KR20150045872A - 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 레플리콘을 사용한 구제역 백신주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 레플리콘을 사용한 구제역 백신주에 관한 것이다. 본 발명은 구제역 바이러스의 구조 단백질을 발현하지만 RNA가 캡시드 내에 포함되지 않아 안전성이 높으면서도 방어능이 향상된 백신주를 개발, 생산하는 데 유용하게 이용할 수 있다. 본 발명의 백신주를 사용하면 오일 어주번트를 필수적으로 사용하지 않아도 되므로 돼지 목근육 부위의 폐기로 인한 엄청난 경제적 손실을 막을 수 있다.

Description

돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 레플리콘을 사용한 구제역 백신주{Foot-and-mouth disease vaccine strain using Porcine Reproductive and Respiraritory Syndrome virus replicon}

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 바이러스 레플리콘을 사용한 구제역 백신주에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-mouth disease, FMD)은 우제류에 감염되는 가축 전염병이다. FMD에 감염되면 발열, 발과 입의 물집, 물집으로 인한 파행 증상이 나타나며, 입, 혀, 코, 발 및 유두에 수포성 병변이 발생한다. FMDV는 숙주의 인두에서 급속하게 복제되어 48시간 내에 혈류로 진입함으로써 입과 발에 병변을 유발하며, 에어로졸, 직접 접촉, 오염된 축산물을 통하여 전파된다. 최근 연구에 따르면 돼지가 이 질병의 주요한 인자로서 질병 전파에 중요한 역할을 하는데, 이는 감염된 단 한 마리의 돼지가 단시간 내에 3000 마리의 소에 해당하는 에어로졸 바이러스를 방출하기 때문이다(Moraes et al., 2002).

FMDV는 항원 변이성이 가장 높은 바이러스 중의 하나인데, 이는 복제 과정에서 에러가 발생하기 쉬운 구조이고, 3D 폴리머라제 유전자 교정(3D pol gene proofreading) 및 복제후 수리 활성이 결여되어 있기 때문이다. 따라서, FMD 백신은 type O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1 타입을 포함하는 7개의 혈청형을 갖는다. 이 중에서 O 혈청형이 중국 및 그 주변 국가에 가장 만연해 있다.

따라서 구제역 백신으로 생독백신은 잘 사용되고 있지 않으며, 현재 사독백신이 전세계적으로 널리 사용되고 있다. 일반적인 사독백신은 면역원성이 떨어져 오일 어주번트(oil adjuvant)를 사용하는데, 이로 인해 백신 접종한 이근부 이하 목근육에 비화농성병소가 발생되는 부작용이 나타난다. 이 부위는 식육으로서 가치가 특히 높은 부분이므로 연간 1천억원에 해당하는 피해액이 발생하고 있다.

본 발명은 구제역 백신으로 사용할 수 있는, 변형된 구제역 유전자가 삽입된 돼지 생식기 호흡기 바이러스 레플리콘을 제공한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4로 기재되는, 변형된 구제역 바이러스 유전자를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 레플리콘 DNA를 제공한다.

본 발명에 있어서 '레플리콘'이란 하나의 복제 기점으로부터 복제되는 DNA 또는 RNA 영역을 말한다. 본 발명의 레플리콘은 스스로를 복제할 수 있으나 바이러스 입자를 구성하는 데 필수적인 단백질을 코딩하는 지놈이 삭제되어 감염력은 없다.

본 발명은 상기 서열번호 4로 기재되는 레플리콘 DNA로부터 역전사된 RNA를 제공한다.

본 발명에 있어 상기 서열번호 4로 기재되는 레플리콘 DNA는 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자를 포함할 수 있다.

상기 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자는 FMDV의 O형(Genbank accession No HM229661, 홍콩 변이주)에서 P1, 2A, 3C 영역을 이은 것에 해당한다. P1에 의하여 FMDV의 캡시드 단백질이 polyprotein으로서 발현되고, 2A 및 3C에 의하여 절단된다. P1-2A-3C 유전자에 의하여 발현되는 단백질은 감염성은 없으나 전체 바이러스 입자와 유사한 입자를 형성하여 강력한 면역원성을 발휘한다. 상기 유전자는 진핵세포에서 발현시키기 위하여 아미노산 서열을 변경시키지 않는 한도 내에서 코돈 최적화될 수 있으며, 이러한 코돈 최적화는 당업자에게 자명하다. 상기 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자로 암호화되는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 20으로 기재하였다.

본 발명은 상기 서열번호 4로 기재되는 레플리콘 DNA를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 수탁번호 KCCM11457P인 세포 또는 수탁번호 KCCM11560P일 수 있다. 또한 상기 세포는 Escherichia coli DH5α 세포일 수 있다.

본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자 DNA를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자 DNA가 역전사된 RNA를 제공한다.

본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자 DNA를 포함하는 세포를 제공한다.

본 발명은 구제역 바이러스 VP1 유전자를 포함하는 레플리콘 DNA를 포함하는 세포를 제공한다. 상기 세포는 수탁번호 KFCC11559P인 세포일 수 있다.

본 발명은 상기 DNA 또는 RNA를 포함하는 구제역 백신을 제공한다. 상기 백신은 동물용인 백신일 수 있으며, 상기 동물은 돼지일 수 있다.

본 발명은 상기 유전자 및 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 포함하는 구제역 백신을 제공한다. 본 발명의 일 구현예로서, 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 서열번호 1로 기재되는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 또는 서열번호 2로 기재되는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예로서, 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 N 유전자가 제거된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주일 수 있으며, 이 변이주는 서열번호 5로 기재되는 것일 수 있다.

상기 백신은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트(adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 불활화된 것일 수 있다.

