CN109355301A

CN109355301A - 一种石斑鱼重组NNVcp的密码子优化的核酸序列、融合表达载体、制备方法及其本身

Info

Publication number: CN109355301A
Application number: CN201810962545.9A
Authority: CN
Inventors: 邓利; 郭二鹏; 杨晓东; 兰文升
Original assignee: Shenzhen University; Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
Current assignee: Shenzhen University; Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine
Priority date: 2018-08-22
Filing date: 2018-08-22
Publication date: 2019-02-19

Abstract

本发明提供了一种石斑鱼重组NNVcp的密码子优化序列、融合表达载体、制备方法以及其本身。包括构建表达斜带石斑鱼NNVcp的基于pET‑SUMO的融合表达载体，并优化出实现高效的可溶性表达的最佳条件，且优化出融合蛋白酶切释放出目的肽的最佳条件，从而获得高纯度的无任何额外氨基酸的重组石斑鱼NNVcp。同时证明来源于石斑鱼的NNVcp在不同鱼类具有极高同源性，显示了广泛的鱼类NNV感染防控的应用价值。

Description

一种石斑鱼重组NNVcp的密码子优化的核酸序列、融合表达载体、制备方法及其本身

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高纯度石斑鱼重组神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法。

背景技术

神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)是一种世界范围内流行、严重危害多种海水鱼类甚至淡水鱼类的传染性病原。1985年，澳大利亚、日本、东南亚和加勒比海地区几乎同时在多种海水鱼类种苗培育中暴发了一种新的疾病，死亡率高达90％以上，患病鱼苗食欲差，体色偏黑，间或作突发性的螺旋游动，组织切片观察可见脑部有空泡化病变。1992年，Mori等从患病的拟鲹 (Pseudocaranx dentex)幼鱼上纯化了病毒，研究了病毒的核酸和衣壳蛋白，将病毒命名为神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)。1997年，日本Nishizawa 等根据病毒衣壳蛋白基因的核苷酸序列，对来自不同国家和地区16种鱼类25株病毒进行分析，将NNV分成4个基因型：拟鲹神经坏死病毒基因型(Striped jack NNV,SJNNV)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)神经坏死病毒基因型 (Tiger puffer NNV,TPNNV)，条斑星鲽神经坏死病毒基因型(Barfin flounder NNV,BFNNV)和赤点石斑神经坏死病毒基因型(Red spotted grouper NNV, RGNNV)[Nishizawa T,Furuhashi M,Nagai T,et al.Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogeneticanalysis of the coat protein gene. Applied and EnvironmentalMicrobiology.1997,63(4):1633-1636]。

目前该病毒引起的疾病在除非洲以外的世界其它地方迅速蔓延开来，给各国海水养殖业造成了巨大的损失，受感染的鱼类已达40余种。我国对鱼类神经坏死病毒的研究起步较晚。自从2001年Lin等在广东省大亚湾孵化培育的石斑鱼中发现NNV，随后多位学者对我国大陆流行的鱼类NNV基因型进行研究，认为属于RGNNV型；2003年Chi等对1994-2001年间中国台湾地区分离的所有NNV病毒株进行了基因型和抗原特性的研究，认为也属于RGNNV基因型。我国沿海大规模网箱养殖的石斑鱼等重要经济鱼类，由于受NNV的感染，给育苗生产带来极大的损失。[Lin L,He J G,Mori K,et al.Mass mor talities associate withviral nervous necrosis in hatchery reared groupers in the People's Republicof China.Fish Pathol.,2001,6:186-188；陈文捷,刘晓丹,胡先勤,等. 鱼类神经坏死病毒研究进展与发展趋势.水产学报,2014,38(9):1666-1672]

当前对该病毒的感染还没有特效治疗药物，主要以预防为主，利用病毒衣壳蛋白作为抗原研制新型疫苗可能是有效的防治手段之一。NNV基因组包含两条正义RNA链，其中RNA1编码RNA依赖的RNA聚合酶，RNA2编码病毒衣壳蛋白，即NNV唯一的结构蛋白，具有免疫活性，可用来制备亚单位疫苗。利用基因工程技术高效重组表达NNV的衣壳蛋白是一个重要的抗原获取途径。

但至今已发表的研究论文和申请的发明专利显示，采用基因工程技术构建的原核表达载体，在大量表达的NNV衣壳蛋白(NNV capsid protein,NNVcp) 都是以包涵体的形式存在，没有能够正确折叠，将影响其作为疫苗的免疫活性；而且所表达的NNVcp均带有标签或其他额外氨基酸，如融合表达的组氨酸标签、起分子伴侣作用的融合蛋白如硫氧还蛋白等，也会影响NNVcp作为疫苗的免疫活性。这两方面的问题成为NNV疫苗开发的障碍。

为了获得高表达量的重组蛋白，通常需要建立基因的高效表达系统。目前，常用的蛋白表达系统有哺乳动物细胞表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统和原核表达系统(大肠杆菌E.coli表达系统)。其中，大肠杆菌表达系统具有遗传背景研究较透彻、细胞繁殖快速、培养周期短和产量高等优点，已成为高效表达的首选体系。但是已有研究或专利在利用大肠杆菌表达系统表达NNVcp存在的两方面的问题亟待解决，以突破NNV疫苗开发的障碍。

