de elicitar anticorpos os mencionados retrovírus ou flavivírus, e/ou capazes de elicitar a produção de anticorpos neutralizantes contra o retrovírus ou flavivírus. Em outra realização, o peptídeo codificado ou compreendido pelas seqüências de ácido nucléico heterólogas é um antígeno tumoral ou um antígeno especificamente expressado na superfície celular de células cancerosas. De acordo com outra realização da presente invenção, as seqüências codificam multi epítopos ou antígenos que, alternativamente ou adicionalmente, também elicitam uma resposta imune celular contra o retrovírus ou flavivírus.

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42/63 [093] Vantajosamente, o vírus de sarampo recombinante produzido pelo método da presente invenção pode também elicitar uma resposta imune celular e/ou humoral contra o vírus do sarampo. Esta resposta não é, entretanto, obrigatória, desde que a resposta imune contra o epítopo ou multiepítopos ou antígenos descrita acima seja de fato obtida.

[094] Em uma realização preferida da presente invenção, o ácido nucléico heterólogo codifica uma proteína a partir de um retrovírus de HIV, em particular, um antígeno de envelope de HIV e, preferencialmente, um peptídeo derivado de uma proteína ou glicoproteína de envelope de HIV-1 ou HIV-2. Os antígenos de interesse neste sentido são particularmente gp160, gp120 e gp41 de HIV-1 ou gp140, GAG ou TAT de HIV-1. Em uma realização particular da presente invenção, a seqüência de aminoácidos heteróloga é derivada de um gp160, gp120 de HIV-1 ou gp140, GAG ou TAT de HIV-1 recombinante.

[095] Em outra realização, os loops V1, V2 e/ou V3 do antígeno gp120 (ou gp160) são deletados completamente ou parcialmente, individualmente ou em combinação de forma que os epítopos conservados sejam expostos no antígeno GP 120 recombinante obtido. Os loops V1, V2 e V3 do antígeno gp120 (ou gp160) de HIV-1 foi especificamente descrito nos campos da virologia (Fields B.N. et al. Editora Lippincott Raven 1996, p. 19531977).

[096] Em outra realização, o ácido nucléico heterólogo codifica um peptídeo que é derivado do antígeno gp120 (ou gp160) de HIV-1, em que os loops V1, V2 e/ou V3 do antígeno gp120 (ou gp160) são substituídos completa ou parcialmente, individualmente ou em combinação, de forma que os epítopos conservados sejam expostos no antígeno gp 120 recombinante obtido (ou gp160).

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43/63 [097] Em outra realização, o ácido nucléico heterólogo que codifica um peptídeo que é derivado de um antígeno de envelope de HIV-1, particularmente, é derivado do antígeno gp 120 de forma que os loops V1 e V2 são deletados e o loop V3 é substituído pela seqüência AAELDKWASAA.

[098] Em outra realização, o ácido nucléico heterólogo codifica um peptídeo que é gp160AV3, gp160AV1V2, gp160AV1V2V3, gp140AV3, gp140AV1V2, gp140AV1V2V3.

[099] Clones de cDNA preferidos, que contém epítopos de HIV,

WNV, YFV, DV ou JEV são vetores definidos na tabela II, depositados na CNCM (Coleção nacional de cultura de microorganismos - Institut Pasteur Paris, France), e cujas características são dadas abaixo.

Tabela II: Linhagem da qual a seqüência é derivada	Nome do vetor	Número de depósito	Data de depósito
Linhagem Edmonston B.	pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P	CNCM I-2883	12 de Junho de 2002
pMV2(EdB)gp160HIV89.6P	CNCM I-2884
pMV2(EdB)gp140HIV89.6P	CNCM I-2885
pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P	CNCM I-2886
pMV2(EdB)-NS1YFV17D	CNCM I-2887
pMV2(EdB)-EnvYFV17D	CNCM I-2888
Linhagem Schwarz	pTM-MVSchw2-Es(WNV)	CNCM I-3033	26 de Maio de 2003
pTM-MVSchw2-GFPbis	CNCM I-3034
pTM-MVSchw2-p17p24[delta]myr{HIVB)	CNCM I-3035
pTM-MVSchw3-Tat(HIV89-6p)	CNCM I-3036
pTM-MVSchw3-GFP	CNCM I-3037
pTM-MVSchw2-Es (YFV)	CNCM I-3038
pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6)	CNCM I-3054	19 de Junho

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Tabela II: Linhagem da qual a seqüência é derivada	Nome do vetor	Número de depósito	Data de depósito
	pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V3 (HIV89-6)	CNCM I-3055	de 2003
	pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6)	CNCM I-3056
	pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 (HIV89-6)	CNCM I-3057
	pTM-MVSchw2-Gag SIV239 p17-p24 [delta] myr-3-	CNCM I-3058
	gp140 (HIV89-6)
	pTM- MVSchw2 [EDIII + M^1-40]WNV (IS-98-ST1)	CNCM I-3440
	pTM- MVSchw2 [EDIII + apoptoM]DV1 (FGA89)	CNCM I-3442	26 de Maio
	pTM- MVSchw2 [EDIII] JEV (Nakayama)	CNCM I-3441	de 2005

[0100] I-2883 (pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo a seqüência completa do virus de sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7, e contendo o gene de gp160AV3 + ELDKWAS do vírus SVIH linhagem 89.6P inserido em um ATU na posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é 21264nt.

