ES2392670T3 - Vectores recombinantes basados en el virus modificado de Ancara (MVA) como vacunas preventivas y terapéuticas contra el sida - Google Patents

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Abstract

Vectores Recombinantes basados en el Virus Modificado de Ankara (MVA) como Vacunas Preventivas y Terapéuticas contra el SIDA. Losvirus recombinantes de la invención contienen secuencias que se encuentran insertadas en el mismo sitio de inserción del MVA y permiten la expresión simultánea de varios antígenos, una proteína Env del VIH-I consistente en una proteína gpl20 carente de secuencias correspondientes a la proteína gp41, y una proteína quiméricade fusión de Gag, Pol y Nef. Son virus estables, que permiten eldesencadenamiento de respuestas inmunes contra gran variedad deantígenos. Aquellos cuya proteína quimérica deriva de secuenciaspropias del VIH-I son adecuados para preparar vacunas preventivaso terapéuticas contra el SIDA, especialmente para usarse protocolos de vacunación que comprenden varias dosis y distintos vectores, como indican ensayos realizados gracias a otros vectores de lainvención, con igual organización del genoma, pero cuya proteínaquimérica deriva de secuencias de SHIV patógenos.

Description

Vectores recombinantes basados en el virus modificado de Ankara (MVA) como vacunas preventivas y terapéuticas contra el SIDA
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a virus recombinantes que expresan antígenos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), diseñados para utilizarse como vacunas preventivas y terapéuticas contra el SIDA. Más concretamente, la invención se refiere a virus recombinantes basados en el virus Vaccinia Modificado de Ankara (MVA) que expresan simultáneamente la proteína de la envuelta gp120 y una proteína quimérica resultante de la fusión de Gag, Poi y Nef. La invención se refiere también a virus recombinantes basados en el virus Vaccinia Modificado de Ankara (MVA) que expresan antígenos del virus quimérico de la inmunodeficiencia de simio y humano (SHIV), válidos para ser utilizados para la inmunización de simios y poder comprobar el grado de protección que los simios adquieren al ser infectados con el virus SHIV, un híbrido de VIH y SIV. De esta manera se confirma en animales evolutivamente muy próximos a los seres humanos, susceptibles de ser infectados de forma natural por un virus similar al virus de la inmunodeficiencia humana, la eficacia como vacunas de dichos vectores derivados de MVA, lo que es un indicativo de la potencialidad de los vectores homólogos primeramente mencionados, los virus derivados de MVA que expresan antígenos del VIH-1, como vacunas eficaces para proteger a seres humanos contra el virus de la inmunodeficiencia humana.
Estado de la Técnica
Los datos de la OMS indican que en el año 2004 la enfermedad del SIDA había causado más de 23 millones de fallecimientos, con más de 40 millones de personas infectadas y con unas predicciones de sobrepasar los 60 millones de infectados para el año 2012. Las diferencias geográficas y económicas de esta enfermedad son evidentes, pues más del 95% de los casos y el 95% de las muertes por SIDA ocurren en el tercer mundo, la mayoría de ellas en el África subsahariana y el sudeste asiático, sobre todo entre jóvenes adultos y con un incremento progresivo entre las mujeres. De entre los países desarrollados, España continúa siendo el país con mayor número de personas infectadas de la Unión Europea, con unos 150.000 casos. Si bien es cierto que una mejora en los servicios sanitarios en muchas regiones contribuiría a disminuir la velocidad de transmisión del virus, existe consenso en la comunidad internacional de la urgente necesidad en desarrollar vacunas profilácticas y terapéuticas contra el SIDA que ayuden a solucionar el problema.
El desarrollo del SIDA .representa los últimos estadios de la infección causada por el retrovirus conocido como virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El VIH es un retrovirus que pertenece al genero Lentivirus, con un genoma de 9,-81<b. El virión contiene dos copias de ARN de banda sencilla y de polaridad positiva. En los primeros estadios de la infección, el ARN genómico, por medio de la transcriptasa en reverso o retrotranscriptasa (RT) que llega a la célula asociada al ARN viral, se convierte en ADN lineal de doble banda. Este ADN se transporta al núcleo, donde se integra en la célula hospedadora en forma de provirus, a partir del cual se transcriben los genes estructurales gag, poi y env, los genes reguladores, tat, rev, nef, y los genes accesorios vif, vpr y vpu. Los productos de la traducción de dichos genes son los siguientes:
•
El producto de la traducción del gen Gag es la poliproteína precursora gag-p55 que se procesa dando lugar a la proteína matriz p17, la proteína de la cápsida p24 y las proteínas de la nucleocápsida p6 y p7.
•
El procesamiento del precursor Poi da lugar a las tres enzimas víricas: la proteasa (p11), la retrotranscriptasa (p6S/S1) (RT) y la integrasa (p32) , de las que la RT posee actividad de ADN polimerasa (dependiente tanto de ARN como de ADN) y actividad endonucleasa (RNasa H), ambas requeridas durante la síntesis del ADN, mientras que la integrasa está involucrada en el proceso del integración del provirus, actuando como endonucleasa.
•
El producto del gen Env es una proteína de 88 kDa que está fuertemente glicosilada (gp160). Esta proteína es procesada por proteasas celulares, dando lugar a las proteínas gp120 y gp41 , que permanecen unidas por uniones no covalentes en la superficie del virión. En la glicoproteína gp120 se localizan los sitios de unión a los receptores celulares, el receptor CD4 y los correceptores CXCR4 (llamado X4) y CCR5 (llamado C5). Es a esta proteína a la que se debe mayoritariamente la variabilidad genética del virus VIH y su capacidad para escapar a la respuesta inmune tanto humoral como celular, por ser la que está más expuesta en la superficie del virus. Por su parte, la glicoproteína gp41 o transmembrana actúa como anclaje a la membrana lipídica. Tiene en su extremo amino terminal una zona hidrófoba altamente conservada, requerida para la fusión de la membrana vírica y la membrana plasmática celular durante el proceso de entrada del virus en la célula hospedadora.
•
Los genes reguladores y auxiliares son codificados por seis fragmentos de marco de lectura abierta solapante. Los genes Tat y Rev son necesarios para la replicación vírica en todas las células infectadas. El gen Tat codifica una proteína de 14 kDa que aumenta la expresión de los genes del VIH. El gen Rev
codifica una proteína de 19 kDa que facilita el transporte al citoplasma de los ARNm. La proteína Nef, de 210 aminoácidos, se asocia con estructuras de membrana e induce la internalización y degradación de moléculas de CD4 en los lisosomas. El gen Vif codifica una proteína necesaria para la propagación del virus en linfocitos de sangre periférica, macrófagos primarios y algunas líneas celulares establecidas. El gen Vpr codifica una proteína de 15 kDa que se asocia con la proteína de la nucleocápsida p6. La proteína Vpu es una fosfoproteína que facilita la disociación dentro de la célula infectada de la gp160 y CD4 por degradación de la molécula CD4 en el retículo endoplásmico.
En los extremos 5' y 3' del DNA viral se encuentran la secuencias L TR (long terminal repeats) , en las que se localizan importantes regiones reguladoras que juegan un papel primordial durante el proceso de retrotranscripción.
Se han identificado dos clases del virus: VIH-1 y VIH-2, de las que la segunda, VIH-2, parece ser menos patógena que la primera y se localiza sobre todo en la zona occidental de África. Es la forma que genera la enfermedad con mayor rapidez, VIH-1, la que se encuentra más extendida por el planeta y la que más se ha diversificado. Existen tres subtipos del VIH-1, denominados M, N Y 0, aunque más del 95% de todos los aislados del VIH a nivel global en la población, pertenecen al subtipo M. En función de las diferencias en la secuencia de nucleótidos, en especial en la parte correspondiente a las proteínas de la envuelta (Env), este subtipo se subdivide a su vez en ocho estirpes principales, a las que se alude generalmente como clades y que se denominan con las letras A, B, C, D, F, G, H Y J. Los clades B y C representan aproximadamente el 80% de las infecciones a nivel mundial, siendo el clade B el más representativo en Europa y América del Norte, mientras que el clade C es prevalente en África y Asia. Son abundantes las zonas en las que las dos clases están presentes en la población (China, India, África subsahariana), por lo que se piensa que las vacunas que contuvieran antígenos correspondientes a los dos clades, B y C, serían mucho más eficaces en dichas zonas.
Una posibilidad para el diseño de tales vacunas consiste en la generación de moléculas de ADN recombinante que contengan secuencias capaces de expresar proteínas del VIH, o fragmentos o formas de fusión de las mismas de forma que, al ser administradas a un individuo, se sintetizan dichas proteínas, fragmentos o formas de fusión de las mismas y se genera una respuesta inmune contra ella. Dichas moléculas de ADN recombinante pueden generarse a partir de genomas de virus en los que se han eliminado o inactivado regiones cuya expresión es necesaria para la replicación del virus en las células diana y/o en los que se han sustituido regiones que codifican proteínas no imprescindibles para que el virus desarrolle la parte de su ciclo vital que se desea que tenga lugar en la célula diana. En esos casos, el ADN recombinante puede administrarse en forma de partículas virales completas que facilitan la transfección del ADN recombinante a la célula diana. De entre los virus que se están utilizando como vectores, las formas modificadas del virus Vaccinia están entre los vectores virales más tentativos para ser aplicados como vacuna recombinante. Algunas de ellas, como el virus NYVAC, (cuyo genoma se representa en la parte inferior de la Figura 1), han sido generadas por mutagénesis dirigida con el resultado de la eliminación de 18 genes del virus Vaccinia (estirpe Copenhague), aproximadamente 10 kb. Otras, como el virus Vaccinia modificado de Ankara (MVA), han sido generadas de forma menos controlada; concretamente, el MVA se ha generado al haber pasado el virus por más de 570 pases seriados en cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo (CEF), lográndose una pérdida del 15% del genoma viral parental (1, 2) que supone deleciones en genes de los que algunos de ellos están intactos en el genoma del virus NYVAC (genes que se indican subrayando su nombre en la Figura 1) y otros han sido delecionados en ambos vectores (genes que aparecen con el nombre en negrita en la Figura 1), existiendo también genes que permanecen intactos en el genoma del virus MVA y que presentan deleciones en el genoma de NYVAC (los genes cuyo nombre aparece en cursiva en la Figura 1). En el virus MVA, los genes estructurales del virus han permanecido inalterados, mientras que genes involucrados en la evasión del sistema inmune (3), y genes relacionados con el rango de hospedador (2, 4, 5), han sido delecionados o fragmentados. MVA produce su ciclo infeccioso completo en células CEF y en células de riñón de Hámster (BHK), mientras que en líneas celulares humanas, incluyendo las células HeLa, tiene un ciclo abortivo (6, 7). Aunque la replicación viral depende del tipo celular, el bloqueo del programa de morfogénesis en las células no permisivas ocurre en los pasos posteriores a la formación de formas virales inmaduras (IV), sin haber alteraciones de la expresión de genes virales tempranos y tardíos (8, 9). En células en cultivo, los recombinantes de MVA producen niveles similares o mayores de proteína heteróloga que los vectores derivados de la cepa silvestre del virus Vaccinia WR (Western Reserve) (9-11), lo que le hace interesante como sistema de expresión. En mamíferos, recombinantes de MVA han demostrado inducir una inmunidad protectora frente a un amplio espectro de patógenos (6, 12-16), mostrando las siguientes ventajas como vector de expresión de antígenos heterólogos:
Alto nivel de seguridad, demostrada cuando se usó en más de 120000 individuos durante la campaña de
erradicación de la viruela en Alemania.
Avirulento en una amplia variedad de animales en condiciones inmunosupresoras.
Poca o nula reacción sistémica o local tras su inoculación en humanos, incluyendo individuos de alto riesgo.
Alta plasticidad y estabilidad de su genoma, lo que permite introducir grandes cantidades de material génico
exógeno.
Potente inductor de respuestas inmunes eficaces frente a una gran variedad de antígenos.
Dada su seguridad y capacidad de producir protección, puede ser de gran utilidad en la generación de vacunas vivas frente a enfermedades infecciosas y en la terapia del cáncer. Como cualquier otra vacuna dirigida a seres humanos, para llevar a cabo ensayos clínicos de la posible eficacia como vacunas de vectores derivados del MVA, es necesario obtener información previa sobre su comportamiento inmunogénico y su capacidad de conferir protección en modelos animales. En el caso del SIDA, sin embargo, no es sencillo encontrar un modelo animal adecuado. Las especies animales habituales que se usan para la experimentación con otras enfermedades, como pueden ser los ratones, no sirven como modelo de infección, al no replicarse en ellos ni el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) ni el equivalente de simio, el virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV). Sí es posible, sin embargo, obtener de los ratones información previa sobre el comportamiento inmunológico de los vectores en estudio que permita una evaluación previa de su posible eficacia y ayude a descartar o considerar interesante continuar con los ensayos. Además, el modelo de ratón transgénico que expresa el antígeno de histocompatibilidad humano MHC de clase I (HLA-A2) permite demostrar si la vacunación confiere presentación antigénica similar a la humana por parte del HLA-A2, que es prevalente en la población, algo que no se puede hacer, de momento, en primates, por no disponerse de primates transgénicos para dicho antígeno humano. Los estudios sobre la capacidad protectora conferida por la vacunación, sin embargo, requieren el uso de otros modelos distintos del modelo de ratón.
En esa línea, los modelos de primates no humanos se han convertido en una herramienta fundamental para evaluar en ensayos clínicos las vacunas candidatas contra el SIDA. La infección de chimpancés por el VIH-1 ha presentado grandes limitaciones como su elevado costo, su poca disponibilidad y la ausencia de síntomas clínicos. Se ha encontrado que el virus de la inmunodeficiencia de simios (o SIV, a partir de su nombre en inglés, simian immunodeficiency virus) es un modelo mucho más útil. Se trata de un lentivirus que infecta de forma natural diversos tipos de primates. Se han descrito cinco subgrupos del mismo. La forma aislada de macacos Rhesus (Macaca mulafta), a la que se denomina SIVmac, pertenece al primer tipo.
Al igual que sucede con el VIH, su genoma se caracteriza por presentar dos secuencias LTR en sus extremos 3' y 5', en las cuales se encuentran el promotor y las secuencias reguladoras o de unión a factores transcripcionales. Presenta tres marcos de lectura abierta para proteínas estructurales: gag, poi y env; marcos de lectura abierta para genes reguladores: nef, tat y rev, y los llamados genes accesorios: vif, vpr y vpx. Los miembros del subgrupo SIVmac comparten un alto grado de homología genética con el VIH-2.
Existen puntos comunes entre los virus SIV y VIH, entre los que se encuentran el tropismo celular, la organización genómica, las características ultraestructurales, el modo de transmisión, la respuesta del hospedador a la infección y los síntomas clínicos de la enfermedad, con la salvedad de las infecciones asintomáticas. Estas características han propiciado que los modelos basados en el virus SIV sean atractivos para la evaluación de la eficacia de candidatos a vacunas y el diseño de nuevas vacunas para ensayos en humanos.
La infección por SIV se caracteriza por un máximo de viremia en las dos primeras semanas, seguido por una disminución de los niveles virales hasta un punto que es variable y del cual dependerá la progresión de la enfermedad. El período de incubación viral es menor que en la infección por VIH. La variabilidad en la progresión de la enfermedad depende de la heterogeneidad genética de los macacos usados en los estudios, así como del virus empleado en el desafío y la ruta de exposición (intravenosa, mucosa o perinatal). Ante la infección por SIV, la respuesta del hospedador es parecida a la generada contra el VIH, pero difiere en la especificidad de los anticuerpos neutralizantes contra los antígenos de la envoltura.
El SIV presenta varias desventajas como modelo. En primer lugar, es un virus diferente al VIH; por tanto, las proteínas de la envuelta, que son el blanco fundamental de los anticuerpos neutralizantes, son muy divergentes en ambos modelos. Otra desventaja es que el virus SIV usa sólo el correceptor CCR5 para entrar en la célula, mientras que el VIH usa, además, otros correceptores como CXCR4, CCR2 o CCR3. Por esta y otras razones, la calidad y la eficacia de un candidato probado en este modelo no se considera necesariamente extrapolable a seres humanos.
Para soslayar estas desventajas, en 1991 se obtuvo por primera vez un virus híbrido entre el VIH y el SIV. Este virus se denominó SHIV (del inglés Simian-Human Immunodeficiency Virus) (25). Este híbrido contenía los genes env y tat del VIH y el resto del material genético del SIV. El SHIV fue capaz de infectar macacos Rhesus, aunque no era capaz de reproducir los sintomas caracteristicos del SIDA en los animales inoculados con él.
Con este primer híbrido, se dispuso de un modelo de infección en macacos útil para estudios de protección contra la infección, si bien este modelo aún no permitía concluir si los candidatos a vacunas eran capaces de proteger contra la enfermedad. Unos años más tarde, a través de pasos sucesivos por macacos y en cultivo, se lograron aislar varias variantes agresivas del SHIV capaces no sólo de infectar macacos, sino de producir un síndrome similar al SIDA. Estas cepas, adaptadas a multiplicarse en los animales así inoculados, provocaron depleción en los linfocitos CD4+ y la muerte de los macacos en menos de un año tras la inoculación. De entre estas variantes del SHIV, una de las más comúnmente utilizadas es la denominada SHIV89.6P, obtenida mediante pases seriados en macacos Rhesus del virus parental SHIV89.6, que contiene los genes gag, poi, vif, vpx, vpr y nef del virus de simio SIVmac239, mientras que los genes auxiliares tat, rev y vpu y el gen de las proteínas de la envuelta env proceden de un aislado citopático del HIV-1, el HIV89.6 (26,27). Gracias al virus SHIV89.6P y otros similares se cuenta con un modelo para evaluar la protección contra la enfermedad y la muerte conferida por posibles vacunas en desarrollo.
Gracias a este modelo ha sido posible realizar varios estudios en macacos que han demostrado la relevancia de vectores recombinantes de MVA como vacuna potencial frente al VIH, especialmente cuando se utilizan en sistemas combinados de inmunización en los que se emplean dos o más dosis de vacunación separadas en el tiempo, suministrándose al menos en la primera dosis un vector diferente al de las siguientes dosis, aunque los antígenos expresados a partir de cada uno de los vectores pueden ser los mismos. Para hacer referencia a estos protocolos de vacunación, en los que se suministra una primera dosis de desencadenamiento de la respuesta inmune con un vector que da lugar a la expresión de un antígeno y una o más dosis de potenciación o refuerzo de la respuesta inmune generada que contienen un vector diferente, pero que da lugar generalmente a la expresión del mismo antígeno, se emplea a menudo en español su denominación en inglés prime/boost. Estos protocolos se consideran especialmente adecuados para ser aplicados para la prevención o el tratamiento de las infecciones por el virus VIH pues, por una parte, evitan la administración de formas vivas atenuadas del virus, recurriéndose sólo a la utilización de componentes del mismo; por otra parte, el uso de vectores de expresión capaces de introducirse en las células en lugar de recurrir a la administración directa de las proteínas que expresan posibilita que las proteínas que deben actuar como antígenos se encuentren presentes en el citoplasma de las células hospedadoras para que se produzca su procesamiento mediante la ruta de presentación de antígenos del MHC de clase 1, lo que es necesario para desencadenar una respuesta inmune de células T, particularmente respuestas citotóxicas inmunes asociadas con linfocitos T C08+. Por último, el uso de vectores diferentes en cada una de las dosis disminuye la probabilidad de que el vector de vacunación como tal sea eliminado rápidamente por el sistema inmune del hospedador, evitándose la potenciación de la respuesta inmune dirigida contra las partes constituyentes del vector que no proceden del microorganismo contra el que se busca protección.
En los estudios con macacos (12), los vectores recombinantes derivados del MVA están demostrando ser particularmente útiles para ser utilizados en protocolos combinados de inducción y potenciación de la respuesta inmune con vectores diferentes, en especial cuando el recombinante derivado del MVA se administra en la segunda y/o en alguna dosis posterior a esta y expresa, al igual que el vector utilizado en la primera dosis, múltiples antígenos de VIH y SIV (Virus de la Inmunodeficiencia de Simio). La respuesta de células T citotóxicas y de memoria generada demuestra el potencial de los recombinantes de MVA como vacunas frente al virus VIH (17).
Por ello, se han diseñado distintos vectores recombinantes, basados en el MVA, capaces de expresar diversos antígenos del VIH. Intentando buscar formas más eficaces para generar una respuesta protectora, se han construido vectores capaces de expresar más de una proteína de dicho virus, en ocasiones formando proteínas de fusión. Así, por ejemplo, las solicitudes de patente WO 02/072754 y WO 2004/087201 describen en general vectores derivados del MVA que expresan las proteínas Env, Gag y Poi (rMVA), considerando como una opción adicional la posibilidad de que el antígeno inmunizante incluya también secuencias de vif, vpr, tal, rev, vpu o nef, aunque sin discutir que la expresión de alguna de esas secuencias tenga gran importancia de cara a la posible respuesta de protección generada, ni utilizando esa opción en las realizaciones de la invención. Aunque en dichas solicitudes de patentes internacionales se menciona que las secuencias de vif, vpr, tat, rev, vpu o nef, así como las correspondientes a env, gag y poi, pueden en general codificar sólo fragmentos de la correspondiente proteína, y/o presentar mutaciones, es una característica definitoria de la invención que se intenta proteger en dichas solicitudes internacionales que el gen env carezca de parte o de la totalidad de los nucleótidos que codifican el dominio citoplasmático de gp41. Wyatt et al. (AIOS Research and Human Retroviruses, Mary Ann Liebert, US, vol. 20, no. 6, 1 Junio 2004, páginas 645-653) han divulgado vectores derivados de MVA con las mismas características.
El estado de la técnica no describe específicamente la posibilidad de que la parte codificante correspondiente a la proteína gp41 se elimine en su totalidad ni discute las posibles consecuencias que esto tendría. Sí se menciona en cambio en los ejemplos de ambas solicitudes de patente, tal como Wyatt et al. mencionan en el resumen de su artículo, que dichas proteínas de la envuelta, gracias al truncamiento de la proteína gp41, ven facilitada su acumulación en la membrana de las células que la expresan, lo que se trata como un efecto positivo buscado. También se trata como un efecto positivo deseado la formación de partículas similares a virus VIH en las que están presentes proteínas Gag y Env y que se pueden detectar, entre otras localizaciones, en el exterior de las células en las que las correspondientes proteínas se han expresado. Respecto al lugar de inserción de las secuencias expresadas, no se menciona que este hecho tenga una importancia especial salvo para manifestar como positivo el hecho de que la elección del sitio de la deleción 111 como uno de los lugares en los que se insertan secuencias permite que el recombinante MVA siga siendo TK+. Ello implica que el vector recombinante MVA descrito en dicho estado de la técnica exprese timidina quinasa y, por consiguiente, mantenga una cierta virulencia. Tampoco se discute que tenga relevancia alguna que se utilice más de un lugar de inserción para incluir en el vector las secuencias que codifican los antígenos que se desean expresar, no describiéndose pruebas para demostrar la estabilidad de dichos vectores.
La solicitud de patente WO 2004/035006 describe también vectores derivados de MVA que contienen secuencias codificantes de varias proteínas de VIH que se expresan en forma de proteínas de fusión, concretamente una fusión Gag-Poi y una fusión nef-tat. Sin embargo, su enfoque es diferente al de las solicitudes internacionales anteriormente comentadas: el objetivo de esta solicitud de patente es que no haya empaquetamiento en proteínas virales. La solución propuesta es que al menos una de las secuencias codificantes de proteínas del VIH esté unida a una secuencia líder heteróloga, siendo la del tPA la secuencia que se elige para las realizaciones correspondientes a vectores derivados del MVA y promoviéndose de esta manera la secreción de las proteínas sintetizadas. En lo que se refiere a la inserción de las secuencias, además, se muestra preferencia por el sitio de la deleción 111, utilizándose de nuevo en un mismo vector un segundo lugar de inserción de secuencias adicionales, el de la deleción 11, para una proteína de fusión tPA-nef-tat, sin considerar que esto pueda tener consecuencias para la estabilidad del vector ni realizar experimentos para verificar que realmente sea estable. Además, la única forma considerada para la secuencia env, delta V2 env, posee deleciones en la parte correspondiente a la proteína gp120, no considerándose de nuevo la posibilidad de eliminar la proteína gp41 ni las posibles consecuencias derivadas de ello.
Scheiflinger et al. (Archives of Virology, Springer Wien, AT, vol. 141, no. 3/04, 1 enero 1996, páginas 663-669) describen virus MVA recombinantes que expresan genes exógenos cuyo sitio de inserción es el locus de timidina quinasa. Los genes exógenos están insertados en el gen de la timidina quinasa, que está interrumpido por los genes foráneos. Así, los virus MVA recombinantes son TK-, pero la secuencia codificante del gen TK, aunque interrumpido, permanece en los geno mas recombinantes. Los virus recombinantes resultantes se describen como difíciles de crecer, manejar y purificar, requiriendo la inserción de un gen adicional TK (el gen de timidina quinasa del virus de la viruela aviar) para superar estos inconvenientes.
La presente invención, por su parte, proporciona distintos vectores recombinantes, basados en el virus MVA, capaces de expresar diversos antígenos del VIH, que responden a un enfoque diferente a los descritos en solicitudes de patente anteriores. Estos vectores recombinantes derivados del MVA poseen secuencias que permiten la expresión simultánea de la proteína gp120 y de una proteína de fusión Gag-Pol-Nef. Tanto la secuencia que expresa la proteína gp120 como la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se encuentran insertadas en un mismo lugar, el correspondiente al gen de la timidina quinasa. Este hecho aumenta la estabilidad de los vectores, al utilizar un único sitio de inserción con respecto a otros vectores derivados también del MVA que contienen varias secuencias codificantes de proteínas del VIH, dado que estos últimos, al llevar insertas cada una de las secuencias en un lugar diferente de inserción, pierden con facilidad los insertos presentes en ellos. Además, la utilización específica del/ocus de la timidina quinasa como lugar de inserción da lugar a que los vectores objeto de la invención sean virus recombinantes derivados del MVA que presentan una mayor seguridad para ser utilizados como vacunas, por carecer de un gen, el de la timidina quinasa, involucrado en virulencia. A diferencia de lo descrito en solicitudes como WO 02/072754 y WO 2004/087201, la expresión de la proteína gp120 en ausencia de secuencias correspondientes a la proteína gp41, permite su liberación al medio extracelular pocas horas después de su síntesis en el citoplasma de la célula infectada, facilitándose con ello la inducción tanto de respuesta humoral como celular frente a esta proteína, la proteína que mayor variabilidad presenta en su secuencia entre los distintos clades.
Los virus recombinantes de la presente invención expresan al menos cuatro antígenos: Env, Gag, Poi y Nef, por considerarse que un vector que exprese esos cuatro antígenos es mucho más eficaz que vectores recombinantes capaces de expresar sólo alguno de dichos antígenos o incluso otros, por la capacidad de los antígenos elegidos para inducir respuestas celulares específicas y por la menor diversidad genética que existe entre aislados del VIH en lo que a las secuencias de Gag, Poi y Nef se refiere. Además, se considera una característica particularmente importante de la invención la presencia de secuencias correspondientes al gen regulador nef, junto con las correspondientes a los genes estructurales gag, poi y env, pues se expresa en etapas tempranas del ciclo del VIH y la generación de una respuesta celular frente a sus productos se considera necesaria para aumentar el repertorio de defensa inmunológica contra el VIH y conseguir una respuesta protectora adecuada que permita el control inmunológico de la infección por el VIH-1. La asociación de las secuencias codificantes de gag, poi y nef se ha realizado en los vectores objeto de la invención de forma que se generara una proteína de fusión que mantuviera todos los epítopos con capacidad para generar respuesta celular, posibilitando una mayor presentación antigénica que otros vectores que expresan fusiones que corresponden sólo a las proteínas Gag y Poi, pero generándose una proteína de fusión que no se proteoliza por acción de la proteasa viral, no da lugar a la formación de partículas virales y que, al contrario de lo que sucedía con las proteínas expresadas en otros vectores de la técnica anterior, se acumula en el citoplasma en forma de una poliproteína estable. El uso de un promotor sintético idéntico para dirigir la expresión tanto de la proteína gp120 como de la fusión Gag-Pol-Nef, -un promotor eligido para que permita la expresión de las correspondientes proteínas tanto a tiempos tempranos como a tiempos tardíos durante la replicación del MVA -, permite la expresión simultánea de las secuencias de la gp120 y de la proteína quimérica Gag-Pol-Nef, su acumulación a lo largo del ciclo de infección del MVA y el procesamiento antigénico de las mismas a tiempos tempranos y tardíos.
Un grupo de los vectores objeto de la invención han sido diseñados específicamente para la vacunación de seres humanos. En estos vectores, tanto la secuencia de la proteína gp120 como la secuencia de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se han generado a partir de secuencias del virus de la inmunodeficiencia humana VIH-1. La utilización para la generación de los vectores recombinantes de secuencias obtenidas específicamente de aislados naturales y que preferentemente pertenecen a los clades del VIH-1 más representados en la naturaleza, (los clanes B y C), posibilita además una vacunación mundial más representativa de la población infectada o en riesgo. Por todo ello, el uso de estos vectores para vacunación, de forma aislada o como parte de protocolos de inmunización en los que se suministran vectores codificantes de antígenos en varias dosis espaciadas en el tiempo, se ha considerado que puede ser de especial utilidad para ayudar a contener la expansión del virus VIH. Además, estos vectores derivados del virus MVA representan tanto una alternativa a construcciones similares derivadas del virus NYVAC como un complemento útil para la utilización de cada uno de los mencionados vectores recombinantes en fases diferentes de protocolos de inmunización durane los cuales se suministra una o dos dosis para desencadenar la respuesta inmune y una o más dosis sucesivas para potenciarla, pues las pruebas realizadas hasta ahora por el grupo de los inventores muestran que, además de diferir en su genoma y en la respuesta inmune que generan en ratones frente a los antígenos del VIH gp120 y Gag-Pol-Nef, ambos vectores manifiestan un comportamiento diferente en cultivos celulares y modelos animales (inducción de diferentes patrones de expresión de genes humanos en células HeLa, menor inducción por parte del MVA de apoptosis que el vector NYVAC, induciendo éste último mayor destrucción celular y respuesta humoral contra sí mismo (28». Este comportamiento diferencial hace predecible que su comportamiento sea diferente también tras haber sido administrados a seres humanos como vacunas de vectores recombinantes generados a partir de cada uno de ellos.
Tal como se describe más adelante en la sección de Ejemplos de la presente memoria, los ensayos realizados en ratones demuestran la capacidad inmunogénica de estos vectores objeto de la invención diseñados para la vacunación de seres humanos y, en particular, de las dos realizaciones de vectores de la invención con las que se llevaron a cabo los ensayos, los vectores MVA-B y MVA-C. Sin embargo, para poder evaluar su capacidad para conferir protección para controlar la infección por el VIH, es necesario acudir a un modelo de primates no humanos, como puede ser el de los macacos Rhesus anteriormente descritos, de forma que estos animales sean sometidos a un protocolo de desencadenamiento/potenciación de la respuesta inmune y en los que se evalúe posteriormente la capacidad para controlar la infección que la respuesta inmune generada sea capaz de conferir tras "desafiar" la misma mediante la inoculación de un virus capaz de infectar a los macacos y de dar lugar en ellos a síntomas similares a los del SIDA. Para este tipo de desafío sería adecuada una de las variantes patogénicas del SHIV mencionadas anteriormente. Este tipo de ensayos, sin embargo, no pueden realizarse con los vectores de la invención diseñados para la vacunación de seres humanos, vectores cuyos insertos codifican proteínas exógenas al virus MVA que derivan todas ellas de secuencias de proteínas propias del VIH-1. Requieren la generación de vectores especiales que cumplan varias condiciones:
a) Contener secuencias codificantes retrovirales del mismo origen que las contenidas en el virus que vaya a utilizarse en el desafío. Este virus puede muy bien ser el SHIV, de manera que la secuencia correspondiente al gen env procederá del VI H-1 , mientras que las posibles secuencias correspondientes a otros genes, como puedan ser gag, poi o nef, procederán del SIV.
b) Presentar la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que los vectores diseñados para uso en humanos con los que se quieren comparar.
El cumplimiento de estas condiciones permite que el estudio sea factible y que se puedan extrapolar de sus resultados el comportamiento esperable al utilizar en seres humanos los vectores con los que se los quiere comparar. La presente invención proporciona también vectores que permiten valorar la capacidad protectora que podría generarse en seres humanos que fueran vacunados con los virus recombinantes objeto de la presente invención, derivados del virus MVA y con secuencias exógenas derivadas todas ellas de secuencias de proteínas del VIH-1. Adicionalmente, se proporcionan también vectores recombinantes análogos construidos a partir de otro derivado de poxvirus, el virus NYVAC, para poder comparar el efecto de ambos.
Descripción de la invención
La invención proporciona nuevos vectores recombinantes derivados del virus MVA capaces de expresar simultáneamente una forma de la proteína Env del VIH-1 que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 y una proteína de fusión correspondiente a las proteínas Gag, Poi y Nef del virus VIH-1 que no se proteoliza por acción de la proteasa del VIH, estando las secuencias de la proteína Env y de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef bajo el control de promotores idénticos e insertadas ambas en el mismo sitio de inserción del vector. Estos vectores objeto de la invención, en los que las secuencias codificantes de antígenos exógenos al MVA se derivan todas ellas de secuencias propias del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), han sido diseñados para poder fabricar con ellos medicamentos que puedan utilizarse como vacunas preventivas o terapéuticas contra el SIDA en seres humanos. Para ello, y para diferenciar los vectores de la presente invención que se describirán más adelante y que comprenden secuencias derivadas del vius SIVmac y han sido diseñados para ser administrados a macacos, en la presente memoria se alude en ocasiones a los primeros vectores objeto de la invención con expresiones como "los vectores objeto de la invención diseñados para la vacunación de seres humanos', "los vectores derivados del MVA diseñados para la vacunación de seres humanos", o con expresiones similares. Por claridad de la descripción cuando se usan estas expresiones, en ocasiones se alude a dichos vectores como "los vectores en los que las secuencias codificantes de antígenos exógenos al MVA se derivan todas ellas de secuencias propias del VIH-1".
Así, la invención se refiere también tanto a composiciones que contienen dichos vectores recombinantes como al uso de dichos vectores para la fabricación de un medicamento destinado a ser utilizado como vacuna para ayudar a prevenir o tratar la infección provocada por el virus VIH.
La expresión de la proteína Env sintetizada a partir de los vectores de la presente invención da lugar a proteínas gp120 no asociadas a proteínas gp41 o fragmentos de la misma, facilitándose con ello su salida de la célula y su liberación al medio, lo que a su vez hace más probable la activación de las células B y la producción de anticuerpos neutralizantes frente al VIH. En las realizaciones preferidas de los vectores de la presente invención, la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env que forma parte de los vectores objeto de la invención codifica una proteína gp120 completa, habiéndose delecionado toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp120, eliminando con ello la totalidad de la secuencia codificante correspondiente a la proteína gp41.
La proteína de fusión de Gag, Poi y Nef está diseñada de tal manera que no da lugar a la formación de partículas similares a partículas virales. La forma utilizada para la construcción de las realizaciones de la invención, que se describen con detalle en la presente memoria, se acumula en el citoplasma de las células infectadas con los vectores recombinantes objeto de la invención en forma de poliproteína, sin experimentar el procesamiento característico del virus VIH provocado por la proteasa viral que daría lugar a su escisión en proteínas más pequeñas, aunque posteriormente sí va a experimentar el procesamiento celular que permite la presentación de péptidos antigénicos de la proteína de fusión y la generación de una respuesta inmune contra los mismos.
El sitio del vector en el que se encuentran insertadas las secuencias de la proteína Env y de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef es el gen de la timidina quinasa, gen que queda inactivado por deleción por la presencia de las secuencias insertadas en su lugar, aumentándose con ello la seguridad de los vectores objeto de la invención para ser administrados a individuos con el propósito de generar en ellos una respuesta inmune frente al VIH. En las realizaciones preferidas de dichos vectores de la presente invención, diseñados para la vacunación de seres humanos, la secuencia codificante de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se genera a partir de secuencias de proteínas Gag, Poi y Nef para las que se deduce una secuencia de ADNc utilizando codones de lectura frecuentes en mamíferos, buscando con ello aumentar los niveles de expresión de la proteína de fusión. Además, en la secuencia codificante de la proteína de fusión, se provocan modificaciones respecto a las secuencias naturales, para aumentar su inmunogenicidad y su seguridad. Las modificaciones por las que se tiene preferencia incluyen la inactivación por mutagénesis del sitio activo de la proteasa y la eliminación mediante deleción del sitio activo de la integrasa, la realización de deleciones en el gen nef y su inserción en la región codificante de la RT, la traslocación del sitio activo de la RT al extremo e-terminal de la proteína de fusión y la fusión de la secuencia del gen gag en fase de lectura con pol-nef, creando una desviación de una fase de lectura e introduciendo un cambio de glicina a alanina para prevenir la formación de partículas semejantes a virus. De entre ellas, se prefiere específicamente las modificaciones realizadas para generar la secuencia correspondiente a la proteína de fusión descritas por Didierlaurent A. el al. (18). Un esquema de los elementos que conforman una proteína de fusión Gag-Pol-Nef que cumple todas estas características se muestra en la zona inferior de la Figura 40, marcada como GagPolNef (gpn).
En las realizaciones preferidas de los vectores de la presente invención diseñados para la vacunación de seres humanos, el promotor se escoge de manera que permita la expresión de la proteína Env y de la proteína de fusión Gag-Pol-Env tanto en etapas tempranas como tardías del ciclo infectivo del virus MVA. El promotor sintético temprano/tardío de poxvirus pE/L (19) es la opción elegida para las realizaciones más preferidas de la invención, aunque cualquier otro promotor de poxvirus podría utilizarse igualmente para la construcción de los vectores objeto de la invención.
En una realización particularmente preferida de los vectores objeto de la invención diseñados para la vacunación de seres humanos, en los que las secuencias codificantes de antígenos exógenos al MVA se derivan todas ellas de secuencias propias del VIH-1, tanto la secuencia correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia que da lugar a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden de aislados naturales del clade By/o e. En realizaciones aún más preferidas de la presente invención, la secuencia correspondiente a la proteína Env y las secuencias utilizadas para generar la secuencia que da lugar a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden de aislados naturales pertenecientes a un mismo clade, preferentemente el clade B o el clade e, pero también se consideran realizaciones de la invención aquellas en las que la secuencia correspondiente a la proteína Env procede de un aislado de un clade y las secuencias utilizadas para generar la secuencia que da lugar a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef proceden de un aislado de un clade diferente. Están incluidas también dentro del alcance de la presente invención aquellas realizaciones en las que al menos una de las secuencias utilizadas para generar la secuencia correspondiente a la proteína de fusión, es decir, la secuencia de gag, la secuencia de poi o la secuencia de nef, procede de un aislado diferente, pudiendo ser diferentes los tres aislados de los que se obtiene cada una de las correspondientes secuencias codificantes e, incluso, no pertenecer al mismo clade. Las composiciones de la presente invención que contienen los vectores recombinantes objeto de la invención, destinadas a ser utilizadas en la vacunación contra el virus VIH, pueden contener vectores recombinantes generados únicamente a partir de aislados de un clade concreto, preferentemente el clade B o el e, mezclas de vectores recombinantes de distintos clades en las que cada uno de los vectores se ha construido con secuencias procedentes de aislados de un único clade, vectores idénticos entre sí que se han construido a partir de secuencias procedentes de aislados de ciad es diferentes o mezclas de cualquiera de los vectores incluidos dentro del alcance de la invención. Se prefieren aquellas composiciones que contengan vectores de la invención generados a partir de un único clade, preferentemente el clade B o el e, o mezclas de vectores generados a partir de aislados del clade B y vectores generados a partir de aislados del clade e. Las composiciones que contengan tanto vectores generados a partir de aislados del clade B y vectores generados a partir de aislados del clade e deberían ser de especial utilidad para ser utilizadas para la prevención y/o el tratamiento de la infección por el VIH en aquellas zonas en las que ambos dades están representados de forma significativa.
