CN106163532B - 以减毒的新城疫病毒为特征的组合物和用于治疗瘤形成的使用方法 - Google Patents

以减毒的新城疫病毒为特征的组合物和用于治疗瘤形成的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于在人类受试者中诱导肿瘤消退的方法，这些方法利用具有修饰的F蛋白质切割位点的新城疫病毒(NDV)的修饰的中等毒力株，该中等毒力株对家禽是不致病的(弱毒力)，但是展现出溶瘤特性。这些披露的方法提供了安全、有效和可靠的手段在对其需要的个体中诱导肿瘤消退。这些方法克服了使用病毒的致病株用于人类疗法的缺点。

Description

以减毒的新城疫病毒为特征的组合物和用于治疗瘤形成的使 用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年9月3日提交的美国临时申请序列号61/873,039的权益，该申请的内容通过引用结合在此。
发明背景
新城疫病毒(NDV)是一种禽病毒引起的传染性鸟疾病，影响许多驯养的和野生的鸟类。人类接触受感染的鸟类(例如，在家禽加工厂中)可以引起轻微的结膜炎和流感样症状，但是NDV以其他方式并不会对人类健康造成任何危害，并且大多数人针对NDV是血清反应阴性的。基于鸡中的病毒致病性，NDV致病性，如由脑内致病指数(CPI)确定的，分类为高(强毒力)、中等(中等毒力)或低(弱毒力)。由于农业考虑，自从2008年，具有鸡毒力(ICPI>0.7)的中等毒力和强毒力的NDV已经被USDA分类为“选择剂”该选择剂和毒素列表包括生物剂，这些生物剂具有对人类和动物健康、对植物健康、或对动物和植物产品构成严重威胁的潜能。
天然发生形式的NDV已经被用于临床研究中，作为免疫疗法和病毒疗法的生物制品。因为病毒的选择性杀死人类肿瘤细胞的能力，伴随着对正常细胞的有限的毒性，NDV显示出了作为抗癌剂的希望。然而，由于NDV重新分类为选择剂，NDV作为抗癌剂的发展未能取得进展。其他溶瘤病毒在临床试验中已显示出相当大的希望。为了有助于NDV作为癌症疗法的发展，需要新形式的病毒。理想地，此类新的形式将仍然保留他们靶向肿瘤细胞的能力，但是在鸟类中将不再引起疾病。
发明概述
如以下所描述，本发明特点是用于治疗瘤形成的组合物和方法。
在一方面，本发明总体上提供了减毒的新城疫病毒(NDV)，该新城疫病毒具有NDVLaSota病毒株的或巨细胞病毒(CMV)的糖蛋白B(gB)的F蛋白质切割位点(S116)。在本发明的一个实施例中，经修饰的F蛋白质切割序列(FPCS)具有以下序列修饰之一，S116：111H-N-R-T-K-S/F117；S116K：111H-N-K-T-K-S/F117；S116M：111H-N-R-M-K-S/F117；S116KM：111H-N-K-M-K-S/F-I118；或R116：111H-N-R-T-K-R/F-I118。在另一个实施例中，减毒病毒株是一种经修饰的73T病毒株。在又另一个实施例中，减毒NDV病毒是r73T-R116病毒。在其他实施例中，该病毒具有增大的HN-L基因间区域。在又一其他实施例中，HN-L基因间区域是一种长度在至少约50-300氨基核苷酸之间的非编码序列。在其他实施例中，该非编码序列衍生自1型副粘病毒(APMV-1)，呼吸道合胞体病毒(RSV)或随机序列。在又另一个实施例中，HN和L基因间非编码序列长度为60、102、144、198、或318nt。在另外的实施例中，该病毒在P-M联接和/或HN-L联接处具有插入的一个或多个异源多核苷酸序列。在其他实施例中，该病毒具有两个或更多个异源多核苷酸序列，其中将至少一个异源多核苷酸插入P-M联接处并且至少一个插入HN-L联接处。在其他实施例中，异源多核苷酸序列是一种编码多肽的转基因，该多肽增强了病毒溶瘤特性。在又另一个实施例中，该转基因编码细胞因子、细胞表面配体、和/或趋化因子。在其他实施例中，该细胞因子选自下组，该组由以下各项组成：GM-CSF、IL-2、IL-21、IL-15、IL-12、和IL-12p70。在具体实施例中，该细胞因子是人类GM-CSF。在其他实施例中，该异源多核苷酸序列是编码可检测部分的转基因。在某些实施例中，可检测部分的表达水平与病毒复制相关联。在又另一个实施例中，将NDV的F和HN基因由犬副流感病毒5(PIV 5)或鸽1型副粘病毒(PPMV-1)的相应的胞外域替换。在另一个具体实施例中，该病毒是73T-R116i-hGM-CSF。在其他实施例中，该减毒病毒具有大于90小时或约90-156小时的蛋中平均死亡时间(MDT)。在另一个实施例中，该减毒病毒具有在约0-0.7之间的脑内致病指数。在另外的实施例中，该减毒病毒具有约0的脑内致病指数。在又另一个实施例中，该减毒病毒在HT1080细胞中具有低于约15％的细胞毒性。在其他实施例中，该减毒病毒以至少10％或15％的杀死效率选择性杀死肿瘤细胞。在另一个实施例中，肿瘤细胞杀死效率处于在约75％-100％之间。
本发明的另一方面一般特征是一种选择性杀死肿瘤细胞的方法，该方法涉及将肿瘤细胞与在此描述的减毒的新城疫病毒接触。在本发明的另一个实施例中，该肿瘤细胞是膀胱、卵巢、脑、胰脏、前列腺、肉瘤、肺、乳腺、宫颈、肝、头颈、胃、肾、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺、结肠、和黑色素瘤癌细胞。在又另一个实施例中，该方法涉及向受试者给予有效量的在此描述的减毒的新城疫病毒。在又另一个实施例中，将该减毒的新城疫病毒经全身、向腹膜内、或肿瘤内递送。在其他实施例中，将病毒以约107pfu至约109pfu的剂量给予。在另外的实施例中，将病毒以约109pfu至约1011pfu的剂量经静脉内给予。在其他实施例中，受试者患有选自下组的癌症，该组由以下各项组成：膀胱癌、卵巢癌、脑癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、胃癌、肾癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、结肠癌、和黑色素瘤。
在又另一方面，本发明一般特征是一种治疗已经产生抗NDV免疫应答的受试者中瘤形成的方法，该方法涉及向受试者给予有效量的在此描述的减毒嵌合新城疫病毒，其中该病毒是一种嵌合病毒，该嵌合病包括犬副流感病毒5(PIV 5)或鸽1型副粘病毒(PPMV-1)的F和/或HN基因，其中嵌合新城疫病毒在抗原性上与NDV不同。在本发明的一个实施例中，相对于已经形成抗NDV疫应答但是并没有接受嵌合新城疫病毒的对照受试者中存在的溶瘤病毒的水平，该方法增加了受试者中存在的溶瘤病毒的水平。
定义
除非另外说明，本文所用的所有科技术语的意义都与本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的意义一致。下面的参考文献为技术人员提供了本发明所用的多个术语的通用定义：辛格尔顿(Singleton)等人，微生物学和分子生物学词典(Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology)(第2版，1994)；剑桥科技词典(The CambridgeDictionary ofScience and Technology)(沃克(Walker)编著，1988)；遗传学的术语表(The Glossary ofGenetics)，第5版，R.列赫尔(R.Rieger)等人(编著)，斯普林格出版社(Springer Verlag)(1991)；以及黑尔(Hale)和马哈姆(Marham)，哈珀柯林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary ofBiology)(1991)。除非另行指明，如在此使用的以下术语具有以下赋予它们的含意。
“减毒的新城疫病毒”意指一种新城疫病毒，该新城疫病毒选择性杀死肿瘤细胞但是并不对家禽构成威胁。在一个实施例中，减毒的新城疫病毒具有小于约0.4或0.7的ICPI。在其他实施例中，减毒的新城疫病毒具有在约0和0.1之间的ICPI。
“异源多核苷酸序列”意指一种在野生型条件中不存在的重组多核苷酸。
所谓“可检测的标记物(detectable label)”意味着一种组合物，当把该组合物连接到一个感兴趣的分子时，使后者变成通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、或化学的手段可检测的。例如，有用的标记物包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶粒、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，如通常在酶联免疫吸附试验(ELISA)中所使用的)、生物素、地高辛、或半抗原。
所谓“试剂”意味着任何小分子的化学化合物、抗体、核酸分子、或多肽、或其片段。
“变更”或“变化”意指增加或减少。变更可以少至1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、或40％、50％、60％，或者甚至多达70％、75％、80％、90％、或100％。
如在此所使用，术语“抗体”指代由通过多肽链的折叠形成的至少一个结合结构域构成的多肽或多肽组，这些多肽链具有三维结合空间，其中内表面形状和电荷分布与抗原的抗原决定簇的特征互补。抗体典型地具有四聚体形式，包括两对相同的多肽链，每对具有一个“轻链”和一个“重链”。每个轻/重链对的可变区、或可变链多肽形成抗原结合位点。
术语“mAb”是指单克隆抗体。本发明的抗体包括但不限于全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab'、单链V区片段(scFv)、融合多肽、和非常规抗体。
“生物样品”意指从受试者中获得的样品，该样品包括体内或原位获得或收集的生物组织或流体源的样品。在具体的实施例中，生物样品包括任何细胞、组织、流体、或其他衍生自生物的材料。
“捕获试剂”意指一种试剂，该试剂特异性结合核酸分子或多肽，来选择或分离该核酸分子或多肽。
“临床侵略性”意指瘤形成的严重性。侵略性瘤形成比较少侵略性的瘤形成更可能转移。当保守的治疗方法适用于侵略性较低的瘤形成时，侵略性较高的瘤形成需要更积极的治疗方案。
如在此使用的术语“确定”、“评估”、“测定”、“测量”和“检测”是指定量和定性确定，并且正因如此，术语“确定”在此可与“测定”、“测量”、等等互换使用。其中定量测定为目的时，使用短语“确定分析物以及类似物的量”。其中定性和/或定量测定为目的时，使用短语“确定分析物的水平”或“检测”分析物。
术语“受试者”或“患者”是指一种动物，该动物为治疗、观察、或试验的对象。仅通过举例的方式，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于，人或非人哺乳动物，如非人类灵长动物、鼠、牛、马、犬、羊、或猫。
术语“减少”或“增加”分别意指消极或积极地改变。改变可以是5％、10％、25％、30％、50％、75％、或甚至是100％。
“参考”意指用于比较的标准。
“周期的”意指定期。周期性患者监测包括，例如，测试的时间表，该测试每天、每两周、每两月、每月、每两年、或每年给予。
“瘤形成的严重性”意指病变程度。瘤形成的严重性增加，例如，当瘤形成的阶段或等级增加时。
在本发明的方法中有用的核酸分子包括对本发明的多肽或其片段进行编码的任何核酸分子。这样的核酸分子不需要与内源性核酸序列具有100％的同一性，但是将典型地表现出基本的同一性。与内源性序列具有“基本同一性”的多核苷酸典型地能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。所谓“杂交”意味着在不同的严格条件下进行配对以便在互补的多核苷酸序列(例如，在此描述的基因)、或其部分之间形成双链分子。(例如，参见华尔，G.M.(Wahl,G.M.)和S.L.伯杰(S.L.Berger)(1987)酶学方法(Methods Enzymol.)152:399)，基梅尔，A.R.(Kimmel，A.R.)(1987)酶学方法(Methods Enzymol.)152:507)。
例如，严格的盐浓度通常将是小于大约750mM的氯化钠和75mM的柠檬酸三钠、优选地是小于大约500mM的氯化钠和50mM的柠檬酸三钠、并且更优选地是小于大约250mM的氯化钠和25mM的柠檬酸三钠。在缺少有机溶剂(例如，甲酰胺)下可以获得低严格杂交，而在至少大约35％的甲酰胺、并且更优选地是至少大约50％的甲酰胺存在下可以获得高严格杂交。严格的温度条件将通常包括至少大约30℃、更优选地是至少大约37℃、并且最优选地是至少大约42℃的温度。不同的另外的参数，如杂交时间、清洁剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS))浓度、以及载体DNA的包含或排除，对本领域的普通技术人员是熟知的。根据需要通过组合这些不同的条件实现不同的严格水平。在一个优选的实施例中，杂交将会在30℃、在750mM的氯化钠、75mM的柠檬酸三钠、以及1％的SDS中发生。在一个更优选的实施例中，杂交将会在37℃、在500mM的氯化钠、50mM的柠檬酸三钠、1％的SDS、35％的甲酰胺、以及100μg/ml的变性的鲑精DNA(ssDNA)中发生。在一个最优选的实施例中，杂交将会在42℃、在250mM的氯化钠、25mM的柠檬酸三钠、1％的SDS、50％的甲酰胺、以及200.mu.g/ml的ssDNA中发生。这些条件的有用的变体对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。
对于大多数的应用，杂交之后的洗涤步骤也将会在严格度方面不同。通过盐浓度和温度可以定义洗涤严格条件。如上所述，通过降低盐浓度或增加温度可以增加洗涤严格度。例如，用于洗涤步骤的严格盐浓度将为优选地小于大约30mM的氯化钠和3mM的柠檬酸三钠、并且最优选地是小于大约15mM的氯化钠和1.5mM的柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件将通常包括至少大约25℃、更优选地是至少大约42℃、并且甚至更优选地是至少大约68℃的温度。在一个优选的实施例中，洗涤步骤将会在25℃、在30mM的氯化钠、3mM的柠檬酸三钠、以及0.1％的SDS中发生。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将会在42℃、在15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸三钠、以及0.1％的SDS中发生。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将会在68℃、在15mM的氯化钠、1.5mM的柠檬酸三钠、以及0.1％的SDS中发生。这些条件的另外的变体对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。杂交技术对于本领域的普通技术人员是熟知的并且描述于例如本顿(Benton)与戴维斯(Davis)(科学(science)196:180，1977)；格伦斯坦(Grunstein)和霍格内斯(Hogness)(美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)72:3961，1975)；奥苏贝尔(Ausubel)等人(分子生物学实验手册，威利出版社期刊全文数据库，纽约(Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，New York)，2001)；伯杰(Berger)和基梅尔(Kimmel)(分子克隆技术指南(Guide to Molecular Cloning Techniques)，1987，学术出版社，纽约(Academic Press，New York))；以及萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆实验指南，冷泉港实验室出版社，纽约，(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York)。
所谓“基本上同一的”意味着相对于参考氨基酸序列(例如，在此描述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，在此描述的任一核酸序列)，一种多肽或核酸分子表现出至少50％的同一性。优选地，相对于用于比较的序列，这样的序列在氨基酸水平或核酸上为至少60％，更优选地80％或85％，并且更优选地90％、95％、96％、97％、98％，或甚至99％或的更高的同一性。
