TW201606079A - 以減毒新城雞瘟病毒為特徵之組合物及用於治療贅瘤形成之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供用於診斷及治療贅瘤形成之組合物及方法。
Description
本申請案主張於2013年9月3日提出申請之美國臨時申請案第61/873,039號之權益,該申請案之內容以引用方式併入本文中。
新城雞瘟病毒(NDV)係侵襲許多家養及野生禽類物種之導致傳染性鳥疾病之禽類病毒。人類於受感染鳥(例如,在家禽加工廠中)下之暴露可導致輕度結膜炎及流感樣症狀,但NDV原本對人類健康並無危害,且大多數人對NDV為血清陰性。基於雞中之病毒致病性,NDV致病性歸類為重度(強毒性)、中度(中毒性)或低度(弱毒性),如藉由大腦內致病指數(ICPI)所測定。由於對農業之關注,USDA自2008起已將具有雞毒力(ICPI>0.7)之中毒性及強毒性NDV歸類為「選擇劑」。選擇劑及毒素列表包括對人類及動物健康、植物健康或動物及植物產品具有嚴重威脅之潛能之生物劑。
NDV之天然形式已於臨床研究中用作免疫治療及病毒治療性生物劑。因病毒選擇性殺死對正常細胞具有有限毒性之人類腫瘤細胞的能力,故NDV顯示有希望作為抗癌劑。然而,由於NDV重新歸類為選擇劑,故無法進行作為抗癌劑之NDV之研發。其他溶瘤病毒在臨床試驗中已顯示相當希望。為促進NDV作為癌症療法之研發,需要病毒
之新穎形式。理想地,該等新穎形式將保留其靶向腫瘤細胞之能力,但不再引起鳥疾病。
如下文所闡述,本發明以用於治療贅瘤形成之組合物及方法為特徵。
在一態樣中,本發明通常提供具有NDV LaSota株或巨細胞病毒(CMV)(S116)糖蛋白B(gB)之F蛋白裂解位點的減毒新城雞瘟病毒(NDV)。在本發明之一實施例中,經修飾F蛋白裂解序列(FPCS)具有以下序列修飾中之一者:S116:111H-N-R-T-K-S/F117(SEQ ID NO:1);S116K:111H-N- K -T-K-S/F117(SEQ ID NO:2);S116M:111H-N-R- M -K-S/F117(SEQ ID NO:3);S116KM:111H-N- K - M -K-S/F-I118(SEQ ID NO:4);或R116:111H-N-R-T-K- R /F-I118(SEQ ID NO:5)。在另一實施例中,減毒病毒株係經修飾73T株。在另一實施例中,減毒NDV病毒係r73T-R116病毒。在其他實施例中,病毒具有增加的HN-L基因間隔區。在其他實施例中,HN-L基因間隔區係長度介於至少約50-300個胺基核苷酸之間之非編碼序列。在其他實施例中,非編碼序列係源自1型副黏液病毒(APMV-1)、呼吸道融合病毒(RSV)或隨機序列。在另一實施例中,HN與L基因間非編碼序列之長度為60 nt、102 nt、144 nt、198 nt或318 nt。在其他實施例中,該病毒具有一或多個插入P-M接合處及/或HN-L接合處之異源多核苷酸序列。在其他實施例中,該病毒具有兩個或更多個異源多核苷酸序列,其中至少一個異源多核苷酸序列插入P-M接合處且至少一個插入HN-L接合處。在其他實施例中,異源多核苷酸序列係編碼增強病毒之溶瘤特性之多肽的轉基因。在另一實施例中,轉基因編碼細胞介素、細胞表面配體及/或趨化因子。在其他實施例中,細胞介素係選自由以下組成之群:GM-CSF、IL-2、IL-21、IL-15、IL-12及IL-12p70。在具體實施例中,細
胞介素係人類GM-CSF。在其他實施例中,異源多核苷酸序列係編碼可檢測部分之轉基因。在某些實施例中,可檢測部分之表現量與病毒複製相關。在另一實施例中,NDV之F及HN基因經犬類副流感病毒5(PIV5)或鴿1型副黏液病毒(PPMV-1)之相應細胞外結構域替代。在另一具體實施例中,病毒係73T-R116i-hGM-CSF。在其他實施例中,減毒病毒具有大於90hr或約90-156小時之卵平均死亡時間(MDT)。在另一實施例中,減毒病毒具有介於約0-0.7之間之大腦內致病指數。在其他實施例中,減毒病毒具有約0之大腦內致病指數。在另一實施例中,減毒病毒在HT1080細胞中具有小於約15%之細胞毒性。在其他實施例中,減毒病毒以至少10%或15%之殺死效率選擇性殺死腫瘤細胞。在另一實施例中,腫瘤細胞殺死效率介於約75%-100%之間。
本發明之另一態樣通常以選擇性殺死腫瘤細胞之方法為特徵,該方法涉及使腫瘤細胞與本文所闡述之減毒新城雞瘟病毒接觸。在本發明之另一實施例中,腫瘤細胞係膀胱癌、卵巢癌、腦癌、胰臟癌、前列腺癌、肉瘤、肺癌、乳癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸癌、胃癌、腎癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、結腸癌細胞及黑色素瘤細胞。在另一實施例中,該方法涉及向個體投與有效量之本文所闡述之減毒新城雞瘟病毒。在另一實施例中,減毒新城雞瘟病毒係以全身性、腹膜內或腫瘤內方式遞送。在其他實施例中,病毒係以約107pfu至約109pfu之劑量投與。在其他實施例中,病毒係以約109pfu至約1011pfu之劑量經靜脈內投與。在其他實施例中,個體患有選自由以下組成之群之癌症:膀胱癌、卵巢癌、腦癌、胰臟癌、前列腺癌、肉瘤癌、肺癌、乳癌、子宮頸癌、肝癌、頭頸癌、胃癌、腎癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、結腸癌及黑色素瘤。
在另一態樣中,本發明通常以治療已發生抗NDV免疫反應之個體之贅瘤形成的方法為特徵,該方法涉及向個體投與有效量之本文所
闡述之減毒嵌合新城雞瘟病毒,其中該病毒係包含犬類副流感病毒5(PIV5)或鴿1型副黏液病毒(PPMV-1)之F及/或HN基因之嵌合病毒,其中該嵌合新城雞瘟病毒之抗原與NDV不同。在本發明之一實施例中,相對於已發生抗NDV免疫反應、但未接受嵌合新城雞瘟病毒之對照個體中所存在之溶瘤病毒之含量,該方法增加個體中所存在之溶瘤病毒之含量。
除非另有定義,否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬技術領域者通常所理解相同之含義。以下參考文獻向熟習此項技術者提供本發明中所使用之許多術語之一般定義:Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版,1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編輯,1988);The Glossary of Genetics,第5版,R.Rieger等人(編輯),Springer Verlag(1991);以及Hale及Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所使用,除非另有說明,否則以下術語具有歸於下文之含義。
「減毒新城雞瘟病毒」意指選擇性殺死腫瘤細胞、但對家禽不具威脅之新城雞瘟病毒。在一實施例中,減毒新城雞瘟病毒具有小於約0.4或0.7之ICPI。在其他實施例中,減毒新城雞瘟病毒具有介於約0與0.1之間之ICPI。
「異源多核苷酸序列」意指在野生型條件下不存在之重組多核苷酸。
「可檢測標記」意指在連接至所關注分子時,使後者可經由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學或化學方式檢測之組合物。例如,有用標記包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠質體子、螢光染料、電子緻密試劑、酶(例如,如ELISA中所常用)、生物素、地高辛
(digoxigenin)或半抗原。
「藥劑」意指任何小分子化學化合物、抗體、核酸分子或多肽或其片段。
「變化」或「改變」意指增加或減小。變化可小至1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%或40%、50%、60%,或甚至大至70%、75%、80%、90%或100%。
如本文所使用,術語「抗體」係指包含至少一個自摺疊多肽鏈形成之結合結構域的多肽或多肽之群,該等多肽鏈具有內表面形狀及電荷分佈與抗原之抗原決定簇之特徵互補的三維結合空間。抗體通常具有四聚體形式,包含兩對一致的多肽鏈,每一對皆具有一條「輕」鏈及一條「重」鏈。每一輕/重鏈對之可變區或可變鏈多肽形成抗體結合位點。
術語「mAb」係指單株抗體。本發明抗體包含(但不限於)全天然抗體、雙特異性抗體;嵌合抗體;Fab、Fab'、單鏈V區片段(scFv)、融合多肽及非習用抗體。
「生物樣品」意指自個體獲得之樣品,包括在活體內或原位獲得或收集之生物組織或流體來源之樣品。在具體實施例中,生物樣品包括任何細胞、組織、流體或源自有機體之其他材料。
「捕獲試劑」意指特異性結合核酸分子或多肽來選擇或分離核酸分子或多肽之試劑。
「臨床攻擊性」意指贅瘤之嚴重程度。攻擊性贅瘤比攻擊性較弱之贅瘤更可能轉移。儘管保守治療方法適用於攻擊性較弱之贅瘤,但攻擊性更強之贅瘤需要攻擊性更強之治療方案。
如本文所使用,術語「測定」、「評價」、「分析」、「量測」及「檢測」係指定量及定性測定二者,且因此術語「測定」在本文中可與「分析」、「量測」及諸如此類互換使用。在意欲進行定量測定時,
使用片語「測定分析物之量」及諸如此類。在意欲進行定性及/或定量測定時,使用片語「測定分析物之量」或「檢測」分析物。
術語「個體」或「患者」係指為治療、觀察或實驗目標之動物。僅舉例而言,個體包括(但不限於)哺乳動物,包括(但不限於)人類或非人類哺乳動物,例如非人類靈長類動物、鼠類、牛、馬類、犬類、綿羊或貓。
術語「減少」或「增加」分別意指負性或正性改變。變化可為5%、10%、25%、30%、50%、75%或甚至100%。
「參考」意指比較之標準。
「週期性」意指呈規則間隔。週期性患者監測包括例如每天、每兩週、每兩月、每月、每半年或每年投與之測試方案。
「贅瘤之嚴重程度」意指病理學之程度。贅瘤之嚴重程度隨例如贅瘤增加之階段或等級而增加。
可用於本發明方法中之核酸分子包括編碼本發明多肽或其片段之任何核酸分子。該等核酸分子無需與內源核酸序列100%一致,但通常將展現實質一致性。與內源序列具有「實質一致性」之多核苷酸通常能夠與雙鏈核酸分子之至少一條鏈雜交。「雜交」意指在不同嚴格度條件下在互補多核苷酸序列(例如,本文所闡述之基因)或其部分之間配對而形成雙鏈分子。(例如,參見Wahl,G.M.及S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399;Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。
例如,嚴格鹽濃度通常將小於約750mM NaCl及75mM檸檬酸三鈉,較佳小於約500mM NaCl及50mM檸檬酸三鈉,且更佳小於約250mM NaCl及25mM檸檬酸三鈉。在有機溶劑(例如甲醯胺)不存在下可獲得低嚴格度雜交,而在至少約35%甲醯胺、且更佳至少約50%甲醯胺存在下可獲得高嚴格度雜交。嚴格溫度條件通常將包括至少約30
℃、更佳至少約37℃、且最佳至少約42℃之溫度。不同其他參數(例如雜交時間、洗滌劑(例如,十二烷基硫酸鈉(SDS))之濃度及包括或不包括載體DNA)為彼等熟習此項技術者所熟知。不同程度之嚴格度係藉由視需要組合該等不同條件來實現。在較佳實施例中,雜交係在30℃下在750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉及1% SDS中進行。在更佳實施例中,雜交係在37℃下在500mM NaCl、50mM檸檬酸三鈉、1% SDS、35%甲醯胺及100μg/ml變性鮭魚精DNA(ssDNA)中進行。在最佳實施例中,雜交係在42℃下在250mM NaCl、25mM檸檬酸三鈉、1% SDS、50%甲醯胺及200.mu.g/ml ssDNA中進行。彼等熟習此項技術者將容易地明瞭該等條件之有用變化形式。
對於大多數應用,雜交後之洗滌步驟亦將改變嚴格度。洗滌嚴格度條件可由鹽濃度及溫度來定義。如上所述,可藉由降低鹽濃度或升高溫度來增加洗滌嚴格度。例如,用於洗滌步驟之嚴格鹽濃度較佳小於約30mM NaCl及3mM檸檬酸三鈉,且最佳小於約15mM NaCl及1.5mM檸檬酸三鈉。用於洗滌步驟之嚴格溫度條件通常將包括至少約25℃、更佳至少約42℃、且甚至更佳至少約68℃之溫度。在較佳實施例中,洗滌步驟係在25℃下在30mM NaCl、3mM檸檬酸三鈉及0.1% SDS中進行。在更佳實施例中,洗滌步驟係在42℃下在15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉及0.1% SDS中進行。在更佳實施例中,洗滌步驟係在68℃下在15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉及0.1% SDS中進行。彼等熟習此項技術者將容易地明瞭該等條件之其他變化形式。
雜交技術為彼等熟習此項技術者所熟知,且闡述於例如Benton及Davis(Science 196:180,1977);Grunstein及Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975);Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001);Berger及Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York);
及Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York中。
「實質上一致」意指展現與參考胺基酸序列(例如,本文所闡述之任一胺基酸序列)或核酸序列(例如,本文所闡述之任一核酸序列)至少50%一致性之多肽或核酸分子。較佳地,此一序列與用於比較之序列在胺基酸或核酸層級上至少60%、更佳80%或85%,且更佳90%、95%、96%、97%、98%或甚至99%或更大一致。
序列一致性通常係使用序列分析軟體(例如,Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705之序列分析軟體包、BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程式)來量測。該軟體藉由指配與多種取代、缺失及/或其他修飾之同源度來匹配一致或類似的序列。保守取代通常包括以下基團內之取代:甘胺酸、丙胺酸;纈胺酸、異白胺酸、白胺酸;天冬胺酸、麩胺酸;天冬醯胺、麩醯胺酸;絲胺酸、蘇胺酸;離胺酸、精胺酸;及苯丙胺酸、酪胺酸。在測定一致度之實例性方式中,可使用BLAST程式,其中e-3與e-100之間之可能性評分指示密切相關之序列。
如本文所使用,「實質上純淨」意指所關注物質係所存在之主要物質(即,基於莫耳濃度,其比組合物中之任何其他個別物質更豐富),且較佳地,實質上經純化之部分係其中目標物質包含至少約50%(基於莫耳濃度)之所存在所有大分子物質之組合物。通常,實質上純淨之組合物包含組合物中所存在之大於約80%之所有大分子物質,更佳大於約85%、90%、95%及99%。最佳地,將所關注物質純化至基本上均質(藉由習用檢測方法在組合物中無法檢測到污染物種類),其中組合物基本上係由單一大分子物質組成。
如本文所使用,術語「治療(treat、treating、treatment)」及諸如
此類係指減輕或改善病症及/或與其相關之症狀。應瞭解,治療病症或病況無需完全消除病症、病況或與其相關之症狀,但並不排除完全消除。因此,成功治療可延長患者之存活期或緩解不期望症狀。
