ES2282041B1 - Mejoras introducidas en el objeto de la patente principal n es200501841 para "vectores recombinantes basados en el virus modificado de ankara (mva) como vacunas preventivas y terapeuticas contra el sida". - Google Patents

Mejoras introducidas en el objeto de la patente principal n es200501841 para "vectores recombinantes basados en el virus modificado de ankara (mva) como vacunas preventivas y terapeuticas contra el sida". Download PDF

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Abstract

Mejoras introducidas en el objeto de la patente principal n° ES200501841 para ¿Vectores Recombinantes basados en el Virus Modificado de Ankara (MVA) como Vacunas Preventivas y Terapéuticas contra el SIDA¿. Consisten en la obtención de vectores recombinantes derivados de MVA que presentan la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que los vectores diseñados para uso en humanos descritos en la patente principal, pero cuyas secuencias codificantes retrovirales son del mismo origen que las contenidas en un virus SHIV capaz de infectar a simios y de dar lugar en ellos a síntomas similares a los del SIDA. Permiten realizar una estimación del potencial como vacunas de los vectores de la patente principal inmunizando con ellos simios y evaluando la capacidad para controlar la infección que la respuesta inmune generada es capaz de conferir tras desafiar la misma mediante la inoculación del correspondiente virus SHIV patógeno.

Description

Mejoras introducidas en el objeto de la patente principal nº P 200501841 para: "Vectores Recombinantes basados en el Virus Modificado de Ankara (MVA) como Vacunas Preventivas y Terapéuticas contra el SIDA".
Ámbito de la invención
El objeto de la presente patente de adición es la mejora de la patente principal mediante la construcción de virus recombinantes basados en el virus Vaccinia Modificado de Ankara (MVA) que expresan antígenos del virus quimérico de la inmunodeficiencia de simio y humano (SHIV), válidos para ser utilizados para la inmunización de simios y poder comprobar el grado de protección que los mismos adquieren al ser infectados con el virus híbrido de VIH y SIV, SHIV. De esta manera se confirma en animales evolutivamente muy próximos a los seres humanos, susceptibles de ser infectados de forma natural por un virus similar al virus de la inmunodeficiencia humana, la eficacia como vacunas de los vectores derivados de MVA de la presente patente de adición, lo que es un indicativo de la potencialidad de los vectores homólogos, derivados de MVA, de la patente principal, como vacunas eficaces para proteger a seres humanos contra el virus de la inmunodeficiencia humana.
Estado de la técnica
Los datos de la OMS indican que en el año 2004 la enfermedad del SIDA ha causado más de 23 millones de fallecimientos, con más de 40 millones de personas infectadas y con unas predicciones de sobrepasar los 60 millones de infectados para el año 2012. Las diferencias geográficas y económicas de esta enfermedad son evidentes, pues más del 95% de los casos y el 95% de las muertes por SIDA ocurren en el tercer mundo, la mayoría de ellas en el África subsahariana y el sudeste asiático, sobre todo entre jóvenes adultos, con un incremento progresivo entre las mujeres. De entre los países desarrollados, España continúa siendo el país con mayor número de personas infectadas de la Unión Europea, con unos 150.000 casos. Si bien es cierto que una mejora en los servicios sanitarios en muchas regiones contribuiría a disminuir la velocidad de transmisión del virus, existe consenso en la comunidad internacional de la urgente necesidad en desarrollar vacunas profilácticas y terapéuticas contra el SIDA que ayuden a solucionar el problema.
El desarrollo del SIDA representa los últimos estadios de la infección por el retrovirus conocido como virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El VIH es un retrovirus que pertenece al genero Lentivirus, con un genoma de 9,8 kb. El virión contiene dos copias de ARN de banda sencilla y de polaridad positiva. En los primeros estadios de la infección, el ARN genómico, por medio de la transcriptasa en reverso o retrotranscriptasa (RT) que llega a la célula asociada al ARN viral, se convierte en ADN lineal de doble banda. Este ADN se transporta al núcleo, donde se integra en la célula hospedadora en forma de provirus, a partir del cual se transcriben los genes estructurales gag, pol y env, los genes reguladores, tat, rev, nef, y los genes accesorios vif, vpr y vpu. Los productos de la traducción de dichos genes son los siguientes:
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El producto de la traducción del gen Gag es la poliproteína precursora gag-p55 que se procesa dando lugar a la proteína matriz p17, la proteína de la cápsida p24 y las proteínas de la nucleocápsida p6 y p7.
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El procesamiento del precursor Pol da lugar a las tres enzimas víricas: la proteasa (p11), la retrotranscriptasa (p6S/S1) (RT) y la integrasa (p32), de las que la RT posee actividad de ADN polimerasa (dependiente tanto de ARN como de ADN) y actividad endonucleasa (RNasa H), ambas requeridas durante la síntesis del ADN, mientras que la integrasa está involucrada en el proceso del integración del provirus, actuando como endonucleasa.
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El producto del gen Env es una proteína de 88 kDa que está fuertemente glicosilada (gp160). Esta proteína es procesada por proteasas celulares, dando lugar a las proteínas gp120 y gp41, que permanecen unidas por uniones no covalentes en la superficie del virión. En la glicoproteína gp120 se localizan los sitios de unión a los receptores celulares, el receptor CD4 y los correceptores CXCR4 (llamado X4) y CCR5 (llamado C5). Es a esta proteína a la que se debe mayoritariamente la variabilidad genética del VIH y su capacidad para escapar a la respuesta inmune tanto humoral como celular, por ser la que está más expuesta en la superficie del virus. Por su parte, la glicoproteína gp41 o transmembrana actúa como anclaje a la membrana lipídica, localizándose en su extremo amino terminal una zona hidrófoba altamente conservada requerida para la fusión de la membrana vírica y la membrana plasmática celular durante el proceso de entrada del virus en la célula hospedadora.
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Los genes reguladores y auxiliares son codificados por seis fragmentos de lectura abierta solapante. Los genes Tat y Rev son necesarios para la replicación vírica en todas las células infectadas. El gen Tat codifica una proteína de 14 kDa que aumenta la expresión de los genes del VIH. El gen Rev codifica una proteína de 19 kDa que facilita el transporte al citoplasma de los ARNm. La proteína Nef, de 210 aminoácidos, se asocia con estructuras de membrana e induce la internalización y degradación de moléculas de CD4 en los lisosomas. El gen Vif codifica una proteína necesaria para la propagación del virus en linfocitos de sangre periférica, macrófagos primarios y algunas líneas celulares establecidas. El gen Vpr codifica una proteína de 15 kDa que se asocia con la proteína de la nucleocápsida p6. La proteína Vpu es una fosfoproteína que facilita la disociación dentro de la célula infectada de la gp160 y CD4 por degradación de la molécula CD4 en el retículo endoplásmico.
En los extremos 5' y 3' del DNA viral se encuentran la secuencias LTR (long - terminal repeats), en las que se localizan importantes regiones reguladoras y que juegan un papel primordial durante el proceso de retrotranscripción.
Se han identificado dos clases del virus: VIH-1 y VIH-2, de las que la segunda, VIH-2, parece ser menos patógena que la primera y se localiza sobre todo en la zona occidental de África. Es la forma que genera la enfermedad con mayor rapidez, VIH-1, la que se encuentra más extendida por el planeta y la que más se ha diversificado. Existen tres subtipos del VIH-1, denominados M, N y O, aunque más del 95% de todos los aislados del VIH a nivel global en la población pertenecen al subtipo M. En función de las diferencias en la secuencia de nucleótidos, en especial en la parte correspondiente a las proteínas de la envuelta (Env), este subtipo se subdivide a su vez en ocho estirpes principales, a las que se alude generalmente como clades y que se denominan con las letras A, B, C, D, F, G, H y J. Los clades B y C representan aproximadamente el 80% de las infecciones a nivel mundial, siendo el clade B el más representativo en Europa y América del Norte, mientras que el clade C es prevalente en África y Asia. Son abundantes las zonas en las que las dos clases están presentes en la población (China, India, África subsahariana), por lo que se piensa que las vacunas que contuvieran antígenos correspondientes a los dos clades, B y C, serian mucho más eficaces en dichas zonas.
Una posibilidad para el diseño de tales vacunas consiste en la generación de moléculas de ADN recombinante que contengan secuencias capaces de expresar proteínas del VIH, o fragmentos o formas de fusión de las mismas de forma que, al ser administradas a un individuo, se sintetizan dichas proteínas, fragmentos o formas de fusión de las mismas y se genera una respuesta inmune contra ella. Dichas moléculas de ADN recombinante pueden generarse a partir de genomas de virus en los que se han eliminado o inactivado regiones cuya expresión es necesaria para la replicación del virus en las células diana y/o en los que se han sustituido regiones que codifican proteínas no imprescindibles para que el virus desarrolle la parte de su ciclo vital que se desea que tenga lugar en la célula diana. En esos casos, el ADN recombinante puede administrarse en forma de partículas virales completas que facilitan la transfección del ADN recombinante a la célula diana. De entre los virus que se están utilizando como vectores, las formas modificadas del virus Vaccinia están entre los vectores virales más tentativos para ser aplicados como vacuna recombinante. Algunas de ellas, como el virus NYVAC, (cuyo genoma se representa en la parte inferior de la Figura 1), han sido generadas por mutagénesis dirigida con el resultado de la eliminación de 18 genes del virus Vaccinia (estirpe Copenhague), aproximadamente 10 kb. Otras, como el virus Vaccinia modificado de Ankara (MVA), han sido generadas de forma menos controlada; concretamente, el MVA se ha generado al haber pasado el virus por más de 570 pases seriados en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo (CEF), lográndose una perdida del 15% del genoma viral parental (1, 2) que supone deleciones en genes de los que algunos de ellos están intactos en el genoma del virus NYVAC y otros han sido delecionados en ambos vectores, existiendo también genes que permanecen intactos en el genoma del virus MVA y que presentan deleciones en el genoma de NYVAC (los genes cuyo nombre aparece en cursiva en la Figura 1). En el virus MVA, los genes estructurales del virus han permanecido inalterados, mientras que genes involucrados en la evasión del sistema inmune (3), y genes relacionados con el rango de hospedador (2, 4, 5), han sido delecionados o fragmentados. MVA produce su ciclo infeccioso completo en células CEF y en células de riñón de Hámster (BHK), mientras que en líneas celulares humanas, incluyendo las células HeLa, tiene un ciclo abortivo (6, 7). Aunque la replicación viral depende del tipo celular, el bloqueo del programa de morfogénesis en las células no permisivas ocurre en los pasos posteriores a la formación de formas virales inmaduras (IV), sin haber alteraciones de la expresión de genes virales tempranos y tardíos (8, 9). En células en cultivo, los recombinantes de MVA producen niveles similares o mayores de proteína heteróloga que los vectores derivados de la cepa silvestre del virus Vaccinia WR (Western Reserve) (9-11), lo que le hace interesante como sistema de expresión. En mamíferos, recombinantes de MVA han demostrado inducir una inmunidad protectora frente a un amplio espectro de patógenos (6, 12-16), mostrando las siguientes ventajas como vector de expresión de antígenos heterólogos:
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Alta seguridad, demostrada cuando se usó en más de 120000 individuos durante la campana de erradicación de la viruela en Alemania.
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Avirulento en una amplia variedad de animales en condiciones inmunosupresoras.
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Poca o nula reacción sistémica o local tras su inoculación en humanos, incluyendo individuos de alto riesgo.
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Alta plasticidad y estabilidad de su genoma, lo que permite introducir grandes cantidades de material génico exógeno.
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Potente inductor de una respuesta inmune eficaz frente a una gran variedad de antígenos.
Dada su seguridad y capacidad de producir protección, puede ser de gran utilidad en la generación de vacunas vivas frente a enfermedades infecciosas y en la terapia del cáncer. Como cualquier otra vacuna dirigida a seres humanos, para llevar a cabo ensayos clínicos de la posible eficacia como vacunas de vectores derivados del MVA, es necesario obtener información previa sobre su comportamiento inmunogénico y su capacidad de conferir protección en modelos animales. En el caso del SIDA, sin embargo, no es sencillo encontrar un modelo animal adecuado. Los modelos habituales para el estudio de otros diversos trastornos, como pueden ser los ratones, no sirven como modelo de infección, al no replicarse en ellos ni el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) ni el equivalente de simio, el virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV), por lo que no son modelos válidos para evaluar la capacidad protectora de la vacunación. Si es posible, sin embargo, obtener de los ratones información previa sobre el comportamiento inmunológico de los vectores en estudio que permita una evaluación previa de su posible eficacia y ayude a descartar o considerar interesante continuar con los ensayos. Además, el modelo de ratón transgénico que expresa el antígeno de histocompatibilidad humano MHC de clase I (HLA-A2) permite demostrar si la vacunación confiere presentación antigénica similar a la humana por parte del HLA-A2, que es prevalente en la población, algo que no se puede hacer, de momento, en primates, por no disponerse de primates transgénicos para dicho antígeno humano. Los estudios sobre la capacidad protectora conferida por la vacunación, sin embargo, requieren el uso de otros modelos distintos del modelo de ratón.
En esa línea, los modelos de primates no humanos se han convertido en una herramienta fundamental para evaluar en ensayos clínicos las vacunas candidatas contra el SIDA. La infección de chimpancés por el VIH-1 ha presentado grandes limitaciones como su elevado costo, su poca disponibilidad y la ausencia de síntomas clínicos. Se ha encontrado que el virus de la inmunodeficiencia de simios (abreviado frecuentemente como SIV a partir de su nombre en inglés, simian immunodeficiency virus) es un modelo mucho más útil. Se trata de un lentivirus que infecta de forma natural diversos tipos de primates. Se han descrito cinco subgrupos del mismo. La forma aislada de macacos Rhesus (Macaca mulatta), a la que se denomina SIVmac, pertenece al primero. Al igual que sucede con el VIH, su genoma se caracteriza por presentar dos secuencias LTR en sus extremos 3' y 5', en las cuales se encuentra el promotor y las secuencias reguladoras o de unión a factores transcripcionales. Presenta tres marcos de lectura abierta para proteínas estructurales: gag, pol y env; marcos de lectura abierta para genes reguladores: nef, tat y rev, y los llamados genes accesorios: vif, vpr y vpx. Los miembros del subgrupo SIVmac comparten un alto grado de homología genética con el VIH-2.
Existen puntos comunes entre los virus SIV y VIH, entre los que se encuentran el tropismo celular, la organización genómica, las características ultraestructurales, el modo de transmisión, la respuesta del hospedador a la infección y los síntomas clínicos de la enfermedad, con la salvedad de las infecciones asintomáticas. Estas características han propiciado que los modelos basados en el virus SIV sean atractivos para la evaluación de la eficacia de candidatos a vacunas y el diseño de nuevas vacunas para ensayos en humanos.
