ES2663224T3 - ADNc infeccioso de una cepa de vacuna aprobada del virus del sarampión. Uso para composiciones inmunogénicas - Google Patents
ADNc infeccioso de una cepa de vacuna aprobada del virus del sarampión. Uso para composiciones inmunogénicas Download PDFInfo
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Abstract
Un proceso para la preparación de una molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de un virus del sarampión (MV) que se origina de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, que comprende los siguientes pasos: - purificar el ARN vírico a partir de partículas víricas de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten; y - obtener la molécula de ADNc por transcripción inversa del ARN vírico purificado, en el que la molécula de ADNc obtenida se dispone bajo el control de una secuencia heteróloga de control de expresión apropiada para la transcripción de la cadena ARN(+) antigenómica partiendo de la molécula de ADNc, y en particular una secuencia heteróloga de control de expresión de dicho ADNc que comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7, y en el que la molécula de ADNc obtenida comprende adicionalmente, en su extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómico infeccioso completa, la secuencia de una ribozima de virus de hepatitis delta.
Description
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DESCRIPCION
ADNc infeccioso de una cepa de vacuna aprobada del virus del sarampión. Uso para composiciones inmunogénicas
El virus del sarampión es un miembro de la orden de mononegavirus, es decir, virus con un genoma de ARN de cadena negativa no segmentado. El genoma no segmentado del virus del sarampión (MV) tiene una polaridad antimensaje que da como resultado un ARN genómico que no se traduce in vivo ni in vitro ni es infeccioso cuando se purifica.
La transcripción y replicación de virus de ARN de cadena (-) no segmentados y su ensamblaje como partículas víricas se ha estudiado y reseñado especialmente en “Fields virology” (3a edición, vol. 1, 1996, Lippincott-Raven publishers - Fields BN y col.). La transcripción y replicación del virus del sarampión no implica al núcleo de las células infectadas, sino que tiene lugar en el citoplasma de dichas células infectadas. El genoma del virus del sarampión comprende genes que codifican seis proteínas estructurales principales de los seis genes (designados N, P, M, F, H y L) y dos proteínas no estructurales adicionales del gen P. El orden génico es el siguiente: 3', N, P (incluyendo C y V), M, F, H, y proteína polimerasa grande L en el extremo 5'. El genoma comprende además regiones no codificantes en la región intergénica M/F; esta región no codificante contiene aproximadamente 1.000 nucleótidos de ARN no traducido. Los genes citados codifican respectivamente el péptido líder (gen I), las proteínas de la nucleocápsida del virus, es decir, la nucleoproteína (N), la fosfoproteína (P) y la proteína grande (L) que se ensamblan alrededor del ARN genómico proporcionando la nucleocápsida. Los demás genes codifican las proteínas de la cubierta vírica incluyendo hemaglutinina (H), proteínas de fusión (F) y de matriz (M).
Se ha aislado el virus del sarampión y se han derivado vacunas vivas atenuadas del MV Edmonston aislado en 1954 (Enders, J. F. y T. C. Peebles. 1954. “Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles”. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 277-286.), mediante pases en serie efectuados en células de riñón humanas primarias o amnióticas. Las cepas usadas se adaptaron entonces a fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para producir semillas de Edmonston A y B (Griffin, D. y W. Bellini. 1996. “Measles virus”, pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, y col. (ed.), “Virology”, vol. 2. Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia). La Edmonston B se licenció en 1963 como la primera vacuna del MV. Pases adicionales de Edmonston A y B en CEF produjeron los virus más atenuados Schwarz y Moraten (Griffin, D. y W. Bellini. 1996. “Measles virus”, pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, y col. (ed.), “Virology”, vol. 2. Lippincott- Raven Publishers, Filadelfia) cuyas secuencias se ha mostrado recientemente que son idénticas (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. “Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage”. J. Virol. 75:921-933; Parks, C. L., Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. “Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage”. J. Virol. 75:910-920). Debido a que la vacuna de Edmonston B era reactogénica, se abandonó en 1975 y se reemplazó por la vacuna de Schwarz/Moraten, que es actualmente la vacuna del sarampión más ampliamente usada en el mundo (Hilleman, M. 2002. “Current overview of the pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practical implications”. Vaccine. 20:651-665). Se usan también varias otras cepas de vacuna: AIK-C, Schwarz F88, CAM70, TD97 en Japón, Leningrad-16 en Rusia y Edmonston Zagreb. Las cepas chinas CAM70 y TD97 no derivaban de Edmonston. Las vacunas Schwarz/Moraten y AIK-C se producen en CEF. La vacuna Zagreb se produce en células diploides humanas (WI-38).
WO99/49017 se refiere a virus de ARN atenuados, generados de forma recombinante, del orden Mononegavirales y describe las secuencias de nucleótidos de diferentes cepas víricas de vacunas del sarampión, incluidas las de la cepa Moraten y de la cepa Schwarz. Ballart et al. (EMBO J., 1991, 10(11), 3558) es un documento de retractación que menciona que el clon descrito en Schmid et al. (Nucl. Acids Res., 1987, 15(10), 3987-3996), y el rescate de ADNc descrito en Ballart et al. (EMBO J., 1990, 9(2), 379-384) fueron artefactos experimentales y que el clon descrito en estos dos documentos no era adecuado para rescatar virus. El documento WO01/03744 describe vacunas de virus parainfluenza recombinante atenuadas por deleción o ablación de un gen no esencial.
La vacuna atenuada viva derivada de la cepa Schwarz se comercializa por Aventis Pasteur (Lyon, Francia) con el nombre comercial Rouvax®.
En un trabajo notable y pionero, Martin Billeter y colaboradores clonaron un ADNc infeccioso correspondiente al antigenoma del MV Edmonston y establecieron un procedimiento genético inverso original y eficaz para recuperar el correspondiente virus (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dotsch, G. Christiansen y M. Billeter., 1995. “Rescue of measles viruses from cloned DNA”. EMBO Journal. 14: 5773-5784 y WO 97/06270 incorporados a la presente como referencia).
Sin embargo, la comparación de secuencia (véase a continuación) reveló que el genoma clonado en este vector divergía de la secuencia de Edmonston B. Era más cercana a Edmonston-wt, un pase temprano en células Vero de aislados de Edmonston (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. udem. 2001. “Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage”. J. Virol. 75:921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. “Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage”. J. Virol. 75:910-920) y tenía 10 sustituciones aminoacídicas no relacionadas
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con ningún subgrupo de Edmonston. Además, a pesar del hecho de que este vector es inmunogénico en ratones que expresan CD46 y carecen del IFN I receptor de tipo I (19), los inventores muestran en el siguiente trabajo experimental que no es inmunogénico en primates no humanos cuando se inocula a la dosis estándar de 104 TCID50. Por lo tanto, este vector desarrollado a partir de una cepa de vacuna abandonada hace 25 años y cuya secuencia divergía tanto, no parece adecuado como vector de vacunación, especialmente en humanos, aunque ciertamente ayuda a comprender algunos aspectos de la replicación del MV.
Por estas razones, los inventores han decidido que necesita desarrollarse un vector del sarampión dirigido a niños a partir de una cepa de vacuna aprobada y en consecuencia han clonado un ADNc infeccioso partiendo de partículas víricas de la cepa de virus del sarampión Schwarz/Moraten ampliamente usada. Este ADNc puede permitir la producción de provisiones de vacuna de Schwarz/Moraten sin tener que contar con la disponibilidad de provisiones de semilla. Puede usarse también como vector de vacunación recombinante basado en una cepa de vacuna aprobada y eficaz crecida en CEF por razones de seguridad y usada en todo el mundo. Tal vector también puede ser de interés para poblaciones adultas en ciertas circunstancias donde existe, por tanto, una necesidad.
Descripción de la invención
La invención se relaciona con un proceso para la preparación de una molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de un virus del sarampión (MV) que se origina de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, que comprende los siguientes pasos:
- purificar el ARN vírico a partir de partículas víricas de la cepa de vacuna Schwarz o la cepa de vacuna Moraten; y
- obtener la molécula de ADNc por transcripción inversa del ARN vírico purificado,
en el que la molécula de ADNc obtenida se dispone bajo el control de una secuencia heteróloga de control de expresión apropiada para la transcripción de la cadena ARN(+) antigenómica partiendo de la molécula de ADNc, y en particular una secuencia heteróloga de control de la expresión de dicho ADNc que comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7, y en el que la molécula de ADNc obtenida comprende adicionalmente, en su extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómico infeccioso completa, la secuencia de una ribozima de virus de hepatitis delta.
En el proceso de acuerdo con la invención, la molécula de ADNc codifica la secuencia nucleotídica de la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de un virus del sarampión (MV) que se origina de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten.
La expresión “codifica” en la definición anterior engloba la capacidad del ADNc de permitir la transcripción de un ARN(+) antigenómico completo, sirviendo dicho ADNc especialmente como molde para la transcripción. En consecuencia, cuando el ADNc es una molécula de doble cadena, una de las cadenas tiene la misma secuencia nucleotídica que la cadena (+) antigenómica de ARN del virus del sarampión, excepto porque los nucleótidos “U” están sustituidos por “T” en el ADNc.
La Figura 5 ilustra la secuencia de una molécula de ADN de la invención que comprende una secuencia de ADNc como se define anteriormente, especificándose que la cadena del ADNc que se representa es idéntica a la de la cadena ARN(+) antigenómica de una cepa de MV excepto por la sustitución de “U” por “T”.
En el proceso de acuerdo con la invención, la molécula de ADNc permite la producción, cuando se dispone en condiciones apropiadas, de un ARN(+) antigenómico infeccioso capaz de producir partículas infecciosas del virus del sarampión.
El ADNc obtenido tiene especialmente los extremos 5' y 3' originales de la cadena (+) antigenómica nativa del ARN vírico. Además, el ADNc obtenido cumple la regla de 6 que es necesaria para expresar partículas víricas infecciosas.
La “regla de seis” que se expresa en el hecho de que el número total de nucleótidos presentes en el ADNc asciende a un múltiplo de seis, regla que permite una replicación suficiente de ARN genómico del virus del sarampión. Se ha descrito en la referencia citada anteriormente “Fields Virology” en la página 1197.
En el proceso de acuerdo con la invención, la molécula de ADNc de la invención que deriva de una cepa de vacuna de MV aprobada se obtiene a partir de la cepa Schwarz o Moraten.
Estas cepas se han descrito en varias publicaciones y se usan para la preparación de las vacunas usadas actualmente. Los inventores proponen especialmente el uso de la cepa de Schwartz que está disponible en Aventis Pasteur (Francia).
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En el proceso de acuerdo con la invención, la molécula de ADNc se dispone bajo el control de una secuencia heteróloga de control de expresión.
La inserción de dicho control para la expresión del ADNc, es favorable cuando se busca la expresión de este ADNc en tipos celulares que no posibilitan una transcripción completa del ADNc con sus secuencias de control nativas.
En el proceso de acuerdo con la invención, la secuencia heteróloga de control de expresión comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7. Estas secuencias están localizadas respectivamente 5' y 3' de la secuencia codificante de la cadena ARN(+) antigenómica completa del MV y en las secuencias adyacentes alrededor de esta secuencia codificante.
En el proceso de acuerdo con la invención, la molécula de ADNc que se define aquí anteriormente se modifica, es decir, comprende secuencias o motivos de nucleótidos adicionales o comprende deleciones o sustituciones dentro de dicho ADNc.
En el proceso de acuerdo con la invención, la molécula de ADNc de la invención comprende además, en su extremo 5' adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+)antigenómica completa de la cepa de vacuna del MV aprobada, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+)antigenómica completa, la secuencia de una ribozima de virus de hepatitis delta (6).
El motivo GGG dispuesto en el extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia codificante anterior, mejora la eficacia de la transcripción de dicha secuencia codificante de ADNc. Como requisito para un ensamblaje apropiado de partículas del virus del sarampión está el hecho de que el ADNc que codifica el ARN(+) antigenómico cumple la regla de seis, cuando se añade el motivo GGG, se añade también una ribozima en el extremo 5' de la secuencia codificante del ADNc, 3' del motivo GGG, para posibilitar la escisión del transcrito en el primer nucleótido codificante de la cadena ARN(+) antigenómica completa de MV.
Por tanto, en caso de que el motivo GGG se añada para mejorar la eficacia de la transcripción, se añaden dos ribozimas para asegurar la escisión de la secuencia codificante de la cadena ARN(+)antigenómica completa del MV.
La expresión “ADNc” engloba una molécula de ADN obtenida mediante transcripción inversa de una molécula de ARN, incluyendo pero sin limitarse a una molécula de ARNm.
Puede usarse cualquier otra técnica para la preparación de ADN, partiendo del material divulgado en la presente invención o usando las características divulgadas relacionadas con el ADNc, incluyendo técnicas que implican síntesis o PCR.
Por lo tanto, la expresión “ADNc” usada para la descripción de la secuencia nucleotídica de la molécula de la invención usada en el proceso de acuerdo con la invención se refiere simplemente al hecho de que originalmente dicha molécula se obtiene mediante transcripción inversa de la cadena ARN(-) genómica completa del genoma de partículas víricas del virus del sarampión. Esto no debe considerase una limitación para los procedimientos usados para su preparación. Los ácidos nucleicos purificados, incluyendo ADN, están por tanto englobados en el significado de ADNc, a condición de que dicho ácido nucleico, especialmente ADN, satisfaga las definiciones anteriormente dadas.
La divulgación se refiere también a una molécula de ADNc según una de las definiciones anteriores que está comprendida en un plásmido capaz de replicación.
Pueden prepararse muchos plásmidos para satisfacer los requisitos de la presente divulgación y la presente divulgación se refiere especialmente al plásmido pTM-MVSchw que se representa en la figura 2.
El plásmido pTM-MVSchw se ha depositado en la CNCM (París, Francia) el 12 de junio de 2002 con el número I-2889. Este plásmido se describe en los ejemplos y figuras siguientes. Es un vector de plásmido derivado de Bluescript, que comprende la secuencia completa que codifica el virus del sarampión, cepa Schwarz, dispuesta bajo el control del promotor de ARN polimerasa T7; su tamaño es de 18967 nucleótidos.
En el proceso de acuerdo con la invención, la molécula de ADNc es capaz de producir partículas víricas infecciosas de la cepa de vacuna aprobada del MV, usando preferiblemente el sistema de recuperación reseñado anteriormente que implica las células auxiliares 293-3-46 (Radecke y col. y WO 97/06270), expresando las células auxiliares 293-3-46 las proteínas necesarias para la transcripción, replicación de la secuencia del genoma de ARN del MV a partir de dicho ADNc y en condiciones que posibilitan el ensamblaje de partículas víricas.