典型地使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心(麦迪逊大学道1710，威斯康星州53705(1710University Avenue，Madison，Wis.53705))遗传计算组的序列分析软件包，BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列同一性。此类软件通过对各种置换、缺失和/或其他修饰分配同源性程度来匹配相同或相似序列。保守置换一般包括在下述组内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中在e-3和e-100之间的概率得分指示紧密相关的序列。
在此使用的，“基本上纯的”意指感兴趣的种类是存在的主要种类(即，在摩尔基础上，它比组合物中任何其他个别种类更丰富)，并且优选地，一个基本上纯的级分是如下的组合物：在其中该目标种类占存在的所有大分子种类的至少约50％(在摩尔基础上)。一般而言，基本上纯的组合物将包括组合物中存在的大于约80％的所有大分子种类，更优选地大于约85％、90％、95％、和99％。最优选地，将感兴趣的种类纯化至必要的均质性(通过常规的检测方法不能在该组合物中检测到污染物种类)，并且该组合物基本上由单一的大分子种类组成。
如在此所使用的术语“治疗(treat、treating、treatment等)”指的是减少或改善失调和/或与其相关联的症状。将被理解的是，尽管不能排除，治疗失调或病症并不要求完全地消除该失调、病症或与其相关联的症状。因此，一个成功的治疗可能会延长患者生存或者缓解不良症状。
如在此所使用的术语，“预防(prevent、preventing、prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等指的是降低失调或病症在受试者中的发展的可能性，该受试者不患有失调或病症，但是有发展失调或病症的风险或者容易发展失调或病症。
给药是指单次给予治疗性组合物。剂量是指在给药中治疗活性分子的量。治疗方案是指一次或多次给药的给予剂量、时间表、和模式。周期是指在治疗方案中具有一次或多次给药的可重复单位。在一些治疗方案中，该剂量针对每次给药是统一的。在其他治疗方案中，该剂量可以是不统一的。例如，可以使用一个或多个负荷剂量以提高患者中治疗性分子的浓度至所希望的水平。负荷剂量随后可以有一次或多次维持给药，该维持给药总体上包括较低剂量(例如，一半的或较少的负荷剂量)，该较低剂量足以维持患者中治疗性分子的所希望的浓度。可以使用一个或多个逐渐减少剂量以逐渐减少患者中治疗性分子的浓度。
“特异性结合”意指一种化合物(例如，抗体)识别并结合一种分子(例如，多肽)，但是其基本上不识别并结合其他分子。
除非确切规定或从上下文显而易见，否则如在此所使用的术语“大约(about)”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均数的2个标准偏差之内。大约可以被理解为在声明值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、或0.01％之内。除非从上下文显而易见，在此提供的所有数值被该术语大约修饰。
在此提供的范围被理解成对范围内的所有值的简写。例如，一个1到50的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围，该组由以下各项组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
在此提供的任何化合物、组合物或方法可以与在此提供的一个或多个任何其他组合物和方法进行组合。
如在此使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”以及“该”包括复数形式，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“一个生物标志物”包括提及超过一个生物标志物。
除非明确声明或从上下文显而易见，如在此所使用的，术语“或”被理解为包括在内。
术语“包括”在此用作意思是短语“包括但不限于”，并且可与后者互换使用。
在此使用的，术语“包括(comprises、comprising)”、“包含(containing)”、“具有(having)”等具有美国专利法指定的意义并且意味着“包括(includes、including)”等；“基本上由…组成(consisting essentially of或consists essentially)”同样具有美国专利法指定的意义并且该术语是开放性的，允许超出所叙述的存在，只要所叙述的基本或新特征不被超过叙述的存在改变，但是排除现有技术实施例。
序列
全长NDV病毒73T的示例性核苷酸序列为：
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wt F蛋白的示例性核苷酸序列是如下，其中已加下划线的序列表示F蛋白质切割位点的核苷酸序列：
atgggccccagaccttctaccaagaacccagcacctatgatgctgactgtccgggtcgcgctggtactgagttgcatctgtccggcaaactccattgatggcaggcctcttgcggctgcaggaattgtggtaacaggagacaaagcagtcaacatatacacctcatcccagacaggatcaatcatagttaagctcctcccaaacctgcccaaggataaggaggcatgtgcgaaagcccccttggatgcatacaacaggacattgaccactttgctcaccccccttggtgactctatccgtaggatacaagagtctgtaactacatctggagggaggagacagaaacgctttataggcgccattattggcggtgtggctcttggagttgcaactgctgcacaaataacagcggccgcagctctgatacaagccaaacaaaatgctgccaacatcctccgacttaaagagagcattgccgcaaccaatgaggccgtgcatgaggtcactgacggattatcgcaactagcagtggcagttgggaagatgcagcagtttgtcaatgaccaatttaataaaacaactcaggaattaggctgcatcagaattgcacagcaagttggcgtagagctcaacctgtatctaaccgaattgactacagtattcggaccacaaatcacttcacctgccttaaacaagctgactattcaggcactttacaatctagctggtgggaatatggatcacttgttgactaagttaggtgtagggaacaatcaactcagctcattaatcggtagcggcttaatcaccggcaaccctattctgtacgactcacagactcaactcttgggtatacaggtaactctaccttcagtcgggaacctaaataatatgcgtgccacctacttggaaaccttatccgtaagcacaaccaggggatttgcctcggcacttgtcccaaaagtggtgacacaggtcggttctgtgatagaagaacttgacacctcatattgtatagaaaccgacttggatttatattgtacaagaatagtaacattccctatgtcccctggtatttattcctgcttgagcggcaatacatcggcctgtatgtactcaaagaccgaaggcgcactcactacgccatacatgactatcaaaggctcagtcatcgctaactgcaagatgacaacatgtagatgtgtaaaccccccgggtatcatatcgcaaaactatggggaagccgtgtctctaatagataagcaatcatgcaatgttttatccttagacgggataactttaaggctcagtggggaattcgatgcaacttatcagaagaatatctcaatacaagattctcaagtaataataacaggcaatcttgatatctcaactgagcttgggaatgtcaacaactcgatcagtaatgctttgaataagttagaggaaagcaacagcaaactagacaaagtcaatgtcaaactgaccagcacatctgctctcattacctatatcgttttgactatcatatctcttgtttttggtatacttagcctggttctagcatgctacctaatgtacaagcaaaaggcgcaacaaaagaccttattatggcttgggaataataccctagatcagatgagagccactacaaaaatgtga
野生型F蛋白的示例性氨基酸序列，其中已加下划线的序列表示F蛋白质切割位点的氨基酸序列：
mgprpstknpapmmltvrvalvlscicpansidgrplaaagivvtgdkavniytssqtgsiivkllpnlpkdkeacakapldaynrtlttlltplgdsirriqesvttsggrrqkrfigaiiggvalgvataaqitaaaaliqakqnaanilrlkesiaatncavhevtdglsqlavavgkmqqfvndqfnkttqelgciriaqqvgvelnlyltelttvfgpqitspalnkltiqalynlaggnmdhlltklgvgnnqlssligsglitgnpilydsqtqllgiqvtlpsvgnlnnmratyletlsvsttrgfasalvpkvvtqvgsvieeldtsycietdldlyctrivtfpmspgiysclsgntsacmyaktegalttpymtikgsvianckmttcrcvnppgiisqnygeavslidkqscnvlsldgitlrlsgefdatyqknisiqdsqviitgnldistelgnvnnsisnalnkleesnskldkvnvkltstsalityivltiislvfgilslvlacylmykqkaqqktllwlgnntldqmrattkm
小鼠GM-CSF的示例性核苷酸序列是如下：
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小鼠GM-CSF的示例性氨基酸序列是如下：
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人类GM-CSF的示例性核苷酸序列是如下：
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人类GM-CSF的示例性氨基酸序列是如下：
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附图简要说明
图1描绘的是NDV 73T反基因组cDNA病毒株73T的构建。将GenBank中NDV序列进行比对，以获得共有序列，来针对病毒RNA的RT-PCR来设计DNA寡核苷酸。将由高保真RT-PCR产生的六个亚基因组cDNA片段组装到pUC19载体中。NDV 73T的全长cDNA称为p73T。将73T中的F蛋白质切割位点(FPCS)的核苷酸和推断的氨基酸序列修饰为NDV LaSota病毒株(弱毒，lento)的以及巨细胞病毒(CMV)的gB的那些(S116)。双斜线指示F蛋白的切割位点。此外，73T病毒株cDNA质粒(p73T)在5’端包含27个核苷酸(nt)T7RNA聚合酶启动子，以及含有HDV反基因组核酶序列的189个nt以及在3’端的T7RNA聚合酶转录终止信号。为了产生非强毒NDV，将编码融合蛋白的蛋白酶切割位点的序列通过定点诱变修饰为非强毒NDV LaSota病毒株的(弱毒，lento)或巨细胞病毒的糖蛋白B(gB)的那些(S116)。
图2A和2B描绘的是一个或多个转基因盒插入NDV 73T基因组中。图2A显示了在P-M联接处转基因的插入。在包含SacII-PmlI片段的亚克隆质粒中在nt 3148处引入AfeI限制位点。编码密码子优化的人类或小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或白介素2(IL-2)的cDNA。插入的基因盒包含基因末端(GE；5'-TTAAGAAAAAA-3')、基因间核苷酸(T)、基因启动序列(GS；5'-ACGGGTAGA-3')和转基因的开放阅读框(ORF)。此外，将十个核苷酸(5'-cgccgccacc-3')插入起始位点的上游，来引入Kozak序列。将来自得到的质粒中的SacII-PmlI片段转移到质粒r73T中并且命名为p73T-P1。此外，图2A显示出在HN ORF和HN的基因末端信号(GE)序列之间的HN-L联接处转基因的插入，在包含AgeI-XbaI片段的质粒中在nt 8231处引入了AfeI限制位点。使用一对磷酸盐正义和反义引物(表3)通过PCR来产生基因盒，并且插入AfeI位点。将来自得到的质粒中的AgI-XbaI片段转移到质粒p73T中，产生p73T-HN1。将在P-M或HN-L联接处包含转基因的全长(FL)73TcDNA分别命名为p73T-P1或p73T-HN1。图2B显示了向P-M联接处插入两个转录盒。在GM-CSF(nt 3619)的ORF的末端引入AfeI位点。使用包含GE和GS序列的一对磷酸盐正义和反义引物来扩增IL-2ORF并且在AfeI位点插入。将来自包括GM-CSF和IL-2转录盒的得到的质粒中的SacII-PmlI片段换回质粒r73T中，产生p73T-P2。
图3A-3C显示出了具有修饰的FPCS的感染性的重组NDV病毒株73T(r73T)的回收，并且描绘体外F蛋白质切割和融合活性。图3A显示出如何将NDV 73T NP、P、L和抗原cDNA(p73T-lento或p73T-S116)在T7RNA聚合酶启动子和终止子的控制下进行克隆。将四个质粒共转染到RNA聚合酶表达细胞系中。将回收的病毒命名为r73T-lento或r73T-S116。将r73T-lento和r73T-S116用介质在有或没有胰蛋白酶增补的情况下在维洛细胞(Vero cell)中进行传代。r73T-lento的生长是胰蛋白酶依赖的，然而r73T-S116可以在没有胰蛋白酶增补的培养基中生长。为了评估在r73T-S116和转基因中的FPCS的遗传稳定性，将在P-M联接处具有或没有hGM-CSF的r73T-S116在没有补充胰蛋白酶的介质中以MOI 0.01在维洛和人类纤维肉瘤HT1080细胞中进一步传代持续10代。在FPCS中在第7代出现了突变(R113K和/或Q114M)，并且在第9代检测该S116R突变。在第10代时，对F、HN和转基因进行测序，并且没有另外的突变被发现。图3B和3C显示出F蛋白质切割位点(FPCS)突变对体外细胞融合和F蛋白质切割的作用。针对共表达两个转基因，GFP和NDVF或HN基因的质粒的构建，通过PCR扩增NDVF或HN基因的蛋白可读框，并且在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下克隆到质粒pVitro2-neo-MCS(英杰公司(Invitrogen))中。第二天，将293T 细胞以5x 105细胞/孔在6孔板上接种用于转染。图3B描绘的是细胞，这些细胞用2μg的NDVF质粒DNA转染一天，并且在用蛋白裂解缓冲液中获得用于蛋白质印迹分析(使用抗NDV F特异性多克隆抗血清)。并没有切割具有弱毒切割位点和S116的NDVF蛋白，仅仅检测了F0。如通过F1蛋白带的的外观所指示的，将R116和S116-KM的F蛋白进行部分切割。图3C显示出细胞，这些细胞是用不同F质粒以及wtHn质粒一起共转染的，并且这些细胞是通过荧光显微镜针对融合形成进行试验过。该wt F蛋白在融合形成中是最有效的。
图4是一个表，该表汇总了r73T-lento和r73T-S116衍生物的特征。a所有的病毒在P-M联接处包含hGM-CSF。b与FPCS-S116不同的FPCS中的氨基酸以下划线标出。c在36小时孵育后覆盖物中没有胰蛋白酶的维洛细胞中的并且在10倍放大倍数下可视化的噬斑形成。d蛋中的平均死亡时间(MDT)。e由脑内致病指数(ICPI)表示的在1日龄的无病原体鸡中NDV的致病性。在国家兽医服务实验室(National Veterinary Service Laboratories，NVSL)(埃姆斯，爱荷华州)进行ICPI测定。f在感染后72小时感染复数(MOI)为0.01的感染后，病毒对人类纤维肉瘤HT1080细胞的细胞毒性作用。通过将每个样品与被认为是100％能生存的未经治疗的细胞相比较来确定存活细胞的相对百分比。在表中存在的数据为死细胞的相对百分比。g在MOI为0.01的情况下在感染后在维洛细胞中生长的并且在37℃下在没有胰蛋白酶增补的OPTI-MEM中培养3-5天的病毒。h在鸡胚胎蛋中生长的病毒。将10-11日龄的鸡胚用1,000pfu的r73T感染。在37℃下孵育72小时后获得羊水。通过噬斑测定确定维洛细胞中感染性病毒滴度。
