KR20090103922A - 비분절 음성 가닥 ｒｎａ 바이러스 생성하는 세포 및 방법 - Google Patents

비분절 음성 가닥 ｒｎａ 바이러스 생성하는 세포 및 방법

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Abstract

본 발명은 특히 홍역 바이러스에서, 특히 백신에 승인받은 것과 같은 약독화 균주에서, 특히 약독화 슈왈쯔 홍역 바이러스 및 다양한 이종 서열을 발현하는 재조합 슈왈쯔 홍역-기초 바이러스에서 유래하는 클로닝된 데옥시리보핵산(cDNA)으로부터 비분절 음성-센스 단일 가닥 RNA 바이러스(NNV 또는 모노네가바이러스)를 생성하는 방법 및 재조합 세포에 관한 것이다. 이렇게 구조된 바이러스는 증폭후, 홍역 및/또는 발현된 이종기원의 펩티드 또는 단백질에 대한 면역용 백신으로서 사용될 수 있다.

Description

비분절 음성 가닥 ＲＮＡ 바이러스 생성하는 세포 및 방법{CELLS AND METHODOLOGY TO GENERATE NON-SEGMENTED NEGATIVE-STRAND RNA VIRUSES}
본 발명은 특히 홍역 바이러스에서, 특히 백신에 승인받은 것과 같은 약독화 균주에서, 특히 약독화 슈왈쯔 홍역 바이러스 및 다양한 이종 서열을 발현하는 재조합 슈왈쯔 홍역-기초 바이러스에서 유래하는 클로닝된 데옥시리보핵산(cDNA)으로부터 비분절 음성-센스 단일 가닥 RNA 바이러스(NNV 또는 모노네가바이러스)를 생성하는 방법 및 재조합 세포에 관한 것이다. 이렇게 구조된 바이러스(rescued virus)는 증폭후, 홍역 및/또는 발현된 이종기원의 펩티드 또는 단백질에 대한 면역용 백신으로서 사용될 수 있다.
생 약독화 RNA 바이러스는 매우 효율적인 백신을 만들 수 있다. 이들 중, 홍역 백신은 수억의 아이들에 사용되어 왔고, 매우 효율적이며 안전한 것으로 판명되었다. 이 백신은 1회 또는 2회의 주사후 평생 면역을 유발한다. 대부분의 나라에서 저비용으로 쉽게 대량생산이 가능하다. 이러한 이점은 홍역 바이러스, 특히 약독화 백신 균주로 하여금 아이들 및 때로는 어른 집단에 대해서도 홍역 및/또는 다른 감염성 병인, 특히 AIDS(레트로바이러스), 플라비바이러스 또는 코로나바이러스(SARS) 질환과 같은 바이러스 질병을 면역화하는 좋은 후보 벡터가 되게 한다.
생 약독화 홍역 바이러스는 1960년대 이후부터 백신으로 사용되어 왔으며, 가장 효과적이고 안전한 인간 백신 중 하나이다. 백신 캠페인은 선진국에서 홍역을 조절하는 매우 효과적인 방법이 되어 왔다. 그러나 아직도 개발 도상국에서는 백신의 부적절한 공급으로 인해, 약 사천오백만명이 홍역에 감염되었으며, 해마다 700,000명의 어린이가 이로 인해 사망한다. 따라서 WHO는 다음 10-20년(C.D.C., 2005)의 전 세계적인 백신 프로그램을 시작하였다. 이러한 WHO의 캠페인에 힘입어 홍역 백신에서 유래된 백신 벡터의 사용은 세계의 어떤 지역에서 홍역 및 다른 감염성 질환에 대해 새로운 다가, 특히 2가의 안전하고 효과적인 소아 백신의 사용으로 동시적인 면역이 가능하게 할 것이다.
홍역 바이러스(MV)는 파라믹소비리데과의 모르빌리바이러스속에 속한다. 이는 외피 바이러스(enveloped virus)로서 음성 극성의 비분절 RNA 게놈(15,894 bp)을 갖는다. 홍역은 면역 시스템이 매우 강한 특이적 반응을 일으키기 때문에 오직 한번 걸리며, 재감염에 대해 평생 면역을 형성한다. 이러한 보호는 항체 및 기억 세포독성 CD8+ T 림포사이트(CTL)의 형성에 기초한다. 병원성 균주는 조혈을 강하게 방해하여(Arnebom et al., 1983; Kim et al., 2002; Okada et al., 2000), 개발도상국에서 홍역 감염으로 인한 죽음의 대부분의 원인이 되는 일시적 면역억제를 초래한다. 1차 균주에 대조적으로, 약독화된 균주는 면역억제를 유발하지 않는다 (Okada et al., 2001 ).
홍역 바이러스의 에드몬스튼 균주(Edmonston strain)는 1차 인간 세포에서 배양에 의해 1954년 분리되었다(Enders et al., 1954). 닭 배아 섬유모세포에 적응시켜 백신 종자를 제조하고, 이를 닭 배아 섬유모세포에서 계대하여 약독화하였다(Schwarz et al., 1962). 슈왈쯔 및 모라텐 균주는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지며(Parks et al., 2001a; Parks et al., 2001 b), 가장 빈번히 사용되는 홍역 백신을 구성한다. 한번 또는 두번의 주사로 백신 접종함으로써 평생면역을 유발한다(Griffin et al., 2001 ; Hilleman et al., 2002). 백신 접종후 25년 까지 CD8 세포 및 항체가 존재한다 (Ovsyannikova et al., 2003). 홍역 백신은 대부분의 나라에서 쉽게 대량생산되며 저비용으로 수득할 수 있다. 복수 돌연변이를 유용하게 조합하여 바이러스 게놈을 약독화시킬 수 있다. 따라서, 이 백신은 매우 안정적이며, 백신 균주의 복귀는 지금까지 한번도 관찰된 바 없다(Hilleman et al., 2002). 또한 바이러스는 세포질내에서만 복제하며, 따라서 숙주 게놈의 염색체내로 통합될 우려가 없다. 이러한 특징으로 인해 약독화 생 홍역 백신은 다가 백신 벡터 개발을 위한 우수한 후보가 된다. 이를 위해 에드몬스톤 B MV 균주 안티게놈(antigenome)에 상당하는 감염성 cDNA이 클로닝되었으며, 상당하는 바이러스 제조를 가능케하는 역유전자기술(reverse genetics technique)이 개발되었다(Radecke et al., 1995).
발명자들은 이전에 전세계에서 가장 통상적으로 사용되는 홍역 백신인 슈왈쯔 MV를 사용하여 벡터를 개발하였다(Combredet et al., 2003). 이 벡터는 다양한 유전자 또는 큰 유전자 조합을 12회 이상의 계대(passage) 동안 안정하게 발현할 수 있다. 추가적인 게놈의 30%가 되는 4,000-5,000개의 추가적인 뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 MV 벡터가 제조되었다. 이 바이러스는 표준 MV에 필적하는 역가로 세포 배양에서 제조되었다. 12회의 계대 후, 증폭 인자 1020으로, 96% 이상의 감염 세포가 추가적인 유전자를 계속하여 발현하였다. 이러한 현저한 안정적인 발현은 다른 모노네가비루스 구성원에서도 관찰되는데(Schnell et al., 1996), 이코사헤드럴 캡시드 바이러스와 달리, 헬리코이드 뉴클레오캡시드 바이러스의 경우 이에 의한 유전자 사이즈에의 기하학적 제한이 없기 때문이다. 또한 MV는 면역 시스템의 세포들(마크로파지 및 수지상 세포)을 감염시켜, 가장 효과적인 항원제시세포에 직접 카고 항원(cargo antigens)을 수송하며, 이는 백신 벡터로서 가장 중요한 이점이다. 최종적으로 MV 게놈은 작으며, 따라서 형질전환유전자(transgenes)에 대한 반응을 압도하는 벡터에 대한 반응을 피할 수 있다.
약독화 균주의 안전성 및 효과는 종국적으로 그 게놈 서열에 의존한다는 가정에 기초하여, 본 발명자는 슈왈쯔 백신의 산업적 제제에서 정제된 바이러스 입자에서 부터 적정 절차(Combredet et al., 2003)를 충실하게 이행하여 슈왈쯔/모라텐 홍역 바이러스의 안티게놈에 상당하는 감염성 cDNA을 클로닝하였다. 역유전학적 시스템의 산출을 적정화하기 위해, 상기 안티게놈 바이러스 cDNA는 적정 효율을 위해 요구되는 추가적인 GGG 모티프를 갖는 T7 파지 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에 두었다. 바이러스 RNA를 정확하게 절단하기 위해, 상기 GGG 모티프 및 제1 바이러스 뉴클레오타이드 사이에 해머해드 리보자임을 삽입하고, 최종 바이러스 뉴클레오타이드의 하류에 델타 간염 바이러스 유래의 리보자임을 위치시켰다. 그 결과 생성된 pTM-MVSchw 플라즈미드는 인간 헬퍼 세포의 트랜스펙션에 기초한 전술한 역 유전자 시스템을 사용하여 상응하는 바이러스를 제조하게 할 수 있었다(Radecke et al., 1995). 재조합 백신이 비인증 세포에 적응하는 것을 방지하기 위해, 상기 cDNA로 트랜스팩션된 헬퍼 세포는 바이러스가 원래 선택되고 현재 생성되는 세포인 닭 배아 섬유모세포와 공-배양하였다. 재조합후 수회의 계대 후, 전체 게놈 서열은 원래 서열과 동일하였다(Combredet et al., 2003). pTM-MVSchw 플라즈미드로부터 구조된(생성된) 바이러스의 면역원성은 형질전환 마우스 및 짧은꼬리원숭이에서 평가되었으며, 산업적으로 제조된 슈왈쯔 백신과 비교되었다. 모든 백신접종된 짧은꼬리원숭이는 항-MV 항체 및 특이적인 세포 반응을 나타내었다. cDNA에서 제조된 슈왈쯔 바이러스와 원래 백신과의 사이에 아무런 차이점이 관찰되지 않았으며, 이는 클로닝된 바이러스가 모백신과 동일한 면역원성을 가짐을 나타낸다(Combredet et al., 2003). 이러한 분자 클로닝은 종자원액(seeding stocks)에 의존함없이 슈왈쯔 홍역 백신을 제조할 수 있게 한다.
pTM-MVSchw 플라즈미드는 게놈의 상이한 위치에 추가적인 전사 유닛(ATU)을 도입함으로써 외래 유전자의 발현에 대해 변경되었다. 이러한 ATUs는 복수-클로닝 사이트 카셋트로서, 예를 들면 바이러스 게놈의 인터제닉 N-P 영역의 카피로 삽입된다(전사에 요구되는 시스 활동 서열을 함유). 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP) 유전자도 이 카셋트에 삽입되었다. ATU는 pTM-MVSchw 플라즈미드내 두 위치에(P 및 M 유전자 사이 및 H 및 L 유전자 사이) 도입되었다. 추가적인 서열에 관계없이, 안티게놈 뉴클레오타이드의 전체수는 6의 배수로서 유지되어 바이러스 복제를 적정화하는 "6 뉴클레오타이드 법칙"을 완수한다(Calain et al., 1993). GFP 트랜스진은 모든 감염 세포 타입에서 발현되었으며, 재조합 슈왈쯔 홍역 바이러스가 벡터로서 역할함을 확인하였다. 이 벡터는 현재 전지구상에서 사용되고 있는 살아있는 약독화 승인 백신 균주에 기초한 복합 백신의 다자인을 허용한다. 이는 본 출원에 참조로 삽입된 국제출원 WO 2004/000876의 발명의 주제이다.
이러한 MV-기초의 재조합 생백신을 대량으로 사용하는 것은 이들이 인증된 세포(예, 1차 닭 배아 섬유모세포(CEF) 또는 인간 이배체 MRC5)에서 안정하게 그리고 양호한 역가로 성장할 수 있는 지 여부에 의존한다. 이러한 세포들은 통상 고역가로 제조하는 아프리카 녹색 원숭이 베로 세포와 같은 실험실 세포주에 비교해 볼 때, 보통 정도의 역가로 MV를 제조한다. 따라서 최초 종자(seed)는 비교적 고역가로 수득되어야 한다. 이 최초 종자는 역유전자법에 의해 cDNA에서 제조된다.
양성-가닥 RNA 또는 DNA 바이러스는 적절한 세포내에서 그 조작된 감염성 cDNA 또는 DNA를 트랜스팩션하여 생체외에서 쉽게 얻을 수 있는 반면, 음성-가닥 RNA 바이러스는 그 cDNA에서 역 유전자법에 의해 직접 얻을 수 없다. 음성 가닥 RNA 바이러스의 게놈은 생체외에서 감염성 사이클을 개시할 수 없는데, 단백질을 직접 코딩하지 않기 때문이다. 전사 및 복제는 둘다 바이러스 게놈을 봉입하는 핵단백내 포함된 트란스크립타제-폴리머라제 효소 복합체를 필요로 한다(RNP 복합체). 따라서 cDNA로부터 재조합 음성-가닥 RNA 바이러스의 생성에는 개별적인 구성성분: RNA 및 단백질로부터 활성 RNPs의 재구성이 관여한다 (Fields B.N. et al - Lippincott Raven publishers 1996, p. 1953-1977).
지난 15년간, 수많은 실험실에서 눈에 띄는 작업에 의해 거의 모든 음성-가닥 RNA 바이러스를 그 cDNA로부터 구조하기 위한 상이한 시스템이 개발되었다(리뷰를 위해서는 Conzelmann을 참조하라). 분절 게놈을 갖는 바이러스와 달리, 비분절 음성-가닥 RNA 바이러스의 RNPs(모노네가비루스)는 견고하게 구조화되어 있으며, 핵단백질(N)이외에 조립체 및 폴리머라제 조인자 인단백질(P) 및 바이러스 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 함유한다. 제1 감염성 모노네가비루스, 광견 랍도비루스는 1994년 cDNA에서 회수되었다(Schnell et al. 1994). 올바른 3' 말단이 델타간염바이러스 (HDV) 리보자임에 의해 생성된 전장 RNA와 함께, 광견 바이러스 N, P, 및 L 단백질의 세포내 발현이 이 접근에 관련되었다. 바이러스 게놈(음성 가닥) 보다는 바이러스 안티게놈(양성 가닥)에 상당하는 전사체가 전장 RNAs에 N, P, 및 L 서열이 존재함으로써 비롯된 안티센스 문제를 피하는데 사용되었다. 이 시스템에서, 필수적인 헬퍼 단백질은 파지 T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 복제가능한 백시니아 벡터에 의해 제공되어, 요구된 N, P 및 L 단백질을 코딩하는 플라즈미드의 T7-특이적 전사를 구동한다. 유사한 시스템을 사용하여 감염성 광견 바이러스(Schnell et al. 1994; lto et al. 2001), VSV(Lawson et al.1995; Whelan et al. 1995), 및 파라믹소비리데 센다이 바이러스 (Garcin et al. 1995; Kato et al. 1996; Leyrer et al. 1998; Fujii et al. 2002), HP1V-3 (Hoffman and Banerjee 1997) 및 홍역 바이러스 (Takeda et al. 2000; Fujii et al. 2002)을 회수할 수 있었다.
생성된 바이러스를 헬퍼 바이러스에서 분리하여야 하는 복제가능한 백시니아의 사용을 피하기 위하여, 비분절 음성-가닥 RNA 바이러스를 생성하기 위한 헬퍼 단백질을 공급하도록 수개의 비복제 헬퍼 바이러스가 적응되었다. 고도로 약독화되게 변경된 백시니아 바이러스 안카라 (MVA)는 T7 RNA 폴리머라제를 발현하며, 뉴모바이러스 RSV (Collins et al. 1995), 루불라바이러스, SV5 (He et al. 1997), HPIV-3 (Durbin et al. 1997), 우역 바이러스 (rinderpest virus; Baron and Barrett 1997), 및 홍역 바이러스 (Schneider et al. 1997), 멈프스 바이러스 (Clarke et al. 2000), CDV (Gassen et al. 2000), HPIV-2 (Kawano et al. 2001 ), 및 BPIV-3 (Schmidt et al. 2000)을 회수하는데 사용되었다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 조류폭스바이러스는 조류 파라믹소비리데 NDV (Peeters et al. 1999) 및 키메라 우역바이러스 (Das et al. 2000)의 회수에 사용되었다.