La infección por SIV se caracteriza por un máximo de viremia en las dos primeras semanas, con una disminución de los niveles virales hasta un punto que es variable y del cual dependerá la progresión de la enfermedad. El período de incubación viral es menor que en la infección por VIH. La variabilidad en la progresión de la enfermedad depende de la heterogeneidad genética de los macacos usados en los estudios, así como del virus empleado en el desafío y la ruta de exposición (intravenosa, mucosa o perinatal). Ante la infección por SIV, la respuesta del hospedador es parecida a la generada contra el VIH, pero difiere en la especificidad de los anticuerpos neutralizantes contra los antígenos de la envoltura.
El SIV presenta varias desventajas como modelo. En primer lugar, es un virus diferente al VIH; por tanto, las proteínas de la envuelta, que son el blanco fundamental de los anticuerpos neutralizantes, son muy divergentes en ambos modelos. Otro dato a añadir es que el SIV usa sólo el correceptor CCR5 para entrar en la célula, mientras que el VIH usa, además, otros correceptores como CXCR4, CCR2 o CCR3. Por esta y otras razones, la calidad y la eficacia de un candidato probado en este modelo no se considera necesariamente extrapolable a seres humanos.
Para soslayar estas desventajas, en 1991 se obtuvo por primera vez un virus híbrido entre el VIH y el SIV, al que se denominó SHIV (del inglés Simian-Human Immunodeficiency Virus) (25). Este híbrido contenía los genes env y tat del VIH y el resto del material genético del SIV. El SHIV fue capaz de infectar macacos Rhesus, aunque no era capaz de reproducir los síntomas característicos del SIDA en los animales inoculados.
Con este primer híbrido, se dispuso de un modelo de infección en macacos útil para estudios de protección contra la infección, si bien este modelo aún no permitía concluir si los candidatos a vacunas eran capaces de proteger contra la enfermedad. Unos años más tarde, a través de pasos sucesivos por macacos y en cultivo, se lograron aislar variantes agresivas del SHIV capaces no sólo de infectar macacos, sino de producir un síndrome similar al SIDA. Estas cepas, adaptadas a multiplicarse en los animales, provocan depleción en los linfocitos CD4+ y la muerte de los macacos en menos de un ano tras la inoculación. De entre estas variantes del SHIV, una de las más comúnmente utilizadas es la denominada SHIV89.6P, obtenida mediante pases seriados en macacos Rhesus del virus parental SHIV89.6, que contiene los genes gag, pol, vif, vpx, vpr y nef del virus de simio SIVmac239, mientras que los genes auxiliares tat, rev y vpu y el gen de las proteínas de la envuelta env proceden de un aislado citopático del HIV-1, el HIV89.6 (26,27). Gracias al virus SHIV89.6P y otros similares se cuenta con un modelo para evaluar la protección contra la enfermedad y la muerte conferida por posibles vacunas en desarrollo.
Gracias a este modelo, varios estudios realizados en macacos han demostrado la relevancia de recombinantes de MVA como vacuna potencial frente al VIH, especialmente cuando se utilizan en sistemas combinados de inmunización en los que se emplean dos o más dosis de vacunación separadas en el tiempo, suministrándose al menos en la primera dosis un vector diferente al de las siguientes dosis, aunque los antígenos expresados a partir de cada uno de los vectores pueden ser los mismos. Para hacer referencia a estos protocolos de vacunación en los que se suministra una primera dosis de desencadenamiento de la respuesta inmune con un vector que da lugar a la expresión de un antígeno y una o más dosis de potenciación o refuerzo de la respuesta inmune generada que contienen un vector diferente, pero que da lugar generalmente a la expresión del mismo antígeno, se emplea a menudo su denominación en inglés - prime/boost. Estos protocolos se consideran especialmente adecuados para ser aplicados para la prevención o el tratamiento de las infecciones por el virus VIH pues, por una parte, evitan la administración de formas vivas atenuadas del virus, recurriéndose sólo a la utilización de componentes del mismo; por otra parte, el uso de vectores de expresión capaces de introducirse en las células en lugar de recurrir a la administración directa de las proteínas que expresan posibilita que las proteínas que deben actuar como antígenos se encuentren presentes en el citoplasma de las células hospedadoras para que se produzca su procesamiento mediante la ruta de presentación de antígenos del MHC de clase I, lo que es necesario para desencadenar una respuesta inmune de células T, particularmente respuestas citotóxicas inmunes asociadas con linfocitos T CD8^{+}; por último, el uso de vectores diferentes en cada una de las dosis disminuye la probabilidad de que el vector de vacunación como tal sea eliminado rápidamente por el sistema inmune del hospedador, evitándose la potenciación de la respuesta inmune dirigida contra las partes constituyentes del vector que no proceden del microorganismo contra el que se busca protección.
En los estudios con macacos (12), los vectores recombinantes derivados del MVA están demostrando ser particularmente útiles para ser utilizados en protocolos combinados de inducción y potenciación de la respuesta inmune con vectores diferentes, en especial cuando el recombinante derivado del MVA se administra en la segunda y/o en alguna dosis posterior a esta y expresa, al igual que el vector utilizado en la primera dosis, múltiples antígenos de VIH y SIV (Virus de la Inmunodeficiencia de Simio). La respuesta de células T citotóxicas y de memoria generada demuestra el potencial de los recombinantes de MVA como vacunas frente al VIH (17).
Por ello, se han diseñado distintos vectores recombinantes, basados en el MVA, capaces de expresar diversos antígenos del VIH. Intentando buscar formas más eficaces para generar una respuesta protectora, se han construido vectores capaces de expresar más de una proteína de dicho virus, en ocasiones formando proteínas de fusión. Así, por ejemplo, las solicitudes de patente WO 02/072754 y WO 2004/087201 describen en general vectores derivados del MVA que expresan las proteínas Env, Gag y Pol (rMVA), considerando como una opción adicional la posibilidad de que el antígeno inmunizante incluya también secuencias de vif, vpr, tat, rev, vpu o nef, aunque sin discutir que la expresión de alguna de esas secuencias tenga gran importancia de cara a la posible respuesta de protección generada ni utilizando esa opción en las realizaciones de la invención. Aunque en dichas solicitudes internacionales se menciona que las secuencias de vif, vpr, tat, rev, vpu o nef, así como las correspondientes a env, gag y pol, pueden en general codificar sólo fragmentos de la correspondiente proteína, y/o presentar mutaciones, es una característica definitoria de la invención que se intenta proteger en dichas solicitudes internacionales que el gen env carezca de parte o de la totalidad de los nucleótidos que codifican el dominio citoplasmático de gp41. El estado de la técnica no describe específicamente la posibilidad de que la parte codificante correspondiente a la proteína gp41 se elimine en su totalidad ni discute las consecuencias que esto tendría. Si se menciona en cambio en los ejemplos de ambas solicitudes que dichas proteínas de la envuelta, gracias al truncamiento de gp41, ven facilitada su acumulación en la membrana de las células que la expresan, lo que se trata como un efecto positivo buscado. También se trata como tal la formación de partículas similares a virus VIH en las que están presentes proteínas Gag y Env y que se pueden detectar, entre otras localizaciones, en el exterior de las células en las que las correspondientes proteínas se han expresado. Respecto al lugar de inserción de las secuencias expresadas, no se menciona que éste tenga una importancia especial salvo para manifestar como positivo el hecho de que la elección del sitio de la deleción III como uno de los lugares en los que se insertan secuencias permite que el recombinante MVA siga siendo TK^{+}. Ello implica que el vector recombinante MVA descrito en dicho estado de la técnica exprese timidina quinasa y, por consiguiente, mantenga una cierta virulencia. Tampoco se discute que tenga relevancia alguna que se utilice más de un lugar de inserción para incluir en el vector las secuencias que codifican los antígenos que se desean expresar, no describiéndose pruebas para demostrar la estabilidad de dichos vectores.
La solicitud de patente WO 2004/035006 describe también vectores derivados de MVA que contienen secuencias codificantes de varias proteínas de VIH que se expresan en forma de proteínas de fusión, concretamente una fusión Gag-Pol y una fusión nef-tat, pero el enfoque es aquí diferente al de las solicitudes internacionales anteriormente comentadas: se busca que no haya empaquetamiento en proteínas virales, para lo cual la solución propuesta es que al menos una de las secuencias codificantes de proteínas del VIH esté unida a una secuencia líder heteróloga, siendo la del tPA la que se elige para las realizaciones correspondientes a vectores derivados del MVA y promoviéndose de esta manera la secreción de las proteínas sintetizadas. Para la inserción de las secuencias, además, se muestra preferencia por el sitio de la deleción III, utilizándose de nuevo en un mismo vector un segundo lugar de inserción de secuencias adicionales, el de la deleción II, para una proteína de fusión tPA-nef-tat, sin considerar que esto pueda tener consecuencias para la estabilidad del vector ni realizar experimentos para verificar que realmente sea estable. Además, la única forma considerada para la secuencia env, delta V2 env, donde posee deleciones es en la parte correspondiente a la proteína gp120, no considerándose de nuevo la posibilidad de eliminar la proteína gp41 ni las posibles consecuencias derivadas de ello.
En la patente principal, por su parte, está descrita la invención de distintos vectores recombinantes, basados en el MVA, capaces de expresar diversos antígenos del VIH, que responden a un enfoque diferente a los descritos en solicitudes anteriores. Estos vectores recombinantes derivados del MVA poseen secuencias que permiten la expresión simultánea de la proteína gp120 y de una proteína de fusión Gag-Pol-Nef. Tanto la secuencia que expresa la proteína gp120 como la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se encuentran insertadas en un mismo lugar, el correspondiente al gen de la timidina quinasa, con lo que se aumenta la estabilidad de los vectores al utilizar un único sitio de inserción con respecto a otros vectores derivados también del MVA que contienen varias secuencias codificantes de proteínas del VIH, dado que estos últimos, al llevar insertas cada una de las secuencias en un lugar diferente del MVA, pierden con facilidad los insertos presentes en ellos. Además, la utilización específica del locus de la timidina quinasa como lugar de inserción da lugar a que los vectores de la invención sean virus recombinantes derivados del MVA que presentan una mayor seguridad para ser utilizados como vacunas, por carecer de un gen, el de la timidina quinasa, involucrado en virulencia. A diferencia de lo descrito en solicitudes como WO 02/072754 y WO 2004/087201, la expresión de la proteína gp120 en ausencia de secuencias correspondientes a la proteína gp41, permite su liberación al medio extracelular pocas horas después de su síntesis en el citoplasma de la célula infectada, facilitándose con ello la inducción tanto de respuesta humoral como celular frente a esta proteína, la que mayor variabilidad presenta en su secuencia entre los distintos clades. Los recombinantes de la patente principal y de la presente patente de adición expresan al menos cuatro antígenos: Env, Gag, Pol y Nef, por considerarse que un vector que exprese esos cuatro antígenos es mucho más eficaz que vectores recombinantes capaces de expresar sólo alguno de dichos antígenos o incluso otros, por la capacidad de los antígenos elegidos para inducir respuestas celulares específicas y por la menor diversidad genética entre aislados del VIH en lo que a las secuencias de Gag, Pol y Nef se refiere. Además, se considera una característica particularmente importante de la invención la presencia de secuencias correspondientes al gen regulador nef, junto con las correspondientes a los genes estructurales gag, pol y env, pues se expresa en etapas tempranas del ciclo del VIH y la generación de una respuesta celular frente a sus productos se considera necesaria para aumentar el repertorio de defensa inmunológica contra el VIH y conseguir una respuesta protectora adecuada que permita el control inmunológico de la infección por el VIH-1. La asociación de las secuencias codificantes de gag, pol y nef se realizó en los vectores de la patente principal de forma que se generara una proteína de fusión que mantuviera todos los epítopos con capacidad para generar respuesta celular, posibilitando una mayor presentación antigénica que otros vectores que expresan fusiones que corresponden sólo a las proteínas Gag y Pol, pero generándose una proteína de fusión que no se proteoliza por acción de la proteasa viral, no da lugar a la formación de partículas virales y que, al contrario de lo que sucedía con las proteínas expresadas en otros vectores de la técnica anterior, se acumula en el citoplasma en forma de una poliproteína estable. El uso de un promotor sintético idéntico para dirigir la expresión tanto de la proteína gp120 como de la fusión Gag-Pol-Nef, promotor que se elige para que permita la expresión de las correspondientes proteínas tanto a tiempos tempranos como a tiempos tardíos durante la replicación del MVA, permite la expresión simultánea de las secuencias de la gp120 y de la proteína quimérica Gag-Pol-Nef, su acumulación a lo largo del ciclo de infección del MVA y el procesamiento antigénico de las mismas a tiempos tempranos y tardíos. La utilización para la generación de los vectores recombinantes de secuencias obtenidas específicamente de aislados naturales y que preferentemente pertenecen a los clades más representados en la naturaleza, B y C, posibilita además una vacunación mundial más representativa de la población infectada o en riesgo. Por todo ello, el uso de estos vectores para vacunación, de forma aislada o como parte de protocolos de inmunización en los que se suministran vectores codificantes de antígenos en varias dosis espaciadas en el tiempo, se ha considerado que puede ser de especial utilidad para ayudar a contener la expansión del virus VIH. Además, estos vectores derivados del virus MVA representan tanto una alternativa a construcciones similares derivadas del virus NYVAC como un complemento útil para la utilización de cada uno de los mencionados vectores recombinantes en fases diferentes de protocolos de inmunización en los que se suministra una o dos dosis para desencadenar la respuesta inmune y una o más dosis sucesivas para potenciarla, pues las pruebas realizadas hasta ahora por el grupo de los inventores muestran que, además de diferir en su genoma y en la respuesta inmune que generan en ratones frente a los antígenos del VIH gp120 y Gag-Pol-Nef, ambos vectores manifiestan un comportamiento diferencial en cultivos celulares y modelos animales (inducción de diferentes patrones de expresión de genes humanos en células HeLa, menor inducción por parte del MVA de apoptosis que el vector NYVAC, induciendo éste último mayor destrucción celular y respuesta humoral contra sí mismo (28)) que hace predecible que su comportamiento sea diferente también tras la administración a seres humanos como vacunas de vectores recombinantes generados a partir de cada uno de ellos.
Los resultados de los ensayos descritos en los Ejemplos de la patente principal demuestran la capacidad inmunogénica de los vectores de la invención descritos en ella y, en particular, de las dos realizaciones de vectores de la invención con las que se llevaron a cabo los ensayos, los vectores MVA-B y MVA-C. Sin embargo, para poder evaluar su capacidad para conferir protección para controlar la infección por el VIH, es necesario acudir a un modelo de primates no humanos, como puede ser el de los macacos Rhesus anteriormente descritos, que sean sometidos a un protocolo de desencadenamiento/potenciación de la respuesta inmune y en los que se evalúe posteriormente la capacidad para controlar la infección que la respuesta inmune generada sea capaz de conferir tras "desafiar" la misma mediante la inoculación de un virus capaz de infectar a los macacos y de dar lugar en ellos a síntomas similares a los del SIDA, desafío para el cual sería adecuada una de las variantes patogénicas del SHIV cuya existencia se mencionó anteriormente. Este tipo de ensayos, sin embargo, no pueden realizarse con los vectores de la patente principal, que expresan proteínas propias del VIH-1 y están diseñados para ser utilizados en seres humanos, sino que requieren la generación de vectores especiales que cumplan varias condiciones:
a)
contener secuencias codificantes retrovirales del mismo origen que las contenidas en el virus que vaya a utilizarse en el desafío, virus que puede ser el SHIV, de manera que la secuencia correspondiente al gen env procederá del HIV-1 mientras que las posibles secuencias correspondientes a otros genes, como puedan ser gag, pol o nef, procederán del SIV);
b)
presentar la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que los vectores diseñados para uso en humanos con los que se quieren comparar.