Las células 293-3-46 se citan como ejemplo para la preparación de partículas víricas. Sin embargo, pueden reemplazarse por cualquier otra línea celular apropiada adecuada para constituir células auxiliares.
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Se dan procedimientos para la producción de dichas partículas infecciosas en los ejemplos de la presente solicitud.
Se describe aquí que moléculas de ADNc particularmente preferidas son las moléculas que tienen una secuencia nucleotídica seleccionada entre las siguientes secuencias:
- la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 83 al nucleótido 15977 de la secuencia representada en la figura 5,
- la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 29 al nucleótido 16202 de la secuencia representada en la figura 5,
- la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 26 al nucleótido 16202 de la secuencia representada en la figura 5,
- la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende de nucleótido 9 al nucleótido 16202 de la secuencia representada en la figura 5,
- la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 29 al nucleótido 15977 de la secuencia representada en la figura 5,
- la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 26 al nucleótido 15977 de la secuencia representada en la figura 5,
- la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 9 al nucleótido 15977 de la secuencia representada en la figura 5.
La presente divulgación se refiere por supuesto a cada una de las secuencias particulares descritas anteriormente.
Se describe aquí que una molécula de ADNc particular es la molécula que comprende el inserto contenido en el plásmido pTMMVschw depositado en la CNCM con el número I-2889, en el que dicho inserto codifica una secuencia nucleotídica completa de la cadena ARN(+) antigenómica del virus del sarampión. Es un inserto particular el comprendido en la secuencia definida por los siguientes sitios de restricción: NotI (localizado en la posición 1 de la figura 5) y NotI (localizado en la posición 16203 en la figura 5).
En el proceso de acuerco con la invención, la molécula de ADNc es el producto de la transcripción inversa del ARN vírico purificado a partir de partículas víricas del virus del sarampión.
La preparación del ADNc a partir de ARN purificado vírico limita ventajosamente la presencia de componentes celulares y especialmente ADN o aRn celular que podrían estar presentes en células usadas para el cultivo de virus. Limita especialmente la presencia de ARN genómico vírico que estaría incompleto o mutado y que está presente en células, y limita la presencia de ARNm vírico presente en grandes cantidades en las células.
La divulgación describe una molécula de ADNc que tiene las características definidas anteriormente, que es capaz de inducir una respuesta inmune contra al menos un antígeno de un virus del sarampión, cuando se administra in vivo.
La descripción describe un virus mononegavirales recombinante que comprende la molécula de ADNc de un virus del sarampión de acuerdo con cualquiera de las definiciones anteriores y una secuencia de ADN de un virus ARN, cuyo virus recombinante es capaz de provocar in vivo una respuesta humoral y/o celular contra el virus del sarampión o contra dicho virus ARN, o contra el virus del sarampión y el virus ARN.
En el proceso de acuerdo con la invención, la molécula de ADNc recombinante como se define anteriormente, comprende además una secuencia de ADN heteróloga clonada en la misma en condiciones que posibiliten su expresión como secuencia aminoacídica heteróloga, efectuándose dicha clonación de tal modo que el ADNc recombinante obtenido cumpla la regla de seis.
Las secuencias codificantes heterólogas especialmente secuencias de ADN se seleccionan ventajosamente entre secuencias capaces de expresar antígenos o epítopos de antígenos, teniendo propiedades inmunogénicas y especialmente teniendo la capacidad de desencadenar o favorecer una respuesta inmunogénica en un huésped en el que son administradas. Dichas secuencias de ADN heterólogas pueden derivar, por ejemplo, de antígenos de patógenos.
La divulgación describe la inserción de dichas secuencias de ADN heterólogas en una secuencia que se designa como unidad de transcripción adicional (ATU), especialmente una ATU como la divulgada por Billeter y col. en WO 97/06270.
Esta ATU se representa especialmente en la Figura 4.
Cuando se usa para la realización de la presente divulgación, la ATU está localizada ventajosamente en la secuencia N- terminal de la molécula de ADNc que codifica la cadena ARN(+) completa del antigenoma del MV y está localizada especialmente entre los genes P y M de este virus o entre los genes H y L. Se ha observado que la transcripción del ARN
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vírico de MV sigue la dirección del extremo 5' al 3'. Esto explica que cuando se inserta en el extremo 5' de la secuencia codificante del ADNc, la ATU posibilitará una expresión más eficaz de la secuencia de ADN heteróloga que contiene.
La divulgación describe un vector que comprende una molécula de ADNc como se define anteriormente incluyendo un ADNc recombinante. Se divulga aquí un vector para la clonación y/o expresión de este ADNc.
El vector divulgado aquí es un plásmido y es especialmente pTM-MVSchw depositado en la CNCM el 12 de junio de 2002 bajo el n° I-2889.
Se divulgan aquí otros vectores, designados pTM-MVSchw2-gfp depositado en la CNCM bajo el n° I-2890 el 12 de junio de 2002 o pTM-MVSchw2-GFPbis depositado en la CNCM bajo el n° I-3034 el 26 de mayo de 2003.
Estos vectores derivan de pTM-MVSchw, y son en consecuencia vectores plasmídicos derivados de Bluescript, que comprende la secuencia completa que codifica el virus del sarampión, cepa Schwarz, dispuesto bajo el control del promotor de ARN polimerasa T7, y que contiene además el gen gfp que codifica la proteína GFP, estando insertado dicho gen en una ATU en posición 2 (concretamente, entre los genes N y P del MV).
El tamaño de pTM-MvSchw es de 18967 nucleótidos. El tamaño de pTM-MVSchw2-gfp es de 19800 nucleótidos.
La diferencia entre pTM-MVSchw2-gfp y pTM-MVSchw2-GFPbis corresponde a una mutación en la secuencia ATU donde se sustituye un nucleótido C como se ilustra en la figura 4B al final de la ATU, para proporcionar pTM-MVSchw2-GFPbis.
La invención también se relaciona con un proceso para la preparación de partículas del virus del sarampión infecciosas, que comprende:
1) purificar el ARN vírico a partir de partículas víricas de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten; y
2) obtener una molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de un virus del sarampión (MV) que se origina de la cepa de vacuna Schwarz o la cepa de vacuna Moraten, por transcripción inversa del ARN vírico purificado;
en el que la molécula de ADNc obtenida se dispone bajo el control de una secuencia heteróloga de control de expresión apropiada para la transcripción de la cadena ARN(+) antigenómica partiendo de la molécula de ADNc, y en particular una secuencia heteróloga de control de expresión de dicho ADNc que comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7, y en el que la molécula de ADNc obtenida comprende adicionalmente, en su extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa, la secuencia de una ribozima de virus de hepatitis delta, proporcionando de este modo un ADNc recombinante;
3) expresar dicho ADNc recombinante en una línea de células auxiliares que expresa también las proteínas necesarias para la transcripción, replicación y encapsidación de la cadena ARN(+) antigenómica del virus del sarampión, partiendo de dicho ADNc y en condiciones que posibilitan el ensamblaje de partículas víricas y
4) recuperar las partículas víricas expresadas,
en el que las células auxiliares derivan por ejemplo de la línea de células de riñón embriónico humano 293 (ATCC CRL- 1573).
De acuerdo con una realización particular de este proceso, éste comprende:
1) transfectar células auxiliares con dicho ADNc recombinante, en el que dichas células auxiliares son capaces de expresar funciones auxiliares para expresar una ARN polimerasa y para expresar las proteínas N, P y L del virus MV;
2) cocultivar dichas células auxiliares transfectadas de la etapa 1) con células sometidas a pases, adecuadas para el paso de la cepa de vacuna de MV de la que se origina el ADNc, por ejemplo, células CEF; y
3) recuperar las partículas víricas de MV infecciosas producidas,
en el que opcionalmente la etapa de transfección es seguida por la sustitución del medio de transfección por medio nuevo y la aplicación de un choque térmico antes de la incubación.
Según una realización preferida, las células auxiliares derivan de la línea celular de riñón embriónico humano 293, estando depositada dicha línea celular 293 en la ATCC bajo el número CRL-1573.
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Según otro aspecto de este proceso, las células adecuadas para pase son células CEF.
Las células CEF pueden prepararse a partir de huevos de gallina fertilizados obtenidos de EARL Morizeau, 8 rue Moulin, 28190 Dangers, Francia, o de cualquier otro productor de huevos de gallina fertilizados.
El proceso que se divulga según la presente invención se usa ventajosamente para la producción de virus del sarampión infeccioso apropiado para uso como composiciones de vacuna.
La divulgación describe una composición inmunogénica cuyo principio activo comprende partículas del virus del sarampión infecciosas obtenidas mediante el proceso divulgado anteriormente.
La divulgación describe una composición de vacuna. Dicha composición de vacuna tiene ventajosamente un principio activo que comprende partículas del virus del sarampión recuperadas del ADNc del vector que se ha definido anteriormente, que se expresa en un sistema de recuperación basado en células auxiliares.
Ventajosamente, dicha composición de vacuna es adecuada para protección frente al virus del sarampión. Como se describe en la presente memoria cuando el ADNc se recombina con una secuencia de ADN heteróloga que codifica una secuencia aminoacídica inmunogénica, la composición de vacuna puede ser adecuada además para protección frente al patógeno del que deriva la secuencia de ADN inmunogénica.
La divulgación describe una célula que se recombina con una molécula de ADNc como se divulga en la presente memoria o con un vector como se define anteriormente. Una célula preferida es una célula procariótica tal como E. coli o Salmonella.
Otra célula divulgada en la presente memoria es una célula eucariótica, especialmente una célula seleccionada entre levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae.
Una célula como se divulga en la presente memoria, puede caracterizarse por el hecho de que ésta comprende secuencias nucleotídicas que expresan funciones auxiliares necesarias para expresar una ARN polimerasa y para expresar las proteínas N, P y L del virus MV. Dicha célula puede usarse por tanto para la recuperación de partículas víricas.
La divulgación describe los siguientes puntos:
Punto 1. Molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de un virus del sarampión (MV) que se origina de una cepa de vacuna aprobada, dicha molécula de ADNc permitiendo la recuperación de un virus que puede crecer en CEF (fibroblastos de embrión de pollo).
Punto 2. Molécula de ADNc según el punto 1, que se dispone bajo el control de una secuencia heteróloga de control de expresión apropiada para la transcripción de la cadena ARN(+) antigenómica partiendo de la molécula de ADNc, y en particular una secuencia heteróloga de control de expresión de dicho ADNc que comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7.
Punto 3. Molécula de ADNc según el punto 1 o 2, que comprende adicionalmente, en su extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de la cepa de vacuna de MV aprobada, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómico infeccioso completa, la secuencia de una ribozima de virus de hepatitis delta.
Punto 4. Molécula de ADNc según cualquiera de los puntos 1 a 3, que es capaz de producir partículas víricas infecciosas de la cepa de vacuna de MV aprobada, en una célula auxiliar capaz de expresar las proteínas necesarias para la transcripción, replicación y encapsidación de la secuencia del genoma de ARN del virus del sarampión a partir de dicho ADNc y en condiciones que posibilitan el ensamblaje de partículas víricas.
Punto 5. Molécula de ADNc según cualquiera de los puntos 1 a 4, que está comprendida en un plásmido capaz de replicación, en particular en un plásmido pTM-MVSchw depositado en la CNCM el 12 de junio, 2002 bajo el n° I-2889.
Punto 6. Molécula de ADNc según cualquiera de los puntos 1 a 5, que tiene la secuencia nucleotídica representada en la figura 5.
Punto 7. Molécula de ADNc según cualquiera de los puntos 1 a 5, que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 83 al nucleótido 15976, del nucleótido 83 al nucleótido 15977, del nucleótido 29 al nucleótido 15977, del nucleótido 29 al nucleótido 16202, del nucleótido 26 al nucleótido 16202 o del nucleótido 9 al nucleótido 16202, de la secuencia representada en la figura 5.
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Punto 8. Molécula de ADNc según el punto 1, que es el inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado en la CNCM el 12 de junio, 2002 bajo el n° I-2889, donde dicho inserto codifica la secuencia nucleotídica de la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa del virus del sarampión.
Punto 9. Una molécula de ADNc recombinante que comprende una molécula de ADNc según cualquiera de los puntos 1 a 8 y que comprende además una secuencia de ADN heteróloga capaz de expresar una secuencia aminoacídica heteróloga, en particular una secuencia de ADN heteróloga que codifica una secuencia inmunogénica de un patógeno, en que dicho ADNc recombinante cumple además con la regla de seis.
Punto 10. Un ADNc recombinante según el punto 9, que comprende además una Unidad de Transcripción Adicional usada para clonar la secuencia de ADN heterólogo, estando dicha Unidad de Transcripción Adicional opcionalmente clonada cadena arriba del gen N del virus del sarampión o entre los genes P y M del virus del sarampión, o entre los genes H y L.
Punto 11. Un vector que comprende una molécula de ADNc según cualquiera de los puntos 1 a 10.
La invención se refiere en particular a las siguientes realizaciones:
Punto 12. Un proceso para la preparación de una molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de un virus del sarampión (MV) que se origina de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, que comprende siguientes pasos:
- purificar el ARN vírico a partir de partículas víricas de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten; y
- obtener la molécula de ADNc por transcripción inversa del ARN vírico purificado,
en el que la molécula de ADNc obtenida se dispone bajo el control de una secuencia heteróloga de control de expresión apropiada para la transcripción de la cadena ARN(+) antigenómica partiendo de la molécula de ADNc, y en particular una secuencia de control de la expresión heteróloga de dicho ADNc que comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7, y en el que la molécula de ADNc obtenida comprende adicionalmente, en su extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómico infeccioso completa, la secuencia de una ribozima de virus de hepatitis delta.
Punto 13. Un proceso según el punto 12, en el que la molécula de ADNc obtenida se modifica mediante deleción o sustituciones de varios nucleótidos con respecto a la cadena ARN(+) de la cepa Schwarz o de la cepa Moraten, con la condición de que el ADNc resultante cumpla con la regla de seis.
