JP4989224B2 - Ｄｎａワクチン組成物およびその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、一般に、ＨＩＶ−１により誘導される疾患および感染を防御するための予防ワクチン分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対するＤＮＡワクチンに関する。

２０００年の終りまでに、全世界で３６１０万人がＨＩＶに感染していると推定されている。同年のみで、全世界で約３００万人がＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連疾患で死亡している。この死亡数うちの推定５００，０００人が１５歳未満の児童であった。世界的公衆衛生におけるＨＩＶワクチンの重要性は、どんなに誇張してもし過ぎることはない。

ヒトにおけるＨＩＶ−１感染またはＨＩＶ−１誘導疾患を阻害または予防する有効なワクチンは、一定のリスクの高い集団の治療およびＨＩＶ−１感染またはＨＩＶ−１誘導疾患の危険性があり得る一般集団のための一般的な予防ワクチン接種として有用であると認識されている。ＨＩＶ−１感染に対する長期防御を付与するワクチンが最も有用であろう。不運なことに、ＨＩＶ−１感染およびＨＩＶ−１疾患の防止のために有用なワクチンの開発方法においては多数の問題が存在する。ある問題は、ＨＩＶ−１ウイルスの固有の性質およびその機能的性質の結果である可能性が最も高く、今までのところ有効なワクチンは開発されていない（概説については、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ＨＩＶ−１，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９５，ｐｐｓ．１３５−１４２，１９９５；Ｃｅａｓｅ ａｎｄ Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｔｏｗａｒｄ ａ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ＡＩＤＳ：Ｔｈｅ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ−Ｂａｓｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２：９２３−９８９；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｔｏｗａｒｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ＨＩＶ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９２，ｐｐｓ．４０−４１，１９９２）を参照のこと）。

ＨＩＶはレトロウイルスであり、それは、そのゲノムがＤＮＡよりもむしろＲＮＡからなることを意味する。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２と呼ばれる２つの主なウイルス株が存在し、ＨＩＶ−１は主にヒト感染を担う株である。ＨＩＶのＲＮＡゲノムは、タンパク質の殻で覆われている。ＲＮＡゲノムとタンパク質の殻との組合わせはヌクレオキャプシドとして公知であり、タンパク質および脂質の両方のエンベロープで覆われている。

ＨＩＶによる宿主細胞への感染は、ウイルスエンベロープ中に存在する高度にグリコシル化されたタンパク質であるＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質が、宿主細胞のＣＤ４受容体分子に結合した時に開始される。この相互作用により、ウイルスと細胞膜とが融合し、その後にウイルスが細胞に侵入する一連の事象が開始される。

宿主細胞への侵入後、ＨＩＶ ＲＮＡは、ウイルス逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに転写される。一旦宿主ゲノムに組み込まれると、宿主のＲＮＡポリメラーゼＩＩ酵素による転写を介して、ＨＩＶは自身を発現する。転写の調節および転写後の転写物のプロセシングの両方を介して、ＨＩＶは、ＨＩＶ自体が発現する範囲を超える高い調節レベルを発揮することができる。

ＨＩＶウイルスの研究により、ＨＩＶの病原性に関して重要な多数の遺伝子およびゲノム領域に関する情報を含む、ウイルスの分子生物学についての多くの情報が明らかとなった。これらの遺伝子および領域のうち、ＨＩｖのｒｔ、ｉｎｔ、ｖｉｆ、および３’ＬＴＲが重要である。

ＨＩＶのｒｔ遺伝子は、ウイルス逆転写酵素をコードする。この酵素は、ＨＩＶのＲＮＡゲノムを利用し、宿主ゲノムに組み込み可能な、対応する線状二本鎖ＤＮＡ分子を産生する。

ＨＩＶのｉｎｔ遺伝子は、インテグラーゼをコードする。これは、宿主ゲノムへの逆転鎖酵素によって産生された線状二本鎖ウイルスＤＮＡの挿入を実際に触媒する酵素である。宿主ゲノムへのウイルスＤＮＡの組み込みを完了するために、宿主細胞ＤＮＡ修復機構は、宿主ＤＮＡとウイルスＤＮＡとのライゲーションを行う。

ＨＩＶのｖｉｆ遺伝子は、「ウイルス感染因子」として公知のタンパク質をコードする。このタンパク質は、感染性ビリオンの産生に必要である。タンパク質は、ＨＩＶ−１を阻む細胞インヒビターを切り抜ける可能性が高く、ウイルスコアおよび組み込み前複合体（ｐｒｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）の安定性を増強することもできる。