El cumplimiento de estas condiciones permite que el estudio sea factible y que se puedan extrapolar de sus resultados el comportamiento esperable al utilizar en seres humanos los vectores con los que se los quiere comparar. La presente patente de adición cubre la necesidad de disponer de vectores para poder valorar la capacidad protectora que podría generarse en seres humanos al ser vacunados con vectores del tipo de los descritos en la patente principal. Adicionalmente, proporciona también vectores recombinantes análogos construidos a partir de otro derivado de poxvirus, el NYVAC, para poder comparar el efecto de ambos.
Descripción de las mejoras de la invención
La presente patente de adición proporciona nuevos vectores recombinantes derivados del virus MVA capaces de expresar simultáneamente, de forma análoga a los vectores descritos en la patente principal Nº ES200501841, una forma de la proteína Env que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 y una proteína de fusión correspondiente a las proteínas Gag, Pol y Nef que no se proteoliza por acción de la proteasa del retrovirus, estando la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef bajo el control de promotores idénticos e insertadas ambas en el mismo lugar de inserción del vector. A diferencia de los vectores descritos en dicha patente principal, sin embargo, la proteína de fusión correspondiente a las proteínas Gag, Pol y Nef no se sintetiza a partir de secuencias procedentes del VIH-1, sino de secuencias procedentes del SIVmac (virus de la inmunodeficiencia de simio aislado de macacos). Ello permite su utilización en protocolos de inmunización de macacos y el posterior desafío de la inmunidad creada con un virus SHIV patógeno en el que la secuencia del gen env deriva de la de un aislado del VIH-1, mientras las secuencias correspondientes a los genes gag, pol y nef correspondan al virus de simio que infecta a macacos. De esta manera, al cumplirse la condición de que las secuencias codificantes retrovirales contenidas en los vectores de la presente patente de adición tengan su origen en el mismo tipo de virus que las presentes en el retrovirus que vaya a utilizarse en el desafío, la inmunidad generada frente a las proteínas sintetizadas a partir de dichos vectores podrá servir para controlar la infección desencadenada por el retrovirus que se inocule en el desafío.
Para que tenga sentido el establecimiento de paralelismos entre los resultados observados en macacos y los que podrían esperarse en seres humanos, los vectores descritos en la presente patente de adición cumplen la condición de presentar la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que los vectores diseñados para uso en humanos con los que se quieren comparar, es decir, los vectores descritos en la patente principal Nº ES200501841. De acuerdo con ello, de forma análoga a los vectores de dicha patente principal, la expresión de la proteína Env sintetizada a partir de los vectores de la presente patente de adición da lugar a proteínas gp120 no asociadas a proteínas gp41 o a fragmentos de la misma, facilitándose con ello su salida de la célula y su liberación al medio, lo que hace más probable la activación de las células B y la producción de anticuerpos neutralizantes frente al VIH. En las realizaciones preferidas de la invención, la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env que forma parte de los vectores de la invención codifica una proteína gp120 completa, habiéndose delecionado toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp120, eliminando con ello, la totalidad de la secuencia codificante correspondiente a la proteína gp41. Un esquema referente a la secuencia de la proteína Env que forma parte de los vectores de la presente patente de adición se muestra en la parte superior de la Figura 3. Es el último gráfico el que corresponde a la secuencia de una proteína gp120 expresada a partir de vectores de la invención, en la que se ha eliminado la totalidad de la secuencia codificante correspondiente a la proteína gp41, mientras los gráficos previos representan proteínas de la envuelta con secuencias correspondientes a la proteína gp41.
En cuanto a la proteína de fusión de Gag, Pol y Nef, también de forma análoga a la proteína homóloga sintetizada a partir de los vectores de la patente principal, está diseñada de manera que no dé lugar a la formación de partículas similares a partículas virales. La forma utilizada para la construcción de las realizaciones de la invención que se describen con detalle en la presente memoria se acumula en el citoplasma de las células infectadas con los vectores recombinantes de la invención en forma de poliproteína, sin experimentar el procesamiento característico del virus VIH provocado por la proteasa viral que daría lugar a su escisión en proteínas más pequeñas, aunque posteriormente sí va a experimentar el procesamiento celular que permite la presentación de péptidos antigénicos de la proteína de fusión y la generación de una respuesta inmune contra los mismos.
Tal como se ha comentado anteriormente, la utilidad principal de los vectores de la presente patente de adición es la de ser utilizados en protocolos de inmunización para extraer datos sobre la posible utilidad como vacunas de vectores diseñados para ser administrados a seres humanos, que deben tener la misma estructura de organización génica, promotores y sitio de inserción. Es por ello que las realizaciones equivalentes a las realizaciones preferidas de los vectores de la patente principal (exceptuando las que se refieren a aislados del VIH-1 como origen preferido de las secuencias codificantes de las proteínas Env y Gag-Pol-Nef) son también realizaciones preferidas de los vectores de la presente patente de adición. Así, se prefiere especialmente que el lugar del vector en el que se encuentran insertadas la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef sea el gen de la timidina quinasa, gen relacionado con la virulencia que queda inactivado por la presencia de las secuencias en él insertadas, aumentándose con ello la seguridad de los vectores.
En las realizaciones preferidas, la secuencia codificante de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se genera a partir de secuencias de proteínas Gag, Pol y Nef para las que se deduce una secuencia de ADNc utilizando codones de lectura frecuentes en mamíferos, buscando con ello aumentar los niveles de expresión de la proteína de fusión. Además, en la secuencia codificante de la proteína de fusión se han provocado modificaciones respecto a las secuencias naturales, para aumentar su inmunogenicidad y su seguridad. Las modificaciones por las que se tiene mayor preferencia incluyen la inactivación por mutagénesis del lugar activo de la proteasa y la eliminación mediante deleción del lugar activo de la integrara, la realización de deleciones en el gen nef y su inserción en la región codificante de la RT, la traslocación del lugar activo de la RT al extremo C-terminal de la proteína de fusión y la fusión de la secuencia del gen gag en fase de lectura con pol-nef, creando una desviación de una fase de lectura e introduciendo un cambio de glicina a alanina para prevenir la formación de partículas semejantes a virus. De entre ellas, se prefiere específicamente las modificaciones realizadas para generar la secuencia correspondiente a la proteína de fusión descritas por Didierlaurent A. et al. (18). Un esquema de los elementos que conforman una proteína de fusión Gag-Pol-Nef que cumple todas estas características se muestra en la zona inferior de la Figura 3, marcada como GagPolNef (gpn).
En las realizaciones preferidas de la invención, el promotor se escoge de manera que permitan la expresión de la proteína Env y de la proteína de fusión Gag-Pol-Env tanto en etapas tempranas como tardías del ciclo infectivo del virus MVA. El promotor sintético temprano/tardío de poxvirus pE/L (19) es la opción elegida para las realizaciones más preferidas de la invención, aunque cualquier otro promotor de poxvirus podría utilizarse igualmente para la construcción de vectores de la invención.
La patente principal describe la construcción de dos vectores que suponen sendas realizaciones de vectores de la invención descrita en dicha patente que cumplen todas las características preferidas mencionadas, los vectores denominados MVA-B y MVA-C. En ellos, la secuencia correspondiente a la proteína Env se encuentra insertada en sentido opuesto con respecto al sentido de la transcripción de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef, encontrándose los promotores correspondientes a cada una de las secuencias correspondientes a proteínas del VIH insertados en orientaciones opuestas y en la zona más interna del inserto. Para poder extraer datos sobre la posible protección que estos vectores conferirían a seres humanos vacunados con ellos, en la presente patente de adición se describe la construcción de un vector, obtenido igualmente a partir del MVA, que posee, igualmente insertado en el locus de timidina quinasa, un inserto que comprende la secuencia codificante de una proteína de fusión Gag-Pol-Nef generada a partir de secuencias del virus SIVmac en la que se han realizado todas las modificaciones antes mencionadas, detalladas en la publicación de Didierlaurent et al. (18) y bajo el control de un promotor sintético temprano/tardío pE/L, así como la secuencia codificante de una proteína gp120, procedente de un virus VIH-1, que carece totalmente de parte codificante correspondiente a la proteína gp41, igualmente bajo el control de un promotor sintético temprano/tardío pE/L, estando los promotores correspondientes a cada una de las secuencias correspondientes a proteínas del VIH insertados en orientaciones opuestas y en la zona más interna del inserto: A los vectores que cumplen estas características se les ha denominado, de forma general MVA-SHIV.
Para realizar el desafío posterior a la administración del vector de la presente patente de adición cuya construcción se describe, se ha elegido el virus quimérico de simio y humano SHIV89.6P. Por ello, para poder realizar los experimentos de valoración de la protección conferida por la inmunización con el vector en condiciones óptimas, se ha construido un vector MVA-SHIV cuyo genoma contiene un inserto del que forman parte tanto la secuencia codificante de la proteína 89.6P-gp120, es decir, una secuencia correspondiente a la proteína Env del virus SHIV89.6P (originariamente procedente del aislado 89.6 de VIH-1), modificada para que carezca totalmente de la parte correspondiente a la proteína gp41, como secuencias codificantes de los antígenos Gag, Pol y Nef de dicho virus SHIV89.6P (originariamente procedentes del virus de la inmunodeficiencia de simio, aislado de macacos, SIVmac239), a partir de las cuales se ha generado la secuencia correspondiente a la proteína de fusión SIVgpn realizando en ellas las modificaciones preferidas de la invención. Es por ello que al vector construido de esta manera se le denomina específicamente MVA-89.6P-SIVgpn o, de forma más detallada, MVA-gp120-HIV89.6p-SIVmac239-gag-pol-nef.
De forma análoga a los Ejemplos descritos en la patente principal, para la realización de los Ejemplos encaminados a valorar la capacidad inmunogénica de los vectores de la presente patente de adición y, por añadidura, su capacidad para conferir protección frente a infecciones causadas por el SHIV, se ha considerado adecuado disponer también de un control positivo con el que evaluar los resultados obtenidos con el vector MVA-SHIV. Al igual que en la patente principal se utilizaron para tal finalidad vectores recombinantes derivados de NYVAC, NYVAC-B y NYVAC-C, que contenían los mismos insertos que los correspondientes vectores MVA-B y MVA-C, se ha generado también un vector derivado de NYVAC, con la misma estructura de organización génica, sitio de inserción en el genoma viral (el locus de timidina quinasa, TK) y los mismos promotores sintéticos tempranos/tardíos, situados en igual disposición que en el vector MVA-SHIV y en los correspondientes vectores homólogos para uso en humanos, NYVAC-B y NYVAC-C. A los vectores que cumplen estas características se les ha denominado, de forma abreviada, NYVAC-SHIV. De nuevo, teniendo en cuenta el origen de las secuencias presentes en su inserto, al vector concreto cuya construcción se describe se le ha denominado NYVAC-89.6P-SIVgpn o, de forma más detallada, NYVAC-gp120-HIV89.6-SIVmac239-gag-pol-nef. Dada su utilidad como control positivo en los ensayos que constituyen la utilidad principal de los vectores MVA-SHIV de la presente patente de invención, los vectores del tipo NYVAV-SHIV están también comprendidos dentro del alcance de la presente invención.
La presente patente de adición se refiere también a composiciones que contienen dichos vectores recombinantes y a su uso para valorar la respuesta inmunológica y la capacidad protectora frente a la infección por el VIH desencadenada por vectores con la misma estructura de organización de genes, promotores y sitio de inserción que se pretendan utilizar para la vacunación de seres humanos. La realización preferida de esa forma de utilización de los vectores de la invención consiste en administrárselos a simios, preferiblemente a macacos Rhesus (Macaca mulatta), en los que se evaluará la respuesta inmunológica producida y la capacidad protectora generada tras dicha administración, sometiéndolos posteriormente a un desafío con un SHIV patógeno. Así se obtiene información relevante para valorar si los resultados indican que merece la pena llevar a cabo la siguiente fase de ensayos clínicos en seres humanos con los vectores homólogos previstos para la vacunación de seres humanos, así como sobre el procedimiento adecuado para realizar dichos ensayos. Preferiblemente, el protocolo que se siga para la administración de los vectores de la presente patente de adición responderá al esquema que se tenga previsto seguir para la vacunación de seres humanos o un esquema del cual se desee evaluar su grado de adecuación. Según esto, la generación de la respuesta protectora se puede conseguir mediante la administración únicamente de vectores de la presente patente de invención, en una única dosis o en dosis separadas en el tiempo, o como parte de un protocolo de inmunización en el que, en distintas dosis, se administran vectores diferentes que expresan todos ellos antígenos del SHIV. Cuando se utilizan protocolos en el que el desencadenamiento de la respuesta inmune (priming) se produce mediante la administración de una o más dosis de un primer vector de inmunización y la potenciación o reforzamiento de la respuesta (boosting) se produce mediante la administración de una o más dosis de un vector diferente, los vectores de la presente patente de adición pueden formar parte de la(s) dosis inicial(es) que desencadena(n) la respuesta o de una o más dosis posteriores destinadas a potenciar la respuesta previamente generada. Dado que los vectores derivados de MVA parecen ser de mayor utilidad para conseguir una respuesta de protección frente al VIH cuando se suministran en la segunda o en dosis sucesivas destinadas al refuerzo de la respuesta inmune previamente desencadenada, se prefiere que los vectores recombinantes derivados del MVA de la presente patente de adición estén presentes al menos en una dosis de vacunación posterior a la primera o posterior a la segunda, pudiendo estar ausente o presente de la(s) primera(s) dosis de vacunación. En los casos en los que al menos un vector derivado de MVA está presente en la segunda dosis y/o en una dosis posterior de vacunación, se prefiere que al menos un vector administrado en la primera dosis de vacunación sea capaz de expresar las mismas proteínas derivadas del VIH que el vector de la presente patente de adición que sea administrado en
otra(s) dosis diferente(s). Son realizaciones preferidas del uso de los vectores de la invención para evaluar la eficacia de candidatos a vectores de vacunación diseñados para su uso en seres humanos y/o la de protocolos de vacunación para seres humanos aquellas en las que la primera y, opcionalmente, la segunda dosis de vacunación, contienen un vector de ADN desnudo que expresa los mismos antígenos del SHIV que los vectores de la presente patente de adición, mientras que en las dosis posteriores de vacunación (que, preferiblemente, no serán más de dos) está presente al menos un vector de la presente patente de adición.