Punto 14. Un proceso para la preparación de partículas del virus del sarampión infecciosas que comprende:
1) purificar el ARN vírico a partir de partículas víricas de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten; y
2) obtener una molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de un virus del sarampión (MV) que se origina de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, por transcripción inversa del ARN vírico purificado,
en el que la molécula de ADNc obtenida se dispone bajo el control de una secuencia heteróloga de control de expresión apropiada para la transcripción de la cadena ARN(+) antigenómica partiendo de la molécula de ADNc, y en particular una secuencia heteróloga de control de expresión de dicho ADNc que comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7, y en el que la molécula de ADNc obtenida comprende adicionalmente, en su extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica completa, la secuencia de una ribozima de virus de hepatitis delta, proporcionando de este modo un ADNc recombinante;
3) expresar dicho ADNc recombinante en una línea de células auxiliares que expresa también las proteínas necesarias para la transcripción, replicación y encapsidación de la cadena ARN(+) antigenómica del virus del sarampión, partiendo de dicho ADNc y en condiciones que posibilitan el ensamblaje de partículas víricas; y
4) recuperar las partículas víricas expresadas,
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en el que las células auxiliares derivan por ejemplo de la línea de células de riñón embriónico humano 293 (ATCC CRL- 1573).
Punto 15. Un proceso según el punto 14, que comprende:
1) transfectar células auxiliares con dicho ADNc recombinante, en el que dichas células auxiliares son capaces de expresar funciones auxiliares para expresar una ARN polimerasa, y para expresar las proteínas N, P y L del virus MV;
2) cocultivar dichas células auxiliares transfectadas de la etapa 1) con células sometidas a pases, adecuadas para el paso de la cepa de vacuna de MV de la que se origina el ADNc, por ejemplo, células CEF; y
3) recuperar las partículas víricas de MV infecciosas producidas,
en el que opcionalmente la etapa de transfección es seguida por la sustitución del medio de transfección por medio nuevo y la aplicación de un choque térmico antes de la incubación.
Punto 16. El proceso según el punto 14 o 15, que se usa para la producción de virus de sarampión infeccioso apropiado para uso como principio activo en una composición de vacuna.
La divulgación describe en particular los siguientes puntos:
Punto 17. Una composición inmunogénica cuyo principio activo comprende (i) partículas víricas de sarampión recuperadas de una molécula de ADNc según cualquiera de los puntos 1 a 10, o del vector según el punto 11, en un sistema de recuperación basado en células auxiliares o (ii) partículas del virus del sarampión infecciosas obtenidas por el proceso según cualquiera de los puntos 14 a 16.
Punto 18. Un virus recombinante mononegavirales que comprende una molécula de ADNc según cualquiera de los puntos 1 a 10 y una secuencia de ADN de un virus ARN, que es capaz de provocar in vivo una respuesta humoral y/o celular contra el virus del sarampión o contra dicho virus ARN, o contra el virus del sarampión y el virus ARN.
Los ejemplos y figuras siguientes proporcionan características adicionales para la caracterización de la invención.
Figura 1. Comparación de genomas de MV. (A) Se muestran en la parte inferior los cambios nucleotídicos para cada región codificante (letras mayúsculas en recuadros) y en regiones no codificantes (letras minúsculas). Se muestran los cambios aminoacídicos en la parte superior (símbolo de aminoácido de una letra). El color amarillo de la rejilla muestra las sustituciones wt. El color azul indica las sustituciones correspondientes al tipo de vacuna Rubeovax/Scwharz/Moraten. El color rojo muestra los cambios nucleotídicos y aminoacídicos que están presentes sólo en la secuencia EdB-tag. Los cambios nucleotídicos en las posiciones 1805 y 1806 EdB-tag corresponden al marcador introducido. (B) Árbol filogenético que muestra EdB-tag entre el grupo Edmonston y dos aislados wt (Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa y Y. Nagai. 1998. “Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase and accessory proteins”. J. Virol. 72: 8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune y M. Tashiro. 2000. “Comparative nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a cell- isolated and vero cell-isolated measles viruses from the same patient”. Virus Genes. 20: 253-257). Se alinearon las secuencias usando Clustal W (Thompson, J. D., D. G. Higgins y T. J. Gibson. 1994. “CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). Se determinó la distancia de secuencia nucleotídica con Dnadist del paquete Phylip versión 3.5, Felsenstein, J. 1989. Cladistics. 5:164-166. El árbol derivaba del análisis del vecino más próximo aplicado a distancias de secuencia por pares calculadas usando una variedad de procedimientos, incluyendo el procedimiento de dos parámetros de Kimura, para generar árboles no enraizados. Se generó el resultado final con Treeview (Page, R. D. 1996. “TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers”. Comput. Appl. Biosci. 12: 357-358).
Figura 2. Mapa esquemático del plásmido pTM-MV Schw. Para construir la secuencia completa, se generaron los seis fragmentos representados en la parte superior y se recombinaron paso a paso usando los sitios de restricción únicos indicados. T7 = promotor T7; hh = ribozima de cabeza de martillo; hSv = ribozima de hepatitis delta; T7t = terminador de ARN polimerasa T7. Se usaron los siguientes oligonucleótidos para la secuenciación de la cepa Schwarz de MV.
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- N°
- Sentido Posición N° Antisentido
- 1
- AT CCGAGAT GGCCACACTTT 101 1a AAAGTGTGGCCATCTCGGAT
- 2
- TGATT CTGGGT ACCATCCT A 601 2a TAGGATGGTACCCAGAATCA
- 3
- T ATGCCAT GGGAGT AGGAGT 1110 3a ACTCCT ACTCCCAT GGCATA
- 4
- TGGCAGGAATCTCGGAAGAA 1609 4a TTCTTCCGAGATTCCTGCCA
- 5
- GCAT CAAGCACT GGGTTACA 2110 5a T GT AACCCAGT GCTTGATGC
- 6
- TACAGGAGTGGACACCCGAA 2651 6a TT CGGGTGTCCACTCCT GT A
- 7
- AGGACAGCTGCTGAAGGAAT 3096 7a ATTCCTTCAGCAGCT GTCCT
- 8
- TTGTTGAGGACAGCGATTCC 3610 8a GGAATCGCT GTCCT CAACAA
- 9
- AGAGT GAAGT CT ACT CTGCC 4120 9a GGCAGAGT AGACTT CACTCT
- 10
- TGACACAAGGCCACCACCAG 4608 10a CT GGT GGT GGCCTTGT GTCA
- 11
- AGCT CCCAGACTCGGCCAT C 5169 11a GAT GGCCGAGT CT GGGAGCT
- 12
- CCAGCCAT CAAT CATTAGTC 5603 12a GACT AAT GATT GAT GGCT GG
- 13
- AGTTTACGGGACCCCATATC 6115 13a GATATGGGGTCCCGTAAACT
- 14
- GGAACCT AAT AGCCAATTGT 6608 14a ACAATTGGCT ATTAGGTT CC
- 15
- CT CTTCGTCAT CAAGCAACC 7151 15a GGTTGCTTGATGACGAAGAG
- 16
- T CACTTGGTGT AT CAACCCG 7677 16a CGGGTTGATACACCAAGTGA
- 17
- AACT GTAT GGT GGCTTTGGG 8126 17a CCCAAAGCCACCAT ACAGTT
- 18
- T GT GTATTGGCTGACT ATCC 8620 18a GGAT AGT CAGCCAAT ACACA
- 19
- AT CAGGCATACCCACT AGTG 9162 19a CACT AGTGGGT AT GCCT GAT
- 20
- GCACAGCTCCCAGT GGTTTG 9701 20a CAAACCACT GGGAGCTGTGC
- 21
- T CATGAGTTAACT GAAGCTC 10214 21a GAGCTT CAGTTAACT CAT GA
- 22
- GTCACGGAGGCTTGTAGATG 10715 22a CAT CT ACAAGCCTCCGT GAC
- 23
- GT ACT GCCTT AATT GGAGAT 11231 23a AT CTCCAATT AAGGCAGT AC
- 24
- TGATGGGCTACTTGTGTCCC 11747 24a GGGACACAAGT AGCCCATCA
- 25
- ACCCTT ACT CAGCAAAT CTT 12223 25a AAGATTTGCT GAGT AAGGGT
- 26
- T CT AT GCGAGGCCACCTT AT 12726 26a ATAAGGTGGCCTCGCATAGA
- 27
- TT GT CCGAGT GGCGAGGT AT 13144 27a AT ACCTCGCCACT CGGACAA
- 28
- CAATTGGGCATTTGATGTAC 13712 28a GT ACAT CAAATGCCCAATTG
- 29
- GAGGCT AT GTT AT CT CCAGC 14172 29a GCT GGAGATAACAT AGCCT C
- 30
- AGTT GGCCTT GTCGAACACA 14723 30a T GT GTTCGACAAGGCCAACT
- 31
- CT GGACTT AT AGGT CACAT C 15190 31a GAT GT GACCT AT AAGT CCAG
- 32
- GGTTTGAAACGTGAGTGGGT 15693 32a ACCCACT CACGTTTCAAACC
Figura 3. Cinética de crecimiento de virus Schwarz y EdB-tag en células Vero y CEF. Se infectaron células en placas de 35 mm con virus MV Schwarz recuperado del plámido pTM-MVSchw (-■-), MV EdB-tag (-o-), y virus Schwarz industrial (A-) a diferentes MOI (como se indica). En cada punto temporal, se recogieron las células y se determinaron los títulos víricos usando el procedimiento TCID50 en células Vero. (A) Células Vero incubadas a 37°C, (B) CEF incubadas a 37°C, (C) CEF incubadas a 32°C.
Figura 4. A: Representación esquemática de la unidad de transcripción adicional (ATU) y vector plasmídico de MV Schwarz. (AA) Elementos de acción en cis de la ATU insertada en posición 2 entre los marcos abiertos de lectura de fosfoproteína (P) y matriz (M) del MV. (AB). Representación de las tres posiciones de la inserción ATU en el vector plasmídico de MV Schwarz.
B: Secuencia ATU: las letras minúsculas representan secuencias adicionales (copia de la región intergénica N- P del virus del sarampión) más sitios de clonación. Las letras mayúsculas corresponden a la secuencia de GFP mejorada insertada. Esta secuencia se inserta en el sitio Spel (posición 3373) de la secuencia de ADNc de la cepa Schwarz del virus del sarampión para ATU2 y en el sitio Spel (posición 9174) para la ATU3. La mutación que distingue la ATU normal de la bis (en pTM-MVSchw2-gfp y pTM-MVSchw2-GFPbis) es una C sustituida (letra mayúscula) al final de la ATU.
Figura 5. Secuencia nucleotídica completa del plásmido pTM-MVSchw. La secuencia puede describirse como sigue con referencia a la posición de los nucleótidos:
- 1-8 sitio de restricción Notl
- 9-28 promotor T7
- 29-82 ribozima de cabeza de martillo
- 83-15976 antigenoma de MV Schwarz
- 15977-16202 ribozima HDV y terminadora T7
- 16203-16210 sitio de restricción Notl
- 16211-16216 sitio de restricción Apal
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- 16220-16226 sitio de restricción Kpnl
- 16226-18967 plásmido pBluescript KS(+) (Stratagene)
Figura 6. Detección de anticuerpos anti-MV en macacos inmunizados con diferentes cepas de vacuna MV. Los anticuerpos anti-MV se detectaron mediante ELISA un mes después de la inmunización de macacos rhesus (2 monos por grupo) con virus Schwarz (barras grises), virus EdB-tag (barras blancas) y vacuna Rouvax (barras negras) a las dosis indicadas. La relación del estado inmune (ISR) se calculó como se describe en materiales y métodos. Solo los valores de ISR superiores a 0,9 se consideraron positivos (las determinaciones se realizaron por triplicado con una dilución de 1/20 de las muestras de suero y los resultados se expresaron como los valores medios ± DE).
Figura 7. Títulos de anticuerpos para MV en ratones inmunizados con diferentes cepas de vacuna MV. Los anticuerpos anti-MV se detectaron mediante ELISA un mes después de la inmunización de ratones CD46 (A) y CD46/IFNAR (B) con 104 TCID50 de virus EdB-tag (barras blancas), virus Schwarz (barras grises) y vacuna Rouvax (barras negras). Los resultados se expresan como valores medios de DO ± DE (4 ratones por grupo) determinados en diluciones seriadas de sueros.
Figura 8. Detección de anticuerpos anti-MV en macacos inmunizados con diferentes preparaciones de virus de sarampión Schwarz. Los anticuerpos anti-MV se detectaron por ELISA en diferentes puntos de tiempo después de la inmunización de macacos cinomolgos (2 monos por grupo) con 104 TCID50 de virus industrial Schwarz en bruto (marcas blancas), virus Schwarz rescatado del plásmido pTM-MVSchw y cultivado en CEF (barras grises) o células Vero (barras negras). La relación del estado inmune (ISR) se calculó como se describe en materiales y métodos.
Figura 9. Cambios en el número de leucocitos circulantes y respuesta de células T específicas de MV en macacos inmunizados con diferentes preparaciones de MV Schwarz. Enumeración de glóbulos blancos (A), linfocitos (B), monocitos (C) y hemaglutinina MV específica de IFN-Y-ELISpots (D) en PBMC de macacos cinomolgos recogidos en diferentes momentos después de la inmunización con 104 TCID50 de Virus Schwarz en bruto (marcas blancas), virus Schwarz rescatado del plásmido pTM-MVSchw y cultivado en CEF (barras grises) o células Vero (barras negras). Se detectó IFN- Y-ELISpots después de la estimulación de PBMC durante 24 horas con un MVA recombinante que expresaba la hemaglutinina Mv. El fondo obtenido con estimulación con MVA-wt se restó y los resultados se expresan como células productoras de IFN-y específicas de MVA-HMV por millón de PBMC.
Figura 10. Representación esquemática de los plásmidos pTM-MVSchw-ATU (A) y expresión de GFP en células Vero infectadas por virus recombinantes rescatados (B). Las células Vero se infectaron con Schwarz MV-GFP recombinante en la posición ATU2 (lado izquierdo) o en la posición ATU3 (lado derecho) y se observó la fluorescencia de GFP en sincicios.