En las realizaciones de la invención cuya construcción se describe en ejemplos de la presente memoria, la secuencia correspondiente a la proteína Env se encuentra insertada en dirección opuesta con respecto a la dirección de la transcripción de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef. Los promotores de cada una de las secuencias correspondientes a proteínas del VIH están insertados en direcciones opuestas y en la zona más interna del inserto. Cada uno de los vectores de la presente invención diseñados para la vacunación de seres humanos cuya construcción se describe se generaron a partir de aislados naturales correspondientes a dades diferentes. El primero de ellos, el vector MVA-B, permite la expresión de una forma del gen env obtenida a partir del aislamiento del VIH BX08, procedente de Europa, y una proteína de fusión Gag-Pol-Nef que resulta de la traducción de una secuencia polinudeotídica generada a partir de secuencias correspondientes a genes gag, poI y nef obtenidos del aislado IIIB, que forma parte, como el aislamiento BX08, del clade B. El segundo de los vectores, el vector MVA-C, permite la expresión una forma del gen env obtenida a partir del aislado del VIH CN54, procedente de China, y una proteína de fusión Gag-Pol-Nef que resulta de la traducción de una secuencia polinudeotídica generada a partir de secuencias correspondientes a genes gag, poI y nef del mismo aislamiento CN54, que forma parte del dade C. Las secuencias de aminoácidos expresadas a partir de cada uno de los genes env contenidos en los vectores derivados de MVA reproducen la secuencia completa de las proteínas gp120 de los virus del aislado BX08, en el caso del MVA-B, y los virus del aislado CN54 en el caso del MVA-C. La construcción de estos vectores y la evaluación de su capacidad inmunogénica en ratones se describen más tarde en este documento con ayuda de las Figuras 1 a 38 y los Ejemplos 1 a 32 en secciones que aparecen más adelante en esta memoria. Sin embargo, como se ha comentado anteriormente, los ratones no son un modelo adecuado para evaluar la capacidad para controlar la infección del VIH que los vectores sean capaces de conferir a seres humanos inmunizados con ellos. Para ello es más adecuado recurrir a animales evolutivamente más próximos a los seres humanos, como pueden ser primates no humanos tales como los macacos Rhesus, a los que se les puede inocular un virus capaz de infectar a dichos animales y de producir en ellos un síndrome similar al SIDA. Algunas variantes patogénicas del virus SHIV como SHIV89.6P cumplen las características anteriores. Desafiar la respuesta inmunogénica producida por uno o más vectores de vacunación con una variante del virus SHIV implica que la inmunización no puede realizarse con los vectores de la invención anteriormente descritos, que están diseñados para expresar proteínas derivadas de secuencias propias del virus contra cuya infección se busca protección, -el VIH-1 -, pues no se reproducirían en el ensayo las condiciones del proceso que sucedería en la infección de un ser humano. Por ello, la evaluación de la capacidad de control de la infección que puedean conferir los vectores de la presente invención diseñados para la vacunación de seres humanos requiere la generación de vectores especiales que cumplan varias condiciones:
a) Contener secuencias codificantes retrovirales del mismo origen que las contenidas en el virus utilizado en el desafio, -virus que puede ser el SHIV-, de manera que la secuencia correspondiente al gen env procederá del VIH-1 mientras que las posibles secuencias correspondientes a otros genes, como puedan ser gag, polo nef, procederán del virus SIV);
b) Presentar la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que los vectores diseñados para uso en humanos con los que se quieren comparar.
La invención proporciona también vectores que cumplen estas características, que son también un objeto de la presente invención. Así, la invención se refiere también a nuevos vectores recombinantes derivados del virus MVA capaces de expresar simultáneamente una forma de la proteína Env del VIH-1 que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 y una proteína de fusión que contiene secuencias de las proteínas Gag, PoI y Nef del virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV), y en los que la secuencia correspondiente a la proteína Env y la secuencia correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef están bajo el control de promotores idénticos e insertadas ambas en el mismo sitio de inserción del vector. En estos vectores, por tanto, a diferencia de los vectores objeto de la invención diseñados para la vacunación de seres humanos, la proteína de fusión correspondiente a las proteínas Gag, PoI y Nef no se sintetiza a partir de secuencias procedentes de VIH-1, sino de secuencias procedentes del SIVmac (virus de la inmunodeficiencia de simio aislado de macacos). Ello permite su utilización en protocolos de inmunización de macacos y en el posterior desafío de la inmunidad creada con un virus SHIV patógeno en el que la secuencia del gen env deriva de la correspondiente secuencia de un aislado del VIH-1, mientras que las secuencias correspondientes a los genes gag, poI y nef corresponden al virus de simio que infecta a macacos. De esta manera, al cumplirse la condición de que las secuencias codificantes retrovirales contenidas en los vectores objeto de la invención diseñados para realizar ensayos en macacos tengan su origen en el mismo tipo de virus que las presentes en el retrovirus que vaya a utilizarse en el desafío, la inmunidad generada frente a las proteínas sintetizadas a partir de dichos vectores podrá servir para controlar la infección desencadenada por el retrovirus que se inocule en el desafío.
Para que tenga sentido el establecimiento de paralelismos entre los resultados observados en macacos y los que podrían esperarse en seres humanos, los vectores objeto de la invención diseñados para realizar ensayos en macacos cumplen la condición de presentar la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que los vectores objeto de la invención diseñados para la vacunación de seres humanos con los que se quieren comparar. De acuerdo con ello, de forma análoga a los vectores en los que las secuencias codificantes de antígenos exógenos al MVA se derivan todas ellas de secuencias propias del VIH-1, la expresión de la proteína Env sintetizada a partir de los vectores objeto de la invención diseñados para ser utilizados en macacos da lugar a proteínas gp120 no asociadas a proteínas gp41 o a fragmentos de la misma, facilitándose con ello su salida de la célula y su liberación al medio, lo que a su vez hace más probable la activación de las células B y la producción de anticuerpos neutralizantes frente al VIH. En las realizaciones preferidas de la presente invención, la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env que forma parte de los vectores objeto de la invención codifica una proteína gp120 completa, habiéndose delecionado toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp120, eliminando con ello, la totalidad de la secuencia codificante correspondiente a la proteína gp41. Un esquema referente a la secuencia de la proteína Env que forma parte de los vectores objeto de la invención se muestra en la parte superior de la Figura 40. El último gráfico corresponde a la secuencia de una proteína gp120 expresada a partir de vectores objeto de la invención, y muestra que se ha eliminado la totalidad de la secuencia codificante de la proteína gp41, mientras los gráficos previos representan proteínas de la envuelta con secuencias correspondientes a la proteína gp41.
En cuanto a la proteína de fusión de Gag, Poi y Nef, -también de forma análoga a la proteína homóloga sintetizada a partir de los vectores en los que la correspondiente secuencia codificante deriva de secuencias propias del VIH-1-, está diseñada de manera que no dé lugar a la formación de partículas similares a partículas virales. La forma utilizada para la construcción de las realizaciones de los vectores objeto de la presente invención que se describen con detalle en la presente memoria se acumula en el citoplasma de las células infectadas con los vectores recombinantes objeto de la presente invención en forma de poliproteína, sin experimentar el procesamiento característico del virus VIH provocado por la proteasa viral que daría lugar a su escisión en proteínas más pequeñas, aunque posteriormente sí va a experimentar el procesamiento celular que permite la presentación de péptidos antigénicos de la proteína de fusión y la generación de una respuesta inmune contra los mismos.
Tal como se ha comentado anteriormente, la utilidad principal de los vectores objeto de la presente invención que comprenden secuencias derivadas del virus SIVmac es la de ser utilizados en protocolos de inmunización para extraer datos sobre la posible utilidad como vacunas de vectores diseñados para ser administrados a seres humanos, que deben tener la misma estructura de organización génica, promotores y sitio de inserción. Es por ello que las realizaciones equivalentes a las realizaciones preferidas de los vectores objeto de la presente invención diseñados para la vacunación de seres humanos (exceptuando las que se refieren a aislados del VIH-1 como origen preferido de las secuencias codificantes de las proteínas Env y Gag-Pol-Nef) son también realizaciones preferidas de los vectores diseñados para realizar ensayos en macacos. Así, el lugar del vector en el que se encuentran insertadas las secuencias de la proteína Env y de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef es el gen de la timidina quinasa, puesto que es un gen relacionado con la virulencia que queda inactivado por deleción por la presencia de las secuencias en él insertadas, aumentándose con ello la seguridad de los vectores.
En las realizaciones preferidas, la secuencia codificante de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se genera a partir de secuencias de proteínas Gag, Poi y Nef para las que se deduce una secuencia de ADNc utilizando codones de lectura frecuentes en mamíferos, buscando con ello aumentar los niveles de expresión de la proteína de fusión. Además, en la secuencia codificante de la proteína de fusión se han provocado modificaciones respecto a las secuencias naturales, para aumentar su inmunogenicidad y su seguridad. Las modificaciones por las que se tiene mayor preferencia incluyen la inactivación por mutagénesis del sitio activo de la proteasa y la eliminación mediante deleción del sitio activo de la integrasa, la realización de deleciones en el gen nef y su inserción en la región codificante de la RT, la traslocación del sitio activo de la RT al extremo C-terminal de la proteína de fusión, y la fusión de la secuencia del ge, gag en fase de lectura con pol-nef, creando una desviación de una fase de lectura e introduciendo un cambio de ~ Ilicina a alanina para prevenir la formación de partículas semejantes a virus. De entre ellas, se prefiere especifican lente las modificaciones realizadas para generar la secuencia correspondiente a la proteína de fusión descrita por Didierlaurent A. et al. (18). Tal como sucedía en el caso de las proteínas Gag-Pol-Nef derivadas de secuencias propias del VIH-1, las proteínas de fusión Gag-Pol-Nef que cumplen todas estas características, aunque derivétdas en este caso de secuencias propias del virus SIVmac, están representadas por el esquema que se muestra en 13 zona inferior de la Figura 40, marcada como GagPolNef (gpn).
En las realizaciones preferidas de la invención, el promotor se escoge de manera que permitan la expresión de la proteína Env y de la proteína de fusión Gag-Pol-Env tanto en etapas tempranas como tardías del ciclo infectivo del virus MVA. El promotor sintél co temprano/tardío de poxvirus pE/L (19) es la opción elegida para las realizaciones más preferidas de la invenCÍI In, aunque cualquier otro promotor de poxvirus podría utilizarse igualmente para la construcción de los vectores ebjeto de la presente invención.
En los Ejemplos 1 y 19 se de;cribe, respectivamente, la construcción de los vectores denominados MVA-B y MVAC, que suponen sendas realiz 3ciones de los vectores objeto de la presente invención, diseñados para la vacunación de seres humanos, que cump en todas las características preferidas para estos vectores de la invención. En ellos, la secuencia correspondiente a 13 proteína Env se encuentra insertada en dirección opuesta con respecto al sentido de la transcripción de la proteína ele fusión Gag-Pol-Nef, encontrándose los promotores correspondientes a cada una de las secuencias correspondien es a proteínas del VIH insertados en orientaciones opuestas y en la zona más interna del inserto.
Para poder extraer datos sobre la posible protección que estos vectores conferirían a seres humanos vacunados con ellos, en la presente memoria se describe la construcción de un vector, obtenido igualmente a partir del virus MVA, que posee, igualmente insertado en el locus de timidina quinasa, un inserto que comprende la secuencia codificante de una proteína de fusión Gag-Pol-Nef generada a partir de secuencias del virus SIVmac en la que se han realizado todas las modificaciones antes mencionadas, detalladas en la publicación de Didierlaurent et al. (18) y bajo el control de un promotor sintético temprano/tardío pE/L, así como la secuencia codificante de una proteína gp120, procedente de un virus VIH-1, que carece totalmente de parte codificante correspondiente a la proteína gp41, igualmente bajo el control de un promotor sintético temprano/tardío pE/L, estando los promotores correspondientes a cada una de las secuencias correspondientes a proteínas del VIH insertados en orientaciones opuestas y en la zona más interna del inserto. A los vectores que cumplen estas características se les ha denominado, de forma general vectores MVASHIV.
Para realizar el desafio posterior a la administración del vector MVA-SHIV cuya construcción se describe más adelente en la presente memoria, se ha elegido el virus quimérico de simio y humano SHIV89.6P. Por ello, para poder realizar los experimentos de valoración de la protección conferida por la inmunización con el vector en condiciones óptimas, se ha construido un vector MVA-SHIV cuyo genoma contiene un inserto del que forman parte tanto la secuencia codificante de la proteína 89.6P-gp120, es decir, una secuencia correspondiente a la proteína Env del virus SHIV89.6P (originariamente procedente del aislado 89.6 del virus VIH-1), modificada para que carezca totalmente de la parte correspondiente a la proteína gp41, como secuencias codificantes de los antígenos Gag, Poi y Nef de dicho virus SHIV89.6P (originariamente procedentes del virus de la inmunodeficiencia de simio, aislado de macacos, SIVmac239), a partir de las cuales se ha generado la secuencia correspondiente a la proteína de fusión SIVgpn realizando en ellas las modificaciones preferidas de la presente invención. Es por ello que al vector construido de esta manera se le denomina específicamente vector MVA-89.6P-SIVgpn o, de forma más detallada, vector MVA-gp120-HIV89.6p-SIVmac239-gag-pol-nef.
Tanto en los Ejemplos que describen los ensayos de inmunogenicidad realizados con los vectores MVA-B y MVA-C, como en los Ejemplos encaminados a valorar la capacidad inmunogénica de los vectores objeto de la invención diseñados para realizar ensayos en macacos y, por añadidura, su capacidad para conferir protección frente a infecciones causadas por el SHIV, se ha considerado adecuado disponer también de un control positivo con el que comparar los resultados obtenidos con los vectores derivados de MVA. Para tal finalidad se han utilizado vectores recombinantes derivados de NYVAC con la misma estructura de organización génica, sitio de inserción en el genoma viral (el locus de timidina quinasa (TK» y los mismos promotores sintéticos tempranos/tardíos, situados en igual disposición que en el vector derivado de MVA con los que se desean comparar: los vectores NYVAC-B (utilizado en los ensayos realizados con MVA-B), NYVAC-C (utilizado en los ensayos realizados con MVA-C) y un vector adicional, previsto para realizar ensayos comparativos con los realizados con los vectores denominados MVASHIV, que se ha diseñado específicamente para realizar los ensayos de evaluación de la capacidad protectora descritos en la presente memoria, al que se ha denominado, de forma abreviada, NYVAC-SHIV. Teniendo en cuenta el origen de las secuencias presentes en su inserto, idéntico al origen de las secuencias presentes en el inserto del vector denominado MVA-89.6P-SIVgpn o MVA-gp120-HIV89.6p-SIVmac239-gag-pol-nef con el que se desea comparar, al vector NYVAC-SHIV concreto cuya construcción se describe en la presente memoria se le ha denominado NYVAC-89.6P-SIVgpn o, de forma más detallada, NYVAC-gp120-HIV89.6-SIVmac239-gag-pol-nef. Dada su utilidad como control positivo en los ensayos que constituyen la utilidad principal de los vectores MVA-SHIV de la presente invención, los vectores del tipo NYVAV-SHIV están también comprendidos dentro del alcance de la presente invención. La presente invención se refiere también a composiciones que contienen los vectores recombinantes objeto de la invención que comprenden una secuencia codificante de una forma de la proteína Env del VIH-1 que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad y una secuencia codificante de una proteína de fusión Gag-Pol-Nef derivada de secuencias del virus SIVmac, así como a su uso para valorar la respuesta inmunológica y la capacidad protectora frente a la infección por el VIH desencadenada por vectores con la misma estructura de organización de genes, promotores y sitio de inserción que se pretendan utilizar para la vacunación de seres humanos. La realización preferida de esa forma de utilización de los vectores de la invención consiste en administrárselos a simios, preferiblemente a macacos Rhesus (Macaca mulafta), para evaluar la respuesta inmune producida y la capacidad protectora generada tras dicha administración, sometiéndolos posteriormente a un desafío con un SHIV patógeno. Así se obtiene información relevante para valorar los resultados y evaluar si indican que merece la pena llevar a cabo la siguiente batería de ensayos clínicos en seres humanos con los vectores homólogos previstos para la vacunación de seres humanos, así como información sobre el procedimiento adecuado para realizar dichos ensayos.
Preferiblemente, el protocolo que se siga para la administración de los vectores objeto de la invención a macacos responderá al esquema que se tenga previsto seguir para la vacunación de seres humanos, o a un esquema del cual se desee evaluar su grado de adecuación.
Los ensayos de inmunogenicidad realizados con los vectores MVA-B y MVA-C, descritos posteriormente en la sección de Ejemplos de la presente memoria, así como los ensayos sobre el grado de protección que ofrecen los vectores frente a la infección por el SHIV89.6P realizados en macacos con el vector MVA-89.6P-SIVgpn, son un indicativo tanto de la utilidad como vacunas de los vectores de la invención diseñados para la vacunación de seres humanos como de la validez de los protocolos de inmunización utilizados. Por todo ello, son también un objeto de la presente invención los métodos de vacunación para prevenir o tratar una infección provocada por el VIH en los que se administra al menos un vector recombinante de la invención, derivado del virus MVA, y capaz de expresar simultáneamente una forma de la proteína Env del VIH-1 que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad y una proteína de fusión que contiene secuencias de las proteínas Gag, Poi y Nef del VIH-1, es decir, uno de los vectores objeto de la presente invención diseñados para la fabricación de medicamentos útiles como vacunas preventivas o terapéuticas contra el SIDA.
Los métodos de vacunación incluidos dentro del alcance de la invención pueden comprender una o más dosis de vacunación, siempre y cuando en una de ellas se administre al menos uno de los vectores de la invención. Se prefieren los métodos en los que se administra más de una dosis de vacunación para desencadenar o potenciar la respuesta inmune. De entre ellos, se prefieren especialmente los protocolos combinados en los que se usan vectores diferentes en la primera dosis de desencadenamiento de la respuesta inmune y en las dosis sucesivas destinadas a reforzar la respuesta desencadenada (dosis de potenciación o refuerzo). Dado que los vectores derivados de MVA parecen ser de mayor utilidad para conseguir una respuesta de protección frente a la infección por el VIH cuando se suministran en la segunda o en dosis sucesivas destinadas al refuerzo de la respuesta inmune previamente desencadenada, lo que más se prefiere es que al menos un vector recombinante derivado del MVA de la invención esté presente en la segunda dosis o en una dosis posterior, pudiendo estar ausente o presente en la primera dosis de vacunación. En los casos en los que al menos un vector derivado de MVA está presente en la segunda dosis y/o en una dosis posterior de vacunación, se prefiere que al menos uno de los vectores administrados en la primera dosis de vacunación sea capaz de expresar las mismas proteínas derivadas del VIH que el vector de la invención presente en otra dosis diferente. De ellos, los vectores derivados del virus NYVAC, NYVAC-B y NYVAC-C y las combinaciones que comprendan ambos vectores son una opción adecuada para ser utilizados en la primera dosis de vacunación como parte de un método de vacunación objeto de la invención cuando el vector de la invención administrado en la segunda y/o en una dosis sucesiva de vacunación es, respectivamente, el vector objeto de la invención que posteriormente se denomina MVA-B o el vector que posteriormente se denomina MVA-C, o bien una composición que comprende tanto el vector MVA-B como el vector MVA-C. También son realizaciones preferidas del método de vacunación de la invención aquellas en las que la primera dosis de vacunación contiene el vector de ADN desnudo DNA-B cuando en la segunda dosis y/o en dosis posteriores de vacunación está presente el vector MVA-B objeto de la presente invención, así como aquellas en las que la primera dosis de vacunación contiene el vector de ADN desnudo DNA-C cuando en la segunda dosis y/o en dosis posteriores de vacunación está presente el vector MVA-C objeto de la invención.
El proceso de construcción de los vectores de la presente invención y los ensayos en los que se evalúa tanto su capacidad inmunogénica y como su capacidad protectora se describe con más detalle con ayuda de las Figuras y los Ejemplos que aparecen más adelante en la presente memoria.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un esquema de los mapas de los geno mas de los virus MVA (parte superior) y NYV AC (parte inferior), en los que la localización de los genes fragmentados se indica mediante un sombreado oscuro, indicándose su denominación inmediatamente debajo. Los nombres subrayados indican los genes delecionados en el virus MVA e intactos en el virus NYVAC, los nombres en negrita indican los nombres de genes delecionados tanto en el virus MVA como en el virus NYVAC; y los nombres en cursiva indican genes intactos en el virus MVA pero con deleciones en el virus NYVAC. Las letras A a Q situadas sobre cada una de las representaciones de los genomas se refieren a la denominación de los distintos fragmentos de restricción generados por la enzima Hindlll al digerir con ella el ADN genómico de los virus MVA y NYVAC. RTI: región terminal izquierda; RCC: región central conservada; RTD: región terminal derecha.
La Figura 2 muestra un esquema del proceso de construcción del vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1 y los plásmidos a partir de los cuales se genera.
La Figura 3 muestra los fragmentos generados en el análisis por PCR del locus TK del virus MVA-B. La parte superior de la figura muestra un esquema en el que se representan las posiciones de los oligonucleótidos utilizados como cebadores, los tamaños estimados de los fragmentos que se generan en el curso de la PCR con las diferentes combinaciones de oligonucleótidos, así como su localización con respecto a los insertos y las secuencias flanqueantes de los mismos. La parte inferior muestra fotografías de los geles obtenidos al someter a electroforesis los productos de los diferentes análisis por PCR realizados con diferentes parejas de cebadores. A: PCR cebada con los oligonucleótidos TK-L y GPN7649; B: PCR cebada con los oligonucleótidos GPN8170 y E/L; C: PCR cebada con los oligonucleótidos BX08556ITK-R. Las muestras correspondientes a cada calle son: 1: pLZAW1gp120B/gagpolnefB-1; 2: MVA-B; 3: MVA-WT; 4: NYVAC-WT.
La Figura 4 muestra una fotografía de un gel obtenido al someter a electroforesis los productos resultantes de una reacción de PCR en la que se utilizaron como cebadores oligonucleótidos que hibridaban con las secuencias flanqueantes del gen TK. Las muestras correspondientes a cada calle son: 1: NYVAC-WT; 2: MVA-B; 3: MVA-WT.
La Figura 5 muestra los resultados del análisis por transferencia tipo Western de la expresión de los genes heterólogos gp120-BX08 (parte superior de la figura) y gagpolnef-IIIB (parte inferior de la figura, en la que la proteína gagpolnef-IIIB se abrevia como GPN) desde un vector NYVAC-B (primera calle), desde los stocks P1, P2 Y P3 (calles 2-4: P1, P2 YP3) Ydesde células en las que se había simulado la infección (calle 5).
La Figura 6 muestra los resultados correspondientes a las pruebas de estabilidad del vector MVA-B. La parte A muestra los resultados de las inmunotinciones de células CEF infectadas con el vector MVA-B y tratadas con los anticuerpos anti-WR (fotografía de la izquierda), anti-p24 (fotografía central) y anti-gp120 (fotografía de la derecha), junto con un gráfico en el que se representa el total de células teñidas con cada anticuerpo. La parte B muestra la detección de la expresión de las proteínas gagpolnef-IIIB (fotografía de la izquierda) y gp120-BX08 (fotografía de la derecha) mediante transferencia tipo Western y detección con anticuerpos dirigidos contra dichas proteínas en células infectadas con el virus recombinante NYVAC-B (NYVACB), células en las que se había simulado la infección
(M) y stocks de virus correspondientes a los pases 7 a 10 (P7, P8, P9 YP10).
La Figura 7 muestra la cinética de expresión de la proteína gp120-BX08 obtenida mediante el análisis con un anticuerpo anti-gp120 del clade B de transferencias tipo Western correspondientes a muestras tomadas pasadas 4, 8, 16 Y 24 horas de una infección con un virus recombinante. La parte superior corresponde a la infección con el virus MVA-B y la inferior a la infección con el virus NYVAC-B. Para cada una de las muestras aparece inmediatamente debajo la intensidad de las señal lograda al incubar las muestras con un anticuerpo anti-~-actina (~act.) P: precipitado; S: sobrenadante; M: simulación de infección.
La Figura 8 muestra la cinética de expresión de la proteína gagpolnef-IIIB obtenida mediante el análisis con un anticuerpo anti-p24 del clade B de transferencias tipo Western correspondiente a muestras tomadas pasadas 6, 18 Y 24 horas de una infección con un virus recombinante. Las calles marcadas como "1" corresponden a muestras infectadas con el virus NYVAC-B, las calles marcadas como "2" a muestras infectadas con el virus MVA-B y la calle marcada con la letra "M" a una muestra en la que se simuló la infección. La flecha indica la posición de la proteína gagpolnef-IIIB (abreviada como GPN).
El gráfico mostraod en la Figura 9 representa la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IFN-y generadas por la inmunización de ratones BALB/c con virus recombinantes a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB. En ordenadas se indica el número de células T secretoras de IFN-y detectadas por cada 106 esplenocitos, específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B que se indican en abscisas. Para cada uno de esos grupos de péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con MVA-B y la segunda a animales inmunizados con NYVAC-B.
La Figura 10 muestra la producción de citoquinas detectada en ratones BALB/c inmunizados con virus recombinantes a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB. La parte izquierda corresponde a los niveles de IFN-y y la derecha a los niveles de IL-10, ambos en pg/ml, detectados en los sobrenadantes de esplenocitos de animales inoculados con MVA-B (primera barra de cada uno de los grupos de péptidos) o NYVAC-B (segunda barra de cada uno de los grupos de péptidos) frente a grupos especifiCOs de péptidos representativos del clade B.
La Fígura 11 muestra gráficos correspondientes a los niveles de distintos tipos de células T secretoras de IFN-y y presentes en los esplenocitos de ratones BALB/c inoculados con MVA-B (primera barra de cada grupo de péptidos)
o NYVAC-B (segunda barra de cada grupo de péptidos) reestimulados por los grupos de péptidos representativos del clade B indicados en el eje X. El gráfico superior muestra el porcentaje de celulas T CD8+ que secretan IFN-y, el gráfico intermedio muestra el porcentaje de celulas T CD4+ que secretan IFN-y y el gráfico inferior muestra el porcentaje total de células T CD8+ y T CD4+ que secretan IFN-y, todos ellos detectados por cada 3 x 105 esplenocitos.
La Figura 12 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IFNy generadas por la inmunización de ratones BALB/c con distintas combinaciones de vectores a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB, así como los resultados correspondientes a los controles, en todos los casos administrando los vectores siguiendo protocolos de inducción/potenciación. En el eje Y se indica el número de células T secretoras de IFN-y detectadas por cada 106 esplenocitos, específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B que se indican en el eje X. Para cada uno de esos péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con DNA-B+MVA-B, la segunda a animales inmunizados con DNA-B+NYVAC-B, la tercera a animales inmunizados con DNA-B+DNA-B, la cuarta a animales inmunizados con DNA 0 +MVA-WT y la última a animales inmunizados con DNA 0 + NYVAC-WT. Los círculos (e) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; los asteriscos (*) indican diferencias significativas (p<0,05) entre los distintos grupos.
La Figura 13 muestra la producción de IFN-y, expresada en pg/ml, generada tras la reestimulación, con los grupos de péptidos indicados en el eje X, de esplenocitos extraídos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos de combinación de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-B en la primera dosis de iniciación de la respuesta excepto en la última muestra, que se inocula con ADN sin inserto (DNA-cjl), inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta lo siguiente: MVA-B (primera barra de cada grupo), NYVAC-B (segunda barra), DNA-B de nuevo (tercera barra), MVA-WT (cuarta barra) y NYVAC-WT (quinta barra, correspondiente a la muestra a la que se le inoculó primeramente DNA-cjl).
La Figura 14 muestra la producción de quimioquinas, expresada en pg/ml y generada tras la reestimulación con los grupos de péptidos del clade B indicados en el eje X, de esplenocitos extraídos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos de combinación de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-B en la primera dosis de iniciación de la respuesta salvo en el control, que se inoculó con ADN sin inserto (DNA-cjl), inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-B (primera barra de cada grupo), NYVAC-B (segunda barra), DNA-B de nuevo (tercera barra), y NYVAC-WT (cuarta barra, correspondiente al control inoculado primeramente con DNA-cjl). El gráfico de la izquierda corresponde a la concentración detectada de MIP-1 P Y el de la derecha a la concentración detectada de RANTES.
La Figura 15 muestra gráficos correspondientes a los niveles de distintos tipos de células T secretoras de IFN-y o TNF-a presentes en esplenocitos reestimulados por los grupos de péptidos representativos del clade B indicados en el eje X tras haber sido extraídos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos combinados de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-B en la primera dosis de iniciación de la respuesta -salvo en los controles, que fueron inoculados con ADN sin inserto (DNA-cjl)-, inoculándose en la segunda dosis de potenciación
de la respuesta MVA-B (primera barra de cada grupo), NYVAC-B (segunda barra) y DNA-B de nuevo (tercera barra), mientras que los controles inoculados con DNA-cjl recibieron en la segunda dosis MVA-WT (cuarta barra) o NYVACWT (quinta barra). La parte superior corresponde a células productoras de IFN-y y la inferior a células productoras de TNF-a. Los gráficos de la izquierda corresponden a las células CD8+, los gráficos intermedios a las células CD4+ y los gráficos de la derecha al total de células implicadas. En cada casos el valor dado se refiere a número de células secretoras de cada tipo (CD8+, CD4+, total) detectadas por cada 3 x 10 esplenocitos.
La Figura 16 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IFNy específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B indicados en el eje X, generadas por la inmunización de ratones BALB/c mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores
derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB. En el eje y se indica el número de células T secretoras de IFN-y, específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B que se indican en el eje X, detectadas por cada 106 esplenocitos. Para cada uno de esos péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con NYVAC-B+MVA-B, la segunda a animales inmunizados con MVA-B+NYVAC-B y la tercera a animales inmunizados con MVA-WT +NYVAC-WT.
La Figura 17 muestra la producción de IFN-y, expresada en pg/ml, generada tras la reestimulación con los grupos de péptidos del clade B indicados en el eje X, de esplenocitos extraídos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos de combinación de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB: NYVAC-B+MVA-B (primera barra), MVA-B+NYVAC-B (segunda barra) y MVA-WT+NYVAC-WT (tercera barra).
La Figura 18 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IFNy específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B indicados en el eje X, generadas por la inmunización de ratones humanizados HHDII mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-B en la primera dosis de inducción de la respuesta, inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-B (primera barra de cada grupo) o NYVAC-B (segunda barra). La tercera barra corresponde al control de inoculación de un ADN sin inserto (DNA 0) en la primera dosis y MVA-WT en la segunda. Los círculos (-) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; los asteriscos (*) indican diferencias significativas (p<0,05) entre los distintos grupos
La Figura 19 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IL-2 específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B indicados en el eje X, generadas por la inmunización de ratones HHDII mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-B en la primera dosis de inducción de la respuesta, inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVAB (primera barra de cada grupo) o NYVAC-B (segunda barra). La tercera barra corresponde al control de inoculación de un DNA sin inserto (DNA 0) en la primera dosis y MVA-WT en la segunda. Los círculos (-) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; los asteriscos (*) indican diferencias significativas (p<0,05) entre los distintos grupos
La Figura 20 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IFNY específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade B indicados en el eje X, generadas por la
inmunización de ratones humanizados HHDII mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-8X08 y gagpolnef-1I18. En el eje Y se indica el número de células T secretoras de IFN-y, específicas para cada uno de los grupos de péptidos, detectadas por cada 106 esplenocitos,. Para cada uno de esos grupos de péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con MVA+NYVAC-8, la segunda a animales inmunizados con NYVAC-8+MVA-8, la tercera a animales inmunizados con MVA-8+MVA-8. la cuarta a animales inmunizados con NYVAC-8+NYVAC-8 y la quinta a animales inmunizados con NYVAC-Wf+MVA-Wf. Los círculos
(e) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo.
La Figura 21 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IL-2 específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade 8 indicados en el eje X, presentes por cada 106 esplenocitos de ratones HHDII inmunizados mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-8X08 y gagpolnef-1I18. Para cada uno de esos grupos de péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con MVA+NYVAC-8, la segunda a animales inmunizados con NYVAC-8+MVA-8, la tercera a animales inmunizados con MVA-8+MVA-8, la cuarta a animales inmunizados con NYVAC-8+NYVAC-8 y la quinta a animales inmunizados con NYVAC-Wf+MVA-Wf. Los círculos (e) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo.
La Figura 22 muestra un esquema de la construcción del vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp1208/gagpolnef-C-14 y los plásmidos a partir de los cuales se genera.
La Figura 23 muestra los fragmentos generados en el análisis por PCR del locus TK del virus MVA-C. La parte superior de la figura muestra un esquema de los tamaños de los fragmentos que se generan con las diferentes combinaciones de oligonucleótidos, así como su localización con respecto a los insertos y las secuencias flanqueantes de los mismos. La parte inferior muestra fotografías de los geles obtenidos al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con diferentes parejas de cebadores.
A: PCR cebada con los oligonucleótidos TK-L y gp120-1213;
8: PCR cebada con los oligonucleótidos gp120-1050 y gp120-10;
C: PCR cebada con los oligonucleótidos GPN-2018 y GPN-3820;
O: PCR cebada con los oligonucleótidos GPN-4000 y TK-R;
E: PCR cebada con los oligonucleótidos GPN-802 y GPN-2198.
Las muestras correspondientes a cada calle son:
1:NYVAC-C;
2: MVA-C (P2);
3: MVA-Wf;
4: NYVAC-Wf.
La Figura 24 muestra, en su parte superior, un esquema de los fragmentos obtenidos al amplificar mediante PCR el locus TK a partir de muestras que contienen o carecen de insertos en dicho locus, mientras que la parte inferior es una fotografía de un gel obtenido al someter a electroforesis los productos resultantes de una reacción de PCR en la que se utilizaron como cebadores oligonucleótidos que hibridaban con las secuencias flanqueantes del gen TK. Las muestras fueron: NYVAC-C (calle 1), MVA-C correspondiente a los stock s P1 (calle 2) y P2 (calle 3) y MVA-Wf (calle 4).
La Figura 25 muestra los resultados del análisis por transferencia tipo Western de la expresión de los genes heterólogos gp120-C (parte superior) y gagpolnef-C (parte inferior, en la que la proteína gagpolnef-C se abrevia como GPN) desde un vector NYVAC-C (última calle), desde los stock s P2 y P3 (calles primera y segunda, marcadas como P2-M y P3, respectivamente) y desde células en las que se había simulado la infección (M).
La Figura 26 muestra los resultados correspondientes a las pruebas de estabilidad del vector MVA-C. La parte A muestra los resultados de las inmunotínciones de células CEF infectadas con el vector MVA-C y tratadas con los anticuerpos anti-WR (fotografía de la izquierda), anti-gp120 específico del clade C (fotografía central) y anti-p24 específico del clade C (fotografía de la derecha), así como un gráfico en el que se representan los porcentajes de las placas teñidas con cada uno de los anticuerpos calculados con respecto al total de placas teñidas con el anticuerpo anti-WR. La parte 8 muestra la detección de la expresión de las proteínas gagpolnef-C (fotografía de la izquierda) y gp120-C (fotografía de la derecha) mediante transferencias tipo Western y detección con anticuerpos dirigidos contra dichas proteínas en células infectadas con el virus recombinante NYVAC-C (calles marcadas como "NYVAC-C", células en las que se había simulado la infección (calles marcadas como "CEF" y stocks de virus correspondientes a los pases 7 a 10 (calles marcadas como P7, P8, P9 YP10).
La Figura 27 muestra la cinética de expresión de la proteína gp120-C obtenida mediante el análisis con un anticuerpo anti-gp120 del clade C de transferencias tipo Western correspondientes a muestras tomadas pasadas 6, 18, Y 24 horas de una infección con un virus recombinante. La parte superior corresponde a la infección con el virus MVA-C y la inferior a la infección con el virus NYVAC-C. Para cada una de las muestras aparece inmediatamente debajo la intensidad de las señal lograda al incubar las muestras con un anticuerpo anti-j3-actina (j3-act.). P: precipitado; S: sobrenadante; M: simulación de infección. P: precipitado; S: sobrenadante; M: simulación de infección.
La Figura 28 muestra la cinética de expresión de la proteína gagpolnef-C obtenida mediante el análisis con un anticuerpo anti-p24 del clade C de transferencias tipo Western correspondientes a precipitados celulares de muestras tomadas pasadas 6, 18 Y24 horas de una infección con un virus recombinante. Las calles marcadas como "1" corresponden a muestras infectadas con el virus MVA-C, las calles marcadas como "2" a muestras infectadas con el virus NYV AC-C y las calles marcadas como M a muestras en las que se simuló la infección. La flecha indica la posición de la proteína gagpolnef-C (abreviada como GPN).
La Figura 29 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IFNy generadas por la inmunización de ratones humanizados HHDII con virus recombinantes a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-C y gagpolnef-C. La parte A corresponde a las células T secretoras de IFNy, detectadas por cada 106 esplenocitos, específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade C que se indican en el eje X. La parte B corresponde a las células T secretores de IFN-y generadas contra la parte de los virus recombinantes que deriva de Vaccinia. Tanto en el caso de los péptidos (parte A) como en el de la respuesta antiVaccinia, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con MVA-C y la segunda a animales inmunizados con NYVAC-C.
La Figura 30 muestra la producción de citoquinas detectada en ratones HHDII inmunizados con virus recombinantes a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-C y gagpolnef-C. La parte superior corresponde a los niveles de IFN-y y la inferior a los niveles de IL-10, ambos expresados en pg/ml, detectados en los sobrenadantes de esplenocitos de animales inoculados con MVA-C (primera barra de cada uno de los grupos de péptidos) o NYVAC-C (segunda barra de cada uno de los grupos de péptidos) frente a grupos específicos de péptidos representativos del clade C.
La Figura 31 muestra gráficos correspondientes a los porcentajes de distintos tipos de células T productoras de IFNy generadas frente a grupos de péptidos específicos representativos del clade C por la inoculación de MVA-C (primera barra de cada grupo de péptidos) o NYVAC-C (segunda barra de cada grupo de péptidos) a ratones HDDII. El gráfico superior representa el porcentaje de células CD8+ respecto al total de células secretoras de IFN-y, el gráfico intermedio el porcentaje de células CD4+ y el gráfico inferior al porcentaje que la suma de las células CD8+ y CD4+ anteriores supone sobre el total de células secretoras de IFN-y.
La Figura 32 muestra la respuesta humoral generada por inoculación de MVA-C o NYVAC-C a ratones HHDII o C57/BL6 mediante los valores de densidad óptica a 492 nm obtenidos al detectar por ELlSA anticuerpos IgG frente
a: (A) extractos celulares de una infección con Vaccinia; (B) proteína Gag o (C) la proteína gp160. Los grupos de inmunización fueron: 1: MVA-C en HHDII; 2: MVA-C en C57/BL6; 3: NYVAC-C en HHDII; 4: NYVAC-C en C57/BL6;
5: control. En cada grupo, la situación de los símbolos marca el valor obtenido para cada uno de los ratones del grupo: +: ratón 1; .: ratón 2; ...: ratón 3; e: ratón 4; la posición de la barra horizontal-indica el valor medio correspondiente a los cuatro ratones de cada grupo.
La Figura 33 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IFNy específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade C indicados en el eje X, presentes por cada 106 esplenocitos de ratones HHDII inmunizados mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-C en la primera dosis de inducción de la respuesta, inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-C (primera barra de cada grupo) o NYVAC-C (segunda barra). La tercera barra corresponde al control de inoculación de un ADN sin inserto (DNA 0) en la primera dosis y NYVAC-WT en la segunda. Los círculos (-) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; la presencia de asteriscos indica diferencias significativas entre los distintos grupos: *: p<0,05; **:p<0,005.
La Figura 34 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IL-2 específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade C indicados en el eje X, presentes por cada 106 esplenocitos de ratones HHDII inmunizados mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se incluye el DNA-C en la primera dosis de inducción de la respuesta, inoculándose en la segunda dosis de potenciación de la respuesta MVA-C (primera barra de cada grupo) o NYVAC-C (segunda barra). La tercera barra corresponde al control de inoculación de un ADN sin inserto (DNA 0) en la primera dosis y NYVAC-WT en la segunda. Los círculos (-) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; los asteriscos indica diferencias significativas entre los distintos grupos: *: p<0,05; **:p<0,005.
La Figura 35 muestra un gráfico que corresponde a la detección mediante ELlSPOT de células T secretoras de IFNy específicas para cada uno de los grupos de péptidos del clade C indicados en el eje X, presentes por cada 106 esplenocitos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-C y gagpolnef-C. Para cada uno de esos grupos de péptidos, la primera barra corresponde al valor detectado en animales inmunizados con NYVAC-C+MVA-C, la segunda a animales inmunizados con MVA-C+MVA-C, la tercera a animales inmunizados con MVA-C+NYVAC-C, la cuarta a animales inmunizados con NYVAC-C+NYVAC-C y la quinta a animales inmunizados con NYVAC-WT +MVA-WT. Los círculos (e) bajo las barras indican diferencias significativas (p<0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo; los asteriscos indica diferencias significativas entre los distintos grupos: *: p<0,05; **:p<0,005.
