BRPI0709613A2 - método para produzir um vetor de vìrus mononegavirales recombinante, vetor de vìrus mononegavirales recombinante, e, vacina contra um patógeno microbiano - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA PRODUZIR UM VETOR DE VìRUS MONONEGAVIRALES RECOMBINANTE, VETOR DE VìRUS MONONEGAVIRALES RECOMBINANTE, E, VACINA CONTRA UM PATóGENO MICROBIANO. A presente invenção proporciona um método para produzir um vetor de vírus Mononegavirales recombinante hospedando uma unidade de transcrição adicional compreendendo um gene estranho operativamente ligado com uma sequência de início de gene (GS) de vírus Mononegavirales a montante e uma seqúência de final de gene (GE) de vírus Mononegavirales a jusante, caracterizado pelo fato de que a seqUência de gene estranho codifica uma proteína, cuja proteína contém um segmento de pelo menos três aminoácidos básicos e a sequência de nucleotídeos dos códons codificadores destes aminoácidos não contém uma sequência que pode ser reconhecida pela polimerase viral do vírus Mononegavirales como uma seqUência de final de gene (GE).

Description

METODO PARA PRODUZIR UM VETOR DE VÍRUSMONONEGAVIRALES RECOMBINANTE, VETOR DE VÍRUSMONONEGAVIRALES RECOMBINANTE, E, VACINA CONTRA UMPATÓGENO MICROBIANO"

Esta invenção refere-se a um vetor de vírus Mononegaviralesrecombinante hospedando uma unidade de transcrição adicionalcompreendendo um gene estranho operativamente ligado com uma seqüênciade início de gene (GS) de vírus Mononegavirales a montante e uma seqüênciade final de gene (GE) de vírus Mononegavirales a jusante. Esta invençãoadicionalmente se refere a um método para a produção de um tal vetor devírus Mononegavirales recombinante, e a uma vacina compreendendo um talvetor de vírus Mononegavirales recombinante.

Vírus vivos que são capazes de se replicarem em umhospedeiro infectado induzem uma resposta imune forte de duração longacontra seus antígenos expressados. São efetivos na geração de respostasimunes tanto mediadas por células quanto humorais, bem como estimulamrotas de citocina e de quimiocina. Portanto, vírus atenuados, vivos oferecemvantagens distintas sobre composições de vacina baseadas em imunógenosquer de subunidade quer inativos que tipicamente grandemente apenasestimulam o ramo humoral do sistema imune.

Durante a última década tecnologia de DNA recombinante temrevolucionado o campo de engenharia genética dos genomas de ambos osvírus de DNA e de RNA. Em particular, agora é possível introduzir genesestranhos dentro do genoma de um vírus de tal modo que sob replicação dovírus vetor novo em um animal hospedeiro é expressada uma proteínaestranha que pode exercer efeitos biológicos no animal hospedeiro. Comotais, vírus vetores recombinantes têm sido explorados não apenas para ocontrole e a prevenção de infecções microbianas, mas também paradesenvolvimento de terapias alvo para doenças não-microbianas tais comomalignidades e em terapia de gene.

A geração de vírus de RNA de fita negativa, não-segmentada(vírus da ordem Mononegavirales) inteiramente de cDNA clonado por umatécnica designada como "genética reversa", primeiro relatada em 1994(Schnell et al., EMBO J 13, 4195-4203, 1994), tem tornado possível o usotambém de vírus da ordem Mononegavirales (MV) como vetores, desdeentão, têm sido publicados estudos que descrevem o uso de muitos vírus daordem MV como vetores virais para expressar antígenos estranhos de umpatógeno almejando o desenvolvimento de vacinas contra aquele patógeno.

A ordem de Mononegavirales é classificada em quatro famíliasprincipais: Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae e Bornaviridae.Vírus pertencendo a estas famílias possuem genomas que são representadospor uma única molécula de RNA de senso negativo (-), i.e. a polaridade dogenoma de RNA é oposta à polaridade de RNA mensageiro (mRNA) que édesignado como de senso positivo (+). A classificação dos vírus MVveterinários e de humano principais é apresentada na tabela abaixo:

Tabela 1: Classificação de vírus dentro da ordem de Mononegavirales

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A organização genômica e os detalhes do ciclo de vida dosvírus da ordem MV estão bem entendidos hoje em dia e são revistos porvários autores (Neumann et al., J. Gen. Virology 83, 2635-2662, 2002;Whelan et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 63119, 2004;

Conzelmann, K., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2004). Emboravírus Mononegaviraleses possuam diferentes hospedeiros e distintaspropriedades morfológicas e biológicas, possuem muitas característicascomuns, tais como organização genômica e elementos essenciais para seutípico modo de replicação e de expressão de gene, ilustrando que têmoriginado de um ancestral comum. São vírus envelopados que se replicam noscitoplasmas da célula e produzem mRNAs que não são editados.

Um vírus Mononegavirales consiste de duas unidadesfuncionais maiores, um complexo de ribonucleoproteína (RNP) e umenvelope. As seqüências de genoma completas para vírus representativos dosgêneros de todas as famílias mencionadas acima têm sido determinadas. Osgenomas variam em tamanho de cerca de 9.000 nucleotídeos a cerca de19.000 e contêm de 5 a 10 genes. A estrutura e a organização dos genomasdos vírus MV são muito similares e são governadas por seu modo particularde expressão de gene. Todos os genomas de vírus MV compreendem três genes de núcleo codificadores: uma nucleoproteína (N ou NP), umafosfoproteína (P) e uma RNA-polimerase dependente de RNA (L). Oenvelope viral é composto de uma proteína de matriz (M) e uma ou maisglicoproteínas de transmembrana (e.g. proteínas G, HN e F) quedesempenham um papel em montagem/germinação de vírus bem como nafixação do vírus em célula e/ou entrada do vírus na célula. Dependendo dogênero o repertório de proteínas é estendido pelas proteínas acessórias queexibem certas funções regulatórias específicas em transcrição e replicação devírus ou que estão envolvidas em reações de hospedeiro - vírus (e.g. proteínasC, V e NS). A ordem do gene de vírus MV está elevadamente conservadacom os genes de núcleo N e P, na ou próxima da terminação 3' e com o genegrande (L) na posição distai 5'. OM, os genes de glicoproteína de superfície,bem como os outros genes acessórios, estão localizados entre os genes Ν, P e L.

No complexo RNP, o RNA genômico ou antigenômico estáfirmemente encapsidado com a proteína N e está associado com a RNA-polimerase dependente de RNA que consiste da proteína L e P. Após infecçãode uma célula, o complexo RNP, mas não o genoma de RNA nu, serve comoum modelo para duas funções de síntese de RNA distintas, i.e., transcrição demRNAs subgenômicos e replicação de RNA genômico de comprimento total.

Todos os genes serialmente arranjados estão separados pordenominadas estruturas "de junção de gene". Uma junção de genecompreende uma seqüência de "final de gene" (GE) conservada, uma "regiãointergênica" (IGR) não-transcrita e uma seqüência de "início de gene" (GS)conservada. Estas seqüências são tanto suficientes quanto necessárias para atranscrição de gene. Durante a transcrição cada gene é seqüencialmentetranscrito em mRNA pela viral RNA-polimerase dependente de RNA queinicia o processo de transcrição na extremidade 3' do RNA genômico naprimeira seqüência GS. Em cada junção de gene transcrição é interrompidacomo um resultado do desengatamento da RNA polimerase na seqüência GE.

Reinicio da transcrição ocorre na subseqüente seqüência GS, embora comuma eficiência reduzida. Como um resultado deste processo interrompido,também chamado de um processo de "interrupção-iniciação", atenuação datranscrição ocorre em cada junção de gene como um resultado do qual genesproximais 3' em um genoma de vírus MV são transcritos maisabundantemente do que os genes a jusantes sucessivos. A forma modular detranscrição de genes de vírus MV na qual cada gene é parte de um cistronseparado ou de uma unidade de transcrição separada torna estes vírusextremamente adequados para a inserção e a expressão de genes estranhos.Cada unidade de transcrição em um genoma de vírus MV compreende osseguintes elementos: 3'-GS-matriz de leitura aberta (ORF)-GE-5\

Nas terminações genômicas -3'- e -5' todos os genomas de vírus MV possuem uma região não-transcrita curta chamada "líder" (cerca de40-50 nt) e "reboque" (cerca de 20-600 nt), respectivamente. As seqüênciaslíder e reboque são seqüências essenciais que controlam a replicação de RNAgenômico A, encapsidação e empacotamento virais.

Tecnologia de genética reversa e resgate de vírus MV infeccioso têm tornado possível a manipulação de seu genoma de RNAatravés de sua cópia de cDNA. O complexo de iniciação de replicaçãomínima requerido para sintetizar RNA viral é o complexo RNP. Vírus MVinfeccioso pode ser resgatado por co-expressão intracelular de RNAs(anti)genômicos e as proteínas de suporte apropriadas de plasmídeosacionados por (T7) RNA polimerase. Desde o relatório inicial em 1994 deSchnell et al., 1994 (supra), recuperação confiável de muitas espécies de vírusMV tem sido alcançada baseado no protocolo original (ou suas ligeirasvariações).

Doença de Newcastle e gripe aviária são doenças importantesde aves domésticas, que podem causar perdas econômicas severas na indústriade aves domésticas em todo o mundo. O vírus da doença de Newcastle é umvírus de RNA de fita negativa, não-segmentada dentro da ordem de MV. Ogenoma, que é de cerca de 15 kb em comprimento, contém seis genes quecodificam a nucleoproteína (NP), fosfoproteína e proteína V (P/V), proteína de matriz (M), proteína de fusão (F), proteína hemaglutinina-neuraminidase(HN) e RNA-polimerase dependente de RNA ou proteína grande (L). Osgenes NDV estão arranjados seqüencialmente na ordem 3'-NP-P-M-F-HN-L-5', e estão separados por regiões intergênicas de comprimento diferente.Todos os genes são precedidos por uma seqüência de início de gene (GS) queé seguida por uma região não-codificadora, a matriz de leitura abertacodificadora das proteínas de NDV, uma segunda região não-codificadora e aseqüência de final de gene (GE). O comprimento do genoma de NDV é ummúltiplo de seus que tem que ser considerado para a introdução de genesestranhos.

