CN101421294A - 表达禽流感病毒的h5血凝素的重组新城疫病毒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生产带有另外的转录单位的重组单股反链病毒目病毒载体的方法，该转录单位包括与上游的单股反链病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的单股反链病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作连接的外源基因，其特征在于该外源基因序列编码一种蛋白，该蛋白包含至少3个碱性氨基酸的伸展序列，而且编码这些氨基酸的密码子的核苷酸序列不含有能被单股反链病毒目病毒的病毒聚合酶识别为基因末端(GE)序列的序列。

Description

表达禽流感病毒的H5血凝素的重组新城疫病毒

本发明涉及一种带有另外的转录单元的单股反链病毒目(Mononegavirales)病毒载体，该转录单元包括与上游的单股反链病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的单股反链病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作连接的异源基因。本发明进一步涉及一种生产这种重组单股反链病毒目病毒载体的方法，并涉及包括这种单股反链病毒目病毒载体的疫苗。

能在受感染宿主中复制的活病毒，诱导抗它们表达的抗原的强而且持久的免疫应答。它们有效地引起体液和细胞介导的免疫应答，而且刺激细胞因子和趋化因子通道。因此，活的，减毒病毒提供优于基于灭活或亚基免疫原的疫苗组合物的显著优点，这些疫苗组合物一般主要只刺激免疫系统的体液性抗体手臂(humoral arm)。

过去的十年，重组DNA技术已经使DNA与RNA病毒基因组的遗传工程领域都发生巨大变化。尤其是，引入外源基因到病毒的基因组中现在是可能的，以便新的载体病毒在宿主动物中复制以后，外源基因紧接着表达，在宿主动物中发挥生物学作用。因而，重组载体病毒已经不仅开发用于控制和预防微生物引起的感染，而且用于设计靶治疗用于非微生物引起的疾病如恶性肿瘤和基因治疗中。

通过命名为“反向遗传学”的技术，完全来自克隆的cDNA的非节段性，负链RNA病毒(单股反链病毒目目的病毒)的产生(其于1994年首次报道(Schnell et al.，EMBO J 13，4195-4203，1994))已经使利用单股反链病毒目(MV)的病毒作为载体成为可能。其后，描述利用MV目的许多病毒作为病毒载体，以表达来源于病原体的外源抗原的研究已经公开，其目的在于开发抗该病原体的疫苗。

单股反链病毒目目划分成4个主要家族：副粘病毒科(paramyxoviridae)，弹状病毒科(Rhabdoviridae)，纤丝病毒科(Filoviridae)和玻那病毒科(Bornaviridae)。属于这些家族的病毒具有由单股，负(-)正义RNA分子表示的基因组，也即，该RNA基因组的极性与指定为正(+)正义的信使RNA(mRNA)的极性相反。主要的人与兽医学MV病毒的分类列于下表中：

表1：单股反链病毒目目内病毒的分类

 

科	属	种
			弹状病毒科	狂犬病毒属	狂犬病毒(RV)
	水疱病毒属	水泡口炎病毒(VSV)
				弹状病毒属	传染性造血器官坏死病毒(IHNV)
			副粘病毒科	呼吸系病毒	仙台病毒(SeV)
		人副流感病毒1和3型(hPIV 1/3)
					牛副流感病毒3型(bPIV3)
	麻疹病毒属	麻疹病毒(MV)
					牛瘟病毒
		犬瘟热病毒(CDV)
				腮腺炎病毒	猿猴病毒5(SV-5)
		人副流感病毒2型(hPIV-2)
					腮腺炎病毒
	Avulavirus	新城疫病毒(NDV)
				肺炎病毒属	人呼吸道合胞病毒(hRSV)
		牛呼吸道合胞病毒(bRSV)
纤丝病毒科	埃博拉样病毒	埃博拉病毒
					马尔堡病毒

目前非常了解，而且多个作者综述了MV目的病毒的基因组结构和生活周期细节(Neumann et al.，J.Gen.Virology 83，2635-2662，2002；Whelan et al.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.203，63-119，2004；Conzelmann，K.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.203，1-41，2004)。尽管单股反链病毒目病毒具有不同的宿主和不同的形态学和生物学特性，但是它们具有许多共同的特征，如基因组结构和它们的一般复制和基因表达模式所必要的元件，这说明它们起源于一个共同的祖先。它们是包膜病毒，其在细胞的胞浆中复制，并产生没有剪接的mRNA。

单股反链病毒目病毒由两个主要的功能单元组成，核糖核蛋白(RNP)复合体和包膜。已经确定了上述所有家族的属的典型病毒的全部基因组序列。基因组大小为大约9.000个核苷酸到大约19.000个核苷酸，而且它们包含5到10个基因。MV病毒的基因组的结构和构造是很类似的，而且取决于它们特别的基因表达模式。所有的MV病毒基因组包括3个核心基因，其编码：核蛋白(N或NP)，磷蛋白(P)和依赖于RNA的RNA聚合酶(L)。病毒包膜由基质(M)蛋白和一种或多种跨膜糖蛋白(例如G，HN和F蛋白)组成，跨膜糖蛋白在病毒装配/出芽以及在细胞附着和/或病毒侵入中发挥作用。取决于属，通过在转录和病毒复制中显示某些特异性调节功能，或涉及病毒宿主反应的辅助蛋白(例如，C，V和NS蛋白)，来扩展蛋白库。MV病毒的基因顺序是高度保守的，在位于3’末端或其附近的核心基因N和P，而且在5’远端位置的大(L)基因。M，表面糖蛋白基因，以及其它的辅助基因，位于N，P与L基因之间。

在RNP复合物中，基因组或反基因组RNA用N蛋白紧密包裹，并与由L和P蛋白组成的依赖于RNA的RNA聚合酶相关。感染细胞以后，RNP复合物，而不是裸露的RNA基因组，用作两个不同的RNA合成功能的模板，也即亚基因组mRNA的转录和全长基因组RNA的复制。

所有串联排列的基因，通过所谓的“基因连接”结构隔开。基因连接包括一个保守的“基因末端”(GE)序列，一个非转录的“基因间隔区”(IGR)和一个保守的“基因起始”(GS)序列。这些序列都是基因转录足够的和必需的。转录期间，每个基因通过依赖于病毒RNA的RNA聚合酶连续转录成mRNA，该RNA聚合酶在第一个GS序列的基因组RNA的3′末端起始转录过程。在每个基因连接中，由于GE序列上的RNA聚合酶的脱离，转录被中断。在随后的GS序列上发生转录的重新起始，尽管以降低的效率。由于这种中断的过程，也称为“终止-起始”过程，转录减弱发生在每个基因连接中，结果MV病毒基因组中3’近端的基因比连续的下游基因转录得更多。MV病毒基因转录的模形式，其中每个基因是独立的顺反子或转录单位的部分，使这些病毒非常适于外源基因的插入和表达。MV病毒基因组中的每个转录单位包括下列元件：3’-GS-开放阅读框(ORF)-GE-5’。

在3’-和5’基因组末端，所有的MV病毒基因组具有短的非转录区，其分别称为“前导”(大约40-50nt)和“尾随”(大约20-600nt)。前导和尾随序列是必需的序列，其控制基因组RNA的复制，病毒衣壳化和包装。

反向遗传学技术和感染性MV病毒的拯救，已经使通过它的cDNA拷贝操作它的RNA基因组成为可能。合成病毒RNA所需的最小复制起始复合物，是RNP复合物。感染性MV病毒可以通过(反)基因组RNA，和来自(T7)RNA聚合酶驱动质粒的合适支持蛋白的细胞内共表达拯救。1994年Schnell等的初步报告，1994(上文)，根据原来的方案(或其轻微的改变)，已经实现了许多MV病毒种的可靠回收。

