ES2399875T3

ES2399875T3 - Composiciones de vacunas de ADN y procedimientos para su uso

Info

Publication number: ES2399875T3
Application number: ES04784389T
Authority: ES
Inventors: Opendra Narayan; Zhenqian Liu
Original assignee: University of Kansas Medical Center
Current assignee: University of Kansas Medical Center
Priority date: 2003-09-16
Filing date: 2004-09-16
Publication date: 2013-04-04
Anticipated expiration: 2024-09-16
Also published as: EP1667523B1; US8916174B2; US20090233857A1; AU2004273965A1; PT1667523E; AU2004273965B2; JP2007505923A; WO2005027844A3; JP4989224B2; DK1667523T3; EP1667523A2; WO2005027844A2; US8003113B2; US20120207782A1; PL1667523T3; CA2538840A1; NZ545954A; IL174325A; US20050112102A1; EP1667523A4

Abstract

Una composición inmunogénica de ADN contra el VIH, que comprende una molécula de ADN aislada que tieneuna secuencia que codifica una pluralidad de proteínas víricas seleccionadas del grupo que consiste en las proteínasgag, pro, vpx, vpr, nef y tat de VIH o VIS, capaz de estimular una respuesta inmunológica contra el VIH, en la quedicha molécula de ADN es incapaz de codificar proteínas funcionales de transcriptasa inversa, integrasa y Vif, y en laque además una repetición terminal larga 3' de dicha molécula de ADN está al menos parcialmente alterada.

Description

Composiciones de vacunas de ADN y procedimientos para su uso.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere, en general, al campo de las vacunas profilácticas para generar protección frente a la infección y la enfermedad inducida por el VIH-1. De modo más específico, la presente invención se refiere a vacunas de ADN contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

Para el final del año 2000, se calculó que 36,1 millones de personas en el mundo estaban infectadas por el VIH. Sólo en ese año, las enfermedades asociadas con VIH/SIDA se cobraron la vida de aproximadamente 3 millones de personas en el mundo. Se calcula que 500.000 de estas muertes corresponden a niños menores de 15 años. La importancia de una vacuna para el VIH con respecto a la salud mundial no puede exagerarse.

Se reconoce que unas vacunas eficaces que inhiban o eviten la infección por VIH-1 o la enfermedad inducida por VIH-1 en seres humanos serían útiles para el tratamiento de ciertas poblaciones de alto riesgo, y como vacunación profiláctica general para la población general que pueda estar en riesgo de una infección por VIH-1 o una enfermedad inducida por VIH-1. Una vacuna que confiera una protección a largo plazo frente a la transmisión del VIH-1 sería lo más útil. Por desgracia, existen muchos problemas que interfieren en el desarrollo de vacunas eficaces para la prevención de la infección y la enfermedad por VIH-1. Es muy probable que ciertos problemas sean el resultado de la naturaleza exclusiva del virus VIH-1 y sus propiedades funcionales, y hasta ahora no se ha desarrollado una vacuna eficaz (para una visión general, véase: Berzofsky et al., Developing Synthetic Peptide Vaccines for HIV-1, Vaccines, 95, pp. 135-142, 1995; Cease y Berzofsky, Toward a Vaccine for AIDS: The Emergence of Immunobiology-Based Vaccine Design, Annual Review of Immunology, 12:923-989; Berzofsky, Progress Toward Artificial Vaccines for HIV, Vaccines, 92, pp. 40-41, 1992).

El documento US2003/0158131 informan sobre una vacuna de ADN que comprende vectores para la producción de partículas víricas de VIH no infecciosas. Las partículas no infecciosas se obtienen introduciendo una serie de mutaciones de inactivación en un genoma vírico nativo, es decir, en al menos una posición de un aminoácido de la proteína de la transcriptasa inversa (RT) o de la proteína de la integrasa (IN). Además, la mutación en el genoma del VIH nativo puede introducirse en agrupaciones, en las que se realizan dos o más mutaciones en la proteína NC, la proteína RT, la proteína IN, o cualquiera de sus combinaciones.

Smith, J.M. et al. (Viral lmm., 13, nº 3, pp. 343-351, 2000) informan sobren el análisis de un genoma de VIS mutante que revela una delección de 1,6 kb que está dentro de marco y abarca a integrasa, vif, vpx. Esta deleción se introdujo en el clon molecular patogénico de origen, y la región U3 de la 5’ LTR se reemplazó por un promotor de citomegalovirus para producir un candidato a vacuna de ADN, pIV.

Kotsopoulou, E. et al. (J. Virol., vol. 74, nº 10, 4839-4852, 2000) informan sobre un módulo de expresión de VIH-1gag-pol sintético (SYNGP). Este módulo de expresión no comprende una secuencia que codifique las proteínas gap, pro, vpx, vpr, net o tat de SIV o VIH.

Seth, A. et al. (J. Virol., vol. 74, nº 6, 2502-2509, 2000) informan sobren un virus vaccinia modificado (virus de Ankara) que expresa de modo recombinante las proteínas Gag-Pol del virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS).