Ejemplos
Comparación de secuencia entre cepa de vacuna EdB-tag y cepa de vacuna del sarampión
En un buen análisis anteriormente reseñado (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. “Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage”. J Virol. 75: 921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. “Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage”. J. Virol. 75: 910-920), se compararon las secuencias codificantes y no codificantes de cepas de virus de vacuna derivados de Edmonston con las de un aislado de pocos pases del virus del sarampión de tipo silvestre de Edmonston. Los autores identificaron 10 sustituciones aminoacídicas compartidas por casi todas las cepas de vacuna. Se compararon las secuencias genómicas de estas cepas de vacuna derivadas de Edmonston y dos aislados primarios (Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa y Y. Nagai. 1998. “Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase and accessory proteins”. J. Virol. 72: 8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune y M. Tashiro. 2000. “Comparative nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a cell-isolated and vero cell-isolated measles viruses from the same patient”. Virus Genes. 20: 253-257) con la del ADNc infeccioso de Edmonston B anteriormente reseñado (EdB-tag) (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dotsch, G. Christiansen y M. Billeter. 1995. “Rescue of measles viruses from cloned DNA”. EMBO Journal. 14: 5773-5784). La Figura 1 muestra que la secuencia nucleotídica de EdB-tag difería de la de Rubeovax (vacuna Edmonston B) por un 0,24% (38 mutaciones) y de la de Schwarz/Moraten por un 0,27% (44 mutaciones). Las secuencias de Schwarz/Moraten y Edmonston B (Rubeovax®) diferían sólo en un 0,1% (16 mutaciones). Entre las 38 diferencias entre EdB-tag y Rubeovax, 17 eran sustituciones aminoacídicas en las regiones codificantes y 7 estaban localizadas en regiones no codificantes. Entre las 44 diferencias entre EdB-tag y Schwarz/Moraten, 22 eran sustituciones aminoacídicas y 9 estaban en regiones no codificantes. Las 10 sustituciones aminoacídicas compartidas por casi todas las cepas de vacuna de Edmonston (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. “Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage”. J. Virol. 75: 921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P.
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Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. “Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage”. J. Virol. 75: 910-920) se conservaban en ADNc de EdB-tag. Sin embargo, 5 de ellas eran específicas del subgrupo AIK-C y Zagreb, indicando que el virus del que se clonó EdB-tag divergía de Edmonston B y no correspondía a ninguna cepa de vacuna aprobada. Además, 10 sustituciones aminoacídicas en EdB-tag no estaban relacionadas con ningún subgrupo de Edmonston, reflejando probablemente la adaptación al crecimiento en células HeLa y/o errores introducidos durante el procedimiento de clonación. Entre estos cambios específicos, 5 estaban localizados en las secuencias codificantes de P/V/C y 3 estaban localizados en el gen de polimerasa L, afectando por tanto posiblemente a la capacidad replicativa del virus in vivo. Estos cambios y otros en secuencias de acción en cis pueden influir en la inmunogenicidad o patogenicidad de los virus recuperados de ADNc de EdB-tag. Es más, se ha mostrado que la adaptación del MV al crecimiento en células Vero está asociada a la pérdida de potencial patogénico (Kobune, F., H. Sakata y A. Sugiura. 1990. “Marmoset lymphoblastoid cells as a sensitive host for isolation of measles virus”. J. Virol. 64: 700-705) y con unos pocos cambios aminoacídicos localizados en la proteína polimerasa (L) y accesorias (P/V/C), dando como resultado la atenuación transcripcional en células linfoides (Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa y Y. Nagai. 1998. “Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase and accessory proteins”. J. Virol. 72: 8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune y M. Tashiro. 2000. “Comparative nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a cell- isolated and vero cell-isolated measles viruses from the same patient”. Virus Genes. 20: 253-257).
Construcción de un ADNc correspondiente al antigenoma de la cepa de vacuna de Schwarz del virus del sarampión
Se purificaron partículas víricas de un lote de vacuna Schwarz del sarampión amablemente proporcionado por Aventis Pasteur (Lyon, Francia). Se obtuvo esta preparación de vacuna en bruto (50 ml, 3 104 TCID50/ml) mediante raspado de células CEF infectadas, congelación-descongelación de células y medio y filtración del desecho celular. Se concentraron las partículas mediante centrifugación a través de un colchón de sacarosa al 30%. Se purificó el ARN vírico a partir de partículas lisadas usando una membrana basada en gel de sílice (QIAmp, Qiagen). Se transcribió de forma inversa el ARN vírico en ADNc usando una mezcla de hexámeros aleatorios (pdN6, 1 jM) y un oligonucleótido específico que representa los 32 primeros nucleótidos del genoma del MV (MVSchwRT1 5'- ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGATAGTTCAATC-3', 10 jM) como cebadores. Para asegurar la fidelidad de la transcripción inversa y el rendimiento de productos completos, se usó la ADN polimerasa II Superscript (GibcoBRL). Se generó un conjunto de 6 fragmentos superpuestos que cubren el ADNc vírico completo (numerados 1 a 6 en la Fig. 2) mediante PCR usando ADN polimerasa PfuTurbo (Stratagene) y un conjunto de cebadores específicos cercanos a sitios de restricción únicos. El fragmento 1 en el extremo 5' del antigenoma vírico estaba modificado por ingeniería genética con cebadores específicos para contener un promotor de ARN polimerasa T7 con el motivo GGG necesario para una eficacia completa y una secuencia de ribozima de cabeza de martillo insertada entre el promotor T7 y el primer nucleótido vírico. Para generar este fragmento, se asociaron conjuntamente dos oligonucleótidos superpuestos: líder 1 (5'- TATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGCC-
AACTTTGTTTGGTCTGA-3') que contiene un sitio Notl, el promotor T7 (subrayado) y los 19 primeros nucleótidos de la secuencia de ribozima de cabeza de martillo, y líder 2 (5'-GGTGACCCGGGACTCCGGGTTTCGTCCTCAC- GGACTCATCAGACCAAACA-3') que contiene la secuencia de cabeza de martillo con un sitio Smal/Xmal. Después de amplificación por PCR, se ligó el fragmento resultante mediante extensión por PCR con un segundo fragmento también generado por PCR a partir de ADNc de Schwarz usando los oligonucleótidos MVSchw1 (5'- GAGTCCCGGGTCACCAAACAAAGTTGGGTAAG-3') que se superpone con la secuencia de cabeza de martillo (subrayada) y que cubre el genoma de MV Schwarz 1-15, y MVSchw160 (5'-GGTTTGTCCTTGTTTCTTTT-3', genoma de MV Schwarz 141-160). Se amplificó el fragmento 2 (2173 nucleótidos de longitud, véase la fig. 2) usando los oligonucleótidos MVSchwRT1 (5'-ACCAAACAAAGTTGGG TAAGGATAGTTCAATC-3', genoma de MV Schwarz 1-32) y MVSchw2173 (5'-ATTCCCTTAACCGCTTCACC- 3', genoma de MV Schwarz 2155-2174). Se amplificó el fragmento 3 (3142 nucleótidos de longitud) usando los oligonucleótidos MVSchw1901 (5'-CTATGGCAGCATGGTCAGAAATA-3', genoma de MV Schwarz 1901-1924) y MVSch5043 (5'-ATTGTCGATGGTTGGGTGCT-3', genoma de MV Schwarz 50245043). Se amplificó el fragmento 4 (4349 nucleótidos de longitud) usando los oligonucleótidos MVSchw4869 (5'- AAACTT AGGGCCAAGGAACAT AC-3', genoma de MV Schwarz 4869-4891) y MVSchw9218 (5'-
GGACCCTACGTTTTTCTTAATTCTG- 3', genoma de MV Schwarz 9194-9218). Se amplificó el fragmento 5 (6200 nucleótidos de longitud) usando los oligonucleótidos MVSchw9119 (5'-AGATAGGGCTGCTAGTGAACCAAT-3', genoma de MV Schwarz 9119-9142) y MVSchw15319 (5'-ATCAGCACCTGCTCTATAGGTGTAA-3', genoma de MV Schwarz 15295-15319). Para obtener el fragmento 6, se asociaron conjuntamente dos fragmentos superpuestos generados mediante PCR. Se usaron los siguientes oligonucleótidos: MVSchw15155 (5'-
GCAGCAGATAATTGAATCATCTGTGAGGACTTCAC, genoma de MV Schwarz 15155-15190) y MVSchw15570 (5'- CCCGGAGTAAAGAAGAATGTGCCCCCAGAATTTGC-3', genoma de MV Schwarz 15535-15570). Se asoció este fragmento con un fragmento que contenía la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV) ligada al terminador T7 que se
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obtuvo anteriormente mediante amplificación por PCR del plásmido p(MV+) (un amable obsequio de M. Billeter) usando los oligonucleótidos MVSchw15547 (5'-GGCACATTCTTCTTTACTCCGGGAACAAAAAGTTG-3', genoma de MV Schwarz 15547-15581) y MVSchwEnd (5'-ATAGGGCCCGCGGCCGCATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCA-3' que contiene un sitio de restricción Apal ligado a los últimos nucleótidos del terminador T7. Se clonaron los 6 fragmentos así generados en el vector pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen, Groningen, Holanda) y se secuenciaron. Para ensamblar el ADN completo de MV Schwarz, se construyó un plásmido BlueScript KS (+) modificado: se asociaron dos oligonucleótidos internamente complementarios que proporcionan un poliligador Notl, Kasl/Narl, Spel, Apal y se insertaron en plásmido pTM digerido con Notl/Apal (pTM derivaba de pBluescript KS (+) (Stratagene) mediante deleción del promotor T7 (Tangy, F., A. McAllister y M. Brahic. 1989. “Molecular cloning of the complete genome of Theiler's virus, strain GDVII, and production of infectious transcripts”. J. Virol. 63: 1101-11066). Se ensamblaron conjuntamente los 6 fragmentos de ADN de MV Schwarz paso a paso usando sitios de restricción únicos. Se ensamblaron conjuntamente los fragmentos 1 y 2 usando el sitio Blpl en la secuencia de MV (Fig. 2) y el sitio Bglll en la cadena principal del vector pCR®2.1- TOPO®. Se ensambló el plásmido resultante con el fragmento 3 usando el sitio Sbfl en la secuencia de MV y el sitio Bglll en la cadena principal del vector pCR®2.1-TOPO®, proporcionando el plásmido pCR®2.1-TOPO®-MVSchw-1-2-3 que contenía los fragmentos de MV Schwarz 1-3. Después de digestión con Notl/Narl de este plásmido, se insertó el fragmento que contenía el promotor T7, ribozima de cabeza de martillo y los 4922 primeros nucleótidos del antigenoma de MV Schwarz en el vector pTM digerido con Notl/Narl, proporcionando pTM-MVL. Al mismo tiempo, se ensamblaron conjuntamente los fragmentos 5 y 6 usando el sitio BsmBI en la secuencia de MV (Fig. 2) y el sitio BssHIl en la cadena principal del vector pCR®2.1-TOPO®, proporcionando el plásmido pCR®2.1-TOPO®-MVSchw-5-6 que contenía los fragmentos de MV Schwarz 5-6. Después de digestión con Spel/Apal de este plásmido, se insertó el fragmento que contiene los 6720 últimos nucleótidos del antigenoma de MV Schwarz, ribozima HDV y secuencias terminadoras de T7 en el vector pTM digerido con Spel/Apal, proporcionando pTM-MVT. Para el ensamblaje final, se prepararon 4 fragmentos y se ligaron conjuntamente: 1) un fragmento Sapl/Sapl de pTM-MVL (4367 nucleótidos de longitud) que contiene una parte de la cadena principal de pTM, el promotor T7, ribozima de cabeza de martillo y los 1813 primeros nucleótidos del antigenoma de MV, 2) un fragmento Sapl/Narl de pTM-MVL (3110 nucleótidos de longitud) que contiene los nucleótidos 1813-4923 del antigenoma de MV Schwarz, 3) un fragmento Narl/Spel de pCR®2.1-TOPO®-MVSchw-3 (4253 nucleótidos de longitud) que contiene los nucleótidos 4923-12157 del antigenoma de MV Schwarz, y 4) un fragmento Spel/Sapl de pTM-MVT (7235 nucleótidos de longitud) que contiene los nucleótidos 12157-15894 del antigenoma de MV Schwarz, ribozima HDV, terminador T7 y una parte de la cadena principal del vector pTM. Después del ligamiento y clonación, se obtuvieron varios constructos enteros. Se secuenció completamente el plásmido resultante, denominado pTM-MVSchw, (N° acceso CNCM I-2889). No se encontraron mutaciones entre este ADNc y la secuencia anteriormente reseñada de genoma Schwarz (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001.“Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage”. J. Virol. 75: 921-933; Parks, C. L, R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. “Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage”. J. Virol. 75: 910-920).
Recuperación de virus Schwarz infeccioso del plásmido pTM-MVSchw
Para recuperar el virus Schwarz del ADNc de pTM-MVSchw, se usó el sistema de recuperación basado en células auxiliares descrito por Radecke y col. (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dotsch, G. Christiansen y M. Billeter. 1995. “Rescue of measles viruses from cloned DNA”. EMBO Journal. 14: 5773-5784) y modificado por Parks y col. (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 1999. “Enhanced measles virus cDNA rescue and gene expression after heat shock”. J. Virol. 73: 3560-3566). Se transfectaron célu- las auxiliares humanas que expresaban establemente ARN polimerasa T7 y proteínas N y P del sarampión (células 293-3-46, dadas a conocer por Radecke y col. (17) usando el procedimiento de fosfato de calcio con plásmido pTM- MVSchw (5 |jg) y un plásmido que expresa el gen L polimerasa de MV (pEMC-La, 20 ng, dado a conocer por Radecke y col. (17). Después de cultivo durante una noche a 37°C, se reemplazó el medio de transfección por medio fresco y se aplicó un choque térmico (43°C durante 2 horas) (12). Después de 2 días de incubación a 37°C, se transfirieron las células transfectadas a una capa de células CEF y se incubaron a 32°C para evitar cualquier adaptación de la vacuna Schwarz que se seleccionó originalmente en células CEF y se cultiva actualmente en estas células por consideraciones de seguridad. Se prepararon las células fibroblásticas embrionarias de pollo (CEF) anteriores del modo siguiente. Se incubaron huevos de gallina fertilizados (EARL Morizeau, 8 rue Moulin, 28190 Dangers, Francia) a 38°C durante 9 días. Se recogieron de forma estéril los embriones. Se retiraron cabeza, miembros y vísceras, se seccionaron los embriones y se tripsinaron durante 5-10 minutos a 37°C (tripsina/EDTA 2,5 g/I). Después de la filtración (70 jm) y de varios lavados con DMEM rico en glucosa/10% de FCS, se sembraron las células (5-7 x 106 células/placa Petri) y se incubaron durante una noche a 37°C. Se recuperó fácilmente el virus infeccioso entre 3 y 7 días después del cocultivo. Aparecieron ocasionalmente sincicios en las CEF, pero no sistemáticamente. Se recuperó también el virus Schwarz mediante la misma técnica después del cocultivo de células auxiliares 293-3-46 transfectadas a 37°C con células Vero de primate (riñón de mono verde africano). En este caso, aparecieron sistemáticamente sincicios en todas las transfecciones después de 2 días de cocultivo. Para
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ensayar la adaptación vírica a células Vero, se pasó una preparación de virus Schwarz clonado recuperado en células Vero dos veces por células Vero. Se purificaron las partículas víricas y se transcribió de forma inversa el ARN vírico como se describe ante- riormente con los cebadores usados para la clonación (véase anteriormente). Se secuenció completamente el genoma vírico. Se encontraron dos cambios nucleotídicos de 15894 entre el virus recuperado/sometido a pase y el ADNc usado para transfección. Se encontraron estas mutaciones en 7 y 8 respectivamente de 10 clones diferentes de la misma región, indicando un alto porcentaje de mutación entre la población vírica. Además, ambas mutaciones dieron como resultado cambios aminoacídicos en la proteína de fusión (F): G^R en la posición 265 e Y^S en la posición 365.