어떠한 감염성 또는 결손성 바이러스 벡터에 의한 오염없이 모노네가비루스를 생성하기 위해, T3 또는 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 세포주가 생성되었다. 이 경우, 세포질에서 RNA-캡핑활성의 결핍된 상황에서 코딩 영역의 상류에 위치된 뇌심근염바이러스(EMCV) 에서 IRES를 사용하여 단백질 발현이 실현되었다. 홍역 바이러스의 에드몬스톤 백신 균주를 회수하기 위해 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 인간 배아 신장 세포주(293-3-46) 및 홍역 바이러스 단백질 N 및 P가 수립되었다(Radecke et al. 1995). 상기 바이러스는 MV 안티게놈 RNA 및 L mRNA를 특정하는 플라즈미드의 트랜스팩션후 구조되었다. 이들 세포에서 구조 효율은 초기에는 매우 낮으나, 트랜스팩션된 배양물을 열충격함으로써 그리고 베로세포에서 트랜스팩션된 세포들을 추가적으로 공배양함으로써 더 증가되었다(Parks et al., 1999). T7 RNA 폴리머라제를 발현하며 아기 햄스터 신장 세포(BHK)에 기초하는 다른 세포주 (BSR T7/5)가 BRSV (Buchholz et al. 2000), 광견 바이러스(Finke and Conzelmann 1999), VSV (Harty et al. 2001 ), NDV (Romer-Oberdorfer et al. 1999), 및 에볼라 바이러스 (Volchkov et al. 2001 )의 회수에 사용되었다.
본 발명자는 슈왈쯔 백신 MV 벡터(Combredet et al., 2003)를 구조하기 위해 293-3-46 세포주를 사용해 왔다. 그러나 트랜스팩션된 세포들에 대해 열충격법을 사용하고 (Parks et al., 1999), 베로 또는 CEF 세포상에서 공배양하여도, 그 구조(생성)에 있어 재현성이 다소 없으며, 수율이 매우 낮고, 특히 추가적인 큰 서열을 함유하는 재조합체의 경우 구조가 거의 불가능하였다. 이는 효율이 계대수에 의존하는 것으로 보아, 헬퍼 세포의 불안정성에 기인한 것이다. 이들 세포는 CMV 프로모터 및 네오마이신 저항성 유전자의 조절하에서 각각 MV N 및 P 유전자 및 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 인코딩하는 pSC6-N, pSC6-P 및 pSC6-T7-NEO로 트랜스팩션된 293 세포의 제네티신-저항성 클론을 선택함으로써 생성되었다. 이들 활성의 안정성은 제네티신하에서 이들의 계속적인 선택(G-418), 및 트랜스팩션 중의 항생제의 제거 및 구조 실험에 의존한다. 염색체 DNA 로의 외래 DNA의 금제의 플라즈미드-기초 재조합 동안, 플라즈미드에 의해 형성되는 연쇄동일서열이 재결합되고 제네티신 선택은 오직 매우 소수인 개별적인 카피를 유지한다. 이는 수회의 계대 이후 293-3-46 세포에 관찰되는 효율 감소를 설명할 수 있다.
따라서 백시니아 바이러스와 같은 다른 헬퍼 바이러스에 의한 오염없이, 임의로 변경된 cDNA로부터 재조합, 비분절 음성-가닥 RNA 바이러스를 재현성있고 고 효율로 구조(생성)할 수 있는 헬퍼 세포주를 생성하기 위한 새로운 방법이 요망된다.
도 1은 플라즈미드들 TRIP△U3.CMV-T7 (A), HIV-1-TRIP△U3.CMV-nlsT7 (B), HIV-1-TRIP△U3.CMV-N (C) 및 HIV-1-TRIP△U3.CMV-P(D)의 도식도이다(ψ: 패키징 psi 모티프: RRE : Rev-반응성 인자; cPPT : 중심 폴리퓨린 트랙, CTS : 중심 종결 서열, CMVie: 사이토메갈로바이러스 즉시-조기 프로모터; △U3: U3 부분의 결실).
도 2는 상이한 세포 용해물에서 MV N 및 P 단백의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다: (A) 형질도입되지 않은 293T, 두 상이한 계대(17 및 19)에서의 293-3-46 세포주, 렌티 바이러스 벡터로 형질도입된 후 생성된 293nlsT7-NP 및 293T7-NP 세포 집단; (B) MV-감염된 베로 세포, 두 상이한 계대(17 및 27)에서의 293-3-46 세포주, 8개의 293T7-NP 세포 클론들 ; (C) MV-감염된 베로 세포, 293-3-46 세포주 (계대 17), 8개의 293nlsT7-NP 세포 클론들, 미감염 베로 세포. 상기 블롯은 항-MV NP 항체(1/500) 및 HRP 항-마우스 Ig 2차 항체로 (1/1000) 탐침되었다.
서열에 대한 간략한 설명
다양한 레트로바이러스 DNA 플랩의 뉴클레오타이드 서열이 다양한 바이러스에서 정의되었다: CAEV (서열 번호: 1), EIAV (서열 번호: 2), VISNA (서열 번호: 3), SIV AGM (서열 번호: 4), HIV-2 ROD (서열 번호: 5), HIV-1 LAI (서열 번호: 6) 및 HIV-1 (서열 번호: 7). T7 RNA 폴리머라제, nls T7 RNA 폴리머라제 및 MV 바이러스의 N, P 및 L 단백질의 뉴클레오타이드 서열들은 각각 서열 번호: 8, 10, 12, 14 및 16에 정의되었고, 이들 각각의 상응하는 단백질 서열은 서열 번호: 9, 11, 13, 15 및 17에 정의되었다. pTM-MVSchw 플라즈미드 (CNCM I-2889)의 전체 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호: 18에 정의되었다. pEMC-LSchw 플라즈미드 (CNCM I-3881) 의 전체 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호: 19에 정의되었다.
본 발명은 최소한 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N; nucleoprotein) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백질(P; phosphoprotein), 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 생성하는 세포에 관한 것이다. 일 특정 실시형태에서, 본 발명의 세포는 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백질(P), 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 생성한다.
본 발명의 세포는 재조합 세포이며, 이는 이들 세포가 생체외 의도적인 유전학적 조작의 결과물로서, 세포의 게놈 서열이 이종 기원의 서열, 즉 다른 세포나 유기체에서 유래하는 서열로 재조합된 것을 의미한다. 분리된 세포에서 출발하여, 재조합 세포는 출발 세포와 다른 유전적 및/또는 표현형적 특징을 갖도록 제조되며, 또한 최소한 RNA 폴리머라제, 하나 또는 수개의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 인단백질(P)을 안정적으로 발현하거나 생성한다. 본 발명의 세포들은 인체 외부의 물건으로서 청구된다.
"안정적으로 생성한다"는 세포가 65 이상의 세포분열회수에 걸쳐, 더욱 유리하게는 세포가 생존하는 한, 최소한 RNA 폴리머라제, 핵단백질(N) 및 인단백질(P)을 발현 또는 생성한다는 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 본 재조합 세포는 최소한 세개의 단백질, 즉, 최소한 RNA 폴리머라제, 핵단백질(N) 및 인단백질(P)을 계속적으로 발현하거나 생성한다. 본 발명의 특정 일 실시형태에 따르면, 통합성 즉, 이들 세 단백질의 일차 아미노산 서열이 유지되며, 발현되거나 생성된 단백질이 항상 동일한 것을 보증한다.
RNA 폴리머라제, 핵단백질(N) 및 인단백질(P)의 안정적인 생성은 이들 단백질을 코딩하는 서열을 운반하는 플라즈미드의 세포내 존재에 독립적이다. 따라서 플라즈미드가 인 비트로(in vitro) 또는 엑스 비보(ex vivo) 세포 조작의 어느 단계에서 사용되든 생성되는 재조합 세포는 최소한 상기 세 단백질을 안정적으로 생성하며, 더이상 플라즈미드를 함유하지 않는다. 이러한 방식으로 상기 발현은, 플라즈미드에 의해 단백질 발현이 구동되는 재조합 세포들과 대조적으로, 소위 플라즈미드-독립적(plasmid-independent)으로 이루어진다.
본 발명의 특정 일 실시형태에서, RNA 폴리머라제, 핵단백질(N) 및 인단백질(P)의 안정적인 생성은 약물, 예컨대 항생제의 존재를 필요로하지 않으며, 즉 안정적인 발현은 선택 압력(selection pressure)을 필요로 하지 않는다. 따라서 상기 안정적인 생산은 생존을 위해, 발현될 단백질의 코딩 서열을 갖는 플라즈미드의 존재를 필수적으로 요구하지 않는다.
본 발명의 다른 특징은 상기 세 단백질의 각각, 즉 RNA 폴리머라제, 핵단백(N) 및 인단백질(P)이 시간에 걸쳐 비슷한 수준으로 생성 또는 발현된다는 것이다. "비슷한 수준"은 상기 세 단백질 각각의 발현이 세포 수명동안, 심지어 세포 분열후에도 꾸준하며, 세포 수명의 다른 시간에 산출된 평균 발현에 비교시 발현 수준의 변동이 30% 이하, 특히 20% 이하, 더욱 바람직하게는 10% 이하인 것을 의미한다.
본 발명의 세포에 의해 발현 또는 생성되는 RNA 폴리머라제는 구제 시스템(rescue system)내 cDNA 클론에서 유도된 비분절 음성 단일 가닥 바이러스 RNA (vRNA)의 생성에 적합한 폴리머라제이다. 폴리머라제의 성질은 본질적으로 구제 시스템(역 유전학, 또는 클로닝된 cDNA로부터 음성-센스 RNA 바이러스의 드 노보 합성으로도 지칭된다)에 사용되는, 비분절 음성 단일 가닥 RNA바이러스의 cDNA 클론내 위치하는 RNA 프로모터 폴리머라제 서열의 성질에 본질적으로 의존한다. 예로서, RNA 폴리머라제는 17 파지 RNA 폴리머라제, 또는 그 핵형 (nlsT7)이다.
"N 단백질" 및 "P 단백질"은 각각 비분절 음성 가닥 단일 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 단일 가닥 RNA 바이러스의 인단백질(P)을 지칭한다. N 및 P 단백질이 유래될 수 있는 비분절 음성 가닥 단일 가닥 RNA 바이러스과, 아과, 속 또는 종의 예시는 표 1에 도시하였다.
특정 일 실시형태에서, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 인단백질(P)은 동일한 바이러스에서 유래된 것으로, 이 바이러스는 동일한 바이러스 균주(virus strain) 또는 상이한 바이러스 균주에서 유래될 수 있다. 다른 실시형태에서, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 인단백질(P)은 상이한 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스에서 유래된다.
[표 1] 모노네가비루스목의 수개의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스(NNV)의 과, 아과, 속 및 종.
과 아과 속 종 약어
랩도비리데 / 비시큐로바이러스 소수포성구내염 바이러스 VSV
리사바이러스 광견바이러스 RV
파라믹소비리데 파라믹소비리네 모르빌리바이러스 홍역바이러스 MV
우역바이러스 RPV
개홍역바이러스 CDV
레스피로바이러스 센다이바이러스 SeV
인간파라인플루엔자바이러스 타입 3 hPIV3
소파라인플루엔자바이러스 타입 3 bPIV3
루불라바이러스 유인원 바이러스 타입 5 SV5
멈프스 바이러스
인간파라인플루엔자바이러스 타입 2 hPIV2
뉴캐슬 질병 바이러스 NDV
뉴모비리네 뉴모바이러스 인간호흡기세포융합바이러스 hRSV
소호흡기세포융합바이러스 bRSV
필로비리데 / 에볼라-유사 바이러스 에볼라바이러스 /
특정 실시형태에서, N 및 P 단백질은 모노네가바이러스, 바람직하게 파라믹소비리데 바이러스, 바람직하게 파라믹소비리네 바이러스, 가장 바람직하게 모르빌리 바이러스에서 유래된다. 모르빌리바이러스의 예로는 홍역 바이러스(MV), 특히 약독화된 비 면역억제성 균주, 예컨대 백신으로 승인된 균주들, 특히 슈왈쯔 MV 균주(Schwarz MV strain) 또는 에드몬스톤 균주(Edmonston strain) 또는 이들 균주에서의 유도체를 들 수 있다. 백신으로 승인받은 균주는 FDA (미국 식약청)에 의해 하기 조건을 만족시키는 것으로 정의된다: 실험실 및 임상 데이터로 엄격하게 확인된 안전성, 효능, 품질 및 재현성(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm).
본 출원에서 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스에 대해 각 시간 참조가 이루어졌으며, 이는 특히 여기 기재된 특정 바이러스, 특히 홍역 바이러스, 더욱 특히 슈왈쯔 균주에 적용될 수 있다.
"기능적 유도체"는 RNA 폴리머라제 및/또는 N 단백질 및/또는 P 단백질의 단편들을 포함하는 기능적 변이체로서, 적어도 리보핵단백질 복합체(RNP 복합체)로서 이들이 유도된 단백질의 활성을 유지하고, cDNA 클론으로부터 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 생성하는 구조 시스템내에서 바이러스 게놈의 전사 및 복제에 기능적인 것들을 지칭한다. 기능적 변이체는 상기 기능적 변이체 단백질을 코딩하는 핵산으로 정의되며, 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다:
- 기능적 변이체를 코딩하는 핵산은 고 스트린전시 조건에서 야생형(대조) RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산 또는 확인된 비분절 음성 가닥 RNA 균주 또는 바이러스의 N 단백질 및 P 단백질과 혼성화한다. 고 스트린전시 조건은 Sambrook et al에 의해 Molecular Cloning: a laboratory manual (1989)에 정의되어 있다. 고 스트린전시 조건은 하기를 포함한다: 니트로셀룰로스 필터를 위한 전세척 용액 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 사용, 50% 포름아미드, 42℃에서 6X SSC의 혼성화 조건 및 68℃에서 0.2X SSC 및 0.1% SDS의 세척 조건. 프로토콜은 본 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다. 또한 당업자는 상기 온도 및 용액 염 농도는 실험 제한에 따라 적절하게 조정될 수 있음을 명백히 인식할 수 있다;
- 기능적 변이체를 코딩하는 핵산은 RNA 폴리머라제를 코딩하는 원 핵산, N 단백질 및 P 단백질과 대비시 최소한 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 95%, 보다 바람직하게 99%의 유사성을 나타내며, 상기 유사성은 두 서열 전체 길이에 걸쳐 산출된다;
- 기능적 변이체를 코딩하는 핵산은 RNA 폴리머라제를 코딩하는 원 핵산, N 단백질 및 P 단백질과 대비시 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환, 바람직하게 1, 2, 3, 4 또는 5 치환, 임의로 하나 이상의 뉴클레오타이드 결실 또는 추가, 바람직하게 1, 2, 3, 4 또는 5 뉴클레오타이드의 결실 또는 추가에 의한 보존적 치환(뉴클레오타이드 치환이 아미노산 서열을 변경시키지 않는 것)을 나타낸다.
본 출원에서 단편은 전장 RNA 폴리머라제, N 단백질 또는 P 단백질의 일부로서, 이들이 유래된 전체 단백질과 동일한 활성, 최소한 전술한 리보핵단백질 복합체(RNP 복합체)로서 동일한 활성을 나타내는 일부로 정의된다. 특정 일 실시형태에서, 상기 단편은 전장 단백질의 70% 이상, 특히 80% 이상, 더욱 바람직하게 90% 이상, 보다 바람직하게 95%이다. RNA 폴리머라제, N 또는 P 단백질 또는 이들의 코딩 서열에 대해 참조시 상기 유사성에 대한 기술은 본 명세서에 정의된 이들의 기능적 유도체에도 적용된다.
특정 실시형태에 따라, 본 발명의 재조합 세포는 RNA 폴리머라제를 코딩하는 한 카피 이상의 핵산, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N)을 코딩하는 한 카피 이상의 핵산, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 한 카피 이상의 핵산을 게놈내에 통합하여 포함한다. 임의로, 상기 세 단백질을 코딩하는 핵산은 각각 또는 이들 중 최소한 하나 이상이 전사조절인자의 조절하에 있다. "게놈내 통합"은 전사조절인자의 조절하에 한 카피이상의 핵산이 재조합 세포의 게놈내에 위치하며, 상기 세포가 상기 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 안정적으로 발현할 수 있는 조건하에 있다는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 재조합 세포는 추가적으로 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코딩하는 핵산 한 카피이상을 게놈내 통합하여 포함하고 있다.