ＨＩＶ−１のＬＴＲ（長末端反復）領域は、ＨＩＶ遺伝子の発現を駆動するのに必要なプロモーター領域を含む。ＨＩＶ−１の５’ＬＴＲは、主にＨＩＶ−１遺伝子発現の駆動を担うプロモーターを含み、５’ＬＴＲ配列が破壊されたとしても、３’ＬＴＲがこの機能を引き受ける。３’ＬＴＲは、宿主ゲノムへのウイルスＤＮＡの組み込みに必要である。

他の重要なＨＩＶ−１遺伝子には、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、及びｖｐｕがある。

ｇａｇ遺伝子は、特に、ＨＩＶのｐ２７キャプシドタンパク質をコードする。このタンパク質は、ウイルスヌクレオキャプシドの集合組立に重要である。ｐ２７タンパク質が、ウイルスの感染力に必要なＨＩＶ細胞タンパク質ＣｙＡと相互作用するということも公知である。ｐ２７とＣｙＡとの相互作用を破壊すると、ウイルス複製が阻害されることが示されている。

ｐｏｌ遺伝子は、ＨＩＶ−１のｒｔ配列及びｉｎｔ配列を含むので、特に、逆転写酵素およびインテグラーゼをコードする。

ｎｅｆ遺伝子産物（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｆａｃｔｏｒ又はＮｅｆとして知られている）は、多数の潜在的に重要な性質を有する。Ｎｅｆは、ＣＤ４およびＭＨＣクラスＩタンパク質を下流制御する能力を有し、これらは共に、身体のウイルス感染細胞認識能力にとって重要である。Ｎｅｆについてはまた、細胞タンパク質キナーゼを活性化し、細胞のシグナル伝達プロセスを妨害することも示されている。サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の病原性クローン由来のｎｅｆの欠失により、成体マカクザルにウイルス非病原性が付与されることは、おそらく最も重要であろう。従って、機能的ｎｅｆ遺伝子は、ＳＩＶがｉｎ ｖｉｖｏで疾患を引き起こす能力に不可欠である。さらに、ｎｅｆ遺伝子が大きく欠失しているＨＩＶ陽性個体は、１０年を超えて健康を維持しており、細胞ＣＤ４数も減少しないことが、研究により示されている。

ｖｐｕ遺伝子は、最初は機能が未知であったが（未知のウイルスタンパク質Ｖｉｒａｌ Ｐｔｏｔｅｉｎ Ｕｎｋｎｏｗｎ又はＶｐｕとして公知となった）、ＣＤ４およびＭＨＣクラスＩ発現を下流制御しウイルスの出芽を促進することが現在公知となったタンパク質をコードする。Ｖｐｕはまた、イオンチャネルとして作用する別のウイルスタンパク質に類似する。ｖｐｕ遺伝子は、ＨＩＶ−１中には存在するが、ＨＩＶ−２中には存在しない。

ほぼ全てのウイルス感染において、感染集団における一定の部分集団は、回復し、同一病原体による更なるウイルス感染に対し免疫になる。典型的なウイルス病原体の例には、麻疹、灰白髄炎、水痘、Ｂ型肝炎、および痘瘡の病原体が含まれる。ＨＩＶ−１感染の高い死亡率、並びに、ＨＩＶ−１感染に対する回復および防御免疫が非常に稀であることは、病原性ＨＩＶ−１が非改変野生型ウイルス病原体である場合に霊長類がＨＩＶ−１感染に対して天然の免疫を生じる能力に、疑問を投げ掛けるものである。従って、霊長類集団にＨＩＶ−１ウイルスに対する防御免疫を付与するワクチンに対して多大な要求が存在する。

将来のウイルス感染に耐性を示す代表的なものは、ウイルス病原体を認識することができる「中和抗体」の生成である。別の手段は、感染組織に対する細胞性免疫である。典型的なウイルス感染では、中和抗体および細胞性免疫の生成は、感染からの回復の先駆けとなる。しかし、ＨＩＶ−１感染では、中和抗体および細胞性免疫は、感染の非常に初期に出現し、ウイルス負荷の一過性の減少にしか関連しない。中和抗体および細胞性免疫の生成にも関わらず、ＨＩＶ−１感染におけるウイルス複製が回復し、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）が発症する。したがって、ＨＩＶ−１感染では、中和抗体および細胞性免疫は防御免疫を正確に評価する手段ではない。