新城疫和禽流感是禽类的重要疾病，其可能在养禽业世界范围内引起严重的经济损失。新城疫病毒是MV目内的一种非节段的，负链RNA病毒。基因组，其长度为大约15kb，包含6个基因，其编码核蛋白(NP)，磷蛋白和V蛋白(P/V)，基质(M)蛋白，融合(F)蛋白，血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白和依赖于RNA的RNA聚合酶或大(L)蛋白。NDV基因以3′-NP-P-M-F-HN-L-5’的顺序连续排列，并被不同长度的基因间隔区隔开。所有的基因放在基因起始(GS)序列之前，其后面是非编码区，编码NDV蛋白的开放式阅读框，第二个非编码区和基因末端(GE)序列。NDV基因组的长度是6的倍数，其对于引入外源基因是必须考虑的。

禽流感(AI)是一种禽类疾病，其特征在于从轻微呼吸性迹象到高死亡率的严重疾病。致病因子是属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的禽流感A病毒(AIV)。AIV包含编码10个蛋白的8个负极性的基因组RNA节段。根据表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(N)的抗原性，对AI病毒划分了亚型。迄今为止，16个血凝素(H 1-H 16)和9个神经氨酸酶(N 1-N 9)亚型是已知的。H和N的抗体在体液免疫应答中是重要的，并抑制感染或预防疾病。

禽流感和新城疫病毒，根据它们的毒性，可以划分成两个不同的致病型。由低致病的AIV(LPAI)或缓发型NDV引起的症状认为较少相关。相反，由高强毒病毒(NDV：中发型和速发型菌株)引起的高致病的禽流感(HPAI)和新城疫，是须申报的疾病。

尽管用缓发型NDV菌株进行抗NDV的常规疫苗接种，以保护鸡抗高毒性的NDV菌株，但是在大多数国家不进行抗HPAI的疫苗接种，因为通过根除策略控制HPAI。但是，疫苗接种可用作一种策略，来最小化损失和降低发病率。疫苗诱导的免疫性是亚型特异性的，其指亚型H5疫苗可以保护免遭H5 AIV，但是不能保护免遭其它的H亚型。通常，流感病毒复制只限于肺，因为LPAI病毒的血凝素只能被类胰蛋白酶Clara裂解，类胰蛋白酶Clara是一种局限于肺的丝氨酸蛋白酶。至今，所有的HPAI病毒都是H5和H7亚型。这些HPAI病毒在H切割位点包含许多碱性氨基酸，因此它可以被普遍存在的弗林蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶样酶裂解成HA₁和HA₂亚基。这种病毒因此可以在其他的器官中生长。

H5和H7亚型疫苗可以为鸡和火鸡提供保护，免遭HPAI感染以后的临床征象和死亡。除了常规灭活的基于油的全AIV以外，载体病毒，亚基蛋白和DNA疫苗已经用实验方法显示有效用于抗AI的免疫。自用于各种病毒的反向遗传学出现以来，生产用作疫苗载体的重组病毒是一种重要的应用。已经构建了表达外源蛋白的各种重组负链RNA病毒。并且，AIV的血凝素被插入道各种载体病毒中如传染性喉气管炎病毒(ILTV)(Luschow et al.，Vaccine 19，4249-59，2001)，牛瘟病毒(Walsh et al.，J.Virol.74，10165-75，2000)和水泡性口膜炎病毒(VSV)(Roberts et al.，J.Virol.247，4704-11，1998)。NDV也用于表达AIV血凝素。流感A/WSN/33的血凝素基因被插入到NDV菌株Hitchner B1的P与M基因之间。这些重组体保护小鼠免受致命感染，尽管在小鼠中存在可检测的体重减轻，其在10天内完全恢复(Nakaya et al.J.Virol.75，11868-73，2001)。具有用于外源基因的相同插入位点的另外的重组NDV，表达LPAI的H7，但是仅仅40％的接种鸡被保护免于速发型NDV和HPAI(Swayne et al.，Avian Dis.47，1047-50，2003)。

流感HA蛋白，被合成作为前体蛋白(HA₀)。前体多肽HA₀在保守的精氨酸(Arg)残基处，被翻译后裂解成两个亚基，HA₁和HA₂。这种裂解有助于病毒的传染性。(HA前体被裂解得越有效，病毒似乎越有毒力)。已经对不同流感病毒的HA₁-HA₂连接区进行了分析。发现致病菌株包含与切割位点邻近的碱性氨基酸序列。(Senne et al.，AvianDiseases，40：425-437，1996；Steinhauser，Virology，258，1-20，1999；Kawaoka and Webster，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，1988.)。

在流感疫苗应该提供的保护方面，高致病病毒是尤其重要的。

然而，当这类蛋白，也即，蛋白如致病的H5流感的HA蛋白(在它们的序列中具有碱性的氨基酸序列)插入到单股反链病毒目载体中时，遇到某些问题。

首先，基因序列似乎某种程度地不稳定。在NDV载体的几次继代之后，该载体中已经插入了H5基因(NDVH5)，在编码氨基酸的碱性序列的基因序列部分中发生自发突变。

而且，这种碱性氨基酸序列的编码序列，可能包含被mononegavirus识别为一种基因末端(GE)序列的序列。Whelan提供了单股反链病毒目的GE序列的综述(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，283，61-119，2004)。Monegavirales的GE序列的特征在于共同的保守序列：nUUUU。

发现碱性氨基酸序列的编码序列的部分，如存在于致病性H5型禽流感病毒的HA蛋白的裂解位点附近，与被单股反链病毒目载体的聚合酶识别为GE序列的GE序列类似。这可能导致全长蛋白降低水平的蛋白表达，其可能影响基于这种载体的疫苗的功效。

本发明的一个目标是提供一种重组MV病毒载体，其显示由外源基因编码的蛋白的较高表达水平，该外源基因插入到载体病毒的基因组中，和/或显示比已知MV病毒载体增加的免疫原性。

本发明人已经发现，本发明的重组单股反链病毒目病毒可满足这个目标。

本发明提供了一种生产带有另外的转录单位的重组单股反链病毒目病毒载体的方法，该转录单位包括与上游的单股反链病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的单股反链病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作连接的外源基因，特征在于该外源基因编码一种蛋白，该蛋白包括至少3个碱性氨基酸的伸展序列，所述伸展序列由精氨酸(Arg)和/或赖氨酸(Lys)残基组成，并至少1个赖氨酸，其中外源基因的核苷酸序列通过它不包含可以被单股反链病毒目病毒的病毒聚合酶识别为基因末端(GE)序列的序列的方式选择。

可以被单股反链病毒目病毒的病毒聚合酶识别为基因末端序列的序列，是包含单股反链病毒目的大多数GE序列共有的最小保守序列的序列，即a/u CUUUU(在负正义中，其是Mononegavirus的基因组正义(genomic sense))。在正正义中(cDNA水平)，该基序是t/a GAAAA。

对于使用的特定单股反链病毒目载体，将应用本领域已知的特异性GE序列(Whelan et al.上文)。对于例如NDV，Whelan中所列的GE序列是aaucUUUUUUu。(-正义，其是单股反链病毒目的基因组正义(genomic sense))。在+正义中(cDNA水平)，该序列因此特征在于腺嘌呤残基的伸展序列：gAAAAAA。

在本发明的载体中，这种GE序列不存在于外源蛋白的编码序列内。

本领域技术人员有几种选择来实现该目标。可以选择这样的外源序列，其本来不含有可被单股反链病毒目病毒的病毒聚合酶识别为基因末端(GE)序列的序列。

例如，当外源基因序列编码病毒蛋白时，可从病毒株获得该外源基因，该病毒株天然携带编码这种蛋白的基因，该蛋白的编码序列不包含可能的GE序列(但是另一个病毒株中的相同基因含有可能的GE序列)。