图5A和5B描绘的是使鸡中r73T-R116病毒毒力衰减的策略。图5A描绘的是在P-M联接(1)和HN-L联接(2)处插入转基因，以及通过插入非编码序列(3)来延长HN-L基因间区域。在P-M联接处插入转基因盒与在图2A中所示的一样。第二转基因盒包含L基因启动序列(GS；5'-ACGGGTAGA-3')、转基因的开放阅读框(ORF)、来自L基因的3’非翻译区的序列(斜体)和L基因末端序列(GE；5'-TTAAGAAAAAA-3)。用于延长HN-L联接的非编码序列取自1型副粘病毒(APMV-1)、呼吸道合胞体病毒(RSV)或与已知序列没有序列一致性或同源性的随机序列。插入序列可以在60-318nt的范围之内。在HN-L处插入第二转基因允许病毒表达两种转基因(例如，hGM-CS和GFP)。图5B描绘的是插入HN-L联接处的序列。
图6A是一个表，该表汇总了r73T-R116衍生物的特征。a所有的病毒在P-M联接处包含hGM-CSF。b如图5B所示在HN-L联接处插入的序列。c在36小时孵育后覆盖物中没有胰蛋白酶的维洛细胞中的并且在10倍放大倍数下可视化的噬斑形成。d蛋中的平均死亡时间(MDT)。e由脑内致病指数(ICPI)表示的在1日龄的无病原体鸡中NDV的致病性。在国家兽医服务实验室(NVSL)(埃姆斯，爱荷华州)进行ICPI测定。f在感染后72小时感染复数(MOI)为0.01的感染后，病毒对人类纤维肉瘤HT1080细胞的细胞毒性作用。通过将每个样品与被认为是100％能生存的未经治疗的细胞相比较来确定存活细胞的相对百分比。在表中存在的数据为死细胞的相对百分比。g在MOI为0.01的情况下在感染后在维洛细胞中生长的并且在37℃下在没有胰蛋白酶增补的OPTI-MEM中培养3-5天的病毒。h在鸡胚胎蛋中生长的病毒。将10-11日龄的鸡胚用1000pfu的r73T感染。在37℃下孵育72小时后获得羊水。通过噬斑测定确定维洛细胞中感染滴度。
图6B-6E是示图，这些示图显示出DF-1和维洛细胞中的重组NDV的生长动力学。将六孔板中的DF-1和维洛细胞以5.0(单循环，图6B和6C)或0.001(多循环，图6C和6D)的感染复数(m.o.i.)用每种指示的病毒进行感染。每隔10小时收集受感染细胞培养上清液，直至感染后50小时，并且通过噬斑测定来确定病毒滴度。
图6F和6G显示出DF-1细胞中病毒RNA和蛋白质合成。将DF-1细胞以5.0的m.o.i用每种指示的病毒来感染，孵育20小时，将总细胞内RNA进行提取用于RNA印迹分析(图6F)，并且针对蛋白质合成，通过蛋白质印迹法检验第二组受感染细胞(图6G)。RNA是在甲醛琼脂糖凝胶中通过电泳分离，转移到硝酸纤维素膜上，并且用对HN、NP、P、和L基因有特异性的生物素标记的RNA探针进行杂交。在L基因中正RNA探针被用来检测病毒基因组RNA。将总蛋白在SDS-PAGE上进行分离，并且用抗-NP、F、HN和L血清进行印迹。通过肌动蛋白特异性抗体来检测负载于凝胶上的总蛋白。在HN和L基因间序列之间具有198nt插入的重组NDV R116i在DF-1细胞中具有整体减少的RNA和蛋白质合成。
图6H和6I描绘的是维洛细胞中病毒RNA和蛋白质合成。图6H显示出RNA合成的RNA印迹分析。将维洛细胞以5.0的m.o.i用病毒进行感染，孵育20h，提取总细胞内RNA。RNA是在甲醛琼脂糖凝胶中通过电泳分离，转移到硝酸纤维素膜上，并且用对NP和L基因和正义L基因RNA有特异性的生物素标记的RNA探针进行杂交来检测基因组RNA。图6I描绘的是在感染的维洛细胞中病毒蛋白质合成的蛋白质印迹分析。将总蛋白在SDS-PAGE上进行分离，转移至硝酸纤维素膜，并且用抗-NP、F、HN和L血清进行印迹。通过肌动蛋白特异性抗体来检测负载于凝胶上的总蛋白。具有198nt插入的R116i病毒具有与S116和wt NDV相比减少的基因组RNA，但是大大提高的NP mRNA。L mRNA水平太低以致于不能区分。在维洛细胞中，L基因上游的蛋白质上调，但是L蛋白水平降低。
图6J和6K显示出通过蛋白质印迹分析在以低感染复数感染的DF-1和维洛细胞中比较蛋白质合成。将DF-1和维洛细胞以0.001的m.o.i用指示的每种病毒进行感染，孵育72h并且在蛋白裂解缓冲液中获得。将总蛋白在SDS-PAGE上进行分离，转移至硝酸纤维素膜，并且用抗-NP、F、HN和L血清进行印迹。通过针对肌动蛋白的抗体来检测负载于凝胶上的蛋白。在两种细胞系中L蛋白水平都降低了，然而，L基因上游的蛋白在DF-1细胞中下调，但是在维洛细胞中上调。
图6L显示出与F-1细胞相比在感染的人类细胞中病毒蛋白质合成。将人类HT1080、海拉细胞和DF-1细胞以5.0的m.o.i用指示的每种病毒进行感染，孵育20h并且在蛋白裂解缓冲液中获得。将蛋白在SDS-PAGE上进行分离，转移至硝酸纤维素膜，并且用抗-HN和抗-L血清进行印迹。在HN和L联接之间具有198nt插入的R116i的HN蛋白质表达在HT1080和海拉细胞中增加，但是在DF-1细胞中减少。L蛋白在所有三种被R116i-198或198RSV感染的细胞系中降低。
图7是示图，这些示图描绘的是r73T病毒在鸡胚中的生长动力学。为了确定r73T病毒的生长条件，在蛋中进行生长动力学研究。将鸡胚胎蛋用100、1000、10,000或100,000PFU/蛋的指示的病毒进行感染，并且孵育2、3或4天(73T wt，左上；R116，右上；R116i-318，中左；R116i-198-RSV，中右；R116i-198-随机，左下；S116-KM，右下)。获得尿囊液并且通过FFA确定病毒滴度。接种100FFU/蛋在第1天具有低滴度，但是在第2天达到了峰值滴度。总之，无论接种使用的剂量是多少，大多数病毒在第2天达到了约8logs/mL的峰值滴度。R116i-198具有最低滴度，低接种量在第2天产生最高产量，指示可能存在缺陷颗粒的积累。R116i-318-APMV-插入也具有约7logs的较低峰值滴度。R116i-198-RSV达到了7.5logs的峰值滴度。由反向遗传再衍生的S116在蛋中没有减少病毒的产生。因此，在R116衍生物中，就在蛋中的生长特性而言，具有RSV-198nt插入的病毒是优先溶瘤病毒候选者。
图8是示图，这些示图描绘的是r73T病毒在维洛细胞中的生长动力学。还在无血清的维洛细胞克隆51D11(由医学免疫公司(MedImmune)产生的专有的细胞系)中评估了病毒。所有的病毒都在两种moi条件(0.001，上；0.0001，下)下同样良好复制。73TFPCS的修饰和在R116的HN-L联接中的基因间插入并没有影响病毒在维洛细胞中生长。
图9A-9D显示出与非赘生性细胞相比，r73T病毒在肿瘤细胞中选择性复制，并且具有针对肿瘤细胞的细胞毒性。在用r73T衍生物以范围从1至100,000PFU内的不同剂量感染持续72小时后获得数据。图9A是一个示图，该示图显示出，相对于未治疗的对照细胞，针对于在人类纤维肉瘤HT1080中的细胞杀死，rT3T及其衍生物的评估。在HT1080癌细胞中，具有弱毒FPCS的病毒具有最少的杀死，处于FPCS处的S116是中等，并且在FPCS处具有R116的病毒具有与r73T wt病毒一样有效的细胞杀死。图9B是一个示图，该示图显示出，相对于未治疗的对照细胞，针对于在正常人皮肤成纤维细胞CCD1122Sk细胞中的细胞杀死，rT3T及其衍生物的评估。在正常CCD1122SK细胞中，所有的病毒并没有与癌细胞一样有效杀死细胞，伴随着约100倍杀死效率的降低。无论何种FPCS序列，所有病毒在正常细胞中具有相似的杀死，可能由于单周期的复制(没有病毒传播)。图9C是表，该表显示出在癌细胞和正常细胞中的细胞杀死效率，表达为使用Prism 6.0的从剂量反应曲线内推的50％有效浓度(EC50)。R116衍生物与具有10PFU的EC50的r73T wt拥有类似的EC50值，指示FPCS的修饰并没有影响病毒在癌细胞中的复制以及细胞杀死效率。图9D是一个示图，该示图显示出在感染后第3天以MOI 0.01在HT1080和CCD1122SK细胞中的病毒复制。所有的病毒优先在癌细胞而不是在正常细胞中复制，伴随着约1.5-2.0logs的差异。
图10A和10B是示图，这些示图显示出当局部和全身给予后，r73T衍生物在肿瘤消退方面是有效的。为了评估体内溶瘤活性，HT1080异种移植模型是通过以5x 106细胞/0.1ml的浓度经皮下将HT1080细胞注射到5-6周龄的Balb/C无胸腺裸鼠中来形成。图10A是示图，该示图显示出瘤内地(it)或经静脉内(iv)给予的R116i-318-hGM-CSF的作用。数据显示出当经全身或瘤内递送至携带人类肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠时，R116i-318-hGM-CSF衍生物具有体内抗肿瘤活性。在治疗与对照组之间比较肿瘤生长速率。由两种给予途径诱导的肿瘤消退都与对照组显著不同。当肿瘤体积达到约65mm3时，将小鼠随机分配到所指示的组(n＝10)中。小鼠接受了单次剂量的向瘤内(IT)给予的PBS或2x 107Pfu的r73T-hGM-CSF-R116i-198或通过尾静脉注射经静脉内(IV)给予1x108PFU。*P<0.05，不成对学生t检验。图10B是示图，该示图在 HT1080异种移植物中通过IV注射1x 108PFU，比较了r73T衍生物的溶瘤活性。两剂量的r73T衍生物能够诱导具有不同程度效果的显著肿瘤消退。r73T-lento在肿瘤消退中是效果最差的，然而r73T wt在肿瘤消退中是最有效的。r73T-lento与S116病毒具有相似的作用，虽然S116病毒在体外细胞杀死方面具有低10倍的EC50(参见图9A)。第2次给药后直到9天(肿瘤植入后第19天)，r73T-R116i-318在抑制肿瘤生长方面与73T wt一样有效，肿瘤在R116i治疗过的小鼠中又恢复生长，但是在73T wt治疗组中没有。当肿瘤体积达到约180mm3时，将小鼠随机分配到组(n＝7)中。小鼠接受了通过IV给予的PBS或1x 108PFU的r73T-hGM-CSF-lento(lento)或r73T-hGM-CSF-S116K113M114(S116KM)或r73T-hGM-CSF-R116i-318nt APMV-N(R116i)或r73T-hGM-CSF(r73Twt)。每3-4天测量肿瘤大小。*P<0.05，不成对学生t检验。数据显示出当经全身或瘤内递送至携带人类肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠时，r73T衍生物具有体内抗肿瘤活性。F蛋白的有效的切割针对体外和体内病毒复制是十分重要的。在FPCS处具有R116的病毒在体外和体内的细胞杀死中更为有效。
图11A-G描绘的是在静脉输送之后r73T衍生物的组织生物分布和小鼠与人类GM-CSF对肿瘤生长抑制的作用。为了确定溶瘤的NDV病毒是否在肿瘤组织中选择性复制，确定在不同器官中的病毒清除、病毒分布。将荷有约250mm3大小的皮下HT1080肿瘤的无胸腺裸鼠以1x 108PFU的剂量用R116i(r73T-hGM-CSF-R116i-318ntAPMV-N)经静脉进行治疗，并在第1、4或8天中，且处死(每时间点n＝3)。收集血清、肺、脾、卵巢和肿瘤，并且将病毒的存在进行量化。在感染后的第1、4和8天评估肿瘤和器官中的病毒复制。图11A是示图，该示图描绘了通过在维洛细胞中噬斑测定量化了组织中的病毒。仅在第1天检测器官中病毒(在所有的时间点都没有检测卵巢中的病毒，无数据显示)，并且在肿瘤组织中负荷的病毒比肺和脾高出约100倍。在肿瘤中病毒的存在持续了至少8天，指示出病毒在肿瘤组织中选择性复制。
图11B是示图，该示图描绘的是通过hGM-CSF转基因表达的ELISA测定，由组织中病毒表达的GM-CSF的量化。与通过噬斑测定获得的病毒复制数据一致，hGM-CSF的水平是最高的，并且在肿瘤组织中持续超过8天。这些数据证实，NDV病毒在肿瘤组织中有效复制，并且转基因有效递送至局部肿瘤组织。
图11C描绘的是示图，这些示图显示出在HT1080异种移植小鼠肿瘤模型中mGM-CSF表达对肿瘤生长抑制的作用。将各每组(每组七只)中的5-6周龄的无胸腺裸鼠用5x106Ht1080细胞在右胁经皮下(s.c.)植入。当肿瘤达到110mm3的体积时(第6天)，将肿瘤用单次剂量的1x 108pfu rNDV，具有mGM-CSF或hGM-CSF的R116i-198RSV，进行感染。每3-4天测量肿瘤大小。具有mGM-CSF的R116i-198RSV在肿瘤生长抑制方面比hGM-CSF转基因效果较差。然而，针对具有hGM-CSF或mGM-CSF的S116，在肿瘤生长抑制方面没有观察到差异。
图11D描绘的是示图，这些示图显示出在HT1080异种移植小鼠肿瘤模型中mGM-CSF对来自肿瘤的病毒清除的作用。将各组(每组三只)中的无胸腺裸鼠用5x 106Ht1080细胞在右胁经皮下(s.c.)植入。当肿瘤达到180mm3的体积时(第10天)，将小鼠用一次剂量为1x108pfu的R116i-198RSV或S116KM经静脉内治疗。在第4或7天收集肿瘤，并且通过噬斑测定来确定肿瘤组织中的病毒滴度。在第4天，具有mGM-CSF或hGM-CSF的R116i-198RSV和S116KM都具有可比较的滴度。在第7天，具有mGM-CSF的R116i-198RSV与具有hGM-CSF的R116i-198RSV相比大大减少。相比而言，S116mGM-CSF和hGM-CSF的滴度是具有可比性的。
图11E描绘的是示图，该示图显示出在HT1080异种移植小鼠肿瘤模型中R116i-198RSV或S116KM感染对免疫细胞浸润到肿瘤中的作用。将各组(每组三只)中的无胸腺裸鼠用5x 106Ht1080细胞在右胁经皮下(s.c.)植入。当肿瘤达到180mm3的体积时(第10天)，将小鼠用一次剂量为1x 108pfu的所指示的病毒经静脉内治疗。在第四天，收集肿瘤，并且通过FACS分析针对嗜中性细胞、NK细胞和巨噬细胞染色处理这些组织。R:R116i-198-RSV，S:S116-KM。具有mGM-CSF的R116i-198RSV具有更多的免疫细胞浸润。
图11F描绘的是表，该表显示出在HT1080异种移植小鼠肿瘤模型中细胞因子和趋化因子上调。将各组(每组三只)中的无胸腺裸鼠用5x 106Ht1080细胞在右胁经皮下(s.c.)植入。当肿瘤达到180mm3的体积时(第10天)，将小鼠用一次剂量为1x 108pfu的具有hGM-CSF或mGM-CSF的R116i-198RSV或S116KM经静脉内治疗。在第四天，收集肿瘤，并且通过路明克斯(Luminex)分析针对细胞因子和趋化因子的水平处理这些组织。在局部肿瘤组织中，病毒感染诱导细胞因子和趋化因子产生，其水平基于病毒骨架和人类或小鼠GM-CSF而变化。
图11G描述的是示图，该示图显示出在HT1080异种移植小鼠肿瘤模型中R116i-198RSV-hGM-CSF和R116i-318APMV-hGM-CSF在肿瘤生长抑制方面是具有可比性的。将各组(每组七只)中的无胸腺裸鼠用5x 106Ht1080细胞在右胁经皮下(s.c.)植入。当肿瘤达到约110mm3体积时(第6天)，将以1x 108pfu的单次剂量的病毒瘤内地注射。每3-4天测量肿瘤大小并且作图。198nt和318nt的插入长度并没有影响R116i溶瘤活性。
图12A和图12B描绘的是含有嵌合的F和/或HN基因的73T的反基因组cDNA的构建及其特征，并且图12C比较了RNA聚合酶复合物活性的功能。在鸡中，针对免疫原性和毒力，病毒表面糖蛋白是重要的抗原。NDV的F和/或HN基因被其他副粘病毒的相应的胞外(ecto)域替代，该副粘病毒单独或组合地在鸡中非强毒。副流感病毒5(PIV 5)是犬副粘病毒并且并不引起人类疾病，并且已经显示鸽1型副粘病毒(PPMV-1)在鸡中非强毒。图12A显示出全长反基因组NDV 73T cDNAs的F和/或HN糖蛋白胞外结构域被PPMV-1和/或PIV5的那些替代。分别用着色为蓝色、紫色或绿色的盒指示NDV、PIV5、和PPMV-1序列。指示了个别蛋白质或蛋白结构域的氨基酸的长度。图12B是表，该表显示出含有嵌合的F和/或HN基因的73T衍生物的表征。在维洛中噬斑形成，相对的HT1080细胞杀死和MDT入之前描述的进行。嵌合的病毒，除PVI-5F-HN之外，都进行了回收并且在外源胰蛋白酶不存在的情况下在细胞中进行生长。所有三种病毒都形成了相当大的噬斑，并且显示出有效的细胞至细胞的扩散。PPMV-1F-HN或F嵌合的病毒分别具有79和84小时的MDT值，指示在鸡中的潜在的毒力。两种PMI-1嵌合的病毒以71％和61％的水平有效地杀死了HT1080细胞。PIV5-F嵌合体并没有在蛋中生长，并且在鸡中非强毒，但是以47％杀死了HT1080细胞。通过中和测定使用从小鼠中收集的血清检测在NDV和PPMV-1或PIV5嵌合体之间的血清交叉反应性，该小鼠用2次剂量的1x 108PFU的r73T-R116i进行IV给予。r73T病毒可以通过NDV感染的血清(滴度960)来中和，然而该PPMV-1和PIV5嵌合体并没有被中和(滴度<4)，确认在NDV和PPMV-1或PIV5之间没有交叉反应性。具有不同抗原性的嵌合病毒可以增加在先前NDV治疗过程中已经形成抗NDV免疫应答的患者中的溶瘤病毒。