Seth, A. et al. (PNAS, vol. 95, 10112-10116, 1998) informan sobre la utilidad de un virus vaccinia modificado (virus de Ankara) (MVA) como vector para inducir SIDA. Después de dos inmunizaciones intramusculares con MVA-SIVSM gag pol, el modelo de mono rhesus/virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS) desarrolló una respuesta de CTL específica de epitopo de Gag que puede detectarse con facilidad en linfocitos de sangre periférica utilizando un ensayo de muerte funcional.

Barouch, D.H. et al. (Science, vol. 290, 486-492) y Barouch, D.H. et al. (PNAS, vol. 97, nº 8, 4192-4197, 2000) informan sobren la eficacia protectora de respuestas inmunológicas inducidas por vacunas frente a una exposición a SHIV-89.6P patogénico en monos rhesus. Las respuestas inmunológicas fueron inducidas por vacunas de ADN que expresan Gag de SIVmac239 y Env de HIV-189.6P.

El VIH es un retrovirus, lo cual significa que su genoma consiste en ARN en lugar de ADN. Existen dos cepas principales del virus, denominadas VIH-1 y VIH-2, siendo el VIH-1 la cepa principalmente responsable de la infección en seres humanos. El genoma de ARN del VIH está rodeado por una cubierta de proteínas. La combinación del genoma de ARN y la cubierta de proteínas se conoce como nucleocápsida, que a su vez está rodeada por una envuelta de proteínas y lípidos.

La infección de las células hospedantes por el VIH comienza cuando la proteína gp120 del VIH, una proteína muy glicosilada localizada en la envuelta vírica, se une a la molécula receptora CD4 de una célula hospedante. Esta interacción inicia una serie de acontecimientos que permiten la fusión entre las membranas vírica y celular y la posterior entrada del virus en la célula.

Después de entrar en la célula hospedante, el ARN del VIH es transcrito en ADN bicatenario por una enzima transcriptasa inversa vírica. Tras integrarse en el genoma hospedante, el VIH se expresa a través de transcripción por la enzima ARN polimerasa II del hospedante. A través de un control transcripcional y un procesamiento de la transcripción postranscripcional, el VIH es capaz de ejercer un alto nivel de control sobre el grado en el que se expresa.

Los estudios del virus del VIH han revelado mucha información acerca de la biología molecular del virus, incluyendo información acerca del número de genes y de las regiones genéticas importantes para la patogenicidad del VIH. Entre estos genes y regiones importantes se encuentran rt, int, vif, y la 3’ LTR del VIH.

El gen rt del VIH codifica la transcriptasa inversa vírica. Esta enzima utiliza el genoma de ARN del VIH para producir una correspondiente molécula de ADN bicatenario lineal que puede incorporarse al genoma del hospedante.

El gen int del VIH codifica una integrasa. Esta es la enzima que realmente cataliza la inserción del ADN vírico bicatenario lineal producido por la transcriptasa inversa, en el genoma del hospedante. Para completar la integración del ADN vírico en el genoma del hospedante, la maquinaria de reparación del ADN de la célula hospedante realiza un acoplamiento entre los ADN del hospedante y vírico.

El gen vif del VIH codifica una proteína conocida como “factor de infectividad vírica”. Esta proteína es necesaria para la producción de viriones infecciosos. Es probable que la proteína domine a un inhibidor celular que de otra forma inhibiría al VIH-1, y también puede potenciar la estabilidad del núcleo vírico y del complejo de preintegración.

Las regiones LTR (“long terminal repeat”, repetición terminal larga) del VIH-1 contienen regiones de promotores necesarias para conducir la expresión de los genes del VIH. La 5’ LTR del VIH-1 contiene el promotor que es principalmente responsable de conducir la expresión génica del VIH-1, aunque si la secuencia de 5’ LTR es alterada, la 3’ LTR puede asumir esta función. La 3’ LTR es necesaria para la integración del ADN vírico en el genoma del hospedante.

Otros genes importantes del VIH-1 son gag, pol, nef, y vpu.

El gen gag codifica, entre otras cosas, la proteína de la cápsica p27 del VIH. Esta proteína es importante para el ensamblaje de las nucleocápsidas víricas. También se sabe que la proteína p27 interacciona con la proteína celular CyA del VIH, que es necesaria para la infectividad vírica. Se ha demostrado que la alteración de la interacción entre p27 y CyA inhibe la replicación vírica.

El gen pol contiene las secuencias rt e int del VIH-1, por tanto codifica, entre otras cosas, la transcriptasa inversa y la integrasa.

El producto del gen nef (conocido como factor negativo, o Net) tiene una serie de propiedades potencialmente importantes. Nef tiene la capacidad de infrarregular las proteínas de clase I de MHC y CD4, siendo ambas importantes para la capacidad del cuerpo para reconocer a las células infectadas por el virus. También se ha demostrado que Nef activa a proteína quinasas celulares, interfiriendo con ello en los procesos de señalización de la célula. Quizás de modo más importante, la deleción de nef de un clon patógeno del virus de la inmunodeficiencia de simio (VIS) hace que el virus no sea patogénico en monos macacos adultos. Así, un gen nef funcional es crucial para la capacidad del VIS para provocar enfermedad in vivo. Otros estudios han demostrados que individuos VIH-positivo con grandes deleciones en el gen nef permanecen sanos durante bastante más de diez años, sin reducción en los recuentos de células CD4.

