ES2708755T3 - Composiciones que presentan un virus de la enfermedad de Newcastle atenuado y métodos de uso para el tratamiento de la neoplasia - Google Patents

Composiciones que presentan un virus de la enfermedad de Newcastle atenuado y métodos de uso para el tratamiento de la neoplasia Download PDF

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Abstract

Una cepa 73T del virus de la enfermedad de Newcastle atenuado (NDV) en la que se modifica el sitio de escisión de la proteína F de tipo salvaje (FPCS) que tiene la secuencia de aminoácidos 111G-R-R-Q-K-R/F117, y en la que la secuencia de escisión de la proteína F modificada (FPCS) comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: S116: 111H-N-R-T-K-S/F117; S116K: 111H-N-K-T-K-S/F117; S116M: 111H-N-R-M-K-S/F117; S116KM: 111H-N-K-M-K-S/F-I118; y R116: 111H-N-R-T-K-R/F-I118.

Description

DESCRIPCION
Composiciones que presentan un virus de la enfermedad de Newcastle atenuado y metodos de uso para el tratamiento de la neoplasia
Antecedentes
El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus aviar que causa una enfermedad contagiosa de las aves que afecta a muchas especies de aves domesticas y silvestres. La exposicion de humanos a aves infectadas (por ejemplo, en plantas procesadoras de aves de corral) puede causar conjuntivitis leve y sintomas similares a la influenza, pero el NDV no representa ningun riesgo para la salud humana y la mayoria de las personas son seronegativas para el NDV. Segun la patogenicidad viral en pollos, la patogenicidad del NDV se clasifica como alta (velogenica), media (mesogenica) o baja (lentogena) segun lo determinado por el indice de patogenicidad intracerebral (ICPI). Debido a preocupaciones agricolas, el USDA ha clasificado a los VNP mesogenicos y velogenicos con virulencia en el pollo (ICPI> 0.7) como "agentes selectos" desde 2008. La lista de toxinas y agentes selectos incluye agentes biologicos que tienen el potencial de representar una amenaza grave para la salud humana y animal, la salud de las plantas o los productos animales y vegetales.
Las formas de origen natural de NDV se han usado en estudios clinicos como un agente biologico inmunoterapeutico y viroterapeutico. El NDV se muestra prometedor como agente anticancerigeno debido a la capacidad del virus para matar selectivamente celulas tumorales humanas con toxicidad limitada para las celulas normales. Sin embargo, debido a la reclasificacion de NDV como un agente selecto, el desarrollo de NDV como agente anticancer no ha progresado. Otros virus oncoliticos han mostrado una promesa considerable en los ensayos clinicos. Para facilitar el desarrollo del NDV como terapia del cancer, se requieren nuevas formas del virus. Idealmente, estas nuevas formas retendrian su capacidad de atacar a las celulas tumorales, pero ya no causaran enfermedades en las aves.
Resumen
Como se describe a continuacion, la presente divulgacion proporciona composiciones y metodos para el tratamiento de la neoplasia.
La presente divulgacion proporciona en general un virus de la enfermedad de Newcastle atenuado (NDV) que tiene un sitio de escision de la proteina F de la cepa NDV LaSota o la glucoproteina B (gB) del citomegalovirus (CMV) (S 116). La presente divulgacion proporciona una secuencia de escision de la proteina F modificada (FPCS) con una de las siguientes modificaciones de secuencia S116: 111H-N- R-T-K-S/F117; S116K: 111H-N-K-T-K-S/F117;S116M: 111H-N-R-M-K-S/F117;S116KM: 111H-N-K-M-K-S/F-I118;o R116: 111H-N-R-T-K-R/F-I118. Tambien se describe en este documento, cuando la cepa de virus atenuada es una cepa 73T modificada. Tambien se describe en este documento, cuando el virus NDV atenuado es el virus r73T-R116. Tambien se describe en este documento, cuando el virus tiene una region intergenica HN-L aumentada. Tambien se describe en este documento, cuando la region intergenica HN-L es una secuencia no codificante entre al menos aproximadamente 50-300 amino nucleotidos de longitud. Tambien se describe en este documento, cuando la secuencia no codificante se deriva de un paramixovirus tipo -1 (APMV-1), un virus sincitial respiratorio (RSV) o una secuencia aleatoria. Tambien se describe en este documento, cuando la secuencia no codificante intergenica de HN y L tiene una longitud de 60, 102, 144, 198 o 318 nt. Tambien se describe en este documento, cuando el virus tiene una o mas secuencias de polinucleotidos heterologas insertadas en la union P-M y/o la union HN-L. Tambien se describe en este documento, cuando el virus tiene dos o mas secuencias de polinucleotidos heterologas, en las que al menos una secuencia de polinucleotidos heterologa se inserta en la union P-M y al menos una se inserta en la union HN-L. Tambien se describe en este documento, cuando la secuencia de polinucleotidos heterologa es un transgen que codifica un polipeptido que mejora las propiedades oncoliticas del virus. Tambien se describe en este documento, cuando el transgen codifica una citoquina, un ligando de la superficie celular y/o una quimiocina. Tambien se describe en este documento, cuando la citoquina se selecciona del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-21, IL-15, IL-12, y IL-12p70. Tambien se describe en este documento, cuando la citoquina es GM-CSF humano. Tambien se describe en este documento, cuando la secuencia de polinucleotidos heterologa es un transgen que codifica una unidad estructural detectable. Tambien se describe en este documento, cuando el nivel de expresion de la unidad estructural detectable se correlaciona con el virus. Tambien se describe en este documento, cuando los genes F y HN de NDV se reemplazan por los correspondientes dominios extracelulares del virus 5 de parainfluenza de canino (PIV 5) o paramixovirus de paloma tipo 1 (PPMV-1). Tambien se describe en este documento, cuando el virus es 73T-R116i-hGM-CSF. Tambien se describe en este documento, cuando el virus atenuado tiene un tiempo de muerte medio en huevos (MDT) de mas de 90 horas o aproximadamente 90-156 horas. Tambien se describe en este documento, cuando el virus atenuado tiene un indice de patogenicidad intracerebral entre aproximadamente 0-0.7. Tambien se describe en este documento, cuando el virus atenuado tiene un indice de patogenicidad intracerebral de aproximadamente 0. Tambien se describe en este documento, cuando el virus atenuado tiene menos de aproximadamente 15% de citotoxicidad en celulas HT1080. Tambien se describe en este documento, cuando el virus atenuado mata selectivamente las celulas tumorales con una eficiencia de muerte de al menos el 10 o el 15%. Tambien se describe en este documento, cuando la eficacia de muerte de celulas tumorales esta entre aproximadamente 75% -100%.
La presente divulgacion incluye un metodo para matar selectivamente celulas tumorales, que implica poner en contacto una celula tumoral con el virus de la enfermedad de Newcastle atenuado descrito en este documento. La presente divulgacion tambien proporciona una celula tumoral que es una celula de un cancer de vejiga, ovario, cerebro, pancreas, prostata, sarcoma, pulmon, mama, cuello uterino, higado, cabeza y cuello, gastrico, rinon, melanoma, linfoma, leucemia, tiroides, colon, y celulas de cancer de melanoma. Tambien se describe en este documento, cuando el metodo implica administrar al sujeto una cantidad eficaz de un virus de la enfermedad de Newcastle atenuado descrito en este documento. Tambien se describe en este documento, cuando el virus de la enfermedad de Newcastle atenuado se administra de forma sistemica, intraperitoneal o intratumoral. Tambien se describe en este documento, cuando el virus se administra a una dosis de aproximadamente 107 pfu a aproximadamente 109 pfu. Tambien se describe en este documento, cuando el virus se administra por via intravenosa a una dosis de aproximadamente 109 pfu a aproximadamente 1011 pfu. Tambien se describe en este documento, cuando el sujeto tiene un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer de vejiga, ovario, cerebro, pancreas, prostata, sarcoma, pulmon, mama, cuello uterino, higado, cabeza y cuello, gastrico, rinon, melanoma, linfoma, leucemia, tiroides, colon y melanoma.
La presente divulgacion tambien proporciona un metodo de tratamiento de una neoplasia en un sujeto que ha desarrollado una respuesta inmune anti-NDV, el metodo que implica administrar al sujeto una cantidad eficaz de un virus de la enfermedad de Newcastle quimerico atenuado descrito en este documento, en el que el virus es un virus quimerico que comprende un gen F y/o HN de virus de parainfluenza de canino 5 (PIV 5) o paramixovirus de paloma tipo 1 (PPMV-1), en el que el virus de la enfermedad de Newcastle quimerico es antigenicamente distinto del NDV. La presente divulgacion tambien proporciona un metodo que aumenta el nivel de virus oncoliticos presentes en el sujeto en relacion con el nivel de virus oncoliticos presentes en un sujeto control que ha desarrollado una respuesta inmune anti-NDV, pero que no esta recibiendo un virus de la enfermedad de Newcastle quimerico.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en este documento tienen el significado comunmente entendido por un experto en el arte a la que pertenece esta divulgacion. Las siguientes referencias proporcionan a los expertos una definicion general de muchos de los terminos usados en esta divulgacion: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se usa en este documento, los siguientes terminos tienen los significados que se les atribuyen a continuacion, a menos que se especifique lo contrario.