但是，由于可以从野生型病毒获得这种变体基因序列的机会较低，优选通过位点定向诱变使外源基因的野生型序列发生突变，来改变序列到这种可能的GE序列不再存在的程度。

得到的重组单股反链病毒目病毒载体同样是本发明的一部分，其中外源基因编码包含至少3个碱性氨基酸的伸展序列的蛋白，所述的伸展序列由精氨酸(Arg)和/或赖氨酸(Lys)残基组成，并包含至少1个赖氨酸，该外源基因不包含可被单股反链病毒目病毒的病毒聚合酶识别为基因末端序列的序列。

需要修饰的外源基因的部分，特别是在当外源蛋白是致病性H5禽流感病毒的HA蛋白的情形中，可以是编码至少3个碱性氨基酸的伸展序列的野生型外源基因序列的部分。

碱性氨基酸的伸展序列，限定为包含选自赖氨酸(单字母代码：K)和精氨酸(单字母代码：R)的至少3个氨基酸，其中至少1个氨基酸残基是赖氨酸。这将包括KKK序列，和2K与1R的组合(KKR，KRK，RKK)，以及1K与2R的组合(KRR，RKR和RRK)，而且这里也提到了包括特定的3个氨基酸序列的较长的碱性伸展氨基酸序列。如可以从Steinhauser等(上文)看到的，邻近致病性流感病毒的HA蛋白中的裂解位点的碱性伸展氨基酸序列可以更长，而且可包括序列如RRKKR或RRRKK。

编码赖氨酸的密码子是aaa和aag，而编码精氨酸的密码子包括aga和agg。已经发现，特别是在H5致病性禽流感病毒的HA蛋白的编码序列中，编码邻近该蛋白的裂解位点的碱性伸展氨基酸序列的编码序列，可包含GE基序t/aGAAAA。

为了修饰存在于野生型外源基因中的GE序列，可以引入至少1个突变，借此GE序列内的腺嘌呤伸展序列的“A”该GE序列具有共同的基序(t/aGAAAA)，原来存在于野生型外源基因序列中)被另一个核苷酸取代。

实际上，如果引入突变到“aaaa”序列段中，该“aaaa”序列段是公认为GE序列的序列的一部分，至少1个腺嘌呤核苷酸将必须被另一个核苷酸取代(例如，胍(“g”))。

当通过定点诱变改变序列时，这些改变优选是沉默的(意思是该突变没有导致氨基酸水平的突变)。但是，核酸水平的突变，其导致氨基酸水平的保守突变(指一个碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸取代，例如，L变成R，或者R变成L)，也是可接受的。例如，当在编码碱性氨基酸伸展序列的野生型基因序列的部分中，至少一个赖氨酸残基由密码子“aaa”编码时，在插入到本发明载体中的修饰的外源基因中，这个密码子可以突变成“aag”。或者，当在野生型序列中，形成碱性氨基酸伸展序列的部分的特定精氨酸残基由“aga”编码时，在成为本发明载体的部分的基因中，这个密码子可以突变成“agg”。

在野生型序列中，至少一个“aaa”密码子(编码赖氨酸)可以被突变，以产生修饰的外源基因序列，其被整合到本发明的载体中。这种突变可包括“aaa”密码子被“aag”密码子取代。这样的载体是优选的，即其中例如碱性氨基酸伸展序列包括并排的(in row)至少两个赖氨酸，而且其中这些赖氨酸中的至少一个由密码子“aag”编码，但是可以进行两个或多个突变。例如，当编码序列包含并排的两个“aaa”密码子时，两个都可能被“aag”密码子取代。

特别是考虑到得到的载体的所需稳定性时，优选引入至少两个突变到外源基因中。当外源基因包含并排的两个“aaa”密码子时，两个都优选被突变，而且可以被aag密码子取代。

用其中编码碱性氨基酸伸展序列的外源基因的部分包含一个突变的载体，获得了好的结果，其中所述突变存在于每个都编码碱性氨基酸的3个或4个连续密码子中。在其中碱性伸展序列仅仅包含3个氨基酸的情况中，可进行3个突变，但是当存在4个碱性氨基酸或更多时，可进行更多突变。

例如，当野生型序列包含氨基酸序列RRKK时，其由核苷酸序列aga aga aaa aaa编码(+正义序列，其中在可能的GE序列基序下划线)，该编码序列可以突变成仍然编码RRKK的agg agg aag aag。

单股反链病毒目病毒载体优选为新城疫病毒(NDV)载体，外源基因为致病性H5禽流感病毒的HA蛋白。

用NDV载体获得了好的结果，其中已经整合了修饰的致病性H5禽流感的HA基因(NDVH5m)。

HA基因已经整合到NDV载体的NDV融合(F)与血凝素-神经氨酸酶(HN)基因之间的基因间隔区中。HA基因是修饰的H5基因，其中根据本发明的方法，野生型“aga aga aaa aaa”序列已经变成“agg aggaag aag”序列。

该载体产生显著更多的全长HA转录物，表达显著较高水平的HA，而且在它的包膜中还包含更多的HA蛋白。

而且，NDVH5m在超过10次继代都稳定表达修饰的HA基因。用NDVH5m免疫接种鸡，诱导NDV-与AIVH5-特异性抗体，并在分别用致死剂量的速发型NDV或高致病性AIV攻击以后，保护鸡抗临床疾病。值得注意地，没有观察到流感病毒的排毒。而且，用NDVH5m免疫接种，容许根据抗AIV的核蛋白(NP)的抗体，对接种的和AIV领域病毒感染的动物进行血清学区分。因此，重组NDVH5m适合作为抗NDV和AIV的二价疫苗，而且可用作标记疫苗用于控制禽流感(AI)。

用于制备重组MV病毒载体的方法(该载体带有包含外源基因的另外的转录单位)是本领域公知的。

更特别地，在该方法中，分离的核酸分子和MV病毒的基因组，以它们的cDNA形式(+正义)使用。这允许容易的操作和插入想要的核酸分子到病毒基因组中。

一般，基因组的不同部分可用于在两个基因之间插入外源基因，也即基因间隔区(IGR)，基因的3’或5’非编码区，以及基因组的3’启动子近端(N/NP基因之前)或5’远端(L基因之后)中。

外源基因可以有利地插入到N/NP基因之前，NP-P，P-M，M-G/F，G/F-HN，HN-L之间，和L基因之后。

最简单的方法是使用已经现有的限制性内切酶(RE)识别序列，在这些位点之一用酶进行切割并引入合适的转录盒。由于天然存在的限制性内切酶识别序列并不总是位于预定位置，通常可以通过定点诱变或PCR诱变，把RE识别位点引入到基因组中。

待插入的转录盒的组成取决于插入的位点。例如，在转录盒被插入到IGR中的情况中，转录盒可以包含下列元件：3’RE识别位点-GS-非编码区-ORF(外源基因的)-非编码区-GE-RE识别位点5’。

做为选择，在引入转录盒到天然MV病毒基因的5′非编码区的情况中，转录盒可由以下物质组成：3’RE识别位点-GE-IGR-GS-非编码区-ORF(外源基因的)-非编码区-RE识别位点5’。

类似地，在引入转录盒到天然MV病毒基因的3′非编码区的情况中，转录盒可由以下物质组成：3’RE识别位点-非编码区-ORF(外源基因的)-非编码区-GE-IGR-GS-RE识别位点5’。

这种转录盒的制备和将其插入到MV病毒基因组中，只涉及常规的分子生物技术，如所列的参考文献中和本实施例中例示的。特别地，技术如定点诱变和PCR诱变可用于该目的(Peeters et al.，1999，上文；Current Protocols in Molecular Biology，eds.：F.M.Ausubelet al.，Wiley N.Y.，1995版，页码8.5.1.-8.5.9；和Kunkel etal.，Methods in Enzymology Vol.154，376-382，1987)。

