JP2024502658A - 麻疹－ｈｉｖ又は麻疹－ｈｔｌｖワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、免疫不全ウイルス(IV)又はHTLVポリペプチドを発現する組換え麻疹ウイルスに関し、特に、少なくとも1つの免疫不全ウイルス又はヒトTリンパ球向性ウイルスのタンパク質を含む麻疹ウイルス及び/又はウイルス様粒子(VLP)により発現される免疫原性免疫不全ウイルス粒子に関する。これらの粒子は、投与後に宿主において複製することができる組換え感染性粒子であってもよい。本発明は、これらの組換え感染性粒子を産生するための手段、特に核酸構築物、ベクター、細胞、及び救済系を提供する。また、本発明は、HIV又はHTLVによる感染症の治療又は予防のための、特に組成物の形態での、より詳細にはワクチン製剤におけるこれらの組換え感染性粒子の使用に関する。

Description

本出願は、概して、そのタンパク質、ポリペプチド、抗原性断片、及びその突然変異バージョンを含む免疫不全ウイルス(IV)抗原又はヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)抗原、特に、少なくとも1つのヒト(HIV;特にHIV-1又はHIV-2)、サル(SIV)、若しくはネコ(FIV)(本明細書ではこの3つはすべて頭字語IVで参照される)免疫不全ウイルス、又はHTLV-1、HTLV-2、若しくはHTLV-3ウイルス抗原、タンパク質、ポリペプチド、その抗原性断片、及びその突然変異バージョンをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え麻疹ウイルスcDNAを含む組換え遺伝子構築物に関する。また、本出願は、遺伝子構築物又はウイルスの使用、より詳細には、免疫不全ウイルス又はHTLV及び/又は麻疹ウイルス(MV又はMeV)に対する防御を誘導するためのそれらの適用に関する。
本発明の手段は、より詳細には、決定されたIV若しくはHTLVの以下の抗原:GAG、ENV、及びNEF、又はその短縮バージョン、又はその突然変異バージョン、又はその抗原性断片の少なくとも1つの発現を可能にする組換え核酸構築物の組合せであって、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、HIV、SIV、及びFIV、特に任意の既知クレードに由来するHIV、より詳細にはHIV-1又はHIV-2、最も好ましくはHIV-1に起源を有するか又は由来してもよく、ENV及び/又はNEFの免疫抑制ドメインは突然変異している、組換え核酸構築物の組合せに関する。本発明の手段は、より詳細には、決定されたHTLVの以下の抗原:GAG、ENV、及びHBZ(及び該当する場合はTAX)、特にHBZ及び該当する場合はTAX、又はその短縮バージョン、又はその突然変異バージョン、又はその抗原性断片のうちの少なくとも1つの発現を可能にする組換え核酸構築物の組合せであって、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、HTLV、特にHTLV-1、HTLV-2、又はHTLV-3、より詳細にはHTLV-1に起源を有するか又は由来してもよく、ENVの免疫抑制ドメインは突然変異している、組換え核酸構築物の組合せに関する。
また、本発明は、以前に言及したIV又はHTLV抗原、ポリペプチド、その抗原性断片、又はその突然変異バージョン、即ちGAG及びENV、並びに該当する場合はNEF又はHBZ(及びTAX)の少なくとも1つを発現する組換えMeV-IV又はMeV-HTLVウイルスに関する。また、本発明は、組換え麻疹ウイルスにより発現され、IV若しくはHTLV抗原、特に少なくともGAG及びENV並びに該当する場合はNEF若しくはHBZ(及びTAX)抗原、ポリペプチド、その抗原性断片、その短縮及び/若しくは突然変異バージョン、並びに/又は少なくともGAG、ENV、及びおそらくはNEF若しくはHBZ(及びTAX)ポリペプチド、若しくはタンパク質、又はその抗原性断片、若しくはその突然変異バージョンを含む、ウイルス様粒子のような免疫原性ウイルス粒子であって、前記免疫原性粒子及び/又はVLPは、IV又はHTLVに対する細胞性及び/又は体液性応答、特にIFNγ及び/又はIL-2応答を誘発することができる、ウイルス様粒子のような免疫原性ウイルス粒子に関する。
特に、本発明は、HIV、SIV、又はHTLV感染に対する、より詳細にはHIV-1、HIV-2、HTLV-1、HTLV-2、又はHTLV-3感染に対する宿主内での免疫原性応答を誘導するための、これらの遺伝子構築物、組換え核酸構築物、プラスミドベクターなどのような発現ベクター、組換えウイルス感染性粒子、VLPの使用に関する。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、最も危険なヒト疾患の1つである後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因物質である。HIVは、レトロウイルス科のメンバーであるレンチウイルス属のメンバーである。レンチウイルスは、一本鎖プラスセンスエンベロープRNAウイルスである。標的細胞内に進入すると、ウイルスRNAゲノムは、ウイルスにコードされた逆転写酵素により二本鎖DNAへと逆転写される。HIVウイルスは、ウイルスの9つの遺伝子をコードするプラスセンス一本鎖RNAの2つのコピーで構成されている。ウイルスゲノムは、ウイルスタンパク質p24で構成されるカプシドにより包まれている。ウイルスタンパク質p17で構成されるマトリックスがカプシドを取り囲み、ビリオン粒子の完全性を保っている。一本鎖RNAはヌクレオカプシドタンパク質p7に結合している。RNAゲノムは、構造的ランドマーク及び19個のタンパク質をコードする9つの遺伝子(gag、pol、env、tat、rev、nef、vif、vpr、及びvpu)からなる。
30年よりも前にHIVが発見されて以来、この疾患を予防するために種々の戦略が開発されてきた。一例として、ウイルスライフサイクルの種々の段階を阻止するための抗ウイルス薬が開発されている。このような手法は、宿主でのウイルス増幅の抑制を可能にし、宿主の感染細胞のゲノム物質へのウイルスの組込みを低下させる。その結果、HIV感染患者の寿命が大幅に延長される。にもかかわらず、宿主内でのウイルスの全体的な抑制にはまだ達していない。更に、多くの抗HIV薬に対するウイルス耐性が見られ、HIV薬物耐性ウイルス形態の蔓延に結び付いている。HIV逆転写酵素はプルーフリーディング能力を欠如しているため、HIVは性質が非常に変化し易く、そのためHIV患者には薬物耐性形態のHIVが常に出現する。したがって、HIVを効果的に抑制する治療が必要とされている。この疾患を予防又は治療するためのワクチン候補の開発は、HIV感染を効果的に予防し、患者におけるHIV複製及び/又は組込みを阻止するための最も有望な戦略の1つである。最も有望な戦略は、HIVによる感染を予防するワクチンを提供することである。そのようなワクチンは、ヒト内で療法応答を誘発し、それにより既にHIVに感染している宿主を治療することもできる。
HIV感染を予防するための最も有望な療法の1つは予防ワクチン接種であるが、そのようなワクチンは現在利用可能ではない。予防は、HIV感染を制御し、集団をHIVによる感染から防御する最も容易で安全な方法であるだろう。この状況では、予防ワクチンのような予防的処置の開発は、ヒト集団の必要性を満たすための主要な優先事項である。したがって、HIV一次感染の転帰の予防、特にHIV感染の予防及び後天性免疫不全症候群の発症の予防を含む、HIV感染を治療又は予防することができる十分に効率的な治療が必要とされている。
近年、幾つかのワクチン候補が開発されている。残念ながら、これまでにHIVワクチン候補を用いて実施された6つの臨床有効性治験のうち、RV144治験だけが、42か月時点での推定有効性が31%と、ある程度のレベルの防御効果を示しており、HIVワクチンに対するベクター/抗原組合せの重要性が指摘されている(2)。実際、HIV-カナリア痘ベクター(ALVAC HIV)初回刺激、続いてgp120 ENVタンパク質による追加免疫(AIDS VAXB/E)の投与は、RV144治験で感染したワクチン接種個人において、最初の1年間でワクチン有効性が減少したこと及びウイルス量が高いこと及びCD4 T細胞が枯渇したことが観察されたことにより明らかなように、短期免疫を誘導した可能性がある(2、3)。
HIV抗原を発現する複製不能アデノウイルス5(Ad5)によるワクチン接種は有効性を示さず、感染に対する感受性が増加さえした(4)。これは、志願者に抗Ad5抗体免疫が既に存在していたためである可能性が高い。他の臨床研究でも、HIV T細胞エピトープのみ(Step研究、2)又はエンベロープタンパク質のみ(Vax003、Vax004、5、6)のいずれかを使用したワクチン接種の限界が強調されている。
ヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)は、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)が発見される前、80年代初頭に初めて報告された。どちらもサル集団からの人獣共通性感染後にヒト集団に出現したレトロウイルスである。
世界で3,700万人がHIVに感染しているのに対し、HTLV-1に感染していると推定されているのは約1,000万人である。HTLV-1及びHIV-1は両方とも慢性感染症を引き起こす。HTLV-1感染は、2つの主要な疾患:成人T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)と称される悪性リンパ増殖症及び熱帯痙性対不全麻痺症/HTLV-1関連脊髄症(TSP/HAM)と称される慢性進行性脊髄症の発症に結びつく可能性がある。HTLV-1感染個人のおよそ2～4%がATLLを発症し、1～2%がTSP/HAMを発症することになる。in vivoでは、HTLV-1拡散は、2つの機序:新規感染又は感染細胞のクローン性拡大増殖により生じる。HTLV-1完全長組込みウイルスゲノムは、主に活性化CD4+ T細胞に見出される。プロウイルスDNAは、CD8+ T細胞、B細胞、単球、及び樹状細胞でも検出されるが、程度はより低い。
HTLV-1は、5'キャップ及び3'ポリA尾部を有する、8,5kbの単節型直鎖状二量体一本鎖RNA(+)ゲノムを有する。5'末端及び3'末端には、約600ヌクレオチド残基の2つの長い末端反復配列(LTR)が存在する。LTRは、U3領域、R領域、及びU5領域を含む。また、5'末端にはプライマー結合部位(PBS)が、3'末端にはポリプリントラクト(PPT)が存在する。組込みウイルスでは、5' LTRのプロモーターエレメントを使用して転写が開始及び駆動されて、ビリオンへとパッケージングされるゲノムRNAとしての役目を果たすことになる未スプライス完全長mRNAが生成される。HTLV-1のゲノムRNAは、他のレトロウイルスと同様の構造タンパク質及び酵素タンパク質GAG、ENV、及びPOLをコードする。HTLV-1は、pX領域と呼ばれる3'末端側の固有領域が他のレトロウイルスと異なる。この領域には、TAX及びREXなどの調節タンパク質、及びHBZ(逆方向にコードされた塩基性ロイシンジッパー(bZIP)因子(HBZ))のような追加のタンパク質がコードされており、それらの機能は現在十分に報告されている(46)。
HTLV-1感染又はHTLV-1関連疾患を予防するワクチンは存在しない。抗HTVL-1ワクチンの実現可能性は、第1にはHTLV-1株間の世界的な遺伝的安定性により、第2には動物モデルにおけるワクチン接種後の有望な結果により、最終的には感染個人における強力なHTLV-1関連免疫応答の存在により支持されている。こうした興味深い資産にも関わらず、抗HTVL-1ワクチンの必要性は満たされていない。
したがって、ワクチン及びワクチンを調製するための活性成分などの産物、並びにこれらの産物及びワクチンを生産するための方法が必要とされている。ワクチン候補は、それを必要とする人々を免疫する際に安全及び効率的であり、重大な副作用がなく、HIV又はHTLV-1を中和する抗体並びにおそらくはヘルパーT細胞及び/又は細胞傷害性T細胞を含むT細胞の産生を誘導しなければならない。言い換えれば、ワクチンは、強力な細胞性応答及び/又は体液性応答を誘発しなければならない。有利には、ワクチンは、単回免疫化又は初回刺激-追加免疫免疫化後に、殺菌免疫を付与しなければならない。この目的のために、HIVタンパク質及び/若しくはHIV VLP又はHTLVタンパク質及び/若しくはHTLV VLPの、in vivoでの、特に宿主の感染細胞での生成を可能にすることになり、したがって、効率的で長期持続性の免疫を提供し、特に同種又は異種投与レジメン(例えば、同種初回刺激-追加免疫投与レジメン又は異種初回刺激-追加免疫投与レジメン)内で単回のみの又は2回若しくは数回の投与工程後に生涯免疫を誘導するワクチンが必要とされている。
別の必要性は、医療センターなどへのアクセスがほとんどない集団のワクチン接種を促進することである。複数の疾患因子に対する免疫を誘発することになるワクチン候補は、これらの集団の世界的健康を増強することができる。したがって、単回ワクチン接種は、対象の地理的領域に存在する幾つかの疾患因子に対する免疫化を可能にすることができる。特に、麻疹ウイルス(MeV)を完全に根絶することを目的として、MeV及びHIV又はHTLVの両方に対して免疫を付与するワクチンは、これら2つの主要な脅威からこれらの集団を防御することできることは明らかである。
生弱毒化麻疹ワクチンは、過去40年間に10億人を上回る小児に安全に投与されており、1回又は2回の投与後に93～97%の有効率で生涯防御をもたらす。MVベクターは、マウス及びNHP(非ヒト霊長類)において免疫原性であり、ベクターに対する事前免疫が存在する場合でも、長期中和抗体及び細胞性免疫を誘導し、数多くの病原体に関して致死的攻撃からの防御が前臨床で示されている(7)。MeVを送達ベクターとして使用する異種病原性因子に対する防御免疫は、MeVがin vivoで複製され、麻疹ウイルスが天然で標的とする免疫細胞における異種抗原の発現をin vivoでもたらすことに依存する。この技術のヒトにおける概念実証は、臨床治験での試験が成功した麻疹チクングニヤワクチン(MV-CHIK)で実証されている(8)。このワクチンは耐容性が良好であり、2回の免疫化後に100%の志願者においてロバストで機能的な抗体応答を誘導した。最も重要なことには、既存の麻疹抗体は異種抗原の免疫原性を損なわず、ワクチン接種又は感染による麻疹に対する事前免疫が新しいワクチンのための組換えMVの使用を制限しないことが確認された(8)。
麻疹ウイルスは1954年に単離された(9)。麻疹ウイルスは、モノネガウイルス目のメンバー、つまり非分節マイナス鎖RNAゲノムを有するウイルスである。MeVの非分節ゲノムはアンチメッセージポラリティ(antimessage polarity)を有し、精製するとそのため、in vivoでもin vitroでも翻訳されず、感染性ではないゲノムRNAがもたらされる。非分節(-)鎖RNAウイルスの転写及び複製、並びにそれらのウイルス粒子へのアセンブリは、特にFields virologyにおいて研究及び報告されている(10)。麻疹ウイルスの転写及び複製には感染細胞の核は関与せず、むしろ宿主細胞の細胞質で起こる。MeVのゲノムは、N、P、M、F、H、及びLと呼ばれる6つの主要構造タンパク質、並びにC及びVと呼ばれる、P遺伝子の追加の2つの非構造タンパク質をコードする遺伝子を含む。遺伝子の順序は以下の通りである:ゲノムRNAの3'末端から5'末端へと、N、P(C及びVを含む)、M、F、H、及びL大型ポリメラーゼ。ゲノムは、遺伝子間領域M/Fに非コード領域を更に含む。この非コード領域は、およそ100ヌクレオチドの非翻訳RNAを含む。引用したMeV遺伝子はそれぞれ、ウイルスのヌクレオカプシドのタンパク質又は核タンパク質(N)、リンタンパク質(P)、大型タンパク質(L)(これらはゲノムRNA周囲に共にアセンブリしてヌクレオカプシドをもたらす)、ヘマグルチニン(H)、融合タンパク質(F)、及びマトリックスタンパク質(M)をコードする。
弱毒化ウイルスは、ワクチン株を提供するため、MeVウイルス、特にSchwarz株又はそれに由来する株に由来する。Schwarz麻疹ワクチンは、麻疹の予防に現在利用可能な安全で効率的なワクチンである。ワクチンの提供に加えて、Schwarz株などの弱毒化麻疹ウイルス株は、安定であり、ジカウイルス又はチクングニヤウイルスのような他のウイルスに対する免疫化のための効率的な送達ベクターの設計に好適であることが示されている(11)。
米国特許出願第14/363095号 国際公開第2005095442号 国際公開第2013083799号 国際公開第2005095441号 国際公開第97/06270号 国際公開第2013083799号 国際公開第2005095442号 国際公開第2004/000876号 国際公開第2008/078198号
技術水準の欠点に少なくとも部分的に対処するため、本発明者らは、組換え遺伝子構築物に基づく、特に感染性複製可能麻疹ウイルス内に、免疫不全ウイルス(IV)ポリペプチド、タンパク質、若しくは抗原、又はその抗原性断片をコードするか、或いはヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)ポリペプチド、タンパク質、若しくは抗原、又はその抗原性断片をコードする、クローン抗原若しくはポリヌクレオチド又はその突然変異バージョンを含む組換え核酸構築物に基づく、ワクチンの活性コンポーネント(又は成分)の産生を達成した。ワクチンは、投与後に組換え麻疹ウイルスが宿主にて複製する場合、回収することができる。したがって、本発明は、IVワクチン又はHTLV-1ワクチン、特に小児用ワクチンに関し、市販されている既知ワクチン株、特に広く使用されているSchwarz麻疹ワクチンなどの弱毒化麻疹ウイルス株に基づく活性成分に関する。全てのこれらの理由で、本発明者らは、弱毒化麻疹ウイルスを使用して、IV又はHTLVのポリペプチドを安定的に発現する組換え麻疹ウイルス粒子、特にそれらの免疫原性ウイルス粒子及び/又はVLPを生成した。本発明の麻疹手法は、将来のIVワクチン又はHTLVワクチン、特に将来のHIVワクチン又はHTLVワクチンの関連基準を全て満たす。
本発明の1つの目的は、IV抗原若しくは粒子又はHTLV抗原若しくは粒子、及び任意選択で更にIVウイルス様粒子(IV-VLP)又はHTLVウイルス様粒子(HTLV-VLP)を発現する麻疹ウイルスの回収に好適な遺伝子構築物、特に組換え遺伝子構築物、特に組換え核酸構築物を提供することである。
本発明では、Gag-Envを同時発現してウイルス様粒子(VLP)を形成するMeV-SHIV(サル-ヒト免疫不全ウイルス;つまりサルIV及びヒトIVに起源を有する両抗原を含むMeV構築物)ベクターを生成した。SIV239 gag及びHIV-1 env遺伝子に対応する配列を、2つの異なる追加転写ユニット(ATU)(初回刺激の場合はコンセンサスB Env及び追加免疫の場合はSF162 Env)に挿入した。分泌及び非ミリストイル化形態のSIV239 Nefを発現する別のMVベクターを生成した。HIV Env及びSIV Nef免疫抑制ドメイン(本明細書ではIS又はISDとも呼ばれる)内に標的突然変異を有する特定のベクターも生成した。実際、HIVはそのEnv内だけでなく、Nefタンパク質内にもISドメインを有する(13、14)。本発明では、Gag-Envを同時発現して、非常に免疫原性であることが以前に実証されていたウイルス様粒子(VLP)を形成するMeV-HTLV(つまり、HTLVに起源を有する抗原を含むMeV構築物)ベクターを生成した。HTLV-1のgag遺伝子及びenv遺伝子に対応する配列を、2つの異なる追加転写ユニット(ATU)に挿入した。Env免疫抑制ドメイン(本明細書ではIS又はISDとも呼ばれる)内に標的突然変異を有する特定のベクターも生成した。実際、HTLVは、そのEnvタンパク質内にISドメインを有する。免疫抑制機能を喪失したか又は実質的に喪失した抗原は、効率的な免疫応答を誘発することができる。これにより、一度ウイルスに感染した個体において、免疫系が感染細胞を破壊し、感染を予防/治癒することが可能になる。ENV及び/又はNEFの免疫抑制ドメイン内の突然変異は、これらのタンパク質の免疫抑制特性を消失させる。免疫抑制ドメインの突然変異は、免疫拒絶に対する腫瘍細胞感受性を回復させ(15、16)、ワクチン免疫を向上させる(17)ことが示されている。ENVタンパク質は、そのようなタンパク質を発現するウイルスに免疫抑制機能を付与することが知られている。適切に突然変異された免疫抑制ドメインは、突然変異タンパク質(又は抗原)の免疫抑制機能を低下させるが、タンパク質の構造に対する影響は限定的であるため、タンパク質の正常な発現及び立体構造(つまりフォールディング)は可能である。したがって、ISD内で突然変異しているタンパク質を発現するウイルスは、野生型対応物よりも免疫抑制性が低い可能性はあるが、他の機能は損なわれていない。一例として、突然変異ISDを有するENVタンパク質は、そのようなENVタンパク質を発現するウイルスの免疫抑制効果を低下させるが、ENVのエンベロープ機能は突然変異による影響を受けず、野生型ENVタンパク質と同じ構造を共有するENVタンパク質を有するウイルスの発現に結び付く。所与のタンパク質の免疫抑制特性は、Mangeney & Heidmann(18)及びMangeneyら(19)に記載の基本手順に従って測定することができる。
HIVの突然変異ENV及びNEFタンパク質、並びにHTLVのENVは、それぞれ米国特許出願第14/363095号、国際公開第2005095442号(HIV NEF)、及び国際公開第2013083799号(HIV NEF)、及び国際公開第2005095441号(HTLV ENV)に開示されており、こうした文献には、ENV又はNEFのISD内の幾つかの突然変異がそれぞれ開示されており、どの突然変異が、突然変異ENV及び/又はNEFを発現するより免疫原性の高いウイルスの発現を可能にするかが示されている。
第1の態様によると、本発明は、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(i)サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、又はヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の少なくとも1つのGAG抗原、その断片、又はその突然変異バージョンをコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、第1の異種ポリヌクレオチド;
(ii)免疫抑制ドメイン(ISD)を含む少なくとも1つのENV抗原又はその断片、特にENV抗原の膜貫通サブユニットを含む少なくとも1つの断片をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、ENV抗原又はその断片は、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異しており、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、又はヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)のものであり、第2の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に挿入されたATU3に作動可能にクローニングされた、第2の異種ポリヌクレオチド
を含む核酸構築物であって、
ENVのISDドメイン内の突然変異は、ENV抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG及びENV抗原又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHIV又はHTLVに、好ましくはHIV-1又はHIV-2又はHTLV-1に由来する、核酸構築物に関する。
第2の態様では、本発明は、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(i)サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、又はヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の少なくとも1つのGAG抗原、その断片、又はその突然変異バージョンをコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、第1の異種ポリヌクレオチド;
(ii)免疫抑制ドメイン(ISD)を含む少なくとも1つのENV抗原又はその断片、特にENV抗原の膜貫通サブユニットを含む少なくとも1つの断片をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、ENV抗原又はその断片は、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異しており、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、又はヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)のものであり、第2の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に挿入されたATU3に作動可能にクローニングされた、第2の異種ポリヌクレオチド;
(iii)免疫抑制ドメイン(ISD)を含む少なくとも1つのNEF抗原又はその断片をコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、NEF抗原は、そのISDドメイン内で突然変異しており、SIV又はHIVのものであり、第3の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)又は(ii)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのN遺伝子の上流に位置するATU内に、特にMeVのN遺伝子の上流に挿入されたATU1に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド
又は(iiiの2)HTLVの少なくとも1つのHBZ抗原又はその断片又はその突然変異バージョンをコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)又は(ii)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのN遺伝子の上流に位置するATU内に、特にMeVのN遺伝子の上流に挿入されたATU1に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド
を含む核酸構築物であって、
ENVのISDドメイン内の突然変異は、ENV抗原の免疫抑制指数を低減させ、NEFのISDドメイン内の突然変異は、抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG、ENV、及びNEF、又はGAG、ENV、及びHBZ、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHIV-1、HIV-2、又はHTLV-1に由来する、核酸構築物に関する。