[0101] I-2884 (pMV2(EdB)gp160HIV89.6P) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo a seqüência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e contendo o gene de gp160 do vírus SVIH linhagem 89.6P inserido em uma ATU na posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é 21658 nt.

[0102] I-2885 (pMV2(EdB)gp140HIV89.6P) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo a seqüência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e contendo o gene de gp140 do vírus SVIH linhagem 89.6P inserido em ATU na

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45/63 posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é 21094 nt.

[0103] I-2886 (pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo a seqüência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e contendo o gene do gp140AV3(ELDKWAS) do vírus SVIH linhagem 89.6P inserido em ATU na posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é 21058 nt.

[0104] I-2887 (pMV2(EdB)-NS1YFV17D) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo a seqüência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e contendo o gene NS1 do vírus de febre amarela (YFV 17D) inserido em ATU na posição 2 (entre os genes N e P do vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é 20163 nt.

[0105] I-2888 (pMV2(EdB)-EnvYFV17D) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência completa do vírus do sarampo (linhagem Edmonston B), sob o controle do promotor de RNA polimerase T7 e contendo o gene Env do vírus de febre amarela (YFV 17D) inserido em ATU na posição 2 (entre os genes N e P de vírus do sarampo). O tamanho do plasmídeo é 20505 nucleotídeos (nt).

[0106] I-3033 (pTM-MVSchw2-Es(WNV)) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso complete do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor T7 RNA polimerase e expressando o gene do envelope secretado (E) do vírus do Nilo ocidental (WNV), inserido em uma ATU.

[0107] I-3034 (pTM-MVSchw2-GFPbis) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle

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46/63 do promotor T7 RNA polimerase e expressando o gene do GFP inserido em uma ATU.

[0108] I-3035 (pTM-MVSchw2-p17p24[delta]myr(HIVB)) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso complete do vírus de sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor T7 RNA polimerase e expressando o gene do gene gag codificando proteínas p17p24Amyr do vírus HIVB inserido na ATU.

[0109] I-3036 (pTMVSchw3-Tat(HIV89-6p)) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz) sob o controle do promotor T7 RNA polimerase e expressando o gene do gene Tat da linhagem viral 89.6P inserida na ATU.

[0110] I-3037 (pTM-MVSchw3-GFP) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus de sarampo (linhagem Schwarz) sob o controle do promotor T7 RNA polimerase e expressando o gene do gene GFP inserido em uma ATU que possui uma deleção de um nucleotídeo.

[0111] I-3038 (pTM-MVSchw2-Es) (YFV) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus de sarampo (linhagem Schwarz) sob o controle do promotor T7 RNA polimerase e expressando o gene da proteína secretada do vírus da febre amarela (YFV) inserido em uma ATU.

[0112] I-3054 (pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V1 V2 V3 (HIV896)) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus de sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor T7 RNA polimerase e expressando o gene que codifica gp140 [delta] V1 V2 (HIV 89-6) inserido na ATU.

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47/63 [0113] I-3055 (pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V3 (HIV89-6)) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus de sarampo (linhagem Schwarz) sob o controle do promotor T7 RNA polimerase e expressando o gene que codifica gp14 [delta] V3 (HIV 89-6) inserido na ATU.

[0114] I-3056 (pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV896)) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus de sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor T7 RNA polimerase e expressando o gene que codifica gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV 89-6) inserido na ATU.

[0115] I-3057 (pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 (HIV89-6)) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus de sarampo (linhagem Schwarz), sob o controle do promotor T7 RNA polimerase e expressando o gene que codifica gp160 [delta] V1 V2 (HIV 89-6) inserido na ATU.

[0116] I-3058 (pTM-MVSchw2-Gag SIV239 p17-p24 [delta] myr3-gp140 (HIV89-6)) é um plasmídeo derivado de Bluescript contendo uma seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus do sarampo (linhagem Schwarz) sob o controle do promotor T7 RNA polimerase, expressando o gene que codifica Gag S1V239 p17-p24 [delta] myr-3-gp140 (HIV89-6) inserido na ATU.

[0117] I-3440 (pTM-MvSchw2-[EDIII+M^1-40] WNV (IS-98-ST1)) é um plasmídeo derivado de PTM contendo a seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus de sarampo (linhagem Schwarz) e uma unidade de expressão adicional localizada entre os genes P e M, sendo que a mencionada unidade contém a seqüência de nucleotídeos do domínio III da proteína de envelope do vírus do Nilo ocidental (WNV) (WNV IS-98-ST1) fundido à seqüência 1-40 da proteína de membrana M.

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48/63 [0118] I-3442 (pTM-MvSchw2-[EDIII+ApoptoM] DV1 (FGA89)) é um plasmídeo derivado de PTM que contém a seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus de sarampo (linhagem Schwarz) e uma unidade de expressão adicional localizada entre os genes P e M, sendo que a mencionada unidade contem a seqüência de nucleotídeos do domínio III da proteína de envelope do vírus da dengue I (linhagem FGA89) fundida à seqüência apoptótica da proteína de membrana M.