Por "virus de la enfermedad de Newcastle atenuado" se entiende un virus de la enfermedad de Newcastle que mata selectivamente las celulas tumorales pero que no representa una amenaza para las aves de corral. Tambien se describe en este documento, cuando el virus de la enfermedad de Newcastle atenuado tiene un ICPI inferior a aproximadamente 0.4 o 0.7. Tambien se describe en este documento, cuando el virus de la enfermedad de Newcastle atenuado tiene un ICPI entre aproximadamente 0 y 0.1.
Por "secuencia de polinucleotidos heterologa" se entiende un polinucleotido recombinante que no esta presente en la condicion de tipo salvaje.
Por "etiqueta detectable" se entiende una composicion que cuando esta unida a una molecula de interes hace que esta ultima sea detectable, por medios espectroscopicos, fotoquimicos, bioquimicos, inmunoquimicos o quimicos. Por ejemplo, las etiquetas utiles incluyen isotopos radiactivos, perlas magneticas, perlas metalicas, particulas coloidales, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usan comunmente en un ELISA), biotina, digoxigenina o haptenos.
Por "agente" se entiende cualquier compuesto quimico de molecula pequena, anticuerpo, molecula de acido nucleico o polipeptido, o fragmentos de los mismos.
Por "alteracion" o "cambio" se entiende un aumento o una disminucion. Una alteracion puede ser tan pequena como 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, o como 40%, 50%, 60%, o incluso hasta 70%, 75%, 80%, 90%, o 100%.
Como se usa en este documento, el termino "anticuerpo" se refiere a un polipeptido o grupo de polipeptidos que comprende al menos un dominio de union que se forma a partir del plegamiento de cadenas polipeptidicas que tienen espacios de union tridimensionales con formas de superficie internas y distribuciones de carga complementarias a las caracteristicas de un determinante antigenico de un antigeno. Un anticuerpo por lo general tiene una forma tetramerica, que comprende dos pares identicos de cadenas polipeptidicas, cada par tiene una cadena "ligera" y una "pesada". Las regiones variables, o polipeptidos de cadena variable, de cada par de cadenas ligeras/pesadas forman un sitio de union de anticuerpo.
El termino "mAb" se refiere a anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos de la divulgacion comprenden, sin limitacion, anticuerpos nativos completos, anticuerpos biespecfficos; anticuerpos quimericos; Fab, Fab', fragmentos de la region V de una sola cadena (scFv), polipeptidos de fusion y anticuerpos no convencionales.
Por "muestra biologica" se entiende una muestra obtenida de un sujeto que incluye una muestra de tejido biologico u origen de fluido, obtenida o recolectada in vivo o in situ. Una muestra biologica puede incluir cualquier celula, tejido, fluido u otro material derivado de un organismo.
Por "reactivo de captura" se entiende un reactivo que se une especfficamente a una molecula de acido nucleico o polipeptido para seleccionar o aislar la molecula de acido nucleico o polipeptido.
Por "agresividad clmica" se entiende la gravedad de la neoplasia. Las neoplasias agresivas son mas propensas a convertirse en metastasis que las neoplasias menos agresivas. Si bien los metodos de tratamiento conservadores son apropiados para las neoplasias menos agresivas, las neoplasias mas agresivas requieren regfmenes terapeuticos mas agresivos.
Como se usa en este documento, los terminos "determinar", "evaluar", "ensayar", "medir" y "detectar" se refieren a determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas, y como tal, el termino "determinar" se usa indistintamente en este documento con "ensayar", "medir" y similares. Cuando se pretende una determinacion cuantitativa, se usa la frase "determinar una cantidad" de un analito y similares. Cuando se pretende una determinacion cualitativa y/o cuantitativa, se usa la frase "determinar un nivel" de un analito o "detectar" un analito.
El termino "sujeto" o "paciente" se refiere a un animal que es objeto de tratamiento, observacion o experimento. Solo a modo de ejemplo, un sujeto incluye, pero no se limita a, un mamffero, que incluye, pero no se limita a, un mamffero humano o no humano, tal como un primate no humano, murino, bovino, equino, canino, ovino, o felino.
El termino "reducir" o "aumentar" pretende alterar de manera negativa o positiva, respectivamente. Una alteracion puede ser del 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75%, o incluso del 100%.
Por "referenda" se entiende un estandar de comparacion.
Por "periodico" se entiende a intervalos regulares. El monitoreo periodico del paciente incluye, por ejemplo, un programa de pruebas que se administran diariamente, cada dos semanas, cada dos meses, mensualmente, cada dos anos o anualmente.
Por "gravedad de la neoplasia" se entiende el grado de patologfa. La gravedad de una neoplasia aumenta, por ejemplo, a medida que aumenta la etapa o el grado de la neoplasia.
Las moleculas de acido nucleico utiles en los metodos descritos en este documento incluyen cualquier molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido descrito en este documento o un fragmento del mismo. Tales moleculas de acido nucleico no necesitan ser 100% identicas a una secuencia de acido nucleico endogena, pero por lo general exhibiran una identidad sustancial. Los polinucleotidos que tienen una "identidad sustancial" con una secuencia endogena son por lo general capaces de hibridar con al menos una cadena de una molecula de acido nucleico bicatenario. Por "hibridacion" se entiende un par para formar una molecula bicatenaria entre secuencias de polinucleotidos complementarias (por ejemplo, un gen descrito en este documento), o porciones de las mismas, en diversas condiciones de rigurosidad. (Vease, por ejemplo, Wahl, G. M. y S. L. Berger (1987) Methods Enzymol.
152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507).
Por ejemplo, la concentracion rigurosa de sal generalmente sera menor que aproximadamente NaCl 750 mM y citrato trisodico 75 mM, preferiblemente menor de aproximadamente NaCl 500 mM y citrato trisodico 50 mM, y mas preferiblemente menor de aproximadamente NaCl 250 mM y citrato trisodico 25 mM. Se puede obtener una hibridacion de baja rigurosidad en ausencia de solvente organico, por ejemplo, formamida, mientras que se puede obtener una hibridacion de alta rigurosidad en presencia de al menos aproximadamente 35% de formamida, y mas preferiblemente al menos aproximadamente 50% de formamida. Las condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluiran temperaturas de al menos aproximadamente 30 °C, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 37 °C, y mas preferiblemente de al menos aproximadamente 42 °C. Variar parametros adicionales, tal como el tiempo de hibridacion, la concentracion de detergente, por ejemplo, el dodecil sulfato de sodio (SDS), y la inclusion o exclusion del ADN portador, son bien conocidos para los expertos en el arte. Se logran diversos niveles de rigurosidad combinando estas diversas condiciones segun sea necesario. Tambien se describe en este documento, cuando se producira la hibridacion a 30 °C en NaCl 750 mM, citrato trisodico 75 mM y SDS al 1%. Tambien se describe en este documento, cuando se producira la hibridacion a 37 °C en NaCl 500 mM, citrato trisodico 50 mM, SDS al 1%, formamida al 35% y ADN de esperma de salmon desnaturalizado a 100 mg/ml (ssADN). Tambien se describe en este documento, cuando se producira la hibridacion a 42 °C en NaCl 250 mM, citrato trisodico 25 mM, SDS al 1%, formamida al 50% y 200 m.pg/ml de ssADN. Las variaciones utiles en estas condiciones seran facilmente evidentes para los expertos en el arte.
En la mayoria de las aplicaciones, las etapas de lavado que siguen a la hibridacion tambien variaran en el rigor. Las condiciones de rigurosidad de lavado se pueden definir por la concentracion de sal y por la temperatura. Como se indico anteriormente, la rigurosidad del lavado se puede aumentar al disminuir la concentracion de sal o al aumentar la temperatura. Por ejemplo, la concentracion de sal rigurosa para las etapas de lavado sera preferiblemente menor que aproximadamente NaCl 30 mM y citrato trisodico 3 mM, y mas preferiblemente menor de aproximadamente NaCl 15 mM y citrato trisodico 1.5 mM. Las condiciones de temperatura rigurosas para las etapas de lavado generalmente incluiran una temperatura de al menos aproximadamente 25 °C, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 42 °C, e incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente 68 °C. Tambien se describe en este documento, cuando las etapas de lavado aparecen a 25 °C en NaCl 30 mM, citrato trisodico 3 mM y SDS al 0.1%. Tambien se describe en este documento, cuando se produciran las etapas de lavado a 42 °C en
NaCl 15 mM, citrato trisodico 1.5 mM y SDS al 0.1%. Tambien se describe en este documento, cuando ocurriran las etapas de lavado a 68 °C en NaCl 15 mM, citrato trisodico 1.5 mM y SDS al 0.1%. Las variaciones adicionales en estas condiciones seran facilmente evidentes para los expertos en el arte. Los expertos en el arte conocen bien las tecnicas de hibridacion y se describen, por ejemplo, en Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Por "sustancialmente identico" se entiende un polipeptido o molecula de acido nucleico que muestra al menos un 50% de identidad con una secuencia de aminoacidos de referencia (por ejemplo, una cualquiera de las secuencias de aminoacidos descritas en este documento) o una secuencia de acido nucleico (por ejemplo, una cualquiera de las secuencias de acido nucleico descritas en este documento). Preferiblemente, dicha secuencia es al menos 60%, mas preferiblemente 80% o 85%, y mas preferiblemente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o incluso 99% o mas identica a nivel de aminoacidos o acido nucleico a la secuencia usada para la comparacion.