La Figura 36 muestra la producción de citoquinas detectada tras la inmunización de ratones BALB/c mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-C y gagpolnef-C. La parte izquierda corresponde a los niveles de IFN-y (expresados en ng/ml) y la derecha a los niveles de IL-10 (expresados en pg/ml), detectados en los sobrenadantes de esplenocitos, reestimulados con cada uno de los grupos de péptidos del clade C indicados junto a cada grupo de barras, extraídos de animales inoculados con: MVA-C+NYVAC-C (primera barra de cada grupo), MVA-C+MVA-C (segunda barra), NYVAC-C+MVA-C (tercera barra), NYVAC-C+NYVAC-C (cuarta barra), NYVAC-WT+MVA-WT (quinta barra) o MVA-WT+NYVAC-WT (sexta barra).
La Figura 37 muestra gráficos correspondientes a los niveles de distintos tipos de células T secretoras de IFN-y y presentes en los esplenocitos de ratones BALB/c inmunizados mediante protocolos de inducción/potenciación en los que se combinan vectores derivados de Vaccinia a partir de los cuales pueden expresarse las proteínas gp120-C y gagpolnef-C, tras ser reestimulados por los grupos de péptidos representativos del ciad e C indicados en el eje X. El gráfico superior corresponde a las células CD8+ productoras de IFN-y presentes por cada 3 x 105 células CD8+, el gráfico intermedio a las células CD4+ productoras de IFN-y presentes por cada 3 x 105 células CD4+ y el gráfico inferior al conjunto de células CD8+ más CD4+ productoras de IFN-y presentes por cada 3 x 105 células CD8+ más CD4+. Las barras que se aparecen en cada grupo de péptidos corresponden a animales inoculados con: NYVACC+MVA-C (primera barra de cada grupo), MVA-C+MVA-C (segunda barra), MVA-C+NYVAC-C (tercera barra), NYVAC-C+NYVAC-C (cuarta barra), NYVAC-WT+MVA-WT (quinta barra).
La Figura 3Sa muestra los resultados obtenidos al tratar con anticuerpos dirigidos contra la proteína PARP lisados de células HeLa recogidos transcurrido los distintos tiempos, expresados en horas, que se indican sobre las calles, tras la infección con MVA-WT (calles encabezadas por UMVA") o con NYVAC (calles encabezadas por uNYVAC"). PARPc indica la posición de la proteína PARP completa; PARPf indica la posición de la proteína PARP que ha sufrido una rotura especifica. La parte inferior muestra la intensidad de las señales logradas al incubar las muestras con un anticuerpo anti-p-actina (p-act.).
La Figura 3Sb muestra las señales de inmunofluorescencia detectadas a partir de células infectadas con MVA-WT (fotografía superior) o NYVAC-WT (fotografía inferior) cuyos núcleos habían sido teñidos con DAPI.
La Figura 3Se muestra una fotografía de un gel obtenido al someter a electroforesis muestras de ARN ribosómico obtenidas de células HeLa transcurridos los intervalos de tiempo de 18 y 24 horas que se indican sobre las calles, tras infectar dichas células con: muestras carentes de virus (pocillos marcados como "HeLa"), virus Vaccinia silvestre de la cepa Western Reserve (pocillos marcados como ''WR''), MVA-WT (pocillos marcados como UMVA"), o NYVACWT (pocillos marcados como uNYVAC"). Se indican las posiciones en las que se detectan los ARN ribosómicos 28S (28S rRNA) y 18S (18S rRNA) y la de las bandas resultantes de su degradación.
La Figura 3Sd muestra un gráfico en el que se indica el factor de incremento del número de células apoptóticas detectado mediante citometria de flujo en células HeLa infectadas según se indica en el eje X: M: simulación de infección; WR: infección con virus Vaccinia silvestre de la cepa Western Reserve; MVA: infección con MVA-WR; NYVAC: infección con NYVAC-WT. Los signos u_u y "+" indican, respectivamente, la ausencia o la presencia del inhibidor de caspasas zVAD en las muestras utilizadas para provocar la infección.
La Figura 39 muestra un esquema de la organización del genoma del virus quimérico de la inmunodeficiencia de simio y humano SHIV89.6P. Las secuencias representadas por rectángulos rellenos provienen del genoma del virus de simio SIVmac239, mientras que las secuencias representadas por rectángulos sin relleno provienen del genoma del aislado 89.6 del virus VIH-1.
La Figura 40 muestra la estructura de las secuencias codificantes de antígenos de retrovirus presentes en los vectores objetode la presente invención. La parte superior, encabezada por la abreviatura uEnv" corresponde a distintas formas de la secuencia correspondiente a la proteína de la envuelta, de las que la última, la marcada como "C-env-120", representa la presente en los vectores objeto de la invención, carente por completo de la parte correspondiente a la proteína gp41. La parte inferior muestra el esquema correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef sintetizada a partir de los vectores cuya construcción se describe en la sección de Ejemplos. Las modificaciones realizadas sobre las secuencias deducidas a partir de las proteínas del SHIV89.P, generadas deduciendo la secuencia de tripletes correspondientes a las secuencias de aminoácidos de las proteínas -utilizando para ello los codones más frecuentes en mamíferos-, fueron las siguientes modificaciones principales: la secuencia correspondiente al antígeno Gag que incluye las proteínas de la matriz (MA), la cápsida (CA), p2 Y p7 se ligó respetando el marco de lectura (en el punto marcado como FS-1) con la secuencia correspondiente al antígeno Poi que carecía de dominio integrasa; además, el sitio activo de la transcriptasa en reverso (RT) fue reemplazado por un gen nef en el que se había alterado el orden de los aminoácidos (sc-net), de manera que la zona que de forma natural contiene el extremo carboxilo (RT-C) fuera la parte inicial, mientras la zona que de forma natural contiene el extremo amino (RT-A) pasó a ser la zona final; la secuencia de RT que solapa con el sitio activo (sitio activo, RT) se traslocó respetando el marco de lectura al extremo 3' de la secuencia codificante de la proteína de fusión; adicionalmente, la glicina del extremo amino se sustituyó por alanina (LlMyr (G.....A» para impedir su miristilación, mientras se anulaba la actividad enzimática de la proteasa (XPR) introduciendo una mutación puntual en su sitio activo (L\PRr (O.....N».
La Figura 41 muestra un esquema de la construcción del vector plasmídico de transferencia pLZAW-1-89.6P SIVgpn-18 y de los plásmidos a partir de los cuales se genera. La Figura 41a muestra los pasos necesarios para la obtención del vector pLZAW1-89.6P-9; la Figura 41b muestra los pasos necesarios para la obtención del vector pLZAW-1-89.6P-SIVgpn-18 a partir del vector pLZAW-1-89.6P-9. En ambos casos la parte correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef, denominada posteriormente "SIVgpn" se indica en la Figura como "SIVsyngagpolnef', mientras la parte correspondiente a la proteína de la envuelta, denominada posteriormente 89.6gp120, aparece indicada como "89.6Psynenv120" .
La Figura 42 muestra los fragmentos generados en el análisis por PCR del locus de timidina quinasa (TK) del virus MVA-89.6P-SIVgpn. La parte superior de la figura, marcada como "A" muestra un esquema en el que se representan las posiciones de apareamiento de los oligonucleótidos utilizados como cebadores respecto a los brazos izquierdo (TK-L) y derecho (TK-O) del locus TK, así como los tamaños estimados de los fragmentos que se generan en la PCR realizada utilizando como molde el virus MVA-89.6P-SIVgpn (primera línea del gráfico) o el virus MVA sin inserto (línea inferior del gráfico, situada en la zona marcada como "WT"). La parte inferior, marcada como "8", muestra la fotografía del gel obtenido al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con los cebadores TK-L y TK-R2 sobre AON extraído de células infectadas con MVA-WT (calle 3), el stock P2 del MVA89.6P-SIVgpn (calle 4), el stock P3 del MVA-89.6P-SIVgpn (calle 5) o transfectadas con el plásmido pLZAW1-89.6PSIVgpn-18 (control positivo, C+) (calle 2). La calle 1 corresponde a un marcador de tamaño.
La Figura 43 muestra los resultados del análisis por transferencia tipo Western de la expresión de los genes heterólogos 89.6p-gp120 (parte superior de la figura, marcada como "anti-gp120", en la que la posición de la proteína se indica mediante la flecha etiquetada como "89.6P") y SIVgpn (parte inferior de la figura, marcada como "anti-SIVp27", en la que la posición de la proteína SIVgpn se indica mediante la flecha etiquetada como "GPN") detectada en extractos de células transfectadas de forma transitoria con el plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 (segunda calle, marcada como "C+") o en extractos de células infectadas con los stock s P1 (tercera calle, marcada como "P1"), P2 (cuarta calle, marcada como "P2") y P3 (quinta calle, marcada como "P3") del virus MVA-89.6P.SIVgpn, o desde células tratadas en las mismas condiciones pero que no habían entrado en contacto ni con el plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 ni con ningún stock de virus (cultivos de células en las que se simuló la infección, analizadas en la primera calle, marcada como "M").
La Figura 44 muestra, en la parte superior, los resultados de las inmunotinciones de células CEF infectadas con el vector MVA-89.6P-SIVgpn y tratadas con anticuerpos anti-WR (que reconoce la parte del vector derivada de MVA) (fotografía de la izquierda), anti-gp120 (fotografía central) y anti-SIVp27 (que reconoce la parte de la proteína SIVgpn correspondiente a la proteína p27) fotografía de la derecha), mientras en la parte inferior aparece un gráfico en el que se representan los porcentajes de las placas teñidas con cada uno de los anticuerpos calculados con respecto al total de placas teñidas con el anticuerpo anti-WR.
La Figura 45 muestra los fragmentos generados en el análisis por PCR del locus TK del virus NYVAC-89.6PSIVgpn. La parte superior de la figura, marcada como "A", muestra un esquema en el que se representan las posiciones de apareamiento de los oligonucleótidos utilizados como cebadores respecto a los brazos izquierdo (TKL) y derecho (TK-R) del locus TK, así como los tamaños estimados de los fragmentos que se generan en la PCR realizada utilizando como molde: el virus NYVAC-89.6P-SIVgpn (primera línea del gráfico) o el virus NYVAC sin inserto, (línea inferior de la parte del gráfico marcada como "NYVAC-WT"). La parte inferior, marcada como "8", muestra la fotografía del gel obtenido al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con los cebadores TK-L y TK-R2 sobre AON extraído de células infectadas con NYVAC-WT (calle 2), el stock P3 del NYVAC-89.6P-SIVgpn (calle 3), el stock P3 del MVA-89.6P-SIVgpn (calle 4) o el virus MVA-WT, que carece de inserto (calle 5). La calle 1 corresponde a un marcador de tamaño.
La Figura 46 muestra los resultados del análisis por transferencia tipo Western de la expresión de los genes heterólogos 89.6p-gp120 (parte superior de la figura, marcada como "anti-gp120", en la que la posición de la proteína se indica mediante la flecha etiquetada como "89.6P") y SIVgpn (parte inferior de la figura, marcada como "anti-SIVp27", en la que la posición de la proteína SIVgpn se indica mediante la flecha etiquetada como "GPN") detectada en extractos de células infectadas con los stock s P1 (calle 3), P2 (calle 4) y P3 (calle 5) del vector NYVAC-89.6P-SIVgpn, con el stock P3 del vector MVA-89.6P-SIVgpn (calle 2) o en extractos de células tratadas en las mismas condiciones pero que no habían entrado en contacto con ningún stock de virus (cultivos de células en las que se simuló la infección, analizadas en la calle 1).
La Figura 47 muestra, en la parte superior, los resultados de las inmunotinciones de células CEF infectadas con el vector NYVAC-89.6P-SIVgpn y tratadas con los anticuerpos anti-WR (fotografía de la izquierda), anti-gp120 (fotografía central) y anti-SIVp27 (fotografía de la derecha), mientras en la parte inferior aparece un gráfico en el que se representan los porcentajes de las placas teñidas con cada uno de los anticuerpos calculados con respecto al total de placas teñidas con el anticuerpo anti-WR.
La Figura 48 muestras fotografías de transferencias tipo Western de geles de poliacrilamida en los que se había sometido a electroforesis extractos de células infectadas con diferentes stocks P3 de los virus NYVAC-89.6P-SIVgpn (calles 1 y 2, correspondientes, respectivamente a los stocks P3.1 (29/01/04) Y P3.2 (25/02/04)) Y MVA-89.6PSIVgpn (stocks P3 del 20/06/03 (calle 3), P3 del 20/09/04 (calle 4), P3.1 del 20/09/04 (calle 5) y P3.2, del 1/10/04 (calle 6). La calle 7 corresponde a un extracto de células en las que se había simulado la infección. La fotografía de la izquierda corresponde a la incubación con un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120; la posición de la proteína 89.6P-gp120 se indica mediante una flecha marcada como "89.6P". La fotografia de la derecha corresponde a la incubación con un anticuerpo monoclonal anti-SIV-gag-p27, que reconoce la proteína SIVgpn, cuya posición en el gen se indica mediante una flecha marcada como "SIVgpn".
La Figura 49 muestra un esquema del estudio realizado en macacos para evaluar la inmunogenicidad y eficacia como vacunas frente al virus SHIV de los vectores derivados de poxvirus objeto de la presente invención. Los números del esquema marcan los distintos eventos. Los números situados debajo de la segunda línea horizontal indican el tiempo transcurrido, en semanas, desde el comienzo del estudio. El punto O corresponde al momento de inoculación del primer vector de vacunación. Las flechas gruesas indican los momentos en los que se inoculó a los macacos bien un vector de vacunación, bien un virus capaz de producir infección, según se indica en la línea inferior: ADN: inoculación de DNA-SHIV, es decir, dos plásmidos desnudos con insertos correspondiente a secuencias codificantes de proteínas del SHIV89.6P, Env (pcDNA-gp120 89.6p) y SIVgpn (pcDNA-gag-pol-nef) (grupos 1 y 2), o del plásmido desnudo carente de inserto DNA-emp (grupo 3), NYVAC vs MVA: inoculación de los vectores derivados de poxvirus NYVAC-89.6P-SIVgpn (grupo 2), MVA-89.6P-SIVgpn (grupo 1) o del vector NYVAC tipo silvestre, carente de inserto con secuencias codificantes de proteínas del SHIV89.6P (grupo 3); DESAFío: inoculación del virus patógeno quimérico SHIV89.6P. Las flechas delgadas, marcadas como "CMI", indican los momentos en los que se extrajeron de los macacos muestras de sangre periférica.
La Figura 50 muestra, en escala logarítmica, el número de células SFC (spot forming cel/s) que expresaban IFN-y obtenido por cada 106 células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en muestras procedentes de cada uno de los macacos incluidos en el estudio de eficacia de la vacunación. Los números que aparecen en el eje de abscisas indican, en semanas, el momento en el tiempo en el que fueron tomadas cada una de las muestras, tomando como tiempo O el momento de la administración de la primera dosis de vacunación. Para cada valor de tiempo, aparecen tres grupos de valores. Estos valores representan el comportamiento de cada uno de los 7 animales utilizados en el estudio y sometidos a un procedimiento de inmunización concreto: la primera vertical de puntos, marcados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba (+) corresponde a muestras tomadas de cada uno de los macacos del grupo 1 (inmunizados con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn); la segunda vertical de puntos, marcados mediante cuadrados cuyos vértices determinan dos líneas paralelas (.), corresponde a muestras tomadas de cada uno de los macacos del grupo 2 (inmunizados con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn); la tercera vertical de puntos, marcados mediante círculos (e), corresponde a muestras tomadas de cada uno de los macacos del grupo 3 (inmunizados con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT). Cada punto representa el valor obtenido para un macaco concreto, mientras los rectángulos situados en cada una de las verticales indican el valor medio correspondiente a todos los macacos de ese grupo para las muestras tomadas en un mismo momento en el tiempo. La presencia de un número de puntos inferior a 7 en algunas verticales indica que el punto situado sobre el eje X representa a más de un macaco, en cada uno de los cuales el valor de las SFC detectadas por cada 106 PBMC analizadas no fue superior a 1. La línea punteada indica el valor por debajo del cual los valores no se consideran significativos (20 SFC). Las flechas blancas indican la inoculación de un vector de vacunación; la flecha negra indica el momento en el que se produjo el desafío mediante la inoculación del virus SHIV89.6P.
La Figura 51 muestra, en escala logarítmica, los valores medios de SPF que expresaban IFN-y obtenidos, por cada
PBMC analizadas, para cada grupo de macacos a lo largo del tiempo de estudio, tiempo que se expresa en semanas en el eje X. El tiempo O al momento de la administración de la primera dosis de vacunación. Las flechas con relleno punteado indican los momentos en los que se administraron dosis de vacunación. La flecha con relleno oscuro continuo indica el momento en el que se produjo el desafío mediante la inoculación del virus SHIV89.6P. Los datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba (+) corresponden al grupo 1 (los animales de este grupo fueron inmunizados con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn); los datos indicados mediante cuadrados cuyos vértices determinan dos líneas paralelas (.) corresponden al grupo 2 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn). Los datos indicados mediante triángulos (A.) corresponden al grupo 3 (inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT).
La Figura 52 muestra, en escala logarítmica, los valores medios de SPF que expresaban IL-2 obtenidos, por cada 106
PBMC analizadas, para cada grupo de macacos a lo largo del tiempo de estudio. El tiempo se expresa en semanas en el eje X, correspondiendo el tiempo O al momento de la administración de la primera dosis de vacunación. Las flechas con relleno punteado indican los momentos en los que se administraron dosis de vacunación. La flecha con relleno oscuro continuo indica el momento en el que se produjo el desafío mediante la inoculación del virus SHIV89.6P. Los datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba (+) corresponden al grupo 1 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn); los datos indicados mediante cuadrados cuyos vértices determinan dos líneas paralelas (.) corresponden al grupo 2 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn). Los datos indicados mediante triángulos (A.) corresponden al grupo 3 (inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT).
La Figura 53 muestra, en escala logarítmica, los valores medios de SPF que expresaban IL-4 obtenidos, por cada 106
PBMC analizadas, para cada grupo de macacos a lo largo del tiempo de estudio. El tiempo se expresa en semanas en el eje X, correspondiendo el tiempo O al momento de la administración de la primera dosis de vacunación. Las flechas con relleno punteado indican los momentos en los que se administraron dosis de vacunación. La flecha con relleno oscuro continuo indica el momento en el que se produjo el desafío mediante la inoculación del virus SHIV89.6P. Los datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba (+) corresponden al grupo 1 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn); los datos indicados mediante cuadrados cuyos vértices determinan dos líneas paralelas (.) corresponden al grupo 2 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn). Los datos indicados mediante triángulos (A.) corresponden al grupo 3 (inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT).
La Figura 54 corresponde a la valoración de la viremia en los tres grupos en estudio. El gráfico superior corresponde al grupo 3, inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT. Los gráficos inferiores corresponden a los grupos que recibieron vectores derivados de poxvirus: el gráfico de la parte inferior izquierda corresponde al grupo 1, inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA89.6P-SIVgpn; el gráfico de la parte inferior derecha corresponde al grupo 2, inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn. Cada línea que conecta puntos representa un macaco. Cada punto marcado con un símbolo representa las copias de ARN del SHIV89.6P, detectadas mediante OC RNA-PCR, en la muestra de plasma de ese macaco tomada en la semana que se indica en el eje X. El tiempo O corresponde al momento de inoculación del virus SHIV89.6P.
La Figura 55 muestra la concentración, por microlitro de sangre, de células C04+ (puntos marcados mediante círculos sin relleno, O) y de células C08+ (puntos marcados mediante triángulos sin relleno, .6.), detectadas por FACS mediante el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra cada uno de estos tipos de células. Cada grupo de puntos corresponde a los valores obtenidos en las muestras de un macaco diferente, extraídas en el momento en el tiempo indicado. El tiempo se expresa, en semanas, en la parte superior de los gráficos. El tiempo O corresponde al momento de inoculación del virus SHIV89.6P, indicado mediante la abreviatura "desf.". Los gráficos superiores corresponden a macacos del grupo 1, inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn. Los gráficos intermedios corresponden a macacos del grupo 2, inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn. Los gráficos inferiores corresponden a macacos de grupo 3, inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT. El último gráfico, carente de puntos indicativos de valores, marcado como "07 98028 (euth)", corresponde a un macaco que hubo de ser sacrificado debido al avanzado estado de la enfermedad que el virus SHIV89.6P inoculado desencadenó en él.
La Figura 56 muestra, en el eje Y, el porcentaje de supervivencia de los macacos que componían cada uno de los grupos según las semanas transcurridas desde el momento de la infección con el virus SHIV89.6P, que se indican en el eje X, correspondiendo el tiempo O al de la primera inoculación de dicho virus. Los datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba (+) corresponden al grupo 1 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + MVA-89.6P-SIVgpn); los datos indicados mediante cuadrados cuyos vértices determinan dos líneas paralelas (.) corresponden al grupo 2 (inmunizado con sendos plásmidos con insertos correspondientes a la proteína gp120 del
5 SHIV89.6P y la proteína de fusión SIVgpn del SHIV89.6P + NYVAC-89.6P-SIVgpn). Los datos indicados mediante triángulos (A) corresponden al grupo 3 (inmunizado con un plásmido a partir del cual no se expresaba ningún antígeno correspondiente al SHIV89.6P + NYVAC-WT).
Ejemplos 10
Construcción y ensayos de inmunogenicidad de vectores diseñados para la vacunación de seres humanos
-
Ejemplo 1.-Generación del MVA-B
15 Construcción del vector plasmídico pLZAW1 gp120B/gagpolnef-B-1
El vector plasmídico pLZAWlgp120B/gagpolnef-B-1 fue construido por los inventores para la generación del virus recombinante de MVA que expresa los genes Env de VIH-I (aislamiento BX08) y la quimera de Gag, Poi y Nef (aislamiento IIIB), ambos pertenecientes al clade B. El AON de la quimera Gag-Pol-Nef fue generado por GeneArt
20 (Regensburg, Alemania) y el AON de gp120 fue generado por el grupo Aventis; los plásmidos que los contienen utilizados para la construcción de pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1 y del MVA-B a partir de éste último, fueron cedidos al grupo de los inventores en el marco del programa de colaboración EuroVacl.
El plásmido pLZAWlgp120B/gagpolnef-B-1 es un derivativo de pUC diseñado para la selección de placas
25 azules/blancas. Contiene las secuencias flanqueantes derecha (TK-R) e izquierda (TK-L) del gen viral de la timidina quinasa (TK) , el promotor E3L dirigiendo la expresión del marcador de selección p-galactosidasa, y el gen de resistencia a ampici1 ina (AP). Entre las dos secuencias flanqueantes se encuentran las dos secuencias que se desean expresar, gp120-BX08 (SEQ ID NO:15) y gagpolnef-IIIB (SEQ ID NO:16), que han sido modificadas para optimizar el uso de codones de mamífero. Para dirigir la expresión de cada una de las secuencias hay sendos
30 promotores sintéticos temprano/tardío (pE/L), situados en orientación opuesta en la zona del inserto más alejada de las secuencias flanqueantes. La posición de cada uno de los componentes incluidos en el plásmido se describe a continuación en la Tabla 1.
Tabla 1.-Posición de los componentes del plásmido pLZAW1gp120B/gagpolnefB-1
Secuencia flanqueante izquierda de TK
90-410 Complementaria
T5NT para p-gal
929-935 Complementaria
p-gal
ATG-TAA (936-4079) Complementaria
Promotor E3L para p-gal
4080-4140 Complementaria
Parte 1 de la secuencia flanqueante izquierda de TK
4151-4498 Complementaria
gagpolnef-IIIB
ATG-TAA (4533-8513) Complementaria
Promotor E/L para gagpolnef-IIIB
8523-8561 Complementaria
Promotor E/L para gp120-BX08
8576-8614
BX08gp120
ATG-T AA (8624-10105)
T5NT para BX08gp120
10144-10150
Secuencia flanqueante derecha de TK
10212-10903 Complementaria
AP
ATG-TAA (12074-12934) Complementaria
Para la construcción de este plásmido se utilizaron otros dos plásmidos diferentes:
-
pMA60gp120B/gagpolnefB-12,17 (proporcionado por el grupo Aventis, Canadá). El plásmido es un derivativo de pUC que contiene las secuencias flanqueantes derecha (TK-R) e izquierda (TK-L) del gen viral de la timidina quinasa
40 (TK), el promotor E3L dirigiendo la expresión del marcador de selección p-galactosidasa, y el gen de resistencia a ampici1 ina (AP). Entre las dos secuencias flanqueantes se encuentras las dos secuencias que se desean expresar, gp120-BX08 y gagpolnef-IIIB, que han sido modificadas para optimizar el uso de codones de mamífero. Para dirigir la expresión de cada una de las secuencias hay sendos promotores sintéticos temprano/tardío (pE/L), situados en orientación opuesta en la zona del inserto más alejada de las secuencias flanqueantes.
-
pLZAW1: El plásmido fue proporcionado por Linong Zhang, del grupo Aventis, Canadá. Es un plásmido basado en pUC que contiene un brazo izquierdo del gen de TK, sitios de clonación para insertar genes exógeno, una repetición corta del brazo izquierdo el gen de TK, un promotor E3L dirigiendo la expresión de un casete con p-gal y un brazo derecho del gen de TK.
La construcción del plásmido pLZAW1gp120B/gagpolnefB-1 a partir de estos otros dos plásmidos se representa en la Figura 2. Brevemente, un fragmento de AON de 5,6 Kb que contenía los genes de interés fue sacado por digestión con BamHI del plásmido pMA60gp120/gagpolnefB-12,17 modificado por incubación con la AON polimerasa Klenow para generar extremos romos, y clonado en el vector pLZAW1 previamente digerido con la endonucleasa de restricción Ascl, modificado por incubación con Klenow, y desfosforilado por incubación con la enzima fosfatasa alcalina, generándose de esta forma el vector plasmídico de transferencia pLZAWlgp120B/gagpolnef-B-1. El plásmido generado dirige la inserción de los genes de interés en ellocus TK del genoma del virus atenuado MVA.
Construcción del virus recombinante MVA-B
Cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) fueron infectados con virus atenuado MVA en pase 586 (habiendo sido el MVA-F6, pase 585, proporcionado por Gerd Sutter) a una multiplicidad de 0,05 ufp/célula, y posteriormente transfectados con 10 IJg del vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120B/gagpolnefB-1, usando para ello lipofectina comercial suministrada por Invitrogen y siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 72 horas post-infección las células fueron recogidas, sonicadas y usadas para la selección de los virus recombinantes. Los virus MVA recombinantes que contenían los genes gp120B/gagpolnef-B y coexpresaban de forma transitoria el gen marcador p-Gal (MVA-B (X-Gan), fueron seleccionados por pases consecutivos de purificación de placas en células CEF teñidas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-galactósido (XGal) (300 IJg/ml). Los MVA recombinantes que contenían los genes gp120B/gagpolnef-B y que habían perdido el gen marcador (MVA-B (X-Gall), fueron seleccionados como focos virales no teñidos en células CEF en presencia de XGal . En cada paso de purificación las placas aisladas fueron expandidas en CEF durante 3 días, y el extracto viral crudo obtenido fue usado para el paso de purificación de placas consecutivo.
Tras 4 pases consecutivos de purificación fueron aisladas 12 placas recombinantes que expresaban eficientemente ambos antígenos y que habían perdido el gen marcador. Se hizo crecer el recombinante designado como MVA-B
4.1.5.2 (P1) para generar un stock crudo (P2) que se envió a producción en condiciones GMP para estudios clínicos. La secuencia del inserto situada en ellocus de la timidina quinasa de este recombinante está representada por SEO ID NO:19. La localización en dicha secuencia de cada uno de los elementos que componen el inserto se indica a continuación en la Tabla 2:
Tabla 2.-Posición de los componentes principales del inserto del vector MVA-B
Parte 1 de la secuencia flanqueante i~quierda de TK
1-502 Complementaria
gagpolnef-III B
ATG-TAA (537-4517) Complementaria
Promotor E/L para gagpolnef-IIIB
4527-4565 Complementaria
Promotor E/L para gp120-BX08
4580-4618
gp120-BX08
ATG-TAA (4628-6109)
Secuencia flanqueante derecha de TK
6216-6907 Complementaria
A partir del P2, se preparó un stock P3 de virus purificado de células CEF infectadas a una multiplicidad de infección de 0,05 ufp/célula a través de dos colchones de sacarosa al 45%. Este stock P3, con un título de 2,4 x 109 ufp/ml, fue el que se utilizó en los protocolos de inmunización.
Caracterización del MVA-B
Para confirmar la homogeneidad genética del virus MVA-B generado y la integridad de los genes insertados, se realizó un análisis por PCR del AON viral extraído de células CEF infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula, empleando para ello oligonucléotidos que hibridan o con las regiones TK flanquean tes del inserto de interés o con regiones internas de los genes insertados. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados como cebadores y la posición en que aparecen sobre el vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120B/gagpolnefB-1 se muestran en la Tabla 3. Las posiciones en las que hibridan dichos oligonucleótidos, así como los tamaños estimados de los fragmentos generados en las distintas PCR y la localización de los mismos con respecto a los insertos y las secuencias flanqueantes, aparecen representados en la parte superior de la Figura 3.
T bl
a a 3.-Oligonucleótidos utilizados como cebadores de las PCRde caracterización del vector MVA-B
Oligo nucleótido
SECUENCIA Posición
TK-L
5' TGATTAGTTTGATGCGATTC 3' (SEO ID NO:1) 4338-4357
TK-R
5' TGTCCTTGATACGGCAG 3' (SEO ID NO:2) 1 0379-10395
BX08556
5' TGCCCATCGACAACG 3' (SEO ID NO:3) 9129-9143
GPN7649
5' AGCCCCATCGAGACCG 3' (SEO ID NO:4) 6698-6713
GPN8170
5' ATTAGCCTGCCTCTCGG 3' (SEO ID NO:5) 7218-7234
E/L
5' TAIIIIIIIIITTTGGAATATAAATAG 3' (SEO ID NO:6) 8522-8548
La parte inferior de la Figura 3 muestra fotografías de los geles obtenidos al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con las diferentes parejas de cebadores para efectuar el análisis de los fragmentos del VIH-1 incluidos en el virus MVA-B. Para ello, 100 ng de AON viral extraído de células de embrión de pollo (CEF) infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula con los virus MVA-B del stock P3 (calle 2), MVA-WT (calle 3) y NYVAC-WT (calle 4) o bien con 10 ng del plásmido pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1 (calle 1), fueron usados como molde para hacer una amplificación mediante PCR de los diferentes fragmentos del VIH-1 incluidos en MVA-B. Las condiciones de cada PCR se estandarizaron de forma individualizada para cada pareja de oligonucleótidos cebadores empleada. Como se observa en las fotografía mostradas en la parte inferior de la Figura 3, las muestras correspondientes al control positivo, el plásmido pLZAW1gp120B/gagpolnef-B-1, dan lugar en todos los casos a bandas de igual tamaño que las correspondientes muestras MVA-B, mientras que en las calles 3 y 4, correspondientes a muestras que carecen de inserto (MVA-WT y NYVAC-WT, respectivamente), no se observan bandas.
El virus NYVAC de tipo silvestre utilizado en este ejemplo, así como las formas recombinantes NYVAC-B y NYVACC utilizadas posteriormente y que se han generado insertando sobre el NYVAC de tipo silvestre las mismas secuencias utilizadas para generar, respectivamente, los vectores de la invención MVA-B y MVA-C, fueron donados por el grupo Aventis, en el marco de colaboración del proyecto EuroVac 1, en viales conteniendo aproximadamente 7x107 unidades infecciosas por vial. Previamente a su utilización, el vector NYVAC-B fue crecido en células CEF y purificado en colchón de sacarosa en las mismas condiciones que MVA-B.
La Figura 4, por su parte, muestra una fotografía de un gel correspondiente al análisis de productos de PCR correspondientes al locus TK. Para su obtención, 100 ng del AON viral extraído de células CEF infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula con los virus NYVAC-WT (calle 1), MVA-B (calle 2) o MVA-WT (calle 3), fueron usados como molde para hacer un análisis por PCR del locus TK empleando como cebadores 100 ng de los oligonucleótidos que hibridan con las secuencias flanqueantes del gen TK, TK-L (SEO ID NO:1) y TK-R (SEO ID NO:2) en una mezcla de reacción que contenía 0,3 mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCh y 2,5 U de la enzima polimerasa Platinum Taq. El programa incluye un ciclo de desnaturalización a 94°C durante 5 min, 25 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min, hibridación a 60°C durante 1 min y extensión a 68°C durante 2 min, y finalmente un ciclo de extensión a 68°C durante 10 mino Los productos de PCR fueron analizados en un gel de agarosa al 0,7%, obteniéndose el resultado que se muestra en la Figura 4. En la calle 2, la correspondiente al vector MVA-B, se observa una banda de aproximadamente 6 Kb compatible con la presencia del inserto completo, mientras que en las calles correspondientes a los virus de tipo silvestre MVA-WT (3) y NYVAC-WT (1) aparecen bandas mucho menores, que corresponderían al locus de TK sin inserto. Las diferencias observadas en los tamaños de las bandas correspondientes a los virus sin inserto MVA-WT y NYVAC-WT se debe a que el gen TK es uno de los que ha sufrido una inactivación selectiva en el virus NYVAC (véase la Figura 1), siendo el tamaño del gen TK menor en esta forma atenuada de Vaccinia.
Ejemplo 2.-Análisis de la expresión de proteínas del VIH a partir del MVA-B
La expresión de las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-B por el virus MVA-B fue analizada mediante transferencia tipo Western. Monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de los diferentes stocks de virus recombinante MVA-B: P1, P2 Y P3. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SOS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a la reacción frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120 (generado en el laboratorio) que reconoce la proteína gp120 del aislamiento BX08; y frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-p24 (cedido por el programa EVA, ARP432) que reconoce la quimera gagpolnef-B del aislamiento IIIB. Como controles positivos se utilizaron extractos procedentes de células infectadas con el vector NYVAC-B.
Como se observa en la Figura 5, ambos antígenos son expresados eficientemente por los diferentes stocks del recombinante MVA-B generado.
Ejemplo 3.-Comprobación de la estabilidad del MVA-B
Para verificar que el recombinante MVA-B podía ser pasado sucesivamente sin perder la expresión de los genes insertados, se realizó un ensayo de estabilidad efectuando varios pases sucesivos del virus recombinante MVA-B en células CEF. Monocapas de células CEF crecidas en placas P100 fueron infectadas de forma sucesiva, a una multiplicidad de 0,05 ufp/célula, partiendo del stock P2 del MVA-B (pase 6) hasta generar el pase 10 (P10J. A continuación, monocapas de células CEF crecidas en placas de 6 pocillos fueron infectadas con una dilución 10· del extracto viral obtenido del último pase (P10). A las 48 horas post-infección, las placas de lisis generadas fueron analizadas por inmunotinción, empleando anticuerpos policlonales anti-WR (que reconoce proteínas del virus MVA); anti-gp120 (que reconoce la gp120 del aislamiento BX08); y anti-p24 (que reconoce la quimera gagpolnef-B del aislamiento IIIB); estos dos últimos anticuerpos fueron los mismos que se utilizaron en el Ejemplo 2. Los resultados de estas inmunotinciones se muestran en la parte A de la Figura 6. Los recuentos de placas efectuados mostraron que un 100% de las placas resultaban teñidas con los anticuerpos anti-WR, anti-p24 y anti-gp120. Por ello, se puede considerar que, tras 10 pases sucesivos del virus en células CEF, ambos antígenos se expresan eficientemente (100% de las placas reconocidas por los tres anticuerpos), corroborándose la estabilidad del producto generado.
Los extractos de células CEF infectadas con los pases 7, 8, 9 Y 10 también fueron analizados por inmunotransferencia tipo Western, pruebas a las cuales corresponden las tinciones mostradas en la parte B de la Figura 6. Para realizar estos ensayos, monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de los extractos virales obtenidos en los pases 7 (P7), 8 (P8), 9 (P9) Y10 (P10) del virus recombinante MVA-B. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDA-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa y hechos reaccionar con los mismos anticuerpos policlonales anti-gp120 (parte derecha de la figura) o anti-p24 (parte izquierda de la figura) utilizados en la prueba correspondiente a la parte A de la Figura 6. Ambos anticuerpos se utilizaron a una dilución 1/500. Como control positivo se empleó un extracto de células CEF infectadas con el virus NYVAC-B (cedido por el grupo Aventis). Los resultados confirman la correcta expresión de las proteínas gp120-BX08 y gagpolnef-B en todos los extractos obtenidos por la infección con virus procedentes de distintos pases.
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Ejemplo 4.-Liberación de gp120-BX08 y cinética de expresión a partir del MVA-B en el transcurso del tiempo
Para definir si la proteína gp120-BX08 era eficientemente secretada, monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con MVA-B a 5 ufp/célula. A las 4, 8, 16 Y24 horas post-infección las células se recogieron separando el precipitado (P) del sobrenadante (S) celular. Los sobrenadantes de cada tiempo analizado fueron concentrados y fraccionados junto a los precipitados celulares en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a reacción frente al anticuerpo policlonal antigp120 (diluidos 1/500) anteriormente utilizado en los Ejemplos 2 y 3. De igual forma fueron tratadas células CEF infectadas con el NYVAC-B (proporcionado por el grupo Aventis), usado como control positivo en el ensayo. Como control interno para verificar que habia sido aplicado en el gel la misma cantidad de proteína, las membranas fueron incubadas también frente a un anticuerpo monoclonal anti-~-actina. Los resultados se muestran en la Figura 7. En su parte superior, correspondiente a la muestra del MVA-B, puede apreciarse que la proteina gp120-BX08 es expresada eficientemente por el MVA-B desde las 4 horas post-infección, detectándose en el sobrenadante celular a partir de las 8 horas post-infección, y con un comportamiento similar al que se observa en células infectadas con el NYVAC-B, para el cual se muestran los resultados obtenidos en la parte inferior de la Figura 7.
La expresión de la proteína de fusión gagpolnef-B fue analizada siguiendo un procedimiento similar: monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con MVA-B a 5 ufp/célula aunque, en este caso, la presencia de la proteína se ensayó en el precipitado celular obtenido a las 6, 18 Y 24 horas post-infección, igualmente mediante transferencia tipo Western y poniendo de manifiesto la presencia de la proteína mediante reacción con el anticuerpo policlonal anti-p24 utilizado en los Ejemplos 2 y 3. Los resultados se muestran en la Figura 8. En ella puede observarse la correcta expresión de esta proteína de fusión a lo largo del tiempo de infección tanto desde MVA-B (calle 2 de cada tiempo de infección) como desde NYVAC-B (calle 1), aunque se produce una mayor acumulación de la proteína de fusión en células infectadas con MVA-B.
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Ejemplo 5.-lnmunogenicidad del MVA-B: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-y
Una vez generado y caracterizado el recombinante MVA-B, el siguiente objetivo fue analizar su capacidad de inducir una respuesta inmune específica en el modelo murino frente a los antigenos que expresa. Para ello, ratones BALB/c (n=4) de 6-8 semanas de edad se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de 2 x 107 ufp/ratón de MVAB (stock P3) o de NYVAC-B. 10 días después de la inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical, y se les extrajo el bazo para llevar a cabo el ensayo de ELlSPOT que detecta las células T específicas frente al antígeno en función de su cualidad para producir IFN-y, que es un indicador positivo de que un inmunógeno es capaz de activar selectivamente una respuesta celular del tipo CD4+ Th1, característica esta última que se considera indicadora de la eficacia de un proceso de vacunación. Para ello, placas de 96 pocillos con fondos de nitrocelulosa se cubrieron con 75 !JI/pocillo a una concentración de 6 !Jg/ml de un anticuerpo monoclonal de rata antiIFN-y murino (R4-6A2, Pharmingen, San Diego, CA) resuspendido en PBS, incubándose toda la noche a temperatura ambiente. Posteriormente se lavaron los pocillos tres veces con medio RPMI y finalmente se incubó con medio complementado con 10% FCS, al menos una hora a 37°C en atmósfera de CO2 al 5%. Por otro lado, los bazos de los ratones inmunizados, que una vez extraídos se mantuvieron en RPMI + 10% FCS, se dispusieron en una rejilla estéril sobre una placa de 60 mm, y se homogeneizaron, disgregando el extracto mediante su paso por agujas de diferente calibre (21 G->25G). Las células así disgregadas se centrifugaron 5 min a 1.500 rpm a 4°C, y se lavaron dos veces con RPMI + 10% FCS. Para lisar los eritrocitos de las muestras, se añadió NH4CI 0,1 M estéril (2 mi/bazo) y se mantuvo a 4°C durante 3-5 min, se añadió RPMI + 10% FCS y se centrifugó. Después se lavaron 2 veces, y finalmente se resuspendieron en 1-2 mi de RPMI + 10% FCS. El recuento de la viabilidad de los esplenocitos se realizó mediante tinción con azul tripan (4% en agua, Sigma).
