KR20120014918A - 홍역-말라리아 조합 백신 - Google Patents

홍역-말라리아 조합 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 여러 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 항원들을 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 상이한 약독화 재조합 홍역-말라리아 벡터를 함유한, 홍역-말라리아 조합 백신에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 플라스모듐 팔시파룸의 서컴스포로조이트(CS) 단백질, 플라스모듐 팔시파룸의 분열소체 표면 단백질 1(MSP-1), 및 그의 글리코실화 형태 및 분비된 형태의 유도체 (p-42; p-83-30-38), 및 플라스모듐 팔시파룸의 결합 또는 분비된 형태의 첨단막 항원 1(AMA1)을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 상기 바이러스 벡터는 백신으로 사용되며, 목적 유전자를 전달하는데 효과적이고, 관련 면역 세포에 효과적으로 결합하여 이를 감염시키는 균주에 기반한, 약독화 홍역 바이러스에서 유래한다. 바람직한 구체예에서, 상기 CS, MSP1 및 AMA1 단백질들은 포유동물, 바람직하게는 사람에서 강력한 면역 반응을 유발하기 위해 바이러스로부터 생산될 것이다; 상기 단백질들의 발현은 인간 코돈 최적화로 인해 향상된다. 또한, 본 발명은 말라리아의 예방적 치료에서의 상기 재조합 백신의 용도에 관한 것이다.

Description

홍역-말라리아 조합 백신{Combined measles-malaria vaccine}
본 발명은 여러 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 항원을 코딩하는 이종(heterologous) 핵산을 포함하는 상이한 약독화 재조합 홍역-말라리아 벡터를 함유한, 홍역-말라리아 조합 백신에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 플라스모듐 팔시파룸의 서컴스포로조이트(circumsporozoite, CS) 단백질, 플라스모듐 팔시파룸의 분열소체 표면 단백질 1(merozoite surface protein 1, MSP-1), 및 그의 글리코실화 형태 및 분비된 형태의 유도체 (p-42; p-83-30-38), 및 플라스모듐 팔시파룸의 결합(anchored) 또는 분비된 형태의 첨단막 항원 1(apical membrane antigen 1, AMA1)을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 상기 바이러스 벡터는 백신으로 사용되며, 목적 유전자를 전달하는데 효과적이고, 관련 면역 세포에 효과적으로 결합하여 이를 감염시키는 균주(strain)에 기반한, 약독화 홍역 바이러스로부터 유래한다. 바람직한 구체예에서, 상기 CS, MSP1 및 AMA1 단백질들은 포유동물, 바람직하게는 사람에서 강력한 면역 반응을 유발하기 위해 바이러스로부터 생산될 것이다; 상기 단백질들의 발현은 인간 코돈 최적화로 인해 향상된다. 또한, 본 발명은 말라리아의 예방적 치료에서의 상기 재조합 백신의 용도에 관한 것이다.
홍역 바이러스
본 발명은 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum, Pf)의 항원을 발현하는 재조합 약독화 홍역 바이러스를 포함하는 백신, 및 홍역 및 말라리아 항원 모두에 대한 면역력을 부여할, 재조합 홍역-말라리아 백신의 제조를 위한 그의 용도에 관한 것이다.
홍역 바이러스 (MV)는 모노네가비랄레스(Mononegavirales) 목의 구성원이며, 즉, 비분절(non-segmented) 음성 가닥 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. MV의 비분절 게놈은 안티메세지 극성(antimessage polarity)을 갖는다; 따라서, 게놈 RNA는 생체 내 또는 인 비트로(in vitro)에서 번역되지 않는다. 또한, 게놈 RNA는, 3개의 바이러스 단백질과 리보뉴클레오단백질(ribonucleoprotein, RNP) 복합체의 형태로 매우 특이적으로 연관되어 있는 경우에만 생물학적 활성을 나타낸다 (하기를 참조한다). 비분절 (-) 가닥 RNA 바이러스의 전사 및 복제, 및 그의 바이러스 입자로의 조립(assembly)은 광범위하게 검토되어 왔다 (1). 홍역 바이러스의 전사 및 복제는 감염된 세포의 핵을 포함하지 않으나, 오히려 감염된 세포의 세포질에서 발생한다. 홍역 바이러스이 게놈은 6개의 유전자 (N, P, M, F, H 및 L로 지칭됨)로부터 유래하는 6개의 주요 구조 단백질, 및 추가적으로, 구성(constitutive) 면역 반응의 상쇄(counteracting) 및 전사/복제의 조절에 관여하는, P 유전자, C 및 V로부터 유래하는 2개의 비구조 단백질을 코딩하는 유전자들을 포함한다. 유전자 순서는 3' N, P (C 및 V 포함), M, F, H, 및 L 5'이다. 또한, 3'-말단 영역에서부터, 약 50개의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 리더(reader) RNA가 전사된다. 상기 언급된 유전자들은 각각, 바이러스의 리보뉴클레오캡시드(ribonucleocapsid, RNP)의 단백질, 즉 뉴클레오단백질(nucleoprotein, N), 포스포단백질(phophoprotein, P) 및 거대한 폴리머라제/레플리카제(replicase) 단백질 (L)을 코딩하며, 이들은 게놈 RNA와 매우 단단하게 결합하여, RNP를 형성한다. 다른 유전자들은 헤마글루티닌(hemagglutinin, H), 융합(fusion, F) 및 매트릭스 (M) 단백질을 포함한, 바이러스 피막(envelope) 단백질을 코딩한다. MV 유전자의 전사는 감소 구배(decreasing gradient)를 따른다: 폴리머라제가 게놈 주형에서 작동하는 경우, 이는 하류 유전자로부터 제조된 RNA보다, 상류 유전자로부터 제조된 RNA를 더 많이 합성한다. 이 불연속적 전사 모드에서, mRNA는 캐핑 및 폴리아데닐화된다. 역으로, 복제 모드에서, L 단백질은 전장(full length) 안티게놈(antigenomic) 및 게놈 RNA를 생산하며, 이들은 N, P 및 L 단백질로 즉시 피복되어 감염성 후대(progeny) RNP를 생성한다.
홍역 바이러스는 1954년에 분리되었다: 엔더스(Enders) 및 피블스(Peebles)는 1차 인간 신장 세포에, 홍역에 걸린 유아, 데이비드 에드몬스톤(David Edmonston)의 혈액을 접종시켰으며, 후속적으로, 그로부터 얻어진 에드몬스톤 MV 주 (2)를 다양한 세포주에서 증식하도록 적응(adapt)시켰다. 닭 배아, 계배아 섬유아세포(chick embryo fibroblast, CEF), 및/또는 개 신장 세포 및 인간 이배체(diploid) 세포로의 적응은, 약독화 에드몬스톤 A 및 B (3), 자그렙(Zagreb, EZ), 및 AIK-C 종자를 생성시켰다. 에드몬스톤 B는 1963년 최초의 MV 백신으로 허가받았다. CEF에 대한 에드몬스톤 A 및 B의 추가적인 계대감염(passage)은 보다 약독화된 슈바르츠(Schwarz) 및 모라텐(Moraten) 바이러스 (3)를 생성시켰으며, 이들의 서열은 최근에 동일한 것으로 밝혀졌다 (4; 5). 에드모스톤 B 백신은 면역반응 유발성(reactogenic)을 나타냈기 때문에, 1975년에 포기되었으며, 상기 슈바르츠/모라텐 백신으로 대체되었다. 여러 다른 백신주들이 또한 사용된다: AIK-C, 슈바르츠 F88, CAM70, 일본의 TD97, 러시아의 Leningrad-16, 및 에드몬스톤 자그렙. CAM70 및 TD97 중국 백신주들은 에드몬스톤으로부터 유래된 것이 아니다. 슈바르츠/모라텐 및 AIK-C 백신은 CEF에서 생산된다. 자그렙 백신은 인간 이배체 세포 (WI-38)에서 생산된다. 최근에는, 상기 슈바르츠/모라텐, AIK-C 및 EZ 백신이 통상적으로 사용되나 (6), 이론적으로, 하나의 고유한 MV 혈청형으로 이루어지고, 안전하며, 장기-지속성 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀진, 임의의 약독화된 백신주가 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
MV 백신은 1회 또는 2회의 저용량 주사 후에, 일생 지속되는(life-long) 면역력을 유도한다. 홍역에 대한 보호는 항체 및 CD4 및 CD8 T 세포 모두에 의해 매개된다. MV-특이적 항체 및 CD8 세포의 지속성(persistence)은 백신화 후 25년 동안인 것으로 나타났다 (7).
MV 백신은 대부분의 국가에서 대규모로 생산하기에 용이하고, 저가로 분배될 수 있다. MV 게놈의 약독화는 다수의 돌연변이의 유익한 조합에 기인하므로, 상기 백신은 매우 안정하며, 병원성으로의 전환은 관찰된 바 없다 (6).
안전성과 관련하여, MV는 세포질에서만 복제되므로, 숙주 DNA 내로의 통합 가능성을 배제시킨다. 이러한 특성은 약독화 MV 생백신을 다가 백신화 벡터(multivalent vaccination vector)로서 사용하기 위한 매력적인 후보로 만든다. 이와 같은 백신은 벡터 바이러스 자체에 대해서뿐만 아니라, 다른 병원체에 대한 장기-지속성 면역 보호를 유도하는데 효율적인 것으로 밝혀졌다.
마틴 빌레터(Martin Billeter) 및 동업자들은 에드몬스톤 MV의 안티게놈에 해당하는 cDNA를 클로닝하고, 상기 바이러스를 구제(rescue)하기 위한 최초의 효율적인 역유전학(reverse genetics) 방법을 정립하였으며 (8), 이는 국제특허출원 WO 97/06270에서 개시된다. 재조합 홍역 바이러스는, 안정하게 형질감염되고, MV N 및 P 단백질, 및 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는, 헬퍼 세포주 293-3-46로부터 회수된다. 임의의 변이체 또는 재조합체 MV의 구제를 위하여, 상기 헬퍼 세포주를 그 다음, L 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드, 및 가장 중요하게는, 후대 MV를 생성시키기에 적합한, 임의의 돌연변이 또는 재조합 안티게놈 RNA를 생산하도록 적절하게 제작된 임의의 안티게놈 플라스미드로 일시적으로 형질감염시킨다. 상기 일시적(transient) 형질감염 단계는 처음에, 바람직하게는 내재성(resident) T7 RNA 폴리머라제에 의한, 전사를 야기한다. 그로부터 얻어진 안티게놈 RNA를 즉시 (생성된 상태에서(in statu nascendi)) 바이러스 N, P 및 L 단백질로 피복시켜 안티게놈 RNP를 생성시키며, 이로부터 게놈 RNP가 생산된다. 두번째로, 상기 게놈 RNP는 부착된 L에 의해 전사되어, 모든 바이러스 mRNA 및 각각에 해당하는 단백질을 생산한다. 마지막으로, 게놈 및 안티게놈 RNP는 모두 복제에 의해 증폭된다.
상기 방법의 약간의 변형예에서, 안정적으로 형질감염된 293-3-46 헬퍼 세포를 사용하는 대신에, 원특허 개시에서 상세하게 설명된 5가지 플라스미드, N, P 및 T7 폴리머라제를 코딩하는 (앞에서 헬퍼 세포주를 생성하는데 사용된) 플라스미드, 및 L을 코딩하는 플라스미드 및 안티게놈 플라스미드를 동시에 사용하여, 상업적으로 이용가능한 293T 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. "완전한 일시적 형질감염(fully transient transfection)" 방법에서, L 단백질 및 안티게놈을 또한 발현시키기 위해 내재성 RNA 폴리머라제 Ⅱ를 대신 사용하여, 변이체 발현 플라스미드도 사용하고 이와 함께 T7 RNA 폴리머라제의 사용을 피하는 것이 가능하다는 것에 주목한다 (9).
개별 재조합 MV를 구제하기 위해, 사용되는 안티게놈 플라스미드는 MV-특이적 전사 출발 서열 및 종결 서열이 옆에 부착(flanked)됨으로써 부가적 전사 단위(additional transcription unit, ATU)를 형성하는, 이종(heterologous) 목적 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (이종 뉴클레오티드 서열)과 재조합된, 홍역 바이러스의 전장 안티게놈 (+)RNA를 코딩하는 cDNA를 포함한다. 이 MV 에드몬스톤 주 벡터는 외래 유전자의 발현을 목적으로 본래의 MV 구제 발명자들에 의해 개발되었으며 (10), 그의 큰 삽입 용량(capacity of insertion) (5 kb) 및 B형 간염 바이러스 표면 항원, 원숭이 또는 인간 면역결핍 바이러스 (SIV 또는 HIV), 볼거리(mumps) 바이러스, 및 인간 IL-12와 같은, 이식유전자(transgene)의 발현에 있어서의 높은 안정성 (11; 12)이 입증되었다. 특히, 초기에, B형 간염 바이러스 표면 및 코어 항원을 개별적으로 또는 조합하여 발현하는 재조합 홍역 바이러스가 생산되었으며, 유전자 변형 생쥐에서 체액성 면역 반응을 유도한다는 것이 밝혀졌다.
홍역 바이러스의 특성 및 특히, 높은 역가의 중화 항체를 유도하는 능력 및 장기간 지속되는 세포성 면역 반응의 강력한 유도물질(inducer)이 되는 성질에 대한 관찰로부터, 본 발명자들은 홍역 바이러스가 동물 및 보다 바람직하게는 인간 숙주에서, 바람직하게는 적어도 어느 정도 수준의 보호를 달성하기에 적합할 수 있는, 상기 말라리아 기생충에 대한 중화 항체를 유도하기 위한, P. 팔시파룸에서 유래한 항원을 발현하는 재조합 바이러스의 생산을 위한 좋은 후보일 수 있음을 제안하였다.
특히, MV 주 및 구체적으로는 백신 주는 본 발명에서, MV 면역력을 갖고 있지 않기 때문에 노출된(exposed) 영아(infant) 인구에서, 홍역 바이러스, 및 구성물질(constituent)이 상기 고안된 재조합 MV 내에서 발현되는 P. 팔시파룸 기생충 모두에 대한 면역을 유도하기 위한 후보 벡터로서 선발되었다.
그러나 성인 인구, 심지어 이미 MV 면역력을 갖는 개체들도, 본 발명의 재조합 형태 하의 MV 바이러스의 재투여는 항-MV 항체의 증폭(boost)을 초래하기 때문에, MV 재조합 면역화로부터 이익을 얻을 수 있다 (13).
본 발명은 특히, P. 팔시파룸 기생충(parasite)에서 유래한 이종 유전자를 포함하는 재조합 홍역 바이러스의 제조에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 홍역 바이러스의 유익한 면역학적 성질은, 홍역 바이러스에 대해 감수성이 있는(susceptible) 동물들 중에서 선택된 동물 모델에서 입증될 수 있으며, 상기 모델에서 이종 항원 및/또는 홍역 바이러스에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응이 측정된다. 면역 반응의 특성 규명을 위한 모델로서 사용하기에 적합한 동물들 중에, 당업자는 특히, MV에 대해 특이적인 수용체 중 하나인 CD46을 발현하는, 유전자이식 마우스를 사용할 수 있다. 가장 유력한 재조합체는 원숭이에서 시험될 수 있다.