如本文所使用,術語「預防(prevent、preventing、prevention)」、「預防性治療」及諸如此類係指降低未患但具有罹患病症或病況之風險或易患病症或病況之個體罹患病症或病況之可能性。
給藥係指單次投與治療組合物。劑量係指給藥中治療活性分子之量。治療方案係指一或多次給藥之投與劑量、方案及模式。週期係指在治療方案內一或多次給藥之可重複單元。在一些治療方案中,每次給藥之劑量係均一的。在其他治療方案中,劑量可能不均一。例如,可使用一或多次負載劑量將患者中治療分子之濃度提高至期望水準。負載劑量之後可為一或多個維持劑量,通常包含足以維持患者中治療分子之期望濃度之較低劑量(例如負載劑量之一半或更低)。可使用一或多個逐漸減少之劑量來逐步降低患者中治療分子之濃度。
「特異性結合」意指識別並結合分子(例如,多肽)、但實質上並不識別並結合其他分子之化合物(例如,抗體)。
除非明確說明或自上下文可明瞭,否則如本文所使用,術語「約」應理解為在業內正常耐量之範圍內,例如在平均值之2個標準偏差內。約可理解為在所述值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%內。除非上下文明確說明,否則本文所提供之所有數值皆係由術語約來修飾。
本文所提供之範圍應理解為該範圍內之所有值之簡寫。例如,1至50之範圍應理解為包括來自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50組成之群之任何數值、數
值之組合或子範圍。
本文所提供之任何化合物、組合物或方法可與本文所提供之任何其他組合物及方法中之一或多者組合。
除非上下文另外明確指出,否則如本文所使用,單數形式「一(a、an)」及該包括複數形式。因此,例如,對「生物標記物」之提及包括提及一個以上之生物標記物。
除非明確說明或自上下文可明瞭,如本文所使用,術語「或」應理解為具有包涵性。
術語「包括」在本文中意指片語「包括(但不限於)」,且可與該片語互換使用。
如本文所使用,術語「包含(comprises、comprising)」、「含有」、「具有」及諸如此類可具有美國專利法中針對其指定之含義,且可意指「包括(includes、including)」及諸如此類;「基本上由......組成」或「基本上組成」同樣具有美國專利法中所指定之含義,且該術語具有開放性,從而容許存在未列舉內容,只要未列舉者之存在不改變所列舉者之基本或新穎特徵即可,但不包括先前技術實施例。
全長NDV病毒73T之實例性核苷酸序列係:
(SEQ ID NO:6)
wt F蛋白之實例性核苷酸序列如下,其中加下劃線之序列表示F蛋白裂解位點之核苷酸序列:
(SEQ ID NO:7)
野生型F蛋白之實例性胺基酸序列如下,其中加下劃線之序列表示F蛋白裂解位點之胺基酸序列:
(SEQ ID NO:8)
小鼠GM-CSF之實例性核苷酸序列係:
(SEQ ID NO:9)
小鼠GM-CSF之實例性胺基酸序列係:
(SEQ ID NO:10)
人類GM-CSF之實例性核苷酸序列係:
(SEQ ID NO:11)
人類GM-CSF之實例性胺基酸序列係:
(SEQ ID NO:12)
圖1繪示NDV 73T反基因組cDNA株73T之構築。比對GenBank中之NDV序列以獲得共有序列,以設計用於病毒RNA之RT-PCR之DNA寡核苷酸。將藉由高保真度RT-PCR產生之六個亞基因組cDNA片段組裝於pUC19載體中。NDV 73T之全長cDNA稱為p73T。將73T中F蛋白裂解位點(FPCS)之核苷酸及所推導胺基酸序列修飾為NDV LaSota株(弱毒性,lento)及巨細胞病毒(CMV)(S116)之gB的F蛋白裂解位點。
雙斜線指示F蛋白之裂解位點。此外,73T株cDNA質體(p73T)含有在5'末端之27核苷酸(nt)T7 RNA聚合酶啟動子及含有HDV反基因組核酶序列之189 nt以及在3'末端之T7 RNA聚合酶轉錄終止信號。為產生非毒性NDV,藉由位點定向誘變將編碼融合蛋白之蛋白酶裂解位點之序列修飾成非毒性NDV LaSota株(弱毒性,lento)或巨細胞病毒(S116)糖蛋白B(gB)之彼等。圖1按出現順序分別揭示SEQ ID NO 34、16、35、1及17-18。
圖2A及2B繪示將轉基因盒插入NDV 73T基因組中。圖2A顯示在P-M接合處插入轉基因。在含有SacII-PmlI片段之亞選殖質體之nt 3148處引入AfeI限制性位點。cDNA編碼密碼子經優化之人類或小鼠顆粒球巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)或介白素2(IL-2)。所插入基因盒含有基因末端(GE;5'-TTAAGAAAAAA-3')(SEQ ID NO:13)、基因間核苷酸(T)、基因起始序列(GS;5'-ACGGGTAGA-3')(SEQ ID NO:14)及轉基因之開放閱讀框(ORF)。此外,將十個核苷酸(5'-cgccgccacc-3')(SEQ ID NO:15)插入起始位點上游以引入Kozak序列。
圖2A將全長序列揭示為SEQ ID NO:36。將來自所得質體之SacII-PmlI片段混洗至質體r73T中且命名為p73T-P1。此外,圖2A顯示在HN ORF與HN之基因末端信號(GE)序列之間之HN-L接合處插入轉基因,在含有AgeI-XbaI片段之質體之nt 8231處引入AfeI限制性位點。藉由
PCR使用一對磷酸鹽有義及反義引子(表3)產生基因盒並將其插入AfeI位點中。將來自所得質體之AgeI-XbaI片段混洗至質體p73T中,產生p73T-HN1。在P-M或HN-L接合處含有轉基因之全長(FL)73T cDNA分別稱為p73T-P1或p73T-HN1。圖2B顯示將兩個轉錄盒插入P-M接合處。在GM-CSF之ORF末端(nt 3619)引入AfeI位點。使用一對含有GE及GS序列之磷酸鹽有義及反義引子擴增IL-2 ORF並將其插入AfeI位點處。將來自包括GM-CSF及IL-2轉錄盒之所得質體之SacII-PmlI片段交換回至質體r73T中,從而產生p73T-P2。圖2B按出現順序分別揭示SEQ ID NO 36-37。
圖3A-3C顯示具有經修飾FPCS之感染性重組NDV株73T(r73T)之回收,且繪示活體外F蛋白裂解及融合活性。圖3A顯示在T7 RNA聚合酶啟動子及終止子之控制下如何選殖NDV 73T NP、P、L及反基因組cDNA(p73T-lento或p73T-S116)。將四種質體共轉染至表現RNA聚合酶之細胞系中。所回收病毒稱為r73T-lento或r73T-S116。使用含及不含胰蛋白酶補充物之培養基使r73T-lento及r73T-S116在Vero細胞中傳代。r73T-lento之生長具有胰蛋白酶依賴性,而r73T-S116可在不含胰蛋白酶補充物之培養基中生長。為評價r73T-S116中之FPCS及轉基因之遺傳穩定性,在未補充胰蛋白酶之培養基中,使在P-M接合處具及不具hGM-CSF之r73T-S116在Vero及人類纖維肉瘤HT1080細胞中以MOI 0.01進一步傳10代。FPCS中之突變(R113K及/或Q114M)發生在第7代,並在第9代時檢測到S116R突變。在第10代時,對F、HN及轉基因測序且未發現其他突變。圖3B及3C顯示F蛋白裂解位點(FPCS)突變對活體外細胞融合及F蛋白裂解之效應。為構築共表現兩個轉基因(GFP及NDV F或HN基因)之質體,藉由PCR擴增NDV F或HN基因之蛋白質開放閱讀框,並在巨細胞病毒(CMV)啟動子之控制下選殖至質體pVitro2-neo-MCS(Invitrogen)中。以5×105個細胞/孔將293T細胞接種
於6孔板上以供第二天轉染。圖3B繪示經2μg NDV F質體DNA轉染一天且於蛋白質溶解緩衝液中收穫以使用抗NDV F特異性多株抗血清進行西方墨點(Western blot)分析的細胞。具有弱毒性裂解位點及S116之NDV F蛋白並未裂解,故僅檢測到F0。R116及S116-KM之F蛋白部分裂解,如藉由出現F1蛋白條帶所指示。圖3C顯示共轉染有不同F質體與wt HN質體且藉由螢光顯微鏡檢查融合形成之細胞。Wt F蛋白在融合形成中並非最有效。
圖4係概述r73T-lento及r73T-S116衍生物之特徵之表。a所有病毒在P-M接合處皆含有hGM-CSF。b加下劃線處為FPCS中之與FPCS-S116不同之胺基酸(按出現順序分別為SEQ ID NO 21、38-40及4-5)。c培育36hr後在不含胰蛋白酶之Vero細胞塗層中之溶菌斑形成,且在×10放大倍數下可見。d卵平均死亡時間(MDT)。e藉由大腦內致病指數(ICPI),NDV在1天齡無病原體之雞中之致病性。在國家獸醫服務實驗室(National Veterinary Service Laboratories)(NVSL)(Ames,Iowa)實施ICPI分析。f在以0.01之感染倍率(MOI)感染後72小時時,病毒對人類纖維肉瘤HT1080細胞之細胞毒性效應。藉由比較每一樣品與視為100%活之未經治療細胞來確定存活細胞之相對百分比。表中所呈現之數據係死細胞之相對百分比。g在以0.01之MOI感染後使病毒於Vero細胞中生長,且在37℃下在不含胰蛋白酶補充物之OPTI-MEM中培養3-5天。h使病毒於受精雞卵中生長。使用1,000pfu之r73T感染10-11天齡之受精卵。在37℃下培育72hr後收穫羊水。在Vero細胞中藉由溶菌斑分析測定感染性病毒效價。
圖5A及5B繪示減弱雞中之r73T-R116病毒毒力的策略。圖5A繪示在P-M接合處(1)及HN-L接合處(2)插入轉基因,並藉由插入非編碼序列(3)來延長HN-L基因間區。P-M接合處插入轉基因盒與圖2A中所示相同。第2個轉基因盒含有L基因起始序列(GS;5'-ACGGGTAGA-3')
(SEQ ID NO:14)、轉基因之開放閱讀框(ORF)、來自L基因3’非轉譯區之序列(以斜體表示)及L基因末端序列(GE;5'-TTAAGAAAAAA-3')(SEQ ID NO:13)。用於延長HN-L接合處之非編碼序列取自1型副黏液病毒(APMV-1)、呼吸道融合病毒(RSV)或與已知序列不具序列一致性或同源性之隨機序列。插入序列可介於60-318 nt範圍內。在HN-L處插入第2個轉基因容許病毒表現兩個轉基因(例如hGM-CSF及GFP)。
圖5A按出現順序分別揭示SEQ ID NO 41-42。圖5B繪示插入HN-L接合處之序列(按出現順序分別為SEQ ID NO 43-48)。
圖6A係概述r73T-R116衍生物特徵之表。a所有病毒在P-M接合處含有hGM-CSF。b插入HN-L接合處之序列如圖5B中所示。c培育36小時後在不含胰蛋白酶之Vero細胞塗層中溶斑形成,且在×10放大倍數下可見。d卵平均死亡時間(MDT)。e藉由大腦內致病指數(ICPI),NDV在1天齡無病原體之雞中之致病性。在國家獸醫服務實驗室(NVSL)(Ames,Iowa)實施ICPI分析。f在以0.01之感染倍率(MOI)感染後72小時,病毒對人類纖維肉瘤HT1080細胞之細胞毒性效應。藉由比較各樣品與視為100%活之未經治療細胞來確定存活細胞之相對百分比。表中所呈現之數據係死細胞之相對百分比。g在以0.01之MOI感染後病毒於Vero細胞中生長,且在37℃在不含胰蛋白酶補充物之OPTI-MEM中培養3-5天。h病毒於受精雞卵中生長。使用1000pfu之r73T感染10-11天齡之受精卵。在37℃培育72小時後收穫羊水。在Vero細胞中藉由溶斑分析測定感染效價。
圖6B-6E係顯示重組NDV在DF-1及Vero細胞中之生長動力學之圖。使用每一所指示病毒以5.0(單一週期,圖6B及6C)或0.001(多個週期,圖6C及6D)之感染倍率(m.o.i.)感染六孔板中之DF-1及Vero細胞。以10小時間隔直至感染後50小時收集受感染細胞培養物上清液,且藉由溶菌斑分析來測定病毒效價。
圖6F及6G顯示DF-1細胞中之病毒RNA及蛋白質合成。使用如所指示之每一病毒以5.0之m.o.i感染DF-1細胞,培育20h,提取總細胞內RNA用於北方墨點(Northern blot)分析(圖6F),且藉由西方墨點(Western blotting)檢查第二組受感染細胞之蛋白質合成(圖6G)。藉由甲醛瓊脂糖凝膠中之電泳分離RNA,轉移至硝基纖維素膜中,且與特異性針對HN、NP、P及L基因之經生物素標記之RNA探針雜交。使用L基因中之陽性RNA探針來檢測病毒基因組RNA。在SDS-PAGE上分離總蛋白,且使用抗NP、F、HN及L血清實施印跡。藉由肌動蛋白特異性抗體檢測凝膠上所負載之總蛋白。在HN與L基因間序列之間插入198 nt之重組NDV R116i在DF-1細胞中具有總體上減少之RNA及蛋白質合成。
圖6H及6I繪示Vero細胞中之病毒RNA及蛋白質合成。圖6H顯示RNA合成之北方墨點分析。使用病毒以5.0之m.o.i感染Vero細胞,培育20h,提取總細胞內RNA。藉由甲醛瓊脂糖凝膠中之電泳分離RNA,轉移至硝基纖維素膜中,且與特異性針對NP及L基因之經生物素標記之RNA探針或有義L基因RNA雜交來檢測基因組RNA。圖6I繪示受感染Vero細胞中病毒蛋白質合成之西方墨點分析。在SDS-PAGE上分離總蛋白,轉移至硝基纖維素膜,且使用抗NP、F、HN及L血清實施印跡。藉由肌動蛋白特異性抗體檢測凝膠上所負載之總蛋白。與S116及wt NDV相比,具有198 nt插入之R116i病毒具有減少的基因組RNA及顯著增加之NP mRNA。L mRNA含量太低而無法確定差異。在Vero細胞中,L基因上游之蛋白質上調,但L蛋白含量降低。
圖6J及6K顯示藉由西方墨點分析以低感染倍率感染之DF-1及Vero細胞中蛋白質合成之比較。使用如所指示之每一病毒以0.001之m.o.i感染DF-1及Vero細胞,培育72h,且於蛋白質溶解緩衝液中收穫。在SDS-PAGE上分離總蛋白,轉移至硝基纖維素膜,且使用抗
NP、F、HN及L血清實施印跡。藉由針對肌動蛋白之抗體檢測凝膠上所負載之蛋白質。L蛋白之含量在兩種細胞系中皆有所降低,然而,L基因上游之蛋白質在DF-1細胞中下調但在Vero細胞中上調。
圖6L顯示受感染人類細胞中與DF-1細胞相比之病毒蛋白質合成。使用如所指示之每一病毒以5.0之m.o.i感染人類HT1080、Hela細胞及DF-1細胞,培育20h,且於蛋白質溶解緩衝液中收穫。在SDS-PAGE上分離蛋白質,轉移至硝基纖維素膜,且使用抗HN及抗L血清實施印跡。在HN與L接合處之間插入198 nt之R116i之HN蛋白表現在HT1080及Hela細胞中增加,但在DF-1細胞中減少。L蛋白在經R116i-198或198RSV感染之所有三種細胞系中皆減少。
圖7係繪示r73T病毒在受精雞卵中之生長動力學之圖。為確定r73T病毒之生長條件,在卵中實施生長動力學研究。使用100、1000、10,000或100,000PFU/卵之所指示病毒感染受精雞卵,且培育2天、3天或4天(73T wt,左上方;R116,右上方;R116i-318,左中間;R116i-198-RSV,右中間;R116i-198-隨機,左下方;S116-KM,右下方)。收穫尿囊液且藉由FFA測定病毒效價。接種100 FFU/卵在第1天時具有低效價,但在第2天時達到峰值效價。總之,無論所用接種劑量如何,大部分病毒在第2天時皆達到約8 log/mL之峰值效價。在第2天時,R116i-198具有最低效價,低接種物劑量產生最高產率,此指示可能存在缺陷性粒子之累積。R116i-318-APMV-插入亦具有約7 log之較低峰值效價。R116i-198-RSV達到7.5 log之峰值效價。藉由反向遺傳學再衍生之S116在卵中之病毒產生並未降低。因此,在R116衍生物中,根據卵中之生長特性,具有RSV-198 nt插入之病毒係首選溶瘤病毒候選者。