核酸構築物は、第1のATU内に挿入された第1の異種ポリヌクレオチド、第1のATUとは異なる位置の第2のATU内に挿入された第2の異種ポリヌクレオチド配列、並びに第1及び第2のATUとは異なる位置の第3のATU内に挿入された第3の異種ポリヌクレオチドを含んでいてもよい。その代わりに、少なくとも2つの異種ポリヌクレオチドが同じATU内に挿入されていてもよく、又は3つの異種ポリヌクレオチドが同じATU内に挿入されていてもよい。
第3の態様では、本発明は、核酸の組合せであって、組合せは、
(a)麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(i)サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、又はヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の少なくとも1つのGAG抗原、その断片、又はその突然変異バージョンをコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、第1の異種ポリヌクレオチド;
(ii)サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、又はヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異している少なくとも1つのENV抗原をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に挿入されたATU3に作動可能にクローニングされた、第2の異種ポリヌクレオチド
を含む第1の核酸構築物;並びに
(b)
(i')麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードする第2のcDNA分子;及び
(ii')SIV又はHIVの、ISDドメイン内で突然変異した少なくとも1つのNEF抗原又はその断片をコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された転写ユニット(ATU)、特にMeVのN遺伝子の上流に位置するATU内に、特にMeVのN遺伝子の上流に挿入されたATU1に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド、
又は(iii'の2)HTLVの少なくとも1つのHBZ抗原又はその断片又はその突然変異バージョンをコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された転写ユニット(ATU)、特にMeVのN遺伝子の上流に位置するATU内に、特にMeVのN遺伝子の上流に挿入されたATU1に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド
を含む第2の核酸構築物を含み、
ENVのISDドメイン内の突然変異は、ENV抗原の免疫抑制指数を低減させ、NEFのISDドメイン内の突然変異は、NEF抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG、ENV、及びNEF抗原若しくはHBZ抗原、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHIV-1、HIV-2、又はHTLV-1に由来する、核酸の組合せに関する。
抗原の免疫抑制指数を低減させることにより、突然変異抗原は、野生型対応物と比較してより高い免疫原性を誘発するが、突然変異抗原の構造(つまり、二次構造及び/又は三次構造、例えば、フォールディング)は、維持されるか又は野生型抗原の構造と同等であることが理解されるべきである。
これらの実施形態による特定の核酸構築物は、図1及び図20並びに本発明の実施例に示されている。SIV GAGタンパク質をコードする第1の異種ポリヌクレオチド及びHIV ENVタンパク質をコードする第2の異種ポリヌクレオチドを含む、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子に対応する核酸構築物の配列は、配列番号32に示されている。SIV NEFタンパク質をコードする第1の異種ポリヌクレオチドを含む、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子に対応する核酸構築物の配列は、配列番号33に示されている。SIV GAGタンパク質をコードする第1の異種ポリヌクレオチド及び突然変異HIV ENVタンパク質をコードする第2の異種ポリヌクレオチドを含む、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子に対応する核酸構築物の配列は、配列番号40に示されている。突然変異SIV NEFタンパク質をコードする第1の異種ポリヌクレオチドを含む、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子に対応する核酸構築物の配列は、配列番号41に示されている。野生型SIV NEFタンパク質をコードする第1の異種ポリヌクレオチドを含む、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子に対応する核酸構築物の配列は、配列番号42に示されている。SIV GAGタンパク質をコードする第1の異種ポリヌクレオチド及び野生型HIV ENVタンパク質をコードする第2の異種ポリヌクレオチドを含む、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子に対応する核酸構築物の配列は、配列番号43に示されている。SIV GAGタンパク質をコードする第1の異種ポリヌクレオチド及び突然変異HIV ENVタンパク質をコードする第2の異種ポリヌクレオチドを含む、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子に対応する核酸構築物の配列は、配列番号44に示されている。HTLV GAGタンパク質をコードする第1の異種ポリヌクレオチド及びHTLV ENVタンパク質をコードする第2の異種ポリヌクレオチドを含む、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子に対応する核酸構築物の配列は、配列番号54に示されている。
上記の定義における「コードする」という表現は、完全長アンチゲノム(+)RNAの転写を可能にする核酸構築物、特にcDNAの能力を包含し、前記cDNAは、特に転写及び適切な場合には産物を細胞又は細胞株内で発現させるための翻訳の鋳型としての役目を果たす。したがって、cDNAが二本鎖分子である場合、一方の鎖は、cDNAの「T」ヌクレオチドにより置換されている「U」ヌクレオチドを除き、第1の異種ポリヌクレオチドがその内にクローニングされた、麻疹ウイルスのアンチゲノム(+)RNAと同じヌクレオチド配列を有する。本発明の核酸構築物は、コード配列の転写を制御する調節エレメント、特に転写のためのプロモーター及び終結配列、並びにおそらくはエンハンサー及び他のシス作用性エレメントを含んでいてもよい。これらの調節エレメントは、IV遺伝子又はHTLV遺伝子に起源を有するか又は由来する異種ポリヌクレオチドに関して異種であってもよく、特に麻疹ウイルス株の調節エレメントであってもよい。
「作動可能にクローニングされた」という表現は、「作動可能に連結した」という表現により置き換えることができ、異種ポリヌクレオチドが、特に、IV又はHTLVの少なくとも1つの抗原、又は少なくとも1つのタンパク質、又は少なくとも1つのポリペプチド、又は少なくともその抗原性断片を発現する組換え感染性MeV粒子又はMeVを産生するための救済系の一部として使用される細胞、細胞株、宿主細胞において、前記ポリヌクレオチド及び核酸構築物が効率的に転写され、適切な場合には翻訳されるように、本発明の核酸構築物内に機能的にクローニング又は挿入されていることを指す。言い換えれば、本発明の核酸構築物は、適切な条件に置かれると、HIV又はHTLVの少なくとも1つの抗原、又は少なくとも1つのタンパク質、又は少なくとも1つのポリペプチド、又は少なくともその抗原性断片を産生することが可能な感染性アンチゲノム(+)RNAの産生を可能にする。
本発明の特定の実施形態では、MeVの完全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖のヌクレオチド配列をコードするcDNAを含むが、作動可能にクローニングされた異種抗原を有しない核酸構築物は、麻疹ウイルスゲノムの6(六)の法則に従う。言い換えれば、MeVの完全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖のヌクレオチド配列をコードするcDNAは、ポリ六量体(polyhexameric)cDNAである。
麻疹ウイルスのゲノムの構成並びにその複製及び転写プロセスは、先行技術において十分に特定されており、特に、Horikami S.M.及びMoyer S.A.(20)に、又はこのウイルスのSchwarzワクチン株についてはCombredet C.ら(21)に、又は幅広くマイナスセンスRNAウイルスであるとみなされているものについては、Neumann G.ら(22)に開示されている。
「6の法則」は、MeV(+)鎖RNAゲノムを表す核酸又はそれを含む核酸構築物に存在するヌクレオチドの総数が6の倍数であるという事実を表現する。「6の法則」は、技術水準において、MeVゲノムRNAの効率的な又は最適化された複製を可能にする、麻疹ウイルスのゲノムのヌクレオチドの総数に関する要件として認識されている。6の法則を満たす核酸構築物を規定する本発明の実施形態では、前記法則は、完全長MV(+)鎖RNAゲノムをコードするcDNAを特定する核酸構築物に適用される。この点に関して、6の法則は、麻疹ウイルスの完全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖のヌクレオチド配列をコードするcDNAに対して、おそらくはしかしながら必ずという訳ではないが、前記cDNAにクローニングされており、IV又はHTLVの少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、個々に適用される。
本発明の核酸構築物は、特に、作動可能にクローニング又は共に連結されている、MeVの少なくとも1つのポリヌクレオチドとIV又はHTLVの少なくとも1つ又は幾つかの抗原との組換えにより得られるか又は得ることができる精製DNA分子である。
本発明によると、核酸構築物は、少なくとも1つの抗原、ポリペプチド、タンパク質、その抗原性断片、又はその突然変異バージョンをコードする、抗原、ポリヌクレオチド、又は幾つかの抗原若しくはポリヌクレオチドをクローニングすることにより調製し、抗原、又はそのポリペプチド、タンパク質、断片、及び突然変異バージョンは、麻疹ウイルスの完全長アンチゲノム(+)RNAをコードするcDNAにおいて、HIV及びSIVに起源を有するか若しくは由来するGAG、ENV、及びNEF、又はHTLV-1に起源を有するか若しくは由来するGAG、ENV、及びHBZからなる群から選択される。本発明による構築物は図1及び図20に示されている。その代わりに、本発明の核酸構築物は、PCRによることを含む、核酸断片を合成する工程又は鋳型から重合させる工程を使用して調製することができる。本発明のポリヌクレオチド及び核酸構築物は、むしろ、当技術分野で公知の任意の方法に準拠して調製することができ、特に、クローニングし、産生細胞で産生させてもよく、重合により得てもよく、又は合成してもよい。その代わりに、これらの抗原又はポリヌクレオチドのいずれか1つは、逆転写後には、IV又はHLTVのゲノムRNAに起源を有するcDNAであってもよく、前記cDNAは完全ゲノムcDNA又はその断片のいずれかであり、IV又はHTLVのポリペプチドをコードする。
追加転写ユニット(ATU)
異種ポリヌクレオチド、特にIV gag、env、及び/又はnef遺伝子、特にHTLV-1 gag、env、及び/又はhbz遺伝子は、MeVのcDNAに挿入された追加転写ユニット(ATU)内に挿入、特にクローニングされている。ATU配列は、当業者に公知であり、MeVのcDNAへのクローニング工程で使用するために、MeV cDNAにおいて先行する遺伝子のプロモーターなどの導入遺伝子のMeV依存性発現に必要なシス作用性配列、前記ATUのマルチクローニングサイトカセットに挿入されたIV又はHTLVポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより表されるインサートを含む。ATUは、Billetterらによる国際公開第97/06270号に開示されているように更に規定することができる。図1A及び図1Bには3つのATUが提示されている。ATUは、MeVのcDNA内に、特にMeVゲノムのP-M遺伝子間領域間に、及び/又はMeVゲノムの遺伝子間H-L領域間に挿入されたマルチクローニングカセットであると定義することもできる。ATUは、MeVのP遺伝子の転写に必要なシス作用性配列、特にMeVに起源を有するか又は由来するシス作用性配列を含んでいてもよい。異なるATU、特にATU1及びATU2は、それらの核酸配列に関して同一であってもよい。ATUは、一般に、ポリメラーゼの開始コドン及び終止コドンにそれぞれ対応する2つのCTTコドン間に位置する。ATUは、ATU内にクローニングされた異種ポリヌクレオチドを翻訳するための開始コドン及び終止コドンにそれぞれ対応するATGコドン及びTAGコドンを更に含んでいてもよい。その代わりに、ATUは、ATU内にクローニングされた異種ポリヌクレオチドを翻訳するための開始コドン及び終止コドンにそれぞれ対応するATGコドンとTAGコドンとの間に位置している。本発明の好ましい実施形態では、ATUは、本明細書で規定の抗原をコードするポリヌクレオチド配列が挿入されている配列番号24を含むか又はからなるポリヌクレオチドである。
配列番号24
配列番号24は、麻疹ウイルスの完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子内に位置するATU配列である。ポリメラーゼの開始コドン及び終止コドンにそれぞれ対応するCTTコドンは太字で示されている。ATU内にクローニングされた異種ポリヌクレオチドを翻訳するための開始コドン及び終止コドンに対応するATGコドン及びTAGコドンには下線が引かれている。
配列中、*は、挿入される少なくとも1つのHTLVポリペプチドをコードする異種の、任意選択でコドン最適化された配列ポリヌクレオチドの位置に対応する。
SIV GAGポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むATUは、例えば、配列番号32の3539位と5074位との間に位置する。HIV ENVポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むATUは、例えば、配列番号32の10991位と13335位との間に位置する。SIV NEFポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むATUは、例えば、配列番号33の272位と1126位との間に位置する。
HTLV GAGポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むATUは、例えば、配列番号54の3541位と4830位との間に位置する。HTLV ENVポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むATUは、例えば、配列番号54の10750位と12216位との間に位置する。
麻疹ウイルスのcDNA内の異種ポリヌクレオチドの位置のそのような例は図16及び図21に示されている。
ATU(ATU2という参照名で知られている)は、MeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置する。別のATU(ATU1という参照名で知られている)は、MeVのN遺伝子の上流に位置する。別のATU(ATU3という参照名で知られている)は、MeVのH遺伝子とL遺伝子との間に位置する。MeVのウイルスRNAの転写は5'末端から3'末端への勾配に従うことが観察されている。これにより、異種ポリヌクレオチドは、挿入される場所に応じてその発現レベルが変化し、ATU1、ATU2、又はATU3内に挿入された場合、効率はより高い場合も又はより低い場合もあるだろうということが説明される。
本発明の一態様によると、核酸構築物は、1つのATU又は異なるATU内に作動可能にクローニングされたGAG及びENVをコードする第1及び第2の異種ポリヌクレオチドを含む(つまり、ENV抗原をコードする第2のポリヌクレオチドは、第1のクローニングされた異種ポリヌクレオチドの位置とは異なる位置にあり、前記別のATUは特にATU3である)。言い換えれば、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖内に挿入されたポリヌクレオチドは、同じATU内に位置してもよく、又は異なるATU内に位置してもよい。より詳細な実施形態では、第1及び第2のポリヌクレオチドは、異なるATU内に、より詳細にはATU2及びATU3内に挿入されている。好ましい実施形態では、GAGをコードするポリヌクレオチドはATU2内に挿入されており、ENVをコードするポリヌクレオチドはATU3内に挿入されている。特に、異種ポリヌクレオチドは、HIV、特にHIV-1のENV及びGAGをコードする。
・本発明の核酸構築物によりコードされる抗原
「抗原」という用語は、「ポリペプチド」又は「タンパク質」又は「抗原性断片」という用語と同義的に使用され、その突然変異バージョン及び/又はその短縮バージョンも指し、アミノ酸残基の連結からもたらされる分子を規定する。特に、本出願で開示されるポリペプチドは、HIV及びSIVのいずれかのgag、env、及びnef遺伝子の発現に由来するか、又はHTLV-1のgag、env、及び/若しくはhbz遺伝子の発現に由来し、天然タンパク質(つまり、野生型タンパク質)と同一であってもよく、又はその代わりに、アミノ酸残基の置換(特に保存的アミノ酸残基による)若しくは付加を含む突然変異により、又は翻訳後の二次修飾により、又は参照天然タンパク質と比べて短いサイズを有する断片をもたらす天然タンパク質の部分の欠失により、それらから導出することができる抗原、タンパク質、構造タンパク質、又はその抗原性断片である。断片は、宿主、特に小児宿主を含むヒト宿主における免疫応答、好ましくはIV若しくはHTLV、特にHIV感染に対する、又はIV若しくはHTLV、特にHIV関連疾患に対する防御を可能にする応答の誘発に好適な天然タンパク質のエピトープを有する限り、本発明内に包含される。エピトープは、特に、細胞媒介免疫応答(CMI応答)の誘発に関与する型のTエピトープである。Tエピトープは、MHCクラスI及びII分子に結合することができるT細胞エピトープの提示によるT細胞の刺激に関与し、T細胞の活性化に結び付く。その代わりに、エピトープは、タンパク質が投与された宿主、又は本発明の感染性複製可能粒子の投与後にタンパク質が発現された宿主における抗体産生の活性化に関与するB型であってもよい。断片は、IV又はHTLV、特にHIV、SIV、又はHTLV-1の天然タンパク質のアミノ酸配列サイズの50%よりも多くに、好ましくは少なくとも90%又は95%に相当するサイズを有していてもよい。ポリペプチドは、HIV、特にHIV-1の天然タンパク質と少なくとも50%同一性、好ましくは少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、好ましくは少なくとも85%又は95%同一性を有していてもよい。また、断片は、上記の定義に対応してもよいが、該当する場合(例えば、抗原がENV又はNEFのいずれかである場合)、突然変異免疫抑制ドメインを更に含む。天然IVタンパク質は、SIV GAGの場合は配列番号1、HIV-1 GAGの場合は配列番号2、HIV-2 GAGの場合は配列番号3、SIV GAG-proの場合は配列番号4、HIV-1 GAG-proの場合は配列番号5、HIV-2 GAG-proの場合は配列番号6に対応する野生型タンパク質に対応してもよい。抗原の突然変異バージョンは、SIV-GAGの場合は配列番号1、HIV-1 GAGの場合は配列番号2、HIV-2 GAGの場合は配列番号3、SIV GAG-proの場合は配列番号4、HIV-1 GAG-proの場合は配列番号5、HIV-2 GAG-proの場合は配列番号6に対応する野生型タンパク質と少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%、又は少なくとも95%同一性を有するポリペプチドに対応してもよい。天然HTLVタンパク質は、HTLV-1 GAGの場合は配列番号45、HTLV-1 ENVの場合は配列番号47、HTLV-2 ENVの場合は配列番号52、HTLV-1 GAG-proの場合は配列番号46、HTLV-1 HBZの場合は配列番号55、TAXの場合は配列番号50に対応する野生型タンパク質に対応してもよい。抗原の突然変異バージョンは、HTLV-1 GAGの場合は配列番号45、HTLV-1 GAG-proの場合は配列番号46、HTLV-1 ENVの場合は配列番号47、HTLV-1 HBZの場合は配列番号55、TAXの場合は配列番号50に対応する野生型タンパク質と少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも90%、又は少なくとも95%同一性を有するポリペプチドに対応してもよい。
本発明の特定の実施形態では、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に作動可能にクローニングされた各ポリヌクレオチドは、IV又はHTLVポリペプチドのうちの1つの内に位置するエピトープを含むポリペプチドをコードする。この実施形態によると、エピトープ配列は、天然のHIV又はSIV、又はHTLV-1の選択されたタンパク質のエピトープ配列と100%同一性を共有する。そのようなエピトープは、免疫エピトープデータベース及び分析リソース(www.iedb.org)に掲載されている。ポリヌクレオチドによりコードされ、本明細書で規定のエピトープ配列を有するHIV、FIV、SIV、又はHTLV-1のポリペプチド内では、どのエピトープにも属さないアミノ酸残基は、天然(つまり、野生型)HIV、SIV、又はHTLV-1タンパク質の配列の対応するアミノ酸残基と異なっていてもよい。
「HIV、SIV、若しくはFIVのポリペプチド」又は「HTLVのポリペプチド」とは、本明細書で規定の「抗原」又は「ポリペプチド」(ポリペプチド、抗原、タンパク質、その抗原性断片、又はポリペプチドの野生型バージョンと比較したその突然変異バージョンのいずれか)を意味し、そのアミノ酸配列は、HIV、SIV、若しくはHTLV、特にHIV-1の株における対応物と同一であるか又はそれに由来するか、或いはHIV、SIV、又はHTLVのタンパク質の天然成熟又は前駆体であるポリペプチドを含む、HIV若しくはHTLV、特にHIV-1のコンセンサス配列に由来するか、或いは本明細書で規定のその抗原性断片又はその突然変異体、特に天然に存在するHIV若しくはSIVタンパク質GAG、ENV、及びNEF、又は天然に存在するHTLVタンパク質GAG、ENV、及びHBZと少なくとも50%、少なくとも80%、特に有利には少なくとも90%、若しくは好ましくは少なくとも95%アミノ酸配列同一性を有する抗原性断片若しくは突然変異体である。
HIVアミノ酸配列同一性は、当業者であれば、手作業によるアラインメントを使用するか、又は利用可能な数多くのアラインメントプログラム(例えば、BLASTP-http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)を使用してアラインメントすることにより決定することができる。本発明のGAG、ENV、及びNEFポリペプチドの断片又は突然変異体は、本明細書に示されている特定のアミノ酸配列、特に、GAGの場合は配列番号1、配列番号2、配列番号3、GAG-proの場合は配列番号4、配列番号5、配列番号6、ENVの場合は配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、並びにNEFの場合は配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19からなる群から選択されるアミノ酸配列と比べて規定することができる。本発明の特定の実施形態では、ポリペプチドは、HIV若しくはSIVの天然タンパク質と、又はGAGの場合は配列番号1、配列番号2、配列番号3、GAG-proの場合は配列番号4、配列番号5、配列番号6、ENVの場合は配列番号7、配列番号9、配列番号12、及び配列番号16、並びにNEFの場合は配列番号14、配列番号16、及び配列番号18のポリペプチドと、少なくとも50%、少なくとも80%、特に有利には少なくとも90%、又は好ましくは少なくとも95%アミノ酸配列同一性を共有する。その代わりに、HIV又はSIVの天然タンパク質GAG、GAG-pro、ENV、及びNEFは、これらに限定されないが、全ての配列が収集されており、注釈及びデータ分析に焦点が当てられているロスアラモスのHIV配列データベース、並びにスタンフォードのHIV RT/プロテアーゼ配列データベースなどのデータベースに見出すことができる。
HTLVアミノ酸配列同一性は、当業者であれば、手作業によるアラインメントを使用するか、又は利用可能な数多くのアラインメントプログラム(例えば、BLASTP-http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)を使用してアラインメントすることにより決定することができる。本発明のGAGポリペプチド及びENV HTLVポリペプチドの断片又は突然変異体は、本明細書に示されている特定のアミノ酸配列、特に、GAGの場合は配列番号45、GAG-proの場合は配列番号46、野生型HTLV-1-ENVの場合は配列番号47、HTLV-2 ENVの場合は配列番号52、ISドメイン内で突然変異したHTLV-1 ENVの場合は配列番号48、ISドメイン内で突然変異したHTLV-2の場合は配列番号53、野生型HBZの場合は配列番号55、突然変異HBZの場合は配列番号49、及びTAXの場合は配列番号50からなる群のアミノ酸配列と比べて規定することができる。本発明の特定の実施形態では、ポリペプチドは、HTLV、特にHTLV-1又はHTLV-2の天然タンパク質と、又はGAGの場合は配列番号45、GAG-proの場合は配列番号46、ENVの場合は配列番号47、及びHBZの場合は配列番号55、及びTAXの場合は配列番号50のポリペプチドと、少なくとも50%、少なくとも80%、特に有利には少なくとも90%、又は好ましくは少なくとも95%アミノ酸配列同一性を共有する。その代わりに、HTLVの天然タンパク質GAG、GAGpro、ENV、HBZ、及びTAXは、配列が収集されているデータベースに見出すことができる。
・GAG抗原
