CN111172120A - 新城疫病毒及其用途 - Google Patents

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德米特里·扎马林
詹姆斯·艾利森
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Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
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Abstract

本发明描述的是经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂的嵌合的新城疫病毒和包含这样的病毒的组合物。本发明还描述的是经工程改造以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的嵌合的新城疫病毒和包含这样的病毒的组合物。该嵌合的新城疫病毒和组合物可用于治疗癌症。另外，本发明描述的是用于治疗癌症的方法，包括给予新城疫病毒与免疫的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的组合。

Description

新城疫病毒及其用途
本申请是申请日为2014年03月04日、申请号为201480026748.7、名称为“新城疫病毒及其用途”的发明申请的分案。
本申请要求美国临时申请号61/782,994(申请日为2013年3月14日)的优先权，所述美国临时申请以其整体并入本文作为参考。
本发明是在政府资助下完成的，资助号为5T32CA009207-35和HHSN26620070010C，资助奖金由美国国家卫生研究院(the National Institutes of Health)提供。美国政府在本发明中具有一定的权利。
1.技术领域
本文描述的是经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂的嵌合的新城疫病毒，和包含这样的病毒的组合物。本文还描述的是经工程改造以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的嵌合的新城疫病毒，和包含这样的病毒的组合物。所述嵌合的新城疫病毒和组合物可用于治疗癌症。另外，本文描述的是用于治疗癌症的方法，包括给予新城疫病毒与免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的组合。
2.背景技术
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)中的禽腮腺炎病毒属或禽副粘病毒属(Avulavirus)的成员，已表明可感染许多禽类物种(Alexander,DJ(1988).Newcastle disease,Newcastle disease virus--an avianparamyxovirus(新城疫，新城疫病毒—一种禽副粘病毒).Kluwer Academic Publishers:Dordrecht,The Netherlands.,第1-22页)。NDV具有呈负义的单链RNA基因组并且不经历与宿主基因组或与其它病毒重组(Alexander,DJ(1988).Newcastle disease,Newcastledisease virus--an avian paramyxovirus(新城疫，新城疫病毒—一种禽副粘病毒).Kluwer Academic Publishers:Dordrecht,The Netherlands.第1-22页)。该基因组RNA含有以3'-NP-P-M-F-HN-L-5’的顺序的基因，这在下文有更详细的描述。两种另外的蛋白质V和W由NDV的P基因通过RNA编辑产生的可变mRNA产生。该基因组RNA还在3'末端含有前导序列。
病毒体(virion)的结构元件包括病毒包膜，病毒包膜是来源于细胞质膜的脂质双层。糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)从包膜中伸出，使得病毒含有血凝素(例如，受体结合/基因融合)和神经氨酸酶两种活性。融合糖蛋白(F)，也与病毒膜相互作用，首先作为无活性前体产生，然后经翻译后修饰切割产生两条经二硫键连接的多肽。有活性的F蛋白通过促进病毒包膜与宿主细胞质膜的融合来参与NDV的穿透进入宿主细胞。基质蛋白(M)参与病毒装配，并且与病毒膜以及核衣壳蛋白二者相互作用。
核衣壳的主要蛋白质亚基是核衣壳蛋白(NP)，其赋予衣壳上的螺旋状对称。与核衣壳缔合的是P蛋白和L蛋白。经受了磷酸化的磷酸蛋白(P)被认为在转录时起调节作用，并且也可以参与甲基化、磷酸化和聚腺苷酸化。L基因，编码依赖RNA的RNA聚合酶，与P蛋白一起是病毒RNA合成所需要的。L蛋白，几乎占到病毒基因组的编码容量的一半，是病毒蛋白中最大的，并且在转录和复制中起到重要的作用。V蛋白已被证明抑制干扰素-α并且对NDV的毒力作出贡献(Huang等人(2003).Newcastle disease virus V protein is associatedwith viral pathogenesis and functions as an Alpha Interferon Antagonist(新城疫病毒V蛋白与病毒的致病性相关并且起α干扰素拮抗剂的作用).Journal of Virology77:8676-8685)。
已有报道指出，天然存在的NDV在多种动物肿瘤模型中是有效的溶瘤剂(oncolytic agent)(Sinkovics,JG和Horvath,JC(2000).Newcastle disease virus(NDV):brief history of its oncolytic strains(新城疫病毒(NDV)：其溶瘤株的生活简史).J Clin Virol 16:1-15；Zamarin等人,2009；Mol Ther 17:697；Elankumaran等人,2010；J Virol 84:3835；Schirrmacher等人,2009；Methods Mol Biol 542:565；Bart等人,1973；Nat New Biol 245:229)。天然存在的NDV毒株已在对抗人类晚期癌症的多种临床试验中使用(Sinkovics,JG和Horvath,JC(2000).Newcastle disease virus(NDV):briefhistory of its oncolytic strains(新城疫病毒(NDV)：其溶瘤株的生活简史).J ClinVirol 16:1-15；Lorence等人(2007).Phase 1clinical experience using intravenousadministration of PV701,an oncolytic Newcastle disease virus(使用PV701—一种溶瘤新城疫病毒的静脉内给药的1期临床体验).Curr Cancer Drug Targets 7:157-167；Hotte等人(2007).An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701(用于溶瘤病毒PV701的最优化临床方案).Clin Cancer Res 13:977-985；Freeman等人(2006).Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrentglioblastoma multiforme(静脉内NDV-HUJ溶瘤病毒在复发性多形性成胶质细胞瘤中的I/II期试验).Mol Ther 13:221-228；Pecora等人(2002).Phase I trial of intravenousadministration of PV701,an oncolytic virus,in patients with advanced solidcancers(PV701—一种溶瘤病毒的静脉内给药在晚期实体癌症患者中的I期试验).J ClinOncol 20:2251-2266；Csatary等人(2004).MTH-68/H oncolytic viral treatment inhuman high-grade gliomas(人类高级别胶质瘤中的MTH-68/H溶瘤病毒治疗).JNeurooncol 67:83-93)。然而，天然存在的NDV毒株在这些针对人类晚期癌症的临床试验中的成功仅仅是边缘的(Hotte等人(2007).An optimized clinical regimen for theoncolytic virus PV701(用于溶瘤病毒PV701的最优化临床方案).Clin Cancer Res 13:977-985；Freeman等人(2006).Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolyticvirus in recurrent glioblastoma multiforme(静脉内NDV-HUJ溶瘤病毒在复发性多形性成胶质细胞瘤中的I/II期试验).Mol Ther 13:221-228；Pecora等人(2002).Phase Itrial of intravenous administration of PV701,an oncolytic virus,in patientswith advanced solid cancers(PV701—一种溶瘤病毒的静脉内给药在晚期实体癌症患者中的I期试验).J Clin Oncol 20:2251-2266)。因此，仍然有可用于治疗癌症、尤其是晚期癌症的基于NDV 的疗法的需求。
3.发明内容
在一个方面，本文提供的是经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的嵌合的新城疫病毒(NDV)。在一个具体的实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂的包装基因组，其中所述激动剂被表达。在一个具体的实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的包装基因组，其中所述拮抗剂被表达。
在另一个实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂和引起该NDV成为高度基因融合(highly fusogenic)的突变的F蛋白的包装基因组，其中所述激动剂和所述突变的F蛋白被表达。在另一个实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂和具有突变切割位点(mutatedcleavage site)的突变的F蛋白的包装基因组，其中所述激动剂和所述突变的F蛋白被表达。在一个具体的实施方案中，表达该突变F蛋白的嵌合的NDV相对于表达在该切割位点无突变的对应物(counterpart)F蛋白的相应病毒，具有增加的基因融合活性。在另一个具体的实施方案中，所述修饰的F蛋白被掺入到病毒体(virion)中。
在另一个实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的抑制信号的拮抗剂和引起该NDV成为高度基因融合的突变的F蛋白的包装基因组，其中所述拮抗剂和所述突变的F蛋白被表达。在另一个实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的抑制信号的拮抗剂和具有突变切割位点的突变的F蛋白的包装基因组，其中所述拮抗剂和所述突变的F蛋白被表达。在一个具体的实施方案中，表达该突变的F蛋白的嵌合的NDV相对于表达在该切割位点无突变的对应物F蛋白的相应病毒，具有增加的基因融合活性。在另一个具体的实施方案中，所述修饰的F蛋白被掺入到病毒体中。
在另一个实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂和细胞因子(例如，白介素(IL)-2)的包装基因组，其中所述激动剂和所述细胞因子被表达。在另一个实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂、细胞因子(例如，IL-2)和引起该NDV成为高度基因融合的突变的F蛋白的包装基因组，其中所述激动剂、所述细胞因子和所述突变的F蛋白被表达。在另一个实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂、细胞因子(例如，IL-2)和具有突变切割位点的突变的F蛋白的包装基因组，其中所述激动剂、所述细胞因子和所述突变的F蛋白被表达。在一个具体的实施方案中，表达具有突变切割位点的突变F蛋白的嵌合的NDV是高度基因融合的。在另一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白被掺入到病毒体中。
在另一个实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的抑制信号的拮抗剂和细胞因子(例如，IL-2)的包装基因组，其中所述拮抗剂和所述细胞因子被表达。在另一个实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的抑制信号的拮抗剂、细胞因子(例如，IL-2)和引起该NDV成为高度基因融合的突变的F蛋白的包装基因组，其中所述拮抗剂、所述细胞因子和所述突变的F蛋白被表达。在另一个实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的抑制信号的拮抗剂、细胞因子(例如，IL-2)和具有突变切割位点的突变的F蛋白的包装基因组，其中所述拮抗剂、所述细胞因子和所述突变的F蛋白被表达。在一个具体的实施方案中，表达具有突变切割位点的突变F蛋白的嵌合的NDV是高度基因融合的。在另一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白被掺入到病毒体中。
在一个具体的实施方案中，免疫细胞的共刺激信号的激动剂是由免疫细胞表达的共刺激受体的激动剂。共刺激受体的具体实例包括糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、可诱导T-细胞共刺激物(ICOS或CD278)、OX40(CD134)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、CD226、细胞毒性和调节T细胞分子(CRTAM)、死亡受体3(DR3)、淋巴毒素-β受体(LTBR)、跨膜激活物和CAML互作物(TACI)、B细胞-激活因子受体(BAFFR)和B细胞成熟蛋白(BCMA)。在一个具体的实施方案中，由免疫细胞表达的共刺激受体的激动剂是特异性结合至共刺激受体的抗体(或其抗原结合片段)或配体。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是sc-Fv。在一个具体的实施方案中，所述抗体是结合至免疫细胞上的两个受体的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抗体结合至免疫细胞上的一个受体并且结合至癌细胞上的另一个受体。在多个具体的实施方案中，所述抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，所述配体或抗体是包含NDV F蛋白或其片段或NDV HN蛋白或其片段的嵌合蛋白。用于产生这样的嵌合蛋白的方法在本领域中是已知的。参见例如，美国专利申请公布号2012-0122185，所述文献的公开内容以其整体并入本文作为参考。也参见Park等人,PNAS 2006；103:8203-8和Murawski等人,J Virol 2010；84:1110-23，所述各文献的公开内容以其整体并入本文作为参考。在某些实施方案中，所述配体或抗体被表达为嵌合的F蛋白或NDV F-融合蛋白，其中所述嵌合的F蛋白或NDV F-融合蛋白包含NDV F糖蛋白的细胞质结构域和跨膜结构域或其片段，并且所述胞外结构域包含所述配体或抗体。在有些实施方案中，所述配体被表达为嵌合的HN蛋白或NDV HN-融合蛋白，其中所述嵌合的HN蛋白或NDV HN-融合蛋白包含NDV HN糖蛋白的跨膜结构域和胞外结构域或其片段，并且所述胞外结构域包含所述配体或抗体。在一个具体的实施方案中，所述配体或抗体被表达为嵌合蛋白，如在第7节实施例2中所描述，参见下文。
在一个具体的实施方案中，免疫细胞的抑制信号的拮抗剂是由免疫细胞表达的抑制受体的拮抗剂。抑制受体的具体实例包括细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4或CD52)、编程性细胞死亡蛋白1(PD1或CD279)、B和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T-细胞膜蛋白3(TIM3)、腺苷A2a受体(A2aR)、具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)和CD160。在一个具体的实施方案中，由免疫细胞表达的抑制受体的拮抗剂是特异性结合至共刺激受体的抗体(或其抗原结合片段)。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是sc-Fv。在多个具体的实施方案中，所述抗体是人抗体或人源化抗体。在另一个具体的实施方案中，抑制受体的拮抗剂是特异性结合至抑制受体的配体的可溶性受体或抗体(或其抗原结合片段)。在某些实施方案中，所述抗体是包含NDV F蛋白或其片段或NDV HN蛋白或其片段的嵌合蛋白。参见例如，美国专利申请公布号2012-0122185,Park等人,PNAS 2006；103:8203-8，和Murawski等人,J.Virol 2010；84:1110-23，各自以其整体并入本文作为参考。在某些实施方案中，所述抗体被表达为嵌合的F蛋白或NDV F-融合蛋白，其中所述嵌合的F蛋白或NDV-F-融合蛋白包含NDV F糖蛋白的细胞质结构域和跨膜结构域或其片段，并且所述胞外结构域包含所述抗体。在有些实施方案中，所述抗体被表达为嵌合的HN蛋白或NDV HN-融合蛋白，其中所述嵌合的HN蛋白或NDVHN-融合蛋白包含NDV HN糖蛋白的跨膜结构域和胞内结构域或其片段，并且所述胞外结构域包含所述抗体。
在另一个方面，本文提供的是用于繁殖本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)的方法。本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)能够在对NDV感染敏感的任何细胞、对象、组织或器官中繁殖。在一个实施方案中，本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)可以在细胞系中繁殖。在另一个实施方案中，本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)可以在癌细胞中繁殖。在另一个实施方案中，本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)可以在含胚卵(embryonated egg)中繁殖。在某些实施方案中，本文提供的是用本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)感染的分离的细胞、组织或器官。参见例如，第5.4节，关于用本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)感染的细胞、动物和卵的实例，参见下文。在多个具体的实施方案中，本文提供的是用本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)感染的分离的癌细胞。在某些实施方案中，本文提供的是用本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)感染的细胞系。在其它的实施方案中，本文提供的是用本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)感染的含胚卵。
在另一个方面，本文提供的是包含本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)的组合物。在一个具体的实施方案中，本文提供的是包含本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一个实施方案中，本文提供的是包含用本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)感染的癌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。在多个具体的实施方案中，所述癌细胞在掺入到所述药物组合物之前已用伽马辐射(gamma radiation)处理。在多个具体的实施方案中，所述癌细胞在用NDV(例如，嵌合的NDV)感染之前已用伽马辐射处理。在其它具体的实施方案中，所述癌细胞在用NDV(例如，嵌合的NDV)感染之后已用伽马辐射处理。在另一个实施方案中，本文提供的是药物组合物，其包含来自裂解的NDV-感染的癌细胞(例如，嵌合的-NDV感染的癌细胞)的蛋白质浓缩物和药学上可接受的载体。
在另一个方面，本文提供的是用于生产包含本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)的药物组合物的方法。在一个实施方案中，用于生产药物组合物的方法包括：(a)将本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)在对NDV感染敏感的细胞系中繁殖；和(b)收集子代病毒(progeny virus)，其中使所述病毒生长至足够数量，并且在所述病毒没有污染的足够条件下生长，使得所述子代病毒适合于配制成药物组合物。在另一个实施方案中，用于生产药物组合物的方法包括：(a)将本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)在含胚卵中繁殖；和(b)收集子代病毒，其中使所述病毒生长至足够数量，并且在所述病毒没有污染的足够条件下生长，使得所述子代病毒适合于配制成药物组合物。
在另一个方面，本文提供的是使用本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或包含此类嵌合的NDV的组合物治疗癌症的方法。在一个具体的实施方案中，用于治疗癌症的方法包括用本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或其组合物感染对象的癌细胞。在另一个实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向有其需要的对象给予本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或其组合物。在多个具体的实施方案中，将有效量的本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或包含有效量的本文描述的嵌合的NDV的组合物给予对象以治疗癌症。在多个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含基因组，所述基因组包含免疫细胞的共刺激信号的激动剂(例如，免疫细胞的共刺激受体的激动剂)和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂(例如，免疫细胞的抑制受体的拮抗剂)。在某些实施方案中，所述NDV的基因组也包含突变的F蛋白。在某些实施方案中，将两种或两种以上嵌合的NDV给予对象以治疗癌症。
在另一个实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向有其需要的对象给予用本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或其组合物感染的癌细胞。在多个具体的实施方案中，所述癌细胞在给予至对象或掺入到所述组合物之前已用伽马辐射处理。在另一个实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向有其需要的对象给予来自用嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或其组合物感染的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜碎片(plasma membrane fragments)。在多个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含基因组，所述基因组包含免疫细胞的共刺激信号的激动剂(例如，免疫细胞的共刺激受体的激动剂)和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂(例如，免疫细胞的抑制受体的拮抗剂)。在某些实施方案中，所述NDV的基因组也包含突变的F蛋白。
在另一个方面，本文提供的是使用本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV，如在第5.2节中所描述，参见下文)或包含这样的所述NDV的组合物并且结合一种或多种其它疗法治疗癌症的方法。在一个实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括给予对象本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV，如在第5.2.1节中所描述，参见下文)和一种或多种其它疗法。在另一个实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括给予对象有效量的本文描述的NDV或包含有效量的本文描述的NDV的组合物，和一种或多种其它疗法。所述NDV和一种或多种其它疗法可以同时地或序贯地给予至所述对象。在某些实施方案中，所述NDV和一种或多种其它疗法在同一组合物中给予。在其它的实施方案中，所述NDV和一种或多种其它疗法在不同的组合物中给予。所述NDV和一种或多种其它疗法可以通过相同或不同的给药途径给予至所述对象。
任何NDV型或毒株都可以用于本文公开的联合疗法中，包括但不限于天然存在的毒株、变异体或突变体、诱变产生的病毒、重配子(reassortants)和/或遗传工程改造的病毒。在一个具体的实施方案中，与一种或多种其它疗法联合使用的NDV是天然存在的毒株。在另一个实施方案中，与一种或多种其它疗法联合使用的NDV是嵌合的NDV。在一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含包装基因组，所述基因组包含细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-17或IL-21)。在多个具体的实施方案中，所述细胞因子由用所述嵌合的NDV感染的细胞表达。在一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含包装基因组，所述基因组包含肿瘤抗原。在多个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原由用所述嵌合的NDV感染的细胞表达。在一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含包装基因组，所述基因组包含促凋亡分子(pro-apoptotic molecule)或抗凋亡分子。在多个具体的实施方案中，所述促凋亡分子或抗凋亡分子由用所述嵌合的NDV感染的细胞表达。
在另一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含包装基因组，所述基因组包含免疫细胞的共刺激信号的激动剂(例如，免疫细胞的共刺激受体的激动剂)和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂(例如，免疫细胞的抑制受体的拮抗剂)。在多个具体的实施方案中，所述激动剂和/或拮抗剂由用所述嵌合的NDV感染的细胞表达。在某些实施方案中，所述NDV的基因组也包含突变的F蛋白。在某些实施方案中，与本文描述的NDV联合使用的一种或多种疗法是下文在第5.6.4节中描述的一种或多种其它疗法。在多个特定的实施方案中，与本文描述的NDV联合使用的一种或多种疗法是免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂(参见例如，第5.6.4.1节，参见下文)。参见例如，第5.2.1节关于免疫细胞的共刺激信号的激动剂和免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的实例，参见下文。在一个具体的实施方案中，免疫细胞的抑制信号的拮抗剂是下文在第6节和第7节中描述的抗CTLA-4抗体。在另一个具体的实施方案中，免疫细胞的抑制信号的拮抗剂是下文在第7节中描述的抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在另一个具体的实施方案中，免疫细胞的共刺激信号的激动剂是下文在第6节和第7节中描述的ICOS配体。
3.1术语
如本文所用的，术语“约(about)”或“近似地(approximately)”当与数字连用时是指参考数值的1％、5％或10％以内的任意数值。
如本文所用的，术语“激动剂”是指与其它分子结合并且诱导生物学反应的分子。在一个具体的实施方案中，激动剂是与细胞上的受体结合并且触发一种或多种信号转导途径的分子。举例来说，激动剂包括与细胞上的受体结合并且诱导一种或多种信号转导途径的抗体或配体。在某些实施方案中，所述抗体或配体与细胞上的受体结合并且诱导一种或多种信号转导途径。在其它的实施方案中，所述激动剂促进天然配体与天然受体的相互作用。
如本文所用的，术语“拮抗剂”是指抑制其它分子的作用而不激起本身生物学应答的分子。在一个具体的实施方案中，拮抗剂是与细胞上的受体结合并且阻断或减弱激动剂的生物学活性的分子。举例来说，拮抗剂包括与细胞上的受体结合并且阻断或减弱天然配体与细胞的结合而不诱导一种或多种信号转导途径的抗体或配体。拮抗剂的另一个实例包括与细胞上的天然受体竞争与天然配体的结合并且因此阻断或减弱当天然受体与天然配体结合时所诱导的一种或多种信号转导途径的抗体或可溶性受体。
如本文所用的，术语“抗体”是指含有抗原结合位点的分子，例如免疫球蛋白。抗体包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、单域抗体、骆驼化(camelized)抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的双特异性Fvs(sdFv)、胞内抗体(intrabodies)和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，抗Id抗体和抗抗体的抗抗Id抗体)和任何上述抗体的表位结合片段。具体地说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段。免疫球蛋白分子可以属于任何型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一个具体的实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体。在另一个具体的实施方案中，抗体是单克隆抗体或scFv。在某些实施方案中，抗体是人或人源化单克隆抗体或scFv。在其它具体的实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。在某些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合至免疫细胞的共刺激受体或免疫细胞的抑制受体，和癌细胞上的受体。在有些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合至免疫细胞上的两个受体，例如，免疫细胞上的两个共刺激受体、免疫细胞上的两个抑制受体或免疫细胞上的一个共刺激受体和免疫细胞上的一个抑制受体。
如本文所用的，术语“衍生物”在蛋白质或多肽的上下文中是指：(a)与天然多肽有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或有40％至65％、50％至90％、65％至90％、70％至90％、75％至95％、80％至95％或85％至99％同一性的多肽；(b)由与编码天然多肽的核酸序列有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或有40％至65％、50％至90％、65％至90％、70％至90％、75％至95％、80％至95％或85％至99％同一性的核酸序列编码的多肽；(c)相对于天然多肽含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或20个以上，或2至5、2至10、5至10、5至15、5至20、10至15或15至20个氨基酸突变(即，添加、缺失和/或取代)的多肽；(d)由在高、中等或典型严格性杂交条件下与编码天然多肽的核酸序列能够杂交的核酸序列编码的多肽；(e)由在高、中等或典型严格性杂交条件下与编码天然多肽的至少10个连续氨基酸、至少12个连续氨基酸、至少15个连续氨基酸、至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸、至少40个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少75个连续氨基酸、至少100个连续氨基酸、至少125个连续氨基酸、至少150个连续氨基酸，或10至20、20至50、25至75、25至100、25至150、50至75、50至100、75至100、50至150、75至150、100至150或100至200个连续氨基酸的片段的核酸序列能够杂交的核酸序列编码的多肽；或(f)天然多肽的片段。衍生物也包括包含天然存在的成熟形式的哺乳动物多肽的氨基酸序列和异源信号肽氨基酸序列的多肽。另外，衍生物包括已经过化学修饰的多肽，例如，糖基化、乙酰化、聚乙二醇化(pegylation)、磷酸化、酰胺化，通过已知的保护/封端基团衍生化、蛋白酶切割、与细胞配体或其它蛋白质部分键合，等等。此外，衍生物包括包含一个或多个非经典氨基酸的多肽。在一个实施方案中，衍生物是分离的。在多个具体的实施方案中，衍生物保留了其所衍生的天然多肽的一种或多种功能。
百分同一性可使用本领域技术人员已知的任何方法来测定。在一个具体的实施方案中，百分同一性使用序列分析软件包(the Sequence Analysis Software Package)的“Best Fit”或“Gap”程序(第10版；Genetics Computer组,Inc.,University of WisconsinBiotechnology Center,Madison,Wisconsin)来测定。关于杂交条件(例如，高、中等和典型严格性条件)的信息已有描述，参见例如，美国专利申请公布号US 2005/0048549(例如，段落72-73)。
如本文所用的，术语“片段(fragment)”在蛋白质性物质(proteinaceous agent)(例如，蛋白质)的片段的上下文中是指这样的片段：即蛋白质性物质的8个或8个以上连续氨基酸、10个或10个以上连续氨基酸、15个或15个以上连续氨基酸、20个或20个以上连续氨基酸、25个或25个以上连续氨基酸、50个或50个以上连续氨基酸、75个或75个以上连续氨基酸、100个或100个以上连续氨基酸、150个或150个以上连续氨基酸、200个或200个以上连续氨基酸，或者在10至300个连续氨基酸、10至200个连续氨基酸、10至250个连续氨基酸、10至150个连续氨基酸、10至100个连续氨基酸、10至50个连续氨基酸、50至100个连续氨基酸、50至150个连续氨基酸、50至200个连续氨基酸、50至250个连续氨基酸、50至300个连续氨基酸、25至50个连续氨基酸、25至75个连续氨基酸、25至100个连续氨基酸或75至100个连续氨基酸之间的范围内。在一个具体的实施方案中，蛋白质性物质的片段保留了该蛋白质性物质的一种或多种功能–换句话说，它是一种功能性片段。例如，蛋白质性物质的片段保留了与其它蛋白质相互作用和/或诱导、增强或激活一种或多种信号转导途径的能力。