La identidad de la secuencia se mide normalmente usando un software de analisis de secuencia (por ejemplo, el paquete de software de analisis de secuencia del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP, o PILEUP/PRETTYBOX). Tal software empareja secuencias identicas o similares asignando grados de homologia a diversas sustituciones, eliminaciones y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras incluyen por lo general sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; acido aspartico, acido glutamico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En un enfoque de ejemplo para determinar el grado de identidad, se puede usar un programa BLAST, con una puntuacion de probabilidad entre e-3 y e-100 que indica una secuencia estrechamente relacionada.
Como se usa en este documento, "sustancialmente pura" significa que una especie de interes es la especie predominante presente (esto es, en una base molar es mas abundante que cualquier otra especie individual en la composicion), y preferiblemente una fraccion sustancialmente purificada es una composicion en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general, una composicion sustancialmente pura comprendera mas de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composicion, mas preferiblemente mas de aproximadamente el 85%, 90%, 95% y 99%. Mas preferiblemente, la especie de interes se purifica hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composicion mediante metodos de deteccion convencionales) en el que la composicion consiste esencialmente en una sola especie macromolecular.
Como se usa en este documento, los terminos "tratar", "que trata", "tratamiento" y similares se refieren a reducir o mejorar un trastorno y/o sintomas asociados con el mismo. Se apreciara que, aunque no se excluye, tratar un trastorno o afeccion no requiere que el trastorno, la afeccion o los sintomas asociados con estas se eliminen por completo. De este modo, un tratamiento exitoso puede prolongar la supervivencia de un paciente o aliviar un sintoma no deseado.
Como se usa en este documento, los terminos "prevenir", "prevenir", "prevencion", "tratamiento profilactico" y similares se refieren a reducir la probabilidad de desarrollar un trastorno o afeccion en un sujeto, que no tiene, pero es en riesgo de o ser susceptible de desarrollar un trastorno o afeccion.
Una dosis se refiere a una administracion unica de una composicion terapeutica. La dosificacion se refiere a la cantidad de una molecula terapeuticamente activa en una dosis. Un regimen de tratamiento se refiere a la dosis, el horario y el modo de administracion de una o mas dosis. Un ciclo se refiere a una unidad repetible de una o mas dosis dentro de un regimen de tratamiento. En algunos regimenes de tratamiento las dosis son uniformes para cada dosis. En otros regimenes de tratamiento, las dosis pueden no ser uniformes.
Por ejemplo, se pueden usar una o mas dosis de carga para elevar la concentracion de una molecula terapeutica a un nivel deseado en un paciente. Las dosis de carga pueden ir seguidas de una o mas dosis de mantenimiento, que generalmente comprenden dosis mas bajas (por ejemplo, la mitad o menos de una dosis de carga) que son suficientes para mantener una concentracion deseada de una molecula terapeutica en un paciente. Se puede usar una o mas dosis reducidas para reducir gradualmente la concentracion de una molecula terapeutica en un paciente.
Por "se une especificamente" se entiende un compuesto (por ejemplo, un anticuerpo) que reconoce y se une a una molecula (por ejemplo, un polipeptido), pero que no reconoce y se une sustancialmente a otras moleculas.
A menos que se indique especificamente o sea obvio en el contexto, como se usa en este documento, el termino "aproximadamente" se entiende dentro de un intervalo de tolerancia normal en la tecnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estandar de la media. Aproximadamente se puede entender dentro del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% o 0.01% del valor establecido. A menos que se indique lo contrario en el contexto, todos los valores numericos proporcionados en este documento estan modificados por el termino acerca de.
Se entiende que los intervalos proporcionados en este documento son abreviados para todos los valores dentro del intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier numero, combinacion de numeros o subintervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50.
Cualquier compuesto, composicion o metodo proporcionado en este documento se puede combinar con uno o mas de cualquiera de las otras composiciones y metodos proporcionados en este documento.
Como se usa en este documento, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen formas plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "un biomarcador" incluye la referencia a mas de un biomarcador.
A menos que se indique especificamente o sea obvio a partir del contexto, como se usa en este documento, el termino "o" se entiende que es inclusivo.
El termino "que incluye" se usa en este documento para significar, y se usa de manera intercambiable con, la frase "que incluye pero no se limita a".
Como se usa en este documento, los terminos "comprenden", "que comprende", "que contiene", "que tiene" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de Patentes de los Estados Unidos y pueden significar "incluye", "que incluye" y similares; "que consiste esencialmente en” o "consiste esencialmente" tambien tiene el significado que se le atribuye en la Ley de Patentes de EE. UU. y el termino es abierto, permitiendo la presencia de mas de lo que se recita siempre que las caracteristicas basicas o novedosas de lo que se recita no se modifica por la presencia de mas de lo que se recita, pero excluye las realizaciones de la tecnica anterior.
Secuencias
Una secuencia de nucleotidos de ejemplo del virus 73V de NDV de longitud completa es:
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Una secuencia de nucleotidos de ejemplo de la proteina F de wt es, en la que la secuencia subrayada indica la secuencia de nucleotidos del sitio de escision de la proteina F:
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Una secuencia de aminoacidos de ejemplo de la proteina F de tipo salvaje en la que la secuencia subrayada indica la secuencia de aminoacidos del sitio de escision de la proteina F:
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Una secuencia de nucleotidos de ejemplo de GM-CSF de raton es:
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Una secuencia de aminoacidos de ejemplo de GM-CSF de raton es:
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Una secuencia de nucleotidos de ejemplo de GM-CSF humano es:
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Una secuencia de aminoacidos de ejemplo de GM-CSF humano es:
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Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 representa la construccion de la cepa 73T de ADNc antigenomico NDV 73T. Las secuencias de NDV en GenBank se alinearon para obtener secuencias de consenso para disenar oligonucleotidos de ADN para RT-PCR del ARN viral. Seis fragmentos de ADNc subgenomicos generados por RT-PCR de alta fidelidad se ensamblaron en el vector pUC19. El ADNc de longitud completa de NDV 73T se designo como p73T. La secuencia de nucleotidos y de aminoacidos deducida del sitio de escision de la proteina F (FPCS) en la 73T se modifico como la de la cepa LaSota del NDV (lentogenica, lenta) y gB de citomegalovirus (CMV) (S116). La doble barra indica el sitio de escision de la proteina F. Ademas, el plasmido de ADNc de la cepa 73T (p73T) contiene un promotor de la ARN polimerasa T7 de 27 nucleotidos (nt) en el extremo 5' y una secuencia de ribozima antigenoma HDV que contiene 189 nt y una senal de terminacion de la transcripcion de la ARN polimerasa T7 en el extremo 3'. Para generar NDV no virulento, la secuencia que codifica el sitio de escision de la proteasa de la proteina de fusion se modifico por mutagenesis de sitio dirigida como las de la cepa NDV LaSota no virulenta (lentogenica, lenta) o la glucoproteina B (gB) del citomegalovirus (S116).
Las figuras 2A y 2B representan la insercion de casete (s) de transgenes en el genoma del NDV 73T. La figura 2A muestra la insercion de un transgen en la union P-M. Se introdujo un sitio de restriccion Afel en nt 3148 en el plasmido subclon que contiene el fragmento Sacll-Pmll. ADNc que codifican el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos de granulocitos humano o de raton (GM-CSF) o interleucina 2 (IL-2). El casete del gen insertado contiene el extremo del gen (GE; 5’-TTAAGAAAAAA -3’), el nucleotido intergenico (T), la secuencia de inicio del gen (GS; 5’-ACGGGTAGA -3’) y el marco de lectura abierto (ORF) del transgen. Ademas, se insertaron diez nucleotidos (5’- cgccgccacc-3’) corriente arriba del sitio de inicio para introducir una secuencia Kozak. El fragmento Sacll-Pmll del plasmido resultante se barajo en el plasmido r73T y se nombro como p73T-P1. Adicionalmente, la figura 2A muestra la insercion de un transgen en la union HN-L entre el ORF de HN y la secuencia de la senal de terminacion de gen (GE) de HN, se introdujo un sitio de restriccion Afel en nt 8231 en el plasmido que contiene el fragmento Agel-Xbal. El casete del gen se genero por PCR usando un par de cebadores antisentido y de sentido de fosfato (Tabla 3) y se inserto en el sitio Afel. El fragmento Agl-Xbal del plasmido resultante se barajo en el plasmido p73T, produciendo p73T-HN1. El ADNc 73T de longitud completa (FL) que contiene el transgen en la union P-M o HN-L se designo como p73T-P1 o p73T-HN1, respectivamente. La figura 2B muestra la insercion de dos casetes de transcripcion en la union P-M. Se introdujo un sitio Afel al final del ORF de GM-CSF (nt 3619). El ORF de lL-2 se amplifico usando un par de cebadores antisentido y de sentido de fosfato que contenian las secuencias GE y GS y se inserto en el sitio Afel. El fragmento Sacll-Pmll del plasmido resultante, incluidos los casetes transcripcionales GM-CSF e lL-2, se intercambio de nuevo en el plasmido r73T, produciendo p73T-P2.