第1のポリヌクレオチドは、GAG抗原、その免疫原性断片、又はその突然変異バージョンをコードする。GAGに起源を有するか又は由来する抗原は、本明細書に記載の「抗原」の定義に対応する。GAGをコードするポリヌクレオチドは、SIV株、HIV株、又はHTLV株に起源を有してもよい。GAG抗原は、GAGタンパク質又はGAGのプレプロタンパク質に対応するGAG-proタンパク質に対応してもよい。特定の実施形態では、GAGをコードするポリヌクレオチドは、HTLV-1、HTLV-2、HTLV-3、HIV-1、又はHIV-2に、より詳細にはHIV-1に起源を有する。ポリヌクレオチドは、配列番号1(GAG-SIV)、配列番号4(GAG-pro-SIV)、配列番号2(GAG-HIV-1)、配列番号3(GAG-HIV-2)、配列番号5(GAGpro-HIV-1)、配列番号6(GAGpro-HIV-2)からなる群から選択される配列を有する抗原をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく又はからなっていてもよい。コードされている抗原は、配列番号1(GAG-SIV)、配列番号4(GAG-pro-SIV)、配列番号2(GAG-HIV-1)、配列番号3(GAG-HIV-2)、配列番号5(GAGpro-HIV-1)、配列番号6(GAGpro-HIV-2)からなる群から選択されるアミノ酸配列で構成されていてもよい。第1のポリヌクレオチドは、任意のATU内、特にATU1、ATU2、又はATU3内のMeVのアンチゲノム(+)RNA鎖のcDNA内に挿入されていてもよい。特定の実施形態では、第1のポリヌクレオチドはATU2内に挿入されている。GAGをコードするポリヌクレオチドは、HTLV株に起源を有してもよい。GAG抗原は、GAGタンパク質又はGAGのプレプロタンパク質に対応するGAG-proタンパク質に対応してもよい。特定の実施形態では、GAGをコードするポリヌクレオチドは、HTLV-1、HTLV-2、又はHTLV-3に、より詳細にはHTLV-1に起源を有する。ポリヌクレオチドは、配列番号45(GAG-HTLV)又は配列番号46(GAGpro-HTLV)からなる群から選択される配列を有する抗原をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく又はからなっていてもよい。コードされている抗原は、配列番号45(GAG-HTLV)又は配列番号46(GAGpro-HTLV)からなる群から選択されるアミノ酸配列で構成されていてもよい。第1のポリヌクレオチドは、任意のATU内、特にATU1、ATU2、又はATU3内のMeVのアンチゲノム(+)RNA鎖のcDNA内に挿入されていてもよい。特定の実施形態では、第1のポリヌクレオチドはATU2内に挿入されている。
・突然変異及び野生型NEF抗原(HIV由来)及び突然変異及び野生型ENV抗原(HIV及びHTLV由来)
本明細書では、「突然変異NEF」又は「突然変異ENV」という表現は、野生型NEF抗原又は野生型ENV抗原と比較して免疫抑制指数が低減されたNEF抗原又はENV抗原に対応する。野生型NEF抗原及び野生型ENV抗原は、配列番号7(ENV SIV)、配列番号9(ENV-HIV-1)、配列番号12(ENV-HIV-2)、配列番号14(NEF-SIV)、配列番号16(NEF-HIV-1)、又は配列番号18(NEF-HIV-2)に示されているアミノ酸配列に部分的に又は完全に対応してもよい。突然変異ENV抗原又はNEF抗原は、本明細書に記載の野生型アミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%同一性を有し、免疫抑制活性が低減されているか又は示さない抗原に対応してもよい。
第2のポリヌクレオチドは、その免疫抑制ドメイン内で突然変異したENV抗原又はその免疫原性断片をコードする。免疫抑制ドメイン(ISD)は、HIV、SIV、及びHTLVのエンベロープ遺伝子(env)の保存された領域である。本発明では、ISドメインは、突然変異がENVタンパク質の免疫抑制特性に影響を及ぼす可能性がある特定のドメインを指す。ISドメインの位置は、Benitら(23)に記載のように、ウイルスの全てのENVタンパク質において決定することができる。広義には、ISドメインは、免疫抑制活性を有するか又は有しないという事実に関わりなく、その構造及びその位置により規定される。本発明による突然変異ENVタンパク質の免疫抑制特性は、以前に開示されている(15、18)、ENVタンパク質の免疫抑制活性をアッセイするためのin vivo手順に従って測定することができる。
ISD内の突然変異は、ENVのISD内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応してもよい。突然変異HIV ENVは、国際公開第2013083799号に開示されており、この文献には、HIV ENVのISD内の幾つかの突然変異が開示されており、どの突然変異が、突然変異ENVを発現するより免疫原性の高いウイルスの発現を可能にするかが示されている。ISD内の突然変異は、ENVのISD内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応してもよい。突然変異HTLV ENVは、国際公開第2005095442号に開示されており、この文献には、HTLV ENVのISD内の幾つかの突然変異が開示されており、どの突然変異が、突然変異ENVを発現するより免疫原性の高いウイルスの発現を可能にするかが示されている。
こうした文献に開示されている任意の突然変異HIV ENVを、本発明の核酸構築物内に挿入された異種ポリヌクレオチドにコードすることを企図することができる。より詳細には、ENVの免疫抑制ドメイン内の突然変異は、ENVのISドメイン内に位置するアミノ酸残基の置換で構成されていてもよい。一例として、配列番号9の589位に位置するアミノ酸残基Yは、アミノ酸残基Rにより置換されていてもよい。そのような突然変異は、配列番号10のタンパク質ENVに対応する。幾つかの置換は、ENVのISドメイン内でも実施することができる。一例として、配列番号9の589位に位置するアミノ酸残基Yはアミノ酸残基Rにより置換されていてもよく、配列番号9の620位に位置するアミノ酸残基Kは、アミノ酸残基A、G、又はSにより置換されていてもよい。両置換(Y589R及びK620A)を含むHIV-1 ENVタンパク質は、配列番号11のアミノ酸配列に対応してもよい。他の突然変異を企図することができる。例として、配列番号9の589位のアミノ酸残基Yは、アミノ酸残基G、L、A、又はFにより置換されていてもよく、配列番号9の590位のアミノ酸残基Lは、アミノ酸残基Rにより置換されていてもよい。
ENV抗原がHIV-2に起源を有する場合、ISドメインの突然変異は、配列番号12の582位に位置するアミノ酸残基Lのアミノ酸残基Rによる置換に対応してもよい。そのような突然変異HIV-2 ENV抗原は、配列番号13に示されているアミノ酸配列に対応してもよい。ENV抗原がSIVに起源を有する場合、ISドメインの突然変異は、配列番号7の600位に位置するアミノ酸残基Lのアミノ酸残基Rによる置換に対応してもよい。このような突然変異SIV ENV抗原は、配列番号8に示されているアミノ酸配列に対応してもよい。突然変異ISDを有するENV抗原は、野生型ENVにより誘導される免疫抑制を低減させる。本発明において有用な突然変異ISDを有するENV抗原は、野生型対応物と比較して低減又は低下した免疫抑制指数を提示する突然変異ENVに対応する。
免疫抑制指数は、本発明の実施例に示される方法に従って、特に本明細書の作業例に示される腫瘍拒絶アッセイにより測定することができる。簡単に説明すると、野生型(野生型ENVタンパク質)又は試験しようとするタンパク質を発現する修飾核酸(突然変異ENVタンパク質)を、公知の方法によりMCA205及びCL8.1細胞株、特にMC1205細胞株などの腫瘍細胞株に形質導入する。次いで、試験しようとするタンパク質を発現する腫瘍細胞を、宿主、一般にはマウスに特に皮下(s.c.)注射する。前記注射をした後、腫瘍の確立又は逆にその拒絶を決定し、腫瘍面積を測定する。触診により腫瘍確立を決定し、垂直腫瘍直径を測定することにより腫瘍面積(mm<2>)を決定した。免疫抑制指数を、i=(Senv-Snone)/Snoneと定義した。数式中、Senvは、エンベロープタンパク質を発現する腫瘍が到達した最大面積であり、Snoneは、ENVタンパク質を発現しない腫瘍(陰性対照)が到達した最大面積である。免疫抑制指数に関する上記で定義した比は、0.2未満であってもよく、負の値であってもよい。本発明では、免疫抑制特性が低減されているか又は示さない抗原は、本発明による突然変異抗原が約0.2未満の免疫抑制指数を有することを意味する場合がある。ENVタンパク質の免疫抑制ドメイン内の突然変異は、対応する野生型ENVと比べて突然変異ENVタンパク質の免疫抑制活性を減少させるのに十分である。しかしながら、それにより、突然変異ENVタンパク質の構造は、対応する野生型ENVタンパク質と比べて本質的に保存されることが保証されるため、別のアミノ酸を突然変異させることもできることが有利である可能性がある。したがって、突然変異ENV抗原は、その野生型対応物(つまり、非突然変異抗原)と実質的に同じ構造を有することができる。
ENVに起源を有するか又は由来する抗原は、本明細書に記載の「抗原」の定義に対応する。ENVをコードするポリヌクレオチドは、SIV株、HIV株、又はHTLV株に起源を有してもよい。
特定の実施形態では、ENVポリヌクレオチドは、HTLV-1又はHIV、より詳細にはHIV-1に起源を有する。コードされている抗原は、配列番号8(突然変異ENV-SIV)、配列番号10(単一突然変異ENV-HIV-1)、配列番号11(二重突然変異ENV-HIV-1)、配列番号13(突然変異ENV-HIV-2)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応してもよい。特定の実施形態では、核酸構築物が例えば初回刺激-追加免疫レジメンで使用される場合、追加免疫中に使用される核酸構築物は、配列番号21(ENV-HIV consB)又は配列番号20(ENV SF162-HIV)のENVをコードしてもよい。第2のポリヌクレオチドは、MeVのアンチゲノム(+)RNA鎖のcDNA内の任意のATU内、特にATU1、ATU2、又はATU3内に挿入されていてもよい。特定の実施形態では、第1のポリヌクレオチドはATU3内に挿入されている。
突然変異HIV-1 ENVタンパク質は、配列番号9の589位に位置するアミノ酸残基Yがアミノ酸残基Rにより置換されていてもよい。このような突然変異は、配列番号10のタンパク質ENVに対応する。また、幾つかの置換が、ENVのISドメイン内に実施されていてもよい。一例として、配列番号9の589位に位置するアミノ酸残基Yは、アミノ酸残基Rにより置換されていてもよく、配列番号9の620位に位置するアミノ酸残基Kは、アミノ酸残基A、G、又はSにより置換されていてもよい。両置換(Y589R及びK620A)を含むHIV-1 ENVタンパク質は、配列番号11のアミノ酸配列で構成されていてもよい。他の突然変異を企図することができる。例として、配列番号9の589位のアミノ酸残基Yは、アミノ酸残基G、L、A、又はFにより置換されていてもよく、配列番号9の590位のアミノ酸残基Lは、アミノ酸残基Rにより置換されていてもよい。ENV抗原がHIV-2に起源を有する場合、ISドメインの突然変異は、配列番号12の582位に位置するアミノ酸残基Lのアミノ酸残基Rによる置換に対応してもよい。このような突然変異HIV-2 ENV抗原は、配列番号13に示されるアミノ酸配列に対応してもよい。ENV抗原がSIVに起源を有する場合、ISドメインの突然変異は、配列番号7の600位に位置するアミノ酸残基Lのアミノ酸残基Rによる置換に対応してもよい。そのような突然変異SIV ENV抗原は、配列番号8に示されるアミノ酸配列に対応してもよい。
特定の実施形態では、ENV抗原の断片は、HIVエンベロープサブユニットの細胞外ドメインに対応し、免疫優勢領域(クラスターI)が欠失されているが、突然変異免疫抑制ドメイン、いわゆる3Sモチーフ及びMPER(膜近位外部領域)を含むエンベロープサブユニットgp41を含むか又はからなる。そのようなENV抗原は、例えば、配列番号43及び配列番号44の本発明の核酸構築物によりコードされている。
本発明者らは、上記のGAG及び突然変異ENV-GP41のポリヌクレオチドを含むMeVが、マウスにおいてVLP関連抗原の産生及び強力な細胞性免疫応答をもたらすことを示した(例えば、図17及び図18に示されている結果を参照)。
ENVをコードするポリヌクレオチドは、任意のHTLV株に起源を有してもよい。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドはHTLV-1に起源を有する。コードされている抗原は、配列番号48(突然変異ENV-HTLV-1)又は配列番号53(突然変異ENV-HTLV-2)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応してもよい。第2のポリヌクレオチドは、任意のATU内、MeVのアンチゲノム(+)RNA鎖のcDNA内に、特にATU1、ATU2、又はATU3内に挿入されていてもよい。特定の実施形態では、第1のポリヌクレオチドはATU3内に挿入されている。
特定の実施形態では、ENV抗原の断片は、突然変異免疫抑制ドメインを含む、HTLVエンベロープ膜貫通(TM)サブユニットの細胞外ドメインに対応するエンベロープサブユニットgp21を含むか又はからなる。
上記のGAG及び突然変異ENV-GP21のポリヌクレオチドを含むMeVは、強力な細胞性免疫応答を誘導するはずであるVLP関連抗原の産生をもたらす(例えば、図21及び図22に示されている結果を参照)。
突然変異HTLV-1 ENVタンパク質は、配列番号47の389位のアミノ酸残基Qがアミノ酸残基Rにより置換されていてもよい。ENVのISドメイン内に追加の置換を実施してもよく、配列番号47の395位に位置するアミノ酸残基Aがアミノ酸残基Fにより置換されていてもよい。両置換(Q389R及びA395F)を含むHTLV-1 ENVタンパク質は、配列番号48のアミノ酸配列である。
突然変異HTLV-2 ENVタンパク質は、配列番号52の385位のアミノ酸残基Qがアミノ酸残基Rにより置換されていてもよい。HTLV-2のENVのISドメイン内に別の又は追加の置換を実施してもよく、配列番号52の391位に位置するアミノ酸残基Aがアミノ酸残基Fにより置換されていてもよい。両置換(Q385R及びA391F)を含むHTLV-2 ENVタンパク質は、配列番号53のアミノ酸配列である。
本出願で開示される任意の突然変異NEF抗原が、本発明による核酸構築物内にコードされていてもよい。NEFをコードするポリヌクレオチドは、SIV株又はHIV株に起源を有してもよい。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、HIV-1に起源を有する。コードされている抗原は、配列番号15(突然変異NEF-SIV)、配列番号17(突然変異NEF-HIV-1)、又は配列番号19(突然変異NEF-HIV-2)からなる群から選択されるアミノ酸配列に対応してもよい。第3のポリヌクレオチドは、MeVのアンチゲノム(+)RNA鎖のcDNA内の任意のATU内、特にATU1、ATU2、又はATU3内に挿入されていてもよい。特定の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、ATU1内に挿入されている。
より詳細には、NEFの免疫抑制ドメイン内の突然変異は、NEFのISドメイン内に位置するアミノ酸残基の置換で構成されていてもよい。免疫抑制指数は、本発明の実施例に示される方法に従って、特に、ENV抗原について上記に記載の腫瘍拒絶アッセイにより測定することができる。特定の実施形態では、突然変異は、NEFタンパク質の免疫抑制ドメインにおける少なくとも1つのアミノ酸置換からなり、それは前記タンパク質の免疫抑制特性を調節する。
一例として、NEFの免疫抑制ドメイン内の突然変異は、NEFのISドメイン内に位置するアミノ酸残基の置換で構成されていてもよい。NEFのISD内の突然変異は、NEFのISD内に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応してもよい。突然変異免疫抑制ドメインを有するNEF抗原は、本明細書の上記に記載のように免疫抑制特性が低減されているか又は示さないが、野生型NEF抗原と比較して他の機能的特性は保たれている。
例として、NEF抗原がSIVに起源を有する場合、配列番号14の125位に位置するアミノ酸残基Eは、アミノ酸残基Rにより置換されていてもよく、そのような突然変異NEF抗原は、配列番号15のアミノ酸配列のタンパク質に対応してもよい。NEF抗原がHIV-1に起源を有する場合、配列番号16の93位に位置するアミノ酸残基Eはアミノ酸残基Rにより置換されていてもよく、そのような突然変異NEF抗原は、配列番号17のアミノ酸配列のタンパク質に対応してもよい。NEF抗原がHIV-2に起源を有する場合、配列番号18の125位に位置するアミノ酸残基Eはアミノ酸残基Rにより置換されていてもよく、そのような突然変異NEF抗原は、配列番号19のアミノ酸配列のタンパク質に対応してもよい。また、NEF抗原をコードする任意のポリヌクレオチドは、NEF抗原の細胞外搬出(つまり、分泌)を可能にするペプチドシグナルを含んでいてもよい。ペプチドシグナルは、タンパク質の搬出を可能にすることが知られている任意のペプチドシグナルであってもよい。配列番号22のNEF抗原は、ペプチドシグナルを有する野生型HIV-1-NEF(つまり、そのISドメイン内で突然変異されていない)に対応し、配列番号23のNEF抗原は、突然変異ISD(配列番号17の93位に位置するアミノ酸残基Eのアミノ酸残基Rによる置換)及びペプチドシグナルを有するHIV-1-NEF抗原に対応する。また、NEF抗原は、ミリストイル化を回避するために突然変異されていてもよい。
核酸構築物内では、GAG及びENVをコードするポリヌクレオチドは、同じウイルス種に起源を有する遺伝子に起源を有するか又は由来し、つまり、両方とも、HIV、SIV、若しくはHTLVに、特にHIV-1若しくはHIV-2に、又はHLTV-1に、より詳細にはHIV-1に起源を有するか又は由来する。特定の実施形態では、GAG及びENV抗原(又はGAG及びENV抗原をコードするポリヌクレオチド)は両方とも、HIV、特にHIV-1又はHIV-2に起源を有するか又は由来する。
核酸構築物内では、GAG、ENV、及びNEFをコードするポリヌクレオチドは、同じウイルス種に起源を有する遺伝子に起源を有するか又は由来し、つまり、両方とも、HIV又はSIVに、特にHIV-1又はHIV-2に、より詳細にはHIV-1に起源を有するか又は由来する。特定の実施形態では、GAG、ENV、及びNEF抗原(又はGAG及びENV抗原をコードするポリヌクレオチド)は全て、HIVに、特にHIV-1又はHIV-2に起源を有するか又は由来する。
・突然変異HBZ抗原及び野生型HBZ抗原(HTLV由来)
本発明の一実施形態では、第3の異種ポリヌクレオチドは、HBZ抗原の少なくとも断片をコードする。HBZはHTLV bZIP因子を指す。HBZの野生型バージョンは、UniProt参照番号P0C746として掲載されているタンパク質、又は配列番号55のタンパク質に対応してもよい。本明細書では、HBZ抗原は、配列番号49の突然変異HBZの少なくとも断片、又はその断片若しくは更なる突然変異バージョンに対応してもよい。その代わりに、配列番号55の野生型HBZの断片又は突然変異バージョンは、本発明の核酸構築物内に挿入された異種ポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。突然変異HBZは、特に配列番号49の野生型HBZに対応してもよく、配列番号49では、トランスフォーミング増殖因子ベータ/Smad経路の活性化を防止し、それにより配列番号55の野生型HBZの発がん特性を低減させるために、N末端部分に位置する2つのロイシンアミノ酸残基がアラニン残基に置換されている(L27A/L28A)。
第3の異種ポリヌクレオチドは、特に、TAX抗原の少なくとも断片に会合している、配列番号49のアミノ酸配列を含むか又はからなる、HTLVのHBZ抗原の少なくとも断片をコードしてもよい。特に、第3の異種ポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号49及び配列番号50の、又はHBZ抗原及びTAX抗原がGPIアンカーに会合している配列番号51のアミノ酸残基のTAX抗原に会合しているHBZ抗原をコードする。
突然変異HBZ抗原は、本明細書に記載の野生型アミノ酸配列(配列番号49)と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%の同一性を有し、免疫抑制活性が低減されているか又は示さない抗原に対応してもよい。また、HBZ抗原は、HTLVに起源を有する別の抗原、特にTAX、より詳細には配列番号50のアミノ酸残基配列のTAXに会合していてもよい。HBZ及びTAXの抗原を含むこのような融合タンパク質は、例えば、配列番号51に示されているアミノ酸残基配列に示されている。突然変異TAX抗原が、本発明の核酸構築物にコードされていてもよい。突然変異TAXは、本明細書に記載の野生型アミノ酸配列(配列番号50)と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%の同一性を有するTAX抗原に対応してもよい。特定の実施形態では、HBZ抗原は、T細胞、特にヒトT細胞により認識される少なくとも2つのエピトープを含むTAX抗原の断片に会合している。
核酸構築物内では、GAG、ENV、及びHBZ(及び該当する場合はTAX)をコードするポリヌクレオチドは、同じウイルス種に起源を有する遺伝子に起源を有するか又は由来し、つまり、両方とも、同じHTLVに、特にHTLV-1又はHTLV-2又はHTLV-3に、より詳細にはHTLV-1に起源を有するか又は由来する。ある特定の実施形態では、GAG、ENV、及びHBZ(又は該当する場合はTAX)抗原(又はGAG、ENV、HBZ (及び該当する場合はTAX)抗原をコードするポリヌクレオチド)は全て、同じHTLVに、特にHTLV-1又はHTLV-2又はHTLV-3に起源を有するか又は由来する。
本発明の特定の実施形態によると、NEF抗原又はHBZ抗原、ENV抗原、及びGAG抗原(GAGpro抗原を含む)は、完全長タンパク質に対応し、おそらくは該当する場合はそれらのISドメイン内で突然変異している。
本発明の一態様によると、HIV、SIV、若しくはHTLV、特にHIV-1の少なくとも1つの抗原をコードするポリヌクレオチドは、HIV、SIV、若しくはHTLV、特にHIV-1の単離及び精製野生株のゲノムに起源を有するか若しくは由来するか、又はゲノムが完全に又は部分的に配列決定されている任意のウイルス株を含む、コンセンサスHIV-1ゲノムなどのコンセンサス配列に由来する。これらの配列の少なくとも一部は、NCBIヌクレオチドデータベース又は免疫不全ウイルスに関するロスアラモスデータベースに見出すことができる。ポリヌクレオチドを規定する際に使用される「に由来する」という用語は、前記ポリヌクレオチドの配列が任意のIV株若しくはHTLV株の対応する配列と同一であってもよいこと、又は本発明による「抗原」若しくは「ポリペプチド」の規定を満たすIV若しくはHTLVのポリペプチド、抗原、タンパク質、若しくはその断片をコードする限り異なっていてもよいことを指定するに過ぎない。特に、ポリヌクレオチドは、IV株又はHTLV株の配列に対してコドン最適化されている場合、そのような核酸に由来する。したがって、この用語は、ポリヌクレオチドの産生様式を限定するものではない。ポリヌクレオチドは、特にENV及びNEFの免疫抑制ドメイン内に、抗原又はポリペプチドの野生型配列と比較して突然変異した抗原又はポリペプチドをコードしてもよい。
その代わりに、断片は、免疫エピトープデータベース及び分析リソース(http://www.iedb.org)に掲載されている天然タンパク質のエピトープを有する、少なくとも10アミノ酸残基を有する短いポリペプチドであってもよい。この点では、断片としては、ポリエピトープも挙げられる。
MeVのウイルスRNAの転写は5'末端から3'末端への勾配に従うため、本発明者らは、麻疹ウイルスの完全長アンチゲノム(+)RNAをコードするcDNA内の異なる位置に2つのポリヌクレオチドをクローニングすると、より高い収量の抗原性粒子及び/又はSIV、HIV、若しくはHTLVウイルス様粒子(VLP)の産生をもたらすことができるが、この産生は、ポリヌクレオチドが全て単一の同じ位置内にクローニングされる場合にはそれほど有意義ではないことを見出した。更に、異種ポリヌクレオチドを異なる位置にクローニングすると、コードされているポリペプチドの発現の減弱を低減させることができる。実際、単一のATU内に幾つかの遺伝子をクローニングすると、コードされているポリペプチドの発現の低減に結びつく可能性がある。この実施形態による特定の核酸構築物は、図1及び図20並びに実施例に示されている。したがって、別の実施形態としては、幾つかのポリヌクレオチドを単一のATU内に挿入し、それにより、例えば、幾つかのポリヌクレオチドによりコードされる複数の抗原を含む融合タンパク質の発現がもたらしてもよい。
MeVの完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子は、MeVの弱毒化株に特徴的なものであってもよく、又はそれから得られるものであってもよい。MeVの「弱毒化株」は、免疫優勢T細胞及びB細胞エピトープを保存するために宿主に投与されると、免疫原性及びおそらくはアジュバント性、並びにおそらくはT細胞共刺激タンパク質又はサイトカインIL-12の誘導などのアジュバント性(adjuvancity)を維持しつつ、同じ宿主において親株よりも無毒性であるか又は毒性が低い株であると規定される。
したがって、麻疹ウイルスの弱毒化株は、選択された細胞で連続継代されており、おそらくは他の細胞に適応してヒトワクチン株の調製に好適な種株を生成し、病原性への復帰も宿主染色体への組込みも生じさせないと考えられる安定ゲノムを有する株を指す。特定の「弱毒化株」としては、ワクチン用に承認された株が、FDA(米国食品医薬品局)により定められた基準を満たす場合、つまり、実験室データ及び臨床データの厳密な審査を経て、安全性、有効性、品質、及び再現性の基準を満たす場合(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm)、本発明に好適な弱毒化株である。
特に、MeVの完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子は、Schwarz株、Zagreb株、AIK-C株、Moraten株、Philips株、Beckenham 4A株、Beckenham 16株、Edmonston seed A株、Edmonston seed B株、CAM-70株、TD 97株、Leningrad-16株、Shanghai 191株、及びBelgrade株からなる群から選択される弱毒化ウイルス株から得られる。これらの株は全て先行技術に記載されている。本発明では、特に、市販ワクチンとしての使用が許可されている株が使用される。特に、MeVの完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子は、Schwarz株から得られる。
