CN114606174A - 一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株及应用，该生物合成原儿茶酸甲酯的菌株是KPHS基因片段与线性化表达质粒载体连接环化的质粒pHG10转化导入大肠杆菌感受态细胞筛选而成，该生物合成原儿茶酸甲酯的菌株生物催化对羟基苯甲酸甲酯合成原儿茶酸甲酯。本发明生物合成原儿茶酸甲酯的菌株作为催化剂，以生物合成的方式获得原儿茶酸甲酯，能够减少化学试剂的使用量，降低对人体的毒害性。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株及应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
原儿茶酸甲酯，又名3，4二羟基苯甲酸甲酯，能显著增强神经元细胞的活性，促进神经元突起生长，使神经网络更发达，与神经营养因子的作用类似，可在成人神经细胞的存活、突起生长、神经网络构建以及神经系统的可塑性等方面发挥关键性的作用，在防治神经退行性疾病及其他相关疾病方面具有较强的应用价值。但目前原儿茶酸甲酯大多采用化学合成的方式获得，所使用的危化品试剂较多，所需的能量较大，对人体存在一定的伤害。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株及应用，本发明以含有KPHS基因的质粒为模板，构建重组菌株sHG10，以该菌株为催化剂，以生物合成的方式制备原儿茶酸甲酯，能够减少化学试剂的使用量，降低对人体的毒害性能够减少化学试剂的使用量，降低对人体的毒害性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，该生物合成原儿茶酸甲酯的菌株是KPHS基因片段与线性化表达质粒载体连接环化的质粒pHG10转化导入大肠杆菌感受态细胞筛选而成；所述KPHS基因片段是含有KPHS基因的质粒经扩增获得，所述线性化表达质粒载体是表达质粒经反向扩增、消化获得。
其中，所述表达质粒为pet20b、pET28a或pThioHisA的一种；pet20b的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，pET28a的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示，pThioHisA的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。
其中，所述KPHS基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1~SEQ ID No.14所示的任一序列。
其中，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BW25113、大肠杆菌W3110或大肠杆菌MG1655的一种。
本发明还提供了一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株的构建方法，具体步骤如下：
一、环形质粒pHG10构建
（1）KPHS基因片段：以含有KPHS基因的质粒为模板，通过引物KPHS-F/KPHS-R进行PCR扩增，获得KPHS基因片段；
（2）线性化表达质粒载体：以表达质粒为模板，通过引物质粒-F/质粒-R进行反向扩增，得到PCR产物，经过纯化、I消化，获得线性化表达质粒载体；
（3）环形质粒pHG10：将上述的KPHS基因片段和上述的线性化表达质粒载体进行连接环化，获得环形质粒pHG10；
二、重组菌株sHG10构建
（1）复苏培养：将0.2~5μl质粒pHG10以化学转化法导入50μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min后于42℃水浴中热激60s进行热休克处理，再进行冰浴2min，接着再加入1mL的LB液体培养基，在37℃下培养1h，获得复苏细胞液；
（2）平板培养：将复苏细胞液涂布在LB琼脂糖平板上，在37℃下过夜培养，长出菌落，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组菌株sHG10，即生物合成原儿茶酸甲酯的菌株；
LB液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余纯水；LB琼脂糖平板的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂10g，其余纯水。
其中，所述引物KPHS-F/KPHS-R的KPHS-F的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示，KPHS-R的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示。
其中，表达质粒为pet20b时，质粒-F/质粒-R为pet20b-F/pet20b-R，则pet20b-F的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示，pet20b-R的核苷酸序列为SEQ ID No.11所示；表达质粒为pET28a时，质粒-F/质粒-R为pET28a-F/pET28a-R，则pET28a-F的核苷酸序列为SEQ IDNo.12所示，pET28a-R的核苷酸序列为SEQ ID No.13所示；表达质粒为pThioHisA时，质粒-F/质粒-R为pThioHisA-F/pThioHisA-R，则pThioHisA-F的核苷酸序列为SEQ ID No.14所示，pThioHisA-R的核苷酸序列为SEQ ID No.15所示。
本发明还提供了应用上述的重组菌株sHG10生物催化制备原儿茶酸甲酯的方法，具体步骤如下：
（1）培养发酵：将重组菌株sHG10接种到50~200mL LB液体培养基中，在37℃、220rpm下进行培养发酵；
（2）诱导表达：当发酵液中的细胞OD600达到0.2~1.2，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在30~40℃下诱导培养2h；
（3）生物合成：向诱导后的发酵液中加入对羟基苯甲酸甲酯，震荡培养2~12 h，获得含有原儿茶酸甲酯的发酵液，发酵液经离心过膜后，采用高效液相色谱仪测定原儿茶酸甲酯的产量；
LB液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余纯水。
其中，所述重组菌株sHG10的接种量为1%。
其中，反应前，发酵液中的对羟基苯甲酸甲酯的初始浓度为1g/L。
本发明的有益效果：本发明通过KPHS基因片段与线性化表达质粒载体连接环化的质粒pHG10转化导入大肠杆菌感受态细胞筛选得到重组菌sHG10，能够作为催化剂，生物催化对羟基苯甲酸甲酯合成原儿茶酸甲酯；本发明的生物合成原儿茶酸甲酯的菌株通过生物合成的方式生产原儿茶酸甲酯，能够减少化学试剂的使用量，降低对人体的毒害性；同时使用本发明生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，催化对羟基苯甲酸甲酯生成的原儿茶酸甲酯的产率达到90%以上，为工业化应用奠定坚实的基础。
附图说明
图1为本发明的原儿茶酸甲酯的生物合成工艺；
图2为本发明的原儿茶酸甲酯的标准曲线图；
图3为本发明实施例4中的序号6制备获得的原儿茶酸甲酯的液相色谱图。
具体实施方式
为了对本发明作出更加清楚完整地说明，下面用具体实施例说明本发明，但并不是对发明的限制。
实施例1 环形质粒pHG10的构建
具体过程如下：
（1）KPHS基因片段：以含有KPHS基因的质粒为模板，该KPHS基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1~SEQ ID No.4所示的任一序列，通过引物KPHS-F/KPHS-R在95℃变性、55-65℃退火、72℃延伸、循环35次的条件下进行PCR扩增，获得KPHS基因片段；
其中，引物KPHS-F/KPHS-R
上游引物KPHS-F的核苷酸序列：gaagatttccgcgccga
下游引物KPHS-R的核苷酸序列：ctcgaattccgcggcgtgca；