Las figuras 3A-3C muestran la recuperacion de la cepa 73T de NDV recombinante infecciosa (r73T) con FPCS modificado y representan la escision de la proteina F y la actividad de fusion in vitro. La figura 3A muestra como se clonaron n Dv 73T NP, P, L y ADNc antigenico (p73Tlento o p73T-S116) bajo el control del promotor y terminador de la polimerasa de ARN T7. Los cuatro plasmidos se cotransfectaron en una linea celular que expresa la ARN polimerasa. Los virus recuperados se designaron como r73T-lento o r73T-S116. El r73T-lento y el r73T-S116 se pasaron en celulas Vero con medios con y sin suplemento de tripsina. El crecimiento de r73T-lento depende de la tripsina, mientras que r73T-S116 puede crecer en un medio sin el suplemento de tripsina. Para evaluar la estabilidad genetica de FPCS en r73T-S116 y transgen, r73T-S116 con y sin hGM-CSF en la union P-M se pasaron adicionalmente por 10 pasajes en celulas Vero y fibrosarcoma humano HT1080 en MOl 0.01 en medio sin suplemento de tripsina. Las mutaciones (R113K y/o Q114M) en el FPCS aparecieron en el pasaje 7 y la mutacion S116R se detecto en los pasajes 9. En el pasaje 10, se secuenciaron F, HN y el transgen y no se encontraron mutaciones adicionales. Las figuras 3B y 3C muestran el efecto de la mutacion del sitio de escision de la protefna F (FPCS) sobre la fusion celular y la escision de la protefna F in vitro. Para la construccion del plasmido que coexpresa dos transgenes, GFP y NDV F o genes HN, los marcos de lectura abiertos de la protefna del NDV F o el gen HN se amplificaron por PCR y se clonaron en el plasmido pVitro2-neo-MCS (Invitrogen) bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV). Las celulas 293T se sembraron a 5 x105 celulas/pocillo en una placa de 6 pocillos para la transfeccion al dfa siguiente. La figura 3B representa celulas transfectadas con 2 gg de ADN plasmfdico de NDV F durante un dfa y recogidas en solucion reguladora de lisis de protefnas para analisis de transferencia de Western usando un antisuero policlonal especffico anti-NDV F. La protefna NDV F con el sitio de escision lentogenico y S116 no se escindieron, solo se detecto F0. Las protefnas F de R116 y S116-KM se escindieron parcialmente segun lo indicado por la aparicion de la banda de protefna F1. La figura 3C muestra las celulas que se cotransfectaron con un plasmido F diferente con el plasmido HN wt y que se examinaron para determinar la formacion de fusion con un microscopio fluorescente. La protefna F wt fue mas eficiente en la formacion de fusion
La figura 4 es una tabla que resume las caracterfsticas de los derivados de r73T-lento y r73T-S116. aTodos los virus contienen hGMCSF en la union P-M. bLos aminoacidos en el FPCS que son diferentes de FPCS-S116 estan subrayados. cFormacion de placa en celulas Vero sin tripsina en el revestimiento despues de 36 horas de incubacion y se visualiza con un aumento de x10. dTiempo de muerte medio en huevos (MDT). ePatogenicidad de NDV en pollos libres de patogenos de 1 dfa por el fndice de patogenicidad intracerebral (ICPI). El ensayo ICPI se realizo en National Veterinary Service Laboratories (NVSL) (Ames, Iowa). fEfecto de la citotoxicidad de los virus en celulas de fibrosarcoma humano HT1080 posteriores a la infeccion en multiplicidades de infeccion (MOI) de 0.01 a las 72 horas posteriores a la infeccion. El porcentaje relativo de celulas supervivientes se determina comparando cada muestra con celulas no tratadas que se consideraron 100% viables. Los datos presentados en la tabla son porcentajes relativos de celulas muertas. gEl virus crecio en celulas Vero posteriores a la infeccion con MOI de 0.01 y se cultivo en OPTI-MEM sin suplemento de tripsina durante 3-5 dfas a 37 °C. hVirus cultivados en huevos embrionados de pollo. Los huevos embrionados de 10-11 dfas se infectaron con 1,000 pfu de r73T. El lfquido amniotico se recogio despues de la incubacion a 37 °C, durante 72 horas. El tftulo de virus infeccioso se determino en celulas Vero mediante ensayo de placa.
Las figuras 5A y 5B representan estrategias para atenuar la virulencia del virus r73T-R116 en pollos. La figura 5A muestra la insercion de transgenes en la union P-M (1) y la union HN-L (2), y la extension de la region intergenica HN-L mediante la insercion de una secuencia no codificante (3). La insercion del casete de transgenes en la union P-M es la misma que se muestra en la figura 2A. El segundo casete de transgen contiene la secuencia de inicio del gen L (GS; 5’-ACGGGTAGA-3’), el marco de lectura abierto (ORF) del transgen, las secuencias de la region 3' no traducida del gen L (en cursiva) y la secuencia final del gen L (GE; 5’-TTAAGAAAAAA-3’). Las secuencias no codificantes usadas para extender la union HN-L se tomaron de paramixovirus tipo -1 (APMV-1), virus sincitial respiratorio (RSV) o secuencia aleatoria que no tiene identidad de secuencia u homologfa con secuencias conocidas. La secuencia de insercion puede estar en el intervalo de 60-318 nt. La insercion de un segundo transgen en HN-L permite que el virus exprese dos transgenes (por ejemplo, hGM-CSF y GFP). La figura 5B representa las secuencias que se insertaron en la union HN-L.
La figura 6A es una tabla que resume las caracterfsticas de los derivados de r73T-R116. aTodos los virus contienen hGM-CSF en la union P-M. bSecuencias insertadas en la union HN-L como se muestra en la figura 5B. cFormacion de placa en celulas Vero sin tripsina en el revestimiento despues de 36 horas de incubacion y se visualiza con un aumento de x10. dTiempo de muerte medio en huevos (MDT). ePatogenicidad del NDV en pollos libres de patogenos de 1 dfa con el fndice de patogenicidad intracerebral (ICPI). El ensayo ICPI se realizo en National Veterinary Service Laboratories (NVSL) (Ames, Iowa). fEfecto de la citotoxicidad de los virus en celulas de fibrosarcoma humano HT1080 posteriores a la infeccion en multiplicidades de infeccion (MOI) de 0.01 a las 72 horas posteriores a la infeccion. El porcentaje relativo de celulas supervivientes se determina comparando cada muestra con celulas no tratadas que se consideraron 100% viables. Los datos presentados en la tabla son porcentajes relativos de celulas muertas. gEl virus crecio en celulas Vero posteriores a la infeccion con MOI de 0.01 y se cultivo en OPTI-MEM sin suplemento de tripsina durante 3-5 dfas a 37 °C. hVirus cultivados en huevos embrionados de pollo. Los huevos embrionados de 10-11 dfas se infectaron con 1000 pfu de r73T. El lfquido amniotico se recogio despues de la incubacion a 37 °C, durante 72 horas. El tftulo infeccioso se determino en celulas Vero mediante ensayo de placa.
Las figuras 6B-6E son graficos que muestran la cinetica de crecimiento de NDV recombinante en celulas DF-1 y Vero. Se infectaron celulas DF-1 y Vero en placas de seis pocillos con cada virus indicado en una multiplicidad de infeccion (m.o.i.) de 5.0 (ciclo unico, Figuras 6B y 6C) o 0.001 (multiciclo, Figuras 6C y 6D). Los sobrenadantes de cultivo de celulas infectadas se recogieron a intervalos de 10 horas hasta 50 horas posteriores a la infeccion, y los tftulos de virus se determinaron mediante un ensayo en placa.
Las figuras 6F y 6G muestran la sfntesis de ARN y protefnas en las celulas DF-1. Las celulas DF-1 se infectaron con cada virus como se indica en un moi de 5.0, se incubaron durante 20 h, se extrajeron los ARN intracelulares totales para el analisis de transferencia Northern (Figura 6F) y se examino un segundo conjunto de celulas infectadas para la sfntesis de protefnas mediante transferencia Western (Figura 6G). Los ARN se separaron mediante electroforesis en un gel de agarosa formaldehfdo, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se hibridaron con sondas de ARN marcadas con biotina especificas para los genes HN, NP, P y L. Se uso una sonda de ARN positiva en el gen L para detectar ARN genomico viral. Las proteinas totales se separaron en SDS-PAGE y se transfirieron con suero anti-NP, F, HN y L. Las proteinas totales cargadas en el gel fueron detectadas por un anticuerpo especifico de actina. El NDV Rl16i recombinante con 198 nt de insercion entre la secuencia intergenica HN y L tuvo una sintesis global reducida de ARN y proteinas en las celulas DF-1.