本発明の特定の実施形態によると、cDNA分子は、異種発現制御配列の制御下に置かれている。
cDNAを発現するためのこのような制御因子の挿入は、その天然制御配列ではcDNAの十分な転写が可能ではない細胞タイプにおいてこのcDNAの発現が求められる場合に有利である。
本発明の特定の実施形態によると、異種発現制御配列は、T7プロモーター配列及びT7ターミネーター配列を含む。これらの配列は、それぞれ、MeVの完全長アンチゲノム(+)RNA鎖のコード配列の5'及び3'に位置し、このコード配列の周囲の隣接配列を形成する。
本発明の特定の実施形態では、上記で規定されているcDNA分子は修飾されており、つまり追加のヌクレオチド配列又はモチーフを含む。
好ましい実施形態では、本発明に従って使用されるcDNA分子は、MeV承認ワクチン株の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の第1のヌクレオチドに隣接して、5'末端にGGGモチーフ、続いてハンマーヘッド型リボザイム配列を更に含み、完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードする前記ヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに隣接して、その3'末端にリボザイムの配列を含む。デルタ肝炎ウイルスリボザイム(δ)は、この好ましい実施形態の実施に適切である。
上記コード配列の第1のヌクレオチドに隣接して5'末端に配置されたGGGモチーフは、前記cDNAコード配列の転写効率を向上させる。麻疹ウイルス粒子の正しいアセンブリの要件は、アンチゲノム(+)RNAをコードするcDNAが6の法則に従うという事実であるため、GGGモチーフを付加する場合、MeVの完全長アンチゲノム(+)RNA鎖の第1のコードヌクレオチドの転写物の切断を可能にするために、cDNAのコード配列の5'末端のGGGモチーフの3'側にリボザイムも付加される。
本発明の核酸構築物を調製するために、先行技術で開示されている麻疹ウイルスの完全長アンチゲノム(+)RNAをコードするcDNA分子の調製は、公知の方法により達成される。得られるcDNAは、特に、プラスミドなどのベクターに挿入される場合、組換え麻疹ウイルス粒子の救済に関与するゲノムベクターの基盤を提供する。
本発明の核酸構築物の調製に好適な特定のcDNA分子は、麻疹ウイルスのSchwarz株を使用して得られるものである。プラスミドpTM-MVSchw、特に配列番号25のプラスミドは、Schwarz MVワクチン株のアンチゲノムに対応する感染性MeV cDNAを含み、本発明の異種ポリヌクレオチドを包含する組換えベクターの調製に使用される。これは他所に記載されている(21)。したがって、本発明内で使用されるcDNAは、国際公開第2004/000876号に開示されているように得てもよく、又は2002年6月12日にパスツール研究所によるCNCMにNo. I-2889で寄託されたプラスミドpTM-MVSchwから得てもよく、その配列は参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2004/000876号に開示されている。プラスミドpTM-MVSchwは、Bluescriptプラスミドから得られており、T7 RNAポリメラーゼのプロモーターの制御下に置かれたSchwarz株の完全長麻疹ウイルス(+)RNA鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。pTM-MVSchwは、18967個のヌクレオチド及び配列番号25として表されている配列を有する。他のMeV株由来のcDNA分子(便宜上、麻疹ウイルスのcDNA又はMeV cDNAとも称される)は、本明細書に記載のものなど、弱毒化MeVのウイルス粒子から精製された核酸から開始して同様に得ることができる。Combredetら(21)に説明されているように、追加転写ユニットは、ベクターに事前に挿入されているマルチクローニングサイトカセットであってもよい。ATUは、挿入されたIV遺伝子又はHTLV遺伝子の転写に必要なシス作用性配列を含んでいてもよい。異種ポリヌクレオチドは、上記で規定の追加転写ユニット(ATU)内にクローニング又は挿入されている。
これらの実施形態は、免疫抑制性ウイルスに関する疾患、特にHIV又はHTLV感染に関連付けられる疾患及び関連疾患の治療に好適な核酸構築物を提供するのに特に好適である。
既に開示されている実施形態のいずれか1つと組み合わせることができる特定の実施形態では、第3のポリヌクレオチドは、その5'末端側にペプチドシグナルを更に含むNEF抗原をコードし、NEFの細胞外搬出及びミリストイル化欠如を可能にする。このようなNEF抗原は、配列番号22又は配列番号23に示されているアミノ酸配列に対応してもよい。ペプチドシグナルは、これらに限定されないが、マウスIgGカッパシグナル配列又はヒトIL-2シグナル配列のような、NEF抗原の細胞外搬出を可能にするペプチドシグナルの群の中から選択することができる。これらのペプチドシグナルは、それぞれ配列番号36及び配列番号38の配列のアミノ酸残基に対応し、それぞれ配列番号37及び配列番号39のポリヌクレオチド残基によりコードされていてもよい。NEFのミリストイル化を回避するために、野生型NEFのアミノ酸配列を更に突然変異させてもよい。ミリストイル化されていないNEF抗原は、CD4及びMHC-Iの発現を下方制御しない。ミリストイル化されていない突然変異NEF抗原は、例えば、配列番号22及び配列番号23のアミノ酸残基配列に対応する。別の例として、配列番号26、又は配列番号27、又は配列番号28、又は配列番号29、配列番号30、又は配列番号31のアミノ酸残基の配列を有する抗原のミリストイル化が回避される。
別の特定の実施形態では、HBZ抗原は、外側細胞付着領域、例えば、GPIアンカー(GPIはグリコシルホスファチジルイノシトールの略称である)を更に含んでいてもよい。そのような実施形態は、HBZの発現、細胞膜への細胞外搬出、及び細胞膜の外側表面への係留局在化を可能にする。GPIは短い糖脂質である。GPIは、配列番号51に示されているように、HBZ-TAX抗原をコードする異種ポリヌクレオチドの翻訳後に、HBZ抗原の3'末端に又はHBZ-TAX抗原の3'末端に付着するようにコードされていてもよい。GPIアンカーは、配列番号35のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号34のアミノ酸残基配列に対応してもよい。また、HBZは、例えば細胞外搬出及びHBZのミリストイル化欠如を可能にするために、特にその5'末端側にペプチドシグナルを更に含むポリヌクレオチドによりコードされていてもよい。ペプチドシグナルは、これらに限定されないが、マウスIgGカッパシグナル配列又はヒトIL-2シグナル配列のような、HBZ抗原の細胞外搬出を可能にするペプチドシグナルの群の中から選択することができる。これらのペプチドシグナルは、それぞれ配列番号36及び配列番号38の配列のアミノ酸残基に対応し、それぞれ配列番号37及び配列番号39のポリヌクレオチド残基によりコードされていてもよい。
別の特定の実施形態では、NEF抗原は、外側細胞付着領域、例えば、GPIアンカー(GPIはグリコシルホスファチジルイノシトールの略称である)を更に含んでいてもよい。そのような実施形態は、NEFの発現、細胞膜への細胞外搬出、及び細胞膜の外側表面への係留局在化を可能にする。GPIは短い糖脂質である。GPIアンカーは、配列番号30及び配列番号31に示されているように、NEF抗原をコードする異種ポリヌクレオチドの翻訳後に、NEF抗原の3'末端に付着するようにコードされていてもよい。GPIアンカーは、配列番号35のヌクレオチド配列によりコードされる配列番号34のアミノ酸残基配列に対応してもよい。
好ましい実施形態によると、本発明は、宿主細胞におけるHIV、SIV、又はHTLV抗原、タンパク質、ポリペプチド、又はその断片の効率的な発現を可能にするための、ポリヌクレオチドの修飾、特に最適化にも関する。
したがって、ポリヌクレオチド配列の最適化は、核酸分子のシス活性ドメイン:内部TATAボックス、chi部位、及びリボソーム侵入部位;ATリッチ又はGCリッチ配列ストレッチ;ARE、INS、CRS配列エレメント;反復配列及びRNA二次構造;潜在スプライスドナー及びアクセプターサイト、分岐点を回避するように行うことができる。
また、最適化ポリヌクレオチドは、特定の細胞タイプにおける発現のためにコドン最適化されていてもよく、特に、マカク属(Maccaca)コドン使用頻度又はヒトのコドン使用頻度に合わせて修飾されていてもよい。この最適化は、発現タンパク質のアミノ酸組成に影響を及ぼすことなく、細胞でのキメラ感染性粒子産生の効率を増加させることを可能にする。
特に、HIV、SIV、又はHTLV抗原をコードするポリヌクレオチドの最適化は、元のコドンと比べて、コドンから翻訳されるアミノ酸残基の同一性に影響を及ぼすことなく、前記コドンのゆらぎ位置を修飾することにより実施することができる。
麻疹ウイルスの編集様配列を回避するための最適化も実施される。麻疹ウイルスの転写物の編集は、特に麻疹ウイルスのP遺伝子によりコードされる転写物において生じるプロセスである。この編集は、P転写物内の特定部位への追加のG残基の挿入により、Pタンパク質と比較して短縮された新しいタンパク質を生じさせる。G残基を1つだけ付加すると、固有のカルボキシル末端を含むVタンパク質の発現がもたらされる(24)。
本発明のこの特定の実施形態によるポリヌクレオチドでは、麻疹ウイルスの以下の編集様配列:AAAGGG、AAAAGG、GGGAAA、GGGGAA、並びにそれらの相補性配列:TTCCCC、TTTCCC、CCTTTT、CCCCTTを突然変異させてもよい。例えば、AAAGGGはAAAGGCに突然変異させてもよく、AAAAGGは、AGAAGGに、又はTAAAGGに、又はGAAAGGに突然変異させてもよく、GGGAAAは、GCGAAAに突然変異させてもよい。
したがって、本発明の核酸構築物は、以下の配列の少なくとも1つ、又は以下の配列の複数、又は以下の配列の少なくとも2つ、又は以下の配列の3つを含んでいてもよい:
- 配列番号32;配列番号33;配列番号:40;配列番号41;配列番号42;配列番号43及び/若しくは配列番号44;特に少なくとも配列番号32及び配列番号33、又は少なくとも配列番号40若しくは配列番号41。
本発明の一実施形態では、第1の核酸構築物は、
- 配列番号32(構築物MeV-SIVgag-HIVenv Cons B WT);
- 配列番号40(構築物MeV-SIVgag-HIVenv Cons B MT);
- 配列番号33(構築物MeV-SIVgag-HIVenv SF162 WT);
- 配列番号41(構築物MeV-SIVgag-HIVenv SF162 MT);
- 配列番号43(構築物MeV-SIVgag-HIVenv gp41 WT);及び
- 配列番号44(構築物MeV-SIVgag-HIVenv gp41 MT)
からなる群から選択される組換えcDNA配列を有する。
本発明の一実施形態では、第2の核酸構築物は、
- 配列番号33(構築物MeV-NEF SIV WT);及び
- 配列番号41(構築物MeV-NEF SIV MT)
からなる群から選択される組換えcDNA配列を有す:。
本発明の一実施形態では、第1の核酸構築物は配列番号44(構築物MeV-SIVgag-HIVenv gp41 MT)の組換えcDNA配列を有し、第2の核酸構築物は配列番号41(構築物MeV-NEF SIV MT)の組換えcDNA配列を有する。
本発明の一実施形態では、第1の核酸構築物は配列番号40(構築物MeV-SIVgag-HIVenv Cons B MT)の組換えcDNA配列を有し、第2の核酸構築物は配列番号41(構築物MeV-NEF SIV MT)の組換えcDNA配列を有する。
本発明の一実施形態では、第1の核酸構築物は配列番号41(構築物MeV-SIVgag-HIVenv SF162 MT)の組換えcDNA配列を有し、第2の核酸構築物は配列番号41(構築物MeV-NEF SIV MT)の組換えcDNA配列を有する。
本発明の特定の実施形態のいずれか1つによると、キメラ組換えMeV-HIV、MeV-SIV、又はMeV-HTLV感染性粒子産生の効率を増加させるポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
その代わりに又は相補的に、異種ポリヌクレオチドは、以下の抗原若しくはその抗原性断片のいずれか1つ、又は以下の抗原の少なくとも2つ、又は以下の抗原の3つをコードしていてもよい:
- 配列番号2、配列番号3、配列番号4、若しくは配列番号5のGAG、又はその抗原性断片;及び/或いは
- 配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号20、若しくは配列番号21のENV、又はその抗原性断片;及び/或いは
- 配列番号15、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号22、若しくは配列番号23のNEF抗原、又はその抗原性断片。
本発明の一実施形態では、核酸構築物は、配列番号54(構築物MeV-HTLVgag-HTLVenv)の組換えcDNA配列を有する。
本発明の特定の実施形態のいずれか1つによると、キメラ組換えMeV-HTLV感染性粒子産生の効率を増加させるポリヌクレオチドを含む核酸構築物が提供される。
その代わりに又は相補的に、異種ポリヌクレオチドは、以下の抗原若しくはその抗原性断片のいずれか1つ、又は以下の抗原の少なくとも2つ、又は以下の抗原の3つをコードしてもよい:
- 配列番号45若しくは配列番号46のGAG又はその抗原性断片;及び/或いは
- 配列番号47、配列番号48、配列番号52、若しくは配列番号53のENV、又はその抗原性断片;より詳細には、配列番号48若しくは配列番号53のENV又はその抗原性断片、及び/或いは
- 特に配列番号50(TAXに対応する)又はその抗原性断片と組み合わせた、配列番号49のHBZ抗原。
ポリヌクレオチドは、本明細書の上記で規定されたポリペプチドを1回コードしていてもよく、又は単一のポリヌクレオチドによりポリペプチドの断片が何回かコードされていてもよいことに留意されたい。好ましい実施形態では、各ポリペプチドは、単一の異種ポリヌクレオチド内に1回コードされており、より優先的には、各ポリペプチドは、複数のポリペプチド内に1回コードされている。本発明の特定の実施形態によると、各ポリヌクレオチドが少なくとも1つのHTLV抗原をコードする幾つかのポリヌクレオチドを組み合わせて又は融合させて、HTLVの幾つかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを形成する。これらのポリヌクレオチドは、それらがHTLVの種々の株のタンパク質又はHTLV株の異なるタンパク質をコードするという事実により互いに区別することができる。
ポリヌクレオチドは、本明細書の上記に規定されたポリペプチドを1回コードしていてもよく、又は単一のポリヌクレオチドによりポリペプチドの断片が何回かコードされていてもよいことに留意されたい。好ましい実施形態では、各ポリペプチドは、単一の異種ポリヌクレオチド内に1回コードされており、より優先的には、各ポリペプチドは、複数のポリペプチド内に1回コードされている。本発明の特定の実施形態によると、各ポリヌクレオチドが少なくとも1つのHIV、SIV、又はHTLV抗原をコードする幾つかのポリヌクレオチドを組み合わせて又は融合させて、HIV、SIV、又はHTLVの幾つかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを形成する。これらのポリヌクレオチドは、それらがHIV、SIV、又はHTLVの種々の株のタンパク質又はHIV、SIV、及びHTLV株の異なるタンパク質をコードするという事実により互いに区別することができる。
本発明の特定の実施形態では、核酸構築物は、5'末端から3'末端へと以下のポリヌクレオチド:
(a)少なくともNEF抗原若しくはHBZ抗原(及び該当する場合はTAX抗原)、又はその免疫原性断片をコードし、MeVのN遺伝子の上流に位置するATU内、特にATU1内に作動可能にクローニングされた第3の異種ポリヌクレオチド;
(b)MeVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)MeVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)少なくともGAG抗原又はその免疫原性断片をコードし、ATU内に、特にATU2内に、特に作動可能にクローニングされた第1の異種ポリヌクレオチド;
(e)MeVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(f)MeVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(g)MeVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(h)少なくともENV抗原又はその免疫原性断片をコードし、ATU内に、特にATU3内に、特に作動可能にクローニングされた第2の異種ポリヌクレオチド;
(i)MeVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含み、
前記ポリヌクレオチドは、核酸構築物内の、MeVリーダー配列及びトレーラー配列などのウイルス複製及び転写調節エレメントの制御下に作動可能に連結している。
この実施形態の幾つかの例は図1及び図20に概略的に示されている。
本明細書で使用される種々の用語は、前述の特定の実施形態で使用されたものと同じ意味を有する。核酸構築物内に挿入される異なるポリヌクレオチドは、GAG、ENV、及びNEF若しくはHBZ(及び該当する場合はTAX)抗原、又はそのそれぞれの免疫原性断片若しくは突然変異バージョンをコードし、全て同じウイルス型に、特に同じウイルス株に、より詳細にはHIV-1又はHTLV-1に由来する。この構築物では、ENV抗原、GAG抗原、及びNEF抗原又はHBZ抗原は、特にHIVに、特にHIV-1又はHIV-2又はHTLV-1又はHTLV-2又はHTLV-3に由来し、本明細書に示されているアミノ酸配列に対応する。
「Nタンパク質」、「Pタンパク質」、「Mタンパク質」、「Fタンパク質」、「Hタンパク質」、及び「Lタンパク質」という表現は、それぞれ、麻疹ウイルスの核タンパク質(N)、リンタンパク質(P)、マトリックスタンパク質(M)、融合タンパク質(F)、赤血球凝集素タンパク質(H)、及びRNAポリメラーゼ大型タンパク質(L)を指し、それぞれのポリペプチド又はその抗原性断片への参照を包含する。これらの成分は先行技術で特定されており、特にFields, Virology(10)に開示されている。
本発明の特定の実施形態では、核酸構築物は、その配列が、
- 配列番号32、配列番号40、配列番号43、又は配列番号44、特に配列番号40又は配列番号44(MeV-GAG-ENV);
- 配列番号33又は配列番号41、特に配列番号41(MeV-NEF)
からなる群から選択される組換えcDNAを含む。
前記配列は、以下のように記述される。
配列番号32及び配列番号40
配列番号32及び配列番号40は、本発明の特定の実施形態による核酸構築物の配列であり、前記構築物は、HIV-1のGAGタンパク質及びENVタンパク質をコードする配列が、それぞれ追加転写ユニット2及び追加転写ユニット3内にクローニングされたpTM-MVSchwarzベクターを含む。ENVは、本明細書の上記に記載の突然変異ISDを有する。
配列番号33及び配列番号41
配列番号33及び配列番号41は、本発明の特定の実施形態による核酸構築物の配列であり、前記構築物は、HIV-1のNEFタンパク質をコードする配列が、追加転写ユニット1内にクローニングされたpTM-MVSchwarzベクターを含む。NEFは、本明細書の上記に記載の突然変異ISDを有する。
また、本発明は、ヘルパー細胞又は産生細胞から救済する場合、組換えMeV-IV又はMeV-HTLV粒子の調製に使用することができるトランスファーベクターに関する。幾つかのトランスファーベクターを図1及び図20に示す。本発明の好ましい実施形態では、トランスファーベクターは、ヘルパー細胞又は産生細胞のトランスフェクションに好適であり、本発明による核酸構築物を含むトランスファーベクタープラスミドである。トランスファーベクタープラスミドは、Bluescriptプラスミドから得ることができ、本発明の異種ポリヌクレオチドを本明細書の上記に記載のpTM-MVSchwプラスミドにクローニングすることにより得ることができる。
本発明の特定の実施形態では、図1(HIVの場合)及び図20(HTLVの場合)に示されているように、NEF抗原又はHBZ抗原をコードする異種ポリヌクレオチドはATU1に位置し、GAG抗原をコードする異種ポリヌクレオチドはATU2に位置し、ENV抗原をコードする異種ポリヌクレオチドはATU3に位置する。
別の特定の実施形態では、GAG抗原をコードする異種ポリヌクレオチドは、麻疹ウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATUに位置し、ENV抗原をコードする異種ポリヌクレオチドは、麻疹ウイルスのH遺伝子とL遺伝子との間に位置するATUに位置し、別の麻疹ウイルスでは、NEF抗原をコードする異種ポリヌクレオチドは、麻疹ウイルスのN遺伝子の上流に位置するATUに位置する(それぞれ図16A及び図16Bに示されている)。例えば、図20及び図21に示されているように、HTVLに起源を有する抗原を用いて同様の構築をなすことができる。一例として、GAG抗原をコードする異種ポリヌクレオチドは、麻疹ウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATUに位置し、ENV抗原をコードする異種ポリヌクレオチドは、麻疹ウイルスのH遺伝子とL遺伝子との間に位置するATUに位置し、別の麻疹ウイルスでは、HBZ抗原をコードする異種ポリヌクレオチドは、麻疹ウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間に位置する。
図1(MeV-IV)及び図20(MeV-HTLV)は、本発明に包含される異なる核酸構造物を表す。図示されているように、核酸構築物内にコードされる抗原の異なる組合せが企図され、各抗原をコードする異種ポリヌクレオチドの位置は様々である。これらのスキームは説明のために図示されているに過ぎない。それらは、本発明の核酸構築物内の異種ポリヌクレオチドの位置を限定するものではなく、本発明の核酸構築物によりコードされる抗原の全ての組合せを表すものではない。
特定の実施形態では、本発明は、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(i)ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の、特に配列番号45又は配列番号46のGAGの少なくとも1つのGAG抗原、その断片、又はその突然変異バージョンをコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、第1の異種ポリヌクレオチド;
(ii)免疫抑制ドメイン(ISD)を含む少なくとも1つのENV抗原又はその断片、特にENV抗原の膜貫通サブユニットを含む少なくとも1つの断片をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、ENV抗原又はその断片は、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異しており、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)のものであり、特に配列番号48のENVであり、第2の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に挿入されたATU3に作動可能にクローニングされた、第2の異種ポリヌクレオチド
を含む核酸構築物であって、
ENVのISDドメイン内の突然変異は、ENV抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG及びENV抗原、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHTLV-1に由来する、核酸構築物に関する。
特定の実施形態では、本発明は、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(iii)ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)のHBZの、特に配列番号49のHBZの発がん性ドメインにおける少なくとも1つのHBZ抗原、その断片、又はその突然変異バージョンをコードし、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の発がん性ドメインにおける少なくとも1つのTAX抗原、その断片、その突然変異バージョン、特に配列番号50のTAXを更にコードする第3の異種ポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、第3の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)又は(ii)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、核酸構築物に関する。
特定の実施形態では、本発明は、麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(i)ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の、特に配列番号45又は配列番号46のGAGの少なくとも1つのGAG抗原、その断片、又はその突然変異バージョンをコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、第1の異種ポリヌクレオチド;
(ii)ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異されている少なくとも1つのENV抗原、特に配列番号48のENVをコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に挿入されたATU3に作動可能にクローニングされた、第2の異種ポリヌクレオチド;
(iii)ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)のHBZ、特に配列番号49のHBZの発がん性ドメインにおける少なくとも1つのHBZ抗原、その断片、又はその突然変異バージョンをコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)内、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド;