发明内容

本发明的目的是根据现有技术的不足，提供一种NNVcp(NNV衣壳蛋白) 的基于大肠杆菌表达系统的密码子优化核酸序列，其重组融合表达载体， NNVcp表达方法，以及后续的纯化、酶切等工艺。

根据本发明的一方面，优化密码子，并构建NNVcp的最优重组表达载体。

现有技术已构建许多NNVcp表达载体，但都存在一些缺陷。

在如下5篇论文或专利中，如图1所示，使用表达载体pET-32a在大肠杆菌表达NNVcp，结果形成了包涵体，且表达产物带一段编码硫氧还蛋白的序列及 6个His标签：

[1]陈晓艳,翁少萍,殷志新,等.斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化.中山大学学报(自然科学版).2005,44(6):83-87；[2]陈晓艳, 何建国.斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白抗体的制备.中国水产科学, 2006,13(5):841-844；[3]翟伟锋.斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化研究.中国畜牧兽医文摘,2017,33(12):58；[4]陈晓艳,翁少萍, 殷志新,黄剑南,何建国.一种神经坏死病毒重组蛋白疫苗及其编码序列和用途.中国发明专利,申请号:200410027186.6；[5]袁于人，殷波，陆洲.一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用.中国发明专利,申请号:2016111597010.5.

在专利(林蠡,伊丽竹,秦真东,周洋,兰江风,邓俊杰,谭锐敏.一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应用.中国发明专利,申请号: 201510150323.3)中，使用表达载体pGEX-5x-1在大肠杆菌表达NNVcp，形成了包涵体，且表达产物带一段编码谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的序列：

在论文(苏友禄,郭志勋,冯娟,等.赤点石斑鱼神经坏死病毒主衣壳重组蛋白多克隆抗体的制备.南方水产,2010,6(6):8-14.)中，使用表达载体pRSET A在大肠杆菌表达NNVcp，形成了包涵体，且表达产物带一段7.45kDa的序列 (含His标签)。

而本发明的目的是根据现有技术的不足，优化编码NNVcp的核酸序列，构建一种基于pET-SUMO高效融合表达系统，SUMO具有分子伴侣作用，同时融合蛋白在切除SUMO后释放目的蛋白NNVcp将不带任何标签或其他额外氨基酸的，便于后续处理获得高纯度的NNVcp。

首先依据石斑鱼NNVcp(gNNVcp)氨基酸序列，设计编码该蛋白的DNA 序列，将序列优化为大肠杆菌密码子偏好性序列，并通过化学合成该DNA序列。gNNVcp氨基酸序列来源于GenBank，登录号为3JBM_A。氨基酸序列如下：

MVRKGEKKLAKPATTKAANPQPRRRANNRRRSNRTDAPVSKASTVTGFGR GTNDVHLSGMSRISQAVLPAGTGTDGYVVVDATIVPDLLPRLGHAARIFQR YAVETLEFEIQPMCPANTGGGYVAGFLPDPTDNDHTFDALQATRGAVVAKW WESRTVRPQYTRTLLWTSSGKEQRLTSPGRLILLCVGNNTDVVNVSVLCRW SVRLSVPSLETPEETTAPIMTQGSLYNDSLSTNDFKSILLGSTPLDIAPDGAVF QLDRPLSIDYSLGTGDVDRAVYWHLKKFAGNAGTPAGWFRWGIWDNFNK TFTDGVAYYSDEQPRQILLPVGTVCTRVDSEN(SEQ ID NO.1)

优化设计并通过化学合成的编码该蛋白的DNA序列如下：

ATGGTCCGTAAAGGTGAGAAGAAACTGGCTAAACCGGCGACCACCAAAGCAGCGAA CCCGCAGCCTCGTCGCCGCGCTAACAACCGTCGTCGTAGCAACCGCACTGATGCACC AGTAAGCAAAGCTAGCACGGTGACGGGTTTCGGTCGTGGTACTAACGACGTCCACCT GAGCGGTATGAGCCGTATCTCCCAAGCAGTCCTGCCAGCAGGTACTGGTACTGATGGT TACGTGGTGGTTGACGCCACTATCGTGCCTGATCTGCTGCCTCGTCTGGGTCACGCAG CACGTATCTTCCAACGTTACGCTGTTGAGACCCTGGAATTCGAAATCCAGCCAATGTG CCCGGCCAACACCGGCGGTGGCTACGTGGCTGGTTTCCTGCCGGATCCGACTGATAAC GATCACACCTTCGACGCTCTGCAGGCTACTCGTGGTGCCGTTGTTGCGAAATGGTGGG AAAGCCGTACTGTCCGTCCGCAGTACACTCGTACGCTGCTGTGGACCTCTTCTGGTAA AGAACAGCGTCTGACCTCTCCGGGTCGTCTGATTCTGCTGTGTGTGGGTAACAACACC GATGTTGTGAACGTTAGCGTACTGTGCCGCTGGTCCGTTCGCCTGTCCGTTCCGTCTCT GGAAACCCCGGAAGAAACCACCGCCCCGATTATGACCCAGGGCTCTCTGTACAACGA TTCCCTGTCCACCAATGACTTCAAATCCATCCTGCTGGGCTCCACCCCGCTGGATATCG CTCCGGATGGCGCGGTATTTCAGCTGGACCGCCCGCTGTCTATTGACTACTCTCTGGGC ACTGGCGACGTTGACCGTGCGGTATATTGGCATCTGAAGAAATTCGCGGGCAATGCGG GCACCCCGGCGGGCTGGTTCCGCTGGGGCATTTGGGACAACTTTAACAAGACGTTTA CCGACGGCGTTGCGTATTATTCTGACGAACAGCCGCGCCAGATCCTGCTGCCGGTTGG CACCGTATGTACCCGCGTAGACTCTGAGAATTAA(SEQ ID NO.2)