图12C显示出通过微型基因组测定与其他副粘病毒比较NDVRNA聚合酶活性。使用Lipofectamine 2000的，将T7表达细胞用三种表达NDV的NP、P、L蛋白的质粒和编码NDV反微型基因组cDNA(编码GFP基因)的质粒，或编码麻疹病毒(MV)或呼吸道合胞体病毒(RSV)的N、P、L基因的质粒和各自的RSV或MV GFP反微型基因组cDNA质粒来转染。转染后的两天或三天，在荧光显微镜下如通过表达GFP所指示检查微型基因组复制。与麻疹病毒和RSV相比，NDV具有最强聚合酶活性。
图13A和B显示出癌细胞系对rNDV变体的敏感性。将来自各种源组织的癌细胞系以0.1的MOI用NDV S116或NDV R116i进行感染，并且在感染后72小时使用细胞滴度Glo(CellTitre Glo)评估细胞生活力。对NDV的敏感性定义为在感染后72小时大于30％细胞杀死。图13A描绘的是在至少16个广泛的适应症中NDV敏感的人类癌细胞系的百分比的示图。每个组内的细胞系数目以数值并且在表中表示。图13B描述的是22个癌细胞系对NDV变体的敏感性的示图。细胞杀死％确定为未治疗的对照细胞的百分比。
图14是示图，这些示图显示出癌细胞系对recNDVGM-CSF的许可性。图14中呈现了代表性肿瘤细胞系中R116i-GM-CSF的细胞杀死。相对于以0.1的MOI的未感染的对照，在感染肿瘤细胞系后3天确定最大杀死％。尽管某些细胞系衍生自相同肿瘤类型，如膀胱癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和肺癌，但是它们显示出对病毒杀死的不同敏感性。在表1中汇总了来自每个肿瘤适应症的细胞系的数目，这些细胞系可以被R116i-GM-CSF以>50％的比率杀死。
图15A-F是示图，这些示图显示出在不同小鼠癌症模型中NDV衍生物抑制肿瘤生长。图15A和B是示图，这些示图显示出在同系小鼠黑色素瘤模型(B16F10AP3)中recNDVGM-CSF病毒株抑制肿瘤生长。在试点研究中，在B16黑色素瘤模型中，针对其溶瘤作用，评估73T-R116i-hGM-CSF(图15A左)和R116i-mGM-CSF(图15A右)。因为进行评估B16小鼠中的病毒耐受性，所以该组规模很小(n＝3)。每种病毒以2x 107pfu在第11和14天两次经静脉内(i.v)给予；以2x 107pfu在第11和14天两次向腹膜内(i.p)给予；或以1.1x 107pfu在第11天一次向瘤内(i.t)给予。与未处理的组相比，通过三种给予途径用R116-hGM-SCF或mGM-SCF治疗的组具有更慢的肿瘤生长速率。肿瘤抑制率与对照组相比具有统计学意义。
图15B显示出在向瘤内给予1x 108pfu的S116NDV变体的B16F10同系鼠黑色素瘤模型中的效率研究。在左图上显示出了肿瘤生长抑制，并且在中间图上显示出了个体的动物测量值，并且在右侧显示出了存活图。
图15C显示出NDV在具有免疫能力的小鼠CT26结肠直肠肿瘤模型中具有有效的抗肿瘤活性。具体地而言，图15C提供了在向瘤内给予1x 108pfu的编码人类GM-CSF的S116NDV变体的CT26同系鼠结肠直肠模型中的效率研究。在右图上显示出了肿瘤生长抑制，并且在具有H&E和NDV染色的右手侧上显示出了剩余肿瘤的IHC分析。指示了坏死区域、多核合胞体的证据和肿瘤的有活性的区域。
图15D-F描绘的是在卵巢异种移植模型中的肿瘤生长抑制。将无 胸腺裸鼠用Ovcar4细胞在右胁经皮下(s.c.)植入。当肿瘤达到100mm3的体积时，将小鼠随机分配到治疗组中。将形成的肿瘤用2.5x 107pfu rNDV，具有mGM-CSF或hGM-CSF的R116i-318，每周注射一次。 显示出肿瘤生长曲线(图15D)和肿瘤的组织学分析(图15E和图15F)。
图16是表，该表汇总了NDV构建体的特征。在36小时孵育后 覆盖物中没有胰蛋白酶的维洛细胞中的并且在10倍放大倍数下可视 化的噬斑形成。感染复数(MOI)为0.01的感染后在感染后72小时， 病毒对人类纤维肉瘤HT1080细胞的细胞毒性作用。通过将每个样品与被认为是100％能生存的未经治疗的细胞相比较来确定存活细胞的 相对百分比。在表中存在的数据为死细胞的相对百分比。由脑内致病 指数(ICPI)表示的在1日龄的无病原体鸡中NDV的致病性。在国 家兽医服务实验室(NVSL)(埃姆斯，爱荷华州)进行ICPI测定。
图17是示图，该示图显示出从蛋和人细胞系产生的NDV展现出 对补体介导的失活的不同敏感性。将具有确认补体(C’)活性的人类 血清(西格马(Sigma)，圣路易斯，密苏里州)用PBS连续稀释， 并且在针对噬斑测定来感染维洛细胞之前与100pfu的NDV在37℃ 下孵育1小时。在37℃下孵育6小时之后，通过龙胆紫染色使噬斑 可视并且评分。在鸡胚中生长的病毒通过以1:10至1:40的血清稀 释大部分是失活的。293-生长的病毒比蛋-生长病毒对C’更有抵抗力， 以1:40的血清浓度仍有约40％感染性保留。然而，海拉-生长的病毒 对C’介导的病毒失活是最有抵抗力的。以1:40的血清浓度90％活病 毒是具有感染性的。
图18A和18B是蛋白质印迹，这些蛋白质印迹显示出在293和 海拉细胞和在从这两种细胞系中生产的病毒中RCA蛋白水平的比较。 针对图18A，将等量的293和海拉S3细胞负载到SDS-PAGE上用于 蛋白质印迹。海拉细胞比293细胞包含更高水平的hCD46、hCD55和hCD59蛋白。图18B显示出蛋白质印迹，该蛋白质印迹进行以检验来 自感染的293或海拉细胞的病毒中的蛋白量。未感染的细胞(模拟) 充当对照。在来自感染的海拉细胞的病毒中检测到三种CD分子，高 于来自293细胞的那些的水平。
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图19显示出膜结合的C’调节因子(RCA)蛋白在C’介导的病毒失活中的评估。编码hCD55、hCD59和hCD46的cDNA是由傲锐东源归属(Origene)(罗克维尔市，马里兰州)或金斯瑞归属(Genscript) (皮斯卡塔韦，新泽西)合成的。将每个基因盒插入NDV反基因组cDNA的P-N基因间区域，并且重组病毒是通过反向遗传学产生的。该重组病毒在蛋中扩增，并且以15％-60％蔗糖梯度进行纯化，并且将病毒带通过超速离心沉淀。重组NDV对每种RCA蛋白的表达通过蛋白质印迹法来确认。
图20是示图，该示图显示出CD55是用于防止NDV的C’失活的主要RCA蛋白。具有hCD46、hCD55或hCD59的NDV在蛋中扩增，通过蔗糖梯度来纯化，用从1:10至1:40稀释的人血浆孵育1小时，并且将病毒感染性通过在维洛细胞中噬斑测定来检验。与在海拉细胞中产生的NDV相比，在蛋中产生的具有hCD55的NDV对C’具有相似的抗性，在1:20的血浆浓度下为约65％有活性病毒以及在1:40的血浆浓度下为约80％有活性病毒。hCD46显示出轻微或略微改进对C’介导的失活的病毒抗性，与NDV对照相比，当用1:40稀释的人血浆一起孵育时，多出约20％有活性病毒。在更低的血浆稀释时没有检测到差异。
发明详述
本发明特点是包括减毒的新城疫病毒的组合物和使用那种病毒用于治疗瘤形成的方法。
本发明至少部分基于具有减轻的鸡毒力的溶瘤NDV的发现。剧以下更详细报道，NDV 73T病毒株衍生自NDV MK-107，该NDV Mk-107是于1948年首次上市的商业家禽疫苗(中等毒力)。NDV Mk-107病毒株在埃利希腹水瘤细胞中经过73代仍然保持(卡塞尔(Cassel)等人，癌症(Cancer)，1965年7月；18:863-8)。NDV Mk-107在20世纪70年代被用于一系列的PhI和Ph II临床研究。NDV Mk-107还在20世纪80年代被用作一种免疫疗法来治疗晚期黑色素瘤患者(卡塞尔等人，癌症，19831；52:856-860；默里(Murray)等人，癌症，1977，40:680-686)。
为了产生具有减轻的鸡毒力的溶瘤NDV，重组NDV 73T病毒株包括某些遗传修饰。具体地而言，改变F蛋白质切割序列，并且增加HN-L基因间序列的长度。有利的是，修饰的病毒可以被用来表达感兴趣的转基因。在一个实施例中，NDV 73T病毒株包括一种编码多肽的转基因，该多肽增强了重组NDV的溶瘤特性。在另一个实施例中，NDV 73T病毒株包括编码生物标志的转基因，该生物标志提供了用于监测病毒复制的读数。如果需要，可以修饰NDV73T病毒株来掺入另外的遗传信息，该遗传信息破坏了标准基因组的正常转录极性，并且有望进一步降低鸡中病毒毒力。因此，本发明提供了使用反向遗传学产生的重组新城疫病毒(NDV)，来降低其在鸡中的发病机理，同时保持其选择性癌细胞杀死能力，以及产生此病毒的方法。本发明还提供了NDV作为病毒载体来递送和表达用于增强癌症治疗的异源基因产品的构建和用途。本文以下描述了编码示例性治疗剂的转基因，该治疗剂可以由NDV来递送。在本文以下描述的工作实施例中，表达粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的新颖的NDV病毒构建体选择性杀死癌细胞，但是并没有杀死正常细胞。当在异种移植HT1080肿瘤模型中测试时，在多个癌细胞系中连同体内观察到为了这种选择性癌细胞杀死作用。还在黑色素瘤模型中证实了重组减毒的新城疫病毒(NDV)的功效和选择性，其中观察到肿瘤消退。总之，本发明提供了一种或多种特异性转基因到重组减毒NDV载体的插入，以及在肿瘤环境中编码蛋白的有效表达。
新城疫病毒
新城疫病毒(NDV)是一种包含线性、单股、非节段的、反义RNA基因组的有包膜病毒。NDV的反义、单股的基因组编码RNA指导的RNA聚合酶、融合(F)蛋白、血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白、基质蛋白、磷蛋白和核蛋白。基因组RNA包含以下顺序的基因：3'-NP-P-M-F-HN-L。本文以下更详细的描述了NDV RNA基因组的构造。基因组RNA还在3'端包含前导序列。
病毒粒子的结构元件包括病毒包膜，该病毒包膜是衍生自细胞质膜的脂双层。糖蛋白，血凝素-神经氨酸酶(HN)，从包膜突出，允许病毒包含血凝素和神经氨酸酶活性。作为膜内在蛋白质的融合糖蛋白(F)，是首先作为无活性前体产生的，然后在翻译后切割，以产生两个二硫键连接的多肽。该活性F蛋白涉及通过促进病毒包膜与宿主细胞质膜的融合来使NDV侵入宿主细胞。基质蛋白(M)涉及病毒装配，并且与病毒膜连同核壳蛋白相互作用。
核壳的主要蛋白质亚基是在衣壳上赋予螺旋对称的核壳蛋白(NP)。与核壳相关联是P和L蛋白。受到磷酸化作用的磷蛋白(P)被认为在转录中发挥了调节的作用，并且还可能涉及甲基化、磷酸化和多聚腺苷酸化。针对病毒RNA合成，需要编码RNA依赖型RNA聚合酶的L基因与P蛋白一起。L蛋白，该L蛋白占据了病毒基因组的近一半的编码容量，是病毒蛋白中最大的，并且在转录和复制中发挥了重要作用。
包括NDV的所有负链RNA病毒的复制，由于复制RNA需要的细胞机器的缺失而复杂化。此外，负链基因组不能直接翻译成蛋白，而是必须首先转录成正链(mRNA)拷贝。因此，当进入宿主细胞时，单独的基因组RNA不能合成所需要的依赖RNA的RNA聚合酶。当感染时，L、P和NP蛋白必须与基因组一起进入细胞。
在不受限于理论的情况下，假设转录NDV mRNA的大部分或所有的病毒蛋白都也进行复制。对蛋白的相同补体的其他用途进行调节(即，转录或复制)的机制尚未明确。紧随病毒侵入之后，转录是通过L蛋白使用核壳中的反义RNA作为模板来起始的。调节病毒RNA合成，这样使得它在转录过程中产生单顺反子mRNA。在转录之后，病毒基因组复制是当负链RNA病毒感染细胞后发生的第二事件。如同其他负链RNA病毒一样，新城疫病毒(NDV)的病毒基因组复制是由病毒特异性蛋白来介导的。复制的RNA合成的第一个产物是NDV基因组RNA(cRNA)的互补的拷贝(即，加极性)。这些加链的拷贝(反基因组)与加链mRNA转录物在其末端结构中不同。与mRNA转录物不同，反基因组cRNA在5'末端并没有加帽和甲基化，并且在3'末端并没有截短和多腺苷酸化。cRNA与其负链模板是共终端的，并且在每个互补形式的基因组RNA区段中包含所有的遗传信息。针对NDV负链病毒基因组的合成，cRNA充当模板。
NDV负链基因组(vRNA)和反基因组(cRNA)都是通过核壳蛋白壳体化的；唯一未壳体化的RNA种类是病毒mRNA。针对NDV，细胞质是病毒RNA复制的场所，正如它是转录的场所。病毒组分的装配可能发生在宿主细胞质膜。然后成熟的病毒通过出芽从细胞中释放。
溶瘤病毒
已知病毒对肿瘤细胞施加了溶瘤作用，并且已经报道了溶瘤病毒作为治疗剂的用途。在治疗癌症患者中已作出一些努力以使用针对其天然宿主展现出中等至高度致病性的非人类病毒。本发明披露了在人类受试者中用于诱导肿瘤消退的方法，该方法利用具有修饰的F蛋白质切割位点的新城疫病毒(NDV)的修饰的中等毒力病毒株，该病毒株对家禽是不致病的(弱毒力)，但是展现出溶瘤特性。披露的方法提供了安全、有效和可靠的手段在对其需要的个体中来诱导肿瘤消退。这些方法克服了使用病毒的致病病毒株用于人类疗法的缺点。
因此，在一方面，本发明提供了一种用于在受试者中诱导肿瘤消退的方法，该方法包括向受试者给予药用组合物的步骤，该药用组合物包括治疗有效量的NDV的弱毒力溶瘤病毒株。根据一个实施例，NDV的弱毒力溶瘤病毒株是NDV r73T-R116。
溶瘤病毒能够在体外和体内对肿瘤细胞施加细胞毒性或杀死作用，伴随着对正常细胞很小的作用或没有作用。术语“溶瘤活性”是指靶向肿瘤细胞的病毒的细胞毒性或杀死活性。不希望受任何作用机制约束，由NDV的低毒力病毒株(例如，r73T-R116)施加的溶瘤活性，可能主要是由于细胞凋亡和较少程度由于质膜溶解，后者伴随有活性子代释放进入细胞环境，随后感染相邻的细胞。不希望受具体理论约束，据信NDV对癌细胞具有直接的细胞溶解活性。还据信，NDV能够从正常的、健康的细胞确切地分化癌细胞。结果已经指示，已知向癌细胞赋予恶性行为的若干癌基因(H-ras、N-ras、和N-myc)通过NDV提高了细胞对杀死的敏感性。参见，洛伦斯(Lorence)，R.M.，赖卡德(Reichard)，K.W.，卡西诺(Cascino)，C.J.等人，(1992)，美国癌症研究协会学报(Proc.Am.Assoc.Cancer Res.)，33,398；赖卡德(Reichard)，K.W.，洛伦斯，R.M.，卡西诺，C.J.等人，(1992)外科论坛(Surg.Forum)，43,603-606。此外，已经观察到用视黄酸(维生素A)处理细胞也提高了NDV对癌细胞溶解。赖卡德，K.W.，洛伦斯，R.M.，卡都比格(Katubig)，B.B.等人，(1993)，小儿外科杂志(J.Pediatr.Surg.)，28,1221。
在体外或体内条件下细胞毒性作用可以通过本领域已知的各种手段检测，例如，通过抑制细胞增殖，通过使用钆增强的MRI扫描检测肿瘤大小，通过放射性标记肿瘤，以及诸如此类。
针对临床研究，令人希望的是要获得克隆的病毒以便确保病毒的同源性。可以根据技术人员可使用的任何方法生产克隆的病毒。例如，可以通过有限稀释法或通过噬斑纯化生产克隆的病毒。
NDV培养
本发明中使用的病毒可以通过多种方法制备。例如，NDV可以在8至10日龄的受精的鸡蛋中制备(从伊利诺斯州，罗诺克，SPAFAS公司获得)。分离病毒的方法在本领域中是已知并且描述过的，例如，由韦斯(Weiss)，S.R.和布拉特(Bratt)，M.A.，(1974)病毒学杂志(J.Virol)，13,1220-1230。在以下实例#1中进一步描述了该方法。使用这种分离方法，可以获得约90％-95％纯的NDV。
可替代地，可以在体外细胞培养中制备病毒。优选地，细胞培养包括哺乳动物细胞，并且更优选地，可以将细胞用于病毒生产如维洛细胞。病毒将通过色谱仪或其他适当的方法来纯化。这些细胞可以是贴壁依赖的或无贴壁依赖的。
可以在病毒制备中使用的细胞培养技术是本领域中已知的，并且可以包括具有大表面面积的静置培养烧瓶或罗拉式烧瓶的使用。优选地，所选择的培养系统的类型可以支持相对大量的细胞。为了生产大量的病毒，将部署生物反应器方法，而细胞在微载体珠中生长用于病毒感染和生产。
可以在病毒生产中使用的细胞培养介质对本领域技术人员是已知的。介质典型包括营养源、抗生素和白蛋白或包含一种或多种生长因子的血清源。在本领域的技术内选择适用于培养中使用的细胞的具体介质和介质组分。在某些实施例中，胰蛋白酶包括在生长介质中。在其他实施例中，不包括胰蛋白酶。
培养条件典型地包括在所希望的温度(如37℃)下孵育，连同选择的氧和二氧化碳的浓度。可以根据在培养中使用的细胞，确定选择的具体培养条件，并且此类条件的确定是在本领域的技术之内。
将细胞置于培养瓶中，并且允许在选择的培养条件下孵育和生长。优选地，允许贴壁依赖性细胞生长至汇合或峰值生长。生长需要的时间将取决于添加至培养瓶的原始细胞接种物的量和使用的细胞的倍增时间而变化。优选地，每cm2铺板约3×103至约3×105细胞并且生长持续一至五天。针对细胞培养的病毒接种，从细胞中去除介质(针对粘附细胞，通过抽吸培养介质；针对在混悬液中生长的细胞，通过离心细胞混悬液并且抽吸细胞上清液)，并且将病毒(在重构之后)添加至在最小体积的介质或盐溶液(如汉克氏(Hank's)平衡盐溶液，吉布科公司(Gibco))中的细胞中，以防止脱水。优选地，这一体积范围从约10至约2500微升/cm2培养瓶表面面积或105细胞。病毒接种物的优选的稀释范围从约0.001至约10感染单位/细胞，最适比取决于具体的病毒和细胞系。然后病毒从1至7天生长，时间长度主要由剩余生存的细胞系确定。针对NDV，最优的收获时间是在病毒接种后的1至5天。