[0119] I-3441 (pTM-MvSchw2-[EDIII] JEV (Nakayama)) é um plasmídeo derivado de PTM contendo a seqüência de cDNA do genoma infeccioso completo do vírus de sarampo (linhagem Schwarz) e uma unidade de expressão adicional localizada entre os genes P e M, sendo que a mencionada unidade contém a seqüência de nucleotídeos do domínio III da proteína de envelope do vírus da encefalite japonesa (JEV), linhagem Nakayama.

[0120] Em uma realização particular, o ácido nucléico heterólogo codifica um peptídeo que é derivado de um antígeno do vírus da febre amarela selecionado entre as proteínas de envelope (Env), a proteína NS1 ou mutantes imunogênicos das mesmas. Quando a seqüência de DNA heteróloga presente no vetor do vírus de sarampo recombinante da presente invenção é derivada do vírus da febre amarela (YFV), ela é vantajosamente selecionada entre YFV 17D 204 comercializado pela Aventis Pasteur sob a marca Stamaril®.

[0121] Em outra realização particular, o ácido nucléico heterólogo codifica um peptídeo que é derivado de um antígeno do vírus do Nilo ocidental selecionado entre as proteínas de envelope (E), pré-membrana (preM) ou mutantes imunogênicos das mesmas. Quando a seqüência de DNA heterólogo presente no vetor do vírus de sarampo recombinante da presente

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49/63 invenção é derivada do vírus do Nilo ocidental (WNV), ele é vantajosamente selecionada entre a linhagem neurovirulenta IS 98-ST1.

[0122] O ácido nucléico heterogêneo pode codificar um antígeno específico de tumor (TSA) ou um antígeno associado a tumor (TAA).

[0123] Outra vantagem da presente invenção é a possibilidade de inserir no clone de cDNA de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, um ácido nucléico heterólogo longo ou uma série de ácidos nucléicos heterólogos. Portanto, o clone de cDNA pode ser modificado pela inserção de um ou mais ácidos nucléicos heterólogos cuja seqüência total é pelo menos 5 kb.

[0124] A presente invenção refere-se a cada e qualquer fragmento de ácido nucléico contido nos polinucleotídeos inseridos nos plasmídeos depositados referenciados no presente, e particularmente, a cada e qualquer região apropriada para desenvolver o inserto, de acordo com a presente descrição. A presente invenção refere-se ainda ao uso destes fragmentos para a construção dos plasmídeos da presente invenção.

[0125] A presente invenção refere-se ainda a métodos para a produção de células recombinantes que expressam de forma estável as três ou pelo menos as três proteínas a seguir, quais sejam, uma RNA polimerase, uma nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e uma fosfoproteína (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou derivados funcionais das mesmas, em que o método compreende ou consiste de:

a) recombinar uma célula com pelo menos:

- um vetor de expressão que compreende uma alça de DNA, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma RNA polimerase,

- um vetor de expressão que compreende uma alça de DNA, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína N de

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50/63 um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e

- um vetor de expressão que compreende uma alça de DNA, e pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína P de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado; e

b) seleção das células que produzem de forma estável pelo menos uma RNA polimerase, a nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma fosfoproteína (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou seus derivados funcionais; ou

a) recombinar uma célula com pelo menos um vetor de expressão que compreende:

- pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma RNA polimerase sob o controle de um promotor,

- pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína N de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado sob o controle de um promotor, e

- pelo menos uma cópia de um ácido nucléico que codifica uma proteína P de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado sob o controle de um promotor, e

- uma alça de DNA; e

b) selecionar as células que produzem de forma estável pelo menos uma RNA polimerase, a nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma fosfoproteína (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou seus derivados funcionais.

[0126] Em uma realização específica da presente invenção, o método para a produção de células recombinantes compreende adicionalmente a recombinação das células recombinantes obtidas na etapa (a) do método acima, com um vetor de expressão que compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína grande da RNA polimerase (L) ou seu derivado funcional,

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51/63 de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e seleção das células que produzem de forma estável pelo menos uma RNA polimerase, a nucleoproteína (N) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado e uma fosfoproteína (P) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, e que produz uma proteína grande (L) de um vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, ou seus derivados funcionais.

[0127] A presente invenção refere-se adicionalmente, ao uso das células recombinantes de acordo com a presente invenção, conforme descritas na presente descrição, como células auxiliares, em particular, como células auxiliares na produção de vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, recombinante, infeccioso.

[0128] Realizações e características adicionais da presente invenção são descritas nos exemplos a seguir e figuras.

Exemplos [0129] A presente invenção será adicionalmente descrita nos exemplos a seguir, que não limitam o escopo da presente invenção descrito e presente nas reivindicações.

Células e Vírus [0130] Células Vero (rim de macaco verde africano) foram crescidas como monocamadas em um meio Eagle modificado com Dulbecco (DMEM) suplementado com 5% de soro fetal de bezerro (FCS). Células 293 (HEK-293) de rim humano foram crescidas em meio DMEM suplementado com 10% FCS. Células MRC5 diplóides humanas foram crescidas como monocamadas em meio DMEM suplementado com 10% FCS. Células fibroblásticas de embrião de frango (CEF) foram preparadas conforme segue: ovos de frango fertilizados (Morizeau, Dangers, France) foram incubados a 38°C por 9 dias. Os embriões foram coletados sob condições estéreis. A cabeça, os membros e as vísceras foram removidos e os embriões foram

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52/63 cortados e então submetidos a tripsina por 5 a 10 minutos a 37°C (Tripsina/EDTA 2,5 g/l). Após filtração (70 μm) e diversas lavagens em meio DMEM com alta concentração de glicose /10% FCS, as células foram semeadas (5 a 7 x10⁶ células por placa de Petri) e incubadas por uma noite a 37°C antes do uso para infecção viral.