ＨＩＶ−１の有効なワクチンの開発におけるさらなる問題は、野生型ウイルスの抗原性の多様性である。組換えＨＩＶ−１外殻タンパク質を介して生成されたワクチンは、ウイルスの特定の表現型に対する耐性を付与するが、広範な免疫性を示さない可能性が高い。組換えＨＩＶ−１ｇｐ１２０ペプチド（ＨＩＶ−１ウイルス外殻タンパク質）を使用したワクチン開発は、毒性を示さないで第Ｉ相臨床試験を通過する。しかし、中和抗体は一過性にしか出現しないことがデータにより示された。したがって、組換えＨＩＶ−１ｇｐ１２０ペプチドワクチンは、短期間しか作用することができず、将来的に感染する、感受性が逆戻りする。

一般に、生ウイルスワクチンは、単離されたウイルスタンパク質よりも病原体ウイルスに対してより良好な免疫を誘導することが認められている（例えば、Ｐｕｔｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＳＩＶ_mac Ｃａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｍａｃａｑｕｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＩＶ_sm，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９６，ｐｐｓ．２００−２１０，１９９６；Ｄｉｍｍｏｃｋ ａｎｄ Ｐｒｉｍｒｏｓｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｄｅｒｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４を参照のこと）。ＨＩＶ−１ワクチンなどの生レンチウイルスワクチンの使用は認められていないが、これは、接種された個体の宿主ＤＮＡにウイルスＤＮＡが組み込まれるため、接種された集団中でこのウイルスが無制限にとどまるという強い懸念があるからである（例えば、Ｈａａｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ＳＩＶ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｏｆ Ｍａｃａｑｕｅｓ Ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｌｉｖｅ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＳＩＶ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９６，ｐｐｓ．２１９−２２４，１９９６を参照のこと）。従って、ＨＩＶ−１に対する安全且つ有効なワクチンは、最初は非病原性であるワクチンウイルスが無作為に変異または他の変化のいずれかを起こすことによって起こり得る強毒性病原菌感染の発生を防止するような修飾を含む。このようなワクチンとしての可能性を有するものの１つに、ＨＩＶ−１に対するＤＮＡワクチンの形態があり得る。

ＤＮＡワクチンを、一般に、プラスミドＤＮＡまたはＲＮＡ分子の形態でニードルまたは微粒子銃を介して宿主組織に注入する。一旦送達されると、ＤＮＡは、トランスフェクトされた細胞内で抗原ペプチドの発現を誘導する。米国特許第６，１９４，３８９号には、動物被験体中に生理学的免疫応答生成タンパク質を産生するための脊椎動物細胞へのＤＮＡの導入方法が記載されており、その全体が本明細書中で参考として援用される。

ワクチン有効性試験は、一般に、生きたウイルスまたはＤＮＡを用いて被験体を攻撃することを必要とする。ヒト被験体を使用して予備研究を試みることは倫理的および実際的に困難である。予備デザインおよび候補ワクチンの試験のためのモデル系の使用は、ウイルスの種々の種特異的性質によって妨げられている。ＨＩＶ−１ウイルス自体が、一定の比率で感染するのみであり、ヒトに加えてチンパンジー種が危険にさらされていることが現在知られている。ＨＩＶ−１ウイルスワクチンの完全な予備研究のために十分な数のこのような危険にさらされている動物が得られる可能性は極めて低い。有効な類似の動物モデル系を使用することが好ましい。

ＨＩＶ−１の１つの類似のモデル系は、ＳＩＶ_mac（サル免疫不全ウイルス、マカクザル）系であった。ＳＩＶは種々のサル（マカクザルが含まれる）に感染するが、ＳＩＶとＨＩＶとの間の相違により、ＳＩＶの潜在的なヒトワクチンとしての使用は制限される。したがって、ＨＩＶの近縁種であるウイルスから作製したワクチンが必要とされているが、試験目的のための動物モデルで依然として感染性を示す。

ＳＩＶ_macのバックグラウンドにＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質を置くことによってキメラＳＩＶ−ＨＩＶウイルスが開発されている。キメラウイルスはサルに感染性を示すことが証明されたが、末期のエイズまたは偽ＨＩＶ−１感染サルの正確なモデルは得られなかった。
Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ＨＩＶ−１，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９５，ｐｐｓ．１３５−１４２，１９９５ Ｃｅａｓｅ ａｎｄ Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｔｏｗａｒｄ ａ Ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ＡＩＤＳ：Ｔｈｅ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ−Ｂａｓｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２：９２３−９８９ Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｔｏｗａｒｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ＨＩＶ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９２，ｐｐｓ．４０−４１，１９９２ Ｐｕｔｋｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｌｉｖｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＳＩＶmac Ｃａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｍａｃａｑｕｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＳＩＶsm，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９６，ｐｐｓ．２００−２１０，１９９６ Ｄｉｍｍｏｃｋ ａｎｄ Ｐｒｉｍｒｏｓｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｄｅｒｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４ Ｈａａｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ＳＩＶ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｏｆ Ｍａｃａｑｕｅｓ Ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｌｉｖｅ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ＳＩＶ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９６，ｐｐｓ．２１９−２２４，１９９６