（2）线性化表达质粒载体：以表达质粒为模板，该表达质粒为pet20b、pET28a或pThioHisA的一种，通过引物质粒-F/质粒-R在95℃变性、55-65℃退火、72℃延伸、循环35次的条件下进行反向扩增，得到PCR产物，再依次经过纯化试剂盒纯化、DpnI消化，获得线性化表达质粒载体；
其中，pet20b的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，pET28a的核苷酸序列为SEQ IDNo.6所示，pThioHisA的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示；
表达质粒为pet20b时，引物质粒-F/质粒-R为pet20b-F/pet20b-R：
上游引物pet20b-F的核苷酸序列：atccggatat agttcctcctttca
下游引物pet20b-R的核苷酸序列：tcttttactttcaccagcgtttct；
表达质粒为pET28a时，引物质粒-F/质粒-R为pET28a-F/pET28a-R：
上游引物pET28a-F的核苷酸序列：cggatatagttcctcctttcagca
下游引物pET28a-R的核苷酸序列：tgaaaatattgttgatgcgctggca；
表达质粒为pThioHisA时，引物质粒-F/质粒-R为pThioHisA-F/ppThioHisA-R：
上游引物pThioHisA-F的核苷酸序列：cgaatgggacgcgccctgta
下游引物pThioHisA-R的核苷酸序列：gttttgcagcagcagtcgcttca；
（3）环形质粒pHG10：将KPHS基因片段和线性化载体通过In-Fusion试剂盒进行连接环化，获得环形质粒pHG10。
根据本实施例1的构建方法，不同来源的KPHS基因与不同质粒连接表达，获对不同组别的得环形质粒pHG10，并标记，结果如表1所示。
表1
| 组别 | A | B | C | D | E | F | G |
| 表达质粒 | pet20b | pET28a | pThioHisA | pet20b | pThioHisA | pet20b | pET28a |
| KPHS基因的核苷酸序列 | SEQ ID No.1 | SEQ ID No.2 | SEQ ID No.3 | SEQ ID No.4 | SEQ ID No.2 | SEQ ID No.1 | SEQ ID No.4 |
| 环形质粒pHG10的标号 | pHG10-A | pHG10-B | pHG10-C | pHG10-D | pHG10-E | pHG10-F | pHG10-G |
实施例2 重组菌株sHG10的构建
具体过程如下：
（1）复苏培养：将0.2~5μl上述的环形质粒pHG10以化学转化法导入50μl大肠杆菌感受态细胞中，该大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BW25113、大肠杆菌W3110或大肠杆菌MG1655的一种，冰浴30 min后于42℃水浴中热激60 s进行热休克处理，再进行冰浴2 min，接着再加入1 mL的LB液体培养基，在37℃下培养1h，获得复苏细胞液；
（2）平板培养：将复苏细胞液涂布在LB琼脂糖平板上，在37℃下过夜培养，长出菌落，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组菌株sHG10；
LB液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余纯水；LB琼脂糖平板的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂10g，其余纯水。
根据本实施例2的构建方法，将实施例1中不同组别的环形质粒pHG10导入大肠杆菌感受态细胞培养获得不同组别的重组菌株sHG10，并标记，结果如表2所示。
表2
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 环形质粒pHG10的标号 | pHG10-A | pHG10-B | pHG10-C | pHG10-D | pHG10-E | pHG10-F | pHG10-G |
| 大肠杆菌感受态细胞 | 大肠杆菌BL21 | 大肠杆菌BW25113 | 大肠杆菌W3110 | 大肠杆菌MG1655 | 大肠杆菌BW25113 | 大肠杆菌MG1655 | 大肠杆菌BL21 |
| 重组菌株sHG10的标号 | sHG10-A | sHG10-B | sHG10-C | sHG10-D | sHG10-E | sHG10-F | sHG10-G |
实施例3 原儿茶酸甲酯的高效液相检测
1、高效液相色谱条件：色谱柱为 C18 色谱柱（5 μm，250 mm × 4. 6 mm），流动相为甲醇-1%冰乙酸为60:40（v:v），流速为1 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为25 ℃，出峰时间约4.68min。
2、原儿茶酸甲酯的标准曲线
称取原儿茶酸甲酯标准样0.1g，移至50ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，后取0.5ml、1ml、2ml、4ml、6ml、8ml分别移至6个100ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，分别获得浓度为0.01g/L、0.02g/L、0.04g/L、0.08g/L、0.12g/L、0.16g/L，通过上述的色谱条件进行检测，以浓度（g/L）为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制原儿茶酸甲酯标准曲线，y = 1×108x-74833，R2 = 0.998（R2是线性拟合常数），如图2所示。
实施例4 含有KPHS基因的重组菌株sHG10的应用
将含有KPHS基因的重组菌株sHG10作为催化剂，生物催化对羟基苯甲酸甲酯制备原儿茶酸甲酯的方法，具体过程如下：
（1）培养发酵：将重组菌株sHG10按照1%的接种量接种到50~200mL LB液体培养基中，在37℃、220rpm下进行培养发酵；
（2）诱导表达：当发酵液中的细胞OD600达到0.2~1.2，加入终浓度为0.2mM的IPTG，在30~40℃下诱导培养2h；
（3）生物合成：向诱导后的发酵液中加入对羟基苯甲酸甲酯，使对羟基苯甲酸甲酯的初始浓度为1g/L，震荡培养2~12 h，获得含有原儿茶酸甲酯的发酵液，将发酵液离心、过膜，然后使用高效液相色谱仪进行测定；
LB液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余纯水。
根据本实施例4的生物合成方法，将实施例2中不同组别的环的重组菌株sHG10作为生物催化剂，催化对羟基苯甲酸甲酯合成原儿茶酸甲酯，采用实例3的原儿茶酸甲酯的高效液相色谱条件及标准曲线，先对处理后的发酵液进行稀释，再进行测定，结果如表3。
表3
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 重组菌株sHG10的标号 | sHG10-A | sHG10-B | sHG10-C | sHG10-D | sHG10-E | sHG10-F | sHG10-G |
| 对羟基苯甲酸甲酯初始浓度g/L | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 原儿茶酸甲酯的产量g/L | 1 | 1.006 | 1.02 | 1.012 | 1.031 | 1.058 | 1.01 |
| 原儿茶酸甲酯的产率% | 90.48 | 91.03 | 92.29 | 92.75 | 93.28 | 95.73 | 91.39 |
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
序列表
<110> 南京合谷生命生物科技有限公司
<120> 一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株及应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1563
<212> DNA
<213> 4-hydroxyphenylacetate catabolism
<400> 1