El gen vpu codifica una proteína con una función antes desconocida (conocida como proteína vírica, desconocida, o Vpu) pero que ahora se sabe que infrarregula la expresión de proteínas de clase I de MHC y CD4, así como estimula la gemación vírica. Vpu también es similar a otra proteína vírica que actúa como canal iónico. El gen vpu está presente en el VIH-1, pero está ausente en el VIH-2.

En casi todas las infecciones víricas, ciertos segmentos de la población infectada se recuperan y se convierten en inmunes frente a una futura infección vírica por el mismo patógeno. Los ejemplos de patógenos víricos típicos incluyen el sarampión, la poliomielitis, la varicela, la hepatitis B, y la viruela. La alta tasa de mortalidad de la infección por VIH-1, y la incidencia extremadamente infrecuente de recuperación e inmunidad protectora frente a la infección por VIH-1, ha sembrado dudas sobre la capacidad de los primates para generar una inmunidad natural frente a la infección por VIH-1 cuando el VIH-1 patogénico es el patógeno vírico de tipo salvaje no modificado. Por tanto, es muy necesaria una vacuna que confiera a poblaciones de primates una inmunidad protectora frente al virus VIH-1.

Una característica de la resistencia a una futura infección vírica es la generación de “anticuerpos neutralizantes” capaces de reconocer al patógeno vírico. Otra medida es la inmunidad celular frente a células infectadas. En las infecciones víricas típicas, la generación de anticuerpos neutralizantes e inmunidad celular anuncia la recuperación de la infección. Sin embargo, en la infección por VIH-1, los anticuerpos neutralizantes y la inmunidad celular aparecen en un momento muy temprano de la infección y se han asociado con una disminución sólo transitoria en la carga vírica. A pesar de la generación de anticuerpos neutralizantes y de inmunidad celular, la replicación vírica en la infección por VIH-1 rebota y se desarrolla SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida). Así, en la infección por VIH-1, los anticuerpos neutralizantes y la inmunidad celular no son medidad precisas de la inmunidad protectora.

Otro problema en el desarrollo de una vacuna eficaz para el VIH-1 es la diversidad antigénica del virus de tipo salvaje. Existe una gran posibilidad de que las vacunas generadas por medio de proteínas de la envuelta del VIH-1 recombinantes confieran resistencia a fenotipos específicos del virus y no produzcan una inmunidad de amplio espectro. El desarrollo de vacunas que utilicen el péptido gp120 de VIH-1 recombinante, una proteína de la envuelta del virus VIH-1, ha pasado los ensayos clínicos de fase 1 sin mostrar toxicidad. Sin embargo, los datos indican que apartecen anticuerpos neutralizante sólo de modo transitorio. Así, las vacuna del péptido gp-120 de VIH-1 recombinante pueden actuar sólo a corto plazo, produciéndose en el futuro una reversión a la susceptibilidad.

En general, se acepta que las vacunas con virus vivos inducen una inmunidad mejor frente a virus patógenos que las proteínas víricas aisladas (véase, por ejemplo, Putkonen et al., Immunization with Live Attenuated SIVmac Can Protect Macaques Against Mucosal Infection with SIVsm, Vaccines, 96, pp. 200-210, 1996; Dimmock y Primrose, Introduction to Modem Virology, 4ª ed., Blackwell Science, 1994). Hay una resistencia al uso de vacunas de lentivirus vivos, tales como la vacuna del VIH-1, porque existe una gran preocupación de que el virus persista indefinidamente en la población inoculada debido a la integración del ADN vírico en el ADN hospedante de los individuos inoculados (véase, por ejemplo, Haaft et al., Evidence of Circulating Pathogenic SIV Following Challenge of Macaques Vaccinated with Live Attenuated SIV, Vaccines, 96, pp. 219-224, 1996). Por tanto, una vacuna segura y eficaz frente al VIH-1 incluirá una modificación para evitar el desarrollo de una infección patógena virulenta que se produciría por una mutación aleatoria o por otro cambio en el virus de vacuna inicialmente no patogénico. Una posibilidad para esta vacuna podría venir en forma de una vacuna de ADN contra el VIH-1.

La publicación de patente de EEUU nº 2003/0158131 A1 divulga una vacuna que comprende partículas víricas de VIH no infecciosas mutadas. Las partículas no infecciosas se obtienen introduciendo una serie de mutaciones inactivadoras en el genoma vírico nativo. Las mutaciones se introducen en al menos una posición de un aminoácido de la proteína NC (nucleocápsida) en combinación con al menos otra mutación en un aminoácido de la proteína RT (transcriptasa inversa) o en la proteína In (integrasa). Las mutaciones pueden introducirse en agrupaciones, en las que se realizan dos o más mutaciones en la proteína NC, la proteína RT, la proteína IN, o cualquiera de sus combinaciones.

Smith et al., Viral Immunology, 13(3), pp. 343-351 (2000) informan sobren un análisis de un genoma de VIS mutante que revela una deleción de 1,6 kb que está dentro de marco, abarca a integrasa, vif, vpx, y la mayor parte de vpr, y produce una fusión génica pol/vpr. Esta deleción se introdujo en el clon molecular patogénico de origen, y la región U3 de la 5’ LTR se reemplazó por un promotor de citomegalovirus para producir un candidado a vacuna de ADN.