本発明は、非感染被験体に防御免疫を供与するか感染被験体に治療免疫を供与することを目的とする。

本発明は、ＨＩＶに対する免疫化のためのＤＮＡワクチンに関する。本発明は、ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ分子を含む。該ＤＮＡ分子には、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆをコードする遺伝子を破壊することにより、ワクチンとして使用するための安全性が付与される。該ＤＮＡ分子には、３’ＬＴＲの少なくとも部分的な欠失によって、さらに安全性が付与される。

本発明の該ＤＮＡ分子は更に、ＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。さらに、本発明の該ＤＮＡ分子は、好ましくは、天然のＳＩＶプロモーター配列によって調節される。

本発明はまた、本発明の前記ＤＮＡワクチンの個体への投与によるＨＩＶに対する該個体の免疫化方法に関する。

本発明は、さらに、複数のＨＩＶサブタイプのみならずＨＩＶ以外のウイルスに対するワクチンに関し、ここで該ワクチンは、本明細書中に記載のオルソロガスＨＩＶ及び／又はＳＩＶ遺伝子の、他のウイルス由来の遺伝子への置換によって産生されたワクチンに関する。

本発明の特定のＤＮＡ構築物および方法は、ワクチン接種した宿主におけるＨＩＶ−１に対する免疫応答の惹起に有効である。

本発明の１つの態様は、ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができるウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子に関する。好ましい実施形態では、該ＤＮＡワクチンは、ＨＩＶまたはＳＩＶのｇａｇ、ｐｒｏ、ｖｐｘ、ｖｐｒ、ｎｅｆ、ｔａｔタンパク質をコードする。

本発明のＤＮＡ分子は、病原性において重要なタンパク質をコードする能力が除去されるように機能が破壊されているという点が重要である。より詳細には、好ましい実施形態においては、該ＤＮＡワクチンのｖｉｆ、ｉｎｔ、およびｒｔ遺伝子の機能を破壊する。他の実施形態においては、ｒｔ遺伝子の機能を破壊する。変化した配列におけるヌクレオチドの数が、変化しない配列と異なるよう、少なくとも１つのヌクレオチドを挿入または欠失させることによって、該ＤＮＡをその機能上において破壊することができると予想される。機能的アミノ酸をコードする１つまたは複数のヌクレオチドを非機能的アミノ酸をコードする１つまたは複数の異なるヌクレオチドに置換することによって、病原性関連タンパク質をコードするＤＮＡの機能を破壊できる、ということも予想される。本発明の好ましい実施形態では、病原性関連タンパク質をコードするＤＮＡの機能的破壊はｒｔ、ｉｎｔ、およびｖｉｆ遺伝子の欠失によって起こる。

本発明の別の重要な態様は、宿主ゲノムへのＤＮＡ配列の望ましくない組み込みを可能とする３’ＬＴＲ配列を破壊するＤＮＡワクチンを提供することである。機能的ヌクレオチドを、異なる非機能的ヌクレオチドへ置換することによっても、３’ＬＴＲの機能を無効にすることができる。該欠失した３’ＬＴＲ領域が、ＳＶ４０ポリアデニル化配列によって置換されることが好ましい。当業者は、ＳＶ４０以外の種々の供給源由来のポリアデニル化部位を３ＬＴＲ配列の置換物として使用することもできることを認識するであろう。

本発明のさらなる態様は、ＳＨＩＶ_ku2またはＳＩＶ５’ＬＴＲプロモーター（配列番号７）の使用による、本発明のＤＮＡ分子の調節である。このプロモーターは、ＤＮＡワクチン中に存在する、ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができるウイルスタンパク質の発現を駆動する。当業者は、本発明の別の実施形態を、所望のウイルスタンパク質の発現も駆動する他の機能的プロモーター配列と置換しうることを認識するであろう。