圖8係繪示r73T病毒在Vero細胞中之生長動力學之圖。亦在無血清Vero細胞純系51D11(由MedImmune產生之專有細胞系)中評估病
毒。所有病毒在兩種moi條件(0.001,上圖;0.0001,下圖)下皆以相似方式充分複製。73T FPCS之修飾及R116之HN-L接合處中之基因間插入並不影響Vero細胞中之病毒生長。
圖9A-9D顯示與非贅瘤細胞相比,r73T病毒在腫瘤細胞中選擇性複製,且對腫瘤細胞具有細胞毒性。在使用r73T衍生物以介於1至100,000PFU範圍內之不同劑量感染72小時後獲得數據。圖9A係顯示評估rT3T及其衍生物在人類纖維肉瘤HT1080中相對於未經治療之對照細胞之細胞殺死的圖。在HT1080癌細胞中,具有弱毒性FPCS之病毒具有最小殺死,在FPCS處具有S116之病毒具有中等殺死,且在FPCS處具有R116之病毒具有與r73T wt病毒同樣有效之細胞殺死。圖9B係顯示評估rT3T及其衍生物在正常人類皮膚纖維母細胞CCD1122Sk細胞中相對於未經治療之對照細胞之細胞殺死的圖。在正常CCD1122SK細胞中,所有病毒皆未如殺死癌細胞般有效地殺死該等細胞,且殺死效率降低至約1/100。無論FPCS序列如何,所有病毒在正常細胞中皆具有相似的殺死,此可能因單一複製週期(無病毒擴散)所致。圖9C係顯示癌細胞及正常細胞中之細胞殺死效率之表,使用Prism 6.0該細胞殺死效率表示為自劑量反應曲線內插之50%有效濃度(EC50)。R116衍生物具有與r73T wt相似之EC50值,且EC50為10PFU,此指示FPCS之修飾並不影響病毒在癌細胞中之複製及細胞殺死效率。圖9D係顯示在以MOI 0.01感染後第3天時病毒在HT1080及CCD1122SK細胞中之複製的圖。與正常細胞相比,所有病毒優先在癌細胞中複製,且差為約1.5-2.0 log。
圖10A及10B係顯示r73T衍生物在局部及全身投與後有效地引起腫瘤消退之圖。為評估活體內溶瘤活性,藉由將濃度為5×106個細胞/0.1ml之HT1080細胞皮下注射至5-6週齡之Balb/C無胸腺裸小鼠中來建立HT1080異種移植物模型。圖10A係顯示經腫瘤內(it)或靜脈內(iv)
投與之R116i-318-hGM-CSF之效應的圖。數據顯示R116i-318-hGM-CSF衍生物當以全身性或腫瘤內方式遞送至攜載人類腫瘤異種移植物之免疫缺陷性小鼠時具有活體內抗腫瘤活性。比較治療組與對照組之間之腫瘤生長速率。由兩種投與途徑引起之腫瘤消退皆與對照組顯著不同。當腫瘤體積達到約65mm3時,如所指示將小鼠隨機化至多個組(n=10)中。使小鼠接受單次劑量之PBS或2×107Pfu之r73T-hGM-CSF-R116i-198(經腫瘤內(IT)投與)或1×108PFU(經由尾靜脈注射經靜脈內(IV)投與)。* P<0.05,未配對樣本T測試。圖10B係藉由IV注射1×108PFU比較r73T衍生物在HT1080異種移植物中之溶瘤活性的圖。兩種r73T衍生物劑量能夠引起顯著的腫瘤消退且具有不同程度之有效性。r73T-lento在腫瘤消退方面最不有效,而r73T wt在腫瘤消退方面最有效。r73T-lento具有與S116病毒相似之效應,但S116病毒在活體外細胞殺死中具有低10倍之EC50(參見圖9A)。r73T-R116i-318如同73T wt一般有效地抑制腫瘤生長,直至第2次劑量後9天(腫瘤植入後第19天),腫瘤在經R116i治療之小鼠中再次生長,但在經73T wt治療之組中未再生長。當腫瘤體積達到約180mm3時,將小鼠隨機化至多個組(n=7)中。藉由IV投與使小鼠接受PBS或1×108PFU之r73T-hGM-CSF-lento(lento)或r73T-hGM-CSF-S116K113M114(S116 KM)或r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N(R116i)或r73T-hGM-CSF(r73T wt)。
每3-4天量測腫瘤大小。* P<0.05,未配對樣本T測試。數據顯示r73T衍生物當以全身性或腫瘤內方式遞送至攜載人類腫瘤異種移植物之免疫缺陷性小鼠時具有活體內抗腫瘤活性。F蛋白之有效裂解對活體外及活體內病毒複製至關重要。在FPCS處具有R116之病毒在活體外及活體內細胞殺死方面更強效。
圖11A-G繪示靜脈內遞送後r73T衍生物之組織生物分佈及小鼠GM-CSF與人類GM-CSF相比之對腫瘤生長抑制之效應。為確定溶瘤
NDV病毒在腫瘤組織中是否選擇性複製及病毒清除率,測定不同器官中之病毒分佈。使用劑量為1×108PFU之R116i(r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N)經靜脈內治療帶有大小為約250mm3之皮下HT1080腫瘤之無胸腺裸小鼠,且在第1天、第4天或第8天(n=3/時間點)時處死該等小鼠。收集血清、肺、脾、卵巢及腫瘤且量化病毒之存在。評價感染後第1天、第4天及第8天時腫瘤及器官中之病毒複製。圖11A係繪示在Vero細胞中藉由溶菌斑分析量化組織中之病毒的圖。僅在第1天時檢測器官中之病毒(在卵巢中在所有時間點下皆未檢測到病毒,數據未顯示),且腫瘤組織中之病毒負載係肺及脾中病毒負載的約100倍。腫瘤中病毒之存在持續至少8天,此指示病毒在腫瘤組織中選擇性複製。
圖11B係繪示藉由ELISA分析hGM-CSF轉基因表現量化組織中由病毒表現之GM-CSF的圖。與藉由溶菌斑分析獲得之病毒複製數據一致,在腫瘤組織中hGM-CSF之含量最高且持續8天以上。該等數據展示NDV病毒可在腫瘤組織中有效地複製,且轉基因可有效地遞送至局部腫瘤組織。
圖11C繪示顯示在HT1080異種移植物小鼠腫瘤模型中mGM-CSF表現對腫瘤生長抑制之效應的圖。向七組5-6週齡之無胸腺裸小鼠之右側腹中皮下(s.c.)植入5×106個HT1080細胞。當腫瘤達到110mm3之體積時(第6天),向腫瘤注射單次劑量之1×108pfu rNDV、具有mGM-CSF或hGM-CSF之R116i-198RSV。每3-4天量測腫瘤大小。具有mGM-CSF之R116i-198RSV在腫瘤生長抑制方面不如hGM-CSF轉基因強效。然而,對具有hGM-CSF或mGM-CSF之S116未觀察到腫瘤生長抑制差異。
圖11 D繪示顯示在HT1080異種移植物小鼠腫瘤模型中mGM-CSF對自腫瘤清除病毒之效應的圖。向三組無胸腺裸小鼠之右側腹中皮下
(s.c.)植入5×106個HT1080細胞。當腫瘤達到180mm3之體積時(第10天),使用一個劑量之1×108pfu之R116i-198RSV或S116KM經靜脈內治療小鼠。在第4天或第7天時收集腫瘤,且藉由溶菌斑分析測定腫瘤組織中之病毒效價。具有mGM-CSF或hGM-CSF之R116i-198RSV及S116KM二者在第4天時具有相當效價。在第7天時,具有mGM-CSF之R116i-198RSV與具有hGM-CSF之R116i-198RSV相比顯著降低。相比之下,S116mGM-CSF與S116hGM-CSF之效價相當。
圖11E繪示顯示在HT1080異種移植物小鼠腫瘤模型中R116i-198RSV或S116KM感染對腫瘤中之免疫細胞浸潤之效應的圖。向三組無胸腺裸小鼠之右側腹中皮下(s.c.)植入5×106個HT1080細胞。當腫瘤達到180mm3之體積時(第10天),使用一個劑量之1×108pfu之如所指示之病毒經靜脈內治療小鼠。在第4天時收集腫瘤,且處理組織用於藉由FACS分析嗜中性球、NK細胞及巨噬細胞染色。R:R116i-198-RSV,S:S116-KM。具有mGM-CSF之R116i-198RSV具有更多免疫細胞浸潤。
圖11F繪示顯示在HT1080異種移植物小鼠腫瘤模型中細胞介素及趨化因子上調之表。向三組無胸腺裸小鼠之右側腹中皮下(s.c.)植入5×106個HT1080細胞。當腫瘤達到180mm3之體積時(第10天),使用一個劑量之1×108pfu之具有hGM-CSF或mGM-CSF之R116i-198RSV或S116KM經靜脈內治療小鼠。在第4天時收集腫瘤,且處理組織用於藉由Luminex分析細胞介素及趨化因子之含量。病毒感染引起局部腫瘤組織中產生細胞介素及趨化因子,其含量基於病毒骨架及人類或小鼠GM-CSF而變化。
圖11G繪示顯示在HT1080異種移植物小鼠腫瘤模型中R116i-198RSV-hGM-CSF與R116i-318APMV-hGM-CSF在腫瘤生長抑制方面相當之圖。向七組無胸腺裸小鼠之右側腹中皮下(s.c.)植入5×106個
HT1080細胞。當腫瘤達到約110mm3之體積時(第6天),經腫瘤內注射單次劑量之1×108pfu之病毒。每3-4天量測腫瘤大小並製成圖表。
198 nt及318 nt之插入長度並不影響R116i溶瘤活性。
圖12A及圖12B繪示含有嵌合F及/或HN基因之73T之反基因組cDNA的構築及其表徵,且圖12C比較RNA聚合酶複合物活性之功能。病毒表面糖蛋白係對雞中之免疫原性及毒力至關重要之抗原。藉由在雞中無毒性之其他副黏液病毒之個別或呈組合形式之相應細胞外(包外)結構域替代NDV之F及/或HN基因。副流感病毒5(PIV 5)係犬類副黏液病毒,且不會導致人類疾病,且已顯示鴿1型副黏液病毒(PPMV-1)在雞中無毒性。圖12A顯示使用PPMV-1及/或PIV5之F及/或HN糖蛋白胞外結構域替代全長反基因組NDV 73T cDNA之彼等。
NDV、PIV5及PPMV-1序列分別係以呈藍色、紫色或綠色之有色框指示。指示個別蛋白質或蛋白質結構域之胺基酸長度。圖12A按出現順序分別揭示SEQ ID NO 34、34及49。圖12B係顯示含有嵌合F及/或HN基因之73T衍生物之特徵的表。如前文所闡述實施Vero中之溶菌斑形成、相對HT1080細胞殺死及MDT。回收除PVI-5 F-HN外之嵌合病毒,且使其能夠於不存在外源胰蛋白酶之細胞中生長。所有三種病毒皆形成適當大小之溶菌斑,且顯示有效的細胞至細胞擴散。PPMV-1F-HN或F嵌合病毒分別具有79hr及84hr之MDT值,此指示在雞中之潛在毒力。兩種PPMI-1嵌合病毒以71%及61%之水準有效地殺死HT1080細胞。PIV5-F嵌合體並不在卵中生長且在雞中無毒性,但殺死47%的HT1080細胞。藉由中和分析使用自IV投與2個劑量之1×108PFU之r73T-R116i的小鼠收集之血清檢查NDV與PPMV-1或PIV5嵌合體之間之血清交叉反應性。r73T病毒可經受NDV感染之血清中和(效價960),而PPMV-1及PIV5嵌合體無法被中和(效價<4),從而確認NDV與PPMV-1或PIV5之間無交叉反應性。在已在先前NDV治療期間發生
抗NDV免疫反應之患者中,具有不同抗原性之嵌合病毒可係加強溶瘤病毒。
圖12C顯示藉由微型基因組分析比較NDV與其他副黏液病毒之RNA聚合酶活性。使用Lipofectamine 2000使用以下質體轉染表現T7之細胞:三個表現NDV之NP、P、L蛋白之質體,及編碼NDV反微型基因組cDNA(編碼GFP基因)之質體,或編碼麻疹病毒(MV)或呼吸道融合病毒(RSV)之N、P、L基因的質體及各別RSV或MV GFP反微型基因組cDNA質體。轉染後兩天或三天,在螢光顯微鏡下檢查如藉由GFP蛋白之表現所指示之微型基因組複製。NDV與麻疹病毒及RSV相比具有最強聚合酶活性。
圖13A及13B顯示癌細胞系對rNDV變體之敏感性。使用NDV S116或NDV R116i以0.1之MOI感染來自不同來源組織之癌細胞系,且使用Cell Titre Glo評價感染後72hr之細胞活力。對NDV之敏感性定義為在感染後72hr時大於30%之細胞殺死。圖13A繪示在最少16種廣義適應症中NDV敏感性人類癌細胞系之百分比的圖。每一組內細胞系之數量以數值形式指示於表中。圖13B繪示22種癌細胞系對NDV變體之敏感性之圖。細胞殺死%定義為未經治療之對照細胞之百分比。
圖14係顯示癌細胞系對recNDVGM-CSF之允許度之圖。R116i-GM-CSF於代表性腫瘤細胞系中之細胞殺死呈現於圖14中。以0.1之MOI感染腫瘤細胞系後3天測定相對於未受感染對照之最大殺死%。儘管某些細胞系係源自相同的腫瘤類型,例如膀胱癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、胰臟癌及肺癌,但其顯示對病毒殺死之不同敏感性。來自每一腫瘤適應症之可由R116i-GM-CSF以>50%之速率殺死的細胞係數量概述於表1中。
圖15A-F係顯示在不同小鼠癌症模型中NDV衍生物抑制腫瘤生長之圖。圖15A及15B係顯示在同基因小鼠黑色素瘤模型(B16F10 AP3)中
recNDVGM-CSF株抑制腫瘤生長之圖。在先導研究中之B16黑色素瘤模型中評估73T-R116i-hGM-CSF(圖15A左圖)及R116i-mGM-CSF(圖15A右圖)之溶瘤效應。在評估B16小鼠中之病毒耐受性時,組大小較小(n=3)。在第11天及第14天時以2×107pfu靜脈內(i.v)投用每一病毒兩次;在第11天及第14天時以2×107pfu腹膜內(i.p)投用兩次;或在第11天時以1.1×107pfu腫瘤內(i.t)投用一次。使用R116-hGM-SCF或mGM-SCF藉由三條投與途徑治療之組具有與未經治療之組相比較緩慢之腫瘤生長速率。腫瘤抑制率與對照組相比在統計學上較顯著。
圖15B顯示腫瘤內投與1×108pfu之S116 NDV變體之B16F10同基因鼠類黑色素瘤模型中之效能研究。腫瘤生長抑制顯示於左圖上,且個別動物量測顯示於中間圖上,且存活曲線顯示於右圖上。
圖15C顯示NDV在免疫勝任小鼠CT26結腸直腸腫瘤模型中具有強效抗腫瘤活性。具體而言,圖15C提供腫瘤內投與1×108pfu之編碼R116 NDV變體之人類GM-CSF的CT26同基因鼠類結腸直腸模型中之效能研究。腫瘤生長抑制顯示於右圖上,且剩餘腫瘤之IHC分析顯示於利用H及E以及NDV染色之右側。指示腫瘤之壞死區域、多核融合之證據及活力區域。
圖15D-F繪示卵巢異種移植物模型中之腫瘤生長抑制。向無胸腺裸小鼠之右側腹中皮下(s.c.)植入Ovcar4細胞。當腫瘤達到100mm3之體積時,將小鼠隨機化至治療組中。向所建立腫瘤每週一次注射2.5×107pfu rNDV、具有mGM-CSF或hGM-CSF之R116i-318。顯示腫瘤生長曲線(圖15D)及腫瘤之組織學分析(圖15E及圖15F)。
圖16係概述NDV構築體之特徵之表。培育36hr後在不含胰蛋白酶之Vero細胞塗層中之溶菌斑形成,且在×10放大倍數下可見。在以0.01之感染倍率(MOI)感染後72小時時,病毒對人類纖維肉瘤HT1080細胞之細胞毒性效應。藉由比較每一樣品與視為100%活之未經治療
細胞來確定存活細胞之相對百分比。表中所呈現之數據係死細胞之相對百分比。藉由大腦內致病指數(ICPI),NDV在1天齡不含病原體之雞中之致病性。在國家獸醫服務實驗室(NVSL)(Ames,Iowa)實施ICPI分析。圖16按出現順序分別揭示SEQ ID NO 50-54、53及53。
圖17係顯示自卵及人類細胞系產生之NDV對補體介導之失活展現不同敏感性之圖。使用PBS連續稀釋具有確認的補體(C’)活性之人類血清(Sigma,St.Louis,MO),且在37℃下與100pfu之NDV一起培育1小時,然後感染Vero細胞用於溶菌斑分析。在37℃下培育6天後,藉由結晶紫染色使溶菌斑可見並評分。藉由以1:10至1:40稀釋之血清使受精雞卵中之病毒生長幾乎失活。293生長之病毒比卵生長之病毒對C’更具抗性,在1:40之血清濃度下保留約40%感染力。然而,Hela生長之病毒對C’介導之病毒失活最具抗性。約90%之活病毒在1:40之血清濃度下具有感染性。