Gripe aviária (AI) é uma doença de ave domésticacaracterizada por sinais respiratórios suaves a doença severa com mortalidadealta. O agente causador é um vírus de gripe aviária A (AIV) pertencendo àfamília Orthomyxoviridae. AIV contém oito segmentos de RNA genômico depolaridade negativa que codificam 10 proteínas. Baseado na antigenicidadedas glicoproteínas de superfície hemaglutinina (HA) e neuraminidase (N)3vírus AI são de subtipo. Até agora, são conhecidos 16 subtipos dehemaglutinina (H1 - Hl6) e nove subtipos de neuraminidase (NI - N9).Anticorpos para HeN são importantes na resposta imune humoral e inibeminfecção ou previnem doença.

Vírus da doença de Newcastle e da gripe aviária podem seragrupados em dois patótipos distintos de acordo com sua virulência. Sintomascausados por AIV patogênico baixo AIV (LPAI) ou NDV lentogênico sãoconsiderados de relevância menor. Em contraste, gripe aviária elevadamentepatogênica (HPAI) e doença de Newcastle causada por vírus virulentoselevados (NDV: cepas mesogênicas e velogênicas) são doenças notificáveis.

Embora vacinação rotineira contra NDV com cepas de NDVlentogênicas seja realizada para proteger galinha contra cepas de NDVelevadamente virulentas, vacinação contra HPAI não é realizada na maioriados países, porque HPAI é controlada por uma estratégia de erradicação.

Contudo, vacinação pode ser usada como uma estratégia para minimizarperdas e reduzir a incidência de doença. Imunidade induzida por vacinas éespecífica para subtipo, o que significa que uma vacina de subtipo H5 podeproteger contra AIV H5 mas não contra outros subtipos H. Normalmente,replicação do vírus da gripe é restrita aos pulmões porque hemaglutinina devírus de LPAI pode ser clivada apenas por triptase Clara, a serina proteaserestrita aos pulmões. Até agora, todos os vírus de HPAI têm sido dos subtiposH5 e H7. Estes vírus de HPAI contêm múltiplos aminoácidos básicos no sítiode clivagem H de modo que ela pode ser clivada por enzimas semelhantes àsubtilisina e furina ubíquas nas subunidades HAl e HA2. Tais vírus portantopodem crescer em outros órgãos.

Vacinas de subtipos H5 e H7 podem proporcionar proteção degalinhas e perus contra sinais clínicos e morte após infecção com HPAI. Emadição às vacinas de AIV inteiro baseadas em óleo convencionais, tem sidomostrado experimentalmente que as vacinas de vírus vetor, proteína desubunidade e DNA são efetivas para imunização contra AI. Desde o adventode genética reversa para vírus diferentes a geração de vírus recombinantespara uso como vetores de vacina é uma aplicação importante. Vírus de RNAde fita negativa recombinantes diferentes expressando proteínas estranhas têmsido construídos. Também, a hemaglutinina de AIV foi inserida em vírusvetores diferentes como o vírus da laringotraqueite infecciosa (ILTV)(Luschow et al., Vaccine 19, 4249-59, 2001), vírus da Peste Bovina (Walsh etal., J. Virol. 74, 10165-75, 2000) e vírus da estomatite vesicular (VSV)(Roberts et al., J. Virol. 247, 4704-11, 1998). Também NDV foi usado para aexpressão de hemaglutinina de AIV. O gene de hemaglutinina da gripeA/WSN/33 foi inserido entre os genes P e M de cepa Hitchner Bl de NDV.Este recombinante protegeu camundongos contra infecção letal emborahouvesse uma perda de peso detectável em camundongos que se recuperaramtotalmente dentro de 10 dias Nakaya et al. (J. Virol. 75, 11868-73, 2001). Umoutro NDV recombinante com o mesmo sítio de inserção para gene estranhoexpressou o H7 de um LPAI mas apenas 40 % das galinhas vacinadas foramprotegidas de ambos HPAI e NDV velogênico (Swayne et al., Avian Dis. 47,1047-50, 2003).Proteínas PiA de gripe, são sintetizadas como proteínasprecursoras (HA0). Após tradução o polipeptídeo precursor HA0 é clivado emum resíduo de arginina (Arg) conservado em duas subunidades, Ha1 e HA2.Esta clivagem contribui para a infectividade do vírus. (Quanto mais eficientea clivagem do precursor HA mais virulento parece ser o vírus). As regiões dejunção HAi-HA2 de vários vírus da gripe têm sido analisadas. Foi descobertoque as cepas patogênicas contêm um segmento de aminoácidos básicosadjacente ao sítio de clivagem. (Senne et al., Avian Diseases, 40: 425-437,1996; Steinhauser, Virology, 258, 1-20, 1999; Kawaoka e Webster, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85, 1988.).

Especialmente os vírus elevadamente patogênicos sãoimportantes em termos da proteção que deve ser proporcionada por umavacina contra gripe.

Contudo, quando estes tipos de proteínas, isto é, proteínas como as proteínas HA de uma grupo H5 patogênica, que possuem umsegmento básico de aminoácidos em sua seqüência, foram inseridos em umvetor de mononegavirales, foram encontrados certos problemas.

Primeiro a seqüência de gene pareceu instável em uma certaextensão. Após várias passagens em ovo de um vetor de NDV no qual umgene H5 havia sido inserido (NDVH5), ocorreram mutações espontâneasdentro da parte da seqüência de gene codificadora do segmento básico deaminoácidos.

Em adição, a seqüência codificadora do segmento deaminoácidos básicos provavelmente contém uma seqüência que é reconhecida por um mononegavírus como uma seqüência de final de gene (GE). Umavisão geral de seqüências de GE para mononegavirales é dada em Whelan,(Curr. Top. Microbiol. Immunol., 283, 61-119, 2004). As seqüências GE paramonegavirales são caracterizadas por uma seqüência conservada comum:nUUUU.Foi verificado que partes da seqüência codificadora de umsegmento de aminoácidos básicos, tal como presente adjacente ao sítio declivagem da proteína HA do vírus da gripe aviária de tipo H5 patogênico,parecem-se com a seqüência GE reconhecida pelas polimerases do vetormononegavirales como uma seqüência GE. Isto pode levar a níveis reduzidosde expressão de proteína da proteína de comprimento total, que pode afetar aeficácia de uma vacina baseada em um tal vetor.

Um objetivo desta invenção é proporcionar um vetor de vírusMV recombinante que exibe um nível de expressão mais alto de uma proteínacodificada por um gene estranho inserido no genoma do vírus vetor e/ou quemostra uma imunogenicidade aumentada do que os vetores de vírus MVexistentes.

Os presentes inventores têm verificado que este objetivo podeser alcançado por um vírus Mononegavirales recombinante de acordo com ainvenção.

A presente invenção proporciona um método para produzir umvetor de vírus Mononegavirales recombinante hospedando uma unidade detranscrição adicional compreendendo um gene estranho operativamenteligado com uma seqüência de início de gene (GS) de vírus Mononegavirales amontante e uma seqüência de final de gene (GE) de vírus Mononegavirales ajusante, caracterizado pelo fato de que a seqüência de gene estranho codificauma proteína, cuja proteína contém um segmento de pelo menos trêsaminoácidos básicos, citado segmento consistindo de resíduos de Arginina(Arg) e/ou Lisina (Lys) e contendo pelo menos uma Lisina, no qual aseqüência de nucleotídeos do gene estranho é selecionada em um tal modoque ela não contém uma seqüência que pode ser reconhecida pela polimeraseviral do vírus mononegavirales como uma seqüência de final de gene (GE).

Uma seqüência que pode ser reconhecida pela polimerase viraldo vírus mononegavirales como uma seqüência de final de gene é umaseqüência que incluiria a seqüência conservada mínima compartilhada pelamaioria das seqüências GE de mononegavirales, a saber a/uCUUUU (nosenso negativo, que é o senso genômico para um mononegavirus). Em umsenso positivo (nível de cDNA) este motivo é t/aGAAAA).

Para o vetor de mononegavirales específico usado a seqüênciaGE específica conhecida na arte aplicaria (Whelan et al. supra). Para NDVpor exemplo, a seqüência GE listada em Whelan é aaucUUUUUUu. (senso -,que é o senso genômico para mononegavirales). No senso + (nível de cDNA),a seqüência portanto seria caracterizada por um segmento de resíduos deadenina: gAAAAAA.

Em um vetor de acordo com a invenção uma tal seqüência GEnão ocorre dentro da seqüência codificadora da proteína estranha.

Há várias opções abertas para a pessoa experiente paraalcançar este objetivo. Pode ser selecionada uma seqüência estranha que, pornatureza não contém a seqüência que pode ser reconhecida pela polimeraseviral do vírus mononegavirales como uma seqüência de final de gene (GE).

Por exemplo, quando a seqüência de gene estranho codificauma proteína viral, o gene estranho pode ser obtido de uma cepa do vírus que,por natureza, carrega um gene codificador desta proteína cuja seqüênciacodificadora não inclui uma seqüência GE potencial (enquanto que o mesmogene em outra cepa do vírus a inclui).

Contudo, visto que são baixas as chances de que uma talseqüência de gene variante possa ser obtida de um vírus de tipo selvagem, épreferido mutar uma seqüência de tipo selvagem do gene estranho pormutagênese sítio-direcionada para alterar a seqüência em uma tal extensãoque a seqüência GE potencial não esteja mais presente.