更特别地，本发明的重组MV病毒载体，可通过沿用已久的“反向遗传学”的方法制备，其能进行MV目的非节段，负链RNA病毒的遗传修饰(例如Conzelmann，K.K.的综述，Current Topics Microbiol.Immunol.203，1-41，2004；and Walpita et al.，FEMS Microbiol.Letters 244，9-18，2005)。

在该方法中，合适的细胞，在足以容许MV(反)基因组和支持蛋白转录和共表达，以及重组MV载体产生的条件下，通过包括含有编码MV病毒的全长基因组，或者，优选，反基因组(正正义)的核苷酸序列的cDNA分子的载体，和一种或多种包括含有编码所需支持蛋白的核苷酸序列的cDNA分子的载体共转染。在该方法中，编码全长MV病毒(反)基因组的所述核酸分子，包括如上所述限定的另外的转录单位。

载体指复制子，如质粒，噬菌体或粘粒，另一个DNA节段可能附着到其上，以便引起附着的DNA节段在用该载体转染的细胞中复制和它的转录和/或表达。

优选地，用于全长基因组转录的载体是质粒，其包括编码MV病毒的(反)基因组的cDNA序列，旁临为位于它的5′末端的T7聚合酶启动子，和位于它的3’末端的(肝炎Delta)核酶序列，尽管也可以使用T3或SP6 RNA聚合酶启动子。

对于合适的支持蛋白的细胞内表达，优选使用包括编码这些蛋白的cDNA序列的质粒，在合适的表达调控序列例如T7聚合酶启动子的调控下进行。

在用于制备本发明的重组MV病毒载体的一种特别优选的方法中，使用编码MV病毒的N(或NP)，P和L蛋白的表达质粒。

用于这种反向遗传学技术的转染支持质粒的量或比例，覆盖了一个较大的范围。用于支持质粒N:P:L的比例范围可以为大约20:10:1到1:1:2，而且每种病毒的有效转染方案是本领域已知的。

通过T7 RNA聚合酶启动子和核酶序列的共同作用，使基因组RNA的精确拷贝在转染的细胞中进行，而且该RNA接着被共转染表达质粒提供的病毒支持蛋白包装并复制。

由感染转染细胞的重组牛痘病毒，尤其是由牛痘病毒vTF7-3，提供T7聚合酶酶是优选的，可是其他的重组痘载体，如禽痘病毒，例如fpEFLT7pol，或其他的病毒载体也可用于T7 RNA聚合酶的表达。

来自牛痘病毒的拯救病毒的分离，可以通过简单的物理技术如过滤很容易地完成。对于仙台病毒或NDV的拯救，可通过在具胚的卵中接种转染细胞的上清液来完成。

在一个更加优选的实施方案中，细胞系用于转录和表达载体的转染，所述载体组成型表达(T7)RNA聚合酶和/或一个或多个所需的支持蛋白。

例如，麻疹病毒的拯救可以在人胚肾细胞系，293-3-46中完成，其表达T7 RNA聚合酶和麻疹病毒支持蛋白N和P(Radecke et al.，EMBO J.14，5773-5784，1995)。可有利地用于本发明的另一个很有用的细胞系，是基于BSR的细胞，其表达T7 RNA聚合酶，也即BSR-T7/5细胞系(Buchholz et al.，J.Virol.73，251-259，1999)。

而且，Conzelmann，K.K.(上文)的综述和实施例1中，公开了这里用于制备本发明的MV病毒的关于反向遗传学技术的更详细的信息。

重组MV病毒载体稳定表达外源基因的能力，已经导致了用于预防和治疗应用的载体的发展。

在本发明的重组MV病毒载体中，外源基因可以根据特定的MV病毒载体种类和病毒载体的应用而改变。

外源基因可以编码(其他的)微生物病原体(例如病毒，细菌或寄生虫)的抗原，特别是外源基因编码能引起保护性免疫应答的病原体的抗原。

例如，可以插入到本发明的病毒载体中的异源基因序列包括，但不限于流感病毒糖蛋白基因，尤其是，禽流感病毒的H5和H7血凝素基因，来源于传染性囊病病毒(IBDV)的基因，特别地(IBDV)的VP2，来源于传染性支气管炎病毒(IBV)，猫白血病毒，犬瘟热病毒，马传染性贫血病毒，狂犬病病毒，埃利希氏体属生物体，特别是犬埃里希氏体，呼吸道合胞病毒，副流感病毒，人metapneumoviruses和麻疹病毒的基因。

做为选择，外源基因可以编码多肽免疫调节剂，其能例如通过共表达细胞因子如白细胞介素(例如IL-2，IL-12，IFN-γ，TNF-α或GM-CSF)增强或调节对病毒感染的免疫应答。

MV目包括能在人和动物，或在二者(例如，狂犬病病毒和新城疫病毒)中复制的病毒。因此，外源基因可以选自各种人和兽医学微生物病原体。

尽管所有的MV病毒都可用作本发明的病毒载体，在本发明的一个优选的实施方案中，重组MV病毒载体分别是弹状病毒科的病毒，优选狂犬病毒属或弹状病毒属的病毒，更优选狂犬病病毒或IHNV种。

在一个也优选的实施方案种，重组MV病毒是副粘病毒科，优选Respovirus属，特别是hPIV3或bPIV3种；Morbillivirus，特别是CDV种；Pneumovirus，特别是RSV种；和Avulavirus，特别是NDV种的病毒。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，提供了一种重组MV病毒载体，其中病毒是新城疫病毒(NDV)。由于NDV能在人和动物中，特别是禽类，更特别地鸡中复制，本发明的重组NDV载体可包含编码病原体，特别是呼吸病原体的抗原的外源基因，或包含编码能在人或任何这些动物中引起合适的免疫应答的免疫调节剂的外源基因。

Peeters等(J.Virology 73，5001-5009，1999)， rfer等(J.Gen.Virol.80，2987-2995，1999)，以及Conzelmann，K.K.(上文)的综述中，已经公开了特别用于NDV的，NDV的遗传操作的反向遗传学方法。而且，已知NDV可用作载体用于外源基因的表达，例如，用于在用NDV载体感染的动物中引起免疫应答(Nakaya et al.，2001，上文)和Swayne et al.，Avian Dis.47，1047-50，2003)。

外源基因可以有利地引入到NDV基因组中的不同位置，如上面对MV病毒的一般描述的。特别地，在本发明的重组NDV载体中，外源基因(作为合适的转录单位的部分)，可以插入到下列NDV基因之间：NP-P，P-M，M-F，F-HN，HN-L，而且位于3’近端-和5’远端的基因座(Zhao et al.，2003，上文；Nakaya et al.，2001，上文)，优选位于3’近端，P-M，M-F和F-HN区，F-HN区是最优选的。

在本发明的一个特定的实施方案中，提供了一种重组NDV载体，其中另外的转录单位位于F-HN基因之间。

本发明的重组NDV载体，可有利地用于在禽类，特别是鸡中，诱导抗其他的病原体的免疫应答。因此，重组NDV载体，优选包括编码禽病原体，特别是流感病毒，马立克氏病病毒(MDV)，传染性喉气管炎病毒(ILTV)，传染性支气管炎病毒(IBV)，传染性囊病病毒(IBDV)，鸡贫血病毒(CAV)，reo病毒，禽逆转录病毒，家禽腺病毒，火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)，大肠杆菌，Eimeria species，Cryptosporidia，支原体如M.Gallinarum，M.synoviae和M.meleagridis，Salmonella-，Campylobacter-，Ornithobacterium(ORT)或Pasteurella sp的保护性抗原的外源基因。