Δ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物の構築
図１は、本発明のΔ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物（配列番号１）の略図である。本発明のＤＮＡワクチンであるΔ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物（配列番号１）の構築を以下のように行う。本発明のワクチンのために使用したベクターは、ｐＥＴ−９ａである。ｐＥＴ−９ａの２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｍｍＩフラグメントを、約７．４ｋｂの修飾ＳＨＩＶ_ku2プロウイルスゲノムおよびＳＶ４０の約０．５ｋｂのポリアデニル化シグナル配列と置換して、中間ベクターを得る。ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を、別の中間ベクター中の５’ＬＴＲおよびｎｅｆ遺伝子の末端のすぐ上流に作製する。逆転写酵素（ｒｔ）、インテグラーゼ（ｉｎｔ）、およびｖｉｆの遺伝子を、ｐｒｏ遺伝子の下流末端とｖｐｘ遺伝子の上流との間の約２．５ｋｂ ＤＮＡフラグメントの欠失によって消失させる。次いで、ＳＨＩＶ_ku2プロウイルスゲノムのエンベロープ（ｅｎｖ）、ｎｅｆ、および３’ＬＴＲをコードする約３．８ｋｂのヌクレオチド配列を、ＨＩＶ−１のｅｎｖおよびｎｅｆ遺伝子をコードする約３．２ｋｂのＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントと置換する。ＳＨＩＶ_ku2中のＳＩＶ_mac239のリーダー配列、ｇａｇ、およびｐｒｏ遺伝子をコードする約２．５ｋｂのＮａｒＩ／ＢｓｔＥ ＩＩ ＤＮＡフラグメントを、ＨＩＶ−１のＨＩＶ−１リーダー配列、ｇａｇ、およびｐｒｏをコードする約２．４ｋｂのＮａｒＩ／ＢｓｔＥ ＩＩフラグメントと置換して、Δ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物（配列番号１）を得る。而して、本発明のワクチンの５’ＬＴＲ、ｖｐｘ、及びｖｐｒはＳＩＶ_mac239に由来し、ｇａｇ、ｐｒｏ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖ、及びｎｅｆはＨＩＶ−１に由来する。本発明のＤＮＡワクチンであるΔ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡの好ましい実施形態の配列を、配列番号１と命名する。

Δ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物（配列番号１）の構造をより完全に詳述するために以下の情報を提供する。全ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をコードするＳＨＩＶ_ku2の４，９８１ｂｐフラグメント（従って、ゲノムのｒｔおよびｉｎｔ部分を含む）ならびにｖｉｆ遺伝子の最初の４７２ｂｐを、Δ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物中のＨＩＶ−１の２，３７６ｂｐのＤＮＡフラグメントと置換する。この２，３７６ｂｐフラグメントは、全ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子およびＨＩＶ−１ｐｏｌ遺伝子の一部をコードする（プロテアーゼをコードする全領域が含まれ、逆転写酵素の最初の１０４個のアミノ酸に対応するヌクレオチドが除去され、ｉｎｔおよびｖｉｆ遺伝子が完全に除去されている）。置換されたＳＨＩＶ_ku2の４，９８１ｂｐフラグメントを、配列番号２と命名する。置換されたＳＨＩＶ_ku2のｖｉｆ遺伝子の最初の４７２ｂｐのＤＮＡ配列を、配列番号３と命名する。欠失された４，９８１ｂｐ及び４７２ｂｐのＳＨＩＶ_ku2配列（それぞれ、配列番号２および配列番号３）を置換するために使用したＨＩＶ−１の２，３７６ｂｐフラグメントのＤＮＡ配列を、配列番号４と命名する。

上記に加えて、ＳＨＩＶ_ku2の３’ＬＴＲから４１１ｂｐのＤＮＡフラグメントを欠失させて、Δ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物（配列番号１）を得る。この欠失された３’ＬＴＲ配列を、配列番号５と命名する。Δ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物では、欠失された３’ＬＴＲ配列を、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列の４８１ｂｐのＤＮＡ配列と置換し、これを配列番号６と命名する。

Δ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡワクチンの効果
本発明の機能的態様およびその使用に由来する実験結果を詳述する前に、以前のものの有効性との比較によって本発明の有効性を確立することが必要である。本発明のワクチン前およびその試験より以前には、以前のもののワクチンとしての有用性は知られていなかった。