본 발명은 상기 세포를 이용하여 구제역 백신을 생산하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 구제역 백신을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은

1) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 발현벡터화하는 단계;및

2) 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자를 상기 발현벡터에 삽입하는 단계를 포함하는, 변형된 구제역 바이러스 유전자가 삽입된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 기반 발현벡터의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 '발현벡터화'는 바이러스에 다중 클로닝 자리(multiple cloning site, MCS) 및 전사 개시서열(TRS)을 삽입하여 외부 유전자가 삽입되어 발현될 수 있도록 한 것을 말한다.

또한 본 발명은

1) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 발현벡터화하는 단계;

2) 구제역 바이러스의 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자를 상기 발현벡터에 삽입하는 단계;및

3) 상기 발현벡터에서 ORF1 내지 6에 해당하는 부분을 제거하는 단계를 포함하는, 변형된 구제역 바이러스 유전자가 삽입된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 레플리콘의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 3)단계는

ⅰ. 상기 발현벡터에서 ORF 1 내지 7에 해당하는 부분을 제거하는 단계; 및

ⅱ. 상기 발현벡터에서 ORF 7에 해당하는 부분을 삽입하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 FMDV의 구조 단백질인 캡시드를 발현하지만 FMDV의 RNA가 캡시드 내에 포함되지 않아 안전성이 높으면서도 방어능이 향상된 백신을 개발하는 데 유용하게 이용할 수 있다. 본 발명의 레플리콘을 사용하면 오일 어주번트(oil adjuvant)를 필수적으로 사용하지 않아도 되므로 돼지 목근육 부위의 폐기로 인한 엄청난 경제적 손실을 막을 수 있다.

도 1은 PRRSV의 ORF를 나타낸 모식도이다.
도 2는 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘의 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘으로 MARC-145 세포를 형질감염시킨 경우 면역형광분석으로 단백질의 발현을 확인한 것이다. 좌측 도는 PRRSV의 N 단백질 발현을 나타낸 것이고, 우측 도는 FMDV의 VP1 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 4는 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘 및 PK418DM으로 MARC-145 세포를 공동감염시킨 경우에 면역형광분석으로 단백질의 발현을 확인한 도이다. 좌측 도는 PRRSV의 N 단백질 발현을 나타낸 것이고, 우측 도는 FMDV의 VP1 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 5는 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘으로 형질감염된 세포에 추가적으로 K418DM을 감염시킨 경우에 면역형광염색으로 단백질의 발현을 확인한 도이다. 좌측 도는 PRRSV의 N 단백질 발현을 나타낸 것이고, 우측 도는 FMDV의 VP1 단백질 발현을 나타낸 것이다.
도 6은 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘으로 감염시킨 돼지 폐포 대식시포(좌측)를 감염되지 않은 세포(우측)과 비교한 전자현미경 사진이다.
도 7은 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘으로 감염시킨 돼지 폐포 대식시포에서 PRRSV의 N 단백질 및 FMDV의 VP1 단백질이 발현됨을 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 8은 GFP를 함유한 PRRSV 플라스미드를 사용하여 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘을 돼지 폐포 대식세포에 형질감염시킨 경우 형광이 발현되는 것을 확인한 결과이다.

FMDV, PRRSV 모두 RNA 바이러스에 해당하나, RNA는 쉽게 파괴되기 때문에 DNA로 바꾸어서 모든 작업을 수행한 후에 이로부터 RNA를 합성하여 세포를 형질감염시켰다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. PRRS 바이러스 벡터 준비

1-1. NVSL 97-9785 변이주 및 LMY 변이주 간의 관계 확인

북아메리카 타입의 분리주에 속하는 2가지 바이러스 변이주인 NVSL 97-9785 및 LMY를 사용하여 PRRS 키메릭 바이러스 제작에 사용하였다. NVSL 97-9785는 모돈에서 유사산을 야기시키는 강독주로 알려져 있으며 (Allende et al., 2000), LMY는 한국의 대표 균주로 병원성이 강하지 않은 것으로 알려져 있다 (Cha SH et al., 2006).

PRRS 바이러스의 GP5 단백질은 분리주 별로 변이율이 가장 높은 단백질로써 바이러스의 중화능에 관여하는 중화 항체 에피토프를 포함하고 있어 중요한 역할을 하며, PRRS 바이러스의 계통을 분류하는 데에도 이용되고 있다. 각국의 분리주 및 백신주로 사용되고 있는 PRRS 바이러스의 GP5 단백질에 의한 계통수(phylogenetic tree)는 도 1과 같다. 하단의 막대는 뉴클레오티드 위치마다 0.05개의 뉴클레오티드 치환이 있음을 의미한다. 도 1에서 NVSL 97-9785 및 LMY는 서로 85% 정도 유전적 관계가 있는 균주인 것을 알 수 있다.

1-2. NVSL 97-9785 변이주 및 LMY 변이주의 준비

미국 네브라스카 링컨 대학의 Dr. Fernando Osorio 및 Dr. Asit Pattnaik로부터, pBR322 벡터에 NVSL 97-9785 변이주의 모든 유전자가 삽입된 감염성 클론인 FL12의 cDNA 클론인 pFL12를 공급받아 사용하였다.

한국에 가장 만연한 분리주인 LMY의 전체 구조 유전자를 포함하는 지놈 영역을 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 역전사효소 PCR로 증폭하였다.

[표 1]

1-3. 키메릭 바이러스 클론의 제작

1-2에서 증폭한 LMY 변이주의 전체 구조 유전자를 포함하는 지놈 영역에서 ORF2부터 ORF7까지의 부위를 제한효소인 ECoRV 및 PacI를 사용하여 절단한 후, pFL12의 해당 부위와 치환하여 플라스미드를 제작하고 이를 K418로 명명하였다.