圖18A及18B係顯示比較293及Hela細胞以及自該兩種細胞系產生之病毒中的RCA蛋白含量之西方墨點。對於圖18A,將等量293及HelaS3細胞負載於SDS-PAGE中用於西方墨點。Hela細胞含有高於293細胞之hCD46、hCD55及hCD59蛋白含量。圖18B顯示經實施以檢查來自受感染293或Hela細胞之病毒中之蛋白質量的西方墨點。未受感染之細胞(模擬物)用作對照。在含量高於來自293細胞之病毒之來自受感染Hela細胞之病毒中檢測到三個CD分子。
圖19顯示在C’介導之病毒失活中對膜結合C’調控劑(RCA)蛋白之評估。藉由Origene(Rockville,MD)或Genscript(Piscataway,NJ)合成編碼hCD55、hCD59及hCD46之cDNA。將每一基因盒插入NDV反基因組cDNA之P-N基因間隔區中,且藉由反向遺傳學產生重組病毒。
在卵中擴增重組病毒且藉由15%-60%蔗糖梯度純化,並藉由超離心使病毒條帶沈澱。藉由西方墨點確認重組NDV對每一RCA蛋白之表現。
圖20係顯示CD55係用於防止NDV之C’失活之主要RCA蛋白之圖。在卵中擴增具有hCD46、hCD55或hCD59之NDV,藉由蔗糖梯度純化,與自1:10至1:40稀釋之人類血漿一起培育1小時,且藉由Vero細胞中之溶菌斑分析檢查病毒感染力。在卵中產生之具有hCD55之NDV與在Hela細胞中產生之NDV相比具有相似的C’抗性,在1:20之血漿濃度下為約65%活病毒且在1:40之血漿濃度下為約80%活病毒。與NDV對照相比,hCD46似乎輕微地或稍微改良病毒對C’介導之失活之抗性,當與1:40稀釋之人類血漿一起培育時多約20%活病毒。在較低血漿稀釋下未檢測到差異。
本發明以包含減毒新城雞瘟病毒之組合物及使用該病毒治療贅瘤形成之方法為特徵。
本發明至少部分地基於具有減小的雞毒力之溶瘤NDV之發現。
如下文更詳細報導,NDV 73T株係源自於1948年首次出售之商業家禽疫苗(中毒性)NDV MK-107。NDV MK-107株通過73代維持於艾氏腹水(Ehrlich ascites)腫瘤細胞中(Cassel等人,Cancer.1965年7月;18:863-8)。在1970年代,NDV MK-107用於一系列Ph I及Ph II臨床研究中。NDV MK-107亦於1980年代用作免疫治療劑來治療晚期黑色素瘤患者(Cassel等人,Cancer.1983 1;52:856-860;Murray等人,Cancer.1977.40:680-686)。
為產生具有減小的雞毒力之溶瘤NDV,重組NDV 73T株包括某些遺傳修飾。具體而言,改變F蛋白裂解序列並增加HN-L基因間序列之長度。有利地,可使用經修飾病毒來表現所關注之轉基因。在一實施例中,NDV 73T株包括編碼增強重組NDV之溶瘤特性之多肽的轉基因。在另一實施例中,NDV 73T株包括編碼提供可用於監測病毒複製之讀出值之生物標記物的轉基因。若需要,NDV 73T株可經修飾以納
入破壞標準基因組之正常轉錄極性且預期進一步減小雞中之病毒毒力之其他遺傳資訊。因此,本發明提供使用反向遺傳學產生之重組新城雞瘟病毒(NDV)以減少其在雞中之發病,同時維持其選擇性癌細胞殺死能力;及產生此一病毒之方法。本發明亦提供NDV之構築及其用途,其作為病毒載體用於遞送並表現異源基因產物以供增強的癌症治療。編碼可藉由NDV遞送之實例性治療劑之轉基因闡述於下文中。在下文所闡述之工作實例中,表現顆粒球巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)之新穎NDV病毒構築體會選擇性殺死癌細胞,但並不殺死正常細胞。當在異種移植物HT1080腫瘤模型中測試時,在多個癌細胞系以及活體內觀察到此選擇性癌細胞殺死效應。在其中觀察到腫瘤消退之黑色素瘤模型中亦展示重組減毒新城雞瘟病毒(NDV)之效能及選擇性。總之,本發明提供將特定轉基因插入重組減毒NDV載體中及所編碼蛋白質在腫瘤環境中之有效表現。
新城雞瘟病毒(NDV)係含有線性、單鏈、非分段、負義RNA基因組之有包膜病毒。NDV之負義、單鏈基因組編碼RNA定向RNA聚合酶、融合(F)蛋白、血球凝集素-神經胺糖酸苷酶(HN)蛋白、基質蛋白、磷蛋白及核蛋白。基因組RNA含有呈以下順序之基因:3'-NP-P-M-F-HN-L。NDV RNA基因組之結構更詳細闡述於下文中。基因組RNA亦在3'末端含有前導序列。
病毒粒子之結構要素包括為源自細胞質膜之脂質雙層之病毒包膜。糖蛋白、血球凝集素-神經胺糖酸苷酶(HN)自包膜伸出,從而容許病毒含有血球凝集素及神經胺糖酸苷酶活性二者。融合糖蛋白(F)係一種整合膜蛋白,其首先係以無活性前體產生,然後在轉譯後裂解以產生兩個二硫鍵連接之多肽。活性F蛋白藉由促進病毒包膜與宿主細胞質膜之融合來參與NDV至宿主細胞中之滲透。基質蛋白(M)參與
病毒組裝,且與病毒膜以及核衣殼蛋白二者相互作用。
核衣殼之主要蛋白質亞單位係賦予衣殼螺旋對稱性之核衣殼蛋白(NP)。P及L蛋白與核衣殼相關。磷蛋白(P)係磷酸化之對象,業內認為其在轉錄中起調控作用,且亦可參與甲基化、磷酸化及多腺苷酸化。L基因編碼RNA依賴性RNA聚合酶,該基因為病毒RNA合成以及P蛋白所必需。L蛋白佔據了病毒基因組幾乎一半的編碼能力,其係最大的病毒蛋白,且在轉錄及複製二者中起重要作用。
所有負鏈RNA病毒(包括NDV)之複製因不存在複製RNA所需之細胞機構而複雜化。另外,負鏈基因組無法直接轉譯成蛋白質,但必須首先轉錄成正鏈(mRNA)拷貝。因此,在進入宿主細胞中後,僅基因組RNA無法合成所需之RNA依賴性RNA聚合酶。感染後,L、P及NP蛋白必須與基因組一起進入細胞。
在不受限於理論的情況下,假設轉錄NDV mRNA之大部分或所有病毒蛋白亦進行複製。業內尚未明確鑒定出調控相同蛋白質補體之替代性用途(即,轉錄或複製)之機制。在病毒滲透後,藉由L蛋白使用核衣殼中之負義RNA作為模板直接起始轉錄。病毒RNA合成經調控以使其在轉錄期間產生單順反子mRNA。轉錄後,病毒基因組複製係在負鏈RNA病毒感染細胞後發生之第二事件。與利用其他負鏈RNA病毒一樣,新城雞瘟病毒(NDV)之病毒基因組複製係由病毒特異性蛋白來調介。複製性RNA合成之第一產物係NDV基因組RNA(cRNA)之互補拷貝(即,正極性)。該等正鏈拷貝(反基因組)之末端結構與正鏈mRNA轉錄本有所不同。與mRNA轉錄本不同,反基因組cRNA在5'端未經封端及甲基化,且在3'端未經截短及多腺苷酸化。cRNA與其負鏈模板共末端,且含有呈互補形式之每一基因組RNA區段中之所有遺傳資訊。cRNA用作合成NDV負鏈病毒基因組(vRNA)之模板。
NDV負鏈基因組(vRNA)及反基因組(cRNA)二者經核衣殼蛋白殼
體化;唯一未經殼體化之RNA種類係病毒mRNA。對於NDV,細胞質係病毒RNA複製之位點,此僅因其係轉錄之位點。病毒組份之組裝可能發生在宿主細胞質膜上。然後成熟病毒藉由出芽自細胞釋放。
業內已知病毒發揮針對腫瘤細胞之溶瘤效應,且已報導溶瘤病毒作為治療劑之用途。業內致力於使用對其天然宿主展現中等至高致病性之非人類病毒來治療癌症患者。本發明揭示誘導人類個體中之腫瘤消退之方法,該等方法利用具有經修飾F蛋白裂解位點之經修飾新城雞瘟病毒(NDV)中毒性株,其對家禽不具致病性(弱毒性),但展現溶瘤特性。所揭示方法提供安全、有效且可靠的方式來誘導有需要之個體中之腫瘤消退。該等方法克服了將病毒之致病株用於人類療法之缺點。
因此在一態樣中,本發明提供誘導個體中之腫瘤消退之方法,該方法包含以下步驟:向個體投與包含治療有效量之NDV之弱毒性溶瘤株之醫藥組合物。根據一實施例,NDV之弱毒性溶瘤株係NDV r73T-R116。
溶瘤病毒能夠發揮針對腫瘤細胞之活體外及活體內細胞毒性或殺死效應且對正常細胞具有極小或無效應。術語「溶瘤活性」係指靶向腫瘤細胞之病毒之細胞毒性或殺死活性。在不希望受限於任何作用機制的情況下,NDV之弱毒性株(例如,r73T-R116)所發揮之溶瘤活性可能主要歸因於細胞凋亡且在較小程度上歸因於質膜溶解,後者伴隨有活子代釋放至細胞環境中,隨後感染毗鄰細胞。在不希望受限於具體理論的情況下,人們認為NDV對癌細胞具有直接細胞溶解活性。
人們亦認為,NDV能夠特異性區分癌細胞與正常、健康細胞。結果已指示,已知賦予癌細胞惡性行為之若干致癌基因(H-ras、N-ras及N-myc)會增強細胞對NDV殺死之敏感性。參見,Lorence,R.M.、
Reichard,K.W.、Cascino,C.J.等人(1992)Proc.Am.Assoc.Cancer Res.,33,398;Reichard,K.W.、Lorence,R.M.、Cascino,C.J.等人(1992)Surg.Forum,43,603-606。另外,已觀察到使用視黃酸(維生素A)治療細胞亦會增強NDV對癌細胞之溶解。Reichard,K.W.、Lorence,R.M.、Katubig,B.B.等人(1993)J.Pediatr.Surg.,28,1221。
可藉由如業內已知之多種方式來檢測活體外或活體內條件下之細胞毒性效應,該等方式係例如藉由抑制細胞增殖、藉由使用釓增強MRI掃描檢測腫瘤大小、藉由放射性標記腫瘤及諸如此類。
對於臨床研究,期望獲得純系病毒以確保病毒均一性。純系病毒可根據熟習此項技術者可獲得之任何方法來產生。舉例而言,純系病毒可藉由限制性稀釋或藉由溶菌斑純化來產生。
用於本發明中之病毒可藉由眾多種方法來製備。舉例而言,NDV可在8至10天齡受精雞卵(自SPAFAS公司,Roanoke,Ill.購得)中進行製備。分離病毒之方法為業內已知,且闡述於例如Weiss,S.R.及Bratt,M.A.(1974)J.Virol,13,1220-1230中。此方法進一步闡述於下文實例編號1中。使用此分離方法,可獲得約90%-95%純之NDV。
另一選擇為,病毒可在活體外細胞培養物中進行製備。較佳地,細胞培養物包含哺乳動物細胞,且更佳地,細胞可用於病毒製造,例如Vero細胞。藉由層析或其他適宜方法純化該等病毒。細胞可為錨定依賴性或非錨定依賴性。
可用於病毒製備中之細胞培養技術為業內已知,且可包括使用具有大表面積之靜止培養燒瓶或滾筒型燒瓶。較佳地,所選培養系統之類型可支撐相對較大之細胞數。為產生大量病毒,採用生物反應器製程,而使細胞生長於微載體珠中用於病毒感染及產生。
可用於產生病毒之細胞培養基為彼等熟習此項技術者已知。培
養基通常包括營養素來源、抗生素及白蛋白或含有生長因子之血清來源。熟習此項技術者熟知選擇適於培養中所採用細胞之具體培養基及培養基成份。在某些實施例中,生長培養基中包括胰蛋白酶。在其他實施例中,不包括胰蛋白酶。
培養條件通常包括在期望溫度(例如37℃)以及所選氧及二氧化碳濃度下培育。所選具體培養條件可根據培養中所採用之細胞來確定,且確定該等條件為熟習此項技術者所熟知。
將細胞置於培養容器中,且容許在所選培養條件下培育及生長。較佳地,容許錨定依賴性細胞生長至鋪滿或峰值生長。生長所需之時間將端視添加至培養容器中之初始細胞接種物之大小及所採用細胞系之倍增時間而變化。較佳地,將約3×103至約3×105個細胞平鋪於每cm2中且使其生長1至5天。對於細胞培養物之病毒接種,自細胞移除培養基(對於附著細胞,藉由抽吸培養基;對於懸浮液中生長之細胞,藉由離心細胞懸浮液並抽吸細胞上清液),且將病毒(重構後)添加至最小體積之培養基或鹽水溶液(例如漢克氏平衡鹽溶液(Hank's Balanced Salt Solution),Gibco)中之細胞中,以防止脫水。較佳地,此體積介於約10至約2500微升/cm2培養容器表面積或105個細胞範圍內。病毒接種物之較佳稀釋介於約0.001至約10個感染單位/細胞範圍內,最佳比率端視具體病毒及細胞系而定。然後使病毒生長約1至7天,主要藉由細胞系之殘留存活量確定時間長度。對於NDV,最佳收穫時間為病毒接種後1至5天。
然後可藉由以下方式收穫病毒:移除上清液並以12至48小時間隔將其更換為新鮮培養基或含有新鮮細胞之新鮮培養基,或冷凍-解凍細胞以使病毒釋放於上清液中。然後可將上清液離心並超速離心以回收呈相對較純形式之病毒或藉由層析方法來實施。可藉由蛋白質測定及/或藉由電泳來測試病毒製劑之純度。然後可將病毒添加至醫藥
上可接受之載劑中,如下文進一步闡述。
療法可在實施癌症療法之任何地點提供:在家、醫師辦公室、診所、醫院門診部或醫院。在一實施例中,本發明提供新城雞瘟病毒(NDV)(例如,r73T-R116)之用途。
治療通常開始於醫院以使得醫師可密切觀察療法之效應並作出所需之任何判斷。療法之持續時間端視所治療癌症之種類、患者之年齡及病況、患者疾病之階段及類型以及患者身體對治療之反應方式而定。可以不同間隔(例如,每天、每週或每月)來實施藥物投與。療法可以包括停藥時段之開始及停止循環來給予,以使患者之身體有機會建立健康新穎的細胞且恢復其強度。
端視癌症之類型及其發展階段,該療法可用於減緩癌症之擴散,減緩癌症之生長,殺死或阻止可能已自初始腫瘤擴散至身體其他部分之癌細胞,減輕由癌症引起之症狀或在第一時間預防癌症。癌症生長係不受控及進行性生長,且發生在將不引發或將導致正常細胞休止、繁殖的條件下。
如上文所闡述,若需要,使用本發明組合物之治療可與治療增殖性疾病之療法(例如,放射性療法、手術或化學療法)組合。
投與本發明病毒(例如,NDV r73T-R116)來治療腫瘤可藉由產生與其他組份組合可有效地預防、改善或減輕腫瘤之治療劑濃度的任何適宜方式來實施。該藥劑可以任何適宜量含於任何適宜載劑物質中,且通常係以組合物總重量之1重量%-95重量%之量存在。組合物可以適於非經腸(例如,皮下、靜脈內、肌內或腹膜內)投與途徑之劑型來提供。醫藥組合物可根據習用醫藥實踐來調配(例如,參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版),A.R.Gennaro、
Lippincott Williams及Wilkins編輯,2000以及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,J.Swarbrick及J.C.Boylan編輯,1988-1999,Marcel Dekker,New York)。
本發明之醫藥組合物可經調配以實質上在投與後立即或在投與後之任何預定時間或時間段釋放活性化合物。後一類型之組合物通常稱為控制釋放調配物,其包括(i)在體內產生延長時間段之實質上恆定之藥物濃度的調配物;(ii)在預定滯後時間後在體內產生延長時間段之實質上恆定之藥物濃度的調配物;(iii)在預定時間段期間藉由維持體內相對恆定、有效之含量、同時最小化與活性物質之血漿含量波動相關之不期望副作用持續作用的調配物(鋸齒動力學模式);(iv)藉由例如將控制釋放組合物在空間上置於毗鄰肉瘤或肉瘤中來局部化作用的調配物;(v)容許方便投用、以例如每週或每兩週一次投與劑量的調配物;及(vi)藉由使用載劑或化學衍生物將治療劑遞送至肉瘤細胞來靶向增殖性贅瘤細胞之調配物。對於一些應用而言,控制釋放調配物無需在當天頻繁投用以使血漿含量保持在治療水準。
可遵循多種策略中之任一者,以獲得其中所討論化合物之釋放速率大於代謝速率的控制釋放。在一實例中,控制釋放係藉由適當選擇不同的調配參數及成份(包括例如不同類型之控制釋放組合物及包衣)來獲得。因此,使用適宜賦形劑將治療劑調配成在投與後以控制方式釋放治療劑之醫藥組合物。實例包括單一或多單位錠劑或膠囊組合物、油溶液、懸浮液、乳液、微膠囊、微球體、分子複合物、奈米粒子、貼片及脂質體。