Para evaluar la respuesta inmune específica, se utilizaron diferentes grupos de 40-50 péptidos de 15 aminoácidos cada uno, solapantes en 11 aminoácidos, que cubrían todas las regiones antigénicas incluidas en el recombinante MVA-B de la invención. Cada grupo de péptidos se diluyó a una concentración de 10 ¡Jg/ml en RPMI + 10% FCS a los que se les añadió 30 U/mi de IL-2. Una vez preparado, se añadió a cada pocillo 100 ¡JI de mezcla del grupo de péptidos, sobre lo cual se añadió 100 ¡JI/pocillo de esplenocitos de los animales inmunizados, a una concentración de 107 esplenocitos/ml y diluciones 1/4 y 1/16 de la misma. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37°C en atmósfera de C02, se lavaron 5 veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (PBST), y se incubaron con 2 ¡Jg/ml del anticuerpo monoclonal de rata anti-IFN-y biotinilado XMG1.2 (Pharmingen) diluido en PBST, durante 2 horas a temperatura ambiente. Después se lavaron las placas 5 veces con PBST y se añadió una dilución 1/800 de avidina-peroxidasa (0,5 mg/ml) (Sigma). Tras 1 hora a temperatura ambiente se lavó 3 veces con PBST y 2 con PBS, añadiéndose finalmente la mezcla reveladora con 1 ¡Jg/ml del sustrato DAB (Sigma), resuspendido en Tris-HCI 50 mM pH 7,5, que contenía 0,015% de H202. La reacción se detuvo lavando la placa con abundante agua y, una vez seca, se llevó a cabo el recuento de las manchas generadas con la ayuda de un estereomicroscopio de Leíca MZ122 APO y el software Imaging System QWIN (Leica, Cambridge, Reino Unido). El número de células productoras de IFN-y obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
Los resultados, que se muestran en la Figura 9, demuestran que el MVA-B es capaz de potenciar una respuesta inmune específica frente a casi todos los grupos de péptidos ensayados, en distinta proporción que su homólogo NYVAC-B.
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Ejemplo 6.-lnmunogenicidad del MVA-B: Producción de citoguinas por esplenocitos reestimulados
A continuación, se procedió a evaluar la producción de citoquinas estimulada en los esplenocitos de los ratones inmunizados al ser mezclados con los diferentes grupos de péptidos solapantes. Para ello, los esplenocitos aislados en el Ejemplo 5 fueron cultivados (5x106 células/pocillo) en una placa de 24 pocillos y estimulados con 1 ¡Jg/ml de cada grupo de péptidos. La placa se incubó durante 5 días a 37°C en atmósfera del 5% C02. Después de este período, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos y se centrifugaron a 1.500 rpm, 5 min, a 4°C, almacenándose a -70°C hasta su utilización. Tal como se ha comentado anteriormente, los niveles de la citoquina interferón-gamma (IFN-y) son un indicador positivo de la activación de una respuesta celular del tipo CD4+ Th1, mientras que la citoquina IL-10, por su parte, es un indicador de activación de la respuesta celular tipo CD4+ Th2. La relación entre los niveles de IFN-y e IL-10 indica si la vacunación es más o menos eficaz. Para conocer los niveles de una y otra citoquina, IL-10 e IFN-y, presentes en los sobrenadantes de cultivos de esplenocitos reestimulados "in vitro", se procedió a la determinación de estos niveles mediante kits de ELlSA comerciales de Pharmingen. Siguiendo las instrucciones del fabricante, placas de 96 pocillos de fondo plano se cubrieron con el anticuerpo anticitoquina, diluido en su correspondiente tampón, y se incubó toda la noche a 4°C. Después, los pocillos se lavaron con PBST, y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con PBST + 10% FCS (PBSTB). Posteriormente, se añadieron diluciones seriadas en PBSTB de las muestras y de las citoquinas estándar, incubándose la placa a temperatura ambiente durante 2 horas. Después, se lavó con PBST y se incubó a temperatura ambiente, durante 1 hora, con el anticuerpo específico anti-citoquina biotinilado, junto a la estreptavidina conjugada con peroxidasa, todo ello diluido en PBSTB. Finalmente, la reacción se detectó con TMB (3,3",5,5"-tetrametilbenzidina, Sigma), a temperatura ambiente y en oscuridad, y se detuvo, tras 30 min de incubación, con H2S04 2 N.
La absorbancia se leyó a 450 nm y los valores obtenidos fueron extrapolados en la curva estándar (pg/ml). Los resultados, mostrados en la Figura 10, indican que existe una polarización de la respuesta celular específica hacia un subtipo Th1, caracterizado por la secreción de altos niveles de IFN-y, tanto para MVA-B como para NYVAC-B, frente a los diferentes grupos de péptidos ensayados. Existen claras diferencias entre las respuestas generadas por cada uno de los recombinantes.
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Ejemplo 7.-Inmunogenicidad del MVA-B: Identificación de los tipos de células T específicas secretoras de IFN-y
Como las células presentadoras que se estaban empleando hasta el momento en la caracterización de la respuesta celular eran las propias del bazo que expresan las moléculas de histocompatibilidad tanto de clase I (MHC-I) como de clase II (MHC-II), el siguiente paso fue dilucidar si la respuesta celular que se estaba obteniendo en ELlSPOT era debida a la secreción de IFN-y por las células T CD8+ o por las células T CD4+. Para ello, los esplenocitos obtenidos en el Ejemplo 5 fueron reestimulados in vitro durante 1 hora a 37°C con 5 ¡Jg/ml de cada grupo de péptidos solapantes pertenecientes al clade B, tras lo cual se añadió Brefeldina a una concentración de 10 ¡Jg/ml, incubándose durante toda la noche a 37°C. Siete días después se procedió a un marcaje de superficie empleando anticuerpos específicos anti-CD4 o anti-CD8 conjugados a FITC, seguido de un marcaje intracelular empleando antiIFN-y conjugado a PE. Una vez fijadas las células fueron analizadas en el citó metro de flujo.
Los resultados, mostrados en la Figura 11, permiten apreciar que, tanto para el grupo de animales inmunizado con el MVA-B, como para el grupo inmunizado con NYVAC-B, la respuesta productora de IFN-y es mayoritariamente debida a la población de células T CD8+ especificas activadas frente a los diferentes grupos de péptidos. Al determinar los niveles totales de IFN-y secretados por ambos tipos de células, se corroboró el resultado obtenido en el ensayo de ELlSPOT descrito en el Ejemplo 5, donde se observaba una respuesta específica frente a la mayoría de los grupos de péptidos en los animales inmunizados con ambos recombinantes. De nuevo, existen diferencias claras entre las respuestas generadas por cada uno de los recombinantes.
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Ejemplo 8.-Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-y
Una vez establecido que la administración de una primera dosis de inmunización que contenía el MVA-B era capaz de inducir una respuesta inmune específica en el modelo murino, se evaluó a continuación si la utilización de este vector de la invención como parte de protocolos de inducción/potenciación (priming/baasting) daba lugar a un incremento en la magnitud y en la amplitud de la respuesta inmune. Para ello, grupos de 4 ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad se inocularon por vía intramuscular (i.m.) con 100 IJg del vector de ADN DNA-B (cedido por GeneArt, Alemania), que contiene las mismas secuencias codificantes de proteínas del VIH-1 que lleva insertadas el MVA-B, pero bajo el control de sendos promotores de citomegalovirus e insertadas en vectores plasmídicos (uno para gp120 y otroa para la proteína de fusión Gag-Pol-Net). Los grupos control fueron inoculados (i.m.) con 100 IJg de ADN sin inserto (DNA 0). 15 días después se les inmunizó por vía intraperitoneal (i.p.) con 2 x 107 ufp/ratón de MVA-B (stock P3) o de NYVAC-B (grupo Aventis, Francia), que expresa los mismos antígenos de VIH que MVA-B. Un tercer grupo recibió una segunda dosis de DNA-B (100 IJg, i.m.). Los grupos control recibieron una dosis de 2 x
de ufp/ratón de MVA-WT o NYVAC-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELlSPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, mezclas de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas (paa/s) de péptidos sOlapantes perteneCientes al clade B (5 IJg/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IFN-y obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 12, en la que aparece
el número de células secretoras de IFN-y espeCíficas detectadas por cada esplenocitos en los ratones inmunizados con las diferentes combinaciones de vectores. Se observa para casi todos los grupos de péptidos analizados que la inclusión de vectores derivados de poxvirus que codifican antígenos del VIH-1 en la segunda dosis de refuerzo de la respuesta inmune da lugar en casi todos los casos a un incremento significativo de la respuesta inmune con respecto a la utilización únicamente de vectores de ADN, siendo la respuesta generada diferente según se utilice MVA-B o NYVAC-B.
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Ejemplo 9.-Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación: Producción de citoguinas por esplenocitos reestimulados
Cinco grupos de ratones BALB/c (n=4) fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y de potenciación de la misma mediante la inoculación de otro vector en una segunda dosis, de manera análoga a como se describió en el Ejemplo 8 y utilizando las mismas combinaciones de vectores. Los esplenocitos extraídos fueron estimulados in vitro con las diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (1 og/mL) e incubados durante 5 dias a 37 oC. Transcurrido ese tiempo, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -70°C. Los niveles de IFN-y se determinaron por ELlSA usando un Kit comercial (Pharmigen). Los resultados se muestran en la Figura 13, donde se observa que la producción de IFN-y difiere según se utilice MVA-B o NYVAC-B como segundo vector de inmunización.
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Ejemplo 10.-Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación: Producción de Bguimioguinas por esplenocitos reestimulados
Cinco grupos de ratones BALB/c (n=4) fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y de potenciación de la misma mediante la inoculación de otro vector en una segunda dosis, de manera análoga a como se describió en el Ejemplo 8 y utilizando las mismas combinaciones de vectores. Los esplenocitos extraídos fueron estimulados in vitro con las diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (1 IJg/ml) e incubados durante 5 días a 37 oC. Transcurrido ese tiempo, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -70°C. Los niveles de MIP-1 13 y RANTES se determinaron por ELlSA usando kits comerciales (Pharmigen)
Los resultados se muestran en la Figura 14, donde se observa que la producción de quimioquinas MIP-1 13 y RANTES difieren según se utilice MVA-B o NYVAC-B como segundo vector de inmunización.
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Ejemplo 11.-Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación: Identificación de los tipos de células T específicas productoras de IFN-x y TNF-a
Cinco grupos de ratones BALB/c (n=4) fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y de potenciación de la misma mediante la inoculación de otro vector en una segunda dosis, de manera análoga a como se describió en el Ejemplo 8 y utilizando las mismas combinaciones de vectores. Los esplenocitos extraídos fueron estimulados in vitro con el péptido de la envuelta del aislado Bx08 (5 ¡.Ig/ml) e incubados durante 1 hora a 37 oC. Transcurrido ese tiempo se le añadió Brefeldina A (10 ¡.Ig/mL) y se dejó incubando a 37 oC. Siete días después, se procedió a un marcaje de superficie empleando anticuerpos específicos anti-C04 o anti-C08 conjugados a FITC (diluidos 1/100), seguido de un marcaje intracelular empleando anti-IFN-y o anti-TNF-¡3 conjugado a PE (diluido 1/100). Una vez fijadas las células fueron analizadas en el citómetro de flujo
Los resultados se muestran en la Figura 15. En ellos se observan diferencias en los niveles de células C08+ entre los grupos, con un mayor incremento de células secretoras de TNF-a en el grupo que había recibido ONA-B+MVA-B.
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Ejemplo 12.-Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan varios vectores derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-y
Grupos de 4 ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de con 2 x 107 ufp/ratón de MVA-B (stock P3), NYVAC B (grupo Aventi) o MVA WT. 15 días después los ratones recibieron una segunda dosis por vía intraperitoneal (i.p.) de 2 x 107 ufp/ratón de vector, de manera que se inoculó NYVAC-B a los ratones que habían recibido MVA-B en la primera dosis, MVA-B a los ratones que habían recibido NYVAC-B en la primera dosis y NYVAC-WT (grupo Aventis) a los ratones que habían recibido MVA-WT en la primera dosis. Se generaron así grupos que habían sido inoculados con las siguientes combinaciones de vectores: NYVAC-B+MVA-B, MVA-B+NYVAC-B y MVA-WT+NYVAC-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELlSPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, grupos de mezcla de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 ¡.Ig/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IFN-y obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 16. En ella puede observarse como las dos combinaciones de vectores que contienen secuencias derivadas de VIH-1 incrementan tanto la magnitud como la amplitud de la respuesta inmune específica generada, según se observa con los diferentes grupos de péptidos. La combinación en la que el NYVAC-B se inocula en la primera dosis y el MVA-B en la segunda fue la que dio lugar al número más elevado de células secretoras de IFN-y frente a los diferentes grupos de péptidos.
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Ejemplo 13.-Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Producción de IFN-x por esplenocitos estimulados
Tres grupos de ratones BALB/c (n=4) de 6-8 semanas de edad fueron inoculados en reglmen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y de potenciación de la misma mediante la inoculación de otro vector en una segunda dosis, de manera análoga a como se describió en el Ejemplo 12 y utilizando las mismas combinaciones de vectores. Los esplenocitos extraídos fueron estimulados in vitro con las diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (1 ¡.Ig/ml) utilizadas en los Ejemplos anteriores e incubados durante 5 días a 37 oC. Transcurrido ese tiempo, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -70°C. Los niveles de IFN-y se determinaron por ELlSA usando un kit comercial (Pharmigen).
Los resultados se muestran en la Figura 17, donde se observa que la producción de IFN-y más amplia se obtiene con la combinación NYVAC-B+MVA-B, al igual que en el Ejemplo 12.
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Ejemplo 14.-Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores de AON y vectores virales derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-yen ratones humanizados HHOII
Se procedió también a realizar experimentos con ratones humanizados HHOII. Estos ratones, generados por F. Lemonier en Francia y cedidos por él para la realización de los experimentos descritos en la presente memoria, sólo permiten la presentación de antígenos en el contexto del MHC de clase I humano, al tener reemplazados los genes murinos del MHC clase I y p-microglobulina por los correspondientes genes humanos. Grupos de 4 ratones HHOII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intramuscular (i.m.) con 100 ¡.Ig del vector de AON ONA-B (cedido por GeneArt, Alemania) utilizado también en el Ejemplo 8. Los grupos control fueron inoculados (i.m.) con 100 ¡.Ig de AON sin inserto (ONA 0). 15 días después se les inmunizó por vía intraperitoneal (Lp.) con 2 x 107 ufp/ratón de MVA-B (stock P3) o de NYVAC-B (grupo Aventis, Francia), que expresa los mismos antígenos de VIH que MVA-B. Un tercer grupo recibió una segunda dosis de DNA-B (100 ~g, i.m.). El grupo control recibió una dosis de 2 x de 107 ufp/ratón de MVA-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELlSPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, mezclas de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 ~g/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IFN-y obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.• denota diferencias significativas (p< 0,005) de cada grupo respecto al control negativo. * denota diferencias significativas (p< 0,05) entre los distintos grupos
La Figura 18 muestra los resultados obtenidos. Se observa que las combinaciones DNA-B+MVA-B y DNAB+NYVAC-B inducen una amplia respuesta frente a los grupos de péptidos, con inmunodominancia frente a Env.
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Ejemplo 15.-Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores de ADN V vectores virales derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IL-2 en ratones humanizados HHDII
Grupos de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intramuscular (i.m.) con 100 ~g del vector de ADN DNA-B (cedido por GenArt, Alemania). El grupo control fue inoculado (i.m.) con 100 ~g de ADN sin inserto (DNA 0). 15 días después se les inmunizó por vía intraperitoneal (i.p.) con 2 x 107 ufp/ratón de MVA-B (stock P3) o de NYVAC-B (grupo Aventis, Francia), que expresa los mismos antígenos de VIH que MVA-B. Un tercer grupo recibió una segunda dosis de DNA-B (100 ~g, i.m.). El grupo control recibió una dosis de 2 x de 107 ufp/ratón de MVA-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical yel bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELlSPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, mezclas de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 ~g/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IL-2 obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos. La Figura 19 muestra los resultados obtenidos, en la que: • denota diferencias significativas (p< 0,005) de cada pool respecto al control negativo. * denota diferencias significativas (p< 0,05) entre los distintos grupos. Se observa inmunodominancia de antígenos de Env, con amplia respuesta frente a los distintos grupos de péptidos y diferencias significativas entre los grupos DNA-B+MVA-B y DNA-B+NYVAC-B.
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Ejemplo 16.-Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-y en ratones humanizados HHDII
Cinco gru~os de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de 2 x 107 ufplratón de MVA-B (stock P3) (2 grupos), NYVAC B (grupo Aventis) (2 grupos) o NYVAC WT (grupo control). 15 días después los ratones recibieron una segunda dosis por vía intraperitoneal (i.p.) de 2 x 107 ufplratón de vector, de manera que a uno de los grupos que había recibido MVA-B en la primera dosis se le inoculó NYVAC-B y a otro de nuevo MVA-B, a uno de los grupos que habían recibido NYVAC-B en la primera dosis se le inoculó NYVAC-B de nuevo y a otro MVA-B y, finalmente, el grupo control recibió en la segunda dosis MVA-WT (Aventis-Pasterur). Se generaron así grupos que habían sido inoculados con las siguientes combinaciones de vectores: MVAB+NYVAC-B, NYVAC-B+MVA-B, MVA-B+MVA-B, NYVAC-B+NYVAC-B y NYVAC-WT+MVA-WT.
10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELlSPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, grupos de mezcla de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 ~g/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IFN-y obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos. La Figura 20 muestra los resultados obtenidos, en la que: • denota diferencias significativas (p< 0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo. Se observa que la inmunización combinada de vectores virales, MVA-B y NYVAC-B, induce una amplia respuesta inmune contra distintos antígenos del VIH.
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Ejemplo 17.-Utilización del MVA-B en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IL-2 en ratones humanizados HHDII
Cinco gru~os de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) Con una dosis de 2 x 107 ufp/ratón de MVA-B (stock P3) (2 grupos), NYVAC B (grupo Aventis) (2 grupos) o NYVAC WT (grupo control). 15 días después los ratones recibieron una segunda dosis por vía intraperitoneal (i.p.) de 2 x 107 ufp/ratón de vector, de manera que a uno de los grupos que había recibido MVA-B en la primera dosis se le inoculó NYVAC-B
y a otro de nuevo MVA-B, a uno de los grupos que habían recibido NYVAC-B en la primera dosis se le inoculó NYVAC-B de nuevo y a otro MVA-B y, finalmente, el grupo control recibió en la segunda dosis MVA-WT (grupo Aventis). Se generaron así grupos que habían sido inoculados con las siguientes combinaciones de vectores: MVAB+NYVAC-B, NYVAC-B+MVA-B, MVA-B+MVA-B, NYVAC-B+NYVAC-B Y NYVAC-WT+MVA-WT.
10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELlSPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, grupos de mezcla de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade B (5 IJg/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-B y NYVAC-B. El número de células productoras de IL-2 obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos. La Figura 21 muestra los resultados obtenidos, en la que: • denota diferencias significativas (p< 0,005) de cada grupo de péptidos respecto al control negativo. Como en el Ejemplo 16, se observa que la combinación de vectores induce una amplia respuesta inmune (producción de IL-2) frente a distintos antígenos del VIH.
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Ejemplo 18.-Generación del MVA-C
Construcción del vector plasmídico pLZAW1gp120C/gagpolnef-C-14
El vector plasmídico pLZAWlgp120C/gagpolnef-C-14 fue construido por los inventores para la generación del virus recombinante de MVA que expresa secuencias génicas correspondientes a la proteína gp120 (gp120-C) y a la quimera de Gag, PoI y Nef (gagpolnef-C) del aislamiento CN54, que pertenece al clade C. El vector pMA60gp120C/gagpolnefC-14,15 utilizado para su construcción, contiene las secuencias codificantes de ambas proteínas; se construyó utilizando la secuencia codificante de la proteína de fusión gagpolnef-C generada por GeneArt (Regensburg, Alemania) y fue cedido a los inventores para la construcción del vector MVA-C en el marco del programa de colaboración EuroVacl.
El plásmido pLZAWlgp120C/gagpolnef-C-14 es un derivativo de pUC diseñado para la selección de placas azules/blancas. Contiene las secuencias flanqueantes derecha (TK-R) e izquierda (TK-L) del gen viral de la timidina quinasa (TK), el promotor E3L dirigiendo la expresión del marcador de selección 13-galactosidasa, y el gen de resistencia a ampici1 ina (AP). Entre las dos secuencias flanqueantes se encuentras las dos secuencias que se desean expresar, gp120-C (SEO ID NO:17) y gagpolnef-C (SEO ID NO:18), que han sido modificadas para optimizar el uso de codones de mamífero. Para dirigir la expresión de cada una de las secuencias hay sendos promotores sintéticos temprano/tardío (pE/L), situados en orientación opuesta en la zona del inserto más alejada de las secuencias flanqueantes. La posición de cada uno de los componentes incluidos en el plásmido se describe a continuación en la Tabla 4.
Tabla 4.-Componentes del plasml'dop 1 OC/gagpo ne--4
LZAW19p 2 f C 1
Secuencia flanqueante izquierda de TK
410-908 Complementaria
T5NT para 13-gal
929-935 Complementaria
l3-gal
ATG-T AA (936-4079) Complementaria
Promotor E3L para l3-gal
4080-4140 Complementaria
Parte 1 de la secuencia flanqueante izquierda de TK
4151-4498 Complementaria
T5NT para gp120
4607-4614 Complementaria
gp120
ATG-TAA (4643-6139) Complementaria
Promotor E/L para gp120
6149-6187 Com¡:>lementaria
Promotor E/L para gagpolnef
6202-6240
gagpolnef
ATG-T AA (6250-10503)
T5NT para gagpolnef
1 0584-1 0590
Secuencia flanqueante derecha de TK
10652-11343 Complementaria
AP
ATG-TAA (12514-13374) Complementaria
Para la construcción de este plásmido se utilizaron otros dos plásmidos diferentes:
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pMA60gp120C/gagpolnef-C-14,15 (proporcionado por el grupo Aventis, Canadá). El plásmido es un derivativo de pUC que contiene las secuencias flanqueantes derecha (TK-R) e izquierda (TK-L) del gen viral de la timidina quinasa (TK) en sitios de clonación del pUC .. Entre las dos secuencias flanqueantes se encuentras las dos secuencias que se desean expresar, gp120-C y gagpolnef-C, que han sido modificadas para optimizar el uso de codones de mamífero. Para dirigir la expresión de cada una de las secuencias hay sendos promotores sintéticos temprano/tardío (pE/L), situados en orientación opuesta en la zona del inserto más alejada de las secuencias flanqueantes.
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pLZAW1: El plásmido fue proporcionado por Linong Zhang, del grupo Aventis, Canadá. Es un plásmido basado en pUC que contiene un brazo izquierdo del gen de TK, sitios de clonación para insertar genes exógenos, una repetición corta del brazo izquierdo el gen de TK, un promotor E3L dirigiendo la expresión de un casete con [3-gal y un brazo derecho del gen de TK.
La construcción del plásmido pLZAW1gp120C/gagpolnefC-14 a partir de estos otros dos plásmidos se representa en la Figura 22. Brevemente, un fragmento de AON de 6047 kpb que contenía los genes de interés fue sacado por digestión con EcoRV del plásmido pMA60gp120C/gagpolnefC-14, 15, modificado por incubación con la AON polimerasa de Klenow para generar extremos romos, y clonado en el vector pLZAW1 previamente digerido con la endonucleasa de restricción Ascl, modificado por incubación con Klenow, y desfosforilado por incubación con fosfatasa alcalina de intestino de ternera, generándose de esta forma el vector plasmídico de transferencia pLZAWlgp120C/gagpolnef-C-14. El plásmido generado dirige la inserción de los genes de interés en ellocus de la TK del genoma del virus atenuado MVA. Después de aislar el virus recombinante deseado mediante el análisis de la expresión de actividad [3-galactosidasa la posterior propagación del virus recombinante conduce a la autodeleción de [3-gal por recombinación homóloga entre el brazo izquierdo de TK y la repetición corta del brazo izquierdo de TK que flanquean el marcador.
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Construcción del virus recombinante MVA-C
Cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) fueron infectados con virus atenuado MVA en pase 586 (MVA-F6, pase 586, proporcionado por Gerd Sutter) a una multiplicidad de 0,05 ufp/célula, y posteriormente transfectados con 10 IJg de AON del plásmido de transferencia pLZAW1gp120C/gagpolnefC-14, usando para ello lipofectina comercial suministrada por Invitrogen y siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 72 horas post-infección las células fueron recogidas, sonicadas y usadas para la selección de los virus recombinantes. Los virus MVA recombinantes que contenían los genes gp120C/gagpolnef-C y coexpresaban de forma transitoria el gen marcador [3-Gal (MVA-B (X-Gal+)), fueron seleccionados por pases consecutivos de purificación de placas en células CEF teñidas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-[3-galactósido (XGal) (300 IJg/ml). En lo sucesivo, los MVA recombinantes que contenían los genes gp120C/gagpolnef-C y que habían perdido el gen marcador (MVA-B (X-Gar)), fueron seleccionados como focos virales no teñidos en células CEF en presencia de XGal. En cada paso de purificación las placas aisladas fueron expandidas en CEF durante 3 días, y el extracto viral crudo obtenido fue usado para el paso de purificación de placas consecutivo.
Tras 4 pases consecutivos de purificación fueron aisladas 24 placas recombinantes que expresaban eficientemente ambos antígenos y que habían perdido el gen marcador. Se hizo crecer el recombinante designado como MVA-C
1.7.1.2 (P1) (SEO ID NO:16) para generar un stock crudo (P2) que se envió a producción en condiciones de buenas prácticas de fabricación para estudios clínicos. La secuencia del inserto que este recombinante lleva incluido en el sitio de la timidina quinasa viene representada por SEO ID NO:20. La localización en dicha secuencia de cada uno de los elementos que componen el inserto se indica a continuación en la Tabla 5
Tabla 5 -Posición de los componentes principales del inserto del vector MVA-C
Parte 1 de la secuencia flanqueante izquierda de TK
1-502 Complementaria
gp120-C
ATG-TAA (647-2143) Complementaria
Promotor E/L para gp120-C
2153-2191 Complementaria
Promotor E/L para gagpolnef
2206-2244
gagpolnef-C
ATG-TAA (2254-6507)
Secuencia flanqueante derecha de TK
6656-7347 Complementaria
A partir del P2, se preparó un stock P3 de virus, purificándolo a partir de células CEF infectadas a una multiplicidad de infección de 0,05 por pase a través de dos colchones de sacarosa al 36%. Este stock P3, con un título de 4,25 x 108 ufp/ml, fue el que se utilizó en los protocolos de inmunización en el modelo murino.
Caracterización del virus recombinante MVA-C
Para confirmar la homogeneidad genética del virus MVA-C generado y la integridad de los genes insertados, se realizó un análisis por PCR del AON viral extraído de células CEF infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula, empleando para ello oligonucléotidos que hibridan o con las regiones TK flanqueantes del inserto o con regiones internas de los genes insertados. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados como cebadores y la posición en que aparecen sobre el vector plasmídico de transferencia pLZAW1gp120C/gagpolnefC-14 se muestran en la Tabla
6. Las posiciones en las que hibridan dichos oligonucleótidos, así como los tamaños estimados de los fragmentos generados en las distintas PCR y la localización de los mismos con respecto a los insertos y las secuencias flanqueantes, aparecen representadas en la parte superior de la Figura 23.
50 Tabla 6.-Oligonucleótidos utilizados como cebadores de las PCR de caracterización del vector MVA-C
Oligo nucleótido
SECUENCIA Posición
TK-L
5" TGATTAGTTTGATGCGATTC 3' (SEO ID NO:1) 4338-4357
TK-R
5' TGTCCTTGATACGGCAG 3" (SEO ID NO:2) 10819-10835
gp120-10
5' TCGAGCATGGACAGGGCC 3' (SEO ID NO:7) 6128-6145
gp120-1050
5' GTCTTGTTCTGGAAGTGC 3' (SEO ID NO:8) 5088-5105
gp120-1213
5' ATCATCACCATCCCCTGC 3' (SEO ID NO:9) 4925-4942
GPN-802
5' TGGGTTTAAACAAGATCG 3' (SEO ID NO:10) 7043-7060
GPN-2018
5' CAAGGTGAAGCAGTGGCC 3' (SEO ID NO.11) 8260-8276
GPN-2198
5' TGGGTCCTCTTGTTCAGC 3' (SEO ID NO:12) 8439-8456
GPN-3820
5' CGGCCTTGCCGATCTTGG 3' (SEO ID NO:13) 10061-10078
GPN-4000
5' CCGACAAGAGCGAGAGCG 3' (SEO ID NO:14) 10241-10258
La parte inferior de la Figura 23 muestra fotografias de los geles obtenidos al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas con las diferentes parejas de cebadores para efectuar el análisis de los fragmentos del VIH-1 incluidos en el virus MVA-C. Para ello, 100 ng del ADN viral extraído de células CEF infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula con los virus NYVAC-C (calle 1), MVA-C (calle 2), MVA-WT (calle 3) o NYVAC-WT (calle 4), fueron usados como molde para hacer una amplificación mediante PCR de diferentes fragmentos de VIH-1 incluidos en MVA-C. Las condiciones de cada PCR se estandarizaron de forma individualizada para cada pareja de oligonucleótidos cebadores empleada. Como se observa en las fotografías mostradas en la parte inferior de la Figura 23, en las calles 3 y 4, correspondientes a muestras que carecen de inserto, no se observan bandas en ninguno de los casos, mientras que el control positivo NYVAC-C expresa los mismos genes incluidos en MVA-C.
La Figura 24, por su parte, muestra una fotografía de un gel obtenido al someter a electroforesis los productos resultantes de una reacción de PCR en la que se utilizaron como cebadores oligonucleótidos (TK-L y TK-R) que hibridan con las secuencias flanqueantes del gen TK. En las calles 2 y 3, correspondiente a los stocks P1 y P2 del vector MVA-C se observa una banda de algo más de 6 Kb compatible con la presencia del inserto completo; mientras que en la calle 4, correspondiente a ADN extraído de células CEF infectadas con la cepa silvestre MVA-WT del virus MVA aparece una banda mucho menor, que correspondería allocus de TK sin inserto.
Ejemplo 19.-Análisís de la expresión de proteínas del VIH a partir del MVA-C
La expresión de las proteínas gp120-C y gagpolnef-C por el virus MVA-C fue analizada mediante transferencia tipo Western. Monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de los diferentes stocks de virus recombinante MVA-B. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas postinfección, fraccionados en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a la reacción frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120 (generado en el laboratorio) que reconoce la proteína gp120 del aislamiento CN54; y frente a un anticuerpo policlonal de conejo antip24 (cedido por el programa EVA, ARP432) que reconoce la quimera gagpolnef-C del mismo aislamiento. Como controles positivos se utilizaron extractos procedentes de células infectadas con el vector NYV AC-C.
Como se observa en la Figura 25, ambos antígenos son expresados eficientemente por diferentes stock s (P2, P3) del recombinante MVA-C generado.
Ejemplo 20.-Comprobación de la estabilidad del MVA-C
Para verificar que el recombinante MVA-C podía ser pasado sucesivamente sin perder la expresión de los genes insertados, se realizó un ensayo de estabilidad análogo al descrito en el Ejemplo 3, efectuando varios pases sucesivos del virus recombinante MVA-C en células CEF. Monocapas de células CEF crecidas en placas P100 fueron infectadas de forma sucesiva, a una multiplicidad de 0,05 ufp/célula, partiendo del stock P2 del MVA-C (pase 6) hasta generar el pase 10 (P10). A continuación, monocapas de células CEF crecidas en placas de 6 pocillos fueron infectadas con una dilución 10-5 del extracto viral obtenido del último pase (P10). A las 48 horas postinfección, las placas de lisis generadas fueron analizadas por inmunotinción, empleando anticuerpos policlonales anti-WR (que reconoce proteínas del virus MVA); anti-gp120 (que reconoce la gp120 del aislamiento CN54); yantip24 (que reconoce la quimera gagpolnef-C del mismo aislamiento); estos dos últimos anticuerpos fueron los mismos que se utilizaron en el Ejemplo 19. Los resultados de estas inmunotinciones se muestran en la parte A de la Figura
26. Los recuentos de placas demostraron que, tras 10 pases sucesivos del virus en células CEF, ambos antígenos se expresan eficientemente (100% de las placas reconocidas por el anticuerpo anti-WR fueron reconocidas por los anticuerpos anti-gp120 y anti-p24), corroborándose la estabilidad del producto generado. Los extractos de células CEF infectadas con los pases 7,8,9 Y 10 también fueron analizados por inmunotransferencia tipo Western, pruebas a las cuales corresponden las tinciones mostradas en la parte B de la Figura 26. Para realizar estos ensayos, monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de los extractos virales obtenidos en los pases 7 (P7), 8 (P8), 9 (P9) Y 10 (P10) del virus recombinante MVA-C. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDA-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa y hechos reaccionar con los mismos anticuerpos policlonales anti-gp120 (parte derecha de la figura) o anti-p24 (parte izquierda de la figura) utilizados en la prueba correspondiente a la parte A de la Figura 26. Ambos anticuerpos se utilizaron a una dilución 1/500. Como control positivo se empleó un extracto de células CEF infectadas con el virus NYVAC-C (cedido por el grupo Aventis). Los resultados confirman la correcta expresión de las proteínas gp120-C y gagpolnef-C en todos los extractos obtenidos por la infección con virus procedentes de distintos pases.
Ejemplo 21.-Liberación de gp120-C y cinética de expresión a partir del MVA-C en el transcurso del tiempo
Para definir si la proteína gp120-C era eficientemente secretada, monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con el virus recombinante MVA-C a 5 ufp/célula. A las 6, 18 Y 24 horas post-infección las células se recogieron separando el precipitado (P) del sobrenadante (S) celular. Los sobrenadantes de cada tiempo analizado fueron concentrados y fraccionados junto a los precipitados celulares en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a reacción frente al anticuerpo pOliclonal anti-gp120 específico para el aislamiento CN54 anteriormente utilizado en los Ejemplos 19 y
20. De igual forma fueron tratadas células CEF infectadas con el NYVAC-C (proporcionado por el grupo Aventis), usado como control positivo en el ensayo. Como control interno para verificar que había sido aplicado en el gel la misma cantidad de proteína, las membranas fueron incubadas también frente a un anticuerpo monoclonal anti-pactina. Los resultados se muestran en la Figura 27. En su parte superior, correspondiente a la muestra del MVA-C, puede apreciarse que la proteína gp120-C es expresada eficientemente por el MVA-C desde las 6 horas postinfección, detectándose en el sobrenadante celular a partir de las 18 horas post-infección, y con un comportamiento similar al que se observa en células infectadas con el NYVAC-C, para el cual se muestran los resultados obtenidos en la parte inferior de la Figura 27.
La expresión de la proteína de fusión gagpolnef-C fue analizada en el precipitado celular igualmente a las 6, 18 Y24 horas post-infección siguiendo un procedimiento análogo al utilizado para la proteína gp120-C, aunque utilizando en este caso el anticuerpo anti-p24 específico para el aislamiento CN54. Los resultados se muestran en la Figura 28. En ella puede observarse que esta proteína de fusión se expresa eficientemente a lo largo del tiempo de infección tanto desde MVA-C (calle 1 de cada tiempo de infección) como desde NYVAC-C (calle 2).
Ejemplo 22.-lnmunogenicidad del MVA-C: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-y
Una vez generado y caracterizado el recombinante MVA-C, el siguiente objetivo fue analizar su capacidad de inducir una respuesta inmune específica en el modelo murino frente a los antígenos que expresa. Para ello, ratones transgénicos HHDII (n=4) de 10 semanas de edad se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de 2 x 107 ufp/ratón de MVA-C o de NYVAC-C. 8 días después de la inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical, y se les extrajo el bazo para llevar a cabo un ensayo de ELlSPOT análogo al descrito en el Ejemplo 5, siguiendo la misma metodología descrita en dicho Ejemplo con la excepción de que, en este caso, para evaluar la respuesta inmune específica, se utilizaron diferentes grupos que contenían 40-50 péptidos solapan tes de 15 aminoácidos cada uno, pertenecientes al clade C, que cubrían todas las regiones antigénicas incluidas en el recombinante MVA-C de la invención.
Los resultados, que se muestran en la Figura 29, demuestran que el MVA-C es capaz de potenciar una respuesta inmune específica frente a casi todos los grupos de péptidos ensayados, evidenciándose la mejor respuesta frente a los grupos de péptidos representativos de los genes de la envuelta (Env1 y Env2).
Adicionalmente, se evaluó también la respuesta generada contra las proteínas expresadas a partir de las partes del vector derivadas de las formas atenuadas de Vaccinia utilizadas para la construcción de los recombinantes, MVA y NYVAC. Para ello, los esplenocitos de los animales inmunizados se pusieron en contacto durante 48 horas con células RMAS-HDD previamente infectadas durante 5 horas con 5 ufp/célula de las cepas silvestres de MVA y NYVAC, MVA-WT Y NYVAC-WT. El número de células productoras de IFN-y obtenido frente a las células RMASHHDII sin infectar (control negativo) fue sustraído en todos los casos. Los resultados, que se muestran en la parte B de la Figura 29, demuestran que la respuesta anti-Vaccinia fue superior en el grupo de ratones inmunizados con NYVAC-C.
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Ejemplo 23.-Inmunogenicidad del MVA-C: Producción de citoguinas por esplenocitos reestimulados
Los esplenocitos aislados de los animales inmunizados con MVA-C y NYVAC-C aislados en el Ejemplo 22 fueron cultivados (5x106 células/pocillo) en una placa de 24 pocillos y estimulados con 1 ~g/ml de cada grupo de péptidos pertenecientes al clade C. La placa se incubó durante 5 días a 37°C en atmósfera del 5% C02. Después de este período, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos y se centrifugaron a 1.500 rpm, 5 min, a 4°C, almacenándose a -70°C hasta su utilización. Para conocer los niveles de IL-10 e IFN-y presentes en los sobrenadantes de cultivos de esplenocitos reestimulados in vitro, se procedió a la determinación de estos niveles mediante kits de ELlSA comerciales de Pharmigen, siguiendo las instrucciones del fabricante de forma análoga a la descrita en el Ejemplo 6. Los resultados, mostrados en la Figura 30, indican que MVA-C induce la secreción de las citoquinas IL-10 e IFN-y en el sobrenadante de cultivo de los esplenocitos reestimulados. Los niveles de IFN-y fueron significativamente superiores frente a los grupos de péptidos GPN2, Env-1 y Env-2, evidenciando una clara polarización de la respuesta celular antígeno-específica hacia un subtipo Th1.
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Ejemplo 24.-Inmunogenicidad del MVA-C: Identificación de los tipos de células T específicas productoras de IFN-r
Para dilucidar si la respuesta celular que se estaba obteniendo en ELlSPOT era debida a la secreción de IFN-y por las células T CD8+ o por las células T CD4+, los esplenocitos obtenidos en el Ejemplo 22 fueron reestimulados durante 1 hora con 5 IJg/ml de cada grupo de péptidos, tras lo cual se añadió Brefeldina a una concentración de 10 IJg/ml, incubándose durante toda la noche. Posteriormente se procedió a un marcaje de superficie empleando anticuerpos específicos anti-CD4 o anti-CD8 conjugados a FITC, seguido de un marcaje intracelular empleando antiIFN-y conjugado a PE. Una vez fijadas las células fueron analizadas en el citómetro de flujo.
Los resultados, mostrados en la Figura 31, permiten apreciar que, tanto para el grupo de animales inmunizado con el MVA-C, como para el grupo inmunizado con NYVAC-C, la respuesta productora de IFN-y es mayoritariamente debida a la población de células T CD8+ específicas activadas frente a los diferentes grupos de péptidos. Al determinar los niveles totales de IFN-y secretados por ambos tipos de células, se corroboró el resultado obtenido en el ensayo de ELlSPOT, donde se observaba una respuesta específica frente a la mayoría de los grupos de péptidos en los animales inmunizados con ambos recombinantes. De nuevo, existen diferencias claras entre las respuestas generadas por cada uno de los recombinantes.