상기 K418 플라스미드에서 GP5를 코딩하는 지놈 영역에, GP5가 달라붙게 하는 아스파라긴의 코돈에 위치지정 돌연변이를 일으켜 다른 아미노산으로 치환함으로써 GP5의 N-글리코실화 부위를 제거하였다. 즉 GP5는 바이러스 중화능에 중요한 역할을 하는 부분인데, GP5의 탈글리코실화를 통해 중화항체 형성에 관여하는 에피토프를 노출시킴으로써 활발한 항체 생성을 유도할 수 있도록 한 것이다. 이렇게 제작된 변종 플라스미드를 K418DM으로 명명하였다. QIAprep Spin Midiprep kit (Qiagen, Korea)를 사용하여 전체 길이 변종 플라스미드를 추출, 준비하였다.

상기 K418을 포함하는 DH5α 세포를 수탁번호 KCCM11458P로 기탁하였다.

1-4. K418DM 의 발현 벡터화

K418DM의 ORF1b 및 ORF2는 overlapping되지 않으며 그 사이에 한 개의 뉴클레오티드가 존재한다. 따라서 본 발명자들은 ORF1b 및 ORF2 사이에 유전자를 삽입하기가 보다 용이할 것으로 판단하였다.

(1) AscI - SwaI - FseI 및 TRS 가 삽입된 ORF1b / ORF2a junction 의 flanking sequence 단편 제작

먼저 K418DM의 ORF1b/ORF2a junction의 flanking sequence에 다중 클로닝 자리로 작용할 효소 자리(AscI-SwaI-FseI) 및 인공 전사 개시 서열(TRS)을 도입한 DNA 단편을 하기와 같이 overlapping PCR을 통해 제작하였다.

AscI-SwaI-FseI 효소 자리 및 TRS를 포함하도록 합성한 12AR 및 12AF 프라이머(마크로젠, 한국)를 사용하여 K418DM의 ORF1b/ORF2a junction의 flanking sequence를 PCR을 수행하여 두 개의 단편으로서 증폭하였다. 이 단편 혼합물을 정제한 후 주형으로 사용하고, Pk418-11643F 및 Pk418-12194R 프라이머(본 발명자들이 합성)를 사용하여 PCR을 수행하여 하나의 완전히 변형된 단편으로 만들었다. 도 2의 모식도에 나타난 바와 같이, 이렇게 제작된 단편에는 AscI-SwaI-FseI 효소 자리 및 TRS가 존재하게 된다. TRS의 위치는 AscI-SwaI-FseI 효소 자리로부터 22개 뉴클레오티드 하류에 해당하며, 이는 K418DM에 다시 도입하였을 때 ORF2의 개시코돈에서 26개 뉴클레오티드 상류에 해당하는 위치이다. TRS는 프로모터와 같이 작용하여 하류의 유전자의 발현을 유도하는 역할을 한다.

상기 AscI-SwaI-FseI 및 TRS가 삽입된 ORF1b/ORF2a junction의 flanking sequence 단편을 pCR8/GW/TOPO 클로닝 벡터에 TA cloning kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 접합하였고, 이 벡터로 DH5α 세포를 형질전환시켰다. 형질전환이 성공적으로 이루어졌는지 여부는 스펙티노마이신 항생제 내성을 사용하여 스크리닝하여 확인하였다. 형질전환이 성공적으로 이루어져서 스펙티노마이신에 살아 남는 콜로니를 선택하였다.

(2) AscI - SwaI - FseI 및 TRS 가 삽입된 ORF1b / ORF2a junction 의 flanking sequence 단편을 K418DM 에 도입

상기 AscI-SwaI-FseI 및 TRS가 삽입된 ORF1b/ORF2a junction의 flanking sequence 단편을 K418DM에 도입하기 위하여 하기의 과정을 수행하였다.

K418DM의 뉴클레오티드 위치 11671 및 12163에는 HpaI 및 EcoRV 효소 자리가 존재한다. 따라서 본 발명자들은 K418DM을 HpaI 및 EcoRV로 처리하여 K418DM에서 뉴클레오티드 위치 11671 내지 12163이 결실된 DNA를 얻었다.

그 후 상기 (1)에서 수득한 형질전환된 DH5α 세포로부터 재조합 플라스미드를 회수한 후 이를 HpaI 및 EcoRV로 처리하여 AscI-SwaI-FseI 및 TRS가 삽입된 ORF1b/ORF2a junction의 flanking sequence 단편을 포함하는 DNA 단편을 얻었다.

상기 DNA들을 Dokdo-PrepTM Gel Extraction Kit (ELIPIS BIOTECH, Korea)를 사용하여 정제되었다. 그 후 T4 DNA 리가아제를 사용하여 AscI-SwaI-FseI 및 TRS가 삽입된 ORF1b/ORF2a junction의 flanking sequence 단편을 포함하는 DNA 단편이 K418DM 내로 접합되도록 하였다. 상기 접합된 K418DM은 pCR8/GW/TOPO 클로닝 벡터에 TA cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 접합하였고, 이 벡터로 DH5α 세포를 형질전환시켰다.

상기 형질전환된 DH5α 세포로부터 재조합 플라스미드에 해당하는 pCR8/GW/TOPO 클로닝 벡터를 다시 분리하고, 제한 효소를 처리한 후 시퀀싱하여 분석하여 상기 과정들이 성공적으로 수행되었음을 확인하였다.

하기 표는 1-4에서 사용된 프라이머 서열을 정리한 표이다. TTAACC는 TRS를 의미하며, 밑줄로써 나타내었다.