O vetor de vírus Mononegavirales recombinante resultante noqual o gene estranho codifica uma proteína cuja proteína contém umsegmento de pelo menos três aminoácidos básicos, citado segmentoconsistindo de resíduos de Arginina (Arg) e/ou Lisina (Lys) e contendo pelomenos uma Lisina, cujo gene estranho não contém uma seqüência que podeser reconhecida pela polimerase viral do vírus mononegavirales como aseqüência de final de gene, é igualmente parte da invenção.

A parte do gene estranho que necessita ser modificada,especialmente no caso onde a proteína estranha é a proteína HA de um vírusda gripe aviária H5 patogênico, pode ser parte de uma seqüência de geneestranho de tipo selvagem codificadora de um segmento de pelo menos trêsaminoácidos básicos.

Um segmento de aminoácidos básicos é definido comoincluindo pelo menos três aminoácidos selecionados do grupo consistindo deLisina (código de uma letra: K) e Arginina (código de uma letra: R), no qualpelo menos um dos resíduos de aminoácido é Lisina. Isto incluiria a seqüênciaKKK, e combinações de 2K com IR (KKR, KRK5 RKK), e combinações deIK e 2R (KRR, RKR, e RRK), mas também segmentos mais longos deaminoácidos básicos incluindo as seqüências de 3 aminoácidos específicasaqui mencionadas. Como pode ser visto de Steinhauser et al. (supra) ossegmentos de aminoácidos básicos adjacentes aos sítios de clivagem nasproteínas HA dos vírus de gripe patogênicos podem ser mais longos, e podemincluir seqüências como RRKKR, ou RRRKK.

Códons codificadores de Lisina são aaa e aag, enquanto quecódons codificadores de Arginina incluem aga e agg. Tem sido verificadoque, especialmente na seqüência codificadora da proteína HA dos vírus dagripa aviária patogênicos H5, a seqüência codificadora do segmento básico deaminoácidos adjacente ao sítio de clivagem da proteína pode conter o motivode GE t/aGAAAA.

Para modificar a seqüência GE presente dentro do geneestranho de tipo selvagem, pelo menos uma mutação pode ser introduzida pormeio da qual uma "A", do segmento de adenina dentro de uma seqüência GE,possuindo o motivo comum (t/aGAAAA), originalmente presente naseqüência de gene estranho de tipo selvagem, é substituído por outronucleotídeo. Na prática, se uma mutação é introduzida na região "aaaa" que éparte de uma seqüência reconhecida como uma seqüência GE, pelo menos um dos nucleotídeos adenina teria que ser substituído por outro nucleotídeo (porexemplo uma guanidina ("g")).

Quando se altera a seqüência por mutagênese sítio-direcionadaestas alterações preferivelmente são silenciosas (significando que a(s)mutação(ões) não acarreta(m) uma mutação em nível de aminoácido).Contudo mutações em nível de ácido nucleico que levam às mutaçõesconservadas no nível de aminoácido (significando que um aminoácido básicoé substituído por outro aminoácido básico, e.g. L torna-se R, ou R torna-se L)também podem ser aceitáveis. Por exemplo, onde, na parte da seqüência degene de tipo selvagem codificadora do segmento básico de aminoácidos, pelo menos um resíduo de Lisina é codificado pelo códon "aaa" este códon podeser mutado em "aag" no gene estranho modificado inserido em um vetor dainvenção. Ou, onde na seqüência de tipo selvagem um resíduo particular deArginina que forma parte do segmento básico de aminoácidos é codificadopor "aga", este códon pode ser mutado em "agg" no gene tal como é feito parte de um vetor de acordo com a invenção.

Pelo menos um códon "aaa" (codificador de uma Lisina) naseqüência de tipo selvagem pode ser mutado para criar a seqüência de geneestranho modificada que é incorporada em um vetor da invenção. Uma talmutação pode envolver substituição do códon "aaa" por um códon "aag". Vetores nos quais o por exemplo o segmento de aminoácidos básicos contémpelo menos dois aminoácidos Lisina em série, e nos quais pelo menos umadestas Lisinas é codificada pelo códon "aag" são preferidos, mas duas ou maismutações podem ser feitas. Por exemplo, onde a seqüência codificadoraconteria dois códons "aaa" em série, ambos podem ser substituídos peloscódons "aag".

Especialmente em vista da estabilidade desejada do vetorresultante, é preferido a introdução de pelo menos duas mutações no geneestranho. Onde o gene estranho contém dois códons "aaa" em série, ambossão preferivelmente mutados, e podem ser substituídos por códons aag.

Bons resultados foram obtidos com vetores nos quais a partedo gene estranho codificador do segmento básico de aminoácidos continhauma mutação em cada um dos três ou quatro códons consecutivoscodificadores de um aminoácido básico. Nos casos onde o segmento básicoinclui apenas três aminoácidos, três mutações podem ser feitas, mas quandohouver quatro aminoácidos básicos ou mais, mais mutações podem serrealizadas.

Por exemplo, onde a seqüência de tipo selvagem contém aseqüência de aminoácidos RRKK, codificada pela seqüência de nucleotídeosaga aga aaa aaa (seqüência de senso +, na qual o motivo de seqüência GEpotencial está sublinhado), esta seqüência codificadora pode ser mutada emagg agg aag aag ainda codificando RRKK.

O vetor de vírus Mononegavirales é preferivelmente um vetorde vírus da Doença de Newcastle (NDV) e o gene estranho a proteína de umvírus da gripe aviária H5 patogênico.

Bons resultados foram obtidos com um vetor de NDV no qualum gene HA modificado de uma gripe aviária H5 patogênica havia sidoincorporada (NDVH5m).

O gene HA havia sido incorporado na região intergênica entreos genes de fusão (F) de NDV e de hemaglutinina-neuraminidase (HN) dovetor de NDV. O gene HA foi um gene H5 modificado, no qual a seqüênciade tipo selvagem "aga aga aaa aaa" havia sido modificada para uma seqüência"agg agg aag aag" de acordo com o método da presente invenção.

Este vetor produziu significativamente mais transcritos HA decomprimento total, expressou níveis significativamente mais altos de HA etambém incorporou mais proteínas HA em seu envelope.

Além disso, NDVH5m estavelmente expressou o gene HAmodificado para mais do que 10 passagens em ovo. Imunização de galinhascom NDVH5m induziu anticorpos específicos para AIVH5 e NDV e protegeugalinhas contra doença clínica após desafio com uma dose letal de NDVvelogênico ou AIV elevadamente patogênico, respectivamente.Notavelmente, vazamento de vírus da gripe não foi observado. Ademais,imunização com NDVH5m permitiu discriminação sorológica de animaisvacinados e infectados com vírus de campo AIV baseado em anticorposcontra a nucleoproteína (NP) de AIV. Portanto, NDVH5m recombinante éadequado como uma vacina bivalente contra NDV e AIV, e pode ser usadocomo vacina marcadora para o controle de gripe aviária (AI).

Métodos para a preparação de um vetor de vírus MVrecombinante hospedando uma unidade de transcrição adicionalcompreendendo um gene estranho são bem conhecidos na arte.

Mais em particular, neste método a molécula de ácido nucleicoisolada e o genoma do vírus MV são usados em sua forma de cDNA (senso+). Isto permite fáceis manipulação e inserção das moléculas de ácidonucleico desejadas no genoma viral.

Em geral, várias partes do genoma poderiam ser usadas para ainserção do gene estranho, entre dois genes, i.e. em regiões intergênicas(IGR), regiões não-codificadoras 3' ou 5' de um gene bem como extremidadeproximal-promotor-3' (antes dos genes N/NP) ou distal-5' (após os genes L)de um genoma.

O gene estranho poderia ser vantajosamente inserido antes dogene N/NP, entre NP-P, P-M, M-G/F, G/F-HN, HN-L e após o gene L.

O modo mais simples é o uso de uma seqüência dereconhecimento de enzima de restrição (RE) existente em um destes sítiospelo corte com a enzima e introdução de um cassete de transcriçãoapropriado. Visto que seqüências de reconhecimento de enzima de restriçãonaturalmente existentes nem sempre estão localizadas na localizaçãodesejada, os sítios de reconhecimento de RE poderiam ser introduzidos no genoma convencionalmente por mutagênese sítio-direcionada ou por PCR.

A composição do cassete de transcrição a ser inserido dependedo sítio de inserção. Por exemplo, no caso de um cassete de transcrição serinserido em uma IGR o cassete pode compreender os seguintes elementos: 3'-sítio de reconhecimento de RE-GS-região não-codificadora-ORF (de gene estranho)-região não-codificadora-GE-sítio de reconhecimento de RE - 5'.

Alternativamente, no caso de um cassete de transcrição serintroduzido em uma região não-codificadora 5' de um gene de vírus MVnatural o cassete pode ser composto de: 3' - sítio de reconhecimento de RE -GE-IGR-GS-região não-codificadora-ORF (de gene estranho)-região de nãocodificação-sítio de reconhecimento de RE - 5'.

Similarmente, no caso de um cassete de transcrição serintroduzido em uma região não-codificadora 3' de um gene de vírus MVnatural o cassete de expressão pode ser composto de: 3' - sítio dereconhecimento de RE-região não-codificadora-ORF (de gene estranho)-região não-codificadora-GE-IGR-GS-sítio de reconhecimento de RE - 5'.

A preparação de tais cassetes de transcrição e a sua inserçãoem um genoma de vírus MV apenas envolvem técnicas de biologia molecularrotineiras, tais como exemplificadas nas referências de literatura, e nospresentes Exemplos. Em particular, técnicas de tais mutagêneses sítio- direcionada e por PCR podem ser usadas para este propósito (Peeters et al.,1999, supra; Current Protocols in Molecular Biology, eds.: F. M. Ausubel etal., Wiley N.Y., 1995 edition, páginas 8.5.1.-8.5.9; e Kunkel et al., Methodsin Enzymology Vol. 154,376-382, 1987).