如本文所用的，术语“功能性片段”在蛋白质性物质的上下文中，是指蛋白质性物质的一部分，其保留了该蛋白质性物质的一种或多种活性或功能。例如，抑制受体的功能性片段可保留结合其配体中的一种或多种的能力。共刺激受体的配体的功能性片段可保留与受体结合和/或诱导、增强或激活由配体与其共刺激受体结合所介导的一种或多种信号转导途径的能力。
如本文所用的，术语“异源的”是指在自然界中不存在并且不与天然存在的NDV相关联(例如，不由天然存在的NDV的基因组编码和/或表达)的实体。
如本文所用的，术语“老年人”是指65岁或65岁以上的人。
如本文所用的，术语“人类成人”是指18岁或18岁以上的人。
如本文所用的，术语“人类儿童”是指1周岁到18周岁的人。
如本文所用的，术语“人类学步的幼儿(human toddler)”是指1周岁到3周岁的人。
如本文所用的，术语“人类婴儿”是指刚出生的到1周岁的人。
在某些实施方案中，如本文所用的术语“高度基因融合的(highly fusogenic)”和“增加的基因融合活性(increased fusogenic activity)”和类似术语，是指NDV形成含有大量细胞的合胞体(syncytia)的能力增加。在一个具体的实施方案中，用经工程改造以表达突变的F蛋白的本文描述的NDV感染的细胞相对于用衍生该病毒的亲代病毒(parentalvirus)感染的细胞，具有增加的形成合胞体的能力，其中亲代病毒具有未突变的F蛋白。在另一个具体的实施方案中，约10％至约25％、约25％至约50％、约25％至约75％、约50％至约75％、约50％至约95％或约75％至约99％或约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％以上的用经工程改造以表达突变的F蛋白的本文描述的NDV感染的细胞形成合胞体，相对于形成合胞体的衍生该嵌合病毒的亲代病毒(其具有未突变的F蛋白)感染的细胞的数目。在某些实施方案中，在一段时间(例如，约8小时至约12小时、约12小时至约24小时、约24小时至约36小时或约36小时至约48小时)之后，所述合胞体通过统计每个合胞体的细胞核数来进行显微镜法定量。
如本文所用的，术语“干扰素拮抗剂”是指降低或抑制细胞的干扰素免疫应答的药剂。在一个实施方案中，干扰素拮抗剂是降低或抑制细胞的干扰素免疫应答的蛋白质性物质。在一个具体的实施方案中，干扰素拮抗剂是降低或抑制细胞的干扰素应答的病毒蛋白或多肽。
在一个具体的实施方案中，干扰素拮抗剂是降低或抑制干扰素表达和/或活性的药剂。在一个实施方案中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制I型IFN的表达和/或活性。在另一个实施方案中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制II型IFN的表达和/或活性。在另一个实施方案中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制III型IFN的表达和/或活性。在一个具体的实施方案中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制IFN-α、IFN-β或它们二者的表达和/或活性。在另一个具体的实施方案中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制IFN-γ的表达和/或活性。在另一个实施方案中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制IFN-α、IFN-β和IFN-γ中的一种、两种或全部的表达和/或活性。
在某些实施方案中，IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ在含胚卵(embryonated egg)或细胞中的表达和/或活性被干扰素拮抗剂降低近似1至近似100倍、近似5至近似80倍、近似20至近似80倍、近似1至近似10倍、近似1至近似5倍、近似40至近似80倍，或1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍，相对于IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ在不表达或未接触这样的干扰素拮抗剂的对照含胚卵或细胞中的表达和/或活性，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的技术所测量。在其它的实施方案中，IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ在含胚卵或细胞中的表达和/或活性被干扰素拮抗剂降低至少20％至25％、至少25％至30％、至少30％至35％、至少35％至40％、至少40％至45％、至少45％至50％、至少50％至55％、至少55％至60％、至少60％至65％、至少65％至70％、至少70％至75％、至少75％至80％、至少80％至85％、至少85％至90％、至少90％至95％、至少95％至99％或降低20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，相对于IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ在不表达或未接触干扰素拮抗剂的这样的对照含胚卵或细胞中的表达和/或活性，如通过本文描述的或本领域技术人员已知的技术所测量。
如本文所用的，短语“IFN缺陷型系统”或“IFN-缺陷型底物”是指这样的细胞、细胞系和动物(例如，小鼠、鸡、火鸡、兔、大鼠、马等)等系统：其不产生IFN中的一种、两种或两种以上型，或不产生IFN的任何型，或产生低水平的IFN中的一种、两种或两种以上型，或产生低水平的任何IFN(即，在相同条件下，当与能产生IFN(IFN-competent)的系统相比时，任何IFN表达降低5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或90％以上)，对IFN中的一种、两种或两种以上型不应答或以较低效率应答，或对IFN的任何型不应答，对IFN中的一种、两种或两种以上型具有延迟的应答，和/或在由IFN中的一种、两种或两种以上型诱导的或由IFN的任何型诱导的抗病毒基因的活性中是有缺陷的。
如本文所用的，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”在抗体的上下文中是类似的术语，并且是指与抗原(例如，表位或免疫复合物)特异性结合的分子，正如本领域技术人员所了解的。与抗原特异性结合的分子可以与其它肽或多肽以较低亲和力结合，如通过例如免疫测定(例如，ELISA)、表面等离子共振(例如，
Figure BDA0002386487570000131
)、KinEx测定(使用例如KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments,Boise,ID))或本领域已知的其它测定所确定。在一个具体的实施方案中，与抗原特异性结合的分子以解离常数(即,Ka)为至少2logs、2.5logs、3logs、3.5logs、4logs或大于Ka与该抗原结合，当该分子与另一抗原结合时。在另一种具体的实施方案中，与抗原特异性结合的分子不与其它蛋白质交叉反应。
如本文所用的，术语“单克隆抗体”是本领域的一个术语并且一般是指从同质或基本上同质抗体的群体获得的抗体，并且各单克隆抗体将典型地识别抗原上的单一表位(例如，单一构象表位)。
如本文所用的，短语“感染复数(multiplicity of infection)”或“MOI”是每个被感染的细胞中病毒的平均数。把相加的病毒数((加起来的ml)x Pfu/ml)除以相加的细胞数((加起来的ml)x细胞/ml)得出MOI。
如本文所用的，术语“天然配体”是指与天然存在的受体结合的任何天然存在的配体。在一个具体的实施方案中，所述配体是哺乳动物配体。在另一个具体的实施方案中，所述配体是人配体。
如本文所用的，术语“天然多肽”在蛋白质或多肽的上下文中是指任何天然存在的氨基酸序列，包括蛋白质的未成熟或前体及成熟形式。在一个具体的实施方案中，所述天然多肽是人蛋白质或多肽。
如本文所用的，术语“天然受体”是指与天然存在的配体结合的任何天然存在的受体。在一个具体的实施方案中，所述受体是哺乳动物受体。在另一个具体的实施方案中，所述受体是人受体。
如本文所用的，术语“对象(subject)”或“患者(patient)”可互换使用。如本文所用的，术语“对象”是指动物。在有些实施方案中，对象是哺乳动物，包括非灵长类动物(例如，骆驼、驴、斑马、牛、马、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类动物(例如，猴、黑猩猩和人)。在有些实施方案中，对象是非人哺乳动物。在某些实施方案中，对象是宠物(例如，狗或猫)或农场动物(例如，马、猪或牛)。在其它的实施方案中，对象是人。在某些实施方案中，哺乳动物(例如，人)是0至6个月、6至12个月、1至5岁、5至10岁、10至15岁、15至20岁、20至25岁、25至30岁、30至35岁、35至40岁、40至45岁、45至50岁、50至55岁、55至60岁、60至65岁、65至70岁、70至75岁、75至80岁、80至85岁、85至90岁、90至95岁或95至100岁。在多个具体的实施方案中，对象是不为禽类的动物。
如本文所用的，术语“治疗”在给予某种疗法的上下文中是指来自对象接受了有益效果(例如，癌症或其症状的发展或进展的减轻、减少、弱化、变小、稳定化、缓解、阻抑、抑制或停止)的治疗/疗法。在某些实施方案中，对象所接受的治疗/疗法导致产生下述效果中的至少一种或多种：(i)减轻或缓解癌症和/或与其相关的症状的严重程度；(ii)缩短与癌症相关的症状的持续时间；(iii)防止与癌症相关的症状的复发；(iv)引起癌症和/或与其相关的症状的消退；(v)减少对象住院；(vi)缩短住院的时间；(vii)增加对象的生存时间；(viii)抑制癌症和/或与其相关的症状的进程；(ix)增强或提高另一种疗法的治疗效果；(x)减少或消除癌细胞群体；(xi)使肿瘤或赘生物的生长降低；(xii)使肿瘤尺寸减小；(xiii)使肿瘤的形成降低；(xiv)根除、去除或控制原发性、局限性和/或转移性癌症；(xv)使转移瘤(metastases)的数目或尺寸减小；(xvi)使死亡率降低；(xvii)使患者的无癌症生存率增加；(xviii)使无复发生存时间增加；(xix)处于缓解期的患者数增加；(xx)住院率减少；(xxi)在给予疗法之后，肿瘤尺寸维持不变和尺寸不增加，或者肿瘤尺寸增加小于5％或10％，如通过本领域技术人员可获得的常规方法(例如，MRI、X-射线和CAT扫描)所测量；(xxii)预防癌症和/或与其相关的症状的发展或发作；(xxiii)患者的缓解时间增加；(xxiv)使与癌症相关的症状数量减少；(xxv)癌症患者的无症状生存时间增加；和/或(xxvi)转移瘤受限制或缩小。在有些实施方案中，对象所接受的治疗/疗法并不是治愈癌症，而是阻止疾病的进程或恶化。在某些实施方案中，对象所接受的治疗/疗法不预防癌症的发作/发展，而是可预防癌症症状的发作。
如本文所用的，术语“组合”在将两种或两种以上的疗法给予对象的上下文中是指使用超过一种疗法。术语“组合”的使用并不限制将疗法给予对象的顺序。第一疗法可以在将第二疗法给予对象之前(例如，之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)给予。
如本文所用的，术语“疗法”可以指可用于治疗癌症的任何方案、方法和/或药剂(agent(s))。在某些实施方案中，术语“疗法”是指可用于治疗癌症的生物学疗法、支持性疗法、激素疗法、化学疗法、免疫疗法和/或其它疗法。在一个具体的实施方案中，疗法包括辅助疗法。例如，使用与药物疗法、生物学疗法、手术疗法和/或支持性疗法相结合的疗法。在某些实施方案中，术语“疗法”是指本文描述的嵌合的NDV。在其它的实施方案中，术语“疗法”是指不是嵌合的NDV的药剂。
4.附图说明
图1.在体外感染的B16-F10细胞的表面上，NDV感染上调MHC I、MHC II和ICAM-1的表达(感染后24小时)。
图2A-2E.肿瘤内NDV治疗导致被巨噬细胞、NK细胞、CD8和CD4效应子细胞浸润并且减小Tregs的频率。A)总体研究方案。B)总CD45+浸润物。C)总免疫细胞浸润物。D)相对CD4FoxP3+和FoxP3-亚群(subset)的代表性流式细胞术散点图。E)Teff/Treg和CD8/Treg比值。
图3A-3C.用NDV的疗法表现出对远处肿瘤(distant tumor)的肿瘤微环境的良好效果。A)相对CD4 FoxP3+和FoxP3-亚群的代表性流式细胞术散点图。B)CD4效应子、Treg和CD8细胞的绝对数每克肿瘤。C)Teff/Treg和CD8/Treg比值。
图4A-4C.浸润远处肿瘤的淋巴细胞上调激活、裂解和增殖标志物。对于A)CD44、B)颗粒酶B和C)Ki-67显示了CD4效应子细胞上的代表性表达散点图(左)及在CD4效应子、CD8、Tregs中的相应百分比(右)。
图5A-5D.NDV单一疗法延迟远处肿瘤的生长，并且提供对肿瘤再攻击的一些保护。双侧胁腹肿瘤如图2A所述来建立并对动物进行治疗并跟踪存活。A)右胁腹(治疗的)肿瘤的生长。B)左胁腹(未治疗的)肿瘤的生长。C)总体存活率。框内的数字表示无肿瘤动物的百分数。D)通过在第75天用B16-F10黑色素瘤细胞再攻击的NDV治愈B16-F10黑色素瘤的动物存活率。两个不同实验的代表性结果，每组10只小鼠。
图6A-6B.来自治疗的和未治疗的肿瘤二者的肿瘤浸润淋巴细胞在响应NDV疗法时上调CTLA-4。A)在右边(治疗的)肿瘤中，在CD8、CD4效应子和Tregs中CTLA-4表达的代表性散点图。B)在左边(未治疗的)肿瘤中，在CD8、CD4效应子和Tregs中CTLA-4表达的代表性散点图。
图7A-7C.用NDV和CTLA-4阻断的联合疗法增强注射肿瘤和远处肿瘤中的抗肿瘤效应。如图2A所述，建立双侧B16胁腹肿瘤并对动物进行治疗，用或不用抗CTLA-4抗体9H10。A)治疗的肿瘤的生长。B)远处肿瘤的生长。框内的数字表示无肿瘤小鼠的百分比。C)长期存活率。2个不同实验的代表性结果，每组10只小鼠。
图8.用NDV和抗CTLA-4的联合疗法对非病毒许可性前列腺TRAMP肿瘤是系统性有效的。如图2A所述，建立右(第12天)和左(第3天)胁腹TRAMP肿瘤并用NDV对动物进行治疗，用或不用系统性抗CTLA-4抗体。显示了左胁腹(未注射的)肿瘤的生长。框内的数字表示无肿瘤小鼠的百分数。
图9A-9C.在B16-F10肿瘤中，NDV感染上调PD-L1的表达。A)在用NDV感染24小时的B16-F10细胞上的表面PD-L1表达。B)在用UV失活的来自感染的B16-F10细胞的上清液治疗的B16-F10细胞上的表面PD-L1表达。C)在从来自如图2A所述治疗的动物的注射肿瘤和远处肿瘤中分离的肿瘤细胞表面上PD-L1的上调(2个左图--代表性流式细胞术直方图，右图--每组5只小鼠的计算平均值)。
图10A-10F.用NDV和抗PD-1的联合疗法对B16黑色素瘤是系统性有效的，并导致增加的T细胞浸润伴有激活标志物的上调。A)总体存活率。动物如图2A所述进行治疗，用或不用抗PD-1抗体。B)在肿瘤中CD45、CD3、CD8和CD4效应子细胞的绝对数。C)在肿瘤浸润淋巴细胞中调节T细胞的相对百分比。D-E)从远处肿瘤中分离出肿瘤浸润淋巴细胞并染色用于ICOS(D)和颗粒酶B(E)的表达。F)肿瘤浸润淋巴细胞用加载了肿瘤裂解物(tumor lysates)的树突细胞再刺激，并通过细胞内细胞因子染色评价IFNγ的表达。
图11.在远处肿瘤和排肿瘤的淋巴结(tumor-draining lymph nodes,TDLN)中，用NDV和CTLA-4的联合疗法诱导ICOS和CD4效应子细胞的上调。
图12A-12D.NDV-ICOSL病毒的产生和体外评价。A)病毒基因组构建体方案。B)在感染24小时的B16-F10细胞的表面上ICOSL的表达(代表性直方图(histogram)，左图；和每组3个样品的平均值，右图)。C)在被感染的B16-F10细胞中，通过LDH测定所确定的NDV的细胞溶解活性。D)在B16-F10细胞中，重组NDV的复制。
图13A-13C.用NDV-mICOSL和抗CTLA-4的联合疗法保护小鼠免于对侧肿瘤攻击并导致长期动物存活。动物用较大肿瘤剂量攻击并且如图2A所述用NDV加或不加系统性抗CTLA-4抗体进行治疗。显示了左胁腹(未注射的)肿瘤的生长。B)长期存活率。框内的数字表示被保护而免于肿瘤的动物的百分数。每组5-10只小鼠的3个不同实验的合并数据。C)用联合疗法治疗的小鼠在较早前肿瘤位点发生白斑(vitiligo)，但不是系统性的。
图14A-14B.在CT26结肠癌模型中，用NDV-mICOSL和抗CTLA-4的联合疗法保护小鼠免于对侧肿瘤攻击并导致长期动物存活。动物用较大肿瘤剂量攻击并且如图2A所述用NDV加或不加系统性抗CTLA-4抗体进行治疗。显示了左胁腹(未注射的)肿瘤的生长。框内的数字表示被保护而免于肿瘤的动物的百分数。B)长期存活率。用每组5-10只小鼠的代表性实验(A)和每组5-10只小鼠的2个不同实验的合并数据(B)。
图15A-15C.NDV治疗导致远处B16肿瘤被巨噬细胞、NK细胞、CD8和CD4效应子细胞浸润并减小Tregs的频率。A)总CD45+、CD3+、CD8+、CD4+FoxP3-(Teff)和CD4+FoxP3+(Treg)浸润物。B)Teff/Treg和CD8/Treg比值。C)总巨噬细胞、NK和NKT细胞浸润物。
图16A-16B.浸润远处B16肿瘤的淋巴细胞上调激活、裂解和增殖标志物。代表性的Ki-67、颗粒酶B(GrB)和ICOS表达散点图(A)和在CD4效应子和CD8细胞中的相应百分比(B)
图17.来自治疗动物的肿瘤浸润淋巴细胞在响应用加载了B16-F10裂解物的DC刺激时分泌IFN-γ。显示了代表性散点图。
图18A-18B.通过联合疗法治愈的动物被保护免于进一步肿瘤攻击。A)B16-F10黑色素瘤，第120天用1x 105个细胞再攻击。B)CT26结肠癌，第90天用1x 106个细胞再攻击。两个不同实验的代表性结果，每组10只小鼠。
图19A-19B.重组ICOSL-F嵌合蛋白在表面上有效地表达。A)嵌合蛋白的示意图。B)在转染细胞的表面上嵌合的ICOSL-Ftm融合蛋白的表达。
图20A-20D.NDV感染局限于注射肿瘤。A)将重组NDV-Fluc经肿瘤内(IT)或静脉内(IV)给予携带CT26肿瘤的Balb/C动物并在下一个72小时内获取影像。B)将NDV-Fluc给予携带双侧B16-F10黑色素瘤肿瘤的C57BL/6小鼠并监测动物120小时。显示了代表性发光影像。C)归一化至背景发光的来自肿瘤位点的发光的定量测定。D)由图(C)中的数据计算得出的曲线下面积(AUC)。数据显示来自3个独立实验中的1个的代表性结果，每组3-5只小鼠。***p<0.001。
图21A-21F.在注射病毒的肿瘤中，NDV感染增加肿瘤白细胞浸润。动物按照图22A中所描述的方案进行治疗。在第15天切除肿瘤，对TILs进行标记并通过流式细胞术进行分析。A)肿瘤浸润CD45+和CD3+细胞的百分比的代表性流式细胞术散点图。B)CD45+细胞的绝对数/g肿瘤。C)先天性免疫细胞的绝对数/g肿瘤。D)CD4+FoxP3+(Treg)和CD4+FoxP3-(Tconv)细胞的百分比的代表性散点图。E)常规和调节CD4+细胞和CD8+细胞的绝对数/g肿瘤。F)来自肿瘤的计算的Tconv/Treg和CD8+/Treg比值。数据代表来自3个独立实验的累积结果，每组3-5只小鼠。显示了平均值+/-SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图22A-22M.NDV增加远处肿瘤淋巴细胞浸润并且延迟肿瘤生长。A)治疗方案。B)肿瘤浸润CD45+和CD3+细胞的百分比的代表性流式细胞术散点图。C)CD45+细胞的绝对数/g肿瘤。D)先天性免疫细胞的绝对数/g肿瘤。E)来自远处肿瘤的肿瘤切片用H&E染色(顶图)或标记CD3和FoxP3(底图)并通过显微镜术进行分析。由箭头所指的区域表示坏死和炎症性浸润物的区域。比例尺代表200μm。F)CD4+FoxP3+(Treg)和CD4+FoxP3-(Tconv)细胞的百分比的代表性流式细胞术散点图。G)由流式细胞术计算得出的常规和调节CD4+细胞和CD8+细胞的绝对数/g肿瘤。H)CD45+细胞除外的Tregs的相对百分比。I)计算的Tconv/Treg和CD8+/Treg比值。(J,K)在肿瘤浸润Tconv(J)和CD8+细胞(K)上ICOS、颗粒酶B和Ki-67的上调。L)注射NDV的肿瘤和远处肿瘤的生长。M)总体动物存活率。数据代表来自3个(B-K)或2个(L-M)独立实验的累积结果，每组n＝3-5。显示了平均值+/-SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图23A-23E.在双侧爪垫黑色素瘤模型中，NDV疗法增加远处肿瘤淋巴细胞浸润。携带双侧爪垫黑色素瘤肿瘤的动物按照图22A中所描述的时间表进行治疗。在第15天切除远处肿瘤并且标记TILs及通过流式细胞术进行分析。A)肿瘤浸润CD45+和CD3+细胞的百分比的代表性流式细胞术散点图。B)CD4+FoxP3+和CD4+FoxP3-细胞的百分比的代表性流式细胞术散点图。C)常规和调节CD4+细胞和CD8+细胞的绝对数/g肿瘤。D,E)在肿瘤浸润CD8+(D)和Tconv(E)淋巴细胞上ICOS、颗粒酶B和Ki-67的上调。数据显示来自2个独立实验中的1个的代表性结果，每组5只小鼠。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图24A-24I.NDV诱导过继转移的肿瘤特异性淋巴细胞的浸润并且促进肿瘤炎症。A)治疗方案。B)来自用NDV和过继转移的Trp1-Fluc淋巴细胞治疗的动物的代表性发光影像。C)来自肿瘤位点的平均发光的定量测定。D)由图(C)中的数据计算得出的曲线下面积(AUC)。E)由流式细胞术计算得出的远处肿瘤的Pmel淋巴细胞的绝对数。F)在图(A)中，每治疗方案治疗的动物的浸润远处肿瘤的CD45+和CD3+细胞的百分比的代表性流式细胞术散点图。G)用肿瘤内单次注射NDV或PBS治疗的动物的血清转移实验方案。H)浸润注射血清的肿瘤的CD45+和CD3+细胞的百分比的代表性流式细胞术散点图。I)由流式细胞术计算得出的在注射血清的肿瘤中指定细胞亚群的绝对数。图B-E的数据代表3个实验中的1个，每组n＝4-5。图G-I的数据代表来自2个独立实验的合并数据，每组n＝5。显示了平均值+/-SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图25.肿瘤内NDV提供保护作用免于肿瘤再攻击。通过NDV治愈B16-F10黑色素瘤的动物在第75天注射1x105个B16-F10黑色素瘤细胞，监测肿瘤生长，并当肿瘤达到1000mm3时实施安乐死。显示了总体动物存活率。数据显示来自2个独立实验中的1个的累积结果，每组10只小鼠。****p<0.0001。
图26A-26B.肿瘤浸润CD8+淋巴细胞在响应NDV疗法时上调CTLA-4。在NDV治疗的(A)和远处(B)肿瘤中，在CD8+细胞中，CTLA-4表达的代表性散点图(左)和累积结果(右)。来自3个实验中的1个的代表性结果，每组3只小鼠。*p<0.05。
图27A-27K.NDV和CTLA-4阻断协同作用以排斥局部肿瘤和远处肿瘤。A)治疗方案。B)病毒治疗的(右胁腹)B16-F10肿瘤的生长。C)远处(左胁腹)B16-F10肿瘤的生长。D)B16-F10模型中的长期存活率。E)在第90天给幸存的动物在右胁腹注射1x105个B16-F10细胞并跟踪存活。数据代表来自3个实验的累积结果，每组n＝6-11。F)病毒治疗的(右胁腹)和远处(左胁腹)TRAMP C2肿瘤的生长。G)TRAMP C2模型中的长期存活率。H)B16-F10和TRAMP C2细胞对NDV介导的裂解在不同的感染复数(MOI’s)下的体外敏感性。I-K)在用NDV感染的B16-F10和TRAMP C2细胞中MHC I、MHC II、CD80和CD86的上调。显示了来自B16-F10细胞的代表性流式细胞术直方图(I)和对B16-F10(J)和TRAMP C2(K)细胞的计算的平均中值荧光强度(MFI)。显示了平均值+/-SEM。数据代表来自3个(B-E)独立实验中的1个或2个(F,G)独立实验中的1个的结果，每组n＝5-10。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图28A-28E.系统性抗肿瘤效应局限于注射肿瘤类型。A)给动物在右胁腹真皮内(i.d.)注射B16-F10黑色素瘤、MC38结肠癌或PBS，并且在左胁腹真皮内(i.d.)注射B16-F10细胞，并且如该方案中概述的方法进行治疗。B,C)接受了右胁腹B16-F10肿瘤或不接受右胁腹肿瘤的动物的远处肿瘤的生长(B)和总体存活率(C)。数据显示来自2个独立实验中的1个的代表性结果，每组5-10只小鼠。D,E)接受了右侧B16-F10或MC38肿瘤的动物的远处肿瘤的生长(D)和总体存活率(E)。数据代表来自2个独立实验中的1个的结果，每组n＝10。**p<0.01，****p<0.0001。
图29A-29E.用NDV和抗CTLA-4的联合疗法增强肿瘤被先天性和适应性免疫细胞浸润。动物用如图27A所述的联合疗法进行治疗。在第15天收获肿瘤并通过流式细胞术分析浸润免疫细胞。A)CD45+细胞的绝对数/g肿瘤。B)CD11b+和NK 1.1+细胞的绝对数/g肿瘤。C)常规和调节CD4+细胞和CD8+细胞的绝对数/g肿瘤。D)CD45+细胞除外的Tregs的相对百分比。E)计算的Tconv/Treg和CD8+/Treg比值。数据代表来自4个独立实验的累积结果，每组3-5只小鼠。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图30A-30J.用NDV和CTLA-4阻断的联合疗法诱导远处肿瘤中的炎症变化。动物按图27A中的方案进行治疗。在第15天收获肿瘤并且分析浸润免疫细胞。A)来自远处肿瘤的肿瘤切片用H&E染色(顶图)或对CD3和FoxP3染色(下图)并且分别通过光学和荧光显微镜术进行分析。由箭头所指的区域表示坏死和炎症性浸润物。比例尺代表200μm。B)由流式细胞术计算得出的肿瘤浸润CD45+和CD3+细胞的绝对数/g肿瘤。C)在CD45+群体上设门的肿瘤浸润CD4+和CD8+细胞的百分数的代表性流式细胞术散点图。D)Tconv、Treg和CD8+细胞的绝对数每克肿瘤。E)CD45+细胞除外的肿瘤浸润Tregs的相对百分比。F)计算的Tconv/Treg和CD8+/Treg比值。G-I)在肿瘤浸润CD8+和Tconv淋巴细胞上ICOS、颗粒酶B和Ki-67的上调。显示了代表性流式细胞术散点图(顶图)和累积结果(底图)。J)TILs用经B16-F10肿瘤裂解物脉冲的DC再刺激，并通过细胞内细胞因子染色来确定IFNγ产生。显示了代表性流式细胞术散点图(左图)和累积结果(右图)。数据代表来自5个(A-I)或2个(J)独立实验的累积结果，每组n＝3-5。显示了平均值+/-SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图31.抗CD8、CD4和NK1.1的抗体在体内使目标细胞耗竭。耗竭性抗体(depletingantibody)如下文在第7.1节中的材料与方法中所论述进行注射。在第5天收集血液样品并通过流式细胞术用非交叉反应性抗体加工处理CD4+、CD8+和NK细胞。阳性染色用水平尺表示。显示了来自2个独立实验中的1个的代表性直方图，每组5只小鼠。
图32A-32F.NDV联合疗法的抗肿瘤活性取决于CD8+和NK细胞和I型和II型干扰素。A-C)动物如图27A所述进行治疗，用或不用CD4+、CD8+、NK细胞的耗竭性抗体，或IFNγ。A)注射肿瘤的生长。B)远处肿瘤的生长。C)长期存活率。D-F)IFNAR-/-或年龄匹配的C57BL/6小鼠(BL/6)如图3A所述进行治疗并监测肿瘤生长。D)注射肿瘤的生长。E)远处肿瘤的生长。F)长期存活率。所有小图的数据都代表来自2个独立实验的累积结果，每组n＝3-10。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图33A-33B.NDV疗法导致肿瘤和肿瘤浸润白细胞上PD-L1的上调。A).在注射病毒的肿瘤和远处肿瘤中，体外(左图)和体内感染的B16-F10细胞上的PD-L1表达。左：代表性流式细胞术直方图；右：来自肿瘤的B16-F10细胞上PD-L1表达的平均中值荧光强度(MFI)。B)在从远处肿瘤分离的肿瘤浸润白细胞的表面上的PD-L1表达。左：代表性流式细胞术直方图；右：对于各细胞亚群，计算的平均MFI。
图34A-34D.在双侧胁腹B16黑色素瘤模型中，NDV与阻断PD-1的抗体的联合疗法导致增强的抗肿瘤功效。A)治疗方案。B)右胁腹(注射NDV的)肿瘤生长。C)左胁腹(远处)肿瘤生长。D)总体存活率。
图35A-35D.在双侧胁腹B16黑色素瘤模型中，NDV与阻断PD-L1的抗体的联合疗法导致增强的抗肿瘤功效。A)治疗方案。B)右胁腹(注射NDV的)肿瘤生长。C)左胁腹(远处)肿瘤生长。D)总体存活率。
图36A-36E.用NDV和抗PD-1疗法的联合疗法导致增加的远处肿瘤被效应子但不是调节T细胞浸润。A)在肿瘤中CD4+和CD8+细胞的百分比的代表性流式细胞术散点图。B)Tconv(CD4+FoxP3-)和Treg(CD4+FoxP3+)细胞的百分比的代表性流式细胞术散点图。C)由流式细胞术计算得出的T细胞的绝对数每克肿瘤。D)来自CD4+ T细胞的Tregs的相对百分比。E)计算的Tconv/Treg和CD8/Treg比值。
图37A-37B.在用联合NDV和抗PD-1疗法治疗的动物中，来自远处肿瘤的TILs上调裂解和增殖标志物。A)对颗粒酶B和Ki67呈阳性的Tconv和CD8淋巴细胞的百分比的代表性流式细胞术散点图。B)对颗粒酶B和Ki67呈阳性的Tconv和CD8+ T细胞的百分比。
图38A-38C.在注射病毒的肿瘤和远处肿瘤中，NDV诱导肿瘤免疫浸润和CD4和CD8细胞上ICOS的上调。A)治疗方案。B)从注射NDV的(右胁腹)肿瘤中分离的肿瘤浸润CD4+FoxP3-和CD8+细胞上ICOS的表达。显示了代表性流式细胞术散点图(顶)和中值荧光强度(MFI)(底)。C)从远处(左胁腹)肿瘤中分离的肿瘤浸润CD4+FoxP3-和CD8+细胞上ICOS的表达。显示了代表性流式细胞术散点图(顶)和中值荧光强度(MFI)(底)。
图39A-39D.NDV-ICOSL病毒的产生和体外评价。A)病毒基因组构建体方案。B)在感染24小时的B16-F10细胞的表面上ICOSL的表达(代表性直方图，左；和每组3个样品的平均值，右)。C)在被感染的B16-F10细胞中，通过LDH测定所确定的NDV的细胞溶解活性。D)在B16-F10细胞中，重组NDV的复制。
图40A-40F.NDV-ICOSL引起远处肿瘤的生长延迟并且诱导增强的肿瘤淋巴细胞浸润。如前所述建立双侧胁腹B16-F10肿瘤，并且动物用4次肿瘤内注射指定病毒到右侧肿瘤进行治疗。A)注射病毒的肿瘤的生长。B)远处肿瘤的生长。C)总体存活率。D)在右侧肿瘤(注射病毒的肿瘤)中，肿瘤浸润白细胞的绝对数。E)在左侧肿瘤(远处肿瘤)中，肿瘤浸润白细胞的绝对数。F)在远处肿瘤中，Tregs的相对百分比。
图41A-41E.在B16-F10模型中，NDV-ICOSL和CTLA-4阻断的联合疗法导致注射肿瘤和远处肿瘤的排斥并且抵抗肿瘤再攻击。A)治疗方案。B)注射病毒的(右侧)肿瘤的生长。C)远处(左侧)肿瘤的生长。D)总体存活率。E)在第90天幸存的动物在右胁腹用2x105个B16-F10细胞再攻击并跟踪存活。
图42A-42E.在CT26模型中，NDV-ICOSL和CTLA-4阻断的联合疗法导致注射肿瘤和远处肿瘤的排斥。A)治疗方案。B)注射病毒的(右侧)肿瘤的生长。C)远处(左侧)肿瘤的生长。D)总体存活率。E)在第90天幸存的动物在右胁腹用1x106个CT26细胞再攻击并跟踪存活。
图43A-43J.NDV-ICOSL和抗CTLA-4的联合疗法导致增强的肿瘤被先天性和适应性免疫细胞浸润。携带双侧胁腹B16-F10肿瘤的动物按照图41A中所描述的时间表进行治疗。在第15天，将动物处死并且加工远处肿瘤用于TIL的分析。A)在整个肿瘤细胞群体上设门的CD45+和CD3+细胞的代表性流式细胞术散点图。用流式细胞术计算出肿瘤浸润CD45+(B)、CD11b+(C)和NK1.1+细胞(D)的绝对数每克肿瘤。E)肿瘤浸润CD3+、CD8+、CD4+FoxP3-(CD4eff)和CD4+FoxP3+(Treg)的绝对数每克肿瘤。F)所有CD45+细胞的Tregs的相对百分比。G)计算的效应子/Treg比值。H,I,J)对于ICOS、颗粒酶B和Ki67分别呈阳性的肿瘤浸润CD8+和CD4+效应子细胞的相对百分比。
图44A-44C.额外产生的表达嵌合和天然免疫刺激蛋白的重组NDV病毒的示意图。A)与HN的NDV HN细胞内和跨膜区在N末端融合的TNF受体超家族的嵌合蛋白(GITRL、OX40L、4-1BBL、CD40L)示意图(顶图)。下图证明具有与F的细胞内和跨膜区在C末端融合的抗CD28scfv和ICOSL胞外结构域的免疫球蛋白受体超家族的嵌合蛋白示意图。B)所描述的各嵌合蛋白的细胞内-跨膜(HN和F)和胞外结构域的长度。C)转基因的插入位点的示意图及由该策略产生的表达免疫刺激配体的所有重组NDV一览表。
图45A-45C.重组NDV’s的拯救的证实。A)证明对于NDV-HN-GITRL、NDV-aCD28scfv-F、NDV-HN-OX40L、NDV-HN-CD40L、NDV-IL15和NDV-IL21，在各孔中有阳性血细胞凝集活性的血细胞凝集试验。B)在被拯救的病毒中，用于通过RT-PCR证实基因插入的引物位置。C)在从被拯救的病毒中分离的RNA上的RT-PCR。
图46.用重组NDV感染的B16-F10细胞表达表面上的配体。B16-F10细胞用指定重组NDV’s以MOI为2感染并且在18小时后，通过流式细胞术分析表面配体表达。显示了代表性流式细胞术直方图。
图47.NDV-HN-4-1BBL诱导增加的远处肿瘤免疫浸润。携带双侧胁腹B16黑色素瘤肿瘤的动物如先前所述用指定病毒肿瘤内注射到单侧胁腹进行治疗。3次治疗后，将动物实施安乐死，并通过流式细胞术分析来自远处肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞。显示了肿瘤浸润CD3、CD4+FoxP3+(Treg)、CD4+FoxP3-(Tconv)、CD8、NK和CD11b+细胞的总数每克肿瘤。
5.具体实施方式
在一个方面，本文提供的是经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的嵌合的新城疫病毒(NDV)。在一个具体的实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂的包装基因组，其中所述激动剂被表达。在一个具体的实施方案中，本文提供的是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的包装基因组，其中所述拮抗剂被表达。
在另一个方面，本文提供的是用于繁殖本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)的方法。本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)可以在对NDV感染敏感的任何细胞、对象、组织、器官或动物中繁殖。
在另一个方面，本文提供的是包含本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)的组合物。在一个具体的实施方案中，本文提供的是包含本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一个实施方案中，本文提供的是包含用本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)感染的癌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一个实施方案中，本文提供的是包含来自裂解的NDV-感染的癌细胞(例如，嵌合的-NDV感染的癌细胞)的蛋白质浓缩物和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一个方面，本文提供的是用于生产包含本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)的药物组合物的方法。在一个实施方案中，用于生产药物组合物的方法包括：(a)将本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)在对NDV感染敏感的细胞系中繁殖；和(b)收集子代病毒，其中使所述病毒生长至足够数量，并且在所述病毒没有污染的足够条件下生长，使得所述子代病毒适合于配制成药物组合物。在另一个实施方案中，用于生产药物组合物的方法包括：(a)将本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合的NDV)在含胚卵中繁殖；和(b)收集子代病毒，其中使所述病毒生长至足够数量，并且在所述病毒没有污染的足够条件下生长，使得所述子代病毒适合于配制成药物组合物。