Las figuras 6H y 6I representan la sintesis viral de ARN y proteinas en celulas Vero. La figura 6H muestra el analisis de transferencia Northern de la sintesis de ARN. Las celulas Vero se infectaron con los virus a m.o.i de 5.0, se incubaron durante 20 h, se extrajeron los ARN intracelulares totales. Los ARN se separaron por electroforesis en un gel de agarosa formaldehido, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se hibridaron con sondas de ARN marcadas con biotina especificas de los genes NP y L o un ARN del gen L de sentido positivo para detectar el ARN genomico. La figura 6I muestra el analisis de transferencia Western de la sintesis de proteinas virales en celulas Vero infectadas. Las proteinas totales se separaron en SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se transfirieron con suero anti-NP, F, HN y L. Las proteinas totales cargadas en el gel fueron detectadas por un anticuerpo especifico de actina. Los virus R116i con insercion de 198 nt tenian un ARN genomico reducido, pero aumentaron considerablemente el ARNm de NP en comparacion con S116 y NDV wt. El nivel de ARNm L era demasiado bajo para indicar la diferencia. Las proteinas corriente arriba del gen L tenian regulada la expresion, pero el nivel de proteina L se redujo en las celulas Vero.
Las figuras 6J y 6K muestran la comparacion de la sintesis de proteinas en celulas DF-1 y Vero infectadas con una baja multiplicidad de infeccion por analisis de transferencia Western. Las celulas DF-1 y Vero se infectaron con cada virus como se indica a m.o.i de 0.001, se incubaron durante 72 h y se recogieron en solucion reguladora de lisis de proteinas. Las proteinas totales se separaron en SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se transfirieron con suero anti-NP, F, HN y L. Las proteinas cargadas en el gel fueron detectadas por un anticuerpo contra la actina. El nivel de proteina L se redujo en ambas lineas celulares, sin embargo, las proteinas que se encuentran corriente arriba del gen L inhibida la expresion en las celulas DF-1, pero regulada la expresion en las celulas Vero.
Las figuras 6L muestran la sintesis de proteinas virales en celulas humanas infectadas en comparacion con las celulas DF-1. HT1080 humano, celulas Hela y celulas DF-1 se infectaron con cada virus como se indica en m.o.i de 5.0, se incubaron durante 20 h y se recogieron en solucion reguladora de lisis de proteinas. Las proteinas se separaron en SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se transfirieron con suero anti-HN y anti-L. La expresion de la proteina HN de R116i con 198nt de insercion entre la union HN y L aumenta en las celulas HT1080 y Hela, pero disminuye en las celulas DF-1. La proteina L disminuyo en las tres lineas celulares infectadas con R116i-198 o 198RSV.
La figura 7 son graficos que muestran la cinetica de crecimiento de los virus r73T en huevos de pollo embrionados. Para determinar las condiciones de crecimiento de los virus r73T, se realizaron estudios de cinetica de crecimiento en huevos. Los huevos embrionados de pollo se infectaron con 100, 1000, 10,000 o 100,000 PFU/huevo de los virus indicados y se incubaron durante 2, 3 o 4 dias (73T wt, arriba a la izquierda; R116, arriba a la derecha; R116i-318, centro a la izquierda; R116i-198 -RSV, centro a la derecha; R116i-198-aleatorio, abajo a la izquierda; S116-KM, abajo a la derecha). Se recogio el fluido alantoico y se determinaron los titulos viricos mediante fFa . La inoculacion de 100 FFU/huevo tuvo un titulo bajo en el dia 1, pero alcanzo el nivel maximo en el dia 2. En general, la mayoria de los virus alcanzaron titulos maximos de ~ 8 logs/mL en el dia 2, independientemente de la dosis de inoculacion usada. R116i-198 tiene el titulo mas bajo, la dosis de inoculo baja genero el mayor rendimiento en el dia 2, lo que indica que podria haber acumulacion de particulas defectuosas. La insercion de R116i-318-APMV tambien tuvo un titulo maximo mas bajo de ~7 logs. R116i-198-RSV alcanzo el titulo maximo de 7.5 logs. El S116 rederivado por la genetica inversa no tuvo reduccion en la produccion de virus en los huevos. Por lo tanto, entre los derivados de R116, el virus con insercion de RSV-198nt fue un candidato a virus oncolitico superior en terminos de propiedades de crecimiento en huevos.
La figura 8 son graficos que muestran la cinetica de crecimiento de los virus r73T en celulas Vero. Los virus tambien se evaluaron en el clon 51D11 de celulas Vero libre de suero, una linea celular patentada generada por Medlmmune. Todos los virus se replicaron de manera similar en ambas condiciones moi (0.001, arriba; 0.0001, abajo). La modificacion de 73T FPCS y la insercion intergenica en la union HN-L de R116 no afectaron el crecimiento del virus en las celulas Vero.
Las figuras 9A-9D muestran que los virus r73T se replican selectivamente en celulas tumorales y tienen citotoxicidad para celulas tumorales, en comparacion con celulas no neoplasicas. Los datos se obtuvieron posteriores a la infeccion con derivados de r73T a diferentes dosis que oscilaron entre 1 y 100,000 PFU durante 72 horas. La figura 9A es un grafico que muestra la evaluacion de rT3T y sus derivados para la muerte de celulas en el fibrosarcoma humano HT1080 en relacion con las celulas de control no tratadas. En las celulas cancerosas HT1080, el virus con FPCS lentogenico tuvo la menor muerte, el S116 en el FPCS fue intermedio y los virus con R116 en el FPCS tuvieron una muerte celular tan eficiente como el virus r73T wt. La figura 9B es un grafico que muestra la evaluacion de rT3T y sus derivados para la muerte de celulas en celulas CCD1122Sk de fibroblastos de piel humana normal en relacion con celulas de control no tratadas. En las celulas CCD1122SK normales, todos los virus no mataron a las celulas tan eficientemente como las celulas cancerosas, con una reduccion de la eficiencia de muerte de ~ 100 veces. Independientemente de las secuencias de FPCS, todos los virus tuvieron una muerte similar en las celulas normales, probablemente debido a un solo ciclo de replicacion (sin propagacion del virus). La figura 9C es una tabla que muestra la eficiencia de muerte de celulas en el cancer y en las celulas normales, expresada como una concentracion eficaz del 50% (EC50) interpolada desde la curva de respuesta de dosis usando Prism 6.0. El derivado de R116 tenia un valor de EC50 similar a r73T wt con un EC50 de 10 PFU, lo que indica que la modificacion de FPCS no afecto la replicacion del virus en celulas cancerosas y la eficiencia de muerte de celulas. La figura 9D es un grafico que muestra la replicacion de los virus en las celulas HT1080 y CCD1122SK en MOI 0.01 en el dia 3 posteriores a la infeccion. Todos los virus se replicaron preferentemente en las celulas cancerosas que en las celulas normales, con una diferencia de aproximadamente 1.5-2.0 logs.
Las figuras 10A y 10B son graficos que muestran que los derivados de r73T son efectivos en la regresion del tumor en la administracion local y sistemica. Para evaluar la actividad oncolitica in vivo, se establecio un modelo de xenoinjerto HT1080 inyectando celulas HT1080 a una concentracion de 5 x 106 celulas/0.1 ml por via subcutanea en ratones desnudos atimicos Balb/C de 5 a 6 semanas. La figura 10A es un grafico que muestra el efecto de R116i-318-hGM-CSF administrado por via intratumoral (i.t.) o intravenosa (i.v.). Los datos muestran que los derivados de R116i-318-hGM-CSF tenian actividad antitumoral in vivo cuando se administraron ya sea sistemica o intratumoralmente a ratones inmunodeficientes que portan xenoinjertos de tumores humanos. La tasa de crecimiento del tumor se comparo entre el tratamiento y los grupos de control. Las regresiones tumorales inducidas por las dos vias de administracion fueron ambas significativamente diferentes del grupo de control. Los ratones se asignaron al azar en grupos (n = 10) como se indico cuando el volumen del tumor alcanzo aproximadamente 65 mm3. Los ratones recibieron una dosis unica de PBS o 2 x 107 Pfu de r73T-hGM-CSF-R116i-198 administrada por via intratumoral (IT) o 1 x 108 PFU administrados por via intravenosa (IV) mediante inyeccion en la vena de la cola. * P <0.05, prueba T de Student no emparejada. La figura 10B es un grafico que compara las actividades oncoliticas de los derivados de r73T en los xenoinjertos HT1080 mediante inyeccion IV de 1 x 108 PFU. Dos dosis de derivados de r73T fueron capaces de inducir una regresion significativa del tumor con diversos grados de efectividad. r73T-lento fue el menos efectivo en la regresion del tumor, mientras que r73T wt fue el mas efectivo en la regresion del tumor. r73T-lento tuvo un efecto similar al del virus S116, aunque el virus S116 tiene una EC5010 veces menor en la muerte de celulas in vitro (vease la figura 9A). r73T-R116i-318 fue tan potente como 73T wt en la inhibicion del crecimiento tumoral hasta 9 dias despues de la 2a dosis (dia 19 despues de la implantacion del tumor), el tumor volvio a crecer en ratones tratados con R116i pero no en el grupo tratado con 73T wt. Los ratones se asignaron al azar en grupos (n = 7) cuando el volumen del tumor alcanzo aproximadamente 180 mm3. Los ratones recibieron ya sea PBS o 1 x 108PFU de r73T-hGM-CSF-lento (lento) o r73T-hGM-CSF-S116K113M114 (S116 KM) o r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N (R116i) o r73T-hGM-CSF (r73T wt) administrado por IV. El tamano del tumor se midio cada 3-4 dias. * P <0.05, prueba T de Student no emparejada. Los datos muestran que los derivados de r73T tenian actividad antitumoral in vivo cuando se administraron sistemica o intratumoralmente a ratones inmunodeficientes que portan xenoinjertos de tumores humanos. La escision eficaz de la proteina F es importante para la replicacion del virus in vitro e in vivo. Los virus con el R116 en el FPCS fueron mas potentes en la muerte de celulas in vitro e in vivo.