本發明組合物可與醫藥上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑以單位劑型投與。可使用習用醫藥實踐來提供適宜調配物或組合物以向遭受由過度細胞增殖引起之疾病之患者投與該等化合物。投與可在患者呈症狀性之前開始。
可採用任何適宜投與途徑,例如投與可為非經腸、靜脈內、動脈內、皮下、腫瘤內、肌內、顱內、眶內、眼部、心室內、肝內、囊內、鞘內、腦池內、腹膜內、鼻內、氣溶膠、栓劑或經口投與。舉例而言,治療調配物可呈液體溶液或懸浮液形式;對於經口投與,調配物可呈錠劑或膠囊形式;且鼻內調配物呈粉劑、滴鼻劑或氣溶膠形式。對於上文所闡述之任一應用方法,本發明組合物合意地經靜脈內投與或施加至所需凋亡事件之位點(例如,藉由注射)。
業內所熟知用於製備調配物之方法參見例如「Remington:The Science and Practice of Pharmacy」,A.R.Gennaro、Lippincourt Williams及Wilkins編輯,Philadelphia,Pa.,2000。用於非經腸投與之調配物可含有例如賦形劑、無菌水或鹽水、聚伸烷基二醇(例如聚乙二醇)、植物來源之油或氫化萘。可使用生物相容、生物可降解交酯聚合物、交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物來控制化合物之釋放。用於遞送藥劑之其他可能的有用非經腸遞送系統包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物粒子、滲透幫浦、可植入輸注系統及脂質體。用於吸入之調配物可含有賦形劑(例如乳糖),或可係含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、肝膽酸鹽及去氧膽酸鹽之水溶液,或可係用於以滴鼻劑形式或以凝膠投與之油性溶液。
調配物可以治療有效量(例如,預防、消除或減輕病理學病況之量)投與人類患者以提供用於疾病或病況之療法。本發明組合物之較佳劑量可端視諸如病症之類型及程度、具體患者之總體健康狀況、化合物賦形劑之調配物及其投與途徑等變量而定。
本文所闡述之任何療法之人類劑量量最初可藉由自用於小鼠中之化合物量外推來確定,此乃因熟習此項技術者意識到業內通常與動物模型比較來修改用於人類之劑量。在某些實施例中,設想劑量可在約107pfu至約1011pfu或約108pfu至約1010pfu或約109pfu至約1011pfu
之間變化。在其他實施例中,此劑量可為約107pfu、108pfu、109pfu、1010pfu、1011pfu。當然,可向上調節或向下調節劑量量,如在該等治療方案中通常進行,此端視初始臨床試驗之結果及具體患者之需要而定。
在將個體診斷為患有贅瘤形成後,選擇治療之方法。在贅瘤形成中,可獲得例如多個標準治療方案。使用贅瘤形成之標記物概況來選擇治療方法。在一個實施例中,贅瘤形成細胞對NDV(例如r73T-R116)殺細胞有反應。
攻擊性較弱之贅瘤形成可能易受保守治療方法之影響。攻擊性較強之贅瘤形成(例如,轉移贅瘤形成)不易受保守治療方法之影響且可能復發。當本發明方法指示贅瘤形成極具攻擊性時,應選擇攻擊性治療方法。攻擊性治療方案通常包括以下療法中之一或多者:手術性切除、輻射療法或化學療法。
可用於本發明方法中之藥劑(例如,NDV)包括誘導贅瘤細胞死亡及/或降低贅瘤細胞存活(即活力)之彼等。
用於量測細胞活力之分析為業內已知,且闡述於例如Crouch等人(J.Immunol.Meth.160,81-8);Kangas等人(Med.Biol.62,338-43,1984);Lundin等人,(Meth.Enzymol.133,27-42,1986);Petty等人(Comparison of J.Biolum.Chemilum.10,29-34,.1995);及Cree等人(AntiCancer Drugs 6:398-404,1995)。細胞活力可使用眾多種方法來分析,該等方法包括MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基)-2,5-二苯基四唑溴化鎓鹽)(Barltrop、Bioorg.及Med.Chem.Lett.1:611,1991;Cory等人,Cancer Comm.3,207-12,1991;Paull J.Heterocyclic Chem.25,911,1988)。用於細胞活力之分析亦在市面上有售。該等分析包括(但不限
於)CELLTITER-GLO®發光細胞活力分析(Promega),其使用螢光素酶技術來檢測ATP且量化培養物中細胞之健康或數量;及CellTiter-Glo®發光細胞活力分析,其係乳酸去氫酶(LDH)細胞毒性分析(Promega)。
誘導或增加贅瘤細胞死亡(例如增加凋亡、降低細胞存活率)之候選化合物亦可用作抗贅瘤治療劑。用於量測細胞凋亡之分析為熟習此項技術者已知。凋亡細胞之特徵在於特徵性形態變化,包括染色質凝聚、細胞皺縮及膜起泡,其可使用光學顯微鏡清晰地觀察到。凋亡之生物化學特徵包括DNA片段化、特定位置處之蛋白質裂解、線粒體膜滲透性增加及在細胞膜表面上出現磷脂醯基絲胺酸。用於凋亡之分析為業內已知。實例性分析包括TUNEL(末端去氧核苷酸轉移酶生物素-dUTP切口末端標記)分析、半胱天冬酶活性(特定而言半胱天冬酶-3)分析及用於fas-配體及膜連蛋白V之分析。用於檢測凋亡之市售產品包括(例如)Apo-ONE®均質半胱天冬酶-3/7分析、FragEL TUNEL套組(ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS,San Diego,CA)、ApoBrdU DNA片段化分析(BIOVISION,Mountain View,CA)及快速凋亡DNA梯檢測套組(BIOVISION,Mountain View,CA)。
贅瘤細胞具有自其來源基因座轉移或擴散至全身遠端點之傾向。用於轉移潛力或侵襲力之分析為熟習此項技術者已知。該等分析包括用於接觸抑制喪失之活體外分析(Kim等人,Proc Natl Acad Sci U S A.101:16251-6,2004)、增加活體外軟瓊脂菌落形成之分析(Zhong等人,Int J Oncol.24(6):1573-9,2004)、肺部轉移模型(Datta等人,In vivo,16:451-7,2002)及基於Matrigel之細胞侵襲分析(Hagemann等人,Carcinogenesis.25:1543-1549,2004)。用於細胞侵襲力之活體內篩選方法亦為業內已知,且包括例如於無胸腺裸小鼠中之致腫瘤性篩選。
通常用於評估轉移之活體外分析係基於Matrigel之細胞侵襲分析(BD Bioscience,Franklin Lakes,NJ)。
若需要,使用贅瘤形成之動物模型來測試使用本文所闡述之任一篩選方法所選擇之候選化合物之效能。在一個實施例中,向小鼠注射贅瘤性人類細胞。然後向含有贅瘤細胞之小鼠每天注射(例如腹膜內)媒劑(PBS)或候選化合物一段憑經驗確定之時間。然後對小鼠實施安樂死,且收集贅瘤組織,並使用本文所闡述之方法分析NDV、NDV多肽及/或NDV標記物(例如編碼可檢測部分之轉基因)之含量。
預期相對於對照量降低NDV、NDV多肽或NDV標記物含量、mRNA或蛋白質表現之化合物可有效地治療個體(例如人類患者)之贅瘤。在另一實施例中,分析注射有人類贅瘤細胞之小鼠中候選化合物對腫瘤負載之效應。容許贅瘤細胞生長形成團。然後每天使用候選化合物或媒劑(PBS)治療小鼠一段憑經驗確定之時間。對小鼠實施安樂死且收集贅瘤組織。比較經所選候選化合物治療之小鼠中贅瘤組織之質量與相應的對照小鼠中所存在之贅瘤組織質量。
本發明提供用於治療或預防肉瘤之套組。在一實施例中,套組包括呈單位劑型之含有有效量之NDV(例如,r73T-R116)之治療或預防性組合物。在另一實施例中,套組包括呈單位劑型之含有有效量之NDV(例如,r73T-R116)之治療或預防性組合物。
在一些實施例中,套組包含含有治療或預防性組合物之無菌容器;該等容器可為盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包裝或業內已知之其他適宜容器形式。該等容器可由塑膠、玻璃、層壓紙、金屬箔或適於容納藥劑之其他材料製得。
若需要,提供本發明抗體以及向患有或具有罹患贅瘤形成風險之個體投與NDV(例如,r73T-R116)之說明書。說明書通常包括關於使用組合物治療或預防贅瘤形成之資訊。在其他實施例中,說明書包括以下各項中之至少一者:治療劑之描述;用於治療或預防贅瘤形成
或其症狀之劑量方案及投與;注意事項;警告;適應症;禁忌;超劑量資訊;不良反應;動物藥理學;臨床研究;及/或參考文獻。說明書可直接印刷在容器(存在時)上或以標記施加至容器,或呈於容器中或與其一起供應之單獨片、小冊子、卡片或文件夾形式。
除非另外指示,否則本發明之實踐採用分子生物學之習用技術(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學,其為熟習此項技術者所熟知。該等技術全面例示於諸如以下等文獻中:「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」,第2版(Sambrook,1989);「Oligonucleotide Synthesis」(Gait,1984);「Animal Cell Culture」(Freshney,1987);「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」(Weir,1996);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(Miller及Calos,1987);「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel,1987);「PCR:The Polymerase Chain Reaction」,(Mullis,1994);「Current Protocols in Immunology」(Coligan,1991)。該等技術適用於產生本發明之多核苷酸及多肽,且因此可視為構成及實踐本發明。尤其可用於具體實施例之技術將論述於隨附部分中。
提出以下實例以為彼等熟習此項技術者提供如何製備及使用本發明之分析、篩選及治療方法之完整揭示內容及描述,且並不意欲限制本發明者視為其發明之範疇。
將藉由高保真度RT-PCR產生之六個亞基因組cDNA片段組裝於pUC19載體中。NDV 73T之全長cDNA稱為p73T。將73T中F蛋白裂解位點(FPCS)之核苷酸及推導胺基酸序列修飾成NDV LaSota株(弱毒性,lento)或巨細胞病毒(CMV)(S116)之糖蛋白B(gB)之F蛋白裂解位
點(圖1;雙斜線指示F蛋白之裂解位點)。對cDNA完全測序以確認病毒序列。F蛋白裂解位點:Wt:ggg agg aga cag aaa cgc ttt(SEQ ID NO:16);Lento:ggg ggg aga cag gaa cgc ctt(SEQ ID NO:17);S116:cat aat aga acg aaa tcc ttt(SEQ ID NO:18);S116KM:cat aat aaa atg aaa tcc ttt(SEQ ID NO:19);R116:cat aat aga acg aaa cgc ttt(SEQ ID NO:20)。
將轉基因插入p73T中之兩個位置處:介於P與M之間之基因間序列或介於HN與L接合處之間之基因間序列(圖2A)。為在P-M或HN-L接合處插入單一轉基因盒,藉由將轉基因盒插入在P與M基因之間(nt 3148)或在HN與L基因之間(nt 8231)產生之AfeI位點中來構築在P-M或HN-L接合處含有轉基因之p73T cDNA。所插入基因盒含有基因末端(GE;5'-TTAAGAAAAAA-3')(SEQ ID NO:13)、基因間核苷酸(T)、基因起始序列(GS;5'-ACGGGTAGA-3')(SEQ ID NO:14)及轉基因之開放閱讀框(ORF)。另外,將十個核苷酸(5'-cgccgccacc-3')(SEQ ID NO:15)插入起始位點上游以引入Kozak序列。在P-M或HN-L接合處含有轉基因之全長(FL)73T cDNA分別稱為p73T-P1或p73T-HN1。構築在單一基因組中在P-M及HN-L接合處含有兩個單獨轉基因之全長cDNA且稱為p73T-P1-HN1(圖2B)。為在同一接合處(例如,P-M)插入兩個轉基因盒,在第一個轉基因(1號)之ORF末端(nt 3169)引入AfeI位點。使用含有GE及GS序列之引子PCR擴增第2個轉基因ORF並插入AfeI位點處。在P-M接合處含有兩個轉基因盒之反基因組cDNA稱為p73T-P2。
在T7 RNA聚合酶啟動子及終止子控制下選殖NDV 73T NP、P、L蛋白及反基因組cDNA(p73T-lento或p73T-S116)。將四種質體共轉染
至表現RNA聚合酶之細胞系中(圖3A)。所回收病毒稱為r73T-lento或r73T-S116。使用含及不含胰蛋白酶補充物之培養基使r73T-lento及r73T-S116在Vero細胞中傳代。r73T-lento之生長具有胰蛋白酶依賴性,而r73T-S116可在不含胰蛋白酶補充物之培養基中生長。評價在P-M接合處具及不具hGM-CSF之r73T-S116中之F蛋白裂解序列(FPCS)。在未補充胰蛋白酶之培養基中,使73T-S116株在Vero及人類纖維肉瘤HT1080細胞中以MOI 0.01進一步傳10代。FPCS之突變(R113K及/或Q114M)發生在第7代。在第9代檢測到S116R突變。在第10代,對F、HN及轉基因測序且未發現其他突變。
具有新穎經修飾F蛋白裂解序列(FPCS)之重組73T株包括以下序列:
- Lento:111G-G-R-Q-E-R/L-I118(SEQ ID NO:21)
- S116:111H-N-R-T-K-S/F117(SEQ ID NO:1)
- S116K:111H-N- K -T-K-S/F117(SEQ ID NO:2)
- S116M:111H-N-R- M -K-S/F117(SEQ ID NO:3)
- S116KM:111H-N- K - M -K-S/F-I118(SEQ ID NO:4)
- R116:111H-N-R-T-K- R /F-I118(SEQ ID NO:5)
具有不同FPCS之重組73T株之特徵在於MDT、ICPI、相對HT1080細胞殺死、Vero細胞中之複製及卵中之複製(圖4)。
NDV之禽類毒力主要係藉由F蛋白裂解序列(FPCS)來測定。r73T-lento經改造以含有非毒性株LaSota之FPCS。組織培養物中之LaSota病毒複製具有胰蛋白酶依賴性,此乃因F蛋白無法裂解。r73T-lento在不含胰蛋白酶補充物之Vero細胞中形成微小溶菌斑,此指示F蛋白未裂解且病毒無法有效地自細胞擴散至細胞。r73-lento在Vero細胞中以低水準(7.5×103pfu/ml)複製,但在含有內源胰蛋白酶樣酶之卵中有效
地複製(5.7×108pfu/ml)。r73-lento在雞中不具毒性,如藉由接種有病毒之胚胎之平均死亡時間(MDT)(MDT>156hr)及大腦內致病指數(ICPI;ICPI=0.00)所展示,且在HT1080細胞中具有低細胞毒性(13%細胞殺死)。