La construcción de vectores de la presente patente de invención y el uso de los mismos para la evaluación de su capacidad inmunogénica y protectora se describe con más detalle con ayuda de las Figuras y los Ejemplos que aparecen más adelante en la presente memoria de patente de adición.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un esquema de los mapas de los genomas de los virus MVA (parte superior) y NYVAC (parte inferior), en los que la localización de los genes fragmentados se indica mediante un sombreado oscuro, indicándose su denominación inmediatamente debajo. Los nombres subrayados corresponden a denominaciones de genes delecionados en MVA e intactos en NYVAC, los nombres en negrita corresponden a denominaciones de genes delecionados tanto en MVA como en NYVAC y los nombres en cursiva corresponden a denominaciones de genes intactos en MVA y que presentan deleciones en NYVAC. Las letras A a Q situadas sobre cada una de las representaciones de los genomas se refieren a la denominación de los distintos fragmentos de restricción generados por la enzima HindIII al digerir con ella el ADN genómico de MVA y NYVAC. RTI: región terminal izquierda; RCC: región central conservada; RTD: región terminal derecha.
La Figura 2 muestra un esquema de la organización del genoma del virus quimérico de la inmunodeficiencia de simio y humano SHIV89.6P. Las secuencias representadas por rectángulos rellenos provienen del genoma del virus de simio SIVmac239, mientras que las secuencias representadas por rectángulos sin relleno provienen del genoma del aislado 89.6 del virus VIH-1.
La Figura 3 muestra la estructura de las secuencias codificantes de antígenos de retrovirus presentes en los vectores de la presente patente de adición. La parte superior, encabezada por la abreviatura "Env" corresponde a distintas formas de la secuencia correspondiente a la proteína de la envuelta, de las que la última, la marcada como "C-env-120", representa la presente en los vectores de la invención, carente por completo de la parte correspondiente a la proteína gp41. La parte inferior muestra el esquema correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef sintetizada a partir de los vectores cuya construcción se describe en los Ejemplos, indicándose las modificaciones realizadas sobre las secuencias deducidas a partir de las proteínas del SHIV89.P, generadas deduciendo la secuencia de tripletes correspondientes a las secuencias de aminoácidos de las proteínas utilizando para ello los codones más frecuentes en mamíferos, secuencias sobre las cuales se realizaron como modificaciones principales las siguientes: la secuencia correspondiente al antígeno Gag que incluye las proteínas de la matriz (MA), la cápsida (CA), p2 y p7 se ligó respetando el marco de lectura (en el punto marcado como FS-1) con la secuencia correspondiente al antígeno Pol que carecía de dominio integrasa; además, el sitio activo de la transcriptasa en reverso (RT) fue reemplazado por un gen nef en el que se había alterado el orden de los aminoácidos (sc-nef), de manera que la zona que de forma natural contiene el extremo carboxilo (RT-C) fuera la parte inicial, mientras la zona que de forma natural contiene el extremo amino (RT-A) pasó a ser la zona final; la secuencia de RT que solapa con el sitio activo (sitio activo, RT) se traslocó respetando el marco de lectura al extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína de fusión; adicionalmente, la glicina del extremo amino se sustituyó por alanina (\DeltaMyr (G \rightarrow A)) para impedir su miristilación, mientras se anulaba la actividad enzimática de la proteasa (X_{PR}) introduciendo una mutación puntual en su sitio activo (\DeltaPRr
(D \rightarrow N)).
La Figura 4 muestra un esquema de la construcción del vector plasmídico de transferencia pLZAW-1-89.6P-SIVgpn-18 y de los plásmidos a partir de los cuales se genera. La Figura 4a muestra los pasos que conducen a la obtención del vector pLZAW-1-89.6P-9; la Figura 4b muestra los pasos que conducen a la obtención del vector pLZAW-1-89.6P-SIVgpn-18 a partir del vector pLZAW-1-89.6P-9. En ambos casos la parte correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef, denominada posteriormente "SIVgpn" se indica en la Figura como "SIVsyngagpolnef", mientras la parte correspondiente a la proteína de la envuelta, denominada posteriormente 89.6gp120, aparece indicada como "89.6Psynenv120".
La Figura 5 muestra los fragmentos generados en el análisis por PCR del locus de timidina quinasa (TK) del virus MVA-89.6P-SIVgpn. La parte superior de la figura, marcada como "A" muestra un esquema en el que se representan las posiciones de apareamiento de los oligonucleótidos utilizados como cebadores respecto a los brazos izquierdo (TK-L) y derecho (TK-D) del locus TK, así como los tamaños estimados de los fragmentos que se generan en la PCR realizada utilizando como molde el virus MVA-89.6P-SIVgpn (primera línea del gráfico) o el virus MVA sin inserto (línea inferior del gráfico, situada en la zona marcada como "WT"). La parte inferior, marcada como "B", muestra la fotografía del gel obtenido al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con los cebadores TK-L y TK-R2 sobre ADN extraído de células infectadas con MVA-WT (calle 3), el stock P2 del MVA-89.6P-SIVgpn (calle 4), el stock P3 del MVA-89.6P-SIVgpn (calle 5) o transfectadas con el plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 (control positivo, C+) (calle 2). La calle 1 corresponde a un marcador de tamaño.
La Figura 6 muestra los resultados del análisis por transferencia tipo Western de la expresión de los genes heterólogos 89.6p-gp120 (parte superior de la figura, marcada como "anti-gp120", en la que la posición de la proteína se indica mediante la flecha etiquetada como "89.6P") y SIVgpn (parte inferior de la figura, marcada como "anti-SIVp27", en la que la posición de la proteína SIVgpn se indica mediante la flecha etiquetada como "GPN") detectada en extractos de células transfectadas de forma transitoria con el plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 (segunda calle, marcada como "C+") o en extractos de células infectadas con los stocks P1 (tercera calle, marcada como "P1"), P2 (cuarta calle, marcada como "P2") y P3 (quinta calle, marcada como "P3") del virus MVA-89.6P.SIV-gpn, o desde células tratadas en las mismas condiciones pero que no habían entrado en contacto ni con el plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 ni con ningún stock de virus (cultivos de células en las que se simuló la infección, analizadas en la primera calle, marcada como "M").
La Figura 7 muestra, en la parte superior, los resultados de las inmunotinciones de células CEF infectadas con el vector MVA-89.6P-SIVgpn y tratadas con anticuerpos anti-WR (que reconoce la parte del vector derivada de MVA) (fotografía de la izquierda), anti-gp120 (fotografía central) y anti-SIVp27 (que reconoce la parte de la proteína SIVgpn correspondiente a la proteína p27) fotografía de la derecha), mientras en la parte inferior aparece un gráfico en el que se representan los porcentajes de las placas teñidas con cada uno de los anticuerpos calculados con respecto al total de placas teñidas con el anticuerpo anti-WR.
La Figura 8 muestra los fragmentos generados en el análisis por PCR del locus TK del virus NYVAC-89.6P-SIVgpn. La parte superior de la figura, marcada como "A", muestra un esquema en el que se representan las posiciones de apareamiento de los oligonucleótidos utilizados como cebadores respecto a los brazos izquierdo (TK-L) y derecho (TK-R) del locus TK, así como los tamaños estimados de los fragmentos que se generan en la PCR realizada utilizando como molde el virus NYVAC-89.6P-SIVgpn (primera línea del gráfico) o el virus NYVAC sin inserto, (línea inferior de la parte del gráfico marcada como "NYVAC-WT"). La parte inferior, marcada como "B", muestra la fotografía del gel obtenido al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con los cebadores TK-L y TK-R2 sobre ADN extraído de células infectadas con NYVAC-WT (calle 2), el stock P3 del NYVAC-89.6P-SIVgpn (calle 3), el stock P3 del MVA-89.6P-SIVgpn (calle 4) o el virus MVA-WT, que carece de inserto (calle 5). La calle 1 corresponde a un marcador de tamaño
La Figura 9 muestra los resultados del análisis por transferencia tipo Western de la expresión de los genes heterólogos 89.6p-gp120 (parte superior de la figura, marcada como "anti-gp120", en la que la posición de la proteína se indica mediante la flecha etiquetada como "89.6P") y SIVgpn (parte inferior de la figura, marcada como "anti-SIVp27", en la que la posición de la proteína SIVgpn se indica mediante la flecha etiquetada como "GPN") detectada en extractos de células infectadas con los stocks P1 (calle 3), P2 (calle 4) y P3 (calle 5) del vector NYVAC-89.6P-SIVgpn, con el stock P3 del vector MVA-89.6P-SIVgpn (calle 2) o en extractos de células tratadas en las mismas condiciones pero que no habían entrado en contacto con ningún stock de virus (cultivos de células en las que se simuló la infección, analizadas en la calle 1).
La Figura 10 muestra, en la parte superior, los resultados de las inmunotinciones de células CEF infectadas con el vector NYVAC-89.6P-SIVgpn y tratadas con los anticuerpos anti-WR (fotografía de la izquierda), anti-gp120 (fotografía central) y anti-SIVp27 (fotografía de la derecha), mientras en la parte inferior aparece un gráfico en el que se representan los porcentajes de las placas teñidas con cada uno de los anticuerpos calculados con respecto al total de placas teñidas con el anticuerpo anti-WR.
La Figura 11 muestras fotografías de transferencias tipo Western de geles de poliacrilamida en los que se había sometido a electroforesis extractos de células infectadas con diferentes stocks P3 de los virus NYVAC-89.6P-SIVgpn (calles 1 y 2, correspondientes, respectivamente a los stocks P3.1 (29/01/04) y P3.2 (25/02/04)) y MVA-89.6P-SIVgpn (stocks P3 del 20/06/03 (calle 3), P3 del 20/09/04 (calle 4), P3.1 del 20/09/04 (calle 5) y P3.2, del 1/10/04 (calle 6). La calle 7 corresponde a un extracto de células en las que se había simulado la infección. La fotografía de la izquierda corresponde a la incubación con un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120; la posición de la proteína 89.6P-gp120 se indica mediante una flecha marcada como "89.6P". La fotografía de la derecha corresponde a la incubación con un anticuerpo monoclonal anti-SIV-gag-p27, que reconoce la proteína SIVgpn, cuya posición en el gen se indica mediante una flecha marcada como "SIVgpn".
La Figura 12 muestra un esquema del estudio realizado en macacos para evaluar la inmunogenicidad y eficacia como vacunas frente el SHIV de los vectores derivados de poxvirus de la presente patente de adición, en el que están marcados los distintos eventos. Los números situados debajo de la segunda línea horizontal indican el tiempo transcurrido, en semanas, desde el comienzo del estudio. El punto 0 corresponde al de inoculación del primer vector de vacunación. Las flechas gruesas indican los momentos en los que se inoculó a los macacos bien un vector de vacunación, bien un virus capaz de producir infección, según se indica en la línea inferior: ADN: inoculación de DNA-SHIV, es decir, dos plásmidos desnudos con insertos correspondiente a secuencias codificantes de proteínas del SHIV89.6P, Env (pcDNA-gp120 89.6p) y SIVgpn (pcDNA-gag-pol-nef) (grupos 1 y 2), o del plásmido desnudo carente de inserto DNA-emp (grupo 3), NYVAC vs MVA: inoculación de los vectores derivados de poxvirus NYVAC-89.6P-SIVgpn (grupo 2), MVA-89.6P-SIVgpn (grupo 1) o del vector NYVAC tipo silvestre, carente de inserto con secuencias codificantes de proteínas del SHIV89.6P (grupo 3); DESAFÍO: inoculación del virus patógeno quimérico SHIV89.6P. Las flechas delgadas, marcadas como "CMI", indican los momentos en los que se extrajeron de los macacos muestras de sangre periférica.
La Figura 13 muestra, en escala logarítmica, el número de células SFC (spot forming cells) que expresaban IFN-y obtenido por cada 10^{6} células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en muestras procedentes de cada uno de los macacos incluidos en el estudio de eficacia de la vacunación. Los números que aparecen en el eje de abscisas indican, en semanas, el momento en el tiempo en el que fueron tomadas cada una de las muestras, tomando como tiempo 0 el momento de la administración de la primera dosis de vacunación. Para cada valor de tiempo, aparecen tres grupos de valores, que presentan el comportamiento de cada uno de los 7 animales utilizados en el estudio con un procedimiento de inmunización concreto: la primera vertical de puntos, marcados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba (\blacklozenge) corresponde a muestras tomadas de cada uno de los macacos del grupo 1 (inmunizados con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn); la segunda vertical de puntos, marcados mediante cuadrados cuyos vértices determinan dos líneas paralelas (\blacksquare), corresponde a muestras tomadas de cada uno de los macacos del grupo 2 (inmunizados con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn); la tercera vertical de puntos, marcados mediante círculos 100, corresponde a muestras tomadas de cada uno de los macacos del grupo 3 (inmunizados con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT). Cada punto representa el valor obtenido para un macaco concreto, mientras los rectángulos situados en cada una de las verticales indican el valor medio correspondiente a todos los macacos de ese grupo para las muestras tomadas en un mismo momento en el tiempo. La presencia de un número de puntos inferior a 7 en algunas verticales indica que el punto situado sobre el eje de abscisas representa a más de un macaco, en cada uno de los cuales el valor de las SFC detectadas por cada 10^{6} PBMC analizadas no fue superior a 1. La línea punteada indica el valor por debajo del cual los valores no se consideran significativos (20 SFC). Las flechas blancas indican la inoculación de un vector de vacunación; la flecha negra indica el momento en el que se produjo el desafío mediante la inoculación del SHIV89.6P.
La Figura 14 muestra, en escala logarítmica, los valores medios de SPF que expresaban IFN-\gamma obtenidos, por cada 10^{6} PBMC analizadas, para cada grupo de macacos a lo largo del tiempo de estudio, tiempo que se expresa en semanas en el eje de abscisas, correspondiendo el tiempo 0 al momento de la administración de la primera dosis de vacunación. Las flechas con relleno punteado indican los momentos en los que se administraron dosis de vacunación. La flecha con relleno oscuro continuo indica el momento en el que se produjo el desafío mediante la inoculación del virus SHIV89.6P. Los datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba (\rombonegrotachado) corresponden al grupo 1 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn); los datos indicados mediante cuadrados cuyos vértices determinan dos líneas paralelas (\cuadradonegrotachado) corresponden al grupo 2 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn). Los datos indicados mediante triángulos 101 corresponden al grupo 3 (inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT).
La Figura 15 muestra, en escala logarítmica, los valores medios de SPF que expresaban IL-2 obtenidos, por cada 10^{6} PBMC analizadas, para cada grupo de macacos a lo largo del tiempo de estudio, tiempo que se expresa en semanas en el eje de abscisas, correspondiendo el tiempo 0 al momento de la administración de la primera dosis de vacunación. Las flechas con relleno punteado indican los momentos en los que se administraron dosis de vacunación. La flecha con relleno oscuro continuo indica el momento en el que se produjo el desafío mediante la inoculación del virus SHIV89.6P. Los datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba (\rombonegrotachado) corresponden al grupo 1 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn); los datos indicados mediante cuadrados cuyos vértices determinan dos líneas paralelas (\cuadradonegrotachado) corresponden al grupo 2 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn). Los datos indicados mediante triángulos 101 corresponden al grupo 3 (inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT).