更优选地，重组NDV载体包括编码AIV，MDV，ILTV，IBV，TRTV，大肠杆菌，ORT或支原体的抗原的外源基因。

特别地，重组NDV载体突变体包括流感病毒，优选禽流感病毒(AIV)，更优选高致病性AIV的血凝素(HA)基因，特别是H5或H7 AIV的HA基因。

原则上，所有的(禽)流感株的HA基因都可用于本发明。本领域已经公开了许多HA基因的核苷酸序列，而且相关的HA基因可以从核酸序列数据库，如GenBank或NCBI数据库重新得到。

如上所述，最近分离的，高致病性H5N2亚型AIV A/鸡/Italy/8/98的血凝素(HA)基因，可有利地用作本发明中的外源基因。在真核表达载体pcDNA3(Invitrogen)中逆转录，克隆该基因，并进行测序(Luschow et al.，Vaccine，vol.19，p.4249-4259，2001，GenBank登录号AJ305306)。使用产生人工的RE识别位点的特异性引物，该位点允许把HA基因插入到NDV基因组序列中，从获得的表达质粒pCD-HA5，通过扩增，可以获得HA基因。

在另一个实施方案中，如上所述，高致病性H7N1亚型AIV A/鸡/Italy/445/99的HA基因，可用作本发明的外源基因。HA基因进行逆转录，并通过PCR扩增。1711bp产物克隆到SmaI消化的载体pUC18(Amersham)中，并进行测序(Veits et al.，J.Gen.Virol.84.3343-3352，2003；和GenBank登录号AJ580353)。

在本发明的一个特别有利的重组MV病毒载体中，MV载体病毒是减毒的，那就是说，载体病毒对于靶动物是不致病的，或者与野生型病毒相比，显示毒性的大幅度削减。这里使用的许多MV病毒如病毒载体，具有如活的减毒疫苗如麻疹病毒和NDV一样的长安全记录，但是其他的病毒，如SeV和VSV认为对人是不致病的。此外，传统方法存在以获得和筛选减弱病毒，其显示有限的复制或传染可能性。这种技术包括在异源的基质中连续(冷)传代病毒，和化学诱变。

本发明的重组NDV载体可来源于任何常规的ND疫苗株。这种商业可获得的ND疫苗中存在的适合的NDV株的例子是：

，LaSota，Hitchner B1，NDW，C2和AV4；

是优选的株。

本发明人还发现，本发明的重组MV病毒载体，能在动物中诱导保护性免疫应答。

因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了抗微生物病原体的疫苗，其包括如上限定的活或灭活形式的重组MV病毒载体，和药学上可接受的载体或稀释剂。

本发明的疫苗可通过常规方法制备，如通常用于商业可获得的活和灭活MV病毒疫苗的那些方法。

简要地，用重组MV病毒载体接种敏感的基质并繁殖，直到病毒复制到想要的滴度，然后收获含有病毒的物质。接着，把收获的物质配制成具有免疫特性的药物制品。

能支持重组MV病毒载体复制的每种基质，都可用于本发明。作为基质，可使用来自于原核和真核来源的宿主细胞，取决于MV病毒。合适的宿主细胞可以是脊椎动物，例如，灵长类动物的细胞。适合的例子是：人细胞系HEK，WI-38，MRC-5或H-239，猿细胞系Vero，啮齿类动物细胞系CHO，BHK，犬细胞系MDCK或禽CEF或CEK细胞。

本发明的重组NDV载体可以在其上面繁殖的特别适合的基质是SPF具胚的卵。具胚的卵，可以用例如0.2ml NDV接种，其包括每个卵中含有至少10^2.0 EID₅₀的尿囊液。优选的，9到11天的具胚卵，用大约10^5.0 EID₅₀接种，并接着在37℃孵育2-4天。2-4天以后，优选可通过收集尿囊液，收获ND病毒产物。通过过滤器(100μm)过滤上清液之后，液体其后可以2500g离心10min。

本发明的疫苗包括与药学上可接受的载体或通常用于这种组合物的稀释剂一起的重组MV病毒载体。

可以悬浮液的形式或冷冻干燥的形式，制备和销售包含活病毒的疫苗。载体包括稳定剂，防腐剂和缓冲液。稀释剂包括水，含水的缓冲液和多元醇。

在本发明的另一个方面中，提供了包含灭活形式的重组MV病毒载体的疫苗。灭活疫苗的主要优点是它的安全，和可诱导的长期的高水平保护性抗体。

繁殖步骤以后收获的病毒灭活的目标是，消除病毒的繁殖。通常，这可通过公知的化学或物理方法完成。

如果需要，本发明的疫苗可包含佐剂。用于这种目的的适合的化合物和组合物的例子是氢氧化铝，磷酸铝或氧化铝，基于例如矿物油的水包油或油包水乳剂，如Bayol 

或Marcol 

或植物油如维生素E醋酸盐，和皂草苷。

本发明疫苗的给药可通过任何公知有效的形式进行，而且取决于MV病毒载体的类型。适合的给药模式包括，肠胃外，鼻内，口服和喷雾接种疫苗。

本发明的NDV载体疫苗，优选通过通常用于NDV疫苗接种的廉价集中使用技术来施用。对于NDV疫苗接种，这些技术包括饮用水和喷雾疫苗接种。

本发明的疫苗包括有效剂量的重组MV病毒载体作为活性组分，也即免疫MV病毒物质的量，其将在接种的禽类中诱导抗通过毒性微生物有机体的攻击的免疫性。免疫性这里定义为，疫苗接种以后，相较于未接种的组，在人或动物群体中，诱导抗致死率和临床症状的显著较高水平的保护。特别地，本发明的疫苗预防大部分接种的人或动物，以防疾病的临床症状和致死率的发生。

一般地，活疫苗可以10^2.0-10^8.0组织培养/胚胎感染剂量(TC/EID₅₀)的剂量施用，优选以10^4.0-10^7.0TC/EID₅₀的剂量范围。灭活疫苗可以包含10^4.0-10^9.0TC/EID₅₀的抗原同等物。

本发明还包括联合疫苗，其包括，除了本发明的重组MV病毒载体以外，能诱导保护以防另外的病原体的疫苗株。

附图简述：

图1

表达AIV H5的重组NDV的构建。转录调控信号通过灰色三角形用于转录起始进行标记，灰色矩形用于转录终止序列进行标记。NDV的HN ORF被AIV的H5 ORF取代，接着插入HN基因，如材料和方法中所述(步骤A-C)。重组NDVH5(步骤D)包含可信的HA序列，而重组NDVH5m携带HA，其中切割位点序列通过沉默突变改变(步骤E-F)。

图2

NDV重组体产生的转录物的Northern印迹分析。感染8小时以后，制备用NDV克隆30(NDV)，NDVH5，NDVH5m或AIV A/鸡/Italy/8/98(H5N2)感染的CEK细胞和未感染细胞(NI)的总RNA。在变性琼脂糖凝胶中分离RNA，转移到尼龙膜上，并用NDV-F(左边)，AIV-H5(中间)和NDV-HN(右边)的³²P标记的基因特异性反义cRNA杂交。6μg的各个RNA进行Northern杂交，除了中间印迹的AIV道外，其中仅仅点样2μg，以避免过度的AIV信号。RNA标记的大小在左边以千碱基(kb)表示。

图3

在感染细胞中产生的，或整合到表达AIV的HA的NDV重组体中的蛋白的Western印迹分析。NDV Clone 30，NDVH5，NDVH5m或AIV(H5N2)的感染细胞(A)或纯化病颗粒(B)的裂解物，用AIV亚型H5特异性抗血清(α-AIV；上面板)，或用NDV特异性抗血清(α-NDV；下面的板)孵育。用过氧化物酶缀合的第二抗体孵育以后，通过化学荧光显示结合。标记蛋白的位置表示于左边，AIV血凝素的未裂解(HA₀)和加工的形式(HA₁，HA₂)表示于右边。在AIV感染的细胞或病颗粒中，对应于NP/NA和M的另外的病毒蛋白也是可检测的。