Las vacunas de ADN en general se inyectan en tejidos del hospedante en forma de moléculas de ARN o ADN plasmídico con una aguja o mediante bombardeo de partículas. Después de ser transportado, el ADN induce la expresión de proteínas antigénicas dentro de las células transfectadas. La patente de EEUU nº 6.194.389 informan sobre procedimientos para transferir ADN a células de vertebrado para producir inmunorrespuestas fisiológicas que producen proteínas en un sujeto animal.

El ensayo de la eficacia de una vacuna en general requiere la exposición de un sujeto a un virus vivo o a ADN. Resulta difícil, desde un punto de vista ético y práctico, intentar realizar estudios preliminares con sujetos humanos. El uso de sistemas de modelos para el diseño preliminar y el ensayo de candidatos a vacunas se ha visto dificultado por diversas características específicas de especie del virus. En la actualidad, se sabe que el propio virus VIH-1 infecta sólo a ciertas especies amenazadas de chimpancés y en ciertas tasas, además de seres humanos. La viabilidad de obtener un número suficiente de dichos animales amenazados para un estudio preliminar completo de vacunas del virus VIH-1 es muy baja. Es preferible utilizar sistemas de modelos animales análogos validados.

Un sistema de modelo análogo para el VIH-1 ha sido el sistema SIVmac (siglas en inglés del virus de la inmunodeficiencia de simio, macaco). El VIS infecta a una diversidad de simios, incluyendo los macacos, pero la diferencia entre VIS y VIH hace que el VIS tenga un uso limitado como vacuna humana potencial. Por tanto, es necesaria una vacuna fabricada a partir de virus que estén muy relacionados con el VIH, pero que sigan siendo infecciosos en un modelo animal para poder realizar ensayos.

Se ha desarrollado un virus VIS-VIH quimérico colocando las proteínas de la envuelta del VIH-1 en un entorno de SIVmac. El virus quimérico demostró ser infeccioso en monos, pero no produjo SIDA en su estado más avanzado ni resulta un modelo preciso para imitar la infección por VIH-1 en monos.

Tal como se describe a continuación, la presente invención informan sobre construcciones de ADN específicas. Además, se describen procedimientos que son eficaces para generar una respuesta inmunológica frente al VIH-1 en un hospedante vacunado.

Sumario de la invención

La presente invención se dirige a una vacuna de ADN para la inmunización frente el VIH. La invención comprende una molécula de ADN que tiene una secuencia que codifica una pluralidad de proteínas víricas capaces de estimular una respuesta inmunológica contra el VIH. La molécula de ADN se convierte en segura para su uso como vacuna mediante la alteración de genes que codifican la transcriptasa inversa, la invertasa, y Vif. La molécula de ADN se hace aún más segura mediante una deleción al menos parcial de la 3’ LTR.

La molécula de ADN de la presente invención incluye también una secuencia de poliadenilación de SV40. Además, la molécula de ADN de la presente invención es regulada preferiblemente por una secuencia de promotor de VIS natural.

La presente invención se dirige también a una vacuna contra múltiples subtipos de VIH, así como a virus distintos del VIH, produciéndose dicha vacuna sustituyendo genes de dichos otros virus por los genes de VIH y/o VIS ortólogos descritos en la presente.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama esquemático de la construcción de ADN f4-SHIVku2 de la presente invención.

La figura 2 es un diagrama circular de la construcción de ADN f4-SHIVku2 de la presente invención.

Descripción detallada

El objeto de la presente invención es proporcionar composiciones de vacunas de ADN que proporcionan inmunidad protectora a individuos no infectados o inmunidad terapéutica a sujetos infectados. También se describen procedimientos que proporcionan una respuesta inmunológica protectora a sujetos no infectados o una inmunidad terapéutica a sujetos infectados.

Un aspecto de la presente invención se dirige a moléculas de ADN que codifican proteínas víricas capaces de estimular una respuesta inmunológica contra el VIH. En realizaciones preferidas, la vacuna de ADN codifica las proteínas gag, pro, vpx, vpr, nef, tat del VIH o VIS.

De manera importante, las moléculas de ADN de la presente invención se han alterado desde el punto de vista funcional, de modo que se elimina la capacidad de codificar proteínas que son importantes para la patogenicidad. De modo más específico, las realizaciones preferidas alteran desde el punto de vista funcional a los genes vif, int y rt de la vacuna de ADN. Otras realizaciones alteran desde el punto de vista funcional al gen rt. Se anticipa que el ADN puede alterarse desde el punto de vista funcional insertando o delecionando al menos un nucleótido, de modo que el número de nucleótidos en las secuencias alteradas difiere con respecto a las secuencias no alteradas. También se anticipa que el ADN que codifica proteínas relacionadas con la patogenicidad pueda alterarse desde el punto de vista funcional sustituyendo uno o más nucleótidos que codifican aminoácidos funcionales por uno o más nucleótidos diferenciados que codifican aminoácidos no funcionales. En una realización preferida de la presente invención, la alteración funcional del ADN que codifica proteínas relacionadas con la patogenicidad se produce a través de la deleción de los genes rt, int y vif.