La Figura 16 muestra, en escala logarítmica, los valores medios de SPF que expresaban IL-4 obtenidos, por cada 10^{6} PBMC analizadas, para cada grupo de macacos a lo largo del tiempo de estudio, tiempo que se expresa en semanas en el eje de abscisas, correspondiendo el tiempo 0 al momento de la administración de la primera dosis de vacunación. Las flechas con relleno punteado indican los momentos en los que se administraron dosis de vacunación. La flecha con relleno oscuro continuo indica el momento en el que se produjo el desafío mediante la inoculación del virus SHIV89.6P. Los datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba (\rombonegrotachado) corresponden al grupo 1 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn); los datos indicados mediante cuadrados cuyos vértices determinan dos líneas paralelas (\cuadradonegrotachado) corresponden al grupo 2 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn). Los datos indicados mediante triángulos 101 corresponden al grupo 3 (inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT).
La Figura 17 corresponde a la valoración de la viremia en los tres grupos en estudio. El gráfico superior corresponde al grupo 3, inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT. Los gráficos inferiores corresponden a los grupos que recibieron vectores derivados de poxvirus: el gráfico de la parte inferior izquierda corresponde al grupo 1, inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn; el gráfico de la parte inferior derecha corresponde al grupo 2, inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn. Cada línea que conecta puntos representa un macaco. Cada punto marcado con un símbolo representa las copias de ARN del SHIV89.6P, detectadas mediante QC RNA-PCR, en la muestra de plasma de ese macaco tomada en la semana que se indica en el eje de abscisas. El tiempo 0 corresponde al momento de inoculación del virus SHIV89.6P.
La Figura 18 muestra la concentración, por microlitro de sangre, de células CD4+ (puntos marcados mediante círculos sin relleno, \cirblancotachado) y de células CD8+ (puntos marcados mediante triángulos sin relleno, \triblancotachado) detectadas por FACS mediante el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra cada uno de estos tipos de células. Cada grupo de puntos corresponde a los valores obtenidos en las muestras de un macaco diferente, extraídas en el momento en el tiempo que se indica, expresado en semanas, en la parte superior de los gráficos. El tiempo 0 corresponde al momento de inoculación del virus SHIV89.6P, indicado mediante la abreviatura "desf.". Los gráficos superiores corresponden a macacos del grupo 1, inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn. Los gráficos intermedios corresponden a macacos del grupo 2, inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn. Los gráficos inferiores corresponden a macacos de grupo 3, inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT. El último gráfico, carente de puntos indicativos de valores, marcado como "D7 98028 (euth)", corresponde a un macaco que hubo de ser sacrificado debido al avanzado estado de la enfermedad que el virus SHIV89.6P inoculado desencadenó en él.
La Figura 19 muestra, en ordenadas, el porcentaje de supervivencia de los macacos que componían cada uno de los grupos según las semanas transcurridas desde el momento de la infección con el virus SHIV89.6P, que se indican en abscisas, correspondiendo el tiempo 0 al de inoculación de dicho virus. Los datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba (\rombonegrotachado) corresponden al grupo 1 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn); los datos indicados mediante cuadrados cuyos vértices determinan dos líneas paralelas (\cuadradonegrotachado) corresponden al grupo 2 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn). Los datos indicados mediante triángulos 101 corresponden al grupo 3 (inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT).
Ejemplos Construcción de los vectores Ejemplo 1 Generación del MVA-89.6P-SIVgpn Construcción del vector plasmídico pLZAW1-89.6p-SIVgpn-18
El vector plasmídico de transferencia pLZAW1-89.6p-SIVgpn-18 fue construido por los inventores para la generación de los virus recombinantes derivados de MVA y de NYVAC que expresan la parte correspondiente a la proteína gp 120 del gen Env del SHIV 89.6P (89.6Psynenv120, a la que en lo sucesivo se aludirá de forma abreviada como 89.6P-gp120) y la quimera de los genes Gag, Pol y Nef del mismo virus (SIVmac239-gagpolnef, a la que en lo sucesivo se aludirá de forma abreviada como SIVgpn), esta última a partir de una secuencia de nucleótidos obtenida a partir de las secuencias de los genes Gag, Pol y Nef del virus SHIV89.6P en las que se habían practicado las mismas modificaciones que se realizaron para obtener las quimeras de los genes Gag, Pol y Nef presentes en los vectores MVA-B y MVA-C descritos en la patente principal y utilizados en los ensayos comentados en los Ejemplos de dicha patente principal.
El plásmido pLZAW1-89.6p-SIVgpn-18 es un derivativo de pUC diseñado para la selección de placas azules/blan-
cas y la generación, como medida de seguridad, de un vector viral carente del marcador \beta-Gal, al igual que se hizo en el caso de los vectores MVA-B y MVA-C, como medida de seguridad. Contiene las secuencias flanqueantes derecha (TK-R) e izquierda (TK-L) del gen de la timidina quinasa (TK) del MVA, una repetición corta de la secuencia flanqueante izquierda ("brazo izquierdo") del gen TK, el promotor E3L dirigiendo la expresión del marcador de selección \beta-galactosidasa, y el gen de resistencia a ampicilina (AP). Entre las dos secuencias flanqueantes se encuentran las dos secuencias que se desea expresar, 89.6P-gp120 (SEQ ID NO: 3) y SIVgpn (SEQ ID NO: 4), que han sido modificadas para optimizar el uso de codones de mamífero. Para dirigir la expresión de cada una de las secuencias hay sendos promotores sintéticos temprano/tardío (pE/L), situados en orientación opuesta en la zona del inserto más alejada de las secuencias flanqueantes. La posición de cada uno de los componentes incluidos en el plásmido se describe a continuación en la Tabla 1.
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TABLA 1 Posición de los componentes del plásmido pLZAW1gp120B/gagpolnefB-1
1 
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Para la construcción de este plásmido se utilizaron otros dos plásmidos diferentes:
- pcDNA89.6P-syn-CD5-GP120REKR: (proporcionado por Ralf Wagner, Regensburg, Alemania).
- pCR-ScriptSIV-syn-gagpolnef: (proporcionado por Ralf Wagner, Regensburg, Alemania).
- pLZAW1: El plásmido fue proporcionado por Linong Zhang, del grupo Aventis, Canadá. Es un plásmido basado en pUC que contiene un brazo izquierdo del gen de TK, sitios de clonación para insertar genes exógenos, una repetición corta del brazo izquierdo el gen de TK, un promotor E3L dirigiendo la expresión de un casete con \beta-gal y un brazo derecho del gen de TK.
- pJR101: El plásmido fue generado por los inventores. Es un derivado de pUC que contiene las secuencias flanqueantes derecha e izquierda del locus HA del virus MVA, sitios de clonación para insertar genes exógenos bajo el control de la transcripción del promotor sintético temprano/tardío (E/L), y el promotor 7.5 del virus MVA (P7.5) dirigiendo la expresión del gen \beta-gus.
La construcción del plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 a partir de estos otros dos plásmidos se representa en las Figuras 4a y 4b. Brevemente, un fragmento de ADN de 1,518 Kb que contenía el gen 89.6P-gp120 (indicado en la figura como 89.6synenv120) se escindió del plásmido pcDNA89.6P-syn-CD5-GP120REKR mediante digestión con EcoRI, tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para generar extremos romos, y digestión con BamHI. El fragmento de ADN se subclonó en el vector pJR101 (previamente digerido con las endonucleasas de restricción SmaI y BamHI), generando el plásmido pJR-89.6P-18 (7918 pb). Un fragmento de ADN de 1,612 kb que contenía el promotor sintético temprano/tardío (E/L) dirigiendo al gen 89.6-gp120 se escindió del plásmido pJR-89.6P-18 mediante digestión con HindIII y BamHI, seguida de la modificación con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y se clon en el vector pLZAW1 (previamente digerido con la endonucleasa de restricción AscI, modificado mediante la incubación con el fragmento Klenow, y desfosforilado mediante incubación con la fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIP)), generando el vector plasmídico pLZAW 1-89.6P-9 (9131 pb) (Figura 4a).
Por otra parte, un fragmento de ADN de 4,230 kb que contenía el gen SIVgpn (indicado en las Figuras como SIVsyngagpolnef) se escindió del plásmido pCR-Script SIV-syn-gagpolnef mediante digestión con EcoRI y XhoI seguida de la modificación con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y se subclonó en el vector pJR101 (previamente digerido con la endonucleasa de restricción SmaI y desfosforilado mediante incubación con la fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIP)), generando el plásmido pJR-SIVgpn-9 (10630 pb). Un fragmento de ADN de 4,3 kb que contenía el promotor sintético temprano/tardío (E/L) dirigiendo al gen SIVgpn se escindió del plásmido pJR-SIVgpn-9 mediante digestión con HindIII, tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y digestión con NotI, y se clonó en el vector pLZAW1-89.6P-9 (previamente digerido con las endonucleasas de restricción SwaI y NotI, generando el vector plasmídico de transferencia pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 (13399 pb) (Figura 4b).
El plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 generado dirige la inserción de los genes de interés en el locus TK del genoma de MVA y NYVAC. Después de que los virus recombinantes deseados fueron aislados mediante la evaluación de la expresión de la actividad \beta-galactosidasa, la propagación posterior de los virus recombinantes conduce a la autodeleción del gen \beta-gal mediante recombinación homóloga entre el brazo izquierdo de TK y la repetición corta del brazo izquierdo de TK que están flanqueando el marcador.
Construcción del virus recombinante MVA-89.6P-SIVgpn
Cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) procedentes de huevos SPF (libres de patógenos específicos, por sus siglas en inglés "Specific Pathogen Free") fueron infectados con un virus atenuado MVA en pase 586 (habiendo sido el MVA-F6 del pase anterior, 585, proporcionado por Gerd Sutter) a una multiplicidad de 0,05 ufp/célula, y posteriormente transfectados con 10 \mug del vector plasmídico de transferencia pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18, usando para ello el reactivo de transfección lipofectamina (Lipofectamine^{TM} 2000, Cat. 18324-012, lote 1198865, suministrada por Invitrogen S.A., El Prat de Llobregat, Barcelona, España) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 72 horas post-infección las células fueron recogidas, sonicadas y usadas para la selección de los virus recombinantes.
Los virus MVA recombinantes que contenían los genes 89.6P-gp120/SIVgpn y que coexpresaban de forma transitoria el gen marcador \beta-Gal (MVA-SHIV (X-Gal^{+})), fueron seleccionados realizando pases consecutivos de purificación de placas en células CEF teñidas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-galactósido (XGal) (300 \mug/ml). Los virus MVA recombinantes que contenían los genes 89.6P-gp120/SIVgpn y que habían perdido el gen marcador (MVA-SHIV (X-Gal^{-})), fueron seleccionados como focos virales no teñidos en células CEF en presencia de XGal. En cada paso de purificación las placas aisladas fueron expandidas en células CEF durante 3 días, y el extracto viral crudo obtenido fue usado para el siguiente paso de purificación de placas.
En el primer paso de la selección por cribado se aislaron 3 placas X-Gal^{+} a las que se denominó MVA-89.6P-SIVgpn-(1 a 3). La placa denominada MVA-89.6P-SIVgpn-1, que expresaba de forma eficiente los antígenos 89.6P-gp120 y SIVgpn, se amplificó y utilizó para el siguiente paso de purificación. En el segundo pase, se aislaron 22 placas X-Gal^{+}, todas las cuales expresaban de forma eficiente ambas proteínas. Se amplificaron tres placas, denominadas MVA-89.6P-SIVgpn-1.4, MVA-89.6P-SIVgpn-1.6 y MVA-89.6P-SIVgpn-1.18, que se utilizaron para el siguiente paso de purificación. En el tercer pase, se aislaron 20 placas X-Gal^{+} y 4 placas X-Gal^{-}, todas las cuales expresaban de forma eficiente ambos antígenos. Una de las placas X-Gal^{-} (MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8) y una de las placas X-Gal^{+} (MVA-89.6P-SIVgpn-1.18.2) se amplificaron y utilizaron en el siguiente paso de purificación; la primera de ellas, MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8, se utilizó para preparar el stock P1 por infección a partir de una placa p150 en células CEF). En el cuarto pase se aislaron 6 placas X-Gal^{-} y 6 placas X-Gal^{+}. El recombinante denominados MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8.5 (X-Gal^{-}) se utilizó para preparar los stocks P2 por infección a una multiplicidad de 0,01 ufp/célula de cinco placas p150. Los stocks P3 (generados en células CEF infectadas en 40-100 placas p150 a una multiplicidad de infección de 0,05 ufp/célula, recogidos transcurridos 3-4 días después de la infección y purificados a través de dos colchones de sacarosa al 45%) se prepararon solamente a partir del MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8.5 (X-Gal^{-}) para los estudios de inmunización en simios; las características de los diferentes stocks P3 obtenidos se especifican más adelante en el Ejemplo 5.
Caracterización del MVA-89.6P-SIVgpn
Para confirmar la homogeneidad genética del virus MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8.5 (X-Gal^{-}) generado y la integridad de los genes insertados, se amplificaron los stocks P2 (MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8.5) y P3 mediante infección de células CEF a una multiplicidad de infección de 5 ufp/célula, recuperando los extractos celulares a las 24 horas post-infección. Se purificó el ADN del virus y se sometió a análisis mediante PCR empleando para ello oligonucléotidos cebadores que hibridan con las regiones TK flanqueantes del inserto de interés izquierda (oligonucleótido TK-L) o derecha (oligonucleótido TK-R2), con las siguientes secuencias:
TK-L: 5' TGATTAGTTTGATGCGATTC 3' (SEQ ID NO: 1)
TK-R2: 5' CTGCCGTATCAAGGACA 3' (SEQ ID NO: 2)
Las posiciones en las que hibridan dichos oligonucleótidos con respecto al inserto presente en MVA-89.6P-SIVgpn, así como los tamaños estimados de los fragmentos generados en las PCR que utilizan como molde el ADN de dicho virus y el ADN correspondiente al virus MVA de tipo silvestre (WT), carente de inserto, aparecen representados en la parte superior de la Figura 5.
La parte inferior de la Figura 5, por su parte, muestra una fotografía de un gel correspondiente al análisis de productos de PCR situados entre los brazos izquierdo (TK-L) y derecho (TK-R) del locus TK en los virus MVA-SHIV de los stocks P2 (MVA-89.6P-SIVgpn (P2)) y P3 (MVA-89.6P-SIVgpn (P3)), el virus MVA tipo silvestre (MVA-WT) y el plásmido de transferencia pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18. Para su obtención, 100 ng del ADN viral extraído de células CEF infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula con los virus MVA-WT (calle 3), MVA-89.6P-SIVgpn (P2) (calle 4) o MVA-89.6P-SIVgpn (P3) (calle 5) o 10 ng del plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 fueron usados como molde para hacer un análisis por PCR de la secuencia ubicada entre ambos brazos del locus TK empleando como cebadores 100 ng de los oligonucleótidos que hibridan con las secuencias flanqueantes del gen TK, TK-L (SEQ ID NO: 1) y TK-R2 (SEQ ID NO: 2) en una mezcla de reacción que contenía 0,3 mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCl_{2} y 2,5 U de la enzima polimerasa Platinum Taq. El programa incluye un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 5 min, 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 1 min, hibridación a 60ºC durante 1 min y extensión 68ºC durante 2 min, y finalmente un ciclo de extensión a 68ºC durante 10 min. Los productos de PCR fueron analizados en un gel de agarosa al 0,7%, obteniéndose el resultado que se muestra en la parte inferior de la Fig. 3. En las calles 4 y 5, las correspondientes a los dos stocks de vector MVA-SHIV, se observa una banda situada ligeramente por encima de la banda de 6 Kb del marcador (calle 1), compatible con la presencia del inserto completo, banda que también aparece en la calle correspondiente al control positivo, el plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18, mientras que en la calle correspondiente al virus de tipo silvestre MVA-WT (3) aparece una banda mucho menor, que corresponderían al locus de TK sin inserto.