En contraposición, la secuencia genómica del virus recuperado y sometido a pase en células CEF a 32°C era idéntica a la del virus Schwarz original. Esta observación indica que cambiar la célula hospedadora del virus Schwarz conduce a una rápida adaptación que puede afectar a las propiedades de la vacuna.
Capacidad de crecimiento del virus recuperado
Se analizó la capacidad del virus Schwarz recuperado de ADNc de crecer en células CEF y Vero y se comparó con la vacuna Schwarz en bruto industrial de la que derivaba (obtenida de Aventis Pasteur) y con el virus EdB-tag recuperado de su ADNc. Se infectaron monocapas de células Vero en placas de 6 pocillos con virus a diferentes multiplicidades de infección. Se rasparon las células en medio de cultivo en diversos puntos temporales post-infección (pi). Después de congelar y descongelar, se determinaron los títulos de infectividad midiendo el TCID50 en células Vero. Curvas de crecimiento: se infectaron monocapas de células Vero en placas de 6 pocillos con virus a diferentes multiplicidades de infección (MOI). En diversos puntos temporales post-infección (pi), se rasparon las células en medio de cultivo. Después de congelar y descongelar, se determinaron los títulos de infectividad midiendo el TCID50 en células Vero.
Titulo de TCID50: Se sembraron células Vero en placas de 96 pocillos (7500 células/pocillo) y se infectaron me- diante diluciones en serie 1:10 de muestra de virus en DMEM/5% de FCS. Después de la incubación a 37°C durante 4- 5 días para virus Ed-B y 7 días para virus Schwarz, se tiñeron las células con violeta cristal y se determinó la dilución vírica que daba como resultado infección en un 50% de las unidades de ensayo. Se calculó el punto final de 50% como dosis infectiva en cultivo de tejido (TCID50) mediante el procedimiento de Karber (Karber, G. 1931. “Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche”. Arch. Exp. Path. Pharmak. 162: 480-483). Ensayados en células Vero, las cinéticas de crecimiento de virus Schwarz y EdB-tag recuperados de sus ADNc respectivos eran similares (Fig. 3). La producción vírica de Schwarz en células Vero alcanzó altos rendimientos (107-108 TCID50/ml después de 2 días de infección usando una multiplicidad de infección de 0,01). Ensayados en células CEF, el virus Schwarz fue capaz de crecer tanto a 32°C como a 37°C, mientras que EdB-tag no (Fig. 3). Esta observación confirma que el virus del que se clonó EdB-tag no estaba adaptado a células CEF. El rendimiento de virus Schwarz en CEF era menor que en células Vero (106 TCID50/ml después de 4 días de infección usando una multiplicidad de infección de 0,05). Se observaron curvas de crecimiento similar y títulos similares cuando se infectaron células CEF con el virus Schwarz original del que se clonó (Fig. 3). Estas observaciones demuestran que el virus Schwarz recuperado de su ADNc tiene las mismas características de crecimiento que el lote de vacuna original del que se clonó.
Introducción de una unidad de transcripción adicional en ADNc de Schwarz
En el trabajo anterior que reseña la clonación de virus EdB-tag (17), los autores desarrollaron un procedimiento original para adaptar el ADNc vírico como vector adecuado para la expresión de transgenes extraños. Insertaron una unidad de transcripción adicional (ATU) en diferentes posiciones del genoma vírico. Esta ATU es una copia de la región intergénica N-P de MV que contiene las secuencias de acción en cis necesarias para la expresión dependiente de MV de un transgén insertado en un módulo de sitios de clonación múltiples. Ensayada en gran medida por los autores y nosotros mismos, la expresión de transgenes extraños insertados en esta ATU era muy eficaz, dependiendo de la posición de inserción en el genoma. Los diferentes genes de MV se expresan según un gradiente transcripcional en el genoma, conduciendo desde una alta expresión del gen N a una baja expresión del gen L (Lamb, R. y D. Kolakofsky. 1996. “Paramyxoviridae: the viruses and their replication”, pág. 1177-1199. En B. Fields, D. Knipe, y col. (ed.), “Fields Virology”. Lippincott-Raven Publishers, Filadefia).
La inserción de la ATU aprovecha este gradiente, permitiendo una alta o baja expresión del transgén dependiendo de la posición de inserción. Además, en este contexto, los transgenes extraños se expresan usando los mismos controles y rutas que los genes de MV auténticos.
Para transformar el ADNc de Schwarz como vector, se construyó una ATU similar que se insertó en dos posiciones diferentes del ADNc (Figura 4). Se secuenció el ADNc y no se encontraron mutaciones.
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Inmunogenicidad de MV Schwarz recuperado de ADNc
Primer experimento: comparación con la vacuna Schwarz
Se comparó la inmunogenicidad del virus recuperado del plásmido pTM-MVSchw y sometido dos veces a pase en células CEF con la inmunogenicidad de la vacuna Schwarz en macacos cinomolgos. Las condiciones de pase fueron las siguientes:
- Después de la recuperación, se seleccionaron sincicios aislados de las células CEF cocultivadas con células auxiliares 293-3-46 y se diluyó un solo sincicio en 600 pl de OptiMEM 1 (Gibco) y se pasó por vórtex. Se usó el inóculo para infectar células CEF recientes (80-90% confluentes) en un pocillo de 35 mm o un matraz T-25. Después de 2 horas de adsorción a 37°C, se reemplazó el inóculo por DMEM/5% de FCS y se incubaron las células a 32°C durante 1-2 días. Cuando aparecieron sincicios pequeños, se expandieron las células infectadas a matraces T-75: se lavaron las células con PBS y se desprendieron con PBS/EDTA 1 mM/0,25% de tripsina durante 1 minuto, se transfirieron después a matraces T-75 junto con células CEF recientes (1/4 de un cultivo de matraz T-75 confluente). Después de 4-7 días de incubación a 32°C en DMEM/5% de FCS, se recogió el virus (pase 1): se retiró el medio de cultivo y se rasparon las células infectadas en 3 ml de OptiMEM 1. Después de un ciclo de congelación y descongelación, se desecharon los desechos celulares mediante centrifugación (1500 rpm, 5 minutos, temperatura ambiente). Se mantuvo congelada esta provisión de semillas a -80°C y se usó para infectar CEF recientes del mismo modo que se prepara la provisión de 2 pases.
Se ensayaron diferentes formulaciones de la vacuna usando tanto la preparación en bruto sin pases de Aventis Pasteur como la misma preparación sometida a dos pases en células CEF. Se prepararon los virus del modo siguiente: se infectaron células CEF (obtenidas a partir de embriones de pollo incubados durante 9 días) a una MOI de 0,05 y se incubaron a 32°C durante 7 días. Se purificaron los virus mediante raspado de células infectadas, congelación/descongelación y clasificación a baja velocidad de los desechos celulares. Se obtuvieron de Aventis Pasteur los agentes estabilizantes en la preparación de vacuna de MV. Se compararon diferentes preparaciones de vacuna en bruto con y sin agentes estabilizantes a la misma dosis con el producto final liofilizado (Rouvax, Aventis Pasteur). Se titularon todas las preparaciones de vacuna usando el procedimiento TCID50 en células Vero. Se inyectó por vía subcutánea a monos y se tomaron muestras de sangre a diferentes puntos temporales. Para comparar las respuestas tanto humoral como celular, se buscó la presencia de anticuerpos anti-MV en sueros mediante ELISA (Trinity Biotech, EE.UU.) y se buscó la presencia de linfocitos T anti-MV mediante ELISPOT en PBMC.
Segundo experimento: comparación con la cepa EdB-tag
Macacos rhesus criados en colonias (Macaca mulatta) o cinomolgos (Macaca fascicularis) que fueron seronegativos para retrovirus de simio tipo D, virus de simio linfotrópico de células T, virus de la inmunodeficiencia simia y virus del sarampión fueron acomodados de acuerdo con la “American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care”. Diferentes dosis (103-105 TCID50) de EdB-tag o Schwarz MV diluido en OptiMEM (GibcoBRL) o con 104 TCID50 de la vacuna Rouvax MV liofilizada (Aventis Pasteur, Marcy l'Etoile, Francia) diluida en la disolución proporcionada por el proveedor fueron inoculadas a los monos por vía subcutánea. Se tomaron muestras de sangre en diferentes momentos después de la inoculación.
Se buscó la presencia de anticuerpos anti-MV en el suero mediante ELISA (Trinity Biotech, EE. UU.) un mes después de la vacunación. Cada determinación se realizó por triplicado con una dilución 1/20 de muestras de suero. Se utilizó una mezcla de 5 muestras de monos negativos como control negativo. Para determinar la relación del estado inmune (ISR) de cada muestra, la absorbancia del control negativo se restó de la absorbancia de la muestra positiva y el resultado se dividió por la absorbancia de un patrón suministrado en el kit de ELISA, según lo recomendado por el proveedor. Solo los valores de ISR superiores a 0,9 se consideraron positivos en esta prueba.
Las respuestas inmunes celulares se determinaron mediante ensayos ELISpot de IFN-y. Las PBMC congeladas se descongelaron y se incubaron durante la noche en RPMI, 10% FCS y 4 U/ml de rh-IL2 (Boehringer Mannheim). Se recubrieron placas de 96 pocillos Multiscreen-HA durante la noche a 4°C con 4 pg/ml de anti-IFN-Y de captura (GZ-4, MAbTech) en PBS, se lavaron, luego se incubaron con 100 pl de RPMI, 10% FCS durante 1 h a 37°C. El medio se reemplazó por 5 x 105 PBMC en suspensión en 100 pl de RPMI-10% de FCS y 100 pl de agente estimulante. El agente estimulante consistió en 107 pfu de vacuna recombinante Ankara modificada (32) MVA-Hmv o MVA-wt como control. Las células se estimularon durante 24 h a 37°C. Se usó fitohemaglutinina A (2,5 pg/ml, Sigma) como control positivo y RPMI como control negativo. Las placas se lavaron dos veces con PBS, 4 veces con PBS, 0,05% Tween 20 (Sigma) y dos veces nuevamente con PBS. Se añadió un anticuerpo anti-IFN-Y biotinilado (7-B6-1, MabTech, 100 pl, 1 pg/ml en PBS) y las
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placas se incubaron durante 2-4 horas a 37°C. Se añadió conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (AP) (Roche, 100 |jl, dilución 1/2000 en PBS) y se revelaron las manchas con BCIP/NBT (Promega) en Tris 1 M, pH 9,5, NaCI 1,5 M, MgCl2 0,05 M. Después de secar durante la noche a temperatura ambiente, se contaron las manchas usando un sistema de análisis de imágenes automatizado (ELISpot Reader, Bio-Sys). El bajo fondo obtenido después de la estimulación de MVA-wt se restó y los resultados se expresaron como células productoras de IFN-y específicas de MVA-HMV por millón de PBMC.
Inmunización de ratones y caracterización de respuestas inmunes humorales. Se cruzaron ratones FVB heterocigotos para el transgén CD46 (33) con ratones 129sv IFN-a/pR^ que carecen del receptor de interferón tipo I (30). La progenie F1 se cribó mediante PCR y los animales CD46 +/- se cruzaron de nuevo con 129sv de ratones IFN-a/pR_/\ Se seleccionaron animales IFN-a/pR^ CD46 +/- y se usaron para experimentos de inmunización. Estos ratones son susceptibles a la infección por VM (27, 29). Se inoculó 104 TCID50 de las diferentes preparaciones de vacuna (4 ratones por grupo) por vía intraperitoneal a ratones femeninos CD46+/_ o CD46+/_ IFN-a/pR^ (IFNAR) de seis semanas de edad. Se buscó la presencia de anticuerpos anti-MV mediante ELISA (Trinity Biotech, EE. UU.) en sueros recogidos un mes después de la vacunación. En este caso, se usó un IgG anti Igb de ratón (Amersham) como anticuerpo secundario. Cada determinación se realizó por triplicado. La absorbancia determinada con una mezcla de sueros de ratones negativos se restó de la absorbancia medida en ratones positivos. Debido a que no fue posible en este caso utilizar el ISR para comparar muestras, se analizaron diluciones seriadas de sueros de ratones para determinar el límite final de la dilución positiva.
RESULTADOS
Comparación de respuestas inmunes humorales después de la vacunación de macacos y ratones con vacunas EdB-tag y Schwarz MV. EdB-tag MV es una MV molecularmente clonada derivada de la cepa Edmonston B (16). Hemos comparado su inmunogenicidad en macacos con la de la vacuna de MV comercial de Schwarz. El virus EdB-tag se preparó en células Vero infectadas a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,05. Cuando los sincitios ocuparon el 80-90% del cultivo, las células se rasparon, las células y el medio se congelaron/descongelaron y los desechos celulares se eliminaron mediante centrifugación a baja velocidad. Se preparó el Schwarz MV, obtenido de Aventis Pasteur (Marcy l'Etoile, Francia), de la misma manera a partir de fibroblastos de embrión de pollo infectados (CEF) cultivados a 32°C, temperatura a la que esta cepa se adaptó a CEF. Los títulos de ambas preparaciones de vacuna se determinaron mediante ensayos de dilución de punto final en células Vero y se expresaron como TCID50. Se inyectaron diferentes dosis (103 a 105 TCID50) de EdB- tag y Schwarz MV por vía subcutánea a macacos (2 monos por dosis). Como control, a los animales también se les inyectó 104 TCID50 de la vacuna Schwarz comercial liofilizada (Rouvax, Aventis Pasteur). Los niveles de anticuerpos anti-MV se determinaron mediante ELISA en sueros de macacos recogidos un mes después de la vacunación. Los macacos inoculados con 103 y 104 TCID50 de Schwarz MV tenían niveles de anticuerpos similares a los inducidos por una dosis estándar de vacuna Rouvax (Fig. 6). Los macacos inoculados con 104 TCID50 de virus EdB-tag permanecieron negativos (no se muestran). La inyección de una dosis diez veces mayor (105 TCID50) indujo solo una respuesta débil que fue menor que la observada con 103 TCID50 de Schwarz MV (Fig. 6). La vacunación con la vacuna comercial indujo la mejor respuesta probablemente debido al efecto adyuvante de la liofilización.