Otro aspecto importante de esta invención es que proporciona vacunas de ADN que alteran las secuencias 3’ LTR que permiten la integración indeseable de secuencias de ADN en el genoma del hospedante. La función de la 3’ LTR también puede abolirse sustituyendo nucleótidos funcionales por nucleótidos no funcionales diferenciados. La región 3’ LTR delecionada es reemplazada preferiblemente por una secuencia de poliadenilación de SV40. Los expertos en la técnica reconocerán que también pueden utilizarse sitios de poliadenilación derivados de una diversidad de fuentes distintas al SV40 como sustitutos de las secuencias 3’ LTR.

Otro aspecto de la invención es la regulación de la molécula de ADN de la presente invención mediante el uso del promotor SHIVku2 o SIV 5’ LTR (SEQ ID NO:7). Este promotor dirige la expresión de proteínas víricas capaces de estimular una respuesta inmunológica contra el VIH presente en la vacuna de ADN. Los expertos en la técnica reconocerán que en realizaciones alternativas de esta invención, se pueden sustituir otras secuencias de promotores funcionales que también dirijan la expresión de la proteínas víricas deseadas.

Ejemplos

Ejemplo 1. Construcción de la construcción de ADN f4-SHIVku2

La figura 1 es un diagrama esquemático de la construcción de ADN f4-SHIVku2 (SEQ ID NO:1) de la presente invención. La construcción de la construcción de ADN f4-SHIVku2 de la presente vacuna de ADN (SEQ ID NO:1) se realiza como sigue. El vector utilizado para la presente vacuna es pET-9a. El fragmento EcoR I/Xmn I de 2,3 kb de pET-9a se reemplaza por el genoma del provirus SHIVku2 modificado de aproximadamente 7,4 kb y la secuencia señal de poliadenilación de aproximadamente 0,5 kb de SV40 para producir un vector intermedio. Se crean sitios de restricción EcoR I y Not I inmediatamente cadena arriba de 5’ LTR y al final del gen nef, respectivamente, en otro vector intermedio. Los genes de la transcriptasa inversa (rt), la integrasa (int), y vif se eliminan mediante la deleción de un fragmento de ADN de aproximadamente 2,5 kb entre el extremo corriente abajo del gen pro y cadena arriba del gen vpx. La secuencia de nucleótidos de aproximadamente 3,8 kb que codifica la proteína de la envuelta (env), nef, y los genes de 3’ LTR del genoma del provirus SHIVku2 entonces se reemplaza por el fragmento de ADN EcoR V/Not I de aproximadamente 3,2 kb que codifica los genes env, y nef del VIH-1. El fragmento de ADN Nar I/BstE II de aproximadamente 2,5 kb que codifica la secuencia conductora, los genes gag y pro de SIVmac239 en SHIVku2 se reemplaza por un fragmento Nar I/BstE II de aproximadamente 2,4 kb que codifica la secuenca conductora del VIH1, los genes gag y pro del VIH-1, para producir la construcción de ADN f4-SHIVku2 (SEQ ID NO:1). Por tanto, la 5’ LTR, los genes vpx y vpr de la presente vacuna provienen de SIVmac239, y los genes gag, pro, tat, rev, vpu, env y nef provienen del VIH-1. La secuencia de una realización preferida de la presente vacuna de ADN f4-SHIVku2 se denomina SEQ ID NO:1.

Se proporciona la siguiente información para detallar la estructura de la construcción de ADN f4-SHIVku2 (SEQ ID NO:1) de forma más completa. Un fragmento de 4.981 pb de SHIVku2 que codifica los genes gag y pol completos (que, por tanto, incluye las porciones rt e int del genoma), así como las primeras 472 pb del gen vif, se reemplaza por un fragmento de ADN de 2.376 pb del VIH-1 en la construcción de ADN f4-SHIVku2. Este fragmento de 2.379 pb codifica el gen gag de VIH-1 completo, y una porción del gen pol de VIH-1 (se incluye la región completa que codifica una proteasa; se han eliminado los nucleótidos que corresponden a los primeros 104 aminoácidos de la transcriptasa inversa; los genes int y vif se han eliminado por completo). El fragmento de 4.981 pb de SHIVku2 que ha sido reemplazado se denomina SEQ ID NO:2. La secuencia de ADN de los primeros 472 pb del gen vif de SHIVku2, que también ha sido reemplazado, se denomina SEQ ID NO:3. La secuencia de ADN del fragmento de 2.376 pb del VIH1 utilizada para reemplazar las secuencias delecionadas de 4.981 pb y 472 pb de SHIVku2 (SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, respectivamente) se denomina SEQ ID NO:4.

Además de lo anterior, un fragmento de ADN de 411 pb se deleciona de la 3’ LTR de SHIVku2 para producir la construcción de ADN f4-SHIVku2 (SEQ ID NO:1). Esta secuencia de 3’ LTR delecionada se denomina SEQ ID NO:5. En la construcción de ADN f4-SHIVku2, las secuencias 3’ LTR delecionadas se reemplazan por una secuencia de ADN de 481 pb de la secuencia señal de poliadenilación de SV40 que se denomina SEQ ID NO:6.

Ejemplo 2. Eficacia de la vacuna de ADN f2-SHIVku2

Antes de detallar los aspectos funcionales de la presente invención y los resultados experimentales derivados de su uso, es necesario establecer la eficacia de la presente invención mediante comparación con la eficacia de las que han aparecido antes. Antes de la invención de la presente vacuna y su posterior ensayo, su utilidad como vacuna era desconocida.