"한 카피 이상"은 RNA 폴리머라제 및/또는 N 단백질 및/또는 P 단백질 및/또는 L 단백질을 코딩하는 핵산이 하나 또는 수개의 카피로, 바람직하게는 각 단백질에 요구되는 발현 수준에 의존하여 정확하게, 또는 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 카피, 또는 그 이상으로 존재하는 것을 의미한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 본 발명의 세포는 세포 게놈내 통합된 한 카피 이상의 DNA 플랩(DNA flap)을 포함한다. DNA 플랩은 레트로바이러스의 뉴클레오타이드 서열, 특히 두개의 본질적인 영역, 즉 cPPT(중심 폴리퓨린 트랙;central polypurine tract) 및 CTS(시스-활동 종결 서열; cis-acting termination region) 영역을 포함하는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 유사 기원의 뉴클레오타이드 서열이며, 상기 cPPT 및 CTS 영역은 이를 함유하는 DNA의 복제 동안 3-가닥 DNA 구조를 유도한다(Zennou et al., 2000; 및 출원 WO99/55892 및 WO01/27300에 정의됨). 특정 실시형태에서, DNA 플랩은 RNA 폴리머라제, N 단백질, P 단백질 및 가능한 한 L 단백질을 코딩하는 핵산의 전사를 가능하게 하는 내부 프로모터의 상류에 즉시 삽입된다. DNA 플랩(cPPT-CTS)은 기능적 배열로, 즉 cPPT 영역이 CTS 영역에 대해 5'에 존재하도록 본 발명의 레트로바이러스-유래 벡터내 삽입된다(벡터의 5' 부분은 프라이머 결합 부위(PBS)를 함유하는 LTR에 상당하고, 벡터의 3' 부분은 3'PPT를 함유하는 영역에 해당한다).
본 발명에 적합한 DNA 플랩은 레트로바이러스 특히 렌티바이러스 또는 레트로트랜스포손과 같은 레트로바이러스-유사 유기체로부터, 합성(화학 합성)에 의해 수득할 수 있거나 또는 어떠한 레트로 바이러스 특히 렌티바이러스 핵산으로부터 폴리머라제 체인 반응(PCR)과 같은 DNA 플랩의 증폭에 의해 수득할 수 있다. DNA 플랩은 레트로바이러스 특히 렌티바이러스, 특히 인간 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 및 특히 HIV 레트로바이러스, CAEV 바이러스(염소 관절염 뇌염 바이러스; Caprine Arthritis Encephalitis Virus), EIAV 바이러스 (말 감염성 빈혈 바이러스; Equine Infectious Anaemia Virus), VISNA 바이러스, SIV 바이러스(유인원 면역결핍 바이러스; Simian Immunodeficiency Virus) 또는 FIV 바이러스 (고양이 면역결핍 바이러스; Feline Immunodeficiency Virus)로부터 수득할 수 있다. 더욱 바람직한 실시형태에서, DNA 플랩은 예를 들면 HIV-1 또는 HIV-2과 같은 HIV 레트로바이러스 또는 이들 두 타입의 다른 분리체로부터 수득된다.
바람직한 DNA 플랩은 서열번호: 1 내지 7 에 정의된 서열을 포함하거나 이로 구성되어 있다. 사용되는 DNA 플랩은 그 천연(바이러스 게놈) 뉴클레오타이드 즉, 렌티바이러스에 천연적으로 함유된 폴 유전자(pol gene)에서 분리된 것을 사용한다. 따라서 본 발명에서 사용되는 DNA 플랩은 폴 유전자의 불필요한 5' 및 3' 부분을 제거하고 다른 기원의 서열과 재조합된다. 특정 실시형태에 따르면 DNA 플랩은 약 90 내지 150 뉴클레오타이드 서열, 특히 약 100 내지 140 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 (1) DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, (2) DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, (3) DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터와 게놈을 재조합하여 수득할 수 있는 세포에 관한 것이다. 본 세포들에 대해서도 전술한 정의가 적용된다.
본 발명은 또한 (1) DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, (2) DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, (3) DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 (4) DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터와 게놈을 재조합하여 수득할 수 있는 세포에 관한 것이다. 본 세포들에 대해서도 전술한 정의가 적용된다.
본 발명은 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산 한 카피 이상, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N)을 코딩하는 핵산 한 카피 이상, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 핵산 한 카피 이상 및 DNA 플랩을 포함하는 발현 벡터와 게놈을 재조합하여 수득할 수 있는 세포에 관한 것이다. 본 세포들에 대해서도 전술한 정의가 적용된다. 특정 일 실시형태에서 상기 발현 벡터는 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코딩하는 핵산 한 카피 이상을 더 포함한다.
본 발명은 또한 전술한 DNA 플랩 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 구조에 필요한 단백질을 코딩하는 핵산 하나 이상을 포함하는 레트로바이러스-유래의 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 특정 벡터에서, 상기 핵산은 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질으로 이루어진 군에서 선택되는 단백질을 코딩한다.
"게놈(genome)"은 세포내 존재가 선택 압력에 의존하지 않는 핵산분자를 지칭하며, 즉 이 핵산분자의 세포내 존재는 영구적이며 및/또는 환경적인 조건에 의존하지 않는다. "게놈"은 플라즈미드를 포함하지 않는다. 일차적으로, "게놈"은 세포질에 존재하는 핵산 분자에 대조적으로 세포 핵내에 존재하는 핵산(핵 게놈)을 지칭하며, 예를 들면 염색체를 포함한다. 특정 실시형태에서, "게놈"은 예를 들면 미토콘드리아(미토콘드라이 게놈) 또는 엽록체(엽록체 게놈)와 같은, 기관 등의 특정 세포 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 게놈은 진핵세포에서 유래한다.
레트로바이러스-유래 벡터, 및 특히 렌티바이러스-유래 벡터 및 더욱 바람직하게 HIV-1-유래 벡터는 역전사에 필요한 인자, 특히 후술하는 바와 같이 U3 영역 이 부분적으로 결실된 돌연변이 LTR 및 바람직하게 DNA 플랩을 포함하는 바이러스 게놈이다. 이러한 LTR 및 DNA 플랩 영역은 레트로바이러스-유래 발현 벡터에서 레트로바이러스, 특히 렌티바이러스 기원의 유일한 서열일 수 있다. 어떠한 경우에도 레트로바이러스-유래 벡터는 전장 레트로바이러스 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 레트로바이러스-유래 벡터는 DNA 플랩 및 전술한 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 구조를 위해 필요한 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 및 상응하는 바이러스 게놈의 LTRs를 포함하거나 이로 구성되어 있다.
본 발명의 발현 벡터는 DNA 플랩 및 RNA 폴리머라제 또는 이 기능적 부분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 이러한 벡터는 CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3702로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-T7일 수 있으며, 이는 DNA 플랩(TRIP), 프로모터 및 U3 도메인의 인핸서가 결실된 LTR, CMV 프로모터 및 T7 파지 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산, 특히 서열번호:8의 서열을 포함하는 HIV-1 발현 벡터이다. 또는 상기 벡터는 CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3703로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-nlsT7, 즉 DNA 플랩(TRIP), 프로모터 및 U3 도메인의 인핸서가 결실된 LTR, CMV 프로모터 및 T7 파지 RNA 폴리머라제의 핵형을 코딩하는 핵산, 특히 서열번호:10의 서열을 포함하는 HIV-1 발현 벡터이다.
본 발명의 발현 벡터는 DNA 플랩 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 이러한 벡터는 CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3700로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-N, 즉 DNA 플랩(TRIP), 프로모터 및 U3 도메인의 인핸서가 결실된 LTR, CMV 프로모터 및 MV 슈왈쯔의 N 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 서열번호:12의 서열을 포함하는 HIV-1 발현 벡터일 수 있다.
본 발명의 발현 백터는 DNA 플랩 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 이러한 벡터는 CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3701로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-P 즉, DNA 플랩(TRIP), 프로모터 및 U3 도메인의 인핸서가 결실된 LTR, CMV 프로모터 및 MV 슈왈쯔의 P 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 서열번호:14의 서열을 포함하는 HIV-1 발현 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 발현 벡터는 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코딩하는 핵산을 포함한다. 이러한 벡터는 CNCM에 2007년 12월 18일자로 기탁번호 I-3881로 기탁된 pEMC-LSchw 플라즈미드일 수 있다. L 단백질을 코딩하는 특정 일 핵산은 서열번호:19의 서열을 갖는 것이다.
전술한 CNCM I-3700 내지 3703의 벡터는 모두 E. coli (JM109) 균주에 포함되며, 이는 앰피실린(100μg/ml) 보충 LB 배지에서 교반하에 37℃에서 배양된 것이다.
본 발명은 전술한 기탁 플라즈미드내 삽입된 폴리뉴클레오타이드내 함유된 각 뉴클레오타이드 및 모든 뉴클레오타이드 단편에 관한 것이며, 특히 본 발명의 개시에 따라 삽입되도록 디자인되기에 적합한 모든 영역에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 단편들을 본 발명의 플라즈미드 구축에 사용하는 용도에 관한 것이다.
전술한 4 플라즈미드는 본 발명의 재조합 세포를 수득하기 위해 세포 재조합에 사용될 수 있는 벡터의 예이다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다; 따라서 전술한 바와 같이 상기 N 및 P 단백질(또는 이들의 기능적 유도체)는 어떠한 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스에서 유래될 수 있고, T7 폴리머라제는 어떠한 RNA 폴리머라제일 수 있으며, CMV 프로모터는 어떠한 프로모터일 수 있고, TRIP DNA 플랩은 어떠한 DNA 플랩일 수 있으며, HIV-1 발현 벡터는 어떠한 벡터 특히 어떠한 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 발현벡터들은 DNA 플랩 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하거나, 또는 DNA 플랩 및 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질 및 임의로 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코딩하는 핵산(들)을 포함한다.
"발현벡터"는 명백하게 언급된 인자들 이외에, 관심 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 구동하는데 필요한 모든 인자들(발현 조절 인자들), 특히 전사 조절인자를 포함하는 벡터를 말한다. "전사조절인자"는 게놈내 통합된 핵산의 전사를 조절하는데 관여되는 모든 DNA 영역을 말하며, CMV, EF1 알파 또는 mPGK (쥐 포스포글리세레이트 키나제)와 같은 프로모터 또는 더욱 일반적으로 레트로바이러스, 특히 렌티바이러스 백터에서 삽입에 적합한 어떠한 프로모터, 인핸서 또는 시스-활동 조절인자를 포함한다. 이들 인자 및 특히 프로모터는 재조합 세포의 성질에 의존하여 선택된다. 원하는 발현 수준 또는 재조합 세포에 따라 적절한 프로모터를 결정하는 것은 본 기술분야의 당업자의 일반적인 지식에 속한다. 재조합 세포가 수개의 관심 단백질을 코딩하는 이종기원의 핵산(또는 지정된 폴리뉴클레오타이드)를 포함하는 경우, 상기 전사조절인자는 모든 핵산에 대해 고유하거나 또는 이들 중 몇몇에 의해 공유되거나, 또는 대조적으로 각 핵산이 특정 전사조절인자와 결합될 수 있다. 후자의 경우, 수개의 전사 조절인자는 유사하거나 상이할 수 있다.
재조합 단계에서 사용된 모든 벡터에서 DNA 플랩의 존재는 DNA 플랩 위치에DNA 트리플렉스 구조(세가닥)가 형성되도록 하며(상기 트리플렉스 구조는 cPPT 및 CTS 도메인 사이의 영역을 구성하며 CTS 도메인을 포함한다), 이로써 세포의 핵내에 DNA 플랩을 갖는 핵산이 도입되도록 하며(핵막의 세공을 통해), 나아가 이들 세포의 게놈내 통합되게 한다. DNA 플랩은 벡터 핵 도입의 시스-결정자(cis-determinant)로서 작용한다. 첫번째 측면에서, DNA 플랩의 존재는 재조합 및 핵산의 비분열 세포에의 통합에서 매우 관심이 되는데, 세포 분열이 없는 경우(및 막 붕괴), 수입(및 핵산의 세포 게놈에의 통합)은 오로지 잔여 활성으로서 확인되기 때문이다; 따라서 DNA 플랩을 함유하는 벡터는 비분열 세포를 형질도입할 수 있는 비-복제 레트로바이러스 벡터이다. 두번째 측면에서, DNA 플랩의 존재는, DNA 플랩을 함유하는 핵산이 통합된 세포 퍼센트를 상당히 개선시킴으로써, 재조합 및 분열 세포에의 핵산의 통합에 있어 관심의 대상이 된다. 본 명세서에 전술한 바와 같이 발현 벡터에 DNA 플랩 서열을 삽입하는 것은 벡터 DNA의 핵도입을 자극시킴으로써 생체외 및 생체내 유전자 전달을 매우 강하게 상승시킨다(Sirven et al, 2001 ; Zennou et al, 2001). DNA 플랩 서열을 포함하는 HIV 벡터 (TRIP 벡터)는 DNA 플랩이 결핍된 다른 HIV 벡터보다 10배 더 높은 효율로 1차 B 및 T 세포들, 마크로파지, 수지상 세포 등을 형질도입할 수 있다. 통상 80-90%의 세포 형질도입율이 수득된다.
DNA 플랩 및 최소한 상기 세개의 관심 단백질을 코딩하는 핵산(들)을 포함하는 벡터(들)에 의한 재조합 및 이들 핵산의 게놈내 통합에 이어, 상기 재조합 세포는 RNA 폴리머라제, N 단백질 및 P 단백질을 안정적으로 생성한다.
본 발명의 재조합 세포를 수득하는데 사용되는 본 발명의 발현 벡터는 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스-유래, 특히 HIV-, FIV- 또는 SIV-유래 벡터와 같은 렌티바이러스-유래 벡터와 같은 바이러스 발현벡터이다. 특히 상기 렌티바이러스-유래 벡터는 인간 렌티바이러스-유래 벡터이며, 예로써 HIV-1 또는 HIV-2-유래 벡터와 같은 HIV 발현 벡터이다. 바람직한 실시형태에서, 바이러스 벡터는 전술한 DNA 플랩 및 상기 세개의 관심 단백질을 최소한 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 HIV 발현 벡터이다. HIV 벡터는 전형적인 치환 레트로바이러스 벡터이며, 이 벡터에서는 실질적으로 모든 코딩 바이러스 서열이 이전되는 서열에 의해 치환된다. 따라서 HIV 벡터는 두 HIV LTRs 사이 또는 돌연변이된 LTRs 사이에 함유된 이종기원의 핵산만을 DNA 플랩의 조절하에서 발현한다. 이들 벡터들은 따라서 5-6 kb에 달하는 큰 폴리뉴클레오타이드를 수용할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태는 전술한 바와 같이 HIV 발현벡터이며, 특히 HIV-1 LTR이 프로모터 및 U3 도메인의 인핸서가 결실된(△U3) HIV-1 발현벡터이다. 이 특정 결실은 벡터내 함유된 핵산의 발현을 상승시키며, 특히 프로모터와 결합될 때 그러하다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 재조합 세포는 그 게놈을 플라즈미드 HIV-1 -TRIP△U3.CMV-T7, HIV-1-TRIP△U3.CMV-N 및 HIV-1-TRIP△U3.CMV-P, 또는 HIV-1 -TRIP△U3.CMV-nlsT7, HIV-1-TRIP△U3.CMV-N 및 HIV-1 -TRIP△U3.CMV-P와 재조합하여 수득될 수 있다.
본 발명의 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있으며, 특히 동물 또는 식물 세포, 더욱 바람직하게는 인간 세포 또는 비인간 포유 세포와 같은 포유세포일 수 있다. 특정 실시형태에서 세포는 그 게놈을 재조합하기 전에, 1차 배양액 또는 세포주에서 분리한다. 본 발명의 세포는 분열 또는 비분열 세포일 수 있다. 본 발명의 재조합 세포를 제공하기 위해 재조합될 수 있는 세포의 예로는 HEK 293 세포(인간 배아 신장 세포)이며, 이 세포주 293은 ATCC에 기탁번호 CRL-1573로 기탁되어 있다. 특정 실시형태에서, 인간 세포는 배아세포가 아니며 및/또는 배아 줄기세포도 아니다.