然后该病毒可以通过以下来获得：去除上清液并且将其用新鲜的介质或具有新鲜细胞的新鲜的介质以12至48小时的时间间隔来替换，或通过冻融这些细胞在上清液中释放病毒。然后可以离心和超速离心上清液以相对纯的形式或通过层析方法回收病毒。病毒制备的纯度可以通过蛋白质含量测定法和/或通过电泳来测试。然后可以如进一步以下所述将病毒添加至药学上可接受的载体。
疗法
可以在能进行癌症疗法的任何地方提供疗法：在家、医生的办公室、诊所、医院门诊部、或医院。在一个实施例中，本发明提供了新城疫病毒(NDV)的用途(例如，r73T-R116)。
一般在医院开始治疗，使得医生可以接近地观察疗法的效果并且做出任何需要的调整。疗法的持续时间取决于要治疗的癌症种类、患者的年龄和病况、患者的疾病的阶段和类型、以及患者的身体响应治疗。可以按不同的间隔(例如每天、每周、或每月)进行给药。可以按包括休息时段的断续周期给予疗法，使得患者的身体具有构建健康新细胞并且重新获得力量的机会。
取决于癌症的类型及其发展阶段，可以使用疗法减缓癌症扩散，减缓癌症的增长，杀死或停止可能从原始肿瘤扩散至身体其他部分的癌细胞，减轻由癌症引起的症状，或者防止原位的癌症。癌症生长是不受控制的并且是进行性的，并且在不引发正常细胞的扩增或将引起正常细胞的扩增停止的条件下发生。
如上所述，如果希望，用本发明的组合物进行治疗可以联合用于治疗增生性疾病的疗法(例如放射疗法、外科手术、或化学疗法)。
药物组合物的配制
给予本发明的用于治疗肿瘤的病毒(例如，r73T-R116)可以通过任何适合的手段，该给予导致治疗学的浓度，该浓度与其他组分结合，有效预防、缓解、或减小肿瘤。该试剂可以任何合适量地包含于任何合适的载体物质中，并且总体上以该组合物总重的1％-95％(按重量计)存在。该组合物可以是以一种适合于肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌肉内、或腹膜内)给药途径的剂型来提供。这些药物组合物可以根据常规药物惯例进行配制。(参见，例如，雷明顿：药学技术与实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)(第20版编辑)，编辑，A.R.真纳罗(Gennaro)，利平科特威廉姆斯(Lippincott Williams)&威尔金斯(Wilkins)，2000，和制药工艺学百科全书(Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology)，编辑，J.斯沃布里克(Swarbrick)和J.C.博伊兰(Boylan)，1988-1999，马塞尔·德克尔(Marcel Dekker)，纽约)。
根据本发明的这些药物组合物可以配制成在给药时基本上立刻释放出该活性化合物或者在给药后任何一个预定的时刻或时间段释放出该活性化合物。后一种类型的组合物一般被称为控制释放配制品，它包括(i)在身体内在较长的时间内产生一个基本上恒定的药物浓度的配制品；(ii)预定的滞后时间后，在身体内在较长的时间内产生一个基本上恒定的药物浓度的配制品；(iii)配制品，其在一段预定的时间期间，通过维持身体内相对恒定有效的水平，同时相伴的与该活性物质的血浆水平波动(锯齿动力学模式)相关的不希望的副作用最小化，来维持作用；(iv)配制品，其通过，例如，控释组合物与肉瘤相邻或在其中的空间放置来定位作用；(v)允许方便给药，使得，例如，每一个或两个星期给药一次的配制品；以及(vi)配制品，通过使用载体或化学衍生物靶向增生的赘生性细胞以递送该治疗剂至肉瘤细胞。对于某些应用而言，控释配制品排除了对在白天频繁给药以维持血浆水平于治疗水平的需要。
可以遵循许多策略中的任何一个，以便获得其中释放速率大于所谈论的化合物的代谢速率的控释。在一个实例中，控释通过对各种配制参数和成分的合适选择来获得，包括，例如，不同的控释组合物和包衣类型。因此，将该治疗剂与合适的赋形剂配制为一种给药时以受控方式释放该治疗剂的药物组合物。实例包括单或多单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳剂、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、膏药、以及脂质体。
本发明的组合物可以在药学上可接受的稀释剂、载体、或赋形剂内，以单位剂型来给予。可以使用常规药物惯例来提供适合的配制品或组合物，来向患有由细胞增殖过度引起的疾病的患者给予化合物。给予可以在患者有症状之前开始。
可以使用任何适合的给予途径，例如，给予可以是肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、瘤内、肌内、颅内、眼眶内、眼睛、心室内、肝内、囊内、鞘内、脑池内、腹膜内、鼻内、喷雾、栓剂、或口服给予。例如，治疗配制品可以处于液体溶液或悬浮液的形式；针对口服给予，配制品可以处于片剂或胶囊剂的形式；并且针对鼻内配制品，处于散剂、滴鼻剂、或气雾剂的形式。针对以上所述申请的任何方法，本发明的组合物优选静脉内给予或施加到所需的细胞凋亡事件的位点(例如，通过注射)。
本领域中熟知的用于制备配制品的方法发现于，例如，“雷明顿：药学技术与实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)”编辑，A.R.真纳罗(Gennaro)，利平科特威廉姆斯(LippincottWilliams)&威尔金斯(Wilkins)，费城，宾夕法尼亚州，2000。针对肠胃外给予的配制品可以，例如，包含赋形剂、无菌水、或盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油、或氢化萘。可以使用生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧化乙烯-聚氧丙烯共聚物来控制化合物的释放。用于递送试剂的其他潜在有用的肠胃外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统、以及脂质体。用于吸入的配制品可以包括赋形剂，例如，乳糖，或者可以是包含如下的水溶液，例如，聚氧化乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆酸酯和脱氧胆酸酯，或者可以是用于以滴鼻剂的形式或作为凝胶给予的油溶液。
可以将配制品以治疗有效量向人类患者给予(例如，预防、消除、或减轻病理状态的量)，以提供针对疾病或病症的疗法。本发明的组合物的优选的剂量可能取决于变量如障碍的类型和程度，具体患者的整体健康状态，化合物赋形剂的配制品，以及其给予途径。
针对在此所述的任何疗法的人类剂量最初可以通过从小鼠中使用的化合物的量进行推断来确定，正如本领域技术人员认识到的，与动物模型相比来修改对人类的剂量是本领域中的惯例。在某些实施例中，设想该剂量可以从约107pfu至约1011pfu之间；或从约108pfu至约1010pfu或从约109pfu至约1011pfu变化。在其他实施例中，该剂量可以是约107pfu、108pfu、109pfu、1010pfu、1011pfu。当然，同在此类的治疗方案中常规做的一样，这个剂量可以往上或往下调节，这个调节取决于最初的临床试验和具体病人的需要。
治疗方法的选择
在受试者诊断为患有瘤形成之后，选择治疗方法。在瘤形成中，例如，多个标准疗法方案可用。在选择治疗方法中使用瘤形成的标记谱。在一个实施例中，瘤形成细胞响应于由NDV造成的细胞杀死(例如，r73T-R116)。
侵略性较低的瘤形成可能对保守治疗方法敏感。侵略性较高的瘤形成(例如，转移性的瘤形成)对保守治疗方法较不敏感并且可能复发。当本发明的方法指示瘤形成非常具有侵略性时，应当选择侵略性治疗方法。侵略性治疗方案典型地包括以下疗法中的一种或多种：手术切除、放射疗法、或化疗。
用于测量细胞生活力的测定
在本发明是方法中有用的试剂(例如，NDV)包括诱导赘生性细胞死亡和/或减少赘生性细胞生存，即生活力的那些。
用于测量细胞生活力的测定在本领域中是已知的，并且描述于例如，由克劳奇(Crouch)等人(免疫法杂志(J.Immunol.Meth.)，160,81-8)；堪格斯(Kangas)等人(医学与生物学(Med.Biol.)62,338-43,1984)；伦丁(Lundin)等人，(酶学方法(Meth.Enzymol.)133,27-42,1986)；佩蒂(Petty)等人(生物荧光和化学发光杂志的比较(Comparison ofJ.Biolum.Chemilum.)10,29-34,.1995)；科锐(Cree)等人(抗癌药(AntiCancer Drugs)6:398-404,1995)。细胞生活力可以使用各种方法来测定，包括MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基)-2,5-二苯四唑鎓溴化物)(巴尔特罗普(Barltrop)，生物有机与药物化学快报(Bioorg.&Med.Chem.Lett.)1:611,1991；克里(Cory)等人，癌症通信(Cancer Comm.)3,207-12,1991；宝罗(Paull)，杂环化学杂志(J.Heterocyclic Chem.)25,911,1988)。针对细胞生活力的测定也是可商购的。这些测定包括但不限于发光细胞生活力测定(普洛麦格(Promega))，该测定使用萤光素酶技术来检测ATP并且量化培养中的细胞的健康和数量，和发光细胞生活力测定，该测定是乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定(普洛麦格)。
诱导或增加赘生性细胞死亡(例如，增加细胞凋亡，减少细胞存活)的候选化合物也可作为抗肿瘤疗法。用于测量细胞凋亡的测定对技术人员是已知的。凋亡的细胞表征为特征形态变化，这些变化包括染色质凝聚、细胞收缩和膜起泡，这些可以使用光学显微镜法清晰地观察到。细胞凋亡的生物化学特征包括DNA断裂、在特定位置处蛋白质切割、增加的线粒体膜渗透性、以及在细胞膜表面上磷脂酰丝氨酸的出现。针对细胞凋亡的测定在本领域是已知的。示例性测定包括TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP缺口末端标记)测定、半胱天冬酶活性(明确地半胱天冬酶-3)测定、和针对fas配体和膜联蛋白V的测定。可商购的用于检测细胞凋亡的产品包括，例如，均质半胱天冬酶-3/7测定、FragELTUNEL试剂盒(癌基因研究产品公司(ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、ApoBrdU DNA断裂测定(生物视野公司(BIOVISION)，山景城，加利福尼亚州)、以及快速凋亡的DNA梯检测试剂盒(生物视野公司，山景城，加利福尼亚州)。
赘生性细胞具有从其起始位置向全身的远点转移或扩散的倾向。针对转移潜能或侵袭力的测定对技术人员是已知的。此类测定包括针对接触抑制的缺失的体外测定(金姆(Kim)等人，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)101:16251-6,2004)、增加软琼脂菌落体外形成(钟(Zhong)等人，国际肿瘤学杂志(Int J Oncol.)24(6):1573-9,2004)、肺转移模型(达塔(Datta)等人，体内，16:451-7,2002)和基于基质胶的细胞侵袭测定(哈格曼(Hagemann)等人，致癌作用，25:1543-1549,2004)。针对细胞侵袭力的体内筛选法在本领域中也是已知的，并且包括，例如，在无胸腺裸鼠中的致瘤性筛选。评估转移的常用体外测定是基于基质胶的细胞侵袭测定(BD生物科学公司(BD Bioscience)，富兰克林湖，新泽西州)。
如果希望，将使用任何在此描述的筛选法选择的候选化合物针对其效力使用瘤形成动物模型来测试。在一个实施例中，将小鼠注射以赘生性人类细胞。然后将包含赘生性细胞的小鼠每天注射(例如，经腹膜内)载体(PBS)或候选化合物，持续由经验确定的一段时间。然后将小鼠安乐死并且收集肿瘤组织并且针对NDV、NDV多肽、和/或NDV标志物(例如，编码可检测部分的转基因)的水平，使用在此描述的方法来分析。希望相对于对照水平降低NDV、NDV多肽、或NDV标志物水平mRNA或蛋白质表达的化合物有效于治疗受试者(例如，人类受试者)中的肿瘤。在另一个实施例中，在注射人类赘生性细胞的小鼠中分析候选化合物对肿瘤负荷的作用。允许赘生性细胞生长以形成团快。然后将小鼠每日用候选化合物或载体(PBS)来治疗，持续由经验确定的一段时间。将小鼠安乐死并且收集肿瘤组织。将在用选择的候选化合物治疗的小鼠中的肿瘤组织的质量与在相应对照小鼠中存在的肿瘤组织的质量进行比较。
试剂盒
本发明提供了用于治疗或预防肉瘤的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒包括单位剂型的、包含有效量的NDV(例如，r73T-R116)的治疗性或预防性组合物。在另一个实施例中，该试剂盒包括单位剂型的、包含有效量的NDV(例如，r73T-R116)的治疗性或预防性组合物。
在一些实施例中，该试剂盒包括包含治疗性或预防性组合物的无菌容器；此类容器可以是盒、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装、或其他适合的本领域已知的容器形式。此类容器可以是由塑料、玻璃、层压纸、金属箔、或其他适用于容纳药物的材料制成的。
如果希望的话，将本发明的抗体与用于向受试者给予NDV(例如，r73T-R116)的说明书一起提供，该受试者患有或处于发展瘤形成的风险。说明书将一般包括关于使用组合物用于治疗或预防瘤形成的信息。在其他实施例中，这些说明书包括以下各项中的至少一种：治疗剂的描述；用于治疗或预防瘤形成或其症状的剂量日程表和给予；注意事项；警告信息；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。这些说明书可以直接打印在容器(当存在时)上，或作为标签应用于容器，或作为单独的页、小册子、卡片、或在容器中或一起提供的文件夹。
除非另外指明，本发明的实施采用很好地处在熟练业内人士的见识范围之内的分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中得到充分解释，如“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)”，第二版(Sambrook,1989)；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”(Gait,1984)；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”(Freshney,1987)；“酶学方法(Methods in Enzymology)”“实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)”(Weir,1996)；“哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for MammalianCells)”(Miller and Calos,1987)；“当前分子生物学方案(CurrentProtocols inMolecular Biology)”(Ausubel,1987)；“PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase ChainReaction)”，(Mullis,1994)；“当前免疫学方案(Current Protocols in Immunology)”(Coligan,1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的生产，并且按照这样，可以被考虑用于制备和实施本发明。对具体实施例特别有用的技术将在下面的部分进行讨论。
给出以下的实例是为了给本领域普通技术人员提供如何准备和使用测试、筛选和本发明的治疗方法的一个完整的公开和说明，而不是旨在限定诸位发明人认为是自己的发明的范围。
实例
实例1.NDV病毒株73T的反基因组cDNA的装配。
将由高保真RT-PCR产生的六个亚基因组cDNA片段组装到pUC19载体中。NDV 73T的全长cDNA称为p73T。将73T中的F蛋白质切割位点(FPCS)的核苷酸和推断的氨基酸序列修饰为NDV LaSota病毒株(弱毒，lento)的或巨细胞病毒(CMV)的糖蛋白B(gB)的序列(S116)(图1；双斜线指示F蛋白的切割位点)。完全测序cDNA以确认病毒序列。F蛋白质切割位点：Wt：ggg agg aga cag aaa cgc ttt；Lento：ggg ggg aga cag gaa cgc ctt；S116：cat aataga acg aaa tcc ttt；S116KM：cat aat aaa atg aaa tcc ttt；R116：cat aat aga acgaaa cgc ttt。