ＨＩＶに対する生ウイルスワクチンがウイルスに対する防御の誘発に非常に有効であることは、本発明者らによって行われた以前の研究から知られている。ＤＮＡワクチンがこのような防御の提供に同様に有効であり得ることを立証するために、５頭のマカクザルを使用した実験を行った。この動物のうちの３頭に、ワクチンの安全性を増大させるためにｒｔおよび３’ＬＴＲを欠損させたΔ２−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ（特許出願１０／２７９，９９２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）においてＶ７として以前に記載）を注射した。Δ２−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡにおいてはまた、欠損した３’ＬＴＲ配列がＳＶ４０ポリアデニル化配列に置換されている。残りの２頭の動物は、生ウイルスワクチンで免疫化した。ＤＮＡワクチンでワクチン接種した３頭の動物にそれぞれ２ｍｇのＤＮＡを皮内注射し、６週間後に５ｍｇのＤＮＡを筋肉内注射し、３回目は、１２週間後に０．５ｍｇのＤＮＡを筋肉内注射した。最後の免疫化から１２週間後に、マカクザルの静脈内にＳＨＩＶ８９．６Ｐの非希釈ストック調製物で攻撃誘発した。対象区の接種動物では、同一用量のＳＨＩＶ８９．６Ｐによって、その１００％において疾患が発症されるということに留意することが重要である。生ウイルスをワクチン接種した２頭のマカクザルに、ワクチン接種から１０週間後に同一のＳＨＩＶウイルスで攻撃誘発した。

その後該動物を研究することにより、ＤＮＡワクチンが、ＥｎｖおよびＧａｇペプチド中のエピトープに対するＥＬＩＳＰＯＴ（商標）（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）応答、ならびに、ＳＨＩＶ_ku2に対する中和抗体を誘導することが明らかとなった。ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）応答は、本明細書中で、表示されるエピトープを発現する細胞数の基準と定義する。ＤＮＡワクチンをワクチン接種した３頭全ての動物がＳＨＩＶ８９．６Ｐに感染したが、血漿中でそれぞれ低レベルのウイルスＲＮＡのみを産生し、ＣＤ４ Ｔ細胞を喪失しなかった。ＤＮＡワクチンΔ２−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡをワクチン接種した動物は、攻撃誘発後に既往性の強いＥＬＩＳＰＯＴ（商標）応答を示した。これらの動物における感染は、２８週間を超えて制御された。２８週間目に、ＤＮＡワクチンで免疫化した３頭の動物は、生ワクチンで免疫化した動物ほどの有効性を有する防御を示した。こうして、前記ＤＮＡワクチンは、異種ＳＨＩＶ８９．６Ｐに対する防御の誘発において生ワクチンと同等であることが証明された。さらに、ＤＮＡワクチン接種を受けた動物は、以前の生ワクチンウイルス接種の負荷に耐える必要はなかった。

Δ２−ＳＨＩＶ_ku2およびΔ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡワクチンのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
実施例２に記載の実験はｒｔ遺伝子および３’ＬＴＲを欠くＤＮＡワクチンであるΔ２−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡの有効性を示していたものの、本発明のワクチンであるΔ４−ＳＨＩＶ_ku2がワクチンとして有効であるかどうかは明らかではなかった。この不確定さは、本発明のワクチンであるΔ４−ＳＨＩＶ_ku2が４つの欠失（ｒｔ、ｉｎｔ、ｖｉｆ、および３’ＬＴＲ）を含み、各欠失はウイルスの感染性に重要なウイルスゲノムの一部に対応するという事実に由来する。ウイルスを非感染性にすること及び使用時の安全を目的として欠失させたが、生ウイルスよりもむしろＤＮＡを使用するという事実に加えて、これらの４つの欠失により、ワクチンのＨＩＶ−１に対する防御付与を不可能とするかどうかは知られていなかった。驚くべきことに、本発明のウイルスは、異種ＳＨＩＶ８９．６Ｐに対する防御の誘導において、実施例２の生ウイルスとの比較で記載したΔ２−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡワクチンと同様に有効であることが証明された。

３頭のマカクザルに、５ｍｇのΔ２−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡを筋肉内注射し、他のマカクザルに５ｍｇの本発明のΔ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡを筋肉内注射した。１１週間後に注射を繰り返し、第２の免疫化から６週間後に、動物の静脈内にＳＨＩＶ８９．６Ｐの非希釈ストックで攻撃誘発した。６頭全ての動物が、第１の注射から３週間後にワクチンに対してＥＬＩＳＰＯＴ（商標）応答を示し、この応答は、約３週間後に検出不可能なレベルまで減少した。第２の注射からたった１週間後に応答が再度出現し、低レベルまで再度減少した。攻撃誘発時には最小の応答しか検出されなかった。攻撃誘発から１週間までに、各動物は高力価のウイルス複製を示し、これは強力なＣＭＩ（細胞媒介性免疫）応答と適合した。攻激誘発から２週間後、前記動物におけるウイルス負荷は、１週間前に認められた濃度の１／１０と１／２０との間のレベルに減少した。ＣＤ４ Ｔ細胞を喪失した動物は認められなかった。注射からたった２週間後にＤＮＡが防御を誘導する能力は、前記ＤＮＡワクチンの有効性を強調するものであり、本実験結果は、さらなる欠失にも関わらず、本発明のΔ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物であるＤＮＡワクチン（配列番号１）が、Δ２−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡワクチンと同様の有効性を示す、言い換えると、生ウイルスワクチンと同様の有効性を示すことを、明確に示した。