(iv)ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の発がん性ドメイン、特に配列番号50のTAXにおける少なくとも1つのTAX抗原、その断片、その突然変異バージョンをコードする第4の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、第4の異種ポリヌクレオチド
を含む核酸構築物に関する。
また、本発明は、組換えウイルスMeV-IV又はMeV-HTLV粒子の救済に好適な細胞を形質転換するための、特に、そのような細胞をそれぞれ本発明の核酸構築物を有するプラスミドで又はウイルスベクターでトランスフェクト又は形質導入するための、本発明によるトランスファープラスミドベクターの使用又は本発明による核酸構築物の使用であって、前記細胞は、組換え感染性複製可能組換えMeV-IV又はMeV-HTLV粒子における、本発明の核酸構築物に対応するウイルスの組換えゲノムの適切な複製、転写、及びカプシド形成に必要な麻疹ウイルスタンパク質を発現する能力について選択されている、使用に関する。
本発明の核酸構築物及びトランスファープラスミドベクターは、組換え感染性複製可能組換え麻疹-免疫不全ウイルス(MeV-IV)又は複製可能組換え麻疹-ヒトTリンパ球向性ウイルス(MeV-HTLV)の調製に好適であり、それが意図されており、したがって、前記核酸構築物及びトランスファープラスミドベクターは、前記組換えMeV-IVウイルス又はMeV-HTLVウイルスを産生するために、及びIV又はHTLVポリペプチドをおそらくはIV VLP又はHTLV VLPとして発現させるために、麻疹ウイルス、特にSchwarz株のcDNA分子を結果として含むトランスファーゲノムベクターに挿入することが意図されている。pTM-MVSchwプラスミドは、IV又はHTLVポリペプチド、タンパク質、抗原、又はその抗原性断片の発現に必要な本明細書に記載の異種ポリヌクレオチドを挿入することによるトランスファーベクターの調製に好適である。本明細書で使用される場合、「ウイルス様粒子」(VLP)という用語は、少なくとも1つの属性がウイルスに似ているが、それ自体では感染性であることが実証されていない構造を指す。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝情報を有しておらず、一般に、ウイルス様粒子はウイルスゲノムを欠如するため、非感染性及び非複製性である。本発明によると、ウイルス様粒子は、大量に生産することができ、MeV-IV又はMeV-HTLV組換え粒子と共に発現される。
本発明は、本発明のトランスファーベクターにより、並びにヘルパー機能及びタンパク質を提供する更なるポリヌクレオチドにより、このように形質転換された細胞又は細胞株にも関する。したがって、特に麻疹ウイルスのN、P、及びLタンパク質(つまり、リボ核タンパク質(RNP)複合体を形成することが可能な天然MeVタンパク質又はその機能的変異体)を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、好ましくは、組換えウイルスMeV-IV又はMeV-HTLV粒子の転写及び複製に際して機能する少なくともNタンパク質及びPタンパク質が安定発現タンパク質として、前記細胞に存在する。Nタンパク質及びPタンパク質は、それらのコード配列を含むプラスミドから細胞において発現させてもよく、又は細胞のゲノムに挿入されたDNA分子から発現させてもよい。Lタンパク質は、異なるプラスミドから発現させてもよい。Lタンパク質は一過性発現であってもよい。また、ヘルパー細胞は、本発明の核酸構築物に由来する組換えRNAの合成を可能にするのに好適なRNAポリメラーゼを、おそらくは安定発現RNAポリメラーゼとして発現させることが可能である。RNAポリメラーゼは、T7ファージポリメラーゼ又はその核型(nlsT7)であってもよい。
一実施形態では、麻疹ウイルスのcDNAクローンは、Nタンパク質及び/又はPタンパク質及び/又はLタンパク質と同じ麻疹ウイルス株に由来する。別の実施形態では、麻疹ウイルスのcDNAクローンは、Nタンパク質及び/又はPタンパク質及び/又はLタンパク質とは異なるウイルス株に由来する。
本発明による核酸構築物で形質転換又はトランスフェクトされた細胞は、組換え麻疹ウイルス及び/又はIV VLP若しくはHTLV VLPを産生することができる。したがって、組換え麻疹ウイルスは、本発明の核酸構築物をそのゲノムに含み、IV又はHTLVの少なくとも1つのポリペプチド、タンパク質、又はその抗原性断片を発現することができる。したがって、本発明の麻疹ウイルスは、突然変異ENV抗原、突然変異ENVタンパク質、若しくは突然変異ENVポリペプチド、又はその抗原性断片;及び/或いはGAG抗原、GAGタンパク質、若しくはGAGポリペプチド、又はその抗原性断片;及び/或いは突然変異NEF若しくはHBZ抗原、突然変異NEF若しくはHBZタンパク質、又は突然変異NEF若しくはHBZポリペプチド、或いはその抗原性断片を発現することができる。
本発明の好ましい実施形態では、組換え麻疹ウイルスは、IV又はHTLVの少なくとも突然変異ENV抗原及びGAG抗原を発現する。本発明の別の好ましい実施形態では、組換え麻疹ウイルスは、IV又はHTLVの、特にHIV-1又はHIV-2又はHTLV-1又はHTLV-2又はHTLV-3の突然変異ENV抗原、GAG抗原、及びNEF抗原又はHBZ抗原を発現する。
更に、本発明の一部の実施形態によると、組換え麻疹ウイルスは、麻疹ウイルスの少なくとも1つのポリペプチド若しくはタンパク質又はその抗原性断片も発現する。言い換えれば、組換え麻疹ウイルスは、以下のポリペプチド:MeVのNタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、Hタンパク質、及びLタンパク質の少なくとも1つを発現する。
この実施形態によると、組換えウイルスは、麻疹ウイルス及びIVウイルス若しくはHTLVウイルスの組換え抗原粒子を発現し、IV又はHTLVのポリペプチドに対する及びMeVのポリペプチドに対する細胞性応答、又は体液性応答、又は細胞性及び体液性応答の誘発を可能にする。本発明の特定の実施形態では、細胞性応答の誘発は、T細胞応答、特にCD4+及び/又はCD8+ T細胞応答、並びにより詳細にはIFNγ及びIL-2の誘発を含む。
したがって、本発明は、組換え感染性麻疹ウイルス粒子を調製するための方法であって、
(a)本発明による核酸構築物又は本発明によるトランスファープラスミドベクターで、T7 RNAポリメラーゼ及び麻疹N及びPタンパク質を安定的に発現する細胞、特にヘルパー細胞、特にHEK293ヘルパー細胞をトランスフェクトする工程;
(b)トランスフェクトされた細胞を、組換え麻疹ウイルス及び/又はIV VLP若しくはHTLV VLPの産生に好適な条件で維持する工程;
(c)工程(b)のトランスフェクトされた細胞と共培養することにより細胞を感染させて、組換え麻疹ウイルス及び/又はIV VLP若しくはHTLV VLPの増殖を可能にする工程;
(d)優先的には、HIVに、特にHIV-1若しくはHIV-2に起源を有するか若しくは由来するか、又はHTLVに、特にHTLV-1若しくはHTLV-2若しくはHTLV-3に由来する、少なくとも1つのIV抗原又はHTLV抗原、優先的には少なくともENV及びGAG抗原及び任意選択でNEF抗原又はHBZ抗原、GAG抗原、並びにENV抗原を発現する組換え麻疹ウイルスを回収する工程
を含む方法に関する。
特定の実施形態によると、本発明は、組換え感染性麻疹ウイルス粒子を調製するための方法であって、
a)本発明の核酸構築物又はそのような核酸構築物を含むトランスファーベクターを、ウイルス粒子アセンブリを可能にする条件下で、そのcDNAからMeVのアンチゲノム(+)RNA配列を転写、複製、及びカプシド形成するために必要なタンパク質も発現するヘルパー細胞株に移入、特にトランスフェクトする工程、並びに
b)IV若しくはHTLVの少なくとも1つの抗原、ポリペプチド、若しくはタンパク質、又はその抗原性断片を発現する組換え感染性MeV-IV又はMeV-HTLVウイルスを、優先的にはHIVから、より詳細にはHIV-1若しくはHIV-2から、又はHTLVから、より詳細にはHTLV-1若しくはHTLV-2若しくはHTLV-3から回収する工程
を含む方法に関する。
本発明の特定の実施形態によると、本方法は、
a)トランスファープラスミドベクターを用いて本発明による核酸構築物をヘルパー細胞にトランスフェクトする工程であって、前記ヘルパー細胞は、RNAポリメラーゼを発現するための、並びにMeVウイルスのN、P、及びLタンパク質を発現するためのヘルパー機能を発現することが可能である、工程;
b)工程1)の前記トランスフェクトされたヘルパー細胞を、cDNAが由来するMeV弱毒化株の継代に好適な継代細胞と共に共培養する工程;
c)それぞれIV又はHTLVの少なくとも1つのポリペプチドを発現する組換え感染性MeV-IV又はMeV-HLTVウイルスを回収する工程
を含む。
本発明の別の特定の実施形態によると、組換え感染性MeV-IV又はMeV-HTLVを産生するための方法は、
a)RNAポリメラーゼ、麻疹ウイルスの核タンパク質(N)、及び麻疹ウイルスのポリメラーゼ補因子リンタンパク質(P)を安定的に産生する細胞又は細胞の培養物に、本発明の核酸構築物、及び麻疹ウイルスのRNAポリメラーゼ大型タンパク質(L)をコードする核酸を含むベクターを組み換える工程、及び
b)前記組換え細胞又は組換え細胞の培養物から感染性MeV-IV又はMeV-HTLVウイルスを回収する工程
を含む。
この方法の特定の実施形態によると、少なくともENVタンパク質及びGAGタンパク質を含むIVタンパク質若しくはHTLVタンパク質、及び/又は少なくともENVタンパク質及びGAGタンパク質を含むIV VLP若しくはHTLV VLPを発現する組換えMeVが生成され、組換えMeV及び/又はVLPは、少なくとも1つの他のIVタンパク質若しくはHTLVタンパク質若しくは抗原、又はその抗原性断片、つまりNEF若しくはHBZ又はその断片を発現することができる。他の実施形態では、IV VLP又はHTLV VLPは、突然変異ENVタンパク質又はその断片、GAGタンパク質又はその断片、及び突然変異NEF若しくはHBZタンパク質又はその断片を含む。例として、IVタンパク質又はHTLVタンパク質、特にIv VLP又はHTLV VLPを発現する組換えMeVを救済するための方法は、
1)T7 RNAポリメラーゼ、及び麻疹N及びPタンパク質を安定的に発現するヘルパー細胞、特にHEK293ヘルパー細胞に、(i)少なくとも1つのIVタンパク質又はHTLVタンパク質をコードする、例えば、突然変異ENVタンパク質、GAGタンパク質、及び突然変異NEF又はHBZタンパク質をコードし、同じ核酸構築物内に又は異なる核酸構築物内に位置する少なくとも1つのポリヌクレオチドで組み換えた麻疹ウイルスの完全長アンチゲノム(+)RNAをコードするcDNAを含むトランスファーベクター、特にプラスミド、及び(ii)MeV LポリメラーゼcDNAをコードするベクター、特にプラスミドを共トランスフェクトする工程;
2)前記共トランスフェクトしたヘルパー細胞を、MeV-IV組換えウイルス又はMeV-HTLV組換えウイルスの産生を可能にする条件にて培養する工程;
3)工程2)の前記ヘルパー細胞を、Vero細胞など、前記増殖を可能にする細胞と共培養することにより、このようにして産生された組換えウイルスを増殖させる工程;
4)複製性MeV-IV又はMeV-HTLV組換えウイルス及びIVタンパク質又はHTLVタンパク質、特にIVウイルス様粒子又はHTLVウイルス様粒子、より詳細にはHIV-1又はHIV-2又はHTLV-1又はHTLV-2又はHTLV-3タンパク質、更により詳細にはHIV-1ウイルス様粒子又はHTLV-1ウイルス様粒子を回収する工程
を含む。
本明細書で使用される場合、「組み換える」は、少なくとも1つのポリヌクレオチドを、例えばベクターの形態で細胞に導入することであって、前記ポリヌクレオチドは細胞に組み込まれるか(全体が又は部分的に)又は組み込まれないことを意味する。特定の実施形態によると、組換えは、本発明の核酸構築物である第1のポリヌクレオチドを用いて得ることができる。組換えは、それに加えて又はその代わりに、麻疹ウイルスのRNAポリメラーゼ大型タンパク質(L)をコードするベクターであるポリヌクレオチドの導入を包含することもでき、その定義、性質、及び発現の安定性は、本明細書に記載されている。
本発明によると、RNAポリメラーゼ、麻疹ウイルスの核タンパク質(N)、及び麻疹ウイルスのポリメラーゼ補因子リンタンパク質(P)を安定的に産生する細胞又は細胞株又は細胞の培養物は、本明細書で規定の細胞若しくは細胞株、又は本明細書で規定の細胞の培養物であり、つまり、上記で規定の1つ又は複数のポリヌクレオチドの導入により形質転換されているという点で組換え細胞でもある。本発明の特定の実施形態では、RNAポリメラーゼ、Nタンパク質、及びPタンパク質を安定的に産生する細胞又は細胞株又は細胞の培養物は、麻疹ウイルスのLタンパク質を産生しないか、又は麻疹ウイルスのLタンパク質を安定的に産生せず、例えば、その一過性発現又は産生を可能にする。本発明の組換えMeV-IV又はMeV-HTLVウイルスの産生は、本明細書に記載のように形質転換された細胞の移入を含んでいてもよい。「移入」は、本明細書で使用される場合、組換え細胞を異なるタイプの細胞上に、特に異なるタイプの細胞の単層上に播種することを指す。これらの後者の細胞は、感染性組換えMeV-IV又はMeV-HTLVウイルスの複製及び産生の両方を維持する能力があり、つまり、細胞内での感染性ウイルスの形成、及びおそらくは細胞の外部へのこれらの感染性ウイルスの放出、おそらくはIV免疫原性粒子及び/若しくはIV VLP又はHTLV免疫原性粒子及び/若しくはHTLV VLPの放出をそれぞれ維持する能力がある。この移入は、以前の文章で規定のように、本発明の組換え細胞とコンピテント細胞との共培養をもたらす。上記の移入は、組換え細胞が効率的なウイルス産生培養物ではない場合の、つまり、感染性組換えMeV-IVウイルス又はMeV-HTLVウイルスをこれらの組換え細胞から効率的に回収することができない場合の、追加の、つまり任意選択の工程であり得る。この工程は、本発明の組換え細胞に、本発明の任意の核酸構築物、及び任意選択で麻疹ウイルスのRNAポリメラーゼ大型タンパク質(L)をコードする核酸を含むベクターを更に組み換えた後で導入される。
本発明の特定の実施形態では、通常、容易に組み換えることができる能力について選択された組換え細胞は、組換え感染性MeV-IVウイルス又はMeV-HTLVの維持及び産生に十分には効率的ではないため、移入工程が必要である。前記実施形態では、上記で規定の方法の工程1)の細胞又は細胞株又は細胞の培養物は、本発明による組換え細胞又は細胞株又は組換え細胞の培養物である。
本発明の組換え細胞の調製に好適な細胞は、原核細胞若しくは真核細胞、特に動物細胞若しくは植物細胞、より詳細にはヒト細胞若しくは非ヒト哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞、又はトリ細胞、又は酵母細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、そのゲノムの組換え前に、初代培養物又は細胞株のいずれかから単離される。本発明の細胞は、分裂細胞であってもよく又は非分裂細胞であってもよい。
好ましい実施形態によると、ヘルパー細胞はヒト胎児腎臓細胞株293に由来し、この細胞株293は、No. CRL-1573としてATCCに寄託されている。特定の細胞株293は、国際公開第2008/078198号に開示されている細胞株であり、以下の実施例では293T7-NPと呼ばれる。したがって、本発明は、本発明の任意の実施形態による核酸構築物をトランスフェクト若しくは形質転換したか、又はトランスファープラスミドベクターをトランスフェクトした宿主細胞、特にトリ細胞又は哺乳動物細胞にも関する。好適な細胞は、VERO NK細胞又はE6細胞(アフリカミドリザル腎臓細胞)、及びMRC5細胞(Medical Research Council細胞株5)である。この方法の別の態様によると、継代に好適な細胞はCEF細胞(ニワトリ胚線維芽細胞)である。CEF細胞は、EARL Morizeau(8 rue Moulin、28190 Dangers、フランス)又は任意の他の受精鶏卵生産者から得た受精鶏卵から調製することができる。
本発明により開示された方法は、免疫化組成物としての使用に適切な感染性複製可能組換えMeV-IV又はMeV-HTLVウイルスの産生に有利に使用される。したがって、本発明は、その有効成分が、本発明の核酸構築物から救済され、特に本開示の方法により得られる感染性複製可能組換えMeV-IV又はMeV-HTLVウイルスを含む、組成物、特に抗原性組成物に関する。組成物は、それを必要とするヒト、特に小児に投与するためのワクチン組成物であってもよい。前記組成物は、IV感染症又はHTLV感染症に対する治療に使用することができる。前記組成物は、AIDS又はHTLV関連疾患に対する防御のために使用することができる。したがって、組成物は、HIV又はHTLV感染に対する防御又は予防治療のための免疫原性又は抗原性組成物であってもよい。特に、組成物内の活性成分又は有効成分は、組換えMeV-HIV又はHTLV粒子を含み、前記組換えMeV-HIV又はMeV-HTLV粒子は、本発明によるトランスファープラスミドベクターから救済される。本発明の特定の実施形態では、組成物はワクチンである。
また、本発明は、対象、特にヒト対象、特に小児におけるHIV又はHTLVウイルスによる感染症の治療又は予防に使用するための、HIV若しくはHTLVポリペプチド若しくはタンパク質、又はその抗原性断片、おそらくは関連するHIV若しくはHTLV VLP、又は本発明による任意の組成物に関連付けられる組換えMeV-HIV又はMeV-HTLV感染性複製性ウイルス粒子にも関する。
また、本発明は、特にヒト対象、特に小児における、HIV又はHTLVウイルス感染性又は誘導性疾患に対する免疫応答、有利には防御免疫応答を誘発する投与スキーム及び投与量計画に使用するための、組換えMeV-HIV又はMeV-HTLV感染性複製性ウイルス及び関連するHIV若しくはHTLVポリペプチド若しくはタンパク質、又はその抗原性断片、及び潜在的に関連するHIV若しくはHTLV VLPにも関する。
本発明の特定の実施形態では、組成物又は組成物の使用は、皮下注射、特に筋肉内注射のような単回注射後に、対象、特にヒト対象、特に小児の免疫化を誘発することができる。言い換えれば、組成物又は組成物の使用は、選択された用量の組換えMeV-HIV又はMeV-HTLV感染性複製可能ウイルスの単回投与を必要とする場合がある。その代わりに、初回刺激-追加免疫レジメンでの複数用量投与を必要とする可能性がある。初回刺激及び追加免疫は、組換えMeV-HIV又はMeV-HTLV感染性複製可能ウイルス及び関連するHIV若しくはHTLVポリペプチド若しくはタンパク質、又はその抗原性断片、並びに/或いはHIV VLP又はHTLV VLPからなる同一の活性成分を用いて達成してもよい。別の実施形態では、本発明の実施例に示されているように、核酸構築物によりコードされる抗原は、初回刺激と追加免疫とで異なっていてもよく又は単一タイプのウイルスの異なる株に起源を有してもよい。
この実施形態は、ENV抗原の少なくとも1つの断片をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物が、NK依存性T CD4細胞枯渇の中和抗体及び療法用抗体阻害剤を促進するための初回刺激又は追加免疫として使用される、ワクチン初回刺激-追加免疫投与レジメンにおいて特に有用である。
したがって、本発明の特定の実施形態によると、初回刺激/追加免疫投与レジメン、特に初回刺激/追加免疫ワクチン接種、より詳細には異種初回刺激/追加免疫ワクチン接種で使用するための、本発明によるMeV-HIV又はMeV-HTLV感染性複製可能ウイルス及び関連するHIV若しくはHTLVポリペプチド若しくはタンパク質、及び/又はHIV VLP若しくはHTLV VLP、及び/又は遺伝子構築物を一成分として含むワクチンが提供される。異種初回刺激/追加免疫ワクチン接種は、第1の療法剤を含む第1の用量(初回刺激用量)及び第2の異なる療法剤を含む第2の用量(追加免疫用量)の対象への投与を含み、第2の用量は第1の用量後に(通常は数週間後に)投与される。
本発明によると、異種初回刺激/追加免疫ワクチン接種は、初回刺激用量又は追加免疫用量のための療法剤として、本発明による成分MeV-HIV若しくはMeV-HTLV感染性複製可能ウイルス、及び関連するHIV若しくはHTLVポリペプチド若しくはタンパク質、及び/又はHIV若しくはHTLV VLP、及び/又は遺伝子構築物を用いて実施される。該当する場合、別の療法剤が初回刺激用量又は追加免疫用量のために提供される。第2の療法剤は、RNA、特にmRNA、メッセンジャーRNA-リポソーム型化合物、ワクチンHIV又はHTLV抗原を発現するアデノウイルス型のワクチンベクター、ワクチンHIV又はHTLV抗原を発現する非麻疹ベクター、HIV若しくはHTLV抗原に対応する合成又は天然ペプチド形態のタンパク質、ペプチド、完全長タンパク質抗原、又はペプチドサブドメインであってもよい。提供される抗原は、本明細書に開示される任意の遺伝子構築物によりコードされる抗原に対応してもよい。このような投与の効率は、本発明の実施例に示されている(図19を参照)。タンパク質及び/又はペプチド初回刺激又は追加免疫投与は、組換え麻疹ウイルスによる初回刺激又は追加免疫中に(該当する場合)発現される抗原の完全長及び/又はサブドメインタンパク質からなっていてもよい。HIVワクチン接種の場合、投与されるタンパク質は、およそ50～70アミノ酸のペプチド及び/又は小型タンパク質の形態の、ENV抗原(つまり、gp41の細胞外ドメイン)及びNEF抗原のサブドメインであってもよい。HTLVワクチン接種の場合、投与されるタンパク質は、ENV抗原、HBZ抗原、及び/又はTAX抗原のサブドメインに由来するペプチド及び/又は小型タンパク質であってもよい。
異種初回刺激又は追加免疫に使用されるこれらのペプチド、小型タンパク質、及びウイルスは、特にアジュバントの存在下で投与してもよい。これらのアジュバントには幾つかの種類があり、特にアルミニウム塩(Alum)、Tween(ポリソルベート)80及びスクアレン(MF59)エマルジョン、3-O-デスアシル-4'-モノホスホリルリピドA(MPL)などのTLR4アゴニスト、イミダゾキノリン(R848、Resiquimod)などの合成TLR7/8アゴニスト、並びに/又は22量体一本鎖DNA(CpG 1018)などのTLR9アゴニストであってもよい。
本発明によるワクチンは、様々な経路で投与することができる。一実施形態では、本発明によるワクチンは、皮下経路、筋肉内経路、及び/又は粘膜内経路により投与される。本発明者らは、非ヒト霊長類において、皮下経路及び鼻腔内(粘膜)経路により投与したMeV-HIVのワクチン有効性を実証した(図13及び図14)。本発明の好ましい実施形態では、ワクチンは、粘膜内経路(例えば、舌、直腸、又は膣)、より詳細には鼻腔経路によるMeV-HIV又はMeV-HTLVの投与を含む。これらのタイプの投与は、ウイルスを主要進入部位で阻止することによりHIV感染又はHTLV感染を予防するために、IgA抗体を粘膜レベルで誘導することを目的とする。一実施形態では、ワクチンは、特に異種初回刺激/追加免疫ワクチン接種における初回刺激投与としては、粘膜内経路(例えば、舌、直腸、又は膣)による、より詳細には鼻腔経路によるMeV-HIV又はMeV-HTLVの投与を含む。一実施形態では、ワクチンは、特に異種初回刺激/追加免疫ワクチン接種における追加免疫投与としては、粘膜内経路(例えば、舌、直腸、又は膣)による、より詳細には鼻腔経路によるMeV-HIV又はMeV-HTLVの投与を含む。
また、本発明は、これらの成分の1つとして、組換えMeV-HIV若しくはMeV-HTLV感染性複製可能ウイルス、及び関連するHIV若しくはHTLVポリペプチド若しくはタンパク質、及び/又はHIV若しくはHTLV VLPを含む、異なる活性成分のアセンブリに関する。活性成分のアセンブリは、宿主、特にヒト宿主の免疫化に使用するのに有利である。
本発明者らは、サルにおいて、組換えMeV-HIV感染性複製可能ウイルスの投与が免疫応答を誘発し、特にHIV関連ポリペプチドに対する中和抗体の産生を誘発することを示した。したがって、本発明による活性成分の投与が、宿主の免疫化を誘発することが示された。本発明によるワクチンは安全であり、特にCD4+及びCD8+ T細胞応答、特にIFNγ及び/又はIL-2応答を包含する、宿主内での免疫応答に結び付く。実施例に示されているように、本発明によるワクチンは、抗原特異的T細胞応答を誘導する。免疫化サル宿主は、SHIV感染時にウイルス血症の低減を示すことも示された。組換えMeV-HTLV感染性複製可能ウイルスの投与は、免疫応答を誘発することができ、特に、HIV関連ポリペプチドに対する中和抗体の産生を誘発することができ、MeV-HIV感染性複製可能ウイルスで観察されるものと同様の免疫応答に関連付けることができる。
本発明による組成物は、組換えHIV又はHTLV特異的免疫グロブリン、特にIgM及びIgG、並びに中和抗体の産生を誘発することができる可能性がある。本発明による組成物は、安全なワクチンであり、免疫原性であり、宿主において有効であるはずである。組成物及びそれらの使用は、少なくともT細胞応答を付与することができ、HIV又はHTLV感染に対する免疫をワクチン接種宿主に付与することができる。
また、本発明による組成物は、特にヒト対象、特に小児において麻疹ウイルス感染性又は誘導性疾患に対する免疫応答、有利には防御免疫応答を誘発する投与スキームにおいて及び投与量計画に従って使用するための、組換えMEV-HIV又はHTLV感染性複製可能ウイルス、及び関連するHIV若しくはHTLVポリペプチド若しくはタンパク質又はその抗原性断片、及び潜在的には関連するHIV又はHTLV VLPに関する。
また、本発明は、対象、特にヒト対象、特に小児における、麻疹ウイルスによる感染症の治療又は予防に使用するための、HIV若しくはHTLVポリペプチド若しくはタンパク質又はその抗原性断片、及び/或いはHIV若しくはHTLV VLP、或いは本発明による任意の組成物に関連付けられる組換えMeV-HIV又はMeV-HTLV感染性複製性ウイルス粒子に関する。
本出願が参照する図面の一部はカラーである。出願時の本出願は、図面のカラー印刷物を含み、特許庁にて出願ファイルを閲覧すればそれにアクセスすることができる。