在另一个方面，本文提供的是使用本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或包含此类嵌合的NDV的组合物治疗癌症的方法。在一个具体的实施方案中，用于治疗癌症的方法包括用本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或其组合物感染胞对象的癌细胞。在另一个实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向有其需要的对象给予本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或其组合物。在多个具体的实施方案中，将有效量的本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或包含有效量的本文描述的嵌合的NDV的组合物给予对象以治疗癌症。在多个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含包装基因组，所述基因组包含免疫细胞的共刺激信号的激动剂(例如，免疫细胞的共刺激受体的激动剂)和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂(例如，免疫细胞的抑制受体的拮抗剂)，其中所述激动剂和/或拮抗剂由所述NDV表达。在某些实施方案中，所述NDV的基因组也包含突变的F蛋白。在某些实施方案中，将两种或两种以上嵌合的NDV给予对象以治疗癌症。
在另一个实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向有其需要的对象给予用本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或其组合物感染的癌细胞。在多个具体的实施方案中，所述癌细胞在给予至对象或掺入到所述组合物之前已用伽马辐射(gamma radiation)处理。在另一个实施方案中，用于治疗癌症的方法包括向有其需要的对象给予来自用嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)或其组合物感染的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜碎片。在多个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含包装基因组，所述基因组包含免疫细胞的共刺激信号的激动剂(例如，免疫细胞的共刺激受体的激动剂)和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂(例如，免疫细胞的抑制受体的拮抗剂)，其中所述激动剂和/或拮抗剂由所述NDV表达。在某些实施方案中，所述NDV的基因组也包含由所述NDV表达的突变的F蛋白。
在另一个方面，本文提供的是使用本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV，如在第5.2节所描述，参见下文)或包含此类NDV的组合物并且结合使用一种或多种其它疗法治疗癌症的方法。在一个实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括给予对象本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV，如在第5.2节所描述，参见下文)和一种或多种其它疗法。在另一个实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括给予对象有效量的本文描述的NDV或包含有效量的本文描述的NDV的组合物，和一种或多种其它疗法。所述NDV和一种或多种其它疗法可以同时地或序贯地给予至所述对象。在某些实施方案中，所述NDV和一种或多种其它疗法在同一组合物中给予。在其它的实施方案中，所述NDV和一种或多种其它疗法在不同的组合物中给予。所述NDV和一种或多种其它疗法可以通过相同或不同的给药途径给予至所述对象。
任何NDV型或毒株可用于本文公开的联合疗法中，包括但不限于天然存在的毒株、变异体或突变体、诱变产生的病毒、重配子和/或遗传工程改造的病毒。在一个具体的实施方案中，与一种或多种其它疗法联合使用的NDV是天然存在的毒株。在另一个实施方案中，与一种或多种其它疗法联合使用的NDV是嵌合的NDV。在一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含包装基因组，所述基因组包含细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-15、IL-17或IL-21)。在多个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含包装基因组，所述基因组包含肿瘤抗原。在多个具体的实施方案中，所述肿瘤抗原由用所述嵌合的NDV感染的细胞表达。在另一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含包装基因组，所述基因组包含促凋亡分子(例如，Bax、Bak、Bad、BID、Bcl-xS、Bim、Noxa、Puma、AIF、FasL和TRAIL)或抗凋亡分子(例如，Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1和XIAP)。在多个具体的实施方案中，所述促凋亡分子或抗凋亡分子由用所述嵌合的NDV感染的细胞表达。在另一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV包含包装基因组，所述基因组包含免疫细胞的共刺激信号的激动剂(例如，免疫细胞的共刺激受体的激动剂)和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂(例如，免疫细胞的抑制受体的拮抗剂)。在多个具体的实施方案中，所述激动剂和/或拮抗剂由用所述嵌合的NDV感染的细胞表达。在某些实施方案中，所述NDV的基因组也包含突变的F蛋白、肿瘤抗原、异源干扰素拮抗剂、促凋亡分子和/或抗凋亡分子。在某些实施方案中，与本文描述的NDV联合使用的一种或多种疗法是下文在第5.6.4节中描述的一种或多种其它疗法。在多个特定的实施方案中，与本文描述的NDV联合使用的一种或多种疗法是免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂。参见例如，第5.2.1节关于免疫细胞的共刺激信号的激动剂和免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的实例，参见下文。在一个具体的实施方案中，免疫细胞的抑制信号的拮抗剂是下文在第6节中描述的抗CTLA-4抗体。在另一个具体的实施方案中，免疫细胞的共刺激信号的激动剂是下文在第6节中描述的ICOS配体。
5.1新城疫病毒
任何NDV型或毒株可用于本文公开的联合疗法中，包括但不限于天然存在的毒株、变异体或突变体、诱变产生的病毒、重配子和/或遗传工程改造的病毒。在一个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是天然存在的毒株。在某些实施方案中，所述NDV是裂解毒株(lytic strain)。在其它的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是非裂解毒株(non-lytic strain)。在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是缓发型毒株(lentogenic strain)。在有些实施方案中，所述NDV是中发型毒株(mesogenic strain)。在其它的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是速发型毒株(velogenic strain)。NDV毒株的具体实例包括但不限于73-T毒株、NDV HUJ毒株、Ulster毒株、MTH-68毒株、Italien毒株、Hickman毒株、PV701毒株、Hitchner B1毒株(参见例如，Genbank No.AF309418或NC_002617)、La Sota毒株(参见例如，GenbankNo.AY845400)、YG97毒株、MET95毒株、Roakin毒株和F48E9毒株。在一个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是Hitchner B1毒株。在另一个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是由Genbank No.AF309418或NC_002617标识的B1毒株。在另一个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是由ATCC No.VR2239标识的NDV。在另一个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是La Sota毒株。
在多个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV不是致病性鸟类，如通过技术人员已知的技术所评价。在某些具体的实施方案中，在联合疗法中使用的NDV不是致病性的，如通过用病毒经颅内注射1日龄鸡，并评分疾病发展和死亡持续8天所评价。在有些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV的颅内致病性指数为小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1。在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV的颅内致病性指数为零。
在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是中发型毒株，其经遗传工程改造以便被认为在鸟类中不具有致病性，如通过本领域技术人员已知的技术所评价。在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是速发型毒株，其经遗传工程改造以便被认为在鸟类中不具有致病性，如通过本领域技术人员已知的技术所评价。
在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV表达突变的F蛋白。在一个具体的实施方案中，在联合疗法中使用的NDV表达突变的F蛋白，其是高度基因融合的并且能够形成合胞体。在另一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白被掺入到病毒体中。
在一个实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV的基因组经工程改造以表达具有突变切割位点的突变的F蛋白。在一个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV经工程改造以表达突变的F蛋白，其中F蛋白的切割位点经突变产生多碱基(polybasic)氨基酸序列，其允许该蛋白质被细胞内蛋白酶剪切，这使得该病毒在进入细胞并且形成合胞体时更有效。在另一个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV经工程改造以表达突变的F蛋白，其中F蛋白的切割位点用含有一个或两个额外的精氨酸残基的位点替代，这使得突变的切割位点被弗林蛋白酶(furin)家族的遍在表达的蛋白酶所激活。表达这样的突变的F蛋白的NDV的具体实例包括但不限于rNDV/F2aa和rNDV/F3aa。关于向NDV引入F蛋白以产生具有突变的切割位点的突变的F蛋白的突变的描述，参见例如，Park等人(2006)Engineered viral vaccine constructs with dual specificity:avian influenza and Newcastle disease(具有双特异性的工程病毒疫苗构建体：禽流感与新城疫).PNAS USA 103:8203-2808，所述文献以其整体并入本文作为参考。在有些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV经工程改造以表达具有氨基酸突变L289A的突变的F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述L289A突变的F蛋白在切割位点中具有一、二或三个精氨酸残基。在某些实施方案中，所述突变的F蛋白是来自除骨架NDV以外的NDV的不同型或毒株。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白不是骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白替换了骨架NDVF蛋白。
在某些实施方案中，将在本文公开的联合疗法中使用的NDV减毒，使得该NDV保留至少部分的感染性并能在体内复制，但是仅产生低滴度，其导致产生非致病性的感染的亚临床水平(参见例如，Khattar等人,2009,J.Virol.83:7779-7782)。在一个具体的实施方案中，所述NDV因V蛋白缺失而减毒。这样的减毒NDV可以尤其适合于本文描述的实施方案，其中将所述病毒给予对象以便用作免疫原，例如活疫苗。所述病毒可以通过本领域已知的任何方法减毒。
在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV不包含NDVV蛋白编码序列。在其它的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV表达突变的V蛋白。参见例如，关于突变的V蛋白的实例，Elankumaran等人,2010,J.Virol.84(8):3835-3844，所述文献通过引用并入本文作为参考。在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的中发型或速发型NDV毒株表达突变的V蛋白，例如由Elankumaran等人,2010,J.Virol.84(8):3835-3844所披露。
在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是在美国专利号7,442,379、美国专利号6,451,323或美国专利号6,146,642中所公开的NDV，所述美国专利以其整体并入本文作为参考。在多个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV经遗传工程改造以编码并且表达异源肽或蛋白质。在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是本领域技术人员已知的嵌合的NDV或本文公开的嵌合的NDV(参见例如，第5.2节，参见下文)。在有些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达肿瘤抗原(参见下文关于肿瘤抗原的实例)的基因组。在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达异源干扰素拮抗剂(参见下文关于异源干扰素拮抗剂的实例)的基因组。在有些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是在美国专利申请公布号2012/0058141中所公开的嵌合的NDV，所述美国专利申请以其整体并入本文作为参考。在某些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是在美国专利申请公布号2012/0122185中公开的嵌合的NDV，所述美国专利申请以其整体并入本文作为参考。在有些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α等)的基因组。在有些实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达IL-2、IL-15或IL-21的基因组。在一个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达细胞因子(如在第7节实施例2中所描述，参见下文)的基因组。
5.2嵌合的新城疫病毒
在一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂的基因组。在有些实施方案中，所述激动剂和/或拮抗剂被掺入到病毒体中。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂。在另一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的抑制信号的拮抗剂。换句话说，所述NDV用作经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂的“骨架(backbone)”。下面提供了共刺激信号的激动剂的具体实例以及抑制信号的拮抗剂的具体实例。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂和突变的F蛋白的基因组。在一个实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂，和突变的F蛋白。在另一个实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的抑制信号的拮抗剂，和突变的F蛋白。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白是高度基因融合的并且能够形成合胞体。在另一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白被掺入到病毒体中。在某些实施方案中，经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂的NDV的基因组，包含NDV V蛋白编码序列。
在一个实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂，和具有突变切割位点的突变的F蛋白。在一个具体的实施方案中，所述NDV经工程改造以表达突变的F蛋白，其中F蛋白的切割位点经突变产生多碱基(polybasic)氨基酸序列，其允许该蛋白质被细胞内蛋白酶剪切，这使得该病毒在进入细胞并且形成合胞体时更有效。在另一个具体的实施方案中，所述NDV经工程改造以表达突变的F蛋白，其中F蛋白的切割位点用含有一个或两个额外的精氨酸残基的位点替代，这使得突变的切割位点被弗林蛋白酶(furin)家族的遍在表达的蛋白酶所激活。表达这样的突变的F蛋白的NDV的具体实例包括但不限于rNDV/F2aa和rNDV/F3aa。关于向NDV引入F蛋白以产生具有突变的切割位点的突变的F蛋白的突变的描述，参见例如Park等人(2006)Engineered viral vaccine constructs with dual specificity:avian influenza and Newcastle disease(具有双特异性的工程病毒疫苗构建体：禽流感与新城疫).PNAS USA 103:8203-2808，所述文献以其整体并入本文作为参考。在有些实施方案中，所述嵌合的NDV经工程改造以表达具有氨基酸突变L289A的突变的F蛋白。在某些实施方案中，所述突变的F蛋白是来自除骨架NDV以外的NDV的不同型或毒株。在多个具体的实施方案中，L289A突变的F蛋白在切割位点中具有一、二或三个精氨酸残基。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白不是骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白替换了骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白被掺入到病毒体中。
在有些实施方案中，经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂的NDV的基因组，包含突变的NDV V蛋白编码序列，例如由Elankumaran等人,2010,J.Virol.84(8):3835-3844所披露。在其它的实施方案中，经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂的NDV的基因组，不包含NDV V蛋白编码序列。在某些实施方案中，所述嵌合的NDV的亲代骨架(parental backbone)是经工程改造以表达突变的V蛋白的是中发型或速发型NDV毒株，例如由Elankumaran等人,2010,J.Virol.84(8):3835-3844所披露。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂和细胞因子的基因组。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂，和细胞因子。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的抑制信号的拮抗剂，和细胞因子。细胞因子的具体实例包括但不限于白介素(IL)-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、干扰素(IFN)γ、GM-CSF和肿瘤坏死因子(TNF)-α。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂、突变的F蛋白和细胞因子(例如，IL-2、IL-7、IL-9、IL-15、IL-17、IL-21、IL-22、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α)的基因组。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白是高度基因融合的。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白具有突变的切割位点(如本文中所述)。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白包含氨基酸突变L289A。在有些实施方案中，所述嵌合的NDV经工程改造以表达具有氨基酸突变L289A的突变的F蛋白。在某些实施方案中，所述突变的F蛋白是来自除骨架NDV以外的NDV的不同型或毒株。在多个具体的实施方案中，所述L289A突变的F蛋白在切割位点中具有一、二或三个精氨酸残基。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白不是骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白替换了骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白被掺入到病毒体中。
在某些方面，本文提供的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达细胞因子(例如，IL-7、IL-15、IL-21或本文描述的或本领域技术人员已知的其它细胞因子等)的基因组。参见例如，第7节中关于经工程改造以表达细胞因子的嵌合的NDV以及产生这样的嵌合的NDV的方法的实例。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达(i)免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂和(ii)肿瘤抗原的基因组。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂，和肿瘤抗原。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的抑制信号的拮抗剂，和肿瘤抗原。
肿瘤抗原包括肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。肿瘤抗原的具体实例包括但不限于MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙酰基葡糖胺基转移酶-V、p-15、gp100、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、酪氨酸酶、细胞周期蛋白-依赖性激酶4、β-联蛋白、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人乳头瘤病毒-E6、人乳头瘤病毒E7、CD20、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体、MUC-1、caspase-8、CD5、粘蛋白-1、Lewisx、CA-125、p185HER2、IL-2R、Fap-α、腱生蛋白(tenascin)、与金属蛋白酶相关的抗原和CAMPATH-1。其它实例包括但不限于KS 1/4pan-癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸性磷酸、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺特异性膜抗原、CEA、多形性上皮粘蛋白抗原、乳脂肪球抗原、结肠直肠肿瘤相关抗原(如：CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1和LEA)、伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)抗原-38.13、CD19、B-淋巴瘤抗原-CD20、CD33、黑色素瘤特异性抗原(例如，神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂GM3)、肿瘤特异性移植型细胞-表面抗原(TSTA)(例如，病毒诱导的肿瘤抗原，包括T-抗原DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原)、癌胚抗原-甲胎蛋白，例如结肠的CEA、膀胱肿瘤癌胚抗原、分化抗原(例如，人肺癌抗原L6和L20)、纤维肉瘤的抗原、白血病T细胞抗原-Gp37、拟糖蛋白(neoglycoprotein)、鞘脂类、乳腺癌抗原(例如，EGFR(表皮生长因子受体)、HER2抗原(p185.sup.HER2)和HER2 neu表位)、多形性上皮粘蛋白(PEM)、恶性人淋巴细胞抗原-APO-1、分化抗原(例如，在胎儿红细胞、原内胚层中发现的I抗原，在成体红细胞、植入前胚胎中发现的I抗原，在胃腺癌中发现的I(Ma)，在乳腺上皮中发现的M18、M39，在髓系细胞中发现的SSEA-1，在结肠直肠癌中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D.sub.156-22，在结肠腺癌中发现的TRA-1-85(血型H)、C14，在肺腺癌中发现的F3，在胃癌中发现的AH6，在胚胎癌细胞中发现的Y半抗原、Le.sup.y，在A431细胞中发现的TL5(血型A)、EGF受体，在胰腺癌中发现的E1系列(血型B)，在胚胎癌细胞中发现的FC10.2，在腺癌中发现的胃腺癌抗原、CO-514(血型Lea)，在腺癌中发现的NS-10，在A431细胞的EGF受体中发现的CO-43(血型Leb)、G49，在结肠腺癌中发现的MH2(血型ALeb/Ley)，在结肠癌中发现的19.9，在髓系细胞中发现的胃癌粘蛋白、T5A7，在黑色素瘤中发现的R24，在胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8和在4到8个细胞阶段胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4)、来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生肽、C-反应蛋白(CRP)、癌抗原-50(CA-50)、与乳腺癌相关的癌抗原15-3(CA15-3)、与胃肠癌相关的癌抗原-19(CA-19)和癌抗原-242、癌相关抗原(CAA)、嗜铬粒蛋白A、上皮粘蛋白抗原(MC5)、人上皮特异性抗原(E1A)、Lewis(a)抗原、黑色素瘤抗原、黑色素瘤相关抗原100、25和150、粘蛋白样癌相关抗原、多药耐药相关蛋白(MRPm6)、多药耐药相关蛋白(MRP41)、Neu致癌基因蛋白(C-erbB-2)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、P-糖蛋白(mdr1基因产物)、多药耐药相关抗原、p170、多药耐药相关抗原、前列腺特异性抗原(PSA)、CD56和NCAM。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂、突变的F蛋白和肿瘤抗原的基因组。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白是高度基因融合的。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白具有突变的切割位点(如本文中所述)。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白包含氨基酸突变L289A。在有些实施方案中，所述嵌合的NDV经工程改造以表达具有氨基酸突变L289A的突变的F蛋白。在某些实施方案中，所述突变的F蛋白是来自除骨架NDV以外的NDV的不同型或毒株。在多个具体的实施方案中，所述L289A突变的F蛋白在切割位点中具有一、二或三个精氨酸残基。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白不是骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白替换了骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白被掺入到病毒体中。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达(i)免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂和(ii)异源干扰素拮抗剂的基因组。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)，和异源干扰素拮抗剂。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的抑制信号的拮抗剂，和异源干扰素拮抗剂。参见例如，美国专利申请公布号2012-0058141中关于经工程改造以表达异源干扰素拮抗剂的嵌合的NDV的实例，所述文献通过引用并入本文作为参考。
干扰素拮抗剂可以使用本领域技术人员已知的任何技术来鉴定，所述技术包括例如美国专利号6,635,416、7,060,430和7,442,527中描述的技术，所述美国专利以其整体并入本文作为参考。在一个具体的实施方案中，所述异源干扰素拮抗剂是病毒蛋白。这样的病毒蛋白可以得自或来源于任何病毒，并且所述病毒可感染任何种(例如，所述病毒可感染人类或非人类哺乳动物)。示例性的异源干扰素拮抗剂包括但不限于Nipah病毒W蛋白、NipahV蛋白、埃博拉(Ebola)病毒VP35蛋白、牛痘病毒E3L蛋白、流感病毒NS1蛋白、呼吸道合胞病毒(RSV)NS2蛋白、单纯疱疹病毒(HSV)1型ICP34.5蛋白、丙型肝炎病毒NS3-4蛋白酶、阻断诱导或响应先天性免疫力的显性失活细胞蛋白(例如，STAT1、MyD88、IKK和TBK)和先天性免疫应答的细胞调节剂(例如，SOCS蛋白、PIAS蛋白、CYLD蛋白、IkB蛋白、Atg5蛋白、Pin1蛋白、IRAK-M蛋白和UBP43)。参见例如，美国专利申请公布号2012-0058141中关于异源干扰素拮抗剂的其它信息，所述美国专利申请以其整体并入本文作为参考。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂、突变的F蛋白和异源干扰素拮抗剂的基因组。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白是高度基因融合的。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白具有突变的切割位点(如本文中所述)。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白包含氨基酸突变L289A。在有些实施方案中，所述嵌合的NDV经工程改造以表达具有氨基酸突变L289A的突变的F蛋白。在某些实施方案中，所述突变的F蛋白是来自除骨架NDV以外的NDV的不同型或毒株。在多个具体的实施方案中，所述L289A突变的F蛋白在切割位点中具有一、二或三个精氨酸残基。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白不是骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白替换了骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白被掺入到病毒体中。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂和促凋亡分子的基因组。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂，和促凋亡分子。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的抑制信号的拮抗剂，和促凋亡分子。促凋亡分子的具体实例包括但不限于Bax、Bak、Bad、BID、Bcl-xS、Bim、Noxa、Puma、AIF、FasL和TRAIL。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂、突变的F蛋白和促凋亡分子的基因组。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白是高度基因融合的。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白具有突变的切割位点(如本文中所述)。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白包含氨基酸突变L289A。在有些实施方案中，所述嵌合的NDV经工程改造以表达具有氨基酸突变L289A的突变的F蛋白。在某些实施方案中，所述突变的F蛋白是来自除骨架NDV以外的NDV的不同型或毒株。在多个具体的实施方案中，所述L289A突变的F蛋白在切割位点中具有一、二或三个精氨酸残基。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白不是骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白替换了骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白被掺入到病毒体中。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂和抗凋亡分子的基因组。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂，和抗凋亡分子。在一个具体的实施方案中，NDV的基因组经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的抑制信号的拮抗剂，和抗凋亡分子。抗凋亡分子的具体实例包括但不限于Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1和XIAP。