在Vero細胞中,r73T-S116可形成相對較大之溶菌斑,且達到4.4×106pfu/ml之效價。此與當r73T-S116在補充有胰蛋白酶之Vero細胞中生長時獲得之效價相當。此數據指示,在組織培養物中,r73T-S116之融合蛋白裂解位點(FPCS)可在不含外源胰蛋白酶的情況下裂解。其在雞中不具毒性且在HT1080細胞中顯示31%細胞殺死。藉由活體外細胞傳代檢查r73T-S116之遺傳穩定性。
在Vero或HT1080細胞中傳10代後,在FPCS中發現胺基酸取代:R113K、Q114M及/或S116R。為消除在病毒基因組中出現其他序列變化之可能性,藉由反向遺傳學構築重組r73T-S116突變體病毒並進行評估。除r73T-R116外,r73T-S116及其衍生物與親代S116之相似之處在於,該等突變體病毒在雞中不具毒性且能夠進行相似程度的HT1080細胞殺死。HT1080細胞殺死對於單一突變介於29%-31%之間且對於雙突變為48%。
M114及K113M114之溶菌斑大小顯著大於S116。r73T-R116突變體獲得在FPCS之殘基116(S116R)處之一個胺基酸變化。已知靠近裂解位點之R116對F蛋白之有效裂解至關重要。r73T-R116在Vero細胞中形成大溶菌斑,在含與不含胰蛋白酶補充物的情況下生長至相似效價,且有效地殺死HT1080細胞(80%)。R116會增加雞毒力,如藉由MDT分析所顯示(72hr、80hr)。儘管在一個測試中ICPI值(0.65)係<0.7,但較佳進一步降低其雞毒力。
病毒可經改造以表現P-M接合處之轉基因(1)、HN-L接合處之第2
個轉基因(2)及藉由插入非編碼序列延長之增加的HN-L基因間隔區(3)(圖5A)。此處使用如圖2A中用於在P-M接合處插入轉基因盒之相同設計。第2轉基因盒含有L基因起始序列(GS;5'-ACGGGTAGA-3')(SEQ ID NO:14)、轉基因之開放閱讀框(ORF)、來自L基因3’非轉譯區之序列(以斜體突出顯示)及L基因末端序列(GE;5'-TTAAGAAAAAA-3')(SEQ ID NO:13)。用於增加HN-L接合處之非編碼序列取自1型副黏液病毒(APMV-1)、呼吸道融合病毒(RSV)或與任何已知序列不具同源性之隨機序列。插入可介於60-318 nt範圍內。在HN-L處插入第2個轉基因容許病毒表現兩個轉基因,例如hGM-CSF及GFP。列示在HN-L接合處插入之序列(圖5B)。
為降低雞中之r73T-R116毒力,藉由插入不同長度之序列來修飾r73T-R116病毒以增加HN與L基因間序列。藉由檢查溶菌斑形成以及細胞及卵中之複製來評估r73T-R116衍生物之感染力;藉由檢查MDT及ICPI來評估禽類致病性,且評估腫瘤細胞殺死(圖6A)。
來自APMV之318 nt、來自RSV之198 nt及198隨機序列之基因間插入確實降低了雞中之毒力,其中MDT>156hr且ICPI分別為0.27、0.0375及0。長插入(隨機198 nt)比短插入(隨機60 nt)對降低毒力具有增加的效應。插入144 nt、102 nt及60 nt在雞中具有一定程度之毒力,但MDT時間較短。針對插入144 nt、102 nt及60 nt之ICPI值分別為0.74、0.51及0.78。插入非病毒序列(隨機198 nt)比插入病毒序列(RSV-198 nt)會更有效地降低毒力。在HN-L接合處插入第2轉基因盒(EGFP)並不降低雞毒力(MDT 86hr且ICPI為0.82)。所有插入會將卵中之病毒複製稍微降低最多4倍,但不會影響Vero細胞中之病毒複製(約106pfu/ml)。儘管突變體病毒在雞中更減毒,但腫瘤細胞殺死功能不受影響。所有r73T-R116衍生物在感染第3天時皆具有介於75%-86%範
圍內之腫瘤細胞殺死效率。
為確定r73T病毒之生長條件,在卵(圖7)及Vero細胞(圖8)中實施生長動力學研究。使用100、1000、10,000或100,000FFU/卵之所指示病毒感染受精雞卵,且培育2天、3天或4天。收穫尿囊液且藉由FFA測定病毒效價。如圖7中所顯示,100FFU/卵在第1天時具有低效價,但在第2天時達到峰值效價。總之,無論所用接種劑量如何,大部分病毒在第2天時皆達到約8 log/mL之峰值效價。在第2天時,R116i-198具有最低效價,低接種物劑量產生最高產率,此指示可存在缺陷性粒子之累積。R116i-318-APMV插入亦具有約7 log之較低峰值效價。
R116i-198-RSV達到7.5 log之峰值效價。藉由反向遺傳學構築之S116在卵中之病毒產生並未降低。因此,在R116衍生物中,根據卵中之生長特性,具有RSV-198 nt插入之病毒係首選溶瘤病毒候選者。
亦在無血清Vero細胞純系51D11(由MedImmune產生之專有細胞系)中評估病毒。所有病毒在兩種MOI條件(0.001及0.0001)下充分複製(圖8)。73T FPCS之修飾及R116之HN-L接合處之基因間插入並不影響Vero細胞中的病毒生長。
評估rT3T及其衍生物在人類纖維肉瘤HT1080中與正常人類皮膚纖維母細胞CCD1122Sk細胞相比之相對於未經治療之對照細胞的細胞殺死(圖9A及9B)。使用r73T衍生物以介於1PFU至100,000PFU範圍內之不同劑量感染72hr後獲得數據。在HT1080癌細胞中,具有弱毒性FPCS之病毒具有最小殺死,FPCS處之S116具有中等殺死,且在FPCS處具有R116之病毒具有與r73T wt病毒同樣有效之細胞殺死。在正常CCD1122SK細胞中,所有病毒之細胞殺死皆不如對癌細胞之細胞殺
死有效。殺死效率降低至約1/100。無論FPCS序列如何,所有病毒在正常細胞中皆具有相似的殺死效率。使用Prism 6.0,癌症及正常細胞中之細胞殺死效率表示為自劑量反應曲線內插之50%有效濃度(EC50)(圖9C)。R116衍生物與r73T wt具有相似的EC50值,且EC50為10PFU,此指示FPCS之修飾並不影響癌細胞中之病毒複製及細胞殺死效率。在以MOI 0.01感染後第3天時,測定該等病毒在HT1080及CCD1122SK細胞中之複製(圖9D)。與正常細胞相比,所有病毒優先在癌細胞中複製,且差為約1.5-2.0 log。
為評估活體內溶瘤活性,藉由將濃度為5×106個細胞/0.1ml之HT1080細胞皮下注射至5-6週齡之Balb/C無胸腺裸小鼠中來建立HT1080異種移植物模型。由於hGM-CSF在小鼠中不具交叉反應性,故此研究並不適於評價轉基因效應,但適於評價不同r73T構築體之溶瘤能力。腫瘤內(it)或靜脈內(iv)給予R116-318i-hGM-CSF,且比較治療組與對照組之間之腫瘤生長速率(圖10A)。
當腫瘤體積達到約65mm3時,如所指示將小鼠隨機化至多個組(N=10)中。使小鼠接受單次劑量之PBS或2×107Pfu之r73T-hGM-CSF-R116i-198(經腫瘤內(IT)投與)或1×108PFU(經由尾靜脈注射經靜脈內(IV)投與)。每3-4天量測腫瘤大小。如圖10A中所呈現,r73T-R116i當藉由IV或IT投與時可引起顯著的腫瘤消退。由兩條途徑引起之腫瘤消退之量相當,且與對照組顯著不同。
在HT1080異種移植物中藉由IT注射1×108PFU來比較r73T衍生物之溶瘤活性(圖10B)。當腫瘤體積達到約180mm3時,將小鼠隨機化至多個組(n=7)中。使小鼠接受PBS或1×108PFU之r73T-hGM-CSF-lento(lento)或r73T-hGM-CSF-S116K113M114(S116 KM)或r73T-hGM-
CSF-R116i-318 nt APMV-N(R116i)或r73T-hGM-CSF(r73T wt)。每3-4天量測腫瘤大小(* P<0.05,未配對樣本T測試)。兩個劑量之r73T衍生物能夠引起顯著的腫瘤消退,但有效性不同。在腫瘤消退方面r73T-lento最不有效,而r73T wt最有效。r73T-lento具有與S116病毒相似之效應,但S116病毒在活體外細胞殺死方面具有低10倍之EC50(參見圖9A)。r73T-R116i-318如同73T wt一般有效地抑制腫瘤生長,直至第2次劑量後9天(腫瘤植入後第19天),腫瘤在經R116i治療之小鼠中再次生長,但在經73T wt治療之組中未再生長。該等數據顯示r73T衍生物當以全身性或腫瘤內方式遞送至攜載人類腫瘤異種移植物之免疫缺陷性小鼠時具有活體內抗腫瘤活性。F蛋白之有效裂解對活體外及活體內病毒複製至關重要。在FPCS處具有R116之病毒在活體外及活體內細胞殺死方面更強效。
為確定溶瘤NDV病毒在腫瘤組織中是否選擇性複製及病毒清除率,測定不同器官中之病毒分佈。使用劑量為1×108PFU之R116i(r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N)經靜脈內治療帶有大小為約250mm3之皮下HT1080腫瘤之無胸腺裸小鼠,且在第1天、第4天或第8天(n=3/時間點)時處死該等小鼠。收集血清、肺、脾、卵巢及腫瘤。
藉由Vero細胞中之溶菌斑分析量化病毒之存在,且藉由ELISA分析量測hGM-CSF轉基因表現。在感染後第1天、第4天及第8天時評價腫瘤及器官中之病毒複製。僅在第1天時檢測器官中之病毒(在卵巢中在所有時間點下未檢測到病毒),且腫瘤組織中之病毒負載係肺及脾中病毒負載的約100倍(圖11A)。腫瘤中病毒之存在持續至少8天,此指示病毒在腫瘤組織中選擇性複製。與病毒複製數據一致,hGM-CSF之含量最高且持續8天以上(圖11B)。該等數據展示NDV病毒可在腫瘤組織中有效地複製,且將轉基因有效地遞送至局部腫瘤組織。
病毒表面糖蛋白係對雞中之免疫原性及毒力至關重要之抗原。策略經探究以藉由在雞中無毒性之其他副黏液病毒之個別或呈組合形式之相應細胞外(胞外)結構域替代NDV之F及HN基因。副流感病毒5(PIV 5)係犬類副黏液病毒且不會導致人類疾病。已顯示鴿1型副黏液病毒(PPMV-1)在雞中無毒性且ICPI為0.025,如先前所報導,且抗原與NDV不同(Dortmans等人,Veterinary Microbiology,2010,第143卷,第139-144頁。)。存在兩種在遺傳上密切相關之鴿1型副黏液病毒(PPMV-1)變體,該等變體具有相同的強毒性融合蛋白裂解位點,但具有顯著不同之毒力(Veterinary Microbiology,2010,143:139-144)。產生其中F及/或HN糖蛋白胞外結構域交換為PPMV-1及/或PIV5之糖蛋白胞外結構域之NDV 73T的全長反基因組cDNA(圖12A)。NDV、PIV5及PPMV-1序列分別係以呈藍色、紫色或綠色之有色框指示。
指示個別蛋白質或蛋白質結構域之胺基酸長度。如前文所闡述實施Vero中之溶菌斑形成、相對HT1080細胞殺死及MDT(圖12B)。回收除PIV-5 F-HN外之嵌合病毒,且使其能夠於不存在外源胰蛋白酶之細胞中生長。所有三種病毒皆形成適當大小之溶菌斑,此顯示有效的細胞至細胞擴散。PPMV-1 F-HN或F嵌合病毒分別具有79hr及84hr之MDT值,此指示在雞中之潛在毒力。兩種PPMI-1嵌合體以71%及61%之水準有效地殺死HT1080細胞。PIV5-F嵌合體並不在卵中生長且在雞中無毒性,但殺死47%的HT1080細胞。藉由中和分析使用自接受2個靜脈內劑量之1×108PFU之r73T-R116i的小鼠收集之血清檢查NDV與PPMV-1或PIV5嵌合體之間之血清交叉反應性。r73T病毒經受NDV感染之血清中和(效價960),而PPMV-1及PIV5嵌合體無法被中和(效價<4)。此結果確認NDV與PPMV-1或PIV5之間無交叉反應性。對於已在先前NDV治療期間發生抗NDV免疫反應之患者,具有不同抗原性
之嵌合病毒具有用作加強溶瘤病毒的潛能。
藉由微型基因組分析比較NDV與其他副黏液病毒之RNA聚合酶活性(圖12C)。使用Lipofectamine 2000使用以下質體轉染表現T7之細胞:三個表現NDV之NP、P、L蛋白之質體,及編碼NDV反微型基因組cDNA(編碼GFP基因)之質體,或編碼麻疹病毒(MV)或呼吸道融合病毒(RSV)之N、P、L基因的質體及各別RSV或MV GFP反微型基因組cDNA質體。轉染後兩天或三天,在螢光顯微鏡下檢查如藉由GFP蛋白之表現所指示之微型基因組複製。NDV與麻疹病毒及RSV相比具有最強聚合酶活性。
為理解何種腫瘤類型可能對NDV溶瘤敏感,測試涵蓋寬範圍之腫瘤類型及適應症之180種癌細胞系對重組NDV及其變體之敏感性。自美國典型組織收集中心(American Type Tissue Collection,Manassas,VA)或歐洲細胞培養物收集中心(European Collection of cell cultures,ECACC)獲得細胞系,且在培養基中及供應商所推薦之條件下培養。將10,000種癌細胞系接種於96孔板中,且隨後使用病毒感染6小時。病毒濃度介於MOI 10-0.0001(或1至100,000pfu/孔)範圍內。在感染後48-96hr測定細胞活力。使用病毒以0.1之MOI感染後72hr時使用>30%細胞殺死之截留測定敏感性。圖13A及13B提供敏感性依照腫瘤類型之概圖。血液學癌細胞系(白血病及淋巴瘤)對NDV溶瘤相對較不敏感,而所測試之大部分黑色素瘤、卵巢及胰臟細胞系對NDV敏感。相對於所測試細胞系之4%對基於S之病毒敏感,所測試之所有人類癌細胞系的約58%對FPCS處之NDV R116i敏感。此最可能歸因於蛋白酶對F蛋白之裂解。R116i病毒更可能經普遍存在之弗林蛋白酶(furin)樣蛋白酶裂解,而可能裂解S116 F蛋白之蛋白酶加下劃線且可能較不普遍地表現。再衍生之S116-KM變體產生相對於初始S116變體
較大之溶菌斑大小及增強的溶瘤效能。為測試此,使用表現GFP之變體感染已經測定對NDV R116病毒具有一系列敏感性之22種癌細胞系之此另一較小面板,且在感染後72hr時測定細胞活力。使用如上文所闡述之相同敏感性截留,所測試細胞系之41%對R116i敏感,4%對S116敏感,且再衍生之S-KM比S116 NDV更強效,且所測試細胞系之27%較為敏感。
檢查源自所指示癌組織之細胞之在FPCS處具有R116及人類GM-CSF之重組NDV 73T的細胞殺死。指示對moi為0.1之病毒感染顯示大於50%殺死之細胞數及所篩選之總細胞系。
改進腫瘤模型後,測試S116-RD NDV之編碼人類或鼠類GM-CSF在經改進B16F10同基因模型中之效能(圖15A及15B)。腫瘤內感染1×108pfu達3個劑量且每組存在最少8只小鼠。展示>80%腫瘤生長抑制之顯著腫瘤生長抑制(圖15B)。藉由重複腫瘤內(i.t.)投用會達成短期腫瘤消退,其亦會導致存活時間顯著增加,相對於治療組之42天對於對照組為18天。3個劑量後停止治療後會引起腫瘤再生長。在50天時藉由在另一側腹上植入B16F10腫瘤細胞再激發S116-mGM-CSF組中無殘留腫瘤證據之單一動物。腫瘤生長延遲,但不被抑制,此表明此模型在此單一動物內未達成完整免疫記憶反應。
為評價對腫瘤生長之溶瘤及免疫效應,測試分別編碼NDV變體R116i及S116之hGM-CF或mGM-CSF在小鼠同基因免疫勝任CT26結腸直腸腫瘤模型中之效能。每一病毒係以1×108PFU之病毒腫瘤內投用達4個劑量。腫瘤在投用開始前為最小100mm3。經病毒治療之所有動物皆展示強效抗腫瘤活性作為單療法。在編碼人類GM-CSF之R116治療後11/12動物無腫瘤為92%完全反應率。溶解性較差之再衍生S116-KM病毒具有降低的腫瘤生長抑制,此達成53% TGI及36%之完全反應速率。然而,在與人類GM-CSF不同在小鼠模型中有活性之鼠類GM-CSF存在下,此反應速率增加至54%,且腫瘤生長抑制為75%。因此,可能使S116病毒具有GM-CSF可增強抗腫瘤活性。