本発明の核酸構築物の概略図である。図1A～図1Kに示されているように、SIV/HIV gag及びHIV env(A)、SIV/HIV Nef(B)、HIV Nef、HIV gag、及びHIV env(C～F)、HIVgp41(G)、HIV GAG及びHIV gp41(H)の配列を有する様々な遺伝子配列がATU1、ATU2、又はATU3に挿入されている。 組換えMeV-SIVgag-HIVenvウイルスに感染したVero細胞の電子顕微鏡画像を示す図である。N:核;C:サイトゾル;矢印頭部:MeVウイルス粒子;矢印:gag形成VLP。MOI:0.01。 ワクチン及び免疫化スケジュール並びに反復低用量SHIV162P3負荷の概要を示す図である。A:初回刺激及び追加免疫1を皮下投与した。追加免疫2は皮下及び鼻腔内の両方だった。負荷は直腸内(i.r.)だった。皮下免疫化は、動物の左背及び右背の2つの異なる地点で実施し、鼻腔内免疫化は、スプレーワクチンで実施した。B:動物の免疫化に使用したワクチン及び用量。MV:MeV対照;Wt:野生型MeV-SHIV;Mt:突然変異MeV-SHIV(突然変異SIV-nef及びHIV-env;野生型SIV-gag)。 SHIV-SF162p3で負荷した動物における感染を示す図である。A:カプラン-マイヤー推定量による、各負荷後の感染動物のパーセンテージ。B:血清1ml当たり104ウイルスコピーの閾値を上まわる感染動物のカプラン-マイヤー推定。p値はログランクマンテル-コックス検定により計算されている。*:p<0.05;**:p<0.01。 免疫化及び負荷動物の各群におけるSHIV RNAコピー数のピークを示す図である。A:負荷後の対数ピーク。B:1週間後の対数ピーク。MV:MeV対照。Wt:野生型MeV-SHIV;Mt:突然変異MeV-SHIV。p値は、クラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定により計算されている。*:p<0.05;**p<0.01。水平バーは中央値を表す。 四分位範囲で提示されたワクチン接種動物(Wt及びMt)並びに対照動物(MV)における血漿ウイルス負荷動態を示す図である。p値は、ウィルコクソンマッチドペア符号付き順位検定に従って計算されている。*:p<0.05;**:p<0.01。MV:MeV対照;Wt:野生型MeV-SHIV;Mt:突然変異MeV-SHIV。水平バーは中央値を表す。 負荷後のリンパ球NADIR数を示す図である。血液1μl当たりのリンパ球数×1000。p値は、クラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定により計算されている。*:pw0.05。MV:MeV対照;Wt:野生型MeV-SHIV;Mt:突然変異MeV-SHIV。水平バーは中央値を表す。 最初の検出から13週間後に測定された、血漿1ml当たりのSHIV RNAコピーのqRT-PCTによるSHIV162p3の検出を示す図である。MV:MeV対照;Wt:野生型MeV-SHIV;Mt:突然変異MeV-SHIV。 様々な細胞型又は器官における106細胞当たりのSHIV組込みDNAコピー数を示す図である。A:PBMC。B:脾臓。C:腋窩リンパ節。D:鼠径リンパ節。E:直腸。MV:MeV対照;Wt:野生型MeV-SHIV;Mt:突然変異MeV-SHIV。p値は、クラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定を反映している。*:p<0.05;**p<0.01。水平バーは中央値を表す。 初回刺激後のIFNγ細胞性免疫応答を示す図である。A:初回刺激の2週間後に分析したIFNγ抗GAGワクチン誘導性免疫応答。B:初回刺激の2週間後に分析したIFNγ抗NEFワクチン誘導性免疫応答。応答は、IFNγFluorospotアッセイ(FLISPOT)で分析し、SIV-GAG及びSIV-NEFに対するスポット形成細胞(SFC)として図示されている。水平バーは中央値を表す。 追加免疫後のIL-2細胞性免疫応答を示す図である。A:2回目の追加免疫の1週間後に分析したIL-2抗GAGワクチン誘導性免疫応答。B:2回目の追加免疫の2週間後に分析したIL-2抗NEFワクチン誘導性免疫応答。測定は、IL-2細胞内染色(ICS)アッセイにより実施した。MV:MeV対照;Wt:野生型MeV-SHIV;Mt:突然変異MeV-SHIV(突然変異SIV-nef及びHIV-env;野生型SIV-gag)。p値は、クラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定により計算した。*:p<0.05;**:p<0.01。水平バーは中央値を表す。 ウイルス血症ピークにおける1ml当たりのSHIV RNAコピー数の対数を示す図である。A:+2週目の初回刺激後の抗GAG FLISPOT。B:+24週目の追加免疫後の抗ENV。結果は、ワクチン接種動物におけるPBMC106個当たりのIFNγ産生スポット形成細胞(SFC)として提示されている。赤色三角:Wt:野生型MeV-SHIV;緑色三角:Mt:突然変異MeV-SHIV(突然変異SIV-nef及びHIV-env;野生型SIV-gag)。統計分析は、ノンパラメトリックスピアマン相関、両側p値を使用して実施されている。 ワクチン誘発性体液性免疫応答 - A:Env(gp120);B:Gag;C:Nef;D:MeV(MV)タンパク質に対するELISAによる抗体力価(エンドポイントELISA力価の対数)を示す図である。p値は、クラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定により計算されている。*:p<0.05;**p<0.01;***:p<0.001。水平バーは中央値を表す。血清を、ベースライン(-2週目)、初回刺激(+2週目)、追加免疫(2回目の追加免疫の2週間後=+31週目)、及び負荷後(SHIVSF162p3 RNAの最初の陽性qRT-PCRから2週間)で収集した。 ワクチン誘発性細胞性応答 - A:Env;B:Gag;C:Nef:D:MeV(MV)タンパク質に特異的なIFNγ産生細胞を示す図である。p値は、クラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定により計算されている。*:p<0.05;**p<0.01;***:p<0.001。水平バーは中央値を表す。PBMCを、ベースライン(-2週目)、初回刺激(+2週目)、追加免疫(2回目の追加免疫の2週間後=+31週目)、及び負荷後(SHIVSF162p3 RNAの最初の陽性qRT-PCRから2週間)で収集した。 ワクチン接種動物における好酸球レベル対ウイルス血症ピークを示す図である。RNAコピー数/1ml血清(Log 10)当たりの好酸球数×1000。p値は、スピアマン相関ノンパラメトリック検定を反映している。**:p<0.01。 本発明による核酸構築物の概略図である。(A)は、SIV由来のGAG抗原をコードする第1の異種ポリヌクレオチド、及びHIV由来のENV抗原をコードする第2の異種ポリヌクレオチドを含むMeVベクターを表す。(B)は、SIV由来のNEF抗原をコードする第3の異種ポリヌクレオチドを含むMeVベクターを表す。 MeV-SHIV GAG GP41に感染した細胞におけるSIV GAG及びHIV GP41の産生を示す図である。MeV HIV GAG ENV-gp41に感染したVero細胞のGP41抗原及びGAG抗原のウェスタンブロット分析。細胞:細胞ライセート(cell lysat);VLPウイルス様粒子。染色:2F5抗GP41抗体;55-2F12抗GAG抗体。 本発明による麻疹-SHIVウイルスによるワクチン接種後のマウスにおける細胞性応答。MeV GAG GP41 Wt又はMt(SIV GAG HIV GP41)、MV GAG ENV Wt(SIV GAG HIV ENV)、及びMeV対照ウイルスによるマウスワクチン接種後の細胞免疫応答のELISPOTによる測定。 HIVエンベロープの免疫抑制(IS)ドメインに対する抗体の誘導に関する、異種初回刺激/追加免疫ワクチン接種と同種初回刺激/追加免疫ワクチン接種との比較を示す図である。同種初回刺激/追加免疫(Me-HIV/Me-HIV)のMe-HIV又は異種Me-HIV初回刺激及びgp41追加免疫ペプチド(Me-HIV/gp41ペプチド)でワクチン接種した6匹マウスの2群で得られたISドメイン抗体力価の比較。同種初回刺激/追加免疫(白色ボックスプロット)とは対照的に、異種初回刺激/追加免疫は、ISドメインに対する高力価の抗体を誘導した(赤色ボックスプロット)。N=4回の実験、平均値及びSDが示されている。 本発明の核酸構築物の概略図である。図20A～図20Cに示されているように、様々な遺伝子配列がATU1、ATU2、又はATU3に挿入されている。HTLV GAG及びHTLV ENV(A)、HBZ-Tax、HTLV gag、及びHTLV env(B及びC)。 本発明による核酸構築物の概略図である。HTLV由来のGAG抗原をコードする第1の異種ポリヌクレオチド、及びHTLV由来のENV抗原をコードする第2の異種ポリヌクレオチドを含むMeVベクターが図示されている。 本発明の核酸構築物MeV HTLV GAG ENVに感染した細胞におけるHTLV GAG及びHTLV ENVの産生を示す図である。MeV HTLV GAG ENVに感染したVero細胞のHTLV ENV抗原(A)及びHTLV GAG抗原(B)のウェスタンブロット分析。黒色矢印は、ENV抗原又はGAG抗原の分子量に対応するブロットを指し示している。細胞:細胞ライセート(cell lysat);VLP:ウイルス様粒子。染色:VC-17抗HTLV ENV抗体;4D7-H5抗GAG抗体。 本発明による麻疹-HTLVウイルスによるワクチン接種後のマウスにおける細胞性応答を示す図である。MeV HTLV GAG ENV Wt又はMt、及びMeV対照ウイルスによるマウスワクチン接種後の細胞免疫応答のELISPOTによる測定。
材料及び方法
プラスミド構築及びベクター生成。プラスミドpTM-MVSchwは、Schwarz MVワクチン株のアンチゲノムに対応する感染性cDNAを有する(9)。追加転写ユニット(ATU)は、部位特異的突然変異誘発により、プラスミド骨格のMV P遺伝子とMV M遺伝子との間に挿入されている。各MVオープンリーディングフレーム(ORF)発現は、それ自体のシス作用性エレメントにより制御される。ATUに挿入された追加ORFの発現は、N/P境界領域に存在するものをモデルにしたシス作用性エレメントにより制御される(導入遺伝子の上流での必要とされる一過性転写終結、自律的転写、キャッピング、及び導入遺伝子のポリアデニル化を可能にする)。単一pTM-MVSchwプラスミドのATU2及びATU3には、SIVmac239 Gag遺伝子及びHIV-1 Env遺伝子(初回刺激の場合はコンセンサスB EnvデルタV1/V2及び追加免疫の場合はSF162 Env)がそれぞれサブクローニングされている(図1)。別のpTM-MVSchwプラスミドのATU2には、SIVmac239 Nef遺伝子がサブクローニングされている(図1)。SIVmac239 NEF遺伝子は、分泌及び非ミリストイル化形態をコードする。対応するウイルスを、ヘルパー細胞ベース系を使用してpTM-MVSchw-SHIVプラスミドから救済した。簡単に説明すると、T7-RNAポリメラーゼ並びにSchwarz MV N及びPタンパク質を両方とも発現するヘルパーHEK293細胞(HEK293-T7-MV)を、pTM-MVSchw-SHIV(Gag-Env抗原又はNef抗原のいずれかをコードする)及びSchwarz MVポリメラーゼLを発現するプラスミドで共トランスフェクトした。その後、トランスフェクトしたHEK293-T7-MVヘルパー細胞を穏やかに回収し、MVSchw-SHIVウイルスの増幅のためにMRC-5細胞と共に共培養した。ウイルス力価を、Vero細胞に対するエンドポイント滴定により決定し、TCID50/mlとして表した。単一pTM-MVSchwプラスミドには、配列番号45のHTLV-1のGAG及び配列番号48のHTLV-1のENVをコードするポリヌクレオチド配列が挿入されている。対応するウイルスを、ヘルパー細胞ベース系を使用してpTM-MVSchw-HTLVプラスミドから救済した。簡単に説明すると、T7-RNAポリメラーゼ並びにSchwarz MV N及びPタンパク質を両方とも発現するヘルパーHEK293細胞(HEK293-T7-MV)を、pTM-MVSchw- HTLV(Gag-Env抗原をコードする)及びSchwarz MVポリメラーゼLを発現するプラスミドで共トランスフェクトした。その後、トランスフェクトしたHEK293-T7-MVヘルパー細胞を穏やかに回収し、MVSchw-HTLVウイルスの増幅のためにMRC-5細胞と共に共培養した。ウイルス力価を、Vero細胞に対するエンドポイント滴定により決定し、TCID50/mlとして表した。
透過型電子顕微鏡法。0.1Mリン酸緩衝液中1.6%グルタルアルデヒドで固定したMV-SHIV感染細胞を掻取って収集し、遠心分離した。2%四酸化オスミウムで後固定した細胞ペレットをエタノールで脱水し、Epon(商標)812に包埋した。酢酸ウラニル及びクエン酸鉛標準溶液で染色した超薄切片をFEI Tecnai 12電子顕微鏡で観察した。SIS MegaviewIII CCDカメラでデジタル画像を撮影した。
腫瘍拒絶反応アッセイによるHIV Env及びSIV Nef免疫抑制(IS)ドメイン突然変異の特定。293T細胞(7.5 105)を、pDFGレトロウイルスベクター(1.75μg)及びMLVタンパク質の発現ベクター(アンホトロピックMLV envベクターの場合は0.55μg、MLV gag及びpolベクターの場合は1.75μg;参考文献10を参照)に挿入されたISドメインが点突然変異しているHIV env又はnef遺伝子断片で共トランスフェクトした。トランスフェクションの36時間後、MCA205細胞に感染させるために上清を回収した(5.105細胞当たり2.5ml、8mg/mlポリブレンを用いて)。細胞を選択培地(400単位/mlハイグロマイシン)中で3週間維持し、次いでPBSで洗浄し、トリプシン処理をせずに掻き取り、マウス側腹部にs.c.接種した。垂直腫瘍直径を測定することにより腫瘍面積(mm2)を決定し、免疫抑制の程度を、腫瘍サイズに基づく指標(AISドメイン-Anone)/Anoneにより定量化した。式中、AISドメイン及びAnoneは、それぞれEnv若しくはNef ISドメイン発現細胞又は対照細胞を注射したマウスの腫瘍増殖のピークにおける平均面積である。マウスは、Gustave Roussy研究所の動物飼育施設において施設規制に従って飼育した。
腫瘍拒絶反応アッセイによるHTLV Env免疫抑制(IS)ドメイン突然変異の特定。293T細胞(7.5 105)を、pDFGレトロウイルスベクター(1.75μg)及びMLVタンパク質の発現ベクター(アンホトロピックMLV envベクターの場合は0.55μg、MLV gag及びpolベクターの場合は1.75μg;参考文献6を参照)に挿入されたISドメインが点突然変異しているHTLV env遺伝子断片で共トランスフェクトした。トランスフェクションの36時間後、MCA205細胞に感染させるために上清を回収した(5.105細胞当たり2.5ml、8mg/mlポリブレンを用いて)。細胞を選択培地(400単位/mlハイグロマイシン)中で3週間維持し、次いでPBSで洗浄し、トリプシン処理をせずに掻き取り、マウス側腹部にs.c.接種した。垂直腫瘍直径を測定することにより腫瘍面積(mm2)を決定し、免疫抑制の程度を、腫瘍サイズに基づく指標(AISドメイン-Anone)/Anoneにより定量化した。式中、AISドメイン及びAnoneは、それぞれEnv ISドメイン発現細胞又は対照細胞を注射したマウスの腫瘍増殖のピークにおける平均面積である。マウスは、Gustave Roussy研究所の動物飼育施設において施設規制に従って飼育した。
動物、免疫化、負荷。この研究には、モーリシャスから輸入された各々体重が4～5kgのナイーブ雄カニクイザル(CM)(マカカ・ファシキュラリス(Macaca fascicularis))24頭を割り当てた。動物は、SIV、STLV(サルTリンパ球向性ウイルス)、ヘルペスBウイルス、フィロウイルス、SRV-1、SRV-2a(サルレトロウイルス1及び2a)、及びMVに対して陰性であることを確認した。免疫群1群当たり8頭の動物を割り当てた(図3)。H6 MHCクラスIハプロタイプを有する3頭の動物を、3つの実験群に均等に分配した(1群当たり1頭のマカク)(25)。(i)「MV」群:対照としてのMV空ベクターで動物を免疫した。(ii)「Wt」群:野生型SIV Gag及びNef並びに野生型HIV EnvをコードするMVベクターで動物を免疫した。(iii)「Mt」群:野生型SIV Gag、ISドメイン突然変異SIV Nef及びHIV EnvをコードするMVベクターで動物を免疫した。野生型又はISD突然変異型コンセンサスB EnvデルタV1/V2を用いて初回刺激を実施し、Wt又はMt完全長SF162 Envを用いて追加免疫1及び追加免疫2を実施した。
ワクチンベクターを、0週目、13週目、及び29週目に皮下注射した。Gagタンパク質及びEnvタンパク質をコードするMV、MV-SHIV WT、及びMV-SHIV ISドメイン突然変異体を1.105 50%組織培養感染用量(TCID50)で、Nefタンパク質をコードするMVSIV Wt及びISドメイン突然変異体を3.104 TCID50で注射した。追加免疫1及び追加免疫2は、初回刺激と比べて10倍増加用量で実施した(1.106 TCID50 MV SHIV Gag Env Wt/Mt及び3.105 TCID50 MV SIV Nef Wt/Mt)。追加免疫2は経鼻及び皮下の両方で投与した。各動物は、1×106 MVSHIV Gag Env Wt/Mt及び3×105 MVSIV Nef Wt/Mt TCID50を、皮下及び鼻孔内噴霧の両方で受け取った。
マカクに、0.5動物感染用量50%(AID50)のSHIV162p3を直腸内経路により週1回繰り返して負荷した。ウイルスストックは、NIH AIDS Research and Reference Reagent Programから提供を受けた。血漿ウイルス量を毎週測定し、連続2回のqRT-PCRウイルス検出まで、最大10回の接種で負荷を続けた。
血漿ウイルス及びプロウイルス定量化。血漿SIV RNAを以前に記載のように定量化した(26、27)。定量下限(LOQ)及び検出下限(LOD)は、それぞれ、37コピー及び12.3コピーのvRNA/mLだった。PBMC及び器官におけるプロウイルスDNAを、SIVのgag領域を増幅するプライマーを使用して定量的PCRで測定した(30)。測定は、SHIVが血漿中で初めて検出された後、+13週目に実施した。
FLUOROSPOT IFN-γ及びIL-2アッセイ。IFN-γ及びIL-2応答を、製造業者の説明書に従ってFluoroSpotアッセイ(Mabtech、Nacka、スウェーデンのFS-2122-10サルIFNγ/IL2 FluoroSpotキット)を使用することにより、PBMCにおいて分析した。以下のペプチドプールをex vivo刺激に使用した(2μg/mL):85個ペプチドの1プール中のGag-SIVp15-p27(15量体、Proteogenix提供);63個ペプチドの1プール中のNef-SIV(15量体、Proteogenix提供);70個ペプチドの3つのプールに分割したHIV-1コンセンサスB Envペプチド-完全セット(15量体、NIH提供、カタログ番号9480)、及びMV 5 Schwarzウイルス(1pfu/細胞)。PMA/イオノマイシンを陽性対照として使用した。プレートを、5% CO2を含む雰囲気中、+37℃で44時間インキュベートした。スポットを、自動化FluoroSpotリーダーELRIFL04 (Autoimmun Diagnostika GmbH、ストラスバーグ、ドイツ)で計数した。
細胞内サイトカインアッセイ(ICS)。2×106個のPBMCを、抗CD28(1μg/ml)及び抗CD49d(1μg/ml)(BD Biosciences、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)を有する200μlの完全培地(10%ウシ胎児血清FBSを含むL-グルタミンを有するRPMI 1640)中でインキュベートした。ブレフェルジンA(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)を最終濃度10μg/mlで各ウェルに添加し、プレートを37℃、5% CO2で一晩インキュベートし、様々な刺激条件を適用した:(i)対照としてのDMSO溶媒、(ii)HIV Envペプチドプール(2μg/ml)、(iii)SIV Nefペプチドプール(2μg/ml)、(iv)SIV Gagペプチドプール(2μg/ml)、(v)MVタンパク質、(vi)陽性対照としてのSEB(4ug/ml)。染色緩衝液で洗浄した後、細胞を生存色素(紫色蛍光反応性色素、Invitrogen)で染色し、次いでBD Cytofix/Cytoperm試薬で固定及び透過処理した。透過処理した細胞試料を、以下の抗体:CD3、CD4、及びCD8(系統マーカーとして使用)、並びにINF-g、TNF-a、IL-2、及びCD154での染色手順にかける前に-80℃で保管した。インキュベーション後、細胞をBD Perm/洗浄緩衝液で洗浄してから、200μlの洗浄緩衝に再懸濁し、BD Canto IIフローサイトメーター(BD Biosciences)で回収した。フローサイトメトリーデータを、Flowjoソフトウェア(TreeStar、オレゴン州)を使用して分析した。
血清中の抗体応答の分析。SHIV抗原に対する抗体応答を、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Envタンパク質:gp120 Bal)又はNIBSC(Nef J5タンパク質及びGag rp27タンパク質)からのタンパク質を捕捉抗原として使用して酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)で測定した。抗MV(Trinity Biotech)抗体を、市販のELISAキットを使用して検出した。簡単に説明すると、1μg/mLのタンパク質を使用して、96ウェルNunc Maxisorp マイクロタイタープレートをコーティングした。陰性対照は、正常なカニクイザル血清及び飽和アッセイ緩衝液からなっていた。血清の開始希釈は1/50であり、結合抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Hrp)にコンジュゲートされたヤギ抗サル全Ig(Jackson Immunoresearch)を用いて検出した。TMB基質の添加後、プレートの光学密度を450nmで読み取った。結合抗体のエンドポイントELISA力価は、以下のように規定した:exp[Ln(希釈度>)+(ベースラインOD)/(OD>-OD<)×Ln(希釈度>/希釈度<)]。ELISAの検出限界は、試験血清の開始希釈(1/50)であるとみなした。
血漿抗体について記載したように、直腸分泌IgA結合抗体を、ヤギ抗サルIgA(Alpha Diagnostics、サンアントニオ、テキサス州)を使用してWeck-Cel(商標)スポンジで収集した流体から探索した。
完全な血液学的特徴付け。リンパ球、好酸球、及び血球数(CBC)は、HMX A/L(Beckman Coulter)を使用して実施した。
ウイルス中和アッセイ。中和アッセイを以前に記載のように実施した(28)。トランスフェクションの48～72時間後に293T細胞上清から偽ウイルスストックを収集し、遠心分離により清澄化し、少容積に分けて-80℃で凍結した。感染性ウイルスであるSHIV SF162p3、HIV1 SF162、及びHIV1 QH10を、活性化ヒトPBMCにて増殖させた。TZM-blインジケーター細胞株を使用し、記載のようにルシフェラーゼを読取りとして用いて、熱不活化血清試料の5倍系列希釈物を、Env偽ウイルスに対するそれらの阻害能についてアッセイした。TZM-bl細胞を平底96ウェルプレートに播種し、一晩培養した。3.5%(容積/容積)FBS(Hyclone)及び40μg/ml DEAE-デキストランを有するDMEM中の偽ウイルス(1ウェル当たり2000IU)を、血漿又は血清の系列希釈物と混合し、その後、播種したTZM-bl細胞に添加した。感染48時間後に細胞を溶解し、Gen 5、v2.0ソフトウェアを備えたBioTek Synergy HTマルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。一連の未感染ウェルの平均バックグラウンド発光を各実験ウェルから差し引き、GraphPad Prism v6.0d を使用して感染力曲線を生成し、実験ウェルの値を、試験試薬を有しないウイルスを含むウェル(100%感染力)と比較した。中和IC50力価値は、Graphpad Prism v6.2 (GraphPad、サンディエゴ、カリフォルニア州)で、可変傾き、対数変換x値、及び正規化y値を用いた用量応答阻害分析機能を使用して計算した。
統計分析。カプラン-マイヤー曲線及びログランクマンテルコックス検定を使用して、生存曲線の違いを検定した。ノンパラメトリッククラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定を使用して、3つの異なる免疫化群:MV、Wt、及びMtで得られた免疫反応を評価した.血漿ウイルス血症の分析を実施する場合、ウィルコクソンマッチドペア符号付き順位検定を使用して、ベースライン頻度と比較した頻度の変化の有意性を比較した。相関性に関しては、スピアマン順位相関法を使用した。統計分析は、GraphPad Prism v6.2ソフトウェア(GraphPad、サンディエゴ、カリフォルニア州)を使用して実施した。
(実施例1)
SHIV抗原を発現する組換えMeVウイルスの生成
Gag-Envを同時発現して、本発明者らが非常に免疫原性であることを以前に実証した(12)ウイルス様粒子(VLP)を形成する新しいMV-SHIVベクターを生成した(図2)。SIV239 gag遺伝子及びHIV-1 env遺伝子に対応する配列を、2つの異なる追加転写ユニットに挿入した(ATU)(初回刺激の場合はコンセンサスB Env及び追加免疫の場合はSF162 Env) (図1A)。分泌及び非ミリストイル化形態のSIV239 Nefを発現する別のMVベクターを生成した(図1B)。Nefタンパク質は、細胞外搬出及びミリストイル化欠如をもたらすシグナル配列と融合されている。HIV Env及びSIV Nef ISドメイン内に標的突然変異を有する特定のベクターも生成した。実際、HIVは、他のレトロウイルスと同様に、そのEnv内にISドメインを有するだけでなく、Nefタンパク質内にもISドメインを有する(10～11)。ISドメインの突然変異は、免疫拒絶に対する腫瘍細胞感受性を回復させ(15)、ワクチン免疫性を向上させることが示されている(17)。ここでは、野生型形態を有する腫瘍細胞と比較して、突然変異ウイルスタンパク質を発現する腫瘍細胞をin vivoで直ちに拒絶する能力に基づき、HIV Envドメイン及びSIV Nef ISドメインの両方を突然変異させた。
(実施例2)
動物免疫化及びワクチンレジメン
野生型又はISドメイン突然変異体形態の2つのMV-SHIVベクター(図3B)による、初回刺激及び13週目及び29週目の2回の追加免疫(図3A)を用いて皮下経路により動物を免疫した。HIV/SIVの天然制御増加に関連付けられるMHCハプロタイプを3つの群に展開させた(25)。異なるワクチンレジメンの防御有効性を評価するために、全ての動物に、41週目(最後の免疫化から3か月後)に、0.5 AID50のSHIV-SF162-P3クレードB R5向性キメラウイルス(各負荷において動物の25%に感染する可能性がある用量)を直腸内に週1回負荷した。その後2回のqRT-PCRウイルス検出後に負荷を中止した。
ほぼ全ての動物が負荷の5週間後に感染した(図4A)。しかしながら、ワクチン接種動物の75%が104血漿ウイルスコピー/mlを下まわるウイルスピーク値を呈したため、ウイルス血症は、収量及び排除までの時間短縮の両方が、対照と比較してワクチン接種動物において大幅に低減された(図4B)。注目すべきことに、13回のその後の負荷にも関わらず、突然変異群の1頭の動物は研究期間にわたって未感染のままだった。