在另一个方面，本文描述的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂、突变的F蛋白和抗凋亡分子的基因组。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白是高度基因融合的。在一个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白具有突变的切割位点(如本文中所述)。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白包含氨基酸突变L289A。在有些实施方案中，所述嵌合的NDV经工程改造以表达具有氨基酸突变L289A的突变的F蛋白。在某些实施方案中，所述突变的F蛋白是来自除骨架NDV以外的NDV的不同型或毒株。在多个具体的实施方案中，所述L289A突变的F蛋白在切割位点中具有一、二或三个精氨酸残基。在有些实施方案中，所述突变的F蛋白不是骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白替换了骨架NDV F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述突变的F蛋白被掺入到病毒体中。
在某些方面，本文提供的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达促凋亡分子的基因组。在某些方面，本文提供的是嵌合的NDV，其包含经工程改造以表达抗凋亡分子的基因组。本文提供了促凋亡分子和抗凋亡分子的实例。
任何NDV型或毒株可以用作骨架，该骨架经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的抑制信号的拮抗剂，和在某些实施方案中，经工程改造以表达细胞因子、肿瘤抗原、异源干扰素拮抗剂、促凋亡分子、抗凋亡分子和/或突变的F蛋白，包括但不限于天然存在的毒株、变异体或突变体、诱变产生的病毒、重配子和/或遗传工程改造的病毒。在一个具体的实施方案中，在本文公开的联合疗法中使用的NDV是天然存在的毒株。在某些实施方案中，用作遗传工程的骨架的NDV是裂解毒株。在其它的实施方案中，用作遗传工程的骨架的NDV是非裂解毒株。在某些实施方案中，用作遗传工程的骨架的NDV是缓发型毒株。在有些实施方案中，用作遗传工程的骨架的NDV是中发型毒株。在其它的实施方案中，用作遗传工程的骨架的NDV是速发型毒株。NDV毒株的具体实例包括但不限于73-T毒株、NDV HUJ毒株、Ulster毒株、MTH-68毒株、Italien毒株、Hickman毒株、PV701毒株、Hitchner B1毒株、La Sota毒株(参见例如，Genbank No.AY845400)、YG97毒株、MET95毒株、Roakin毒株和F48E9毒株。在一个具体的实施方案中，用作遗传工程的骨架的NDV是Hitchner B1毒株。在另一个具体的实施方案中，用作遗传工程的骨架的NDV是由Genbank No.AF309418或NC_002617标识的B1毒株。在另一个具体的实施方案中，用作遗传工程的骨架的NDV是由ATCC No.VR2239标识的NDV。在另一个具体的实施方案中，用作遗传工程的骨架的NDV是La Sota毒株。
在某些实施方案中，期望嵌合的NDV减毒或进一步减毒，使得嵌合的NDV保留至少部分的感染性并能在体内复制，但是仅产生低滴度，其导致非致病性的感染的亚临床水平(参见例如，Khattar等人,2009,J.Virol.83:7779-7782)。在一个具体的实施方案中，NDV因V蛋白缺失而减毒。这样的减毒嵌合NDV可以尤其适合于本文描述的实施方案，其中将所述病毒给予对象以便用作免疫原，例如活疫苗。所述病毒可以通过本领域已知的任何方法减毒。
在某些实施方案中，本文描述的嵌合的NDV表达以下分子中的一、二、三种或三种以上或者全部及自杀基因：(1)免疫细胞的共刺激信号的激动剂；(2)免疫细胞的抑制信号的拮抗剂；(3)细胞因子；(4)肿瘤抗原；(5)异源干扰素拮抗剂；(6)促凋亡分子；(7)抗凋亡分子；和/或(8)突变的F蛋白。在多个具体的实施方案中，除表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的抑制信号的拮抗剂，和在某些实施方案中，突变的F蛋白和细胞因子以外，嵌合的NDV经工程改造还表达自杀基因(例如，胸苷激酶)或抑制NDV复制或功能的其它分子(使NDV对抗生素或抗病毒剂敏感的基因)。在有些实施方案中，除表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞(例如，T-淋巴细胞或NK细胞等)的抑制信号的拮抗剂，和在某些实施方案中，突变的F蛋白和细胞因子以外，嵌合的NDV经工程改造还编码组织特异性微小RNA(microRNA)(miRNA)靶位点(例如，由miR-21、miR-184、miR-133a/133b、miR-137和/或miR-193a微小RNA所靶向的位点)。
在某些实施方案中，所述嵌合的NDV的向性(tropism)被改变。在一个具体的实施方案中，所述病毒的向性通过修饰F蛋白切割位点以被组织特异性或肿瘤特异性蛋白酶如基质金属蛋白酶(MMP)和尿激酶所识别而改变。在其它的实施方案中，所述病毒的向性通过引入组织特异性miRNA靶位点而改变。在某些实施方案中，NDV HN蛋白经突变以识别肿瘤特异性受体。
在某些实施方案中，以下分子中的一种或多种由嵌合的NDV表达为嵌合蛋白或融合蛋白：(1)免疫细胞的共刺激信号的激动剂；(2)免疫细胞的抑制信号的拮抗剂；(3)细胞因子；(4)肿瘤抗原；(5)异源干扰素拮抗剂；(6)促凋亡分子；(7)抗凋亡分子；和/或(8)突变的F蛋白。在多个具体的实施方案中，所述嵌合蛋白或融合蛋白包含NDV F或NDV HN蛋白的跨膜结构域和细胞质结构域或其片段及包含前一个句子中提及的分子之一的胞外结构域。参见美国专利申请号2012-0122185中关于这样的嵌合蛋白或融合蛋白的描述，及国际申请公布号WO 2007/064802，这两份文献通过引用并入本文作为参考。
在本文的实施方案中，可以将免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂插入到在两个转录单元之间的骨架NDV的基因组中。在一个具体的实施方案中，将免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂插入到在M和P转录单元之间和在HN和L转录单元之间的骨架NDV的基因组中。根据本文的其它实施方案所述，将所述细胞因子、肿瘤抗原、异源干扰素拮抗剂、促凋亡分子、抗凋亡分子和/或突变的F蛋白插入到在两个或两个以上转录单元之间(例如，在M和P转录单元之间或者在HN和L转录单元之间)的骨架NDV的基因组中。
5.2.1.免疫细胞刺激剂
本文描述的嵌合的NDV可以经工程改造以表达免疫细胞(例如，T-淋巴细胞、NK细胞或本领域技术人员已知的抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞等))的共刺激信号的任何激动剂和/或抑制信号的任何拮抗剂。在多个具体的实施方案中，所述激动剂和/或拮抗剂是免疫细胞的人共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的人抑制信号的拮抗剂。在某些实施方案中，共刺激信号的激动剂是在免疫细胞(例如，T-淋巴细胞(例如，CD4+或CD8+T-淋巴细胞)、NK细胞和/或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)等)上发现的共刺激分子(例如，共刺激受体)的激动剂。共刺激分子的具体实例包括糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、可诱导T-细胞共刺激物(ICOS或CD278)、OX40(CD134)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、淋巴毒素α(LTα)、LIGHT(淋巴毒素样，表现出可诱导表达，并且与单纯疱疹病毒糖蛋白D竞争HVEM，一种由T淋巴细胞表达的受体)、CD226、细胞毒性和调节T细胞分子(CRTAM)、死亡受体3(DR3)、淋巴毒素-β受体(LTBR)、跨膜激活物和CAML互作物(TACI)、B细胞-激活因子受体(BAFFR)和B细胞成熟蛋白(BCMA)。在多个具体的实施方案中，所述激动剂是免疫细胞的人共刺激受体的激动剂。在某些实施方案中，共刺激受体的激动剂不是ICOS的激动剂。在有些实施方案中，所述拮抗剂是在免疫细胞(例如T-淋巴细胞(例如，CD4+或CD8+ T-淋巴细胞)、NK细胞和/或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)等)上发现的抑制分子(例如，抑制受体)的拮抗剂。抑制分子的具体实例包括细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4或CD52)、编程性细胞死亡蛋白1(PD1或CD279)、B和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)、T-细胞膜蛋白3(TIM3)、CD160、腺苷A2a受体(A2aR)、具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)和CD160。在多个具体的实施方案中，所述拮抗剂是免疫细胞的人抑制受体的拮抗剂。
在一个具体的实施方案中，共刺激受体的激动剂是特异性结合至共刺激受体的抗体或其抗原结合片段。共刺激受体的具体实例包括GITR、ICOS、OX40、CD27、CD28、4-1BB、CD40、LTα、LIGHT、CD226、CRTAM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR和BCMA。在某些具体的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在其它具体的实施方案中，所述抗体是sc-Fv。在一个具体的实施方案中，所述抗体是结合至免疫细胞上的两个受体的双特异性抗体。在其它的实施方案中，所述双特异性抗体结合至免疫细胞上的一个受体并且结合至癌细胞上的另一个受体。在多个具体的实施方案中，所述抗体是人抗体或人源化抗体。在有些实施方案中，所述抗体被表达为具有NDV F蛋白或其片段或NDV HN蛋白或其片段的嵌合蛋白。参见例如，美国专利申请公布号2012/0122185中关于产生嵌合的F或嵌合的HN蛋白的描述，所述文献通过引用并入本文作为参考。在一个具体的实施方案中，所述嵌合蛋白是下文在第6节和/或第7节中描述的嵌合的F蛋白。下文关于产生嵌合的ICOSL-F蛋白和嵌合的CD28-F蛋白所描述的技术可以用于产生其它嵌合的F蛋白或嵌合的HN蛋白。
在另一个实施方案中，共刺激受体的激动剂是共刺激受体的配体。在某些实施方案中，所述配体是天然配体的片段。天然配体的具体实例包括ICOSL、B7RP1、CD137L、OX40L、CD70、疱疹病毒进入媒介物(HVEM)、CD80和CD86。编码天然配体的核苷酸序列以及天然配体的氨基酸序列在本领域中是已知的。例如，B7RP1(别处称为ICOSL；GenBank human:NM_015259.4,NP_056074.1murine:NM_015790.3,NP_056605.1)、CD137L(GenBank human:NM_003811.3,NP_003802.1,murine:NM_009404.3,NP_033430.1)、OX40L(GenBank human:NM_003326.3,NP_003317.1,murine:NM_009452.2,NP_033478.1)、CD70(GenBank human:NM_001252.3,NP_001243.1,murine:NM_011617.2,AAD00274.1)、CD80(GenBank human:NM_005191.3,NP_005182.1,murine:NM_009855.2,NP_033985.3)和CD86(GenBank human:NM_005191.3,CAG46642.1,murine:NM_019388.3,NP_062261.3)的核苷酸序列和氨基酸序列都可以在GenBank中找到。在其它的实施方案中，所述配体是天然配体的衍生物。在有些实施方案中，所述配体是包含特异性结合至共刺激受体的天然配体的至少一部分或天然配体的衍生物和异源氨基酸序列的融合蛋白。在多个具体的实施方案中，所述融合蛋白包含特异性结合至共刺激受体的天然配体的至少一部分或天然配体的衍生物，和免疫球蛋白的Fc部分或其片段。配体融合蛋白的一个实例是与免疫球蛋白的Fc部分融合的4-1BB配体(由Meseck M等人,J Immunother.2011 34:175-82所描述)。在有些实施方案中，所述配体表达为具有NDV F蛋白或其片段或NDV HN蛋白或其片段的嵌合蛋白。在一个具体的实施方案中，所述蛋白质是下文在第7节中描述的嵌合的HN蛋白。下文关于产生嵌合的HN-GITRL、嵌合的HN-OX40-L、嵌合的HN-4-1BBL和/或嵌合的HN-CD40L所描述的技术可以用于产生其它嵌合的F蛋白或嵌合的HN蛋白。
在另一个实施方案中，抑制受体的拮抗剂是特异性结合至抑制受体的天然配体并且阻断天然配体与抑制受体结合并且不转导抑制信号的抗体(或抗原结合片段)或可溶性受体。抑制受体的天然配体的具体实例包括PDL-1、PDL-2、B7-H3、B7-H4、HVEM、Gal9和腺苷。与天然配体结合的抑制受体的具体实例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3和A2aR。
在多个具体的实施方案中，抑制受体的拮抗剂是特异性结合至抑制受体的天然配体并且阻断天然配体与抑制受体结合并且不转导抑制信号的可溶性受体。在某些实施方案中，所述可溶性受体是特异性结合至天然配体(例如，天然抑制受体的胞外结构域或抑制受体的衍生物)的天然抑制受体的片段或天然抑制受体的衍生物的片段。在有些实施方案中，所述可溶性受体是包含天然抑制受体的至少一部分或天然抑制受体的衍生物(例如，天然抑制受体的胞外结构域或天然抑制受体的衍生物)和异源氨基酸序列的融合蛋白。在多个具体的实施方案中，所述融合蛋白包含天然抑制受体的至少一部分或天然抑制受体的衍生物，和免疫球蛋白的Fc部分或其片段。可溶性受体融合蛋白的一个实例是LAG3-Ig融合蛋白(由Huard B等人,Eur J Immunol.1995 25:2718-21所描述)。
在多个具体的实施方案中，抑制受体的拮抗剂是特异性结合至抑制受体的天然配体并且阻断天然配体与抑制受体结合并且不转导抑制信号的抗体(或抗原结合片段)。在某些具体的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在其它具体的实施方案中，所述抗体是scFv。在多个特定的实施方案中，所述抗体是人抗体或人源化抗体。抗抑制配体的抗体的一个具体实例是抗PD-L1抗体(Iwai Y等人,PNAS 2002；99:12293-12297)。
在另一个实施方案中，抑制受体的拮抗剂是与所述抑制受体结合但不转导抑制信号的抗体(或抗原结合片段)或配体。抑制受体的具体实例包括CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3和A2aR。在某些具体的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在其它具体的实施方案中，所述抗体是scFv。在多个特定的实施方案中，所述抗体是人抗体或人源化抗体。抗抑制受体的抗体的一个具体实例是抗CTLA-4抗体(Leach DR等人,Science 1996；271:1734-1736)。抗抑制受体的抗体的另一个实例是抗PD-1抗体(Topalian SL,NEJM 2012；28:3167-75)。
在某些实施方案中，本文描述的嵌合的NDV经工程改造成CTLA-4的拮抗剂，例如伊匹木单抗(Ipilimumab)或曲美木单抗(Tremelimumab)等。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的NDV经工程改造成PD1的拮抗剂，例如MDX-1106(BMS-936558)、MK3475、CT-011、AMP-224或MDX-1105等。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的NDV经工程改造以表达LAG3的拮抗剂，例如IMP321等。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的NDV经工程改造以表达与B7-H3结合的抗体(例如，单克隆抗体或其抗原结合片段，或scFv)，例如MGA271等。在多个具体的实施方案中，本文描述的嵌合的NDV经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂，如在第6节和/或第7节所论述，参见下文。在多个具体的实施方案中，本文描述的NDV经工程改造以表达抗CD28 scvFv、ICOSL、CD40L、OX40L、CD137L、GITRL和/或CD70。
在某些实施方案中，免疫细胞的共刺激信号的激动剂诱导(例如，选择性诱导)由共刺激受体与其配体的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种。在多个具体的实施方案中，共刺激受体的激动剂诱导由共刺激受体与其配体中的一种或多种的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种为至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或在介于25％至50％、25％至75％、50％至75％、50％至95％、75％至95％或75％至100％之间的范围内，相对于在不存在该激动剂的情况下由共刺激受体与其配体中的一种或多种的结合诱导的一种或多种信号转导途径。在多个具体的实施方案中，共刺激受体的激动剂：(i)诱导由共刺激受体与一种特定配体的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种为至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或在介于25％至50％、25％至75％、50％至75％、50％至95％、75％至95％或75％至100％之间的范围内，相对于在不存在该激动剂的情况下由共刺激受体与特定配体的结合诱导的一种或多种信号转导途径；和(ii)不诱导或诱导由共刺激受体与一种或多种其它配体的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种达小于20％、15％、10％、5％或2％或在介于2％至5％、2％至10％、5％至10％、5％至15％、5％至20％、10％至15％或15％至20％之间的范围内，相对于在不存在该激动剂的情况下由共刺激受体与这样的一种或多种其它配体的结合诱导的一种或多种信号转导途径。
在某些实施方案中，免疫细胞的共刺激信号的激动剂激活或增强(例如，选择性激活或增强)由共刺激受体与其配体的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种。在多个具体的实施方案中，共刺激受体的激动剂激活或增强由共刺激受体与其配体中的一种或多种的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种为至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或在介于25％至50％、25％至75％、50％至75％、50％至95％、75％至95％或75％至100％之间的范围内，相对于在不存在该激动剂的情况下由共刺激受体与其配体中的一种或多种的结合诱导的一种或多种信号转导途径。在多个具体的实施方案中，共刺激受体的激动剂：(i)共刺激信号的激动剂激活或增强由共刺激受体与一种特定配体的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种为至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或在介于25％至50％、25％至75％、50％至75％、50％至95％、75％至95％或75％至100％之间的范围内，相对于在不存在该激动剂的情况下由共刺激受体与特定配体的结合诱导的一种或多种信号转导途径；和(ii)不激活或不增强，或激活或增强由共刺激受体与一种或多种其它配体的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种达小于20％、15％、10％、5％或2％或在介于2％至5％、2％至10％、5％至10％、5％至15％、5％至20％、10％至15％或15％至20％之间的范围内，相对于在不存在该激动剂的情况下由共刺激受体与这样的一种或多种其它配体的结合诱导的一种或多种信号转导途径。
在有些实施方案中，免疫细胞的抑制信号的拮抗剂抑制或降低(例如，选择性抑制或降低)由抑制受体与其配体的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种。在多个具体的实施方案中，抑制受体的拮抗剂抑制或降低由抑制受体与其配体中的一种或多种的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种为至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或在介于25％至50％、25％至75％、50％至75％、50％至95％、75％至95％或75％至100％之间的范围内，相对于在不存在该拮抗剂的情况下由抑制受体与其配体中的一种或多种的结合诱导的一种或多种信号转导途径。在多个具体的实施方案中，抑制受体的拮抗剂：(i)抑制或降低由抑制受体与一种特定配体的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种为至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％或在介于25％至50％、25％至75％、50％至75％、50％至95％、75％至95％或75％至100％之间的范围内，相对于在不存在该拮抗剂的情况下由抑制受体与一种特定配体的结合诱导的一种或多种信号转导途径；和(ii)不抑制或不降低，或抑制或降低由抑制受体与一种或多种其它配体的结合诱导的信号转导途径中的一种或多种达小于20％、15％、10％、5％或2％或在介于2％至5％、2％至10％、5％至10％、5％至15％、5％至20％、10％至15％或15％至20％之间的范围内，相对于在不存在该拮抗剂的情况下由抑制受体与这样的一种或多种其它配体的结合诱导的一种或多种信号转导途径。
在多个具体的实施方案中，免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂诱导、激活和/或增强一种或多种免疫活性、功能或应答。所述一种或多种免疫活性、功能或应答可以呈诸如以下的形式：抗体应答(体液应答)或细胞免疫应答，例如，细胞因子分泌(例如，干扰素-γ)、辅助活性或细胞的细胞毒性。在一个实施方案中，在免疫细胞上激活标志物(例如，CD44、颗粒酶或Ki-67)的表达、在免疫细胞上共刺激受体(例如，ICOS、CD28、OX40或CD27)的表达、共刺激受体的配体(例如，B7HRP1、CD80、CD86、OX40L或CD70)的表达、细胞因子分泌、免疫细胞(例如，T-淋巴细胞、B淋巴细胞和/或NK细胞)浸润至肿瘤、抗体产生、效应子功能、T细胞激活、T细胞分化、T细胞增殖、B细胞分化、B细胞增殖和/或NK细胞增殖在与免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂接触之后被诱导、激活和/或增强。在另一个实施方案中，髓系来源的抑制细胞(MDSC)肿瘤浸润和增殖、Treg肿瘤浸润、激活和增殖、外周血MDSC和Treg计数在与免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂接触之后受到抑制。
5.3NDV的构建
本文描述的NDV可以使用反向遗传学(reverse genetics)技术来产生。反向遗传学技术包括制备含有负链病毒RNA的非编码区的合成重组病毒RNA，该非编码区对于被病毒聚合酶识别和对于产生成熟病毒体所需的包装信号均是必不可少的。重组RNA从重组DNA模板合成并在体外用纯化的病毒聚合酶复合物重构以形成重组核糖核蛋白(RNPs)，其可以用于转染细胞。如果在合成RNA体外或体内转录期间存在病毒聚合酶蛋白，则能实现更有效的转染。合成的重组RNPs可以被拯救成为感染性病毒颗粒。前述技术描述于美国专利号5,166,057(1992年11月24日公告)；美国专利号5,854,037(1998年12月29日公告)；美国专利号6,146,642(2000年11月14日公告)；欧洲专利公布EP 0702085A1(1996年2月20日公布)；美国专利申请序列号09/152,845；国际专利公布PCT WO97/12032(1997年4月3日公布)；WO96/34625(1996年11月7日公布)；欧洲专利公布EP A780475；WO 99/02657(1999年1月21日公布)；WO 98/53078(1998年11月26日公布)；WO 98/02530(1998年1月22日公布)；WO 99/15672(1999年4月1日公布)；WO 98/13501(1998年4月2日公布)；WO 97/06270(1997年2月20日公布)；和EPO 780 475A1(1997年6月25日公布)，所述各文献以其整体并入本文作为参考。
还可以使用无辅助质粒技术来工程改造本文描述的NDV。简而言之，构建NDV(例如，Hitchner B1毒株)的完全cDNA，插入到质粒载体中并且经工程改造以在两个转录单元(例如，NDV P和M基因；或NDV HN和L基因)之间含有独特限制位点。可以将编码异源氨基酸序列的核苷酸序列(例如，编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂的核苷酸序列)插入到病毒基因组的独特限制位点中。可选地，编码异源氨基酸序列的核苷酸序列(例如，编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂的核苷酸序列)可以经工程改造成NDV转录单元，只要插入不影响病毒感染和复制的能力。使单个区段位于T7启动子和丁型(delta)肝炎病毒核酶之间以由T7聚合酶产生精确负义转录物。将包含必需病毒蛋白的质粒载体和表达载体转染到细胞中，导致产生重组病毒颗粒(参见例如，国际公布号WO 01/04333；美国专利号7,442,379、6,146,642、6,649,372、6,544,785和7,384,774；Swayne等人(2003).Avian Dis.47:1047-1050；和Swayne等人(2001).J.Virol.11868-11873，所述各文献以其整体并入本文作为参考)。
用于产生表达抗体的嵌合的NDV的技术是本领域已知的。参见例如，Puhler等人,Gene Ther.15(5):371-283 2008)，关于产生由两个转基因表达完全IgG的重组NDV。
由单一mRNA产生多种蛋白质的双顺反子技术是本领域技术人员已知的。双顺反子技术允许通过使用IRES序列将多种蛋白质的编码序列工程改造成单一mRNA。IRES序列指导核糖体至RNA分子的内部募集并且允许以帽(cap)依赖性方式的下游翻译。简而言之，将一种蛋白质的编码区插入到第二种蛋白质的ORF中。该插入侧接IRES和对于恰当表达和/或功能所必需的任何非翻译信号序列。该插入必须不破坏第二种蛋白质的开放阅读框(openreading frame)、聚腺苷酸化或转录启动子(参见例如，García-Sastre等人,1994,J.Virol.68:6254-6261和García-Sastre等人,1994Dev.Biol.Stand.82:237-246，所述各文献以其整体并入本文作为参考)。
5.4NDV的繁殖
本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)可以在任何这样的底物(substrate)中繁殖，其允许病毒生长至许可性使用本文描述的病毒的滴度。在一个实施方案中，该底物允许本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)生长至比得上测定为对应的野生型病毒的滴度。
本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)可以是生长在对被该病毒感染敏感的细胞(例如，禽细胞、鸡细胞等)、含胚卵(例如，鸡蛋或鹌鹑蛋)或动物(例如，鸟类)中。这样的方法是本领域技术人员众所周知的。在一个具体的实施方案中，本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)可以在诸如以下的癌症细胞中繁殖：癌细胞(例如，乳腺癌细胞和前列腺癌细胞)、肉瘤细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞和生殖细胞肿瘤细胞(例如，睾丸癌细胞和卵巢癌细胞)。在另一个具体的实施方案中，本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)可以在诸如以下的细胞系中繁殖：癌细胞系，例如HeLa细胞、MCF7细胞、THP-1细胞、U87细胞、DU145细胞、Lncap细胞和T47D细胞。在某些实施方案中，所述细胞或细胞系(例如，癌细胞或癌细胞系)得自和/或来源于人。在另一个实施方案中，本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)在鸡细胞或含胚卵中繁殖。代表性的鸡细胞包括但不限于鸡胚成纤维细胞和鸡胚肾细胞。在一个具体的实施方案中，本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)在Vero细胞中繁殖。在另一个具体的实施方案中，本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)在癌细胞中繁殖，根据第6节和/或第7节中描述的方法，参见下文。在另一个具体的实施方案中，本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)在鸡蛋或鹌鹑蛋中繁殖。在某些实施方案中，本文描述的NDV病毒(例如，嵌合的NDV)首先在含胚卵中繁殖且然后在细胞(例如，细胞系)中繁殖。
本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)可以在例如6-14日龄、6-12日龄、6-10日龄、6-9日龄、6-8日龄或10-12日龄的含胚卵中繁殖。初期或未成熟含胚卵可以用于繁殖本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)。未成熟含胚卵包括小于10日龄卵的卵，例如6-9日龄或6-8日龄的卵，其是IFN有缺陷的。未成熟含胚卵还包括人工模拟未成熟卵高达、但小于10日龄的卵，这是由于生长条件改变所致，例如孵化温度变化、用药物处理或任何其它导致卵延迟发育的改变，使得与10-12日龄卵相比，IFN系统不完全发育。本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)可以在含胚卵的不同位置(例如，尿囊腔)中繁殖。关于病毒生长和繁殖的详细讨论，参见例如美国专利号6,852,522和美国专利号7,494,808，这两份专利以其整体并入本文作为参考。
对于病毒分离，本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)可从细胞培养物中去除并从细胞组分中分离出来，典型地通过公知的净化(clarification)程序，例如梯度离心和柱色谱，并可以根据需要使用本领域技术人员众所周知的程序来进一步纯化，例如空斑测定(plaque assays)。
5.5组合物与给药途径
本文所涵盖的是本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)在组合物中的用途。本文还涵盖的是来自NDV感染的细胞或用NDV感染的全癌细胞的质膜碎片在组合物中的用途。在一个具体的实施方案中，所述组合物是药物组合物，例如免疫原性制剂(例如，疫苗制剂)。所述组合物可以用于治疗癌症的方法中。
在一个实施方案中，药物组合物包含本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)，与药学上可接受的载体混合(in an admixture with a pharmaceutically acceptable carrier)。在有些实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种另外的预防剂或治疗剂，例如第5.6.4节中描述的预防剂或治疗剂，参见下文。在一个具体的实施方案中，药物组合物包含有效量的本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)，并且任选地包含一种或多种另外的预防剂或治疗剂，在药学上可接受的载体中。在有些实施方案中，所述NDV(例如，嵌合的NDV)是所述药物组合物中所包括的唯一活性成分。
在另一个实施方案中，药物组合物(例如，肿瘤裂解物疫苗(oncolysatevaccine))包含来自NDV感染的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜碎片制备物，与药学上可接受的载体混合。在有些实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种另外的预防剂或治疗剂，例如第5.6.4节中描述的预防剂或治疗剂，参见下文。在另一个实施方案中，药物组合物(例如，全细胞疫苗)包含用NDV感染的癌细胞，与药学上可接受的载体混合。在有些实施方案中，所述药物组合物还包含一种或多种另外的预防剂或治疗剂，例如第5.6.4节中描述的预防剂或治疗剂，参见下文。
本文提供的药物组合物可以呈允许将该组合物给予对象的任何形式。在一个具体的实施方案中，所述药物组合物适合于兽医和/或人类给药。如本文所用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其它一般公认的药典中列举的用于动物，更特别是用于人体的。术语“载体”是指与药物组合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或溶媒。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是对于注射液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、干脱脂奶粉、甘油、丙二醇(propylene,glycol)、水、乙醇等。合适的药用载体的实例描述于E.W.Martin所著的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。制剂应当与给药方式相适应。
在一个具体的实施方案中，所述药物组合物配制成适合于向对象给药的计划途径。例如，所述药物组合物可以配制成适合于胃肠外、静脉内、动脉内、胸膜内、吸入、腹膜内、口服、真皮内、结肠直肠、腹膜内、颅内和肿瘤内给药。在一个具体的实施方案中，所述药物组合物可以配制成静脉内、动脉内、口服、腹膜内、鼻内、气管内、胸膜内、颅内、皮下、肌内、局部、肺部或肿瘤内给药。
5.6抗癌用途及其它用途
在一个方面，本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)可以用于治疗癌症。在一个实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)或其组合物。在一个具体的实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予有效量的本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)或其组合物。
在多个具体的实施方案中，将经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂的嵌合的NDV或其组合物给予对象以治疗癌症。在另一个具体的实施方案中，将经工程改造以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的嵌合的NDV或其组合物给予对象以治疗癌症。在某些实施方案中，将经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂和突变的F蛋白的嵌合的NDV或其组合物给予对象以治疗癌症。在某些实施方案中，将经工程改造以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂和突变的F蛋白的嵌合的NDV或其组合物给予对象以治疗癌症。