Construções de Plasmídeo [0131] De forma a permitir a fácil recombinação de seqüências adicionais utilizando o sistema de recombinação Gateway® (Invitrogen), o cassete Gateway® (attbl/attb2 Seq) foi introduzido por ligação no vetor plasmidial HIV-1-TRIP-AU3-BSX (Zennou et al., 2000) linearizado por digestão com Smal. O gene da RNA polimerase T7 foi amplificado a partir do plasmídeo pAR-1173 (Brookhaven National Laboratory, ref) por PCR utilizando DNA polimerase PfuTurbo (Stratagene) e os seguintes primers, contendo as seqüências de recombinação Gateway® (sublinhadas):

AttB1 -T7Pol: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGG

AATTCTCTGACATCGAACTGGCT-3'

AttB2-retourT7Pol: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCAC

GCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3'

A forma nuclear da RNA polimerase T7 (nlsT7) também foi amplificada a partir do plasmídeo pAR-3288 (Brookhaven National Laboratory, ref) utilizando os seguintes primers que contem uma localização sinal nuclear (em negrito) e as seqüências de recombinação Gateway® (sublinhadas): AttBI-SV40nls: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATG

GCACCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3'

AttB2-retourT7Pol: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCACG

CGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3' [0132] Utilizando o mesmo acesso, os genes N e P do vírus de sarampo Schwarz MV foram amplificados por PCR a partir do plasmídeo pTMPetição 870190010487, de 31/01/2019, pág. 71/102

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MVSchw, que contem um antigenoma de Schwarz MV infeccioso de comprimento completo (Combredet et al., 2003). Os seguintes primers que contem as seqüências de recombinação Gateway® (sublinhadas) foram utilizados:

AttB1 -N: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCCACAC

TTTTAAGGAGCTTAGCA-3'

AttB2-N: 5'-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTGTACTAGTCTAG

AAGATTTCTGTCATTGTA-3'

AttB1 -P: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCAGAAG

AGCAGGCACGCCAT-3'

AttB2-P: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACTACTTCAT

TATTATCTTCATCAGCATCTGGTGGA-3' [0133] Os fragmentos de PCR diferentes que codificam a RNA polimerase T7, a RNA polimerase nlsT7 e as proteínas N e P de MV foram então introduzidos no plasmídeo de entrada pDONR™207 (Invitrogen) e recombinados no plasmídeo HIV-1-TRIP-AU3-BSX modificado utilizando o sistema de recombinação Gateway® (Invitrogen). Os plasmídeos vetores recombinantes diferentes obtidos (HIV-1-TRIP delta U3.CMV-T7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-nlsT7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-N e HIV-1-TRIP delta U3.CMVP) foram completamente seqüenciados. Estes vetores foram depositados com a CNCM em 14 de dezembro de 2006, sob os seguintes números respectivos: I-3702, I-3703, I-3700 e I-3701.

[0134] O plasmídeo pEMC-LSchw que expressa a proteína grande de polimerase (L) de Schwarz MV foi construído de forma similar, conforme descrito por Radecke et al. (1995). A seqüência longa de 6552 nucleotídeos do gene L de Schwarz foi obtido a partir do plasmídeo pTMMVSchw (Combredet et al., 2003) e inserido no plasmídeo pEMC-La anteriormente descrito em Radecke et al. (1995), utilizando procedimentos de

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54/63 clonagem clássicos. Este plasmídeo foi depositado com a CNCM em 18 de dezembro de 2007 sob o número I-3881.

Produção de Partículas de Vetor [0135] As partículas de vetor foram produzidas por cotransfecção de células HEK-293 utilizando o procedimento de fosfato de cálcio com os plasmídeos vetores: HIV-1-TRIP delta U3.CMV-T7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-nlsT7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-N, ou HIV-1-TRIP delta U3.CMV-P, um plasmídeo de encapsidação que expressa genes HIV-1 gag e pol, e um plasmídeo que expressa a glicoproteína de envelope VSV-G (pHCMV-G), conforme descrito em Zennou et al., 2000. A quantidade de antígeno Gag p24 no choque de partículas de vetor concentradas por ultra-centrifugação foi determinada pelo uso de HIV-1 p24 ELISA (Perkin Elmer LifeSciences).