Mais em particular, um vetor de vírus MV recombinante deacordo com a presente invenção pode ser preparado por meio do método de"genética reversa" bem estabelecido que permite a modificação genética devírus de RNA de fita negativa, não-segmentada da ordem MV (revisto porexemplo por Conzelmann, K.K., Current Topics Microbiol. Immunol. 203, 1-41, 2004; e Walpita et al., FEMS Microbiol. Letters 244, 9-18, 2005).

Neste método, uma célula apropriada é co-transfectada por umvetor compreendendo uma molécula de cDNA compreendendo umaseqüência de nucleotídeos que codifica um genoma de comprimento total, ou,preferivelmente, um antigenoma (senso positivo) de um vírus MV, e um oumais vetores compreendendo as moléculas de cDNA compreendendoseqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas de suporte requeridas,sob condições suficientes para permitir a transcrição e a co-expressão do(anti)genoma de MV e proteínas de suporte e a produção de um vetor MVrecombinante. Neste método, a citada molécula de ácido nucleicocodificadora de (anti)genoma de vírus MV de comprimento total compreendeuma unidade de transcrição adicional como definida acima.

O termo vetor significa um replicon, tal como plasmídeo, fagoou cosmídeo, no qual outro segmento de DNA pode ser ligado de modo arealizar a replicação do segmento de DNA ligado e suas transcrição e/ouexpressão em uma célula transfectada com este vetor.

Preferivelmente, o vetor para a transcrição do genoma decomprimento total é um plasmídeo que compreende uma seqüência de cDNAcodificadora do (anti)genoma do vírus MV, flanqueada pelo promotor de T7polimerase em sua extremidade 5' e uma seqüência de ribozima (hepatitedelta) em sua extremidade 3', embora um promotor de T3 ou SP6 RNApolimerase também possa ser usado.

Para a expressão intracelular das proteínas de suporteapropriadas é feito uso, preferivelmente, de plasmídeos compreendendo aseqüência de cDNA codificadora destas proteínas, sob o controle deseqüências de controle de expressão apropriadas, e.g. um promotor de T7polimerase.

Em um método particularmente preferido a preparação de umvetor de vírus MV recombinante de acordo com a presente invenção, são usados plasmídeos de expressão que codificam as proteínas N (ou NP), PeLdo vírus MV.

As quantidades ou razões de plasmídeos de suportetransfectados a serem usados nesta tecnologia genética reversa cobrem umafaixa ampla. Razões para os plasmídeos de suporte N:P:L podem variar de cerca de 20:10:1 a 1:1:2 e protocolos de transfecção eficientes para cada vírussão conhecidos na arte.

Uma cópia exata do RNA genômico é preparada em umacélula transfectada pela ação combinada do promotor de T7 RNA polimerasee da seqüência de ribozima, e este RNA é subseqüentemente empacotado e replicado pelas proteínas de suporte virais fornecidas pelos plasmídeos deexpressão co-transfectados.

E preferido que uma enzima T7 polimerase seja proporcionadapor um vírus de vacínia recombinante que infecta a célula transfectada, emparticular pelo vírus de vacínia vTF73, ainda também outros vetores de varíola recombinantes, tal como o vírus de epitelioma contagioso, e.g.fpEFLT7pol, ou outros vetores virais podem ser usados para a expressão deT7 RNA polimerase.

Separação do vírus resgatado do vírus da vacínia pode serfacilmente realizada por técnicas físicas simples, tal como filtração. Para resgate do vírus Sendai ou NDV, o resgate pode ser realizado por inoculaçãodo sobrenadante de células transfectadas em ovos embrionados.

Em uma modalidade ainda mais preferida linhagens de célularecombinante são usadas para a transfecção dos vetores de transcrição eexpressão que constitutivamente expressam a (T7) RNA polimerase e/ou umaou mais das proteínas de suporte requeridas.

Por exemplo, resgate do vírus do Sarampo pode ser realizadoem uma linhagem de célula de rim de embrião humano, 293-3-46, queexpressa ambos a T7 RNA polimerase e as proteínas de suporte N e P dovírus do Sarampo (Radecke et al., EMBO J. 14, 5773-5784, 1995). Outralinhagem de célula muito útil que pode ser usada vantajosamente na presenteinvenção é baseada nas células BSR expressando a T7 RNA polimerase, i.e.linhagem celular BSR-T7/5 (Buchholz et al., J. Virol. 73, 251-259, 1999).

Ademais, informação mais detalhada referente à tecnologia degenética reversa a ser usada para a preparação de um vírus MV de acordo coma presente invenção é descrita na revisão por Conzelmann, K.K. (supra) e

Exemplo 1.

A capacidade de vetores de vírus MV recombinantes deestavelmente expressarem genes estranhos tem resultado no desenvolvimentode vetores para ambas as aplicações profiláticas e terapêuticas.

Em um vetor de vírus MV recombinante de acordo com apresente invenção o gene estranho pode variar dependendo da espécie devetor de vírus MV específica e da aplicação do vírus vetor.

O gene estranho pode codificar um antígeno de um (outro)patógeno microbiano (e.g., um vírus, uma bactéria de parasita), especialmenteo gene estranho codifica um antígeno de um patógeno que é capaz de produziruma resposta imune protetora.

Por exemplo, seqüências de gene heterólogas que podem serinseridas nos vetores de vírus da invenção incluem, mas não são limitadas aosgenes de glicoproteína de vírus da gripe, em particular, genes dehemaglutininas H5 e H7 do vírus da gripa aviária, genes derivados de Vírusda Doença Bursal Infecciosa (IBDV), especificamente VP2 de (IBDV), genesderivados de Vírus da Bronquite Infecciosa (IBV), vírus da leucemia felina,vírus da cinomose canina, vírus da anemia infecciosa eqüina, vírus da raiva,organismo ehrlichia, em particular Ehrlichia canis, vírus sinciciaisrespiratórios, vírus da parainfluenza, vírus do sarampo e metapneumovírus dehumano.

Alternativamente, o gene estranho pode codificar um imune-modulador polipeptídeo que é capaz de intensificar ou modular a respostaimune à infecção de vírus, por exemplo por co-expressão de uma citocina talcomo uma interleucina (e.g. IL-2, IL-12, lFN-γ, TNF-α ou GM-CSF).

A ordem dos vírus MV inclui ambos os vírus que são capazesde se replicarem em humanos e animais, ou em ambos (e.g. vírus da raiva e vírus da doença de Newcastle). Portanto, o gene estranho pode serselecionado de uma ampla variedade de patógenos microbianos veterinários ehumanos.

Embora todos os vírus possam ser usados como um vírus vetorna presente invenção, em uma modalidade preferida da invenção o vetor de vírus MY recombinante é um vírus da família Rhabdoviridae, preferivelmentedo gênero Lyssavirus ou Novirhabdovirus, mais preferivelmente da espéciedo vírus da raiva ou IHNV, respectivamente.

Em uma modalidade também preferida o vírus MVrecombinante é um vírus da família Paramyxoviridae, preferivelmente dogênero Respovirus, em particular a espécie hPIV3 ou bPIV3; Morbillivirus,em particular a espécie CDV; Pneumovirus, em particular a espécie RV; eAvulavirus, em particular a espécie NDV.

Em uma maneira particularmente preferida da presenteinvenção é proporcionado um vetor de vírus MV recombinante no qual ovírus é Vírus da doença de Newcastle (NDV). Como NDV é capaz de sereplicar em ambos humanos e animais, em particular aves domésticas, maisem particular, galinhas, um vetor de NDV recombinante de acordo com ainvenção pode compreender um gene estranho que codifica um antígeno deum patógeno, em particular de um patógeno respiratório, ou um imune-modulador que é capaz de produzir uma resposta imune em humanos ouqualquer um destes animais.

Métodos de genética reversa para a manipulação genética deNDV têm sido descritos para NDV por Peeters et al. (J. Virology 73, 5001-5009, 1999), Rõmer-Oberdõrfer et al. (J. Gen. Virol. 80, 2987-2995, 1999), ena revisão por Conzelmann, K.K. (supra). Ademais, também é sabido queNDV pode ser usado como um vetor para a expressão de genes estranhos, porexemplo, para a produção de uma resposta imune em animais infectados como vetor de NDV (Nakaya et al., 2001, supra) e Swayne et al., Avian Dis. 47, 1047-50,2003).

Um gene estranho pode ser vantajosamente introduzido em umgenoma de NDV em várias posições como descrito em geral para os vírusMV acima. Em particular, em um vetor de NDV recombinante de acordo coma invenção, um gene estranho (como parte de uma unidade de transcrição apropriada) pode ser inserido entre os seguintes genes NDV: NP-P, P-M, M-F, F-HN, HN-L e no locus proximal 3' e distai 5' (Zhao et al., 2003, supra;Nakaya et al., 2001, supra), preferivelmente nas regiões proximal 3', P-M, M-F e F-HN, a região F-HN sendo mais preferida.

Em uma modalidade particular da invenção um vetor de NDV recombinante é aqui proporcionado no qual a unidade de transcrição adicionalestá localizada entre os genes F-HN.

Um vetor de NDV recombinante de acordo com a presenteinvenção pode ser vantajosamente usado para induzir uma resposta imune emave doméstica, em particular galinhas, contra outros patógenos. Portanto, ovetor de NDV recombinante, preferivelmente compreende um gene estranhoque codifica um antígeno protetor de um patógeno aviário, em particular devírus da gripe, vírus da doença de Marek (MDV), vírus da laringotraqueíteinfecciosa (ILTV), vírus da bronquite infecciosa (IBV), vírus da doençabursal infecciosa (IBDV), vírus da anemia de galinha (CAV), reovírus,retrovírus aviário, adenovírus de ave, vírus da rinotraqueíte de peru (TRTV),E. coli, espécie Eimeria, Cryptosporidia, Mycoplasms tais como M.gallinarum, M. synoviae e M. meleagridis, Salmonella, Campylobacter,Ornithobacterium (ORT) ou Pasteurella sp.