Adicionalmente, se procedió a secuenciar el ADN del virus MVA-89.6P-SIVgpn del stock P2, utilizando como cebadores los oligonucleótidos TK-L (SEQ ID NO: 1), TK-R2 (SEQ ID NO: 2) y E/L (SEQ ID NO: 6) obteniéndose la secuencia representada por SEQ ID NO: 5.
Los elementos que forman parte del inserto presente en el genoma del virus MVA-89.6-SIVgpn se especifican a continuación en la Tabla 2.
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TABLA 2 Posición de los componentes principales del inserto del vector MVA-89.6P-SIVgpn
2 
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Ejemplo 2 Análisis de la expresión de proteínas del SHIV a partir del MVA-89.6P-SIVgpn 2.1. - Transferencias tipo Western
La expresión de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn por los stocks P2 y P3 del virus MVA-89.6P-SIVgpn fue analizada mediante transferencia tipo Western. Monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula del stock P2 o del stock P3. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a la reacción frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120 (generado en el laboratorio de los inventores) que reconoce la proteína gp120 del SHIV89.6P; y frente a un anticuerpo monoclonal anti-SIV-gag-p27 (cedido por el programa EVA, ARP392) que reconoce la parte correspondiente a la proteína p27 del antígeno Gag del SIV y, por ello, la proteína de fusión SIVgpn. Como controles positivos se utilizaron extractos procedentes de células transfectadas de forma transitoria con el vector plasmídico de transferencia pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18.
Como se muestra en la Figura 6, tanto la proteína 89.6-gp 120 (fotografía superior, marcada como "anti-gp120") como la proteína de fusión SIVgpn (fotografía inferior, marcada como "anti-SIVp27") se detectaron en los extractos de células infectadas con virus de los stocks P1, P2 y P3 del MVA-89.6P-SIVgpn, así como en el extracto de células transfectadas de forma transitoria con el plásmido utilizado como control positivo (calles marcadas como "C+"), indicando la correcta expresión de ambos antígenos por los virus recombinantes derivados de MVA gene-
rados.
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2.2. Inmunotinción de placas
La expresión de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn por parte del recombinante MVA-89.6P-SIVgpn se analizó también en células CEF infectadas con una dilución 10^{-5} del stock P3, mediante la inmunotinción de las mismas utilizando bien un anticuerpo policlonal dirigido contra las proteínas propias del vector MVA tipo silvestre (anti-WR), bien un anticuerpo policlonal anti-gp 120 del clade B (anti-gp 120) o bien el anticuerpo monoclonal anti-SIVgag-p27 proporcionado por el programa EVA (ARP392). Los resultados, mostrados en la Figura 7, muestran que más del 97% de las placas virales que resultaban teñidas con el anticuerpo anti-WR eran también positivas para los anticuerpos anti-gp120 (fotografías y barras marcadas como "antigp120") y anti-SIVgag-p27 (fotografías y barras marcadas como "anti-SIVp27").
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Ejemplo 3 Construcción v caracterización del virus recombinante NYVAC-89.6P-SIVgagpolnef
Se infectaron con la cepa de tipo silvestre de NYVAC (donada por el grupo Aventis, en el marco de colaboración del proyecto financiado por el V Programa Marco de la Unión Europea (European Vaccine Effort Against HIV, conocido por su acrónimo EuroVacI), a una multiplicidad de infección de 0,025 ufp/célula, células BSC40 (una línea celular derivada de riñón de mono, que carece de potencial miogénico), que luego se transfectaron con 10 \mug de ADN del vector plasmídico de transferencia pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 (cuyas características se describieron en el Ejemplo 1), utilizando como reactivo lipofectamina (Invitrogen, Cat. 18324-012, lote 1198865) siguiendo las instrucciones del fabricante. 72 horas después de la infección se recogieron las células, se sonicaron y se utilizaron para realizar un cribado en busca de virus recombinantes.
Los virus NYVAC recombinantes que contenían los genes 89.6P-gp120/SIVgpn y que coexpresaban de forma transitoria el gen marcador \beta-Gal (NYVAC-89.6P-SIVgpn (X-Gal^{+})), fueron seleccionados realizando pases consecutivos de purificación de placas en células BSC40 teñidas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-galactósido (XGal) (300 \mug/ml). Los virus NYVAC recombinantes que contenían los genes 89.6P-gp120/SIVgpn y que habían perdido el gen indicador \beta-Gal (NYVAC-89.6P-SIVgpn (X-Gal^{-})), fueron seleccionados como focos virales no teñidos en células BSC40 en presencia de XGal. En cada paso de purificación las placas aisladas fueron expandidas en células BSC40 durante 2 días, y el extracto viral crudo obtenido fue usado para el siguiente paso de purificación de
placas.
En el primer paso de la selección por cribado se aislaron 3 placas X-Gal^{+} a las que se denominó NYVAC-89.6P-SIVgpn-(1 a 3). Las tres placas, que expresaban eficientemente los antígenos 89.6P-gp120 y SIVgpn, se amplificaron y utilizaron para el siguiente paso de purificación de placas. En el segundo pase, se aislaron 18 placas X-Gal^{+}; 8/18 expresaban ambas proteínas. Se amplificó la placa denominada NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1, que se utilizó para el siguiente paso de purificación. En el tercer pase, se aislaron 12 placas X-Gal^{+}, todas las cuales expresaban de forma eficiente la proteína 89.6P-gp120 y 11/12 expresaban la proteína SIVgpn. Las placas denominadas NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1.1 y NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1.2 se amplificaron y utilizaron en el siguiente paso de purificación. En el cuarto pase se aislaron 12 placas X-Gal^{-} y 12 placas X-Gal^{+}; todas ellas expresaban de forma eficiente la proteína 89.6P-gp120 y 22 de 24 expresaban la proteína SIVgpn. Los recombinantes denominados NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1.1.1 (X-Gal^{-}) y NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1.2.3 (X-Gal^{-}) se amplificaron y utilizaron en el siguiente paso de purificación. En el quinto pase se aislaron 12 placas X-Gal^{-}; todas ellas expresaban de forma eficiente ambos antígenos. El recombinante denominado NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1.1.1.4 (X-Gal^{-}) se amplificó en células CEF (una placa de p150 para generar el stock P1) y se utilizó para preparar los stocks P2 (por infección de cinco placas p150 a 0,01 ufp/célula). Los stocks P3 (crecidos en 40-100 placas p150 de células CEF infectadas a una multiplicidad de infección de 0,05, recogidos transcurridos 3-4 días después de la infección y purificados a través de dos colchones de sacarosa al 45%) se prepararon para los estudios de inmunización en simios; las características de cada uno de los stocks P3 generados se mencionan en el Ejemplo 5.
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Caracterización del NYVAC-89.6P-SIVgpn
Para confirmar la homogeneidad genética y pureza del virus NYVAC-89.6P-SIVgpn generado y la integridad de los genes insertados, se amplificó el stock P3 mediante infección de células CEF a una multiplicidad de infección de 5 ufp/célula, recuperando los extractos celulares a las 24 horas post-infección. Se purificó el ADN del virus y se sometió a análisis mediante PCR empleando para ello oligonucléotidos cebadores que hibridan con las regiones TK flanqueantes del inserto de interés izquierda (TK-L) (SEQ ID NO: 1) y derecha (TK-R2) (SEQ ID NO: 2), de forma análoga a la descrita en el Ejemplo 1.
Las posiciones en las que hibridan dichos oligonucleótidos con respecto al inserto presente en NYVAC-SHIV, así como los tamaños estimados de los fragmentos generados en las PCR que utilizan como molde el ADN de dicho virus y el ADN correspondiente al virus NYVAC de tipo silvestre (WT) carente de inserto, aparecen representados en la parte superior de la Figura 8. La parte inferior de dicha Figura 86 muestra la fotografía de los geles obtenidos al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con la pareja de cebadores TK-L/TK-R2 para efectuar el análisis del inserto incluido en el virus NYVAC-SHIV presente en el stock P3 (NYVAC-89.6P-SIVgpn (P3)) (calle3), que se comparó con los productos de PCR generados a partir del control positivo MVA-SHIV (MVA-89.6P-SIVgpn (P3)) (calle 4) y con los vectores tipo silvestre, sin insertos, como controles positivos, es decir, NYVAC-WT (calle 2) y MVA-WT (calle 5). Para ello, 100 ng de ADN viral extraído de células de embrión de pollo (CEF) infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula con los virus NYVAC-WT, NYVAC-89.6P-SIVgpn (P3) (MVA-SHIV), MVA-89.6P-SIVgpn (P3) (MVA-SHIV) y MVA-WT fueron usados como molde para hacer una amplificación mediante PCR del fragmento de secuencia comprendido entre los brazos TK-L y TK-R en cada uno de ellos. Como se observa en las fotografía mostradas en la parte inferior de la Figura 8, la muestra correspondiente al control positivo, el virus recombinante MVA-89.6P-SIVgpn (P3) (calle 4), da lugar a una banda de igual tamaño que las correspondientes a las muestras del virus recombinante cuya descripción se describe en este ejemplo NYVAC-SHIV (NYVAC-89.6P-SIVgpn (P3), calle 3), mientras que en la calle 2, correspondientes al virus NYVAC que carece de inserto (NYVAC-WT), se observa una banda de aproximadamente 400 pb compatible con la ausencia de inserto en el locus de TK propio de NYVAC, más corto que el del MVA-WT que, por su parte, da lugar a la banda de casi 900 pb que habría de esperarse según las características del locus de TK en este último virus.
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Ejemplo 4 Análisis de la expresión de proteínas del SHIV a partir del NYVAC-89.6P-SIVgpn 4.1.- Transferencias tipo Western
La expresión de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn por el virus recombinante NYVAC-89.6P-SIVgpn fue analizada mediante transferencia tipo Western. Monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de los stocks P1, P2 o P3. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a la reacción frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120 (generado en el laboratorio de los inventores inmunizando conejos con la proteína gp120 del aislado IIIB), que es capaz de reconocer la proteína gp120 del SHIV89.6P; y frente a un anticuerpo monoclonal anti-SIV-gag-p27 (cedido por el programa EVA, ARP392) que reconoce la proteína gag del SIV y, por ello, la proteína de fusión SIVgpn. Como controles positivos se utilizaron extractos procedentes de células infectadas con el virus MVA-SHIV (MVA.89.6P-SIVgpn(P3)).
Como se muestra en la Figura 9, tanto la proteína 89.6-gp120 (fotografía de superior, marcada como "anti-gp120") como la proteína de fusión SIVgpn (fotografía inferior, marcada como "anti-SIVp27") se detectaron en los extractos de células infectadas con virus de los stocks P1, P2 y P3 del NYVAC-89.6P-SIVgpn (NYVAC-SHIV), así como en el extracto de células infectadas con el control positivo MVA-SHIV, indicando la correcta expresión de ambos antígenos por los virus recombinantes derivados de NYVAC generados.
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4.2. Inmunotinción de placas
La expresión de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn por parte del recombinante NYVAC-89.6P-SIVgpn se analizó también en células DF-1 infectadas con una dilución 10^{-5} del stock P3 del NYVAC-SHIV (NYVAC-89.6P-SIVgpn (P3)), mediante la inmunotinción de las mismas utilizando bien un anticuerpo policlonal dirigido contra las proteínas propias del vector MVA tipo silvestre (anti-WR), bien un anticuerpo policlonal anti-gp120 del clade B (anti-gp120) o bien el anticuerpo monoclonal anti-SIVgag-p27 proporcionado por el programa EVA (ARP392). Los resultados, mostrados en la Figura 10, muestran que más del 98% de las placas virales que resultaban teñidas con el anticuerpo anti-WR eran también positivas para los anticuerpos anti-gp120 (fotografías y barras marcadas como "antigp120") y anti-SIVgag-p27 (fotografías y barras marcadas como "anti-SIVp27").
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Ejemplo 5 Control de los stocks virales enviados para los estudios de inmunización de macacos
De los stocks de virus recombinantes MVA-SHIV y NYVAC-SHIV obtenidos, se seleccionaron para ser utilizados en estudios de inmunización de macacos los que se muestran a continuación en la Tabla 3:
TABLA 3 Stocks de virus recombinantes seleccionados para estudios de inmunización en macacos
3
La expresión de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn por los diferentes stocks de virus recombinantes MVA-89.6P-SIVgpn y NYVAC-89.6P-SIVgpn fue analizada mediante transferencia tipo Western. Monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de uno de los stocks mencionados en la Tabla 3. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a la reacción frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120 (generado en el laboratorio de los inventores inmunizando conejos con la proteína gp120 del aislado IIIB), que es capaz de reconocer la proteína gp120 del SHIV89.6P; y frente a un anticuerpo monoclonal anti-SIV-gag-p27 (cedido por el programa EVA, ARP392) que reconoce la proteína gag del SIV y, por ello, la proteína de fusión SIVgpn. Como control negativo se utilizó un extracto de células en las que se había simulado la infección, es decir, que habían sido sometidas a los mismos pasos que las células infectadas, pero que no habían recibido virus en la solución con las que deberían haber sido infectadas (extracto M). La Figura 11 muestra los resultados de las inmunotinciones con cada uno de los anticuerpos, correspondiendo la parte superior a la tinción con el anticuerpo anti-gp120 y la inferior a la tinción con el anticuerpo anti-SIV-gag-p27.
Comprobada la expresión eficiente de ambas proteínas en los extractos procedentes de cada uno de los stocks, se enviaron alícuotas de los mismos a los Drs. Jonathan Heeney y Petra Mooij, del Biomedical Primate Research Centre de Rijswijk, Holanda, donde se llevaron a cabo los ensayos con macacos que se describen en los siguientes Ejemplos.
Estudio preclínico de la eficacia como vacuna Protocolo de inmunización y desafío posterior
Los ensayos que se describen a continuación en los Ejemplos 5 y 6 se llevaron a cabo para evaluar la inmunogenicidad y la eficacia de los vectores descritos en la presente patente de adición para proteger a simios inmunizados con ellos frente al desarrollo de la enfermedad del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida, con el fin de valorar a partir de los resultados obtenidos el grado de eficacia esperable de los vectores descritos en la patente principal al inmunizar con ellos seres humanos. Dichos ensayos se llevaron a cabo en el Biomedical Primate Research Centre de Rijswisjk (Países Bajos). Para su realización, se utilizaron macacos Rhesus (Macaca mulatta) adultos jóvenes, que habían demostrado ser negativos a la infección por SIV, retrovirus de simio y virus de leucemia de simio. Las condiciones de estabulación y manejo de los animales siguieron las normas éticas establecidas por el mencionado centro de experimentación.