Geração de Linhagens Celulares 293-T7-MV [0136] As células (HEK-293) foram semeadas em cavidades de 35 mm um dia antes da transdução pelos vetores lentivirais TRIP-T7 e TRIPnlsT7. Os vetores (500 ng/ml p24) foram adicionados em meio DMEM suplementado com 10% FCS. Durante 8 dias, a mesma quantidade de vetor foi repetidamente adicionada a cada dia nas células. As células foram expandidas a cada dois dias. Após cada passagem, a atividade RNA polimerase T7 das células foi determinadas. Uma cultura celular de 35 mm foi transfectada com 5 pg of pEMC-Luc utilizando o procedimento de fosfato de cálcio, e a atividade luciferase em 1/20 do lisato celular claro coletado um dia após a transfecção foi mensurada em um luminômetro. A atividade luciferase aumentou após cada transdução adicional, e permaneceu no máximo entre a sétima e oitava transdução. A ausência da citotoxicidade da expressão de RNA polimerase T7 foi demonstrada após cada transdução através da quantificação da viabilidade celular utilizando o método de exclusão de tripano azul e comparação com células não transduzidas. Após 8 etapas de transdução, duas populações

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55/63 celulares foram geradas com uma atividade muito alta de RNA polimerase T7, populações citoplasmáticas (293-T7) ou nucleares (293-nlsT7).

[0137] As duas populações celulares (293-T7 e 293-nlsT7) foram então co-transduzidas simultaneamente pelos vetores TRIP-N e TRIP-P. Os vetores (TRIP N: 390 ng/ml p24 e TRIP P: 330 ng/ml p24) foram adicionados nas células semeadas em cavidades de 35 mm. Durante 10 dias, a mesma quantidade de ambos os vetores foi repetidamente adicionada a cada dia sobre as células. As células foram expandidas a cada dois dias. Após 10 rodadas de transdução, a expressão das proteínas N e P de MV foi analisada nas populações celulares totais por western blotting utilizando 1/20 do lisato total de uma cavidade de 35 mm. A expressão de ambas as proteínas foi comparada à expressão de um número similar de células Vero infectadas (Figura 2). As células transduzidas foram então clonadas por limitação da diluição. As células foram semeadas em placas de 96 cavidades a uma diluição de 1/3 de células por cavidade. Após 2 semanas, os primeiros clones foram selecionados. Cerca de 100 clones de cada célula 293-T7-NP e 293-nlsT7-NP foram expandidos para placas de 24 cavidades, então para cavidades de 35 mm. A expressão das proteínas N e P de MV foi analisada nos 20 clones por western blotting utilizando 1/20 do lisato total de uma cavidade de 35 mm. A expressão de ambas as proteínas foi comparável à expressão de número similar de células Vero infectadas (Figura 2). A atividade da RNA polimerase T7 foi medida para cada clone conforme descrito acima. Um número de clones com atividade luciferase muito alta e um nível similar de expressão de N e P de MV foram selecionadas. Os clones, listados abaixo, foram amplificados e congelados a -180°C e meio DMEM/30%FCS/10%DMSO a uma densidade de 10⁷ células/ml: 293-T7-NP1, 293-T7-NP3, 293-T7-NP5, 293-T7-NP7, 293-T7NP8, 293-T7-NP10, 293-T7-NP13, 293-T7-NP14, 293-T7-NP20, 293-T7-NP28, 293-T7-NP31, 293-T7-NP33, 293-nlsT7-NP1, 293-nlsT7-NP5, 293-nlsT7-NP6,

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293-nlsT7-NP13, 293-nlsT7-NP14, 293-nlsT7-NP15, 293-nlsT7-NP30 e 293nlsT7-NP40.

Resgate de Schwarz MV Utilizando Células Auxiliares 293-T7-NP e 293NLST7-NP [0138] Para avaliar a capacidade de diferentes clones de células 293-T7-NP e 293-nlsT7-NP auxiliares gerados para resgatar de forma eficiente MV de cDNA, foi utilizado o plasmídeo pTM-MVSchw-eGFP (Combredet et al., 2003) para resgatar uma linhagem Schwarz MV recombinante que expressa a proteína fluorescente verde (eGFP). Foi utilizado um sistema similar conforme anteriormente descrito (Radecke et al., 1995; Parks et al., 1999; Combredet et al., 2003). As células auxiliares 293-T7-NP ou 293-nlsT7-NP foram transfectadas utilizando o procedimento de fosfato de cálcio com pTM-MVSchw-eGFP (5pg) e o plasmídeo pEMC-LSchw que expressa o gene (L) polimerase de Schwarz MV (20-100 ng). Após uma noite de incubação a 37° C, o meio de transfecção foi substituído por meio fresco e as células sofreram choque térmico a 43° C por 3 horas, sendo então retornadas a 37°C (22). Após dois dias de incubação a 37° C, as células transfectadas foram transferidas em monocamadas de células Vero, CEF ou MRC5 e incubadas a 37° C em placas de 10 cm, exceto para CEF que foram incubadas a 32° C. As células fluorescentes apareceram rapidamente após 2 a 3 dias de co-cultivo em células Vero, CEF ou MRC5. As células infectadas expandiram rapidamente no foco. O vírus recombinante foi altamente sincicial em células Vero e não-sincicial em células CEF e MRC5. Focos únicos infecciosos ou sincicial foram transferidos para cavidades de 35 mm de células Vero, CEF ou MRC5, e então expandidos para placas maiores por adição de células frescas. O vírus foi coletado de células CEF ou MRC5 após 5 dias de infecção, a partir de células Vero quando sincicia envolveu de 80 a 90% da cultura (normalmente após 2 dias) pela raspagem de células infectadas,

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57/63 congelamento de degelo das células e do meio, e centrifugação para remover resíduos celulares. Estas produções virais foram tituladas utilizando o método de titulação TCID50. Em resumo, as células Vero foram semeadas em placas de 96 cavidades (7500 células/cavidade) e infectadas por diluições em série 1:10 da amostra de vírus em meio DMEM/5% FCS. Após incubação a 37°C por 7 dias, as células foram manchadas com cristal violeta e foi determinada a diluição do vírus que resultou na infecção em 50% das unidades testadas. O ponto final de 50% descrito como dose de infecção de cultura de tecido (TCID50) foi calculado pelo método Karber (3). O vírus recombinante resgatado e crescido em células Vero teve um título de 10⁷ a 10⁸ TCID50/ml, e o vírus resgatado e crescido em células CEF ou MRC5 teve títulos menores, de 10⁴ a 10⁶ TCID50/ml.