Las diferentes preparaciones de vacunas también se probaron en ratones genéticamente modificados obtenidos como se describe en Materiales y Métodos. Se usaron dos tipos de ratones: ratones que expresan CD46 (33), el receptor humano para cepas de vacuna MV (34) y ratones que expresan CD46 y carecen del receptor de IFN tipo I (29). Se inocularon ratones de seis semanas de edad intraperitonealmente con 104 TCID50 de las diferentes preparaciones de vacuna (4 ratones por grupo). La Figura 7 muestra la detección de anticuerpos anti-MV en sueros de ambos tipos de ratones recogidos un mes después de la vacunación. En ratones CD46, el virus EdB-tag fue menos inmunogénico que la vacuna Schwarz. El título promedio obtenido con el primero fue 1/80, mientras que fue 1/1280 con el segundo. El virus EdB-tag también era menos inmunogénico en ratones CD46 que carecían del receptor de IFN tipo I pero la diferencia era menos pronunciada que en ratones inmunocompetentes CD46, indicando posiblemente una diferencia en la sensibilidad a IFN a/p entre las dos cepas víricas.
Inmunogenicidad de Schwarz MV recuperado de ADNc. Se comparó la inmunogenicidad para macacos cinomolgos del virus rescatado del plásmido pTM-MVSchw y sometidos a dos pases en células CEF o Vero con la de la vacuna industrial Schwarz. Los macacos cinomolgos se usaron en este experimento debido a la dificultad de obtener macacos rhesus de China que fueran MV negativos. Estos macacos son tan sensibles a MV como los macacos rhesus, como se muestra en varios estudios (28, 26). Se inyectaron los monos (2 animales por preparación) subcutáneamente con 104 TCID50 de la vacuna Schwarz MV de Aventis o Schwarz MV rescatados del plásmido pTM-MVSchw y se cultivaron en células CEF o Vero. La presencia de anticuerpos anti-MV se determinó en sueros recogidos en diferentes momentos (Fig. 8). Todos los macacos vacunados se volvieron positivos. No se observó diferencia estadísticamente significativa, uno o
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dos meses después de la inmunización, entre las diferentes preparaciones de vacuna probadas. Este resultado demuestra que el virus rescatado del plásmido pTM-MVSchw tiene la misma inmunogenicidad en primates no humanos que la vacuna parental Schwarz. No se detectaron diferencias entre los virus rescatados cultivados en células CEF o Vero, lo que indica que las dos mutaciones generadas en la proteína F por los pases en células Vero no afectaron la inmunogenicidad del virus.
Se observaron cambios en el número total de glóbulos blancos (WBC), linfocitos y monocitos durante el primer mes después de la inoculación (Fig. 9). Hubo leucopenia leve durante la primera semana, como se observó previamente después de la vacunación con MV (1). Durante la segunda semana, se observó un claro aumento en el número de linfocitos circulantes y monocitos. Coincidió con un pico del número de linfocitos T específicos de MV detectados por un ensayo ELISpot de IFN-y (Fig. 9D). No se detectó ninguna diferencia estadísticamente significativa entre las respuestas inmunitarias celulares específicas inducidas por el MV Schwarz rescatado del plásmido y la vacuna Schwarz preparada por Aventis.
DISCUSIÓN
En el presente trabajo describimos la clonación y el rescate de la cepa atenuada Schwarz/Moraten del virus del sarampión, constituyente de dos vacunas contra el sarampión ampliamente utilizadas, Attenuavax (Merck and Co. Inc., West Point, EE. UU.) y Rouvax (Aventis Pasteur, Marcy l'Etoile, Francia), y de la vacuna combinada contra el sarampión, las paperas y la rubéola (MMR) (35). Para ser utilizado en un ensayo clínico pediátrico, una MV atenuada viva producida a partir de un ADNc debe ser tan segura y eficiente como la vacuna parental. Suponiendo que la seguridad y la eficiencia dependen en última instancia de la secuencia genómica de la cepa atenuada, clonamos el ADNc de MV Schwarz a partir de partículas víricas preparadas a partir de un lote industrial de vacuna utilizando procedimientos optimizados para la fidelidad de la clonación. Como resultado, la secuencia del clon que obtuvimos fue idéntica a la del genoma de Schwarz MV parental. Para maximizar el rendimiento durante el rescate, el ADNc antigenómico viral se colocó bajo el control de un promotor T7 de ARN polimerasa con el motivo GGG necesario para una eficacia completa. Se insertó una ribozima de cabeza de martillo entre este motivo GGG y el primer nucleótido viral para permitir la escisión exacta del ARN vírico. Con el fin de evitar la adaptación de la vacuna Schwarz a células no certificadas durante el rescate, las células auxiliares transfectadas con el ADNc modificado se cocultivaron con CEF, las células en las que originalmente se seleccionó esta vacuna y se prepara actualmente. El virus rescatado fue sometido a dos pases en CEF y su genoma fue completamente secuenciado. No se encontró ninguna mutación cuando la secuencia se comparó con la del virus original. Además, la cinética de crecimiento y el rendimiento del virus rescatado y el virus Schwarz original en CEF fueron idénticos.
El virus Schwarz también se rescató después del cocultivo de células cooperadoras transfectadas con células Vero, que son muy permisivas para MV. En este caso, sin embargo, aparecieron dos mutaciones en la proteína de fusión viral (F) después de dos pases en células Vero. Esta adaptación rápida se correlacionó con un fenotipo mucho más fusogénico en las células Vero. En contraste, el MV de Schwarz rescatado no fue fusogénico en CEF (solo se pudieron observar poco frecuentes sincitios en CEF infectado). Las dos mutaciones ocurrieron en la proteína F (G->R en la posición 266 e Y->S en la posición 365). Estas mutaciones están presentes en el virus EdB-tag (ver Figura 6) que crece en células Vero. También están presentes en la cepa Hallé, que está muy relacionada con la cepa Edmonston y no infecta a CEF (31). Estas dos mutaciones parecen correlacionarse con la fusión mejorada en células Vero. La rápida adaptación de la proteína F después de solo dos pases del virus Schwarz en células Vero muestra que para mantener su integridad genética, la vacuna debe cultivarse en CEF.
El virus rescatado del plásmido pTM-Schw tenía la misma inmunogenicidad en macacos que la vacuna parental Schwarz. Es importante enfatizar que en estos experimentos los macacos fueron inoculados con la dosis baja de virus utilizada para la inmunización humana. Por lo tanto, será posible llevar a cabo ensayos clínicos en humanos con este virus usando dosis de vacuna estándar (104 TCID50). Por el contrario, EdB-tag MV previamente clonado no era inmunogénica en macacos y poco inmunogénica en ratones transgénicos para CD46, cuando se usaba a la misma dosis que la MV Schwarz clonada.
¿Cuál podría ser el motivo de la mayor inmunogenicidad de la cepa Schwarz MV? Inducir una buena inmunogenicidad con una vacuna vírica atenuada requiere la replicación en los tejidos a un nivel lo suficientemente alto como para preparar adecuadamente el sistema inmune. Varias de las mutaciones entre los genomas de Schwarz y EdB-tag MV se encuentran en los genes P/V/C y L, lo que sugiere una diferencia en la eficacia de la replicación. Es posible que el Schwarz MV se replique en células linfoides in vivo más eficientemente que el EdB-tag MV a pesar de que se replicaron a la misma velocidad en células Vero. La replicación eficiente in vivo requiere algún mecanismo de evasión de la respuesta de IFN- a/p. Las células Vero, en las que se adaptó el virus EdB-tag, no responden a la estimulación con IFN-a/p. Por lo tanto, la EdB-tag MV se seleccionó en ausencia de una respuesta de IFN-a/p y podría ser particularmente sensible a este mecanismo de defensa del huésped. De hecho, se ha demostrado que pasar MV nativo en células Vero cambia el fenotipo
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del virus de IFN-no-inductor a IFN-inductor (36). Además, el hecho de que Ed-tag MV fuera inmunogénico en ratones transgénicos para el receptor CD46, siempre que también fueran inactivados para el receptor de IFN-a/p, sugiere que este virus es particularmente sensible a IFN. Curiosamente, la respuesta de IFN-a/p ayuda a preparar la respuesta inmune específica contra la vacuna. Por lo tanto, una buena vacuna viva debe inducir al mismo tiempo una respuesta de IFN-a/p y evadirla hasta cierto punto. Por esta razón, seleccionar vacunas virales atenuadas en células primarias con una fuerte respuesta a IFN-a/p, como CEF, podría ser una buena estrategia.
Los productos de MV que contribuyen a la resistencia a IFN no han sido identificados. Sin embargo, se ha demostrado que la proteína C no estructural del estrechamente relacionado virus Sendai contrarresta el estado antivírico inducido por IFN (37). Las 5 mutaciones no relacionadas con ningún subgrupo de Edmonston que hemos encontrado en el gen EdB- tag P/V/C podrían ser responsables de su baja inmunogenicidad en macacos. Por otro lado, las dos mutaciones generadas en la proteína F al pasar el virus Schwarz sobre las células Vero no afectaron su potencial inmunitario, lo que indica que la propiedad fusogénica de las proteínas de la envoltura vírica puede no desempeñar un papel significativo en la inmunogenicidad.
El plásmido pTM-MVSchw se diseñó para la expresión de genes foráneos mediante la introducción de dos ATU en diferentes posiciones del genoma. La MV recombinante rescatada de Schwarz expresó la proteína verde fluorescente, mostrando así que esta nueva vacuna contra el sarampión funciona como un vector. En conclusión, este clon molecular permitirá producir la vacuna MV sin tener que depender de las existencias de semillas. Con sus ATUs, será posible usarlo como un vector para producir vacunas recombinantes basadas en una cepa de vacuna aprobada, eficiente y utilizada en todo el mundo.
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Claims (5)
- 510152025303540455055Reivindicaciones1. Un proceso para la preparación de una molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de un virus del sarampión (MV) que se origina de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, que comprende los siguientes pasos:- purificar el ARN vírico a partir de partículas víricas de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten; y- obtener la molécula de ADNc por transcripción inversa del ARN vírico purificado,en el que la molécula de ADNc obtenida se dispone bajo el control de una secuencia heteróloga de control de expresión apropiada para la transcripción de la cadena ARN(+) antigenómica partiendo de la molécula de ADNc, y en particular una secuencia heteróloga de control de expresión de dicho ADNc que comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7, y en el que la molécula de ADNc obtenida comprende adicionalmente, en su extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómico infeccioso completa, la secuencia de una ribozima de virus de hepatitis delta.
- 2. Proceso según la reivindicación 1, en el que la molécula de ADNc obtenida se modifica mediante deleción o sustituciones de varios nucleótidos con respecto a la cadena ARN(+) de la cepa Schwarz o la cepa Moraten, con la condición de que el ADNc resultante cumpla con la regla de seis.
- 3. Un proceso para la preparación de partículas del virus del sarampión infecciosas, que comprende:1) purificar el ARN vírico a partir de partículas víricas de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten; y2) obtener una molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de un virus del sarampión (MV) que se origina de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, por transcripción inversa del ARN vírico purificado,en el que la molécula de ADNc obtenida se dispone bajo el control de una secuencia heteróloga de control de expresión apropiada para la transcripción de la cadena ARN(+) antigenómica partiendo de la molécula de ADNc, y en particular una secuencia heteróloga de control de expresión de dicho ADNc que comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7, y en el que la molécula de ADNc obtenida comprende adicionalmente, en su extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa de la cepa de vacuna Schwarz o de la cepa de vacuna Moraten, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena ARN(+) antigenómica infecciosa completa, la secuencia de una ribozima de virus de hepatitis delta, proporcionando de este modo un ADNc recombinante;3) expresar dicho ADNc recombinante en una línea de células auxiliares que expresa también las proteínas necesarias para la transcripción, replicación y encapsidación de la cadena ARN(+) antigenómica del virus del sarampión, partiendo de dicho ADNc y en condiciones que posibilitan el ensamblaje de partículas víricas; y4) recuperar las partículas víricas expresadas,en el que las células auxiliares derivan por ejemplo de la línea de células de riñón embriónico humano 293 (ATCC CRL- 1573).
- 4. Un proceso según la reivindicación 3, que comprende:1) transfectar células auxiliares con dicho ADNc recombinante, en el que dichas células auxiliares son capaces de expresar funciones auxiliares para expresar una ARN polimerasa y para expresar las proteínas N, P y L del virus MV;2) cocultivar dichas células auxiliares transfectadas de la etapa 1) con células sometidas a pases, adecuadas para el paso de la cepa de vacuna de MV de la que se origina el ADNc, por ejemplo, células CEF; y3) recuperar las partículas víricas de MV infecciosas producidas,en el que opcionalmente la etapa de transfección es seguida por la sustitución del medio de transfección por medio nuevo y la aplicación de un choque térmico antes de la incubación.