取出剩餘腫瘤進行組織學分析,並藉由蘇木素及曙紅染色劑(H及E)染色,且使用免疫組織化學方法進行NDV檢測(圖15C)。存在NDV表現之明確證據,且此似乎集中在腫瘤之壞死區域周圍,此表明NDV有助於腫瘤細胞死亡及壞死。亦存在免疫細胞浸潤至腫瘤及壞死區域中之明確證據。在對NDV具有強染色之區域中,亦可注意到多核細胞融合形成。另外,似乎存在極少剩餘活腫瘤,此指示腫瘤生長抑制數據可能低估了NDV在此模型內之活性。
圖15C顯示在免疫-勝任小鼠CT26結腸直腸腫瘤模型中NDV具有強效抗腫瘤活性。為評價對腫瘤生長之溶瘤及免疫效應,測試分別編碼hGM-CF或mGM-CSF之NDV變體R116i及S116在小鼠同基因免疫勝任CT26結腸直腸腫瘤模型中之效能。每一病毒係以1×108PFU之病毒腫瘤內投用達4個劑量。腫瘤在投用開始前為最小100mm3。經病毒治療之所有動物皆展示強效抗腫瘤活性作為單療法。利用11/12之無腫瘤動物在經編碼R116之人類GM-CSF治療後為92%完全反應速率。溶解性較差之再衍生S116-KM病毒具有降低的腫瘤生長抑制,此達成53% TGI及36%之完全反應速率。然而,在與人類GM-CSF不同在小鼠模型中有活性之鼠類GM-CSF存在下,此反應速率增加至54%,且腫瘤生長抑制為75%。因此,使S116病毒具有GM-CSF會增強抗腫瘤活性。
圖15D-F顯示多次投用rNDV R116i會導致腫瘤生長抑制且驅動免疫細胞募集至卵巢癌(OVCAR4)異種移植物模型中。為進一步評估活體內rNDV溶瘤活性,利用人類卵巢癌異種移植物模型(OVCAR4)。此模型係緩慢生長,且具有較差分化之細胞形態及大腹水樣填充區域之人類卵巢腫瘤之總病理學暗示。一旦腫瘤達到100mm3,即將小鼠隨機化以接受8個劑量之編碼R116i NDV之小鼠或人類GM-CSF或作為對
照之PBS。僅來自鼠類基因序列之產物在小鼠模型中具有生物活性。
將2.5×107pfu以小於50μl之體積進行每週一次腫瘤內注射。腫瘤生長曲線顯示於圖15D中。在經NDV變體治療之帶有腫瘤之動物中達成長期腫瘤抑制。使用RT-PCR亦證實在研究結束時(最後一次劑量後24hr)在腫瘤內存在病毒基因組。組織學分析後存在殘留腫瘤中之免疫浸潤以及其他組織學變化之明確證據(圖15E及F)。經治療腫瘤之去分化遠小於經對照治療之動物,且似乎具有較小腹水填充區域。在毗鄰剩餘腫瘤之多個經治療腫瘤中發現之大量發炎浸潤及免疫組織化學(IHC)分析揭露該等免疫浸潤對NDV蛋白呈陽性。在經NDV治療之組中存在較高程度之先天免疫細胞至腫瘤中之募集。該等數據展示強效抗腫瘤在形態相關之卵巢癌模型中之效能,此可經由直接溶瘤及先天免疫募集以及活化來引起。
評估73T-R116i-hGM-CSF及73T-R116i-mGM-CSF在B16黑色素瘤模型中之溶瘤效應。該研究評估B16小鼠中之病毒耐受性。每一病毒係在第11天及第14天時以2×107pfu靜脈內(i.v)或腹膜內(i.p)投用兩次或在第11天時以1.1×107pfu腫瘤內(i.t)投用一次。使用R116-hGM-SCF或mGM-SCF藉由三條不同投與途徑治療之組與未經治療之組相比具有較緩慢之腫瘤生長速率(圖15A)。每一組皆包括3只小鼠。腫瘤抑制率與對照組相比在統計學上較顯著。因此,本發明之r73T衍生物具有有利地低之禽類致病性、高溶瘤活性且在雞卵中複製至高效價。基於該等結果,本發明病毒可用於誘導腫瘤消退且增強癌症患者治療結果(圖16)。
除GM-CSF外,可將多個轉基因(表2)插入NDV 73T株中來增強腫瘤殺死。該等轉基因包括以下各項:
(1)細胞介素或細胞介素之經改造變體,例如GM-CSF、IL-2、
IL-21、IL-15、IL-12及IL-12p70
(2)細胞表面配體及趨化因子,包括OX40L、CD40L、ICOSL、Flt3:、B.1(CD80)、CD137L、CXCL10(IP-10)、CCL5、CXCL9。(3)Myc抑制劑:Omomyc。(4)出於活體內成像目的之轉基因,例如碘化鈉同向運輸蛋白(NIS)介導之放射性病毒療法用於放射性病毒療法。(5)腫瘤細胞存活之其他調節劑,以增強腫瘤殺死,包括(但不限於)細胞週期進展之抑制劑,抑制抗凋亡蛋白,增強促凋亡蛋白,抑制惡性轉變之關鍵致癌驅動劑。該等可包括在腫瘤細胞中選擇性NDV複製後蛋白質之轉基因遞送,產生選擇性或廣義活性siRNA,遞送miRNA或抑制所選miRNA。(6)腫瘤抗原,例如E6、E7、睪丸癌抗原、癌胚胎抗原、單獨或與其他轉基因組合作為新穎腫瘤抗原之人工或過表現蛋白。(7)抗體或重組融合蛋白,其靶向免疫調節蛋白以阻斷負調控或提供激動信號來增強T細胞功能。該等抗體之實例可包括(但不限於)PD-L1、CTLA4、CD-137(4-1BB)、OX40、GITR、TIM-3、CD73、PD-1、HVEM及LIGHT。(8)藉由在細胞中改造或表現recNDV來增強recNDV之藥效學/藥物動力學活性,該等細胞將蛋白質轉移至recNDV上,以降低補體清除率或減少對NDV之適應性免疫反應。
NDV溶瘤病毒可在適宜時與治療性抗體或激動性融合蛋白(例如抗PD-L1、抗CTLA4、抗OX40、抗GITR、抗TIM-3、抗PD-1及抗ICOS)同時或依序投與。產生建立與本文所闡述之新穎NDV構築體組合增強NDV在腫瘤模型中之活性之分子的最有效劑量及方案的臨床前數據。可將轉基因插入重組NDV中用於單獨或組合表現來遞送多個活性模式,例如增強由NDV之新穎變體引起之腫瘤細胞死亡。與免疫調節方式組合增加腫瘤細胞抗原之釋放具有增加對該等所釋放之腫瘤抗原之適應性免疫反應的潛能。
為理解F蛋白裂解位點之差異是否會影響受感染細胞中之F蛋白裂解及其對融合活性之影響,將F蛋白質體轉染至293細胞中來檢查F蛋白裂解。另外,共轉染F及HN質體以在瞬時分析中檢查融合活性,此乃因F及HN蛋白二者為融合形成所必需(圖3B及3C)。宿主蛋白酶對
wt F蛋白之裂解比在F蛋白裂解位點處具有R、S或S-KM突變之F蛋白更有效,在具有S裂解位點之F中檢測到極少F蛋白裂解產物(F1),且在經弱毒性F質體轉染之細胞中未檢測到裂解產物。R及S構築體之F蛋白在裂解位點處具有N-連接糖基化位點(NXT),從而在SDS-PAGE上產生慢於lento及S-KM之遷移活動性,此乃因KM突變消除了糖基化位點。該等數據展示F蛋白裂解位點處之R及S突變影響F蛋白裂解,且S-KN比S更有效。由於F及HN基因各自選殖至編碼EGFP基因之pVitro2-neo-MCS載體中,故藉由綠色融合細胞使融合形成可見。在經wt F及HN質體轉染之293細胞中觀察到大融合形成。在F蛋白裂解位點中具有R、S或S-KM殘基之所有F突變體會極大地減少融合形成。
在HN-L接合處之間插入198 nt之R116i病毒在雞DF-1細胞中在高moi條件下展現較緩慢生長動力學,如圖6B及6D中所顯示。在較早感染時間點(10-20h)下與wt及不具基因間插入之R病毒相比,具有198 nt插入之R116i之生長差異減小。在Vero細胞中,該等病毒之間之生長差異並不非常明顯(圖6C及6E)。為理解R116i病毒中之基因間插入是否會影響病毒RNA轉錄及複製,分別藉由北方及西方墨點分析檢查受感染DF-1細胞中之病毒RNA及蛋白質合成(圖6F及6G)。在受感染DF-1細胞中,具有198 nt插入之R116i之RNA及蛋白質合成極大地降低。
相比之下,在受感染Vero細胞中,上游基因轉錄本(例如NP mRNA)在經R118i-198或198RSV感染之細胞中極大地增加,而該兩種病毒之基因組RNA減少。該兩種病毒之L蛋白之含量減少,但其他病毒蛋白產物增加,例如NP、F及HN,如圖6H及6I中所顯示。在高moi條件下(moi=5)實施圖6F-I中所獲得之數據。在低moi條件下(moi=0.001)進一
步評估RNA及蛋白質合成。而且,R116i-198或198RSV在DF-1及Vero細胞中具有差異RNA及蛋白質合成譜。R116i-198或198RSV之RNA及蛋白質合成二者在雞DF-1細胞中皆減少(圖6J)。相比之下,上游RNA及蛋白質在Vero細胞中增加,但L mRNA及L蛋白之含量因基因間插入198 nt序列而減少(圖6K)。在人類細胞系、人類纖維肉瘤HT1080及Hela細胞以及DF-1細胞中進一步比較病毒RNA及蛋白質合成(圖6L)。
該等數據確認R116i-198或198RSV具有差異表現,上游RNA及蛋白質合成增加而L蛋白表現下調。該等數據解釋了R116i-198或198RSV病毒在哺乳動物細胞系(例如Vero、人類HT1080及Hela細胞)中充分複製但無法在受精雞卵及雞DF-1細胞中良好地生長之原因。亦提供該等R116i病毒之減弱的雞致病性之基礎,如藉由其低大腦內致病指數(ICPI)值所展示。
圖11C比較在HT1080異種移植物小鼠腫瘤模型中mGM-CSF與hGM-CSF轉基因表現對R116i-198RSV及S116-KM之溶瘤活性的貢獻。hGM-CSF轉基因不與mGM-CSF交叉反應且因其使用其作為對照。腫瘤內投與之R116i-198中之mGM-CSF轉基因與hGM-CSF相比具有較低腫瘤生長抑制效能。觀察到mGM-CSF與hGM-CSF對S116病毒具有相似的腫瘤生長抑制。藉由溶菌斑分析測定經病毒治療之腫瘤中之病毒效價(圖11D)。在腫瘤注射後第4天時,對具有mGM-CSF或hGM-CSF對之R116i-198RSV及S116-KM檢測到相似效價。然而,在注射後第7天時,未檢測到具有mGM-CSF之R116i-198RSV,而具有hGM-CSF之R116i-198RSV仍具有約4.5 log/g組織之病毒效價。具有hGM-CSF或mGM-CSF之S116之病毒效價無差異。該等數據指示R116i對mGM-CSF之表現促進病毒清除率。
檢查受病毒感染之腫瘤組織中之免疫細胞浸潤(圖11E)。在經治療腫瘤中,與具有hGM-CSF以及S116 hGM-CSF及mGM-CSF對之R116-198RSV相比,具有mGM-CSF之R116i-198RSV具有最大數量之嗜中性球、NK及巨噬細胞。藉由luminex分析測定經病毒治療之腫瘤中之細胞介素及趨化因子(圖11F)。與未經治療之腫瘤組織相比,所有四種病毒刺激數倍的細胞介素及趨化因子產生。R116i對mGM-CSF之表現係S116的約10倍(106.7對9.9倍)。
圖11G顯示在HT1080異種移植物小鼠腫瘤模型中,含有相同hGM-CSF轉基因之在HN-L接合處插入198 nt或318 nt之R116i之相似的腫瘤生長抑制活性。HN-L接合處之318個核苷酸插入不會降低病毒溶瘤病毒活性。
補體(C’)系統係宿主中抵抗微生物侵襲之主要防禦系統。在人類補體系統中存在約30種不同的糖蛋白,其中20種在血漿中起作用且10種係調控劑或細胞膜上之受體。膜結合C’調控劑(RCA)包括4種經充分表徵之分子:hCD46、hCD55、hCD59及hCD35。其主要功能係保護人類細胞抵抗自體補體攻擊而不影響C’在消除外源劑中之作用。該等RCA蛋白具有宿主物種特異性。在過去用於病毒療法之NDV通常在受精雞卵中產生。預期藉由靜脈內注射投與癌症患者之NDV溶瘤病毒可被快速清除,因此減少有效的病毒投用。由於自人類細胞產生之有包膜病毒在其自受感染細胞釋出期間納入RCA蛋白,因此期望在人類細胞培養物中產生NDV以減少C’介導之病毒溶解或失活。
藉由檢查受精雞卵、人類293及Hela S3懸浮液細胞系中所產生之NDV評估NDV對C’介導之失活之敏感性(圖17)。在卵中生長之病毒對C’失活敏感,藉由熱處理(56℃,保持30min)血清消除血清抑制。豚鼠補體具有相似程度之病毒失活效應(數據未顯示),此確認病毒失活
歸因於C’。另外,自Hela細胞產生之病毒比293細胞及卵對人類C’介導之病毒失活更具抗性。因此,該數據表明Hela細胞之NDV溶瘤病毒產生優於293細胞,此可能產生較緩慢之病毒清除率且因此增加治療指數。
為解釋自Hela S3細胞產生之NDV對C’更具抗性的原因,評估293及Hela S懸浮液細胞系之4種經充分表徵之人類RCA蛋白hCD46、hCD55、hCD59及hCD35的含量。在293及Hela細胞中藉由西方分析未檢測到hCD35且因此數據在圖18中未顯示。在豐度高於293細胞之Hela S3細胞中檢測hCD46、hCD55及hCD59。因此,RCA蛋白之含量與病毒對C’之敏感性呈負相關。
為確定所有三種RCA蛋白是否調控C’功能,藉由反向遺傳學將hCD55、hCD59或hCD46轉基因插入NDV基因組中,且產生表現三種RCA蛋白中每一者之重組病毒。西方墨點分析顯示,該等RCA蛋白中之每一者皆由病毒來表現且納入病毒粒子中(圖19)。hCD55經測定為賦予C’失活功能之主要RCA蛋白(圖20)。在將hCD55納入病毒粒子中之卵中產生之表現hCD55的病毒對C’介導之失活最具抗性,其最接近Hela細胞中所產生之病毒。相比之下,hCD46在病毒對C’失活之抗性方面具有邊際改良,且hCD59在C’調控中不具可檢測作用。
總之,為降低溶瘤病毒療法之病毒清除率且改良NDV治療指數,將Hela細胞視為用於病毒產生選擇之細胞系。
本文所闡述之結果係使用以下材料及方法來獲得。
使用以下細胞系及相應的培養基:非洲綠猴腎Vero細胞系(ATCC)及人類纖維肉瘤(HT1080,ATCC)、含有10%胎牛血清(FBS)之伊格爾最低必需培養基(Eagle’s minimal essential medium,EMEM,Hyclone);Vero純系51D11系(MedImmune)、含有1%麩醯胺酸之無血
清培養基(SFMMegaVir,Hyclone);正常人類皮膚纖維母細胞(CCD1122Sk,ATCC)、含有10% FBS之ATCC調配之伊氏改良達爾伯克氏培養基(ATCC formulated Iscove's Modified Dulbecco's medium,IMEM)。使重組新城雞瘟病毒(NDV)在不含特定病原體(SPF)之10-11天齡受精雞卵、Vero或Vero純系51D11細胞之尿囊腔中生長。
自Dr.Mark Peeples(全國兒童醫院(Nationwide Children’s Hospital))獲得NDV株73T之病毒RNA。比對NDV序列(基因庫)以獲得共有序列,以設計用於病毒RNA之RT-PCR之DNA寡核苷酸。藉由高保真度RT-PCR產生跨越整個NDV基因組之六個亞基因組cDNA重疊片段(圖1)。pUC19載體經修飾以包括含有引入EcoRI與HindIII位點之間之限制位點的88 nt寡核苷酸連接體用於依序組裝NDV 73T株之全長反基因組cDNA。另外,73T株cDNA質體(p73T)含有在5’末端之27核苷酸(nt)T7 RNA聚合酶啟動子及含有HDV反基因組核酶序列之189 nt以及在3’末端之T7 RNA聚合酶轉錄終止信號。為產生非毒性NDV,藉由位點定向誘變將編碼融合蛋白之蛋白酶裂解位點之序列修飾成非毒性NDV LaSota株(弱毒性,lento)之彼等或巨細胞病毒(S116)之糖蛋白B(gB)。為構築NP、P及L表現質體,藉由RT-PCR擴增蛋白質開放閱讀框(ORF),並在T7 RNA聚合酶之控制下選殖至質體pCITE2a中。
為在P-M接合處插入轉基因,在含有SacII-PmlI片段之亞純系質體之nt 3148處引入AfeI限制位點(圖2A)。對編碼人類或小鼠顆粒球巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)或介白素2(IL-2)之cDNA實施密碼子優化且藉由DNA 2.0合成。基因盒含有N之基因末端(GE)、P之基因起始(GS)及插入AfeI位點中之轉基因之開放閱讀框(ORF)。將來自所得質體之SacII-PmlI片段混洗至質體r73T中且命名為p73T-P1。