재조합 홍역 바이러스 뉴클레오티드 서열은, 6의 배수인 총 뉴클레오티드 수를 포함해야 한다. 이러한 소위 "6의 규칙(rule of six)"의 고수는 MV에 대해서뿐만 아니라, 파라믹소비리나에(Paramyxovirinae) 아과(subfamily)에 속하는 모든 바이러스에 대한 절대적 요건이다. 명백히, 각각 6개의 뉴클레오티드와 접하는 N 단백질 분자는, 정확하게 5' 말단에서 3' 말단까지의 게놈 및 안티게놈 RNA를 포함해야 한다.
ATU의 위치는 안티게놈 cDNA를 따라 변화할 수 있다는 것에 주목한다. 따라서, 상기 언급된 MV mRNA의 자연적 발현 구배(natural expression gradient)의 이점을 취하여, 삽입된 ATU의 발현 수준은 적절한 수준까지 변화할 수 있다. 바람직한 ATU의 위치는, 각각 이종 단백질의 낮은 발현, 중등도의 발현, 및 강한 발현을 초래하는, L-유전자의 상류(upstream), M 유전자로부터의 상류 및 N 유전자의 상류이다.
말라리아 기생충
말라리아는 최근 전세계적으로, 특히 열대 및 아열대 지역에서 가장 만연하는 감염성 질환들 중 하나인 것으로 나타난다. 매년, 말라리아 감염은 전세계에 걸쳐 수억 명의 개체에서 중증의 질병을 초래하며, 개발도상국 및 신흥부상국에서 100만 내지 300만 명의, 주로 어린 영아의 사망을 야기한다. 말라리아의 광범위한 발생 및 증가된 발병률은 DDT의 광범위한 금지, 및 약제-내성(drug-resistant) 기생충 및 살충제-저항성 기생충 벡터 수의 증가에 기인한 결과이다. 다른 인자들은 환경 및 기후 변화, 민간 소요(civil disturbance) 및 인구 이동의 증가를 포함한다.
말라리아는 첨복 포자충문(phylum Alicomplexa)에서 유래한 플라스모듐 속에 속하는, 모기-매개성 헤마토프로토조안(mosquito-borne hematoprotozoan) 기생충에 기인한다. 플라스모듐 속의 4가지 종들이 인간을 감염시킨다: 말라리아 콰르타나(Malaria quartana)의 원인이 되는 플라스모듐 말라리아(P. malariae), 말라리아 테르티아나(Malaria tertiana)를 야기하는 플라스모듐 비박스(P. vivax) 및 플라스모듐 오발레(P. ovale), 및 말라리아 트로피카(Malaria tropica)의 병원체이며 거의 모든 치명적 감염의 원인인, 플라스모듐 팔시파룸. 마우스에서의 플라스모듐 요엘리이(P. yoelii) 및 플라스모듐 베르게이(P. berghei)와 같은, 다수의 다른 종들이 동물에서 질환을 초래한다.
말라리아 기생충은 여러 단계로 구성된 생활 주기를 갖는다. 각각의 단계는 상응하여 발생하는 단계-특이적 항원에 대한 특이적 면역 반응을 유도한다. 말라리아 기생충은 암컷 아노펠레스(Anopheles) 모기의 여러 종들에 의해 인간에게 전염된다. 감염된 모기는 말라리아 기생충의 "스포로조이트(sporozoite)" 형태를 포유동물 혈류 내로 주입한다. 스포로조이트는 간세포(hepatocyte)를 침입하기 전에 순환계에서 수 분 동안 잔류한다. 이 단계에서, 기생충은 세포외 환경에 위치하며, 주로 스포로조이트 표면의 주요 구성성분인 "서컴스포로조이트(circumsporozoite)" (CS) 단백질을 향한, 항체 공격에 노출된다. 간 내에 유입되면, 상기 기생충은 복제되며, 소위 "분열체(schizont)"로 성장한다. 이 분열체는 감염 세포 당 최대 20,000의 비율로 생성된다. 이 기생충의 세포내(intra-cellular) 단계 동안, 숙주 면역 반응의 주요 참가자들은 T-림프구, 특히 CD8+ T-림프구이다. 간 감염 후 약 1주일 경과시, 수천 개의 소위 "분열소체(merozoite)"가 혈류로 방출된다. 첨단막 항원 1(apical membrane antigen 1, AMAl) 및 분열소체 표면 단백질 1(merozoite surface protein 1, MSP1) 모두가 감염된 간세포로부터 발생한 분열소체 상에 존재한다; 이들은 무성 혈액-단계 분열소체(asexual blood-stage merozoite)의 필수 구성성분으로, 적혈구 침투의 원인이 된다. 적혈구 내로 들어가면, 이들은 항체-매개성 면역 반응 및 T-세포 분비 사이토카인의 표적이 된다. 적혈구로 침투한 후, 분열소체는 여러 복제 단계를 거치며, 소위 "영양체(trophozoite)"를 생성시키고, 및 새로운 적혈구를 감염시킬 수 있는 분열체 및 분열소체를 생성한다. 제한된 양의 영양체가 기생충의 유성 단계를 구성하는, "생식모세포(gametocyte)"로 진화할 수 있다. 감수성 있는 모기가 적혈구를 섭취한 경우, 생식모세포는 적혈구로부터 방출되며, 여러 개의 숫생식모세포(male gametocyte) 및 하나의 암생식모세포(female gametocyte)를 생성시킨다. 이 생식모세포들의 수정은 접합체(zygote) 생성 및 운동접합체(ookinete)로의 후속적 변화, 그 다음 접합자낭(oocyst) 및 최종적으로 타액선 스포로조이트로의 변화를 초래한다, 생식모세포 단계-특이적 표면 항원에 대한 표적화 항체는 모기 중장(mid gut) 내에서의 이 주기를 차단시킬 수 있다. 그와 같은 항체는 포유동물 숙주를 보호하지는 않을 것이나, 감염된 모기의 수 및 그의 기생생물 적재량(parasite load)을 감소시킴으로써 말라리아 전염을 감소시킬 것이다.
MSP-1은 190-200 kDa (d-190) 전구체로서 합성되며, 이는 분열생식(schizogony) 동안 단백질 분해에 의해(proteolytically) 가공되어 83, 30, 38 및 42 kD (d-42)의 절편을 생성한다 (14). 적혈구 침투 시기에, 상기 42-kDa은 추가적으로 절단되어, 복합체의 나머지와 함께 탈락(shed)되는 33 kDa 절편, 및 침투 중에 분열소체 막에 결합된 상태로 존재하는, 2개의 상피 증식 인자 (EGF)-유사 도메인을 포함하는 19 kDa 절편을 생산한다. 이러한 이차적 절단은 성공적인 적혈구 침투를 위한 전제 조건이다 (15).
MSP-1은 Kl 및 MAD20 프로토타입(prototype)을 특징으로 하는 이형태성 대립유전자(dimorphic allele) 내에서 높은 보존을 나타내는, 본질적인 이형태성 단백질이다.
AMA-1 (16)은 시토졸 영역 (50 aa), 막통과(transmembrane) 영역, 및 엑토도메인(ectodomain)에 조직화되어 있는, 플라스모듐 팔시파룸에서의 622 aa를 포함한 (PfAMA-1) 제I형 막관통 단백질로서, N-말단 프로시퀀스(pro-sequence) 및 3개의 도메인(DI, DⅡ, DⅢ)으로서 폴딩한다. 상기 단백질의 발현은 후기 분열생식에서 최대이다: AMA-1의 전구체(83 kDa)는 단백질 분해에 의해 가공되어, 프로시퀀스를 절단시켜 상기 단백질을 분열소체의 재분배(relocalization)를 가능하게 하는 66 kDa 형으로 전환시킨다. 항체는 DI 및 DⅡ를 주로 인식하고, 여러 대립유전자 변이체들과 동등하게 잘 반응하는 것으로 보인다. DⅢ에 대한 항체 반응은 일반적으로 낮으며, 그 수준은 성인에서 증가한다 (17, 18).
PfAMA-1은 64개의 다형성 위치(polymorphic position) (프로시퀀스에 9개, 엑토도메인에 52개, 시토졸 영역에 3개)를 포함하며, 이들 중 대부분은 이형태성이고, 숙주 면역 반응을 위한 중요한 에피토프이다. PfAMA-1에 기반한 백신을 개발하기 위해, 다형성을 포괄하는 것이 중요하다: 다양성 커버링(DiCo 1, 2 및 3) PfAMA-1은 가능한 최대의 범위에서, PfAMA-1 엑토도메인의 자연발생적(naturally occurring) 다형성을 나타내는 인공 서열이다. 이들은 다양한 PfAMA-1 대립유전자를 운반하는 광범위한 기생충에 대해 작용하는 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 이 접근법은 광범위한 천연 PfAMA1 대립유전자에 대해 강력하고 기능적인 보호가 유도될 수 있도록, PfAMA1를 표적화하는 백신을 생산하는 수단을 제공할 수 있다 (19).
CS 단백질 (CSP)은 약 420 aa 및 58 kDa의 분자량을 가진다. 상기 단백질은 스포로조이트의 주요 표면 단백질을 나타낸다: 그의 기능은 접합자낭(oocystis)에서 스포로조이트로의 성숙 및 간세포 침투에 필수적이며, 양전하로 하전된 아미노산의 보존 모티프(conserved motif)로부터 매개된다. CSP는 5' 및 3' 말단의 두 개의 비-반복성(non-repetitive) 영역, 및 CSP 내의 주된 에피토프를 나타내는, 4개-잔기-길이를 갖는 모티프의 다중 반복으로 이루어진 가변적인 종-특이적 중심 영역(species-specific central region)으로 조직된다. CSP는 분열생식의 적어도 처음 3일 동안 검출가능한 상태로 지속되기 때문에, 세포외 스포로조이트에 대한 항체-매개성 면역 반응, 및 분열체에 대한 세포-매개성 면역 반응 모두에 대한, 매력적인 백신 표적으로 고려된다 (20).
말라리아 백신 개발을 위한 현재의 접근법은 전술된 바와 같은, 기생충이 존재할 수 있는 상이한 단계에 따라 분류될 수 있다.
3가지의 가능한 백신 형태가 구별될 수 있다: i) 스포로조이트 및/또는 분열체-감염 세포에 대한, 전-적혈구성 백신(pre-erythrocytic vaccine). 이 백신 형태는 주로 CS에 기반하고, 이상적으로는 체액성 및 세포성 면역 반응에 의해 매개되는, 멸균(sterile) 면역을 부여하여, 말라리아 감염을 예방해야 한다; ii) 분열소체-감염 세포에 대한 무성적 혈액-단계 백신(asexual blood-stage vaccine): MSPl 및 AMAl은 임상적 중증도를 최소화하도록 고안된, 대표적인 말라리아 백신 후보이다. 이 백신들은 이환율 및 사망율을 감소시켜야 하고, 기생충이 적혈구 내에 유입 및/또는 성장하는 것을 방지하도록 의도된다; ⅲ) 모기 숙주에서 기생충 성장을 저해하도록 고안된, 감염-저해 백신(transmission-blocking vaccine); 이 백신 유형은 전집단(population-wide) 말라리아 감염률의 감소를 초래해야 한다. 이 백신들 다음으로, 기생충 생활 주기 중 다수의 단계를 표적화하는 말라리아 백신의 개발 가능성이 소위 다성분 및/또는 다단계 백신에 있어서 지향되어 왔다.
오늘날의 세계적 말라리아 백신 포트폴리오는 47개의 새로운 백신 후보, 즉 전임상 개발 중인 31개, 임상 시험에서 좁혀진 16개로서 유망해 보인다. 이들 중 하나인, RTS,S 백신은 GSK Biologicals에 의해 개발되었으며, PATH-MVI은 2008년에 최종 Ⅲ상 임상시험에 들어가야 한다. 다른 흥미로운 백신 후보들은 국제특허출원 US2006127413에 개시된 변형된 백시니아 앙카라(Modified Vaccinia Ankara (MVA), 폭스바이러스(poxvirus) (US6214353, AU7060294, AU1668197, WO9428930, 및 US5756101), 아데노바이러스 (US2007071726, US2005265974, US2007088156 및 CA2507915), 저온-적응(cold-adapted) 약독화된 인플루엔자 바이러스와 같은, 살아있는 재조합 바이러스에 기반한 백신, 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 사카로미세스 종과 같은 효모, 또는 살모넬라 종 (US5112749) 및 대장균 (EBO 191748)과 같은 박테리아 발현 시스템에 기반한 백신이다 (22). 말라리아에 대한 백신의 개발은 30년보다 이전에 시작되었음에도 불구하고, 현재로서 상업적 이용가능성이 있는 말라리아 백신은 존재하지 않는다. 다수의 인자들이 말라리아 백신 개발을 어렵고 난해하게 만든다. 첫째, 기생충의 크기 및 유전적 복잡성은 각각의 감염이 인간 면역계로 수천 개의 항원을 제시한다는 것을 의미한다. 이들 중 어떤 항원이 백신 개발에 유용한 표적이 될 수 있는지를 이해하는 것은 복잡했으며, 지금까지 40개 이상의 상이한 유력한 항원들이 규명되어 왔다. 둘째, 상기 기생충은 심지어 인간 숙주 내에서도 여러 생활 단계를 통해 변화하며, 생활 주기의 각각의 단계에서, 상이한 분자들의 아집단을 면역계에 제시한다. 셋째, 상기 기생충은 인간 면역계를 혼란시키고, 가리고(hide), 호도(misdirect)할 수 있도록 하는 일련의 전략을 발달시켰다. 마지막으로, 상이한 종 뿐 아니라, 상이한 주에 해당하는, 복수의 말라리아 감염을 동시에 가질 수 있다.
따라서, 본 발명은 여러 플라스모듐 팔시파룸 항원을 코딩하는 이종 핵산을 포함하는, 상이한 약독화 재조합 홍역-말라리아 벡터를 함유한 홍역-말라리아 조합 백신을 제공함으로써, 종래기술의 장기간 동안 있어온 요구를 충족시킨다.
본 발명의 일 구체예에서, 홍역 및 말라리아 모두에 대한 면역 반응 및 보호를 유도한 수 있는 말라리아 항원을 발현하는, 재조합 홍역 백신 바이러스를 포함하는 홍역-말라리아 조합 백신을 제공한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 MSP1 말라리아 항원을 발현하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 홍역 백신 바이러스를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 재조합 홍역 백신 바이러스는 3D7 및 FCB1 주에서 유래한, 결합된 형태 및 분비된 형태의 말라리아 항원 dl90 또는 d83-30-38 또는 d42를 발현하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 다양성 커버링(DiCo) AMA1 말라리아 항원을 발현하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 홍역 백신 바이러스를 제공한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 CS 말라리아 항원을 발현하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, 재조합 홍역 백신 바이러스를 제공한다.
도 1: 홍역 바이러스의 안티게놈 DNA p(+)MV-EZ의 개략도(schematic representation). p(+)MV-EZ는 각각 위치 1 (홍역 바이러스의 N 유전자 전), 2 (홍역 바이러스의 P 유전자와 M 유전자 사이) 및 3 (홍역 바이러스의 H 유전자와 L 유전자 사이)에 3개의 ATU를 포함하고, 간염 델타 리보자임(hepatitis delta ribozyme) 및 T7 RNA 폴리머라제 터미네이터 (δ T7t)에 의해 정확하게 종결되는, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 (T7)의 제어를 받는, 홍역 바이러스의 완전한 서열을 포함하는 pBluescript에서 유래된 플라스미드 (에드몬스톤 자그렙)이다. 플라스미드의 크기는 18941 bp이다.