在用于治疗癌症的方法中使用的本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞癌症疫苗可以用作疗法的任何线(例如，第一线、第二线、第三线、第四线或第五线疗法)。
在某些实施方案中，本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)是所给予的唯一活性成分以治疗癌症。在多个具体的实施方案中，将本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)是组合物中所给予的唯一活性成分以治疗癌症。
所述嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)或其组合物可以局部地或系统地给予对象。例如，所述嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)或其组合物可以经胃肠外(例如，静脉内、动脉内或皮下)、肿瘤内、胸膜内、鼻内、腹膜内、颅内、口服、直肠、通过吸入、肌内、局部或真皮内给予对象。在一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV经由肝动脉，通过例如肝动脉注射给予，其可以通过介入性放射学或通过置入动脉输注泵进行。在另一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV在手术中、腹腔镜检查或内镜检查时给予。在一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV的腹膜内给药通过直接注射、经由导管的输注或在腹腔镜检查期间注射进行。
在某些实施方案中，本文描述的方法包括治疗无治疗可利用的癌症。在有些实施方案中，将本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)或其组合物作为其它常规疗法的替代疗法给予对象以治疗癌症。
在一个实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)或其组合物和一种或多种另外的疗法(如在第5.6.4节所描述，参见下文)。在一个特定的实施方案中，一种或多种疗法与本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)或其组合物联合给予对象以治疗癌症。在一个具体的实施方案中，所述另外的疗法目前正在用于、已经用于或已知用于治疗癌症。在另一个实施方案中，将本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)或其组合物与支持性疗法、疼痛缓解疗法或对癌症没有治疗效果的其它疗法联合给予对象。在一个具体的实施方案中，与本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)联合给予的一种或多种另外的疗法是下文在第5.6.4.1节中描述的疗法中的一种或多种。在某些实施方案中，本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)和一种或多种另外的疗法在同一组合物中给予。在其它的实施方案中，嵌合的NDV和一种或多种另外的疗法在不同的组合物中给予。
在某些实施方案中，将两种、三种或多种NDV(包括一种、两种或两种以上本文描述的嵌合的NDV，例如第5.2节中描述的嵌合的NDV的一种、两种或两种以上，参见上文)给予对象以治疗癌症。根据本文描述的包括将两种、三种或多种NDV给予对象以治疗癌症的方法所述使用的第二种或更多种的嵌合的NDV，可以是天然存在的嵌合的NDV或经工程改造以表达异源氨基酸序列(例如，细胞因子)的工程改造的嵌合的NDV。所述第一种和第二种嵌合的NDV可以是相同药物组合物或不同药物组合物的一部分。在某些实施方案中，所述第一种嵌合的NDV和所述第二种嵌合的NDV通过相同的给药途径给予(例如，二者均为肿瘤内或静脉内给予)。在其它的实施方案中，所述第一种嵌合的NDV和所述第二种嵌合的NDV通过不同的给药途径给予(例如，一种为肿瘤内给予，而另一种为静脉内给予)。
在多个具体的实施方案中，将经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂的第一种嵌合的NDV与经工程改造以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂第二种嵌合的NDV联合给予患者以治疗癌症。在其它具体的实施方案中，经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫的抑制信号的拮抗剂的第一种嵌合的NDV与经工程改造以表达以下分子中的一种、两种或两种以上的第二种嵌合的NDV联合给予：细胞因子(例如，IL-2)、异源干扰素拮抗剂、肿瘤抗原、促凋亡分子和/或抗凋亡分子。在一个具体的实施方案中，所述第一种嵌合的NDV、所述第二种嵌合的NDV或二者表达突变的F蛋白，其增加所述嵌合的NDV的基因融合活性。在另一个具体的实施方案中，所述第一种嵌合的NDV、所述第二种嵌合的NDV或二者表达在切割位点中具有突变的突变的F蛋白(如本文中所述)。
在多个具体的实施方案中，将包含经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂的第一种嵌合的NDV的第一种组合物(例如，药物组合物)与包含经工程改造以表达免疫细胞的抑制信号的拮抗剂的第二种嵌合的NDV的第二种组合物(例如，药物组合物)联合给予患者以治疗癌症。在其它具体的实施方案中，给予将包含经工程改造以表达免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫的抑制信号的拮抗剂的第一种嵌合的NDV的第一种组合物(例如，药物组合物)与包含经工程改造以表达以下分子中的一种、两种或两种以上的第二种嵌合的NDV的第二种组合物(例如，药物组合物)联合给予：细胞因子(例如，IL-2)、异源干扰素拮抗剂、肿瘤抗原、促凋亡分子和/或抗凋亡分子。在一个具体的实施方案中，所述第一种嵌合的NDV、所述第二种嵌合的NDV或二者表达突变的F蛋白，其增加所述嵌合的NDV的基因融合活性。在另一个具体的实施方案中，所述第一种嵌合的NDV、所述第二种嵌合的NDV或二者表达在切割位点中具有突变的突变的F蛋白(如本文中所述)。
在另一个方面，在癌症的治疗中，本文描述的NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)可以与一种或多种另外的疗法(例如，第5.6.4节中描述的疗法，参见下文(例如，第5.6.4.1节，参见下文))联合使用。在一个实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予本文描述的NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)或其组合物和一种或多种另外的疗法，例如第5.6.4节中描述的疗法，参见下文(例如，第5.6.4.1节)。在一个具体的实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予有效量的本文描述的NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)或其组合物和有效量的一种或多种另外的疗法，例如第5.6.4节中描述的疗法，参见下文(例如，第5.6.4.1节)。在某些实施方案中，将本文描述的NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)和一种或多种另外的疗法，例如第5.6.4节中描述的疗法，参见下文(例如，第5.6.4.1节)在同一组合物中给予。在其它的实施方案中，NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)和一种或多种另外的疗法在不同的组合物中给予。
与一种或多种另外的疗法联合使用的所述NDV可以经系统性或局部给予。例如，所述NDV或其组合物可以经胃肠外(例如，静脉内、动脉内或皮下)、肿瘤内、胸膜内、鼻内、腹膜内、颅内、口服、直肠、通过吸入、肌内、局部或真皮内给予对象。在一个具体的实施方案中，所述NDV经由肝动脉，通过例如肝动脉注射给予，其中可以通过介入性放射学或通过置入动脉输注泵进行。在另一个具体的实施方案中，所述NDV在手术中、腹腔镜检查或内镜检查时给予。在一个具体的实施方案中，所述NDV的腹膜内给药通过直接注射、经由导管的输注或在腹腔镜检查期间注射来进行。
本文描述的NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞癌症疫苗与一种或多种另外的疗法(例如，第5.6.4节中描述的疗法，参见下文)组合可以用作根据本文描述的方法治疗癌症的疗法的任何线(例如，第一线、第二线、第三线、第四线或第五线疗法)。
在另一个方面，用本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)感染的全癌细胞可以用于治疗癌症。在一个具体的实施方案中，可以将接触过癌细胞或癌细胞群体和被感染的癌细胞或癌细胞群体的本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)给予对象以治疗癌症。在一个实施方案中，所述癌细胞在用本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)感染之前经过伽马辐射。在另一个实施方案中，所述癌细胞在用本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)感染之后经过伽马辐射。在一个特定的实施方案中，所述癌细胞在给予对象致使癌细胞不能在对象体内繁殖之前经过处理。在一个具体的实施方案中，所述癌细胞不能在对象体内繁殖并且所述病毒不能感染所述对象。在一个实施方案中，所述癌细胞在给予对象之前经过伽马辐射。在另一个实施方案中，所述癌细胞在给予对象之前经过超声处理。在另一个实施方案中，所述癌细胞在给予对象之前用丝裂霉素C(mitomycin C)处理。在另一个实施方案中，所述癌细胞在给予对象之前通过冷冻和融化处理。在另一个实施方案中，所述癌细胞在给予对象之前用热处理进行处理。所述癌细胞可以经局部或系统性给予对象。例如，所述癌细胞可以经胃肠外(例如，静脉内或皮下)、肿瘤内、鼻内、口服、通过吸入、胸膜内、局部或真皮内给予对象。在一个具体的实施方案中，所述癌细胞经肿瘤内给予或给予至对象的皮肤(例如，真皮内)。所使用的癌细胞可以是自体的或同种异体的(allogeneic)。在一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV的骨架是非裂解毒株。所述癌细胞可以单独或与另外的疗法联合给予对象。所述癌细胞是优选在药物组合物中。在某些实施方案中，所述癌细胞与一种或多种另外的疗法(例如，第5.6.4节中描述的疗法，参见下文)联合给予。在某些实施方案中，所述癌细胞和一种或多种另外的疗法在同一组合物中给予。在其它的实施方案中，所述癌细胞和一种或多种另外的疗法在不同的组合物中给予。
在另一个方面，在癌症的治疗中，用本文描述的NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)感染的全癌细胞可以与一种或多种另外的疗法(第5.6.4节中描述的疗法，参见下文)联合使用。在一个实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予用本文描述的NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)感染的全癌细胞与一种或多种另外的疗法(第5.6.4节中描述的疗法，参见下文)的组合。在一个具体的实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予有效量的用本文描述的NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)感染的全癌细胞与有效量的一种或多种另外的疗法(第5.6.4节中描述的疗法，参见下文)的组合。在某些实施方案中，用本文描述的NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)感染的全癌细胞和一种或多种另外的疗法(第5.6.4节中描述的疗法，参见下文)在同一组合物中给予。在其它的实施方案中，用本文描述的NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)感染的全癌细胞和一种或多种另外的疗法在不同的组合物中给予。
在另一个方面，来自用嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)感染的裂解的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜制备物可以用于治疗癌症。在一个实施方案中，包含来自用本文描述的嵌合的NDV感染的癌细胞的碎片的质膜制备物可以用于治疗癌症。在另一个实施方案中，来自用本文描述的嵌合的NDV感染的癌细胞的蛋白质浓缩物可以用于治疗癌症。可以用本领域技术人员已知的技术来生产所述蛋白质浓缩物或质膜制备物。在一个具体的实施方案中，可能接触过癌细胞或癌细胞群体和被感染的癌细胞或癌细胞群体的本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)可以采用本领域技术人员已知的技术裂解以获得被NDV感染的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜碎片，并且可以将被NDV感染的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜碎片给予对象以治疗癌症。所述蛋白质浓缩物或质膜碎片可以经局部或系统性给予对象。例如，所述蛋白质浓缩物或质膜碎片可以经胃肠外、肿瘤内、鼻内、胸膜内、口服、通过吸入、局部或真皮内给予对象。在一个具体的实施方案中，这样的蛋白质浓缩物或质膜制备物经肿瘤内给予或给予至对象的皮肤(例如，真皮内)。用于生产所述蛋白质浓缩物或质膜制备物的癌细胞可以是自体的或同种异体的。在一个具体的实施方案中，所述嵌合的NDV的骨架是裂解毒株。所述蛋白质浓缩物或质膜制备物可以单独给予或者与另外的疗法联合给予对象。所述蛋白质浓缩物或质膜制备物是优选在药物组合物中。在某些实施方案中，所述蛋白质浓缩物或质膜制备物与一种或多种另外的疗法(例如，第5.6.4节中描述的疗法，参见下文(例如，第5.6.4.1节))联合给予。在某些实施方案中，所述蛋白质浓缩物或质膜制备物和一种或多种另外的疗法在同一组合物中给予。在其它的实施方案中，所述蛋白质浓缩物或质膜制备物和一种或多种另外的疗法在不同的组合物中给予。
在另一个方面，在癌症的治疗中，来自用NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)感染的裂解的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜制备物可以与一种或多种另外的疗法(例如，第5.6.4节中描述的疗法，参见下文(例如，第5.6.4.1节))联合使用。在一个实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予来自用NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)感染的裂解的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜制备物与一种或多种另外的疗法(例如，第5.6.4节中描述的疗法，参见下文(例如，第5.6.4.1节))的组合。在一个具体的实施方案中，本文提供的是用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予有效量的来自用NDV(例如，第5.1节中描述的NDV，参见上文)感染的裂解的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜制备物与有效量的一种或多种另外的疗法(例如，第5.6.4节中描述的疗法，参见下文(例如，第5.6.4.1节))的组合。在某些实施方案中，所述蛋白质浓缩物或质膜制备物和一种或多种另外的疗法(例如，第5.6.4节中描述的疗法，参见下文)在同一组合物中给予。在其它的实施方案中，所述蛋白质浓缩物或质膜制备物和一种或多种另外的疗法在不同的组合物中给予。
在另一个方面，本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)可以用于产生抗体，该抗体可以用于诊断性免疫测定、被动免疫疗法及用于产生抗独特型抗体。例如，可以将本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)给予对象(例如，小鼠、大鼠、猪、马、驴、鸟或人)以产生抗体，然后该抗体可以经过分离并且使用，例如，在诊断测定、被动免疫疗法和产生抗独特型抗体中使用。在某些实施方案中，将本文描述的NDV(例如，第5.1或5.2节中描述的NDV，参见上文)与一种或多种另外的疗法(例如，在第5.6.4节中描述的疗法，参见下文)联合给予对象(例如，小鼠、大鼠、猪、马、驴、鸟或人)以产生抗体，然后该抗体可以经过分离并且使用，例如，在诊断测定、被动免疫疗法和产生抗独特型抗体中使用。所产生的抗体可以通过本领域已知的标准技术(例如，免疫亲和色谱、离心、沉淀等)来分离，并且用于诊断性免疫测定、被动免疫疗法及用于产生抗独特型抗体。
在某些实施方案中，从给予本文描述的嵌合的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见上文)的对象所分离的抗体或者从给予本文描述的NDV(例如，第5.1节或第5.2节中描述的NDV，参见上文)与一种或多种另外的疗法(如在第5.6.4节中所描述，参见下文)组合的对象所分离的抗体，可用于评价NDV蛋白、由嵌合的NDV表达的异源肽或蛋白质或它们二者的表达。本领域已知的任何免疫测定系统可用于该目的，包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，使用技术例如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治(sandwich)”免疫测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射度量测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫电泳测定，这里仅列举了少数例子。
5.6.1.患者群体
在有些实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予患癌对象。在其它的实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予倾向于或易于患癌的对象。在有些实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予诊断为患癌的对象。癌症类型的具体实例是本文描述的。在一个实施方案中，对象患有转移性癌症。在另一个实施方案中，对象患有1期、2期、3期或4期癌症。在另一个实施方案中，对象是处于缓解期。在又一个实施方案中，对象具有癌症的复发。
在某些实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予0至6个月、6至12个月、6至18个月、18至36个月、1至5岁、5至10岁、10至15岁、15至20岁、20至25岁、25至30岁、30至35岁、35至40岁、40至45岁、45至50岁、50至55岁、55至60岁、60至65岁、65至70岁、70至75岁、75至80岁、80至85岁、85至90岁、90至95岁或95至100岁的人。在有些实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予人类婴儿。在其它的实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予人类学步的幼儿。在其它的实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予人类儿童。在其它的实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予人类成人。在又一些实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予老年人。
在某些实施方案中，将NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予处于免疫缺失状态或免疫抑制状态或处于变成免疫缺失或免疫抑制的风险之中的对象。在某些实施方案中，将NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予接受免疫抑制疗法或从免疫抑制疗法中恢复的对象。在某些实施方案中，将NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予患有癌症或处于得癌症的风险之中的对象。在某些实施方案中，所述对象正在经历、将要经历或已经经历外科手术、化学疗法和/或放射疗法。在某些实施方案中，所述患者已经经历外科手术以切除肿瘤或赘生物。在多个具体的实施方案中，所述患者在给予外科手术以切除肿瘤或赘生物之后给予NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法。在其它实施方案中，所述患者在经历外科手术以切除肿瘤或赘生物之前给予NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法。在某些实施方案中，将NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予具有、将具有或已具有组织移植、器官移植或输血的对象。
在有些实施方案中，将NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予已证明对除所述嵌合的NDV或其组合物、肿瘤裂解物、全细胞疫苗或联合疗法以外的疗法难治但不再对这些疗法难治的患者。在一个具体的实施方案中，将NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予已证明对化学疗法难治的患者。在一个实施方案中，癌症对疗法难治意味着癌症细胞的至少一些有意义部分未被杀死或它们的细胞分裂未停止。确定癌症细胞是否难治可以通过本领域已知的用于测定疗法对癌症细胞的影响的任何方法在体内或体外进行，在这样的情况下使用“难治”的本领域可接受的含义。在某一个实施方案中，难治性患者是对标准疗法难治的患者。在某些实施方案中，癌症患者当肿瘤或赘生物已无法明显根除和/或症状已无法明显减轻时对疗法是难治的。确定患者是否难治可以通过本领域已知的用于癌症治疗的有效性的任何方法在体内或体外进行，在这样的情况下使用“难治”的本领域可接受的含义。
在某些实施方案中，根据本文描述的方法治疗的患者是已经用抗生素、抗病毒、抗真菌或其它生物学疗法/免疫疗法或抗癌疗法治疗的患者。其中，这些患者都是难治性患者和太年轻无法进行常规疗法的患者。在有些实施方案中，给予NDV(例如，嵌合的NDV)、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法的对象在给予所述嵌合的NDV或组合物、所述肿瘤裂解物疫苗或所述全细胞疫苗或所述联合疗法之前未曾接受疗法。
在有些实施方案中，将NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予患者以预防处于发生癌症的风险之中的患者的癌症发作。在有些实施方案中，将化合物给予对常规疗法的不利反应敏感的患者。
在有些实施方案中，给予NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法的对象不接受现有疗法。在其它的实施方案中，将NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法给予在给予所述NDV(例如，嵌合的NDV)或组合物、所述肿瘤裂解物疫苗、所述全细胞疫苗或所述联合疗法之前已接受疗法的对象。在有些实施方案中，给予NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗或本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法的对象经历了现有疗法的毒副作用或者现有疗法由于对所述对象的不可接受的毒性水平而中断。
5.6.2.剂量和频率
在治疗癌症中有效的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗的量将取决于癌症性质、给药途径、对象的一般健康状况等，并且应当根据执业医师(medicalpractitioner)的判断来决定。可以任选用标准临床技术(例如，体外测定)来帮助鉴别最佳剂量范围。然而，NDV的合适给药剂量范围一般为约102、5x 102、103、5x 103、104、5x 104、105、5x 105、106、5x 106、107、5x 107、108、5x 108、1x 109、5x 109、1x 1010、5x 1010、1x 1011、5x 1011或1012pfu和最优选为约104至约1012、106至1012、108至1012、109至1012或109至1011，并且可以给予对象一次、两次、三次、四次或四次以上，间隔时间随需要而定。肿瘤裂解物疫苗的给药剂量范围可包括0.001mg、0.005mg、0.01mg、0.05mg.0.1mg.0.5mg、1.0mg、2.0mg.3.0mg、4.0mg、5.0mg、10.0mg、0.001mg至10.0mg、0.01mg至1.0mg、0.1mg至1mg和0.1mg至5.0mg，并且可以给予对象一次、两次、三次或三次以上，间隔时间随需要而定。全细胞疫苗的给药剂量范围可包括102、5x 102、103、5x 103、104、5x 104、105、5x 105、106、5x106、107、5x 107、108、5x 108、1x 109、5x 109、1x 1010、5x 1010、1x 1011、5x 1011或1012个细胞，并且可以给予对象一次、两次、三次或三次以上，间隔时间随需要而定。在某些实施方案中，将与目前正在用于NDV、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗的临床试验的那些剂量类似的剂量给予对象。有效剂量可以从来源于体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线来外推。
在某些实施方案中，NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物作为单剂量给予对象，然后1到6周、1到5周、1到4周、1到3周、1到2周后给予第二次剂量。根据这些实施方案所述，可以在给予对象第二次接种之后，在间隔6到12个月时给予对象多次加强接种。在某些实施方案中，肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗作为单剂量给予对象，然后1到6周、1到5周、1到4周、1到3周、1到2周后给予第二次剂量。
在某些实施方案中，可以重复给予相同的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗，并且重复给药可以间隔至少1天、2天、3天、5天、6天(says)、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在其它的实施方案中，可以重复给予相同的NDV(例如，同一种NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗，并且重复给药可以间隔1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3个月、3至6个月、3至12个月或6至12个月。在有些实施方案中，将第一次NDV(例如，第一次嵌合的NDV)或其组合物给予对象，然后给予第二次NDV(例如，第二次嵌合的NDV)或其组合物。在某些实施方案中，所述第一次和第二次NDV(例如，所述第一次和第二次嵌合的NDV)或其组合物可以间隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。在其它的实施方案中，所述第一次和第二次NDV(例如，所述第一次和第二次嵌合的NDV)或其组合物可以间隔1至14天、1至7天、7至14天、1至30天、15至30天、15至45天、15至75天、15至90天、1至3个月、3至6个月、3至12个月或6至12个月。
在某些实施方案中，将NDV或其组合物或肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗与一种或多种另外的疗法(例如，第5.6.4节中描述的疗法，参见下文)联合给予对象。其它一种或多种另外的疗法的剂量将取决于多种因素，包括例如疗法、癌症性质、给药途径、对象的一般健康状况等，并且应当根据执业医师的判断来决定。在多个具体的实施方案中，其它疗法的剂量是单剂根据本文公开的方法来使用时的疗法所推荐疗法的给药剂量和/或频率。在其它的实施方案中，其它疗法的剂量比是单剂根据本文公开的方法来使用时的疗法所推荐疗法的给药的更低剂量和/或更少频率。被批准疗法的推荐剂量可以在《医师案头参考(thePhysician’s Desk Reference)》书中找到。
在某些实施方案中，在给予一种或多种另外的疗法的同时，将NDV或其组合物或肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗给予对象。在其它的实施方案中，每3至7天、1至6周、1至5周、1至4周、2至4周、1至3周或1至2周将NDV或其组合物或肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗给予对象，并且每3至7天、1至6周、1至5周、1至4周、1至3周或1至2周给予一种或多种另外的疗法(如在第5.6.4节中所描述，参见下文)。在某些实施方案中，每1至2周将NDV或其组合物或肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗给予对象，并且每2至4周给予一种或多种另外的疗法(如在第5.6.4节中所描述，参见下文)。在有些实施方案中，每周将NDV或其组合物或肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗给予对象，并且每2周给予一种或多种另外的疗法(如在第5.6.4节中所描述，参见下文)。
5.6.3.癌症的类型
可以根据本文描述的方法治疗的癌症的具体实例包括但不限于：白血病，例如但不限于急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(如成髓细胞白血病、前髓细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病性白血病)和骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病(Hodgkin’s disease)、非霍奇金病(non-Hodgkin’s disease)；多发性骨髓瘤，例如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病(placancer cell leukemia)、孤立浆细胞瘤(solitary placancercytoma)和髓外浆细胞瘤(extramedullary placancercytoma)；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
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macroglobulinemia)；意义未明的单克隆γ-球蛋白病变(monoclonal gammopathy of undetermined significance)；良性单克隆γ-球蛋白病变；重链病；骨和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨肉瘤(bone sarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、软骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)、恶性巨细胞肿瘤、骨的纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(angiosarcoma,hemangiosarcoma)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，例如但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非神经胶质肿瘤、多形性成胶质细胞瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤、原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于导管癌、腺癌、小叶(癌细胞)癌、导管内癌、髓质性乳腺癌、粘液性乳腺癌、管性乳腺癌、乳头性乳腺癌、佩吉特病(Paget’s disease)和炎症性乳腺癌；肾上腺癌，例如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头性或囊性甲状腺癌、髓质甲状腺癌和间变性甲状腺癌；胰腺癌，例如但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、血管活性肠肽瘤、分泌生长激素抑制素的肿瘤和类癌瘤或胰岛细胞肿瘤；脑垂体癌，例如但不限于库欣病(Cushing’s disease)、分泌催乳素的肿瘤、肢端肥大症和糖尿病性尿崩症(diabetesinsipidus)；眼癌，例如但不限于眼黑色素瘤，例如虹膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤和睫状体黑色素瘤和视网膜母细胞瘤；阴道癌，例如鳞状细胞癌、腺癌和黑色素瘤；外阴癌，例如鳞状细胞癌、黑色素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和佩吉特病；宫颈癌，例如但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮癌、交界肿瘤(borderline tumor)、生殖细胞肿瘤和基质肿瘤；食管癌，例如但不限于鳞状癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞状癌、肉瘤、黑色素瘤、浆细胞瘤(placancercytoma)、疣状癌和燕麦形细胞(癌细胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌(蕈状(息肉状)、溃疡形成、浅表面扩散、弥散性扩散)、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如但不限于肝细胞癌和肝胚细胞瘤；胆囊癌，例如腺癌；胆管癌，例如但不限于乳头状、结节性和弥散性；肺癌，例如非癌细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和癌细胞肺癌；睾丸癌，例如但不限于精细胞瘤、精原细胞瘤(间变性、经典(典型)、精子细胞)、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、绒毛膜癌(卵黄囊肿瘤)、前列腺癌，例如但不限于前列腺上皮内瘤(prostatic intraepithelial neoplasia)、腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；penal cancers；口腔癌，例如但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鳞状细胞癌和疣状；皮肤癌，例如但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑色素瘤、浅表面扩散性黑色素瘤、结节性黑色素瘤、小痣恶性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤；肾癌，例如但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、过渡型细胞癌症(肾盂和/或uterer)；维尔姆斯肿瘤(Wilms’tumor)；膀胱癌，例如但不限于过渡型细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括粘液肉瘤、成骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管原癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(关于这样的疾病的综述参见Fishman等人,1985,Medicine,第2版,J.B.Lippincott Co.,Philadelphia；和Murphy等人,1997,Informed Decisions:The Complete Book of Cancer Diagnosis,Treatment,andRecovery(《理性判定癌症诊断、治疗和康复全书》),Viking Penguin,Penguin BooksU.S.A.,Inc.,United States of America)。