為將轉基因插入介於HN ORF與HN之基因末端信號(GE)序列之間之HN-L接合處,在含有AgeI-XbaI片段之質體的nt 8231處引入AfeI限制位點(圖2A)。藉由PCR使用一對磷酸鹽有義及反義引子(表3)產生基因盒且插入AfeI位點中。
加下劃線處為基因末端(GE)及基因起始(GS)序列。Kozak序列以小寫顯示。對應於轉基因之5’或3’序列之序列以斜體顯示。除EGFP(H-N)外,所有其他引子對皆可用於插入G-M或HN-L之間之轉基因。
hGM-CSF:人類顆粒球-巨噬細胞菌落刺激因子;mGM-CSF:小鼠GM-CSF;hIL-2及mIL-2分別對應於人類及小鼠介白素2(IL-2)。
將來自所得質體之AgeI-XbaI片段混洗至質體p73T中,從而產生p73T-HN1。在HN-L接合處插入序列之另一策略係在HN之基因末端信號(GE)與L之基因起始信號(GS)之間在nt 8359處引入之AfeI位點處插入轉基因盒或來自其他副黏液病毒之序列(圖4)。FL cDNA質體稱為p73T-R116i。由於NDV基因組長度必須呈6核苷酸之倍數(6之規則),故使不同構築體之反基因組cDNA遵循6之規則。
為將兩個轉錄盒插入P-M接合處,在GM-CSF之ORF末端(nt 3619)引入AfeI位點(圖2B)。使用一對含有GE及GS序列之磷酸鹽有義及反義引子擴增IL-2 ORF且插入AfeI位點處。將來自包括GM-CSF及IL-2轉錄盒之所得質體之SacII-PmlI片段交換回至質體r73T中,從而產生p73T-P2。
藉由用鴿副黏液病毒1(PPMV-1)之F及HN替代NDV之彼等產生嵌
合NDV基因組DNA。連接NDV 73T F之細胞質尾區及跨膜部分之C末端編碼序列(胺基酸殘基503至553)與PPMV-1之胞外結構域F蛋白編碼序列(殘基1至502),藉由重疊PCR反應使用GeneArt套組(Invitrogen)將NDV HN之N末端編碼序列(胺基酸序列殘基1至45)與HN(殘基46至577)融合在一起。將擴增片段消化且選殖至經PmlI-AgeI消化之NDV cDNA中。藉由相似選殖策略將副流感病毒5(PIV-5)F或HN引入NDV 73T反基因組cDNA中。將PIV5 F(殘基1至486)胞外結構域與NDV 73TF之跨膜及細胞質尾區(殘基503至553)融合在一起。連接NDV HN(殘基1至45)與PIV5 HN胞外結構域(殘基36至565)。將cDNA片段選殖至經PmlI-AgeI消化之NDV反基因組cDNA中。
使用三個表現NDV NP、P及L蛋白之質體(分別為0.4μg、0.4μg及0.2μg/孔6孔盤)及編碼NDV反基因組cDNA之質體(1.6μg)使用Lipofectamine 2000轉染表現T7 RNA聚合酶之哺乳動物細胞系(例如BHK-T7細胞)。轉染後3天,將細胞培養物上清液注射至10至11天齡SPF受精雞卵之尿囊腔中或於Vero細胞中傳代以擴增獲救病毒。藉由血凝分析使用1%雞紅血細胞(RBC)確認病毒之回收。亦可藉由將NP、P、L、反基因組cDNA質體以及表現T7 RNA聚合酶之質體電穿孔至如先前所闡述之Vero細胞中實施病毒之拯救(Kaur等人,Optimization of plasmid-only rescue of highly attenuated and temperature-sensitive respiratory syncytial virus(RSV)vaccine candidates for human trials.2008 J.Virol.Methods 153:196-202)。藉由對RT-PCR擴增之cDNA測序確認所回收病毒。
為檢查F蛋白裂解序列(FPCS)是否穩定且是否可在組織培養物中傳代後選擇任何穩定突變,在Vero及人類纖維肉瘤HT1080細胞中以
0.01之MOI將r73T-S116連續傳代10次。每2-3代後,自培養基分離病毒RNA,藉由RT-PCR擴增cDNA且對F及/或HN基因實施測序。
使用連續稀釋病毒感染6孔板上之Vero細胞且在37℃下在1%甲基纖維素塗層下培育3天或6天以供分析溶菌斑形態,且在胰蛋白酶(TrpyLETM,Invitrogen)存在下培育以供量化病毒效價。使用甲醇固定細胞單層且用針對全失活NDV病毒之雞抗NDV多株抗體染色,然後暴露於辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之抗雞抗體(Dako)下。
在10天齡SPF受精雞卵中藉由平均死亡時間(MDT)測試測定r73T病毒之致病性。在1天齡SPF雞中在USDA國家獸醫服務實驗室(NVSL,Ames,Iowa)實施ICPI測試。對於MDT測試,將0.1ml介於10-6與10-9之間之一系列10倍稀釋接種於8-10個9-10天齡卵之尿囊腔/稀釋中,且在37℃下培育。每天兩次檢查卵持續7天以記錄胚胎死亡時間。MDT計算為殺死所有接種胚胎之病毒之最小致死劑量的平均時間(hr)。MDT分析提供病毒致病性之合理預測。MDT<60hr之病毒通常為病毒原性(毒性)株;MDT=60hr至90hr為中毒性(中等)株;>90h為強毒性(毒性)株。對於ICPI測試,經由大腦內途徑將針對每一病毒之新鮮感染性尿囊液之0.05ml 1:10稀釋接種於10 1天齡SPF雞群中。每8hr一次觀察鳥之臨床症狀及死亡率持續8天之時段。在每次觀察時,如下對鳥進行評分:0,正常;1,患病;及2,死亡。ICPI係經8天時段之評分/鳥/觀察之平均值。ICPI值介於0.0至2.0範圍內。低毒性(LoND):ICPI<0.7;毒性(vND):ICPI0.7。
將細胞以不同MOI經r73T過夜感染之5×103個細胞/孔平鋪於96孔
板中。根據製造手冊藉由CellTiter Glo套組(Promega)測定細胞活力。
藉由比較每一測試樣品之ATP含量對100%活之未經治療樣品對照測定存活細胞之相對百分數。表中所呈現之數據係經殺死細胞之相對百分數。
向無胸腺NCR同源裸小鼠(Taconic)之一側腹皮下(s.c.)植入5×106個HT1080細胞(於100μL PBS中)。病毒治療開始於腫瘤達到65-300mm3之體積時。分別藉由腫瘤內(i.t)經局部注射或藉由腫瘤內(i.t)以全身性方式注射將100μl中之重組73T以不同劑量值投與至尾靜脈中。向對照動物僅注射100μL PBS。使用數位卡尺量測腫瘤生長,且腫瘤體積計算為0.5×(高度)×寬度×長度(mm3)。在體重下降佔初始體重之20%或腫瘤體積超過2000mm3時處死小鼠。
向9只帶有HT1080人類纖維肉瘤異種移植物皮下腫瘤之裸小鼠i.v注射108pfu之r73T-R116i-hGM-CSF。在注射後1天、4天及8天終止三隻小鼠。在第8天終止一隻注射有PBS之小鼠。收集腫瘤、肺、脾、卵巢及血清樣品。藉由溶菌斑分析量化組織均質物中之感染性病毒效價。
根據製造商之說明書使用溫和MACS解離器(Miltenyi Biotec)將來自受NDV感染及PBS注射之小鼠之腫瘤於PBS中均質化。藉由Duoset ELISA套組(R&D)測試來自均質化組織之上清液或自小鼠收集之血清的GM-CSF含量。
使用GraphPad Prism 6.0軟體實施所有統計學分析。使用未配對t-測試來評價組之間之腫瘤消退差異。亦使用GraphPad Prism軟體來計
算正常及腫瘤細胞中之活體外細胞殺死之rNDV 73T之IC50。
根據上文描述將明瞭,可對本文所闡述之本發明作出變化及修改以使其適應不同的用途及條件。該等實施例亦在下文申請專利範圍之範疇內。
本文變量之任何定義中之要素列表之列舉包括該變量作為任何單一要素或所列示要素之組合(或子組合)的定義。本文實施例之列舉包括作為任何單一實施例或與任何其他實施例或其部分組合之該實施例。
本說明書中所提及之所有專利、公開案、CAS及登錄號皆以引用方式併入本文中,其併入程度如同明確地及個別地指示將每一獨立專利、公開案及登錄號以引用方式併入一般。
<110> 英商梅迪繆思有限公司
<120> 以減毒新城雞瘟病毒為特徵之組合物及用於
治療贅瘤形成之方法
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Claims (43)
- 一種減毒新城雞瘟病毒(NDV),其包含源自巨細胞病毒(CMV)(S116)之糖蛋白B(gB)之F蛋白裂解位點。
- 如請求項1之減毒新城雞瘟病毒,其中該經修飾之F蛋白裂解序列(FPCS)包含選自由以下組成之群之序列:S116:111H-N-R-T-K-S/F117(SEQ ID NO:1)S116K:111H-N- K -T-K-S/F117(SEQ ID NO:2)S116M:111H-N-R- M -K-S/F117(SEQ ID NO:3)S116KM:111H-N- K - M -K-S/F-I118(SEQ ID NO:4)R116:111H-N-R-T-K- R /F-I118(SEQ ID NO:5)。
- 如請求項1或2之減毒新城雞瘟病毒,其中該減毒病毒株係經修飾73T株。
- 如請求項1或2之減毒新城雞瘟病毒,其中該減毒NDV病毒係r73T-R116病毒。
- 如請求項1或2之減毒新城雞瘟病毒,其中該病毒包含增加的HN-L基因間區。
- 如請求項1至5中任一項之減毒新城雞瘟病毒,其中該HN-L基因間區包含長度介於至少約50個至300個之間之胺基核苷酸之非編碼序列。
- 如請求項6之減毒新城雞瘟病毒,其中該非編碼序列係源自1型副黏液病毒(APMV-1)、呼吸道融合病毒(RSV)或隨機序列。
- 如請求項6之減毒新城雞瘟病毒,其中該HN與L基因間非編碼序列之長度為60 nt、102 nt、144 nt、198 nt或318 nt。
- 如請求項1至8中任一項之減毒新城雞瘟病毒,其中該病毒包含一或多個異源多核苷酸序列插入P-M接合處及/或HN-L接合處。
- 如請求項9之減毒新城雞瘟病毒,其中該病毒包含兩個或更多個異源多核苷酸序列,其中至少一個異源多核苷酸序列插入該P-M接合處且至少一個插入該HN-L接合處。
- 如請求項9之減毒新城雞瘟病毒,其中該異源多核苷酸序列係編碼增強該病毒之溶瘤特性之多肽的轉基因。
- 如請求項10之減毒新城雞瘟病毒,其中該轉基因編碼細胞介素、細胞表面配體及/或趨化因子。
- 如請求項10之減毒新城雞瘟病毒,其中該細胞介素係選自由以下組成之群:GM-CSF、IL-2、IL-21、IL-15、IL-12及IL-12p70。
- 如請求項13之減毒新城雞瘟病毒,其中該細胞介素係人類GM-CSF。
- 如請求項9之減毒新城雞瘟病毒,其中該異源多核苷酸序列係編碼可檢測部分之轉基因。
- 如請求項15之減毒新城雞瘟病毒,其中該可檢測部分之表現量與病毒複製相關。
- 如請求項1至16中任一項之減毒新城雞瘟病毒,其中NDV之F及HN基因經犬副流感病毒5(PIV 5)或鴿1型副黏液病毒(PPMV-1)之相應細胞外結構域替代。
- 如請求項1或2之減毒新城雞瘟病毒,其中該病毒係73T-R116i-hGM-CSF。
- 如請求項1或2之減毒新城雞瘟病毒,其中該減毒病毒具有大於90小時或約90小時至156小時之卵平均死亡時間(MDT)。
- 如請求項1或2之減毒新城雞瘟病毒,其中該減毒病毒具有介於約0至0.7之間之大腦內致病指數。
- 如請求項1或2之減毒新城雞瘟病毒,其中該減毒病毒具有約0之 大腦內致病指數。
- 如請求項1或2之減毒新城雞瘟病毒,其中該減毒病毒在HT1080細胞中具有小於約15%之細胞毒性。
- 如請求項1或2之減毒新城雞瘟病毒,其中該減毒病毒以至少10%或15%之殺死效率選擇性殺死腫瘤細胞。
- 如請求項23之減毒新城雞瘟病毒,其中該腫瘤細胞殺死效率介於約75%至100%之間。
- 一種選擇性殺死腫瘤細胞之方法,該方法包含使腫瘤細胞與如請求項1至22中任一項之減毒新城雞瘟病毒接觸。
- 一種誘導個體之腫瘤消退之方法,該方法包含使腫瘤細胞與如請求項1至22中任一項之減毒新城雞瘟病毒接觸。
- 一種降低腫瘤細胞存活率或增殖之方法,該方法包含使腫瘤細胞與如請求項1至22中任一項之減毒新城雞瘟病毒接觸。
- 如請求項25至27中任一項之方法,其中該細胞係選自由以下組成之群之癌細胞:膀胱癌、卵巢癌、腦癌、胰臟癌、前列腺癌、肉瘤、肺癌、乳癌、子宮頸癌、骨癌、肝癌、頭頸癌、胃癌、腎癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、結腸癌、結腸直腸癌及黑色素瘤細胞。
- 一種治療個體之贅瘤形成之方法,該方法包含向個體投與有效量之如請求項1至22中任一項之減毒新城雞瘟病毒。
- 如請求項25至29中任一項之方法,其中該減毒新城雞瘟病毒係r73T-S116。
- 如請求項26之方法,其中該減毒新城雞瘟病毒係以全身性、腹膜內或腫瘤內遞送。
- 如請求項26之方法,其中病毒係以約107pfu至約109pfu之劑量投與。
- 如請求項26之方法,其中該病毒係以約109pfu至約1011pfu之劑量靜脈內投與。
- 如請求項29之方法,其中該個體具有選自由以下組成之群之贅瘤形成:膀胱癌、卵巢癌、腦癌、胰臟癌、前列腺癌、肉瘤、肺癌、乳癌、子宮頸癌、骨癌、肝癌、頭頸癌、胃癌、腎癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、甲狀腺癌、結腸癌、結腸直腸癌及黑色素瘤。
- 一種治療已發生抗NDV免疫反應之個體之贅瘤形成的方法,該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至22中任一項之減毒嵌合新城雞瘟病毒,其中該病毒係包含犬副流感病毒5(PIV 5)或鴿1型副黏液病毒(PPMV-1)之F及/或HN基因之嵌合病毒,其中該嵌合新城雞瘟病毒之抗原與NDV不同。
- 如請求項29之方法,其中相對於已發生抗NDV免疫反應、但未接受嵌合新城雞瘟病毒的對照個體中所存在之溶瘤病毒之含量,該方法增加該個體中所存在之溶瘤病毒之含量。
- 一種包含73T之全長cDNA之核酸,其中該核酸編碼選自由以下組成之群之經修飾F蛋白裂解序列:S116:111H-N-R-T-K-S/F117(SEQ ID NO:1)S116K:111H-N- K -T-K-S/F117(SEQ ID NO:2)S116M:111H-N-R- M -K-S/F117(SEQ ID NO:3)S116KM:111H-N- K - M -K-S/F-I118(SEQ ID NO:4)R116:111H-N-R-T-K- R /F-I118(SEQ ID NO:5)。
- 一種包含73T之全長cDNA之載體,其中該載體編碼選自由以下組成之群之經修飾F蛋白裂解序列:S116:111H-N-R-T-K-S/F117(SEQ ID NO:1)S116K:111H-N- K -T-K-S/F117(SEQ ID NO:2) S116M:111H-N-R- M -K-S/F117(SEQ ID NO:3)S116KM:111H-N- K - M -K-S/F-I118(SEQ ID NO:4)R116:111H-N-R-T-K- R /F-I118(SEQ ID NO:5)。
- 一種毒性粒子,其包含如請求項37之核酸。
- 一種宿主細胞,其經如請求項1至24中任一項之減毒新城雞瘟病毒感染。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項37之核酸。
- 如請求項1至24中任一項之減毒新城雞瘟病毒,其中該新城雞瘟病毒株係73T。
- 如請求項10之減毒新城雞瘟病毒,其中該轉基因係選自表5中所列示之轉基因。
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