Se sabe, a partir de estudios anteriores realizados por el inventor de la presente invención, que una vacuna de virus vivos contra el VIH es muy eficaz para inducir una protección frente al virus. Para comprobar si una vacuna de ADN sería igual de eficaz para proporcionar esta protección se realizó un experimento con cinco macacos. Tres de los animales recibieron inyecciones de un ADN f2-SHIVku2, en el que se ha delecionado rt y 3’ LTR para aumentar la seguridad de la vacuna. El ADN f2-SHIVku2 también reemplaza la secuencia 3’ LTR delecionada por la secuencia de poliadenilación de SV40. Los otros dos animales fueron inmunizados con una vacuna de virus vivos. Los tres animales vacunados con la vacuna de ADN recibieron cada uno 2 mg del ADN, inyectados por vía intradérmica, seguido de una inyección intramuscular de 5 mg de ADN seis semanas más tarde, y una tercera inyección de 0,5 mg de ADN intramuscular doce semanas después. Los macacos se expusieron por vía intravenosa a una preparación madre sin diluir de SHIV 89.6P doce semanas después de la inmunización final. Es importante advertir que la misma dosis de SHIV 89.6P provoca enfermedad en 100% de los animales control inoculados. Los dos macacos vacunados con el virus vivo se expusieron diez semanas después de la vacunación al mismo virus SHIV.

Cuando los animales fueron estudiados posteriormente, se hizo evidente que la vacuna de ADN induce respuestas ELISPOTp (Cellular Technology Limited, Cleveland, Ohio) contra epitopos en los péptidos Env y Gag, así como anticuerpos neutralizantes contra SHIVku2. Las respuestas ELISPOTp se definen en la presente como mediciones del número de células que expresan un epitopo indicado. Los tres animales vacunados con la vacuna de ADN se infectaron con SHIV 89.6P, pero cada uno desarrolló sólo niveles bajos de ARN vírico en el plasma, sin pérdida de células T CD4. Los animales vacunados con la vacuna de ADN f2-SHIVku2 desarrollaron una masiva respuesta ELISPOT anamnésica después de la exposición. La infección en estos animales se controló durante más de 28 semanas. A las 28 semanas, los tres animales que fueron inmunizados con la vacuna de ADN mostraron una protección que era tan eficaz como en los animales inmunizados con la vacuna viva. Así, la vacuna de ADN demostró ser tan eficaz como la vacuna viva para inducir una protección frente a SHIV 89.6P heterólogo. Ademas, los animales que recibieron la vacunación de ADN no tuvieron que soportar la carga de una infección anterior con un virus de vacuna vivo.

Ejemplo 3. Eficacia in vivo de las vacunas de ADN f2-SHIVku2 y f4-SHIVku2

Aunque el experimento descrito en el ejemplo 2 indica la eficacia de la vacuna de ADN f2SHIVku2 que carece del gen rt y de 3’ LTR, no está claro si la presente vacuna, f4-SHIVku2, sería eficaz como vacuna. La duda surge del hecho de que la presente vacuna f4-SHIVku2 contiene cuatro deleciones (rt, int, vif, y la 3’ LTR), correpondiendo cada deleción a una porción del genoma vírico importante para la infectividad del virus. Las deleciones se realizaron para hacer que el virus no sea infeccioso y sea seguro para su uso, pero se desconoce si estas cuatro deleciones, además del hecho de que se está utilizando ADN en lugar de un virus vivo, harían que la vacuna fuera incapaz de proporcionar protección frente al VIH-1. De manera sorprendente, el presente virus demostró ser igual de eficaz para inducir una protección frente a SHIV 89.6P heterólogo que la vacuna de ADN f2-SHIVku2 descrita en la comparación con virus vivos del ejemplo 2.

Tres macacos recibieron una inyección intramuscular de 5 mg del ADN f2-SHIVku2, mientras que otros tres macacos recibieron una inyección intramuscular de 5 mg del presente ADN f4-SHIVku2. Las inyecciones se repitieron once semanas despues, y los animales se expusieron por vía intravenosa a una disolución madre sin diluir de SHIV 89.6P seis semanas después de la segunda inmunización. Los seis animales desarrollaron respuestas ELISPOTp a la vacuna tres semanas después de la primera inyección, disminuyendo las respuestas aproximadamente tres semanas después hasta niveles indetectables. Las respuestas aparecieron una vez más sólo una semana después de la segunda inyección, y de nuevo disminuyeron hasta niveles bajos. Sólo se detectaron respuestas mínimas en el momento de la exposición. A la semana después de la exposición, cada uno de los animales había desarrollado unas titulaciones altas de replicación vírica, que se correspondían con una poderosa respuesta CMI (respuesta inmunológica mediada por células). A las dos semanas después de la exposición, la carga vírica en los animales disminuyó hasta niveles entre diez y viente veces menores que las concentraciones observadas una semana antes. Ninguno de los animales había perdido células T CD4. La capacidad del ADN para inducir protección después de tan solo dos inyecciones subraya la potencia de las vacunas de ADN, y los resultados del experimiento demuestran claramente que, a pesar de las deleciones adicionales, la vacuna de ADN de la construcción de ADN f4-SHIVku2 (SEQ ID NO:1) de la presente invención es tan eficaz como la vacuna de ADN f2-SHIVku2, que a su vez es tan eficaz como la vacuna de virus vivos.