实例2.转基因插入NDV 73T基因组。
将转基因在两个位置插入p73T中：在P或M之间的基因间序列或在HN和L联接之间的基因间序列(图2A)。为了在P-M或HN-L联接处插入单个转基因盒，通过将转基因盒插入在P和M基因之间(nt3148)或在HN和L基因之间(nt 8231)产生的AfeI位点进行在P-M或HN-L联接处包含转基因的p73T cDNA的构建。插入的基因盒包含基因末端(GE；5'-TTAAGAAAAAA-3')、基因间核苷酸(T)、基因启动序列(GS；5'-ACGGGTAGA-3')和转基因的开放阅读框(ORF)。此外，将十个核苷酸(5'-cgccgccacc-3')插入起始位点的上游，来引入Kozak序列。将在P-M或HN-L联接处包含转基因的全长(FL)73T cDNA分别命名为p73T-P1或p73T-HN1。构建在单一基因组中在P-M和HN-L联接处包含两个单独的转基因的全长cDNA并且命名为p73T-P1-HN1(图2B)。为了在相同联接(例如，P-M)处插入两个转基因盒，将AfeI位点引入第一转基因(#1)(nt 3169)的ORF的末端。将第2转基因ORF使用包含GE和GS序列的引物来PCR扩增，并且在AfeI位点插入。将在P-M联接处包含两个转基因盒的反基因组cDNA命名为p73T-P2。
实例3.回收具有修饰的FPCS的感染性重组NDV病毒株73T(r73T)。
将NDV 73T NP、P、L和抗原cDNA(p73T-lento或p73T-S116)在T7RNA聚合酶启动子和终止子的控制下进行克隆。将四个质粒共转染到RNA聚合酶表达细胞系中(图3A)。将回收的病毒命名为r73T-lento或r73T-S116。将r73T-lento和r73T-S116用介质在有或没有胰蛋白酶增补的情况下在维洛细胞中进行传代。r73T-lento的生长是胰蛋白酶依赖的，然而r73T-S116可以在没有胰蛋白酶增补的培养基中生长。在P-M联接处有或没有hGM-CSF的情况下，评估r73T-S116中的F蛋白质切割序列(FPCS)。在没有补充胰蛋白酶的介质中，以 MOI0.01，在维洛和人类纤维肉瘤HT1080细胞中，将73T-S116病毒株进一步传代持续10代。在FPCS(R113K和/或Q114M)中突变出现在第7代。在第9代检测S116R突变。在第10代时，对F、HN和转基因进行测序，并且没有另外的突变被发现。
实例4.具有不同F蛋白质切割序列的重组73T病毒株的表征。
具有新颖的修饰的F蛋白质切割序列(FPCS)的重组73T病毒株包括以下序列：
-Lento：111G-G-R-Q-E-R/L-I118
-S116：111H-N-R-T-K-S/F117
-S116K：111H-N-K-T-K-S/F117
-S116M111H-N-R-M-K-S/F117
-S116KM111H-N-K-M-K-S/F-I118
-R116：111H-N-R-T-K-R/F-I118
关于MDT、ICPI、相对的HT1080细胞杀死、维洛细胞中的复制、和蛋中的复制，对具有不同FPCS的重组73T病毒株进行了表征(图4)。
NDV的禽类毒力主要通过F蛋白质切割序列(FPCS)来确定。将r73T-lento工程化为包含非强毒病毒株LaSota的FPCS。在组织培养中LaSota病毒的复制是胰蛋白酶依赖的，因为F蛋白不能被切割。在没有胰蛋白酶增补的维洛细胞中，r73T-lento形成了微小噬斑，指示了F蛋白并没有被切割并且病毒不能从细胞至细胞有效地传播。rR73-lento在维洛细胞中以低水平复制(7.5x 103pfu/ml)，但是在具有内源胰蛋白酶样酶的蛋中有效地复制(5.7x 108pfu/ml)。如通过用病毒接种的胚胎的平均死亡时间(MDT)(MDT>156小时)和通过脑内致病指数(ICPI；ICPI＝0.00)所证实的，r73-lento在鸡中非强毒的，并且在HT1080细胞中具有低细胞毒性(13％细胞杀死)。
r73T-S116可以形成相对大的噬斑，并且在维洛细胞中达到4.4x106pfu/ml的滴度。将此滴度与当r73T-S116在补充以胰蛋白酶的维洛细胞中生长的时候获得的滴度相比。这种数据指示r73T-S116的融合蛋白质切割位点(FPCS)可以在没有外源胰蛋白酶的情况下在组织培养中进行切割。它在鸡中是非强毒的并且在HT1080细胞中显示出31％细胞杀死。针对r73T-S116的遗传稳定性通过体外细胞传代对其进行检验。
在维洛或HT1080细胞10次传代后，在FPCS中发现了如下氨基酸取代：R113K、Q114M、和/或S116R。为了消除在病毒基因组中发生另外序列变化的可能性，通过反向遗传学构建重组r73T-S116突变病毒，并且进行评估。除r73T-R116之外，r73T-S116及其衍生物与亲本S116类似，因为这些突变病毒在鸡中非强毒，并且能够具有相似水平的HT1080细胞杀死。Ht1080细胞杀死针对单突变在29％-31％之间并且针对双突变为48％。
M114和K113M114的噬斑大小明显比S116更大。73T-R116突变在FPCS中的残基116(S116R)处获得了一个氨基酸变化。切割位点旁边的R116已知针对F蛋白的有效切割是非常重要的。r73T-R116在维洛细胞中形成了大噬斑，在有或没有胰蛋白酶增补的情况下生长至相似滴度，并且有效杀死HT1080细胞(80％)。如通过MDT测定(72、80小时)所示，R116增加了鸡毒力。尽管在一个测试中ICPI值(0.65)是<0.7，但是它优选进一步降低了其鸡毒力。
实例5.r73T-R116衍生物具有降低的鸡毒力。
可以将病毒工程化来表达在P-M联接处的转基因(1)、在HN-L联接处的第2转基因(2)以及通过插入非编码序列延长的增大的HN-L基因间区域(3)(图5A)。在此使用了图2A中在P-M联接处掺入转基因盒的相同设计。第二转基因盒包含L基因因启动序列(GS；5'-ACGGGTAGA-3')、转基因的开放阅读框(ORF)、来自L基因的3’非翻译区的序列(斜体)和L基因末端序列(GE；5'-TTAAGAAAAAA-3')。用于增加HN-L联接区的非编码序列取自1型副粘病毒(APMV-1)、呼吸道合胞体病毒(RSV)或与任何已知序列没有同源性的随机序列。插入可以在60-318nt的范围之内。在HN-L处插入第二转基因允许病毒表达两种转基因，如，hGM-CS和GFP。列出在HN-L联接处的插入的序列(图5B)。
实例6.r73T-R116的修饰和r73T-R116衍生物的表征。
为了降低在鸡中的r73T-R116毒力，将r73T-R116病毒进行修饰以通过插入各种长度的序列来增加HN和L基因间序列。针对以下项评估r73T-R116衍生物：感染性，通过检验细胞和蛋中的噬斑形成和复制；禽类致病性，通过检验MDT和ICPI；以及肿瘤细胞杀死(图6A)。
基因间插入来自APMV的318nt、来自RSV的198nt和198随机序列确实减少了鸡中的毒力，伴随着MDT>156小时和分别0.27、0.0375和0的ICPI。长插入(随机的198nt)比短插入(随机的60nt)对减少毒力具有增加的作用。插入144、102和60nt在鸡中具有一些毒力，但是MDT时间更短。针对插入144、102和60nt的ICPI值分别是0.74、0.51和0.78。插入无病毒序列(随机的198nt)比插入病毒序列(RSV-198nt)更有效减少毒力。在HN-L联接处插入第2转基因盒(EGFP)并没有减少鸡毒力(MDT 86小时并且0.82的ICPI)。所有的插入都轻微减少了蛋中病毒复制高达4倍，但是并没有影响在维洛细胞中的病毒复制(约106pfu/ml)。尽管突变病毒在鸡中是更减毒的，但是肿瘤细胞杀死功能并没有被影响。所有r73T-R116衍生物在感染第3天时具有处于75％-86％范围内的肿瘤细胞杀死效率。
实例7.r73T病毒在蛋和维洛细胞中的生长动力学。
为了确定r73T病毒的生长条件，在蛋(图7)和维洛细胞中(图8)进行生长动力学研究。将鸡胚用100、1000、10,000或100,000FFU/蛋的指示的病毒来感染并且孵育持续2、3或4天。获得尿囊液并且通过FFA确定病毒滴度。如图7中所示，100FFU/蛋在第1天具有低滴度，但是在第2天达到了峰值滴度。总之，无论接种使用的剂量是多少，大多数病毒在第2天达到了约8logs/mL的峰值滴度。R116i-198具有最低滴度，低接种量在第2天产生最高产量，指示可能存在缺陷颗粒的积累。R116i-318-APMV-插入也具有约7logs的较低峰值滴度。R116i-198-RSV达到了7.5logs的峰值滴度。由反向遗传构建的S116在蛋中没有减少病毒的产生。因此，在R116衍生物中，就在蛋中的生长特性而言，具有RSV-198nt插入的病毒是优先溶瘤病毒候选者。
还在无血清的维洛细胞克隆51D11(由医学免疫公司(MedImmune)产生的专有的细胞系)中评估了病毒。所有的病毒都在两种MOI条件(0.001和0.0001)下良好复制(图8)。修饰73T FPCS和在R116的HN-L联接中基因间插入并没有影响病毒在维洛细胞中生长。
实例8.与正常细胞相比，r73T或衍生物在癌细胞中的选择性细胞杀死。
与正常人皮肤成纤维细胞CCD1122Sk细胞相比，相对于未治疗的对照细胞，评估rT3T及其衍生物在人类纤维肉瘤HT1080中的细胞杀死(图9A和9B)。在用r73T衍生物以范围从1至100,000PFU内的不同剂量感染持续72小时后获得数据。在HT1080癌细胞中，具有弱毒FPCS的病毒具有最少的杀死，处于PCS的S116是中等，并且在FPCS处具有R116的病毒具有与r73T wt病毒一样有效的细胞杀死。在正常CCD1122SK细胞中，所有病毒的细胞杀死都不如针对癌细胞的细胞杀死有效。杀死效率的降低是约100倍。无论何种FPCS序列，所有的病毒在正常细胞中都具有相似的杀死效率。将在癌细胞和正常细胞中的细胞杀死效率表达为使用Prism 6.0的从剂量反应曲线内推的50％有效浓度(EC50)(图9C)。R116衍生物与10PFU的EC50的r73T wt具有类似的EC50值，指示修饰FPCS并没有影响在癌细胞中的病毒复制以及细胞杀死效率。在感染后第3天确定以MOI 0.01 进行这些病毒在HT1080和CCD1122SK细胞中的复制(图9D)。所有的病毒优先在癌细胞中超过在正常细胞中复制，伴随着约1.5-2.0logs的差异。
实例9.当经全身或瘤内递送至携带人类肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠时，r73T衍生物具有体内抗肿瘤活性。
为了评估体内溶瘤活性，HT1080异种移植模型是通过以5x 106细胞/0.1ml的浓度经皮下将HT1080细胞注射到5-6周龄的Balb/C无胸腺裸鼠中来形成。因为hGM-CSF在小鼠中没有交叉反应性，因此这项研究不适合评估转基因作用，但是适合评估各种r73T构建体的溶瘤能力。经瘤内(it)或静脉内(iv)给予R116-318i-hGM-CSF，并且在治疗和对照组之间比较肿瘤生长速率(图10A)。
当肿瘤体积达到约65mm3时，将小鼠随机分配到所指示的组(N＝10)中。小鼠接受了单次剂量的向瘤内(IT)给予的PBS或2x 107Pfu的r73T-hGM-CSF-R116i-198或通过尾静脉注射经静脉内(IV)给予1x 108PFU。每3-4天测量肿瘤大小。如图10A中呈现的，当r73T-R116i通过IV或IT给予时，它可以诱导显著的肿瘤消退。由两种途径诱导的肿瘤消退的数量是可以比较的，并且与对照组具有显著差异。
在通过IT注射1x 108PFU的HT1080异种移植物中比较r73T衍生物的溶瘤活性。当肿瘤体积达到约180mm3时，将小鼠随机分配到组(n＝7)中。小鼠接受了PBS或1x 108PFU的r73T-hGM-CSF-lento(lento)或r73T-hGM-CSF-S116K113M114(S116KM)或r73T-hGM-CSF-R116i-318nt APMV-N(R116i)或r73T-hGM-CSF(r73T wt)。每3-4天测量肿瘤大小(*P<0.05，不成对学生t检验)。两次剂量r73T衍生物能够诱导显著肿瘤消退，虽然存在效果中的差异。r73T-lento是效果最差的，而r73T wt在肿瘤消退中是最有效的。r73T-lento与S116病毒具有相似的作用，虽然S116病毒在体外细胞杀死中具有低10倍的EC50(图9A)。第2次给药后直到9天(肿瘤植入后第19天)，r73T-R116i-318在抑制肿瘤生长方面与73T wt一样有效，肿瘤在R116i治疗过的小鼠中又恢复生长，但是在73T wt治疗组中没有。这些数据显示出当经全身或瘤内递送至携带人类肿瘤异种移植物的免疫缺陷小鼠时，r73T衍生物具有体内抗肿瘤活性。F蛋白的有效的切割针对体外和体内病毒复制是十分重要的。在FPCS处具有R116的病毒在体外和体内的细胞杀死中更为有效。
实例10.在静脉输送后，r73T衍生物的组织生物分布。
为了确定溶瘤的NDV病毒是否在肿瘤组织中选择性复制，确定在不同器官中的病毒清除、病毒分布。将荷有约250mm3大小的皮下HT1080肿瘤的无胸腺裸鼠以1x 108PFU的剂量用R116i(r73T-hGM-CSF-R116i-318nt APMV-N)经静脉进行治疗，并在第1、4或8天中，且处死(每时间点n＝3)。收集血清、肺、脾、卵巢和肿瘤。
在维洛细胞中通过噬斑测定来量化病毒的存在，并且通过ELISA测定来测量hGM-CSF转基因的表达。在感染后的第1、4和8天评估肿瘤和器官中的病毒复制。仅在第1天检测器官中的病毒(在所有的时间点都没有检测卵巢中的病毒)，并且在肿瘤组织中负荷的病毒比肺和脾高出约100倍(图11A)。在肿瘤中病毒的存在持续了至少8天，指示出病毒在肿瘤组织中选择性复制。与病毒复制数据一致，hGM-CSF的水平是最高的，并且持续超过8天(图11B)。这些数据证实，NDV病毒在肿瘤组织中有效复制，并且转基因有效递送至局部肿瘤组织。
实例11.包含嵌合的F和/或HN基因的73T的反基因组cDNA。
在鸡中，针对免疫原性和毒力，病毒表面糖蛋白是重要的抗原。探讨了将NDV的F和/或HN基因被其他副粘病毒的相应的胞外(ecto)区域替代的策略，该副粘病毒单独或组合地在鸡中非强毒。副流感病毒5(PIV 5)是一种犬副粘病毒并且并没有引起人类中的疾病。如之前报道的，已经显示出鸽1型副粘病毒(PPMV-1)在ICPI为0.025的情况下在鸡中是非强毒，并且在抗原性上与NDV不同(多特曼斯(Dortmans)等人，兽医微生物学(VeterinaryMicrobiology)，2010年，第143卷，第139-144页)。存在两种具有相同强毒力融合蛋白切割位点的遗传学上紧密相关的鸽1型副粘病毒(PPMV-1)变体，但具有强烈对比的毒力(兽医微生物学，2010，143:139-144)。产生NDV 73T的全长反基因组cDNA，其中将该F和/或HN糖蛋白胞外结构域与PPMV-1和/或PIV5进行交换(图12A)。分别用着色为蓝色、紫色或绿色的盒指示NDV、PIV5、和PPMV-1序列。
指示了个别蛋白质或蛋白结构域的氨基酸的长度。在维洛中的噬斑形成，相对的HT1080细胞杀死和MDT如之前描述的进行(图12B)。嵌合的病毒，除PIV-5F-HN之外，都进行了回收并且在外源胰蛋白酶不存在的情况下在细胞中能够生长。所有三种病毒都形成了相当大的噬斑，显示出有效的细胞至细胞的扩散。PPMV-1F-HN或F嵌合的病毒分别具有79和84小时的MDT值，指示在鸡中的潜在的毒力。两种PMI-1嵌合体以71％和61％的水平有效地杀死了HT1080细胞。PIV5-F嵌合体并没有在蛋中生长，并且在鸡中非强毒，并且以47％杀死了HT1080细胞。通过中和测定使用从小鼠中收集的血清检测在NDV和PPMV-1或PIV5嵌合体之间的血清交叉反应性，该小鼠接受了2次静脉内剂量的1x 108PFU的r73T-R116i。将r73T病毒用NDV-感染的血清(滴度960)进行中和，然而并没有中和PPMV-1和PIV5嵌合体(滴度<4)。此结果确认了，在NDV和PPMV-1或PIV5之间不存在交叉反应性。针对在NDV治疗之前的过程中已经形成抗NDV免疫应答的患者，具有不同的抗原性的嵌合的病毒具有充当提高的溶瘤病毒的潜力。
通过微型基因组测定与其他副粘病毒比较NDVRNA聚合酶活性(图12C)。使用Lipofectamine 2000的，将T7表达细胞用三种表达NDV的NP、P、L蛋白的质粒和编码NDV反微型基因组cDNA(编码GFP基因)的质粒，或编码麻疹病毒(MV)或呼吸道合胞体病毒(RSV)的N、P、L基因的质粒和各自的RSV或MV GFP反微型基因组cDNA质粒来转染。转染后的两天或三天，在荧光显微镜下如通过表达GFP所指示检查微型基因组复制。与麻疹病毒和RSV相比，NDV具有最强聚合酶活性。
实例12.通过细胞组筛选鉴定对NDV敏感的癌细胞.