３’ＬＴＲの置換物としてのＳＶ４０ポリアデニル化配列の有用性
３’ＬＴＲ配列の置換物としてのＳＶ４０ポリアデニル化配列の有用性を比較するために、更なる実験を行った。該実験は、Ｖ５実施形態であるインタクトな３’ＬＴＲを有するＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡワクチンと、ＳＶ４０ポリアデニル化配列と置換された３’ＬＴＲを有するＶ６実施形態であるＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡワクチン（配列番号６）との、ベクターがコードするウイルスタンパク質を発現する能力の比較によって完遂された（Ｖ５およびＶ６実施形態は、特許出願番号１０／２７９，９９２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている）。該２つのＤＮＡ分子の細胞内区画および細胞外区画中におけるウイルスタンパク質の発現についての性能を、トランスフェクトした初代ヒト繊維芽細胞細胞、ヒト胚腎臓上皮細胞株２９３、およびＪｕｒｋａｔ細胞中で比較した。発現の持続時間およびタンパク質の産生量ならびに翻訳後修飾および前駆タンパク質の切断についてもＤＮＡを比較した。３’ＬＴＲ欠失Ｖ６実施形態であるＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡワクチン構築物は、驚くべきことに、両ＬＴＲを有するＶ５実施形態であるＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡワクチンよりもウイルスタンパク質産生でより有効であると判断した。タンパク質産生の持続時間もまた、３’ＬＴＲ欠失ワクチンにおいての方が長かった。免疫沈降分析により、３’ＬＴＲ欠失により、ｇａｇ前駆体の切断が迅速となり、細胞外区画に輸送されるｐ２７の量が２倍となることが明らかとなった。まとめると、これらのデータは、３’ＬＴＲの欠失により宿主ＤＮＡへのウイルスゲノムの組み込みに関する懸念が軽減されるだけでなく、ウイルスタンパク質がより有効に発現することを示している。

サイトカインとΔ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡワクチンとの同時投与
次に、本発明のワクチンによって誘導される免疫応答を、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）ＤＮＡの同時投与によって増強することができるかどうかを確認するために研究を行った。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、１００μｇのΔ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡと２５μｇのマウスＧＭ−ＣＳＦ ＤＮＡとの混合物によって筋肉内を通じて免疫化した。注射を２週間間隔で２回行い、マウスを第２の免疫化から１週間後に屠殺した。脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）アッセイにおいて５群に分割したＳＩＶ Ｇａｇペプチドに対する応答について試験した。免疫化用量が低く、且つ組織サンプルを初期に採取したにも関わらず、ＣＭＩ応答がピークになる前に、ワクチンＤＮＡと共にＧＭ−ＣＳＦ ＤＮＡを投与された４頭全ての動物が、２０〜４０細胞／１０⁶脾細胞の範囲でＥＬＩＳＰＯＴ（商標）応答を示したのに対して、ワクチンＤＮＡのみを投与された動物ではその５０％しかこのような応答を示さなかった。注射部位に多数の単核球が集中したことによって証明されるように、ＧＭ−ＣＳＦが顕著な走化性効果を生じた。この効果は、さらに多くの抗原提示樹状細胞を注射部位に引き付け、該現象はＤＮＡワクチンのみを投与された動物で示された。しかし、驚くべきことに、ワクチンＤＮＡおよびＧＭ−ＣＳＦの両方を投与されたマウスは、ＤＮＡワクチンのみを投与された動物よりも低いＣＭＩ力価を示した。すなわち、ワクチンのみによって生成されたウイルスタンパク質特異的ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）陽性細胞数は、ワクチン＋ＧＭ−ＣＳＦによって生成された細胞数より有意に多かった。活性化脾細胞を発生する注射被験体の数の増加が予防的または治療的に望ましい場合、Δ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡワクチンとＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインとの同時投与が望ましいであろうと結論づけられた。