[표 2]

실시예 2. P1 -2A-3C 유전자 단편 제작

FMDV는 non-enveloped, icosahedral capsid 바이러스로서 Pricornaviridae 과의 Aphthovirus 속에 속한다. FMDV의 지놈은 compact positive-strand RNA이고 약 8300 뉴클레오티드 길이이고 한 개의 ORF로 구성되어 있다. FMDV의 지놈은 하나의 ORF로 번역되어 전구체 polyprotein을 생성하며, 전구체 polyprotein은 바이러스에 의해 코딩되는 프로테아제에 의해 중간체 및 성숙 구조단백질 및 비구조단백질로 절단된다. 최초 절단 산물에 기초하여, 지놈 ORF는 각각 L, P1, P2 및 P3 영역을 포함하는 4개의 영역으로 나누어진다. 지놈의 P1 영역은 네 개의 바이러스 구조단백질(VP4, VP2, VP3 및 VP1)을 암호화한다. P1 영역 다음에 나오는 것은 P2 영역이며, 세 개의 바이러스 비구조 단백질인 2A, 2B 및 2C를 암호화하고, P3 영역은 비구조 단백질인 3A, 세 copy의 VPg(3B1, 3B2 및 3B3), 3Cpro 및 3Dpol을 암호화한다. 프로테아제 3C는 바이러스 구조단백질의 절단에 있어서 중요한 역할을 수행하며 적절한 folding 및 감염된 세포내에서의 바이러스 조립을 가능하게 한다 (Belsham, 1993;GRUBMAN et al.,1995; Pariente et al.,2005).

2-1. P1 -2A-3C 유전자 합성

한국의 바이오니어(주)에서 FMDV의 O형(Genbank accession No HM229661, 홍콩 변이주) 바이러스에 진핵세포 발현에 최적화되도록 코돈을 최적화시켜 신규한 P1-2A-3C 유전자를 합성하였다.

합성된 P1-2A-3C 유전자에 두 개의 효소 자리(AscI 및 FseI)를 5' 과 3' 말단에 각각 도입하였다. 더 나아가, 합성된 P1-2A-3C 유전자의 양 말단 사이에도 내재적 FseI site가 존재하므로, 이 부분을 제한효소가 인식하지 못하도록 프라이머인 MF 및 MR과 위치지정 돌연변이(site-directed-mutagenesis) 키트(Qiagen, USA)를 사용하여 코돈을 변화시키지 않는 위치지정 돌연변이를 내재적 FseI 사이트에 일으켰다. 이렇게 합성된 전체 길이 P1-2A-3C 유전자를 PCR로 증폭한 후, pCR8/GW/TOPO TA 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. 한국 마크로젠 사에서 시퀀싱하여 삽입된 P1-2A-3C 유전자를 확인하였다.

MF 및 MR 프라이머의 시퀀스는 하기 표에 나타내었다.

[표 3]

2-2. P1 -2A-3C의 K418DM 발현벡터 내로의 도입

실시예 1에서 준비한 발현벡터화된 K418DM을 포함하는 pCR8/GW/TOPO TA 클로닝 벡터에 AscI 및 FseI를 처리하였다.

실시예 2-1에서 준비한 P1-2A-3C 유전자를 포함하는 pCR8/GW/TOPO TA 클로닝 벡터에 AscI, FseI 및 XhoI 제한 효소를 처리하여 P1-2A-3C 유전자 단편만을 수득하였다. XhoI 제한효소는 TA 클로닝 벡터를 한번 더 절단하여 P1-2A-3C와 크기를 달라지게 하여 전기영동시 명확히 구별되도록 처리하기 위함이다.

상기 K418DM 및 P1-2A-3C 유전자를 T4 DNA 리가아제로 접합하고, 이 벡터를 K418DM-P1-2A-3C로 명명하였다. K418DM-P1-2A-3C을 이용하여 DH5α 세포를 형질전환 시켰다. 형질전환된 세포로부터 시퀀싱을 통하여 단편 삽입 여부를 확인하였다.

2-3. K418DM - P1 -2A-3C의 레플리콘화

(1) ORF 2 내지 7의 제거

2-2에서 제작된 K418DM-P1-2A-3C을 추가적으로 변형하여 레플리콘을 제작하기 위해 하기의 과정을 수행하였다.

EcoRV 및 PacI 효소 자리의 flanking sequence가 되도록 서로 overlapping되는 프라이머인 17R 및 17F 프라이머를 디자인하였다. K418DM-P1-2A-3C를 주형으로 하고 17R 및 17F 프라이머를 사용하여 overlapping PCR을 수행하였다. 합성된 두 종류의 DNA 단편 혼합물을 주형으로 하고 12AF 및 pacI R 프라이머를 사용하여 하나의 완전한 단편을 합성하여 증폭하였다.

증폭된 단편을 TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 pCR8/GW/TOPO 클로닝 벡터 내로 접합하였다.

상기 17R 및 17F 프라이머에는 EcoRV 및 PacI 효소 자리가 포함되고 PCR 산물에서 ORF 2 내지 7에 해당하는 부분이 두 효소 자리 사이에 위치하는 형태로 합성되도록 디자인되었다. 따라서 EcoRV 및 PacI를 처리하여 ORF 2 내지 7에 해당하는 부분을 K418DM-P1-2A-3C으로부터 제거하였다.

상기 재조합 pCR8/GW/TOPO 클로닝 벡터로 Escherichia coli DH5α 세포를 형질전환시켰다. 시퀀싱을 통하여 유전자 삽입 여부를 확인하였다.

(2) ORF7 (N 유전자)의 도입

ORF 7은 PRRSV의 Nucleocapsid(N) 단백질을 코딩하는 부분이기 때문에, ORF 7이 결여되면 K418DM-P12-2A-3C의 유전자 복제 능력이 상실된다. 따라서 ORF 7을 다시 삽입하기 위하여 하기의 과정을 수행하였다.