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Ejemplo 25.-lnmunogenicidad del MVA-C: Respuesta humoral generada
Para evaluar la respuesta humoral generada por la inoculación de MVA-C y NYVAC-C, grupos de 4 ratones HHDII o C57BU6 de 6-10 semanas de edad fueron inoculados por vía intraperitoneal (i.p.) con una dosis de 2 x 107 ufp/ratón de MVA-C (stock P3) o de NYVAC-C (grupo Aventis, Francia). 14 días después, se extrajo sangre del plexo suborbital de los ratones inmunizados y, tras dejarlo toda la noche a 4 oC se centrifugó obteniéndose el suero. La cantidad total de anticuerpos IgG presentes en los sueros frente a la proteína Gag (2 IJg/ml), la proteína de la envuelta gp-160 (2 IJg/mL) o frente a extractos celulares de una infección con vaccinia fue determinada por ELlSA, diluyendo para ello los sueros 1/500 para la detección de los anticuerpos frente a Vaccinia y 1/50 para la detección de los anticuerpos frente a la proteína Gag y frente a la proteína gp160. Los resultados, que se muestran en la Figura 32, muestran un aumento de la respuesta humoral generada frente a la proteína de la envuelta en los ratones inmunizados con el vector recombinante MVA-C con respecto a los controles y los ratones inmunizados con NYV ACC, siendo inferior la respuesta humoral generada frente a los antígenos del propio vector Vaccinia en los ratones inmunizados con MVA-C que en los ratones del mismo tipo inmunizados con NYVAC-C.
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Ejemplo 26.-Utilización del MVA-C en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores de ADN v vectores virales derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-y generada en ratones humanizados HHDII
Grupos de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intramuscular (i.m.) con 100 IJg del vector de ADN DNA-C (cedido por GeneArt, Alemania), formado por dos plásmidos recombinantes derivados de pcDNA que contienen cada uno de ellos una de las secuencias codificantes de proteínas del VIH-1 (gp120-C y gagpolnef-C) que lleva insertadas el MVA-C, bajo el control de sendos promotores de citomegalovirus. El grupo control fue inoculado (i.m.) con 100 IJg de ADN sin inserto (DNA 0). 15 días después se les inmunizó por vía intraperitoneal (i.p.) con 2 x 107 ufp/ratón de MVA-C (stock P3) o de NYVAC-C (grupo Aventis, Francia), que expresa los mismos antígenos de VIH que MVA-C. El grupo control recibió una dosis de 2 x de 107 ufp/ratón de NYVAC-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELlSPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, mezclas de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade C (5 IJg/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-C y NYVAC-C. El número de células productoras de IFN-y obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
Los resultados se muestran en la Figura 33. Se observa que la inmunización combinada de vectores genera una respuesta inmune amplia, con producción de IFN-y frente a distintos antígenos del VIH, con diferencias significativas entre los vectores. La combinación DNA-C+NYVAC-C produjo inmunodominancia frente a Env.
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Ejemplo 27.-Utilización del MVA-C en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores de ADN Vvectores virales derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IL-2 generada en ratones humanizados HHDII
Grupos de 4 ratones HHDII de 6-10 semanas de edad se inocularon por vía intramuscular (i.m.) con 100 IJg del vector de ADN DNA-C (cedido por GeneArt, Alemania) utilizado en el Ejemplo 26. El grupo control fue inoculado (i.m.) con 100 IJg de ADN sin inserto (DNA 0). 15 días después se les inmunizó por vía intraperitoneal (i.p.) con 2 x 107 ufp/ratón de MVA-C (stock P3) o de NYVAC-C (grupo Aventis, Francia), que expresa los mismos antígenos de VIH que MVA-C. El grupo control recibió una dosis de 2 x de 107 ufp/ratón de NYVAC-WT. 10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELlSPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, mezclas de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con las mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade C (5 IJg/ml), que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-C y NYVAC-C, utilizadas en los Ejemplos anteriores referentes al MVA-C. El número de células productoras de IL-2 obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 34. Se observa que la inmunización combinada de vectores genera una respuesta inmune amplia, con producción de IL-2 frente a los distintos antígenos del VIH, con diferencias significativas entre los vectores. La combinanción DNA-C +NYVAC-C produjo inmunodominancia frente a Env.
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Ejemplo 28.-Utilización del MVA-C en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Respuesta inmune específica de células T productoras de IFN-y en ratones BALB/c
Habiendo establecido que la administración de una primera dosis de inmunización que contenía el MVA-C era capaz de inducir una respuesta inmune específica en el modelo murino, se evaluó a continuación si la utilización de este vector de la invención como parte de un protocolo de inducción/potenciación, con diferentes combinaciones de MVAC y NYVAC-C, daba lugar a un incremento en la magnitud y la amplitud de la respuesta inmune. Por ello, se suministró una primera dosis de inmunización a 4 grupos de ratones BALB/c (n=4) de 6-8 semanas de edad que contenía 2 x 107 ufp/ratón de MVA-C (P3), NYVAC-C (grupo Aventis), MVA-WT o NYVAC-WT por la ruta intraperitoneal. 15 días después los ratones recibieron una segunda dosis por vía intraperitoneal (i.p.) de 2 x 107 ufp/ratón, de manera que a uno de los grupos que había recibido MVA-B en la primera dosis se le inoculó NYVAC-C ya otro de nuevo MVA-C, a uno de los grupos que habían recibido NYVAC-C en la primera dosis se le inoculó NYVAC-C de nuevo y a otro MVA-B y, el grupo control que había recibido MVA-WT recibió en la segunda dosis NYVAC-C y el grypo control que había recibido NYVAC-WT recibió en la segunda dosis MVA-WT (grupo Aventis). Se generaron así grupos que habían sido inoculados con las siguientes combinaciones de vectores: MVAC+NYVAC-C, NYVAC-C+MVA-C, MVA-C+MVA-C, NYVAC-C+NYVAC-C, NYVAC-WT+MVA-WT Y MVAWT +NYVAC-WT.
10 días después de la última inmunización los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical y el bazo fue extraído para llevar a cabo el ensayo de ELlSPOT. Para detectar la respuesta inmune específica, grupos de mezcla de esplenocitos de los animales inmunizados en cada grupo se pusieron en contacto durante 48 horas con diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade C (5 Dg/ml) que comprenden todas las regiones antigénicas incluidas en los virus recombinantes MVA-C y NYVAC-C. El número de células productoras de IFN-D obtenido frente a una mezcla de péptidos antigénicos no relacionados (control negativo) fue sustraído en todos los casos.
De los resultados obtenidos, que se muestran en la Figura 35, se puede deducir que las diferentes combinaciones de vectores derivados de poxvirus (MVA-C+NYVAC-C, MVA-C+MVA-C, NYVAC-C+MVA-C, NYVAC-C+NYVAC-C, NYVAC-WT+MVA-WT, MVA-WT+NYVAC-WT) incrementan tanto la magnitud como la amplitud de la respuesta inmune específica generada, según se observa con los diferentes grupos de péptidos. Los grupos de péptidos mejor reconocidos fueron los correspondientes a Env1, GPN1 y GPN2, seguidos de GPN3 y Gag1.
Las combinaciones de MVA-C y NYVAC-C dieron lugar a mayores respuestas que la administración de dos dosis de virus homólogos, MVA-C+MVA-C o NYVAC-C+NYVAC-C. El grupo de ratones al que se le administró en la primera dosis NYVAC-C y en la dosis de potenciación MVA-C fue el que mostró el número más elevado de células secretoras de IFN-y frente a los diferentes grupos de péptidos.
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Ejemplo 29.-Utilización del MVA-C en protocolos de inducción/potenciación que combinan vectores derivados de Vaccinia: Producción de citoquinas por esplenocitos reestimulados procedentes de ratones BALB/c
Seis grupos de ratones BALB/c (n=4) fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y la potenciación de la misma mediante la inoculación de un segundo vector en una segunda dosis, de manera análoga a la descrita en el Ejemplo 28 y utilizando las mismas combinaciones de vectores. Los esplenocitos extraídos fueron estimulados in vitro con las diferentes mezclas de péptidos solapantes pertenecientes al clade C (1 !Jg/ml) e incubados durante 5 días a 37°C. Transcurrido ese tiempo, se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -70°C. Los niveles de IFN-y e IL-10 se determinaron por ELlSA usando kits comerciales (Pharmigen).
Los resultados se muestran en la Figura 36. Se observa que la combinación de vectores virales induce una respuesta celular tipo Th2, con polarización hacia los antígenos Env y gpn1.
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Ejemplo 30.-Utilización del MVA-C en protocolos de inducción/potenciación gue combinan vectores derivados de Vaccinia: Identificación de los tipos de células T específicas secretoras de IFN-r generadas en ratones BALB/c
Cinco grupos de ratones BALB/c (n=4) fueron inoculados en régimen combinado de inducción de la respuesta inmune mediante la administración de una primera dosis de vector y la potenciación de la misma mediante la inoculación de un segundo vector en una segunda dosis, de manera análoga a la descrita en el Ejemplo 28 y utilizando las mismas combinaciones de vectores salvo en el caso de los controles, en el que se prescindió de inocular la combinación MVA-WT +NYV AC-WT en este orden.
Los esplenocitos extraídos fueron reestimulados in vitro durante 1 hora a 37°C con 5 !Jg/ml de cada grupo de péptidos solapantes pertenecientes al clade C, tras lo cual se añadió Brefeldina a una concentración de 10 !Jg/ml, incubándose durante toda la noche a 37°C. Siete días después se procedió a un marcaje de superficie empleando anticuerpos específicos anti-CD4 o anti-CD8 conjugados a FITC, seguido de un marcaje intracelular empleando antiIFN-y conjugado a PE. Una vez fijadas las células fueron analizadas en el citómetro de flujo.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 37. Se observa que la combinación de vectores virales induce un menor aumento de células CD8+ productoras de IFN-y que de células CD4+, con la combinación NYVAC-C+MVA-C induciendo el mayor incremento frente a los péptidos de Gag1, Env1, Gpn1 y Gpn2.
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Ejemplo 31.-Perfil diferencial de cambios en los niveles de expresión de genes humanos inducidos durante la infección con los vectores MVA y NYV AC
Para evaluar si las diferencias en las respuestas inmunes inducidas por la inoculación de vectores recombinantes derivados de MVA y NYVAC iban acompañadas también de perfiles diferentes de inducción de variaciones en los niveles de expresión de genes en las células infectadas, se realizó un experimento de infección de células HeLa con MVA y NYVAC y se evaluaron los cambios experimentados en los niveles de expresión de 15000 genes humanos utilizando microarrays con ADNc humano. Para ello, se generaron microarrays de ADNc tal como se ha descrito previamente (20), utilizando la genoteca de ADNc humano 40K de Research Genetics (http://www.resgen.com/products/SVHcDNA.php3). que contenían 15.360 secuencias de ADNc, (de las cuales 13295 corresponden a genes conocidos y 2.257 corresponden a genes de control), utilizando portaobjetos CMTGAPS 11 (Coming) sobre los que se fijaron las secuencias de ADNc mediante el Microgrid 11 (BioRobotics) a 22°C y una humedad relativa de 40-45%. Por otro lado, se cultivaron células HeLa (de la American Type Culture Collection) en placas de 10 cm de diámetro, en medio de Dulbecco al que le había añadido suero bovino de recién nacido al 10% y antibióticos y se llevaron a cabo infecciones con el MVA-WT y el NYVAC-WT a una multiplicidad de infección de 5 ufp/célula. El ARN total se aisló de las células infectadas utilizando Ultraespect-II RNA (Biotecx), siguiendo las instrucciones del fabricante, a partir de muestras tomadas por duplicado de las células infectadas con cada uno de los virus transcurridas 2, 6 Y 16 horas del momento de la infección. Cada muestra de ARN se utilizó en dos hibridaciones diferentes: en una hibridación, la muestra infectada con MVA-WT se marcó con dUTP-Cy3 y la muestra infectada con NYV AC-WT se marcó con dUTP-Cy5, mientras que en la otra la muestra infectada con MVAWT se marcó con dUTP-Cy5 y la muestra infectada con NYVAC-WT se marcó con dUTP-Cy3. El doble marcaje se utilizó para suprimir diferencias en el marcaje y la hibridación debidas a características específicas del Cy-dUTP. Una mezda que contenía 40 !Jg de ARN, 150 pmoles de oligo(dTho,dATP 0,5 mM, dGTP 0,5 mM, dCTP 0,5 mM, dTIP 0,1 mM, dUTP-Cy3/Cy5 0,05 mM (Amersham), tampón de reacción para la primera hebra 1X (Invitrogen) y ditiotreitol 10 mM en un volumen de 38 !JI se calentó (65°C, 5 min) y se preincubó (42°C, 5 min), tras lo cual se añadieron 400 U de SuperScript 11 (Invitrogen) y 40 U de inhibidor de RNasa (Roche) y se incubó la mezda a 42°C durante 2,5 horas. La reacción se terminó añadiendo EDTA y el molde de ARN de partida se retiró añadiendo 2 !JI de NaOH 10 N, seguido de incubación (20 min, 65°C). La reacción se neutralizó añadiendo 4 !JI de ácido acético 5 M. Se mezclaron las sondas de Cy5 y Cy3 Y los colorantes no incorporados se retiraron mediante precipitación con isopropanol. Las sondas se resuspendieron en agua des ionizada; los agentes bloqueantes añadidos para incrementar la especificidad fueron poli(A) (20 !Jg, Sigma), ARNt (20 !Jg, Sigma) y ADN humano Cot-1 (20 !Jg, Invitrogen). Mientras las sondas se secaban en una Speed-Vac, los microarrays se prehibridaron con una mezcla que contenía SSC 6x (SSC 1X está formado por NaCI 0,15 M Y citrato sódico 0,015 M), dodecilsulfato sódico (SOS) al 0,5% y albúmina de suero bovino al 1% (42°C, 1 hora), se lavaron cinco veces con agua, y se secaron mediante centrifugación (563 x g, 1 min). Las sondas se resuspendieron en 40 !JI de tampón de hibridación (formamida al 50%, SSC 6x, SOS al 0,5%, solución de Denhardt 5x) y se incubaron con los portaobjetos que contenían los microarrays (42°C, 16 horas) en cámaras de hibridación (Array-It) en un baño de agua en la oscuridad. Después de la incubación, los portaobjetos se lavaron dos veces en SSC O,1X-SDS 0,1 % durante 5 minutos cada vez y tres veces en SSC 0,1 x durante 5 minutos cada vez. Finalmente, los portaobjetos se secaron mediante centrifugación como se
describió anteriormente y se escanearon en un ScanArray 4000 (Packard Biosciences) utilizando el software ScanArray 3.1. A partir de las imágenes de Cy5 y Cy3 se obtuvieron datos preliminares utilizando el software QuantArray 3.0 (Packard Biosciences), que se procesaron utilizando el software SOLAR (BioALMA, Madrid, España. La señal de fondo se resta de la señal, se representa log1O(señal) frente log2(relación) y se realiza una normalización 5 mínima. Este valor se calcula para las cuatro réplicas y se obtiene una tabla con la señal media, el factor de cambio, log (relación), la desviación estándar del logaritmo de la relación y el valor z (una medida de la proximidad de un valor [Iog relación] a otros valores con señales similares) (21). Una vez obtenidos estos datos, el juego de datos se redujo eliminando los genes con una desviación estándar entre las réplicas >1 y aquellos que mostraban valores de z :::; 2, después de lo se reprocesaron los datos, se agrupó los genes utilizando el mapa clásico de autoorganización
10 de Kohonen (22,23,24) y se analizó el mapa resultante utilizando el software Engene, disponible en hUp://www.engene.cnb.uam.es.
Las diferencias más representativas detectadas en las células infectadas con uno y otro virus se resumen en la Tabla 7, en la que se indican el factor de aumento de la expresión de varios genes representativos observado
15 transcurridos distintos intervalos de tiempo (horas post-infección: h.p.i.) tras el momento de la infección. En ella puede observarse que el perfil de inducción de variaciones en los niveles de expresión de genes en las células infectadas es diferente según el virus utilizado para la infección. Por ejemplo, el incremento por MVA y no por NYVAC de genes coestimuladores de la respuesta inmune, como IL-7, proteína B7, NFATC3 y MAP2K5, puede condicionar el menor grado de respuesta inmune de un vector frente al otro.
Tabla 7.-.Perfiles de expresión de genes representativos modificados por la infección de '1 I h H L a con cepas d MVA y NYVAC
ce u as umanas e e
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Ejemplo 32.-Perfil diferencial de cambios en los niveles de inducción de apoptosis inducidos durante la infección de células en cultivo por los vectores MVA y NYVAC
Para evaluar si las diferencias observadas en la resupuesta inmune inducida por la inoculación de vectores derivados de MVA y NYVAC iban acompañadas de variaciones en los niveles de inducción de muerte celular por apoptosis, se llevaron a cabo distintos experimentos para evaluar el grado de apoptosis, evaluando distintos parámetros indicativos del mismo. Una de las características de la apoptosis es la rotura específica por proteasas de 10 la proteína PARP. Para evaluarla, se procedió a la infección de células HeLa con 5 ufp/célula de MVA o NYVAC y se recogieron a 4, 8 Y 16 horas postinfección en tampón de lisis (Tris-HCI 50 mM, pH 8,0, NaCI 0,5 M, NP-40 10%, SOS 1%.). Se separaron cantidades iguales de lisados de proteínas (10 J.Ig) mediante electroforesis en geles de SDSpoliacrilamida (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con un anticuerpo antiPARP humano (1 :500 dilución) de Cell Signalling, obteniéndose los resultados que se muestran en la parte superior 15 de la Figura 38a, en la que se indica la posición de la banda correspondiente a la proteína PARP completa (PARPc)
y la correspondiente a un fragmento de la proteína PARP escindido de la proteína completa (PARPf). Como control interno para verificar que había sido aplicado en el gel la misma cantidad de proteína, las membranas fueron incubadas también frente a un anticuerpo monoclonal anti-p-actina (SIGMA), obteniéndose la señal que se muestra en la parte inferior de dicha Figura. Los resultados muestran que la infección de células HeLa con NYVAC induce con el tiempo de infección la degradación de PARP. Esta degradación es mucho menor en células infectadas con MVA. La inducción de apoptosis por NYVAC también se confirmó mediante pruebas de inmunofluorescencia de células HeLa infectadas con 5 ufp/célula cuyos núcleos fueron teñidos a las 24 horas postinfección con DAPI durante 30 min a temperatura ambiente y las célula fotografiadas. Los resultados se muestran en la Figura 38b, en cuya parte inferior, correspondiente a células HeLa infectadas con NYVAC, se observa que NYVAC favorece condensación de la cromatina y formación de cuerpos apoptóticos, algo que no se observa en la infección con MVA (parte superior de la Figura). Otro indicador de apoptosis es la activación de la enzima RNasa L, que favorece la ruptura del ARN ribosómico. Para evaluar esta activación, se aisló el total de ARN usando el sistema de purificación por resina de ARN Ultraspec-II (Bioteck), a partir de muestras de células HeLa infectadas con 5 ufp/célula obtenidas transcurridas 18 ó 24 de la infección con la cepa Western Reserve (WR) de Vaccinia, con MVA o con NYVAC, añadiendo un control en el que se simuló la infección. Se sometieron los ARNs (2 microgramos) a electroforesis en geles de agarosa-formaldehido al 1 % que contenían bromuro de etidio y se fotografió bajo luz ultravioleta el patrón de bandas obtenido. Los resultados, mostrados en la Figura 38c muestran que la infección de células HeLa con NYVAC induce a las 18 horas degradación del ARN ribosómico en fragmentos característicos de la activación de la enzima RNasa L, lo que no se observa en la infección con MVA.
Finalmente, otro indicador de apoptosis es la cuantificación del número de células apoptóticas por citometría de flujo. Este ensayo se realizó de nuevo en células HeLa infectadas (5 ufp/célula) con Vaccinia WR, MVA y NYVAC, así como en controles en los que se simuló la infección. Los diferentes estad íos del ciclo celular y el porcentaje de células en la fase subGo fueron analizadas por tinción con yoduro de propidio (IP). Para cada uno de ellos se realizó el ensayo en muestras que habían sido incubadas en ausencia o en presencia del inhibidor general de caspasas zVAD (4 micromolar, Calbiochem). A las 24 horas se recogieron las células, se lavaron con PBS frio, se permeabilizaron con etanol al 70% en PBS a 4°C durante 30 mino Después de tres lavados con PBS, las células se incubaron durante 45 min a 37°C con RNasa A y se tiñeron con IP (10 microgramos/ml). El porcentaje de células que presentaban DNA hipodiploide se determinó por citometría de flujo. Los datos fueron adquiridos en 15000 células por muestra y los resultados se representan como veces de incremento en células apoptóticas respecto a las células sin infectar. El gráfico de la Figura 38d muestra el factor de incremento de células apoptóticas observado en cada uno de los casos. En él puede observarse que la infección con NYVAC provoca apoptosis en una gran parte de la población celular (más del 40%) y que este fenómeno se previene con la adición del inhibidor general de caspasas zVAD. La inducción de apoptosis por MVA fue mucho más reducida.
Los resultados de estos ensayos demuestran que NYVAC induce apoptosis durante la infección, mientras que MVA no parece activar apoptosis o da muestras de activar en menor medida. Estas diferencias bioquímicas, junto a las diferencias genéticas definidas en el Ejemplo 31, indican que es de esperar que los vectores recombinantes generados a partir de MVA y NYVAC, a pesar de contener las mismas secuencias codificantes del VIH-1 bajo el control de promotores idénticos, den lugar a comportamientos diferentes al ser inoculados en seres humanos con la intención de provocar una respuesta inmune contra el VIH. Los vectores recombinantes derivados de MVA, por tanto, representan una interesante alternativa para sustituir o complementar de forma ventajosa a los vectores recombinantes derivados de NYV AC en protocolos de inmunización frente al VIH-1.
Construcción y ensayos realizados con los vectores diseñados para uso en macacos
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Ejemplo 33.-Generación del MVA-89.6P-SIVgpn
Construcción del vector plasmídico pLZAW1-89.6p-SIVgpn-18
El vector plasmídico de transferencia pLZAW1-89.6p-SIVgpn-18 fue construido por los inventores para la generación de los virus recombinantes derivados de MVA y de NYVAC que expresan la parte correspondiente a la proteína gp120 del gen Env del SHIV 89.6P (89.6Psynenv120, a la que en lo sucesivo se aludirá de forma abreviada como 89.6P-gp120) y la quimera de los genes Gag, Poi y Nef del mismo virus (SIVmac239-gagpolnef, a la que en lo sucesivo se aludirá de forma abreviada como SIVgpn), esta última a partir de una secuencia de nucleótidos obtenida a partir de las secuencias de los genes Gag, Poi y Nef del virus SHIV89.6P en las que se habían practicado las mismas modificaciones que se realizaron para obtener las quimeras de los genes Gag, Poi y Nef presentes en los vectores MVA-B y MVA-C. El plásmido pLZAW1-89.6p-SIVgpn-18 es un derivativo de pUC diseñado para la selección de placas azules/blancas y la generación, como medida de seguridad, de un vector viral carente del marcador p-Gal, al igual que se hizo en el caso de los vectores MVA-B y MVA-C, como medida de seguridad. Contiene las secuencias f1anqueantes derecha (TK-R) e izquierda (TK-L) del gen de la timidina quinasa (TK) del MVA, una repetición corta de la secuencia f1anqueante izquierda ("brazo izquierdo") del gen TK, el promotor E3L dirigiendo la expresión del marcador de selección p-galactosidasa, y el gen de resistencia a ampici1 ina (AP). Entre las dos secuencias f1anqueantes se encuentran las ~os secuencias que se desea expresar, 89.6P-gp120 (SEQ ID NO: 22) y SIVgpn (SEQ ID NO: 23), que han sido modificadas para optimizar el uso de codones de mamífero. Para
dirigir la expresión de cada una de las secuencias hay sendos promotores sintéticos temprano/tardío (pE/L), situados en orientación opuesta en la zona del inserto más alejada de las secuencias flanqueantes. La posición de cada uno de los componentes incluidos en el plásmido se describe a continuación en la Tabla 8.
a a oSlclon d 1 l' ·d LZAW1Igp·120BI T bl 8 -P .. , de 1os componentes e plasml Opl Igagpo nefB 1
Secuencia flanqueante izquierda de TK
410-908 Complementaria
T5NT para p-gal
929-935 Complementaria
p-gal
ATG-T AA (936-4079) Complementaria
Promotor E3L para p-gal
4080-4140 Complementaria
Parte 1 de la secuencia flanqueante izquierda deTK
4151-4498 Complementaria
89.6p-gp120
ATG-TAA (4518-6032) Complementaria
Promotor E/L para 89.6P-gp120
6080-6118 Complementaria
Promotor E/L para SIVgpn
6143-6181
SIVgpn
A TG-T AG (6226-10443)
T5NT para SIVgpn
1 0499-1 0505
Secuencia flanqueante derecha de TK
10488-11179 Complementaria
AP
ATG-TAA (12350-13210) Complementaria
Para la construcción de este plásmido se utilizaron otros dos plásmidos diferentes:
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pcDNA89.6P-syn-CD5-GP120REKR: (proporcionado por Ralf Wagner, Regensburg, Alemania).
-pCR-ScriptSIV-syn-gagpolnef: (proporcionado por Ralf Wagner, Regensburg, Alemania).
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pLZAW1: El plásmido fue proporcionado por Linong Zhang, del grupo Aventis, Canadá. Es un plásmido basado en pUC que contiene un brazo izquierdo del gen de TK, sitios de clonación para insertar genes exógenos, una repetición corta del brazo izquierdo el gen de TK, un promotor E3L dirigiendo la expresión de un casete con p-gal y un brazo derecho del gen de TK.
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pJR1 01: El plásmido fue generado por los inventores. Es un derivado de pUC que contiene las secuencias flanqueantes derecha e izquierda del/ocus HA del virus MVA, sitios de clonación para insertar genes exógenos bajo el control de la transcripción del promotor sintético temprano/tardío (E/L), y el promotor 7.5 del virus MVA (P7.5) dirigiendo la expresión del gen p-gus.
La construcción del plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 a partir de estos otros dos plásmidos se representa en las Figuras 41 a y 41 b. Brevemente, un fragmento de ADN de 1,518 Kb que contenía el gen 89.6P-gp120 (indicado en la figura como 89.6synenv120) se escindió del plásmido pcDNA89.6P-syn-CD5-GP120REKR mediante digestión con EcoRI, tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa para generar extremos romos, y digestión con BamHI. El fragmento de ADN se subclonó en el vector pJR101 (previamente digerido con las endonucleasas de restricción Smal y BamHI), generando el plásmido pJR-89.6P-18 (7918 pb). Un fragmento de ADN de 1,612 kb que contenía el promotor sintético temprano/tardío (E/L) dirigiendo al gen 89.6-gp120 se escindió del plásmido pJR89.6P-18 mediante digestión con Hindlll y BamHI, seguida de la modificación con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y se clonó en el vector pLZAW1 (previamente digerido con la endonucleasa de restricción Ascl, modificado mediante la incubación con el fragmento Klenow, y desfosforilado mediante incubación con la fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIP», generando el vector plasmídico pLZAW1-89.6P-9 (9131 pb) (Figura 41a).
Por otra parte, un fragmento de ADN de 4,230 kb que contenía el gen SIVgpn (indicado en las Figuras como SIVsyngagpolnef) se escindió del plásmido pCR-Script SIV-syn-gagpolnef mediante digestión con EcoRI y Xhol seguida de la modificación con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa, y se subclonó en el vector pJR101 (previamente digerido con la endonucleasa de restricción Smal y desfosforilado mediante incubación con la fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIP», generandO el plásmido pJR-SIVgpn-9 (10630 pb). Un fragmento de ADN de 4,3 kb que contenía el promotor sintético temprano/tardío (E/L) dirigiendo al gen SIVgpn se escindió del plásmido pJR-SIVgpn-9 mediante digestión con Hindllll, tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa y digestión con Notl, y se clonó en el vector pLZAW1-89.6P-9 (previamente digerido con las endonucleasas de restricción Swal y Notl, generando el vector plasmídico de transferencia pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 (13399 pb) (Figura 41b).
El plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 generado dirige la inserción de los genes de interés en el locus TK del genoma de MVA y NYVAC. Después de que los virus recombinantes deseados fueron aislados mediante la evaluación de la expresión de la actividad p-galactosidasa, la propagación posterior de los virus recombinantes conduce a la autodeleción del gen p-gal mediante recombinación homóloga entre el brazo izquierdo de TK y la repetición corta del brazo izquierdo de TK que están flanqueando el marcador.
Construcción del virus recombinante MVA-89.6P-SIVgpn
Cultivos primarios de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) procedentes de huevos SPF (libres de patógenos específicos, por sus siglas en inglés "Specific Pathogen Free") fueron infectados con un virus atenuado MVA en pase 586 (habiendo sido el MVA-F6 del pase anterior, 585, proporcionado por Gerd Sutter) a una multiplicidad de 0,05 ufp/célula, y posteriormente transfectados con 10 IJg del vector plasmídico de transferencia pLZAW1-89.6PSIVgpn-18, usando para ello el reactivo de transfección lipofectamina (Lipofectamine™ 2000, Cat. 18324-012, lote 1198865, suministrada por Invitrogen S.A., El Prat de Llobregat, Barcelona, España) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 72 horas post-infección las células fueron recogidas, sonicadas y usadas para la selección de los virus recombinantes.
Los virus MVA recombinantes que contenían los genes 89.6P-gp120/SIVgpn y que coexpresaban de forma transitoria el gen marcador p-Gal (MVA-SHIV (X-Gan), fueron seleccionados realizando pases consecutivos de purificación de placas en células CEF teñidas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-galactósido (XGal) (300 IJg/ml). Los virus MVA recombinantes que contenían los genes 89.6P-gp120/SIVgpn y que habían perdido el gen marcador (MVA-SHIV (X-Gar», fueron seleccionados como focos virales no teñidos en células CEF en presencia de XGal. En cada paso de purificación las placas aisladas fueron expandidas en células CEF durante 3 días, y el extracto viral crudo obtenido fue usado para el siguiente paso de purificación de placas.
En el primer paso de la selección por cribado se aislaron 3 placas X-Gal+ a las que se denominó MVA-89.6PSIVgpn-(1 a 3). La placa denominada MVA-89.6P-SIVgpn-1, que expresaba de forma eficiente los antígenos 89.6Pgp120 Y SIVgpn, se amplificó y utilizó para el siguiente paso de purificación. En el segundo pase, se aislaron 22 placas X-Gal+, todas las cuales expresaban de forma eficiente ambas proteínas. Se amplificaron tres placas, denominadas MVA-89.6P-SIVgpn-1.4, MVA-89.6P-SIVgpn-1.6 y MVA-89.6P-SIVgpn-1.18, que se utilizaron para el siguiente paso de purificación. En el tercer pase, se aislaron 20 placas X-Gal+ y 4 placas X-Gar, todas las cuales expresaban de forma eficiente ambos antígenos. Una de las placas X-Gar (MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8) y una de las placas X-Gal+ (MVA-89.6P-SIVgpn-1.18.2) se amplificaron y utilizaron en el siguiente paso de purificación; la primera de ellas, MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8, se utilizó para preparar el stock P1 por infección a partir de una placa p150 en células CEF). En el cuarto pase se aislaron 6 placas X-Gar y 6 placas X-Gal+. El recombinante denominados MVA89.6P-SIVgpn-1.6.8.5 (X-Gal) se utilizó para preparar los stocks P2 por infección a una multiplicidad de 0,01 ufp/célula de cinco placas p150. Los stocks P3 (generados en células CEF infectadas en 40-100 placas p150 a una multiplicidad de infección de 0,05 ufp/célula, recogidos transcurridos 3-4 días después de la infección y purificados a través de dos colchones de sacarosa al 45%) se prepararon solamente a partir del MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8.5 (XGar) para los estudios de inmunización en simios; las características de los diferentes stocks P3 obtenidos se especifican más adelante en el Ejemplo 38.
Caracterización del MVA-89.6P-SIVgpn
Para confirmar la homogeneidad genética del virus MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8.5 (X-Gal) generado y la integridad de los genes insertados, se amplificaron los stocks P2 (MVA-89.6P-SIVgpn-1.6.8.5) y P3 mediante infección de células CEF a una multiplicidad de infección de 5 ufp/célula, recuperando los extractos celulares a las 24 horas postinfección. Se purificó el AON del virus y se sometió a análisis mediante PCR empleando para ello oligonucléotidos cebadores que hibridan con las regiones TK f1anqueantes del inserto de interés izquierda (oligonucleótido TK-L) o derecha (oligonucleótido TK-R2), con las siguientes secuencias:
TK-L: 5" TGATIAGTTTGATGCGATIC 3' (SEO ID NO:1) TK-R2: 5' CTGCCGTATCMGGACA 3" (SEO ID NO:21)
Las posiciones en las que hibridan dichos oligonucleótidos con respecto al inserto presente en MVA-89.6P-SIVgpn, así como los tamaños estimados de los fragmentos generados en las PCR que utilizan como molde el AON de dicho virus y el AON correspondiente al virus MVA de tipo silvestre 0NT), carente de inserto, aparecen representados en la parte superior de la Figura 42.
La parte inferior de la Figura 42, por su parte, muestra una fotografía de un gel correspondiente al análisis de productos de PCR situados entre los brazos izquierdo (TK-L) y derecho (TK-R) dellocus TK en los virus MVA-SHIV de los stocks P2 (MVA-89.6P-SIVgpn (P2» y P3 (MVA-89.6P-SIVgpn (P3», el virus MVA tipo silvestre (MVA-WT) y el plásmido de transferencia pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18. Para su obtención, 100 ng del AON viral extraído de células CEF infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula con los virus MVA-WT (calle 3), MVA-89.6P-SIVgpn (P2) (calle 4)
o MVA-89.6P-SIVgpn (P3) (calle 5) o 10 ng del plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 fueron usados como molde para hacer un análisis por PCR de la secuencia ubicada entre ambos brazos del locus TK empleando como cebadores 100 ng de los oligonucleótidos que hibridan con las secuencias f1anqueantes del gen TK, TK-L (SEO ID NO:1) y TKR2 (SEO ID NO:21) en una mezcla de reacción que contenía 0,3 mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCI2 y 2,5 U de la enzima polimerasa Platinum Taq. El programa incluye un ciclo de desnaturalización a 94°C durante 5 min, 25 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min, hibridación a 60°C durante 1 min y extensión a 68°C durante 2 min, y finalmente un ciclo de extensión a 68°C durante 10 mino Los productos de PCR fueron analizados en un gel de agarosa al 0,7%, obteniéndose el resultado que se muestra en la parte inferior de la Fig. 3. En las calles 4 y 5, las
5 correspondientes a los dos stocks de vector MVA-SHIV, se observa una banda situada ligeramente por encima de la banda de 6 Kb del marcador (calle 1), compatible con la presencia del inserto completo, banda que también aparece en la calle correspondiente al control positivo, el plásmido pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18, mientras que en la calle correspondiente al virus de tipo silvestre MVA-WT (3) aparece una banda mucho menor, que corresponderían al locus de TK sin inserto.
10 Adicionalmente, se procedió a secuenciar el AON del virus MVA-89.6P-SIVgpn del stock P2, utilizando como cebadores los oligonucleótidos TK-L (SEO ID NO:1), TK-R2 (SEO ID NO:21) y E/L (SEO ID NO:25) obteniéndose la secuencia representada por SEO ID NO:24.
15 Los elementos que forman parte del inserto presente en el genoma del virus MVA-89.6-SIVgpn se especifican a continuación en la Tabla 9.
Tabla 9.-Posición de los componentes principales del inserto del vector MVA-89.6P-SIVgpn
Parte 1 de la secuencia flanqueante izquierda de TK
1-499 Complementaria
89.6P-gp120
ATG-TM (519 -2033) Complementaria
Promotor E/L para 89.6P-gp120
2081 -2119 Complementaria
Promotor E/L para SIVgpn
2144 -2183
SIVgpn
ATG-T AG (2227 -6444 )
Secuencia flanqueante derecha de TK
6488 -7179 Complementaria
20 Ejemplo 34.-Análisis de la expresión de proteínas del SHIVa partir del MVA-89.6P-SIVgpn
34.1.-Transferencias tipo Western
La expresión de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn por los stocks P2 y P3 del virus MVA-89.6P-SIVgpn fue
25 analizada mediante transferencia tipo Western. Monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula del stock P2 o del stock P3. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas postinfección, fraccionados mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida con SOS (SOS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a la reacción frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120 (generado en el laboratorio de los inventores) que reconoce la proteína gp120 del SHIV89.6P; y frente a
30 un anticuerpo monoclonal anti-SIV-gag-p27 (cedido por el programa EVA, ARP392) que reconoce la parte correspondiente a la proteína p27 del antígeno Gag del SIV y, por ello, la proteína de fusión SIVgpn. Como controles positivos se utilizaron extractos procedentes de células transfectadas de forma transitoria con el vector plasmídico de transferencia pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18.
35 Como se muestra en la Figura 43, tanto la proteína 89.6-gp120 (fotografía superior, marcada como "anti-gp120") como la proteína de fusión SIVgpn (fotografía inferior, marcada como "anti-SIVp27") se detectaron en los extractos de células infectadas con virus de los stocks P1, P2 Y P3 del MVA-89.6P-SIVgpn, así como en el extracto de células transfectadas de forma transitoria con el plásmido utilizado como control positivo (calles marcadas como "C+"), indicando la correcta expresión de ambos antígenos por los virus recombinantes derivados de MVA generados.
34.2. Inmunotinción de placas
La expresión de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn por parte del recombinante MVA-89.6P-SIVgpn se analizó también en células CEF infectadas con una dilución 10-5 del stock P3, mediante la inmunotinción de las mismas
45 utilizando bien un anticuerpo policlonal dirigido contra las proteínas propias del vector MVA tipo silvestre (anti-WR), bien un anticuerpo policlonal anti-gp120 del clade B (anti-gp120) o bien el anticuerpo monoclonal anti-SIVgag-p27 proporcionado por el programa EVA (ARP392).
Los resultados, mostrados en la Figura 44, muestran que más del 97% de las placas virales que resultaban teñidas 50 con el anticuerpo anti-WR eran también positivas para los anticuerpos anti-gp120 (fotografías y barras marcadas como "antigp120") y anti-SIVgag-p27 (fotografías y barras marcadas como "anti-SIVp27").
-
Ejemplo 35.-Construcción y caracterización del virus recombinante NYVAC-89.6P-SIVgagpolnef
55 Se infectaron con la cepa de tipo silvestre de NYVAC (donada por el grupo Aventis, en el marco de colaboración del proyecto financiado por el V Programa Marco de la Unión Europea (European Vaccíne Effort Agaínst HIV, conocido por su acrónimo EuroVac 1), a una multiplicidad de infección de 0,025 ufp/célula, células BSC40 (una línea celular derivada de riñón de mono, que carece de potencial miogénico), que luego se transfectaron con 10 !Jg de AON del vector plasmídico de transferencia pLZAW1-89.6P-SIVgpn-18 (cuyas características se describieron en el Ejemplo 33), utilizando como reactivo lipofectamina (Invitrogen, Cat. 18324-012, lote 1198865) siguiendo las instrucciones del fabricante. 72 horas después de la infección se recogieron las células, se sonicaron y se utilizaron para realizar un cribado en busca de virus recombinantes. Los virus NYVAC recombinantes que contenían los genes 89.6Pgp120/SIVgpn y que coexpresaban de forma transitoria el gen marcador ~-Gal (NYVAC-89.6P-SIVgpn (X-Gar+», fueron seleccionados realizando pases consecutivos de purificación de placas en células BSC40 teñidas con 5bromo-4-cloro-3-indolil-~-galactósido (XGal) (300 !Jg/ml). Los virus NYVAC recombinantes que contenían los genes 89.6P-gp120/SIVgpn y que habían perdido el gen indicador ~-Gal (NYVAC-89.6P-SIVgpn (X-Gar», fueron seleccionados como focos virales no teñidos en células BSC40 en presencia de XGal. En cada paso de purificación las placas aisladas fueron expandidas en células BSC40 durante 2 días, y el extracto viral crudo obtenido fue usado para el siguiente paso de purificación de placas.