Mais preferivelmente, o vetor de NDV recombinantecompreende um gene estranho que codifica um antígeno de AIV, MDV,ILTV, IBV5 TRTV, E. coli, ORT ou Mycoplasma.

Em particular, o vetor de NDV recombinante mutantecompreende um gene de hemaglutinina (HA) de um vírus da gripe,preferivelmente de um vírus da gripe aviária (AIV), mais preferivelmente deum AVI elevadamente patogênico, em particular de AIV H5 ou H7.

Em princípio, o gene HA de todas as cepas de gripe (aviária)pode ser usado nesta invenção. As seqüências de nucleotídeos de muitosgenes HA têm sido descritas na arte e os genes HA relevantes podem serresgatados de bancos de dados de seqüências de ácido nucleico, tais como osbancos de dados GenBank ou NCBI.

O gene de hemaglutinina (HA) do subtipo H5N2 de AIVA/chicken/Italy/8/98 elevadamente patogênico pode ser vantajosamente usadocomo um gene estranho na presente invenção como descrito acima. O gene éreversamente transcrito, clonado no vetor de expressão eucariótico pcDNA3(Invitrogen), e seqüenciado (Lüschow et al., Vaccine, vol. 19, p. 4249-4259,2001, e No. de Acesso no GenBank de AJ305306). Do plasmídeo deexpressão obtido pCD-HA5 o gene HA pode ser obtido por amplificação pelouso de iniciadores específicos que geram sítio de reconhecimento de REsartificial que permite a inserção do gene HA nas seqüências genômicas de NDV.

Em uma outra modalidade o gene HA do subtipo H7N1 deAIV A/chicken/Italy/445/99 elevadamente patogênico pode ser usado comoum gene estranho na presente invenção como descrito acima. O gene HA éreversamente transcrito, e amplificado por PCR. O produto de 1711 pb éclonado no vetor pUC18 digerido por SmaI (Amersham) e seqüenciado (Veitset al., J. Gen. Virol. 84, 3343-3352, 2003; e No. de Acesso no GenBank deAJ580353).

Em um vetor de vírus MV recombinante particularmentevantajoso de acordo com a presente invenção o vírus vetor MV é atenuado,isto é, o vírus vetor não é patogênico para o animal alvo ou exibe umaredução substancial de virulência comparado com o vírus de tipo selvagem.Muitos vírus MV aqui usados como vetores de vírus possuem um registro desegurança longo como vacinas atenuadas vivas tais como o vírus do sarampoe NDV, enquanto que outros vírus, tais como SeV e VSV são consideradosnão-patogênicos para humanos. Em adição, existem técnicas comerciais paraobter e triar vírus atenuados que mostram um potencial limitado deinfectividade ou replicação. Tais técnicas incluem passagem serial (fria) dovírus em um substrato heterólogo e mutagênese química.

Um vetor de NDV recombinante de acordo com a invençãopode ser derivado de qualquer cepa de vacina ND convencional. Exemplos detais cepas de NDV adequadas presentes em vacinas ND comercialmentedisponíveis são: Clone-30®, La Sota, Hitchner BI, NDW, C2 e AV4; Clone-30® a cepa preferida.

Também tem sido verificado pelos presentes inventores queum vetor de vírus MV recombinante de acordo com a presente invenção écapaz de induzir uma resposta imune protetora em animais.

Portanto, em outra modalidade desta invenção é proporcionadauma vacina contra um patógeno microbiano que compreende um a vetor devírus MV recombinante como definido acima em uma forma viva ouinativada, e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Uma vacina de acordo com a invenção pode ser preparada pormétodos convencionais tais como aqueles comumente usados para vacinas devírus MV inativado ou vivo comercialmente disponíveis.

Resumidamente, um substrato suscetível é inoculado com ovetor de vírus MV recombinante e propagado até que o vírus replicado tenhao título desejado após o qual o material contendo o vírus é colhido.

Subseqüentemente, o material colhido é formulado em uma preparaçãofarmacêutica com propriedades imunizantes.

Cada substrato que é capaz de suportar a replicação do vetorde vírus MV recombinante pode ser usado na presente invenção. Como umsubstrato células hospedeiras podem ser utilizadas de ambas as origensprocariótica e eucariótica, dependendo do vírus MV. Células hospedeirasapropriadas podem ser células de vertebrado, e.g. de primata. Exemplosapropriados são as linhagens de células humanas HEK, WI-38, MRC-5 ou H-239, a linhagem de célula simiana Vero, a linhagem de célula de roedor CHO,BHK, a linhagem de célula canina MDCK ou as linhagens de células aviárias CEFouCEK.

Um substrato particularmente adequado sobre o qual um vetorde NDV recombinante de acordo com a presente invenção pode serpropagado refere-se ao ovos embrionados SPF. Ovos embrionados podem serinoculados com, por exemplo, 0,2 mL de fluido alantóico contendo NDVcompreendendo pelo menos 10"2'0 EID50 por ovo. Preferivelmente, ovosembrionados de 9- a 11-dias de idade são inoculados com cerca de IO5'0 EID50e subseqüentemente incubados a 37°C por 2-4 dias. Após 2-4 dias o produtode vírus ND pode ser colhido preferivelmente por coleta do fluido alantóico.O fluido pode ser depois centrifugado a 2,500 g seguido por filtração dosobrenadante através de um filtro (100 μm).

A vacina de acordo com a invenção compreende o vetor devírus MV recombinante juntamente com um diluente ou veículofarmaceuticamente aceitável costumeiramente usado para tais composições.

A vacina contendo o vírus vivo pode ser preparada ecomercializada na forma de uma suspensão ou em uma forma liofilizada.Veículos incluem estabilizadores, conservantes, e tampões. Diluentes incluemágua, tampão aquoso e polióis.

Em outro aspecto da presente invenção é proporcionada umavacina compreendendo o vetor de vírus MV recombinante em uma formainativada. As vantagens maiores de uma vacina inativada são sua segurança eos níveis altos de anticorpos protetores de duração longa que podem serinduzidos.

O objetivo da inativação dos vírus colhidos após a etapa depropagação é a eliminação da reprodução dos vírus. Em geral, isto pode seralcançado por meios físicos ou químicos bem conhecidos.

Se desejado, a vacina de acordo com a invenção pode conterum adjuvante. Exemplos de compostos e composições adequados comatividade adjuvante para este propósito são hidróxido de alumínio, fosfato dealumínio ou óxido de alumínio, emulsão de óleo-em-água ou de água-em-óleobaseada em, por exemplo um óleo mineral, tal como Bayol F® ou Marcol52® ou óleo vegetal tal como acetato de vitamina E, e saponinas.

A administração de uma vacina de acordo com a invençãopode ser por qualquer uma das formas bem conhecidas e pode depender dotipo de vetor de vírus . Modos de administração adequados incluem vacinaçãoparenteral, intranasal, oral e por borrifo.

Uma vacina de vetor de NDV de acordo com a invenção épreferivelmente administrada por técnicas de aplicação em massa baratascomumente usadas para vacinação contra NDV. Para vacinação contra NDVestas técnicas incluem vacinação por borrifo e água potável.

A vacina de acordo com a invenção compreende uma dosagemefetiva do vetor de vírus MV recombinante com o componente ativo, i.e. umaquantidade de material de vírus MV imunizante que induzirá imunidade nasaves vacinadas contra desafio por um organismo microbiano virulento.Imunidade é aqui definida como a indução de um nível mais alto significativode proteção em uma população de humanos ou de animais contra mortalidadee sintomas clínicos após vacinação comparada com um grupo não-vacinado.Em particular, a vacina de acordo com a invenção previne uma proporção grande de animais ou humanos vacinados contra a ocorrência de sintomasclínicos da doença e mortalidade.

Tipicamente, a vacina viva pode ser administrada em umadose de 10 2,0 -10 8,0' cultura de tecido/dose infecciosa para embrião (TC/EID50),preferivelmente em uma dose variando de IO4'0-IO7'0 TC/EID50. Vacinasinativadas podem conter o equivalente antigênico de IO4'0-IO9,0 TC/EID50.

A invenção também inclui vacinas de combinaçãocompreendendo, em adição ao vetor de vírus MV recombinante de acordocom a invenção, uma cepa de vacina capaz de induzir proteção contra umoutro patógeno.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

Figura 1

Construção de NDV recombinante expressando AIV H5.Sinais de controle de transcrição estão marcados por um triângulo cinza paraseqüência de iniciação de transcrição e um retângulo cinza para seqüência de terminação de transcrição. A HN ORF de NDV foi substituída pela H5 ORFde AIV e o gene HN foi subseqüentemente inserido como descrito emmaterial e métodos (etapas Α-C). NDVH5 recombinante (etapa D) contém aseqüência HA autêntica, enquanto que NDVH5m recombinante transporta umHA no qual a seqüência de sítio de clivagem foi alterada por mutaçãosilenciosa (etapas E-F).

Figura 2

Análises de Northern blot dos transcritos produzidos porrecombinantes de NDV. RNA total de células CEK infectadas com NDVClone 30 (NDV), NDVH5, NDVH5m ou AIV A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) ede células não-infectadas (NI) foram preparados após 8 horas de infecção.

RNA foi separado em geles de agarose desnaturantes, transferido paramembranas de náilon, e hibridizados com cRNAs de anti-senso específicos degene marcado com P de NDVF (esquerda), AIV-H5 (meio) e NDV-HN(direita). Seis μg do respectivo RNA foram submetidos à hibridização deNorthern, exceto para a pista de AIV no blot do meio onde apenas 2 μg foramcarregados para evitar sinal de AIV excessivo. Tamanhos de marcador deRNA estão indicados em quilobases (kb) à esquerda.