Ejemplo 4. Utilidad de la secuencia de poliadenilación de SV40 como sustituto para la 3’ LTR

Se realizó otro experimento para comparar la utilidad de las secuencias de poliadenilación de SV40 como sustitutos para la secuencia 3’ LTR. Esto se realizó comparando la capacidad de la realización V5 de la vacuna de ADN SHIVku2 con una 3’ LTR intacta, y la realización V6 de la vacuna de ADN SHIVku2 que tiene la 3’ LTR reemplazada por una secuencia de poliadenilación de SV40 (SEQ ID NO:6) para expresar proteínas víricas codificadas por un vector. Se comparó la actuación de las dos moléculas de ADN en fibroblastos humanos primarios transfectados, la línea de células epiteliales de riñón embrionario humano 293, y en células Jurkat, para la expresión de proteínas víricas en compartimentos intra- y extracelulares. Los ADN también se compararon para la duración de la expresión y para la cantidad de producción de proteína, así como para la modificación postraduccional y la ruptura de las proteínas precursoras. Se determinó que la realización V6 de la construcción de la vacuna de ADN SHIVku2 con 3’ LTR delecionada, de modo sorprendente, era más eficaz para producir proteínas víricas que la realización V5 de la construcción de la vacuna de ADN SHIVku2 que tiene ambas LTR. La duración de la producción de proteínas también fue mayor en la vacuna con la 3’ LTR delecionada. Un análisis de inmunoprecipitación reveló que la deleción de la 3’ LTR dio como resultado una rápida ruptura del precursor gag, doblando la cantidad de p27 exportada hacia el compartimento extracelular. Tomados conjuntamente, estos datos indican que la deleción de la 3’ LTR no sólo calma la preocupación acerca de la integración del genoma vírico en el ADN hospedante, sino que también produce una expresión más eficaz de las proteínas víricas.

Ejemplo 5. Coadministración de citoquinas con la vacuna de ADN f4-SHIVku2

A continuación se realizó un estudio para determinar si la respuesta inmunológica inducida por la presente vacuna puede potenciarse mediante la coadministración de ADN de citoquinas (por ejemplo, GM-CSF). Se inmunizaron ratones BALB/C por vía intramuscular con una mezcla de 100 !g de ADN de f4-SHIVku2 y 25 !g de ADN de GM-CSF de ratón. Las inyecciones se administraron dos veces, con un intervalo de dos semanas, y los ratones se sacrificaron una semana después de la segunda inmunización. Los esplenocitos se ensayaron para la respuesta a los péptidos Gag de VIS divididos en cinco grupos en el ensayo ELISPOTp. Aunque las dosis de inmunización fueron bajas y las muestras de tejido se recolectaron temprano, antes de que las respuestas de CMI alcanzasen el máximo, los cuatro animales que recibieron el ADN de GM-CSF junto con la vacuna de ADN desarrollaron respuestas ELISPOTp, que varían de 20 a 40 células/106 esplenocitos, mientras que sólo 50% de los animales que recibieron la vacuna de ADN sola desarrollaron estas respuestas. El GM-CSF provocó un impresionante efecto quimiotáctico, según demostró el gran número de células mononucleares que se concentraron en el sitio de la inyección. Este efecto atrajo muchas más células dendríticas presentadoras de antígenos al sitio de la inyección que en los animales que sólo recibieron la vacuna de ADN. Sin embargo, de modo sorprendente, los ratones que recibieron la vacuna de ADN y GM-CSF desarrollaron unas titulaciones de CMI menores que los que recibieron sólo la vacuna de ADN. Es decir, el número de células positivas a ELISPOTp específico de proteínas víricas generado por la vacuna sola fue significativamente mayor que el generado por la vacuna más GM-CSF. Se concluye que la coadministración de la vacuna de ADN f4-SHIVku2 con una citoquina, tal como GM-CSF, puede ser deseable en los casos en que resulta deseable, desde el punto de vista profiláctico o terapéutico, aumentar el número de sujetos inyectados que desarrollen esplenocitos activados.

Así, la presente vacuna de ADN es útil para proporcionar protección frente al VIH. El ADN utilizado en la presente invención proviene de SHIVku2, un virus que tiene una estrategia de replicación muy eficaz, haciendo que sea muy patogénico. La maquinaria transcripcional del ADN se mantuvo conservando la 5’ LTR que alberga las secuencias de promotores/potenciadores del ADN vírico. Además, la 5’ LTR contiene sitios de unión para factores de transcripción, tales como NFKB, NFAT, SP-1 y similares, y el sitio de unión para el ARN de tat, una molécula exclusiva del VIH y del lentivirus responsable de la transactivación del ADN vírico. El gen de la integrasa y la 3’ LTR se delecionaron para minimizar la capacidad del ADN para integrarse en el ADN de la célula hospedante. Así, el ADN no puede persistir indefinidamente en los tejidos. Además, la deleción de la transcriptasa inversa y los genes vif inutiliza la capacidad del genoma para codificar virus infecciosos. Al mismo tiempo, las proteínas víricas codificadas por los genes env, gag, vpu, tat, y nef se expresan en gran medida en células transfectadas con el ADN. La presente vacuna de ADN es muy inmunogénica en macacos e induce una inmunidad protectora frente a virus heterólogos. De manera importante, la presente vacuna no sólo puede utilizarse de modo profiláctico sino también terapéutico en individuos que ya están infectados por el VIH, porque el ADN puede inyectarse en cualquier momento durante un periodo en el que se esté desarrollando una terapia con fármacos antirretrovíricos.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Narayan, Opendra Liu, Zhenqian

<120> Composiciones de vacunas de ADN y procedimientos para su uso.