在一个具体的实施方案中，本文描述的嵌合的NDV或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法可用于治疗各种各样的癌症和异常增生性疾病，包括(但不限于)以下的癌症和疾病：癌症，包括膀胱、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、子宫颈、甲状腺和皮肤的癌症；包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)；髓系谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和前髓细胞白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma)；其它肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和许旺瘤(schwannomas)；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarama)和骨肉瘤；和其它肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原细胞瘤、甲状腺囊性癌症和畸胎癌。
在有些实施方案中，与细胞凋亡中的畸变相关的癌症根据本文描述的方法来治疗。这样的癌症可包括但不限于囊性淋巴瘤，具有p53突变的癌症，乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤，和癌前病变，例如家族性腺瘤性息肉病和骨髓增生异常综合征。在多个具体的实施方案中，恶性肿瘤或增生异常变化(例如，化生(metaplasias)和发育不良(dysplasias))或皮肤、肺、肝、骨、脑、胃、结肠、乳腺、前列腺、膀胱、肾、胰腺、卵巢和/或子宫的过度增殖性紊乱根据本文描述的方法来治疗。在其它具体的实施方案中，肉瘤或黑色素瘤根据本文描述的方法来治疗。
在一个具体的实施方案中，根据本文描述的方法治疗的癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)。可以根据本文描述的方法治疗的白血病和其它血源性癌症的具体实例包括但不限于急性淋巴母细胞白血病“ALL”、急性淋巴母细胞B-细胞白血病、急性淋巴母细胞T-细胞白血病、急性成髓细胞白血病“AML”、急性前髓细胞白血病“APL”、急性成单核细胞性白血病、急性红白血病性白血病、急性成巨核细胞性白血病、急性髓单核细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、急性未分化白血病、慢性髓细胞白血病“CML”、慢性淋巴细胞白血病“CLL”和毛细胞白血病。
可以根据本文描述的方法治疗的淋巴瘤的具体实例包括但不限于霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和真性红细胞增多。
在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的癌症是实体肿瘤。可以根据本文描述的方法治疗的实体肿瘤的实例包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓质癌、支气管原癌(bronchogenic carcinoma)、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯肿瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、癌细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的癌症是转移性的。在另一个实施方案中，根据本文描述的方法治疗的癌症是恶性的。
在一个具体的实施方案中，根据本文描述的方法治疗的癌症是具有预后差和/或对常规疗法(例如，化疗和放疗)应答差的癌症。在另一个具体的实施方案中，根据本文描述的方法治疗的癌症是恶性黑色素瘤、恶性神经胶质瘤、肾细胞癌、胰腺腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肺腺癌、肺小细胞癌、肺鳞状细胞癌、间变性甲状腺癌和头颈部鳞状细胞癌。在另一个具体的实施方案中，根据本文描述的方法治疗的癌症是下文在第6节和/或第7节中描述的癌症类型。
5.6.4.另外的疗法
可以与本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗联合使用以治疗癌症的另外的疗法包括但不限于小分子、合成药物、肽(包括环状肽)、多肽、蛋白质、核酸(例如，DNA和RNA核苷酸，包括但不限于反义核苷酸序列、三重螺旋、RNAi和编码生物学活性蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列)、抗体、合成或天然无机分子、模拟药剂(mimetic agents)和合成或天然有机分子。在一个具体的实施方案中，所述另外的疗法是化学治疗剂。
在有些实施方案中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗与放射疗法联合使用，所述放射疗法包含使用x-射线、伽马射线和其它来源的辐射以消灭癌细胞。在多个具体的实施方案中，所述放射疗法作为外部射线束辐射或远距射线疗法来给予，其中辐射直接来自远程来源。在其它的实施方案中，所述放射疗法作为内部疗法或近距射线疗法来给予，其中放射活性源被置于身体内靠近癌细胞和/或肿瘤块的位置。
在某些实施方案中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞癌症疫苗与过继性T细胞疗法联合使用。在一个具体的实施方案中，在过继性T细胞疗法中使用的T细胞是已从对象中分离的肿瘤浸润淋巴细胞及其已扩增备用的特殊T细胞或克隆。在有些实施方案中，在过继性T细胞疗法中使用的T细胞是在患者接受了癌症疫苗之后从其血液中获取并且在使用之前经过体外扩增的T细胞。在另一个具体的实施方案中，在过继性T细胞疗法中使用的T细胞是已受影响以强力识别和攻击肿瘤的T细胞。在另一个具体的实施方案中，在过继性T细胞疗法中使用的T细胞经过遗传修饰以表达肿瘤-抗原特异性T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。在一个具体的实施方案中，所使用的过继性T细胞疗法与下文在第7节中所描述的相类似。
在某些实施方案中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞癌症疫苗与细胞因子联合使用。在一个具体的实施方案中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞癌症疫苗与干扰素(例如，IFN-γ)联合使用。
目前可获得的癌症疗法及其剂量、给药途径和推荐的用法在本领域中是已知的并且在诸如Physician’s Desk Reference(第67版,2013)的参考文献中已有描述。
可以与本文描述的NDV或其组合物联合使用的抗癌剂的具体实例包括：激素类药剂(例如，芳香酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)和雌激素受体拮抗剂)、化学治疗剂(例如，微管拆散阻滞剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂和DNA交联剂或损伤剂)、抗血管生成剂(例如，VEGF拮抗剂、受体拮抗剂、整联蛋白拮抗剂、血管靶向剂(VTA)/血管破坏剂(VDA))、放射疗法和常规外科手术。
可以与本文描述的NDV或其组合物联合使用的激素类药剂的非限制性实例包括芳香酶抑制剂、SERM和雌激素受体拮抗剂。作为芳香酶抑制剂的激素类药剂可以是类固醇的或非类固醇的。非类固醇激素类药剂的非限制性实例包括来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、法倔唑(fadrozole)和伏氯唑(vorozole)。类固醇激素类药剂的非限制性实例包括阿诺新(aromasin)(依西美坦(exemestane))、福美坦(formestane)和睾内酯(testolactone)。作为SERM的激素类药剂的非限制性实例包括他莫昔芬(tamoxifen)(品牌/销售为
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)、阿莫昔芬(afimoxifene)、阿佐昔芬(arzoxifene)、巴多昔芬(bazedoxifene)、氯米芬(clomifene)、femarelle、拉索昔芬(lasofoxifene)、奥美昔芬(ormeloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)和托瑞米芬(toremifene)。作为雌激素受体拮抗剂的激素类药剂的非限制性实例包括氟维司群(fulvestrant)。其它激素类药剂包括但不限于阿比特龙(abiraterone)和洛那立生(lonaprisan)。
可以与本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗联合使用的化学治疗剂的非限制性实例包括微管拆散阻滞剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂和DNA交联剂或损伤剂。作为微管拆散阻滞剂的化学治疗剂包括但不限于紫杉醇类(taxenes)(例如，紫杉醇(paclitaxel)(品牌/销售为
Figure BDA0002386487570000611
)、多西他赛(docetaxel)、abraxane、拉罗他赛(larotaxel)、奥他赛(ortataxel)和替司他赛(tesetaxel))；埃坡霉素类(epothilones)(例如，伊沙匹隆(ixabepilone))；和长春花属生物碱类(vinca alkaloids)(例如，长春瑞滨(vinorelbine)、长春碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)和长春新碱(vincristine)(品牌/销售为
Figure BDA0002386487570000612
))。
作为抗代谢药的化学治疗剂包括但不限于叶酸类抗代谢药(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、氨基蝶呤(aminopterin)、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed))；嘌呤类抗代谢药(例如，克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、喷司他丁(pentostatin)、硫鸟嘌呤(thioguanine))；嘧啶类抗代谢药(例如，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)
Figure BDA0002386487570000613
阿糖胞苷(cytarabine)、地西他滨(decitabine)、氟尿苷(floxuridine)、替加氟(tegafur))；和脱氧核糖核苷酸类抗代谢药(例如，羟基脲(hydroxyurea))。
作为拓扑异构酶抑制剂的化学治疗剂包括但不限于I类(喜树属)拓扑异构酶抑制剂(例如，托泊替康(topotecan)(品牌/销售为
Figure BDA0002386487570000614
)、依立替康(irinotecan)、卢比替康(rubitecan)和贝洛替康(belotecan))；II类(鬼臼属)拓扑异构酶抑制剂(例如，依托泊苷(etoposide)或VP-16和替尼泊苷(teniposide))；蒽环类(例如，多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、Doxil、阿柔比星(aclarubicin)、氨柔比星(amrubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、戊柔比星(valrubicin)和佐柔比星(zorubicinn))；和蒽二酮类(例如，米托蒽醌(mitoxantrone)和匹蒽醌(pixantrone))。
作为DNA交联剂(或DNA损伤剂)的化学治疗剂包括但不限于烷化剂(例如，环磷酰胺(cyclophosphamide)、氮芥(mechlorethamine)、异环磷酰胺(ifosfamide)(品牌/销售为
Figure BDA0002386487570000615
)、曲磷胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、泼尼莫司汀(prednimustine)、苯达莫司汀(bendamustine)、乌拉莫司汀(uramustine)、雌莫司汀(estramustine)、卡莫司汀(carmustine)(品牌/销售为
Figure BDA0002386487570000616
)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、链佐星(streptozocin)、白消安(busulfan)、甘露舒凡(mannosulfan)、曲奥舒凡(treosulfan)、卡波醌(carboquone)、N,N'N'-三亚乙基硫代磷酰胺、三亚胺醌(triaziquone)、三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine))；烷基化样药剂(例如，卡铂(carboplatin)(品牌/销售为
Figure BDA0002386487570000621
)、顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、奈达铂(nedaplatin)、四硝酸三铂(triplatintetranitrate)、沙铂(satraplatin)、picoplatin)；非经典DNA交联剂(例如，丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)(品牌/销售为
Figure BDA0002386487570000622
)、六甲蜜胺(altretamine)、二溴甘露醇(mitobronitol))；和嵌入剂(例如，放射菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素(mitomycin)和普卡霉素(plicamycin))。
5.6.4.1免疫调节剂
在多个具体的实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗与以下药剂中的一种或多种联合给予对象：免疫细胞(例如，T-淋巴细胞、NK细胞或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)等)的共刺激信号的任何激动剂和/或免疫细胞(诸如，例如，T-淋巴细胞、NK细胞或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)的抑制信号的任何拮抗剂，正如本领域技术人员已知的。在多个特定的实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗与上文在第5.2.1节中描述的免疫细胞的共刺激信号的激动剂中的一种或多种联合给予对象。在有些实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗与上文在第5.2.1节中描述的免疫细胞的抑制信号的拮抗剂中的一种或多种联合给予对象。在某些实施方案中，将本文描述的NDV(例如，嵌合的NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗与下文在第6节和/或第7节中描述的免疫细胞的共刺激信号的激动剂中的一种或多种和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂中的一种或多种(例如，抗CTLA-4抗体、ICOS-L、抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体)联合给予对象。
5.7生物学测定
体外病毒测定
病毒测定包括使用本领域众所周知的方法，在培养的细胞中，在体外测量改变的病毒复制(如例如通过空斑形成确定的)或病毒蛋白的产生(如例如通过蛋白质印迹分析确定的)或病毒RNA(如例如通过RT-PCR或RNA印迹分析确定的)的那些。
本文描述的NDV的生长可以通过本领域已知的或本文描述的任何方法(例如，在细胞培养物(例如，鸡胚肾细胞的培养物或鸡胚成纤维细胞(CEF)的培养物中)来评价。病毒滴度可以通过将系列稀释的本文描述的NDV接种到细胞培养物(例如，CEF、MDCK、EFK-2细胞、Vero细胞、原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、H292人上皮细胞系或HeLa细胞)、鸡胚或活体动物(例如，禽类)来测定。在病毒孵育规定时间之后，用标准方法分离病毒。使用应用于病毒上清液的PCR(Quinn&Trevor,1997；Morgan等人,1990)、血细胞凝集试验、组织培养物感染剂量(TCID50)或卵感染剂量(EID50)进行病毒滴度的物理定量。下文在第6节和第7节中描述了评价病毒滴度的一个示例性方法。
将编码异源肽或蛋白质(例如，细胞因子、突变的F蛋白、突变的V蛋白或miRNA靶位点)的核苷酸序列掺入到本文描述的嵌合的NDV的基因组中可以通过本领域已知的或本文描述的任何方法(例如，在细胞培养物、动物模型或在含胚卵中的病毒培养物中)进行评价。例如，来自含胚卵的尿囊液的细胞培养物的病毒颗粒可以通过蔗糖缓冲(sucrosecushion)的离心进行纯化并且随后使用本领域众所周知的方法通过蛋白质印迹法(Western blotting)分析融合蛋白表达。
基于免疫荧光的方法也可以用于检测病毒并且评价病毒生长。这样的方法是本领域技术人员众所周知的，例如荧光显微镜术和流式细胞术(参见，第6节和第7节，参见下文)。
抗体测定
由本文描述的NDV产生的抗体可以用本领域技术人员众所周知的各种各样的方法(例如，ELISA、表面等离子共振显示(BIAcore)、蛋白质印迹(Western blot)、免疫荧光、免疫染色和/或微中和测定)进行表征。具体地说，可以测定由本文描述的嵌合的NDV产生的抗体与病毒的抗原或异源肽或蛋白质特异性结合的能力。这样的测定可以在溶液中(例如，Houghten,1992,Bio/Techniques 13:412 421)、在微珠上(Lam,1991,Nature 354:82 84)、在芯片上(Fodor,1993,Nature 364:555 556)、在细菌上(美国专利号5,223,409)、在孢子上(美国专利号5,571,698、5,403,484和5,223,409)、在质粒上(Cull等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865 1869)或在噬菌体上(Scott和Smith,1990,Science249:386 390；Cwirla等人,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378 6382；和Felici,1991,J.Mol.Biol.222:301 310)(这些参考文献中的每一个都以其整体并入本文作为参考)进行。
可以测定已经鉴定与病毒的抗原或异源肽或蛋白质特异性结合的由本文描述的嵌合的NDV产生的抗体对所述的病毒抗原或异源肽或蛋白质的特异性。该抗体与病毒抗原或异源肽或蛋白质的特异性结合和与其它抗原的交叉反应性可以通过本领域已知的任何方法来测定。可以用于分析特异性结合和交叉反应性的免疫测定法包括但不限于竞争性和非竞争性测定系统，使用技术例如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治(sandwich)”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射度量测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定，这里仅列举了少数例子。这样的测定都是常规的并且本领域众所周知(参见例如，Ausubel等人(编著),1994,Current Protocols in Molecular Biology,第1卷,John Wiley&Sons,Inc.,New York，所述文献以其整体并入本文作为参考)。
抗体与抗原的结合亲和力及抗体-抗原相互作用的解离速率(off-rate)可以通过竞争性结合测定来确定。可选地，可以用表面等离子共振测定(例如，BIAcore动力学分析)或KinExA测定(Blake等人,Analytical Biochem.,1999,272:123-134)来确定抗体对本文描述的嵌合的NDV的抗原的结合速率和解离速率。
IFN测定
IFN由本文描述的NDV诱导和释放可以用本领域技术人员已知的或本文描述的技术来测定。例如，在用本文描述的NDV感染后，在细胞中被诱导的IFN量可以用免疫测定(例如，ELISA或蛋白质印迹测定)来确定，以测量IFN表达或测量其表达由IFN诱导的蛋白质的表达。可选地，所诱导的IFN量可以在RNA水平通过本领域技术人员已知的测定法(例如，RNA印迹(Northern blots)和定量RT-PCR)来测量。在多个具体的实施方案中，所释放的IFN量可以用ELISPOT测定法(参见例如，在第6节和第7节中描述的方法，参见下文)。此外，细胞因子的诱导和释放可以通过例如免疫测定或ELISPOT测定在蛋白质水平上和/或定量RT-PCR或RNA印迹(Northern blots)在RNA水平上来测定。参见，下文在第6节和/或第7节中关于用于测量细胞因子诱导和释放的测定。
激活标志物测定
用于评价由免疫细胞表达激活标志物、共刺激分子、配体或抑制分子的技术是本领域技术人员已知的。例如，由免疫细胞(例如，T淋巴细胞或NK细胞)表达激活标志物、共刺激分子、配体或抑制分子可以通过流式细胞术来评价。在一个具体的实施方案中，下文在第6节和/或第7节中描述的技术用于评价由免疫细胞表达激活标志物、共刺激分子、配体或抑制分子。
免疫细胞浸润测定
用于评价免疫细胞浸润的技术是本领域技术人员已知的。在一个具体的实施方案中，下文在第6节和/或第7节中描述的技术用于评价免疫细胞浸润。
毒性研究
在有些实施方案中，本文描述的NDV或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法在哺乳动物(优选人)细胞系中测试了细胞毒性(参见例如，第6节和/或第7节中描述的细胞毒性测定，参见下文)。在某些实施方案中，细胞毒性在细胞系的以下非限制性实例中的一种或多种中进行评价：U937，一种人单核细胞细胞系；原代外周血单核细胞(PBMC)；Huh7，一种人肝胚细胞瘤细胞系；HL60细胞、HT1080、HEK 293T和293H、MLPC细胞，一种人胚肾细胞系；人黑色素瘤细胞系，例如SkMel2、SkMel-119和SkMel-197；THP-1，单核细胞系；HeLa细胞系；和神经母细胞瘤细胞系，例如MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y和BE(2)-C。在某些实施方案中，细胞毒性在各种癌细胞中进行评价。在有些实施方案中，用ToxLite测定来评价细胞毒性。
可以用本领域众所周知的许多测定来评价在用本文描述的NDV或其组合物感染或用本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法治疗后细胞或细胞系的活力，并因此确定所述NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或联合疗法的细胞毒性。例如，细胞增殖可以通过如下方法测定：通过测量溴脱氧尿苷(BrdU)掺入、(3H)胸苷掺入，通过直接细胞计数，或通过检测已知基因例如原癌基因(例如，fos,myc)的转录、翻译或活性或细胞周期标记(Rb、cdc2、cyclin A、D1、D2、D3、E等)中的变化。这样的蛋白质和mRNA及活性的水平可以用本领域众所周知的任何方法来确定。例如，蛋白质可以通过已知的免疫诊断方法来定量，例如ELISA、蛋白质印迹法(Western blotting)或免疫沉淀，使用抗体，包括商业上可获得的抗体。mRNA可以用本领域众所周知的和常规的方法来定量，例如，用RNA分析、RNase保护或聚合酶链式反应与反转录结合。细胞活力可以通过使用台盼蓝染色(trypan-blue staining)或本领域已知的其它细胞死亡或活力标记来评价。在一个具体的实施方案中，测量细胞ATP的水平来确定细胞活力。在优选的实施方案中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或联合疗法杀死癌细胞，但不杀死健康(即，非癌性)细胞。在一个实施方案中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或联合疗法优先杀死癌细胞，但不杀死健康(即，非癌性)细胞。
在多个具体的实施方案中，细胞活力在三天和七天周期内用本领域的标准测定方法(例如，CellTiter-Glo测定试剂盒(Promega)，该试剂盒测量细胞内ATP水平)来测量。细胞ATP的降低预示着细胞毒性效应。在另一个具体的实施方案中，细胞活力可以在中性红摄入测定中进行测量。在其它的实施方案中，用于形态学变化的肉眼观察结果可以包括增大、颗粒性、具有粗糙边缘的细胞、膜性外观、变圆、从孔的表面脱落或其它变化。
可以在动物模型(参见例如，第6节和/或第7节中描述的动物模型，参见下文)中，测试本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或联合疗法的体内毒性。例如，本文描述的和/或本领域其它已知的可用于测试化合物对癌症的影响的动物模型，也可以用于确定本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或联合疗法的体内毒性。例如，给予动物一定范围的pfu的本文描述的NDV(例如，第5.2节中描述的嵌合的NDV，参见下文)。随后，监测动物随时间的致死率、体重减轻或体重不增加和/或血清标记的水平，所述血清标记可以指示组织损伤(例如，肌酸磷酸激酶水平，作为一般性组织损伤的指标；谷氨酸草酸转氨酶或丙酮酸转氨酶水平，作为可能的肝脏损伤的指标)。这些体内测定也可以改变以适应测试除剂量以外的各种不同的给药方式和/或方案的毒性。
本文描述的NDV或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法的毒性和/或功效可以通过细胞培养物或实验性动物中的标准药学程序来确定，例如，确定LD50(使群体50％致死的剂量)和ED50(在群体50％中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果间的剂量比是治疗指数，其可以表示为比值LD50/ED50。表现出大治疗指数的疗法是优选的。尽管可以使用表现出毒性副作用的疗法，但是应当小心设计递药系统使得这样的疗法靶向受累组织的部位以便对非癌性细胞的潜在损害最小化，从而降低副作用。
从细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可以用于制定疗法用于对象的剂量的范围。该药剂的剂量优选在循环浓度的范围内，循环浓度包括具有非常小或没有毒性的ED50。剂量可以在这个范围内变化，这取决于所采用的剂型和所使用的给药途径。对于本文描述的任何疗法，治疗有效剂量可以最初从细胞培养物测定来估算。剂量可以在动物模型中制定以达到循环血浆浓度范围，包括IC50(即，嵌合的NDV达到最大抑制症状一半时的浓度)，正如在细胞培养物中所确定的。这样的信息可以用于更精确地确定对象中的有用剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱法来测量。
抗癌研究
使用针对癌症的动物模型，可以测试本文描述的NDV或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法的生物学活性。这样的动物模型系统包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔等。在一个具体的实施方案中，本文描述的NDV或联合疗法的抗癌活性可以在小鼠模型系统中进行测试。这样的模型系统被广泛使用并且为技术人员所熟知，例如SCID小鼠模型或转基因小鼠。
本文描述的NDV或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗或本文描述的联合疗法的抗癌活性可以通过如下方法来确定：将所述NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或联合疗法给予动物模型，并且验证所述NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或联合疗法在所述动物模型中在降低癌症的严重程度、降低癌症的症状、降低癌症转移和/或降低肿瘤尺寸方面是有效的(参见例如，第6节和/或第7节，参见下文)。用于癌症的动物模型的实例一般包括但不限于陪伴动物的自发发生的肿瘤(参见例如，Vail和MacEwen,2000,Cancer Invest18(8):781-92)。用于肺癌的动物模型的实例包括但不限于由Zhang&Roth(1994,In-vivo 8(5):755-69)所描述的肺癌动物模型和具有破坏的p53功能的转基因小鼠模型(参见例如，Morris等人,1998,J La State Med Soc 150(4):179-85)。用于乳腺癌的动物模型的一个实例包括但不限于过度表达细胞周期蛋白D1的转基因小鼠(参见例如，Hosokawa等人,2001,Transgenic Res10(5):471-8)。用于结肠癌的动物模型的一个实例包括但不限于TCR b和p53双敲除小鼠(参见例如，Kado等人,2001,Cancer Res.61(6):2395-8)。用于胰腺癌的动物模型的实例包括但不限于PancO2鼠胰腺腺癌的转移性模型(参见例如，Wang等人,2001,Int.J.Pancreatol.29(1):37-46)和皮下胰腺肿瘤中产生的nu-nu小鼠(参见例如，Ghaneh等人,2001,Gene Ther.8(3):199-208)。用于非霍奇金淋巴瘤的动物模型的实例包括但不限于严重联合免疫缺陷("SCID")小鼠(参见例如，Bryant等人,2000,Lab Invest 80(4):553-73)和IgHmu-HOX11转基因小鼠(参见例如，Hough等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(23):13853-8)。用于食管癌的动物模型的一个实例包括但不限于针对人乳头瘤病毒16型E7致癌基因转基因的小鼠(参见例如，Herber等人,1996,J.Virol.70(3):1873-81)。用于结肠直肠癌的动物模型的实例包括但不限于Apc小鼠模型(参见例如，Fodde&Smits,2001,Trends Mol Med 7(8):36973和Kuraguchi等人,2000)。在一个具体的实施方案中，用下文在第6节和/或第7节中描述的用于癌症的动物模型来评价NDV或其组合物、肿瘤裂解物、全细胞疫苗或联合疗法的功效。
6.实施例1
本实施例证明了NDV疗法与免疫刺激性的免疫关卡调节剂(checkpointmodulators)组合在癌症治疗中的治疗功效。
6.1材料与方法
小鼠
BALB/c小鼠(6-8周龄)和WT C57BL/6小鼠购自美国杰克逊实验室(JacksonLaboratory)。所有小鼠都维持在微型隔离笼中并且根据美国国家卫生研究院和美国实验室动物管理规则协会(the NIH and American Association of Laboratory Animal Careregulations)来处理。用于本研究的所有小鼠程序和实验都由纪念斯隆-凯特琳癌症中心实验动物管理与使用委员会(the Memorial Sloan-Kettering Cancer CenterInstitutional Animal Care and Use Committee)批准。
细胞系
将黑色素瘤(B16-F10)和结肠癌(CT26和MC38)的鼠癌细胞系维持在补充10％胎牛血清和青霉素加上链霉素的RPMI培养基中。将鼠前列腺癌细胞系TRAMP-C2维持在补充5％胎牛血清(FCS；Mediatech,Inc.)、5％Nu血清IV(BD Biosciences)HEPES、2-ME、青霉素/链霉素、L-glut、5μg/mL胰岛素(Sigma)和10nmol/L DHT(Sigma)的DMEM培养基中。
抗体
治疗性抗CTLA-4(克隆9H10)、抗PD-1(克隆RMP1-14)和抗PD-L1单克隆抗体由BioXcell公司生产。用于流式细胞术的抗体购自eBioscience公司、Biolegend公司、Invitrogen公司和BD Pharmingen公司。
病毒和克隆化
重组缓发型NDV LaSota毒株用于所有实验。为了产生表达鼠ICOSL的NDV病毒，将编码侧翼为适宜NDV-特异性RNA转录信号的鼠ICOSL的DNA片段插入到在pT7NDV/LS的P基因和M基因之间产生的SacII位点。使用先前描述的方法由cDNA拯救病毒并且对于插入保真度通过反转录PCR进行测序。通过系列稀释和免疫荧光在Vero细胞中测定病毒滴度。重组ICOSL-F融合构建体通过PCR扩增编码具有侧翼EcoRI和MluI限制位点的胞外结构域(氨基酸1-277)的ICOSL DNA及编码具有侧翼MluI和XhoI限制位点的F跨膜结构域和胞内结构域(氨基酸501-554)的NDV FDNA来产生。所获得的DNA片段使用三部分(3-part)连接法在pCAGGS载体中组装。
体外感染实验
为了评价表面MHC-I、MHC-II和ICAM-1由NDV上调并且为了评价来自NDV-ICOSL病毒的ICOSL转基因的表面表达，在6孔培养皿中以MOI 2一式三份地感染B16-F10细胞。24小时后，通过机械刮擦法收获细胞并且针对表面标记进行处理及通过流式细胞术定量。对于病毒生长曲线实验，将B16-F10细胞与病毒一起在6孔培养皿中以指定的MOIs在100μl的总体积中在室温下孵育。在孵育后1小时，吸出感染培养基并且将细胞在1ml的DMEM(含10％鸡胚尿囊液)中于37℃孵育。在24、48和72小时后，收集上清液，如上所述测定病毒滴度。对于体外细胞毒性实验，以类似的方式进行感染。在感染后24、48、72和96小时时，细胞用1％TritonX-100于37℃洗涤并孵育30分钟。使用Promega CytoTox 96测定试剂盒，按照生产商的说明，测定裂解物中的LDH活性。
肿瘤攻击存活实验.