K418의 ORF 7이 삽입된 플라스미드를 준비하였다. 상기 플라스미드 및 상기 (1)에서 준비한 ORF 1 내지 6이 제거된 K418DM-P1-2A-3C이 포함된 플라스미드를 EcoRV 및 PacI 효소로 처리하고 접합하였다. 이렇게 재조합된 유전자를 pCR8/GW/TOPO 클로닝 벡터 내로 접합하였다. 상기 재조합 pCR8/GW/TOPO 클로닝 벡터로 Escherichia coli DH5α 세포를 형질전환시켰다. 시퀀싱을 통하여 유전자 삽입 여부를 확인하였다. 상기 세포를 수탁번호 KFCC11560P 및 KCCM11457P로 기탁하였다.

이렇게 제작된 레플리콘은 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘(또는 PRRSVK418-P12A3C라고 지칭. 'DM'은 VP1 부분에 탈글리코실화가 일어난 'double mutant'의 약자인데, 상기 레플리콘에서는 VP1을 포함하는 ORF5가 누락되어 있기 때문이다)으로 명명하였다. 이 레플리콘에서, P1-2A-3C의 하류 22 뉴클레오티드에 위치하는 TRS6에 의해 N 유전자의 전사가 유도될 것이다. PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘은 복제 능력이 있지만 ORF 2 내지 6에 해당하는 부분이 결여되어 있어 완전한 PRRS 바이러스 입자를 형성하지는 못한다. 따라서 감염된 세포에서 P1-2A-3C 유전자를 발현하지만 주변 세포로 감염을 전파시키지는 못한다.

하기 표에 실시예 2에서 사용한 프라이머를 정리하였다.

[표 4]

한편 상기 실시예 1 내지 2의 과정에서 K418DM의 ORF1b 이후에 FMDV의 VP1 단백질 유전자만을 삽입한 레플리콘도 제조하고 PRRSVK418DM-FMDVVP1 레플리콘이라고 명명하였다. 상기 레플리콘을 포함하는 Escherichia coli DH5α 세포는 수탁번호 KFCC11559P로 기탁하였다.

실시예 3. PRRSVK418DM - P12A3C 레플리콘의 MARC -145 세포의 형질감염( transfection )

3-1. RNA 전사물의 합성

QIAprep SPin Miniprep kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 하기와 같이 실시예 2에서 제작한 형질감염된 Escherichia coli DH5α 세포로부터 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘이 삽입된 pCR8/GW/TOPO 클로닝 벡터를 추출하고 정제하였다.

먼저 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘이 삽입된 pCR8/GW/TOPO 클로닝 벡터 10 μg를 AcII 또는 PacI 제한 효소로 절단하여 선형화시키고, 추가적으로 녹두 뉴클레아제를 처리하고, 이어서 페놀:클로로폼을 사용하여 DNA를 추출 및 정제하였다.

상기 정제된 선형화된 DNA를 주형으로 Mmessage MACHINE SP6 kit(Ambion, USA)를 제조자의 프로토콜에 따라서 사용하여 RNA를 합성하였다. 그 후 주형으로 넣어준 DNA를 제거하기 위해 DNase로 RNA로 처리하였다. 수득된 RNA는 nuclease-free water에 용해하였다.

3-2. MARC -145 세포의 형질감염

MARC-145 세포(Afican Green Monkey kidney epithelial cell line)을 준비하고, 5% FBS 및 항생제를 함유하는 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂에서 유지하였다. 그 후 PBS에 400 μl 당 2×10⁶ 개의 MARC-145 세포가 포함되도록 현탁하였다.

감염되지 않은 MARC-145 세포로부터 total cellular RNA를 추출하였다.

2개 군의 MARC-145 세포를 준비하여, 1개 군에는 상기 3-1에서 준비한 RNA 전사물 1 μg 및 감염되지 않은 MARC-145 세포로부터 추출한 RNA 9 μg을 전기천공을 통해 형질감염시켰다.

또 다른 1개 군에는 상기 3-1에서 준비한 RNA 전사물 1 μg과 K418DM 1 MOI 및 상기 감염되지 않은 MARC-145 세포로부터 추출한 RNA 9 μg을 전기천공을 통해 공동 형질감염시켰다.

전기천공에는 Bio-Rad Gene Pulser Xcell을 사용하여 250 V, 950 μF에서 4.0 mm 큐벳을 사용하였다.

형질감염된 MARC-145 세포는 완전 배지(낮은 글루코오스 및 중탄산염을 포함하는 DMEM 배지로서, 10% FBS, 항생제 및 1.25% DMSO를 포함)에서 배양하였다. 그 후 6 well 플레이트에 분주하고 2일간 배양하여 log phase에 도달할 때까지 성장시켰다. 세포를 5% FBS를 포함하는 DMEM으로 1회 세척한 후, FBS는 포함하지 않고 1.25% DMSO를 포함하는 DMEM으로 2회 세척하였다.

상기 3-1에서 준비한 RNA 전사물 및 감염되지 않은 MARC-145 세포로부터 추출한 RNA만으로 형질감염된 MARC-145 세포들 중 일부는 형질감염 96시간 후에 1 MOI의 K418DM을 추가적으로 형질감염시켰다.

형질감염된 세포 일부는 바이러스 회수를 위하여 60 mm 세포 배양 플레이트로부터 10% FBS 및 1.25% DMSO를 포함하는 DMEM으로 이동시켰다. 또 다른 일부는 면역형광분석을 위해 별도의 플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 하에서 배양하였다. 16시간 후에 세포를 세척하고 5% FBS를 함유하는 DMEM으로 배지를 교체하였다. 백신주로 사용할 바이러스를 준비하기 위하여 형질감염된 세포들을 96시간 배양 후 상청액을 수집하여 60 mm 플레이트에 분주하였고, 100 mm 플레이트에서 새로운 MARC-145 세포로 stock 바이러스를 계대하였다.