然后利用Champion pET SUMO Protein Expression System，将表达上述 gNNVcp的DNA克隆连接至该表达系统的线性化质粒中，构建表达载体，建立重组表达gNNVcp的表达系统。

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白(Small ubiquitin-like modifier,SUMO)，是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一，SUMO 可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。

构建成功的插入序列如下，其中下划线表示表达gNNVcp的基因序列，着重号表示为载体的基因序列：

根据本发明的另一方面，优化表达条件，大幅减少表达产物形成的包涵体，从而获得大量的重组gNNVcp可溶性表达。可溶性表达量较高、包涵体形成最少的条件是26℃条件下培养，0.5mmol/L IPTG诱导过夜表达。

根据本发明的又一方面，提供纯化工艺，采用镍离子凝胶亲和层析融合蛋白，再用SUMO蛋白酶在4℃酶切过夜释放出目的蛋白，再采用镍离子凝胶亲和层析，从而获得高纯度的无任何额外氨基酸的重组gNNVcp。

有益效果：本发明首次将编码石斑鱼NNVcp(gNNVcp)氨基酸序列的 DNA序列优化为大肠杆菌密码子偏好性序列，并通过化学合成该DNA序列，获得gNNVcp全新基因，首次构建表达gNNVcp的基于pET-SUMO的融合表达载体，并优化出实现可溶性表达的条件，实现gNNVcp的大量可溶性表达，本发明的结果显示，pET-SUMO的融合表达载体与pET32等表达相比，融合蛋白中的SUMO(预测分子量13.42kDa)发挥了更好的分子伴侣作用，使得长度达338aa(预测分子量37.06kDa)的较大分子量蛋白gNNVcp在大量表达时能够实现较多的可溶性表达。gNNVcp在不同鱼类中具有极高同源性，可作为抗原应用于多种鱼类的免疫，在水产养殖中防控神经坏死病毒的感染具有广泛的应用前景。

附图说明：

图1表达载体pET-SUMO-gNNVcp构建的测序验证-1

图2表达载体pET-SUMO-gNNVcp构建的测序验证-2

图3 gNNVcp与其它鱼类NNVcp的BLAST

图4不同表达条件下SUMO-gNNVcp的SDS-PAGE电泳图

注:M protein marker；1、2 37℃培养，1.0mmol/L IPTG诱导所获上清、沉淀；3、437℃培养， 0.5mmol/L IPTG诱导所获上清、沉淀；5、6 26℃培养，1.0mmol/L IPTG诱导所获上清、沉淀；7、8 26℃培养，0.5mmol/L IPTG诱导所获上清、沉淀

图5 SUMO-gNNVcp经过SUMO蛋白酶酶切、亲和层析纯化的SDS-PAGE电泳图

注：M protein marker；1经纯化、酶切的样品；2经纯化、酶切、再纯化的样品

图6基于载体pET-Trx的重组NNVcp表达载体

图7基于载体pGEX-GST的重组NNVcp表达载体

图8基于载体pRSET的重组NNVcp表达载体

图9基于载体pET SUMO的重组NNVcp表达载体

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步解释本发明，但不限制权利要求范围。

试验材料和设备

1、菌体来源

大肠杆菌(E.coli Top 10,E.coli Bl21(DE3))购自宝生物工程(大连)有限公司。

2、试剂

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒、DL-2000 DNA Marker、 DL-5000DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司。重组蛋白表达系统 Champion pET SUMOProtein Expression System(K30001)及SUMO蛋白酶 (SUMO Protease)、培养基M199购自Invitrogen Life Technologies公司(美国)。抗生素Penicillin-Streptomycin购于生工生物工程(上海)股份有限公司。 Protein Marker(10-180kDa)购于GenStar公司(北京)。Ni离子琼脂糖(6 Fast Flow)购于GE Healthcare(中国)公司。

焦碳酸二乙酯(Diethy pyrocarbonate,DEPC)处理水、异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)、卡那霉素、NaCl、蛋白胨、细菌培养用酵母提取物、琼脂粉、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、 37.5:1的40％聚丙烯酰胺、29:1的40％聚丙烯酰胺、19:1的40％聚丙烯酰胺及十二烷基硫酸钠(SDS)等购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