도 2: 3D7 주에서 유래한 MSP-1 합성 유전자 (d-190)의 개략도. d-190 유전자 절편(d-83-30-38 및 d-42)의 인접 영역(flanking region) 상의 코딩 뉴클레오티드 및 그에 해당하는 아미노산이 제시된다. 클로닝 과정을 위해 부가된 고유 제한 부위가 유색으로 표시되어 있다; SP: 시그널 펩티드; GPI: 막-결합 영역을 코딩하는, 글리코실-포스파티딜-이노시톨 서열.
도 3: FCB1 주에서 유래한 MSP-1 합성 유전자 (d-190)의 개략도. d-190 유전자 절편(d-83-30-38 및 d-42)의 인접 영역 상의 코딩 뉴클레오티드 및 그에 해당하는 아미노산이 제시된다. 클로닝 과정을 위해 부가된 고유 제한 부위가 유색으로 표시되어 있다; SP: 시그널 펩티드; GPI: 막-결합 영역을 코딩하는, 글리코실-포스파티딜-이노시톨 서열. SP 및 GPI 영역은 3D7 주에서 유래한다.
도 4: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV2-EZ-dl90-3D7의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 2에 클로닝된, 단백질의 GPI-결합 형태를 코딩하는 d-190 말라리아 유전자 (3D7 주), 5253 bp를 포함하는, p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 24323 bp이다.
도 5: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드, p(+)MV2-EZ-dl90*-3D7의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 게놈의 위치 2에 클로닝된, 단백질의 분비된 형태를 코딩하는 dl90* 말라리아 유전자 (3D7 주), 5160 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 24227 bp이다.
도 6: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드, p(+)MV3-EZ-dl90-3D7 또는 p(+)MV3-EZ-dl90*-3D7의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 게놈의 위치 3에 클로닝된, 단백질의 GPI-결합 형태를 코딩하는 d-190 말라리아 유전자 (3D7 주), 5253 bp, 또는 단백질의 분비된 형태를 코딩하는 dl90* 말라리아 유전자 (3D7 주), 5160 bp를 포함하는, p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드 p(+)MV3-EZ-dl90은 24323 bp이고, p(+)MV3-EZ-dl90* 은 24227 bp이다.
도 7: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV2-EZ-d83-30-8-3D7의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 2에 클로닝된, 단백질의 GPI-결합 형태를 코딩하는 d-83-30-38 말라리아 유전자 (3D7 주), 4122 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 23195 bp이다.
도 8: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV2-EZ-d83-30-38*-3D7의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 2에 클로닝된, 단백질의 분비된 형태를 코딩하는 d-83-30-38* 말라리아 유전자 (3D7 주), 4029 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 23105 bp이다.
도 9: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드, p(+)MV3-EZ-d83-30-38-3D7 또는 p(+)MV3-EZ-d83-30-38*-3D7의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 게놈의 위치 3에 클로닝된, 단백질의 GPI-결합 형태를 코딩하는 d-83-30-38 말라리아 유전자 (3D7 주), 4122 bp, 또는 단백질의 분비된 형태를 코딩하는 d-83-30-38* 유전자 (3D7 주), 4029 bp를 포함하는, p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드 p(+)MV3-EZ-d83-30-38은 23195 bp이고, p(+)MV3-EZ-d83-30-38*은 23105 bp이다.
도 10: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV2-EZ-d42-3D7의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 2에 클로닝된, 단백질의 GPI-결합 형태를 코딩하는 d-42 말라리아 유전자 (3D7 주), 1347 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 20417 bp이다.
도 11: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV2-EZ-d42*-3D7의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 2에 클로닝된, 단백질의 분비된 형태를 코딩하는 d-42* 말라리아 유전자 (3D7 주), 1254 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 20345 bp이다.
도 12: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드, p(+)MV3-EZ-d42-3D7 또는 p(+)MV3-EZ-d42*-3D7의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 게놈의 위치 3에 클로닝된, 단백질의 GPI-결합 형태를 코딩하는 d-42 말라리아 유전자 (3D7 주), 1347 bp, 또는 단백질의 분비된 형태를 코딩하는 d-42* 말라리아 유전자 (3D7 주), 1254 bp를 포함하는, p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드 p(+)MV3-EZ-d42은 20417 bp이고, p(+)MV3-EZ-d42*은 20345 bp이다.
도 13: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV2-EZ-dl90-FCBl의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 2에 클로닝된, 단백질의 GPI-결합 형태를 코딩하는 d-190 말라리아 유전자 (FCB1 주), 5013 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 24083 bp이다.
도 14: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV3-EZ-dl90-FCBl의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 3에 클로닝된, 단백질의 GPI-결합 형태를 코딩하는 d-190 말라리아 유전자 (FCB1 주), 5013 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 24083 bp이다.
도 15: CS 합성 유전자의 개략도. CS 유전자의 인접 영역 상의 코딩 뉴클레오티드 및 그에 해당하는 아미노산이 제시된다. 클로닝 과정을 위해 부가된 고유 제한 부위는 색으로 표시된다.
도 16: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV2-EZ-CS의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 2에 클로닝된, CS 유전자, 1119 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 20219 bp이다.
도 17: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV3-EZ-CS의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 3에 클로닝된, CS 유전자, 1119 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 20219 bp이다.
도 18: DiCo-1 완전(complete) 합성 유전자의 개략도. DiCo1 완전 유전자 도메인 (엑토 및 트랜스-시토(trans-cyto))의 인접 영역 상의 코딩 뉴클레오티드 및 그에 해당하는 아미노산이 표시된다. 클로닝 과정을 위해 부가된 고유 제한 부위가 색으로 표시된다; SP; 시그널 펩티드 인간 코돈 최적화(signal peptide human codon optimised).
도 19: DiCo-1 엑토 합성 유전자의 개략도. DiCo1 엑토 도메인의 인접 영역 상의 코딩 뉴클레오티드 및 그에 해당하는 아미노산이 표시된다. 클로닝 과정을 위해 부가된 고유 제한 부위가 색으로 표시된다; SP: 시그널 펩티드 (인간 코돈 최적화).
도 20: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV2-EZ-DiCol-완전체(complete)의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 2에 클로닝된, 단백질의 막관통 형태를 코딩하는 DiCo1 완전 유전자, 1689 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 20753 bp이다.
도 21: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV3-EZ-DiCol-완전체의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 3에 클로닝된, 단백질의 막관통 형태를 코딩하는 DiCo1 완전 유전자, 1689 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 20753 bp이다.
도 22: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV2-EZ-DiCol-엑토의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 2에 클로닝된, 단백질의 분비된 형태를 코딩하는 DiCo1 엑토 유전자, 1458 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 20525 bp이다.
도 23: 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 p(+)MV3-EZ-DiCol-엑토의 개략도. 이는 SgrAI-BssHII 절단에 의해 홍역 바이러스 게놈의 위치 3에 클로닝된, 단백질의 분비된 형태를 코딩하는 DiCo1 엑토 유전자, 1458 bp를 포함하는 p(+)MV-EZ에서 유래한 플라스미드이다. 재조합 플라스미드의 크기는 20525 bp이다.
도 24: p(+)MV2EZ-GFP의 완전 뉴클레오티드 서열. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 592-608 T7 프로모터
- 609-17354 MV 에드모스톤 자그렙 안티게놈
- 4049-4054 MluI 제한 부위
- 4060-4067 SgrAI 제한 부위
- 4079-4084 BssHII 제한 부위
- 4085-4801 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP) ORF
- 4805-4810 BssHII 제한 부위
- 4817-4822 AaflI 제한 부위
- 17355-17580 HDV 리보자임 및 T7 터미네이터
도 25: p(+)MV3EZ-GFP의 완전 뉴클레오티드 서열. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 592-608 T7 프로모터
- 609-17359 MV 에드모스톤 자그렙 안티게놈
- 9851-9856 MluI 제한 부위
- 9862-9869 SgrAI 제한 부위
- 9886-9891 BssHII 제한 부위
- 9892-10608 녹색 형광 단백질 (GFP) ORF
- 10612-10617 BssHII 제한 부위
- 10624-10629 AaflI 제한 부위
- 17360-17585 HDV 리보자임 및 T7 터미네이터
도 26: ANlOlTE: 이는 본 발명자들에 의해 클로닝된 MSPl d-190 3D7 서열 ORF이다. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 1-3 시작 코돈
- 4-99 d-1903D7 시그널 펩티드
- 100-105 BamHl 제한 부위
- 4014-4020 BstEII 제한 부위
- 5152-5157 AclI 제한 부위
- 5158-5250 GPI 서열
- 5251-5253 STOP 코돈
도 27: AN102TE: 이는 본 발명자들에 의해 클로닝된 MSPl d-190* 3D7 서열 ORF이다. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 1-3 시작 코돈
- 4-99 d-190*3D7 시그널 펩티드
- 100-105 BamHI 제한 부위
- 4014-4020 BstEII 제한 부위
- 5152-5157 AclI 제한 부위
- 5158-5160 STOP 코돈
도 28: AN103TE: 이는 본 발명자들에 의해 클로닝된 MSPl d-83-30-38 3D7 서열 ORF이다. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 1-3 시작 코돈
- 4-99 d-83-30-38 3D7 시그널 펩티드
- 100-105 BamHI 제한 부위
- 4014-4020 BstEII 제한 부위
- 4021-4026 AclI 제한 부위
- 4027-4119 GPI 서열
- 4120-4122 STOP 코돈
도 29: AN104TE: 이는 본 발명자들에 의해 클로닝된 MSPl d-83-30-38* 3D7 서열 ORF이다. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 1-3 시작 코돈
- 4-99 d-83-30-38* 3D7 시그널 펩티드
- 100-105 BamHI 제한 부위
- 4014-4020 BstEII 제한 부위
- 4027-4029 STOP 코돈
도 30: AN105TE: 이는 본 발명자들에 의해 클로닝된 MSPl d-42 3D7 서열 ORF이다. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 1-3 시작 코돈
- 4-99 d-42 3D7 시그널 펩티드
- 100-105 BamHI 제한 부위
- 108-114 BstEII 제한 부위
- 1246-1251 AclI 제한 부위
- 1252-1344 GPI 서열
- 1345-1347 STOP 코돈
도 31: AN106TE: 이는 본 발명자들에 의해 클로닝된 MSPl d-42* 3D7 서열 ORF이다. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 1-3 시작 코돈
- 4-99 d-42* 3D7 시그널 펩티드
- 100-105 BamHI 제한 부위
- 108-114 BstEII 제한 부위
- 1246-1251 AclI 제한 부위
- 1252-1254 STOP 코돈
도 32: AN107TE: 이는 본 발명자들에 의해 클로닝된 MSPl d-190 FCBl 서열 ORF이다. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 1-3 시작 코돈
- 4-99 d-190 FCBl 시그널 펩티드
- 100-105 BamHI 제한 부위
- 146-151 HindIII 제한 부위
- 3825-3831 BstEII 제한 부위
- 4912-4917 AclI 제한 부위
- 4918-5010 GPI 서열
- 5011-5013 STOP 코돈
도 33: AN108TE: 이는 본 발명자들에 의해 클로닝된 CS 서열이다. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 1-3 시작 코돈
- 4-1116 CS 서열
- 1117-1119 STOP 코돈
도 34: AN109TE: 이는 본 발명자들에 의해 클로닝된 DiCo 1 완전 서열 ORF이다. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 1-3 시작 코돈
- 4-99 DiCo 1 완전 시그널 펩티드
- 100-105 BamHI 제한 부위
- 106-1686 DiCo 1 완전 서열 ORF
- 1687-1689 STOP 코돈
도 35: ANl1OTE: 이는 본 발명자들에 의해 클로닝된 DiCo 1 엑토 서열 ORF이다. 상기 서열은 뉴클레오티드의 위치와 관련하여 하기와 같이 기술될 수 있다:
- 1-3 시작 코돈
- 4-99 DiCo 1 엑토 시그널 펩티드
- 100-105 BamHI 제한 부위
- 106-1455 DiCo 1 엑토 서열 ORF
- 1456-1458 STOP 코돈
도 36: 재조합 홍역-p-42 말라리아 바이러스 MV 바이러스 백신으로 감염시킨 후 베로(Vero) 세포에서 생성된 비교 세포병변 효과
도 37: 홍역 벡터 (MV3EZ-d-42 SgrAI)의 위치 3으로 삽입된 d-42 3D7 이식유전자의 발현. 빈(empty) 홍역 벡터 (MVEZ) 및 음성 대조군 (MV3L1, 재조합 MV-파필로마 바이러스)에 대한 웨스턴 블롯에 의해 분석된 1, 5 및 10 계대(passage)로부터 얻은 세포 용해물.
도 38: 빈 홍역 벡터(MVEZ) 및 음성 대조군 (MV2EZL1, 재조합 MV-파필로마 바이러스)과 비교한, 면역형광법(immunofluorescence)에 의해 분석된 홍역 벡터의 위치 3 (MV3EZ-d-42 SgrAI)으로 삽입된 d-42 3D7 이식유전자의 발현. 화살표는 면역염색 전과 후에 광학 현미경을 사용하여 관찰된 동일한 신시티움(syncythium)를 가리킨다.
도 39: MV 바이러스 백신과 비교한, 재조합 홍역-p-42 말라리아 바이러스의 생장 속도 곡선(Growth kinetics curve).
도 40: 홍역 벡터의 위치 2 및 3 (MV2 -3EZ-d-190 SgrAI FCBl)으로 삽입된 d-190 FCBl 이식유전자의 발현. 빈 홍역 벡터(MVEZ) 및 음성 대조군 (MV2EZL1, 재조합 MV-파필로마 바이러스)에 대한 웨스턴 블롯에 의해 분석된 세포 용해물.
도 41: MV 바이러스 백신과 비교한, 재조합 홍역-p-190-FCB1 말라리아 바이러스의 생장 속도 곡선.
본 발명의 목적은 플라스모듐 팔시파륨의, 분비된 형태 또는 표면 결합된 형태의, CS, MSP-1 또는 그의 부분 단편(partial section) 및 AMA-1 또는 부분 단편을 코딩하는, 안정적으로 통합된(integrated) DNA 서열을 함유할 수 있는 재조합 홍역 벡터로부터 홍역-말라리아 조합 백신을 생산하는 것이다.
본 발명은 또한 감수성 있는 유전자이식 마우스, 원숭이 및 인간 숙주에서, 감염, 복제 및 PfCS, PfMSP-l 및 PfAMA-1 항원의 발현이 가능한, 재조합 MV-말라리아 바이러스의 구제를 포함할 것이다.
또한, 본 발명은 동일한 벡터 내에 두 개의 상이한 항원이 동시에 클로닝 및 발현되어 두 항원 모두에 대한 면역력을 부여하는, 다가(multivalent) 재조합 홍역-말라리아 벡터의 제작(construction)을 포함하는 것으로 의도된다.
또한, 본 발명은 3개의 상이한 재조합 홍역-말라리아 바이러스의 조합에 관한 것으로, 각각은 기생충의 생활 주기의 상이한 단계에 대한 숙주 내에서의 면역 반응을 유도하도록, 상이한 유전자를 운반하고 상이한 항원을 발현시킨다.