El estudio no sólo pretendió establecer correlaciones con la inmunogenicidad y eficacia que serían esperables al utilizar los vectores de la patente principal como vacunas en seres humanos, sino que también intentó obtener datos para compararlos con los resultados obtenidos al utilizar un vector, también derivado de poxvirus, que contiene el mismo inserto de secuencias codificantes de antígenos del SHIV89.6P que el vector derivado de MVA de la presente patente de adición cuya construcción y caracterización se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2, MVA-89.6P-SIVgpn, al que también se hará referencia en los Ejemplos siguientes mediante la denominación general abreviada MVA-SHIV. El vector alternativo utilizado cuya construcción está también descrita en la presente memoria es el vector derivado de NYVAC, denominado NYVAC-89.6P-SIVgpn, al que también se hará referencia en los Ejemplos siguientes mediante la denominación general abreviada NYVAC-SHIV. Tanto el MVA-SHIV como el NYVAC-SHIV, que contienen el mismo inserto, fueron administrados en dosis de refuerzo o potenciación de la respuesta inmune (a las que se alude con frecuencia mediante el término inglés boost) con posterioridad a la administración de dosis de iniciación o desencadenamiento de la respuesta inmune (priming) en las que los animales recibieron ADN desnudo que contenía un inserto idéntico al presente en el ADN de los vectores MVA-SHIV y NYVAC-SHIV, el vector DNA-SHIV, que consta de dos plásmidos de expresión, pcDNA-gp120.89.6p, que expresa la proteína gp120 del SHIV89.6P, y pcDNA-SIVgag-pol-nef, que expresa la proteína SIVgpn generada a partir de secuencias correspondientes al virus SHIV89.6P, plásmidos que fueron generados por el Dr. Ralf Wagner, Regensburg, Alemania, y cedidos por el mismo para la realización del estudio. Los detalles sobre el estudio y los resultados obtenidos se describen con mayor detalle a continuación en los Ejemplos 6 y 7.
Ejemplo 6 Inmunización de los macacos y valoración de la inmunidad generada
Los 21 macacos utilizados en el estudio fueron divididos en tres grupos (grupos 1, 2, y 3), cada uno compuesto de 7 individuos. Cada uno de los grupos fue sometido a un protocolo de inmunización diferente, según se muestra a continuación en la Tabla 4:
TABLA 4 Grupos de inmunización y tratamiento recibido
4
El grupo 3, de control, recibió en las dos primeras dosis ADN desnudo que carecía del inserto con las secuencias propias del SHIV89.6P (DNA-emp), mientras que en las dos últimas recibió el vector NYVAC-WT, que carece igualmente del inserto. Para la realización del estudio, el vector NYVAC-WT fue crecido en células CEF y purificado en dos colchones de sacarosa de forma análoga a la utilizada con los recombinantes MVA-SHIV y NYVAC-SHIV; del stock generado se enviaron al centro de primates de Holanda, el día 20 de abril de 2004, un total de 8 x 10^{9} ufp, con un título de 1 x 10^{9} ufp/ml.
Las inmunizaciones con ADN desnudo se produjeron con un total de 4 mg de plásmido, utilizando en el caso del vector DNA-SHIV 2 mg de cada uno de los plásmidos que lo componen, pcDNA-gp12089.6p y pcDNA-SIV-gag-pol-nef, y empleando 4 mg del vector DNA-emp para los controles. En cada una de las dos inoculaciones de ADN desnudo que recibió cada macaco se suministraron 2 mg de plásmido, disueltos en 1,5 ml de PBS, que se suministraron por vía intramuscular en la parte superior de cada pata.
Las inmunizaciones con los vectores NYVAC-SHIV, MVA-SHIV y NYVAC-WT se llevaron a cabo inoculando en la parte superior del brazo derecho, por vía intramuscular, 0,5 ml que contenían 5 x 10^{8} ufp, de manera que en cada dosis se inocularon 5 x 10^{8} ufp/macaco. Para ello se utilizaron los siguientes stocks:
-
en el caso del MVA-SHIV, P3 (20/06/03), con un título de 1,6 x 10^{9} ufp/ml,;
-
en el caso del NYVAC-SHIV, P3.1 (29/01/04), con un título de 1,2 x 10^{9} ufp/ml,;
-
en el caso del NYVAC-WT, el stock con un título de 1 x 10^{9} ufp/ml mencionado anteriormente.
En todos los casos, transcurridas 32 semanas después de recibir la primera dosis de inmunización, los macacos fueron sometidos a lo que se conoce como un "desafío" o "reto" viral (traducción del término inglés "challenge"), es decir, se inoculó a los animales por vía intravenosa una dosis de 50-100 MID50 de SHIV89.6P, dilución 1:1000 del stock de Letvin (entendiendo como MID50 o "Monkey Infectious Dose" la cantidad de virus que es capaz de producir infección en el 50% de los animales) y se observó la evolución de cada animal.
2 semanas antes de comenzar con el protocolo de inmunización, en distintos momentos a lo largo del mismo y con posterioridad al desafío se extrajeron muestras de sangre periférica, mediante punción intravenosa, de cada uno de los animales. De la sangre heparinizada se obtuvieron las células PBMC ("peripheral blood mononuclear cells", células mononucleares de sangre periférica), que se utilizaron para los ensayos de respuesta celular: En la Figura 12 se muestra un esquema del transcurso del estudio, en el que están marcados los momentos de las tomas de muestras (CMI, abreviatura de "cell mediated immunity" o inmunidad mediada por células), los momentos en los que se administraron las distintas dosis de inmunización (ADN y vectores derivados de poxvirus: NYVAC ó MVA) y el momento en el que se procedió al desafío con el virus SHIV89.6P.
Con el fin de valorar la inmunidad generada, se realizaron ensayos para detectar por la técnica de ELISPOT la respuesta de IFN-\gamma, IL-2 e IL-4 en los animales de cada uno de los grupos y su evolución en el tiempo, según se describe a continuación.
La respuesta de citoquinas se evaluó en las fracciones de células PBMC extraídas de cada uno de los macacos. Para ello, muestras de dichas células de cada uno de los macacos se incubaron durante 48 horas con grupos de péptidos. Para el ELISPOT de gp120 se utilizó un grupo de 48 péptidos, concretamente los péptidos 4702 a 4749 del Nº Cat. 4827 del NIH AIDS Research and Reference Reagents Program, cada uno de los cuales consta de 20 aminoácidos de los que 10 aminoácidos son solapantes con el siguiente péptido, con los cuales queda representada la secuencia de la proteína 89.6P-gp120. Para el ELISPOT de SIVgpn, los péptidos fueron sintetizados por SynPep Dublín (California, Estados Unidos) y son grupos de 15 aminoácidos con 11 aminoácidos solapantes, que se pueden agrupar en los grupos (pools): Gag-pool 11, 1-54; Gag-pool 12, 55-108; Pol-pool 11, 109-168; Pol pool 12, 169-173 + 236-290; Pol pool 13, 291-349; Nef pool 11, 174-235; la respuesta de los 7 grupos de péptidos fue analizada utilizando 2 microgramos/ml de cada péptido en el ensayo. Tras la incubación, en cada una de las muestras se midieron las SPF (Spot forming cells), que son las células PBMC que expresan una determinada citoquina, después de su estimulación con péptidos específicos incluidos en las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn. Esto es una medida de las células que fueron estimuladas específicamente por la inoculación de los vectores que expresaban dichas proteínas. Se realizaron medidas por ELISPOT para detectar las SPF que expresaban IFN-\gamma, IL-2 ó IL-4 (29).
En el caso de las SPF que expresaban IFN-\gamma, los resultados obtenidos con cada uno de los animales, expresados como SPF totales (las estimuladas por 89.6P-gp120 y la estimuladas por SIVgpn) detectadas por cada 10^{6} PBMC analizadas, se representan en la Figura 13, en la que se ha utilizado una escala logarítmica en el eje de ordenadas. Los números que aparecen en el eje de abscisas indican el momento en el tiempo en el que fueron tomadas cada una de las muestras. Para cada valor de tiempo, aparecen tres grupos de valores, que presentan el comportamiento de cada uno de los 7 animales utilizados en el estudio con un procedimiento de inmunización concreto: la primera vertical de puntos corresponde a muestras tomadas de macacos del grupo 1 (DNA-SHIV/MVA-SHIV); la segunda vertical de puntos corresponde a muestras tomadas de macacos del grupo 2 (DNA-SHIV/NYVAC-SHIV); la tercera vertical de puntos corresponde a muestras tomadas de ratones del grupo 3 (DNA-emp/NYVAC-WT). Cada punto representa el valor obtenido para un macaco concreto, mientras los rectángulos situados en cada una de las verticales indican el valor medio correspondiente a todos los macacos de ese grupo para las muestras tomadas en un mismo momento en el tiempo. La presencia de un número de puntos inferior a 7 en algunas verticales indica que el punto situado sobre el eje de abscisas representa a más de un macaco, en cada uno de los cuales el valor de las SFC detectadas por cada 10^{6} PBMC analizadas no fue superior a 1. La línea punteada indica el valor por debajo del cual los valores se consideran insignificantes (20 SFC). Las flechas blancas indican la inoculación de un vector de vacunación; la flecha negra indica el momento en el que se produjo el desafío con el SHIV89.6P. Se aprecia como antes del desafío, los puntos correspondientes a los dos primeros grupos, y en especial el valor medio de los mismos, son superiores a los obtenidos en el grupo control, inmunizado con DNA/NYVAC sin insertos. Una vez producida la infección con el patógeno
SHIV89.6P, los valores quedan bastante igualados en todos lo grupos al producirse inmunidad frente al SHIV.
Para simplificar la interpretación de los datos, en la Figura 14 se representan los valores medios del número total de células que expresan IFN-\gamma obtenidos para cada uno de los grupos, de nuevo en escala logarítmica, en función del tiempo en el que se tomaron las muestras, partiendo en este caso del momento en el que los macacos recibieron la primera dosis de ADN desnudo. Las Figuras 15 y 16, por su parte, representan los valores medios obtenidos para cada uno de los grupos, igualmente en escala logarítmica, en función del tiempo, de SFC que expresaban IL-4 (Figura 15) o IL-2 (Figura 16).
Se observa que, tanto en el grupo 1 (el que recibió el vector MVA-SHIV, el MVA-89.6P-SIVgpn, en las dosis de potenciación de la respuesta) (datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba, \rombonegrotachado) como en el grupo 2 (el que recibió el vector NYVAC-SHIV, el NYVAC-89.6P-SIVgpn, en las dosis de potenciación de la respuesta) (datos mediante cuadrados cuyos vértices conforman dos líneas paralelas, \cuadradonegrotachado), la magnitud de la respuesta inmune es semejante y claramente superior a la que se detecta en el grupo 3, el de los macacos que recibieron vectores que no expresaban antígenos del SHIV (cuyos datos se indican mediante triángulos, 101. En este último grupo, se aprecia como la respuesta inmune aumenta claramente después del desafío con el virus SHIV89.6P, debido a la replicación del virus, lo que hace que, a partir de ese momento, los valores sean semejantes en los tres grupos.
Estos datos indican que la media total de la respuesta inmune (producción de IFN-\gamma) resulta claramente potenciada al serles administrados a los macacos los vectores MVA-89.6P-SIVgpn y NYVAC-89.6P-SIVgpn. La respuesta inmune inducida por estos dos vectores es semejante. Ambos inducen una buena respuesta celular frente a los antígenos 89.6P-gp120 y SIVgpn.
Ejemplo 7 Eficacia de la respuesta inmune generada para proteger frente al desarrollo del virus SHIV
Para valorar la eficacia de protección frente al desarrollo de una infección generada por el virus SHIV89.6 en relación a la respuesta inmune evaluada en los ensayos descritos en el Ejemplo 6, se procedió a extraer datos sobre dos magnitudes significativas: el número de partículas virales detectables en el plasma de las muestras sanguíneas que habían sido extraídas de los macacos una vez que se les habían inoculado el virus patógeno SHIV89.6P, así como el porcentaje que las células CD4+ y CD8+ suponían respecto al total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
7.1. - ARN viral detectable en plasma
Los valores referentes al número de partículas virales detectables en plasma constituyen un buen valor indicativo de la capacidad de la respuesta inmune generada para controlar la posible infección producida por el virus SHIV89.6P inoculado. Valores por encima de 100.000 copias/ml se consideran que conducen al desarrollo en los macacos de SIDA y a la muerte del animal, mientras que valores próximos a 10.000 copias/ml o inferiores mantienen al animal sin aparentes efectos patógenos. La detección de una concentración de copias virales inferior a ese valor puede considerarse indicativo de que la respuesta inmune generada es capaz de conferir protección en los modelos animales utili-
zados.
Por ello, se procedió a detectar el ARN del virus SHIV89.6P presente en el plasma de las muestras sanguíneas extraídas de los macacos justo antes (tiempo 0) y con posterioridad a la inoculación de dicho virus. Para ello se utilizó la técnica cuantitativa en tiempo real QC RNA-PCR, que mide el número de copias virales por mililitro de plasma y es capaz de detectar 50 copias por ml. Los valores obtenidos para cada uno de los macacos se muestran en la Figura 17, en la que aparecen tres gráficos. El gráfico superior corresponde al grupo 3, el de los macacos control que habían sido inmunizados con ADN y NYVAC que carecían de inserto desde el que poder expresar antígenos del SHIV. El gráfico de la parte inferior izquierda corresponde al grupo 1, inmunizado con DNA-SHIV/MVA-SHIV, mientras el gráfico de la parte inferior derecha corresponde al grupo 2, inmunizado con DNA-SHIV/NYVAC-SHIV.
En dicha Figura puede apreciarse como, de los 7 macacos que recibieron la inmunización control, 32 semanas después del desafío, 6 presentan valores continuados de viremia que oscilan entre 10.000-100.000 copias/ml, mientras que uno de los animales no respondió a la infección.
De los animales vacunados, todos los animales del grupo DNA-SHIV/MVA-SHIV redujeron los niveles de viremia con respecto al grupo control. 3 eliminaron completamente el virus antes de las 20 semanas, concretamente transcurridas 7, 14 ó 18 semanas. En cuanto al resto, al cabo de las 32 semanas, tres macacos redujeron la viremia por debajo de 1000 copias/ml y uno mantenía alrededor de 2000 copias/ml.
En cuanto al grupo vacunado con DNA-SHIV/NYVAC-SHIV, 4 animales eliminaron completamente el virus antes de las 20 semanas, concretamente transcurridas 4, 14 6 17 semanas. En cuanto al resto, al cabo de las 32 semanas, dos macacos mantenían niveles por debajo de 1000 copias/ml y uno de ellos por debajo de 10000 copias/ml.