血漿ウイルス血症は、ワクチン接種動物では、ピークが大幅に低減され(突然変異体群:p<0.05、クラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定、図5A)、ピークの1週間後では、ワクチン接種サル16頭中9頭で50RNAコピー/ml以下だった(p<0.01、図5B)。ワクチン接種は、最初の1週間以内に血漿ウイルス低減の動態に強力な影響を及ぼした(p=0.0078 野生型、p=0.0156 ISドメイン突然変異体、ウィルコクソンマッチドペア符号付き順位検定、図6)。ウイルスピークの2週間後、50%よりも多くのワクチン接種動物(Wt群及びMt群の16頭中9頭のワクチン接種サル)は、血漿中にウイルスRNAを有しておらず、したがって感染が完全に制御された。他の動物は、対照と比較してウイルス血症が大幅に低減された(図6)。対照的に、血漿ウイルスRNAコピーは、ピークの3週間後でも8頭中7頭の対照サルで依然として検出された(図6、MV群)。また、ワクチン接種は、リンパ球枯渇からサルを防御した(負荷後のリンパ球NADIR、p<0.05、クラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定、図7)。
ワクチン接種動物における血漿ウイルス量の低減は、PBMC(p<0.01 クラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定)(図8対図9A))、脾臓(p<0.05及びp<0.01)(図8対図9B)、腋窩リンパ節(p<0.05及びp<0.01)(図8対図9C)、鼠径リンパ節(p<0.01)(図8対図9D)、及び直腸(p<0.01)(図8対図9E)におけるプロウイルス組込みの低減と相関していた。全ての対照動物がほとんどの器官でプロウイルス組込み陽性であったのに対し(図8及び図9、MV群)、ワクチン接種動物はかなりの割合が陰性であった(ワクチン接種動物16頭のうち、PBMCでは8頭、脾臓では9頭、腋窩リンパ節では5頭、鼠径リンパ節では3頭、及び直腸では5頭)。興味深いことに、長期非進行性/エリートコントローラー患者におけるウイルス保菌の制御は、優れた細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答に起因すると考えられている(29)。
ワクチン組成物におけるISドメイン突然変異の役割に関して、本発明者らは、抗Gag及びNef IFNγ細胞性免疫応答が、野生型抗原とは対照的に(Gagの場合はp<0.05及びNefの場合は有意性無し)(図10)、ISドメイン突然変異により初回刺激後に増加したことを見出した(対照と比較してp<0.001、クラスカル-ワリス検定及びDunnの多重比較検定)(図10)。追加免疫は、グローバルな細胞性免疫応答(これは、単回免疫化後に長期的細胞性応答を誘発する生ワクチンの特徴である)を向上させなかったが(図14)、ISドメイン突然変異体をワクチン接種した動物では、対照動物と比較してより高いIL-2細胞内サイトカインレベルが測定された。しかしながら、ISドメイン野生型では測定されなかった(応答は、Nef p<0.05、Env p<0.05、及びGag p<0.01に特異的だった)(図11)。
防御の相関性を調べたところ、本発明者らは、初回刺激後(抗Gag、p=0.029、r=-0.5500ノンパラメトリックスピアマン相関法、P値:両側)及び追加免疫後(抗Env、p=0.0080、r=-0,6461)(図12)のIFNγ細胞性免疫応答が、負荷ウイルスピークの低減と相関していたことを見出した。抗Gag細胞性免疫応答の防御的役割は、SHIVSF162p3を負荷したサルにおいて以前に報告されている(30)。加えて、T細胞エピトープを有するワクチン接種患者を対象としたSTEP治験においてウイルスエスケープ突然変異体(クレードB Gag/Pol/Nef)が特定されており(31)、細胞性免疫系が強力な圧力をかけていることが示唆される。初期複製部位にてエフェクター細胞(TEM)を分化させる能力を有する効率的な細胞性免疫応答は、生ワクチンの特徴である。これは、SIVタンパク質を発現する複製能力のあるサイトメガロウイルスワクチンで以前に示されており、初期感染は予防することができなかったが、検出可能な抗体を有していない動物の50%において、SIV特異的CTL応答の強力な刺激によりウイルスを制御及び排除した(32、33)。
広域中和抗体はNHPにおいて防御的である可能性があり、Env可変V2ループに対する非中和抗体はRV144治験におけるワクチン誘導性防御と相関していた(2、3)。本発明者らの研究では、MVに対しては高レベルであり、HIV Envに対しては中程度のレベルであり、SIV Gag及びNefに対しては低レベルであるか又は検出不能でさえある抗体が検出された(図13)。抗Env抗体は、2回目の追加免疫後に全ての動物において比較的高レベルで検出され、ワクチン接種対象では負荷後に既往応答の10倍に増加した(図13A)。SIV Gagに対する抗体は、境界線レベルで誘発されたが、負荷後に増加しなかった(図13B)。SIV Nefに対する抗体は、追加免疫後に全てのワクチン接種動物で誘導され、負荷後にわずかに増加した(突然変異体ワクチン群において対照と比較してp<0.05)(図13C)。Tier2 SHIVSF162p3株に対する中和抗体は見出されず、中和が容易なTier1 HIV-SF162株に対する2回目の追加免疫後では、少数の動物のみが低い抗体中和活性を示した(Table 1(表1))。本発明者らは、抗体力価、特に抗Env抗体と、ウイルス量又はSHIV獲得との間に相関性を見出さなかったが、ワクチン誘導性抗体は、非中和抗体について以前に示されているように、抗体依存性細胞傷害(ADCC)機序及び/又は抗体依存性細胞貪食(ADCP)機序(2、3)を介してSHIV制御に寄与することができると推測している。
本発明者らは、HIV Env、SIV Gag、SIV Nef、及びMVベクター抗原に応答した細胞媒介性免疫応答を、IFNγ ELISPOTアッセイで評価した(図14A～図14D)。HIV-Env細胞応答は低く、初回刺激後にのみ観察され、負荷後に増加しなかった(図14A)。対照的に、Gag及びNef細胞性免疫応答は、MV-SHIV初回刺激により有意に誘導された(図14B及び図14C)。追加免疫は、MV特異的細胞性応答と同様にこれらの応答を向上させなかった(図14D)。これは、単回ワクチン接種後に長期的細胞性応答を誘導する生ワクチンの特徴である。SHIV及びMV抗原に対して誘発された初回刺激後の細胞性応答は、2回の追加免疫免疫化及び負荷にも関わらず、時間の経過と共に衰えた。本発明者らは、以前に、マカクザルで同じ観察を行い、MVベクターに対するメモリーT細胞応答は、循環中PBMCではほとんど検出することができず、検出には長期間のin vitro増殖を必要とするが、リンパ節及び脾臓などの二次リンパ器官では持続することを実証した(11)。
注目すべきことに、本発明者らは、ワクチン接種動物の好酸球細胞数がウイルス血症のレベルと正に相関することを観察した(p=0.0207、r=0.5794、スピアマン検定)(図15)、これは、高レベルの好酸球細胞がSHIV感染に寄与する可能性があることを示唆する。実際、SIV感染マカクザルでは好酸球増加症の有病率が70%であるのに対し、ナイーブサルでは10%であることが以前に報告されており(34)、好酸球増加症は、HIV感染/AIDS進行に関連付けられることが記載されている(35)。
中和耐性SHIV162p3に対するワクチン防御は、限られた数のNHP治験でのみ達成されている(36～39)。CCR5向性SHIV162p3は、長期感染マカクザルにおける広域中和抗体のレベルが低い最も厳格なNHP負荷モデルの1つである(40)。SF162 Env三量体タンパク質による同種ワクチン接種は、保菌体におけるSHIVSF162p3獲得及びプロウイルス量を防御しなかった(28)。同様に、SIVmac251抗原によるワクチン接種及びSIVmac251による負荷は、マカクザルでは防御効果を示さなかった(41)。HIV伝染予防の観点では、ヒト感染の50%が感染の急性期又は初期段階にあるドナーを介して生じるため、HIVワクチンによる初期血漿ウイルスの低減は、重要な役割を果たすことができると考えられる(42、43)。更に、抗レトロウイルス療法(ART)の早期開始と同様に、感染の初期段階でウイルス量を低減させることにより、AIDSの転帰を遅延させることができると考えられる(44、45)。
本発明による麻疹-SHIVウイルス(MeV-SIV-GAG HIV-ENV-gp41)に感染した細胞におけるSHIV抗原の産生(図17)及び本発明の麻疹-SHIVウイルスをワクチン接種したマウスにおける免疫応答(図18)。
図17に示されているように、MeV-GAG-gp41は、感染細胞においてGAGタンパク質及びgp41タンパク質の産生に結び付き、GAGタンパク質及びgp41タンパク質を有するVLPの産生にも結び付く。図18に示されているように、ENV-gp41(そのISドメイン内で突然変異しているか又はされていない)及びGAGをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、本発明によるMeV-SHIVをワクチン接種したマウスの免疫系は、コードされている抗原の発現及び分泌に対して応答し、実際、ワクチン接種マウスの免疫系の細胞は、SHIVペプチドによる刺激に対してより応答性である(MeVワクチン接種対照マウスよりも多くのIFNγを分泌する)。更に、そのISドメイン内で突然変異したENV-gp41及びGAGをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、本発明によるMeV-SHIVウイルスをワクチン接種したマウスは、対照マウス、並びに野生型gp41又はENV及びGAGをコードするMeV-SHIVウイルスをワクチン接種したマウスと比較して、向上された免疫応答を誘発することを観察することができる。
初回刺激/追加免疫ワクチン接種による免疫応答の誘発
図19に示されているように、HIV抗原を発現する組換え麻疹ウイルス(MeV)(MeV-HIV)を異種追加免疫と組み合わせると、免疫原性、特に特定の抗原ドメインに対する体液性応答が大幅に増加する。これらの結果は、マウスにおいて、HIVエンベロープの免疫抑制(IS)ドメインに対する抗体の誘導に関して、同種初回刺激/追加免疫ワクチンよりも異種初回刺激/追加免疫ワクチン接種の方が優れていることを示している。これらの実験では、2つの群のマウスに、2週間の間隔をおいて、MeV-HIV/Me-HIV初回刺激/追加免疫(SIV Gag及びHIV Env又はgp41抗原を発現するMeV)又はMeV-HIV初回刺激及びそれに続くgp41の細胞外領域の幾つかのペプチドアジュバントからなる追加免疫を与えた。麻疹ベクター化HIVワクチン接種は、タンパク質(ペプチド)、mRNA-リポソーム、又は非麻疹ウイルスベクター及びワクチン抗原に続く追加免疫としても使用することができる。
結論
この研究は、麻疹由来複製性ワクチンベクターが、NHPにおける高ウイルス血症及び保菌確立からのある程度の防御を提供することができることを初めて実証した。ウイルス制御は、異種追加免疫及び複雑な組成物を必要とせずに達成され、細胞性免疫応答のレベルと相関していた。ISドメインの突然変異は、ワクチン免疫原性を明らかに増加させた。これは、任意の他のHIVワクチン戦略にISドメインが含まれるべきであることを示している。このヒト用ワクチンの複製能力は、防御に大きな役割を果たした可能性が高い。麻疹ワクチンプラットフォームは、臨床実現可能性が既に実証されている。これは、製造及び配布が容易な安価な生ワクチンである。小児用ワクチンによるAIDSの予防は理想的な目標であり、ヒトにおけるそのようなMV-HIV-1ワクチン候補の可能性を確認するために、本発明の臨床研究が進行中である。
(実施例3)
本発明による麻疹-HTLVウイルス(MeV HTLV GAG ENV)に感染した細胞におけるHTLV抗原の産生及び本発明の麻疹-HTLVウイルスをワクチン接種したマウスにおける免疫応答(図22及び図23)。
HIV及びHTLVは両方ともレトロウイルス科に属し、それぞれレンチウイルス属及びデルタウイルス属に属する。これらのレトロウイルスは、3つの遺伝子が、転写調節ドメインLTR(長い末端反復配列)によりフレーミングされた、カプシドタンパク質(Gag)、付着タンパク質(Env)、及び酵素タンパク質(Pro及びPol)をコードするという同様のゲノム構成を有する。HIV及びHTLVは、異なる抗原性特徴を有し、組換え麻疹ウイルスを使用した初回刺激/追加免疫ワクチン戦略で使用される異なるタンパク質:HIVの場合はNEFタンパク質、HTLVの場合はTAXタンパク質及びHBZタンパク質をコードする。
麻疹-HIVワクチンは、Gag、Env、及びNef抗原に対する強力なCD8 T細胞応答を誘導する(図14を参照)。これは、次いで非ヒト霊長類に見出される負荷後ウイルス量の低減と相関する(図15)。HTLVワクチン接種に適用されるMeV-HIV初回刺激/追加免疫異種ワクチン接種戦略は、非ヒト霊長類において高レベルの細胞性免疫応答及び体液性免疫応答に結び付くはずである。MeV-HTLVワクチン接種は、ワクチン抗原Gag、Env、Tax、及びHBZの投与に基づく。しかしながら、HTLV-1塩基性ロイシンジッパー(bZIP)因子(HBZ)又はTAX抗原を発現する組換えワクシニアウイルス(rVV)によるワクチン接種は、ヒトHTLVリンパ腫細胞を接種したマウスを防御し、非ヒト霊長類ではHBZ抗原及びTAX抗原の両方に対する強力な細胞性応答を誘導した(Sugataら、2015年)。加えて、幾つかの臨床研究では、HTLV感染患者におけるHTLV TAX CD8 Tエピトープを有する樹状細胞の自己移入により強力なT-CD8細胞性応答を誘導することによる療法上の利点が報告されている(Suehiroら、2015年;El Hajjら、2020年)。
MeVのcDNA内に、HTLV由来のGAG抗原をコードする第1のポリヌクレオチド(図22B)及びHTLV由来のENV抗原をコードする第2のポリヌクレオチド(図22A)を含む本発明の核酸構築物に感染した細胞は、ENVの性質(つまり、抗原の野生型バージョン又はその突然変異バージョンのいずれか)に関わらず、検出可能な量のGAG及びENV抗原を産生する。また、VLPは、核酸構築物に感染した細胞により産生され、これらの構築物に基づくワクチンは、宿主内で免疫応答を誘導する可能性が高いことを示している。図23に示されているように、ENV(そのISドメイン内で突然変異しているか又はしていない)及びGAGをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、本発明によるMeV-HTLVをワクチン接種したマウスの免疫系は、コードされている抗原の発現及び分泌に応答し、実際、ワクチン接種マウスの免疫系の細胞は、HTLVペプチドによる刺激に対してより応答性である(陰性対照と比較して対照マウスよりも多くのIFNγを分泌する)。更に、そのISドメイン内で突然変異したENV及びGAGをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、本発明によるMeV-HTLVウイルスをワクチン接種したマウスは、対照マウス、並びに野生型ENV及びGAGをコードするMeV-HTLVウイルスをワクチン接種したマウスと比較して、向上された免疫応答を誘発することを観察することができる。
結論
この研究は、麻疹由来複製性ワクチンベクターが、宿主細胞においてHTLV抗原の産生を誘発することができることを初めて実証した。ENV ISドメインの突然変異は、ワクチン免疫原性を増加させる。これは、ENV ISドメインの突然変異がワクチン戦略に含まれるべきであることを示している。麻疹ワクチンプラットフォームは、臨床実現可能性が既に実証されている。このヒトワクチンの複製能力は、防御の提供に大きな役割を果たした可能性が高い。これは、製造及び配布が容易な安価な生ワクチンである。ワクチンによるHTLVの予防は理想的な目標であり、ヒトにおけるそのようなMV-HTLVワクチン候補の可能性を確認するために、本発明の臨床研究が進行中である。
本発明は、以下の実施形態により規定することができる。
1.麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(i)サル免疫不全ウイルス(SIV)又はヒト免疫不全ウイルス(HIV)の少なくとも1つのGAG抗原、その断片、又はその突然変異バージョンをコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、第1の異種ポリヌクレオチド;
(ii)免疫抑制ドメイン(ISD)を含む少なくとも1つのENV抗原又はその断片、特にENV抗原の膜貫通サブユニットを含む少なくとも1つの断片をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、ENV抗原又はその断片は、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異しており、サル免疫不全ウイルス(SIV)又はヒト免疫不全ウイルス(HIV)のものであり、第2の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に挿入されたATU3に作動可能にクローニングされた、第2の異種ポリヌクレオチド
を含む核酸構築物であって、
ENVのISDドメイン内の突然変異は、ENV抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG及びENV抗原又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHIV-1に由来する、核酸構築物。
2.GAG及びENV抗原はHIV及び/又はSIVに起源を有し、
(iii)免疫抑制ドメイン(ISD)を含む少なくとも1つのNEF抗原又はその断片をコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、NEF抗原は、そのISDドメイン内で突然変異しており、SIV又はHIVのものであり、第3の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)又は(ii)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのN遺伝子の上流に位置するATU内に、特にMeVのN遺伝子の上流に挿入されたATU1に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド
を含み、
NEFのISD内の突然変異は、NEF抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG、ENV、及びNEF抗原、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHIV-1に由来する、実施形態1に記載の核酸構築物。
3.(a)GAG及びENV抗原はHIV及び/又はSIVに起源を有する、実施形態1に記載の第1の核酸構築物;及び
(b)
(i')麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードする第2のcDNA分子;
(ii')SIV又はHIVの、そのISD内で突然変異した少なくとも1つのNEF抗原又はその断片をコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、(i')のアンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのN遺伝子の上流に位置するATU内に、特にMeVのN遺伝子の上流に挿入されたATU1に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド
を含む第2の核酸構築物
を含む核酸構築物の組合せであって、
NEFのISD内の突然変異は、NEF抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG、ENV、及びNEF抗原、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHIV-1に由来する、核酸構築物の組合せ。
4.第1の異種ポリヌクレオチドは、SIV-GAG、SIV-GAGpro、HIV-GAG、又はHIV-GAGpro、特にHIV-1-GAG又はHIV-1-GAGpro、特に配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、又は配列番号6に示されているアミノ酸配列を含むか又はからなる抗原からなる群から選択される抗原の少なくとも断片をコードする、実施形態1から3のいずれか1つに記載の核酸構築物。
5.第2の異種ポリヌクレオチドは、SIV-ENV若しくはHIV-ENV、特にHIV-1-ENV、特に配列番号8、配列番号10、配列番号11、若しくは配列番号13に示されているアミノ酸配列を含むか若しくはからなる抗原からなる群から選択される少なくとも1つの抗原若しくはその断片をコードするか、又は第2の異種ポリヌクレオチドは、少なくともENV抗原又はその断片をコードし、前記抗原又は断片は、突然変異免疫抑制ドメイン(ISD)を含み、突然変異は、野生型ENV ISDと比較した、特に配列番号7、配列番号9、又は配列番号12のENVポリペプチドのISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応する、実施形態1から4のいずれか1つに記載の核酸構築物。
6.第3の異種ポリヌクレオチドは、SIV-NEF若しくはHIV-NEF、特にHIV-1-NEFのアミノ酸配列を含むか若しくはからなる少なくともNEF抗原若しくはその断片、特に配列番号15、配列番号17、若しくは配列番号19に示されているアミノ酸配列を含むか若しくはからなる抗原をコードするか、又は第3の異種ポリヌクレオチドは、少なくともNEF抗原若しくはその断片をコードし、前記抗原又は断片は、突然変異免疫抑制ドメイン(ISD)を含み、突然変異は、野生型NEF ISDと比較した、特に配列番号14、配列番号16、又は配列番号18のNEFポリペプチドのISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応する、実施形態2に記載の核酸構築物。
7.第1の異種ポリヌクレオチドは、HIV-GAG又はHIV-GAGpro、特にHIV-1-GAG又はHIV-1-GAGpro、特に配列番号2のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるHIV-1-GAG、又は配列番号5のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるHIV-1-GAGproの少なくとも断片をコードし、
第2の異種ポリヌクレオチドは、HIVコンセンサスB ENVのアミノ酸配列、又はSF162 ENVのアミノ酸配列、特に配列番号20若しくは配列番号21からなる群に示されているアミノ酸配列を含むか若しくはからなるENV若しくはENV断片をコードするか、又は第2の異種ポリヌクレオチドは、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異したENV抗原の少なくとも断片をコードし、突然変異は、野生型ENV ISDと比較した、特に配列番号7、配列番号9、又は配列番号12のENVポリペプチドの、特に配列番号8、配列番号10、配列番号11、又は配列番号13のアミノ酸配列を含むか又はからなるENV抗原の少なくとも断片のISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応し、
第3の異種ポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号17、若しくは配列番号19のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるNEF抗原の少なくとも断片をコードするか、又は第3の異種ポリヌクレオチドは、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異したNEF抗原の少なくとも断片をコードし、突然変異は、野生型NEF ISDと比較した、特に配列番号14、配列番号16、又は配列番号18のNEFポリペプチドのISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応する、実施形態2から6のいずれか1つに記載の核酸構築物。
8.麻疹ウイルスは、Schwarz株、Zagreb株、AIK-C株、Moraten株、Philips株、Beckenham 4A株、Beckenham 16株、Edmonston seed A株、Edmonston seed B株、CAM-70株、TD 97株、Leningrad-16株、Shanghai 191株、及びBelgrade株からなる群から選択される弱毒化ウイルス株、特にSchwarz株である、実施形態1から7のいずれか1つに記載の核酸構築物。
9.第1の核酸構築物は、
- 配列番号32(構築物MeV-SIVgag-HIVenv Cons B WT);
- 配列番号40(構築物MeV-SIVgag-HIVenv Cons B MT);
- 配列番号33(構築物MeV-SIVgag-HIVenv SF162 WT);
- 配列番号41(構築物MeV-SIVgag-HIVenv SF162 MT);
- 配列番号43(構築物MeV-SIVgag-HIVenv gp41 WT);及び
- 配列番号44(構築物MeV-SIVgag-HIVenv gp41 MT)
からなる群から選択される組換えcDNA配列を有する、実施形態1から8のいずれか1つに記載の核酸構築物。
10.実施形態1から9のいずれか1つに記載の1つの核酸構築物をそのゲノムに含む感染性組換え麻疹ウイルスであって、特に、感染性複製性麻疹ウイルスは、突然変異ENV抗原、GAG抗原、若しくはGAGpro抗原、及び任意選択で突然変異NEF抗原からなる群から選択される少なくとも1つの抗原又はその免疫原性断片を発現する、感染性組換え麻疹ウイルス。
11.特に初回刺激-追加免疫免疫化後に、より詳細には同種初回刺激-追加免疫免疫化後に、GAG、ENV、及び/若しくは存在する場合はNEF抗原の免疫原性抗原、又はその免疫原性断片に対する、細胞性及び/又は体液性並びに細胞性応答、特にT細胞応答、特にIFNγ及び/又はIL-2応答を誘発する、実施形態10に記載の感染性複製性組換え麻疹ウイルス。
12.実施形態1から9のいずれか1つに記載の核酸構築物の組合せでトランスフェクトされたか、又は実施形態10若しくは11に記載の組換え麻疹ウイルスに感染した宿主細胞、特に哺乳動物細胞、VERO NK細胞、CEF細胞、又はヒト胎児腎臓細胞株293T。
13.SIV及び/又はHIVのGAG及びENV抗原及び任意選択でNEF抗原又はその免疫原性断片を含む組換えウイルス様粒子(VLP)であって、抗原又はその免疫原性断片は、実施形態1から9に記載の核酸構築物、又は実施形態10若しくは11に記載の組換え麻疹ウイルスの第1、第2、及び任意選択で第3の異種ポリヌクレオチドによりコードされているか、又は実施形態12に記載の宿主細胞内で産生される、組換えVLP。