또한, 본 발명은 결손 간섭 입자(defective interfering particle, DI)가 포함되지 않은, 재조합 홍역-말라리아 바이러스를 생산하는 방법을 포함한다. 상기 DI는 모든 생산 시스템에서 바이러스의 생장을 현저하게 저해하고, 인간 개체에서 면역 반응을 성공적으로 억제하는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명은 그와 같은 재조합 바이러스를 포함하는 백신을 제조하는 방법을 포함한다.
하기 실시예들은 본 발명을 수행하는 바람직한 방식을 설명한다. 이 실시예들은 예시를 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 재조합 MV - PfMSP -1 플라스미드의 제작
모든 클로닝 과정은 샘부르크 등 (1989)에 개시된 기법에 따라 이루어졌다.
모든 제한 효소는 New England BioLabs으로부터 입수했으며; 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머 및 DNA 폴리링커는 Invitrogen으로부터 입수했다.
분비된 형태 및 결합된 형태의, PfMSP1 및 그의 절편 (d-83-30-38 및 d-42)들을 화학적으로 합성하였으며, 인간 코돈 최적화시켰다. 이들을 pZE21MV 매개(intermediate) 벡터 내에 클로닝하고, 5' 말단에 SgrAI 클로닝 부위를 첨가하고, 뒤이어 최적화된 Kozak 서열 (TCATCA)을 첨가함으로써 약간 변형시켰다. 이러한 변형을 MWG Biotech에서 서열분석에 의해 확인하였다.
MAD20 프로토타입에 속하는 3D7 주 및 K1 프로토타입에 속하는 FCB1 주에서 유래한, GPI-결합 형태 및 분비된(*) 형태의, 재조합 MV-PfMSP-1 플라스미드의 목록:
p(+)MV2EZ-d-190-SgrAI (3D7)
p(+)MV3EZ-d-190-SgrAI (3D7)
p(+)MV2EZ-d-83-30-38-SgrAI (3D7)
p(+)MV3EZ-d-83-30-38-SgrAI (3D7)
p(+)MV2EZ-d-42-SgrAI (3D7)
p(+)MV3EZ-d-42-SgrAI (3D7)
p(+)MV2EZ-d-190*-SgrAI (3D7)
p(+)MV3EZ-d-190*-SgrAI (3D7)
p(+)MV2EZ-d-83-30-38*-SgrAI (3D7)
p(+)MV3EZ-d-83-30-38*-SgrAI (3D7)
p(+)MV2EZ-d-42*-SgrAI (3D7)
p(+)MV3EZ-d-42*-SgrAI (3D7)
p(+)MV2EZ-d-190-SgrAI (FCBl)
p(+)MV3EZ-d-190-SgrAI (FCBl)
1a) p(+)MV2EZ-d-190-SgrAI (3D7, 24323 bp) 및 p(+)MV3EZ-d-190-SgrAI (3D7, 24323 bp)의 제작.
녹색 형광 단백질 (GFP)를 포함하는 l ㎍의 MV 플라스미드 (p(+)MV2-3EZ-GFP 베르나(Berna) 주, 19774 bp: 도 24 및 25)를 50 ㎕ 최종 부피에서 1 유닛(unit)의 SgrAI 및 BssHII 제한 효소 모두를 사용하여, 이들의 최적 온도에서 2시간 동안 절단(digest)시켰다. 절단된 DNA 전체를 1% 아가로오스 겔에 로딩하고, 약 2시간 동안 80 볼트로 전개시켰다. 그 다음, 적절한 밴드(19048 bp)를 겔로부터 잘라내고, QIAEX 겔 정제에 의해 정제하고, 260 nm에서의 흡광도에 의해 DNA 농도를 계산하고, 1 ㎍/mL로 조정하였다.
매개 플라스미드 (pZE21 MV-d-190 SgrAI, 7564 bp) 내로 삽입된, l ㎍의 d-190 유전자를, 50 ㎕의 최종 부피에서, 최적 온도에서 2시간 동안 SgrAI 및 BssHI 절단 (각각의 효소 1 유닛)에 의해 빼냈다. 절단된 DNA 전체를 1% 아가로오스 겔에 로딩하고, 약 2시간 동안 80 볼트로 작동시켰다. 그 다음, 적절한 밴드 (5275 bp)를 겔로부터 잘라내고, QIAEX 겔 정제 키트에 의해 정제하고, 260 nm에서의 흡광도에 의해 DNA 농도를 계산하고, 1 ㎍/mL로 조정하였다.
따라서, 벡터 (MV DNA: 도 1) 및 삽입체(insert) (d-190 DNA: 도 2)를, 100 ㎕의 최종 부피에서, 1 유닛의 T4 DNA 리가아제 및 그의 고유(own) 반응 완충액을 사용하여, 16 ℃에서 밤새 동몰비(equimolar ratio)로 연결(ligate)시켰다.
XL10 Gold 화학적 반응능 세포(chemical competent cell)를 표준 형질전환 프로토콜 (Sambrook 등, 1989)에 따라 전체 연결 용량(all ligation volume)를 사용하여 형질전환시키고, LB-아가 플레이트에 도포(plate)하고, 암피실린 저항성에 대해 선별하였다. DNA 플라스미드 제조 (QIAGEN, 미니(mini)- 미디(midi) 및 맥시(maxi) 키트) 및 제한 효소 절단에 의해 콜로니를 스크리닝하였다. 올바른 클론을 서열분석을 위해 MWG로 보냈다: DNA 스트리더(DNA Strider) 소프트웨어를 사용하여 추정 서열과 함께 배열된(ligned) 상기 서열은, 100% 동일성을 나타냈다.
MV 벡터의 위치 2에 삽입된 (SgrAI, pos. 4060, 및 BssHII, pos. 9335) d-190-3D7 유전자가 도 4에 제시되며, 그의 오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame, ORF)을 도 26에 나열하였다.
MV 벡터의 위치 3에 삽입된 (SgrAI, pos. 9862, 및 BssHII, pos. 15137) d-190-3D7 유전자가 도 6에 제시된다.
재조합 홍역-말라리아 플라스미드의 게놈 길이 (ACC, pos. 609로부터 GGT, pos. 21884까지)는 6의 배수이며, 이는 재조합 MV2 -3-d-190-3D7 바이러스의 구제를 가능하게 한다.
1b) p(+)MV2EZ-d-83-30-38-SgrAI (3D7, 23195 bp) 및 p(+)MV3EZ-d-83-30-38-SgrAI (3D7, 23195 bp)의 제작.
홍역 벡터를 실시예 3a에 상술된 바와 같이 제조하였다.
pZE21MV-d-190 SgrAI를 BstEII-AclI으로 절단시켜, d-42 절편을 잘라냈다; 접착성(cohesive) BstEII 및 AclI 말단을 갖는 폴리링커(polylinker)를 연결시켜, 매개 플라스미드 pZE21MV-d-83-30-38-SgrAI (6436 bp)를 얻었다.
폴리링커의 서열은 다음과 같았다: 5'-GTCACCAGCGGCCGCAA-3'. l ㎍의 pZE21MV-d-83-30-38 SgrAI를 50 ㎕의 최종 부피에서, 각 효소의 최적 온도에서 2시간 동안, SgrAI-BssHII (각각의 효소 1 유닛) 절단시켰다. 절단된 모든 DNA를 1% 아가로오스 겔에 로딩하고, 약 2시간 동안 80볼트에서 작동시켰다. 그 다음, 적절한 밴드(4147bp)를 겔로부터 잘라내고, QIAEX 겔 정제 키트에 의해 정제하고, 260 nm에서의 흡광도에 의해 DNA 농도를 계산하고, 1□㎍/mL로 조정하였다.
따라서, 벡터 (MV DNA: 도 1) 및 삽입체 (d-83-30-38 DNA: 도 2)를, 100 ㎕의 최종 부피에서, 1 유닛의 T4 DNA 리가아제 및 그의 고유 반응 완충액을 사용하여 16 ℃에서 밤새 동몰비로 연결시켰다.
XL10 Gold 화학적 반응능 세포를 표준 형질전환 프로토콜 (Sambrook 등, 1989)에 따라 전체 연결 용량를 사용하여 형질전환시키고, LB-아가 플레이트에 도포하고, 암피실린 저항성에 대해 선별하였다. DNA 플라스미드 제조 (QIAGEN, 미니- 미디 및 맥시 키트) 및 제한 효소 절단에 의해 콜로니를 스크리닝하였다.
올바른 클론들을 서열분석을 위해 MWG로 보냈다: DNA 스트리더 소프트웨어를 사용하여 추정 서열들과 함께 배열된 상기 서열들은, 100% 동일성을 나타냈다.
MV 벡터의 위치 2에 삽입된 (SgrAI, pos. 4060, 및 BssHII, pos. 8207) d-83-30-38-3D7 유전자가 도 7에 제시되며, 그의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 도 28에 나열되어 있다.
MV 벡터의 위치 3에 삽입된 (SgrAI, pos. 9862 및 BssHII, pos. 14006) d-83-30-38-3D7 유전자가 도 9에 제시된다.
재조합 홍역-말라리아 플라스미드의 게놈 길이 (ACC, pos. 609로부터 GGT, pos. 20756까지)는 6의 배수이며, 이는 재조합 MV2 -3-d-83-30-38-3D7 바이러스의 구제를 가능하게 한다.
1c) p(+)MV2EZ-d-42-SgrAI (3D7, 20417bp) 및 p(+)MV3EZ-d-42-SgrAI (3D7, 20417 bp)의 제작
홍역 벡터를 실시예 3a에서 상술된 바와 같이 제조하였다.
매개 플라스미드 (pZE21MV-d-42 SgrAl, 3658 bp)에 삽입된 l ㎍의 d-42 유전자를, 50 ㎕의 최종 부피에서, 2시간 동안 각 효소의 최적 온도에서 SgrAI-BssHII 절단(각각의 효소 1 유닛)에 의해 잘라냈다. 절단된 모든 DNA를 1% 아가로오스 겔에 로딩하고, 약 2시간 동안 80볼트에서 작동시켰다. 그 다음, 적절한 밴드(1369 bp)를 겔로부터 잘라내고, QIAEX 겔 정제 키트에 의해 정제하고, 260 nm에서의 흡광도에 의해 DNA 농도를 계산하고, 1□㎍/mL로 조정하였다.
따라서, 벡터 (MV DNA: 도 1) 및 삽입체 (d-42 DNA: 도 2)를, 10□ ㎕의 최종 부피에서 1 유닛의 T4 DNA 리가아제 및 그의 고유 반응 완충액을 사용하여 16 ℃에서 밤새 동몰비로 연결시켰다.
XL10 Gold 화학적 반응능 세포를 표준 형질전환 프로토콜 (Sambrook 등, 1989)에 따라, 전체 연결 용량으로 형질전환시키고, 암피실린 저항성을 위해 LB-아가 플레이트에 도포 및 선별하였다. DNA 플라스미드 제조 (QIAGEN, 미니- 미디 및 맥시 키트) 및 제한 효소 절단에 의해 콜로니를 스크리닝하였다.
올바른 클론들을 서열분석을 위해 MWG로 보냈다: DNA 스트리더 소프트웨어를 사용하여 추정 서열들과 함께 배열된 상기 서열들은, 100% 동일성을 나타냈다.
MV 벡터의 위치 2에 삽입된 (SgrAI, pos. 4060, 및 BssHII, pos. 5429) d-42-3D7 유전자가 도 10에 제시되며, 그의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 도 30에 나열되어 있다.
MV 벡터의 위치 3에 삽입된 (SgrAI, pos. 9862 및 BssHII, pos. 11231) d-42 -3D7 유전자가 도 12에 제시된다.
재조합 홍역-말라리아 플라스미드의 게놈 길이 (ACC, pos. 609로부터 GGT, pos. 17978까지)는 6의 배수이며, 이는 재조합 MV2 -3-d-42-3D7 바이러스의 구제를 가능하게 한다.
재조합 홍역-p-42 말라리아 바이러스 및 MV 백신은 유사한 세포병변 효과를 유도하였다 (도 36). 이식유전자는 상당히 안정하게 발현된다: 그의 발현은 하나의 최초 구제 클론으로부터 인간 이배체 세포 MRC5에서의 10회의 연속적 바이러스 계대감염(virus passage) 후 유래한, 분석된 모든 후대 클론에서 완전하게 유지되었다 (도 37-38).
재조합 MV-말라리아 바이러스 및 MV 백신의 생장 곡선은 동일한 속도론을 보였다 (도 39).
1d) p(+)MV2EZ-d-190*-SgrAI (3D7, 24227 bp) 및 p(+)MV3EZ-d-190*-SgrAI (3D7, 24227 bp)의 제작
홍역 벡터를 실시예 3a에 상술된 바에 따라 제조하였다.
매개 벡터 pZE21MVd-190-SgrAI를 주형으로 사용하여, AclI (pos. 5434)와 ClaI (pos. 5536) 부위 사이에 위치한 GPI 결합 영역을 제거하기 위해 PCR 반응을 수행하였다.
PCR 증폭은 교정(proofreading) Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene)을 사용하여 수행하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 DNA 서열은 MV 뉴클레오티드의 경우 소문자(lower case), 및 비 MV 뉴클레오티드의 경우 대문자(upper case)로 제시되어 있다; 관련 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위가 밑줄로 표시된다. 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다: For-ClaI, 5'-CCAATAAACGTTTAAT AGatcgattacgcgcgctctagc-3', 및 Rev-AvrII, 5'-gcctttgagtgagctgatacc-3'.
For-ClaI는 ClaI 및 BssHII 부위 수준에서 주형에 대해 상동성(homologous)이고, 두 개의 종결 코돈 (TAATAG), AclI 부위 (AACGTT), 및 AclI을 위한 6 bp 길이의-보호 부위 (CCAATA)를 갖는 오버행(대문자)을 포함한다. 소위 PCR-GPI 및 최종 구조물 d-190*에서, AclI은 ClaI에 근접해질 것이다.
Rev-AvrIl는 주형에 대해 상동성을 갖는다 (pos. 5704로부터 5724까지).
PCR 산물은 207 bp의 길이를 가졌다: AclI + AvrII를 사용한 절단 및 사전 절단시킨(pre-digested) AclI + AvrII 매개 벡터 pZE21MVd-190-SgrAI를 사용한 연결은 pZE21MVd-190*-SgrAI를 생성시켰다.
상세하게는, AclI + AvrII를 사용한 벡터의 절단은 7318 bp 및 246 bp (결실되는 GPI 영역 포함)의 두 개의 밴드를 생성시킨다: 7.3 kb-절편을 QIAEX II 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 정제하고, 절단된 AclI + AvrII PCR (삽입체)에 연결시켜, pZE21MVd-l90*-SgrAI을 얻었다. 양성 클론을 스크리닝하기 위해 NcoI 절단을 수행하였으며, d-190* 매개 벡터로부터 7 kb의 단일 밴드 및, 최초 GPI-결합 구조물로부터 1.3 및 5.7 kb의 2개의 밴드가 생성되었다.
"6의 법칙(rule of six)"에 따라 최종(definitive) 재조합 p(+)MeV2EZ-dl90* 및 p(+)MeV3EZ-dl90* (도 5 및 도 6)를 제작하기 위해, MeV 벡터 및 매개 플라스미드를 SgrAI+BssHII로 절단한 후, 상호 간 연결시켰다.