atgaaacctg aagatttccg cgccgacgcg aaacgcccgt taactggcga agagtattta 60
aaaagcctgc aggatggccg cgaaatttat atctacggcg agcgcgtgaa agacgtcacc 120
acgcatccgg ccttccgtaa tgccgcggcc tccgtcgctc agctgtacga tgcgctgcac 180
aaaccggaga tgcaggattc cctgtgctgg ggcaccgata ccggcagcgg cggctacacc 240
cataaattct tccgcgtggc gaaaagcgcc gacgatctgc gccagcagcg cgacgccatc 300
gccgaatggt cgcgcttaag ctacggctgg atgggccgca ccccagacta caaagccgcc 360
ttcggctgcg cgctgggcgc caacccggcg ttttacggcc agttcgagca gaacgcccgc 420
aactggtaca cccgcattca ggaaaccggc ctgtacttta accacgctat cgtcaacccg 480
ccgattgacc gccacaagcc agctgatgaa gtgaaggatg tctacatcaa gctggaaaaa 540
gagactgatg ccgggatcat cgtcagcggc gcgaaagtgg tcgccaccaa ctcggcgctg 600
acccactaca acatgatcgg cttcggctcc gcacaggtga tgggcgagaa cccggacttc 660
gcgctgatgt tcgtcgcgcc gatggatgcc gaaggcgtca agcttatctc ccgcgcctcc 720
tatgagatgg tcgccggcgc gaccggatcg ccgtacgact atccgctttc cagccgtttc 780
gacgagaacg acgcgattct ggtaatggat aaggtgctga tcccatggga gaacgtactg 840
atttatcgcg actttgaccg ctgccgccgc tggaccatgg aaggtggttt cgcccgcatg 900
tacccgctgc aggcctgcgt gcgcctggcg gtaaaactgg actttatcac cgccctgctg 960
aaacgctctc tggaatgtac cggcaccctc gaattccgcg gcgtgcaggc cgaccttggc 1020
gaagtggtgg cgtggcgcaa tatgttctgg gcgttaagcg attctatgtg ctcggaagcg 1080
acgccgtggg tcaacggcgc atggctgccg gatcacgccg cgctgcagac ctatcgcgtg 1140
atggccccga tggcctacgc caagatcaag aacatcatcg agcgcaacgt caccagcggc 1200
ctgatttatc tgccgtccag cgcccgcgat ctgaacaacc cgcagatcga ccagtatctg 1260
gcgaagtacg tgcgcggctc caacggtatg gaccacgttg aacgtatcaa aatcctcaaa 1320
ctgatgtggg acgccatcgg cagcgaattc ggcggccgcc atgaactgta tgagatcaac 1380
tactccggta gccaggatga aattcgcctg cagtgtctgc gccaggcgca gagctccggc 1440
aatatggaca aaatgatggc gatggtcgac cgctgcctgt ccgagtacga ccagaacggc 1500
tggacggtgc cgcatctgca caataatgct gatatcaaca tgttggataa gctgctgaag 1560
taa 1563
<210> 2
<211> 1563
<212> DNA
<213> Pluralibacter gergoviae
<400> 2
atgaaaccag aagattaccg tagtgatgcc agacgtccgc tgaccggaga agagtacctg 60
aagagcctgc aggacggccg cgagatctat atttacggcg agcgcgtgaa agacgttacc 120
acccatccgg cgttccgcaa tgccgccgcc tcggtggccc agctctacga cgccctgcac 180
aaaccggaga tgcaggacag cctgtgctgg aataccgaca ccggcagcgg cggctatacg 240
cataagtttt tccgggtggc gaaaagtgcc gacgacctgc gccagcagcg cgacgccatc 300
gccgaatggt cgcgcctgag ctacggctgg atgggccgca cgccggacta caaggcggcg 360
tttggcagcg cgctcggcgc aaatcccggc ttttacggcc agttcgagca gaacgcccgc 420
aactggtaca cccgcattca ggagtgcggg ctctacttta accacgccat cgtgaacccg 480
cctatcgacc gccacaaacc cgccgatgag gtgaaggacg ttttcattaa ggtagaaaaa 540
gagaccgacg ccgggattat cgtcagcggc gcgaaggtgg tggccaccaa ctcggccctg 600
acccactaca acatgatagg cttcggctct gcccaggtga tgggcgagaa tcccgacttc 660
gcgctgatgt tcgtcgcccc gatggatgcc gacggcgtga agcttatctc ccgcgcctcc 720
tacgagatgg tggccggtgc gaccggttcg ccttacgact acccgctctc cagccgcttc 780
gacgagaacg acgcgatcct ggtgatggat aatgtgctga tcccgtggga aaacgtgctg 840
atctaccgcg atttcgaccg ctgccgccgc tggagcatgg agggcggctt cgctcgcatg 900
tacccgctgc aggcctgcgt gcgcctgggc gtcaagctgg acttcattac cgccctgctg 960
aaaaagtcgc tggagtgcac cggtaccgcc gagtttcgcg gcgtgcaggc ggatctcggc 1020
gaggtggtgg cctggcgcaa catgttctgg gcgctgagtg attccatgtg ctcggaggcg 1080
acgccgtggg ttaacggcgc gtacctgccg gaccacgccg cactgcagac ctaccgcgtg 1140
atggccccga tggcctacgc caagatcaaa aatatcattg agcgcaacgt caccagcggc 1200
cttatctacc tgccgtccag cgcccgggat ctgcataacc cgcagatcga taagtacctg 1260
gcgaagtacg tgcgcgggtc gaacggcatg gatcacgtag agcggatcaa gatcctcaag 1320
ctgatgtggg acgccatcgg cagcgagttc ggcggccgcc acgagctgta cgagatcaac 1380
tactccggca gccaggacga ggtacgcctg cagtgcctgc gccaggcgca gacctccggc 1440
aacatggaca aaatgatggc gatggtcgac cgctgcctgg cggaatacga tcagcacggc 1500