3、仪器设备

表1.仪器设备

【实施例1】编码石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的基因的获得

1.1石斑鱼NNVcp蛋白的氨基酸序列选取

gNNVcp氨基酸序列来源于GenBank，登录号为3JBM_A。氨基酸序列如下：

将所述gNNVcp氨基酸序列与上百种其它来自其它鱼类(包括赤点石斑神经坏死病毒基因型(Red spotted grouper NNV,RGNNV)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)神经坏死病毒基因型(Tiger puffer NNV,TPNNV)及条斑星鲽神经坏死病毒基因型(Barfinflounder NNV,BFNNV)等)的NNVcp氨基酸序列进行 BLAST比对，其同源性大部分都达到99％以上，其都显示出了高度同源性。如图3所示，表明gNNVcp能广泛地适用于各种鱼类的疫苗制备。

1.2编码gNNVcp DNA序列的确定

依据大肠杆菌密码子偏好性，优化设计编码该蛋白的DNA序列如下：

将该密码子优化序列进行BLAST核酸数据库比对，没有发现相似的序列。

1.3编码gNNVcp DNA的化学合成

编码gNNVcp DNA的化学合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

【实施例2】表达载体pET-SUMO-gNNVcp的构建

生工生物工程(上海)股份有限公司直接将合成的基因通过PCR扩增，纯化后的PCR产物(即编码gNNVcp DNA的目的基因)与本发明人提供的线性化pET-SUMO载体连接，构建融合表达SUMO-gNNVcp的载体 pET-SUMO-gNNVcp。

【实施例3】gNNVcp的重组表达

3.1质粒转化及测序验证

从-80℃冰箱取出购买的E.coli BL21感受态细胞，置于冰上缓慢解冻，取质粒pET-SUMO-gNNVcp 5μL(约50ng)，加入至50μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置30min后，转至42℃恒温水浴锅中，热激45s，热激后再次置于冰上5min，向离心管中加入200μL LB液体培养基，吹打混匀后置于摇床中，37℃，200rpm，1h培养复苏，然后取其中100ul培养液到LB平板上(含抗生素卡那霉素，Kana)均匀涂布，平板在37℃培养箱过夜倒置培养。挑取单菌落过夜扩大培养，第二天提取质粒，以质粒为模板、SUMO-F和 SUMO-R为引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，将扩增出预期大小片段的质粒送至深圳华大基因公司测序，以确定插入的目的基因序列及连接方向是否正确，选择正确的用于下一步诱导表达，测序验证如图1和图2 所示，表明成功构建表达斜带石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白gNNVcp的基于 pET-SUMO的融合表达载体。

3.2 IPTG诱导表达

1)将测序正确的pET-SUMO-gNNVcp菌株按1:1000的比例接种于10mL 的LB液体培养基中(含Kana)，37℃恒温振荡(200rpm)培养过夜。

2)温度梯度诱导表达：设37℃及26℃2个培养温度，取过夜培养的菌液按1:100的比例分别接种于LB液体培养基中(含Kana)，分别于设置温度恒温振荡(250rpm)培养，待菌液OD₆₀₀≈0.6时，加入IPTG(1.0mmol/L或0.5 mmol/L)，诱导6h。

3)收集菌液：将诱导完毕的菌液于5000rpm离心10min弃上清，用Lysis buffer(200mM NaCl、50mM Tris，PH 8.0-8.1)重悬菌液(10mL buffer/g菌)。

4)均质机破碎：使用均质机破碎Lysis buffer重悬的菌液，每瓶菌液循环破碎3次；

5)离心：破碎后于10000rpm，4℃，离心30min，分别收集上清和沉淀。 3.3蛋白表达检测

采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测蛋白表达情况，SDS-PAGE蛋白胶配方如表1所示。

表2.SDS-PAGE蛋白胶配方

取蛋白样品各25μL，加入5μL等体积的5×的蛋白加样缓冲液，混匀，沸水浴5min，加样，60mV电泳至样品进入分离胶，再调至80mV，待溴酚兰移动至凝胶下边界约2cm时停止电泳，将分离胶移入考马斯染色溶液中。在室温下放在摇床上平缓摇动，染色30min，然后将胶置于适量脱色液中，在水平摇床上平缓摇动2-4h，其间应视情况换脱色液3-4次，直到条带清晰。将已脱色的蛋白胶置于凝胶成像仪拍照保存，观察结果并进行分析。尽管还是有部分表达产物形成包涵体，但是与已有报道的全部形成包涵体相比，本发明实现了可溶性表达，可溶性表达量可达总表达量的近50％，由于总表达量较高，因此本发明获得的gNNVcp可溶性表达量已相当可观，结果见图4。

【实施例4】融合蛋白SUMO-gNNVcp的纯化、酶切

4.1亲和层析纯化融合蛋白SUMO-gNNVcp

利用SUMO自带的组氨酸标签(6×His)，采用镍离子琼脂糖亲和介质 (Ni-IDA)亲和层系统对融合蛋白SUMO-gNNVcp进行纯化。具体步骤如下：

1)将亲和层析介质装柱后，用5倍柱体积的0.5mol/L NaOH溶液活化柱子，流速为5mL/min，柱床体积为20m；

2)5倍柱体积的ddH₂O洗去NaOH溶液，此时亲和层析仪的Cond％＝0；5 倍柱体积的NiSO₄过柱子，使亲和介质吸附Ni²⁺至Cond％平稳；ddH2O 清洗去未结合Ni²⁺，洗至Cond％＝0；Balance Buffer(20mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄,pH7.4,500mmol/L NaCl,5mmol/L咪唑)平衡柱子，至Cond％平稳，此时流速改为3mL/min；