Figura 3

Análises de Western blot de proteínas produzidas em célulasinfectadas ou incorporadas em recombinantes de NDV expressando AIV HA.Lisados de células infectadas (AS) ou vírions purificados (B) de NDV Clone30, NDVH5, NDVH5m ou AIV (H5N2) foram incubados quer com um anti-soro específico para subtipo AIV H5 (α-AIV; painéis superiores) quer comum anti-soro específico para NDV (α-NDV; painéis inferiores). Ligação foivisualizada por quimioluminescência após incubação com anticorpossecundários conjugados em peroxidase. Localizações de proteínas marcadorasestão indicados à esquerda e as formas não-clivadas (HA0) e processadas(HA1, HA2) de hemaglutinina de AIV estão indicadas à direita. Em vírions oucélulas infectadas com AIV proteínas virais adicionados correspondentes àsindicadas à direita. Vírions ou células infectadas com AIV proteínas viraisadicionais NP/NA e M também são detectáveis.

Figura 4

Anticorpos específicos para HA medidos pelo teste HI (A,barras cinzas) ou pelo teste IF (A, barras brancas). Taxas de mortalidade eíndices clínicos de galinhas imunizadas uma vez (B, C) ou duas vezes (D)cOm NDVH5m (H5m) e animais de controle (C) após desafio com os NDVHerts velogênicos (B) ou H5N2 AIV elevadamente patogênico (C, D). Osanimais foram observados diariamente por um período de 10 dias para sinaisclínicos e classificados como saudáveis (0), doentes (1), severamente doentes(2), ou mortos (3). Foi calculado um índice clínico que representa o valormédio de todas as galinhas por grupo para este período.

Figura 5

Exames sorológicos por NP-ELISA. Soros das galinhas foraminvestigados por um NP-ELISA indireto em uma diluição de 1:500. As raçõesde P/N produzidas foram plotadas para soros de galinhas imunizadas comrNDY/AIVH5-BMUT coletados no dia 21 após a imunização (p.i.) e 21 dapós o desafio subseqüente com AIV (p.c.). O valor de corte de 2,0 estámarcado por uma linha pontilhada.

EXEMPLOS:

Exemplo 1: Construção de vetores de NDV compreendendogene H5 não-modificado (de tipo selvagem) e gene H5 modificado eexpressão da proteína.

Vírus da doença de Newcastle (NDV) expressandohemaglutinina (HA) de vírus da gripa aviária (AIV) de subtipo H5 foiconstruído por genética reversa. Uma cópia totalmente clonada do genoma dacepa de NDV lentogênica Clone 30 foi usada para inserção da matriz deleitura aberta codificadora de HA do isolado de AIV elevadamente patogênico(HP) A/chicken/Italy/8/98 (H5N2, Número de acesso no GenBank derAJ305306) na região intergênica entre os genes de fusão (F) de NDV e dehemaglutinina-neuraminidase (HN).

Após três passagens em ovo, o título de recombinante deNDVH5 foi similar àquele do vírus parental Clone 30 (IO9 TCID50/mL), e apresença do gene H5 inserido foi confirmada por RT-PCR. Para verificar atranscrição correta do gene estranho, análise de Northern blot foi realizada(Fig.2). Embora a H5 ORF no NDV recombinante e AIV (H5N2) sejaidêntica, a H5 ORF clonada em NDV é flanqueada por aproximadamente 270nucleotídeos derivados de seqüências não-codificadoras do gene HN.Portanto, a diferença de tamanho entre os mRNAs de NDVH5 e de AIV éuma concordância boa com o tamanho esperado de mRNAs de ~ 2kb e l,7kb,respectivamente (Fig. 2, meio). Contudo apareceu um transcrito secundário decerca de 1 kb em NDVH5. (Fig 2, meio, pista 3).

Como revelado pela análise de Northern blot, NDVH5mrecombinante produziu apenas o tamanho esperado de transcrito H5 de 2kb(Fig. 2, meio, pista 4), confirmando que o transcrito curto em NDVH5termina no sítio de clivagem de HA e mais provavelmente representa apenas aregião HAi.

Como um resultado da modificação, NDVH5m produziu 1,8vezes mais HA de comprimento total HA (HA0) do que NDVH5. Transcritosde HA de comprimento total em células infectadas com AIV foram 3,4- e 6-vezes maiores do que aquele de NDVH5m e NDVH5, respectivamente.Diferente da seqüência de sítio de clivagem H5 de NDVH5, que tem sido alterada em 5 passagens, a seqüência de NDVH5 nesta região permaneceuestável durante as 10 passagens testadas (Tabela 1). Hibridização com sondasNDV F e HN confirmou a transcrição correta dos genes NDV flanqueadores,porque não houve diferença para F e NH mRNA de NDV Clone 30 parental(Fig. 2). Ademais, apenas uma redução ligeira na taxa de transcrição do gene HN foi observada como um resultado da inserção da HA ORF (Fig. 2,direita).

Para confirmar a expressão específica de AIV H5 pelosrecombinantes de NDV, células CEF infectadas foram submetidas ao teste IFindireto. Incubação com um anti-soro específico para NDV revelou uma fluorescência pronunciada em células infectadas com NDV Clone 30,NDVH5 e NDVH5m mas não em células infectadas com AIV-H5N2. Umanti-soro específico para AIV de subtipo H5 por outro lado mostrou expressãoespecífica de H5 em células infectadas com AIV, NDVH5 e NDVH5m,enquanto que as células infectadas com o NDV parental foram negativas.Embora a intensidade da expressão de H5 por células infectadas com AIVseja considerada mais alta do que aquela de ambos os recombinantes, foiverificado que o nível de expressão de H5 pelos recombinantes de NDV énotável.

De acordo com isto, apenas quantidades 3 vezes maiores deNDVH ou NDVH5 RNA foram carregadas em geles de RNA para obtersinais de hibridização comparáveis, mostrados em Fig. 2 (meio), indicandoque AIV produziu aproximadamente 3 vezes mais transcritos epresumivelmente assim muito mais proteína. O interessante é que expressãodeH5 pelas células infectadas com NDVH5m parece mais eficiente do que emcélulas infectadas com NDVH5, que poderia ser atribuído à mutaçãosilenciosa anulando a terminação de transcrição prematura de H5.

Exemplo 2: A proteína AIV H5 é incorporada no envelope departículas de NDV.

Estudos prévios mostraram que a incorporação de proteínasestranhas no envelope de vírus não-relacionados poderia ocorrer passivamentena ausência de sinais de incorporação específicos (Kretzschmar, E. et al.,1997, J. of Virology, vol. 71, p. 5982-5989). Visto que a eficiência de talincorporação passiva principalmente depende do nível de expressão dasproteínas, determinamos se a proteína HA expressada pelos vírusrecombinantes foi apropriadamente clivada e também incorporada noenvelope de recombinantes de NDV (Fig. 3). Em células infectadas comambos recombinantes, o anti-soro específico para subtipo AIV H5 detectoutrês proteínas de aproximadamente 70, 50 e 25 kDa presumivelmenterepresentando as proteínas HA0 não-clivada e as proteínas HA1 e HA2clivadas (Fig. 3A). Isto demonstra que a HA expressada pelos recombinantesé acessível às enzimas proteolíticas. A proteína HA total produzida em célulasinfectadas com vírus NDVH5 foi notavelmente menor do que aquela deNDVH5m e a proteína HA2 em células infectadas com NDVH5 dificilmentevisível. Como esperado, nenhuma reatividade pôde ser detectada em célulasinfectadas com NDV Clone 30, enquanto que todas as espécies de proteínaHA correspondentes foram detectadas em células infectadas com AIV-H5N2.Como o soro específico para AI foi produzido contra o vírus inteiro, outrasespécies de proteína presumivelmente correspondendo a NP/NA e M tambémforam detectadas em células infectadas com AIV (Fig. 3). O interessante éque analises de Western blot de vírions purificados indicaram que a proteínaHA foi incorporada eficientemente no envelope de ambos os recombinantes(Fig. 3B). Embora, mais proteína viral NDVH5 fosse submetida à analise deWestern blot, a quantidade de proteína HA2 incorporada em NDVH5 ainda foiconsideravelmente menor do que a de HA2 em vírions NDVH5m. Istodemonstra que NDVH5 produz e incorpora muito menos proteína HA2,presumivelmente devido à disponibilidade de menos proteína como umresultado da terminação prematura no sítio de clivagem.

Exemplo 3: NDV recombinante trazendo proteína AIV HA éseguro em galinhas.

Um dos modos sensíveis de medir o grau de virulência de umdado isolado de NDV é pela avaliação da patogenicidade do vírus paragalinhas de 1 dia de idade após inoculação intracerebral (CEC (1992) OfficialJournal of the European Community L 260, 1-20.). Os vírus mais virulentosdarão índices que se aproximam do escore máximo de 2,0, enquanto quecepas lentogênicas darão valores próximos de 0,0. Visto que a hemaglutininade AIV é um determinante de virulência importante, is índices depatogenicidade intracerebral (ICPI) para NDVH5 e NDVH5m foramdeterminados para avaliar se expressão de H5 de um vírus HPAI altera avirulência de NDV. Os valores de ICPI foram 0,0, de um escore máximopossível de 2 para ambos os recombinantes, demonstrando que a expressão deAIV H5 em adição às suas próprias proteínas não afetou notavelmente avirulência de NDV. Para comparação, o ICPI de uma cepa de vacina de NDVlentogênica tem que estar abaixo de 0,5 para um possível uso em vacina devírus vivo.

Exemplo 4: NDY recombinante expressando a proteína AIVHA protege galinhas contra desafios de NDV e AIV.