[0139] A presente invenção fornece a tecnologia para a construção e produção de vetores recombinantes, particularmente vetores lentivirais do vírus da imunodeficiência humana (HIV)-TRIP, que expressam a RNA polimerase T7 e as proteínas N e P da linhagem Schwarz de sarampo, sob o controle do promotor citomegalovírus (CMV). Estes vetores podem ser utilizados para transduzir de forma eficiente, in vitro e a altos níveis, quase todas as células, em particular, células de mamíferos ou humanas. Tais células podem ser utilizadas como células auxiliares/transcomplementares capazes de gerar vírus de sarampo recombinante de novo após transfecção pelo cDNA antigenômico viral infeccioso de comprimento total ou por clones de cDNA modificados conforme descrito acima.

[0140] A presente invenção permite o resgate de qualquer vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, tais como vírus do sarampo, a partir de cDNA, opcionalmente modificado, sem a contaminação por qualquer outro vírus auxiliar tal como vírus da varíola. Devido à alta eficácia de transfecção de vetores lentivirais, este método permite a geração de células que expressam

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58/63 um nível muito alto de proteínas auxiliares. Uma vez que a recombinação com base em retrovírus, em particular recombinação com base em lentivírus, de DNA exógeno em DNA cromossômico é genuína, quando comparada a recombinação baseada em ilicitação plasmidial, as células auxiliares geradas pelo presente método são muito estáveis e sua alta eficácia no resgate de vírus de RNA de fita negativa, não segmentado, a partir de cDNA é mantida após inúmeras passagens em série.

Bibliografia

Arnebom, P., G. Biberfeld, M. Forsgren, and L. V. von Stedingk. 1983. Specific and non-specific B cell activation in measles and varicella. Clin Exp Immunol 51:165-72.

Baron, M. D., and T. Barrett. 1997; Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J Virol 71:1265-71.

Buchholz, U. J., H. Granzow, K. Schuldt, S. S. Whitehead, B. R. Murphy, and P. L. Collins. 2000. Chimeric bovine respiratory syncytial virus with glycoprotein gene substitutions from human respiratory syncytial virus (HRSV): effects on host range and evaluation as a live-attenuated HRSV vaccine. J Virol 74:1187-99.

C.D.C. 2005. Progress in reducing measles mortality-worldwide, 1999-2003. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 54:200-203.

Calain, P., and L. Roux. 1993. The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J Virol 67:482230.

Clarke, D. K., M. S. Sidhu, J. E. Johnson, and S. A. Udem. 2000. Rescue of mumps virus from cDNA. J Virol 74:4831-8.

Collins, P. L, M. G. Hill, E. Camargo, H. Grosfeld, R. M. Chanock, and B. R. Murphy. 1995. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription

Petição 870190010487, de 31/01/2019, pág. 77/102

59/63 elongation factor from the 5 proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. Proc Natl Acad SciUSA92:11563-7.

Combredet, C, V. Labrousse-Najburg, L. Mollet, C. Lorin, F. Delebecque, B. Hurtrel, H. McClure, M. Feinberg, M. Brahic, and F. Tangy. 2003. A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice. Journal of Virology 77:11546-11554.

Das, S. C, M. D. Baron, and T. Barrett. 2000. Recovery and characterization of a chimeric rinderpest virus with the glycoproteins of pestedes-petits-ruminants virus: homologous F and H proteins are required for virus viability. J Virol 74:9039-47.

Durbin, A. P., S. L. Hall, J. W. Siew, S. S. Whitehead, P. L. Collins, and B. R. Murphy. 1997. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology 235:323-32.

Enders, J. F., and T. C. Peebles. 1954. Propagation in tissue cultures od cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277-286.

Finke, S., and K. K. Conzelmann. 1999. Virus promoters determine interference by defective RNAs: selective amplification of mini-RNA vectors and rescue from cDNA by a 3' copy-back ambisense rabies virus. J Virol 73:3818-25.

Fujii, Y., T. Sakaguchi, K. Kiyotani, C. Huang, N. Fukuhara, Y. Egi, and T. Yoshida. 2002. Involvement of the leader sequence in Sendai virus pathogenesis revealed by recovery of a pathogenic field isolate from cDNA. J Virol 76:8540-7.

Garcin, D., P. Latorre, and D. Kolakofsky. 1999. Sendai virus C proteins counteract the interferon-mediated induction of an antiviral state. J Virol

Petição 870190010487, de 31/01/2019, pág. 78/102

60/63

73:6559-65.