본 발명의 재조합 세포는 CNCM(프랑스 파리)에 2006년 6월 14일자로 기탁번호 I-3618로 기탁된 293-T7-NP 세포주, 즉 TRIP△U3.CMV-T7, HIV-1-TRIP△U3.CMV-N 및 HIV-1-TRIP△U3.CMV-P 플라즈미드들로 재조합한 HEK-293 세포들일 수 있다. 본 발명의 다른 재조합 세포의 예로서, 2006년 8월 4일자로 기탁번호 I-3662로 기탁된293-nlsT7-NP MV 세포주 즉, HIV-1-TRIP△U3.CMV-nlsT7, HIV-1-TRIP△U3.CMV-N 및HIV-1-TRIP△U3.CMV-P로 재조합한 HEK-293 세포들일 수 있다.
본 발명의 추가적인 실시형태에서, 본 발명의 재조합 세포는 추가적으로 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 재조합될 수 있다. L 단백질의 발현은 일시적이며, DNA 플랩을 포함하지 않는 플라즈미드에 의해 구동될 수 있거나 또는 대조적으로 안정적이며, 전술한 DNA 플랩을 포함하는 벡터에 의해 구동될 수 있다. L 단백질을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 카피를 갖는 플라즈미드 또는 벡터에 의한 재조합은 RNA 폴리머라제, N 단백질 및 P 단백질의 코딩 서열을 갖는 벡터에 의한 재조합과 동시에 또는 후속적으로 이루어질 수 있다.
따라서 본 발명은 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질, 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 생성하고, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 안정적으로, 또는 일시적으로 생성하는 세포에 관한 것이다.
상기 L 단백질은 표 1에 인용된 어떠한 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 L 단백질은 N 단백질 및/또는 P 단백질과 동일한 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스에서 온 것이고, 특히 동일한 바이러스 균주에서 온 것이다. 다른 실시형태에서, 상기 L 단백질은 N 단백질 및/또는 P 단백질과 상이한 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스에서 온 것이다.
특정 실시형태에서, L 단백질은 파라믹소비리데 바이러스, 특히 파라믹소비리네 바이러스, 가장 바람직하게는 모르빌리바이러스에서 유래한다. 모르빌리 바이러스의 예로는 홍역 바이러스(MV), 특히 약독화된 비 면역억제성 균주, 예컨대 백신으로 승인된 균주들, 특히 슈왈쯔 MV 균주(Schwarz MV strain) 또는 에드몬스톤 균주(Edmonston strain)를 들 수 있다. 특히 L 단백질은 MV 바이러스 중 하나 (서열 번호: 16) 또는 pEMC-LSchw 플라즈미드에 삽입된 서열, 특히 서열번호:19의 뉴클레오타이드 1425 및 7976 사이의 서열에 의해 코딩되는 것이다.
특정 일 실시형태에서, L 단백질의 서열은 야생형 L 단백질에 대해 변경될 필요가 없으며, 기능적이어서, N 및 P 단백질 및 T7 폴리머라제로 트랜스콤플리멘트될 때, 숙주세포에서 입자 또는 바이러스의 생성을 가능하게 하여야 한다. L 단백질을 갖는 클론의 기능 유효성을 결정하기 위한 테스트는 적합 세포를 N 단백질, P 단백질 및 T7 (또는 nlsT7) 폴리머라제를 코딩하는 벡터, 테스트될 L 단백질을 코딩하는 벡터 및 리더, 프로모터, 리포터 유전자(GFP와 같은) 및 트레일러(trailer)를 포함하는 미니게놈으로 트랜스팩션함으로써 수행된다. 리포터 유전자를 발현하는 입자가 생성되는 경우 L 클론의 기능성을 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 추가적으로 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 비분절 음성 가닥 cDNA 클론 즉 바이러스 게놈의 안티게놈 RNA (+) 가닥으로 재조합한 세포에 관한 것이다. 본 발명 분자의 뉴클레오타이드 서열의 기술을 위해 사용되는 "cDNA"는 단순히 원래 상기 분자가 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스, 특히 홍역 바이러스의, 가장 바람직하게는 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 바이러스 입자의 전장 게놈 (-) RNA의 역전사에 의해 수득될 수 있다는 사실에 관한 것이다. 이는 이 cDNA 클론의 제조에 사용되는 방법에 제한으로서 간주되어서는 안된다. 따라서 본 발명은 전술하여 정의된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다면 모든 DNA를 "cDNA"라는 표현내에 포함한다. DNA를 포함하여 정제된 핵산, 또는 플라즈미드는 상기 핵산, 특히 DNA가 전술한 정의를 만족한다면 본 발명에 따른 cDNA의 의미내에 포섭된다.
특정 실시형태에서, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론은, 바이러스 서열의 상류에 전사 조절인자를 함유한다. 바람직한 실시형태에서, 이 인자들은 전술한 N, P 및/또는 L 단백질을 포함하는 발현 벡터에 위치하는 것과 동일하다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 인자는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터이다.
일 실시형태에서, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론은 N, P 및/또는 L 단백질과 동일한 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스에서, 특히 동일한 바이러스 균주에서 유래한다. 다른 실시형태에서 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론은 N, P 및/또는 L 단백질과 다른 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스에서 유래한다.
특정 실시형태에서 cDNA 클론은 파라믹소비리데 바이러스와 같은 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스, 특히 파라믹소비리네 바이러스, 가장 바람직하게는 모르빌리바이러스에서 유래한다. 모르빌리바이러스의 예로는 홍역 바이러스(MV), 특히 약독화된 비 면역억제성 균주, 예컨대 백신으로 승인된 균주들, 특히 슈왈쯔 MV 균주 또는 에드몬스톤 균주를 들 수 있다. 또한 상기 비분절 음성 가닥 cDNA 클론의 뉴클레오타이드 서열은 후술하는 야생종 균주 또는 바이러스와 비교시 변경될 수 있다.
본 발명은 또한 세포 배양물에 관한 것으로, 상기 세포는 본 명세서 전반에 걸쳐 정의된 것이며, 특히 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백질(P), 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 생성하는 세포 배양물에 관한 것이다. 다른 실시형태에서 본 발명은 또한 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백질(P), 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 생성하고, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질 또는 그 기능적 유도체을 안정적으로 또는 일시적으로 생성하는 세포 배양물에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 재조합될 세포 배양물은 1차 배양물, 즉 동물(임의로 비-인간) 또는 식물에서 직접 수득된 세포 또는 조직에서 제조된 배양물이다. 다른 실시형태에서 재조합될 세포 배양물은 세포주, 즉 1차 배양물의 첫번째 서브배양 또는 세포의 후속적인 순차적인 계대에서 생성되는 세포집단이다.
다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 세포를 이용하여, 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 바이러스를 제조하는 다양한 방법에 관한 것이다.
감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 첫번째 방법은
a) RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 폴리머라제 조인자 인단백질(P)을 안정적으로 생성하는 세포 또는 세포배양물을, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와 재조합하는 단계,
b) 상기 재조합 세포 또는 재조합 세포 배양물을 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 복제 및 생성 할 수 있는 적격 세포상으로 수송하는 단계, 및
c) 상기 단계 b)의 공배양에서 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 회수하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어진다.
본 발명의 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 두번째 방법은
a) RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 폴리머라제 조인자 인단백질(P)을 안정적으로 생성하는 세포 또는 세포배양물을, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와 재조합하는 단계,
b) 상기 재조합 세포 또는 재조합 세포배양물로부터 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 회수하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어진다.
본 발명에서 "재조합"은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 예를 들면 벡터의 형태하에 세포내로 도입하는 것을 의미하며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 세포 게놈내에 통합되거나(전적으로 또는 부분적으로) 또는 통합되지 않을 수 있다(전술한 바와 같이). 특정 실시형태에 따르면, 재조합은 그 정의, 성질 및 임의의 변경은 본 명세서에 개시된 바 있는 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론인 제1 폴리뉴클레오타이드로 수득될 수 있다. 또는 재조합은 그 정의, 성질 및 임의의 변경은 본 명세서에 개시된 바 있는 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 벡터인 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것을 포함한다.
이 방법들에서, 상기 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 폴리머라제 조인자 인단백질(P)을 안정적으로 생성하는 세포 또는 세포배양물은 본 명세서에 정의된 세포 또는 본 명세서에 정의된 세포 배양물이며, 즉 이들은 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의해 변경되는 정도의 재조합 세포들이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 상기 RNA 폴리머라제, N 및 P 단백질을 안정적으로 생성하는 세포 또는 세포배양물은 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 생성하지 않거나 또는 안정적으로 생성할 수 없는, 즉 일시적으로 발현하거나 생성한다.
본 발명에서 "수송"은 상기 재조합 세포를 다른 형태의 세포, 특히 다른 형태의 세포의 단층에 위치시키는 것을 의미한다. 상기 나중 세포들은 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 복제 및 생성 양 쪽을 지지할 수 있는 적격 세포로서, 즉 각각 세포내에 감염성 바이러스를 형성하고 이들 감염성 바이러스를 세포밖으로 방출할 수 있다. 이러한 수송은 본 발명의 재조합 세포와 상기 정의된 적격 세포와의 공배양을 결과한다. 상기 수송은 상기 재조합 세포가 효율적인 바이러스-생성 배양물이 아닌 경우, 즉 감염성 바이러스가 이들 재조합 세포로부터 효율적으로 회수되지 못할 때 시행되는 부가적, 즉 임의적 단계일 수 있다. 이 단계는, 본 발명의 재조합 세포를 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론 및 임의로 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 추가적으로 재조합한 후, 도입된다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 수송 단계는 쉽게 재조합될 수 있는 능력에 의해 선택된 재조합 세포가 재조합 감염성 바이러스를 유지하고 생성하는데 충분할 정도로 효율적이지 못한 경우 요구된다. 이 실시형태에서, 상기 방법 중 a) 단계의 세포 또는 세포 배양물은 본 발명의 재조합 세포 또는 재조합 세포 배양물, 특히 CNCM에 2006년 6월 14일자로 기탁번호 I-3618로 기탁된 293-T7-NP 세포주 또는 CNCM에 2006년 8월 4일자로 기탁번호 I-3662로 기탁된 293-nlsT7-NP MV 세포주와 같은 재조합 HEK-293 세포이다.
비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 복제 및 생성 양쪽을 지지할 수 있는 적격 세포는 본 발명의 재조합 세포와 공배양될 수 있는 어떤 세포 형태일 수 있으며, 동일한 종, 속, 과, 목, 강, 문, 계의 세포일 필요는 없다. 적격 세포의 예로는 베로세포(아프라카 녹색 원숭이 신장 세포) 또는 CEF 세포(닭 배아 섬유모세포)를 들 수 있다. CEF 세포는 수정된 달걀에서 제조되거나, 예컨대 EARL Morizeau (8 rue Moulin, 28190 Dangers, France) 또는 수정된 달걀의 다른 제조자로부터 수득하거나 MRC5 세포로부터 수득할 수 있다 (ATCC CCL171 ; 폐 섬유모세포).
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 수송 단계는 필요하지 않으므로 시행되지 않는다. 이는 본 발명의 이점 중 하나이며, 본 발명은 종래 방법보다 쉽게, 빠르게, 저비용으로 시행할 수 있으며, 오염되지 않은 재조합 감염성 바이러스의 회수가 가능한 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 이는 다음과 같은 특징을 갖는 본 발명의 재조합 세포로 성취될 수 있다:
- RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 폴리머라제 조인자 인단백질(P)을 안정적으로 생성하고,
- 이로부터 다른 원하지 않는 바이러스 및/또는 다른 형태의 세포에 의한 오염없이, 감염성 재조합 바이러스를 효율적으로 회수할 수 있다.
"감염성 재조합 바이러스의 회수"는 세포에 의해 생성된 감염성 바이러스를 세포로 부터 방출하여 배양된 세포로부터 분리시키는 모든 수단을 의미한다. 감염성 재조합 바이러스가 다른 세포 타입의 관여없이 본 발명의 재조합 세포에서 회수되는 경우, 상기 회수는 "직접적"이라고 말해진다. 반면, 본 발명의 재조합 세포가 아닌 다른 세포 타입을 통해 감염성 재조합 바이러스가 회수되는 경우, 상기 회수는 "간접적"이라고 일컫는다. 전술한 바와 같이 본 발명은 처음으로 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 직접적 회수를 보고하는 것이다.
본 발명의 일 특정 방법에서, 재조합 단계는 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 폴리머라제 조인자 인단백질(P)을 안정적으로 생성하는 세포 또는 세포 배양물을 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 재조합하는 단계를 포함하지 않는다. 이 경우, 본 발명의 재조합 세포는 L 단백질을 발현할 수 있는 능력에 의해 선택되며, 특히 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 미리 재조합되며, 이때 상기 L 단백질을 코딩하는 핵산은 세포 게놈에 통합되거나 그렇지 않다.
특히 단백질들이 결실된 게놈 또는 cDNA 클론이 사용되는 경우, 보조단백질(accessory protein; 비-P, 비-L 또는 비-N 단백질, 또는 비-RNA 폴리머라제)을 포함하는 벡터가 임의로 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이러한 보조 단백질은 C 단백질, V 단백질, NS1 단백질, NS2 단백질, M 단백질, M2 단백질 및/또는 SH 단백질이다. 이러한 보조 단백질의 코딩 서열을 갖는 벡터는 임의로 상기 정의된 cDNA 플랩을 가질 수 있다.
본 발명의 재조합 세포에서 RNA 폴리머라제, N 단백질 및 P 단백질 생산의 안정성은 전술된 방법에 따라 몇가지 이점을 나타낸다:
- 본 발명의 방법은 수송 단계를 필수적으로 포함할 필요가 없다;
- 본 방법은 박 등(1999)에 보고된 바와 같은 열 쇼크 단계를 포함하지 않는다. 실제 이 단계는 플라즈미드상에 존재하는 핵산으로 부터 합성되는 단백질인 바이러스 N 및 P 단백질 뿐 아니라 RNA 폴리머라제의 합성 효율을 개선하는 것으로 알려져 있다. 그러나 본 발명에서는 상기 핵산이 세포 게놈내 통합되고, 이들 단백질은 드 노보 인캡시데이션(de novo encapsidation)을 개시하기에 적합한 수준으로 안정적으로 발현된다.
- 본 방법은 RNA 폴리머라제, N 및 P 단백질의 생산이 안정적이고, 그 발현이 플라즈미드에 종속되지 않기 때문에 대량으로 감염성 바이러스를 생성할 수 있다. 따라서, 106개의 재조합 세포 중 약 100-400개의 세포가 재조합후 감염성 바이러스를 방출한다(구조 건수; number of rescue events). 이는 Radecke et al. (1995)의 방법에서 수득된 비율 즉 106개의 감염된 세포중 1-6에 비하여 훨씬 우월하다. 본 발명의 일 특정 실시형태에서, 106개의 재조합된 세포중 구조 건수는 20이상, 50이상, 100이상, 200이상, 300이상, 400이상 또는 500이상이다.
최종적으로 본 발명의 다른 이점은 매우 다양한 세포들이 재조합되어 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다는 점이다. 실제로 재조합 세포는 진핵세포, 특히 비인간세포이건 인간세포이건 불문하고 어떠한 포유동물세포여도 좋다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 재조합 세포는 인간 섬유모세포, 특히 MRC5 세포주(인간 폐 섬유모세포)이다. 본 발명은 특히 분열하지 않는 세포에 유용하다.