- 5. Un proceso según la reivindicación 3 ó 4, que se usa para la producción de virus de sarampión infeccioso apropiado para uso como principio activo en una composición de vacuna.
imagen1 FIGURA 1FIGURA 2pTM-MVSchwSmalNotlínlhh]BlpI®SbflG>1 (2173 bp) ~|KasI(3)1 (3142 bp) |®CH N [| P/V/C fl Mi—rkb OT2TSpel(4349 bp)®C(6200 bp)Hi—i—rT10TnX12T13BsmB I__LNotl EagIa>imagen2 T7lApalT14T15116imagen3 FIGURA 3FIGURA 4AA A - TAO - H trf aYXAAAAAICIT lAQCi/JwCCAOÓTlCCA-^POLiLlGAOOR^-wsERTÓ-lpotjuGA^OPy- tf -{Tf ATAAAA>U|(^lMAÓ&AAOTV // - ATO -Inicio/terminación^ Inicio/terminación ^Unidad de Transcripción Adicional Posición 2ABO © 0imagen4 T7=promotor de ARN pol. T7; T7t=terminador de ARN pol. T7; hh=ribozima de cabeza de martillo d=r¡bozima en dirección genómica del virus de hepatitis delta (HDV); plásmido=pTM 1, 2,3= unidades de transcripción adicionales (ATU)FIGURA 4BSecuencia de ATU:actagcctaccctccatcattgttataaaaaacttaggaaccaggtccacacagccgccagcccatcaacgcgtacgtagcgcgcATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAGtgagcgcgcagcgctgacgtctcgcgatCgatgctagcFIGURA 5At w I | 30 | 40 | so1 GCGGCCGCTA ATACGACTCA CTATAC-GGcc aactttgttt ggtctgatga 101 AGGATAGTTC AATCAATGAT CATCTTCTAG TGCACTTAGG ATTCAAGATC 201 TTTAAGGAGC TTAGCATTGT TCAAAAGAAA CAAGGACAAA CCACCCATTA 301 CCAATCCCTG GAGATTCCTC AATTACCACT CGATCCAGAC TTCTGGACCG 401 GGGCACTAAT AGGTATATTA TCCTTATTTG TGGAGTCTCC AGGTCAATTG 501 TGTCCAGAGT GACCAGTCAC AATCTGGCCT TACCTTCGCA TCAAGAGGTA 601 AGTAGTGATC AATCCAGGTT CGGATGGTTC GGGAACAAGG AAATCTCAGA 701 TAGCCCAAAT TTGGGTCTTG CTCGCAAAGG CGGTTACGGC CCCAGACACG 801 GGTAGTTGG? GAATTTAGAT TGGAGAGAAA ATGGTTGGAT GTGGTGAGGA 901 CTGGATATCA AGAGAACACC CGGAAACAAA CCCAGGATTG CTGAAATGAT 1001 TGACTATTAA GTTTGGGATA GAAACTATGT ATCCTGCTCT TGGACTGCAT 1101 GCAAATGGGG GAAACTGCAC CCTACATGGT AATCCTGGAG AACTCAATTC 1201 GGAGTAGGAG TGGAACTTGA AAACTCCATG GGAGGTTTGA ACTTTGGCCG 1301 GGTCAGCTGG AAAGGTCAGT TCCACATTGG CATCTGAACT CGGTATCACT 1401 CAAGATCAGT AGAGCGGTTG GACCCAGACA AGCCCAAGTA TCATTTCTAC 1501 AGGAGGGTCA AACAGAGTCG AGGAGAAGCC AGGGAGAGCT ACAGAGAAAC 1601 CACCCCTAGA CATTGACACT GCAACGGAGT CCAGCCAAGA TCCGCAGGAC 1701 CTCGGAAGAA CAAGGCTCAG ACACGGACAC CCCTATAGTG TACAATGACA 1801 CTñCCATCCA TCATTGTTAT AAAAAACTTA GGAACCAGGT CCACACAGCC 1901 CAGGCACGCC ATGTCAAAAA CGGACTGGAA TGCATCCGGG CTCTCAAGGC 2001 AAA7ATCAGA CAACCCAGGA CñGGAGCGAG CCACCTGCAG GGAAGAGAAG 2101 TGAAGGCGG? GCACCTCGCA TCCGCGGTCA GGGACCTGGA GAGAGCGATG 2201 ACTGGGTTAC AGTGTTATTA CGTTTATGAT CACAGCGG7G AAGCGGT7AA 2301 ATAGCACCCT CTCAGGAGGñ GACAATGAAT CTGAAAACAG CGATGTGGAT 2401 TCCCATCTC7 ATGGGGTTCA GGGCT7CTGA TGTTGAAACT GCAGAAGGAG 2501 AAGCTTGGGA AAAC7CTCAA TGTTCCTCCG CCCCCGGACC CCGGTAGGGC 2601 CATTTGGAAC GGAGATCGCG TCTTTATTGA CAGGTGGTGC AACCCAATGT 2701 TGTCCCCGAG TGTGTGAGCA A7GCCGCACT GATACAGGAG TGGACACCCG 2801 GACTATTATG ATGATGAGCT GTTCTCTGAT GTCCAAGATA TTAAAACAGC 2901 CACTGCTGT7 ATTGAAGGGA GAAGTTGAGT CAATTAAGAA GCAGATCAAC 3001 GATCGCCATT CCTGGACTTG GGAAGGATCC CAACGACCCC ACTGCAGATG 3101 GCAC7GGCCG AAGTTCTCAA GAAACCCG7T GCCAGCCGAC AACTCCAAGG 3201 AGCTAAAGCC GA7CGGGAAA AAGATGAGCT CAGCCGTCGG GTTTGTTCCT 3301 CCGGCTAGAG GAGGATCGGA AGCGTTACCT GATGACTCTC CTTGATGATA 3401 ATAA7GAAG7 AGCTACAGCT CAACTTACCT GCCAACCCCA TGCCAGTCGA 3501 TTGCCTCCCA AGGTCCACAA TGACAGAGAC CTACGACTTC GACAAGTCGG 3601 GA7GGCAGGC TGGTGCCCCA GGTCAGAGTC ATAGATCCTG GTCTAGGCGA 3701 ACAGCGATTC CCTAGGGCCT CCAATCGGGC GAGCATTTGG GTTCCTGCCC 3801 CACTGAGCTT GACATAGTTG TTAGACGTAC AGCAGGGC7C AATGAAAAAC 3901 GTCCTAACAA CAGGGAGTGT CTTCAACGCA AACSíCÁGTGT GCAATGCGGTI 60 I 70 | 80 I 90 l 100gtccgtgagg acgaaacccg gagtcccggg tcACCAAACA AAGTTGGGTA 100 CTATTATCAG GGACAAGAGC AGGATTAGGG ATATCCGAGA TGGCCACACT 200 CATCAGGATC CGGTGGAGCC ATCAGAGGAA TCAAACACAT TATTATAGTA 300 5TTGGTGAGG TTAATTGGAA ACCCGGATGT GAGCGGGCCC AAACTAACAG 400 ATTCAGAGGA TCACCGATGA CCCTGACGTT AGCATAAGGC TGTTAGAGGT S00 CCAACATGGA GGATGAGGCG GACCAATACT TTTCACATGA TGATCCAATT 600 TATTGAAGTG CAAGACCCTG AGGGATTCAA CATGATTCTG GGTACCATCC 700 GCAGCTGATT CGGAGCTAAG AAGGTGGATA AAGTACACCC AACAAAGAAG 800 ACAGGATTGC CGAGGACCTC TCCTTACGCC GATTCATGGT CGCTCTAATC 900 A7GTGACATT GATACATATA TCGTAGAGGC AGGATTAGCC AGTTTTATCC 1000 GAATTTGCTG GTGAGTTATC CACACTTGAG TCCTÍGATGA ACCTTTACCA 1100 AGAACAAGTT CAGTGCAGGA TCATACCCTC TGCTCTGGAG CTATGCCATG 1200 ATCTTACTTT GATCCAGCAT ATTTTAGATT AGGGCAAGAG ATGGTAAGGA 1300 GCCGAGGATG CAAGGCTTGT TTCAGAGATT GCAATGCATA CTACTGAGGA 1400 ACGGTGATCA AAGTGAGAAT GAGCTACCGA GATTGGGGGG CAAGGAAGAT 1500 CGGGCCCAGC AGAGCAAGTG ATGCGAGAGC TGCCCATCTT CCAACCGGCA 1600 AGTCGAAGGT CAGCTGACGC CCTGCTTAGG CTGCAAGCCA TGGCAGGAAT 1700 GAAATCTTCT AGACTAGGTG CGAGAGGCCG AGGGCCAGAA CAACATCCGC 1800 GCCAGCCCAT CAACCATCCA CTCCCACGAT TGGAGCCAAT GGCAGAAGAG 1900 CGAGCCCATC GGCTCACTGG CCATCGAGGA AGCTATGGCA GCATGGTCAG 2000 GCAGGCAGTT CGGGTCTCAG CAAACCATGC CTCTCAGCAA TTGGATCAAC 2100 ACGACGCTGA AACTTTGGGA ATCCCCCCAA GAAATCTCCA GGCATCAAGC 2200 GGGAATCCAA GATGCTGACT CTATCATGGT TCAATCAGGC CTTGATGGTG 2300 ATTGGCGAAC CTGATACCGA GGGATATGCT ATCACTGACC GGGGATCTGC 2400 GGGAGATCCA CGAGCTCCTG AGACTCCAAT CCAGAGGCAA CAACTTTCCG 2500 CAGCACTTCC GGGACACCCA TTAAAAAGGG CACAGACGCG AGATTAGCCT 2600 GCTCGAAAGT CACCCTCGGA ACCATCAGGG CCAGGTGCAC CTGCGGGGAA 2700 AATCTGGTAC CACAATCTCC CCGAGATCCC AGAATAATGA AGAAGGGGGA 2800 CTTGGCCAAA ATACACGAGG ATAATCAGAA GATAATCTCC AAGCTAGAAT 290C AGGCAAAATA TCAGCATATC CACCCTGGAA GGACACCTCT CAAGCATCAT 300C TCGAAATCAA TCCCGACTTG AAACCCATCA TAGGCAGAGñ TTCAGGCCGA 3100 AATGACAAAT GGACGGACCA GTTCCAGAGG ACAGCTGCTG AAGGAATTTC 3200 GACACCGGCC CTGCATCACG CAGTGTAATC CGCTCCATTA TAAAATCCAG 3300 TCAAAGGAGC CAATGATCTT GCCAAGTTCC ACCAGATGCT GATGAAGATA 3400 CCCAACTAGT ACAACCTAAA TCCATTATAA AAAACTTAGG AGCAAAGTGA 3500 CATGGGACAT CAAAGGGTCG ATCGCTCCGA TACAACCCAC CñCCTACAGT 3600 CAGGAAGGAT GAATGCTTTA TGTACATGTT TCTGCTGGGG GTTGTTGAGG 3700 TTAGGTGTTG GCAGATCCAC AGCAAAGCCC GAAAAACTCC TCAAAGAGGC 3800 TGGTGTTCTA CAACAACACC CCACTAACTC TCCTCACACC TTGGAGAAAG 3900 TAATCTGATA CCGCTCGATA CCCCGCAGAG GTTCCGTGTT GTTTATATGA 4000FIGURA 5B4001 GCATCACCCG TCTTTCGGAT 4101 TAGGATTGAC AAGGCGATAG 4201 AAGAGTGAAG TCTACTCTGC 4301 GAAGCACAGG CAAAATGAGC 4401 ACTCTGGAGG AGCAGATGCA 4501 GACCAAGGAC TATTCAAAGT 4601 CCTCCGAAAG ACTCCACGGA 4701 CACCACCAGC CACCCCAA7C 4801 CCCGGGAAAG AAACCCCCAG 4901 GCAGGCATCC GACTCCCTAG 5001 CACGGCGCCG CGCCCCCAAC 5101 GACCCAGCAC CCAACCATCG 5201 CACACACGAC CACGGCAACC 5301 GCACCCCAGC CCCGATCCGG 5401 CAGCCTCTCC AAGTCCCCCG 5501 ACCGGGAATC CCAGAATCAA 5601 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TTTGCTAAAA TGACTTACAA AATGAGGGCA TGCCAAGTGA TTGCTGAAAA 11000 AGGATGAGCA CGATTTGACT AAGGCACTCC ACACTCTAGC TGTCTCAGGA 11100 CTACTCCCGA AGCCCAGTCC ACACAAGTAC CAGGAACGTG AGAGCAGCAA 11200 CATCCGGAGA ATATGGAAGC TTACGAGACA GTCAGTGCA7 TTATCACGAC 11300 TTGCACAGAG GCTAAATGAG ATTTACGGAT TGCCCTCATT TTTCCñGTGG 11400 CCCCCCCGAC CTTGACGCCC ATATCCCGTT ATATAAAC-TC CCCAATGATC 11500 CTGTGGACCA TCAGCACCAT TCCCTATCTA TACCTGGCTG CTTATGAGAG 11600 TAACAAAAAG GGTACCCAGC ACATGGCCCT ACAACCTTAA GAAACGGGAA 11700 TGATATTGGC CATCACCTCA AGGCAAATGA GACAATTGTT TCATCACATT 11800 TCACTCAAGA GCATCGCAAG ATG7GTATTC TGGTCAGAGA CTATAGTTGA 11900 TCGAGAGAGG TTATGACCGT TACCTTGCAT ATTCCCTGAA CGTCCTAAAA 12000 GACCCGGGAT GTAGTCATAC CCCTCCTCAC AAACAACGAC CTCTTAATAA 12100 AGCAGGCTGT TTGTCAGAAA CATCGGTGAT CCAGTAACAT CATCAATTGC 12200 ATCAAGTAAT GACACAACAA CCGGGGGACT CTTCATTCCT AGACTGGGCT 12300 CCTCAAGAAC ATAACTGCAA GGTTTGTCCT GATCCATAG7 CCAAACCCAA 12400FIGURA 5D12401 TGTTAAAAGG ATTATTCCA7 GATGACAGTA AAGAAGAGGA CGAGGGACTG 12501 AATCCTGGAT CATAGTGTCA CAGGGGCAAG AGAGTCTATT GCAGGCATGC 12601 ACCTCTCGAG TGATAACCAG ATTGTCCAAT 7A7GACTATG AACAATTCAG 12701 AAGAGTCATG TTCAGTGCAG CTGGCGAGAG CTCTAAGAAG CCATATGTGG 12601 ACTAGAATCT ATGCGAGGCC ACCTTATTCG GCGTCATGAG ACATGTGTCA 12901 TGCCAACTGG ATGATATTGA CAAGGAAACA TCATCCTTGA GAGTCCCATA 13001 GAGCCCCAAG 7CGATCCTTG CGATCTGCTG T7AGAATAGC AACAGTGTAC 13101 GGCTAGGCAA AGGGCCAATG TGAGCCTGGA GGAGCTAAGG GTGATCACTC 13201 CAAGTGAAAT ACTCAGGTAC ATCCCTTGTC CGAGTGGCGA GGTATACCAC 13301 CTAACT7TAT ATACCAACAA GGAATGC77C TAGGGTTGGG TGTTTTAGAA 13401 TCTTCACGTC GAAACAGATT GTTGCGTGAT CCCGATGATA GATCATCCCA 13501 CCATTGATAT ATGATññTGC ACCTTTAATT GACAGAGATG CAACAAGGCT 13601 CACCCCAACT ATA7CACAT7 TTAGCTAAGT CCACAGCACT ATCTA7GAT7 13701 CATAGGGGAT GACGATA7CA ATAGTTTCAT AACTGAGTTT CTGCTCATAG 13301 GCAT77GATG TACATTATCA TAGACCATCA GGGAAATATC AGA7GGGTGA 13901 TTG7CAA7GC TC7AAGCCAC CCAAAGATCT ACAAGAAAT7 C7GGCATTGT 14001 CACAAC7GTG TGCAACA7GG T7TACACA7G CTA7ATGACC TACC7CGACC 14101 GACGAGGA7G 7AG7ACCGGA CAGATTCGAC AACA7CCAGG CAAAACAC77 14201 GAGG7C7AAG ACCGGTAGAG AAATGTGCAG TTC7AACCGA CCATATCAAG 14301 TA77G7AGAC