Gassen, U., F. M. Collins, W. P. Duprex, and B. K. Rima. 2000. Establishment of a rescue system for canine distemper virus. J Virol 74:1073744.

Griffin, D. 2001. Measles virus, p. 1401-1441. In D. Knipe and P. Howley (ed.), Field's Virology, 4th Edition, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Philadelphia.

Harty, R. N., M. E. Brown, F. P. Hayes, N. T. Wright, and M. J. Schnell. 2001. Vaccinia virus-free recovery of vesicular stomatitis virus. J Mol Microbiol Biotechnol 3:513-7.

He, B., R. G. Paterson, C. D. Ward, and R. A. Lamb. 1997. Recovery of infectious SV5 from cloned DNA and expression of a foreign gene. Virology 237:249-60.

Hilleman, M. 2002. Current overview of the pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practical implications. Vaccine 20:651665.

Hoffman, M. A., and A. K. Banerjee. 1997. An infectious clone of human parainfluenza virus type 3. J Virol 71:4272-7.

Ito, N., M. Takayama, K. Yamada, M. Sugiyama, and N. Minamoto. 2001. Rescue of rabies virus from cloned cDNA and identification of the pathogenicity-related gene: glycoprotein gene is associated with virulence for adult mice. J Virol 75:9121-8.

Kato, A., Y. Sakai, T. Shioda, T. Kondo, M. Nakanishi, and Y. Nagai. 1996. Initiation of Sendai virus multiplication from transfected cDNA or RNA with negative or positive sense. Genes Cells 1:569-79.

Kawano, M., M. Kaito, Y. Kozuka, H. Komada, N. Noda, K. Nanba, M. Tsurudome, M. Ito, M. Nishio, and Y. Ito. 2001. Recovery of infectious human parainfluenza type 2 virus from cDNA clones and properties of the

Petição 870190010487, de 31/01/2019, pág. 79/102

61/63 defective virus without V-specific cysteine-rich domain. Virology 284:99-112.

Kim, E. A., K. S. Lee, S. L. Primack, H. K. Yoon, H. S. Byun, T. S. Kim, G. Y. Suh, O. J. Kwon, and J. Han. 2002. Viral pneumonias in adults: radiologic and pathologic findings. Radiographics 22 Spec No:S137-49.

Lawson, N. D., E. A. Stillman, M. A. Whitt, and J. K. Rose. 1995. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc Natl Acad Sci U S A

92:4477-81.

Leyrer, S., W. J. Neubert, and R. Sedlmeier. 1998. Rapid and efficient recovery of Sendai virus from cDNA: factors influencing recombinant virus rescue. J Virol Methods 75:47-58.

Okada, H., F. Kobune, T. A. Sato, T. Kohama, Y. Takeuchi, T. Abe, N. Takayama, T. Tsuchiya, and M. Tashiro. 2000. Extensive lymphopenia due to apoptosis of uninfected lymphocytes in acute measles patients. Arch Virol 145:905-20.

Okada, H., T. A. Sato, A. Katayama, K. Higuchi, K. Shichijo, T. Tsuchiya, N. Takayama, Y. Takeuchi, T. Abe, N. Okabe, and M. Tashiro. 2001. Comparative analysis of host responses related to immunosuppression between measles patients and vaccine recipients with live attenuated measles vaccines. Arch Virol 146:859-74.

Ovsyannikova, I., N. Dhiman, R. Jacobson, R. Vierkant, and G. Poland. 2003. Frequency of measles virus-specific CD4+ and CD8+ T cells in subjects seronegative or highly seropositive for measles vaccine. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 10:411-416.

Parks, C. L, R. A. Lerch, P. Walpita, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 1999. Enhanced measles virus cDNA rescue and gene expression after heat shock. J Virol 73:3560-6.

Parks, C. L, R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and

S. A. Udem. 2001a. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains

Petição 870190010487, de 31/01/2019, pág. 80/102

62/63 in the Edmonston vaccine lineage. J Virol 75:921-33.

Parks, C. L, R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001b. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol 75:910-20.

Peeters, B. P., O. S. de Leeuw, G. Koch, and A. L. Gielkens. 1999. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. J Virol 73:5001-9.

Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, C. Dotsch, G. Christiansen, and M. A. Billeter. 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. Embo J 14:5773-84.

Romer-Oberdorfer, A., E. Mundt, T. Mebatsion, U. J. Buchholz, and T. C. Mettenleiter. 1999. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J Gen Virol 80 (Pt 11):2987-95.

Schmidt, A. C, J. M. McAuliffe, A. Huang, S. R. Surman, J. E. Bailly, W. R. Elkins, P. L. Collins, B. R. Murphy, and M. H. Skiadopoulos. 2000. Bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3) fusion and hemagglutininneuraminidase glycoproteins make an important contribution to the restricted replication of BPIV3 in primates. J Virol 74:8922-9.

Schneider, H., P. Spielhofer, K. Kaelin, C. Dotsch, F. Radecke, G. Sutter, and M. A. Billeter. 1997. Rescue of measles virus using a replicationdeficient vaccinia-T7 vector. J Virol Methods 64:57-64.