Por causa de uma expressão mais alta de proteína H5 porNDVH5m, apenas este recombinante foi testado nos experimentos em animal.NDVH5 recombinante foi assim administrado a 25 galinhas de três semanasde idade em uma dose de IO6 EID50 por animal pela rota oculonasal. Duranteo período de observação, todos os animais permaneceram saudáveis semreações adversas ou quaisquer sinais clínicos de doença. Como determinadopelo teste HI, anticorpos específicos para AIV H5 foram primeiro detectáveisapenas no dia 14 em 28% dos soros e aumentou para 92% no dia 21 após avacinação (Fig. 4A). Um início precoce de imunidade contra AI foi, contudo,detectado em 96% dos soros em 7 dias após a imunização usando um teste IFindireto (Fig. 4A).

Para determinar o efeito protetor de uma vacinação única,grupos de 5 a 10 animais vacinados, juntamente com número apropriado deanimais de controle, foram submetidos a uma primeira rodada de desafiosletais contra NDV e AIV, respectivamente. Não inesperadamente, 100% dosanimais vacinados foram protegidos contra desafio de NDV velogênico letal,enquanto que todos os animais de controle morreram dentro de 4 diasexibindo sinais típicos de ND (Fig. 4B). A infecção de desafio de AIV-H5N2elevadamente patogênico causou doença severa em galinhas não-imunizadascom uma taxa de mortalidade de 100 %. Em contraste, todos os animais degrupo imunizado com NDVH5m sobreviveram à dose letal de AIVelevadamente patogênico. Sete de dez galinhas permaneceram completamentesaudáveis, enquanto que três animais exibiram sintomas respiratórios muitosuaves. Contudo, o escore clínico resultante de 0,05 foi desprezívelcomparado com o escore clínico de 2,61 para o grupo de controle (Fig. 4C).Para determinar o efeito de uma vacinação de reforço em galinhas protegidascontra AI, as dez galinhas restantes receberam uma segunda imunização nodia 42 após a primeira vacinação e foram desafiadas duas semanas depois.Todos os animais foram completamente protegidos contra doença clínica apósuma dose letal do vírus de HPAI homólogo, enquanto que todos os animais decontrole desenvolveram doença severa e morreram dentro de 4 dias resultandoem um escore clínico de 2,66 (Fig. 4D).

Exemplo 5: Vacina contra NDV-AI reduz derramamento de AIV:

Para uma vacina contra AI ser bem sucedida, a vacina deve serefetiva na prevenção de derramamento de vírus além de ser segura e eficaz naprevenção da doença. Para determinar a quantidade de derramamento devírus, esfregaços traqueais e cloacais foram submetidos à PCT-RT de temporeal quantitativa em tempos diferentes após desafio. RNA viral foi detectadoem todas as galinhas não-imunizadas mas desafiadas de ambos os grupos decontrole no dia 2 após o desafio. Os valores de ciclo (Ct) limite de esfregaçosdas galinhas de controle dos primeiro e segundo desafios com AIV variaramentre 32,2-38,1 e 29,2-35,5, respectivamente. Visto que todos os animais decontrole morreram dentro de 4 dias de desafio, nenhum outro teste foirealizado neste grupo. Em contraste, nenhum vRNA foi detectado na maioriados animais imunizados (49 dos 60 esfregaços).

Exemplo 6: NP-ELISA detecta AIV circulante.

Uma dos maiores temores da vacinação rotineira de avesdomésticas é a probabilidade de que a vacinação possa permitir que o víruscircule não detectado dentre as aves. Visto que a vacina de NDVrecombinante apenas contém o gene HA, um ELISA baseado em gene denucleoproteína elevadamente imunogênico foi empregado para analisar ossoros coletados de animais vacinados antes e em tempos diferentes apósdesafio. Embora anticorpos contra AIV NP estivessem ausentes em soros detodos os animais antes da infecção por desafio, soroconversão de NP pôde serdetectada em 90% e 100% das galinhas nos dias 7 e 21 após o desafio deAIV, respectivamente. (Fig. 5). Isto demonstra que o teste ELISA baseado emNP permite não apenas a diferenciação de animais vacinados daquelesinfectados, mas também facilita a detecção de qualquer vírus circulante dentreas aves vacinadas.

Exemplo 7: Material e Métodos para exemplos 1-6.

Vírus e células:

O NDV recombinante baseado em cepa de vacina de Clone-30tem sido descrito previamente (Rõmer-Oberdõrfer, A., Mundt, E., Mebatsion,T., Buchholz, U. J. & Mettenleiter, T. C. (1999), J. Gen. Virol. 80 ( Pt 11),2987-2995.). O isolado de vírus da gripe A/chicken/Italy/8/98 (H5N2) foigentilmente proporcionado por I. Capua. A cepa de NVD velogênica Herts33/56 e a vacina NDV Clone 30 (Nobilis®) foram obtidas de Intervet Int. BV,Boxmeer, Países-Baixos. Os vírus foram propagados em ovos de galinhaembrionados de 10 dias de idade livres de patógeno específico (SPF). CélulasBSR-T7/5 estavelmente expressando fago T7 RNA polimerase (Buchholz, U.J., Finke, S. & Conzelmann, Κ. K. (1999) J. Virol. 73, 251-259) foram usadaspara recuperar NDV infeccioso de cDNA. Fibroblastos de embrião de galinha(CEF) primários, células de rim de embrião de galinha (CEK) primárias oucélulas de músculo de codorna (QM9-R) foram usadas para investigar aexpressão de proteína e a replicação de vírus.

Construção de vírus recombinantes expressando o gene AIVH5:

O plasmídeo pfINDV-1, expressando o RNA antigenômico decomprimento total de Clone 30 (Rõmer-Oberdõrfer, A., Mundt, E.,Mebatsion, T., Buchholz, U. J. & Mettenleiter, T. C. (1999) J. Gen. Virol. 80(Pt 11), 2987-2995) foi usado para introduzir o gene AIV H5. Primeiro, umfragmento NotI/BsiWI (nt 4953 - 8852) de genoma Clone 30 foi clonado emplasmídeo pUC18 (etapa A, Fig. 1). Sítios Ncol e AflII recém-criados foramentão introduzidos (etapa B) usando iniciadores MPl (5'-gacaacagtcctcaaççatggaccgcgccg 3', SEQ ID NO: 1) e MP2 (5'- ctggctagttgagtcaattçttaaggagttggaaagatggc 3', SEQ ID NO: 2). A matriz de leituraaberta (ORF) de AIV H5, que tem sido amplificada do plasmídeo pCD-HA5 (Lüschow, D., Werner, O., Mettenleiter, T. C. & Fuchs, W. (2001) Vaccine 19,4249-4259) por iniciadores específicos contendo sítios de restrição artificiaisNcoI ou AflII (PH5F2: 5'- ccttccatggagaaaatagtgcttc 3', SEQ ID NO: 3' ePH5R2: 5'- cctccttaagtataattgactcaattaaatgcaaattctgcactgcaatgatcc 3', SEQ IDNO: 4), foi usado para substituir a HN ORF de Clone 30 após digestão comNcoL e AflII (etapa C). Em adição, novos sítios SgfI e SnaBI foramintroduzidos na região intergênica na frente do gene L (etapa C) usandoiniciadores MP3 (5'- caaaacagctcatggtacgtaatacgggtaggacatgg 3', SEQ IDNO: 5) e MP4 (5'- gaaaaaactaccggçgatçgçtgaccaaaggacgatatacggg 3', SEQID NO: 6). Sítios similares flanqueando o gene HN (etapa D) foram geradosusando iniciadores MP3 e MP5 (5'-

gaaaaaactaccggcgatcgctgaccaaaggacgatatacggg 3', SEQ ID NO: 7) para opropósito de clonar o gene HN após a H5 ORF (etapa Ε). A seqüência declivagem de H5 parecendo-se com a seqüência de terminação de transcriçãode NDV foi modificada por mutação silenciosa usando o iniciador MPH5F2(5'- ggaatgtccctcaaagaaggaggaagaagagaggactatttggggc 3', SEQ ID NO: 8)como mostrado em etapa F de Fig. 1. Finalmente, o fragmento NotI/BsiWI depfINDV-1 foi substituído por um fragmento similar obtido das etapas E ou Fpara criar clones de comprimento total NDVH ou NDVHm, respectivamente(Fig. 1). O comprimento dos clones resultantes (17196 nucleotídeos) édivisível por seis atendendo deste modo a "regra dos seis". Todas as reaçõesde mutagênese aqui descritas foram feitas usando o kit de mutagênese sítio-direcionada Quik Change IIXL (Stratagene).

Transfecção e recuperação de vírus:Para recuperar NDV recombinante expressando o H5 de AI, osclones de comprimento total juntos com plasmídeos expressando as proteínasNP, PeL foram transfectados em células BSR-T7 usando Lipofectamine2000 (Invitrogen) na razão de DNAiLipofectamine 2000 de 1:1,5. Propagaçãode vírus e confirmação da recuperação de vírus infeccioso foramessencialmente realizadas como descrito previamente (Rõmer-Oberdõrfer,1999, supra; Engel-Herbert, 1., Werner, O., Teifke, J. P., Mebatsion, T.,Mettenleiter, T. C. & Romer-Oberdorfer, A. (2003) J. Virol. Methods 108,19-28).

Análises de Northern blot:

Células CEK foram infectadas com NDV Clone 30, NDVH5,'NDVH5m ou AIV-H5N2 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10por célula e incubadas por 8 h a 37°C. RNA total de células infectadas e não-infectadas foi preparado (Chomczynski, P. & Sacchi, N. (1987) AnalyticalBiochemistry 162, 156-159), separado em geles de agarose desnaturantes ehibridizados com cRNAs radiomarcados como descrito alhures (Fuchs, W. &Mettenleiter, T. C. (1996) J. Gen. Virol. 77 ( Pt 9), 2221-2229). Plasmídeoscontendo as matrizes de leitura aberta de AIV-H5N2 hemaglutinina, NDVClone 30 F e HN foram usados para transcrição in vitro de CRNA marcadocom 32P (SP6/T7 Transcription kit, Roche).