14.実施形態10若しくは11に記載の感染性複製性組換え麻疹ウイルス、実施形態13に記載の組換えVLP、又は実施形態10若しくは11に記載の組換え麻疹ウイルス及び実施形態13に記載の組換えVLP、並びに薬学的に許容されるビヒクルを含む免疫原性組成物、特にウイルスワクチン組成物。
15.HIV及び/若しくはSIVポリペプチド又はその抗原性断片若しくはその突然変異バージョンに対する抗体の誘発による、HIV又はSIVに対する防御的及び優先的には予防的免疫応答の誘発、並びに/或いはそれを必要とする宿主、特にヒト宿主、特に小児における、HIV及び/又はSIVに対する細胞性又は体液性及び細胞性応答の誘発に使用するための、実施形態14に記載の組成物。
16.麻疹ウイルスタンパク質に対する抗体の誘発による麻疹ウイルスに対する防御的及び優先的には予防的免疫応答の誘発、並びに/又はそれを必要とする宿主、特にヒト宿主、特に小児における麻疹ウイルスに対する細胞性及び/若しくは体液性並びに細胞性応答の誘発に使用するための、実施形態14又は15に記載の組成物。
17.HIV関連疾患又はSIV関連疾患を予防又は治療するための方法であって、実施形態13に記載の組換えウイルス様粒子及び/又は実施形態10若しくは11に記載の麻疹ウイルスを、注射、特に粘膜又は筋肉内又は皮下注射、より詳細には粘膜注射、最も詳細には鼻腔注射により、哺乳動物、特にヒト、特に小児を免疫する工程を含む方法。
本発明は、以下の実施形態に従って定義することができる。
1.麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
(i)ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の少なくとも1つのGAG抗原、その断片、又はその突然変異バージョンをコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、第1の異種ポリヌクレオチド;
(ii)免疫抑制ドメイン(ISD)を含む少なくとも1つのENV抗原又はその断片、特にENV抗原の膜貫通サブユニットを含む少なくとも1つの断片をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、ENV抗原又はその断片は、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異しており、ヒトリンパ球向性ウイルス(HTLV)のものであり、第2の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に挿入されたATU3に作動可能にクローニングされた、第2の異種ポリヌクレオチド
を含む核酸構築物であって、
ENVのISDドメイン内の突然変異は、ENV抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG及びENV抗原、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHTLV-1又はHTLV-2又はHTLV-3に由来する、核酸構築物。
2.(iii)HTLVの少なくとも1つのHBZ抗原又はその断片又はその突然変異バージョンをコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)又は(ii)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのN遺伝子の上流に位置するATU内に、特にMeVのN遺伝子の上流に挿入されたATU1に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド
を含み、
GAG、ENV、及びHBZ抗原、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHTLV-1又はHTLV-2又はHTLV-3に由来する、実施形態1に記載の核酸構築物。
3.第1の異種ポリヌクレオチドは、HTLV-GAG又はHTLV-GAGpro、特にHTLV-1-GAG又はHTLV-1-GAGpro、特に配列番号1又は配列番号2に示されているアミノ酸配列を含むか又はからなる抗原からなる群から選択される抗原の少なくとも断片をコードする、実施形態1又は2に記載の核酸構築物。
4.第2の異種ポリヌクレオチドは、HTLV ENV、特にHTLV-1-ENV若しくはHTLV-2-ENV、特に配列番号4若しくは配列番号11に示されているアミノ酸配列を含むか若しくはからなる抗原の少なくとも1つの抗原若しくはその断片をコードするか、又は第2の異種ポリヌクレオチドは、少なくともENV抗原又はその断片をコードし、前記抗原又は断片は、突然変異免疫抑制ドメイン(ISD)を含み、突然変異は、野生型HTLV ENV ISDと比較した、特に配列番号3又は配列番号10のHTLV ENVポリペプチドのISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応する、実施形態1から3のいずれか1つに記載の核酸構築物。
5.第1の異種抗原は、HTLV-GAG、特に配列番号1のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるHTLV-1-GAG、又は配列番号2のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるHTLV-1-GAGproの少なくとも断片をコードし、
第2の異種ポリヌクレオチドは、HTLV ENVのアミノ酸配列、特に配列番号4若しくは配列番号11に示されているアミノ酸配列を含むか若しくはからなるENV又はENV断片をコードするか、又は第2の異種ポリヌクレオチドは、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異したENV抗原の少なくとも断片をコードし、突然変異は、野生型ENV ISDと比較した、特に配列番号3又は配列番号10のENVポリペプチドの、特に配列番号4又は配列番号11のアミノ酸配列を含むか又はからなるENV抗原の少なくとも断片のISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応し、
第3の異種ポリヌクレオチドは、配列番号5若しくは配列番号9のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるHTLVのHBZ抗原の少なくとも断片をコードするか、又は第3の異種ポリヌクレオチドは、HBZ抗原の少なくとも断片をコードし、HBZは、その発がん特性を低減させるように突然変異されており、特に突然変異は、配列番号19の野生型HBZと比較した、HBZ内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応し、特にHBZ抗原は、配列番号9のアミノ酸残基のTAX抗原の少なくとも断片に会合している、実施形態2から4のいずれか1つに記載の核酸構築物。
6.麻疹ウイルスは、Schwarz株、Zagreb株、AIK-C株、Moraten株、Philips株、Beckenham 4A株、Beckenham 16株、Edmonston seed A株、Edmonston seed B株、CAM-70株、TD 97株、Leningrad-16株、Shanghai 191株、及びBelgrade株からなる群から選択される弱毒化ウイルス株、特にSchwarz株である、実施形態1から5のいずれか1つに記載の核酸構築物。
7.第1の核酸構築物は、配列番号12(構築物MeV-HTLVgag-HTLVenv)の組換えcDNA配列を有する、実施形態1から6のいずれか1つに記載の核酸構築物。
8.実施形態1から7のいずれか1つに記載の1つの核酸構築物をそのゲノムに含む感染性組換え麻疹ウイルスであって、特に、感染性複製性麻疹ウイルスは、突然変異ENV抗原、GAG抗原、若しくはGAGpro抗原、及び任意選択で突然変異HBZ抗原からなる群から選択される少なくとも1つの抗原又はその免疫原性断片を発現する、感染性組換え麻疹ウイルス。
9.特に初回刺激-追加免疫免疫化後に、より詳細には同種初回刺激-追加免疫免疫化後に、GAG、ENV、及び/若しくは存在する場合はHBZ抗原の免疫原性抗原、又はその免疫原性断片に対する、細胞性及び/又は体液性並びに細胞性応答、特にT細胞応答、特にIFNγ及び/又はIL-2応答を誘発する、実施形態8に記載の感染性複製性組換え麻疹ウイルス。
10.実施形態1から7のいずれか1つに記載の核酸構築物の組合せでトランスフェクトされたか、又は実施形態8若しくは9に記載の組換え麻疹ウイルスに感染した宿主細胞、特に哺乳動物細胞、VERO NK細胞、CEF細胞、又はヒト胎児腎臓細胞株293T。
11.HTLVのGAG及びENV抗原並びに任意選択でHBZ抗原又はその免疫原性断片を含む組換えウイルス様粒子(VLP)であって、抗原又はその免疫原性断片は、実施形態1から7に記載の核酸構築物、又は実施形態8若しくは9に記載の組換え麻疹ウイルスの第1、第2、及び任意選択で第3の異種ポリヌクレオチドによりコードされているか、又は実施形態10に記載の宿主細胞内で産生される、組換えVLP。
12.実施形態8若しくは9に記載の感染性複製性組換え麻疹ウイルス、実施形態11に記載の組換えVLP、又は実施形態8若しくは9に記載の組換え麻疹ウイルス及び実施形態11に記載の組換えVLP、並びに薬学的に許容されるビヒクルを含む免疫原性組成物、特にウイルスワクチン組成物。
13.HTLVポリペプチド又はその抗原性断片若しくはその突然変異バージョンに対する抗体の誘発による、HTLVに対する防御的及び優先的には予防的免疫応答の誘発、並びに/或いはそれを必要とする宿主、特にヒト宿主、特に小児における、HTLVに対する細胞性又は体液性及び細胞性応答の誘発に使用するための、実施形態12に記載の組成物。
14.麻疹ウイルスタンパク質に対する抗体の誘発による麻疹ウイルスに対する防御的及び優先的には予防的免疫応答の誘発、並びに/又はそれを必要とする宿主、特にヒト宿主、特に小児における麻疹ウイルスに対する細胞性及び/若しくは体液性並びに細胞性応答の誘発に使用するための、実施形態12又は13に記載の組成物。
15.HTLV関連疾患を予防又は治療するための方法であって、実施形態11に記載の組換えウイルス様粒子及び/又は実施形態8若しくは9に記載の麻疹ウイルスを、注射、特に粘膜又は筋肉内又は皮下注射、より詳細には粘膜注射、最も詳細には鼻腔注射により、哺乳動物、特にヒト、特に小児を免疫する工程を含む方法。
［参考文献］
Figure 2024502658000005
Figure 2024502658000006
Figure 2024502658000007
Figure 2024502658000008
Figure 2024502658000009

Claims (19)

  1. 麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子;及び
    (i)サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、又はヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)の少なくとも1つのGAG抗原、その断片、又はその突然変異バージョンをコードする第1の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入されたATU2に作動可能にクローニングされた、第1の異種ポリヌクレオチド;
    (ii)免疫抑制ドメイン(ISD)を含む少なくとも1つのENV抗原又はその断片、特にENV抗原の膜貫通サブユニットを含む少なくとも1つの断片をコードする第2の異種ポリヌクレオチドであって、ENV抗原又はその断片は、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異しており、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、又はヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)のものであり、第2の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に位置するATU内に、特にMeVのH遺伝子とL遺伝子との間に挿入されたATU3に作動可能にクローニングされた、第2の異種ポリヌクレオチド
    を含む核酸構築物であって、
    ENVのISDドメイン内の突然変異は、ENV抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG及びENV抗原、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHIV-1又はHTLV-1に由来する、核酸構築物。
  2. GAG及びENV抗原は、HIV及び/又はSIVに起源を有し、
    (iii)免疫抑制ドメイン(ISD)を含む少なくとも1つのNEF抗原又はその断片をコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、NEF抗原はそのISDドメイン内で突然変異しており、SIV又はHIVのものであり、第3の異種ポリヌクレオチドは、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)又は(ii)と同じ又は異なる転写ユニット(ATU)、特にMeVのN遺伝子の上流に位置するATU内に、特にMeVのN遺伝子の上流に挿入されたATU1に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド
    を含み、
    NEFのISD内の突然変異は、NEF抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG、ENV、及びNEF抗原、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHIV-1に由来する、請求項1に記載の核酸構築物。
  3. GAG及びENV抗原は、HTLVに起源を有し、
    (iii)HTLVの少なくとも1つのHBZ抗原又はその断片又はその突然変異バージョンをコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、アンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された(i)又は(ii)と同じ又は異なる追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのN遺伝子の上流に位置するATU内に、特にMeVのN遺伝子の上流に挿入されたATU1に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド
    を含み、
    GAG、ENV、及びHBZ抗原、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHTLV-1に由来する、請求項1に記載の核酸構築物。
  4. (a)GAG及びENV抗原はHIV及び/又はSIVに起源を有する、請求項1に記載の第1の核酸構築物;及び
    (b)
    (i')麻疹ウイルス(MeV)の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードする第2のcDNA分子;
    (ii')SIV又はHIVの、そのISD内で突然変異した少なくとも1つのNEF抗原又はその断片をコードする第3の異種ポリヌクレオチドであって、(i')のアンチゲノム(+)RNAのcDNA内に挿入された追加転写ユニット(ATU)、特にMeVのN遺伝子の上流に位置するATU内に、特にMeVのN遺伝子の上流に挿入されたATU1に作動可能にクローニングされた、第3の異種ポリヌクレオチド
    を含む第2の核酸構築物
    を含む核酸構築物の組合せであって、
    NEFのISD内の突然変異は、NEF抗原の免疫抑制指数を低減させ、GAG、ENV、及びNEF抗原、又はそれらのそれぞれの免疫原性断片若しくはその突然変異バージョンは全て、同じウイルス型に由来し、特に同じウイルス株に、より詳細にはHIV-1に由来する、核酸構築物の組合せ。
  5. 第1の異種ポリヌクレオチドは、SIV-GAG、SIV-GAGpro、HIV-GAG、HIV-GAGpro、HTLV-GAG、又はHTLV-GAGpro、特にHIV-1-GAG又はHIV-1-GAGpro、特に配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号45、又は配列番号46に示されているアミノ酸配列を含むか又はからなる抗原からなる群から選択される抗原の少なくとも断片をコードする、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  6. 第2の異種ポリヌクレオチドは、SIV-ENV、HIV-ENV、若しくはHTLV-ENV、特にHIV-1-ENV若しくはHTLV-1-ENV、特に配列番号8、配列番号10、配列番号11、配列番号13、若しくは配列番号48に示されているアミノ酸配列を含むか若しくはからなる抗原からなる群から選択される少なくとも1つの抗原若しくはその断片をコードするか、又は第2の異種ポリヌクレオチドは、少なくともENV抗原若しくはその断片をコードし、前記抗原又は断片は、突然変異免疫抑制ドメイン(ISD)を含み、突然変異は、野生型ENV ISDと比較した、特に配列番号7、配列番号9、配列番号12、又は配列番号47のENVポリペプチドのISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応する、請求項1から5のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  7. 第3の異種ポリヌクレオチドは、SIV-NEF若しくはHIV-NEF、特にHIV-1-NEF、特に配列番号15、配列番号17、若しくは配列番号19に示されているアミノ酸配列を含むか若しくはからなる抗原のアミノ酸配列を含むか若しくはからなる少なくともNEF抗原又はその断片をコードするか、又は第3の異種ポリヌクレオチドは、少なくともNEF抗原若しくはその断片をコードし、前記抗原又は断片は、突然変異免疫抑制ドメイン(ISD)を含み、突然変異は、野生型NEF ISDと比較した、特に配列番号14、配列番号16、若しくは配列番号18のNEFポリペプチドのISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応する、請求項2に記載の核酸構築物。
  8. 第1の異種抗原は、HIV-GAG又はHIV-GAGpro、特にHIV-1-GAG又はHIV-1-GAGpro、特に配列番号2のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるHIV-1-GAG、又は配列番号5のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるHIV-1-GAGproの少なくとも断片をコードし、
    第2の異種ポリヌクレオチドは、HIVコンセンサスB ENVのアミノ酸配列、又はSF162 ENVのアミノ酸配列、特に配列番号20若しくは配列番号21からなる群に示されているアミノ酸配列を含むか又はからなるENV又はENV断片をコードするか、或いは第2の異種ポリヌクレオチドは、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異したENV抗原の少なくとも断片をコードし、突然変異は、野生型ENV ISDと比較した、特に配列番号7、配列番号9、又は配列番号12のENVポリペプチドの、特に配列番号8、配列番号10、配列番号11、又は配列番号13のアミノ酸配列を含むか又はからなるENV抗原の少なくとも断片のISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応し、
    第3の異種ポリヌクレオチドは、配列番号15、配列番号17、若しくは配列番号19のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるNEF抗原の少なくとも断片をコードするか、又は第3の異種ポリヌクレオチドは、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異したNEF抗原の少なくとも断片をコードし、突然変異は、野生型NEF ISDと比較した、特に配列番号14、配列番号16、又は配列番号18のNEFポリペプチドのISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応する、請求項2又は4から7のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  9. 第1の異種抗原は、HTLV-GAG、特に配列番号45のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるHTLV-1-GAG、又は配列番号46のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるHTLV-1-GAGproの少なくとも断片をコードし、
    第2の異種ポリヌクレオチドは、HTLV ENVのアミノ酸配列、特に配列番号48に示されているアミノ酸配列を含むか若しくはからなるENV又はENV断片をコードするか、又は第2の異種ポリヌクレオチドは、その免疫抑制ドメイン(ISD)内で突然変異したENV抗原の少なくとも断片をコードし、突然変異は、野生型ENV ISDと比較した、特に配列番号47のENVポリペプチドの、特に配列番号48のアミノ酸配列を含むか又はからなるENV抗原の少なくとも断片のISDと比較した、そのISD内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応し、
    第3の異種ポリヌクレオチドは、配列番号49のアミノ酸配列を含むか若しくはからなるHTLVのHBZ抗原の少なくとも断片をコードするか、又は第3の異種ポリヌクレオチドは、HBZ抗原の少なくとも断片をコードし、HBZは、その発がん特性を低減させるように突然変異されており、特に突然変異は、配列番号55の野生型HBZと比較した、HBZ内の少なくとも1つのアミノ酸残基の置換又は欠失に対応し、特にHBZ抗原は、配列番号50のアミノ酸残基のTAX抗原の少なくとも断片に会合している、請求項1又は3から6のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  10. 麻疹ウイルスは、Schwarz株、Zagreb株、AIK-C株、Moraten株、Philips株、Beckenham 4A株、Beckenham 16株、Edmonston seed A株、Edmonston seed B株、CAM-70株、TD 97株、Leningrad-16株、Shanghai 191株、及びBelgrade株からなる群から選択される弱毒化ウイルス株、特にSchwarz株である、請求項1から9のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  11. - 第1の核酸構築物は、
    - 配列番号32(構築物MeV-SIVgag-HIVenv Cons B WT);
    - 配列番号40(構築物MeV-SIVgag-HIVenv Cons B MT);
    - 配列番号33(構築物MeV-SIVgag-HIVenv SF162 WT);
    - 配列番号41(構築物MeV-SIVgag-HIVenv SF162 MT);
    - 配列番号43(構築物MeV-SIVgag-HIVenv gp41 WT);
    - 配列番号44(構築物MeV-SIVgag-HIVenv gp41 MT);及び
    - 配列番号54(構築物MeV-HTLVgag-HTLVenv)
    からなる群から選択される組換えcDNA配列を有する、請求項1から10のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  12. 請求項1から11のいずれか一項に記載の1つの核酸構築物をそのゲノムに含む感染性組換え麻疹ウイルスであって、特に、感染性複製性麻疹ウイルスは、突然変異ENV、GAG、若しくはGAGpro、及び任意選択で突然変異NEF抗原からなる群から選択される少なくとも1つの抗原又はその免疫原性断片を発現する、感染性組換え麻疹ウイルス。
  13. 特に初回刺激-追加免疫免疫化後に、より詳細には同種初回刺激-追加免疫免疫化後に、GAG、ENV、及び/若しくは存在する場合はNEF抗原の免疫原性抗原、又はその免疫原性断片に対する、細胞性及び/又は体液性並びに細胞性応答、特にT細胞応答、特にIFNγ及び/又はIL-2応答を誘発する、請求項12に記載の感染性複製性組換え麻疹ウイルス。
  14. 請求項1から11のいずれか一項に記載の核酸構築物の組合せでトランスフェクトされたか、又は請求項12若しくは13に記載の組換え麻疹ウイルスに感染した宿主細胞、特に哺乳動物細胞、VERO NK細胞、CEF細胞、又はヒト胎児腎臓細胞株293T。
  15. SIV及び/又はHIV又はHTLVのGAG及びENV抗原並びに任意選択でNEF抗原又はHBZ抗原、又はその免疫原性断片を含む組換えウイルス様粒子(VLP)であって、抗原又はその免疫原性断片は、請求項1から11に記載の核酸構築物、又は請求項12若しくは13に記載の組換え麻疹ウイルスの第1、第2、及び任意選択で第3の異種ポリヌクレオチドによりコードされているか、又は請求項14に記載の宿主細胞内で産生される、組換えVLP。
  16. 請求項12若しくは13に記載の感染性複製性組換え麻疹ウイルス、請求項15に記載の組換えVLP、又は請求項12若しくは13に記載の組換え麻疹ウイルス及び請求項15に記載の組換えVLP、並びに薬学的に許容されるビヒクルを含む免疫原性組成物、特にウイルスワクチン組成物。
  17. HIV及び/若しくはSIV若しくはHTLVポリペプチド又はその抗原性断片若しくはその突然変異バージョンに対する抗体の誘発による、HIV及び/又はSIV又はHTLVに対する防御的及び優先的には予防的免疫応答の誘発、並びに/或いはそれを必要とする宿主、特にヒト宿主、特に小児における、HIV及び/又はSIV又はHTLVに対する細胞性又は体液性及び細胞性応答の誘発に使用するための、請求項16に記載の組成物。
  18. 麻疹ウイルスタンパク質に対する抗体の誘発による麻疹ウイルスに対する防御的及び優先的には予防的免疫応答の誘発、並びに/又はそれを必要とする宿主、特にヒト宿主、特に小児における麻疹ウイルスに対する細胞性及び/若しくは体液性並びに細胞性応答の誘発に使用するための、請求項16又は17に記載の組成物。
  19. HIV又はSIV又はHTLV関連疾患を予防又は治療するための方法であって、請求項15に記載の組換えウイルス様粒子及び/又は請求項12若しくは13に記載の麻疹ウイルスを、注射、特に粘膜又は筋肉内又は皮下注射、より詳細には粘膜注射、最も詳細には鼻腔注射により、哺乳動物、特にヒト、特に小児を免疫化する工程を含む方法。
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