3)将总蛋白溶液上样，控制其流速为1mL/min，用5倍柱体积的Balance Buffer 清洗，至280吸收值稳定，再用100mmol/L咪唑溶液清洗去除非特异性结合杂蛋白；

4)用500mmol/L咪唑溶液洗脱，收集样品峰对应洗脱液，SDS-PAGE分析。

4.2融合蛋白SUMO-gNNVcp的酶切

使用Champion pET SUMO Protein Expression System表达试剂盒推荐使用的蛋白酶SUMO Protease(1U/μl)，酶活单位One unit of SUMO Protease cleaves ≥85％of 2μg control substrate in 1 h at 30℃。由于含融合蛋白的洗脱液中含有高达500mmol/L的咪唑，需要降低或去除咪唑后进行切割实验，降低温度有利于蛋白保持稳定。因此操作方法为：使用Balance Buffer将含融合蛋白的洗脱液过夜透析，然后测定蛋白浓度，加入SUMOProtease(终浓度200U/mg蛋白)，4℃酶切20h，将酶切后的样品采用SDS-PAGE检测酶切效果，结果如图5的泳道1所示。

【实施例5】gNNVcp的纯化及质谱鉴定

5.1酶切后gNNVcp的纯化

1)镍离子琼脂糖亲和柱的活化、平衡等按照“实施例4”的方法进行；

2)上样：将酶切后蛋白溶液小心上柱，控制其流速为1mL/min，收集样品流出液。

5.2 SDS-PAGE分析纯度

采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度。

SUMO除了具有极好的分子伴侣作用外，还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到等同与天然蛋白的无标签、无任何额外氨基酸的重组蛋白。如图5所示，通过亲和层析获得纯度极高的SUMO-gNNVcp，再经过SUMO酶在4℃条件下温和酶切，再用亲和层析去除SUMO，能够获得高纯度的目的蛋白，结果如图5的泳道2所示。

5.3纯化gNNVcp的质谱鉴定

将纯化的目的蛋白经脱盐柱脱盐后，送深圳大学生命与海洋科学学院质谱室进行胰蛋白酶酶切，然后采用液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)进行鉴定。

质谱结果如下所示，gNNVcp的下划线的氨基酸序列即是被质谱检测到的肽段所覆盖的部分，结果显示质谱检测到的肽段97％覆盖gNNVcp，证明本发明表达纯化出的蛋白质确定为gNNVcp。

MVRKGEKKLAKPATTKAANPQPRRRANNRRRSNRTDAPVSKASTVTGFGRGTNDVHLSGMSRISQAVL PAGTGTDGYVVVDATIVPDLLPRLGHAARIFQRYAVETLEFEIQPMCPANTGGGYVAGFLPDPTDNDHTFDALQAT RGAVVAKWWESRTVRPQYTRTLLWTSSGKEQRLTSPGRLILLCVGNNTDVVNVSVLCRWSVRLSVPSLETPEETTA PIMTQGSLYNDSLSTNDFKSILLGSTPLDIAPDGAVFQLDRPLSIDYSLGTGDVDRAVYWHLKKFAGNAGTPAGWF RWGIWDNFNKTFTDGVAYYSDEQPRQILLPVGTVCTRVDSEN(SEQ ID NO.1) 。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

深圳市检验检疫科学研究院

<120> 一种石斑鱼重组NNVcp的密码子优化的核酸序列、融合表达载体、制备方法

及其本身

<130> SZ1137-18P122099

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 338

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> 石斑鱼NNVcp氨基酸序列

<400> 1

Met Val Arg Lys Gly Glu Lys Lys Leu Ala Lys Pro Ala Thr Thr Lys

1 5 10 15

Ala Ala Asn Pro Gln Pro Arg Arg Arg Ala Asn Asn Arg Arg Arg Ser

20 25 30

Asn Arg Thr Asp Ala Pro Val Ser Lys Ala Ser Thr Val Thr Gly Phe

35 40 45

Gly Arg Gly Thr Asn Asp Val His Leu Ser Gly Met Ser Arg Ile Ser

50 55 60

Gln Ala Val Leu Pro Ala Gly Thr Gly Thr Asp Gly Tyr Val Val Val

65 70 75 80

Asp Ala Thr Ile Val Pro Asp Leu Leu Pro Arg Leu Gly His Ala Ala

85 90 95

Arg Ile Phe Gln Arg Tyr Ala Val Glu Thr Leu Glu Phe Glu Ile Gln

100 105 110

Pro Met Cys Pro Ala Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Val Ala Gly Phe Leu