Análises de Western blot:

Células CEK foram infectadas em uma MOI de 5 com NDVClone 30, NDVH5, NDVH5m ou AIV-H5N2 e incubadas por 30 h a 37°C.Lisados de células infectadas ou vírions purificados por gradiente de sacarosecontínuo (30-60%) foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para filtrosde nitrocelulose (Trans-Blot SD cell, Bio-Rad). Blots foram incubados comanti-soro policlonal de coelho contra NDV, ou anti-soro policlonal de galinhacontra AIV do subtipo H5 (Intervet Int. BV, Boxmeer, NL). Ligação deanticorpos secundários específicos para espécie conjugados com peroxidase(Dianova) foi detectada por quimioluminescência usando SuperSignal WestPico Chemiluminescent Substrate (Pierce) sobre filmes de raios-X (HyperfilmMP, Amersham).

Experimentos em animais:

A segurança dos recombinantes de NDV foi avaliada peladeterminação do índice de patogenicidade intracerebral (ICPI) em galinhas de1 dia de idade de acordo com o descrito em European Commuriity CouncilDirective (CEC (1992) Official Journal of the European Community L 260, 1-20.)· Experimentos de vacinação foram realizados pela administração de IO6EID50 de NDVH5m oculonasalmente em 25 galinhas SPF de três semanas deidade. Para avaliar a capacidade protetora do recombinante após umavacinação única, cinco dos vacinados juntos com 5 controles adicionais foramdesafiados com IOjp ELD50 de NDV cepa Herts 33/56 intramuscularmentetrês semanas após a vacinação. Igualmente, 10"7,7 dos vacinados juntos com noveanimais de controle foram desafiados oculonasalmente com IO''' EID50 deAIVH5N2 elevadamente patogênico. As dez galinhas restantes receberamuma imunização secundária seis semanas após a primeira vacinação e foramsubmetidas a um desafio de AI similar juntas com cinco animais de controleadicionais duas semanas depois. Após as imunizações e as infecções dedesafio, todas as aves foram observadas diariamente por um período de 10dias para sinais clínicos.

Análise de derramamento de vírus por RT-PCR de tempo real:Esfregaços orofaringeais e cloacais foram colhidos paraanalisar derramamento de AIV por RT-PCR de tempo real nos dias 2, 4, 8 e14 após desafio. RNA de esfregaços orofaringeais ou cloacais forampreparados quer por Tecan-Automat usando o Núcleo Spin kit (Macherey-Nagel) quer manualmente utilizando o viral RNA kit (Qiagen). Para adetecção de derramamento de AIV após infecção de desafio, o método de RT-PCR de tempo real de vírus de gripe A baseado em amplificação do gene Mfoi usado (18). A extração de RNA e fatores de inibição durante a RT-PCRforam checados por um sistema de controle interno heterólogo (19). O ensaioduplex foi realizado no ciclador MX3000p (Stratagene) usando o one stepRT-PCR kit (SuperscriptTM III One-Step RT-PCR system com Platinum®Taq DNA Polymerase (Invitrogen)). O perfil de temperatura foi 30 min 50°C,2 min 94°C, seguido por 42 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 57°C e 30 s a 68°C.

HI e NP-ELISA:

Para determinar a presença de anticorpos NDV e AIVH5,amostras de sangue foram colhidas a 0, 7, 14 e 21 dias e submetidas ao testede inibição de hemaglutinação(HI) como descrito em European CommunityCouncil Directive (CEC (1992) Official Journal of the European CommunityL 260, 1-20; CEC (1992) Official Journal of the European Communities L167, 1-1620, 21). Para avaliar a presença de anticorpos AIV-H5 apósimunização, os soros foram adicionalmente usados para imunofluorescênciaindireta (IF) por incubação de diluição 1:100 dos soros com CEF infectadocom AIV. Anticorpos contra nucleoproteína (NP) de AIV foram investigadospor ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs) indiretos baseadosem nucleoproteína (NP-ELISA). Para este propósito, uma proteína de fusãode glutationa-S-transferase-NP derivada de baculovírus recombinantepurificada incluindo a região de codificação completa do gene AIV NP, foiusada como antígeno. Soros diluídos 1:300 em PBS contendo 0,05% deTween 20 foram investigados em duplicata. Ligação de anticorpossecundários IgG (H+L) de cabra-a-galinha conjugados com POD(ROCKLAND) foi detectada por uma reação colorida usando o-fenileno-diamina e Absorção foi medida a 492 nm.

Exemplo 8: Construção de vetores de NDV compreendendoum gene H7 modificado:

Em experimentos essencialmente similares àqueles descritosacima, um construto de vetor de NDV foi preparado trazendo um gene H7modificado. O inserto foi derivado do isolado HP H7N1 AIV :A/chicken/Italy/445/99, cuja seqüência está publicada no GenBank sob onúmero de acesso de AJ 580353; veja também: Veits, J. et al. 2003 (J. of Gen.Virol., vol. 84, p. 3343). O gene H7 foi inserido no vetor de NDV entre osgenes F e HN, e foi flanqueado por seqüências não-codificadoras do gene HN.

Uma seqüência de final de gene potencial está presente após aregião de sítio de clivagem do gene H7 HA. A seqüência original emnucleotídeos 1195-1206: ata gaa alfa-amilase ácida act, codificadora dosaminoácidos IEKT, foi mutada em: ata gag aag act, ainda codificadora de IEKT.

Isto resultou em uma expressão estável e melhorado eapresentação da seqüência H7 modificada via o vetor NDV, comparado com aexpressão de um gene H7 não modificado.Listagem de Seqüências

<110> intervet International BV

<i20> Vetor de virus mononegavirales reconibinante

<130> 2006-G08-FF

<150> EP 06111222.3<151> 2006-03-15

<160> a

<170> Patentm versão 3.3

<210> 1

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Claims (13)

1. Método para produzir um vetor de vírus Mononegaviralesrecombinante hospedando uma unidade de transcrição adicionalcompreendendo um gene estranho operativamente ligado com uma seqüênciade início de gene (GS) de vírus Mononegavirales a montante e uma seqüênciade final de gene (GE) de vírus Mononegavirales a jusante, caracterizado pelofato de que a seqüência de gene estranho codifica uma proteína cuja proteínacontém um segmento de pelo menos três aminoácidos básicos, citadosegmento consistindo de resíduos de Arginina (Arg) e/ou Lisina (Lys) econtendo pelo menos uma Lisina, no qual a seqüência de nucleotídeos dogene estranho é selecionada em um tal modo que ela não contém umaseqüência que pode ser reconhecida pela polimerase viral do vírusmononegavirales como uma seqüência de final de gene (GE).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a parte de uma seqüência de gene estranho de tipo selvagem geneestranho codificadora de citado segmento de pelo menos três aminoácidosbásicos é modificada por mutagênese sítio-direcionada para eliminar qualquerseqüência que pode ser reconhecida pela polimerase viral do vírusmononegavirales como uma seqüência de final de gene (GE), para criar umaseqüenciada de gene estranho modificada.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que dentro de uma seqüência t/aGAAAA originalmente presente naseqüência de gene estranho de tipo selvagem, pelo menos uma mutação éintroduzida por meio da qual uma "A, do segmento de adenina é substituídapor outro nucleotídeo.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que a(s) mutação(ções) é\(são) silenciosa(s).

5. Método de acordo com as reivindicações 3-4, caracterizadopelo fato de que pelo menos um códon aaa é substituído por um códon aag.

6. Método de acordo com as reivindicações 3-5, caracterizadopelo fato de que são feitas pelo menos duas mutações pontuais.

7. Método de acordo com as reivindicações 3-6, caracterizadopelo fato de que pelo menos dois códons aaa são substituídos por um códon aag.

8. Método de acordo com as reivindicações 3-7, caracterizadopelo fato de que a seqüência codificadora aga aga aaa aaa é substituída pelaseqüência codificadora agg agg aag aag.

9. Método de acordo com as reivindicações 1-8, caracterizadopelo fato de que o vetor de vírus Mononegavirales é um vetor de vírus daDoença de Newcastle (NDV) e o gene estranho codifica a proteína HA de umvírus da gripa aviária H5 patogênico.

10. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante hospedandouma unidade de transcrição adicional compreendendo um gene estranhooperativamente ligado com uma seqüência de início de gene (GS) de vírusMononegavirales a montante e uma seqüência de final de gene (GE) de vírusMononegavirales a jusante, caracterizado pelo fato de que o gene estranhocodifica uma proteína cuja proteína contém um segmento de pelo menos trêsaminoácidos básicos, citado segmento consistindo de resíduos de Arginina(Arg) e/ou Lisina (Lys) e contendo pelo menos uma Lisina, cujo geneestranho não contém uma seqüência que pode ser reconhecida pela polimeraseviral do vírus mononegavirales como uma seqüência de final de gene.

11. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o gene estranhocodifica a proteína hemaglutinina (HA) de um vírus da gripe aviáriapatogênico, no qual o segmento de aminoácidos básicos contém pelo menosdois aminoácidos Lisina em série, e no qual pelo menos uma destas Lisinas écodificada pelo códon aag.

12. Vetor de vírus Mononegavirales recombinante de acordocom as reivindicações 10-11, caracterizado pelo fato de que o segmento deaminoácidos básicos contém a seqüência de aminoácidos Arg Lys Lys,codificada pela seqüência de nucleotídeos aggaagaag.

13. Vacina contra um patógeno microbiano, caracterizada pelofato de compreender um vetor de vírus MV recombinante como definido emqualquer uma das reivindicações 10-12 e um diluente ou veículofarmaceuticamente aceitável.