建立双侧胁腹肿瘤模型以监测在注射肿瘤和系统性肿瘤二者中的治疗功效。针对各肿瘤模型建立治疗时间表和细胞剂量以通过NDV或抗CTLA-4/抗PD-1作为单药剂达到了10-20％肿瘤清除率。对于评价野生型NDV(NDV-WT)与免疫关卡阻断的联合疗法的实验，通过在第0天在右胁腹真皮内(i.d.)注射2x105个B16F10细胞并且在第4天在左胁腹真皮内(i.d.)注射5x 104个细胞来植入B16F10肿瘤。在第7、10、13和16天，小鼠用4次肿瘤内注射在PBS中的2x 107pfu的NDV进行治疗，总体积为100μl。同时地，在第7、10、13和16天，小鼠接受4次腹膜内(i.p.)注射抗CTLA-4抗体(100μg)或抗PD-1抗体(250μg)。对照组接受相应剂量的同种型抗体(i.p.)和肿瘤内注射的PBS。通用测径器测量来监测随时间的肿瘤尺寸和发病率。
对于TRAMP-C2模型，在第0天在右胁腹植入5x 105个细胞并且在第8天在左胁腹植入5x 105个细胞。以与上述类似的方式在第11、14、17和20天进行治疗。
对于评价表达ICOSL(NDV-ICOSL)的重组NDV的实验，在第0天在右胁腹真皮内(i.d.)注射2x 105个B16F10并且在第4天在左胁腹注射1x 105个细胞来植入B16F10肿瘤。如上所述进行治疗。
对于CT26模型，在第0天在右胁腹真皮内(i.d.)注射1x 106个CT26细胞并且在第2天在左胁腹注射1x106个细胞来植入肿瘤。在第6、9和12天，如上所述进行治疗。
肿瘤浸润淋巴细胞的分离
通过在第0天在右胁腹真皮内(i.d.)注射2x 105个B16F10细胞并且在第4天在左胁腹注射2x 105个细胞来植入B16F10肿瘤。在第7、10和13天，小鼠用3次肿瘤内注射2x107pfu的NDV和100μg的i.p.抗CTLA-4抗体或250μg的i.p.抗PD-1抗体进行治疗，如有规定。在第15天，小鼠通过CO2吸入被处死。用手术钳和手术剪摘取肿瘤和排肿瘤的淋巴结并且称重。在与1.67Wünsch U/mL释放酶(Liberase)和0.2mg/mL DNA酶(DNase)于37℃孵育30分钟之前，将来自各组的肿瘤用剪刀剪碎。通过反复吹打使肿瘤匀化并通过70-μm尼龙滤器过滤。细胞悬液用完全RPMI洗涤一次并且在Ficoll梯度上纯化以消除死细胞。将淋巴结通过70-μm尼龙滤器磨碎，从排肿瘤的淋巴结中分离出细胞。
流式细胞术
将从肿瘤或排肿瘤的淋巴结分离的细胞加工处理用于用若干抗体群组(panels)进行CD45、CD3、CD4、CD8、CD44、PD-1、ICOS、CD11c、CD19、NK1.1、CD11b、F4/80、Ly6C和Ly6G的表面标记染色。可固定活力染料eFluor506(eBioscience)用于辨别活细胞。使用FoxP3固定和透化试剂盒(eBioscience)对细胞进一步透化处理并且针对Ki-67、FoxP3、颗粒酶B、CTLA-4和IFNγ染色。数据使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)获取并且使用FlowJo软件(Treestar)进行分析。
DC纯化和加载
从首次用于实验的
Figure BDA0002386487570000701
小鼠分离出脾脏并且用1.67Wünsch U/mL释放酶(Liberase)和0.2mg/mL DNA酶(DNase)于37℃消化30分钟。所获得的细胞悬液通过70um尼龙滤器过滤并用完全RPMI洗涤一次。使用Miltenyi磁珠通过正向选择纯化CD11c+树突细胞。所分离的树突细胞用重组GM-CSF培养过夜并将B16-F10肿瘤裂解物在Ficoll梯度上纯化。
细胞因子产生的分析
将来自肿瘤或排肿瘤的淋巴结的细胞悬液合并并且使用Miltenyi T-细胞纯化试剂盒富集T细胞。对所分离的T细胞计数并且与加载了B16-F10肿瘤细胞裂解物的树突细胞一起在20U/ml IL-2(R和D)加上布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(BD Bioscience)存在下共培养8小时。再刺激后，将淋巴细胞加工用于如上的流式细胞术。
统计学
数据通过双尾斯图登氏t检验(2-tailed Student’s t test)进行分析，并且P<0.05被认为有统计学显著性。
6.2结果
为了表征由新城疫病毒(NDV)感染诱导的抗肿瘤免疫应答，评价了MHC I和MHC II分子以及ICAM-1在体外感染的细胞表面上的表达。如图1所示，B16黑色素瘤细胞中的NDV感染诱导I类和II类MHC分子以及粘附分子ICAM-1的上调，所有分子被认为是对肿瘤特异性淋巴细胞的募集和抗肿瘤免疫应答的活化是重要的。接下来，在鼠黑色素瘤模型和已建立的允许监测注射病毒的肿瘤以及不接受病毒的远处肿瘤二者中的2-胁腹模型中评价了由NDV感染在体内诱导的抗肿瘤免疫应答。如图2所示，病毒感染的肿瘤显示被免疫细胞(例如，NK细胞、巨噬细胞和CD8和CD4细胞)但不是调节T细胞剧烈浸润。由于该免疫应答的一部分对病毒而不是对肿瘤应答，评价了关于对侧肿瘤的免疫应答(图3)。有趣的是，这些肿瘤证明CD8和CD4效应子而不是T reg浸润物的类似程度的增加。这些细胞的分析揭示出它们上调激活、增殖和裂解标志物(图4)。NDV单一疗法在控制治疗的肿瘤中是有效的(图5A)，但是仅仅使对侧肿瘤的生长呈现边缘减慢(图5B)。然而，清除肿瘤的小鼠证明对进一步肿瘤攻击有一定程度的保护作用(图5D)，提示NDV疗法能诱导持续免疫力。
接下来，评价了是否可以靶向另外的机制以增强由NDV产生的抗肿瘤效应。来自注射NDV的和未注射肿瘤二者的肿瘤浸润淋巴细胞的表征揭示出在淋巴细胞上抑制受体CTLA-4的上调(图6)。然后，评价了CTLA-4受体的抑制是否可以导致NDV的更好治疗功效。引人注目的是，在多数动物中，联合疗法导致双侧肿瘤中的排斥反应，这是一种用任一种治疗见不到的效应(图7)。这种效应甚至当使用对病毒感染不敏感的前列腺腺癌TRAMP模型时也存在(图8)，提示最小限度的病毒复制并且所获得的炎症反应足以产生保护性抗肿瘤免疫力。
为了确定靶向其它免疫关卡与NDV疗法的组合是否可以是有益的，评价了在NDV感染后对PD-1-PD-L1途径的影响。如图9所示，NDV感染的肿瘤细胞在体外和体内均上调了细胞表面上抑制性PD-L1配体的表达。这种效应并不刚好是直接病毒感染的结果，但当未感染细胞用UV-失活的来自病毒感染的细胞的上清液(图9B)治疗时或在对侧未感染肿瘤(图9C)中也能见到。这促使人们测试用NDV和抗PD-1抗体的联合疗法。与CTLA-4阻断类似，NDV疗法与抗PD-1的组合在侵袭性B16黑色素瘤模型中导致多数动物治愈，这是一种与用活化效应子淋巴细胞使肿瘤浸润增加的效应(图10)。
在所进行的整个研究中，当使用较大肿瘤攻击时，联合疗法的治疗功效降低。接下来，评价了可预测更好应答并且可靶向治疗功效进一步改善的激活标志物。从肿瘤和排肿瘤的淋巴结分离的淋巴细胞的分析鉴定出在治疗动物中上调了作为激活标志物之一的共刺激分子ICOS(图11)。先前已表明ICOS上调与更持久的治疗反应和在用抗CTLA-4疗法对恶性黑色素瘤治疗的患者中存活增加相关。评价了ICOS配体(ICOSL)的肿瘤内表达是否能够进一步加强联合疗法的治疗反应。采用NDV的反向遗传学系统，产生了表达鼠ICOSL的NDV(NDV-ICOSL)。该病毒的体外表征揭示出它与亲代NDV毒株具有相似的复制和裂解特性(图12)。然而，当用较大的B16肿瘤攻击在体内测试时，NDV-ICOSL证明当与CTLA-4阻断联合使用时具有优于亲代NDV病毒的明显优点，经治疗的动物多数长期存活(图13)。这种效应并不局限于B16黑色素瘤并且在Balb/C小鼠品系中被证明针对CT26结肠癌，提示这种治疗策略能够转移到不同的肿瘤类型(图14)。对来自治疗动物的B16肿瘤的分析证明被不同的免疫细胞亚型显著浸润，其中上调激活标志物(图15和图16)。这些淋巴细胞是肿瘤特异性的并且证明在对用荷载肿瘤裂解物的树突细胞刺激应答时有IFNγ的分泌(图17)。最后，其B16或CT26肿瘤被治愈的动物用肿瘤细胞再攻击并且证明针对肿瘤再攻击有完全保护作用(图18)。
为了进一步改善ICOSL在肿瘤中的表达并且将配体掺入到病毒体中，产生了由ICOSL的胞外结构域(氨基酸1-277)和NDV F蛋白的跨膜结构域和胞内结构域(氨基酸501-554)组成的嵌合蛋白(图19A)。将所获得的构建体转染到B16-F10细胞中导致当与转染的天然ICOSL相比时，转染细胞表面上嵌合ICOSL-F配体的表达增加，提示控制NDV F蛋白向表面转运的调节机制可用于增加免疫刺激配体的表面表达(图19B)。
总的来说，这些研究证明：1)NDV与免疫关卡调节抗体的组合能够用作一种策略以规避溶瘤病毒疗法和抗体疗法的限制；和2)免疫刺激配体由NDV表达能够进一步提高病毒的治疗功效，尤其是当与免疫调节抗体联合使用时。这些发现具有临床实用性。
7.实施例2
本实施例证明了由溶瘤NDV诱导的抗肿瘤免疫应答和由NDV与CTLA-4阻断组合诱导的抗肿瘤应答。
7.1材料与方法
小鼠
C57BL/6J和Balb/C小鼠购自美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory)。C57BL/6J背景上的IFNAR-/-小鼠是Eric Pamer博士的馈赠礼物。Pmel-1和Trp-1 TCR转基因小鼠已有报道(Overwijk等人,2003,J.Exp.Med,198:568,Muransky等人,2008,Blood 112:362)并且由N.Restifo(National Cancer Institute,Bethesda,MD)提供。Trp1小鼠与由在安德森癌症中心(MDAnderson Cancer Center)(Houston,TX)的Patrick Hwu提供的CD2:萤光素酶小鼠杂交以产生Trp1萤光素酶+(Trp1-Fluc)小鼠。所有小鼠都维持在微型隔离笼中并且根据美国国家卫生研究院和美国实验室动物管理规则协会(the NIH and AmericanAssociation of Laboratory Animal Care regulations)来处理。用于本研究的所有小鼠程序和实验都由纪念斯隆-凯特琳癌症中心实验动物管理与使用委员会(the MemorialSloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee)批准。
细胞系
将黑色素瘤(B16-F10)和结肠癌(CT26和MC38)的鼠癌细胞系维持在补充10％胎牛血清和青霉素+链霉素的RPMI培养基中。将鼠前列腺癌细胞系TRAMP-C2维持在补充5％胎牛血清(FCS；Mediatech,Inc.)、5％Nu血清IV(BD Biosciences)HEPES、2-ME、青霉素链霉素、L-glut、5μg/mL胰岛素(Sigma)和10nmol/L DHT(Sigma)的DMEM培养基中。
抗体
治疗性抗CTLA-4(克隆9H10)、抗PD-1(克隆RMP1-14)、抗PD-L1(克隆9G2)、抗CD8(克隆2.43)、抗CD4(克隆GK1.5)、抗IFN-γ(克隆XMG1.2)和抗NK1.1(克隆PK136)单克隆抗体由BioXcell公司生产。用于流式细胞术的抗体购自eBioscience公司、Biolegend公司、Invitrogen公司和BD Pharmingen公司。
病毒和克隆化
重组缓发型NDV LaSota毒株用于所有实验。为了产生表达鼠ICOSL的NDV病毒，将编码侧翼为适宜NDV-特异性RNA转录信号的鼠ICOSL的DNA片段插入到在pT7NDV/LS的P基因和M基因之间产生的SacII位点。使用先前描述的方法由cDNA拯救病毒并且对于插入保真度通过反转录PCR进行测序。通过系列稀释和免疫荧光在Vero细胞中测定病毒滴度。重组ICOSL-F融合构建体通过PCR扩增编码具有侧翼EcoRI和MluI限制位点的胞外结构域(氨基酸1-277)的ICOSL DNA及编码具有侧翼MluI和XhoI限制位点的F跨膜结构域和胞内结构域(氨基酸类501-554)的NDV F DNA来产生。所获得的DNA片段使用三部分(3-part)连接法在pCAGGS载体中组装。重组抗小鼠CD28scfv-F融合构建体通过PCR扩增编码具有侧翼EcoRI和MluI限制位点的仓鼠抗CD28scfv的cDNA及编码具有侧翼MluI和XhoI限制位点的F跨膜结构域和胞内结构域(氨基酸501-554)的NDV F DNA来产生。所获得的DNA片段使用三部分连接法在pCAGGS载体中组装并且亚克隆到介于P基因和M基因之间的pNDV载体中。为了产生表达其它嵌合蛋白(HN-GITRL,HN-4-1BBL,HN-CD40L,HN-OX40L)的重组病毒，将编码各基因的胞外结构域(图44)的cDNA用具有侧翼EcoRI和MluI限制位点的基因特异性引物进行扩增，并且HN蛋白的跨膜结构域和胞内结构域用具有侧翼MluI和XhoI限制位点的特异性引物进行扩增。完全嵌合基因使用三部分连接法在pCAGGS载体中组装且然后亚克隆到介于P基因和M基因之间的NDV载体中。各嵌合构建体的细节在图44中得到证明。为了产生编码鼠IL-2、IL-15和IL-21的重组NDV，用于各基因的cDNA用具有侧翼SacII限制位点的基因特异性引物进行扩增且然后克隆到介于P基因和M基因之间的pNDV中。使用先前描述的方法由cDNA拯救病毒并且对于插入保真度通过反转录PCR进行测序。通过系列稀释和免疫荧光在Vero细胞中测定病毒滴度。
体外感染实验
对于细胞表面标记，在6孔培养皿中以MOI 2(B16-F10)或MOI 5(TRAMP C2)一式三份地感染细胞。24小时后，通过刮擦法收获细胞并且针对表面标记进行处理及通过流式细胞术定量。对于体外细胞毒性实验，以指定的MOI’s感染细胞并且在无血清培养基中在250ng/ml TPCK胰蛋白酶存在下于37℃孵育。在感染后24、48、72和96小时，细胞用1％Triton X-100于37℃洗涤并孵育30分钟。使用Promega CytoTox 96测定试剂盒，按照生产商的说明，测定裂解物中的LDH活性。
肿瘤攻击存活实验
建立双侧胁腹肿瘤模型以监测在注射肿瘤和系统性肿瘤中的治疗功效。针对各肿瘤模型建立治疗时间表和细胞剂量以通过NDV或抗CTLA-4作为单药剂达到10-20％肿瘤清除率。对于评价NDV与抗CTLA-4抗体的联合疗法的实验，通过在第0天在右胁腹真皮内(i.d.)注射2x105个B16-F10F10细胞并且在第4天在左胁腹真皮内(i.d.)注射5x104个细胞来植入B16-F10肿瘤。在第7、9、11和13天，小鼠用肿瘤内注射在PBS中的2x107 pfu的NDV进行治疗，总体积为100μl。同时地，在第7、9、11和13天，小鼠接受腹膜内(i.p.)注射抗CTLA-4抗体(100μg)、抗PD-1抗体(250μg)或抗PD-L1抗体(250μg)。对照组接受相应剂量的同种型(isotype)抗体(i.p.)及肿瘤内注射PBS。当出现痛苦体征或当总肿瘤体积达到1000mm3时将动物实施安乐死。对于免疫细胞的耗竭，在肿瘤攻击之前一天和之后两天，给小鼠注射(i.p.)500μg的抗CD8+、CD4+、NK1.1或IFNγ的单克隆抗体，然后在整个实验中每5天注射250μg。对于TRAMP-C2模型，在第0天在右胁腹植入1x106个细胞并且在第4天在左胁腹植入5x105个细胞。在第7、10、13和16天，按与上述类似的方式进行治疗。对于CT26模型，在第0天在右胁腹真皮内(i.d.)注射1x106个CT26细胞并且在第2天在左胁腹真皮内(i.d.)注射1x106个细胞来植入肿瘤。在第6、9和12天，如上所述进行治疗。对于评价表达ICOSL、4-1BBL、OX40L、CD40L、GITRL、抗CD28scfv、IL-2、IL-15和IL-21的重组NDV(NDV-转基因)的实验，在第0天在右胁腹真皮内(i.d.)注射2x105个B16F10细胞并且在第4天在左胁腹真皮内(i.d.)注射1x105个细胞来植入B16F10肿瘤。在第7、9、11和13天，小鼠用肿瘤内注射在PBS中的2x107 pfu的NDV进行治疗，总体积为100μl。同时地，在第7、9、11和13天，小鼠接受腹膜内(i.p.)注射抗CTLA-4抗体(100μg)、抗PD-1抗体(250μg)或抗PD-L1抗体(250μg)。
Trp1和Pmel淋巴细胞的分离与过继转移
从转基因小鼠分离出脾脏和淋巴结并通过70-um尼龙滤器磨碎。使用Miltenyi磁珠通过正向选择纯化CD4+和CD8+细胞。
将所分离的Trp1或Pmel细胞在指定的时间表分别按2.5x104个细胞/小鼠和1x106个细胞/小鼠经尾静脉注射到接受动物体内。
血清转移实验
各组的荷瘤小鼠用肿瘤内单次注射NDV或PBS进行治疗。在第4天，经由肢端放血收集血液，再通过离心分离出血清。将来自各组的血清合并，在Stratalinker 1800中用300mJ/cm2紫外线的六次脉冲进行UV-处理以使可潜在存在的任何病毒失活。将未经稀释的100μl血清注射到首次用于实验的B16-F10荷瘤小鼠的肿瘤内，每隔一天注射，总共3次。在最后一次注射后3天取出肿瘤，如下所述加工分离肿瘤浸润淋巴细胞。
生物发光成像
在第6天开始，每2-3天对小鼠成像。给小鼠眶后注射在PBS中的50μl40mg/ml D-萤光素(Caliper Life Sciences)并且立即使用IVIS成像系统(Caliper Life Sciences)进行成像。采用活体图像第4.0版本(Living Image,version 4.0(Caliper Life Sciences))软件覆盖使灰度摄影图像和生物发光彩色图像叠加。在肿瘤上手工选择出目标区域(region of interest,ROI)并且使ROI的面积保持恒定。
肿瘤浸润淋巴细胞的分离
通过在第0天在右胁腹注射2x105个B16-F10细胞并且在第4天在左胁腹注射2x105个细胞来植入B16-F10肿瘤。在第7、9和11天，小鼠用肿瘤内注射2x107 pfu的NDV和腹膜内(i.p.)注射抗CTLA-4或抗PD-1抗体进行治疗，如有规定。罕见死于肿瘤负担的动物(总是在未治疗的对照组中)和完全清除肿瘤的动物(总是在治疗组中)不用于分析。在第15天，将小鼠处死，用手术钳和手术剪摘取肿瘤和排肿瘤的淋巴结并且称重。在与1.67Wünsch U/mL释放酶(Liberase)和0.2mg/mL DNA酶(DNase)于37℃孵育30分钟之前，将来自各组的肿瘤用剪刀剪碎。通过反复吹打使肿瘤匀化并通过70-μm尼龙滤器过滤。细胞悬液用完全RPMI洗涤一次并且在Ficoll梯度上纯化以消除死细胞。将淋巴结通过70-μm尼龙滤器磨碎，从排肿瘤的淋巴结中分离出细胞。
流式细胞术
将从肿瘤或排肿瘤的淋巴结分离的细胞加工处理用于用若干抗体群组进行CD45、CD3、CD4、CD8、CD44、ICOS、CD11c、CD19、NK1.1、CD11b、F4/80、Ly6C和Ly6G的表面标记染色。可固定活力染料eFluor506(eBioscience)用于辨别活细胞。使用FoxP3固定和透化试剂盒(eBioscience)对细胞进一步透化处理并且针对Ki-67、FoxP3、颗粒酶B、CTLA-4和IFNγ染色。数据使用LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)获取并且使用FlowJo软件(Treestar)进行分析。
DC纯化和加载
从首次用于实验的
Figure BDA0002386487570000761
小鼠分离出脾脏并且用1.67Wünsch U/mL释放酶(Liberase)和0.2mg/mL DNA酶(DNase)于37℃消化30分钟。所获得的细胞悬液通过70um尼龙滤器过滤并用完全RPMI洗涤一次。使用Miltenyi磁珠通过正向选择纯化CD11c+DC’s。所分离的DC’s用重组GM-CSF培养过夜并将B16-F10肿瘤裂解物在Ficoll梯度上纯化。
细胞因子产生的分析
将来自肿瘤或排肿瘤的淋巴结的细胞悬液合并并且使用Miltenyi T-细胞纯化试剂盒富集T细胞。对所分离的T细胞计数并且与加载了B16-F10肿瘤细胞裂解物的DC’s一起在20U/ml IL-2(R和D)加上布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(BD Bioscience)存在下共培养8小时。再刺激后，将淋巴细胞加工用于如上的流式细胞术。
免疫荧光和显微镜术
肿瘤自小鼠解剖，在PBS中洗涤，在4％低聚甲醛中固定，并且根据先前所述的方案加工用于石蜡包埋。切片用超薄切片机切割，固定在玻片上，并且加工用于用苏木精和伊红(H&E)或用抗CD3和抗FoxP3抗体染色。玻片在蔡司Axio 2宽视野显微镜(Zeiss Axio2wide-field microscope)(使用10x和20x物镜)进行分析。
统计学
在适当的地方，数据通过双尾斯图登氏t检验(2-tailed Student’s t test)(用于2个组的比较)和ANOVA进行分析。存活率的数据通过对数-秩(Log-Rank)(Mantel-Cox)检验进行分析。双侧p<0.05被认为有统计学显著性(P≤0.05(*)，P≤0.01(**)，P＜0.001(***)，P<0.0001(****))。
7.2结果
NDV复制局限于注射的肿瘤位点
病毒分布动力学用NDV的肿瘤内和系统性给药来表征。肿瘤内注射表达萤火虫萤光素酶报道子的重组NDV(NDV-Fluc)导致注射的胁腹肿瘤中的持续萤光素酶信号，而该病毒的系统性给药导致在肿瘤中的不可检测的萤光素酶信号(图20A)。由于限制的系统性病毒递送不太可能诱导足够的肿瘤溶解和免疫应答，因此探索肿瘤内NDV注射作为引发抗肿瘤免疫应答的手段，可潜在地克服系统性OV疗法的限制。因此，为了进一步研究，将已建模的转移性疾病使用双侧胁腹B16-F10肿瘤模型进行建模(图22A)。向右胁腹肿瘤内的NDV-Fluc给药导致病毒在注射的肿瘤内复制，其中萤光素酶信号可检测长达96小时(图20B-D)。通过发光成像(图20B-D)、通过在含胚卵中传代或RT-PCR，在对侧(左胁腹)肿瘤中未检测到病毒。因此，该系统允许在注射病毒的肿瘤和远处肿瘤中表征免疫应答，该免疫应答没有直接受NDV影响。
NDV疗法增加局部和远处肿瘤淋巴细胞浸润并延迟肿瘤生长
对注射病毒的肿瘤的分析揭示出炎症反应，如用表达白细胞共同抗原CD45的细胞浸润增加所证明(图21A-B)。免疫浸润物通过在先天性免疫隔室(包括髓系细胞、NK细胞和NKT细胞(图21C))和适应性隔室(包括CD8+和常规CD4+FoxP3-(Tconv)T细胞)中增加来表征，导致CD8和Tconv与调节(Treg)T细胞比值显著增加(p＝0.0131和p＝0.0006)(图21D-21F)。值得一提的是，对对侧肿瘤的分析揭示出炎症性浸润物的类似增加(图22B,C)，其特征为先天性免疫细胞(图22D)和效应子T细胞(图22E,G)二者的数目增加。更为重要的是，虽然Tregs的绝对数没有重大变化(图22G)，但是它们的相对百分比有实质性减小(图22E,F,H)，其中CD8和Tconv与Treg比值显著提高(分别是p＝0.002和p＝0.0021)(图22I)。从远处肿瘤分离的效应子T细胞表达激活、增殖和裂解标志物ICOS、Ki-67和颗粒酶B分别增加(图1J,K)。如前所述，病毒或病毒RNA不能够从远处肿瘤分离出来，提示在远处肿瘤微环境中所观察到的变化并不是由于直接病毒感染所致。为了进一步排除不可检测的局部病毒传播的可能性，在产生类似发现物的其它远处位点(例如，双侧后爪垫)植入肿瘤(图23)。
与所观察到的炎症效应相一致，NDV的肿瘤内给药不仅导致注射肿瘤的生长延迟，而且导致对侧肿瘤的生长延迟，结果是动物生存时间延长(图1L,M)。为了确定这种效应是否短暂并且持久抗肿瘤保护是否可能，单胁腹B16-F10荷瘤小鼠用NDV进行肿瘤内治疗并且长期幸存者用B16-F10细胞在相反胁腹进行注射。动物多数证明了肿瘤生长延迟，30％的动物完全地排斥再攻击的细胞，提示用NDV的肿瘤内疗法确实能诱导保护性抗肿瘤记忆应答(图25)。
NDV诱导肿瘤特异性淋巴细胞的肿瘤浸润和扩增
为了确定抗肿瘤免疫应答是否依赖于注射NDV的肿瘤类型或是由NDV感染产生的非特异性炎症的结果，用在相反胁腹植入的异源肿瘤(MC38结肠癌和B16-F10黑色素瘤)进行了实验(图24A)。为了跟踪肿瘤特异性淋巴细胞，将识别黑色素瘤分化抗原gp100(Pmel)和Trp1(Trp1)的T细胞受体转基因同基因型标记的CD8+(Pmel)细胞或萤光素酶-标记的CD4+(Trp1)细胞进行过继性转移(Muranski等人,2008,Blood,112:362；Overwijk等人,2003,JExp Med,198:569)。用生物发光成像来测量过继性转移的Trp1细胞的分布和扩增动力学。Trp1细胞向PBS治疗的荷瘤动物的转移不导致Trp1在肿瘤内累积，突出了在该模型中肿瘤微环境的高度免疫抑制性质(图24B-D)。将NDV注射到B16-F10肿瘤内导致注射的肿瘤内萤光素酶信号显著增加(图24B-D)，表明Trp1 T细胞扩增(曲线下面积(AUC)p＝0.0084)。值得一提的是，在对侧肿瘤中见到类似的扩增，尽管延迟(p＝0.0009)(图24B-D)。相反，将NDV注射到MC38肿瘤内不诱导相当多的Trp1浸润到注射的MC38肿瘤或远处B16-F10肿瘤(图24B-D)，提示远处肿瘤特异性淋巴细胞浸润很可能依赖于注射的肿瘤的抗原身份。类似地，NDV的肿瘤内注射导致在远处肿瘤中Pmel细胞浸润增加，当注射的肿瘤是B16-F10而不是MC38时会更明显(图24E)。
有趣的是，虽然具有过继性转移的淋巴细胞的远处B16-F10肿瘤的浸润依赖于注射的肿瘤身份，但是远处肿瘤的确证明增加的免疫浸润，甚至当初次注射的肿瘤是MC38时(图24F)，提示非特异性炎症反应组分也可能起作用。实际上，来自NDV治疗的动物的血清(其用UV辐射处理以使任何潜在病毒失活)当肿瘤内注射到首次用于实验的B16-F10荷瘤小鼠时诱导了肿瘤白细胞浸润(图24G,H)，其中多数增加在NK和CD8+隔室中见到(分别是p＝0.0089和p＝0.0443)(图24I)。
NDV和CTLA-4阻断协同作用以排斥局部和远处肿瘤
尽管著名的炎症反应和生长延迟在远处肿瘤中见到，但是具有长期存活的完全对侧肿瘤排斥仅在近似10％的动物中见到(图22M)，暗示在肿瘤微环境中有活性免疫抑制机制。注射NDV的肿瘤和远处肿瘤的表征揭示出在肿瘤浸润T细胞上CTLA-4的上调(图26)，提示NDV诱导的肿瘤炎症将使得肿瘤对用CTLA-4阻断的系统性疗法敏感。值得一提的是，NDV与抗CTLA-4抗体的联合疗法(图27A)导致在多数动物中双侧肿瘤的排斥和长期存活，这是仅用任一单种治疗未曾见到的效果(图27B-D)。为了确定所观察到的保护的持久性，在第90天，给幸存的动物在右胁腹注射B16-F10细胞而不给予任何进一步疗法。用NDV和抗CTLA-4联合疗法治疗的动物证明针对肿瘤再攻击有超出80％保护作用，相比较于用单药剂抗CTLA-4抗体治疗的动物仅有40％保护作用(图27E)。