En el primer paso de la selección por cribado se aislaron 3 placas X-Gal+ a las que se denominó NYVAC-89.6PSIVgpn-(1 a 3). Las tres placas, que expresaban eficientemente los antígenos 89.6P-gp120 y SIVgpn, se amplificaron y utilizaron para el siguiente paso de purificación de placas. En el segundo pase, se aislaron 18 placas X-Gal+; 8/18 expresaban ambas proteínas. Se amplificó la placa denominada NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1, que se utilizó para el siguiente paso de purificación. En el tercer pase, se aislaron 12 placas X-Gal+, todas las cuales expresaban de forma eficiente la proteína 89.6P-gp120 y 11/12 expresaban la proteína SIVgpn. Las placas denominadas NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1.1 y NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1.2 se amplificaron y utilizaron en el siguiente paso de purificación. En el cuarto pase se aislaron 12 placas X-Gar y 12 placas X-Gal+; todas ellas expresaban de forma eficiente la proteína 89.6P-gp120 y 22 de 24 expresaban la proteína SIVgpn. Los recombinantes denominados NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1.1.1 (X-Gar) y NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1.2.3 (X-Galj se amplificaron y utilizaron en el siguiente paso de purificación. En el quinto pase se aislaron 12 placas X-Gar; todas ellas expresaban de forma eficiente ambos antígenos. El recombinante denominado NYVAC-89.6P-SIVgpn-2.1.1.1.4 (X-Galj se amplificó en células CEF (una placa de p150 para generar el stock P1) y se utilizó para preparar los stocks P2 (por infección de cinco placas p150 a 0,01 ufp/célula). Los stocks P3 (crecidos en 40-100 placas p150 de células CEF infectadas a una multiplicidad de infección de 0,05, recogidos transcurridos 3-4 días después de la infección y purificados a través de dos colchones de sacarosa al 45%) se prepararon para los estudios de inmunización en simios; las características de cada uno de los stocks P3 generados se mencionan en el Ejemplo 37.
Caracterización del NYVAC-89.6P-SIVgpn
Para confirmar la homogeneidad genética y pureza del virus NYVAC-89.6P-SIVgpn generado y la integridad de los genes insertados, se amplificó el stock P3 mediante infección de células CEF a una multiplicidad de infección de 5 ufp/célula, recuperando los extractos celulares a las 24 horas post-infección. Se purificó el AON del virus y se sometió a análisis mediante PCR empleando para ello oligonucléotidos cebadores que hibridan con las regiones TK f1anqueantes del inserto de interés izquierda (TK-L) (SEO ID NO:1) y derecha (TK-R2) (SEO ID NO:21), de forma análoga a la descrita en el Ejemplo 33.
Las posiciones en las que hibridan dichos oligonucleótidos con respecto al inserto presente en NYVAC-SHIV, así como los tamaños estimados de los fragmentos generados en las PCR que utilizan como molde el AON de dicho virus y el AON correspondiente al virus NYVAC de tipo silvestre (WT) carente de inserto, aparecen representados en la parte superior de la Figura 45. La parte inferior de dicha Figura 45 muestra la fotografía de los geles obtenidos al someter a electroforesis los productos de las PCR realizadas Con la pareja de cebadores TK-LfTK-R2 para efectuar el análisis del inserto incluido en el virus NYVAC-SHIV presente en el stock P3 (NYVAC-89.6P-SIVgpn (P3» (calle3), que se comparó con los productos de PCR generados a partir del control positivo MVA-SHIV (MVA-89.6P-SIVgpn (P3» (calle 4) y con los vectores tipo silvestre, sin insertos, como controles positivos, es decir, NYVAC-WT (calle 2) y MVA-WT (calle 5). Para ello, 100 ng de AON viral extraído de células de embrión de pollo (CEF) infectadas a una multiplicidad de 5 ufp/célula con los virus NYVAC-WT, NYVAC-89.6P-SIVgpn (P3) (MVA-SHIV), MVA-89.6P-SIVgpn (P3) (MVA-SHIV) y MVA-WT fueron usados como molde para hacer una amplificación mediante PCR del fragmento de secuencia comprendido entre los brazos TK-L y TK-R en cada uno de ellos. Como se observa en las fotografía mostradas en la parte inferior de la Figura 45, la muestra correspondiente al control positivo, el virus recombinante MVA-89.6P-SIVgpn (P3) (calle 4), da lugar a una banda de igual tamaño que las correspondientes a las muestras del virus recombinante cuya descripción se describe en este ejemplo NYVAC-SHIV (NYVAC-89.6P-SIVgpn (P3), calle 3), mientras que en la calle 2, correspondientes al virus NYVAC que carece de inserto (NYVAC-WT), se observa una banda de aproximadamente 400 pb compatible con la ausencia de inserto en el locus de TK propio de NYVAC, más corto que el del MVA-WT que, por su parte, da lugar a la banda de casi 900 pb que habría de esperarse según las características del/ocus de TK en este último virus.
Ejemplo 36.-Análisis de la expresión de proteínas del SHIVa partir del NYVAC-89.6P-SIVgpn
36.1.-Transferencias tipo Western
La expresión de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn por el virus recombinante NYVAC-89.6P-SIVgpn fue analizada mediante transferencia tipo Westem. Monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de los stocks P1, P2 o P3. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida con SOS (SOS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a la reacción frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120 (generado en el laboratorio de los inventores inmunizando conejos con la proteína gp120 del aislado IIIB), que es capaz de reconocer la proteína gp120 del SHIV89.6P; y frente a un anticuerpo monoclonal anti-SIV-gag-p27 (cedido por el programa EVA, ARP392) que reconoce la proteína gag del SIV y, por ello, la proteína de fusión SIVgpn. Como controles positivos se utilizaron extractos procedentes de células infectadas con el virus MVA-SHIV (MV A.89.6P-SIVgpn(P3)).
Como se muestra en la Figura 46, tanto la proteína 89.6-gp120 (fotografía de superior, marcada como "anti-gp120") como la proteína de fusión SIVgpn (fotografía inferior, marcada como "anti-SIVp27") se detectaron en los extractos de células infectadas con virus de los stocks P1, P2 Y P3 del NYVAC-89.6P-SIVgpn (NYVAC-SHIV), así como en el extracto de células infectadas con el control positivo MVA-SHIV, indicando la correcta expresión de ambos antígenos por los virus recombinantes derivados de NYVAC generados.
36.2. Inmunotinción de placas
La expresión de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn por parte del recombinante NYVAC-89.6P-SIVgpn se analizó también en células OF-1 infectadas con una dilución 10-del stock P3 del NYVAC-SHIV (NYVAC-89.6P-SIVgpn (P3)), mediante la inmunotinción de las mismas utilizando bien un anticuerpo policlonal dirigido contra las proteínas propias del vector MVA tipo silvestre (anti-WR), bien un anticuerpo policlonal anti-gp120 del clade B (anti-gp120) o bien el anticuerpo monoclonal anti-SIVgag-p27 proporcionado por el programa EVA (ARP392). Los resultados, mostrados en la Figura 47, muestran que más del 98% de las placas virales que resultaban teñidas con el anticuerpo anti-WR eran también positivas para los anticuerpos anti-gp120 (fotografías y barras marcadas como "antigp120") y anti-SIVgag-p27 (fotografías y barras marcadas como "anti-SIVp27").
-
Ejemplo 37.-Control de los stocks virales enviados para los estudios de inmunización de macacos
De los stocks de virus recombinantes MVA-SHIV y NYVAC-SHIV obtenidos, se seleccionaron para ser utilizados en estudios de inmunización de macacos los que se muestran a continuación en la Tabla 10:
Tabla 10.-Stocks de virus recombinantes seleccionados para estudios de inmunización en macacos
MVA-89.6P-SIVgpn
Stock
Título (UFP/ml) UFP totales enviadas Fecha de envío
P3 (20/06/03)
1,6 x 10~ 7,5 x 10~ 10/03/04
P3 (20/09/04)
8,75x10° 5 x 10~ 6/10/04
P3.1 (20/09/04)
1,1 x 10~ 2,2 x 10~ 6/10/04
P3.2 (01/10/04)
2 x 10~ 0,5 x 10~ 13/10/04
NYV AC-89.6P-SIVgpn
Stock
Título (UFP/ml) UFP totales enviadas Fecha de envío
P3.1 (29/01/04)
1,2 x 10" 7,2 x 10" 10/03/04
P3.2 (25/02/04)
5 x 10° 1,2 x 10" 6/10/04
La expresión de las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn por los diferentes stocks de virus recombinantes MVA-89.6PSIVgpn y NYVAC-89.6P-SIVgpn fue analizada mediante transferencia tipo Western. Monocapas de células CEF crecidas en placas de 12 pocillos fueron infectadas con 5 ufp/célula de uno de los stocks mencionados en la Tabla
10. Los extractos celulares fueron recogidos a las 24 horas post-infección, fraccionados mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida con SOS (SOS-PAGE), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y sometidos a la reacción frente a un anticuerpo policlonal de conejo anti-gp120 (generado en el laboratorio de los inventores inmunizando conejos con la proteína gp120 del aislado IIIB), que es capaz de reconocer la proteína gp120 del SHIV89.6P; y frente a un anticuerpo monoclonal anti-SIV-gag-p27 (cedido por el programa EVA, ARP392) que reconoce la proteína gag del SIV y, por ello, la proteína de fusión SIVgpn. Como control negativo se utilizó un extracto de células en las que se había simulado la infección, es decir, que habían sido sometidas a los mismos pasos que las células infectadas, pero que no habían recibido virus en la solución con las que deberían haber sido infectadas (extracto M). La Figura 48 muestra los resultados de las inmunotinciones con cada uno de los anticuerpos, correspondiendo la parte izquierda a la tinción con el anticuerpo anti-gp120 y la derecha a la tinción con el anticuerpo anti-SIV-gag-p27.
Comprobada la expresión eficiente de ambas proteínas en los extractos procedentes de cada uno de los stocks, se enviaron alícuotas de los mismos a los Ors. Jonathan Heeney y Petra Mooij, del Biomedical Primate Research
Centre de Rijswijk, Holanda, donde se llevaron a cabo los ensayos con macacos que se describen en los siguientes Ejemplos.
Estudio preclínico de la eficacia como vacuna
Protocolo de inmunización y desafío posterior
Los ensayos que se describen a continuación en los Ejemplos 38 y 39 se llevaron a cabo para evaluar la inmunogenicidad y la eficacia de los vectores cuya construcción se describe en los Ejemplos 33 y 35 para proteger a simios inmunizados con ellos frente al desarrollo de la enfermedad del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida, con el fin de valorar a partir de los resultados obtenidos el grado de eficacia esperable de los vectores descritos en la patente principal al inmunizar con ellos seres humanos. Dichos ensayos se llevaron a cabo en el Biomedical Primate Research Centre de Rijswisjk (Países Bajos). Para su realización, se utilizaron macacos Rhesus (Macaca mulatta) adultos jóvenes, que habían demostrado ser negativos a la infección por SIV, retrovirus de simio y virus de leucemia de simio. Las condiciones de estabulación y manejo de los animales siguieron las normas éticas establecidas por el mencionado centro de experimentación.
El estudio no sólo pretendió establecer correlaciones con la inmunogenicidad y eficacia que serían esperables al utilizar los vectores de la patente principal como vacunas en seres humanos, sino que también intentó obtener datos para compararlos con los resultados obtenidos al utilizar un vector, también derivado de poxvirus, que contiene el mismo inserto de secuencias codificantes de antígenos del SHIV89.6P que el vector derivado de MVA cuya construcción y caracterización se ha descrito en los Ejemplos 33 y 34, MVA-89.6P-SIVgpn, al que también se hará referencia en los Ejemplos siguientes mediante la denominación general abreviada MVA-SHIV. El vector alternativo utilizado cuya construcción está también descrita en la presente memoria es el vector derivado de NYVAC, denominado NYVAC-89.6P-SIVgpn, al que también se hará referencia en los Ejemplos siguientes mediante la denominación general abreviada NYVAC-SHIV. Tanto el MVA-SHIV como el NYVAC-SHIV, que contienen el mismo inserto, fueron administrados en dosis de refuerzo o potenciación de la respuesta inmune (a las que se alude con frecuencia mediante el término inglés boost) con posterioridad a la administración de dosis de iniciación o desencadenamiento de la respuesta inmune (priming) en las que los animales recibieron ADN desnudo que contenía un inserto idéntico al presente en el ADN de los vectores MVA-SHIV y NYVAC-SHIV, el vector DNA-SHIV, que consta de dos plásmidos de expresión, pcDNA-gp120.89.6p, que expresa la proteína gp120 del SHIV89.6P, y pcDNA-SIVgag-pol-nef, que expresa la proteína SIVgpn generada a partir de secuencias correspondientes al virus SHIV89.6P, plásmidos que fueron generados por el Dr. Ralf Wagner, Regensburg, Alemania, y cedidos por el mismo para la realización del estudio. Los detalles sobre el estudio y los resultados obtenidos se describen con mayor detalle a continuación en los Ejemplos 38 y 39.
Ejemplo 38,-Inmunización de los macacos y valoración de la inmunidad generada
Los 21 macacos utilizados en el estudio fueron divididos en tres grupos (grupos 1, 2, Y 3), cada uno compuesto de 7 individuos. Cada uno de los grupos fue sometido a un protocolo de inmunización diferente, según se muestra a continuación en la Tabla 11:
d .
-
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Tabla 11 Grupos e InmumzaclOn y tra ' t 'b'dI o
Grupo
N° de macacos INMUNIZACIONES Desafío: Semana 32
Semana O
Semana 4 Semana 20 Semana 24
1
7 DNA-SHIV DNA-SHIV MVA-SHIV MVA-SHIV SHIV89.6P
2
7 DNA-SHIV DNA-SHIV NYVAC-SHIV NYVAC-SHIV SHIV89.6P
3
7 DNA-emp DNA-emp NYVAC-WT NYVAC-WT SHIV89.6P
El grupo 3, de control, recibió en las dos primeras dosis ADN desnudo que carecía del inserto con las secuencias propias del SHIV89.6P (DNA-emp), mientras que en las dos últimas recibió el vector NYVAC-WT, que carece igualmente del inserto. Para la realización del estudio, el vector NYVAC-WT fue crecido en células CEF y purificado en dos colchones de sacarosa de forma análoga a la utilizada con los recombinantes MVA-SHIVy NYVAC-SHIV; del stock generado se enviaron al centro de primates de Holanda, el día 20 de abril de 2004, un total de 8x109 ufp, con un título de 1 x1 09ufp/ml.
Las inmunizaciones con ADN desnudo se produjeron con un total de 4 mg de plásmido, utilizando en el caso del vector DNA-SHIV 2 mg de cada uno de los plásmidos que lo componen, pcDNA-gp12089.6p y pcDNA-SIV-gag-polnef, y empleando 4 mg del vector DNA-emp para los controles. En cada una de las dos inoculaciones de ADN desnudo que recibió cada macaco se suministraron 2 mg de plásmido, disueltos en 1,5 mi de PBS, que se suministraron por vía intramuscular en la parte superior de cada pata.
Las inmunizaciones con los vectores NYVAC-SHIV, MVA-SHIV y NYVAC-WT se llevaron a cabo inoculando en la parte superior del brazo derecho, por vía intramuscular, 0,5 mi que contenían 5x108 ufp, de manera que en cada dosis se inocularon 5x108 ufp/macaco. Para ello se utilizaron los siguientes stocks:
-en el caso del MVA-SHIV, P3 (20/06/03), con un título de 1,6 x 1 09 uf~/ml,; -en el caso del NYVAC-SHIV, P3.1 (29/01/04), con un título de 1,2x10 ufp/ml,; -en el caso del NYVAC-WT, el stock con un título de 1x109 ufp/ml mencionado anteriormente.
En todos los casos, transcurridas 32 semanas después de recibir la primera dosis de inmunización, los macacos fueron sometidos a lo que se conoce como un "desafío" o "reto" viral (traducción del término inglés "chal/enge') , es decir, se inoculó a los animales por vía intravenosa una dosis de 50-100 MID50 de SHIV89.6P, dilución 1:1000 del stock de Letvin (entendiendo como MID50 o "Monkey /nfecfious Dose" la cantidad de virus que es capaz de producir infección en el 50% de los animales) y se observó la evolución de cada animal.
2 semanas antes de comenzar con el protocolo de inmunización, en distintos momentos a lo largo del mismo y con posterioridad al desafío se extrajeron muestras de sangre periférica, mediante punción intravenosa, de cada uno de los animales. De la sangre heparinizada se obtuvieron las células PBMC ("penphera/ b/ood mononuc/ear cel/s", células mononucleares de sangre periférica), que se utilizaron para los ensayos de respuesta celular: En la Figura 49 se muestra un esquema del transcurso del estudio, en el que están marcados los momentos de las tomas de muestras (CMI, abreviatura de "cel/ mediafed immunity" o inmunidad mediada por células), los momentos en los que se administraron las distintas dosis de inmunización (ADN y vectores derivados de poxvirus: NYVAC ó MVA) yel momento en el que se procedió al desafío con el virus SHIV89.6P.
Con el fin de valorar la inmunidad generada, se realizaron ensayos para detectar por la técnica de ELlSPOT la respuesta de IFN-y, IL-2 e IL-4 en los animales de cada uno de los grupos y su evolución en el tiempo, según se describe a continuación.
La respuesta de citoquinas se evaluó en las fracciones de células PBMC extraídas de cada uno de los macacos. Para ello, muestras de dichas células de cada uno de los macacos se incubaron durante 48 horas con grupos de péptidos. Para el ELlSPOT de gp120 se utilizó un grupo de 48 péptidos, concretamente los péptidos 4702 a 4749 del N° Cat. 4827 del NIH AIDS Research and Reference Reagents Program, cada uno de los cuales consta de 20 aminoácidos de los que 10 aminoácidos son solapantes con el siguiente péptido, con los cuales queda representada la secuencia de la proteína 89.6P-gp120. Para el ELlSPOT de SIVgpn, los péptidos fueron sintetizados por SynPep Dublín (California, Estados Unidos) y son grupos de 15 aminoácidos con 11 aminoácidos solapantes, que se pueden agrupar en los grupos (poo/s): Gag-pool 11 , 1-54; Gag-pool 12, 55-108; Poi-pool 11 , 109-168; Poi pool 12, 169-173 + 236-290; Poi pool 13,291-349; Nef pool 11, 174-235; la respuesta de los 7 grupos de péptidos fue analizada utilizando 2 microgramos/ml de cada péptido en el ensayo. Tras la incubación, en cada una de las muestras se midieron las SPF (Spof forming cel/s), que son las células PBMC que expresan una determinada citoquina, después de su estimulación con péptidos especificos incluidos en las proteínas 89.6P-gp120 y SIVgpn. Esto es una medida de las células que fueron estimuladas específicamente por la inoculación de los vectores que expresaban dichas proteínas. Se realizaron medidas por ELlSPOT para detectar las SPF que expresaban IFN-y, IL-2 ó IL-4 (29). En el caso de las SPF que expresaban IFN-y, los resultados obtenidos con cada uno de los animales, expresados como
SPF totales (las estimuladas por 89.6P-gp120 y la estimuladas por SIVgpn) detectadas por cada PBMC analizadas, se representan en la Figura 50, en la que se ha utilizado una escala logarítmica en el eje de ordenadas. Los números que aparecen en el eje de abscisas indican el momento en el tiempo en el que fueron tomadas cada una de las muestras. Para cada valor de tiempo, aparecen tres grupos de valores, que presentan el comportamiento de cada uno de los 7 animales utilizados en el estudio con un procedimiento de inmunización concreto: la primera vertical de puntos corresponde a muestras tomadas de macacos del grupo 1 (DNA-SHIV/MVA-SHIV); la segunda vertical de puntos corresponde a muestras tomadas de macacos del grupo 2 (DNA-SHIV/NYVAC-SHIV); la tercera vertical de puntos corresponde a muestras tomadas de ratones del grupo 3 (DNA-emp/NYVAC-WT). Cada punto representa el valor obtenido para un macaco concreto, mientras los rectángulos situados en cada una de las verticales indican el valor medio correspondiente a todos los macacos de ese grupo para las muestras tomadas en un mismo momento en el tiempo. La presencia de un número de puntos inferior a 7 en algunas verticales indica que el punto situado sobre el eje de abscisas representa a más de un macaco, en cada uno de los cuales el valor de las SFC detectadas por cada 106 PBMC analizadas no fue superior a 1. La línea punteada indica el valor por debajo del cual los valores se consideran insignificantes (20 SFC). Las flechas blancas indican la inoculación de un vector de vacunación; la flecha negra indica el momento en el que se produjo el desafío con el SHIV89.6P. Se aprecia como antes del desafío, los puntos correspondientes a los dos primeros grupos, y en especial el valor medio de los mismos, son superiores a los obtenidos en el grupo control, inmunizado con DNAlNYVAC sin insertos. Una vez producida la infección con el patógeno SHIV89.6P, los valores quedan bastante igualados en todos lo grupos al producirse inmunidad frente al SHIV.
Para simplificar la interpretación de los datos, en la Figura 51 se representan los valores medios del número total de células que expresan IFN-y obtenidos para cada uno de los grupos, de nuevo en escala logarítmica, en función del tiempo en el que se tomaron las muestras, partiendo en este caso del momento en el que los macacos recibieron la primera dosis de ADN desnudo. Las Figuras 52 y 53, por su parte, representan los valores medios obtenidos para cada uno de los grupos, igualmente en escala logarítmica, en función del tiempo, de SFC que expresaban IL-4 (Figura 53) o IL-2 (Figura 52).
Se puede observar que, tanto en el grupo 1 (el que recibió el vector MVA-SHIV, el MVA-89.6P-SIVgpn, en las dosis de potenciación de la respuesta) (datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba, .) como en el grupo 2 (el que recibió el vector NYVAC-SHIV, el NYVAC-89.6P-SIVgpn, en las dosis de potenciación de la respuesta) (datos mediante cuadrados cuyos vértices conforman dos líneas paralelas, _ ), la magnitud de la respuesta inmune es semejante y claramente superior a la que se detecta en el grupo 3, el de los macacos que recibieron vectores que no expresaban antígenos del SHIV (cuyos datos se indican mediante triángulos, A). En este último grupo, se aprecia como la respuesta inmune aumenta claramente después del desafío con el virus SHIV89.6P, debido a la replicación del virus, lo que hace que, a partir de ese momento, los valores sean semejantes en los tres grupos.
Estos datos indican que la media total de la respuesta inmune (producción de IFN-y) resulta claramente potenciada al series administrados a los macacos los vectores MVA-89.6P-SIVgpn y NYVAC-89.6P-SIVgpn. La respuesta inmune inducida por estos dos vectores es semejante. Ambos inducen una buena respuesta celular frente a los antígenos 89.6P-gp120 y SIVgpn.
Ejemplo 39.-Eficacia de la respuesta inmune generada para proteger frente al desarrollo del virus SHIV
Para valorar la eficacia de protección frente al desarrollo de una infección generada por el virus SHIV89.6 en relación a la respuesta inmune evaluada en los ensayos descritos en el Ejemplo 38, se procedió a extraer datos sobre dos magnitudes significativas: el número de partículas virales detectables en el plasma de las muestras sanguíneas que habían sido extraídas de los macacos una vez que se les habían inoculado el virus patógeno SHIV89.6P, así como el porcentaje que las células CD4+ y CD8+ suponían respecto al total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
39.1.-ARN viral detectable en plasma
Los valores referentes al número de partículas virales detectables en plasma constituyen un buen valor indicativo de la capacidad de la respuesta inmune generada para controlar la posible infección producida por el virus SHIV89.6P inoculado. Valores por encima de 100.000 copias/mi se consideran que conducen al desarrollo en los macacos de SIDA y a la muerte del animal, mientras que valores próximos a 10.000 copias/mi o inferiores mantienen al animal sin aparentes efectos patógenos. La detección de una concentración de copias virales inferior a ese valor puede considerarse indicativo de que la respuesta inmune generada es capaz de conferir protección en los modelos animales utilizados.
Por ello, se procedió a detectar el ARN del virus SHIV89.6P presente en el plasma de las muestras sanguíneas extraídas de los macacOs justo antes (tiempo O) y con posterioridad a la inoculación de dicho virus. Para ello se utilizó la técnica cuantitativa en tiempo real OC RNA-PCR, que mide el número de copias virales por mililitro de plasma y es capaz de detectar 50 copias por mI. Los valores obtenidos para cada uno de los macacos se muestran en la Figura 54, en la que aparecen tres gráficos. El gráfico superior corresponde al grupo 3, el de los macacos control que habían sido inmunizados con ADN y NYVAC que carecían de inserto desde el que poder expresar antígenos del SHIV. El gráfico de la parte inferior izquierda corresponde al grupo 1, inmunizado con DNASHIV/MVA-SHIV, mientras el gráfico de la parte inferior derecha corresponde al grupo 2, inmunizado con DNASH IV/NYVAC-SH IV.
En dicha Figura puede apreciarse como, de los 7 macaCOS que recibieron la inmunización control, 32 semanas después del desafío, 6 presentan valores continuados de viremia que oscilan entre 10.000-100.000 copias/mi, mientras que uno de los animales no respondió a la infección.
De los animales vacunados, todos los animales del grupo DNA-SHIV/MVA-SHIV redujeron los niveles de viremia con respecto al grupo control. 3 eliminaron completamente el virus antes de las 20 semanas, concretamente transcurridas 7, 14 ó 18 semanas. En cuanto al resto, al cabo de las 32 semanas, tres macacos redujeron la viremia por debajo de 1000 copias/mi y uno mantenía alrededor de 2000 copias/mI. En cuanto al grupo vacunado con DNASH IV/NYVAC-SH IV, 4 animales eliminaron completamente el virus antes de las 20 semanas, concretamente transcurridas 4, 14 ó 17 semanas. En cuanto al resto, al cabo de las 32 semanas, dos macacos mantenían niveles por debajo de 1000 copias/mi y uno de ellos por debajo de 10000 copias/mI.
Estos resultados demuestran claramente que los dos vectores derivados de poxvirus utilizados, MVA-SHIV (MVA89.6P-SIVgpn) y NYVAC-SHIV (MVA-89.6P-SIVgpn), inducen un alto grado de protección en macacos frente al virus patógeno SHIV89.6P al ser utilizados en protocolos de tipo prime/boosf (desencadenamiento/potenciación de la respuesta) al ser utilizados en las dosis de refuerzo o potenciación de la respuesta inmune generada.
39.2.-Porcentaje de células CD4+ y CD8+ Los valores referentes a los porcentajes de células T de sangre periférica C04+ y C08+ detectables son también datos significativos, pues las células C04+ son utilizadas tanto por el VIH como por el SIV como células diana para la infección. La reducción en el número de estas células por debajo de 200 células por mi se considera un síntoma de la enfermedad, el SIDA. La proporción de células T C04+ y C08+ es por tanto un buen indícador del estado de la infección.
Por ello, se procedió a su detección en la fracción de células PBMC de las muestras sanguíneas extraídas a los macacos 12 semanas antes de que se produjera el desafío con el SHIV89.6P, justo antes de inocularlo (tiempo O) y con posterioridad a la inoculación de dicho virus. Para llevar a cabo los ensayos, se utilizaron anticuerpos específicos para cada una de las poblaciones, determinándose por FACS la proporción de células C04+ y C08+ presentes. Los resultados se muestran en la Figura 55.
En la parte superior de dicha Figura, la correspondiente al grupo inmunizado con ONA-SH IV/MVA-SH IV, se observa que 6 de los macacos mantenían niveles normales de células C04+, similares a los de células C08+, y sólo en uno de ellos dichos niveles se redujeron por debajo de 100. En la parte intermedia de la Figura, la correspondiente al grupo inmunizado con ONA-SHIV/NYVAC-SHIV, se obtuvieron resultados similares: 6 animales mantenían niveles normales de células C04+ y sólo en uno dichos niveles se redujeron por debajo de 100. En el grupo control, en cambio, tal como se observa en la parte inferior de la Figura 55, en 5 de los macacos los niveles de células C04+ se redujeron por debajo de 100, habiendo sido necesario sacrificar uno de los otros dos macacos (07 98928, junto a cuyo nombre figura la abreviatura "euth") debido al avanzado estado de la enfermedad. Uno de los macacos control, sin embargo, se mantuvo protegido.
39.3.-Porcentaje de supervivencia de los macacos infectados (%)
Adicionalmente, se realizó un cálculo del porcentaje de supervivencia de los macacos en cada uno de los tres grupos, computando el número de macacos que permanecían vivos tras la inoculación del virus SHIV89.6P. En la Figura 56 se representan los datos obtenidos transcurridos los intervalos de tiempo desde la infección, en semanas, que se representan en el eje abscisas. En dicha Figura puede observarse como, transcurridas más de 50 semanas desde la infección con el SHIV89.6P, tanto los macacos del grupo inmunizado con ONA-SHIV/MVA-SHIV (datos indicados mediante cuadrados con un vértice apuntando hacia arriba, .) como los del grupo inmunizado con ONASHIV/NYVAC-SHIV (datos indicados mediante cuadrados cuyos vértices conforman dos líneas paralelas, .), la supervivencia de los macacos era del 100%, mientras que en el grupo control (datos indicados mediante triángulos, ..) a las 27 semanas desde la inoculación del virus SHIV89.6P comienza a observarse un descenso de los macacos vivos, siendo su porcentaje de supervivencia inferior al 40% transcurridas más de 50 semanas desde la inoculación de dicho virus.
Tomando estos datos en conjunto, puede concluirse que tanto el recombinante generado a partir de MVA, MVA89.6P-SIVgpn, como el generado a partir de NYVAC, NYVAC-89.6P-SIVgpn, que tienen la misma organización genética en sus insertos y son capaces de expresar simultáneamente los antígenos 89.6P-gp120 y SIVgpn, han demostrado en el modelo de primates no humanos, los macacos Rhesus, que son unos excelentes vectores para ser utilizados para la vacunación contra el SIDA de simio. Estos resultados refuerzan los obtenidos en los ensayos descritos en los Ejemplos de la patente principal y suponen un apoyo respecto a la posible utilidad de estos vectores en la vacunación frente al SIDA humano.