3-3. 면역형광분석

3-2의 형질감염 48시간 후에, 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 차가운 메탄올:아세톤(1:1) 용액으로 10분간 실온에서 고정시켰고, 세포를 5분간 air-dry 시킨 후 다시 PBS로 1회 세척하였다. 그 후 PRRSV의 Nucleocapsid (N) 단백질에 특이적인 항체인 MAb SDOW-17 및 FMDV O형의 VP1 에 특이적인 항체인 VP1-MAb를 첨가하여 PBS 내에서 1시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. P1은 3C에 의해서 VP1, VP2, VP3, VP4로 소화되었다가, 다시 합쳐져서 캡시드를 형성하므로, VP1에 대한 항체만으로도 P1-2A-3C의 P1의 발현을 확인할 수 있는 것이다. 이 발현세포를 PBS로 3회 세척한 후에, 1시간 동안 FITC-conjugated goat anti-mouse IgG(H+L) 이차항체를 첨가하여 배양하였다. 그 후 세포를 PBS로 3회 세척하고, 형광 현미경으로 관찰하였다.

결과는 도 3 내지 5에 나타내었다.

도 3은 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘으로 MARC-145 세포를 형질감염시킨 경우 면역형광분석으로 단백질 발현을 확인한 것이다. 좌측 도는 PRRSV의 N 단백질 발현을 나타낸 것이고, 우측 도는 FMDV의 VP1 단백질 발현을 나타낸 것이다.

도 4는 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘 및 K418DM으로 MARC-145 세포를 공동감염시킨 경우에 면역형광분석으로 단백질의 발현을 확인한 도이다. 좌측 도는 PRRSV의 N 단백질 발현을 나타낸 것이고, 우측 도는 FMDV의 VP1 단백질 발현을 나타낸 것이다.

도 5는 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘으로 형질감염된 세포에 96시간 배양 후 K418DM을 감염시킨 경우에 면역형광분석으로 단백질의 발현을 확인한 도이다. 좌측 도는 PRRSV의 N 단백질 발현을 나타낸 것이고, 우측 도는 FMDV의 VP1 단백질 발현을 나타낸 것이다.

상기에서 PRRSV의 N 단백질이 발현되었다는 것은 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘이 형질감염되고 복제력이 있음을 의미하며, FMDV의 VP1 단백질이 발현되었다는 것은 FMDV의 P1-2A-3C 유전자가 상기 레플리콘이 형질감염된 세포에서 발현된다는 것을 의미한다.

도 3에서는 직접적으로 형질감염된 세포만이 형광을 보이는 반면에, 도 4 및 도 5에서는 거의 모든 세포에서 형광을 보이는 것으로 보아 직접적으로 형질감염된 세포 주변의 세포들까지 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘으로 형질감염이 되는 것을 알 수 있다. 이로부터 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘 자체는 감염력이 없으나, K418DM에 의하여 구조적 단백질을 발현하는 능력을 얻게 되어서 자체적으로 감염능력을 갖게 됨을 알 수 있다.

실시예 4. PRRSVK418DM - P12A3C 레플리콘의 돼지 폐포 대식세포의 형질감염

상기 실시예 3에서 MARC-145 세포주에 본 발명의 레플리콘을 형질감염시켜 단백질 발현 여부를 확인하였으나, MARC-145 세포주는 원숭이 유래 세포주이기 때문에 PRRSV 분리 및 배양에 제한이 있다. 따라서 본 발명의 레플리콘의 형질감염 여부를 돼지 폐포 대식세포(Porcine alveolar macrophage, PAM)에서 추가적으로 확인하였다.

일반적인 돼지 폐포 대식세포는 유효 계대 수가 1~2회로 짧기 때문에, 한번 제조한 세포주로부터 반복해서 바이러스를 추출할 수 없다. 따라서 SV40 바이러스의 거대 T 항원(large T antigen)을 이용하여 불멸화시킨 돼지 폐포 대식세포를 실험에 사용하였다.

4-1. 돼지 폐포 대식세포의 형질감염

불멸화된 돼지 폐포 대식세포를 1.5 g/L의 탄산수소나트륨으로 pH가 보정된, 2 mM L-글루타민, 4.5 g/L 글루코오스, 10 mM HEPES, 0.1 mM의 비필수 아미노산이 첨가된 1.0 mM 피루브산 나트륨 및 10% 소태아혈청이 포함된 RPMI 1640 배지에서 계대배양하였다.

상기 3-2에서와 동일한 방법으로 준비한, PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘이 단독 형질감염된 MARC-145 세포를 96시간 동안 배양한 후, 상청액을 채취하여 돼지 폐포 대식세포에 형질감염시켰다. 이때 형질감염시킨 방법은 상기 3-2에서와 동일하다.

도립현미경으로 관찰하였을 때, 감염 72시간 후에 상기 형질감염된 돼지 폐포 대식세포에서 CPE가 관찰되었다(도 6. 좌측 도는 상기 레플리콘으로 형질감염된 세포. 우측 도는 형질감염되지 않은 세포). 즉 CPE로 인해서 세포 성장이 억제되었음을 알 수 있다.

상기 레플리콘이 형질감염된 돼지 폐포 대식세포의 상청액에서 DNA를 추출한 후, RT-PCR을 이용하여 PRRSV의 N 단백질 및 FMDV의 VP1 단백질의 발현을 검사하였다. 도 7에서 PRRSV의 N 단백질 및 FMDV의 VP1 단백질이 발현됨을 확인하였다.

상기 결과로부터 본 발명의 PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘이 돼지 폐포 대식세포에서도 성공적으로 복제되고 FMDV의 P1-2A-3C 유전자를 발현하여 FMDV의 항원을 생산함을 알 수 있다.