图4

通过HI试验(A，灰条)或通过IF试验(A，白条)，测定HA特异性抗体。用速发型NDV Herts(B)或高致病性H5N2 AIV(C，D)攻击以后，用NDVH5m(H5m)免疫一次(B，C)或两次(D)的鸡，和对照动物(C)的死亡率和临床指数。每天观察动物的临床征象，持续10天的时间，并划分为健康的(0)，生病的(1)，严重生病的(2)，或死亡的(3)。计算临床指数，其显示每组这段时间的所有鸡的平均值。

图5

通过NP-ELISA进行血清学检查。通过间接的NP-ELISA，以1:500的稀释度，研究鸡的血清。对用rNDV/AIVH5-BMUT免疫后(p.i.)21天收集的，和随后AIV攻击(p.c.)以后21d收集的鸡血清的提高的P/N-比例进行绘图。通过虚线标记2.0的截止值。

实施例：

实施例1：包括未修饰的(野生型)H5基因和修饰的H5基因的NDV载体的构建和蛋白的表达。

通过反向遗传学构建表达H5亚型的禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)的新城疫病毒(NDV)。缓发型NDV株Clone 30的基因组的克隆全长拷贝用于把编码高致病性(HP)AIV分离物A/鸡/Italy/8/98的HA的开放式阅读框(H5N2，Genbank登录号AJ305306)插入到NDV融合(F)基因与血凝素-神经氨酸酶(HN)基因之间的基因间隔区。

3次继代以后，NDVH5重组体的滴度与亲代病毒Clone 30的相似(10⁹TCID₅₀/ml)，通过RT-PCR证实插入的H5基因的存在。为了证实外源基因的正确转录，进行Northern印迹分析(图2)。尽管重组NDV与AIV(H5N2)中的H5 ORF是相同的，克隆到NDV中的H5 ORF的旁邻为来源于HN基因的非编码序列的大约270个核苷酸。因此，NDVH5与AIV mRNA之间的大小差异，分别与～2kb与1.7kb mRNA的预期大小很吻合(图2，中间)。但是，NDVH5中出现了大约1kb的第二个转录物。(图2，中间，第3道)。

如Northern印迹分析显示的，重组NDVH5m只产生预期大小的2kbH5转录物(图2，中间，4道)，这证实NDVH5中的短转录物终止于HA切割位点，而且很可能只代表HA₁区。

由于修饰的结果，NDVH5m产生比NDVH5多1.8倍的全长HA(HA₀)。AIV感染细胞中的全长HA转录物，分别比NDVH5m和NDVH5多3.4倍和6倍。不同于NDVH5的H5切割位点序列，其已经在5次传代中改变，该区内的NDVH5序列在整个试验的10次传代中都保持稳定(表1)。用NDV F和HN探针杂交证实旁邻NDV基因的正确转录，因为亲本NDVClone30的F与HN mRNA之间没有大小差异(图2)。而且，作为HAORF插入的结果，只观察到HN基因转录速率的轻微降低(图2，右)。

为了证实NDV重组体的AIV H5的特异性表达，对感染的CEF细胞进行间接IF试验。用NDV特异性抗血清孵育，显示用NDV Clone 30，NDVH5和NDVH5m感染的细胞中显著的荧光，而用AIV-H5N2感染的细胞中没有。另一方面，AIV亚型H5特异性抗血清，显示在用AIV，NDVH5和NDVH5m感染的细胞中特异性表达H5，而用亲本NDV感染的细胞是阴性的。尽管AIV感染细胞的H5表达强度显著高于两种重组体，但是发现NDV重组体的H5表达水平是显著的。

根据这个，只点样多3倍的NDVH或NDVH5 RNA量到RNA凝胶上，以获得类似的杂交信号，示于图2中(中间)，这表明AIV产生大约多3倍的转录物，和推测上这么多的蛋白。令人感兴趣地，NDVH5m感染细胞的H5表达似乎比用NDVH5感染的细胞中更高效，其可归因于取消了H5的成熟前转录终止的沉默突变。

实施例2：AIV H5蛋白整合到NDV颗粒的包膜中。

以前的研究表明，在缺乏特异性整合信号时，外源蛋白可能被动地整合到不相关病毒的包膜中(Kretzschmar，E.et al.，1997，J.ofVirology，vol.71，p.5982-5989)。由于这种被动整合的效率主要取决于蛋白的表达水平，我们确定了重组病毒表达的HA蛋白是否正确地裂解，并整合到NDV重组体的包膜中(图3)。在两种重组体感染的细胞中，AIV亚型H5特异性抗血清检测到了大约70，50和25kDa的3种蛋白，其表示未裂解的HA₀和裂解的HA₁和HA₂蛋白(图3A)。这证明重组体表达的HA可接近蛋白水解酶。用NDVH5病毒感染的细胞中产生的总HA蛋白显著低于NDVH5m的，而且NDVH5感染细胞总的HA₂蛋白几乎不能看见。正如所料，在NDV Clone 30感染细胞总没有检测到反应性，而在AIV-H5N2感染细胞中检测到所有对应的HA蛋白种类。由于AI特异性血清抗完整病毒，推测相当于NP/NA和M的其他蛋白种类也在AIV感染的细胞中检测到(图3)。有趣地，纯化病颗粒的Western印迹分析表明，HA蛋白有效地整合到两种重组体的包膜中(图3B)。虽然，对更多的NDVH5病毒蛋白进行了Western印迹分析，整合到NDVH5中的HA₂蛋白的量仍然显著低于NDVH5m病颗粒中的HA₂。这证明NDVH5产生和整合少得多的HA₂蛋白，大概是由于较少蛋白的可利用性(由于切割位点的成熟前终止的结果)。

实施例3：携带AIV HA蛋白的重组NDV在鸡中是安全的。

测定给定的NDV分离物的毒性程度的一种灵敏方法，是脑内接种以后，确定病毒对1天龄鸡的致病性(CEC(1992)Official Journalof the European Community L 260，1-20.)。最强的病毒将产生指数，其接近2.0的最大分数，而缓发型株将产生接近0.0的值。因为AIV的血凝素是重要的毒性决定子，测定NDVH5和NDVH5m的脑内致病性指数(ICPI)，以评估HPAI病毒的H5的表达是否改变NDV毒性。ICPI值是0.0，在两种重组体的最大可能分数2之外，这证明除了它自身的蛋白外，AIVH5的表达没有显著影响NDV毒性。为了比较，缓发型NDV疫苗株的ICPI必须低于0.5，用于可能的活病毒疫苗应用。

实施例4：表达AIV HA蛋白的重组NDV保护鸡抗NDV和AIV攻击。

由于NDVH5m较高地表达H5蛋白，在动物试验中只试验了该重组体。重组体NDVH5因而以每只动物10⁶ EID₅₀的剂量，通过眼鼻途径，施用给25只3周龄的鸡。观察期间，所有的动物都保持健康，而没有任何有害反应或任何疾病的临床征象。如通过HI试验所测定的，AIV H5特异性抗体于疫苗接种以后第14天在28％的血清中首次可检测到，并在第21天增加到92％(图4A)。但是，使用间接IF试验，在免疫后第7天在96％的血清中，检测到抗AI的免疫性的较早发生(图4A)。