Las figuras 11A-G representan la biodistribucion tisular de los derivados de r73T despues de la administracion intravenosa y el efecto del GM-CSF de raton frente al humano en la inhibicion del crecimiento tumoral. Para determinar si el virus NDV oncolitico se replica selectivamente en los tejidos tumorales y la eliminacion viral, se determino la distribucion del virus en diferentes organos. Ratones desnudos atimicos que portaban tumores HT1080 subcutaneos con un tamano de ~ 250 mm3 se trataron con R116i (r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N) a una dosis de 1 x 108 PFU por via intravenosa y se sacrificaron el dia 1,4 o 8 (n = 3 por punto de tiempo). Se recogieron suero, pulmones, bazo, ovarios y tumor y se cuantifico la presencia de virus. La replicacion viral en el tumor y los organos se evaluo en los dias 1, 4 y 8 posteriores a la infeccion. La figura 11A es un grafico que representa la cuantificacion del virus en tejidos mediante el ensayo de placa en celulas Vero. El virus en los organos solo se detecto el dia 1 (el virus no se detecto en el ovario en todos los puntos de tiempo, no se muestran los datos) y la carga de virus en los tejidos tumorales fue de ~ 100 veces mayor que en los pulmones y bazos. La presencia del virus en el tumor persistio durante al menos 8 dias, lo que indica que el virus se replico selectivamente en los tejidos tumorales. La figura 11B es un grafico que representa la cuantificacion de GM-CSF expresado por virus en tejidos mediante el ensayo ELISA de la expresion del transgen de hGMCSF. De acuerdo con los datos de replicacion viral obtenidos mediante el analisis de placa, el nivel de hGMCSF fue el mas alto y duro mas de 8 dias en el tejido tumoral. Estos datos demostraron que el virus NDV se replico de manera eficaz en el tejido tumoral y que el transgen se administro de manera eficaz al tejido tumoral local.
La figura 11C representa graficos que muestran el efecto de la expresion de mGM-CSF en la inhibicion del crecimiento tumoral en el modelo de tumor de raton con xenoinjerto HT1080. Ratones desnudos atimicos de 5-6 semanas en grupos de siete se implantaron subcutaneamente (s.c.) con 5 x 106 celulas HT1080 en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 110 mm3 (dia 6), el tumor se inyecto con una dosis unica de 1 x 108 pfu rNDV, R116i-198RSV con mGM-CSF o hGM-CSF. El tamano del tumor se midio cada 3-4 dias. R116i-198RSV con mGM-CSF fue menos potente en la inhibicion del crecimiento tumoral que el transgen hGMCSF. Sin embargo, no se observo diferencia en la inhibicion del crecimiento tumoral para S116 con hGM-CSF o mGM-CSF.
La figura 11D muestra graficas que muestran el efecto de mGM-CSF en la eliminacion del virus de los tumores en el modelo de tumor de raton con xenoinjerto HT1080. Los ratones atfmicos desnudos en grupos de tres se implantaron por vfa subcutanea (s.c.) con 5 x l06 celulas HT1080 en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 180 mm3 (dfa 10), los ratones se trataron por vfa intravenosa con una dosis de 1 x 108 pfu de R116i-198RSV o S116KM. Los tumores se recogieron el dfa 4 o 7 y los tftulos vfricos en el tejido tumoral se determinaron mediante un ensayo de placa. Tanto R116i-198RSV como S116KM con ya sea mGM-CSF o hGM-CSF tuvieron un tftulo comparable en el dfa 4. En el dfa 7, R116i-198RSV con mGM-CSF se redujo considerablemente en comparacion con R116i-198RSV con hGM-CSF. En comparacion, los tftulos de S116 mGM-CSF y hGM-CSF fueron comparables.
La figura 11E muestra un grafico que muestra el efecto de la infeccion por R116i-198RSV o S116KM en la infiltracion de celulas inmunes en tumores en el modelo de tumor de raton con xenoinjerto HT1080. Los ratones atfmicos desnudos en grupos de tres se implantaron por vfa subcutanea (s.c.) con 5 x 106 celulas HT1080 en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 180 mm3 (dfa 10), los ratones se trataron por vfa intravenosa con una dosis de 1 x 108 pfu de virus segun lo indicado. Los tumores se recolectaron el dfa 4 y los tejidos se procesaron para determinar la tincion de neutrofilos, celulas NK y macrofagos mediante analisis FACS. R: r 116i-198-RSV, S: S116-KM. R116i-198RSV con mGM-CSF tuvo mas infiltracion de celulas inmunes.
La figura 11F muestra una tabla que muestra que las citoquinas y las qimioquinas tenfan regulada la expresion en el modelo de tumor de raton con xenoinjerto HT1080. Los ratones atfmicos desnudos en grupos de tres se implantaron por vfa subcutanea (s.c.) con 5 x 106 celulas HT1080 en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 180 mm3 (dfa 10), los ratones se trataron por vfa intravenosa con una dosis de 1 x 108 pfu de R116i-198RSV o S116KM con hGM-CSF o mGM-CSF. Los tumores se recolectaron el dfa 4 y los tejidos se procesaron para determinar los niveles de citoquinas y quimioquinas mediante analisis Luminex. La infeccion por virus indujo la produccion de citoquinas y quimioquinas en los tejidos tumorales locales, sus niveles variaron segun la columna vertebral del virus y el GM-CSF humano o de raton.
La figura 11G representa un grafico que muestra que R116i-198RSV-hGM-CSF y R116i-318APMV-hGM-CSF fueron comparables en la inhibicion del crecimiento tumoral en el modelo de tumor de raton con xenoinjerto HT1080. Ratones desnudos atfmicos en grupos de siete se implantaron subcutaneamente (s.c.) con 5 x 106 celulas HT1080 en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 110 mm3 (dfa 6), se inyecto por vfa intratumoral una dosis unica de virus a 1 x 108 pfu. El tamano del tumor se midio cada 3-4 dfas y se grafico. La longitud de insercion de 198 y 318nt no afecto la actividad oncolftica de R116i.
Las figuras 12A y la figura 12B representan la construccion del ADNc del antigenoma de 73T que contiene los genes F y/o HN quimericos y su caracterizacion, y la figura 12C compara la funcion de la actividad del complejo de la ARN polimerasa. Las glucoprotefnas de la superficie viral son antfgenos importantes para la inmunogenicidad y la virulencia en los pollos. Los genes F y/o HN de NDV fueron reemplazados por los correspondientes dominios extracelulares (ecto) de otros paramixovirus que no son virulentos en pollos individualmente o en combinacion. El virus de la parainfluenza 5 (PIV 5) es un paramixovirus canino y no causa enfermedades en humanos, y se ha demostrado que el paramixovirus de paloma tipo 1 (PPMV-1) no es virulento en los pollos. La figura 12A muestra que los ectodominios de las glucoprotefnas F y/o HN de los ADNc antigenomicos de NDV 73T de longitud completa se reemplazaron con los de PPMV-1 y/o PIV5. Las secuencias NDV, PIV5 y PPMV-1 se indican con recuadros de colores como azul, purpura o verde, respectivamente. Se indican las longitudes de aminoacidos de protefnas individuales o dominios de protefnas. La figura 12B es una tabla que muestra la caracterizacion de derivados 73T que contienen genes F y/o HN quimericos. La formacion de placa en Vero, la muerte de celulas HT1080 relativa y MDT se realizaron como se describio anteriormente. Los virus quimericos, excepto para PVI-5 F-HN, se recuperaron y crecieron en las celulas en ausencia de tripsina exogena. Los tres virus formaron placas de buen tamano y mostraron una propagacion eficiente de celula a celula. Los virus quimericos PPMV-1 F-HN o F tuvieron un valor de MDT de 79 y 84 h, respectivamente, lo que indica una posible virulencia en los pollos. El virus quimerico PPMI-1 destruyo las celulas HT1080 de manera eficiente a niveles de 71 y 61%. La quimera PIV5-F no crecio en los huevos y no fue virulenta en los pollos, pero mato las celulas HT1080 al 47%. La reactividad cruzada del suero entre las quimeras NDV y PPMV-1 o PIV5 se examino mediante un ensayo de neutralizacion usando el suero recogido de ratones que se administraron por vfa intravenosa con 2 dosis de 1 x 108 PFU de r73T-R116i. El virus r73T puede ser neutralizado por el suero infectado con NDV (tftulo 960) mientras que las quimeras PPMV-1 y PIV5 no se neutralizaron (tftulo < 4), lo que confirma que no hay reactividad cruzada entre NDV y PPMV-1 o PIV5. Los virus quimericos con antigenicidad distinta podrfan ser para estimular los virus oncolfticos en pacientes para los cuales se han desarrollado respuestas inmunes anti-NDV durante el tratamiento previo de NDV.