Schnell, M. J., L. Buonocore, E. Kretzschmar, E. Johnson, and J. K. Rose. 1996. Foreign glycoproteins expressed from recombinant vesicular stomatitis viruses are incorporated efficiently into virus particles. Proc Natl Acad Sci U S A 93:11359-65.

Schnell, M. J., T. Mebatsion, and K. K. Conzelmann. 1994. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. Embo J 13:4195-203.

Petição 870190010487, de 31/01/2019, pág. 81/102

63/63

Schwarz, A. 1962. Preliminary tests of a highly attenuated measles vaccine. Am. J. Dis. Child. 103:216-219.

Sirven, A., E. Ravet, P. Charneau, V. Zennou, L. Coulombel, D. Guetard, F. Pflumio, and A. Dubart-Kupperschmitt. 2001. Enhanced transgene expression in cord blood CD34(+)-derived hematopoietic cells, including developing T cells and NOD/SCID mouse repopulating cells, following transduction with modified trip lentiviral vectors. Mol Ther 3:438-48.

Takeda, M., K. Takeuchi, N. Miyajima, F. Kobune, Y. Ami, N. Nagata, Y. Suzaki, Y. Nagai, and M. Tashiro. 2000. Recovery of pathogenic measles virus from cloned cDNA. J Virol 74:6643-7.

Volchkov, V. E., V. A. Volchkova, E. Muhlberger, L. V. Kolesnikova, M. Weik, O. Dolnik, and H. D. Klenk. 2001. Recovery of infectious Ebola virus from complementary DNA: RNA editing of the GP gene and viral cytotoxicity. Science 291:1965-9.

Whelan, S. P., L. A. Ball, J. N. Barr, and G. T. Wertz. 1995. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc Natl Acad Sci U S A 92:8388-92.

Zennou, V., C. Petit, D. Guetard, U. Nerhbass, L. Montagnier, and P. Charneau. 2000. HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap. Cell 101:173-85.

Zennou, V., C. Serguera, C. Sarkis, P. Colin, E. Perret, J. Mallet, and P. Charneau. 2001. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nat Biotechnol 19:446-50.

Claims

Reivindicações

1. VETOR DE EXPRESSÃO DERIVADO DE RETROVÍRUS, caracterizado por ser o plasmídeo HIV-1-TRIPAU3.CMV-T7 depositado com a CNCM em 14 de dezembro de 2006, sob o número I-3702.
2. VETOR DE EXPRESSÃO DERIVADO DE RETROVÍRUS, caracterizado por ser o plasmídeo HIV-1-TRIPAU3.CMV-nlsT7 depositado com a CNCM em 14 de dezembro de 2006, sob o número I-3703.
3. VETOR DE EXPRESSÃO DERIVADO DE RETROVÍRUS, caracterizado por ser o plasmídeo HIV-1-TRIPAU3.CMV-N depositado com a CNCM em 14 de dezembro de 2006, sob o número I-3700.
4. VETOR DE EXPRESSÃO DERIVADO DE RETROVÍRUS, caracterizado por ser o plasmídeo HIV-1-TRIPAU3.CMV-P depositado com a CNCM em 14 de dezembro de 2006, sob o número I-3701.
5. VETOR DE EXPRESSÃO, caracterizado por ser o plasmídeo pEMC-LSchw depositado com a CNCM em 18 de dezembro de 2007, sob o número I-3881.
6. MÉTODO PARA PRODUZIR UM VÍRUS INFECCIOSO DE SARAMPO, caracterizado por compreender ou consistir em:

a) recombinar uma célula da linhagem celular 293-T7-NP depositada com a CNMC em 14 de junho de 2006, sob número I-3618 com um clone de cDNA de fita negativa, não segmentado de um vírus de sarampo e com um vetor de expressão que compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína grande de RNA polimerase (L) de um vírus de sarampo

b) transferir a mencionada célula recombinante em células competentes para sustentar a replicação e produção de um vírus de sarampo , e

c) recuperar o vírus de sarampo infeccioso a partir da co-cultura da etapa (b).
7. MÉTODO PARA PRODUZIR UM VÍRUS INFECCIOSO DE

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SARAMPO, caracterizado por compreender ou consistir de:

a) recombinar uma célula da linhagem celular 293-nlsT7-NP MV depositada com CNMC em 04 de agosto de 2006, sob número I-3662 com um clone de cDNA de fita negativa, não segmentado de um vírus de sarampo e com um vetor de expressão que compreende um ácido nucléico que codifica uma proteína grande de RNA polimerase (L) de um vírus de sarampo,

b) transferir a mencionada célula recombinante em células competentes para sustentar a replicação e produção de um vírus de sarampo, e

c) recuperar o vírus de sarampo infeccioso a partir da co-cultura da etapa (b).
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pelas mencionadas células competentes da etapa (b) serem células Vero (rim de macaco verde africano), células CEF (fibroblasto embrionário de frango) ou células MRC5.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pela sequência de nucleotídeos do mencionado clone de cDNA de fita negativa, não segmentado, de um vírus de sarampo ser modificada por inserção de pelo menos um ácido nucléico heterólogo em sítios permissivos.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo mencionado ácido nucléico heterólogo codificar epítopos ou poliepítopos.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo mencionado clone de cDNA de fita negativa, não segmentado, modificado, de um vírus de sarampo ser de um vírus MV atenuado, em particular, linhagem Schwarz de MV.