为了测定单次疫苗接种的保护作用，5和10个接种动物的组，与合适数量的对照动物，分别进行抗NDV和AIV的第一轮致命攻击。不出乎意料地，100％的接种动物被保护抗致命速发型NDV攻击，而所有的对照动物在4天内死亡，其显示典型的ND征象(图4B)。高致病性AIV-H5N2攻击感染，在非免疫鸡中引起严重疾病，其死亡率为100％。相反，所有的NDVH5m免疫组动物经受致死剂量的高致病性AIV后幸存。10只鸡中的7只保持完全健康，而3只动物显示很轻微的呼吸症状。但是，相较于对照组2.61的临床分数，0.05的结果临床分数是可以忽略的(图4C)。为了确定加强疫苗接种在保护鸡抗AI中的作用，剩余的10只鸡在第一次疫苗接种以后42天接受第二次免疫，并在其后两周进行攻击。致死剂量的同源HPAI病毒以后，所有的动物完全防止临床疾病，而所有的对照动物发展严重疾病，并在4天内死亡，其导致2.66的临床分数(图4D)。

实施例5：NDV-AI疫苗减少AIV脱落(shedding)：

对于成功的AI疫苗，除了安全和有效预防疾病以外，该疫苗应该能有效预防病毒脱落。为了确定病毒脱落的数量，在攻击后的不同时间，对气管和泄殖腔拭子进行定量实时RT-PCR。攻击后第2天，在两个对照组的所有未免疫但是攻击的鸡中都检测到病毒RNA。第一次与第二次AIV攻击的对照鸡的拭子的阈循环(Ct)值，分别为32.2-38.1与29.2-35.5。由于所有的对照动物在攻击的4天内死亡，对该组没有进行更进一步的试验。相反，在大部分免疫动物中没有检测到vRNA(60个拭子中的49个)。

实施例6：NP-ELISA检测循环AIV：

家禽常规疫苗接种的一个最大的担忧，是疫苗接种可能使病毒能在禽类中未检测到的循环。由于重组NDV疫苗只包含HA基因，基于高免疫原性核蛋白基因的ELISA，用于分析从攻击之前和攻击之后不同时间的接种动物收集的血清。尽管抗AIV NP的抗体，攻击感染之前存在于所有动物的血清中，但是分别在AIV攻击以后的第7和21天在90％和100％的鸡中检测到NP清转化(图5)。这证明基于NP的ELISA试验不仅能把接种的动物从感染动物区分开，而且便于在接种的禽类中检测任何循环病毒。

实施例7：实施例1-6的材料和方法。

病毒和细胞：前面已经描述了基于Clone-30疫苗株的重组NDV(Romer-Oberdorfer，A.，Mundt，E.，Mebatsion，T.，Buchholz，U.J.& Mettenleiter，T.C.(1999)，J.Gen.Virol.80(Pt 11)，2987-2995.)。流感病毒分离物A/鸡/Italy/8/98(H5N2)由I.Capua提供。速发型NDV株Herts 33/56和NDV Clone 30疫苗(

)获自Intervet Int.BV，Boxmeer，The Netherlands。病毒在无特异性病原(SPF)的10天龄具胚的鸡蛋中繁殖。稳定表达噬菌体T7 RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞(Buchholz，U.J.，Finke，S.& Conzelmann，K.K.(1999)J.Virol.73，251-259)用于从cDNA回收感染性NDV。初级鸡胚胎成纤维细胞(CEF)，初级鸡胚胎肾(CEK)细胞，或鹌鹑肌细胞(QM9-R)，用于研究蛋白表达和病毒复制。

表达AIV H5基因的重组病毒的构建：

质粒pflNDV-1，其表达Clone 30的全长反基因组RNA(Romer-Oberdorfer，A.，Mundt，E.，Mebatsion，T.，Buchholz，U.J.& Mettenleiter，T.C.(1999)J.Gen.Virol.80(Pt 11)，2987-2995)，用于引入AIV H5基因。首先，把Clone 30基因组的NotI/BsiWI-片段(4953-8852nt)克隆到pUC18质粒中(步骤A，图1)。然后使用引物MP1(5′-gacaacagtcctcaaccatggaccgcgccg-3′，SEQ ID NO：1)和MP2(5′-ctggctagttgagtcaattcttaaggagttggaaagatggc-3′，SEQ ID NO：2)，引入新建的NcoI和AfIII位点(步骤B)。通过包含人工NcoI或AfIII限制性位点的特异性引物(PH5F2：5′-ccttccatggagaaaatagtgcttc-3′，SEQ ID NO：3，和PH5R2：5′-cctccttaagtataattgactcaattaaatgcaaattctgcactgcaatgatcc-3′，SEQ ID NO：4)，已经从质粒pCD-HA5(Luschow，D.，Werner，O.，Mettenleiter，T.C.& Fuchs，W.(2001)Vaccine 19，4249-4259)扩增的AIV H5开放式阅读框(ORF)，用于在利用NcoI和AfIII消化以后，取代Clone 30的HNORF(步骤C)。而且，使用引物MP3(5′-caaaacagctcatggtacgtaatacgggtaggacatgg-3′，SEQ ID NO：5)和MP4(5′-gaaaaaactaccggcgatcgctgaccaaaggacgatatacggg-3′，SEQID NO：6)，将新的SgfI-和SnaBI位点引入到L基因前面的基因间隔区中(步骤C)。使用引物MP3和MP5(5′-gaaaaaactaccggcgatcgctgaccaaaggacgatatacggg-3′，SEQ ID NO：7)，产生了位于HN基因旁邻类似的位点(步骤D)，用于克隆H5ORF后的HN基因的目的(步骤E)。如图1的步骤F所示，使用引物MPH5F2(5′-ggaatgtccctcaaagaaggaggaagaagagaggactatttggggc-3′，SEQ ID NO：8)，通过沉默突变对类似于NDV的转录终止序列的H5裂解序列进行修饰。最后，pf1NDV-1的NotI/BsiWI-片段被从步骤E或F获得的类似片段取代，以分别产生全长克隆NDVH或NDVHm(图1)。得到的克隆的长度(17196个核苷酸)可被6分解，从而满足“6的规则”。这里描述的所有诱变反应，都使用Quik Change II XL定点诱变试剂盒(Stratagene)进行。

转染和病毒回收：

为了回收表达AI的H5的重组NDV，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，以1:1.5的DNA：Lipofectamine 2000比率，把全长克隆与表达NP，P和L蛋白的质粒一起转染到BSR-T7细胞中。病毒繁殖和感染性病毒回收的确认，基本上如前面所述的进行(Romer-Oberdorfer，1999，supra；Engel-Herbert，I.，Werner，O.，Teifke，J.P.，Mebatsion，T.，Mettenleiter，T.C.&Romer-Oberdorfer，A.(2003)J.Virol.Methods 108，19-28)。

Northern印迹分析：

以每细胞10的感染复数(MOI)，用NDVClone 30，NDVH5，NDVH5m或AIV-H5N2感染CEK细胞，并于37℃孵育8h。如其它地方所述的，制备感染和未感染细胞的总RNA(Chomczynski，P.& Sacchi，N.(1987)Analytical Biochemistry 162，156-159)，在变性琼脂糖凝胶中分离，并用放射性同位素标记的cRNA杂交(Fuchs，W.& Mettenleiter，T.C.(1996)J.Gen.Virol.77(Pt 9)，2221-2229)。包含AIV-H5N2血凝素，NDV Clone 30 F和HN的开放式阅读框架的质粒，用于³²P标记的cRNA的体外转录(SP6/T7转录试剂盒，Roche)。