4-2. GFP 를 함유한 PRRSV 플라스미드를 이용한 돼지 폐포 대식세포의 형질감염

PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘의 P1-2A-3C 유전자 발현을 형광을 이용하여 확인하기 위하여 레플리콘에 GFP를 삽입하여 제작한 후 상기 4-1과 동일한 방법으로 돼지 폐포 대식세포에 형질감염시켰다.

형질감염된 세포가 48시간 이내에 형광을 발하는 것을 확인할 수 있었다(도 8. 좌측 도는 형질감염된 세포이고, 우측 도는 형질감염되지 않은 대조군).

실시예 5. N 유전자가 결여된 PRRSV helper virus 와 공동감염시킨 경우

5-1. N 유전자가 결여된 PRRSV helper virus 의 제조

K418DM에서 N 단백질을 코딩하는 유전자 부분이 제거된 바이러스를 하기의 방법으로 제조하였다.

PRRSV의 ORF부분을 2개의 분절로 증폭하였다 Fragment 1은 ORF2의 일부분 에서부터 ORF6과 3'UTR의 18 뉴클레오티드까지이며. Fragment 2 는 ORF6의 24 뉴클레오티드와 3'UTR까지다. 그러므로 추가적인 상보적인 서열을 이용해 각 분절을 N 단백질 코딩 유전자 없이 overlapping 하였다. 이 실험에 사용된 primer는 하기 표 4에 기재하였다.

Overlapping PCR은 N 유전자를 제외한 PRRSV 구조 단백질 유전자를 합성하는데 사용되었다. PCR 산물들은 TA vector에 클로닝 되었고, 시퀀싱되었다.

상기 helper virus는 N 유전자가 결여되어 있기 때문에 그 자체로 감염력이 있는 전체 바이러스 입자를 생성하지 않을 것이나, PRRSVK418DM-P12A3C 레플리콘과 공동 감염시키는 경우 구조단백질을 레플리콘에 제공하여 레플리콘의 감염력을 향상시키는 역할을 한다. 상기 helper virus는 서열번호 5로 기재되며, 서열번호 5에서 1-191번째 염기는 5'UTR, 192-7703번째 염기는 ORF1a, 7,682-12,073번째 염기는 ORF1b, 12,075-12,845번째 염기는 ORF2, 12,698-13,462번째 염기는 ORF3, 13,243-13,779번째 염기는 ORF4, 13,790-14,392번째 염기는 ORF5, 14,377-14,903번째 염기는 ORF6, 14,904-15,058번째 염기는 3'UTR, 15,059-15,099 번째 염기는 Poly (A) 서열, 15,100-15,111번째 염기는 Ac1I/PacI 자리, 15,112-18,850번째 염기는 pBR322 서열, 18,851-18,874번째 염기는 RsrII 자리 및 T7 프로모터, 18,875-18,876번째 염기는 두 개의 부가적인 G 잔기에 해당한다.

한국미생물보존센터(국내) KFCC11559P 20131007 한국미생물보존센터(국내) KFCC111560P 20131007 한국미생물보존센터(국외) KCCM11457P 20131011 한국미생물보존센터(국외) KCCM11458P 20131011

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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PK418-12693F <400> 18 cagcaatggt taatagctgt acattcctc 29 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RU <400> 19 cacaagaatg ccagctcatc agttatttgg catatttaac aag 43 <210> 20 <211> 1140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FMDV P1-2A-3C protein <400> 20 Met Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser 1 5 10 15 Gly Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln 20 25 30 Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser 35 40 45 Asn Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln 50 55 60 Asn Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu 65 70 75 80 Phe Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu 85 90 95 Glu Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr 100 105 110 Gln Ser Ser Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe 115 120 125 Val Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala 130 135 140 Glu Arg Phe Phe Lys Thr His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro 145 150 155 160 Phe Gly Arg Cys Tyr Leu Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val 165 170 175 Tyr Gly Ser Leu Thr Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp 180 185 190 Val Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu 195 200 205 Val Ala Met Val Pro Glu Leu Cys Ser Ile Asp Lys Arg Glu Leu Tyr 210 215 220 Gln Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met 225 230 235 240 Thr Ala His Ile Thr Val Pro Phe Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln 245 250 255 Tyr Lys Val His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro 260 265 270 Leu Thr Val Asn Thr Glu Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn 275 280 285 Ile Ala Pro Thr Asn Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu 290 295 300 Gly Ile Phe Pro Val Ala Cys Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr 305 310 315 320 Thr Asp Pro Lys Thr Ala Asp Pro Val Tyr Gly Lys Val Phe Asn Pro 325 330 335 Pro Arg Asn Met Leu Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala 340 345 350 Glu Ala Cys Pro Thr Phe Leu His Phe Asp Gly Asp Val Pro Tyr Val 355 360 365 Thr Thr Lys Thr Asp Ser Asp Arg Val Leu Ala Gln Phe Asp Leu Ser 370 375 380 Leu Ala Ala Lys His Met Ser Asn Thr Phe Leu Ala Gly Leu Ala Gln 385 390 395 400 Tyr Tyr Thr Gln Tyr Ser Gly Thr Ile Asn Leu His Phe Met Phe Thr 405 410 415 Gly Pro Thr Asp Ala Lys Ala Arg Tyr Met Ile Ala Tyr Ala Pro Pro 420 425 430 Gly Met Glu Pro Pro Lys Thr Pro Glu Ala Ala Ala His Cys Ile His 435 440 445 Ala Glu Trp Asp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser Ile Pro 450 455 460 Tyr Leu Ser Ala Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Ala Ala Glu 465 470 475 480 Thr Thr Asn Val Gln Gly Trp Val Cys Leu Phe Gln Ile Thr His Gly 485 490 495 Lys Ala Asp Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Ala Ser Ala Gly Lys Asp 500 505 510 Phe Glu Leu Arg Leu Pro Val Asp Ala Arg Thr Gln Thr Thr Ser Thr 515 520 525 Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly 530 535 540 Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu 545 550 555 560 Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp 565 570 575 Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr 580 585 590 Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly 595 600 605 Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn 610 615 620 Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala 625 630 635 640 Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly 645 650 655 Asn Cys Lys Tyr Gly Glu Gly Pro Leu Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu 660 665 670 Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro Thr Ser Phe Asn 675 680 685 Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met 690 695 700 Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val His Pro 705 710 715 720 Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Phe 725 730 735 Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro 740 745 750 Gly Pro Phe Phe Phe Ser Asp Val Arg Ser Asn Phe Thr Lys Leu Val 755 760 765 Glu Thr Val Asn Gln Met Gln Glu Asp Met Ser Thr Lys His Gly Pro 770 775 780 Asp Phe Asn Arg Leu Val Ser Ala Phe Glu Glu Leu Ala Thr Gly Val 785 790 795 800 Lys Ala Ile Arg Thr Gly Leu Asp Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Lys Leu 805 810 815 Ile Lys Trp Leu Leu Ser Arg Leu Ser Cys Met Ala Ala Val Gly Pro 820 825 830 Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys 835 840 845 Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro 850 855 860 Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly 865 870 875 880 Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr Lys Pro 885 890 895 Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Cys Ala Thr 900 905 910 Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe Ala Glu 915 920 925 Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Ala Met Thr Asp Ser Asp 930 935 940 Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln Asp Met Leu 945 950 955 960 Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg Val Arg Asp 965 970 975 Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Val Ala Arg Met Lys Lys Gly Thr Pro 980 985 990 Val Val Gly Val Ile Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu Ile Phe Ser 995 1000 1005 Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys Met Asp Gly Asp 1010 1015 1020 Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Lys Ala Ala Thr Lys Ala Gly Tyr 1025 1030 1035 1040 Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Asp Thr Phe Ile Val 1045 1050 1055 Gly Thr His Ser Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser Cys Val 1060 1065 1070 Ser Arg Ser Met Leu Leu Lys Met Lys Ala His Ile Asp Pro Glu Pro 1075 1080 1085 His His Glu Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val 1090 1095 1100 His Val Met Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val 1105 1110 1115 1120 Phe Asn Pro Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asn Lys Asp Pro Arg 1125 1130 1135 Leu Asn Glu *** 1140