115 120 125

Pro Asp Pro Thr Asp Asn Asp His Thr Phe Asp Ala Leu Gln Ala Thr

130 135 140

Arg Gly Ala Val Val Ala Lys Trp Trp Glu Ser Arg Thr Val Arg Pro

145 150 155 160

Gln Tyr Thr Arg Thr Leu Leu Trp Thr Ser Ser Gly Lys Glu Gln Arg

165 170 175

Leu Thr Ser Pro Gly Arg Leu Ile Leu Leu Cys Val Gly Asn Asn Thr

180 185 190

Asp Val Val Asn Val Ser Val Leu Cys Arg Trp Ser Val Arg Leu Ser

195 200 205

Val Pro Ser Leu Glu Thr Pro Glu Glu Thr Thr Ala Pro Ile Met Thr

210 215 220

Gln Gly Ser Leu Tyr Asn Asp Ser Leu Ser Thr Asn Asp Phe Lys Ser

225 230 235 240

Ile Leu Leu Gly Ser Thr Pro Leu Asp Ile Ala Pro Asp Gly Ala Val

245 250 255

Phe Gln Leu Asp Arg Pro Leu Ser Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Thr Gly

260 265 270

Asp Val Asp Arg Ala Val Tyr Trp His Leu Lys Lys Phe Ala Gly Asn

275 280 285

Ala Gly Thr Pro Ala Gly Trp Phe Arg Trp Gly Ile Trp Asp Asn Phe

290 295 300

Asn Lys Thr Phe Thr Asp Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Glu Gln Pro