用NDV和CTLA-4阻断的联合疗法对病毒非许可性肿瘤是有效的
为了确定这种治疗策略是否可以延伸到其它肿瘤类型，将该策略在不良免疫原性TRAMP C2前列腺腺癌模型中进行评价。与B16-F10模型类似，联合疗法引起注射的肿瘤消退(图27F)，并且延迟远处肿瘤的向外生长或者导致完全远处肿瘤消退伴有延长的长期存活(图27F,G)。有趣的是，鉴于B16-F10细胞对NDV介导的裂解在体外敏感，TRAMP C2细胞是强抗性的，在感染复数(MOI)高达10时仍然观察到低的细胞毒性(图27H)。在两种细胞系中，NDV感染在体外导致MHC和共刺激分子的表面上调(图27I-K)。I类MHC在所有细胞都一致地上调，即使不是所有细胞都用MOI为1的NDV感染。先前的研究证明NDV在B16-F10细胞中诱导I型IFN表达(Zamarin等人,2009,Mol Ther 17:697)。两种I型IFN(Dezfouli等人,2003,Immunol.Cell.Biol.,81:459,Seliger等人,2001,Cancer Res.,61:1095)在B16-F10细胞上上调I类MHC是已知的，提示在被感染肿瘤的情况下，这些机制可能在增强肿瘤免疫原性方面起额外作用。因此，这些提示对病毒介导的裂解的体外敏感性对于NDV疗法的体内敏感性不是必需的并且进一步突出了病毒产生的炎症反应而不是直接癌溶解在所观察到的抗肿瘤功效中的重要性。
系统性抗肿瘤效应对于注射的肿瘤类型是抗原限制性的
为了确定在远处肿瘤中所观察到的抗肿瘤效应对注射的肿瘤类型是否有特异性，在携带单侧远处B16-F10肿瘤的动物中和在具有在相反胁腹植入的异源肿瘤类型(MC38结肠癌和B16-F10黑色素瘤)的动物中评价了联合疗法(图28A)。虽然病毒经真皮内给予非荷瘤右胁腹导致左胁腹肿瘤向外生长延迟，但是在携带双侧B16-F10肿瘤的动物中见到了它不能导致长期保护和肿瘤排斥(图28B,C)。类似地，将NDV注射到携带左胁腹B16-F10肿瘤的动物的右胁腹MC38肿瘤内不能诱导B16-F10肿瘤排斥(图28D,E)，提示NDV诱导的抗肿瘤免疫应答很可能对于注射的肿瘤是抗原限制性的。
用NDV和抗CTLA-4的联合疗法诱导具有活化淋巴细胞的肿瘤浸润
为了检查治疗动物的B16-F10肿瘤微环境，收集双侧肿瘤并进行加工用于浸润细胞的分析。来自治疗动物的注射肿瘤和远处肿瘤的分析揭示出在用联合疗法治疗的动物中有著名的炎症性浸润物和大面积的肿瘤坏死(图30A,图29)。这与联合疗法组中CD45+细胞和T细胞的数目增加相关(图30A-C,图29A-C)。如先前所述，在TILs中所观察到的增加主要是由于CD8+和Tconv而不是Treg细胞的浸润，导致效应子与Treg的比值提高(图30D-F,图29C-E)。来自接受联合治疗的动物的CD4+和CD8+ TILs的表型表征证明了相对于未治疗的和抗CTLA-4治疗的动物，ICOS、颗粒酶B和Ki-67的上调(图30G-I)，和在响应用B16-F10肿瘤裂解物脉冲的树突细胞(DCs)再刺激时存在较大百分比的表达IFNγ的CD8+细胞(图30J)。
NDV联合疗法的抗肿瘤活性依赖于CD8+细胞、NK细胞和I型和II干扰素
为了确定细胞免疫力的哪些组分负责所观察到的治疗效果，在存在CD4+、CD8+或NK细胞的耗竭抗体的情况下重复治疗。各细胞亚群的适当细胞耗竭通过外周血的流式细胞术来证实(图31)。CD8+或NK细胞的耗竭导致在注射病毒的肿瘤和远处肿瘤中治疗效果废止(图32A,B)，长期存活显著降低(p<0.0001，对于CD8耗竭；和p＝0.0011，对于NK耗竭)(图32C)。与这些发现相一致，动物用抗IFNγ中和抗体进行治疗也会使治疗功效降低。相比之下，CD4+细胞的耗竭不导致抗肿瘤效应的明显变化，尽管这些结果必须慎重解释，因为抗CD4+耗竭也导致Tregs的同时耗竭。
I型IFN先前已经证明在引发CD8+细胞对抗肿瘤免疫应答中起重要的作用(Fuertes等人,2011,J Exp Med,208:2005；Diamond等人,2011,J ExpMed,208:1989)。为了研究I型IFN在NDV所致的肿瘤排斥中的作用，在I型IFN受体敲除(IFNAR-/-)小鼠中重复实验。IFNAR-/-小鼠证明了注射的肿瘤和对侧肿瘤的快速进程并且对联合疗法有完全抗性(图32D-F)。总之，这些发现突出了先天性和适应性免疫应答二者对在本研究中所观察到的病毒的系统性治疗功效的重要作用。
NDV疗法导致肿瘤细胞上和肿瘤浸润白细胞上PD-L1的上调
为了确定与NDV疗法组合来靶向其它免疫关卡是否有益，评价了对NDV感染后的PD-1-PD-L1途径的影响。如图33所示，NDV感染的肿瘤细胞在体外和体内均上调了细胞表面上抑制性PD-L1配体的表达(图33A)，这也在远处未感染肿瘤中见到。PD-L1的上调并不是刚好局限于肿瘤细胞，而是也在先天性和适应性免疫谱系的肿瘤浸润白细胞上见到(图33B)。
NDV与PD-1和PD-L1-阻断抗体的联合疗法导致改善的抗肿瘤免疫力和长期动物存活
NDV与阻断PD-1的抗体的组合和NDV与阻断PD-L1的抗体的组合在以上描述的双侧胁腹黑色素瘤模型中进行评价。值得一提的是，与CTLA-4阻断类似，NDV疗法与抗PD-1或抗PD-L1抗体组合导致改善的动物存活(图34和图35)。表征了来自用NDV和抗PD-1抗体的组合治疗的动物的远处肿瘤。正如可从图36所看见的，肿瘤内NDV与系统性PD-1阻断的组合导致具有免疫细胞的被标记的远处肿瘤浸润，其中肿瘤浸润CD8细胞的增加是最重大的发现。该浸润细胞分别上调了增殖和裂解标志物Ki67和颗粒酶B(图37)。
在注射病毒的肿瘤和远处肿瘤和排出肿瘤的淋巴结(TDLN)中，NDV诱导CD4和CD8细胞上ICOS的肿瘤免疫浸润上调
以上发现证明肿瘤内NDV与系统性免疫关卡阻断的组合导致两种治疗方法间的显著协同作用。为了在这些发现的基础上作进一步研究，通过相关共刺激途径可驱动更好的抗肿瘤免疫应答，研究了提高在肿瘤微环境里面的T细胞效应子功能。先前研究鉴定了T细胞上可诱导共刺激物(ICOS)的持续上调作为患者中对CTLA-4阻断应答的强指标(Carthon等人,2010,Clin.Canc.Res.,16:2861)。ICOS是活化T细胞表面上被上调的CD28同源物，已经表明对T细胞-依赖性B淋巴细胞应答和所有T辅助亚群的发育是至关重要的(Simpson等人,2010Curr Opin Immunol.22:326)。ICOS在CTLA-4阻断的抗肿瘤肿瘤功效中的作用目前由小鼠研究加以证实，其中ICOS-缺陷小鼠用CTLA-4阻断在抗肿瘤应答的发育中是严重缺失的(Fu等人,2011,Cancer Res.,71:5445)。
表征了ICOS在用NDV治疗的双侧胁腹肿瘤模型中的表达以确定该受体在这种治疗方法中是否可用作靶标。为了表征肿瘤内NDV疗法的局部和远位效应，使用了双侧胁腹B16-F10黑色素瘤模型，其中给予病毒到单侧肿瘤(图38A)。评价了可预测更好应答并且可以对在治疗功效中的进一步改善所靶向的激活标志物。本实施例集中在ICOS上，因为持续的ICOS上调先前已被证明在对恶性黑色素瘤用抗CTLA-4疗法治疗的患者中，与更持久的治疗反应和生存时间增加相关。对从肿瘤和排肿瘤的淋巴结中分离的淋巴细胞的分析鉴定出在治疗的动物中，作为激活标志物之一的共刺激分子ICOS的上调(图38B,C)。
NDV-ICOSL病毒的产生和体外评价。
利用针对NDV的反向遗传学系统(reverse-genetics system)，产生了表达鼠ICOSL的NDV(NDV-ICOSL)(图39A)。在24小时感染之后，ICOS在感染的B16-F10细胞表面上的表达通过流式细胞术证实(图39B)。病毒的体外表征揭示出其具有与亲代NDV毒株类似的复制(图39D)和裂解(图39C)特性。
远处肿瘤的NDV-ICOSL生长延迟并且诱导增强的肿瘤淋巴细胞浸润
为了评价注射病毒的肿瘤和远处肿瘤中治疗功效的NDV-ICOSL，将携带双侧B16-F10肿瘤的动物用4次肿瘤内注射病毒至单侧胁腹肿瘤进行治疗。NDV-ICOSL和野生型NDV在其引起用病毒直接注射的肿瘤内肿瘤消退的能力方面是相当的(图40A)。然而，当与野生型NDV相比时，NDV-ICOSL导致保留长期无肿瘤的几种动物的远处肿瘤的显著肿瘤生长延迟(图40B-C)。注射病毒的肿瘤的分析揭示出在用野生型NDV和NDV-ICOSL治疗的动物中肿瘤浸润被CD4和CD8效应子细胞增强，尽管两种病毒间的差异没有统计学显著性，反映出两种病毒抵抗右胁腹肿瘤的类似活性(图40A和图40D)。相比之下，左胁腹肿瘤的分析揭示出在NDV-ICOSL治疗组中在肿瘤浸润CD8和Tconv细胞中更明显的增加(图40E)。有趣的是，调节T细胞的绝对数也有增加，在NDV-ICOSL组中见到最高增加(图40E)，尽管调节T细胞的相对百分比明显低于NDV治疗的动物(图40F)。
NDV-ICOSL和CTLA-4阻断的联合疗法导致注射肿瘤和远处肿瘤的排斥反应。
总的来说，以上发现证明了尽管在用NDV-ICOSL的肿瘤内给药的远处肿瘤中见到了显著炎症反应，但是动物多数仍屈服于肿瘤，提示在肿瘤微环境里面有活性的抑制机制阻止通过浸润免疫细胞的肿瘤排斥。因此，评价了局部化NDV-ICOSL与系统性CTLA-4阻断的联合疗法的功效。对于这些实验，将肿瘤攻击剂量增加到用NDV或抗CTLA-4作为单药剂观察到无显著治疗功效的水平。如先前所述，动物用4个剂量的给予至单侧肿瘤的NDV进行治疗，同时给予系统性抗CTLA-4抗体(图41A)。在B16-F10模型中，用NDV-ICOSL和抗CTLA-4的联合疗法导致注射肿瘤和远处肿瘤的多数消退并伴有长期动物存活，这明显优于NDV-WT与抗CTLA-4的组合(图41B-D)。为了确定这些发现是否可以延伸到其它肿瘤模型，在双侧胁腹CT26结肠癌模型中进行了相同的实验。尽管CT26细胞对NDV-介导的溶解的体外敏感性差，但是观察到NDV和抗CTLA-4的联合疗法对注射病毒的肿瘤和远处肿瘤二者的显著治疗功效，在使用NDV-ICOSL与抗CTLA-4的组合的组中再次见到优异功效(图42A-D)。在两种肿瘤模型中，完全清除肿瘤的动物在第90天用致死剂量的肿瘤细胞再攻击而无进一步疗法并且证明在多数动物中对再攻击有保护作用(图41E和图42E)。有趣的是，尽管在CT26模型中所有治愈的动物有保护作用免于再攻击，但是当与仅用抗CTLA-4治愈的动物相比时，在B16-F10模型中用联合疗法治疗的动物证明有优异的保护作用(图41E)，表明该联合方法导致产生更有效的保护性记忆应答。
联合疗法导致增强的用先天性和适应性免疫细胞的肿瘤浸润
来自用NDV和抗CTLA-4疗法的组合治疗的动物的远处B16肿瘤的分析证明用不同免疫细胞亚型的显著肿瘤浸润(图43A,B)。增加的浸润在先天性(图43C,D)和适应性(图43E)免疫隔室二者中是明显的，其中在用NDV-ICOSL和抗CTLA-4的组合治疗的组中见到最高增加。有趣的是，尽管该组证明浸润CD8+淋巴细胞的最高数目，但是在该组中所见到的调节T细胞的增加也有统计学显著性(图43E)，尽管当与未治疗动物或用单药剂抗CTLA-4治疗的动物相比时，Tregs的总体百分比显著减少(图43F)，导致效应子与Treg比值增加(图43G)。TILs的详细分析证明从用NDV-ICOSL和抗CTLA-4组合治疗的动物分离的TILs分别表达最高水平的激活、溶解和增殖标志物ICOS、颗粒酶B和Ki67(图43H-J)。
表达其它共刺激分子的重组NDV的产生
本实施例因此证明由NDV表达共刺激配体能导致激活更强免疫应答，这进而能导致更有效的抗肿瘤免疫力，尤其是在用免疫关卡阻断的联合疗法的情况下。为了评价另外的共刺激分子，研究了靶向受体的免疫球蛋白超家族(ICOS和CD28)和TNF受体超家族(GITR、4-1BB、OX40和CD40)的配体。对于靶向CD28，将由具有NDV F糖蛋白的细胞质结构域和跨膜结构域和由抗CD28的单链抗体组成的胞外结构域的嵌合蛋白(aCD28-scfv)组成的人工配体进行了工程改造(图44A,B)。对于靶向TNF受体超家族的配体，使各配体的胞外结构域与NDV HN糖蛋白的跨膜结构域和胞内结构域融合，以便确保配体在被感染细胞的表面的表达提高(图44A,B)。另外，产生了表达共同γ链受体家族的细胞因子(IL-2、IL-15和IL-21)的重组病毒。所获得的构建体在图44C中用示意图予以说明。重组病毒通过反向遗传学产生并且病毒的存在通过血细胞凝集试验来证实(图45A)。为了确保所插入基因的保真度，从各病毒分离出RNA并用退火至克隆的基因区域外侧的引物进行RT-PCR(图45B,C)。各基因的序列通过Sanger测序法进一步证实。为了证实共刺激配体在被感染细胞表面上的表达，培养的B16-F10细胞以MOI为2感染并且24小时后用对各基因有特异性的抗体通过流式细胞术进行分析(图46)。
NDV-4-1BBL诱导远处肿瘤中增加的用淋巴细胞的肿瘤浸润
使用NDV-4-1BBL作为一个例子，评价了工程改造的病毒证明增强的免疫应答的任何证据的能力。如先前所述，携带双侧胁腹B16-F10黑色素瘤的小鼠用肿瘤内注射到对照NDV或NDV-4-1BBL的右侧肿瘤进行治疗，并且在第15天收集远处肿瘤。正如可在图47中见到的，用NDV-4-1BBL的疗法证明了先天性和适应性免疫细胞二者浸润到对侧肿瘤增强，这与先前证明用表达ICOSL的NDV具有类似结果的发现一致(图40)。总的来说，这些发现提示在肿瘤微环境的情况下由NDV表达免疫刺激的分子可导致抗肿瘤免疫力增强。
使用如该第7节所描述的类似测定评价了所产生的病毒NDV-4-1BBL、NDV-GITRL、NDV-OX40L、NDV-CD40L、NDV-IL-2、NDV-IL-15、NDV-IL-21诱导肿瘤免疫浸润的能力。另外，对于治疗评价，将每一种病毒在双侧胁腹肿瘤模型中用给予至单胁腹肿瘤的病毒与靶向抑制关卡PD-1、PD-L1和/或CTLA-4的系统性抗体组合进行了评价。
结论
为了触发免疫原性肿瘤细胞死亡和炎症反应，使用非致病性NDV，尽管其裂解活性相对较弱，但是已证明它是I型IFN和DC成熟的强效诱导物(Wilden等人,2009,Int J Oncol34:971；Kato等人,2005,Immunity 23:19)。使用在先前被证明不受同时免疫力影响的时间表上具有交错植入肿瘤的双侧胁腹黑色素瘤模型(Turk等人,2004,J Exp Med 200:771)。本实施例证明NDV的肿瘤内注射导致在不存在远处病毒传播的情况下远处肿瘤免疫浸润。更为重要的是，这种效应与Tregs数目相对减少和CD4和CD8效应子与Treg比值明显提高相关，先前已证明这是对免疫疗法有利的免疫学反应的标记(Quezada等人,2006,J ClinInvest 116:1935；Curran等人,2010,Proc Natl Acad Sci U S A 107:4275)。
本实施例中的数据证明NDV增强用肿瘤特异性淋巴细胞的肿瘤浸润，这是一种依赖于注射病毒的肿瘤的身份的效应。过继性转移的淋巴细胞的增强的肿瘤浸润和扩增进一步提示在溶瘤病毒疗法和使用过继性T细胞转移的治疗方法之间有协同作用。肿瘤特异性淋巴细胞在初始病毒感染的部位经历活化和扩增，然后它们迁移到其它肿瘤位点，很可能依赖于趋化因子和淋巴细胞归巢受体(Franciszkiewicz等人,2012,Cancer Res 72:6325)。本实施例中的数据还证明远处肿瘤免疫浸润是部分非特异性的并且可以被异源肿瘤的NDV感染或者将来自治疗动物的血清转移到首次用于实验的荷瘤小鼠所诱导。由炎症性细胞因子(例如，IL-6)诱导的血管通透性增加可以强烈地影响肿瘤血管系统的活化和淋巴细胞向肿瘤的募集(Fisher等人,2011,The Journal of clinical investigation 121:3846)。
尽管在TIL中有明显增加，但是远处肿瘤中的治疗效果用NDV单一疗法不算太高，突出了这些肿瘤的微环境的免疫抑制性质(Spranger等人,2013,Sci Transl Med 5)。值得一提的是，系统性抗CTLA-4抗体与肿瘤内NDV的组合导致远处B16-F10肿瘤的排斥，结果是长期动物存活。该动物也防止进一步肿瘤再攻击，暗示长期记忆的建立。有趣的是，用TRAMPC2和CT26肿瘤模型也见到治疗功效，表现出对NDV介导的细胞溶解的体外敏感性差。这些发现突出了NDV诱导的抗肿瘤免疫/炎症反应的重要性，而不是直接溶解，因为在该模型中一级机制驱动抗肿瘤功效。实际上，用联合疗法治疗的注射NDV的肿瘤和远处肿瘤的分析证明用先天性免疫细胞和活化CD8+和CD4+效应子细胞的明显浸润，尽管CD8+和NK细胞的耗竭废除了治疗功效。再者，组合策略在IFNAR-/-小鼠是完全无效的，这支持I型IFN途径在该系统中在诱导抗肿瘤免疫力中的作用(Fuertes等人,2011,J Exp Med 208,2005；Diamond等人,2011,J Exp Med 208:1989；Swann等人,2007,J Immunol 178:7540)。
概括地说，本实施例证明B16黑色素瘤用NDV的局部化肿瘤内疗法诱导炎症反应，导致在远处(非病毒性注射的)肿瘤中产生淋巴细胞浸润物和抗肿瘤效应，而没有远处病毒传播。炎症作用与用肿瘤特异性CD4+和CD8+T细胞的远处肿瘤浸润同时发生，这依赖于注射病毒的肿瘤的身份。用局部化NDV和系统性CTLA-4阻断的联合疗法导致在不良免疫原性肿瘤模型中预先建立的远处肿瘤的排斥和保护作用免于肿瘤再攻击，与肿瘤细胞系对NDV-介导的裂解的敏感性无关。治疗效果与用活化CD8+和CD4+效应子但不是调节T细胞的标记的远处肿瘤浸润相关，并且依赖于CD8+细胞、NK细胞和I型干扰素。本实施例证明用溶瘤NDV的局部化疗法诱导远处肿瘤中的炎症性免疫浸润物，使得它们对用免疫调节抗体的系统性疗法敏感。
本发明并不限于本文描述的具体实施方案的范围。实际上，除了所描述的那些实施方案以外，对本发明的各种修改对本领域技术人员来说根据以上说明书和附图将变得显而易见。这样的修改预计落入附上的权利要求书的范围内。
本说明书中引用的所有参考文献均通过引用以其整体并入本文作为参考并且用于所有目的，其程度正如每个单独的出版物或专利或专利申请具体地和单独地指明通过引用以其整体并入本文作为参考用于所有目的一样。

Claims (57)

1.嵌合的新城疫病毒(NDV)，包含编码免疫细胞的共刺激受体的激动剂的包装基因组，其中所述激动剂由该病毒表达。
2.嵌合的NDV，包含编码免疫细胞的抑制受体的拮抗剂的包装基因组，其中所述拮抗剂由该病毒表达。
3.权利要求1或2的嵌合的NDV，其中所述包装基因组编码突变的F蛋白并且所述突变的F蛋白由该病毒表达。
4.权利要求1或2的嵌合的NDV，其中所述免疫细胞是T淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞。
5.权利要求1的嵌合的NDV，其中所述共刺激受体是糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、OX40、CD27、CD28、4-1BB或CD40。
6.权利要求2的嵌合的NDV，其中所述抑制受体是细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、编程性细胞死亡蛋白1(PD1)、B和T-淋巴细胞弱化子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞激活基因3(LAG3)或T-细胞膜蛋白3(TIM3)。
7.权利要求1的嵌合的NDV，其中所述激动剂是特异性结合至共刺激受体的抗体。
8.权利要求1的嵌合的NDV，其中所述激动剂是特异性结合至共刺激受体的配体。
9.权利要求1的嵌合的NDV，其中所述激动剂是特异性结合至GITR、OX40、CD27、CD28、4-1BB或CD40的抗体。
10.权利要求7或9的嵌合的NDV，其中所述抗体是单克隆抗体或单链Fv。
11.权利要求8的嵌合的NDV，其中所述配体是GITRL、CD40L、CD137L、OX40L、CD70或ICOSL。
12.权利要求2的嵌合的NDV，其中所述拮抗剂是特异性结合至抑制受体的抗体。
13.权利要求2的嵌合的NDV，其中所述拮抗剂是特异性结合至CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3或TIM3的抗体。
14.权利要求2的嵌合的NDV，其中所述拮抗剂是抑制受体的配体的可溶性受体。
15.权利要求2的嵌合的NDV，其中所述拮抗剂是特异性结合至抑制受体的配体的抗体。
16.权利要求2的嵌合的NDV，其中所述拮抗剂是特异性结合至PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、HVEM或Gal9的抗体。
17.权利要求14的嵌合的NDV，其中所述可溶性受体是PD1、BTLA、KIR、LAG3或TIM3的胞外结构域。
18.权利要求12、13、15或16的嵌合的NDV，其中所述抗体是单克隆抗体或sc-Fv。
19.药物组合物，包含权利要求1、5、7、8、9或11的嵌合的NDV和药学上可接受的载体。
20.药物组合物，包含权利要求2、6、12、13、14、15、16或17的嵌合的NDV和药学上可接受的载体。
21.用于生产药物组合物的方法，所述方法包括：
a.将权利要求1、2、5-9或11-17中任一项的嵌合的NDV在对NDV感染敏感的细胞系中繁殖；和
b.收集子代病毒，
其中使所述病毒生长至足够数量，并且在所述病毒没有污染的足够条件下生长，使得所述子代病毒适合于配制成药物组合物。
22.用于生产药物组合物的方法，所述方法包括：
a.将权利要求1、2、5-9或11-17中任一项的嵌合的NDV在含胚卵中繁殖；和
b.收集子代病毒，
其中使所述病毒生长至足够数量，并且在所述病毒没有污染的足够条件下生长，使得所述子代病毒适合于配制成药物组合物。
23.细胞系，包含权利要求1、2、5-9或11-17中任一项的嵌合的NDV。
24.含胚卵，包含权利要求1、2、5-9或11-17中任一项的嵌合的NDV。
25.用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予包含权利要求1、5、7、8、9或11中任一项的嵌合的NDV的药物组合物。
26.用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予包含权利要求2、6、12、13、14、15、16或17中任一项的嵌合的NDV的药物组合物。
27.权利要求25的方法，其中所述嵌合的NDV的包装基因组编码具有突变切割位点的突变的F蛋白，致使该突变的F蛋白由该病毒表达。
28.权利要求26的方法，其中所述嵌合的NDV的包装基因组编码具有突变切割位点的突变的F蛋白，致使该突变的F蛋白由该病毒表达。
29.权利要求25的方法，还包括向所述对象给予免疫细胞的共刺激受体的第二激动剂。
30.权利要求26的方法，还包括向所述对象给予免疫细胞的共刺激受体的激动剂。
31.权利要求26的方法，还包括向所述对象给予免疫细胞的抑制受体的第二拮抗剂。
32.权利要求25的方法，还包括向所述对象给予免疫细胞的抑制受体的拮抗剂。
33.用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予NDV和免疫细胞的共刺激受体的激动剂。
34.用于治疗癌症的方法，包括向有其需要的对象给予NDV和免疫细胞的抑制受体的拮抗剂。
35.权利要求33的方法，其中所述NDV是嵌合的NDV和其中所述嵌合的NDV包含编码由该病毒表达的细胞因子的包装基因组。
36.权利要求34的方法，其中所述NDV是嵌合的NDV，其包含编码细胞因子的包装基因组，其中所述细胞因子由该病毒表达。
37.权利要求33的方法，其中所述NDV是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的共刺激受体的第二激动剂或免疫细胞的抑制受体的拮抗剂的包装基因组，其中所述第二激动剂或拮抗剂由该病毒表达。
38.权利要求34的方法，其中所述NDV是嵌合的NDV，其包含编码免疫细胞的共刺激受体的激动剂或免疫细胞的抑制受体的第二拮抗剂的包装基因组，其中所述激动剂或第二拮抗剂由该病毒表达。
39.权利要求35或36的方法，其中所述细胞因子是IL-2、IL-7、IL-15或IL-21。
40.权利要求33的方法，其中所述共刺激受体是GITR、OX40、CD27、CD28、4-1BB或CD40。
41.权利要求34的方法，其中所述抑制受体是CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3或TIM3。
42.权利要求33的方法，其中所述激动剂是特异性结合至共刺激受体的抗体。
43.权利要求33的方法，其中所述激动剂是特异性结合至共刺激受体的配体。
44.权利要求33的方法，其中所述激动剂是特异性结合至GITR、OX40、CD27、CD28、4-1BB或CD40的抗体。
45.权利要求42或44的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或单链Fv。
46.权利要求43的方法，其中所述配体是CD137L、OX40L、CD40L、GITRL、CD70或ICOSL。
47.权利要求34的方法，其中所述拮抗剂是特异性结合至抑制受体的抗体。
48.权利要求34的方法，其中所述拮抗剂特异性结合至CTLA-4、PD1、BTLA、KIR、LAG3或TIM3的抗体。
49.权利要求34的方法，其中所述拮抗剂是抑制受体的配体的可溶性受体。
50.权利要求34的方法，其中所述拮抗剂是特异性结合至抑制受体的配体的抗体。
51.权利要求34的方法，其中所述拮抗剂是特异性结合至PDL1、PDL2、B7-H3、B7-H4、HVEM或Gal9的抗体。
52.权利要求51的方法，其中所述可溶性受体是PD1、BTLA、KIR、LAG3或TIM3的胞外结构域。
53.权利要求47、48、50或51的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或scFv。
54.权利要求33或34的方法，还包括给予过继性T淋巴细胞。
55.权利要求33-38、40-44或46-52中任一项的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、结肠直肠癌、乳腺癌、卵巢癌或肾细胞癌。
56.权利要求33-38、40-44或46-52中任一项的方法，其中所述癌症是恶性黑色素瘤、恶性神经胶质瘤、肾细胞癌、胰腺腺癌、恶性间皮瘤、肺腺癌、肺小细胞癌、肺鳞状细胞癌、间变性甲状腺癌或头颈部鳞状细胞癌。
57.权利要求33-38、40-44或46-52中任一项的方法，其中所述对象是人。
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