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Listado de secuencias
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
<120> VECTORES RECOMBINANTES BASADOS EN EL VIRUS COMO VACUNAS PREVENTIVAS Y TERAPÉUTICAS CONTRA EL
MODIFICADO SIDA DE ANKARA (MVA)
<130> PCT-277
<160> 25
<210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> Cebador <223> TK-L
<400> 1 tgattagttt gatgcgattc
20
<210> 2 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia <220> <221> Cebador <223> TK-R
artificial
<400> 2 tgtccttgat acggcag
17
<210> 3 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> cebador <223> BX08556
<400> 3 tgcccatcga caacg
15
<210> 4 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <221> cebador <223> GPN7649
<400> 4 agccccatcg agaccg
<210> 5
<211> 17
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> cebador
<223> GPN8170
<400> 5 attagcctgc ctctcgg
<210> 6
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> cebador
<223> E/L
<400> 6 tatttttttt ttttggaata taaatag
<210> 7
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador
<223> gp120-10
<400> 7 tcgagcatgg acagggcc
<210> 8
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador
<223> gp120-1050
<400> 8 gtcttgttct ggaagtgc
<210> 9
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador
<223> gp120-1213
<400> 9 atcatcacca tcccctgc
<210> 10
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador
<223> GPN-802
<400> 10 tgggtttaaa caagatcg
<210> 11
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador
<223> GPN-2018
<400> 11 caaggtgaag cagtggcc
<210> 12
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador
<223> GPN-2198
<400> 12 tgggtcctct tgttcagc
<210> 13
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador
<223> GPN-3820
<400> 13 cggccttgcc gatcttgg
<210> 14
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador
<223> GPN-4000
<400> 14
ccgacaagag cgagagcg
<210> 15 <211> 1482 <212> ADN <213> Secuencia
artificial derivada del aislado BX08 del VIH-1
<220> <221> <223>
Secuencia codificante gp120-bX08
<400> 15 atg gae ege gee Met Asp Arg Ala
aag etg etg etg etg etg etg etg etg etg etg Lys Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 5 10 15 cee eag gee eag gee Pro Gln Ala Gln Ala 20 60
get age gae ege Ala Ser Asp Arg
etg tgg gtg aea gtg tae tae gge gtg Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val 25 30 cee gtg tgg aag gae gee Pro Val Trp Lys Asp Ala 35 aee Thr 40 120
aee aee etg Thr Thr Leu
tte Phe tge Cys 45 gee tee gae gee Ala Ser Asp Ala aag gee Lys Ala 50 tae gae aee gag gtg cae aae gtg tgg Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp 55 60 180
gee Ala
aee cae gee Thr His Ala tge gtg Cys Val 65 cee aee gae Pro Thr Asp cee aae Pro Asn 70 cee eag gag gtg gtg etg gge aae gtg Pro Gln Glu Val Val Leu Gly Asn Val 75 80 240
aee gag aae Thr Glu Asn
tte Phe aae Asn 85 atg gge aag Met Gly Lys aae aae atg gtg gag eag atg Asn Asn Met Val Glu Gln Met 90 95 cae His gag gae Glu Asp ate Ile ate Ile 100 300
age etg tgg gae eag tee etg aag Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys 105
cee tge gtg Pro Cys Val 110 aag etg aee Lys Leu Thr cee Pro 115 etg tge gtg aee etg Leu Cys Val Thr Leu 120 360
aae tge Asn Cys
aee Thr aag Lys etg aag Leu Lys 125 aae Asn age aee gae aee aae aae Ser Thr Asp Thr Asn Asn 130 aee ege tgg gge aee eag gag Thr Arg Trp Gly Thr Gln Glu 135 140 420
atg aag Met Lys
aae Asn tge Cys tee tte Ser Phe 145 aae Asn ate age aee Ile Ser Thr 150 tee gtg egg aae Ser Val Arg Asn aag Lys 155 atg aag aga gag tae Met Lys Arg Glu Tyr 160 480
gee Ala
etg Leu tte Phe tae tee etg gae Tyr Ser Leu Asp 165 ate gtg Ile Val cee Pro 170 ate gae aae gae aae aee age tae ege I1e Asp Asn Asp Asn Thr Ser Tyr Arg 175 etg Leu 180 540
agg Arg
tee tge Ser Cys aae Asn aee tee Thr Ser 185 ate ate aee eag gee Ile Ile Thr Gln Ala 190 tge Cys cee Pro aag gtg age tte gag Lys Val Ser Phe Glu 195 cee Pro ate Ile 200 600
cee Pro
ate cae Ile His tte tge Phe Cys 205 gee Ala cee gee Pro Ala gge Gly tte gee Phe Ala 210 ate etg aag tge Ile Leu Lys Cys 215 aae aae Asn Asn aag Lys aee Thr tte Phe 220 660
aae Asn
gge aee gge cee Gly Thr Gly Pro 225 tge Cys aee aae Thr Asn gtg age aee gtg eag tge Val Ser Thr Val Gln Cys 230 aee cae Thr His 235 gge Gly ate ege Ile Arg cee Pro 240 720
gtg gtg Val Val
tee aee eag etg etg etg aae gge age etg gee gag gag gag gtg gtg Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val 245 250 255 ate egg Ile Arg 260 780
tee gag aae Ser Glu Asn
tte Phe aee aae aae gee Thr Asn Asn Ala 265 aag Lys aee Thr 270 ate Ile ate gtg eag etg aae Ile Val Gln Leu Asn 275 gag Glu age gtg gag Ser Val Glu 280 840
52
ate aae tge aee aga cee aae aae aae aee agg aag tee ate cae ate gge cee gge ege 900 Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile His Ile Gly Pro Gly Arg 285 290 295 300
gee tte tae aee aee gge gae ate ate gge gae ate egg eag gee cae tge aae ate tee 960 Ala Phe Tyr Thr Thr Gly Asp Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser 305 310 315 320
aga aee aae tgg aee aae aee etg aag agg gtg gee gag aag etg ege gag aag tte aae1020 Arg Thr Asn Trp Thr Asn Thr Leu Lys Arg Val Ala Glu Lys Leu Arg Glu Lys Phe Asn 325 330 335 340
aae aee aee ate gtg tte aae eag age age gge gge gae cee gag ate gtg atg cae tee1080 Asn Thr Thr Ile Val Phe Asn Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Met His Ser 345 350 355 360
tte aae tge gge gge gag tte tte tae tge aae aee aee eag etg tte aae tee aee tggl140 Phe Asn Cys Gly Gly G1u Phe Phe Tyr Cys Asn Thr Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp 365 370 375 380
aae gag aee aae age gag gge aae ate aee tee gge aee ate aee etg cee tge egg ate1200 Asn Glu Thr Asn Ser Glu Gly Asn Ile Thr Ser Gly Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile 385 390 395 400
aag eag ate ate aae atg tgg eag gag gtg gge aag gee atg tae gee cee cee ate gge1260 Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Gly 405 410 415 420
gge eag ate aag tge etg tee aae ate aee gge etg etg etg aee aga gae gge gge tee1320 Gly Gln Ile Lys Cys Leu Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Ser 425 430 435 440
gae aae age age age gge aag gag ate tte ege cee gge gge gge gae atg agg gae aae1380 Asp Asn Ser Ser Ser Gly Lys Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn 445 450 455 460
tgg ege tee gag etg tae aag tae aag gtg gtg aag ate gag cee etg gge ate gee eee1440 Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Ile Ala Pro 465 470 475 480
aee
aag gee aag agg agg gtg gtg eag ege gag aag ege tga 1482
Thr
Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gln Arg Glu Lys Arg *
485
490
<210> 16
<211> 3981
<212> ADN
<213> Secuencia artificial derivada del aislado IIIB del VIH
<220>
<221> Secuencia codificante
<223> gagpolnef-IIIB
<400> 16 atg gee gee agg gee age gtg etg age gge gge gag etg gae agg tgg gag aag ate agg 60 Met Ala Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp Glu Lys Ile Arg
5 10 15 20
etg agg cee gge gge aag aag aag tat aag etg aag cae ate gtg tgg gee age agg gag 120 Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu 25 30 35 40
etg gag agg tte gee gtg aae cee gge etg etg gag aee age gag gge tge agg eag ate 180
Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile
45 50 55 60
etg gge eag etg eag cee age etg eag aee gge age gag gag etg agg age etg tae aae 240 Leu Gly Gln Leu Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn 65 70 75 80
aee gtg gee aee etg tae tge gtg cae eag agg ate gag ate aag gae aee aag gag gee 300 Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val Bis Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala 85 90 95 100
etg gae aag ate gag gag gag eag aae aag tee aag aag aag gee eag eag gee gee gee 360 Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala 105 110 115 120
gae aee gge cae age age eag gtg age eag aae tae cee ate gtg eag aae ate eag gge 420 Asp Thr Gly Bis Ser Ser Gln Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly 125 130 135 140
eag atg gtg cae eag gee ate age cee agg aee etg aae gee tgg gtg aag gtg gtg gag 480 Gln Met Val Bis Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu 145 150 155 160
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age aag agg ate gtg aag tge tte aae tge gge aag gag gge cae ate gee agg aae tge1200 Ser Lys Arg Ile Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Arg Asn Cys 385 390 395 400
agg gee cee agg aag aag gge tge tgg aag tge gge aag gag gge cae eag atg aag gae1260 Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp 405 410 415 420
tge aee gag agg eag gee aae tte etg gge aag ate tgg cee age cae aag gge gge eee1320
Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Gly Pro
425 430 435 440
gge aae tte etg eag aae agg cee gag cee aee gee cee cee gag gag age tte agg tte1380 Gly Asn Phe Leu Gln Asn Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg Phe 445 450 455 460
gag gag gag aee aee aee cee age eag aag eag gag cee ate gae aag gag etg tae eee1440 Glu Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp Lys Glu Leu Tyr Pro 465 470 475 480
etg aee age etg aag age etg tte gge aae gae cee age age eag gaa tte tte agg gag1500 Leu Thr Ser Leu Lys Ser Leu Phe Gly Asn Asp Pro Ser Ser Gln Glu Phe Phe Arg Glu 485 490 495 500
aae etg gee etg cee eag gge agg gee agg gag tte age age gag eag aee agg gee aae1560 Asn Leu Ala Leu Pro Gln Gly Arg Ala Arg Glu Phe Ser Ser Glu Gln Thr Arg Ala Asn 505 510 515 520
age cee aee agg gge gag etg eag gtg tgg gge agg gae aae aae age ate age gag gee1620 Ser Pro Thr Arg Gly Glu Leu Gln Val Trp Gly Arg Asp Asn Asn Ser Ile Ser Glu Ala 525 530 535 540
gge gee aae agg eag gge aee ate age tte aae tte cee eag ate aee etg tgg eag agg1680 Gly Ala Asn Arg Gln Gly Thr Ile Ser Phe Asn Phe Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg 545 550 555 560
cee etg gtg aee ate aag ate gge gge eag etg aag gag gee etg etg aae aee gge gee1740 Pro Leu Val Thr Ile Lys Ile Gly Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asn Thr Gly Ala 565 570 575 580
gge gae aee gtg etg gag gae etg aae etg cee gge aag tgg aag cee aag atg ate gge1800 Gly Asp Thr Val Leu Glu Asp Leu Asn Leu Pro Gly Lys Trp Lys Pro Lys Met Ile Gly 585 590 595 600
gge ate gge gge tte ate aag gtg agg eag tae gag eag ate cee ate gag ate tge gge1860 Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Glu Gln Ile Pro Ile Glu Ile Cys Gly 605 610 615 620
cae aag gee ate gge aee gtg etg gtg gge cee aee cee gtg aae ate ate gge agg aae1920 His Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn 625 630 635 640
etg etg aee eag etg gge tge aee etg aae tte cee ate age cee ate gag aee gtg eee1980 Leu Leu Thr Gln Leu Gly Cys Thr Leu Asn Phe Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr Val Pro 645 650 655 660
gtg aag etg aag cee gge atg gae gge cee aag gtg aag eag tgg cee etg aee gag gag2040 Val Lys Leu Lys Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu 665 670 675 680
aag ate aag gee etg aee gee ate tge gae gag atg gag aag gag gge aag ate aee aag2100 Lys Ile Lys Ala Leu Thr Ala Ile Cys Asp Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile Thr Lys 685 690 695 700
ate gge cee gag aae cee tae aae aee cee ate tte gee ate aag aag aag gae age aee2160 Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Ile Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr 705 710 715 720
aag tgg agg aag etg gtg gae tte agg gag etg aae aag agg aee eag gae tte tgg gag2220 Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu 725 730 735 740
gtg eag etg gge ate cee cae cee gee gge etg aag aag aag aag age gtg aee gtg etg2280 Val Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu 745 750 755 760
gae gtg gge gae gee tae tte age ate cee etg tae gag gae tte agg aag tae aee gee2340 Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Ile Pro Leu Tyr Glu Asp Phe Arg Lys Tyr Thr Ala 765 770 775 780
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cee eag gge tgg aag gge age etc gee ate tte eag age age atg aee ate gag gag etg2460 Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Leu Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Ile Glu Glu Leu 805 810 815 820
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etg aag tgg aag tte gae age eag etg gee cae agg cae agg gee agg gag etg cae eee2760 Leu Lys Trp Lys Phe Asp Ser Gln Leu Ala His Arg His Arg Ala Arg Glu Leu His Pro 905 910 915 920
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tge gee tgg etg gag gee eag gag gag gge gag gtg gge tte cee gtg agg cee eag gtg3000 Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Gly Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val 985 990 995 1000
cee etg agg cee atg aee tae aag gge gee gtg gae etg age tte tte etg aag gag aag3060 Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Gly Ala Val Asp Leu Ser Phe Phe Leu Lys Glu Lys 1005 1010 1015 1020
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1105 1110 1115 1120
gag etg gag etg gee gag aae agg gag ate etg aag gag cee gtg cae gge gtg tae tae3420 Glu Leu Glu Leu Ala Glu Asn Arg Glu Ile Leu Lys Glu Pro Val Bis Gly Val Tyr Tyr 1125 1130 1135 1140
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gee cae aee aae gae gtg aag eag etg aee gag gee gtg eag aag ate gee atg gag gge3600 Ala Bis Thr Asn Asp Val Lys Gln Leu Thr Glu Ala Val Gln Lys Ile Ala Met Glu Gly 1185 1190 1195 1200
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aag gge ate gge gge aae gag eag gtg gae aag etg gtg age age gge ate agg aag gtg4140 Lys Gly Ile Gly Gly Asn Glu Gln Val Asp Lys Leu Val Ser Ser Gly Ile Arg Lys Val 1365 1370 1375 1380
etg aag aee etg gag cee tte agg aag eag aae cee gge ate gtg ate tae eag tae atg4200 Leu Lys Thr Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln Asn Pro Gly Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met 1385 1390 1395 1400
gae gae etg tae gtg gge age gae etg gag ate gge eag cae agg aee aag taa Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln Bis Arg Thr Lys * 1405 1410 1415
<210> 19
<211> 6907
<212> ADN
<213> Secuencia artificial quimérica
<220>
<221> Inserto del MVA-B
<220>
<221> Secuencia flanqueante izquierda de TK
<222> 1 . . 502
<223> TkL
<220>
<221> Secuencia complementaria a secuencia codificante
<222> 537 .. 4517
<223> gagpolnef-IIIB
<220>
<221> Secuencia complementaria de promotor
<222> 4527 .. 4565
<223> pE/L para gagpolnef-IIIB
<220>
<221> Promotor
<222> 4580 .. 4618
<223> pE/L para gp120-BX08
<220>
<221> Secuencia codificante
<222> CDS: 4628 .. 6109
<223> gp120-BX08
<220>
<221> Secuencia flanqueante derecha de TK
<222> 6216 .. 6907
<223> TkR
<400> 19 aagcttttgc gatcaataaa tggatcacaa ccagtatctc ttaacgatgt tcttcgcaga 60 tgatgattca ttttttaagt atttggctag tcaagatgat gaatcttcat tatctgatat 120 attgcaaatc actcaatatc tagactttct gttattatta ttattgatcc aatcaaaaaa 180 taaattagaa gccgtgggtc attgttatga atctctttca gaggaataca gacaattgac 240 aaaattcaca gactctcaag attttaaaaa actgtttaac aaggtcccta ttgttacaga 300 tggaagggtc aaacttaata aaggatattt gttcgacttt gtgattagtt tgatgcgatt 360 caaaaaagaa tcctctctag ctaccaccgc aatagatcct attagataca tagatcctcg 420 tcgcgatatc gcattttcta acgtgatgga tatattaaag tcgaataaag tgaacaataa 480 ttaattcttt attgtcatca tgggtaccaa ggcgcggatc cccgggtacc gagctcttac 540 cacaggaatg ggggctcctt ctggtgcttc ttgtcggggg tggtcaggcc ccacctcagc 600 aggtgctgcc tcagctcctc gatcttggtc ctgtgctggc cgatctccag gtcgctgccc 660 acgtacaggt cgtccatgta ctgatagatc acgatgtcgg ggttctgctt cttgaagggc 720 tccaggatct ttgtcatgct gctctggaag atggcggggc tgcccttcca gccctggggc 780 agcacgttgt actggtagcg gatgccgggg gtctcgttgt tgatgctggg gatggtgaag 840 gcgctggcca 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cgccgtgcac gggctccttc aggatctccc tgttctcggc cagctccagc 1740 tcggcctcct cggtcagggg gatcacctcg gtcagagcct ttgtgcccct cagcagcttg 1800 cacagctgcc tcaccttgat gccggggtag atctggctgg cccagttcag cttgcccacc 1860 agcttctgaa tgtcgttcac ggtccagctg tccttctcgg gcagcacgat gggctgcacg 1920 gtccacttgt cggggtgcag ctcgtagccc atccacagga atggtacttg aggtgtgact 1980 ggaaaaccca cctcctcctc ctcttgtgct tctagccagg cacaatcagc attgttagct 2040 gctgtgttgc tacttgtgat tgctccatgt ttttctaggt ctcgagatgc tgctcccacc 2100 ccatctgctg ctggctcagc tcgtctcatt ctttccctta cagcaggcca tccaaccaca 2160 ctactttttg accacttgcc acccatcctt ggatcaggga agtagccttg tgtgtggtag 2220 atccacagat caaggatatc ttgtcttcgt tgggagtgaa ttagcccttc cagtcccccc 2280 ttttctttta aaaagtggct aagatctaca gctgccttgt aagtcattgg tcttaaaggg 2340 gtatacttcc tgaagtcctc gtccaggggc acgctgaagt aggcgtcgcc cacgtccagc 2400 acggtcacgc tcttcttctt cttcaggccg gcggggtggg ggatgcccag ctgcacctcc 2460 cagaagtcct gggtcctctt gttcagctcc ctgaagtcca ccagcttcct ccacttggtg 2520 ctgtccttct tcttgatggc gaacacgggg gtgttgtagg ggttctcggg gccgatcttg 2580 ctgatcttgc cctccttctc catctcggtg cagatctcca ccagggcctt gatcttctcc 2640 tcggtcaggg gccactgctt caccttaggg ccgtccatgc cgggcttcag cttcacgggc 2700 acggtctcga tggggctgat ggggaagttc agggtgcagc cgatctgggt cagcaggttc 2760 ctgccgatga tgttcacagg tgtaggtccc accagcacgg tgccgatggc cttgtggccg 2820 cagatctcga tcaggatctg gtcgtactgc ctcaccttga tgaagccgcc gatgccgccg 2880 atcatcttgg gcttccacct gccgggcagg ctcatctcct ccagcacggt gtcgtcggcg 2940 ccggtggcca gcagggcctc cttcagctgg ccaccgatct ttattgtgac gaggggtcgt 3000 tgccaaagag tgatctgagg gaagttaaag gatacagttc cttgtctatc ggctcctgct 3060 tctgaggggg agttgttgtc tctaccccag acctgaagct ctcttctggt ggggctgttg 3120 gctctggtct gctctgaaga aatggtgggg ctgttggctc tggtctgctc tgaagaaaat 3180 tccctggcct tcccttgtag gaaggccaga tcttccctaa aattagcctg cctctcggtg 3240 cagtccttca tctggtggcc ctccttgccg cacttccagc agcccttctt cctgggggcg 3300 cggcagttcc tggcggtgtg gccctccttg ccgcagttga agcacttcac catcttcctc 3360 tggttcctga agttgcccct ctgcatcatg atggtggcgg tgttggtcac ctggctcatg 3420 gcctcggcca gcaccctggc cttgtggccg gggccgccca cgccctggca ggcggtcatc 3480 atctcctcca gggtggcggc gggtcccagg gccttcagga tggtcttgca gtcggggttg 3540 gcgttctgca ccagcagggt ctcggtcatc cagttcttca cctcctggct ggcctgctcg 3600 gcgcgcaggg tcttgtagaa cctgtccacg tagtccctga agggctcttt ggggccctgc 3660 ctgatatcca ggatgctggt ggggctgtac atcctcacga tcttgttcag gcccaggatg 3720 atccacctct tgtagatttc gcccacgggg atgggggggt tgttggtcat ccagccgatc 3780 tgctcctgca gggtgctggt ggtgccggcg atgtcgctgc cgcggggctc cctcatctgg 3840 ccgggggcga tggggccggc gtgcacgggg tgcaccctgt cccactcggc ggcctcctcg 3900 ttgatggtct ccttcagcat ctgcatggcg gcctggtggc cgcccacggt gttcagcatg 3960 gtgttcaggt cctggggggt ggctccctcg ctcagggcgc tgaacatggg gatcacctcg 4020 gggctgaagg ccttctcctc caccaccttc acccaggcgt tcagggtcct ggggctgatg 4080 gcctggtgca ccatctggcc ctggatgttc tgcacgatgg ggtagttctg gctcacctgg 4140 ctgctgtggc cggtgtcggc ggcggcctgc tgggccttct tcttggactt gttctgctcc 4200 tcctcgatct tgtccagggc ctccttggtg tccttgatct cgatcctctg gtgcacgcag 4260 tacagggtgg ccacggtgtt gtacaggctc ctcagctcct cgctgccggt ctgcaggctg 4320 ggctgcagct ggcccaggat ctgcctgcag ccctcgctgg tctccagcag gccggggttc 4380 acggcgaacc tctccagctc cctgctggcc cacacgatgt gcttcagctt atacttcttc 4440 ttgccgccgg gcctcagcct gatcttctcc cacctgtcca gctcgccgcc gctcagcacg 4500 ctggccctgg cggccatgct cgagtctatt tatattccaa aaaaaaaaaa taaaatttca 4560 atttttgtcg acaagcttaa aaattgaaat tttatttttt ttttttggaa tataaataag 4620 ctcgagcatg gaccgcgcca agctgctgct gctgctgctg ctgctgctgc tgccccaggc 4680 ccaggccgct agcgaccgcc tgtgggtgac agtgtactac ggcgtgcccg tgtggaagga 4740 cgccaccacc accctgttct gcgcctccga cgccaaggcc tacgacaccg aggtgcacaa 4800 cgtgtgggcc acccacgcct gcgtgcccac cgaccccaac ccccaggagg tggtgctggg 4860 caacgtgacc gagaacttca acatgggcaa gaacaacatg gtggagcaga tgcacgagga 4920
catcatcagc ctgtgggacc agtccctgaa gccctgcgtg aagctgaccc ccctgtgcgt 4980 gaccctgaac tgcaccaagc tgaagaacag caccgacacc aacaacaccc gctggggcac 5040 ccaggagatg aagaactgct ccttcaacat cagcacctcc gtgcggaaca agatgaagag 5100 agagtacgcc ctgttctact ccctggacat cgtgcccatc gacaacgaca acaccagcta 5160 ccgcctgagg tcctgcaaca cctccatcat cacccaggcc tgccccaagg tgagcttcga 5220 gcccatcccc atccacttct gcgcccccgc cggcttcgcc atcctgaagt gcaacaacaa 5280 gaccttcaac ggcaccggcc cctgcaccaa cgtgagcacc gtgcagtgca cccacggcat 5340 ccgccccgtg gtgtccaccc agctgctgct gaacggcagc ctggccgagg aggaggtggt 5400 gatccggtcc gagaacttca ccaacaacgc caagaccatc atcgtgcagc tgaacgagag 5460 cgtggagatc aactgcacca gacccaacaa caacaccagg aagtccatcc acatcggccc 5520 cggccgcgcc ttctacacca ccggcgacat catcggcgac atccggcagg cccactgcaa 5580 catctccaga accaactgga ccaacaccct gaagagggtg gccgagaagc tgcgcgagaa 5640 gttcaacaac accaccatcg tgttcaacca gagcagcggc ggcgaccccg agatcgtgat 5700 gcactccttc aactgcggcg gcgagttctt ctactgcaac accacccagc tgttcaactc 5760 cacctggaac gagaccaaca gcgagggcaa catcacctcc ggcaccatca ccctgccctg 5820 ccggatcaag cagatcatca acatgtggca ggaggtgggc aaggccatgt acgccccccc 5880 catcggcggc cagatcaagt gcctgtccaa catcaccggc ctgctgctga ccagagacgg 5940 cggctccgac aacagcagca gcggcaagga gatcttccgc cccggcggcg gcgacatgag 6000 ggacaactgg cgctccgagc tgtacaagta caaggtggtg aagatcgagc ccctgggcat 6060 cgcccccacc aaggccaaga ggagggtggt gcagcgcgag aagcgctgat aatagggatc 6120 cgcgccaaat ttaaatgatc ctgatccttt ttctgggtaa gtaatacgtc aaggagaaaa 6180 cgaaacgatc tgtagttagc ggccgcctaa ttaactaata ttatattttt tatctaaaaa 6240 actaaaaata aacattgatt aaattttaat ataatactta aaaatggatg ttgtgtcgtt 6300 agataaaccg tttatgtatt ttgaggaaat tgataatgag ttagattacg aaccagaaag 6360 tgcaaatgag gtcgcaaaaa aactgccgta tcaaggacag ttaaaactat tactaggaga 6420 attatttttt cttagtaagt tacagcgaca cggtatatta gatggtgcca ccgtagtgta 6480 tataggatcg gctcctggta cacatatacg ttatttgaga gatcatttct ataatttagg 6540 aatgattatc aaatggatgc taattgacgg acgccatcat gatcctattc taaatggatt 6600 gcgtgatgtg actctagtga ctcggttcgt tgatgaggaa tatctacgat ccatcaaaaa 6660 acaactgcat ccttctaaga ttattttaat ttctgatgta agatccaaac gaggaggaaa 6720 tgaacctagt acggcggatt tactaagtaa ttacgctcta caaaatgtca tgattagtat 6780 tttaaacccc gtggcatcta gtcttaaatg gagatgcccg tttccagatc aatggatcaa 6840 ggacttttat atcccacacg gtaataaaat gttacaacct tttgctcctt catattcagg 6900 ggaattc 6907
<210> 20
<211> 7347
<212> AON
<213> Secuencia artificial quimérica
<220>
<221> Inserto del MVA-C
<220>
<221> Secuencia flanqueante izquierda de TK
<222> 1. .502
<223> TkL
<220>
<221> Secuencia complementaria a secuencia codificante
<222> 647 .. 2143
<223> gp120-C
<220>
<221> Secuencia complementaria de promotor
<222> 2153 .. 2191
<223> pE/L para gp120-C
<220>
<221> Promotor
<222> 2206 .. 2244
<223> pE/L para gp120-C
<220>
<221> Secuencia codificante
<222> CDS: 2254 .. 6507
<223> gagpolnef-C
<220>
<221> Secuencia flanqueante derecha de TK
<222> 6656 .. 7347
<223> TkR
<400> 20 aagcttttgc gatcaataaa tggatcacaa ccagtatctc ttaacgatgt tcttcgcaga 60 tgatgattca ttttttaagt atttggctag tcaagatgat gaatcttcat tatctgatat 120 attgcaaatc actcaatatc tagactttct gttattatta ttattgatcc aatcaaaaaa 180 taaattagaa gccgtgggtc attgttatga atctctttca gaggaataca gacaattgac 240 aaaattcaca gactctcaag attttaaaaa actgtttaac aaggtcccta ttgttacaga 300 tggaagggtc aaacttaata aaggatattt gttcgacttt gtgattagtt tgatgcgatt 360 caaaaaagaa tcctctctag ctaccaccgc aatagatcct attagataca tagatcctcg 420 tcgcgatatc gcattttcta acgtgatgga tatattaaag tcgaataaag tgaacaataa 480 ttaattcttt attgtcatca tgggtaccaa ggcgcgatcg cattttctaa cgtgatggat 540 atattaaagt cgaataaagt gaacaataat taattcttta ttgtcatcat gtaattaact 600 agctacccgg aataaaaatt ccgggagatc tctcgagaga tctttatcac ctcttctccc 660 tctccaccac cctcctcttg gtggtggtgg gggccacgcc caggggcttg atctccacca 720 ccttgtactt gtacagctcg ctcctccagt tgttcctcat gtcgccgccg ccgggcctga 780 aggtctcggt gtcgttgggc tcggtgccgc cgtccctcac cagcagcagg ccggtgatgt 840 tgctcttgca ggtgatgttg cccttgatgg gaggggcgta catggccctg cccacctcct 900 gccacatgtt gatgatctgc ttgatcctgc aggggatggt gatgatgctg ctgctgttgc 960 tcttggtgcc gttgggggtg taggcgccgt tgaacaggcc gctggtgttg cagtagaaga 1020 actcgcccct gcagttgaag ctgtgggtgg tcacctccag gtcgccgccg ctgctgctgg 1080 cgaacttgat ggtcttgttc tggaagtgct cggcaagctt cttgctcacc ctctgcaggg 1140 tctcgttcca cttgtcctcg ctgatgttgc agtgggcctg cctgatgtcg ccgatgatgt 1200 cgccggtggc gtagaaggtc tggccggggc cgatcctgat gctcttcctg gtgttgttgc 1260 cgggcctggt gcacacgatc tccacgctct ggttcaggtg cacgatgatg gttttcacgt 1320 tgttggtcag gttctcgctc ctgatgatga tctcgccctc ggccaggctg ccgttcagca 1380 gcagctgggt gctcaccacg ggcttgatgc cgtgggtgca ctgcacggtg ctcacgttgt 1440 ggcaggggcc ggtgccgttg aagatcttgt cgttgcactt caggatggcg tagccggcgg 1500 gggtgcagta gtggatgggg atggggtcga aggtcacctt ggggcaggcc tgggtgatgg 1560 cgctggtgtt gcagttgatc agcctgtagt actcgctgct gttctcgctg tagttcttct 1620 tggtcagggg cacgatgtcc agcctgtaga acagggcgta cacggtctgc ttcctgtccc 1680 tcaccacggt ggtggcgttg aagctgcagt tcttcatctc cttcatgctc tcgtggtagg 1740 tctcgtggta ggtgtcgttg ctgttgctgc tcacgttcct gcactccagg gtcacgcaca 1800 ggggggtcag cttcacgcag ggcttcaggc tctggtccca caggctgatg acgtcctcct 1860 gcatctggtt caccatctcg ttcttccaca tgttgaagtt ctcggtcacg ttctccagca 1920 ccatctcctg ggggttgggg tcggcgggca cgcaggcgtg ggtggcccac acgttgtgca 1980 cctcggtgtc gtaggccttg gcgtcgctgg cgcagaacag ggtggtggtg gcgcccttcc 2040 acacgggcac gccgtagtac acggtcaccc acaggttgcc cacggcctgg gcctggggca 2100 gcagcagcag cagcagcagc agcagcagct tggccctgtc catgctcgag cttatttata 2160 ttccaaaaaa aaaaaataaa atttcaattt ttaagcttgt cgacaaaaat tgaaatttta 2220 tttttttttt ttggaatata aatagactcg agcatggccg ccagggccag catcctgagg 2280 ggcggcaagc tggacaagtg ggagaagatc aggctgaggc ccggcggcaa gaagcactac 2340 atgctgaagc acctggtgtg ggccagcagg gagctggaga ggttcgccct gaaccccggc 2400 ctgctggaga ccagcgaggg ctgcaagcag atcatgaagc agctgcagag cgccctgcag 2460 accggcaccg aggagctgag gagcctgttc aacaccgtgg ccacccccta ctgcgtgcac 2520 accgagatcg acgtgaggga caccagggag gccctggaca agatcgagga ggagcagaac 2580 aagatccagc agaagaccca gcaggccaag gaggccgacg gcaaggtgag ccagaactac 2640 cccatcgtgc agaacctgca gggccagatg gtgcaccagc ccatcagccc caggaccctg 2700 aatgcatggg tgaaggtggt ggaggagaag gccttcagcc ccgaggtgat ccccatgttc 2760
agcgccctga gcgagggcgc cacccctcag gacctgaaca ccatgctgaa caccgtgggc 2820 ggccaccagg ccgccatgca gatcctgaag gacaccatca acgaggaggc cgccgagtgg 2880 gacaggctgc accccgtgca cgccggcccc atcgcccccg gccagatgag ggagcccagg 2940 ggcagcgaca tcgccggcac caccagcaac ctgcaggagc agatcgcctg gatgaccagc 3000 aacccacccg tgcccgtggg cgacatctac aagaggtgga tcatcctggg tttaaacaag 3060 atcgtgagga tgtacagccc caccagcatc ctggacatca agcagggccc caaggagccc 3120 ttcagggact acgtggacag gttcttcaag accctgaggg ccgagcaggc cacccagggc 3180 gtgaagaact ggatgaccga caccctgctg gtgcagaacg ccaaccccga ctgcaagacc 3240 atcctgaggg ccctgggccc cggcgccagc atcgaggaga tgatgaccgc ctgccagggc 3300 gtgggcggcc ccagccacaa ggccaaggtg ctggccgagg ccatgagcca gaccaacagc 3360 gccatcctga tgcagaggag caacttcaag ggcagcaaga ggatcgtgaa gtgcttcaac 3420 tgcggcaagg agggccacat cgccaggaac tgcagggccc ccaggaagaa gggctgctgg 3480 aagtgcggca aggagggcca ccagatgaag gactgcaccg agaggcaggc caacttcctg 3540 ggcaagatct ggcccagcca caagggcggc cccggcaact tcctgcagaa caggcccgag 3600 cccaccgccc cccccgagga gagcttcagg ttcgaggagg agaccaccac ccccagccag 3660 aagcaggagc ccatcgacaa ggagctgtac cccctgacca gcctgaagag cctgttcggc 3720 aacgacccca gcagccagga attcttcagg gagaacctgg ccctgcccca gggcagggcc 3780 agggagttca gcagcgagca gaccagggcc aacagcccca ccaggggcga gctgcaggtg 3840 tggggcaggg acaacaacag catcagcgag gccggcgcca acaggcaggg caccatcagc 3900 ttcaacttcc cccagatcac cctgtggcag aggcccctgg tgaccatcaa gatcggcggc 3960 cagctgaagg aggccctgct gaacaccggc gccggcgaca ccgtgctgga ggacctgaac 4020 ctgcccggca agtggaagcc caagatgatc ggcggcatcg gcggcttcat caaggtgagg 4080 cagtacgagc agatccccat cgagatctgc ggccacaagg ccatcggcac cgtgctggtg 4140 ggccccaccc ccgtgaacat catcggcagg aacctgctga cccagctggg ctgcaccctg 4200 aacttcccca tcagccccat cgagaccgtg cccgtgaagc tgaagcccgg catggacggc 4260 cccaaggtga agcagtggcc cctgaccgag gagaagatca aggccctgac cgccatctgc 4320 gacgagatgg agaaggaggg caagatcacc aagatcggcc ccgagaaccc ctacaacacc 4380 cccatcttcg ccatcaagaa gaaggacagc accaagtgga ggaagctggt ggacttcagg 4440 gagctgaaca agaggaccca ggacttctgg gaggtgcagc tgggcatccc ccaccccgcc 4500 ggcctgaaga agaagaagag cgtgaccgtg ctggacgtgg gcgacgccta cttcagcatc 4560 cccctgtacg aggacttcag gaagtacacc gccttcacca tccccagcag gaacaacgag 4620 acccccggca tcagctacca gtacaacgtg ctgccccagg gctggaaggg cagcctcgcc 4680 atcttccaga gcagcatgac catcgaggag ctgatctaca gcaagaagag gcaggagatc 4740 ctggacctgt gggtgtacca cacccagggc tacttccccg actggcacaa ctacaccccc 4800 ggccccggcg tgaggttccc cctgaccttc ggctggtgct tcaagctggt gcccgtggac 4860 cccagggagg tggaggaggc caacgagggc gaggacaact gcctgctgca ccccgtgtgc 4920 cagcacggca tggaggacga ccacagggag gtgctgaagt ggaagttcga cagccagctg 4980 gcccacaggc acagggccag ggagctgcac cccgagttct acaaggactg catgggcggc 5040 aagtggagca agagcagcat cgtgggctgg cccgccatca gggagaggat gaggaggacc 5100 gagcccgccg ccgacggcgt gggcgccgtg agcagggacc tggagaagca cggcgccatc 5160 accagcagca acaccgccgc caccaacgag gactgcgcct ggctggaggc ccaggaggag 5220 ggcgaggtgg gcttccccgt gaggccccag gtgcccctga ggcccatgac ctacaagggc 5280 gccgtggacc tgagcttctt cctgaaggag aagggcggcc tggagggcct gaggcagcac 5340 ctgctgaggt ggggcttcac cacccccgac aagaagcacc agaaggagcc ccccttcctg 5400 tggatgggct acgagctgca ccccgacaag tggaccgtgc agcccaccca gctgcccgag 5460 aaggatagct ggaccgtgaa cgacatccag aagctggtgg gcaagctgaa ctgggccagc 5520 cagatctacc ccggcatcaa ggtgaggcag ctgtgcaagc tgctgagggg cgccaaggcc 5580 ctgaccgaca tcgtgcccct gaccgaggag gccgagctgg agctggccga gaacagggag 5640 atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac tacgacccca gcaaggacct gatcgccgag 5700 atccagaagc agggccagga gcagtggacc taccagatct accaggagcc cttcaagaac 5760 ctgaagaccg gcaagtacgc caagatgagg accgcccaca ccaacgacgt gaagcagctg 5820 accgaggccg tgcagaagat cgccatggag ggcatcgtga tctggggcaa gacccccaag 5880 ttcaggctgc ccatccagaa ggagacctgg gagacctggt ggaccgacta ctggcaggcc 5940 acctggatcc ccgagtggga gttcgtgaac acccctcccc tggtgaagct gtggtatcag 6000 ctggagaagg accccatcgt gggcgtggag accttctacg tggacggcgc cgccaacagg 6060 gagaccaaga tcggcaaggc cggctacgtg accgacaggg gcaggaagaa gatcgtgagc 6120 ctgaccgaga ccaccaacca gaagaccgag ctgcaggcca tctgcatcgc cctgcaggac 6180 agcggcagcg aggtgaacat cgtgaccgac agccagtacg ccctgggcat catccaggcc 6240 cagcccgaca agagcgagag cgagctggtg aaccagatca tcgagcagct gatgaagaag 6300 gagagggtgt acctgagctg ggtgcccgcc cacaagggca tcggcggcaa cgagcaggtg 6360
gacaagctgg tgagcagcgg catcaggaag gtgctgaaga ccctggagcc cttcaggaag
6420
cagaaccccg gcatcgtgat ctaccagtac atggacgacc tgtacgtggg cagcgacctg
6480
gagatcggcc
agcacaggac caagtaaaga tctctcgagg agctcaagcg ggcggatccc 6540
ccgggctgca ggaattcgat cgcgccaaat
ttaaatgatc ctgatccttt ttctgggtaa 6600
gtaatacgtc aaggagaaaa
cgaaacgatc tgtagttagc ggccgcctaa ttaactaata 6660
ttatattttt tatctaaaaa
actaaaaata aacattgatt aaattttaat ataatactta 6720
aaaatggatg ttgtgtcgtt agataaaccg tttatgtatt ttgaggaaat tgataatgag
6780
ttagattacg aaccagaaag
tgcaaatgag gtcgcaaaaa aactgccgta tcaaggacag 6840
ttaaaactat
tactaggaga attatttttt cttagtaagt tacagcgaca cggtatatta 6900
gatggtgcca ccgtagtgta tataggatcg gctcctggta cacatatacg ttatttgaga
6960
gatcatttct ataatttagg aatgattatc aaatggatgc taattgacgg acgccatcat
7020
gatcctattc taaatggatt gcgtgatgtg actctagtga ctcggttcgt tgatgaggaa
7080
tatctacgat
ccatcaaaaa acaactgcat ccttctaaga ttattttaat ttctgatgta 7140
agatccaaac gaggaggaaa
tgaacctagt acggcggatt tactaagtaa ttacgctcta 7200
caaaatgtca tgattagtat
tttaaacccc gtggcatcta gtcttaaatg gagatgcccg 7260
tttccagatc aatggatcaa ggacttttat atcccacacg gtaataaaat gttacaacct
7320
tttgctcctt catattcagg ggaattc
7347
<210> 21
<211> 17
<212> AON
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Cebador
<223> TK-R2
<400> 21 ctgccgtatc aaggaca 17
<210> 22
<211> 1515
<212> AON
<213> Secuencia artificial derivada del gen Env del virus SHIV89.6P, carente de nucleótidos correspondientes a la proteína gp41
<220>
<221> Secuencia codificante
<223> 89.6P-gp120
<400> 22 atg ccc atg ggg tct ctg caa ccg ctg gcc acc ttg tac ctg ctg ggg atg ctg gtc gct 60 Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Met Leu Val Ala
5 10 15 20
tcc gtg cta gcg acc gag aag ctg tgg gtg acc gtg tac tac ggc gtg ccc gtg tgg agg 120 Ser Val Leu Ala Thr Glu Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Arg 25 30 35 40
gag gcc acc acc acc ctg ttc tgc gcc agc gac gcc aaa gcc tac gac acc gag gtg cac 180 Glu Ala Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val His 45 50 55 60
aac gtg tgg gcc acc cac gcc tgc gtg ccc acc gac ccc aac ccc cag gag gtg gtg ctg 240 Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu 65 70 75 80
ggc aac gtg acc gag aac ttc aat atg tgg aag aac aac atg gtg gac cag atg cac gag 300 Gly Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asn Met Val Asp Gln Met His Glu 85 90 95 100
gae ate ate age etg tgg gae gag age etg aag cee tge gtg aag etg aee cee etg tge 360
Asp
Ile Ile Ser Leu Trp Asp Glu 105 Ser Leu 110 Lys Pro Cys Val Lys 115 Leu Thr Pro Leu Cys 120
gtg Val
aee Thr etg aae tge Leu Asn Cys 125 aee aae etg aae Thr Asn Leu Asn ate aee Ile Thr 130 aag Lys aae aee aee aae Asn Thr Thr Asn 135 etg Leu aee Thr age Ser age Ser 140 420
age tgg gge atg atg Ser Trp Gly Met Met 145
gag gag gge gag Glu Glu Gly Glu ate aag Ile Lys 150 aae Asn tge Cys age Ser tte tae Phe Tyr 155 ate aee Ile Thr aee Thr tee Ser 160 480
ate agg aae Ile Arg Asn
aag Lys gtg Val 165 aag Lys aag Lys gag tae gee Glu Tyr Ala 170 etg Leu tte Phe aae agg Asn Arg etg gae gtg gtg Leu Asp Val Val 175 cee gtg Pro Val 180 540
aag aae aee Lys Asn Thr
age aae Ser Asn 185 aee Thr aag tae agg Lys Tyr Arg etg Leu 190 att age tge Ile Ser Cys aae aee Asn Thr 195 age gtg Ser Val att aee eag Ile Thr Gln 200 600
gee Ala
tge Cys eet Pro aaa Lys gtg age Val Ser 205 tte eag Phe Gln cee Pro ate cee Ile Pro 210 ate cae tae tge gtg Ile Bis Tyr Cys Val 215 cee gee Pro Ala gge Gly tte Phe 220 660
gee Ala
ate etg aag tge Ile Leu Lys Cys 225 aae aae Asn Asn aag Lys aee Thr tte aae gge Phe Asn Gly 230 age gge Ser Gly cee tge Pro Cys 235 aee aae gtg Thr Asn Val age Ser 240 720
aee gtg Thr Val
eag tge Gln Cys aee Thr 245 cae Bis gge Gly ate agg Ile Arg cee gtg gtg Pro Val Val 250 tet aee eag etg etg etg aae gge Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly 255 260 780
age etg gee Ser Leu Ala
gaa gag gae Glu Glu Asp 265 ate gtg Ile Val ate agg Ile Arg 270 age gag gae Ser Glu Asp tte Phe aee gae aae gtg Thr Asp Asn Val 275 aag Lys aee Thr 280 840
ate ate gtg Ile Ile Val
eag Gln etg aae gag Leu Asn Glu 285 age gtg gtg Ser Val Val 290 att aae tge Ile Asn Cys aee agg Thr Arg 295 cee aae aae aae aee Pro Asn Asn Asn Thr 300 900
agg Arg
gag agg Glu Arg etg age Leu Ser 305 ate gge Ile Gly cee gge agg gee Pro Gly Arg Ala 310 tte tae gee agg agg aae Phe Tyr Ala Arg Arg Asn 315 ate ate gge Ile Ile Gly 320 960
gae Asp
ate agg eag gee Ile Arg Gln Ala 325 cae Bis tge Cys aae Asn ate age agg gee Ile Ser Arg Ala 330 aag tgg aae aae aee Lys Trp Asn Asn Thr 335 etg eag eag Leu Gln Gln 340 1020
ate gte Ile Val
ate aag Ile Lys etg agg Leu Arg 345 gag aag Glu Lys tte agg aae Phe Arg Asn 350 aag Lys aee Thr ate gee Ile Ala 355 tte aae Phe Asn eag Gln age age Ser Ser 360 1080
gge gge gae Gly Gly Asp
cee gag Pro Glu 365 ate gtg atg Ile Val Met cae Bis age Ser 370 tte aae Phe Asn tge gge gge gag Cys Gly Gly Glu 375 tte tte tae tge Phe Phe Tyr Cys 380 1140
aae Asn
aee gee eag etg Thr Ala Gln Leu 385 tte aae Phe Asn age aee tgg aae gtg gee gge gge aee aae Ser Thr Trp Asn Val Ala Gly Gly Thr Asn 390 395 gge aee gag Gly Thr Glu 400 1200
gge aae gae Gly Asn Asp
ate ate aee Ile Ile Thr 405 etg eag tge agg Leu Gln Cys Arg 410 ate aag Ile Lys eag Gln ate ate aae atg tgg eag aag Ile Ile Asn Met Trp Gln Lys 415 420 1260
gtg Val
gge aag Gly Lys gee Ala atg Met 425 tae Tyr gee Ala eet Pro cee Pro ate aee gge eag Ile Thr Gly Gln 430 ate agg tge Ile Arg Cys 435 age Ser age aae Ser Asn ate Ile 440 1320
70
aee gge etg etg etg aet ege gae gge gge aae age aee gag aee gag aee gag ate tte 1380 Thr G1y Leu Leu Leu Thr Arg Asp G1y G1y Asn Ser Thr G1u Thr G1u Thr G1u I1e Phe 445 450 455 460
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agg ate gag cee ate gge gtg gee cee aee agg gee aag agg agg aee gtg eag agg 1500
Val Arg
I1e G1u Pro I1e G1y Val Ala Pro Thr Arg Ala Lys Arg Arg Thr Val G1n Arg
485
490 495 500
gag aag agg tag taa 1515 G1u Lys Arg
<210> 23
<211> 4218
<212> ADN
<213> Secuencia artificial derivada del virus SHIV89.6P mediante modificaciones en las partes correspondientes a los antígenos Gag, Pol y Nef
<220>
<221> Secuencia codificante
<223> SIVgpn
<400> 23 atg ege gtg agg aae age gtg etg age gge aag aag gee gae gag etg gag aag ate agg 60 Met Arg Val Arg Asn Ser Val Leu Ser Gly Lys Lys Ala ASp Glu Leu Glu Lys Ile Arg
1 5 10 15 20
etg agg cee aae gge aag aag aag tat atg etg aag cae gtg gtg tgg gee gee aae gag 120 Leu Arg Pro Asn Gly Lys Lys Lys Tyr Met Leu Lys Bis Val Val Trp Ala Ala Asn Glu
25 30 35 40
etg gae agg tte gge etg gee gag age etg etg gag aae aag gag gge tge eag aag ate 180 Leu Asp Arg Phe Gly Leu Ala Glu Ser Leu Leu Glu Asn Lys Glu Gly Cys Gln Lys Ile 45 50 55 60
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65 70 75 80
aee gtg tge gtg ate tgg tge ate cae gee gag gag aag gtg aag cae aee gag gag gee 300 Thr Val Cys Val Ile Trp Cys Ile Bis Ala Glu Glu Lys Val Lys Bis Thr Glu Glu Ala 85 90 95 100
aag eag ate gtg eag agg cae etg gtg gtg gag aee gge aee aee gag aee atg cee aag 360 Lys Gln Ile Val Gln Arg Bis Leu Val Val Glu Thr Gly Thr Thr Glu Thr Met Pro Lys 105 110 115 120
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Phe Gly Ala Glu Val Val Pro Gly Phe Gln Ala Leu Ser Glu Gly
165
170 175 180
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age age gtg gae gag eag ate eag tgg atg tae agg eag eag aae eet ate cee gtg gge 780 Ser Ser Val Asp Glu Gln Ile Gln Trp Met Tyr Arg Gln Gln Asn Pro Ile Pro Val Gly 245 250 255 260
aae ate tae agg agg tgg ate eag etg gge etc eag aag tge gtg agg atg tae aae cee 840 Asn Ile Tyr Arg Arg Trp Ile Gln Leu Gly Leu Gln Lys Cys Val Arg Met Tyr Asn Pro 265 270 275 280
aea aae ate etg gae gtg aag eag gga cea aag gag cee tte eag tea tat gtg gae agg 900 Thr Asn Ile Leu Asp Val Lys Gln Gly Pro Lys Glu Pro Phe Gln Ser Tyr Val Asp Arg 285 290 295 300
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aee etg etg ate eag aae gee aae cee gae tge aag etg gtg etg aag gge etg gge gtg 1020 Thr Leu Leu Ile Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu Val Leu Lys Gly Leu Gly Val 325 330 335 340
aae cee aee etg gag gag atg etg aee gee tge eag gge gtg gge gge cee gge eag aag 1080 Asn Pro Thr Leu Glu Glu Met Leu Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro Gly Gln Lys 345 350 355 360
get agg etg atg gee gag get etg aag gag gee etg gee cee gtg cee ate cee tte gee 1140 Ala Arg Leu Met Ala Glu Ala Leu Lys Glu Ala Leu Ala Pro Val Pro Ile Pro Phe Ala 365 370 375 380
gee gee eag eag agg gga cee agg aag cee ate aag tge tgg aae tge gge aag gag gge 1200 Ala Ala Gln Gln Arg Gly Pro Arg Lys Pro Ile Lys Cys Trp Asn Cys Gly Lys Glu Gly 385 390 395 400
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cee aga gga cee age tgt gga tet get aaa gaa eta eat gea gtt ggg eaa gea gea gag 1440 Pro Arg Gly Pro Ser Cys Gly Ser Ala Lys Glu Leu His Ala Val Gly Gln Ala Ala Glu 465 470 475 480
aga aaa gea gag aga aag eag aga gaa gee tta eaa gga ggt gae aga gga ttt get gea 1500 Arg Lys Ala Glu Arg Lys Gln Arg Glu Ala Leu Gln Gly Gly Asp Arg Gly Phe Ala Ala 485 490 495 500
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Glu Val Leu Leu Asn Thr Gly Ala Asp Asp Ser 1le Val Thr Gly 1le Glu Leu Gly Pro 525 530 535 540
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aae gtg gag ate gag gtg etg gge aag agg ate aag gge aee ate atg aee gge gae aee 1740 Asn Val Glu 1le Glu Val Leu Gly Lys Arg 1le Lys Gly Thr 1le Met Thr Gly Asp Thr 565 570 575 580
cee ate aae ate tte gge agg aae etg etg aee gee etg gge atg age etg aae tte cee 1800 Pro 1le Asn 1le Phe Gly Arg Asn Leu Leu Thr Ala Leu Gly Met Ser Leu Asn Phe Pro 585 590 595 600
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aag eag tgg eet etg age aag gag aag ate gtg gee etg agg gaa ate tge gag aag atg 1920 Lys Gln Trp Pro Leu Ser Lys Glu Lys 1le Val Ala Leu Arg Glu 1le Cys Glu Lys Met 625 630 635 640
gag aag gae gge eag etg gag gag gee eet cee aee aae cee tae aae aee cee aee tte 1980 Glu Lys Asp Gly Gln Leu Glu Glu Ala Pro Pro Thr Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Thr Phe 645 650 655 660
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agg gtg aea eag gae tte aee gag gtg eag etg gge ate eet cae cee gee gge etg gee 2100 Arg Val Thr Gln Asp Phe Thr Glu Val Gln Leu Gly 1le Pro His Pro Ala Gly Leu Ala 685 690 695 700
aag aag gag aag gge gge etg gag gge ate tae tae age gee agg agg cae agg ate etg 2160 Lys Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly 1le Tyr Tyr Ser Ala Arg Arg His Arg 1le Leu 705 710 715 720
gae atg tae etg gag aag gag gag gge ate ate cee gae tgg eag gae tae aee age gge 2220 Asp Met Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly 1le 1le Pro Asp Trp Gln Asp Tyr Thr Ser G1y 725 730 735 740
cee gge ate aga tae cee aag aee tte gge tgg etg tgg aag etg gtg cee gtg aae gtg 2280 Pro Gly 1le Arg Tyr Pro Lys Thr Phe Gly Trp Leu Trp Lys Leu Val Pro Val Asn Val 745 750 755 760