상세하게는, SgrAI+BssHII 절단시킨 pZE21MVd-190*-SgrAI은 3개의 밴드, 5.2 kb + 1.3 kb + 900 bp를 생성시켰다. D-190* 서열은 5.2 kb 절편 내에 포함되며, 이 절편을 절단하고, 정제하고, T4 DNA 리가아제 1 유닛을 사용하여, 16 ℃에서 밤새, SgrAI+BssHII 절단된 MeV2EZ 및 MeV3EZ 벡터 (19 Kb 길이)에 동몰비로 연결시켰다.
XL10 Gold 화학적 반응능 세포를 표준 형질전환 프로토콜 (Sambrook 등, 1989)에 따라, 전체 연결 용량으로 형질전환시키고, 암피실린 저항성을 위해 LB-아가 플레이트에 도포하고 선별하였다. DNA 플라스미드 제조 (QIAGEN, 미니- 미디 및 맥시 키트) 및 제한 효소 절단에 의해 콜로니를 스크리닝하였다. 올바른 클론들을 서열분석을 위해 MWG로 보냈다: DNA 스트리더 소프트웨어를 사용하여 추정 서열들과 함께 배열된 상기 서열들은, 100% 동일성을 나타냈다.
MV 벡터의 위치 2에 삽입된 (SgrAI, pos. 4060, 및 BssHII, pos. 9239) d-190*-3D7 유전자가 도 5에 제시되며, 그의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 도 27에 나열되어 있다.
MV 벡터의 위치 3에 삽입된 (SgrAI, pos. 9862 및 BssHII, pos. 15041) d-190*-3D7 유전자가 도 6에 제시된다.
재조합 홍역-말라리아 플라스미드의 게놈 길이 (ACC, pos. 609로부터 GGT, pos. 21788까지)는 6의 배수였으며, 이는 재조합 MV2 -3-d-190*-3D7 바이러스의 구제를 가능하게 한다.
1e) p(+)MV2EZ-d-83-30-38*-SgrAI (3D7, 23105 bp) 및 p(+)MV3EZ-d-83-30-38*-SgrAI (3D7, 23105 bp)의 제작.
홍역 벡터를 실시예 3a에 상술된 바에 따라 제조하였다.
매개 벡터 pZE21MVd-190-SgrAI을 BstEII-ClaI 절단시켜 d-42 절편, 및 AclI (pos. 5434)과 ClaI (pos. 5536) 부위 사이에 위치한 GPI 영역을 절단하였다; 접착성 BstEII 및 ClaI 말단을 갖는 폴리링커를 연결시켜 매개 플라스미드 pZE21MV-d-83-30-38*-SgrAI (6346 bp)를 얻었다.
상기 폴리링커의 서열은 다음과 같았다: 5'- GTCACC GGGGAATAATAGCGC AT -3'.
합성 올리고뉴클레오티드 폴리링커의 DNA 서열이 비 MV 뉴클레오티드에 대해 대문자로 제시되어 있다; 관련된 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위의 서열이 밑줄로 표시된다.
폴리링커는 BstEII (GTCACC) 및 ClaI (AT) 점착성 말단, 두 개의 종결 코돈 (TAATAG), 및 6의 규칙을 준수하기 위한 트리플렛(triplet) (GCG)을 포함한다.
l ㎍의 pZE21MV-d-83-30-38* SgrAI을 50 ㎕의 최종 부피에서, 효소의 최적 온도에서 2시간 동안 SgrAI-BssHII (각각의 효소 1 유닛) 절단시켰다. 절단된 모든 DNA를 1% 아가로오스 겔에 로딩하고, 약 2시간 동안 80볼트로 작동시켰다. 그 다음, 상기 겔로부터 적절한 밴드 (4057 bp)를 잘라내고, QIAEX 겔 정제 키트에 의해 정제하고, 260 nm에서의 흡광도에 의해 DNA 농도를 계산하고, l□ ㎍/ml로 조정한다.
따라서, 벡터 (MV DNA: 도 1) 및 삽입체 (d-42 DNA: 도 2)를 동몰비로, 10□ ㎕의 최종 부피에서 T4 DNA 리가아제 1 유닛 및 그의 고유 반응 완충액을 사용하여 16 ℃에서 밤새 연결시켰다.
XL10 Gold 화학적 반응능 세포를 표준 형질전환 프로토콜 (Sambrook 등, 1989)에 따라, 전체 연결 용량을 사용하여 형질전환시키고, 암피실린 저항성을 위해 LB-아가 플레이트에 도포하고 선별하였다. DNA 플라스미드 제조 (QIAGEN, 미니- 미디 및 맥시 키트) 및 제한 효소 절단에 의해 콜로니를 스크리닝하였다. 올바른 클론들을 서열분석을 위해 MWG로 보냈다: DNA 스트리더 소프트웨어를 사용하여 추정 서열들과 함께 배열된 상기 서열들은, 100% 동일성을 나타냈다.
MV 벡터의 위치 2에 삽입된 (SgrAI, pos. 4060, 및 BssHII, pos. 8117) d-83-30-38*-3D7 유전자가 도 8에 제시되며, 그의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 도 29에 나열되어 있다.
MV 벡터의 위치 3에 삽입된 (SgrAI, pos. 9862 및 BssHII, pos. 13919) d-83-30-38*-3D7 유전자가 도 9에 제시된다.
재조합 홍역-말라리아 플라스미드의 게놈 길이 (ACC, pos. 609로부터 GGT, pos. 20666까지)는 6의 배수이며, 이는 재조합 MV2 -3-d-83-30-38*-3D7 바이러스의 구제를 가능하게 한다.
1f) p(+)MV2EZ-d-42*-SgrAI (3D7, 20345bp) 및 p(+)MV3EZ-d-42*-SgrAI (3D7, 20345 bp)의 제작.
홍역 벡터를 실시예 3a에 상술된 바에 따라 제조하였다.
매개 벡터 pZE21MVd-42-SgrAI (3658 bp)를 주형으로 사용하여, AclI (pos. 1528)와 ClaI (pos. 1630) 부위 사이에 위치한 GPI 결합 영역을 제거하게 위해 PCR 반응을 수행하였다.
PCR 증폭은 교정 Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하여 수행하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 DNA 서열은 MV 뉴클레오티드의 경우 소문자, 및 비 MV 뉴클레오티드의 경우 대문자로 제시되어 있다; 관련 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위가 밑줄로 표시된다.
하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다: For-ClaI, 5'-CCAATA AACGTT TAAT AG atcgat tac gcgcgc tctagc-3', 및 Rev-AvrII, 5'-gcctttgagtgagctgatacc-3'.
For-ClaI는 ClaI (pos. 1630) 및 BssHII (pos. 1639) 부위 수준에서 주형에 대해 상동성이고, 두 개의 종결 코돈 (TAATAG), AclI 부위 (AACGTT), 및 AclI을 위한 6 bp 길이의-보호 부위 for AcE (CCAATA)를 갖는 오버행 (대문자)을 포함한다. 소위 PCR-GPI 및 최종 구조물 d-42*에서, AclI는 ClaI에 근접해질 것이다.
Rev-AvrII는 주형에 대해 상동성을 갖는다 (pos. 1798에서 1818까지).
PCR 산물은 207 bp의 길이를 가졌다: AclI + AvrII를 사용한 절단, 및 사전 절단된(pre-digested) AclI + AvrII 매개 벡터 pZE21MVd-42-SgrAI를 사용한 연결은 pZE21MVd-42*-SgrAI를 생성시켰다.
상세하게는, AclI + AvrII를 사용한 벡터의 절단은 3412 bp 및 246 bp (결실되는 GPI 영역 포함)의 두 개의 밴드를 생성시킨다: 7.3 kb-절편을 QIAEX II 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 아가로오스 겔로부터 정제하고, 절단된 AclI + AvrII PCR (삽입체)와 연결시켜, pZE21MVd-42*-SgrAI을 얻었다.
양성 클론을 스크리닝하기 위해 NcoI 절단을 수행하였고, d-42* 매개 벡터로부터 3.4 kb의 단일 밴드 및, 최초 GPI-결합 구조물로부터 1.3 및 2.3 kb의 2개의 밴드가 생성되었다.
"6의 법칙(rule of six)"에 따라 명확한 재조합 p(+)MeV2EZ-d42* 및 p(+)MeV3EZ-d42*를 제작하기 위해, MeV 벡터 및 매개 플라스미드를 SgrAI+BssHII을 사용하여 절단한 후, 상호 간 연결시켰다.
상세하게는, SgrAI + BssHII + SpeI으로 절단한 pZE21MVd-42*-SgrAI은 4개의 밴드, 1.3 kb + 936 bp + 800 bp + 400 bp를 생성시켰다. D-42* 서열은 1.3 kb 절편 내에 포함되어 있으며, 이 절편을 절단하고, 정제하고, T4 DNA 리가아제 1 유닛을 사용하여 16 ℃에서 밤새, SgrAI+BssHII 절단된 MeV2EZ 및 MeV3EZ 벡터 (19 Kb 길이)에 동몰비로 연결시켰다.
XL10 Gold 화학적 반응능 세포를 표준 형질전환 프로토콜 (샘브루크 등, 1989)에 따라, 전체 연결 용량으로 형질전환시키고, 암피실린 저항성을 위해 LB-아가 플레이트에 도포하고 선별하였다. DNA 플라스미드 제조 (QIAGEN, 미니- 미디 및 맥시 키트) 및 제한 효소 절단에 의해 콜로니를 스크리닝하였다. 올바른 클론들을 서열분석을 위해 MWG로 보냈다: DNA 스트리더 소프트웨어를 사용하여 추정 서열들과 함께 배열된 상기 서열들은, 100% 동일성을 나타냈다.
MV 벡터의 위치 2에 삽입된 (SgrAI, pos. 4060, 및 BssHII, pos. 5357) d-42*-3D7 유전자가 도 11에 제시되며, 그의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 도 31에 나열되어 있다.
MV 벡터의 위치 3에 삽입된 (SgrAI, pos. 9862 및 BssHII, pos. 11159) d-42*-3D7 유전자가 도 12에 제시된다.
재조합 홍역-말라리아 플라스미드의 게놈 길이 (ACC, pos. 609로부터 GGT, pos. 17906까지)는 6의 배수였으며, 이는 재조합 MV2 -3-d-42*-3D7 바이러스의 구제를 가능하게 한다.
1g) p(+)MV2EZ-d-190-SgrAI (FCBl, 24083 bp) 및 p(+)MV3EZ-d-190-SgrAI (FCBl, 24083 bp)의 제작.
우선, 시그널 펩티드 및 3D7 주의 MSP-1에서 유래한 GPI-결합 영역을 유지하면서, FCB1 주의 MSP-1에 대한 합성 유전자의, 매개 플라스미드 pZE21MV-SgrAI로의 클로닝을 수행하였다. 하기와 같이, D-190 유전자 (FCB1)를 pZE23f-GX-190H로 지칭되는 매개 벡터로부터 단계별로 수득하였다:
i). 1 ㎍의 플라스미드 pZE21MV-d-190-SgrAI (3D7)를 50 ㎕의 최종 부피에서, 2시간 동안 효소의 최적 온도에서, HindIII + AclI 제한 효소로 절단하였다. 그 다음, 상기 벡터에 해당하는 적절한 밴드 (2558 bp)를 겔로부터 잘라내고, QIAEX 겔 정제에 의해 정제하고, 260 nm에서 DNA 농도를 계산하였다.
ii). MSP-1/FCBl의 d-42 부분을 증폭 및 회수하기 위해, pZE23f-GX-190H를 주형으로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 증폭은 교정 Pfu DNA 폴리머라제를 사용하여 수행하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 DNA 서열을 MV 뉴클레오티드에 대해 소문자로, 및 비 MV 뉴클레오티드에 대해 대문자로 제시하였다; 관련 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위의 서열을 밑줄로 표시하였다.
ρZE23f-GX-190H 서열에 기반하여 디자인된, 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다: For-1 FCBl, 5'-CCC AAGCTT ccaggt ggtcaccg gAgagctgtcactcc-3', 및 Rev-1 FCBl, 5'-GCCTGC aacgtt GCTagagctggagcaGaaGatcccgtcg-3'.
For-1 FCBl는 BstEII 부위 (ggtcacc)를 포함하는 주형 pos. 4509 내지 pos. 4538과 상동성을 갖는다. A (대문자)는 주형 내의 t였고, SgrAI 부위를 제거하기 위해 변형되었다. 이는 3 bp 길이의 보호 부위 (CCC) 뒤에, HiruflII 부위 (AAGCTT)를 갖는 오버행 (대문자)을 포함한다.
Rev-1 FCBl은 6-bp 보호 부위 (GCCTGC)가 선행된 AclI 부위 (aacgtt)를 포함한다. 이는 6의 규칙을 고수하기 위해, 세린을 코딩하는 트리플렛 GCT를 도입하였다; 폴리 (A) 부위를 피하기 위해, 2개의 a는 G로 변형되었다.
수득된 PCR-HindIII-AclI (1.1 kb)을 HindIII + AclI로 절단하고, HindIII + AclI로 사전 절단시킨 pZE21MV-d-190-SgrAI에, 동몰비로 16 ℃에서 밤새 연결시켜 (단계 i), pZE21MV-d-42-SgrAI-FCBl (3657 bp)을 수득하였다. 그 다음, XLlO 골드 화학적 반응능 세포를 표준 형질전환 프로토콜에 따라 (샘부르크 등, 1989) 전체 연결 용적으로 형질전환시키고, 암피실린 저항성을 위해 LB-아가 플레이트에 도포 및 선별하였다. DNA 플라스미드 제조 (QIAGEN, 미니-, 미디 및 맥시 키트) 및 HindIII + AclI를 사용한 제한 효소 절단(예상 절편 2558 bp + 1099 bp)에 의해 콜로니를 스크리닝하였다.
iii). 단계 ii에서 수득한 pZE21MV-d-42-SgrAI-FCBl를 HindIII + BstEII (HindIII, pos. 428, 및 BstEII, pos. 440)로 절단하고, 열린(opened) 벡터에 해당하는 적절한 밴드(3645 bp)를 1% 아가로스 겔에 로딩시키고, 겔로부터 잘라내고, QIAEX 겔 정제에 의해 정제하고, 260 nm에서의 흡광도에 따라 DNA 농도를 계산하였다.
iv). pZE23f-GX-190H HindIII + BstEII로 절단하고, d-83-30-38/FCBl 절편에 해당하는 3679 bp (삽입체)의 적절한 밴드를, 전술된 바와 같이 겔로부터 정제하였다.
v). pZE21MV-d-42-SgrAI-FCBl로부터 얻은, 3657 bp (벡터)의 HindIII + BstEII 절단된 절편을, d-83-30-38/FCBl을 포함하며, pZE23f-GX-190H로부터 절단에 의해 얻은 3679 bp의 HindIII + BstEII 절편 (삽입체)에 연결시켰다. T4 DNA 리가아제 1 유닛을 사용하여, 16 ℃에서 밤새 동몰비로 연결을 수행하여, pZE21MV-d-190-SgrAI-FCBl (7324 bp)을 수득하였다. 뒤이어, 표준 형질전환 프로토콜 (샘브루크 등, 1989)에 따라, 골드 화학적 반응능 세포를 전체 연결 용량으로 형질전환시키고, 암피실린 저항성을 위해 LB-아가 플레이트에 도포 및 선별하였다. 콜로니를 DNA 플라스미드 제조 (QIAGEN, 미니- 미디 및 맥시 키트) 및 제한 효소 절단에 의해 스크리닝하였다.
p(+)MV2EZ-d-190-SgrAI-FCBl 및 p(+)MV3EZ-d-190-SgrAI-FCBl을 제작하기 위해, 홍역 벡터를 실시예 3a에 상술된 바와 같이 준비하였다.