Estos resultados demuestran claramente que los dos vectores derivados de poxvirus utilizados, MVA-SHIV (MVA-89.6P-SIVgpn) y NYVAC-SHIV (MVA-89.6P-SIVgpn), inducen un alto grado de protección en macacos frente al virus patógeno SHIV89.6P al ser utilizados en protocolos de tipo prime/boost (desencadenamiento/potenciación de la respuesta) al ser utilizados en las dosis de refuerzo o potenciación de la respuesta inmune generada.
7.2. - Porcentaje de células CD4+ y CD8+
Los valores referentes a los porcentajes de células T de sangre periférica CD4+ y CD8+ detectables son también datos significativos, pues las células CD4+ son utilizadas tanto por el VIH como por el SIV como células diana para la infección. La reducción en el número de estas células por debajo de 200 células por ml se considera un síntoma de la enfermedad, el SIDA. La proporción de células T CD4+ y CD8+ es por tanto un buen indicador del estado de la infección.
Por ello, se procedió a su detección en la fracción de células PBMC de las muestras sanguíneas extraídas a los macacos 12 semanas antes de que se produjera el desafío con el SHIV89.6P, justo antes de inocularlo (tiempo 0) y con posterioridad a la inoculación de dicho virus. Para llevar a cabo los ensayos, se utilizaron anticuerpos específicos para cada una de las poblaciones, determinándose por FACS la proporción de células CD4+ y CD8+ presentes. Los resultados se muestran en la Figura 18.
En la parte superior de dicha Figura, la correspondiente al grupo inmunizado con DNA-SHIV/MVA-SHIV, se observa que 6 de los macacos mantenían niveles normales de células CD4+, similares a los de células CD8+, y sólo en uno de ellos dichos niveles se redujeron por debajo de 100. En la parte intermedia de la Figura, la correspondiente al grupo inmunizado con DNA-SHIV/NYVAC-SHIV, se obtuvieron resultados similares: 6 animales mantenían niveles normales de células CD4+ y sólo en uno dichos niveles se redujeron por debajo de 100. En el grupo control, en cambio, tal como se observa en la parte inferior de la Figura 18, en 5 de los macacos los niveles de células CD4+ se redujeron por debajo de 100, habiendo sido necesario sacrificar uno de los otros dos macacos (D7 98928, junto a cuyo nombre figura la abreviatura "euth") debido al avanzado estado de la enfermedad. Uno de los macacos control, sin embargo, se mantuvo protegido.
7.3. - Porcentaje de supervivencia de los macacos infectados
Adicionalmente, se realizó un cálculo del porcentaje de supervivencia de los macacos en cada uno de los tres grupos, computando el número de macacos que permanecían vivos tras la inoculación del virus SHIV89.6P. En la Figura 19 se representan los datos obtenidos transcurridos los intervalos de tiempo desde la infección, en semanas, que se representan en el eje abscisas. En dicha Figura puede observarse como, transcurridas más de 50 semanas desde la infección con el SHIV89.6P, tanto los macacos del grupo inmunizado con DNA-SHIV/MVA-SHIV (datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba, \rombonegrotachado) como los del grupo inmunizado con DNA-SHIV/NYVAC-SHIV (datos indicados mediante cuadrados cuyos vértices conforman dos líneas paralelas, \cuadradonegrotachado), la supervivencia de los macacos era del 100%, mientras que en el grupo control (datos indicados mediante triángulos, 101 a las 27 semanas desde la inoculación del virus SHIV89.6P comienza a observarse un descenso de los macacos vivos, siendo su porcentaje de supervivencia inferior al 40% transcurridas más de 50 semanas desde la inoculación de dicho virus.
Tomando estos datos en conjunto, puede concluirse que tanto el recombinante generado a partir de MVA, MVA-89.6P-SIVgpn, como el generado a partir de NYVAC, NYVAC-89.6P-SIVgpn, que tienen la misma organización genética en sus insertos y son capaces de expresar simultáneamente los antígenos 89.6P-gp120 y SIVgpn, han demostrado en el modelo de primates no humanos, los macacos Rhesus, que son unos excelentes vectores para ser utilizados para la vacunación contra el SIDA de simio. Estos resultados refuerzan los obtenidos en los ensayos descritos en los Ejemplos de la patente principal y suponen un apoyo respecto a la posible utilidad de estos vectores en la vacunación frente al SIDA humano.
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<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
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<120> MEJORAS INTRODUCIDAS EN EL OBJETO DE LA PATENTE PRINCIPAL Nº ES200501841 PARA "VECTORES RECOMBINANTES BASADOS EN EL VIRUS MODIFICADO DE ANKARA (MVA) COMO VACUNAS PREVENTIVAS Y TERAPÉUTICAS CONTRA EL SIDA"
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<130> P-100403
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<160> 20
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<210> 1
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Cebador
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<223> TK-L
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskip
tgattagttt gatgcgattc 
\hfill
20 
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<210> 2
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> Cebador
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<223> TK-R2
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<400>
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctgccgtatc aaggaca 
\hfill
17 
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<210> 3
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<211> 1515
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial derivada del gen Env del virus SHIV89.6P, carente de nucleótidos correspondientes a la proteína gp41
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<220>
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<221> Secuencia codificante
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<223> 89.6P-gp120
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<400>
25
26 
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<210> 4
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<211> 4218
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial derivada del virus SHIV89.6P mediante modificaciones en las partes correspondientes a los antígenos Gag, Pol y Nef
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<220>
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<221> Secuencia codificante
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<223> SIVgpn
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<400>
27
28
29
30
31 
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<210> 5
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<211> 7180
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial quimérica
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<220>
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<221> Secuencia flanqueante izquierda de TK
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<222> 1..499
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<223> TK-L
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<220>
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<221> Secuencia complementaria a secuencia codificante
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<222> 519..2033
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<223> Secuencia complementaria a la secuencia codificante de la proteína 89.6P-gp120
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<220>
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<221> Secuencia complementaria de promotor
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<222> 2081..2119
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<223> Secuencia complementaria del promotor pE/L para 89.6P-gp120
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<220>
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<221> Promotor
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<222> 2144..2183
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<223> Promotor pE/L para SIVgpn
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<220>
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<221> Secuencia codificante
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<222> 2227..6444
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<223> Secuencia codificante de la proteína SIVgpn
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<220>
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<221> Secuencia flanqueante derecha de TK
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<222> 6488..7179
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<223> TK-R
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del inserto presente en el genoma de los vectores MVA-89.6P-SIVgpn y NYVAC-89.6P-SIVgpn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
32
33
34 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<223> E/L
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tatttttttt ttttggaata taaatag 
\hfill
27

Claims (38)

1. Un vector recombinante derivado del virus MVA capaz de expresar simultáneamente una forma de la proteína Env del VIH-1 que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad y una proteína de fusión que contiene secuencias de las proteínas Gag, Pol y Nef del virus de la inmunodeficiencia de simio, SIV, estando la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env y la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef bajo el control de promotores idénticos e insertadas ambas secuencias en el mismo lugar de inserción del vector.
2. Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env y la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se encuentran insertadas en el locus de la timidina quinasa de forma que se inactiva dicho gen.
3. Un vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que tanto la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se generan a partir de las secuencias de proteínas Env, Gag, Pol y Nef de virus quiméricos de la inmunodeficiencia de simio y humano, SHIV.
4. Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 3, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env se ha generado realizando en ella modificaciones en la secuencia correspondiente destinada a eliminar la expresión de la proteína gp41 de manera que se ha eliminado toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp 120.
5. Un vector recombinante derivado del virus MVA según cualquiera de las reivindicaciones 3 y 4, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Gag-Pol-Nef no se proteoliza por acción de la proteasa retroviral.
6. Un vector recombinante derivado del virus MVA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los promotores bajo cuyo control están la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef son promotores idénticos que permiten la expresión de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef y de la proteína Env carente de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad tanto en etapas tempranas como tardías del ciclo infectivo del virus MVA.
7. Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 6, en el que los promotores bajo cuyo control están la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef son promotores sintéticos pE/L.
8. Un vector recombinante según las reivindicaciones 1 a 7, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env y la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se encuentran insertadas en el locus de la timidina quinasa de forma que se inactiva dicho gen, la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env se ha generado eliminando toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp 120, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Gag-Pol-Nef da lugar a una poliproteína que no se proteoliza por acción de la proteasa retroviral y los promotores bajo cuyo control están la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef son promotores sintéticos pE/L.
9. Un vector recombinante según la reivindicación 8, en el que tanto la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden del virus quimérico SHIV89.6P.
10. Un vector recombinante según la reivindicación 9, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env está representada por SEQ ID NO: 3.
11. Un vector recombinante según la reivindicación 9, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef está representada por SEQ ID NO: 4.
12. Un vector recombinante según las reivindicaciones 10 y 11 que comprende un inserto cuya secuencia está representada por SEQ ID NO: 5.
13. Una composición que comprende al menos un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Una composición según la reivindicación 13 que comprende adicionalmente al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Uso de un vector recombinante derivado del virus MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 para evaluar la eficacia como vacuna de un vector derivado del virus MVA, diseñado para ser utilizado en seres humanos, que presenta la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que el primer vector.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que la eficacia como vacuna de un vector derivado de MVA, diseñado para ser utilizado en seres humanos, se evalúa tras administrar a macacos un vector recombinante derivado del virus MVA con la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que el vector diseñado para ser utilizado en seres humanos, o una composición que lo comprende.
17. Uso según la reivindicación 16, en el que la eficacia como vacuna de un vector derivado de MVA, diseñado para ser utilizado en seres humanos, se evalúa a partir de la capacidad para controlar el desarrollo de síndrome de inmunodeficiencia de simio que muestra la respuesta inmune generada en los macacos a los que se les ha administrado el vector recombinante derivado del virus MVA con la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que el vector diseñado para ser utilizado en seres humanos, o una composición que lo comprende.
18. Uso según la reivindicación 17, en el que la capacidad para controlar el desarrollo de síndrome de inmunodeficiencia de simio de la respuesta inmune generada en los macacos a los que se les ha administrado o el vector recombinante derivado del virus MVA con la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que el vector diseñado para ser utilizado en seres humanos, o una composición que lo comprende, se evalúa tras inocular a los macacos una forma patógena de un virus quimérico de la inmunodeficiencia de simio y humana, SHIV, con posterioridad a la administración del vector recombinante derivado del virus MVA o de la composición que lo comprende.
19. Uso según la reivindicación 18, en el que la capacidad para controlar el desarrollo de síndrome de inmunodeficiencia de simio de la respuesta inmune generada en los macacos a los que se les ha administrado o el vector recombinante derivado del virus MVA o la composición que lo comprende se evalúa mediante la valoración del número de copias de ARN del virus SHIV inoculado presentes en el plasma de los macacos transcurridos al menos 10 días desde el momento de la inoculación del virus SHIV.
20. Uso según la reivindicación 19, en el que la forma patógena de virus quimérico de la inmunodeficiencia de simio y humana inoculada es el SHIV89.6P.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que el SHIV89.6P se inocula por vía intravenosa.
22. Uso según la reivindicación 21, en el que el vector recombinante derivado del virus MVA que se ha administrado a los macacos previamente a la inoculación del SHIV89.6P es un vector de la reivindicación 12.
23. Uso según la reivindicación 22, en el que el vector diseñado para ser utilizado como vacuna en seres humanos MVA que presenta la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que el vector de la reivindicación 12 es el vector MVA-B y/o el vector MVA-C.
24. Uso según la reivindicación 23, en el que el vector de la reivindicación 12 se administra a los macacos en una o más dosis de vacunación de potenciación de la respuesta inmune.
25. Uso según la reivindicación 24, en el que el vector de la reivindicación 12 se administra a los macacos en la tercera dosis de vacunación.
26. Uso según la reivindicación 25, en el que el vector de la reivindicación 12 se administra a los macacos adicionalmente en una cuarta dosis de vacunación.
27. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 25 ó 26, en el que el vector de la reivindicación 12 está ausente de la primera y/o de la segunda dosis de vacunación administradas a los macacos.
28. Uso según la reivindicación 27, en el que el vector de la reivindicación 12 está ausente de la primera y de la segunda dosis de vacunación administradas a los macacos.
29. Uso según la reivindicación 28, en el que la primera y la segunda dosis de vacunación comprenden un vector de ADN desnudo a partir del cual pueden expresarse en los macacos antígenos del SHIV89.6P.
30. Uso según la reivindicación 24, en el que el vector de la reivindicación 12 se administra por vía intramuscular.
31. Un vector recombinante derivado del virus NYVAC que presenta la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
32. Un vector recombinante derivado del virus NYVAC según la reivindicación 31 que comprende un inserto cuya secuencia está representada por SEQ ID NO: 5.
33. Uso de un vector recombinante derivado del virus NYVAC según una cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32 que presenta la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que el vector derivado de MVA de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como control en un procedimiento en el que se evalúa la eficacia como vacuna de un vector derivado del virus MVA, diseñado para ser utilizado en seres humanos, mediante el uso del vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que presenta la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que el vector derivado de MVA diseñado para ser utilizado en seres humanos.
34. Uso de un vector recombinante derivado del virus NYVAC según la reivindicación 33 en el que el vector recombinante derivado del virus NYVAC es el vector de la reivindicación 32 y el vector recombinante derivado de MVA que se utiliza en el procedimiento en el que se evalúa la eficacia como vacuna de otro vector recombinante derivado del virus MVA, diseñado para ser utilizado en seres humanos, es un vector recombinante de la reivindicación 12.
35. Uso según la reivindicación 34, en el que se evalúa la eficacia como vacuna del vector MVA-B y/o del vector MVA-C.
36. Un plásmido útil como intermedio en la obtención de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y/o en su caracterización que posee un inserto con las mismas secuencias codificantes que el vector recombinante derivado de MVA en cuya obtención se pueda utilizar, secuencias que se encuentran bajo el control de promotores idénticos situados en la misma disposición relativa uno con respecto al otro que deba presentar el correspondiente inserto en el genoma del vector recombinante derivado de MVA, y en el que el inserto esté flanqueado, en uno de sus extremos, por una secuencia correspondiente a uno de los extremos del locus que suponga el lugar de inserción en el genoma del vector recombinante y, en el otro extremo, por una secuencia más corta correspondiente al extremo contrario de dicho locus, presentando el plásmido adicionalmente un gen marcador situado entre la secuencia corta flanqueante del inserto y una secuencia más larga correspondiente al mismo extremo del locus del vector recombinante derivado de MVA en el que deba insertarse el inserto, todo ello en una disposición análoga a la del último plásmido representado en la Fig. 4b.
37. Plásmido según la reivindicación 36, en el que las secuencias flanqueantes corresponden al locus de timidina quinasa, las secuencias codificantes presentes en el inserto corresponden a las de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn, los promotores idénticos bajo cuyo control se encuentran dichas secuencias codificantes son promotores sintéticos pE/L y el gen marcador es LAC-Z.
38. Plásmido según la reivindicación 37, que es el plásmido pLZAW 1-89.6P-SIVgpn-18.
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