5 <130> 15737.10

<150> documento 60/503.197

<170> PatentIn version 3.2

<210>: 1 15 <211> 9994

<212> ADN

<213> VIS/VIH

<400> 1

<210> 2

<211> 4981

<212> ADN

<213> VIS/VIH

<400> 2

<210> 3

<211> 472

<212> ADN

<213> VIS/VIH

<400> 3

<210> 4

<211> 2376

<212> ADN

<213> VIH

<210> 5

<211> 411

<212> ADN

<213> VIH

<400> 5

<210> 6

<211> 481

<212> ADN

<213> SV40

<400> 6

<210>: 7 10 <211> 818

<212> ADN

<213> VIS

<400> 7 15

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Una composición inmunogénica de ADN contra el VIH, que comprende una molécula de ADN aislada que tiene una secuencia que codifica una pluralidad de proteínas víricas seleccionadas del grupo que consiste en las proteínas gag, pro, vpx, vpr, nef y tat de VIH o VIS, capaz de estimular una respuesta inmunológica contra el VIH, en la que dicha molécula de ADN es incapaz de codificar proteínas funcionales de transcriptasa inversa, integrasa y Vif, y en la que además una repetición terminal larga 3’ de dicha molécula de ADN está al menos parcialmente alterada.
2.- La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1, en la que la molécula de ADN comprende además una secuencia de promotor de VIS natural.
3.- Una composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, derivada de un genoma vírico que codifica al menos una proteína capaz de proporcionar una respuesta inmunológica contra el VIH y que tiene una repetición terminal larga 5’ y una repetición terminal larga 3’, un gen rt, un gen int, y un gen vif, en la que la composición inmunogénica de ADN se ha hecho no patogénica mediante la alteración del gen rt, el gen int, el gen vir, y la repetición terminal larga 3’.
4.- Una composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1.
5.- Una composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, que comprende: (a) la 5’ LTR de VIS; (b) el gen gag de VIH; (c) el gen pro de VIH; (d) el gen vpx de VIS; (e) el gen vpr de VIS; (f) el gen nef de VIH; (g) el gen tat de VIH; (h) el gen rev de VIH; (i) el gen env de VIH; y (j) una secuencia de poliadenilación de SV40.
6.- Una composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, que comprende una molécula de ADN aislada que tiene: (a) una secuencia de promotor procedente de la 5’ LTR de VIS que está unida operablemente: (b) una secuencia que codifica una pluralidad de proteínas víricas capaces de estimular una respuesta inmunológica contra el VIH seleccionada del grupo de secuencias codificadoras que consiste en los genes gag, pro, tat, rev, vpu, env, vpx, vpr y nef de VIS o VIH, en la que dicha molécula de ADN es incapaz de codificar proteínas funcionales de transcriptasa inversa, integrasa y Vif, y que contiene una alteración al menos parcial de la repetición terminal larga 3’ de dicha molécula de ADN, y que está unida operablemente; y (c) una secuencia de poliadenilación de SV40.
7.- La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 6, en la que el promotor proviene de la 5’ LTR de VIS identificada en la presente como SEQ ID NO:7.
8.- La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 6, en la que la secuencia que codifica la pluralidad de proteínas víricas capaces de estimular una respuesta inmunológica se selecciona del grupo de secuencias codificadoras que consiste en los genes gag, pro, tat, rev, vpu, env, y nef de VIH, y los genes vpx y vpr de VIS.
9.- La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 6, en la que la secuencia de poliadenilación es la secuencia de poliadenilación de SV40 identificada en la presente como SEQ ID NO:6.
10.- La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 3, que comprende además una secuencia de poliadenilación sustituida en la región de la repetición terminal larga 3’ alterada.
11.- La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 1, en la que la molécula de ADN comprende además una secuencia que codifica una citoquina.
12.- La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 3, que comprende además una citoquina.
13.- La composición inmunogénica de ADN de la reivindicación 12, en la que la citoquina comprende GM-CSF.
14.- Una composición inmunogénica de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 5, o la reivindicación 6, para su uso como una vacuna para inducir una respuesta inmunológica contra el VIH en un individuo.
15.- La composición según la reivindicación 14 para según la reivindicación 14, en el que el individuo es VIH-1 positivo.
16.- La composición según la reivindicación 14 para su uso según la reivindicación 14, en el que la vacuna comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
17.- La composición según la reivindicación 14 para su uso según la reivindicación 14, en el que la composición inmunogénica de ADN comprende además una citoquina, en la que la citoquina comprende GM-CSF.