본 발명에 따르면, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론은 MV 바이러스, 특히 약독화 바이러스, 특히 약독화된 비 면역억제성 균주, 예컨대 슈왈쯔 MV 균주와 같은 백신으로 승인된 균주이다. cDNA 클론은 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 전장 안티게놈을 코딩하는 DNA 서열이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 상기 N, P 및 L 단백질 뿐 아니라 cDNA 클론은 동일한 바이러스에서 유래하며, 이 바이러스는 표 1의 바이러스 중 어떠한 것이어도 좋으며, 특히 홍역 바이러스의 슈왈쯔 MV 균주와 같은 전술한 MV 바이러스일 수 있다. 에드몬스톤 B. 균주 및 슈왈쯔 균주의 뉴클레오타이드 서열은 WO 98/13505에 개시되어 있다. N, P 및 L 단백질 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론의 성질에 관계없이 RNA 폴리머라제는 T7 RNA 폴리머라제이다. 특정 cDNA 서열은 서열번호:18에 정의된 슈왈쯔 균주의 cDNA 서열이다. 이러한 cDNA는 상기 홍역바이러스, 백신 균주 슈왈쯔의 전체 서열을 포함하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드인 pTM-MVSchw에서, T7 RNA 폴리머라제의 프로모터 조절하에, 수득할 수 있다. 크기는 18967nt이다.
또는 상기 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론은 표 1의 어떠한 바이러스로부터도 유래될 수 있다. cDNA 클론이 유래되는 특정 재조합 홍역 바이러스는 슈왈쯔 균주, 특히 아벤티스 파스테르(프랑스)에서 루박스®라는 상표명으로 시판되고 있는 것과 같은 승인된 백신 슈왈쯔 균주에서 유래된다.
"약독화 균주(attenuated strain)"는 동일한 숙주에서 모 균주에 비해 바이러스성이 없거나(avirulent) 또는 덜 바이러스성을 나타내나, 숙주에 투여되었을때 면역원성(immunogenicity) 및 보조성(adjuvanticity)은 유지하는, 즉 면역지배적 T 및 B 세포 에피토프를 유지하고, T 세포 공동자극단백질들(costimulatory proteins) 또는 사이토킨 IL-12의 유도와 같은 보조성은 가능한 유지하는 균주를 말한다. 특정 실시형태에서, 상기 약독화된 균주는 "승인된 백신 균주"로서, 이는 국가 또는 지역 보건당국에 의해 제품 생산 승인(법적 지정)을 받아 백신 제조에 사용되도록 인증된 균주이다. 따라서, "승인된 백신 균주"는 안전하고, 안정하며 효율적인 방어를 제공한다(면역원성 및 보조성). 균주의 안정성은 동일한 인증 세포주상에서 많은 계대 후에도 균주가 실질적인 변경없이 존재하는 성질을 평가함으로써 측정한다.
"유래된(Derived from)"은 야생형 바이러스 또는 균주에 비해 뉴클레오타이드 서열이 변경된 cDNA 클론을 의미한다. 이러한 변경은 뉴클레오타이드 서열에서, 특히 바이러스 또는 균주의 단백질의 코딩 서열에서 하나 이상이 치환되거나, 결실되거나 삽입되어 일어난다. 다른 실시형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 이종 핵산, 즉 이 핵산이 삽입되는 바이러스나 균주에 자연적으로 존재하지 않는 서열 또는 홍역 바이러스의 항원에서 유래되지 않는 서열의 삽입에 의해 변경된다. 또한 cDNA 클론은 야생형 바이러스 게놈의 일부 결실, 및 이종 기원 핵산의 삽입에 의해 변경될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 유래된 cDNA 클론은 하나 또는 수개의 이종 핵산으로 구성되거나 포함하며, 소위 6 법칙을 만족한다. 따라서 유래된 cDNA 클론은 폴리헥사머 길이(polyhexameric length), 즉 6의 배수이다. 이러한 요건은 특히 파라믹소비리데, 특히 홍역 바이러스에서 유래된 cDNA 클론에서 성취된다. 일부 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스는 본 기술분야의 당업자에게 알려져 있듯이 상기 법칙에 따르지 않는다.
삽입에 의해 감염성 재조합 비분절 음성 가닥 바이러스의 생성을 방지하지 않는한(허용 부위), cDNA 클론의 핵산 서열에는 어떠한 이종 핵산도 삽입될 수 있다. 일 특정 실시형태에서, 상기 천연 바이러스 게놈의 삽입 또는 결실은 6의 배수인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 따라서 게놈의 길이가 6의 배수가 아니라하더라도, 상기 변경은 6 또는 6의 배수의 결실 및/또는 삽입으로 이루어진다.
따라서 이종 핵산 서열은, 유기체 또는 특히 병원성 유기체, 예를 들면 바이러스, 특히 레트로바이러스, 플라비바이러스 또는 코로나바이러스, 또는 이들이 기원하는 박테리아 또는 기생충에 대해, 정해진 숙주에서 체액성 및/또는 세포성 면역반응(CTL 또는 CD4 반응)을 유발할 수 있는 하나 또는 수개의 펩티드를 코딩할 수 있다. 따라서 이러한 펩티드의 아미노산 서열은 하나 이상의 항원 에피토프, 특히 보존 에피토프를 포함할 수 있으며, 이 에피토프는 항원상에 자연적으로 노출되거나 또는 항원의 돌연변이 또는 변경 또는 조합 결과로 수득되거나 노출된다. cDNA 클론에 삽입될 수 있는 이종 핵산들은 특히 인간 레트로바이러스 특히 렌티바이러스, 특히 HIV-1 또는 HIV-2, 플라비바이러스 또는 코로나바이러스 외피, 예를 들면 외피 또는 캡시드 항원을 포함하는 바이러스의 구조적 항원(이들의 항원 단편 또는 상기 항원 또는 단편의 유도체를 포함)을 코딩한다. 특히 이러한 항원은 HIV-1 또는 HIV-2를 포함하는 AIDS 바이러스의 엔벤롭, HIV의 캡시드, 황열바이러스의 외피 또는 웨스트나일 바이러스의 외피, 또는 댕기바이러스(DV)의 외피, 일본뇌염바이러스(JEV)의 외피, SARS-수반 코로나바이러스의 외피에서 온다. 다른 레트로바이러스, 플라비바이러스 또는 코로나바이러스 항원도 유용하게 사용되어 재조합 홍역바이러스로 하여금 상기 레트로바이러스 또는 플라비바이러스에 대해 항체를 유도할 수 있도록 하고 및/또는 레트로바이러스 또는 플라비바이러스에 대한 중화항체를 생성하도록 유발시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 이종 핵산 서열을 코딩하거나 포함하는 펩티드는 암항원 또는 암세포의 표면에 특히 발현된 항원이다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 서열은 레트로바이러스 또는 플라비바이러스에 대해 세포면역반응을 대체적으로 또는 추가적으로 유발하는 멀티에피토프 또는 항원을 코딩한다.
유용하게, 본 발명의 방법으로 제조되는 재조합 홍역바이러스는 또한 홍역 바이러스에 대해 체액성 및/또는 세포성 면역반응을 유발한다. 전술한 에피토프, 또는 멀티에피토프 또는 항원에 대해 면역반응이 실제 얻어진다면 이러한 반응은 강제적인 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 상기 이종 핵산은 HIV 레트로바이러스에서 온 단백질, 특히 HIV의 외피 항원 및 특히 HIV-1 또는 HIV-2의 외피 단백질 또는 당단백에서 유래된 펩티드를 코딩한다. 이 점에서 관심 항원은 특히 HIV-1의 gp160, gp120 및 gp41 또는 gp140, GAG 또는 HIV-1의 TAT 이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 이종 아미노산 서열은 HIV-1의 재조합 gp160, gp120 또는 HIV-1의 gp140, GAG 또는 TAT에서 유래한다.
다른 실시형태에서, gp120 (또는 gp160) 항원의 V1 , V2 및/또는 V3 루프는, 보존 에피토프가 수득된 재조합 p120 항원에서 노출되도록, 단독으로 또는 조합되어 결실되거나 부분적으로 결실된다. HIV-1의 gp120 (또는 gp160) 항원의 V1 , V2 및/또는 V3 루프는 특히 Fields virology (Fields B.N. et al. Lippincott Raven publishers 1996, p. 1953-1977)에 개시되어 있다.
다른 실시형태에서, 상기 이종 핵산은 HIV-1의 gp120 (또는 gp160) 항원에서 유래된 펩티드를 코딩하며, gp120 (또는 gp160) 항원의 V1, V2 및/또는 V3 루프는, 보존 에피토프가 수득된 재조합 p120 항원에서 노출되도록, 단독으로 또는 조합되어 결실되거나 부분적으로 결실된다.
다른 실시형태에서, 이종 핵산은 HIV-1의 외피 항원에서 유래된 특히 V1, V2 루프가 결실되고 V3 루프가 서열 AAELDKWASAA를 치환하는 방식으로 gp120에서 유래된 펩티드를 코딩한다.
다른 실시형태에서, 상기 이종 핵산은 gp160△V3, gp160△V1V2, gp160δV1V2V3, gp140△V3, gp140△V1V2, gp140△V1V2V3인 펩티드를 코딩한다.
HIV, WNV, YFV, DV 또는 JEV로부터의 에피토프를 함유하는 바람직한 cDNA 클론은 도 2에 정의된 벡터들로서, 이들은 CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes - 파스퇴르연구소 - 프랑스, 파리)에 기탁되었으며, 그 특징은 하기와 같다.
[표 2]
I-2883 (pMV2(EdB)gp160[delta]V3HIV89.6P)는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(에드몬스튼 균주 B)의 전체 서열을 포함하며, 위치 2(홍역 바이러스의 N 및 P 유전자 사이)의 ATU에 삽입된 SVIH 바이러스 균주 89.6P의 gp160△V3 + ELDKWAS 유전자를 포함하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다. 플라즈미드의 크기는 21264nt이다.
I-2884 (pMV2(EdB)gp160HIV89.6P)는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(에드몬스튼 균주 B)의 전체 서열을 포함하며, 위치 2(홍역 바이러스의 N 및 P 유전자 사이)의 ATU에 삽입된 SVIH 바이러스 균주 89.6P의 gp160 유전자를 포함하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다. 플라즈미드의 크기는 21658 nt이다.
I-2885 (pMV2(EdB)gp140HIV89.6P)는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(에드몬스튼 균주 B)의 전체 서열을 포함하며, 위치 2(홍역 바이러스의 N 및 P 유전자 사이)의 ATU에 삽입된 SVIH 바이러스 균주 89.6P의 gp140 유전자를 포함하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다. 플라즈미드의 크기는 21094 nt이다.
I-2886 (pMV3(EdB)gp140[delta]V3HIV89.6P)는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(에드몬스튼 균주 B)의 전체 서열을 포함하며, 위치 2(홍역 바이러스의 N 및 P 유전자 사이)의 ATU에 삽입된 SVIH 바이러스 균주 89.6P의 gp140△V3(ELDKWAS) 유전자를 포함하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다. 플라즈미드의 크기는 21058 nt이다.
I-2887 (pMV2(EdB)-NS1YFV17D)는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(에드몬스튼 균주 B)의 전체 서열을 포함하며, 위치 2(홍역 바이러스의 N 및 P 유전자 사이)의 ATU에 삽입된 황열 바이러스(YFV 17D)의 NS1 유전자를 포함하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다. 플라즈미드의 크기는 20163 nt이다.
I-2888 (pMV2(EdB)-EnvYFV17D)는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(에드몬스튼 균주 B)의 전체 서열을 포함하며, 위치 2(홍역 바이러스의 N 및 P 유전자 사이)의 ATU에 삽입된 황열 바이러스(YFV 17D)의 Env 유전자를 포함하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다. 플라즈미드의 크기는 20505 nt이다.
I-3033 (pTM-MVSchw2-Es(WNV))는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, ATU에 삽입된 웨스트 나일 바이러스 (WNV)의 분비 외피(E) 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3034 (pTM-MVSchw2-GFPbis)는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, ATU에 삽입된 GFP 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3035 (pTM-MVSchw2-p17p24[delta]myr(HIVB))는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, ATU에 삽입된 HIVB의 p17p24△myr 단백질을 코딩하는 gag 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3036 (pTMVSchw3-Tat(HIV89-6p))는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, ATU에 삽입된 바이러스 균주 89.6P의 Tat 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3037 (pTM-MVSchw3-GFP)는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, 한 뉴클레오타이드가 결실된 ATU에 삽입된 GFP 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3038 (pTM-MVSchw2-Es) (YFV)는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, ATU에 삽입된 황열바이러스(YFV)의 분비 단백질의 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3054 (pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6))는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, ATU에 삽입된 gp140 [delta] V1 V2 (HIV 89-6)를 코딩하는 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3055 (pTM-MVSchw2-gp140 [delta] V3 (HIV89-6))는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, ATU에 삽입된 gp14 [delta] V3 (HIV 89-6)를 코딩하는 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3056 (pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV89-6))는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, ATU에 삽입된 gp160 [delta] V1 V2 V3 (HIV 89-6)를 코딩하는 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3057 (pTM-MVSchw2-gp160 [delta] V1 V2 (HIV89-6))는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, ATU에 삽입된 gp160 [delta] V1 V2 (HIV 89-6)를 코딩하는 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3058 (pTM-MVSchw2-Gag SIV239 p17-p24 [delta] myr-3-gp140 (HIV89-6))는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 조절하에, 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열을 포함하며, ATU에 삽입된 Gag S1V239 p17-p24 [delta] myr-3-gp140 (HIV89-6)를 코딩하는 유전자를 발현하는 블루스크립트에서 유래된 플라즈미드이다.
I-3440 (pTM-MvSchw2-[EDIII+M1-40] WNV (IS-98-ST1))는 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열 및 P와 M 유전자 사이에 위치하는 부가적인 발현 유닛을 포함하는 PTM에서 유래한 플라즈미드로서, 상기 유닛은 막 단백질 M의 서열 1-40에 융합된 웨스트 나일 바이러스(WNV) (WNV IS-98-ST1)의 외피 단백질에서 온 도메인 III의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
I-3442 (pTM-MvSchw2-[EDIII+ApoptoM] DV1 (FGA89))은 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열 및 P와 M 유전자 사이에 위치하는 부가적인 발현 유닛을 포함하는 PTM에서 유래한 플라즈미드로서, 상기 유닛은 막 단백질 M의 아폽토시스 서열에 융합된 댕기-1 바이러스(균주 FGA89)의 외피 단백질에서 온 도메인 III의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
1-3441 (pTM-MvSchw2-[EDIII] JEV (Nakayama))은 홍역 바이러스(슈왈쯔 균주)의 전체 감염성 게놈의 cDNA 서열 및 P와 M 유전자 사이에 위치하는 부가적인 발현 유닛을 포함하는 PTM에서 유래한 플라즈미드로서, 상기 유닛은 일본뇌염바이러스(JEV), 균주 나카야마의 외피 단백질의 도메인 III의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 일 실시형태에서, 상기 이종 핵산은 황열바이러스의 외피(Env), NS1 단백질 또는 이들의 면역원성 돌연변이 중에서 선택되는 항원에서 유래한 펩티드를 코딩한다. 본 발명의 재조합 홍역 바이러스 벡터에 존재하는 이종 DNA 서열이 황열바이러스(YFV)에서 유래되는 경우, 특히 아벤티스 파스테르에 의해 스타마릴®의 상품명으로 시판되는 YFV 17D 204에서 선택되는 것이 바람직하다.
다른 특정 실시형태에서, 이종 핵산은 웨스트 나일 바이러스의 외피(E), 전막(preM) 또는 이들의 면역원성 돌연변이 중에서 선택되는 항원에서 유래된 펩티드를 코딩한다. 본 발명의 재조합 홍역 바이러스 벡터에 존재하는 이종 DNA 서열이 웨스트 나일 바이러스(WNV)에서 유래되는 경우, 특히 뉴로바이러스성 균주 IS 98-ST1에서 선택되는 것이 바람직하다.
상기 이종 핵산은 암-특이적 항원(TSA) 또는 암-수반 항원(TAA)을 코딩할 수 있다.
본 발명의 다른 이점은 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론내에, 긴 이종 핵산 또는 다수의 이종 핵산을 삽입할 수 있다는 점이다. 따라서, 상기 cDNA 클론은 전체 길이가 5 kb 이상인 하나 또는 수개의 이종 핵산의 삽입에 의하여 변경될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 참조된 기탁된 플라즈미드내 삽입된 폴리뉴클레오타이드내 함유된 각 뉴클레오타이드 단편에 관한 것이며, 본 발명의 개시에 따라 삽입되도록 디자인되기에 적합한 각 영역에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 단편을 본 발명의 플라즈미드 구축에 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다음 세 단백질 즉, RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 폴리머라제 조인자 인단백(P) 또는 적어도 상기 세 단백질, 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 발현하는 재조합 세포를 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
a) 최소한 하기로 세포를 재조합하는 단계:
- DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터,
- DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백(N)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및
- DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터와 세포를 재조합하는 단계, 및
b) RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백(P), 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 생성하는 세포를 선택하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어진다.