为了理解什么肿瘤类型可能对NDV溶瘤作用敏感，将涵盖了广泛范围的肿瘤类型的180种癌细胞系和适应症针对对重组NDV及其变体的敏感性进行测试。细胞系获得自美国类型组织集合(马纳萨斯，维吉尼亚州)，或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，并且在介质中并且在由供方建议的条件下培养。将10,000种癌细胞系接种于96孔板上并且在6小时后用病毒感染。病毒浓度范围从MOI 10-0.0001(或1至100,000pfu/孔)。在感染后48-96小时确定细胞生活力。在用以0.1的MOI的病毒感染后72小时，使用>30％细胞杀死的截断来确定敏感性。图13A和13B通过肿瘤类型提供了敏感性的总览。血液学癌细胞系(白血病和淋巴瘤)对NDV溶瘤作用相对不敏感，然而大部分测试的黑色素瘤、卵巢和胰细胞系对NDV是敏感的。相对于4％测试的细胞系对基于S的病毒是敏感的，测试的全部人类癌细胞系的约58％是对处于FPCS的NDVR116i敏感的。这最可能是由于由蛋白酶造成的F蛋白的切割。R116i病毒更可能是通过普遍存在的弗林蛋白酶(furin)样蛋白酶来切割，而可能切割S116F蛋白的蛋白酶是不确定的并且可能是不广泛表达的。相对于最初的S116变体，再衍生的S116-KM变体产生了更大的噬斑大小并且提高了溶瘤能力。为了测试这一另外的具有22种癌细胞系(已经确定其对NDV具有一定范围敏感性)的更小组，将R116病毒用表达GFP的变体进行感染，并且在感染后72小时确定细胞生活力。使用如以上所描述的相同敏感性的截断，所测试的细胞系的41％对R116i是敏感的，4％对S116敏感，并且再衍生的S-KM比S116NDV更为有效，27％所测试的细胞系对S116NDV是敏感的。
表4.通过R116-hGM-CSF，概述癌细胞对病毒杀死的敏感性
利用在FPCS和人类GM-CSF处具有R116的重组NDV 73T，针对细胞杀死检验衍生自指示的癌组织的细胞。细胞的数量显示出由以0.1的moi的病毒感染造成的大于50％杀死，并且指示出了所筛选的全部细胞系。
实例13.在同系黑色素瘤模型中，r73T衍生物具有肿瘤杀死和/或肿瘤生长抑制活性。
在肿瘤模型改进后，在改进的B16F10同系模型中针对效力测试编码人类或鼠GM-CSF的S116-RD NDV(图15A和15B)。瘤内感染1x 108pfu持续3次剂量，并且每组存在最少8只小鼠。用>80％的肿瘤生长抑制来证实显著的肿瘤生长抑制(图15B)。短期肿瘤消退是使用重复瘤内(i.t.)给药来实现的，这也导致了生存时间的显著增加，相对于治疗组的42天，对照组18天。在3次剂量后停止治疗，随后肿瘤重新生长。在50天时，在S116-mGM-CSF组中没有残留肿瘤的迹象的单个动物再次受到在可替代胁部上移植B16F10肿瘤细胞的挑战。延迟并不抑制肿瘤生长表明在这个模型中，完整的免疫记忆应答并不能在该单个动物中实现。
为了评估溶瘤和免疫对肿瘤生长的作用，编码hGM-CF或mGM-CSF的NDV变体R116i和S116分别在小鼠同系免疫活性CT26结肠直肠肿瘤模型中针对效力进行测试。将每种病毒与1x 108PFU的病毒一起瘤内给药，持续4次剂量。在给药开始之前，肿瘤至少100mm3。用病毒治疗的所有的动物证实了作为单一疗法的有效抗肿瘤活性。在用编码人类GM-CSF的R116治疗后，11/12动物没有肿瘤，这是92％的完全应答率。溶解性更低的再衍生的S116-KM病毒具有降低的肿瘤生长抑制，实现了53％TGI和36％的完全应答。然而，在鼠GM-CSF(该鼠GM-CSF不同于人类GM-CSF，将在小鼠模型中活化)的存在下，这种应答率增加至54％，伴随着75％的肿瘤生长抑制。因此，用GM-CSFS装备116病毒很可能可以提高抗肿瘤活性。
取残余的肿瘤用于组织学分析，并且通过苏木精和伊红染色(H和E)来进行染色，并且使用免疫组织化学方法用于NDV检测(图15C)。有明确的证据表明NDV表达，并且这似乎是集中在肿瘤坏死区域的周围，表明NDV导致肿瘤细胞死亡和坏死。也有清楚的证据表明免疫细胞浸润到肿瘤坏死区域中。在针对NDV具有强染色的区域中，还可以注意到多核细胞合胞体形成。此外，似乎有很小的残留活性肿瘤，指示出肿瘤生长抑制数据可能在此模型中低估了NDV的活性。
图15C显示出NDV在具有免疫能力的小鼠CT26结肠直肠肿瘤模型中具有有效的抗肿瘤活性。为了评估溶瘤和免疫对肿瘤生长的作用，编码hGM-CF或mGM-CSF的NDV变体R116i和S116分别在小鼠同系免疫活性CT26结肠直肠肿瘤模型中针对效力进行测试。将每种病毒与1x 108PFU的病毒一起瘤内给药，持续4次剂量。在给药开始之前，肿瘤至少100mm3。用病毒治疗的所有的动物证实了作为单一疗法的有效抗肿瘤活性。在用编码人类GM-CSF的R116治疗后，11/12动物没有肿瘤，这是92％的完全应答率。溶解性更低的再衍生的S116-KM病毒具有降低的肿瘤生长抑制，实现了53％TGI和36％的完全应答。然而，在鼠GM-CSF(该鼠GM-CSF不同于人类GM-CSF，将在小鼠模型中活化)的存在下，这种应答率增加至54％，伴随着75％的肿瘤生长抑制。因此，用GM-CSFS装备116病毒可以提高抗肿瘤活性。
图15D-F显示出用rNDV R116i多次给药引起了肿瘤生长抑制并且驱使免疫细胞募集到卵巢癌(OVCAR4)异种移植模型中。为了进一步评估rNDV体内溶瘤活性，利用人类卵巢癌异种移植模型(OVCAR4)。这种模型是生长迟缓的，并且具有令人联想到人类卵巢肿瘤的总病理，伴随着分化不良的细胞形态和大量腹水样液体填充区。一旦肿瘤达到100mm3，将小鼠随机分配来接受8次剂量的编码小鼠或人类GM-CSF的R116i NDV或作为对照的PBS。在小鼠模型中，只有来自鼠基因序列的产品是具有生物活性的。将2.5x 107pfu向瘤内以少于50μl的体积每周一次进行注射。肿瘤生长曲线示于图15D中。长期肿瘤抑制在用NDV变体治疗的荷瘤动物中实现。还存在在研究末端在肿瘤内使用RT-PCR的病毒基因组的证据(最后一次给药后24小时)。在组织学分析后，在残余肿瘤中存在免疫浸润连同其他组织学的变化的明确证据(图15E和F)。治疗的肿瘤比对照治疗的动物更少去分化，并且似乎具有更少腹水液填充区。在与剩余的肿瘤相邻的多个治疗的肿瘤中发现的高水平炎性浸润以及免疫组织化学(IHC)分析揭示这些免疫浸润针对NDV蛋白是阳性。在NDV治疗组中，存在很强程度的先天免疫细胞募集进入肿瘤中。这些数据证实在形态学相关的卵巢癌模型中有效的抗肿瘤功效，该模型可以通过直接溶瘤作用和先天免疫募集和活化引起。
实例14：NDV病毒诱导的肿瘤消退
在B16黑色素瘤模型中，针对溶瘤作用评估73T-R116i-hGM-CSF和73T-R116i-mGM-CSF。研究评估了在B16小鼠中病毒耐受性。将每种病毒以2x 107pfu在第11和14天两次经静脉内(i.v)或向腹膜内(i.p)给药，或者在第11天一次以1.1x 107pfu瘤内给药。与未处理的组相比，通过三种不同的给予途径用R116-hGM-SCF或mGM-SCF治疗的组具有较慢的肿瘤生长速率(图15A)。每组包括3只小鼠。肿瘤抑制率与对照组相比具有统计学意义。因此，本发明的r73T衍生物在鸡蛋中具有有利地低禽类致病性、高溶瘤活性、以及复制到高滴度。基于这些结果，本发明的病毒可用于诱导肿瘤消退并且提高癌症患者的治疗结果(图16)。
除GM-CSF之外，还可以将多个转基因(表2)插入NDV 73T病毒株中，以增强肿瘤杀死。这些转基因包括以下各项：
(1)细胞因子或细胞因子的工程化变体，如GM-CSF、IL-2、IL-21、 IL-15、IL-12和IL-12p70
(2)细胞表面配体和趋化因子，包括OX40L、CD40L、ICOSL、Flt3:、B.1(CD80)、CD137L、CXCL10(IP-10)、CCL5、CXCL9。(3)Myc抑制剂：Omomyc。(4)针对体内成像目的的转基因，如碘化钠同向转运蛋白(NIS)-介导的放射疗法用于放射治疗。(5)增强肿瘤杀死的肿瘤细胞存活的另外的调节剂，包括但不限于：细胞周期进程的抑制剂、抑制抗凋亡蛋白、提高促凋亡蛋白、抑制恶性转化的关键致癌驱动子。这些可以包括在肿瘤细胞中选择性NDV复制后转基因递送蛋白，生产选择性或广泛活性的siRNA，递送miRNA或抑制选择的miRNA。(6)肿瘤抗原如E6、E7、癌睾丸抗原、癌胚抗原、人工的或过量表达的蛋白单独的或与其他转基因组合的作为新颖的肿瘤抗原。(7)抗体或重组融合蛋白，这些抗体或重组融合蛋白靶向免疫调节蛋白以阻断负向调节或提供激动信号以增强T-细胞功能。此类抗体的实例可以包括但不限于：PD-L1、CTLA4、CD-137(4-1BB)、OX40、GITR、TIM-3、CD73、PD-1、HVEM、和LIGHT。(8)增加recNDV的药效学的/药物代谢动力学活性，这是通过在细胞中工程化或表达recNDV，这些细胞转移蛋白到recNDV上以通过补体降低清除或以减少对NDV的适应性免疫应答。
表5.可能插入NDV 73T中的转基因及其生物活性
实例15.癌症疗法涉及与免疫调节性mAb组合给予溶瘤NDV。
在适当情况下，NDV溶瘤病毒可以与治疗性抗体或激动性融合蛋白同时或顺序地给予(例如，抗-PD-L1、抗-CTLA4、抗-OX40、抗-GITR、抗-TIM-3、抗-PD-1和抗-ICOS)。产生临床前数据，其形成分子的最有效剂量和时间表，与在此描述的新颖的NDV构建体组合来提高NDV在肿瘤模型中的活性。可以将转基因插入重组NDV内用于单独或组合表达，以递送活性的多种模式，例如，来增强由NDV的新颖变体诱导的肿瘤细胞死亡。增加与免疫调节方法组合的肿瘤细胞抗原的释放具有增加对这些释放的肿瘤抗原的适应性免疫应答的潜力。
实例16.在F蛋白质切割位点处具有R、S或S-KM突变的F蛋白中，F蛋白质切割效率和融合活性降低。
为了理解在F蛋白质切割位点中的差异是否影响在受感染细胞中的F蛋白质切割以及其对融合活性的影响，将F蛋白质粒转染到293细胞中，以检验F蛋白质切割。此外，将F和HN质粒共转染以在过渡试验中检验融合活性，因为F和HN蛋白都是融合形成所需的(图3B和3C)。通过宿主蛋白酶Wt F蛋白比在F蛋白质切割位点处具有R、S或S-KM突变的F蛋白更有效地被切割，非常少F蛋白质切割产物(F1)在具有S切割位点的F中检测到，并且在低毒力F质粒转染的细胞中没有检测到切割产物。R和S构建体的F蛋白在切割位点处具有n-联糖基化位点(NXT)，导致在SDS-PAGE上比lento和S-KM更慢的迁移率，因为KM突变废除了糖基化位点。这些数据证实，在F蛋白质切割位点处的R和S突变影响了F蛋白质切割，并且S-KN比S更有效。由于F和HN基因各自在编码EGFP基因的pVitro2-neo-MCS载体中进行克隆，因此合胞体形成可以通过融合的绿细胞进行可视化。在wt F和HN质粒转染的293细胞中观察到了大合胞体形成。在F蛋白质切割位点处具有R、S或S-KM残基的所有F突变导致大大降低合胞体形成。
实例17.与维洛细胞相比，在DF-1细胞中，具有198nt插入的r73T-R116i病毒展现出较慢的生长和差异性RNA和蛋白质合成谱。
在如图6B和6D中所示的高moi条件下，在鸡DF-1细胞中，在HN-L联接处插入198nt的R116i病毒展现出较慢的生长动力学。与wt和R病毒相比，具有198nt插入的R116i的生长差异被降低，这些wt和R病毒在感染的早期时间点(10-20小时)没有基因间插入。在维洛细胞中，在这些病毒中的生长差异不是非常明显的(图6C和6E)。为了理解在R116i病毒中的基因间插入是否影响病毒RNA转录和复制，分别通过RNA印迹分析和免疫印迹分析来检验在感染的DF-1细胞中的病毒RNA和蛋白质合成(图6F和6G)。在感染的DF-1细胞中大大降低了具有198nt插入的R116i的RNA和蛋白质合成。相比之下，在感染的维洛细胞中，上游基因转录物如NP mRNA在R118i-198或198RSV感染的细胞中大大增加，然而这两种病毒的基因组RNA减少了。这两种病毒的L蛋白的水平降低了，但是其他病毒蛋白产物增加了，如图6H和I中所示的NP、F和HN。在图6F-I中获得的数据是在高moi条件下进行的(moi＝5)。进一步在低moi条件下评估RNA和蛋白质合成(moi＝0.001)。此外，R116i-198或198RSV在DF-1和维洛细胞中具有差异性RNA和蛋白质合成谱。在鸡DF-1细胞中R116i-198或198RSV的RNA和蛋白质合成减少(图6J)。相比之下，在维洛细胞中增加了上游RNA和蛋白质，但是由于198nt序列的基因间插入，L mRNA和L蛋白的水平降低(图6K)。进一步在人类细胞系、人类纤维肉瘤HT1080和海拉细胞、以及DF-1细胞中比较病毒RNA和蛋白质合成(图6L)。这些数据确认了，R116i-198或198RSV具有差异表达，上游RNA和蛋白质合成增加，然而L蛋白质表达下调。这些数据解释了为什么R116i-198或198RSV病毒在哺乳动物细胞系如维洛、人类HT1080和海拉细胞中复制良好，但是在鸡胚和鸡DF-1细胞中生长不良。它还提供了这些R116i病毒的降低的鸡致病性的基础，如通过其低脑内致病性指数(ICPI)值所证实的。
实例18.在R116i-198RSV中，小鼠GM-CSF转基因表达比人类GM-CSF转基因表达具有更低的肿瘤生长抑制效力，但是在S116-KM中并不是。
图11C比较了在HT1080异种移植小鼠肿瘤模型中，mGM-CSF与hGM-CSF转基因表达对R116i-198RSV和S116-KM的溶瘤活性的贡献。hGM-CSF转基因并不与GM-CSF交叉反应，并且因此它被用作对照。与hGM-CSF相比，在瘤内给予的R116i-198中的mGM-CSF转基因在肿瘤生长抑制方面具有更低的效力。针对S116病毒，观察到了mGM-CSF和hGM-CSF的相似肿瘤生长抑制。通过噬斑测定来确定病毒治疗的肿瘤中的病毒滴度(图11D)。在肿瘤注射后的第4天，针对具有mGM-CSF或hGM-CSF对的R116i-198RSV和S116-KM检测到相似的滴度。然而，在注射后第7天，没有检测到具有mGM-CSF的R116i-198RSV，然而具有hGM-CSF的R116i-198RSV仍然具有约4.5logs/g组织的病毒滴度。在具有hGM-CSF或mGM-CSF的S116的病毒滴度方面没有差异。这些数据指示出通过R116i表达mGM-CSF有助于病毒清除。
检验在病毒感染的肿瘤组织中的免疫细胞浸润(图11E)。与具有hGM-CSF和S116hGM-CSF和具有mGM-CSF对的R116-198RSV相比，具有mGM-CSF的R116i-198RSV在治疗的肿瘤中具有最大数量的嗜中性细胞、NK和巨噬细胞。通过路明克斯测定来确定病毒治疗的肿瘤中的细胞因子和趋化因子(图11F)。与未治疗的肿瘤组织相比，所有四种病毒数倍地刺激细胞因子和趋化因子产生。R116i对mGM-CSF的表达比S116高出约10倍(106.7与9.9倍)。
图11G显示出在HT1080异种移植小鼠肿瘤模型中包含相同hGM-CSF转基因的HN-L联接之间插入198或318nt的R116i的相似的肿瘤生长抑制活性。在HN-L联接区中318核苷酸插入并没有降低病毒溶瘤病毒活性。
实例19.评估补体介导的NDV失活和调节性蛋白在补体逃脱中的作用。
补体(C’)系统在宿主中是抵抗微生物侵染的主要防御系统。在人类补体系统中存在约30种不同的糖蛋白，其中20种在血浆中作用并且10种是在细胞膜上的调节子或受体。膜结合性C’调节子(RCA)包括4种良好表征的分子：hCD46、hCD55、hCD59和hCD35。在不影响C’在消除外源试剂中的作用的情况下，它们的主要功能是保护人类细胞对抗自体补体攻击。这些RCA蛋白是宿主种特异性的。在过去被用于病毒疗法的NDV一般在鸡胚中产生。所预期的是，通过向癌症患者静脉注射给予的NDV溶瘤病毒可以被快速清除，因此减少了有效的病毒给药。由于从人类细胞产生的有包膜病毒在其从受感染细胞中外出的过程中掺入RCA蛋白中，因此，令人希望的是在人类细胞培养中产生NDV以减少C’介导的病毒溶解或失活。
通过检验在鸡胚、人类293和海拉S3悬浮细胞系中产生的NDV，来评估NDV对C’介导的失活的敏感性(图17)。在蛋中生长的病毒对C’失活是敏感的，通过加热处理(56℃持续30分钟)血清来废除血清抑制。豚鼠补体具有相似水平的病毒的失活作用(数据未显示)，确认了病毒失活是由于C’。此外，从海拉细胞产生的病毒比293细胞和蛋中产生的病毒对人类C’介导的病毒失活更有抵抗力。因此，数据表明针对NDV溶瘤病毒生产，海拉细胞比293细胞更好，这可能导致更低的病毒清除率，并且因此增加了治疗指数。
为了解释为什么从海拉S3细胞产生的NDV对C’更有抵抗力，针对4种良好表征的人类RCA蛋白(hCD46、hCD55、hCD59和hCD35)的水平评估293和海拉S悬浮细胞系。通过蛋白质印迹分析在293和海拉细胞中没有检测到hCD35，并且因此数据并没有显示在图18中。hCD46、hCD55、和hCD59在海拉S3细胞中比在293细胞中检测到更高的丰度。因此，RCA蛋白的水平与病毒对C’的敏感性成反比。
为了确定所有三种RCA蛋白是否调节C’功能，通过反向遗传学将hCD55、hCD59或hCD46转基因插入NDV基因组中，并且生产表达三种RCA蛋白中的每种的重组病毒。蛋白质印迹分析显示出这些RCA蛋白中的每种是通过病毒进行表达的，并且掺入到病毒粒子中(图19)。hCD55被确定为赋予C’失活功能的主要RCA蛋白(图20)。在蛋中生产的表达hCD55的病毒(hCD55被掺入病毒粒子)是对C’介导的失活最有抵抗力的，这与在海拉细胞中生产的病毒非常接近。相比而言，就对C’失活有抗性的病毒而言，hCD46具有边缘化的改进，并且hCD59在C’调节中没有可检测的作用。
结论，为了针对溶瘤病毒疗法减少病毒清除以及为了改进NDV治疗指数，海拉细胞被认为是针对病毒生产选择的细胞系。
使用下面的材料和方法获得了在此描述的这些结果。
细胞和病毒。
使用以下细胞系和相应的介质：非洲绿猴肾维洛细胞系(ATCC)和人类纤维肉瘤(HT1080，ATCC)，具有10％胎牛血清(FBS)的伊戈尔最低必需培养基(EMEM，Hyclone)；维洛细胞克隆51D11系(医学免疫公司)，具有1％谷酰胺的无血清培养液(SFMMegaVir，Hyclone)，正常人皮肤成纤维细胞(CCD1122Sk，ATCC)，具有10％FBS的ATCC配制的伊斯科夫改良达尔伯克培养基(Iscove's Modified Dulbecco's medium，IMEM)。将重组新城疫病毒(NDV)在10-11日龄的无特殊病原体(SPF)鸡胚的尿囊腔、维洛、或维洛克隆51D11细胞中生长。
NDV反基因组cDNA和支持质粒性NP、P和L的构建。