매개 플라스미드 (pZE21MV-d-190 SgrAI, 7324 bp)에 삽입된 l ㎍의 d-190/FCB1 유전자를, 50 ㎕의 최종 부피에서, 2시간 동안 효소들의 최적 온도에서 SgrAI-BssHII 절단(각각의 효소 1 유닛)에 의해 잘라냈다. 절단된 모든 DNA를 1% 아가로오스 겔에 로딩하고, 약 2시간 동안 80볼트에서 작동시켰다. 그 다음, 적절한 밴드(5035 bp)를 겔로부터 잘라내고, QIAEX 겔 정제 키트에 의해 정제하고, 260 nm에서의 흡광도에 의해 DNA 농도를 계산하고, 1□㎍/mL로 조정하였다.
따라서, 벡터 (MV DNA: 도 1) 및 삽입체 (d-190/FCB1 DNA: 도 3)를, 10□ ㎕의 최종 부피에서 1 유닛의 T4 DNA 리가아제 및 그의 고유 반응 완충액을 사용하여 16 ℃에서 밤새, 동몰비로 연결시켰다.
XL10 Gold 화학적 반응능 세포를 표준 형질전환 프로토콜 (Sambrook 등, 1989)에 따라, 전체 연결 용량을 사용하여 형질전환시키고, 암피실린 저항성을 위해 LB-아가 플레이트에 도포 및 선별하였다. DNA 플라스미드 제조 (QIAGEN, 미니- 미디 및 맥시 키트) 및 제한 효소 절단에 의해 콜로니를 스크리닝하였다. 올바른 클론들을 서열분석을 위해 MWG로 보냈다: DNA 스트리더 소프트웨어를 사용하여 추정 서열들과 함께 배열된 상기 서열들은, 100% 동일성을 나타냈다.
MV 벡터의 위치 2에 삽입된 (SgrAI, pos. 4060, 및 BssHII, pos. 9095) d-190-FCB1 유전자가 도 13에 제시되며, 그의 오픈 리딩 프레임(ORF)이 도 32에 나열되어 있다.
MV 벡터의 위치 3에 삽입된 (SgrAI, pos. 9862 및 BssHII, pos. 14897) d-42 -FCB1 유전자가 도 14에 제시된다.
재조합 홍역-말라리아 플라스미드의 게놈 길이 (ACC, pos. 609로부터 GGT, pos. 21884까지)는 6의 배수로, 이는 재조합 MV2 -3-d-190-FCB1 바이러스의 구제를 가능하게 한다.
이식유전자는 상당히 안정하게 발현된다: 그의 발현은 인간 이배체 세포 MRC5에서의 10회의 연속적 바이러스 계대감염 후에 하나의 최초 구제 클론으로부터 유래된, 분석된 모든 후대 클론에서 완전하게 유지되었다 (도 40).
재조합 MV-말라리아 바이러스 및 MV 백신의 생장 곡선은 동일한 속도론을 보였다 (도 41).
실시예 2: DiCoI 핵산 서열의 디자인.
아미노산 DiCoI 서열 (엑토, 트랜스(trans) 및 세포질 도메인: aa 97-622)로부터 출발하고, DNA 스트리더 소프트웨어를 사용하여, DiCo 1 DNA 축퇴성 서열(degenerate sequence)을, BLAST 배열 후 DiCoI과 가장 유사한 서열을 나타낸, 선택된 PfAMAl 유전자 (기탁번호(accession number) AAG141.1)와 비교하여 상응하는 핵산 서열을 디자인하였다. 5' 말단에 클로닝 부위로서, 적합한 고유 제한 부위를 첨가하고 (MuI 및 SgrAI), 뒤이어 최적 KOZAC 서열 및 인간 최적화 시그널 펩티드 (SP)를 첨가하였다. 3' 말단에는, 2개의 종결 코돈 및 BssHII 클로닝 부위를 첨가하였다. 이러한 계획에 따라, 본 발명자들은 (홍역 벡터 내로의 추가적 발현을 위한 "6의 법칙"과 관련하여) DiCo1 단백질의 결합 형태 및 분비 형태를 코딩하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 디자인하였다: 제1 유전자는 외형질 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하며 (도 18), 제2 유전자는 엑토도메인 단독에만 해당한다 (도 19). AT% 함량을 감소시키고, 폴리(A) 서열 및 RNA 불안정성 모티브(instability motif)를 회피하기 위해, 상기 2개의 서열들을 GENEART에 의해 인간 코돈 최적화하였다.
DiCoI 완전 ORF 및 DiCoI 엑토도메인 ORF를 도 34 및 35에 각각 나열하였다.
실시예 3: 재조합 MV - PfAMA -1 플라스미드의 제작.
모든 클로닝 과정들은 샘브루크 등 (1989)에 개시된 기법에 따라 수행하였다.
PfAMAl 및 특히, 분비 형태 및 결합 형태의 다양성 커버링 서열 1 (DiCo1)을 화학적으로 합성하였으며 인간 코돈 최적화하였다.
코돈 최적화된 DiCo1의 분비형 및 결합형들을 SgrAl + BssHII로 절단하고, T4 DNA 리가아제 1 유닛을 사용하여, 사전 절단시킨 MeV2EZ 및 MeV3EZ 벡터 (19 Kb 길이)에 16 ℃에서 밤새, 동몰비로 연결시켜, 다음의 재조합 MV- PfAMA-l 플라스미드를 얻었다: p(+)MV2EZ-DiCol-완전체 (도 20), p(+)MV3EZ-DiCol-완전체 (도 21), p(+)MV2EZ-DiCo1-엑토 (도 22), 및 p(+)MV3EZ-DiCo1-엑토 (도 23).
실시예 4: 재조합 MV - PfCS 플라스미드의 제작
p(+)MV 2 EZ- CS - SqrAI (20219 bp ) 및 p(+)MV 3 EZ- CS - SqrAI (20219 bp )의 제작
모든 클로닝 과정은 기본적으로 샘브루크 등 (1989)에 설명된 바와 같았다.
매개 벡터 pAdApt35Bsu.CS.Pfalc.aa-sub.gcc 내에 클로닝된, PfCSl를 PCR에 의해 증폭시키고, 최종 MV 벡터 내에 직접 클로닝하여, 2개의 재조합 MV-fyCS 플라스미드를 얻었다: p(+)MV2EZ-CS 및 p(+)MV3EZ-CS.
상세하게는, CS 유전자를 증폭 및 회수하기 위해, pAdApt35Bsu.CS.Pfalc.aa-sub.gcc를 주형으로 사용하여 PCR 반응을 수행하였다 (도 15). 교정 Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머의 DNA 서열들이 MV 뉴클레오티드의 경우 소문자, 및 비 MV 뉴클레오티드의 경우 대문자로 제시되어 있다; 관련 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위의 서열이 밑줄로 표시된다.
pAdApt35Bsu.CS.Pfalc.aa-sub.gcc에 대해 디자인된, 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다: For-SgrAI, 5'-ACTTCTCACCGGTGTggaagcttgccac catgat -3', 및 Rev-BssHII-CS 5'-TAGCGCGCtctagaggatccttatcagc-3'.
For-SgrAI은 HindRIII 부위 (aagctt)를 포함하는, 주형 pos. 1356 내지 pos. 1375에 대해 상동성이다. 이는 6-bp 길이의 보호 부위 (ACTTCT) 뒤에, SgrAI 제한 부위 (CACCGGTG)를 갖는 오버행 (대문자)을 포함한다.
Rev-BssHII-CS는 BssHII 제한 부위 (GCGCGC)를 갖는 오버행 (대문자)을 가지며, 이는 PCR-CS (1187 bp) 내의 Xbal (tctaga)에 가까워지게 될 것이다. 수득된 PCR-CS을 SgrAI + BssHII로 절단하고, 1 유닛의 T4 DNA 리가아제를 사용하여, 사전-절단된 MeV2EZ 및 MeV3EZ 벡터 SgrAI+BssHII (19 Kb 길이)에, 동몰비로, 16 ℃에서 밤새 연결시켜, 각각 p(+)MV2EZ-CS-SgrAI (20219 bp, 도 16) 및 p(+)MV3EZ- CS-SgrAI (20219 bp, 도 17)을 얻었다. CS ORF를 도 33에 제시한.
XL10 골드 화학적 반응능 세포를 표준 형질전환 프로토콜 (Sambrook 등, 1989)에 따라, 전체 연결 용량을 사용하여 형질전환시키고, 암피실린 저항성을 위해 LB-아가 플레이트에 도포 및 선별하였다. DNA 플라스미드 제조 (QIAGEN, 미니- 미디 및 맥시 키트) 및 제한 효소 절단에 의해 콜로니를 스크리닝하였다. 올바른 클론들을 서열분석을 위해 MWG로 보냈다: DNA 스트리더 소프트웨어를 사용하여 추정 서열들과 함께 배열된 상기 서열들은, 100% 동일성을 나타냈다.
실시예 5: 세포 및 바이러스
세포들을, 베라 세포 (아프리카 녹색 원숭이 신장)의 경우 5% 우태아 혈청, 및 293T 세포 (인간 배아 신장)의 경우 10% FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)으로 보강한, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM); MRC-5 (인간 태아 섬유아세포(human foetal fibroblast)의 경우 글루타맥스(Glutamax) (F12) 및 10% FCS로 보강된 DMEM; 293-3-46의 경우 10% FCS 및 1.2 mg/mL의 G 418로 보강된 DMEM에서, 단일층으로 유지시켰다
약 107 pfu/ml의 역가에 도달한 MV 바이러스 스톡을 증식시키기 위해, 재조합 바이러스 및 백신주 에드모스톤 자그렙을 MRC-5 세포 내에서 번식(propagate)시켰다; 신시티움(syncythium)을 35 mm MRC-5 세포 배양물로 옮기고, 이를 처음에 10 cm 접시로, 및 그 뒤에 175 cm 플라스크로 넓혀가면서 플라크 정제를 수행하였다. 신시티움 생성이 약 90%로 나타났을 때, 175 cm2 배양물로부터 바이러스 스톡을 제조하였다. 소위 "유리-세포 바이러스 분획(free-cell virus fraction)"에 해당하는 배지를 회수하고, 동결 및 해동을 3회 수행하고, 세포 잔해(cell debris)를 제거하기 위해 스핀 다운(spin down)시켰다. 그 다음, 상기 배지를 -80 ℃에서 저장하였다. 소위 "세포-결합 바이러스 분획(cell-associated virus fraction)"에 해당하는, 세포들을 3 mL의 OPTIMEM (Gibco BRL)으로 긁어 넣은 후, 뒤이어 동결 및 해동을 3회 수행하고, 스핀 다운시켜 투명한 상등액(surnatant)를 -80 ℃에서 보관하였다.
실시예 6: 플라스미드의 형질감염 및 MV 바이러스의 구제
293T 세포들을 35 mm 웰에 시딩하여 ~ 50-70% 컨플루언스에 도달시키고, 이 시점에 형질감염시켰다. 형질감염 4 시간 전에, 배지를 10% FCS를 함유하는 3 ml DMEM로 교체하였다. 모든 재조합 플라스미드는 QIAGEN 플라스미드 제조 키트에 따라 제조하였다. DNA의 Ca2 +포스페이트 공침(coprecipitation)을 위한 키트는 Invitrogen으로부터 입수하였다.
세포들을 다음과 같은 최종 농도로 공동-형질감염(co-transfect)시켰다: pCA-L 0.5 ㎍, pCA-N 0.5 ㎍, pCA-P 0.1 ㎍, pCA T7 1 ㎍ 및 재조합 홍역-말라리아 플라스미드 4 ㎍. 물 중에 희석된, 5개의 플라스미드 모두를, 2M CaCl2를 포함하는 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 혼합물을 HEPES 완충액을 포함하는 또다른 에펜도르프 관에 교반 조건 하에서 첨가하고, 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 따라서, 공침물을 상기 배양물에 적가하고, 37 ℃ 및 5% CO2에서 약 18시간 동안 형질감염을 수행하였다. 그 다음, 형질감염 배지를 10% FCS를 포함하는 3 mL의 DMEM으로 교체하였다.
재조합 홍역-말라리아 백신 바이러스를 얻는 또다른 방법이 본 명세서에서 후술되며, 홍역 N 및 P 단백질, 및 T7 RNA 폴리머라제를 안정적으로 발현하는, 293-3-46 헬퍼 세포 (인간 배아 신장 세포)를 사용한다. 15 ng의 플라스미드 peMCLa로 상기 세포를 형질감염시킴으로써, 바이러스 RNA 폴리머라제 (거대 단백질(large protein), L)를 발현시켰다. 형질감염 효율을 개선시키기 위해, 300 ng의 pSC6-T7 네오(Neo)를 첨가하였다. 형질감염을 위해 칼슘-포스페이트 방법을 사용하였다.
최초의 신시티움은 형질감염 3-4일 후, 상기 세포들이 여전히 컨플루언시 미만일 때(subconfluent) 나타났다. 신시티움 생성이 보다 용이하게 진행되도록 하기 위해, 35 mm 웰 각각의, 거의 컨플루언시 상태인 세포 단일층을 10 cm 디쉬로 옮겼다. 각각의 신시티움 300 ㎕의 형질감염 배지에 취하고, 700 ㎕의 OPTIMEM을 함유하는 멸균된 에펜도르프 관에 넣고, 동결 및 해동을 3회 수행하고, -80 ℃에서 보관하였다.
실시예 7: 플라크 분석에 의한 바이러스 역가측정( titration )
OPTIMEM을 사용하여 최종 부피 0.5 mL까지 바이러스 제조물(preparation)의 10-회 연속 희석을 수행하였다. 35 mm 베로 세포 배양물에 각각의 희석물을 첨가하였다. 바이러스 흡착 1시간 후에, 접종원(inoculum)을 제거하고, 감염된 세포들을 5% FCS 및 1% 저융점 아가로오스(low melting point(LMP) agarose)를 포함하는 2 mL의 DMEM으로 덮었다(overlay). 37 ℃ 및 5% CO2에서 5일간 인큐베이션시킨 후, 배양물을 1 mL의 10% TCA로 고정시킨 다음, 30분 동안 UV 가교(crosslink)시켰다. 아가로오스 덮개(overlay)를 제거한 후, 세포 단일층을 4% 에탄올에 용해시킨 크리스탈 바이올렛(crystal violtet)으로 염색시키고, 물로 세척하고, 도립 현미경(inverted microscope) 하에서 플라크를 계수하였다.
실시예 8: 재조합 바이러스의, MRC -5 바이러스 연속 계대감염 ( passage )
구제된 바이러스를, 0.01 PFU/세포의 MOI로, 표준 및 재조합 MV 바이러스로 감염시킨, 10 cm 직경의 플레이트에 시딩된, MRC5 세포에 10회 연속 계대감염시켰다. 단일층이 완전히 감염된 후, 후속 MRC5 세포 단일층을 감염시키기 위해 각각의 배양물의 1% 상등액을 사용하였다. 이식유전자 발현 및 안정성을 시험하기 위해, 계대 1, 5, 및 10으로부터 얻은 바이러스를, 웨스턴 블롯 및 면역형광법(immunofluorescence)에 의한 추가적인 발현 특성분석을 위해 사용하였다.