La figura 12C muestra la comparacion de la actividad de la ARN polimerasa del NDV con otros paramixovirus mediante un ensayo minigenoma. Las celulas que expresan T7 se transfectaron con los tres plasmidos que expresan las protefnas NP, P, L del NDV y el plasmido que codifica el ADNc antiminogenomico del NDV que codifica el gen GFP usando Lipofectamine 2000, o los plasmidos que codifican los genes N, P, L del virus del sarampion (MV) o virus sincitial respiratorio (RSV) y el respectivo plasmido de ADNc anti-minigenoma de RSV o MV GFP. Dos o tres dfas despues de la transfeccion, la replicacion del minigenoma como se indica mediante la expresion de proteinas GFP se examino bajo un microscopio fluorescente. El NDV tuvo la actividad de polimerasa mas fuerte en comparacion con el virus del sarampion y el RSV.
Las figuras 13A y B muestran la sensibilidad de la linea celular del cancer a las variantes de rNDV. Las lineas celulares de cancer de diversos tejidos de origen se infectaron con NDV S116 o NDV R116i a una MOI de 0.1 y la viabilidad celular se evaluo 72 horas posteriores a la infeccion usando Cell Titre Glo. La sensibilidad al NDV se define como una muerte de celulas superior al 30% a las 72 horas despues a la infeccion. La figura 13A representa un grafico del porcentaje de lineas celulares de cancer humano sensibles al NDV en un minimo de 16 indicaciones generales. Los numeros de lineas celulares dentro de cada grupo se indican numericamente y en la tabla. La figura 13B representa un grafico de la sensibilidad de 22 lineas celulares de cancer a variantes de NDV. El % de muerte celular se determina como un porcentaje de celulas de control no tratadas.
La figura 14 son graficos que muestran la permisividad de las lineas celulares de cancer a recNDVGM-CSF. La muerte celular de R116i-GM-CSF en lineas celulares tumorales representativas se presenta en la figura 14. El % maximo de muerte se determino 3 dias posteriores a la infeccion de lineas celulares tumorales con respecto al control no infectado a MOI de 0.1. Aunque ciertas lineas celulares se derivaron de los mismos tipos de tumores, tal como los canceres de vejiga, gastricos, prostata, melanoma, mama, ovario, pancreas y pulmon, mostraron una sensibilidad diferente a la muerte del virus. Los numeros de lineas celulares de cada indicacion de tumor que se pueden eliminar por R116i-GM-CSF a una tasa de > 50% se resumen en la tabla 1.
Las figuras 15A-F son graficas que muestran que los derivados del NDV inhiben el crecimiento del tumor en diferentes modelos de cancer de raton.
Las figuras 15A y 15B son graficos que muestran que las cepas recNDVGM-CSF inhiben el crecimiento tumoral en el modelo de melanoma de raton singenico (B16F10 Ap3). 73T-R116i-hGM-CSF (Figura 15A a la izquierda) y R116imGM-CSF (Figura 15A a la derecha) fueron evaluados por su efecto oncolitico en el modelo de melanoma B16 en un estudio piloto. Como se evaluo la tolerabilidad del virus en el raton B16, el tamano del grupo fue pequeno (n = 3). Cada virus se administro por via intravenosa (i.v) a 2x107 pfu dos veces en los dias 11 y 14; por via intraperitoneal (i.p.) a 2x107 pfu dos veces en los dias 11 y 14; o por via intratumoral (i.t.) una vez a 1.1x107 pfu el dia 11. Los grupos tratados con R116-hGM-SCF o mGM-SCF por las tres vias de administracion tuvieron una tasa de crecimiento tumoral mas lenta en comparacion con el grupo sin tratar. Las tasas de inhibicion del tumor fueron estadisticamente significativas en el grupo control.
La figura 15B muestra un estudio de eficacia en el modelo de melanoma murino singenico B16F10 con administracion intratumoral de 1x 108 pfu de variantes de S116 NDV. La inhibicion del crecimiento tumoral se muestra en el panel izquierdo y las mediciones individuales de los animales se muestran en el panel central y el grafico de supervivencia se muestra a la derecha.
La figura 15C muestra que el NDV tiene una potente actividad antitumoral en el modelo de tumor colorrectal CT26 de raton inmunocompetente. En particular, la figura 15C proporciona un estudio de eficacia en el modelo colorrectal murino singenico CT26 con administracion intratumoral de 1x 108 pfu de la variante de R116 NDV que codifica GM-CSF humano. La inhibicion del crecimiento tumoral se muestra en el panel derecho y el analisis de IHC del tumor restante se muestra en el lado derecho con tincion de H&E y NDV. Se indican areas necroticas, evidencia de sincitios multinucleados y areas viables de tumores.
Las figuras 15D-F representan la inhibicion del crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto ovarico. Los ratones atimicos desnudos se implantaron subcutaneamente (s.c.) con celulas Ovcar4 en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron un volumen de 100 mm3, los ratones se asignaron al azar a grupos de tratamiento. Los tumores establecidos se inyectaron una vez a la semana con 2.5x 107 pfu rNDV, R116i-318 con mGM-CSF o hGM-CSF. Se muestran las curvas de crecimiento tumoral (Figura 15D) y los analisis histologicos de los tumores (Figura 15E y Figura 15F).
La figura 16 es una tabla que resume las caracteristicas de las construcciones de NDV. Formacion de placa en celulas Vero sin tripsina en el revestimiento despues de 36 horas de incubacion y visualizada con un aumento de x10. Efecto de la citotoxicidad de los virus en celulas de fibrosarcoma humano HT1080 posteriores a la infeccion en multiplicidades de infeccion (MOI) de 0.01 a las 72 horas posteriores a la infeccion. El porcentaje relativo de celulas supervivientes se determina comparando cada muestra con celulas no tratadas que se consideraron 100% viables. Los datos presentados en la tabla son porcentajes relativos de celulas muertas. Patogenicidad de NDV en pollos libres de patogenos de 1 dia por el indice de patogenicidad intracerebral (ICPI). El ensayo ICPI se realizo en National Veterinary Service Laboratories (NVSL) (Ames, Iowa).
La figura 17 es un grafico que muestra que el NDV producido a partir de huevos y lineas celulares humanas presento una sensibilidad diferente para complementar la inactivacion mediada. El suero humano con actividad de complemento (C’) confirmada (Sigma, St. Louis, MO) se diluyo en serie con PBS y se incubo con 100 pfu de NDV durante 1 hora a 37 °C antes de infectar las celulas Vero para el ensayo de placa. Tras la incubacion a 37 °C, durante 6 dias, las placas se visualizaron mediante tincion con cristal violeta y se puntuaron. El virus cultivado en huevos de pollo embrionados se desactivo principalmente con suero diluido de 1:10 a 1:40. El virus crecido 293 fue mas resistente a C’ que el virus cultivado en huevos, se mantuvo aproximadamente el 40% de la infectividad a una concentracion serica de 1:40. Sin embargo, el virus crecido en Hela fue mas resistente a la inactivacion viral mediada por C’. Aproximadamente el 90% del virus vivo fue infeccioso a una concentracion serica de 1:40.
Las figuras 18A y 18B son transferencias de Western que muestran comparaciones de los niveles de proteina RCA en celulas 293 y Hela y en virus producidos a partir de estas dos lineas celulares. Para la figura 18A, una cantidad igual de celulas 293 y Hela S3 se cargaron en la SDS-PAGE para transferencia de Western. Las celulas Hela contenian niveles mas altos de proteinas hCD46, hCD55 y hCD59 que las celulas 293. La figura 18B muestra una transferencia Western que se realizo para examinar las cantidades de proteina en el virus de las celulas 293 o Hela infectadas. Las celulas no infectadas (simulacros) se sirvieron como controles. Las tres moleculas de CD se detectaron en virus de las celulas Hela infectadas a niveles mas altos que los de las celulas 293.
La figura 19 muestra la evaluacion de las proteinas reguladoras de C unidas a membrana (RCA) en la inactivacion viral mediada por C’. El ADNc que codifica hCD55, hCD59 y hCD46 fue sintetizado por Origene (Rockville, MD) o Genscript (Piscataway, NJ). Cada casete genico se inserto en la region intergenica P-N del ADNc antigenomico del NDV y los virus recombinantes se generaron mediante genetica inversa. Los virus recombinantes se amplificaron en huevos y se purificaron con un gradiente de sacarosa del 15-60% y la banda viral se sedimento mediante ultracentrifugacion. La expresion de cada proteina RCA por NDV recombinante se confirmo mediante transferencia de Western.