Western印迹分析：

以5的MOI，用NDVCl one 30，NDVH5，NDVH5m或AIV-H5N2感染CEK细胞，并于37℃孵育30h。连续蔗糖梯度(30-60％)纯化的感染细胞或病颗粒的裂解物，通过SDS-PAGE进行分离，并转到硝酸纤维素滤膜上(Trans-Blot SD cell，Bio-Rad)。印迹用抗NDV的多克隆兔抗血清，或抗H5亚型的AIV的多克隆鸡抗血清(Intervet Int.BV，Boxmeer，NL)进行孵育。使用SuperSignal West Pico化学发光基质(Pierce)，在X光胶片(Hyperfilm MP，Amersham)上，通过化学荧光检测过氧化物酶缀合的种特异性第二抗体(Dianova)的结合。

动物试验：

根据欧洲共同体委员会指令中所描述的，通过测定1天龄鸡中脑内致病性指数(ICPI)，来确定NDV重组体的安全(CEC(1992)Official Journal of the European Community L 260，1-20.)。把10⁶ EID₅₀的NDVH5m通过眼鼻施用给25只3周龄的SPF鸡中，来进行疫苗接种实验。为了评估单次疫苗接种以后，重组体的保护能力，5只接种的与5只另外的对照一起，接种以后3周用10^5.3 ELD₅₀的NDV株Herts 33/56进行肌内攻击。同样，10只接种的与9只另外的对照动物一起用10^7.7 EID₅₀的高致病性AIV-H5N2进行眼鼻攻击。剩余的10只鸡在第一次接种以后6周接受第二次免疫接种，并在其后2周，与5只另外的对照动物一起进行类似的AI攻击。免疫接种和攻击感染以后，每天观察所有鸡的临床征象，观察10天。

通过实时RT-PCR进行病毒脱落分析：

收集口咽和泄殖腔拭子，以在攻击以后第2，4，8和14天，通过实时RT-PCR分析AIV脱落。使用Nucleo Spin试剂盒(Macherey-Nagel)，或者使用病毒RNA试剂盒(Qiagen)通过Tecan-Automat人工制备来自口咽或泄殖腔拭子的RNA。为了检测攻击感染以后的AIV脱落，使用基于M基因扩增的甲型流感病毒实时RT-PCR方法(18)。通过异源内部控制系统，检查RT-PCR期间的RNA提取和抑制因子(19)。使用一步RT-PCR试剂盒(带有

Tag DNA聚合酶的Superscript^TM III One-step RT-PCR系统(Invitrogen))，在MX3000p(Stratagene)循环仪上，进行双重分析。温度模式是50℃ 30min，94℃ 2min，接着进行42个循环的94℃ 30sec，57℃ 30sec和68℃ 30sec。

HI和NP-ELISA：

为了确定NDV和AIVH5抗体的存在，在第0，7，14和21天收集血样，并进行血细胞凝集-抑制(HI)试验，如欧洲共同体委员会指令所述(CEC(1992)Official Journal of the European Community L260，1-20；CEC(1992)Official Journal of the EuropeanCommunities L 167，1-1620，21)。为了确定免疫接种以后AIV-H5的存在，通过用AIV感染的CEF孵育血清的1:100稀释物，血清另外用于间接免疫荧光(IF)。通过基于核蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)(NP-ELISA)，研究抗AIV核蛋白(NP)的抗体。为了该目的，纯化的重组杆状病毒来源的谷胱甘肽-S-转移酶-NP融合蛋白，其包含AIV NP gene的全部编码区，用作抗原。在包含0.05％吐温20的PBS中以1:300稀释的血清，以一式两份进行研究。使用邻苯二胺，通过显色反应，检测第二POD-缀合的山羊-α-鸡IgG(H+L)(ROCKLAND)抗体的结合，并于492nm测定吸收。

实施例8：包含修饰的H7基因的NDV载体的构建：

在基本上与如上所述的那些类似的实验中，制备携带修饰的H7基因的NDV载体构建体。来源于HP H7N1 AIV分离物的插入物：A/chicken/Italy/445/99，其序列在GenBank中以登录号AJ 580353公开；也参见：Veits，J.et al.2003(J.of Gen.Virol.，vol.84，p.3343)。H7基因插入到NDV载体中的F与HN基因之间，其旁邻为来自HN基因的非编码序列。

H7 HA基因的切割位点区之后，存在可能的基因末端序列。1195-1206核苷酸中的原始序列为：ata gaa aaa act，其编码氨基酸IEKT，被突变成ata gag aag act，仍然编码IEKT。

相较于未修饰的H7基因的表达，这导致了通过NDV载体，修饰的H7序列稳定和提高的表达与呈递。

序列表

<110>Intervet International BV

<120>表达禽流感病毒的H5血凝素的重组新城疫病毒

<130>2006-008-FF

<150>EP 06111222.3

<151>2006-03-15

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物

<400>1

<210>2

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物

<400>2

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物

<400>3

<210>4

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物

<400>4

<210>5

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物

<400>5

<210>6

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物

<400>6

<210>7

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物

<400>7

<210>8

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆引物

<400>8

Claims (13)

1.一种生产带有另外的转录单位的重组单股反链病毒目(Mononegavirales)病毒载体的方法，该转录单位包括与上游的单股反链病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的单股反链病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作连接的外源基因，其特征在于该外源基因序列编码一种蛋白，该蛋白包含至少3个碱性氨基酸的伸展序列，所述伸展序列由精氨酸(Arg)和/或赖氨酸(Lys)残基组成，并包含至少1个赖氨酸，其中按照如下方式选择外源基因的核苷酸序列，即以它不含有可被单股反链病毒目病毒的病毒聚合酶识别为基因末端(GE)序列的序列。

2.权利要求1的方法，其特征在于通过定点诱变，对编码所述至少3个碱性氨基酸的伸展序列的野生型外源基因序列的部分进行突变，以消除可能被单股反链病毒目病毒的病毒聚合酶识别为基因末端(GE)序列的任何序列，以产生修饰的外源基因序列。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于在最初存在于野生型外源基因序列中的t/aGAAAA序列内，引入至少一个突变，借此腺嘌呤伸展序列的“A”被另一个核苷酸取代。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于突变是沉默的。

5.根据权利要求3-4的方法，其特征在于至少一个aaa密码子被aag密码子取代。

6.根据权利要求3-5的方法，其特征在于进行至少2个点突变。

7.根据权利要求3-6的方法，其特征在于至少2个aaa密码子被aag密码子取代。

8.权利要求3-7的方法，其特征在于编码序列aga aga aaa aaa被编码序列agg agg aag aag取代。

9.根据权利要求1-8的方法，其特征在于单股反链病毒目病毒载体是新城疫病毒(NDV)载体，而且外源基因编码致病性H5禽流感病毒的HA蛋白。

10.一种带有另外的转录单位的重组单股反链病毒目病毒载体，该转录单位包括与上游的单股反链病毒目病毒基因起始(GS)序列和下游的单股反链病毒目病毒基因末端(GE)序列可操作连接的外源基因，其特征在于该外源基因序列编码一种蛋白，该蛋白包含至少3个碱性氨基酸的伸展序列，所述伸展序列由精氨酸(Arg)和/或赖氨酸(Lys)残基组成，并包含至少1个赖氨酸，其外源基因不含有可被单股反链病毒目病毒的病毒聚合酶识别为基因末端(GE)序列的序列。

11.根据权利要求10的重组单股反链病毒目病毒载体，其特征在于外源基因编码致病性禽流感病毒的血凝素(HA)蛋白，其中碱性氨基酸的伸展序列包含并排的至少2个赖氨酸，而且其中这些赖氨酸的至少一个由aag密码子编码。

12.根据权利要求10-11的重组病毒载体，其特征在于碱性氨基酸的伸展序列包含氨基酸序列Ar g Lys Lys，其由核苷酸序列aggaagaag编码。

13.一种抗微生物病原体的疫苗，其包含根据权利要求10-12的任一项的重组MV病毒载体和药学上可接受的载体或稀释剂。

Images