또는, 상기 방법은
a) 하기를 포함하는 발현 벡터로 세포를 재조합하는 단계:
- 프로모터 조절하에 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산 한 카피 이상,
- 프로모터 조절하에 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백(N)을 코딩하는 핵산 한 카피 이상,
- 프로모터 조절하에 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백을 코딩하는 핵산 한 카피 이상, 및
- DNA 플립, 및
b) RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백(P), 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 생성하는 세포를 선택하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어진다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 재조합 세포를 제조하는 방법은 추가적으로 전술한 방법의 a) 단계에서 수득한 재조합 세포를 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L) 또는 이의 기능적 유도체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 재조합하는 단계 및 최소한 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백질(P)을 안정적으로 생성하고, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 대단백질(L) 또는 이들의 기능적 유도체를 생성하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 전술한 재조합 세포를 헬퍼 세포로서, 특히 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스 제조에 있어서 헬퍼 세포로서 사용하는 용도에 관한 것이다.
이하 실시예 및 도면을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 청구범위에 기재된 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의해 제한되지 않는다.
세포 및 바이러스
베로 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포)는 5% 소태아혈청(FCS)을 보충한 둘베코 변경 이글 미디엄(DMEM)내에 단층으로 성장시켰다. 인간 신장 293 세포 (HEK-293)는 10% FCS를 보충한 DMEM 배지에서 성장시켰다. 인간 이배체 MRC5 세포는 10% FCS를 보충한 DMEM 배지에서 단층으로 성장시켰다. 닭 배아 섬유모세포(CEF)는 다음과 같이 제조하였다: 수정된 달걀(Morizeau, Dangers, France)을 38℃에서 9일간 인큐베이션하였다. 멸균 조건하에서 배아를 수집하였다. 머리, 사지, 내장을 제거하고, 배아를 자른후, 37℃에서 5-10분간 트립신 처리하였다(Trypsin/EDTA 2.5 g/L). 여과후 (70 μm), DMEM 고포도당/10% FCS내에서 수회 세척한 후, 세포를 시딩한 후(5-7×106 세포/페트리 디쉬), 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 바이러스 감염에 사용하였다.
플라즈미드 구축
게이트웨이®재조합 시스템(Invitrogen)을 사용하여 추가서열을 쉽게 재조합하기 위해, 게이트웨이® 카세트(attbl/attb2 Seq)를 Smal 소화로 직선화된 HIV-1-TRIP-△U3-BSX 플라즈마벡터 내로 리게이션에 의해 도입하였다(Zennou et al., 2000). 17 RNA 폴리머라제 유전자는 pAR-1173 플라즈미드 (Brookhaven National Laboratory, ref)로부터 PfuTurbo DNA 폴리머라제 (Stratagene) 및 하기 게이트웨이® 재조합 서열(줄친부분)을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다:
AttB1-T7Pol : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATGG
AATTCTCTGACATCGAACTGGCT-3'
AttB2-retourT7Pol : 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCAC
GCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3'
T7 RNA 폴리머라제의 핵형 (nlsT7) 또한 pAR-3288 플라즈미드(Brookhaven National Laboratory, ref)로부터 하기 핵국재화시그널(굵게) 및 게이트웨이® 재조합 서열(줄친부분)을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다:
AttBI-SV40nls : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCACCATG
GCACCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3'
AttB2-retourT7Pol: 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTATCACG
CGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGTC-3'
동일한 접근방식으로, 슈왈쯔 MV N 및 P 유전자도 PCR에 의해 pTM-MVSchw 플라즈미드로부터 증폭하였으며, 상기 플라즈미드는 전장 감염성 슈왈쯔 MV 안티게놈을 함유한다(Combredet et al., 2003). 하기 게이트웨이® 재조합 서열(줄친부분)을 포함하는 프라이머를 사용하였다:
AttB1-N: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCCACAC
TTTTAAGGAGCTTAGCA-3'
AttB2-N: 5'-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTGTACTAGTCTAG
AAGATTTCTGTCATTGTA-3'
AttB1-P: 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCAGAAG
AGCAGGCACGCCAT-3'
AttB2-P:5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACTACTTCAT TATTATCTTCATCAGCATCTGGTGGA-3'
T7 RNA 폴리머라제, nlsT7 RNA 폴리머라제 및 MV N 및 P 단백질을 포함하는 상이한 PCR 단편들을 pDONR™207 엔트리 플라즈미드 (Invitrogen)에 도입하고, 게이트웨이® 재조합 시스템(Invitrogen)을 사용하여 변경된 HIV-1-TRIP-△U3-BSX 플라즈미드내에서 재조합하였다. 수득된 상이한 재조합 벡터 플라즈미드(HIV-1-TRIP delta U3.CMV-T7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-nlsT7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-N 및HIV-1-TRIP delta U3.CMV-P)는 완전히 시퀀싱하였다. 이 벡터들은 각각 기탁번호 I-3702, I-3703, I-3700 및 1-3701로 CNCM에 2006년 12월 18일 기탁하였다.
슈왈쯔 MV에서 온 폴리머라제 L 단백질을 발현하는 플라즈미드 pEMC-LSchw는 Radecke et al. (1995)에 기재된 것과 유사한 방식으로 구축하였다. pTM-MVSchw 플라즈미드로부터 슈왈쯔 L 유전자의 6552 뉴클레오타이드 길이의 서열을 얻은 후(Combredet et al., 2003), 고전적인 클로닝 과정을 사용하여 전술한 Radecke et al. (1995)에 기술된 pEMC-La 플라즈미드내 삽입하였다. 이 플라즈미드는 2007년 12월 18일 기탁번호 I-3881로 CNCM에 기탁하였다.
벡터 입자의 제조
벡터 입자들은 칼슘-인 과정을 사용하여 HEK-293 세포와, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-T7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-nlsT7, HIV-1-TRIP delta U3.CMV-N, 또는 HIV-1-TRIP delta U3.CMV-P 벡터 플라즈미드, HIV-1 gag 및 pol 유전자를 발현하는 인캡시데이션 플라즈미드(encapsidation plasmid), 및 Zennou et al., 2000에 기재된 바와 같은 VSV-G 외피 당단백(pHCMV-G)을 발현하는 플라즈미드와 공-트랜스팩션하여 제조하였다. 원심분리로 벡터 입자를 농축하고, 그 원액내 Gag p24 항원의 양을 HIV-1 p24 ELISA (Perkin Elmer LifeSciences)를 사용하여 측정하였다.
293-T7-MV 세포주 생성
세포(HEK-293)를 35 mm 웰내에 시딩하고 하루후, TRIP-T7 및 TRIP-nlsT7 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 벡터들(500 ng/ml p24)은 10% FCS 보충 DMEM 배지에 첨가하였다. 8일 동안, 동일향의 벡터를 매일 세포내 반복하여 첨가하였다. 세포는 2일 마다 증량되었다. 각 계대후, 세포의 T7 RNA 폴리머라제 활성을 측정하였다. 35 mm 세포 배양물을 칼슘-인 과정을 통해 5 μg의 pEMC-Luc로 트랜스팩션하고, 하루후 세포용해물을 수확하고, 제거된 세포용해물 20분의 1중 루시페라제 활성을 루미노미터를 사용하여 측정하였다. 루시퍼라제 활성은 매 추가 형질도입후 증가되었으며, 7번째 및 8번째 형질도입사이에 최대로 존재하였다. 각 형질도입후, 트립판블루-배제 시험을 사용하여 세포 생육성을 측정하고 이를 형질도입되지 않은 세포와 비교함으로써 T7 RNA 폴리머라제 발현이 세포독성이 없음을 확인하였다. 8단계의 형질도입후, 세포질형(293-T7) 또는 핵형(293-nlsT7)의 매우 높은 T7 RNA 폴리머라제 활성을 나타내는 두 세포집단이 생성되었다.
상기 두 세포 집단(293-T7 및 293-nlsT7)을 동시에 TRIP-N 및 TRIP-P 벡터로 공-형질도입하였다. 벡터들 (TRIP N: 390 ng/ml p24 및 TRIP P: 330 ng/ml p24)을 35 mm 웰내에 시딩한 세포상에 첨가하였다. 10일 동안, 동일한 양의 양 벡터들을 매일 반복적으로 세포에 첨가하였다. 세포들은 2일마다 증량되었다. 형질도입 10회후, 전체 세포집단에 대해 MV N 및 P 단백질의 발현을 분석하였으며, 이는 35 mm 웰의 전체 용해물의 1/20 을 사용하여 웨스턴 블롯법으로 시행하였다. 양 단백질의 발현은 유사한 수의 감염된 베로 세포와 필적하였다(도 2 참조). 이후 형질도입된 세포는 한계 희석으로 클로닝하였다. 세포들을 웰당 1/3의 희석으로 96웰 플레이트에 시딩하였다. 2주후 첫번째 클론을 선택하였다. 각 293-T7-NP 및 293-nlsT7-NP 세포들의 100 클론이 24웰 플레이트에 이후 35 mm 웰에로 증량되었다. 20 클론에 대해 MV N 및 P 단백질의 발현을 분석하였으며, 이는 35 mm 웰의 전체 용해물의 1/20 을 사용하여 웨스턴 블롯법으로 시행하였다. 양 단백질의 발현은 유사한 수의 감염된 베로 세포와 필적하였다(도 2 참조). 각 클론에 대해 전술한 바와 같이 T7 RNA 폴리머라제 활성을 측정하고, 높은 루시퍼라제 활성 및 유사한 수준의 MV N 및 P 발현을 나타내는 클론들을 선택하였다. 하기 기술한 클론들을 107 세포/ml의 밀도로 DMEM/30%FCS/10%DMSO내에서 증폭하고 -180℃에서 동결하였다: 293-T7-NP1, 293-T7-NP3, 293-T7-NP5, 293-T7-NP7, 293-T7-NP8, 293-T7-NP10, 293-T7-NP13, 293-T7-NP14, 293-T7-NP20, 293-T7-NP28, 293-T7-NP31, 293-T7-NP33, 293-nlsT7-NP1, 293-nlsT7-NP5, 293-nlsT7-NP6, 293-nlsT7-NP13, 293-nlsT7-NP14, 293-nlsT7-NP15, 293-nlsT7-NP30 및 293-nlsT7-NP40.
293-T7-N 및 293-NLST7헬퍼 세포를 사용한 슈왈쯔 MV의 구조
생성된 상이한 헬퍼 세포들 293-T7-NP와 293-nlsT7-NP 세포 클론들의 cDNA로부터 MV의 효과적인 구조 역량을 평가하기 위해, 플라즈미드 pTM-MVSchw-eGFP (Combredet et al., 2003)를 사용하여 녹색 형광 단백질(eGFP)을 발현하는 재조합 슈왈쯔 MV 를 구조하였다. 전술한 것과 유사한 시스템을 사용하였다 (Radecke et al., 1995; Parks et al., 1999; Combredet et al., 2003). 헬퍼세포들 293-T7-NP 또는 293-nlsT7-NP는 칼슘 인 과정을 사용하여 pTM-MVSchw-eGFP (5μg) 및 슈왈쯔 MV 폴리머라제 L 유전자를 발현하는 플라즈미드 pEMC-LSchw(20-100 ng)로 트랜스팩션하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 트랜스팩션 매질을 신선한 매질로 교체하고, 상기 세포들에 43℃에서 3시간 동안 열충격을 가한 후, 37℃가 되게 하였다. 37℃에서 2일간 인큐베이션한 후, 단층의 베로세포, CEF 또는 MRC5 세포에 이송하고, 37℃에서 10 cm 접시에서 인큐베이션하였다(CEF는 32℃에서 인큐베이션). 공 배양 2-3일 후, 베로, CEF 또는 MRC5 세포상에서 형광 세포가 급속히 출현하였다. 감염된 세포들은 초점내 급속히 증량하였다. 재조합 바이러스는 베로 세포에서 매우 융합적(highly syncytial)이고, CEF 및 MRC5 세포에서는 비-융합성이었다. 단일 융합체 또는 감염성 병소를 35 mm 웰의 베로, CEF 또는 MRC5 세포에 이송하고, 신선한 세포를 첨가하여 더 큰 접시로 증량시켰다. 감염 5일 후 CEF 또는 MRC5 세포에서 바이러스를 수확하고, 베로세포에서는 80-90%의 배양물이 융합되었을때(보통 2일 후), 감염 세포를 파쇄하고, 세포와 매질을 동결-해동하고, 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하여 수확한다. 이러한 바이러스 제조는 TCID50 적정 방법을 통해 역가를 측정한다. 간략하게, 베로세포를 96-웰 플레이트 (7500 세포/웰)에 시딩하고, DMEM/5% FCS내 바이러스 샘플을 단계적으로 1:10 희석하여 감염시켰다. 37℃에서 7일간 인큐베이션한 후, 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 테스트 유닛의 50%에서 감염이 일어나는 바이러스 희석농도를 측정하였다. 전술한 50% 종말점 즉 조직 배양 감염 양(TCID50)은 Karber법(3)으로 산출하였다. 베로세포에서 성장하고 구조된 재조합 바이러스는 107-l08 TCID50/ml의 역가를 나타내었으며, CEF 또는 MRC5 세포에서 성장하고 구조된 바이러스는 104-106 TCID50/ml의 낮은 역가를 나타내었다.
본 발명은 재조합 벡터, 특히 T7 RNA 폴리머라제 및 홍역 슈왈쯔 N 및 P 단백질을 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 조절하에서 발현하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-TRIP 렌티바이러스 벡터의 구축 및 제조에 대한 기술을 제공한다. 이러한 벡터들은 거의 모든 세포, 특히 인간 또는 포유류 세포를 고 수준으로 생체외에서 효율적으로 형질도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 세포는 헬퍼/트랜스콤플리멘트 세포(transcomplementary cell)로 사용될 수 있으며, 이는 전술한 전장 감염성 바이러스 안티게놈 cDNA 또는 변경된 cDNA 클론에 의해 트랜스팩션된 후 재조합 홍역 바이러스를 드 노보 생성할 수 있다.
본 발명은 임의로 변경된 cDNA로부터, 백시니아 바이러스와 같은 다른 헬퍼 바이러스에 의한 오염없이, 홍역바이러스와 같은 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 구조할 수 있게 한다. 렌티 바이러스 벡터의 높은 형질전환 효율성으로 인해 본 방법은 세포가 매우 높은 수준의 헬퍼 단백질을 발현하도록 한다. 레트로바이러스-기초 재조합, 특히 렌티바이러스 기초의 재조합이기 때문에, 외래 DNA의 염색체 DNA로의 재조합은 금제의(illicit)의 플라즈미드-기초의 재조합에 비하여 진성이며(genuine), 본 방법으로 생성된 헬퍼 세포들은 매우 안정하고, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 cDNA로부터 구조하는 효율은 다수의 연속적인 계대 후에도 계속 높게 유지된다.