305 310 315 320

Arg Gln Ile Leu Leu Pro Val Gly Thr Val Cys Thr Arg Val Asp Ser

325 330 335

Glu Asn

<210> 2

<211> 1017

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 密码子优化的石斑鱼NNVcp核酸序列

<400> 2

atggtccgta aaggtgagaa gaaactggct aaaccggcga ccaccaaagc agcgaacccg 60

cagcctcgtc gccgcgctaa caaccgtcgt cgtagcaacc gcactgatgc accagtaagc 120

aaagctagca cggtgacggg tttcggtcgt ggtactaacg acgtccacct gagcggtatg 180

agccgtatct cccaagcagt cctgccagca ggtactggta ctgatggtta cgtggtggtt 240

gacgccacta tcgtgcctga tctgctgcct cgtctgggtc acgcagcacg tatcttccaa 300

cgttacgctg ttgagaccct ggaattcgaa atccagccaa tgtgcccggc caacaccggc 360

ggtggctacg tggctggttt cctgccggat ccgactgata acgatcacac cttcgacgct 420

ctgcaggcta ctcgtggtgc cgttgttgcg aaatggtggg aaagccgtac tgtccgtccg 480

cagtacactc gtacgctgct gtggacctct tctggtaaag aacagcgtct gacctctccg 540

ggtcgtctga ttctgctgtg tgtgggtaac aacaccgatg ttgtgaacgt tagcgtactg 600

tgccgctggt ccgttcgcct gtccgttccg tctctggaaa ccccggaaga aaccaccgcc 660

ccgattatga cccagggctc tctgtacaac gattccctgt ccaccaatga cttcaaatcc 720

atcctgctgg gctccacccc gctggatatc gctccggatg gcgcggtatt tcagctggac 780

cgcccgctgt ctattgacta ctctctgggc actggcgacg ttgaccgtgc ggtatattgg 840

catctgaaga aattcgcggg caatgcgggc accccggcgg gctggttccg ctggggcatt 900

tgggacaact ttaacaagac gtttaccgac ggcgttgcgt attattctga cgaacagccg 960

cgccagatcc tgctgccggt tggcaccgta tgtacccgcg tagactctga gaattaa 1017

<210> 3

<211> 1112

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 构建完成的包含gNNVcp基因的重组载体的一部分序列

<400> 3

acgatattat tgaggctcac agagaacaga ttggtggtat ggtccgtaaa ggtgagaaga 60

aactggctaa accggcgacc accaaagcag cgaacccgca gcctcgtcgc cgcgctaaca 120

accgtcgtcg tagcaaccgc actgatgcac cagtaagcaa agctagcacg gtgacgggtt 180

tcggtcgtgg tactaacgac gtccacctga gcggtatgag ccgtatctcc caagcagtcc 240

tgccagcagg tactggtact gatggttacg tggtggttga cgccactatc gtgcctgatc 300

tgctgcctcg tctgggtcac gcagcacgta tcttccaacg ttacgctgtt gagaccctgg 360

aattcgaaat ccagccaatg tgcccggcca acaccggcgg tggctacgtg gctggtttcc 420

tgccggatcc gactgataac gatcacacct tcgacgctct gcaggctact cgtggtgccg 480

ttgttgcgaa atggtgggaa agccgtactg tccgtccgca gtacactcgt acgctgctgt 540

ggacctcttc tggtaaagaa cagcgtctga cctctccggg tcgtctgatt ctgctgtgtg 600

tgggtaacaa caccgatgtt gtgaacgtta gcgtactgtg ccgctggtcc gttcgcctgt 660

ccgttccgtc tctggaaacc ccggaagaaa ccaccgcccc gattatgacc cagggctctc 720

tgtacaacga ttccctgtcc accaatgact tcaaatccat cctgctgggc tccaccccgc 780

tggatatcgc tccggatggc gcggtatttc agctggaccg cccgctgtct attgactact 840

ctctgggcac tggcgacgtt gaccgtgcgg tatattggca tctgaagaaa ttcgcgggca 900

atgcgggcac cccggcgggc tggttccgct ggggcatttg ggacaacttt aacaagacgt 960

ttaccgacgg cgttgcgtat tattctgacg aacagccgcg ccagatcctg ctgccggttg 1020

gcaccgtatg tacccgcgta gactctgaga attaaagaca agcttaggta tttattcggc 1080

gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt ag 1112

<210> 4

<211> 5643

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 载体pET-SUMO的序列

<400> 4

caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa 60

acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat 120

ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta 180

gaggatcgag atctcgatcc cgcgaaatta atacgactca ctatagggga attgtgagcg 240

gataacaatt cccctctaga aataattttg tttaacttta agaaggagat atacatatgg 300

gcagcagcca tcatcatcat catcacggca gcggcctggt gccgcgcggc agcgctagca 360

tgtcggactc agaagtcaat caagaagcta agccagaggt caagccagaa gtcaagcctg 420

agactcacat caatttaaag gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc aagatcaaaa 480

agaccactcc tttaagaagg ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt aaggaaatgg 540

actccttaag attcttgtac gacggtatta gaattcaagc tgatcagacc cctgaagatt 600

tggacatgga ggataacgat attattgagg ctcacagaga acagattggt ggtagacaag 660

cttaggtatt tattcggcgc aaagtgcgtc gggtgatgct gccaacttag tcgagcacca 720

ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc 780

tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg 840

ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg attggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc 900

gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc 960

ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc 1020

cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc 1080

gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg 1140

gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact 1200

ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 1260

tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa 1320

atattaacgc ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 1380

gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gaattaattc ttagaaaaac 1440

tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt 1500

tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca 1560

agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc 1620

ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt 1680

gagaatggca aaagtttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc 1740

tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg 1800

agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg 1860

cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat 1920

acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta 1980

cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc 2040

atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc 2100

gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga 2160

gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cctagagcaa 2220

gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac 2280

agttttattg ttcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga 2340

ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg 2400

cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 2460

aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct 2520

agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 2580

tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 2640

ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 2700

cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 2760

atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 2820

ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 2880

tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 2940

gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 3000

gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 3060

cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 3120

gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 3180

ttcacaccgc aatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag 3240

tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac 3300

ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 3360

ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc 3420

agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat 3480

ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg 3540

ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcactgatgc ctccgtgtaa gggggatttc 3600

tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat gctcacgata cgggttactg 3660

atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa acaactggcg gtatggatgc 3720

ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg cttcgttaat acagatgtag 3780

gtgttccaca gggtagccag cagcatcctg cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg 3840

gcgctgactt ccgcgtttcc agactttacg aaacacggaa accgaagacc attcatgttg 3900

ttgctcaggt cgcagacgtt ttgcagcagc agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg 3960

attcattctg ctaaccagta aggcaacccc gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga 4020

gcacgatcat gcgcacccgt ggggccgcca tgccggcgat aatggcctgc ttctcgccga 4080

aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg cttgagcgag ggcgtgcaag attccgaata 4140

ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc tccagcgaaa gcggtcctcg ccgaaaatga 4200

cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga gttgcatgat aaagaagaca gtcataagtg 4260

cggcgacgat agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct gactgggttg aaggctctca 4320

agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat gagtgagcta acttacatta attgcgttgc 4380

gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 4440

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg tggtttttct tttcaccagt 4500

gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct gagagagttg cagcaagcgg 4560

tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga tggtggttaa cggcgggata 4620

taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg agatatccgc accaacgcgc 4680

agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca tctgatcgtt ggcaaccagc 4740

atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg tttgttgaaa accggacatg 4800

gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt gattgcgagt gagatattta 4860

tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta atgggcccgc taacagcgcg 4920

atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca gtcgcgtacc gtcttcatgg 4980

gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat caagaaataa cgccggaaca 5040

ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat ccagcggata gttaatgatc 5100

agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg ctttacaggc ttcgacgccg 5160

cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt gatcggcgcg agatttaatc 5220

gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg aggtggcaac gccaatcagc 5280

aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg gaatgtaatt cagctccgcc 5340

atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt ggctggcctg gttcaccacg 5400

cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca tactctgcga catcgtataa cgttactggt 5460

ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct tccgggcgct atcatgccat accgcgaaag 5520

gttttgcgcc attcgatggt gtccgggatc tcgacgctct cccttatgcg actcctgcat 5580

taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc gccgccgcaa ggaatggtgc 5640

atg 5643

Claims

1.一种石斑鱼重组NNVcp的密码子优化的核酸序列，所述核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种石斑鱼重组NNVcp的融合表达载体，由密码子优化的NNVcp核酸序列和载体pET-SUMO连接构建，所述密码子优化的NNVcp核酸序列插在SUMO剪切位点，并且所述密码子优化的NNVcp核酸序列3′端引入终止密码子；