このように、本発明のＤＮＡワクチンは、ＨＩＶに対する防御を得るのに有用である。本発明で使用されたＤＮＡは、ＳＨＩＶ_ku2（病原性を高める有効性の高い複製ストラテジーを有するウイルス）に由来する。該ＤＮＡの転写機構は、ウイルスＤＮＡのプロモーター／エンハンサー配列を格納する５’ＬＴＲの保存によって維持された。さらに、５’ＬＴＲは、ＮＦＫＢ、ＮＦＡＴ、及びＳＰ−１などの転写因子のための結合部位と、ｔａｔ（ウイルスＤＮＡの転写を担うＨＩＶおよびレンチウイルスに固有の分子）のＲＮＡのための結合部位とを含む。該ＤＮＡが宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる能力を最小にするためにインテグラーゼ遺伝子および３’ＬＴＲを欠失させた。したがって、該ＤＮＡは、無期限に組織中に存続することができない。さらに、逆転写酵素およびｖｉｆ遺伝子の欠失により、ゲノムが感染性ウイルスをコードする能力が損なわれた。同時に、ｅｎｖ、ｇａｇ、ｖｐｕ、ｔａｔ、及びｎｅｆ遺伝子によってコードされるウイルスタンパク質は、該ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞中で高度に発現された。本発明のＤＮＡワクチンは、マカクザルで免疫原性が高く、異種ウイルスに対して防御免疫を誘発する。該ＤＮＡは抗レトロウイルス薬物療法の実施時にいつでも注射可能であるため、本発明のワクチンが、予防的にのみならず、ＨＩＶに既に感染した個体に治療的にも使用することができる点は重要である。

上記で提供した実施例および開示は本発明の一定の実施形態を説明するが、本発明を制限する意図を有していない。本開示に関して、本発明の精神または範囲を逸脱することなく多数の方法で本発明を修正可能であることは当業者に明らかである。例えば、上記のｅｎｖ、ｇａｇ、およびｎｅｆ遺伝子を切り出して、ＨＩＶの別のサブタイプ由来の対応遺伝子と置換することができる。従って、本発明のワクチンを、ＨＩＶの種々のサブタイプに対する免疫化のために使用することができる。さらに、上記のｅｎｖ、ｇａｇ、ｎｅｆ、および他の遺伝子を、ＳＡＲＳおよびＣ型肝炎などの他のウイルス由来の遺伝子と置換することができる。したがって、上記の本発明のＤＮＡワクチンを、ＨＩＶまたはＳＩＶ以外由来のウイルス遺伝子の発現を駆動し、それにより種々の他のウイルスに対するＤＮＡワクチンを得るための「エンジン」として使用することができる。本発明は、以下の特許請求の範囲のみによって制限される。

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００３年９月１６日提出の米国特許仮出願番号６０／５０３，１９７号の利益を主張する。

（発明の背景）
政府の権利に関する記述。本発明は、ＮＩＨ助成金番号１４０１８３０およびＧ１４０２５００によって一部援助を受けた。合衆国政府は、本発明に権利を有し得る。

本発明のΔ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物の略図である。 本発明のΔ４−ＳＨＩＶ_ku2ＤＮＡ構築物の円形図である。

Claims (6)

1. ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇａｇ遺伝子、ＨＩＶのｐｒｏ遺伝子、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のｖｐｘ遺伝子、ＳＩＶのｖｐｒ遺伝子、ＨＩＶのｖｐｕ遺伝子、ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子、ＨＩＶのｔａｔ遺伝子、ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子、ＨＩＶのｒｅｖ遺伝子をコードするコード配列、および前記コード配列に作動可能に連結されたプロモーターを有する単離されたＤＮＡ分子を含有するＤＮＡ組成物であって、
   前記コード配列がポリアデニル化配列に作動可能に連結され、前記ＤＮＡ組成物が、機能的な逆転写酵素（ｒｔ）遺伝子、機能的なインテグラーゼ（ｉｎｔ）遺伝子、および機能的なウイルス感染性因子（ｖｉｆ）遺伝子を含まず、免疫反応を刺激可能である、ＤＮＡ組成物。
2. 前記プロモーター配列が、ＳＩＶの５’長末端反復（５’ＬＴＲ）である請求項１に記載のＤＮＡ組成物。
3. 前記ＤＮＡ分子が、機能的な３’長末端反復（３’ＬＴＲ）も含まない、請求項１または２に記載のＤＮＡ組成物。
4. 前記ポリアデニル化配列が、ＳＶ４０のポリアデニル化配列である請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ組成物。
5. 薬学的に許容可能な担体をさらに含む請求項１から４のいずれか１項に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
6. 前記単離されたＤＮＡ分子が、配列番号１を含むものである請求項４に記載のＤＮＡ組成物。

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