CA77AC7CA7 GC7CTCTGAC TTA7C7CCGG CGAGGA7CGA 14401 GCTGAGG7AA ATG7CAGTCA GCCAAAGATC GGCAGCAACA ACA7CTCAAA 14501 TCAAAGATA7 CAACACAAGC AAGCACAATC TTCCCAT7TC AGGGGGCAAT 14601 7GCT7GCTAC AAAGC7G77G AGATATCAAC AT7AAT7AGG AGATGCCT7G 14701 ATCAC7TA7A AAGAGA7ACT TAAACTAAAC AAG7GC7TCT ATAA7AG7GG 14801 CCGAAGTTGG CCTTG7CGAA CACAGAATGG GAGTAGGTAA TATTGTCAAA 14901 C7TCAA777C ATAG7TAGTA ATATCCC7AC C7C7AG7G7G GGG77TA7CC 15001 GAATTGGCAG CCATCT7ATC GATGGC7C7G CTCC7GGGCA AAA7AGGATC 15101 77A7AAG77A 7GTAGGGTC7 CATTA7AGAG AAG7GAACCT 7G7ATACCCT 15201 CAAGGCTAAC CGGC7AATGA ATCCTGAAAA GAT7AAGCAG CAGATAAT7G 15301 AAGCAACTAA GCTGCA7ACA AGCAAT7GTG GGAGACGCAG 7TAGTAGAGG 15401 TCAATTGCGG GT7GGCAA77 AACGGACCTA AGC7GTGCAA AGAAT7GA7C 15501 CCTCTACAGG GAGT7GGCAA GATTCAAAGA CAACCAAAGA AG7CAACAAG 15601 ATATCTAGGA TCACCCGCAA A77CTGGGGG CACAT7C77C TTTACTCCGG 15701 7GA7AC7AGA C77ACACCAG AATATCTTCG 77AAGAA7C7 A7CCAAGTCA 15801 GG7AACAGTC AñGGAGACCA AAGAATGG7A TAAGT7AGTC GGATACAGTG 15901 GG7GG7TAGG CA7TA77TGC AATATATTAA AGAAAACTTT GAAAATACGA 16001 gctggcgccg gctgggcaac attccgaggg gaccgtcccc tcggtaatgg 16101 agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 16201 atGCGGCCGC GGGCCCtatG G7ACCCAGC7 777GTTccct ttagtgaggg 16301 7TG7TA7CCG CTCACAATTC CACACAACAT AGGAGCCGGA AGCATAAAG7 16401 CGC7CACTGC CCGCT77CCA G7CGGGAAAC C7G7CGTGCC AGC7GCAT7A 16501 CCGC7TCCTC GCTCACTGAC TCGCTGCGCT CGGTCG7TCG GCTGCGGCGAGCGGCATTCC TCATGGACAG GCATATTATA GTACCTAGGG CAGCTCAXGA 12500 TGGATACCAC AAAAGGCTTG ATTCGAGCCA GCATGAGGAA GGGGGGGITA 12600 AGCAGGGATG GTGCTATTGA CAGGAAGAAA GAGAAATGTC CTCATTGACA 12700 GCGAGGCTAG CTCGAGGACG GCCTATTTAC GGCCTTGAGG TCCCTGATGT 12800 TCTGCGAGTG TGGATCAGXC AAC7ACGGAT GGTTTTTTGT CCCCTCGGGT 12900 TATTGGTTCT ACCACTGATG AGAGAACAGA CATGAAGCTT GCCTTCG7AA 13000 TCATGGGCTT ACGGTGATGA TGATAGCTCT TGGAACGAAG CCTGGTTGTT 13100 CCATCTCAAC TTCGACTAAT TTAGCGCATA GGTTGAGGGA TCGTAGCACT 13200 AATCTCCAAC GACAATCTCT CñTTTGTCAT ATCAGATAAG AAGG7TGATA 13300 ACATTGTTTC GACTCGAGAA AGATACCGGA ICATCTAACA CGGTATTACA 13400 GGA7ACCCAG CTCCCGCAAG CTAGAGCTGA GGGCAGAGCT ATGTACCAAC 13500 ATACACCCAG AGCCATAC-GA GGCACCTTGT GGAATTTGTT ACATGGTCCA 13600 GACCTGGTAA CAAAATTTGA GAAGGACCAT ATGAATGAAA TTTCAGCTCT 13700 AGCCAAGATT ATTCACTATC TACTTGGGCC AGTGTGCGGC CATCAATTGG 13800 GCXGTIGTCA TCGTTCCTXT CTAGAATGAG CAAAGGAGTG TXTAAGGTGC 13900 GGTATTATAG AGCCTATCCA TGGTCCTTCA CTTGATGCTC AAAACTTGCA 14000 TGTTGTTGAA TGAAGAGTTA GAAGAGTTCA CATTTCTCTX GTGXGAAAGC 14100 ATGTGXTCTG GCAGAXTXGT ACXGXCAACC AGGGACCXGC CCACCAAXXC 14200 GCAGAGGCTA TGXXAXCTCC AGCAGGATCX XCGTGGAACA TAAATCCAAX 14300 TCAAACAGAT AAGATTGAGA GTTGATCCAG GATTCATTTX CGACGCCCTC 14400 XAXGAGCATC AAGGCTT7CA GACCCCCACA CGAXGATGTT GCAAAATTGC 14500 CTCGCCAATX ATGAAATCCA TGCTXTCCGC AGAATCGGGT TGAACTCATC 14600 AGCCAGGGGA GGACGGCTTG TXCTTGGGTG AGGGATCGGG TTCXAXGXXG 14700 GGXTTCCGCC AAXXCTAGAT CTGGTCAAAG GGAATTAGCA CCCTATCCCT 14800 GTGCTCTXTA ACGGGAGGCC CGAAGXCACG XGGGTAGGCA GTGTAGATXG 14900 ATTCAGATAT AGAGACCTTG CCXGACAAAG ATACTATAGA GAAGCTAGAG 15000 AATACXGGTG AXTAAGCTXA TGCCTXTCAG CGGGGAXXTT GTXCAGGGAT 15100 AGATACAGCA ACTTCATCTC TACXGAA7CX TATTTGG7TA XGACAGATCX 15200 AAXCAXCXGX GAGGACTXCA CCTGGACTTA XAGGTCACAT CCXAXCCATT 15300 XGATATCAAX CCXACXCTGA AAAAACTTAC ACCXAXAGAG CAGGXGCTGA 15400 CACCAXGATG TXGCCTCAGG GCAAGATGGA XXGCXTAATX CXAXACTCAX 15500 GGATGTTCCA CGCXTACCCC GTATTGGTAA GTAGCAGGCA ACGAGAACTX 15600 GAACAAAAAG TXGATAAATA AGXXXAXCCA GAATCTCAAG TCCGGCTATC 15700 GAGAAACAGA XXAXXAIGAC GGGGGGXTXG AAACGXGAGX GGGXTXXXAA 15800 CCCTGATTAA GGACTAATTG GTXGAACTCC GGAACCCTAA TCCTGCCCTA 15900 AGTTTCTATT CCCAGCTTTG TCTGGTggcc ggcatggccc cagcctcctc 16000 cgaatgggac GCGGCCgatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg 16100 tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 16200 ttaattCCGA GCTTGGCGTA AXCAXGGXCA TAGCTGXTTC CTGXGXGAAA 16300 GTAAAGCCTG GGGXGCC7AA TGAGTGAGGX AACXCACATX AAXXGCGXTG 16400 ATGAAXCGGC CAACGCGCGG GGAGAGGCGG XXTGCGTA7T GGGCGCXCTT 16500 GCGGTAXCAG CTCACTCAAA GGCGG7AATA CGGT7AXCCA CAGAATCAGG 16600FIGURA 5E16601 GGATAACGCA GGAAAGAACA TGTGAGCAAA AGGCCAGCAA AAGGCCAGGA 16701 GAGGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC GAAACCCGAC 16801 CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC CTTTCTCCCT 16901 GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA CCCCCCGTTC 17001 GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGGTA ACAGGATTAG 17101 ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC TCTGCTGAAG 17201 CACCGCTGGT AGCGGTGGTT TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG ATTACGCGCA 17301 GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACGTTAAGGG ATTTTGG1CA TGAGATTATC 17401 CAATCTAAAG TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGTTA CCAATGCTTA 17501 TGCCTGACTG CCCGTCGTGT AGATAACTAC GATACGGGAG GGCTTACCAT 17601 GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA AGGGCCGAGC GCAGAAGTGG 17701 CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT TGTTGCCATT 17801 CTCCGGTTCC CAACGATCAA GGCGAGTTAC ATGATCCCCC ATGTTGTGAA 179C1 GCCGCAGTGT TATCACTCAT GC7TATGGCA GCACTGCATA ATTCTCTTAC 18001 AGTCATTCTG AGAATAGTGT ATGCGGCGAC CGAGTTGCTC TTGCCCGGCG 18101 CATTGGAAAA CGTTCTTCGG GGCGAAAACT CTCAAGGATC TTACCGCTGT 18201 TCTTTTACTT TCACCAGCGT TTCTGGGTGA GCAAAAACAG GAAGGCAAAA 13301 TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTTA TTGTCTCATG 18401 GCGCACATTT CCCCGAAAAG TGCCACCTGA AATTGTAAAC GTTAATATTT 18501 TAGGCCGAAA TCGGCAAAAT CCCTTATAAA TCAAAAGAAT AGACCGAGAT 18601 1GGACTCCAA CGTCAAAGGG CGAAAAACCG TCTATCAGGG CGATGGCCCA 18701 AGCACTAAAT CGGAACCCTA AAGGGAGCCC CCGATTTAGA GCTTGACGGG 18801 GGCGCTAGGG CGCTGGCAAG TGTAGCGGTC ACGCTGCGCG TAACCACCAC 18301 GGCTgCGCAA CTGTTGGGAA GGGCGATCGG TGCGGGCCTC TTCGCTATTA I 10 I 20 | 30 I 40 I 50ACCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGGCGTTTT TCCATAGGCT CGGCCCCCCT 16700 AGGACTATAA AGATACCAGG CGTTCCCCCC TGGAAGCTCC CTCGTGCGCT 16800 TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC TCAATGCTCA CGCTGTAGGT ATCTCAGTTC 16900 AGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTAACT ATCGTCTTGA GTCCAACCCG 17000 CAGAGCGAGG TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG TGGTGGCCTA 17100 CCAGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC TCTTGATCCG GCAAACAAAC 17200 GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA GATCCTTTGA TCTTTTCTAC GGGGTCTGAC 17300 AAAAAGGATC TTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAATGA AGTTTTAAAT 17400 ATCAGTGAGG CACCTATCTC AGCGATCTGT CTATTTCGTT CATCCATAGT 17500 CTGGCCCCAG TGCTGCAATG ATACCGCGAG ACCCACGCTC ACCGGCTCCA 17600 TCCTGCAACT TTATCCGCCT CCATCCAGTC TATTAATTGT TGCCGGGAAG 17700 GCTACAGGCA TCGTGGTGTC ACGCTCGTCG TTTGGTATGG CTTCATTCAG 17800 AAAAAGCGGT TAGCTCCTTC GGTCCTCCGA TCGTTGTCAG AAGTAAGTTG 17900 TGTCATGCCA TCCGTAAGAT GCTTTTCTGT GACTGGTGAG TACTCAACCA 18000 TCAATACGGG ATAATACCGC GCCACATAGC AGAACTTTAA AAGTGCTCAT 18100 TGAGATCCAG TTCGATGTAA CCCACTCGTG CACCCAACTG ATCTTCAGCA 18200 TGCCGCAAAA AAGGGAATAA GGGCGACACG GAAATGTTGA ATACTCATAC 18300 AGCGGATACA TATTTGAATG TATTTAGAAA AATAAACAAA TAGGGGTTCC 18400 TGTTAAAATT CGCGTTAAAT TTTTGTTAAA TCAGCTCATT TTTTAACCAA 18500 AGGGTTGAGT GTTGTTCCAG TTTGGAACAA GAGTCCACTA TTAAAGAACG 18600 CTACGTGAAC CATCACCCTA ATCAAGTTTT TTGGGGTCGA GGTGCCGTAA 18700 GAAAGCCGGC GAACGTGGCG AGAAAGGAAG GGAAGAAAGC GAAAGGAGCG 18800 ACCCGCCGCG CTTAATGCGC CGCTACAGGG CGCGTCCCAT TCGCCATTCA 18500 CGCCAGCCAC CGCGGTG 18967I 60 I 70I 80I90100en■fs.Relación del Estado Inmune (ISR)imagen5 Absorbancia (450 nm)imagen6 FIGURA 7Serología MV (ISR)imagen7 imagen8 SchwarzAventisSchwarzAventisimagen9 pTM-Schw/CEF pTM-Schw/CEF pTM-Sc vhw/Vero pTM-Schw/VeroFIGURA 8imagen10 FIGURA 9REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓNLa lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.Documentos de patente citados en la descripción* WO 9949017 A [0004]* WO 0103744 A [0004]Literatura no patente citada en la descripciónWO 9706270 A [0006] [0031] [0043] EP 02201551 A [0109]• FIELDS BN. Fields virology. Lippincott- Raven pub- lishers, 1996, vol. 1 [0002]• ENDERS, J. F.t; T. C. PEEBLES. Propagation ¡n tissue cultures of cytopathogenic agents from pa- tients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1954, vol, 86, 277-286 [0003]• Measles virus. GRIFFIN, D.; W. BELLINI. et al. Virology. Lippincott - Raven Publishers, 1996, vol. 2, 1267-1312 [0003]• Measles virus GRIFFIN. D.; W. BELLINI et al. Virology. Lippincott - Raven Publishers, 1996, vol. 2, 1267-1312 [0003] [0108]• PARKS, C. L. ; R. A. LERCH ; P. WALPITA ; H. P. WANG ; M. S. SIDHU ; S. A. UDEM. 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