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SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR <110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> CELLS AND METHODOLOGY TO GENERATE NON-SEGMENTED NEGATIVE-STRAND RNA VIRUSES <130> IP20091353 <150> EP06292025.1 <151> 2006-12-22 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CAEV FLAP <400> 1 gttccagcca caatttgtcg ctgtagaatc agccatagca gcagccctag tcgccataaa 60 tataaaaaga aagggtgggc tggggacaag ccctatggat atttttatat ataataaaga 120 acagaaaaga ataaataata aatataataa aaattctcaa aaaattcaat tctgttatta 180 cagaataagg aaaagaggac 200 <210> 2 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> EIAV FLAP <400> 2 cttgtaacaa agggagggaa agtatgggag gacagacacc atgggaagta tttatcacta 60 atcaagcaca agtaatacat gagaaacttt tactacagca agcacaatcc tccaaaaaat 120 tttgttttta caaaatccct ggtgaacatg attggaaggg acctactagg gtgctgtgga 180 agggtgatgg tgcagtagta 200 <210> 3 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VISNA FLAP <400> 3 ggaccctcat tactctaaat ataaaaagaa agggtgggct 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gat gaa ggt act tat cat gag tta act gaa gct cta gat tac 1008 Phe Ser Asp Glu Gly Thr Tyr His Glu Leu Thr Glu Ala Leu Asp Tyr 325 330 335 att ttc ata act gat gac ata cat ctg aca ggg gag att ttc tca ttt 1056 Ile Phe Ile Thr Asp Asp Ile His Leu Thr Gly Glu Ile Phe Ser Phe 340 345 350 ttc aga agt ttc ggc cac ccc aga ctt gaa gca gta acg gct gct gaa 1104 Phe Arg Ser Phe Gly His Pro Arg Leu Glu Ala Val Thr Ala Ala Glu 355 360 365 aat gtt agg aaa tac atg aat cag cct aaa gtc att gtg tat gag act 1152 Asn Val Arg Lys Tyr Met Asn Gln Pro Lys Val Ile Val Tyr Glu Thr 370 375 380 ctg atg aaa ggt cat gcc ata ttt tgt gga atc ata atc aac ggc tat 1200 Leu Met Lys Gly His Ala Ile Phe Cys Gly Ile Ile Ile Asn Gly Tyr 385 390 395 400 cgt gac agg cac gga ggc agt tgg cca ccg ctg acc ctc ccc ctg cat 1248 Arg Asp Arg His Gly Gly Ser Trp Pro Pro Leu Thr Leu Pro Leu His 405 410 415 gct gca gac aca atc cgg aat gct caa gct tca ggt gaa ggg tta aca 1296 Ala Ala Asp Thr Ile Arg Asn Ala Gln Ala Ser Gly Glu Gly Leu Thr 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aca caa caa ccg ggg gac tct tca ttc cta 2976 Thr Leu His Gln Val Met Thr Gln Gln Pro Gly Asp Ser Ser Phe Leu 980 985 990 gac tgg gct agc gac cct tac tca gca aat ctt gta tgt gtc cag agc 3024 Asp Trp Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Ala Asn Leu Val Cys Val Gln Ser 995 1000 1005 atc act aga ctc ctc aag aac ata act gca agg ttt gtc ctg atc 3069 Ile Thr Arg Leu Leu Lys Asn Ile Thr Ala Arg Phe Val Leu Ile 1010 1015 1020 cat agt cca aac cca atg tta aaa gga tta ttc cat gat gac agt 3114 His Ser Pro Asn Pro Met Leu Lys Gly Leu Phe His Asp Asp Ser 1025 1030 1035 aaa gaa gag gac gag gga ctg gcg gca ttc ctc atg gac agg cat 3159 Lys Glu Glu Asp Glu Gly Leu Ala Ala Phe Leu Met Asp Arg His 1040 1045 1050 att ata gta cct agg gca gct cat gaa atc ctg gat cat agt gtc 3204 Ile Ile Val Pro Arg Ala Ala His Glu Ile Leu Asp His Ser Val 1055 1060 1065 aca ggg gca aga gag tct att gca ggc atg ctg gat acc aca aaa 3249 Thr Gly Ala Arg Glu Ser Ile Ala Gly Met Leu Asp Thr Thr Lys 1070 1075 1080 ggc ttg att cga gcc agc atg agg aag ggg ggg tta acc tct cga 3294 Gly Leu Ile Arg Ala Ser Met Arg Lys Gly Gly Leu Thr Ser Arg 1085 1090 1095 gtg ata acc aga ttg tcc aat tat gac tat gaa caa ttc aga gca 3339 Val Ile Thr Arg Leu Ser Asn Tyr Asp Tyr Glu Gln Phe Arg Ala 1100 1105 1110 ggg atg gtg cta ttg aca gga aga aag aga aat gtc ctc att gac 3384 Gly Met Val Leu Leu Thr Gly Arg Lys Arg Asn Val Leu Ile Asp 1115 1120 1125 aaa gag tca tgt tca gtg cag ctg gcg aga gct cta aga agc cat 3429 Lys Glu Ser Cys Ser Val Gln Leu Ala Arg Ala Leu Arg Ser His 1130 1135 1140 atg tgg gcg agg cta gct cga gga cgg cct att tac ggc ctt gag 3474 Met Trp Ala Arg Leu Ala Arg Gly Arg Pro Ile Tyr Gly Leu Glu 1145 1150 1155 gtc cct gat gta cta gaa tct atg cga ggc cac ctt att cgg cgt 3519 Val Pro Asp Val Leu Glu Ser Met Arg Gly His Leu Ile Arg Arg 1160 1165 1170 cat gag aca tgt gtc atc tgc gag tgt gga tca gtc aac tac gga 3564 His Glu Thr Cys Val Ile Cys Glu Cys Gly Ser Val Asn Tyr Gly 1175 1180 1185 tgg ttt ttt gtc ccc tcg ggt tgc caa ctg gat gat att gac aag 3609 Trp Phe Phe Val Pro Ser Gly Cys Gln Leu Asp Asp Ile Asp Lys 1190 1195 1200 gaa aca tca tcc ttg aga gtc cca tat att ggt tct acc act gat 3654 Glu Thr Ser Ser Leu Arg Val Pro Tyr Ile Gly Ser Thr Thr Asp 1205 1210 1215 gag aga aca gac atg aag ctt gcc ttc gta aga gcc cca agt cga 3699 Glu Arg Thr Asp Met Lys Leu Ala Phe Val Arg Ala Pro Ser Arg 1220 1225 1230 tcc ttg cga tct gct gtt aga ata gca aca gtg tac tca tgg gct 3744 Ser Leu Arg Ser Ala Val Arg Ile Ala Thr Val Tyr Ser Trp Ala 1235 1240 1245 tac ggt gat gat gat agc tct tgg aac gaa gcc tgg ttg ttg gct 3789 Tyr Gly Asp Asp Asp Ser Ser Trp Asn Glu Ala Trp Leu Leu Ala 1250 1255 1260 agg caa agg gcc aat gtg agc ctg gag gag cta agg gtg atc act 3834 Arg Gln Arg Ala Asn Val Ser Leu Glu Glu Leu Arg Val Ile Thr 1265 1270 1275 ccc atc tca act tcg act aat tta gcg cat agg ttg agg gat cgt 3879 Pro Ile Ser Thr Ser Thr Asn Leu Ala His Arg Leu Arg Asp Arg 1280 1285 1290 agc act caa gtg aaa tac tca ggt aca tcc ctt gtc cga gtg gcg 3924 Ser Thr 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Asp Arg Asp Ala Thr Arg Leu Tyr 1400 1405 1410 acc cag agc cat agg agg cac ctt gtg gaa ttt gtt aca tgg tcc 4284 Thr Gln Ser His Arg Arg His Leu Val Glu Phe Val Thr Trp Ser 1415 1420 1425 aca ccc caa cta tat cac att tta gct aag tcc aca gca cta tct 4329 Thr Pro Gln Leu Tyr His Ile Leu Ala Lys Ser Thr Ala Leu Ser 1430 1435 1440 atg att gac ctg gta aca aaa ttt gag aag gac cat atg aat gaa 4374 Met Ile Asp Leu Val Thr Lys Phe Glu Lys Asp His Met Asn Glu 1445 1450 1455 att tca gct ctc ata ggg gat gac gat atc aat agt ttc ata act 4419 Ile Ser Ala Leu Ile Gly Asp Asp Asp Ile Asn Ser Phe Ile Thr 1460 1465 1470 gag ttt ctg ctc ata gag cca aga tta ttc act atc tac ttg ggc 4464 Glu Phe Leu Leu Ile Glu Pro Arg Leu Phe Thr Ile Tyr Leu Gly 1475 1480 1485 cag tgt gcg gcc atc aat tgg gca ttt gat gta cat tat cat aga 4509 Gln Cys Ala Ala Ile Asn Trp Ala Phe Asp Val His Tyr His Arg 1490 1495 1500 cca tca ggg aaa tat cag atg ggt gag ctg ttg tca tcg ttc ctt 4554 Pro Ser Gly Lys Tyr Gln Met Gly Glu Leu Leu Ser 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gat atc aac aca agc aag cac aat ctt ccc att tca ggg 5229 Leu Lys Asp Ile Asn Thr Ser Lys His Asn Leu Pro Ile Ser Gly 1730 1735 1740 ggc aat ctc gcc aat tat gaa atc cat gct ttc cgc aga atc ggg 5274 Gly Asn Leu Ala Asn Tyr Glu Ile His Ala Phe Arg Arg Ile Gly 1745 1750 1755 ttg aac tca tct gct tgc tac aaa gct gtt gag ata tca aca tta 5319 Leu Asn Ser Ser Ala Cys Tyr Lys Ala Val Glu Ile Ser Thr Leu 1760 1765 1770 att agg aga tgc ctt gag cca ggg gag gac ggc ttg ttc ttg ggt 5364 Ile Arg Arg Cys Leu Glu Pro Gly Glu Asp Gly Leu Phe Leu Gly 1775 1780 1785 gag gga tcg ggt tct atg ttg atc act tat aaa gag ata ctt aaa 5409 Glu Gly Ser Gly Ser Met Leu Ile Thr Tyr Lys Glu Ile Leu Lys 1790 1795 1800 cta aac aag tgc ttc tat aat agt ggg gtt tcc gcc aat tct aga 5454 Leu Asn Lys Cys Phe Tyr Asn Ser Gly Val Ser Ala Asn Ser Arg 1805 1810 1815 tct ggt caa agg gaa tta gca ccc tat ccc tcc gaa gtt ggc ctt 5499 Ser Gly Gln Arg Glu Leu Ala Pro Tyr Pro Ser Glu Val Gly Leu 1820 1825 1830 gtc gaa cac aga atg gga gta ggt aat att gtc aaa gtg ctc ttt 5544 Val Glu His Arg Met Gly Val Gly Asn Ile Val Lys Val Leu Phe 1835 1840 1845 aac ggg agg ccc gaa gtc acg tgg gta ggc agt gta gat tgc ttc 5589 Asn Gly Arg Pro Glu Val Thr Trp Val Gly Ser Val Asp Cys Phe 1850 1855 1860 aat ttc ata gtt agt aat atc cct acc tct agt gtg ggg ttt atc 5634 Asn Phe Ile Val Ser Asn Ile Pro Thr Ser Ser Val Gly Phe Ile 1865 1870 1875 cat tca gat ata gag acc ttg cct gac aaa gat act ata gag aag 5679 His Ser Asp Ile Glu Thr Leu Pro Asp Lys Asp Thr Ile Glu Lys 1880 1885 1890 cta gag gaa ttg gca gcc atc tta tcg atg gct ctg ctc ctg ggc 5724 Leu Glu Glu Leu Ala Ala Ile Leu Ser Met Ala Leu Leu Leu Gly 1895 1900 1905 aaa ata gga tca ata ctg gtg att aag ctt atg cct ttc agc ggg 5769 Lys Ile Gly Ser Ile Leu Val Ile Lys Leu Met Pro Phe Ser Gly 1910 1915 1920 gat ttt gtt cag gga ttt ata agt tat gta ggg tct cat tat aga 5814 Asp Phe Val Gln Gly Phe Ile Ser Tyr Val Gly Ser His Tyr Arg 1925 1930 1935 gaa gtg aac ctt gta tac cct aga tac agc aac ttc atc tct act 5859 Glu Val Asn Leu Val Tyr Pro Arg Tyr Ser Asn Phe Ile Ser Thr 1940 1945 1950 gaa tct tat ttg gtt atg aca gat ctc aag gct aac cgg cta atg 5904 Glu Ser Tyr Leu Val Met Thr Asp Leu Lys Ala Asn Arg Leu Met 1955 1960 1965 aat cct gaa aag att aag cag cag ata att gaa tca tct gtg agg 5949 Asn Pro Glu Lys Ile Lys Gln Gln Ile Ile Glu Ser Ser Val Arg 1970 1975 1980 act tca cct gga ctt ata ggt cac atc cta tcc att aag caa cta 5994 Thr Ser Pro Gly Leu Ile Gly His Ile Leu Ser Ile Lys Gln Leu 1985 1990 1995 agc tgc ata caa gca att gtg gga gac gca gtt agt aga ggt gat 6039 Ser Cys Ile Gln Ala Ile Val Gly Asp Ala Val Ser Arg Gly Asp 2000 2005 2010 atc aat cct act ctg aaa aaa ctt aca cct ata gag cag gtg ctg 6084 Ile Asn Pro Thr Leu Lys Lys Leu Thr Pro Ile Glu Gln Val Leu 2015 2020 2025 atc aat tgc ggg ttg gca att aac gga cct aag ctg tgc aaa gaa 6129 Ile Asn Cys Gly Leu Ala Ile Asn Gly Pro Lys Leu Cys Lys Glu 2030 2035 2040 ttg atc cac cat gat gtt gcc tca ggg caa gat gga ttg ctt aat 6174 Leu Ile His His Asp Val Ala Ser Gly Gln Asp Gly Leu Leu Asn 2045 2050 2055 tct ata ctc atc ctc tac agg gag ttg gca aga ttc aaa gac aac 6219 Ser Ile Leu Ile Leu Tyr Arg Glu Leu Ala Arg Phe Lys Asp Asn 2060 2065 2070 caa aga agt caa caa ggg atg ttc cac gct tac ccc gta ttg gta 6264 Gln Arg Ser Gln Gln Gly Met Phe His Ala Tyr Pro Val Leu Val 2075 2080 2085 agt agc agg caa cga gaa ctt ata tct agg atc acc cgc aaa ttc 6309 Ser Ser Arg Gln Arg Glu Leu Ile Ser Arg Ile Thr Arg Lys Phe 2090 2095 2100 tgg ggg cac att ctt ctt tac tcc ggg aac aaa aag ttg ata aat 6354 Trp Gly His Ile Leu Leu Tyr Ser Gly Asn Lys Lys Leu Ile Asn 2105 2110 2115 aag ttt atc cag aat ctc aag tcc ggc tat ctg ata cta gac tta 6399 Lys Phe Ile Gln Asn Leu Lys Ser Gly Tyr Leu Ile Leu Asp Leu 2120 2125 2130 cac cag aat atc ttc gtt aag aat cta tcc aag tca gag aaa cag 6444 His Gln Asn Ile Phe Val Lys Asn Leu Ser Lys Ser Glu Lys Gln 2135 2140 2145 att att atg acg ggg ggt ttg aaa cgt gag tgg gtt ttt aag gta 6489 Ile Ile Met Thr Gly Gly 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gaatgattct cgcctcacta atgcctgaag agaccctcca tcaagtaatg acacaacaac 4380 cgggggactc ttcattccta gactgggcta gcgaccctta ctcagcaaat cttgtatgtg 4440 tccagagcat cactagactc ctcaagaaca taactgcaag gtttgtcctg atccatagtc 4500 caaacccaat gttaaaagga ttattccatg atgacagtaa agaagaggac gagggactgg 4560 cggcattcct catggacagg catattatag tacctagggc agctcatgaa atcctggatc 4620 atagtgtcac aggggcaaga gagtctattg caggcatgct ggataccaca aaaggcttga 4680 ttcgagccag catgaggaag ggggggttaa cctctcgagt gataaccaga ttgtccaatt 4740 atgactatga acaattcaga gcagggatgg tgctattgac aggaagaaag agaaatgtcc 4800 tcattgacaa agagtcatgt tcagtgcagc tggcgagagc tctaagaagc catatgtggg 4860 cgaggctagc tcgaggacgg cctatttacg gccttgaggt ccctgatgta ctagaatcta 4920 tgcgaggcca ccttattcgg cgtcatgaga catgtgtcat ctgcgagtgt ggatcagtca 4980 actacggatg gttttttgtc ccctcgggtt gccaactgga tgatattgac aaggaaacat 5040 catccttgag agtcccatat attggttcta ccactgatga gagaacagac atgaagcttg 5100 ccttcgtaag agccccaagt cgatccttgc gatctgctgt tagaatagca acagtgtact 5160 catgggctta cggtgatgat gatagctctt ggaacgaagc ctggttgttg gctaggcaaa 5220 gggccaatgt gagcctggag gagctaaggg tgatcactcc catctcaact tcgactaatt 5280 tagcgcatag gttgagggat cgtagcactc aagtgaaata ctcaggtaca tcccttgtcc 5340 gagtggcgag gtataccaca atctccaacg acaatctctc atttgtcata tcagataaga 5400 aggttgatac taactttata taccaacaag gaatgcttct agggttgggt gttttagaaa 5460 cattgtttcg actcgagaaa gataccggat catctaacac ggtattacat cttcacgtcg 5520 aaacagattg ttgcgtgatc ccgatgatag atcatcccag gatacccagc tcccgcaagc 5580 tagagctgag ggcagagcta tgtaccaacc cattgatata tgataatgca cctttaattg 5640 acagagatgc aacaaggcta tacacccaga gccataggag gcaccttgtg gaatttgtta 5700 catggtccac accccaacta tatcacattt tagctaagtc cacagcacta tctatgattg 5760 acctggtaac aaaatttgag aaggaccata tgaatgaaat ttcagctctc ataggggatg 5820 acgatatcaa tagtttcata actgagtttc tgctcataga gccaagatta ttcactatct 5880 acttgggcca gtgtgcggcc atcaattggg catttgatgt acattatcat agaccatcag 5940 ggaaatatca gatgggtgag ctgttgtcat cgttcctttc tagaatgagc aaaggagtgt 6000 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tattggtaag tagcaggcaa cgagaactta tatctaggat cacccgcaaa ttctgggggc 7740 acattcttct ttactccggg aacaaaaagt tgataaataa gtttatccag aatctcaagt 7800 ccggctatct gatactagac ttacaccaga atatcttcgt taagaatcta tccaagtcag 7860 agaaacagat tattatgacg gggggtttga aacgtgagtg ggtttttaag gtaacagtca 7920 aggagaccaa agaatggtat aagttagtcg gatacagtgc cctgattaag gactaattgg 7980 ttgaactccg gaaccctaat cctgccctag gtggttaggc attatttacc tcgagggggc 8040 cggatccact agttctagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa acgtcgcgca ggtgacaatg tcgagctagc tatgaattcc 8160 ccggggagct cactagtgga tccctgcagc tcgagaggcc taattaatta agtcgacgat 8220 ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa 8280 ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga 8340 actatatccg gatcgagatc aattctgtga gcgtatggca aacgaaggaa aaatagttat 8400 agtagccgca ctcgatggga catttcaacg taaaccgttt aataatattt tgaatcttat 8460 tccattatct gaaatggtgg taaaactaac tgctgtgtgt atgaaatgct ttaaggaggc 8520 ttccttttct aaacgattgg gtgaggaaac cgagatagaa ataataggag gtaatgatat 8580 gtatcaatcg gtgtgtagaa agtgttacat cgactcataa tattatattt tttatctaaa 8640 aaactaaaaa taaacattga ttaaatttta atataatact taaaaatgga tgttgtgtcg 8700 ttagataaac cgtttatgta ttttgaggaa attgataatg agttagatta cgaaccagaa 8760 agtgcaaatg aggtcgcaaa aaaactgccg tatcaaggac agttaaaact attactagga 8820 gaattatttt ttcttagtaa gttacagcga cacggtatat tagatggtgc caccgtagtg 8880 tatataggat ctgctcccgg tacacatata cgttatttga gagatcattt ctataattta 8940 ggagtgatca tcaaatggat gctaattgac ggccgccatc atgatcctat tttaaatgga 9000 ttgcgtgatg tgactctagt gactcggttc gttgatgagg aatatctacg atccatcaaa 9060 aaacaactgc atccttctaa gattatttta atttctgatg tgagatccaa acgaggagga 9120 aatgaaccta gtacggcgga tttactaagt aattacgctc tacaaaatgt catgattagt 9180 attttaaacc ccgtggcgtc tagtcttaaa tggagatgcc cgtttccaga tcaatggatc 9240 aaggactttt atatcccaca cggtaataaa atgttacaac cttttgctcc ttcatattca 9300 gggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 9360 ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc 9420 cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcga cgcgccctgt agcggcgcat 9480 taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 9540 cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc 9600 aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 9660 ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 9720 ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa 9780 caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg 9840 cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat 9900 taacgtttac aatttcccag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 9960 tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 10020 gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 10080 tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 