Claims (24)

1. 서열번호 4로 기재되는, 변형된 구제역 바이러스 유전자 DNA를 포함하는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 레플리콘 DNA.
2. 제1항의 레플리콘 DNA로부터 역전사된 RNA.
3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 4로 기재되는 레플리콘 DNA는 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자 DNA를 포함하는 것인 레플리콘 DNA.
4. 제1항의 서열번호 4로 기재되는 레플리콘 DNA를 포함하는 세포.
5. 제4항에 있어서, 상기 세포는 수탁번호 KCCM11457P 또는 KFCC11560P인 세포.
6. 제5항에 있어서, 상기 세포는 Escherichia coli DH5α 세포인 세포.
7. 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자 DNA.
8. 제7항의 DNA로부터 역전사된 RNA.
9. 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자 DNA를 포함하는 세포.
10. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 구제역 바이러스 VP1 유전자가 삽입된 레플리콘 DNA를 포함하는 세포.
11. 제10항에 있어서, 상기 세포는 수탁번호 KFCC11559P인 세포.
12. 제1항, 제3항, 또는 제7항의 DNA, 또는 제2항 또는 제8항의 RNA를 포함하는 구제역 백신.
13. 제12항에 있어서, 상기 백신은 동물용인 것인 백신.
14. 제13항에 있어서, 상기 동물은 돼지인 것인 백신.
15. 제12항에 있어서, 상기 백신은 담체, 희석제, 부형제, 및 어주번트(adjuvant)로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상을 더 포함하는, 백신.
16. 제1항, 제3항, 또는 제7항의 DNA, 또는 제2항 또는 제8항의 RNA 및 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 포함하는 구제역 백신.
17. 제16항에 있어서, 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 서열번호 1로 기재되는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 DNA 또는 서열번호 2로 기재되는 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 DNA를 갖는 것인 백신.
18. 제16항에 있어서, 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스는 N 유전자가 제거된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 DNA를 갖는 것인 백신.
19. 제18항에 있어서, 상기 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 변이주 DNA는 서열번호 5로 기재되는 것인 백신.
20. 제4항 내지 제6항, 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 세포를 이용하여 구제역 백신을 생산하는 방법.
21. 제1항, 제3항, 또는 제7항의 DNA, 또는 제2항 또는 제8항의 RNA를 이용하여 구제역 백신을 생산하는 방법.
22. 1) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 발현벡터화하는 단계;및
    2) 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자 DNA를 상기 발현벡터에 삽입하는 단계를 포함하는, 변형된 구제역 바이러스 유전자 DNA가 삽입된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 기반 발현벡터의 제조방법.
23. 1) 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 발현벡터화하는 단계;
    2) 서열번호 3으로 기재되는 변형된 구제역 바이러스 유전자 DNA를 상기 발현벡터에 삽입하는 단계;및
    3) 상기 발현벡터에서 ORF1 내지 6에 해당하는 부분을 제거하는 단계를 포함하는, 변형된 구제역 바이러스 유전자가 삽입된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 레플리콘의 제조방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 3)단계는
    ⅰ. 상기 발현벡터에서 ORF 1 내지 7에 해당하는 부분을 제거하는 단계; 및
    ⅱ. 상기 발현벡터 내로 ORF 7에 해당하는 부분을 삽입하는 단계를 포함하는, 변형된 구제역 바이러스 유전자가 삽입된 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 레플리콘의 제조방법.

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