실시예 9: 웨스턴 블롯 , 면역형광법
MV 및 말라리아의 발현을 분석하기 위해, 웨스턴 블롯 및 면역형광법을 실시하였다.
웨스턴 블롯을 위해, 35 mm 디쉬에 시딩된 베로 세포 (1-5x105)를, 그 다음날 90% 컨플루언스에 도달하였는지 모니터링하고, 세포-결합 바이러스 분획(cell-associated virus fraction)으로부터 얻은 깨끗한 바이러스 현탁액으로, 0.1 MOI (감염다중도(Multiplicity Of Infection))를 이용하여 감염시켰으며, 대조군으로서 MVEZ를 포함시켰다. 약 80% 신시티움 생성이 관찰되었을 때, 세포들을 우선 PBS로 세척한 다음, 1 mL PBS에 긁어넣고, 에펜도르프 튜브에 수집하고, 2000 RPM/4분으로 원심분리시켰다. 그 다음, 세포들을 프로테아제 억제제 칵테일 (Complete Mini, Roche, 1 836 153)로 보충된, 70 ㎕의 용해 완충액 (1% NP-40, 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl)을 사용하여, 5분 동안 실온에서 용해시켰다. 13000 RPM/5분의 원심분리에 의해 상등액을 투명화하고, 새로운 관으로 옮겼다: 30 ㎕의 4x 로딩 완충액 (Invitrogen)을 첨가하였다; 샘플을 혼합하고, 95 ℃에서 2분 동안 끓이고, -20 ℃에서 보관하였다.
1x 이동 완충액(running buffer)을 사용하여, 200V에서 50분 동안, 환원 조건에서 NuPAGE 12% 비스-아크릴아미드 겔을 사용하여(run) (시작 100-125 mA, 끝 60-80 mA) SDS-PAGE 이동을 수행하였다.
그 다음, 반건조법(semi-dry method)을 이용하여, 14V에서 1시간 30분 동안, 분리된 세포-단백질들을 니트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose Membrane)에 옮겼다.
1차 항체로서, PVST 중에 1:30000 이상 희석된 MSPl-p-83에 대한 토끼 다중클론항체(rabbit polyclonal), 및 l:50000 이상 희석된 MSPl-p-42,*에 대한 토끼 다중클론항체를 사용하였다. 2차 항체는 증강된 화학발광 키트(enhanced chemiluminescence kit) (ECL™, Amersham LifeScience)에 의해 밴드의 가시화할 수 있게 하는, 겨자무 과산화효소(radish peroxidase)와 결합된 돼지(swine) 항-토끼 항체였다.
면역형광법을 위해, 베로 세포들을 35 mm 웰 내의 24mm x 24mm 유리 커버 슬립(cover slip)에 시딩하고, 밤새 배양하고, 구제된 재조합 바이러스로 감염시켰다. 감염 3일 후, 커버 슬립 상의 세포들을 PBS 중 3,7% 파라포름알데히드로 고정시키고, 0.1% TX-100을 사용하여 투과성을 증대시키고(permeabilize), 블로킹 용액(blocking solution) (1% BSA를 함유하는 PBS)으로 1시간 동안 세척하고, 특이적 항체들로 염색시켰다. p-42 중 p-19 부분의 EGF-유사 도메인을 인식하는, 마우스 하이브리도마 상등액 mAB 5.2를 1:100 희석하여 사용하였으며, 뒤이어 1:250 희석된 FITCH 결합된 염소 항-마우스 혈청을 사용하였다.
실시예 10: 생장 속도 곡선( growth kinetics curve )
35 mm 디쉬에 시딩된 MRC5 세포 (l-5xl05)가 90% 컨플루언스에 도달하였는지 모니터링하고, 세포-결합 바이러스 분획으로부터 얻은 깨끗한 바이러스 현탁액으로 0.1 MOI를 이용하여 감염시켰으며, 대조군으로서 MVEZ를 포함시켰다. 소위 "유리-세포 바이러스 분획", 및 소위 "세포-결합 바이러스 분획"에 해당하는 샘플들을 1주일 동안 매일 수집하고, 역가를 측정하였다.
실시예 11: 마우스 면역화
설명된 구제된 재조합 MV-말라리아 바이러스의 면역원성 능력(immunogenic power)을, MV 감염에 감수성을 갖는 유전자이식 마우스 IFNAR/CD46에 대해 수행된 면역화 시험에 의해 입증하였다. 동물들을 최적 위생 조건에서 유지시키고, 6-8주령에 면역화시켰다. 이하, 2가지 재조합 홍역-말라리아 바이러스: MeV2EZ-d-p42-SgrAI (GPI 결합형) 및 MeV2EZ-d-p42* (분비형)을 사용한 마우스 면역화의 예를 제시한다. 면역화는 각각의 재조합 MV-말라리아 105 PFU를 사용하여, 0주차, 4주차, 및 8주차에의 3회 주사에 의해, 근육내 주사로(intra-muscularly) 실시하였다. 재조합-빈 홍역 (rMVEZ13- 빈 클론(empty cloned)으로 면역화한 마우스를 음성 대조군으로 사용하였다. UV로 불활성화시킨 rMV를, 바이러스 복제가 면역 반응의 활성화에 미치는 효과를 결정하기 위한 대조군으로 사용하였다. MV 벡터화(vectored) 항원의 면역 반응을, 정제된 d-42 단백질(0.5 mg/ml)과 비교하여 시험하였다: 불완전 프렌드 아쥬반트(Incomplete Freund's Adjuvant) 중 20 ㎍의 단백질을 피하주사하여 마우스를 면역화시켰다.
면역화된 IFNAR/CD46 마우스 (시험군 당 6마리 및 대조군의 경우 3마리)로부터 얻은 혈청 중 MV-특이적 항체의 존재를, IgG 항체 검출을 목적으로, 홍역 바이러스 EIA 벌크(bulk)(ATCC VR-24)로 코팅된 96-마이크로웰 플레이트를 사용한 ELISA에 의해 결정하였다. 단백질을 0.05 M 카르보네이트 완충액 (pH 9.4)을 사용하여 0.6 ㎍/ml로 희석시키고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 웰당 100 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, PBS/0.05% 트윈 20 (PT) (ph 7.4)로 세척하고, PT (0.1 ml/웰)- 10% BSA와 함께 37 ℃에서 60분 동안 인큐베이션하고, 다시 PT로 세척하였다. 시험대상 혈청의 연속 2배 희석액을 첨가하고 (100 ㎕/웰), 플레이트를 37 ℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 PT로 세척하고, PT 중 1:2000 희석시킨 염소 항-마우스 IgG HRP 100 ㎕와 함께, 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 PT로 세척하고, 100 ㎕ OPD (o-페닐렌디아민, Fluka 78411)와 함께 인큐베이션하였다. 3-4분 후에 반응을 종료시켰다. MicroElisa Reader에서 490 nm 파장에서 플레이트를 판독하였다. 음성 대조군의 3배를 초과하여 판독되는 경우 양성 반응으로 평가(score)하였다.
면역화된 CD46 마우스 (시험군 당 10마리 이상)의 혈청 중 MV-말라리아-특이적 항체의 존재를 ELISA 분석에 의해 결정하였다. 요약하면, 96-마이크로웰 플레이트를 카르보네이트 완충액 pH 9.4로 희석시킨, 50 ng/웰의 MSP-l-d42 3D7 균주로 코팅하였다. 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하고, PBS/0.05% 트윈 20 (PT)로 세척하였다. 뒤이어, PT 중에 용해시킨 10% 탈지유를 사용하여 비특이적 상호작용을 37 ℃에서 1시간 동안 차단시키고, 웰을 PT로 다시 세척하였다. 플레이트를 뒤이어 다양한 마우스 혈청 희석물 (1:200에서 시작하여, 뒤이은 연속적 2배 희석), 퍼옥시다아제-접합(peroxidase-conjugate) 염소 항-마우스 IgG 및 OPD 기질과 함께 인큐베이션시켰다. 490 nm에서 광학 밀도값을 측정하였다. 컷-오프 백그라운드(cut-off background) 수준 (MV 면역화 마우스 유래 혈청의 평균값에 인자(factor) 2.1을 곱한 값)을 초과하는 값을 양성인 것으로 간주하였다. 역가는 역수적 종말-희석(reciprocal end-dilution)으로 도시하였다.
홍역에 대한 체액성 면역 반응이 하기 도 A에 제시된다. 말라리아 p42에 대한 체액성 면역 반응이 하기 도 B에 제시된다.
Figure pct00001
Figure pct00002

실시예 12: 플라크 정제에 의한, 결손 간섭 입자( DI )로부터 말라이아 항원을 발현하는 재조합 홍역 바이러스의 정제
파라믹소바이러스, 및 특히 홍역 바이러스를 사용한 일정한 횟수의 계대감염(passage) 후, 결손 간섭 입자(DI)의 축적이 발생한다는 것이 문헌에 공지되어 있다 (23, 24). 이 DI는 하기 다양한 결손을 유발한다는 것이 개시된 바 있다: 백신 안정성에 대한 부정적 영향, 생식에 있어서 바이러스 수율(virus yield)에 대한 부정적 영향, 게놈 불안정성 및 백신화 후 면역 반응의 억제. 본 발명자들의 신규한 재조합 바이러스에 있어 그와 같은 DI를 회피하기 위해, 본 발명자들은 293T 세포 대신 MRC5 세포를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 6에 기술된 바와 같은 플라크 정제 방법을 적용하였다. 깨끗하고, 잘 정의된 신시티움의 생성 후, 본 발명자들은 신선한 MRC5 조직 배양물에서의 추가적 계대배양을 위해, 현미경 하에서 마이크로피펫을 사용하여 그와 같은 물질을 흡입시켰다.
실시예 13: 종말점 희석에 의한, 결손 간섭 입자( DI )로부터 말라리아 항원을 발현하는 재조합 홍역 바이러스의 정제
마이크로플레이트에 종말점 희석 기법(end point dilution technique)을 적용하였다: 모든 웰에, MRC5 세포의 신선한 단일층을 막 발생(develop)시켰다. 재조합 홍역-말라리아 바이러스를 포함하는 바이러스 현탁액을 2배 희석물로 제조하였다. 신시티움이 검출된 가장 최근의 단일층으로부터, 피펫으로 상등액을 흡입시켰다. 상기 상등액을 MRC5 세포를 포함하는 현탁액과 혼합하였다. 이 혼합물을 4 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 최종적으로, 이는 작은 코스타 플라스크(Costar flask)에 옮기고, 35 ℃/5% CO2에서 인큐베이션하고, 10일 후 재조합 홍역-말라리아 바이러스를 정제할 목적으로 이를 수확하였다.
실시예 14: 홍역-말라리아 조합 백신의 제조
상기 기술된 재조합 홍역-말라리아 바이러스의 워킹 시드(working seed)를, 1750 cm2 롤러 병 내의 MRC5 세포 단일층 상에서, 35 ℃에서 10일 동안 인큐베이션하였다. 세포들의 건강 상태 및 컨플루언스를 매일 모니터링하였다. 신시티움 생성이 최고 수준에 이른 10일 차에, 상등액을 액체 질소 중에 보관할 목적으로 스틸 실린더에 펌핑하였다. 동일한 과정을 2일 뒤에 반복하였다. 모든 검사 (바이러스 역가, 게놈 안정성, 바이러스 안전성, 세포 안전성, 화학적 분석, 멸균성 등)를 실시한 후에, 수확물을 완전히 해동시키고, 젤라틴, 소르비톨, 아미노산, 및 기타 당(sugar)을 포함하는 안정화제와 혼합하여, 최종 105까지 희석하였다. 자동 충진 장치(automated filling machine)를 사용하여, 작은 리오 병(lyo bottle) (F3)에 각각 0.5 mL씩 접종하였다. 동결 건조 과정 동안 제품의 최대 생존을 보장하기 위해, 특별히 계산된 동결건조(lyophilisation) 프로그램을 사용하였다.
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첨부된 서열목록 참조.