NDV病毒株73T的病毒RNA是从马克·皮尔普斯(MarkPeeples)博士(全国儿童医院(Nationwide Children’s Hospital))获得的。将NDV序列(GenBank)进行比对，以获得共有序列，来针对病毒RNA的RT-PCR来设计DNA寡核苷酸。通过高保真RT-PCR产生跨越整个NDV基因组的六个亚基因组cDNA重叠片段(图1)。修饰pUC19载体以包括88nt寡核苷酸连接体，该连接体包含在EcoRI和HindIII位点之间引入的限制位点用于顺序组装NDV 73T病毒株的全长反基因组cDNA。此外，73T病毒株cDNA质粒(p73T)在5’端包含27个核苷酸(nt)T7RNA聚合酶启动子，以及含有HDV反基因组核酶序列的189个nt以及在3’端的T7RNA聚合酶转录终止信号。为了产生非强毒NDV，将编码融合蛋白的蛋白酶切割位点的序列通过定点诱变修饰为非强毒NDV LaSota病毒株的(弱毒，lento)或巨细胞病毒的糖蛋白B(gB)的那些(S116)。针对NP、P和L表达质粒的构建，通过RT-PCR扩增蛋白开放阅读框(ORF)并且在T7RNA聚合酶的控制下克隆到质粒pCITE2a中。
将转基因插入NDV中。
针对在P-M联接处插入转基因，在包含SacII-PmlI片段的亚克隆质粒中在nt 3148处引入AfeI限制位点(图2A)。将编码人类或小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或白介素2(IL-2)的cDNA进行密码子优化并且通过DNA 2.0来合成。基因盒包含N的基因末端(GE)、P的基因起始(GS)和转基因的开放阅读框(ORF)，将该基因盒插入AfeI位点中。将来自得到的质粒中的SacII-PmlI片段转移到质粒r73T中并且命名为p73T-P1。
为了在HN ORF和HN的基因末端信号(GE)序列之间的HN-L联接处插入转基因，在包含AgeI-XbaI片段的质粒中在nt 8231处引入了AfeI限制位点(图2A)。使用一对磷酸盐正义和反义引物(表3) 通过PCR来产生基因盒，并且插入AfeI位点。
表3.用于插入转基因转录盒的寡核苷酸引物序列。
将基因末端(GE)和基因起始(GS)序列以下划线标出。以小写字母显示Kozak序列。以斜体显示与转基因的5’或3’序列相应的序列。除EGFP(H-N)之外，所有其他引物对可以被用来将转基因插入G-M或HN-L之间。
hGM-CSF：人类粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；mGM-CSF：小鼠GM-CSF；分别与人类和小鼠白介素2(IL-2)相应的hIL-2和mIL-2。
将来自得到的质粒中的AgI-XbaI片段转移到质粒p73T中，产生p73T-HN1。在HN-L联接处插入序列的另一个策略是将来自其他副粘病毒的转基因盒或序列插入在HN的基因末端信号(GE)和L的基因起始信号(GS)之间(图4)在AfeI位点处，该AfeI位点被引入到nt8359处。将FL cDNA质粒命名为p73T-R116i。由于NDV基因组长度必须是处于6个核苷酸的倍数(6规则)，所以使各种构建体的反基因组cDNA遵循6规则。
为了插入两个转录盒到P-M联接处，将AfeI位点引入GM-CSF的ORF的末端(nt3619)(图2B)。使用包含GE和GS序列的一对磷酸盐正义和反义引物来扩增IL-2ORF并且在AfeI位点插入。将来自包括GM-CSF和IL-2转录盒的得到的质粒中的SacII-PmlI片段换回质粒r73T中，产生p73T-P2。
产生包含其他副粘病毒的胞外结构域的r73T嵌合病毒。
通过将NDV的F和HN用鸽1型副粘病毒(PPMV-1)的那些替代来产生嵌合的NDV基因组DNA。将对于NDV 73T F的胞质尾区和跨膜部分(氨基酸残基503至553)而言的C-末端编码序列与PPMV-1的胞外结构域F蛋白编码序列(残基1至502)连接，使用GeneArt试剂盒(英杰公司(Invitrogen))通过重叠PCR反应将NDV HN的N-末端编码序列(氨基酸序列残基1至45)与HN(残基46至577)融合。将扩增的片段进行消化并克隆至PmlI-AgeI消化的NDV cDNA中。通过类似的克隆策略，将副流感病毒5(PIV-5)F或HN引入NDV73T反基因组cDNA中。将PIV5F(残基1至486)胞外结构域与NDV73T F的跨膜和胞质尾区(残基503至553)进行融合。将NDVHN(残基1至45)与PIV5HN胞外结构域(残基36至565)连接。将cDNA片段克隆至PmlI-AgeI消化的NDV反基因组cDNA中。
从转染cDNA质粒回收重组NDV。
使用Lipofectamine 2000，将表达T7RNA聚合酶的哺乳动物细胞系如BHK-T7细胞用表达NDVNP、P、和L蛋白(分别是，6孔板的0.4μg、0.4μg、和0.2μg/孔)的质粒和编码NDV反基因组cDNA的质粒(1.6μg)进行转染。在转染后三天，将细胞培养上清液注射到10至11-日龄的SPF鸡胚的尿囊腔中并且在维洛细胞中传代以扩增拯救的病毒。使用1％鸡红细胞(RBC)通过血细胞凝集测定来确认病毒的回收。如之前描述的，还可以通过将NP、P、L、反基因组cDNA质粒与表达T7RNA聚合酶的质粒一起电穿孔进入维洛细胞中，来进行病毒的拯救(考尔(Kaur)等人，优化质粒-针对人体试验，仅拯救高度减毒的和热敏的呼吸道合胞体病毒(RSV)疫苗选择物(Optimization of plasmid-only rescue of highly attenuatedand temperature-sensitive respiratory syncytial virus(RSV)vaccine candidatesfor human trials)2008，病毒学方法杂志(J.Virol.Methods)153:196-202)。通过对RT-PCR扩增的cDNA进行测序来确认回收的病毒。
体外传代来选择具有稳定的F蛋白质切割位点的病毒。
为了检验F蛋白质切割序列(FPCS))是否稳定并且在组织培养中传代后任何稳定化的突变可否进行选择，在维洛和人类纤维肉瘤HT1080细胞中，以0.01的MOI，将r73T-S116连续传代持续10次。在每2-3代后，将病毒RNA从培养基中分离，将cDNA通过RT-PCR进行扩增，并且测序F和/或HN基因。
在维洛细胞中病毒噬斑形态学和通过噬斑测定的滴度量化。
将在6孔板上的维洛细胞用连续稀释的病毒感染，并且在37℃下在1％甲基纤维素覆盖下孵育3天或6天用于噬斑形态学，在胰蛋白酶(TrpyLETM，英杰公司)的存在下用于病毒滴度量化。将细胞单层用甲醇固定，并且用抵抗全失活的NDV病毒的鸡抗NDV多克隆抗体进行染色，随后暴露于辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗鸡抗体(Dako)。
通过蛋平均死亡时间(MDT)和脑内致病性指数(ICPI)测定的病毒鸡致病性测试。
在10日龄的SPF鸡胚中通过平均死亡时间(MDT)测试来确定r73T病毒的致病性。在1日龄的SPF鸡中的ICPI测试在美国农业部国家兽医服务实验室进行(NVSL，埃姆斯，爱荷华州)。针对MDT测试，将在10-6和10-9之间的一系列10倍稀释的0.1ml每稀释接种于8-10个9-10日龄的蛋的尿囊腔中，并且在37℃下孵育。将蛋每天检验两次，持续7天，以记录胚胎死亡时间。该MDT计算为最小致死量病毒杀死所有接种的胚胎的平均时间(小时)。MDT测定提供了病毒致病性的合理预测。具有MDT<60小时的病毒通常是高毒力(强毒的)病毒株；在MDT＝60至90小时的情况下，是中等毒力(中级)病毒株；>90小时作为低毒力(无毒性的)病毒株。针对ICPI测试，通过脑内的途径，将每种病毒的0.05ml的1:10稀释的新鲜传染的尿囊液接种于具有10个1日龄的SPF鸡的小组中。针对临床症状和死亡率，每8小时一次观察它们，持续8天的时间。在每次观察时，它们被分为如下：如果正常0，如果生病1，以及如果死亡2。ICPI是8天时间内每只每次观察的分数平均值。ICPI值范围从0.0至2.0。弱毒(LoND)：ICPI<0.7；强毒(vND)：ICPI≥0.7。
通过细胞生活力测定评估的病毒细胞杀死。
将细胞以5×103细胞/孔置于96孔板中，以不同的MOI用r73T感染过夜。通过CellTiter Glo试剂盒(普洛麦格公司)按照造商手册来确定细胞生活力。通过将每个测试样品的ATP水平与100％有生活力的未治疗样品对照相比来确定存活细胞的相对百分比。在表中存在的数据为被杀死的细胞的相对百分比。
在皮下的HT1080异种移植模型中评估的NDV肿瘤杀死作用。
将无胸腺NCR同源裸鼠(Taconic)用5x 106Ht1080细胞(在100μL PBS中)经皮下(s.c.)移植到一胁部中。当肿瘤到达65-300mm3的体积时，病毒治疗开始。在100μl中的重组73T以不同的剂量水平分别通过瘤内(i.t)注射局部给予或者通过瘤内(i.t)注射到尾静脉中全身给予。将对照动物仅用100μL PBS进行注射。使用数显卡尺测量肿瘤生长，并且肿瘤体积计算为0.5x(高)x宽x长(mm3)。当体重下降了原始体重的20％或者肿瘤体积超出2000mm3时，将小鼠处死。
Ht1080异种移植小鼠中病毒生物分布。
将九只荷有HT1080人类纤维肉瘤异种移植皮下肿瘤的裸鼠用108pfu的r73T-R116i-hGM-CSF进行i.v注射。在注射后第1、4、和8天终结三只小鼠。将一只注射以PBS的小鼠在第8天终结。收集肿瘤、肺、脾、卵巢和血清样品。通过噬斑测定量化组织匀浆中的感染性病毒滴度。
通过ELISA量化GM-CSF蛋白水平。
将来自NDV感染的和PBS注射的小鼠中的肿瘤在PBS中使用MACS分离器(德国美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))根据厂商说明书进行均化。针对GM-CSF的水平，通过Duoset ELISA试剂盒(安迪生物公司(R&D))测试来自收集自小鼠的均化组织和血清的上清液。
统计学分析
使用GraphPad Prism 6.0软件进行所有的统计分析。使用不成对的t检验来评估在组之间的肿瘤消退中的差异。在正常以及肿瘤细胞中，针对体外细胞杀死，还使用GraphPadPrism软件来计算rNDV 73T的IC50。
其他实施例
从前述说明中，将显而易见的是，可以对本文所述的发明作出变更和修改以使其适应于各种用途和状况。这样的实施例也在下述权利要求的范围内。
在变量的任何定义中对要素清单的引用在本文中包括将所述变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或次组合)。在此的实施例的详述包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分结合的实施例。
本说明书中提及的全部专利、出版物、CAS、及登录号通过引用方式以相同的程度结合在此，如同专门且个别地指出通过引用的方式结合每份单独的专利、出版物、及登录号。

Claims (41)

1.一种减毒的新城疫病毒(NDV)，包括衍生自巨细胞病毒(CMV)的糖蛋白B(gB)的F蛋白质切割位点(S116)，其中该修饰的F蛋白质切割序列(FPCS)包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：
-S116：111H-N-R-T-K-S/F117
-S116K：111H-N-K-T-K-S/F117
-S116M：111H-N-R-M-K-S/F117
-S116KM：111H-N-K-M-K-S/F-I118
-R116：111H-N-R-T-K-R/F-I118。
2.如权利要求1所述的减毒的新城疫病毒，其中该减毒的病毒株是修饰的73T病毒株。
3.如权利要求1所述的减毒的新城疫病毒，其中该减毒的NDV病毒是r73T-R116病毒。
4.如权利要求1所述的减毒的新城疫病毒，其中该病毒包括增大的HN-L基因间区域。
5.如权利要求4所述的减毒的新城疫病毒，其中该HN-L基因间区域包括长度在至少约50-300核苷酸之间的非编码序列。
6.如权利要求5所述的减毒的新城疫病毒，其中该非编码序列衍生自1型副粘病毒(APMV-1)、呼吸道合胞体病毒(RSV)或随机序列。
7.如权利要求5所述的减毒的新城疫病毒，其中该HN和L基因间非编码序列长度为60nt、102nt、144nt、198nt、或318nt。
8.如权利要求1-7中任一项所述的减毒的新城疫病毒，其中该病毒包括在P-M联接处和/或HN-L联接处插入的一个或多个异源多核苷酸序列。
9.如权利要求8所述的减毒的新城疫病毒，其中该病毒包括两个或更多个异源多核苷酸序列，其中将至少一个异源多核苷酸序列在P-M联接处插入并且将至少一个在HN-L联接处插入。
10.如权利要求8所述的减毒的新城疫病毒，其中该异源多核苷酸序列是编码多肽的转基因，该多肽增强该病毒的溶瘤特性。
11.如权利要求9所述的减毒的新城疫病毒，其中该转基因编码细胞因子、细胞表面配体、和/或趋化因子。
12.如权利要求11所述的减毒的新城疫病毒，其中该细胞因子选自下组，该组由以下各项组成：GM-CSF、IL-2、IL-21、IL-15、IL-12、和IL-12p70。
13.如权利要求12所述的减毒的新城疫病毒，其中该细胞因子是人类GM-CSF。
14.如权利要求8所述的减毒的新城疫病毒，其中该异源多核苷酸序列是编码可检测部分的转基因。
15.如权利要求14所述的减毒的新城疫病毒，其中该可检测部分的表达水平与病毒复制相关联。
16.如权利要求1-7中任一项所述的减毒的新城疫病毒，其中将NDV的F和HN基因用犬副流感病毒5(PIV 5)或鸽1型副粘病毒(PPMV-1)的相应的胞外域替换。
17.如权利要求1所述的减毒的新城疫病毒，其中该病毒是73T-R116i-hGM-CSF。
18.如权利要求1所述的减毒的新城疫病毒，其中该减毒的病毒具有大于90小时或约90-156小时的蛋中平均死亡时间(MDT)。
19.如权利要求1所述的减毒的新城疫病毒，其中该减毒的病毒具有在约0-0.7之间的脑内致病指数。
20.如权利要求1所述的减毒的新城疫病毒，其中该减毒的病毒具有约0的脑内致病指数。
21.如权利要求1所述的减毒的新城疫病毒，其中该减毒的病毒在HT1080细胞中具有低于约15％的细胞毒性。
22.如权利要求1所述的减毒的新城疫病毒，其中该减毒的病毒以至少10％或15％的杀死效率选择性杀死肿瘤细胞。
23.如权利要求22所述的减毒的新城疫病毒，其中该肿瘤细胞杀死效率在约75％-100％之间。
24.如权利要求1-23中任一项所述的减毒的新城疫病毒在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于选择性杀死肿瘤细胞的方法中，该方法包括将肿瘤细胞与如权利要求1-23中任一项所述的减毒的新城疫病毒接触。
25.如权利要求1-23中任一项所述的减毒的新城疫病毒在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于在个体中诱导肿瘤细胞消退的方法中，该方法包括将肿瘤细胞与如权利要求1-23中任一项所述的减毒的新城疫病毒接触。
26.如权利要求1-23中任一项所述的减毒的新城疫病毒在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于减少肿瘤细胞生存或增殖的方法中，该方法包括将肿瘤细胞与如权利要求1-23中任一项所述的减毒的新城疫病毒接触。
27.如权利要求24-26中任一项所述的用途，其中该细胞是选自下组的癌细胞，该组由以下各项组成：膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、肉瘤癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、骨癌细胞、肝癌细胞、头颈癌细胞、胃癌细胞、肾癌细胞、黑色素瘤癌细胞、淋巴瘤癌细胞、白血病癌细胞、甲状腺癌细胞、结肠癌细胞、结肠直肠癌细胞、和黑色素瘤癌细胞。
28.如权利要求1-23中任一项所述的减毒的新城疫病毒在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于治疗个体中瘤形成的方法中，该方法包括向该个体给予有效量的如权利要求1-23中任一项所述的减毒的新城疫病毒。
29.如权利要求24-26和28中任一项所述的用途，其中该减毒的新城疫病毒是r73T-S116。
30.如权利要求25所述的用途，其中全身性地、腹膜内地、或瘤内地递送该减毒的新城疫病毒。
31.如权利要求25所述的用途，其中将该病毒以约107pfu至约109pfu的剂量进行给予。
32.如权利要求25所述的用途，其中将该病毒以约109pfu至约1011pfu的剂量经静脉内进行给予。
33.如权利要求28所述的用途，其中该个体具有选自下组的瘤形成，该组由以下各项组成：膀胱癌、卵巢癌、脑癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、骨癌、肝癌、头颈癌、胃癌、肾癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、和黑色素瘤。
34.如权利要求1-23中任一项所述的减毒的新城疫病毒在制备药物组合物中的用途，该药物组合物用于治疗已经产生抗NDV免疫应答的个体中的瘤形成的方法中，该方法包括向该给予有效量的如权利要求1-23中任一项所述的减毒的嵌合新城疫病毒，其中该病毒是包括犬副流感病毒5(PIV 5)或鸽1型副粘病毒(PPMV-1)的F和/或HN基因的嵌合病毒，其中所述嵌合新城疫病毒在抗原性方面与NDV不同。
35.如权利要求28所述的用途，其中相对于已经产生抗NDV免疫应答但是并没有接受嵌合新城疫病毒的对照个体中存在的溶瘤病毒的水平，该方法增加了个体中存在的溶瘤病毒的水平。
36.一种包括73T的全长cDNA的核酸，其中该核酸编码选自下组的修饰的F蛋白质切割序列，该组由以下各项组成：
-S116：111H-N-R-T-K-S/F117
-S116K：111H-N-K-T-K-S/F117
-S116M：111H-N-R-M-K-S/F117
-S116KM：111H-N-K-M-K-S/F-I118
-R116：111H-N-R-T-K-R/F-I118。
37.一种包括73T的全长cDNA的载体，其中该载体编码选自下组的修饰的F蛋白质切割序列，该组由以下各项组成：
-S116：111H-N-R-T-K-S/F117
-S116K：111H-N-K-T-K-S/F117
-S116M：111H-N-R-M-K-S/F117
-S116KM：111H-N-K-M-K-S/F-I118
-R116：111H-N-R-T-K-R/F-I118。
38.一种强毒颗粒，包括如权利要求36所述的核酸。
39.一种宿主细胞，被如权利要求1-23中任一项所述的减毒的新城疫病毒感染。
40.一种宿主细胞，包括如权利要求36所述的核酸。
41.如权利要求10所述的减毒的新城疫病毒，其中该转基因选自列于表5中的转基因。
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