10140 aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 10200 cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 10260 agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 10320 ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 10380 tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 10440 tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 10500 caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 10560 accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 10620 attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 10680 ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 10740 taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 10800 taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 10860 aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 10920 agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 10980 ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 11040 ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 11100 cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 11160 tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 11220 tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 11280 tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 11340 tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 11400 ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 11460 acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 11520 ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 11580 gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 11640 ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 11700 ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 11760 taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 11820 cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 11880 gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 11940 tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 12000 tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 12060 cagctatgac catgattacg cc 12082 <210> 20 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AttB1-T7Pol primer <400> 20 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc caccatggaa ttctctgaca tcgaactggc 60 t 61 <210> 21 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AttB2-retourT7Pol primer <400> 21 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt atcacgcgaa cgcgaagtcc gactctaaga 60 tgtc 64 <210> 22 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AttBI-SV40nls primer <400> 22 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc caccatggca ccaaaaaaga agagaaaggt 60 a 61 <210> 23 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AttB1-N primer <400> 23 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catggccaca cttttaagga gcttagca 58 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AttB2-N primer <400> 24 gggaccactt tgtacaagaa agctgggtgt gtactagtct agaagatttc tgtcattgta 60 <210> 25 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AttB1-P primer <400> 25 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catggcagaa gagcaggcac gccat 55 <210> 26 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AttB2-P primer <400> 26 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg ttactacttc attattatct tcatcagcat 60 ctggtgga 68

Claims (68)

  1. RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백질(P), 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 생성하는 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안정적인 생성은 약물 선택에 의한 것이 아닌 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 전사 조절 인자 조절하에 RNA 폴리머라제를 코딩하는 한 카피 이상의 핵산,
    b) 전사 조절 인자 조절하에 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 한 카피 이상의 핵산,
    c) 전사 조절 인자 조절하에 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 한 카피 이상의 핵산을 게놈내에 통합하여 포함하는 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈내에 한 카피 이상의 DNA 플랩을 추가적으로 포함하고, 상기 하나 이상의 DNA 플랩은 상기 핵산에 기능적으로 연결되어 있는 것인 세포.
  5. 세포 게놈을
    a) DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터,
    b) DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및
    c) DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 재조합함으로써 수득가능한 세포.
  6. 세포 게놈을
    a) 한 카피 이상의 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산,
    b) 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N)을 코딩하는 핵산, 및
    c) 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 핵산, 및
    d) DNA 플랩을 포함하는 발현 백터로 재조합함으로써 수득가능한 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 및 P 단백질은 동일한 바이러스에서 유래된 것인 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 N 및 P 단백질은 동일한 바이러스 균주 또는 상이한 바이러스 균주에 유래된 것인 세포.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 및 P 단백질은 상이한 분절 음성 가닥 RNA 바이러스에서 유래된 것인 세포.
  10. 제8항에 있어서, 상기 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 및 P 단백질은 약독화 MV 바이러스, 특히 슈왈쯔 MV 균주에서 유래된 것인 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA 폴리머라제는 T7 파지 RNA 폴리머라제 또는 그 핵형(nlsT7)인 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 플랩은 레트로바이러스에서 유래된 것인 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 DNA 플랩은 렌티바이러스, 특히 인간 렌티바이러스에서 유래된 것인 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 DNA 플랩은 HIV, CAEV, EIAV, VISNA, SIV 또는 FIV 바이러스에서 유래된 것인 세포.
  15. 제14항에 있어서, 상기 DNA 플랩은 HIV-1 또는 HIV-2 바이러스에서 유래된 것인 세포.
  16. 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 두개의 LTR을 포함하고, 이중 하나의 LTR은 임의로 U3 부분이 결실되며, 발현 및 전사 조절 인자를 포함하는 HIV-유래 수송 유전자 벡터인 세포.
  17. 제5항 또는 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는
    a) CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3702로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-T7 또는 CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3703로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-nlsT7,
    b) CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3700로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-N, 및
    c) CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3701로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-P인 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵세포인 세포.
  19. 제18항에 있어서, 포유류 세포인 세포.
  20. 제19항에 있어서, 인간 세포인 세포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 분열 가능한 세포.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, HEK 293 (인간배아신장) 세포인 세포.
  23. 제22항에 있어서, CNCM에 2006년 6월 14일자로 기탁번호 I-3618로 기탁된 293-T7-NP 세포주인 세포.
  24. 제22항에 있어서, CNCM에 2006년 8월 4일자로 기탁번호 I-3662로 기탁된 293-nlsT7-NP MV 세포주인 세포.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 분열할 수 없는 세포.
  26. 제3항에 있어서, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L) 또는 이의 기능성 유도체를 코딩하는 한 카피 이상의 뉴클레오타이드 서열을, 임의로 전사 조절 인자의 조절하에 게놈내에 통합하여 포함하는 세포.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 CNCM에 2007년 12월 18일자로 기탁번호 I-3881로 기탁된 pEMC-LSchw 플라즈미드와 같은, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 재조합된 세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 발현 벡터가 DNA 플랩, 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코딩하는 한 카피 이상의 핵산을 포함하는 발현 벡터인 세포.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N, P 및 L 단백질이 동일한 바이러스에서 유래된 것인 세포.
  30. 제29항에 있어서, 상기 N, P 및 L 단백질이 동일한 바이러스 균주 또는 상이한 바이러스 균주에서 유래된 것인 세포.
  31. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N, P 및 L 단백질이 상이한 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스에서 유래된 것인 세포.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질이 MV 바이러스, 특히 슈왈쯔 MV 균주에서 유래된 것인 세포.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적으로 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 전장 안티게놈을 코딩하는 cDNA 클론으로 재조합된 것인 세포.
  34. 제33항에 있어서, 상기 비분절 음성 가닥 cDNA 클론의 서열이 이종기원 핵산의 허용 부위에의 삽입에 의해 변경된 것인 세포.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 세포로 구성된 세포 배양물.
  36. 제35항에 있어서, 일차 배양인 세포배양물.
  37. 제35항에 있어서, 세포주인 세포배양물.
  38. DNA 플랩 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스 구조에 필요한 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함하는, 특히 플라즈미드인, 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 상기 핵산이 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질으로 구성된 군에서 선택되는 단백질을 코딩하는 것인 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, FIV- 또는 SIV-유래 벡터인 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  41. 제38항 또는 제39항에 있어서, HIV-유래 벡터와 같은 인간 렌티바이러스인 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  42. 제41항에 있어서, HIV-1- 또는 HIV-2-유래 벡터인 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3702로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-T7와 같은, DNA 플랩 및 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산을 포함하는 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  44. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3703로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-nlsT7와 같은, DNA 플랩 및 RNA 폴리머라제의 핵형을 코딩하는 핵산을 포함하는 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  45. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3700로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-N과 같은, DNA 플랩 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  46. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, CNCM에 2006년 12월 14일자로 기탁번호 I-3701로 기탁된 플라즈미드 HIV-1-TRIP△U3.CMV-P와 같은, DNA 플랩 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  47. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 플랩 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  48. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, DNA 플랩 및 RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질 및 임의로 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 L 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 레트로바이러스 유래 발현 벡터.
  49. CNCM에 2007년 12월 18일자로 기탁번호 I-3881로 기탁된 pEMC-LSchw 플라즈미드인, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 L 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  50. 제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 예를 들면 CMV 프로모터와 같은 전사 조절인자의 조절하에 있는 것인 발현 벡터.
  51. a) RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 폴리머라제 조인자 인단백질(P)을 안정적으로 생성하는 세포 또는 세포배양물을, 비분절 음성 가닥 cDNA 클론 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와 재조합하는 단계,
    b) 상기 재조합 세포 또는 재조합 세포 배양물을 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 복제 및 생성 할 수 있는 적격 세포상으로 수송하는 단계, 및
    c) 상기 단계 b)의 공배양에서 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 회수하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어져 있는,
    감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 방법.
  52. a) 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포배양물을 비분절 음성 가닥 cDNA 클론 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터와 재조합하는 단계,
    b) 상기 재조합 세포 또는 재조합 세포 배양물을 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 복제 및 생성 할 수 있는 적격 세포상으로 수송하는 단계, 및
    c) 상기 단계 b)의 공배양에서 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 회수하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어져 있는,
    감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 방법.
  53. a) 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포배양물을 비분절 음성 가닥 cDNA 클론과 재조합하는 단계,
    b) 상기 재조합 세포 또는 재조합 세포 배양물을 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 복제 및 생성 할 수 있는 적격 세포상으로 수송하는 단계, 및
    c) 상기 단계 b)의 공배양에서 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 회수하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어져 있는,
    감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물이 CNCM에 2006년 6월 14일자로 기탁번호 I-3618로 기탁된 293-T7-NP 세포주 또는 CNCM에 2006년 8월 4일자로 기탁번호 I-3662로 기탁된 293-nlsT7-NP MV 세포주인 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)의 적격 세포가 베로 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포), CEF 세포 (닭 배아 섬유모세포) 또는 MRC5 세포인 방법.
  56. a) RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 폴리머라제 조인자 인단백질(P)을 안정적으로 생성하는 세포 또는 세포배양물을, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 비분절 음성 가닥 cDNA 클론 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터와 재조합하는 단계, 및
    b) 상기 재조합 세포 또는 재조합 세포 배양물에서 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 회수하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어져 있는,
    감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 방법.
  57. a) 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포배양물을, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 비분절 음성 가닥 cDNA 클론 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L)을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터와 재조합하는 단계, 및
    b) 상기 재조합 세포 또는 재조합 세포 배양물에서 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 회수하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어져 있는,
    감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 방법.
  58. a) 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 세포배양물을, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 비분절 음성 가닥 cDNA 클론과 재조합하는 단계, 및
    b) 상기 재조합 세포 또는 재조합 세포 배양물에서 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 회수하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어져 있는,
    감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 제조하는 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 또는 세포 배양물이 진핵 세포 배양물, 특히 포유동물 세포 배양물 또는 인간 세포 배양물인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 세포 배양물이 인간 섬유모세포, 특히 MRC5 세포주 (인간 폐 섬유모세포)인 방법.
  61. 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 비분절 음성 가닥 cDNA 클론의 뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 이종기원 핵산의 허용 부위에의 삽입에 의해 변경된 것인 방법.
  62. 제51항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종기원 핵산은 에피토프 또는 폴리에피토프를 코딩하는 것인 방법.
  63. 제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변경된 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 비분절 음성 가닥 cDNA 클론은 약독화 MV 바이러스, 특히 MV 슈왈쯔 균주에서 유래된 것인 방법.
  64. a) - DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터,
    - DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및
    - DNA 플랩, 및 한 카피 이상의 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터와 세포를 재조합하는 단계, 및
    b) RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백질(P), 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 생성하는 세포를 선택하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어지는,
    제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포를 제조하는 방법.
  65. a) - 프로모터 조절하에 RNA 폴리머라제를 코딩하는 핵산 한 카피 이상,
    - 프로모터 조절하에 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 핵산 한 카피 이상,
    - 프로모터 조절하에 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 P 단백질을 코딩하는 핵산 한 카피 이상, 및
    - DNA 플립을 포함하는 발현 벡터로 세포를 재조합하는 단계; 및
    b) RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백질(P), 또는 이들의 기능적 유도체를 안정적으로 생성하는 세포를 선택하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어지는,
    제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포를 제조하는 방법.
  66. a) 제64항 또는 제65항에 따른 방법에 의해 재조합 세포를 준비하는 단계,
    b) 상기 a) 단계에서 수득한 재조합 세포를 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 RNA 폴리머라제 대단백질(L) 또는 이의 기능적 유도체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터로 더 재조합하는 단계, 및
    c) RNA 폴리머라제, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 핵단백질(N) 및 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 인단백질(P)을 안정적으로 생성하고 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스의 대단백질(L), 또는 이들의 기능적 유도체들을 생성하는 세포를 선택하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어지는,
    제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 재조합 세포를 제조하는 방법.
  67. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 세포를 헬퍼 세포주로 사용하는 용도.
  68. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 세포를 감염성, 재조합, 비분절 음성 가닥 RNA 바이러스를 제조하는데 사용하는 용도.
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