SEQUENCE LISTING <110> CADILA HEALTHCARE LIMITED GLUECK, Reinhard FAZIO, Agata GIANINO, Viviana BILLETER, Martin <120> COMBINED MEASLES-MALARIA VACCINE <130> ZRC-VCC-003 <140> 1181-MUM-09 <141> 2009-05-05 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19793 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Complete nucleotide sequence of p(+)MV2EZ-GFP <400> 1 cacctaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 60 ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 120 cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 180 ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 240 accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 300 gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggccatt taggccatag ggcgctggca 360 agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag 420 ggcgcgtccc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc 480 tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 540 acgccagggt 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ccccggtgcc cacaggcagg gacaccaacc cccgaacaga 6480 cccagcaccc aaccatcgac aatccaagac gggggggccc ccccaaaaaa aagcccccag 6540 gggccgacag ccagcaccgc gaggaagccc acccacccca cacacgacca cggcaaccaa 6600 accagaaccc agaccaccct gggccaccag ctcccagact cggccatcac cccgcagaaa 6660 ggaaaggcca caacccgcgc accccagccc cgatccggcg gggagccacc caacccgaac 6720 cagcacccaa gagcgatccc cgaaggaccc ccgaaccgca aaggacatca gtatcccaca 6780 gcctctccaa gtcccccggt ctcctcctct tctcgaaggg accaaaagat caatccacca 6840 cacccgacga cactcaactc cccaccccta aaggagacac cgggaatccc agaatcaaga 6900 ctcatccaat gtccatcatg ggtctcaagg tgaacgtctc tgccatattc atggcagtac 6960 tgttaactct ccaaacaccc accggtcaaa tccattgggg caatctctct aagatagggg 7020 tggtaggaat aggaagtgca agctacaaag ttatgactcg ttccagccat caatcattag 7080 tcataaaatt aatgcccaat ataactctcc tcaataactg cacgagggta gagattgcag 7140 aatacaggag actactgaga acagttttgg aaccaattag agatgcactt aatgcaatga 7200 cccagaatat aagaccggtt cagagtgtag cttcaagtag gagacacaag agatttgcgg 7260 gagtagtcct ggcaggtgcg 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tatcgctgac aatcaagcaa aatgggctgt cccgacaaca 9840 cgaacagatg acaagttgcg aatggagaca tgcttccaac aggcgtgtaa gggtaaaatc 9900 caagcactct gcgagaatcc cgagtgggca ccattgaagg ataacaggat tccttcatac 9960 ggggtcttgt ctgttgatct gagtctgaca gttgagctta aaatcaaaat tgcttcggga 10020 ttcgggccat tgatcacaca cggttcaggg atggacctat acaaatccaa ccacaacaat 10080 gtgtattggc tgactatccc gccaatgaag aacctagcct taggtgtaat caacacattg 10140 gagtggatac cgagattcaa ggttagtccc tacctcttca ctgtcccaat taaggaagca 10200 ggcgaagact gccatgcccc aacataccta cctgcggagg tggatggtga tgtcaaactc 10260 agttccaatc tggtgattct acctggtcaa gatctccaat atgttttggc aacctacgat 10320 acttccaggg ttgaacatgc tgtggtttat tacgtttaca gcccaggccg ctcattttct 10380 tacttttatc cttttaggtt gcctataaag ggggtcccca tcgaattaca agtggaatgc 10440 ttcacatggg accaaaaact ctggtgccgt cacttctgtg tgcttgcgga ctcagaatct 10500 ggtggacata tcactcactc tgggatggtg ggcatgggag tcagctgcac agtcacccgg 10560 gaagatggaa ccaatcgcag atagggctgc tagtgaacca atcacatgat gtcacccaga 10620 catcaggcat 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gaataacgtg 3960 atgaccttca atgtcaacgt gaaggacatt ctgaacagcc gctttaataa gagagaaaat 4020 ttcaagaacg tcttggagag cgacttgatt ccctataaag acctgacctc ctctaactat 4080 gttgtcaagg acccatacaa gttcctcaat aaagagaaga gggataaatt tctgtctagc 4140 tacaactata tcaaggactc catcgacacc gatatcaatt tcgctaatga tgtgctgggg 4200 tattacaaga tcctgagcga aaaatacaag tctgaccttg actctattaa aaagtatatc 4260 aacgataagc aaggcgagaa tgaaaaatat ctgcccttcc tgaataacat cgaaaccctg 4320 tacaagacag tgaacgacaa aatcgacctc ttcgtaattc acctggaggc caaggtcctc 4380 aactatactt acgagaagag caatgtggaa gttaaaatca aggagctgaa ctacctcaaa 4440 acaatccaag acaagctggc agatttcaag aaaaataaca atttcgtcgg aattgcagac 4500 ctgtctaccg attataacca caacaatctc ctgaccaagt ttctgtccac tggcatggtg 4560 ttcgaaaacc tcgccaaaac agtgctgagc aatctgctcg acggcaacct gcagggcatg 4620 ctgaacatct cccagcacca atgcgtgaag aaacagtgcc cccagaatag cggctgtttc 4680 aggcatctgg acgagcgcga agagtgcaag tgtctcctga actacaaaca agaaggagat 4740 aagtgcgtgg agaacccaaa ccctacctgc aatgaaaaca atggcgggtg tgacgccgat 4800 gctaaatgca ccgaggaaga cagcggctct aacggaaaga aaatcacatg cgagtgtact 4860 aagcccgact cctatccact cttcgacggg atcttctgct ccagctctag caacgttact 4920 acttccggca ctacccgtct tctatctggt cacacgtgtt tcacgttgac aggtttgctt 4980 gggacgctag taaccatggg cttgctgact taa 5013 <210> 10 <211> 1119 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is artificially synthesized CS sequence ORF <400> 10 atgatgagga aactggccat cctgagcgtg agcagcttcc tgttcgtgga ggccctgttt 60 caggagtacc agtgctacgg cagcagcagc aacacccggg tgctgaacga gctgaactac 120 gacaacgccg gcaccaacct gtacaacgag ctggagatga actactacgg caagcaggag 180 aactggtaca gcctgaagaa gaacagccgg tctctgggcg agaacgacga cggcaacaac 240 aacaacggcg acaacggccg ggagggcaag gacgaggaca agcgggacgg caacaacgag 300 gacaacgaga agctgcggaa gcccaagcac aagaaactta agcagcccgc cgacggcaac 360 cccgacccca acgccaaccc caacgtggac cccaacgcca atcctaatgt cgaccccaat 420 gccaatccga acgttgatcc caatgcgaat cctaacgcta accccaatgc caacccaaat 480 gccaatccaa atgcaaatcc caacgccaat ccaaacgcaa accctaatgc taatccaaac 540 gctaatccta atgccaatcc caatgctaac ccaaacgtcg atcctaacgc aaatccgaac 600 gctaacccca acgcaaatcc caacgctaac ccgaacgcaa accctaacgc caatccgaat 660 gccaacccaa acgccaaccc gaacgctaat ccgaatgcta acccgaatgc taatcctaac 720 gcaaacccaa acgcaaaccc caatgcaaac ccaaatgcca atcccaacgc caatcctaat 780 gccaacaaga acaatcaggg caacggccag ggccacaaca tgcccaacga ccccaaccgg 840 aacgtggacg agaacgccaa cgccaacagc gccgtgaaga acaacaacaa cgaggagccc 900 agcgacaagc acatcaagga gtacctgaac aagatccaga acagcctgag caccgagtgg 960 agcccctgca gcgtgacctg cggcaacggc attcaggtgc ggatcaagcc cggcagcgcc 1020 aacaagccca aggacgagct ggactacgcc aatgacatcg agaagaagat ctgcaagatg 1080 gagaagtgca gcagcgtgtt caacgtggtg aactcctga 1119 <210> 11 <211> 1734 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is artificially synthesized DiCo 1 complete sequence ORF <400> 11 ggtaccgtca cgcgtcaccg gtgtcatcat gaccgtggcc aggccctctg tgcctgccgc 60 cctgcccctg ctgggcgagc tgccccggct gctgctcctg gtgctgctgt gcctgcccgc 120 cgtgtgggga tccgtgatcg agatcgtgga gcggagcaac tacatgggca acccctggac 180 cgagtacatg gccaagtacg acatcgagga agtgcacggc agcggcatcc gggtggacct 240 gggcgaggac gccgaggtgg ccggcaccca gtacaggctg cccagcggca agtgccccgt 300 gttcggcaag ggcatcatca tcgagaacag ccagaccacc ttcctgaccc ccgtggccac 360 cgagaaccag gacctgaagg acggcggctt cgccttcccc cccaccaagc ccctgatgag 420 ccccatgacc ctggaccaga tgcggcactt ctacaaggac aacgagtacg tgaagaacct 480 ggacgagctg accctgtgca gccggcacgc cggcaacatg aaccccgaca acgacaagaa 540 cagcaactac aagtaccccg ccgtgtacga cgacaaggat aagaagtgcc acatcctgta 600 tatcgccgcc caggaaaaca acggccccag gtactgcaac aaggacgaga gcaagcggaa 660 cagcatgttc tgcttcagac ccgccaagga caagagcttc cagaactacg tgtacctgag 720 caagaacgtg gtggacaact gggagaaagt gtgcccccgg aagaatctgg aaaacgccaa 780 gttcggcctg tgggtggacg gcaactgcga ggacatcccc cacgtgaacg agttcagcgc 840 caacgacctg ttcgagtgca acaagctggt gttcgagctg tccgccagcg accagcccaa 900 gcagtacgag cagcacctga ccgactacga gaagatcaaa gagggcttca agaacaagaa 960 cgccgacatg atcaagagcg cctttctgcc 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<400> 12 ggtaccgtca cgcgtcaccg gtgtcatcat gaccgtggcc aggccctctg tgcctgccgc 60 cctgcccctg ctgggcgagc tgccccggct gctgctcctg gtgctgctgt gcctgcccgc 120 cgtgtgggga tccgtgatcg agatcgtgga gcggagcaac tacatgggca acccctggac 180 cgagtacatg gccaagtacg acatcgagga agtgcacggc agcggcatcc gggtggacct 240 gggcgaggac gccgaggtgg ccggcaccca gtacaggctg cccagcggca agtgccccgt 300 gttcggcaag ggcatcatca tcgagaacag ccagaccacc ttcctgaccc ccgtggccac 360 cgagaaccag gacctgaagg acggcggctt cgccttcccc cccaccaagc ccctgatgag 420 ccccatgacc ctggaccaga tgcggcactt ctacaaggac aacgagtacg tgaagaacct 480 ggacgagctg accctgtgca gccggcacgc cggcaacatg aaccccgaca acgacaagaa 540 cagcaactac aagtaccccg ccgtgtacga cgacaaggat aagaagtgcc acatcctgta 600 tatcgccgcc caggaaaaca acggccccag gtactgcaac aaggacgaga gcaagcggaa 660 cagcatgttc tgcttcagac ccgccaagga caagagcttc cagaactacg tgtacctgag 720 caagaacgtg gtggacaact gggagaaagt gtgcccccgg aagaatctgg aaaacgccaa 780 gttcggcctg tgggtggacg gcaactgcga ggacatcccc cacgtgaacg agttcagcgc 840 caacgacctg ttcgagtgca acaagctggt gttcgagctg tccgccagcg accagcccaa 900 gcagtacgag cagcacctga ccgactacga gaagatcaaa gagggcttca agaacaagaa 960 cgccgacatg atcaagagcg cctttctgcc aactggcgcc ttcaaggccg acagatacaa 1020 gagccacggc aagggctaca actggggcaa ctacaacaga aagacccaga agtgcgagat 1080 cttcaacgtg aagcccacct gcctgatcaa cgacaagtcc tatatcgcca ccaccgccct 1140 gagccacccc atcgaggtgg agcacaactt cccttgcagc ctgtacaagg atgagatcaa 1200 gaaagagatc gagcgggaga gcaagaggat caagctgaac gacaacgacg acgagggcaa 1260 caagaagatc attgccccca ggatcttcat cagcgacgat aaggacagcc tgaagtgccc 1320 ctgcgacccc gagatcgtgt cccagagcac ctgcaatttc ttcgtgtgca aatgcgtgga 1380 gaagcgggcc gaagtgacca gcaacaacga ggtggtggtg aaagaggaat ataaggacga 1440 gtacgccgac atccccgagc acaagcccac ctacgacaag atgtgatgat gagcgcgcct 1500 gagctc 1506

Claims (42)

  1. 홍역 및 말라리아에 대한 면역 반응 및 보호를 유도할 수 있는 말라리아 항원들을 발현하는 재조합 홍역 백신 바이러스를 포함하는, 홍역-말라리아 조합 백신.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 단일의 또는 상이한 말라리아 항원들을 발현하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 MSP1 말라리아 항원을 발현하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  4. 제1항에 있어서, MSP1 말라리아 항원은 190 내지 200 KDa (dl90)인 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  5. 제1항에 있어서, MSP1 말라리아 항원은 d83-30-38인 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  6. 제1항에 있어서, MSP1 말라리아 항원은 d42인 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 결합된(anchored) 형태 및 분비된 형태의 MSP1 말라리아 항원을 모두 발현하는 것인 홍역-말라리아 백신.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 3D7 균주(strain) 및 MAD 20, 바람직하게는 FCB1 균주에서 유래한, 결합된 형태 및 분비된 형태의 MSP1 말라리아 항원을 발현하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 FCB1 균주에서 유래한 결합된 형태 및 분비된 형태의 MSP1 말라리아 항원을 모두 발현하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  10. 제1항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 다양성 커버링(Diversity Covering, DiCo) AMA1 말라리아 항원을 발현하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  11. 제1항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 AMA1 말라리아 항원의 DiCo-1을 발현하는 것인 홍역-말라리라 조합 백신.
  12. 제1항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 AMA1 말라리아 항원의 DiCo-2를 발현하는 것인 홍역-말라리라 조합 백신.
  13. 제1항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 AMA1 말라리아 항원의 DiCo-3을 발현하는 것인 홍역-말라리라 조합 백신.
  14. 제1항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 AMA1 말라리아 항원의 DiCo-1, DiCo-2 및 DiCo-3을 발현하는 것인 홍역-말라리라 조합 백신
  15. 제10항 내지 제14항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 막관통(trans membrane) 및 분비된 형태의 AMA1 말라리아 항원의 다양성 커버링 (DiCo)을 발현하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  16. 제1항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 CS 말라리아 항원을 발현하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말라리아 항원은 재조합 홍역 백신 바이러스의 P와 M 단백질 사이 또는 H와 L 단백질 사이에 클로닝된 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  18. 말라리아 항원의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 홍역 백신 바이러스 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 도 26 내지 도 35로부터 선택되는 것인 벡터.
  20. 제18항 및 제19항에 있어서, 상기 홍역 백신 바이러스 벡터는 도 24 내지 도 25로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 추가적으로 포함하는 것인 벡터.
  21. 제18항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 MSPl의 d83-30-38 및 d42 및 dl90 절편(fragment), 또는 다양성 커버링(DiCo) AMA1 또는 CS 단백질로부터 선택되는 말라리아 항원을 코딩하는 것인 벡터.
  22. 제18항의 벡터를 포함하는 숙주.
  23. 제22항에 있어서, 대장균(E.Coli) 또는 포유동물 세포주(mammalian cell line)로부터 선택되는 것인 숙주.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 홍역 바이러스는 에드모스톤 자그렙(Edmoston Zagreb)에서 유래한 백신주에 기원하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 MSPl의 d83-30-38 및 d42 및 dl90 절편, 또는 다양성 커버링(DiCo) AMA1 또는 CS 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 말라리아 항원을 발현하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 MSPl의 d83-30-38 및 d42 및 dl90 절편 또는 다양성 커버링(DiCo) AMA1 또는 CS 단백질, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 둘 이상의 말라리아 항원을 발현하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 하기 서열을 포함하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
    MSP-1 d-190-3D7 ANlOlTE
    MSP-1 d-190*-3D7 AN102TE
    MSP-1 d-83-30-38-3D7 AN103TE
    MSP-1 d-83-30-38*-3D7 AN104TE
    MSP-1 d-42-3D7 AN105TE
    MSP-1 d-42*-3D7 AN106TE
    MSP-1 d-190-FCBl AN107TE
    CS AN108TE
    DiCo1-complete AN109TE
    DiCol-ecto AN1lOTE
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 홍역 백신 바이러스는 아쥬반트 특성을 갖는 말라리아 항원 단백질을 추가적으로 코딩하는 것인 홍역-말라리아 조합 백신.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 말라리아 항원에 더하여, 인터루킨(interleukin), 바람직하게는 인터루킨 2를 코딩하는 재조합 홍역 바이러스를 포함하는 것인 백신.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 설명된 재조합 홍역 말라리아 바이러스 중 하나, 또는 둘 내지 여러 개의 그와 같은 바이러스의 혼합물을 포함하는 것인 백신.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설명된 재조합 홍역 말라리아 바이러스 또는 둘 내지 여러 개의 그와 같은 바이러스의 혼합물은 결손 간섭 입자(defective interfering particle, DI)가 결여된 것인 백신.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 우발적으로 발생한 DI 입자는 플라크 정제(plaque purification)에 의해 제거된 것인 백신.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 우발적으로 발생한 DI 입자는 종말점 희석(end point dilution)에 의해 제거된 것인 백신.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 우발적으로 발생한 DI 입자는 분별 원심분리(differential centrifugation)와 같은 물리적 방법에 의해 제거된 것인 백신.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 성분들은 단독의 또는 조합된, 자연적으로 약독화되거나 또는 재조합된, 루벨라(rubella), 볼거리(mumps), 수두(varicella) 또는 또다른 생약독화(life attenuated) 백신 바이러스인, 조합 백신의 한 성분인 것인 백신.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비경구 적용에 이상적인, 젤라틴 및/또는 인간 혈청 알부민 및 소르비톨과 같은 적합한 안정화제를 주 성분으로서 포함하는 것인 백신.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 비강내(intranasal) 적용에 이상적인, 적합한 안정화제 및/또는 아쥬반트(adjuvant)를 포함하는 것인 백신.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 흡입 적용에 이상적인, 적합한 안정화제 및/또는 아쥬반트를 포함하는 것인 백신.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 경구 적용에 이상적인, 적합한 안정화제 및/또는 아쥬반트를 포함하는 것인 백신.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 경피(transdermal) 적용에 이상적인, 적합한 안정화제 및/또는 아쥬반트를 포함하는 것인 백신.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 좌약 제제(suppository formulation)에 이상적인, 적합한 안정화제 및/또는 아쥬반트를 포함하는 것인 백신.
  42. 안정화제 및/또는 아쥬반트를 포함하는 홍역-말라리아 조합 백신의 조성물.
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