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gag gae gge age age eag age etg gge gge etg gge aag gge etg age age agg age tge 2640 Glu Asp Gly Ser Ser Gln Ser Leu Gly Gly Leu Gly Lys Gly Leu Ser Ser Arg Ser Cys
865 870 875 880
gag gge eag aag tae aae eag gge eag tae atg aae aee cee tgg agg aae cee gee gag 2700 Glu Gly Gln Lys Tyr Asn Gln Gly Gln Tyr Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Glu 885 890 895 900
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gae etg gtg gge gtg age gtg agg cee aag gtg cee etg agg gee atg aee tae aag etg 2820 Asp Leu Val Gly Val Ser Val Arg Pro Lys Val Pro Leu Arg Ala Met Thr Tyr Lys Leu 925 930 935 940
geg ate gae atg age cae tte ate etg aae age ate gge tte age aee cee gag gag aag 2880 Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Leu Asn Ser Ile Gly Phe Ser Thr Pro Glu Glu Lys 945 950 955 960
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tgg aee gae tae tgg eag gtg aea tgg ate cee gag tgg gae tte ate age aee eet eet 3480 Trp Thr Asp Tyr Trp Gln Val Thr Trp Ile Pro Glu Trp Asp Phe Ile Ser Thr Pro Pro 1145 1150 1155 1160
etg gtg agg etg gtg tte aat etg gtg aag gae cee ate gag gge gag gag aee tae tae 3540 Leu Val Arg Leu Val Phe Asn Leu Val Lys Asp Pro Ile Glu Gly Glu Glu Thr Tyr Tyr 1165 1170 1175 1180
aee gae gge age tge aae aag eag age aag gag gge aag gee gge tae ate aee gae agg 3600 Thr Asp Gly Ser Cys Asn Lys Gln Ser Lys Glu Gly Lys Ala Gly Tyr Ile Thr Asp Arg 1185 1190 1195 1200
gge aag gae aag gtg aag gtg etg gag eag aee aee aae eag eag gee gag etg gag gee 3660 Gly Lys Asp Lys Val Lys Val Leu Glu Gln Thr Thr Asn Gln Gln Ala Glu Leu Glu Ala 1205 1210 1215 1220
tte etg atg gee etg aee gae age gge cee aag gee aae ate ate gtg gae age eag tat 3720 Phe Leu Met Ala Leu Thr Asp Ser Gly Pro Lys Ala Asn Ile Ile Val Asp Ser Gln Tyr 1225 1230 1235 1240
gtg atg gge ate ate aee gge tge cee aee gag age gag age agg etg gtg aae eag ate 3780 Val Met Gly Ile Ile Thr Gly Cys Pro Thr Glu Ser Glu Ser Arg Leu Val Asn Gln Ile 1245 1250 1255 1260
ate gag gag atg att aag aag age gag att tae gtg gee tgg gtg cee gee cae aag gge 3840 Ile Glu Glu Met Ile Lys Lys Ser Glu Ile Tyr Val Ala Trp Val Pro Ala His Lys Gly 1265 1270 1275 1280
ate gge gge aae eag gag ate gae cae etg gtg age eag ggc ate agg eag gtg etg agg 3900 Ile Gly Gly Asn Gln Glu Ile Asp His Leu Val Ser Gln Gly Ile Arg Gln Val Leu Arg 1285 1290 1295 1300
aag agg ate aee gtg etg gae ate gge gae gee tae tte age ate eet etg gae gag gag 3960 Lys Arg Ile Thr Val Leu Asp Ile Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Ile Pro Leu Asp Glu Glu 1305 1310 1315 1320
tte agg eag tae aee gee tte aee etg cee age gtg aae aae gee gag cee gge aag agg 4020 Phe Arg Gln Tyr Thr Ala Phe Thr Leu Pro Ser Val Asn Asn Ala Glu Pro Gly Lys Arg 1325 1330 1335 1340
tae ate tae aag gtg etg cee eag gge tgg aag gge age cee gee ate tte eag tae aee 4080 Tyr Ile Tyr Lys Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Tyr Thr 1345 1350 1355 1360
atg agg cae gtg etg gag cee tte agg aag gee aae cee gae gtg aee etg gtg eag tae 4140 Met Arg His Val Leu Glu Pro Phe Arg Lys Ala Asn Pro Asp Val Thr Leu Val Gln Tyr 1365 1370 1375 1380
atg gae gae ate etg ate gee tee gae agg aee gae etg gag cae gae agg gtg gtg etc 4200 Met Asp Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asp Arg Thr Asp Leu Glu His Asp Arg Val Val Leu 1385 1390 1395 1400
eag age aag gag etg tag 4218 Gln Ser Lys Glu Leu 1405
<210> 24
<211> 7180
<212> ADN
<213> Secuencia artificial quimérica
<220>
<221> Secuencia flanqueante izquierda de TK
<222> 1. .499
<223> TK-L
<220>
<221> Secuencia complementaria a secuencia codificante
<222> 519 .. 2033
<223> Secuencia complementaria a la secuencia codificante de la proteína 89.6P-gp120
<220>
<221> Secuencia complementaria de promotor
<222> 2081..2119
<223> Secuencia complementaria del promotor pE/L para 89.6P-gp120
<220>
<221> Promotor
<222> 2144 .. 2183
<223> Promotor pE/L para SIVgpn
<220>
<221> Secuencia codificante
<222> 2227 .. 6444
<223> Secuencia codificante de la proteína SIVgpn
<220>
<221> Secuencia flanqueante derecha de TK
<222> 6488 .. 7179
<223> TK-R
<220>
<223> Secuencia del inserto presente en el genoma de los vectores MVA-89.6PSIVgpn y NYVAC-89.6P-SIVgpn
<400> 24 aagcttttgc gatcaataaa tggatcacaa ccagtatctc ttaacgatgt tcttcgcaga 60 tgatgattca ttttttaagt atttggctag tcaagatgat gaatcttcat tatctgatat 120 attgcaaatc actcaatatc tagactttct gttattatta ttgatccaat caaaaaataa 180 attagaagcc gtgggtcatt gttatgaatc tctttcagag gaatacagac aattgacaaa 240 attcacagac tctcaagatt ttaaaaaact gtttaacaag gtccctattg ttacagatgg 300 aagggtcaaa cttaataaag gatatttgtt cgactttgtg attagtttga tgcgattcaa 360 aaaagaatcc tctctagcta ccaccgcaat agatcctatt agatacatag atcctcgtcg 420 cgatatcgca ttttctaacg tgatggatat attaaagtcg aataaagtga acaataatta 480 attctttatt gtcatcatgg gtaccaaggc gcggatcctt actacctctt ctccctctgc 540 acggtcctcc tcttggccct ggtgggggcc acgccgatgg gctcgatcct caccaccttg 600 tacttgtaca gctcgctcct ccagttgtcc ctcatgtcgc cgccgccggg cctgaagatc 660 tcggtctcgg tctcggtgct gttgccgccg tcgcgagtca gcagcaggcc ggtgatgttg 720 ctgctgcacc tgatctggcc ggtgatggga ggggcgtaca tggccttgcc caccttctgc 780 cacatgttga tgatctgctt gatcctgcac tgcagggtga tgatgtcgtt gccctcggtg 840 ccgttggtgc cgccggccac gttccaggtg ctgttgaaca gctgggcggt gttgcagtag 900 aagaactcgc cgccgcagtt gaagctgtgc atcacgatct cggggtcgcc gccgctgctc 960 tggttgaagg cgatggtctt gttcctgaac ttctccctca gcttgatgac gatctgctgc 1020 agggtgttgt tccacttggc cctgctgatg ttgcagtggg cctgcctgat gtcgccgatg 1080 atgttcctcc tggcgtagaa ggccctgccg gggccgatgc tcagcctctc cctggtgttg 1140 ttgttgggcc tggtgcagtt aatcaccacg ctctcgttca gctgcacgat gatggtcttc 1200 acgttgtcgg tgaagtcctc gctcctgatc acgatgtcct cttcggccag gctgccgttc 1260 agcagcagct gggtagacac cacgggcctg atgccgtggg tgcactgcac ggtgctcacg 1320 ttggtgcagg ggccgctgcc gttgaaggtc ttgttgttgc acttcaggat ggcgaagccg 1380 gcgggcacgc agtagtggat ggggatgggc tggaagctca ctttagggca ggcctgggta 1440 atcacgctgg tgttgcagct aatcagcctg tacttggtgt tgctggtgtt cttcacgggc 1500 accacgtcca gcctgttgaa cagggcgtac tccttcttca ccttgttcct gatggaggtg 1560 gtgatgtaga agctgcagtt cttgatctcg ccctcctcca tcatgcccca gctgctgctg 1620 gtcaggttgg tggtgttctt ggtgatgttc aggttggtgc agttcagggt cacgcacagg 1680 ggggtcagct tcacgcaggg cttcaggctc tcgtcccaca ggctgatgat gtcctcgtgc 1740 atctggtcca ccatgttgtt cttccacata ttgaagttct cggtcacgtt gcccagcacc 1800 acctcctggg ggttggggtc ggtgggcacg caggcgtggg tggcccacac gttgtgcacc 1860 tcggtgtcgt aggctttggc gtcgctggcg cagaacaggg tggtggtggc ctccctccac 1920 acgggcacgc cgtagtacac ggtcacccac agcttctcgg tcgctagcac ggaagcgacc 1980 agcatcccca gcaggtacaa ggtggccagc ggttgcagag accccatggg catgctggcg 2040 gcgaattggg taccaggcct agatctgtcg acttcgagct tatttatatt ccaaaaaaaa 2100 aaaataaaat ttcaattttt aagctcgcgc caaatttagc ttaaaaattg aaattttatt 2160
tttttttttt ggaatataaa taagctcgaa gtcgacagat ctaggcctgg tacccaattc 2220 gccaggatgc gcgtgaggaa cagcgtgctg agcggcaaga aggccgacga gctggagaag 2280 atcaggctga ggcccaacgg caagaagaag tatatgctga agcacgtggt gtgggccgcc 2340 aacgagctgg acaggttcgg cctggccgag agcctgctgg agaacaagga gggctgccag 2400 aagatcctga gcgtgctggc ccccctggtg cccaccggca gcgagaacct gaagagcctg 2460 tacaacaccg tgtgcgtgat ctggtgcatc cacgccgagg agaaggtgaa gcacaccgag 2520 gaggccaagc agatcgtgca gaggcacctg gtggtggaga ccggcaccac cgagaccatg 2580 cccaagacca gcaggcccac cgcccccagc tccggccgcg gcggcaacta ccccgtgcag 2640 cagatcggcg gcaactacgt gcacctgccc ctgagcccca ggaccctgaa cgcctgggtg 2700 aagctgatcg aggagaagaa gttcggcgcc gaggtggtgc ccggcttcca ggccctgagc 2760 gagggctgca ccccttacga catcaaccag atgctgaact gcgtgggcga ccaccaggcc 2820 gccatgcaga tcatcaggga catcatcaac gaggaggccg ccgactggga cctgcagcac 2880 cctcagcccg cccctcagca gggccagctg agggagccca gcggcagcga catcgccggc 2940 accacaagca gcgtggacga gcagatccag tggatgtaca ggcagcagaa ccctatcccc 3000 gtgggcaaca tctacaggag gtggatccag ctgggcctcc agaagtgcgt gaggatgtac 3060 aaccccacaa acatcctgga cgtgaagcag ggaccaaagg agcccttcca gtcatatgtg 3120 gacaggttct acaagagcct gagggccgag cagaccgacg ccgccgtgaa gaactggatg 3180 acccagaccc tgctgatcca gaacgccaac cccgactgca agctggtgct gaagggcctg 3240 ggcgtgaacc ccaccctgga ggagatgctg accgcctgcc agggcgtggg cggccccggc 3300 cagaaggcta ggctgatggc cgaggctctg aaggaggccc tggcccccgt gcccatcccc 3360 ttcgccgccg cccagcagag gggacccagg aagcccatca agtgctggaa ctgcggcaag 3420 gagggccaca gcgccaggca gtgcagggcc cccaggaggc agggctgctg gaagtgcggc 3480 aagatggacc acgtgatggc caagtgcccc gacaggcagg ccggttttag gccttggtcc 3540 atggggaaag aagccccgca atttccccat ggctcaagtg catcaggggc tgatgccaac 3600 tgctccccca gaggacccag ctgtggatct gctaaagaac tacatgcagt tgggcaagca 3660 gcagagagaa aagcagagag aaagcagaga gaagccttac aaggaggtga cagaggattt 3720 gctgcacctc aattctctct ttggaggaga ccagtagtga ccgcccacat cgagggccag 3780 cccgtggagg tgctgctgaa caccggcgcc gacgacagca tcgtgaccgg catcgagctg 3840 ggaccccact acacccccaa gatcgtgggc ggcatcggcg gcttcatcaa cacaaaggag 3900 tacaagaacg tggagatcga ggtgctgggc aagaggatca agggcaccat catgaccggc 3960 gacaccccca tcaacatctt cggcaggaac ctgctgaccg ccctgggcat gagcctgaac 4020 ttccccatcg ccaaggtgga gcccgtgaag gtggccctga agcccggcaa ggacggcccc 4080 aagctgaagc agtggcctct gagcaaggag aagatcgtgg ccctgaggga aatctgcgag 4140 aagatggaga aggacggcca gctggaggag gcccctccca ccaaccccta caacaccccc 4200 accttcgcca tcaagaagaa ggacaagaac aagtggagga tgctgatcga cttcagggag 4260 ctgaacaggg tgacacagga cttcaccgag gtgcagctgg gcatccctca ccccgccggc 4320 ctggccaaga aggagaaggg cggcctggag ggcatctact acagcgccag gaggcacagg 4380 atcctggaca tgtacctgga gaaggaggag ggcatcatcc ccgactggca ggactacacc 4440 agcggccccg gcatcagata ccccaagacc ttcggctggc tgtggaagct ggtgcccgtg 4500 aacgtgagcg acgaggccca ggaggacgag aggcactacc tgatgcagcc cgcccagacc 4560 agcaagtggg acgacccctg gggcgaggtg ctggcctgga agtttgaccc caccctggcc 4620 tacacctacg aggcctacgc cagatacccc gaggagctgg aggccagcca ggcctgccag 4680 aggaagaggc tggaggaggg catgggcggc gccatcagca tgaggaggag caagcccgcc 4740 ggcgacctga ggcagaagct gctgagggcc aggggcgaga cctacggcag gctgctgggc 4800 gaggtggagg acggcagcag ccagagcctg ggcggcctgg gcaagggcct gagcagcagg 4860 agctgcgagg gccagaagta caaccagggc cagtacatga acaccccctg gaggaacccc 4920 gccgaggaga aggagaagct ggcctacagg aagcagaaca tggacgacat cgacgaggag 4980 gacgacgacc tggtgggcgt gagcgtgagg cccaaggtgc ccctgagggc catgacctac 5040 aagctggcga tcgacatgag ccacttcatc ctgaacagca tcggcttcag cacccccgag 5100 gagaagttcc agaaggaccc tcccttccag tggatgggct acgagctgtg gcccaccaag 5160 tggaagctcc agaagatcga gctgccccag agggagacct ggaccgtgaa cgacatccag 5220 aagctggtgg gcgtgctgaa ctgggccgcc cagatttacc ccggcatcaa gaccaagcac 5280 ctgtgcaggc tgatccgcgg caagatgaca ctgaccgagg aggtgcagtg gaccgagatg 5340 gccgaggccg agtacgagga gaacaagatc attctgagcc aggagcagga gggctgctac 5400 taccaggagg gcaagcccct ggaggccacc gtgatcaaga gccaggacaa ccagtggagc 5460 tacaagatcc accaggagga caagatcctg aaggtgggca agttcgccaa gatcaagaac 5520 acccacacca acggcgtgag gctgctggcc cacgtgatcc agaagatcgg caaggaggcc 5580 atcgtgatct ggggccaggt gcccaagttc cacctgcccg tggagaagga cgtgtgggag 5640 cagtggtgga ccgactactg gcaggtgaca tggatccccg agtgggactt catcagcacc 5700 cctcctctgg tgaggctggt gttcaatctg gtgaaggacc ccatcgaggg cgaggagacc 5760
tactacaccg acggcagctg caacaagcag agcaaggagg gcaaggccgg ctacatcacc 5820 gacaggggca aggacaaggt gaaggtgctg gagcagacca ccaaccagca ggccgagctg 5880 gaggccttcc tgatggccct gaccgacagc ggccccaagg ccaacatcat cgtggacagc 5940 cagtatgtga tgggcatcat caccggctgc cccaccgaga gcgagagcag gctggtgaac 6000 cagatcatcg aggagatgat taagaagagc gagatttacg tggcctgggt gcccgcccac 6060 aagggcatcg gcggcaacca ggagatcgac cacctggtga gccagggcat caggcaggtg 6120 ctgaggaaga ggatcaccgt gctggacatc ggcgacgcct acttcagcat ccctctggac 6180 gaggagttca ggcagtacac cgccttcacc ctgcccagcg tgaacaacgc cgagcccggc 6240 aagaggtaca tctacaaggt gctgccccag ggctggaagg gcagccccgc catcttccag 6300 tacaccatga ggcacgtgct ggagcccttc aggaaggcca accccgacgt gaccctggtg 6360 cagtacatgg acgacatcct gatcgcctcc gacaggaccg acctggagca cgacagggtg 6420 gtgctccaga gcaaggagct gtagctcgag ggggatccac tagttctaga gcggccgccc 6480 taattaacta atattatatt ttttatctaa aaaactaaaa ataaacattg attaaatttt 6540 aatataatac ttaaaaatgg atgttgtgtc gttagataaa ccgtttatgt attttgagga 6600 aattgataat gagttagatt acgaaccaga aagtgcaaat gaggtcgcaa aaaaactgcc 6660 gtatcaagga cagttaaaac tattactagg agaattattt tttcttagta agttacagcg 6720 acacggtata ttagatggtg ccaccgtagt gtatatagga tcggctcctg gtacacatat 6780 acgttatttg agagatcatt tctataattt aggaatgatt atcaaatgga tgctaattga 6840 cggacgccat catgatccta ttctaaatgg attgcgtgat gtgactctag tgactcggtt 6900 cgttgatgag gaatatctac gatccatcaa aaaacaactg catccttcta agattatttt 6960 aatttctgat gtaagatcca aacgaggagg aaatgaacct agtacggcgg atttactaag 7020
taattacgct ctacaaaatg tcatgattag tattttaaac atggagatgc ccgtttccag atcaatggat caaggacttt aatgttacaa ccttttgctc cttcatattc aggggaattc
<210> 25
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> cebador
<223> E/L
<400> 25 tatttttttt ttttggaata taaatag
cccgtggcat ctagtcttaa 7080 tatatcccac acggtaataa 7140 7180

Claims (91)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA capaz de expresar simultáneamente una forma de la proteína Env del VIH-1 que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad y una proteína de fusión que contiene secuencias de las proteínas Gag, Poi y Nef del VIH-1, estando la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env y la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef bajo el control de promotores idénticos e insertadas ambas secuencias en el mismo lugar de inserción del vector, el locus de timidina quinasa, de manera que el vector recombinante carece del gen de la timidina quinasa.
  2. 2.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 1, en el que tanto la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se generan a partir de las secuencias de proteínas Env, Gag, Poi y Nef de aislados naturales.
  3. 3.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 2, en el que la secuencia de nucleótidos de la proteína Env se ha generado realizando modificaciones en la secuencia correspondiente, destinadas a eliminar la expresión de la proteína gp41, mediante deleción de toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp120.
  4. 4.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Gag-Pol-Nef no se proteoliza por acción de la proteasa del VI H.
  5. 5.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los promotores que controlan las secuencias de la proteína Env y la proteína de fusión Gag-Pol-Nef son promotores idénticos que permiten la expresión de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef y de la proteína Env carente de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad tanto en etapas tempranas como tardías del ciclo infectivo del virus MV A.
  6. 6.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 5, en el que los promotores que controlan la secuencia de la proteína Env y la secuencia de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef son promotores sintéticos pE/L
  7. 7.
    Un vector recombinante según las reivindicaciones 1 a 6, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env se ha generado eliminando toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete de la proteína gp120, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Gag-Pol-Nef da lugar a una poliproteína que no se proteoliza por acción de la proteasa del VIH y los promotores que controlan las secuencias correspondientes a la proteína Env y la proteína Gag-Pol-Nef son promotores sintéticos pE/L
  8. 8.
    Un vector recombinante según la reivindicación 7, en el que tanto la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef han sido obtenidas de aislados naturales del clade 8.
  9. 9.
    Un vector recombinante según la reivindicación 8, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env da lugar a una proteína que reproduce la secuencia de la proteína gp120 del aislado BX08, representada por SEQ ID NO:15.
  10. 10.
    Un vector recombinante según la reivindicación 8, en el que las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef han sido obtenidas del aislado IIIB, estando la secuencia de nucleótidos de dicha proteína de fusión representada por SEQ ID NO:16.
  11. 11.
    Un vector recombinante según las reivindicaciones 9 y 10, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env da lugar a una proteína que reproduce la secuencia de la proteína gp120 del aislado BX08 y las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef han sido obtenidas del aislado IIIB, estando representadas dichas secuencias, respectivamente, por SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16.
  12. 12.
    Un vector recombinante según la reivindicación 7, en el que tanto la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef han sido obtenidas de aislados naturales del clade C.
  13. 13.
    Un vector recombinante según la reivindicación 12, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env da lugar a una proteína que reproduce la secuencia de la proteína gp120 del aislado CN54, representada por SEQ ID NO:17.
  14. 14.
    Un vector recombinante según la reivindicación 12, en el que las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef han sido obtenidas del aislado CN54, estando la secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión representada por SEO ID NO:18.
  15. 15.
    Un vector recombinante según las reivindicaciones 13 y 14, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env da lugar a una proteína que reproduce la secuencia de la proteína gp120 del aislado CN54 y las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión Gag-PolNef se han obtenido también del aislado CN54, estando representadas dichas secuencias, respectivamente, por SEO ID NO:17 y SEO ID NO:18.
  16. 16.
    Una composición que contiene, al menos, un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
  17. 17.
    Una composición que contiene, al menos, un vector recombinante según la reivindicación 16 destinada a ser administrada a un individuo con el propósito de provocar o reforzar una respuesta inmune que ayude a prevenir o a tratar una infección provocada por el virus VIH.
  18. 18.
    Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, que contiene al menos un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
  19. 19.
    Una composición según la reivindicación 18, que contiene, al menos, un vector recombinante según la reivindicación 11.
  20. 20.
    Una composlclon según la reivindicación 19, destinada a ser administrada a un individuo con el propósito de provocar o reforzar una respuesta inmune que ayuda a prevenir o tratar una infección provocada por el virus VIH como parte de un protocolo de inmunización en el que se administra una primera dosis de vacunación para desencadenar la respuesta inmune y una o más dosis posteriores para reforzar la respuesta inmune inicial.
  21. 21.
    Una composición según la reivindicación 20, destinada a ser administrada como la primera dosis de vacunación con la que se desencadena la respuesta inmune.
  22. 22.
    Una composición según la reivindicación 20, destinada a ser administrada tras la primera dosis de vacunación como una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune inicial.
  23. 23.
    Una composición según la reivindicación 20, destinada a ser administrada tanto en la primera dosis de vacunación que tiene el propósito de desencadenar la respuesta inmune como en una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune inicial.
  24. 24.
    Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, que contiene, al menos, un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.
  25. 25.
    Una composición según la reivindicación 24, que contiene, al menos, un vector recombinante según la reivindicación 15.
  26. 26.
    Una composlclon según la reivindicación 25, destinada a ser administrada a un individuo con el propósito de provocar o reforzar una respuesta inmune que ayuda a prevenir o tratar una infección provocada por el virus VIH como parte de un protocolo de inmunización en el que se administra una primera dosis de vacunación para desencadenar la respuesta inmune y una o más dosis posteriores para reforzar la respuesta inmune inicial.
  27. 27.
    Una composición según la reivindicación 26, destinada a ser administrada como la primera dosis de vacunación que tienen el propósito de desencadenar la respuesta inmune.
  28. 28.
    Una composición según la reivindicación 26, destinada a ser administrada como una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito es reforzar la respuesta inmune inicial.
  29. 29.
    Una composición según la reivindicación 26, destinada a ser administrada tanto como la primera dosis de vacunación con la que se desencadena la respuesta inmune como en una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune inicial.
  30. 30.
    Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, que contiene al menos un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, Y al menos un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.
  31. 31.
    Una composición según la reivindicación 30, que contiene, al menos un vector recombinante según la reivindicación 11 y al menos un vector recombinante según la reivindicación 15.
  32. 32.
    Una composlclon según la reivindicación 31, destinada a ser administrada a un individuo con el propósito de provocar o reforzar una respuesta inmune que ayuda a prevenir o tratar una infección provocada por el virus VIH como parte de un protocolo de inmunización en el que se administra una primera dosis de vacunación para desencadenar la respuesta inmune y una o más dosis posteriores para reforzar la respuesta inmune inicial.
  33. 33.
    Una composición según la reivindicación 32, destinada a ser administrada como la primera dosis de vacunación que tiene el propósito de desencadenar la respuesta inmune.
  34. 34.
    Una composición según la reivindicación 32, destinada a ser administrada tras la primera dosis de vacunación como una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune inicial.
  35. 35.
    Una composición según la reivindicación 32, destinada a ser administrada tanto en la primera dosis de vacunación cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune como en una o más de las dosis posteriores de vacunación que tienen el propósito de reforzar la respuesta inmune inicial.
  36. 36.
    Uso de un vector recombinante derivado del virus MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la fabricación de un medicamento destinado a ser utilizado como vacuna para ayudar a prevenir o a tratar una infección provocada por el virus VIH.
  37. 37.
    Uso según la reivindicación 36, en el que medicamento está diseñado para ser la única vacuna que se suministre a un individuo para ayudar a prevenir o a tratar una infección provocada por el virus VIH.
  38. 38.
    Uso según la reivindicación 37, en el que el medicamento contiene al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 y/o al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a
  39. 15.
  40. 39.
    Uso según la reivindicación 36, en el que el medicamento está diseñado para ser administrado como al menos una de las dosis que forman parte de un protocolo de inmunización en el que se administra una primera dosis de vacunación para desencadenar la respuesta inmune y una segunda o más dosis posteriores para reforzar la respuesta inmune inicial.
  41. 40.
    Uso según la reivindicación 39, en el que el medicamento está diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial.
  42. 41.
    Uso según la reivindicación 40, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial, contiene al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 y/o al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.
  43. 42.
    Uso según la reivindicación 41, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación -cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial-contiene al menos un vector según la reivindicación 11, y/o al menos un vector según la reivindicación 15, y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada, contiene al menos un vector recombinante derivado del virus NYVAC.
  44. 43.
    Uso según la reivindicación 42, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial, contiene al menos un vector según la reivindicación 11, Y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada, contiene al menos el vector recombinante NYVAC-B.
  45. 44.
    Uso según la reivindicación 42, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial, contiene al menos un vector según la reivindicación 15, y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada, contiene al menos el vector recombinante NYVAC-C.
  46. 45.
    Uso según la reivindicación 41, en el que tanto el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación -cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial-, como el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores -destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada, contienen al menos un
    vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, y/o al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.
  47. 46.
    Uso según la reivindicación 45, en el que tanto el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación que desencadena la respuesta inmune inicial como el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial previamente desencadenada contienen al menos un vector según la reivindicación 12.
  48. 47.
    Uso según la reivindicación 46 en el que tanto el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación -cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial-como el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores -destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada-contienen al menos un vector según la reivindicación 15.
  49. 48.
    Uso según la reivindicación 39, en el que el medicamento está diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores cuyo propósito es reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada.
  50. 49.
    Uso según la reivindicación 48, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores -cuyo propósito es reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada-contiene al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 y/o al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.
  51. 50.
    Uso según la reivindicación 49, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores -cuyo propósito es reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada-contiene al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, y/o al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, yen el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de o constituyendo la primera dosis de vacunación -cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial-contiene al menos un vector recombinante derivado del virus NYVAC.
  52. 51.
    Uso según la reivindicación 50, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores -destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada-, contiene al menos un vector según la reivindicación 11 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación -cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial-contiene al menos el vector recombinante NYVAC-B.
  53. 52.
    Uso según la reivindicación 50, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores -destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada-, contiene al menos un vector según la reivindicación 15, yen el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación -cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial-contiene al menos el vector recombinante NYVAC-C.
  54. 53.
    Uso según la reivindicación 49, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores -destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada-contiene al menos un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, y/o al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, yen el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación -cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial-contiene al menos un plásmido recombinante que contiene secuencias codificantes de antígenos del VIH-1.
  55. 54.
    Uso según la reivindicación 53, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores -destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada-contiene al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, y/o al menos un vector según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación -cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial-contiene al menos un plásmido recombinante que contiene secuencias codificantes de antígenos del VIH-1 que están presentes también en al menos uno de los vectores según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, o según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 que forman parte o constituyen la segunda dosis y/o dosis posteriores de vacunación.
  56. 55.
    Uso según la reivindicación 54, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores -destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada-contiene al menos un vector según la reivindicación 11, Y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación -cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial-contiene al menos el plásmido recombinante DNA-B.
  57. 56.
    Uso según la reivindicación 54, en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la segunda y/o dosis posteriores -destinadas a reforzar la respuesta inmune inicial, previamente desencadenada-contiene al menos un vector según la reivindicación 15 y en el que el medicamento diseñado para ser administrado como parte de, o constituyendo la primera dosis de vacunación -cuyo propósito es desencadenar la respuesta inmune inicial-contiene al menos el plásmido recombinante DNA-C.
  58. 57.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA capaz de expresar simultáneamente una forma de la proteína Env del VIH-1 que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad y una proteína de fusión que contiene secuencias de las proteínas Gag, Poi y Nef del virus de la inmunodeficiencia de simio, SIV, en el que las secuencias de nucleótidos de la proteína Env y de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef están controladas por promotores idénticos y en el que ambas secuencias están insertadas en el mismo lugar de inserción del vector, el locus de timidina quinasa, de manera que el vector recombinante carece del gen de la timidina quinasa.
  59. 58.
    Un vector recombinante según la reivindicación 57, en el que tanto la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef se generan a partir de las secuencias de proteínas Env, Gag, Poi y Nef de virus quiméricos de la inmunodeficiencia de simio y humano, SHIV.
  60. 59.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 58, en el que la secuencia de nucleótidos de la proteína Env se ha generado realizando modificaciones en la secuencia correspondiente, destinadas a eliminar la expresión de la proteína gp41, mediante deleción de toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp120.
  61. 60.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA según cualquiera de las reivindicaciones 58 y 59, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Gag-Pol-Nef no se proteoliza por acción de la proteasa retroviral.
  62. 61.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 60, en el que los promotores que controlan las secuencias de la proteína Env y la proteína de fusión Gag-Pol-Nef son promotores idénticos que permiten la expresión de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef y de la proteína Env carente de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad, tanto en etapas tempranas como tardías del ciclo infectivo del virus MV A.
  63. 62.
    Un vector recombinante derivado del virus MVA según la reivindicación 61, en el que los promotores que controlan las secuencias de la proteína Env y de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef son promotores sintéticos pE/L.
  64. 63.
    Un vector recombinante según las reivindicaciones 57 a 62, en el que la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env se ha generado eliminando toda la secuencia del gen env que en la secuencia natural de dicho gen aparece tras el último triplete correspondiente a la proteína gp120, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Gag-Pol-Nef da lugar a una poliproteína que no se proteo liza por acción de la proteasa del HIV y los promotores bajo cuyo control están las secuencias correspondientes a la proteína Env y a la proteína Gag-Pol-Nef son promotores sintéticos pE/L.
  65. 64.
    Un vector recombinante según la reivindicación 63, en el que tanto la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína Env como las secuencias utilizadas para generar la secuencia de nucleótidos correspondiente a la proteína de fusión Gag-Pol-Nef han sido obtenidas del virus quimérico SHIV89.6P.
  66. 65.
    Un vector recombinante según la reivindicación 64, en el que la secuencia de nucleótidos de la proteína Env está representada por SEQ ID NO:22.
  67. 66.
    Un vector recombinante según la reivindicación 64, en el que la secuencia de nucleótidos de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef está representada por SEQ ID NO:23.
  68. 67.
    Un vector recombinante según las reivindicaciones 65 y 66 que comprende un inserto cuya secuencia está representada por SEQ ID NO:24.
  69. 68.
    Una composición que comprende al menos un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 67.
  70. 69.
    Una composición según la reivindicación 68, que comprende adicionalmente al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  71. 70.
    Uso de un vector recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 67, o de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 68 o 69, para evaluar la capacidad para conferir
    protección frente a la infección por el VIH de un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que presenta la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 67, evaluando tal capacidad para conferir protección sometiendo a un primate no humano a un protocolo de desencadenamiento/refuerzo de la respuesta inmune en el que el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 67 se administra al primate, inoculando posteriormente al primate un virus capaz de infectarlo y de causar síntomas similares a los del SIDA y evaluando en el primate la capacidad que tiene la respuesta inmune generada para controlar la infección determinando una magnitud seleccionada entre el número de partículas virales presentes en el plasma de muestras de sangre extraídas del primate, el porcentaje de células CD4+ y/o CD8+ en el total de las células mononudeares de sangre periférica (PBMC), la tasa de supervivencia de los primates infectados o combinaciones de las mismas.
  72. 71.
    Uso según la reivindicación 70, en el que se determina el número de partículas virales presentes en el plasma de las muestras de sangre extraídas del primate no humano determinando el número de copias de ARN viral presentes en el plasma.
  73. 72.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 70 ó 71, en el que el primate no humano es un macaco.
  74. 73.
    Uso según la reivindicación 72, en el que el virus capaz de infectar al macaco y de causar síntomas similares a los del SIDA es una forma patógena del virus de la inmunodeficiencia de simio y humana (SHIV).
  75. 74.
    Uso según la reivindicación 73, en el que la forma patógena del virus de la inmunodeficiencia de simio y humana inoculada es el SHIV89.6P.
  76. 75.
    Uso según las reivindicaciones 73 ó 74, en el que el número de copias de ARN viral presentes en el plasma del macacos se determina transcurridos al menos 10 días desde el momento de la inoculación del virus SHIV.
  77. 76. Uso según la reivindicación 74, en el que el SHIV89.6P se inocula por vía intravenosa.
  78. 77.
    Uso según la reivindicación 76, en el que el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 67 administrado a los macacos previamente a la inoculación del SHIV89.6P es un vector de la reivindicación 67.
  79. 78.
    Uso según la reivindicación 77, en el que el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que presenta la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que el vector de la reivindicación 67 es el vector MVA-B y/o el vector MVA-C.
  80. 79.
    Uso según la reivindicación 78, en el que el vector de la reivindicación 67 se administra a los macacos en una o más dosis de potenciación de la respuesta inmune.
  81. 80.
    Uso según la reivindicación 79, en el que el vector de la reivindicación 67 se administra a los macacos en la tercera dosis de vacunación.
  82. 81.
    Uso según la reivindicación 80, en el que el vector de la reivindicación 67 se administra a los macacos adicionalmente en una cuarta dosis de vacunación.
  83. 82.
    Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 80 u 81, en el que el vector de la reivindicación 67 está ausente de la primera y/o de la segunda dosis de vacunación administradas a los macacos.
  84. 83.
    Uso según la reivindicación 82, en el que el vector de la reivindicación 67 está ausente de la primera y/o de la segunda dosis de vacunación administradas a los macacos.
  85. 84.
    Uso según la reivindicación 83, en el que la primera y la segunda dosis de vacunación comprenden un vector de ADN desnudo a partir del cual pueden expresarse en los macacos antígenos del SHIV89.6P
  86. 85.
    Uso según la reivindicación 79, en el que el vector de la reivindicación 67 se administra por vía intramuscular.
  87. 86.
    Uso de un vector recombinante derivado del virus NYVAC que presenta la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que un vector derivado de MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 67 como control en un procedimiento en el que se evalúa la eficacia como vacuna de un vector derivado del virus MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 mediante el uso del vector según una cualquiera de las reivindicaciones 57 a 67 que presenta la misma estructura de organización génica, sitio de inserción y promotores que el vector derivado de MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
  88. 87.
    Uso según la reivindicación 86, en el que el vector recombinante derivado del virus NYVAC comprende un inserto cuya secuencia está representada por SEO ID NO:24 y el vector recombinante derivado de MVA que se utiliza en el procedimiento en el que se evalúa la eficacia como vacuna de otro vector recombinante derivado del virus MVA según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 es un vector recombinante de la reivindicación 11.
  89. 88.
    Uso según la reivindicación 87, en el que se evalúa la eficacia como vacuna del vector MVA-B y/o del vector MVA-C.
  90. 89.
    Un plásmido que posee un inserto con la secuencia codificante de una forma de la proteína Env del VIH-1 que carece de la parte correspondiente a la proteína gp41 en su totalidad y la secuencia codificante de una proteína de fusión que contiene secuencias de las proteínas Gag, Poi y Nef del SIV, inserto en el cual la secuencia codificante de la proteína Env y la secuencia codificante de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef están bajo el control de promotores idénticos localizados en direcciones opuestas y en la zona más interna del inserto, caracterizado por que el inserto esté flanqueado, en uno de sus extremos, por una primera secuencia f1anqueante del locus de timidina quinasa y, en el otro extremo, por una segunda secuencia f1anqueante más corta comprendida en la secuencia que flanquea el extremo opuesto del locus de timidina quinasa, presentando adicionalmente el plásmido una tercera secuencia que corresponde a la secuencia que flanquea el extremo del locus de timidina quinasa oppuesto a la primera secuencia f1anqueante y que es más larga y que comprende la segunda secuencia f1anqueante más corta, y un gen marcador situado entre la segunda secuencia f1anqueante más corta y la tercera secuencia.
  91. 90.
    Plásmido según la reivindicación 89, en el que la secuencia codificante de la proteína Env del VIH-1 es la representada por SEO ID NO:22, la secuencia codificante de la proteína de fusión Gag-Pol-Nef es la representada por SEO ID NO:23, los promotores idénticos que controlan dichas secuencias codificantes son promotores sintéticos pE/L y el gen marcador es LAC-Z.
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