tggaccgtgc cgcacctgca caataatacc gatatcaaca tgctcgataa gctgctgaaa 1560
tag 1563
<210> 3
<211> 1563
<212> DNA
<213> Serratia ficaria
<400> 3
atgaaaccag aagactttcg tgccgacagc aaacgcccgt tcaccggcgc cgagtacctg 60
aaaagtttgc aggacagccg cgaaatctac atttacggcg aacgcgtgaa agacgtcacc 120
acccacccgg cgttccgcaa cgcggcggct tcggtgggcc agctgtacga cgcgctgcac 180
gatccggcca gccaggatcg cctgtgctgg aataccgaca ccggcaacgg cggctacacc 240
cacaaattct tccgctacgc ccgcagcccg gaagagatgc gccagcagcg cgacgccatc 300
gccgactggt cgcgccagag ctacggctgg atgggacgca ccccggacta caaggcggcg 360
ttcggctgcg cgctgggcgc ctatccggaa ttctacggcc agttcgccga taacgcccgc 420
cactggtaca aacgcattca ggaaaccggg ctgtacttca accacgccat cgtcaacccg 480
ccgatcgatc gccacaagcc ggtcaacgaa gtgaaggacg tctacatcca ggtggagaaa 540
gagaccgacg ccggcatcgt cgtcagcggc gccaaggtag tggccaccaa ctcggcgctg 600
acccactaca actttatcgg cttcggctcg gcgcaggtga tgggcgataa tccggacttc 660
gcgttgatgt tcgtggcgcc gatggacgcc gaaggggtga agctgatctc gcgcgcctcc 720
tacgaactgg tggccggcgc caccggatcg ccgttcgact acccgctttc cagccgcttc 780
gacgagaacg acgcgatctt gatcatggat catgtactga tcccctggga aaacgtactg 840
atctaccgcg atttcgaccg ctgccgccgc tggagcaccc agggcggctt cgcccggctg 900
ttcccgctgc aggcctgcgt gcgcctggcg gtgaagatgg acttcatcac cgcgctgctg 960
caaaagagcc tgtcttgcac cggggtgctg gagtttcgcg gcgtgcaggc cgatctgggc 1020
gaagtggtgg cctggcgcaa cctgttctgg tcgctgagcg acgcgatgtg cgccgaagcc 1080
acccaatggg aaaacggcgc ctacctgccg gatgccgccg cgctgcagac ctatcgggta 1140
atggcgccga tggcctacac caaggtgaag cacatcatcg agaagaacgt caccagcggc 1200
ctgatctacc tgccgtccag cgtgcgcgac atgaacaacc cgcagatcga caagtacctg 1260
tcccgctacg tgcgcggatc ggacggcatg gatcacgtcg aacgcatcaa gatcctcaag 1320
ctgatgtggg atgcgatcgg cagcgaattc ggcggccgcc atgagctgta cgagatcaac 1380
tacgccggca gccaggatga gatccgcctg cagtgcctgc gtcacgctca gggatccggc 1440
accatggatc ggatgatgca gatggtcgac aagtgcctgg cggactacga tcagcacggc 1500
tggaaggtgc cgcacctgca taacaatggc gatattaatc agctggataa tctgctgaag 1560
taa 1563
<210> 4
<211> 1563
<212> DNA
<213> Enterobacteriaceae bacterium
<400> 4
atgaaacctg aagatttccg cgccagtacc cagcgtccgt ttaccggtga agagtacctg 60
aagagtttgc aggatggccg tgaaatatac atctacggcg agcgcgtgaa ggatgtcacc 120
actcatccgg cgttccgtaa cgcggcggcg tccgtcgcac agctgtacga tgcgctgcac 180
aaaccagaga tgcaggattc cctgtgctgg aacaccgaca ccggcagtgg cggctacacc 240
cacaagtttt tccgcgtggc gaaaagcccg gacgatctgc gccagcagcg cgacgccatc 300
gccgagtggt cacgcctgag ctacggctgg atgggtcgca cgccggatta caaagccgct 360
ttcggctgtg cgctgggcgc caaccctggc ttctacggcc agtttgagca aaacgcccgc 420
aactggtact cgcgtattca ggaaaccggc ctgtacttca accacgctat cgttaacccg 480
ccgatcgatc gccatttacc gaccgatcag gtgaaagacg tctacatcaa gctggaaaaa 540
gagaccgatg ccgggatcgt agtcagcggc gcaaaagtgg ttgccaccaa ctccgcgctg 600
acccactaca acatgattgg cttcggctca gcacaggtga tgggcgaaaa cccggacttc 660
gcgctgatgt tcgtcgcgcc gatggatgcc gatggcgtga agctgatttc ccgcgcgtcc 720
tatgaaatgg tcgcaggtgc caccgcctcc ccgtacgact acccgctctc cagccgcttc 780
gatgagaatg atgcaatcct ggtgatggat aacgtgctga tcccatggga gaacgtgctg 840
atctaccgcg atttcgatcg ctgccgtcgc tggacgatgg aaggcggttt cgcccgtatg 900
tatccgttgc aggcctgtgt gcgcctggcg gtgaagctcg actttattac cgcgctgttg 960
aaaaaatctc tcgaatgtac cggcacgctg gagttccgtg gcgtgcaggc ggacctcggg 1020
gaagtggtgg cctggcgcaa caccttctgg gcgctgagtg attccatgtg ttcagaagcc 1080
acaccgtggg tgaacggcgc gtatctgccg gatcacgccg cactgcaaac ctaccgcgtc 1140
atggctccga tggcctacgc gaagatcaaa aacatcatcg agcgcaacgt caccagcggg 1200
ctgatctacc tgccgtcgag cgcgcgcgat ctgaataacc cgcagatcga ccagtacctg 1260
gcgaaatacg tgcgcggatc gaacggtatg gatcacgttc agcgcatcaa gatcctcaaa 1320