其中，所述密码子优化的NNVcp具有如SEQ ID NO.2所示的序列，

所述载体pET-SUMO具有如SEQ ID NO.4所示的核酸序列。

3.一种高纯度石斑鱼重组NNVcp的制备方法，包括：

(1)构建如权利要求2所述的石斑鱼重组NNVcp的融合表达载体；

(2)重组表达载体可溶性表达，以及蛋白分离；

(3)利用SUMO自带的组氨酸标签，采用镍柱亲和层析蛋白纯化得到融合蛋白SUMO-NNVcp；

(4)酶切步骤(3)得到的融合蛋白；

(5)再纯化步骤(4)酶切后的融合蛋白，得到NNVcp。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中步骤(2)，使用IPTG诱导载体宿主，在25℃-30℃培养表达。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其中步骤(3)的具体工艺为，

1)将镍离子琼脂糖亲和层析介质装柱后，用5倍柱体积的0.5mol/L NaOH溶液活化柱子，流速为5mL/min，柱床体积为20mL；

2)用5倍柱体积的ddH₂O洗去NaOH溶液，此时亲和层析仪的Cond％＝0；5倍柱体积的NiSO₄过柱子，使亲和介质吸附Ni²⁺至Cond％平稳；ddH₂O清洗去未结合Ni²⁺，洗至Cond％＝0；使用Balance Buffer平衡柱子，至Cond％平稳，此时将流速改为3mL/min；

所述Balance Buffer含20mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄,pH7.4,500mmol/L NaCl,5mmol/L咪唑；

3)将总蛋白溶液上样，控制其流速为1mL/min，用5倍柱体积的Balance Buffer清洗，至280nm波长吸收值稳定，再用100mmol/L咪唑溶液清洗去除非特异性结合杂蛋白；

4)用500mmol/L咪唑溶液洗脱，收集样品峰对应洗脱液，即得到融合蛋白。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其中步骤(4)的具体工艺为，按照体积1:1，将步骤(3)得到的含融合蛋白的洗脱液加入Balance Buffer，然后测定蛋白浓度，加入SUMOProtease，使得SUMO Protease终浓度在200U/mg蛋白，4℃酶切20h。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其中步骤(5)的具体工艺为，

Ⅰ将镍离子琼脂糖亲和层析介质装柱后，用5倍柱体积的0.5mol/L NaOH溶液活化柱子，流速为5mL/min，柱床体积为20m；

Ⅱ用5倍柱体积的ddH₂O洗去NaOH溶液，此时亲和层析仪的Cond％＝0；5倍柱体积的NiSO₄过柱子，使亲和介质吸附Ni₂+至Cond％平稳；ddH₂O清洗去未结合Ni₂+，洗至Cond％＝0；使用Balance Buffer平衡柱子，至Cond％平稳，此时将流速改为3mL/min；

所述Balance Buffer含20mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH7.4,500mmol/L NaCl，5mmol/L咪唑；

Ⅲ用步骤(4)得到的酶切后的蛋白溶液上样，控制流速在1mL/min，收集流穿液，即得NNVcp。

8.一种NNVcp的制备方法，包括：

(1)构建NNVcp重组表达载体；

用密码子优化的NNVcp核酸序列，和载体pET-SUMO连接构建融合表达载体，转化宿主；所述密码子优化的NNVcp核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

其中，在密码子优化的NNVcp核酸序列末端添加终止密码子后，再连接载体pET-SUMO，由此形成目的肽表达区，所述目的肽表达区具有如SEQ ID NO.3所示核酸序列；

(2)重组表达载体可溶性表达，以及蛋白分离；

其中，使用LB培养基，IPTG诱导载体宿主，在26℃培养表达；然后收集菌液破碎离心，收集上清，即得包含融合蛋白的可溶性总蛋白溶液；

1)将镍离子琼脂糖亲和层析介质装柱后，用5倍柱体积的0.5mol/L NaOH溶液活化柱子，流速为5mL/min，柱床体积为20m；

4)用500mmol/L咪唑溶液洗脱，收集样品峰对应洗脱液，即得到融合蛋白；

(4)酶切步骤(3)得到的融合蛋白；

按照体积1:1，将步骤(3)得到的含融合蛋白的洗脱液加入Balance Buffer，然后测定蛋白浓度，加入SUMO Protease，使得SUMO Protease终浓度在200U/mg 蛋白，4℃酶切20h；

(5)再层析纯化步骤(4)酶切后的融合蛋白，得到ecNPY蛋白；

Ⅰ将镍离子琼脂糖亲和层析介质装柱后，用5倍柱体积的0.5mol/L NaOH溶液活化柱子，流速为5mL/min，柱床体积为20mL；

Ⅱ用5倍柱体积的ddH₂O洗去NaOH溶液，此时亲和层析仪的Cond％＝0；5倍柱体积的NiSO₄过柱子，使亲和介质吸附Ni²⁺至Cond％平稳；ddH₂O清洗去未结合Ni²⁺，洗至Cond％＝0；使用Balance Buffer平衡柱子，至Cond％平稳，此时将流速改为3mL/min；

Ⅲ用步骤(4)得到的酶切后的蛋白溶液上样，控制流速在1mL/min，收集流穿液，即得ecNPY蛋白；

其中，步骤(5)所述的层析纯化可以用透析纯化替代。

9.一种石斑鱼重组NNVcp，其特征在于，由权利要求3-8中的任一项的方法制备得到。

10.权利要求9所述的石斑鱼重组NNVcp在制备用于鱼类NNV感染防治的产品中的应用。