ctgatgtggg atgcgatcgg cagcgagttc ggtgggcgtc atgagcttta cgagatcaac 1380
tattccggca gccaggatga gattcgcctg caatgtctgc gtcaggcgca gacctccggc 1440
aacatggaaa aaatgatggc gatggtcgac cgctgccttt ccgagtacga ccaacatggc 1500
tggaccgtgc cgcacctgca caacaacgct gatatcaaca tgttagacaa gctgctgaag 1560
taa 1563
<210> 5
<211> 3716
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180
cgacggagct cgaattcgga tccgaattaa ttccgatatc catggccatc gccggctggg 240
cagcgaggag cagcagacca gcagcagcgg tcggcagcag gtatttcata tgtatatctc 300
cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag agggaaaccg ttgtggtctc cctatagtga 360
gtcgtattaa tttcgcggga tcgagatctc gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg 420
catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta 480
gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc 540
gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg 600
gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc 660
ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct 720
ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc 780
atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac 840
ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc 900
ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga 960
gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct 1020
ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 1080
cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 1140
cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 1200
cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 1260
atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt 1320
ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 1380
ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 1440
tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 1500
tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 1560
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 1620
ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 1680
tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 1740
agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 1800
atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 1860
acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 1920
actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 1980
tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 2040
tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 2100
tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 2160
tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat 2220
caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 2280
cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt 2340
agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag 2400
acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc 2460
gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag 2520
ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca 2580
tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa 2640
ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga 2700
tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata 2760
attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca 2820
agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg 2880
ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg 2940
ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg 3000
cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag 3060
gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac 3120
tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 3180
tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag 3240
tgccacctga aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 3300
tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 3360
agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg 3420
tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac 3480
catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta 3540
aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag 3600
ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg 3660
taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgcca 3716
<210> 6
<211> 5369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180
cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240
tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct gctgcccatg 300
gtatatctcc ttcttaaagt taaacaaaat tatttctaga ggggaattgt tatccgctca 360
caattcccct atagtgagtc gtattaattt cgcgggatcg agatctcgat cctctacgcc 420
ggacgcatcg tggccggcat caccggcgcc acaggtgcgg ttgctggcgc ctatatcgcc 480
gacatcaccg atggggaaga tcgggctcgc cacttcgggc tcatgagcgc ttgtttcggc 540
gtgggtatgg tggcaggccc cgtggccggg ggactgttgg gcgccatctc cttgcatgca 600
ccattccttg cggcggcggt gctcaacggc ctcaacctac tactgggctg cttcctaatg 660
caggagtcgc ataagggaga gcgtcgagat cccggacacc atcgaatggc gcaaaacctt 720
tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atgtgaaacc 780
agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 840
ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 900
ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 960
gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 1020
taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 1080
cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 1140
cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 1200
tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 1260
tgaagacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 1320
gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 1380
atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 1440
gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 1500
ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 1560
cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagacagct catgttatat 1620
cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 1680
cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc ccgtctcact 1740
ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 1800
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 1860
acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg atgcccttga 1920
gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc gtcgccgcac 1980
ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg ctctgggtca 2040
ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg cttgcggtat 2100
tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc aaacgtttcg 2160
gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc 2220
tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac 2280
cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa 2340
catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct 2400
gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta 2460
catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca 2520
tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag 2580
taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa 2640
atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt aacatggccc 2700
gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg gacgcggatg 2760
aacaggcaga catctgtgaa tcgcttcacg accacgctga tgagctttac cgcagctgcc 2820
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 2880
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 2940
ttggcgggtg tcggggcgca gccatgaccc agtcacgtag cgatagcgga gtgtatactg 3000
gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatat gcggtgtgaa 3060
ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc 3120
actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg 3180
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 3240
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 3300
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga 3360
ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc 3420
ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat 3480
agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg 3540
cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3600
aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga 3660
gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact 3720
agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt 3780
ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag 3840
cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3900
tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgaa caataaaact 3960
gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 4020
ttgctctagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc 4080
tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc 4140
gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat 4200
ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg 4260
tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc gggaaaacag cattccaggt 4320
attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg 4380
ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct 4440
cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga 4500
gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataaacttt tgccattctc 4560
accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg 4620
gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct 4680
tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca 4740
aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga 4800
gtttttctaa gaattaattc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 4860
aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata 4920
ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg 4980
aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc 5040
cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa 5100
ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt 5160
cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac 5220
ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta 5280
gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg 5340
cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgcca 5369
<210> 7
<211> 4250
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
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gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
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aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220
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taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460
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gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640
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catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760
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ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880
tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940
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aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
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cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300
cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360
tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420
tatacatatg gctagcatga ctggtggaca gcaaatgggt cgcggatccg aattcgagct 3480
ccgtcgaccc atgaacaacg gcggcaaagc cgagaaggag aacaccccga gcgaggccaa 3540
ccttcaggag gaggaggtcc ggaccctatt tgtcagtggc cttcctctgg atatcaaacc 3600
tcgggagctc tatctgcttt tcagaccatt taagggctat gagggttctc ttataaagct 3660
cacatctaaa cagcctgtag gttttgtcag ttttgacagt cgctcagaag cagaggctgc 3720
aaagaatgct ttgaatggca tccgcttcga tcctgaaatt ccgcaaacac tacgactaga 3780
gtttgctaag gcaaacacga agatggccaa gaacaaactc gtagggactc caaaccccag 3840
tactcctctg cccaacactg tacctcagtt cattgccaga gagccatatg agctcacagt 3900
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gttagcgcct gctctacctc ctcctgcttt cacctatccc gcttcactgc atgcccagat 4020
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<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
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<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgaatgggac gcgccctgta 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gttttgcagc agcagtcgct tca 23
Claims (10)
1.一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，该生物合成原儿茶酸甲酯的菌株是KPHS基因片段与线性化表达质粒载体连接环化的质粒pHG10转化导入大肠杆菌感受态细胞筛选而成；
所述KPHS基因片段是含有KPHS基因的质粒经扩增获得；
所述线性化表达质粒载体是表达质粒经反向扩增、消化获得。
2.根据权利要求1所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述表达质粒为pet20b、pET28a或pThioHisA的一种；pet20b的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，pET28a的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示，pThioHisA的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。
3.根据权利要求1所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述KPHS基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1~SEQ ID No.14所示的任一序列。
4.根据权利要求1所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BW25113、大肠杆菌W3110或大肠杆菌MG1655的一种。
5.根据权利要求1至权利要求4任一所述的生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述生物合成原儿茶酸甲酯的菌株的构建方法，包括以下步骤：S1、环形质粒pHG10构建
S1.1、KPHS基因片段：以含有KPHS基因的质粒为模板，通过引物KPHS-F/KPHS-R进行PCR扩增，获得KPHS基因片段；
S1.2、线性化表达质粒载体：以表达质粒为模板，通过引物质粒-F/质粒-R进行反向扩增，得到PCR产物，经过纯化、I消化，获得线性化表达质粒载体；
S1.3、环形质粒pHG10：将上述的KPHS基因片段和上述的线性化表达质粒载体进行连接环化，获得环形质粒pHG10；
S2、重组菌株sHG10构建
S2.1、复苏培养：将0.2~5μl质粒pHG10以化学转化法导入50μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min后于42℃水浴中热激60s进行热休克处理，再进行冰浴2min，接着再加入1mL的LB液体培养基，在37℃下培养1h，获得复苏细胞液；
S2.2、平板培养：将复苏细胞液涂布在LB琼脂糖平板上，在37℃下过夜培养，长出菌落，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组菌株sHG10，即生物合成原儿茶酸甲酯的菌株；
LB液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余纯水；LB琼脂糖平板的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂10g，其余纯水。
6.根据权利要求5所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述引物KPHS-F/KPHS-R中：KPHS-F的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示，KPHS-R的核苷酸序列为SEQID No.9所示。
7.根据权利要求5所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，表达质粒为pet20b时，质粒-F/质粒-R为pet20b-F/pet20b-R，则pet20b-F的核苷酸序列为SEQ IDNo.10所示，pet20b-R的核苷酸序列为SEQ ID No.11所示；
表达质粒为pET28a时，质粒-F/质粒-R为pET28a-F/pET28a-R，则pET28a-F的核苷酸序列为SEQ ID No.12所示，pET28a-R的核苷酸序列为SEQ ID No.13所示；
表达质粒为pThioHisA时，质粒-F/质粒-R为pThioHisA-F/pThioHisA-R，则pThioHisA-F的核苷酸序列为SEQ ID No.14所示，pThioHisA-R的核苷酸序列为SEQ ID No.15所示。
8.一种权利要求1所述的生物合成原儿茶酸甲酯的菌株催化制备原儿茶酸甲酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）培养发酵：将重组菌株sHG10接种到50~200mL LB液体培养基中，在37℃、220rpm下进行培养发酵；
（2）诱导表达：当发酵液中的细胞OD600达到0.2~1.2，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在30~40℃下诱导培养2h；
（3）生物合成：向诱导后的发酵液中加入对羟基苯甲酸甲酯，震荡培养2~12 h，获得含有原儿茶酸甲酯的发酵液，发酵液经离心过膜后，采用高效液相色谱仪测定原儿茶酸甲酯的产量；
LB液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余纯水。
9.根据权利要求8所述的生物合成原儿茶酸甲酯的菌株催化制备原儿茶酸甲酯的方法，其特征在于，所述重组菌株sHG10的接种量为1%。
10.根据权利要求8所述的生物合成原儿茶酸甲酯的菌株催化制备原儿茶酸甲酯的方法，发酵液中的对羟基苯甲酸甲酯的初始浓度为1g/L。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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