La figura 20 es una grafica que muestra que CD55 es una proteina RCA importante para prevenir la inactivacion de NDV por C’. El NDV con hCD46, hCD55 o hCD59 se amplifico en huevos, se purifico por gradiente de sacarosa, se incubo con plasma humano diluido de 1:10 a 1:40 durante 1 hora y se examino la infectividad viral mediante ensayo de placa en celulas Vero. El NDV con hCD55 producido en huevos tuvo una resistencia similar a la de C' en comparacion con el NDV producido en celulas Hela, aproximadamente un 65% de virus viables a una concentracion plasmatica de 1:20 y -80% de virus viables a una concentracion plasmatica de 1:40. El hCD46 parecio mejorar ligeramente o marginalmente la resistencia viral a la inactivacion mediada por C’, aproximadamente un 20% mas de virus viables cuando se incuba con plasma humano diluido 1:40 en comparacion con el control del NDV. No se detecto ninguna diferencia con una dilucion mas baja del plasma.
Descripcion detallada
La presente divulgacion presenta composiciones que comprenden un virus de la enfermedad de Newcastle atenuado y metodos para usar ese virus para el tratamiento de la neoplasia.
La presente divulgacion se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de un NDV oncolitico con una virulencia reducida en pollos. Como se describe con mas detalle a continuacion, la cepa NDV 73T se derivo de NDV MK-107, que es una vacuna comercial para aves (mesogenica) comercializada por primera vez en 1948. La cepa NDV MK-107 se mantuvo a traves de 73 pasajes en celulas de tumor de ascitis de Ehrlich (Cassel et al., Cancer. 1965 Jul; 18:863-8). NDV MK-107 se uso en una serie de estudios clinicos de Ph I y Ph II en la decada de 1970. NDV MK-107 tambien se uso en la decada de 1980 como un tratamiento inmunoterapeutico para tratar pacientes con melanoma en etapa tardia (Cassel et al., Cancer. 19831 ;52:856-860; Murray et al., Cancer. 1977. 40:680-686).
Para generar un NDV oncolitico con virulencia en el pollo reducida, la cepa NDV 73T recombinante incluye ciertas modificaciones geneticas. En particular, se altero la secuencia de escision de la proteina F y se aumento la longitud de la secuencia intergenica HN-L. Ventajosamente, el virus modificado se puede usar para expresar un(os) transgen (es) de interes. Tambien se describe en este documento, cuando la cepa NDV 73T incluye un transgen que codifica un polipeptido que mejora las propiedades oncoliticas de NDV recombinante. Tambien se describe en este documento, cuando la cepa NDV 73T incluye un transgen que codifica un biomarcador que proporciona una lectura util para controlar la replicacion del virus. Si se desea, la cepa NDV 73T se puede modificar para incorporar informacion genetica adicional que interrumpa la polaridad transcripcional normal del genoma estandar y se espera que reduzca aun mas la virulencia viral en pollos. De acuerdo con lo anterior, la presente divulgacion proporciona un virus de la enfermedad de Newcastle recombinante (NDV) generado mediante el uso de genetica inversa para reducir su patogenesis en pollos mientras mantiene su capacidad selectiva de muerte de celulas cancerosas y los metodos de produccion de dicho virus. La presente divulgacion tambien proporciona la construccion y el uso de NDV como un vector viral para administrar y expresar productos geneticos heterologos para un tratamiento mejorado del cancer. Los transgenes que codifican agentes terapeuticos de ejemplo que pueden ser administrados por NDV se describen a continuacion en este documento. En los ejemplos de trabajo descritos a continuacion en este documento, las construcciones virales de NDV nuevas que expresan el factor estimulante de colonias de macrofagos de granulocitos (GM-CSF) mataron selectivamente las celulas cancerosas, pero no mataron las celulas normales. Este efecto selectivo de muerte de celulas cancerosas se observo en una serie de lineas celulares de cancer, asi como in vivo cuando se probo en el modelo de tumor xerograft HT1080. La eficacia y selectividad del virus de la enfermedad de Newcastle atenuado recombinante (NDV) tambien se demostro en un modelo de melanoma en el que se observo regresion del tumor. En resumen, la presente divulgacion proporciona la insercion de un(os) transgen (es) especifico (s) en un vector NDV atenuado recombinante y la expresion eficaz de la proteina codificada en un entorno tumoral.
Virus de la enfermedad de Newcastle
El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es un virus envuelto que contiene un genoma de ARN de sentido negativo lineal, monocatenario, no segmentado. El genoma de NDV monocatenario de sentido negativo codifica una ARN polimerasa dirigida por ARN, una proteina de fusion (F), una proteina hemaglutinina-neuraminidasa (HN), una proteina de matriz, una fosfoproteina y una nucleoproteina. El ARN genomico contiene genes en el siguiente orden: 3'-NP-P-M-F-HN-L.
La organizacion del genoma de ARN de NDV se describe con mayor detalle en este documento a continuacion. El ARN genomico tambien contiene una secuencia lider en el extremo 3'.
Los elementos estructurales del virion incluyen la envoltura del virus que es una bicapa lipidica derivada de la membrana plasmatica celular. La glucoproteina, hemaglutinina-neuraminidasa (HN), sobresale de la envoltura y permite que el virus contenga actividades tanto de hemaglutinina como de neuraminidasa. La glucoproteina de fusion (F), que es una proteina de membrana integral, se produce primero como un precursor inactivo y luego se escinde despues de la traduccion para producir dos polipeptidos unidos por disulfuro. La proteina F activa participa en la penetracion de NDV en las celulas huesped al facilitar la fusion de la envoltura viral con la membrana plasmatica de la celula huesped. La proteina de la matriz (M) esta implicada con el ensamblaje viral e interactua tanto con la membrana viral asi como con las proteinas de la nucleocapsida.
La subunidad de la proteina principal de la nucleocapsida es la proteina de la nucleocapsida (NP) que confiere simetria helicoidal a la capside. En asociacion con la nucleocapsida estan las proteinas P y L. Se cree que la fosfoproteina (P), que esta sujeta a la fosforilacion, desempena un papel regulador en la transcripcion, y tambien puede estar implicada en la metilacion, la fosforilacion y la poliadenilacion. El gen L, que codifica una ARN polimerasa dependiente de ARN, se requiere para la sintesis de ARN viral junto con la proteina P. La proteina L, que ocupa casi la mitad de la capacidad de codificacion del genoma viral, es la mas grande de las proteinas virales y desempena un papel importante tanto en la transcripcion como en la replicacion.
La replicacion de todos los virus de ARN de cadena negativa, incluido el NDV, se complica por la ausencia de maquinaria celular requerida para replicar el ARN. Adicionalmente, el genoma de la cadena negativa no se puede traducir directamente a la proteina, pero primero se debe transcribir en una copia de la cadena positiva (ARNm). Por lo tanto, tras la entrada en una celula huesped, el ARN genomico solo no puede sintetizar la ARN polimerasa dependiente de ARN requerida. Las proteinas L, P y NP deben ingresar a la celula junto con el genoma en el momento de la infeccion.
Sin estar ligado a la teoria, se plantea la hipotesis de que la mayoria o la totalidad de las proteinas virales que transcriben el ARNm de NDV tambien llevan a cabo la replicacion. El mecanismo que regula los usos alternativos (esto es, la transcripcion o la replicacion) del mismo complemento de proteinas no se ha identificado claramente. Directamente despues de la penetracion del virus, la transcripcion es iniciada por la proteina L usando el ARN de sentido negativo en la nucleocapsida como plantilla. La sintesis de ARN viral se regula de manera tal que produce ARNm monocistronicos durante la transcripcion. Despues de la transcripcion, la replicacion del genoma del virus es el segundo evento que ocurre posteriores a la infeccion de una celula por virus de ARN de cadena negativa. Al igual que con otros virus de ARN de cadena negativa, la replicacion del genoma viral del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) esta mediada por proteinas especificas del virus. Los primeros productos de la sintesis de ARN replicativo son copias complementarias (esto es, polaridad positiva) de ARN del genoma de NDV (ARNc). Estas copias de cadena positiva (antigenomas) difieren de los transcritos de ARNm de cadena positiva en la estructura de sus extremos. A diferencia de los transcritos de ARNm, los ARNc antigenomicos no estan limitados y metilados en los extremos 5', y no estan truncados y poliadenilados en los extremos 3'. Los ARNc son coterminales con sus plantillas de cadena negativa y contienen toda la informacion genetica en cada segmento de ARN genomico en forma complementaria. Los ARNc sirven como plantillas para la sintesis de genomas virales de cadena negativa de NDV (ARNv).
Tanto los genomas de cadena negativa de NDV (ARNv) como los antigenomas (ARNc) estan encapsidados por proteinas de nucleocapsida; Las unicas especies de ARN no encapsidadas son los ARNm de virus. Para el NDV, el citoplasma es el sitio de la replicacion del ARN del virus, al igual que el sitio para la transcripcion. El ensamblaje de los componentes virales probablemente tenga lugar en la membrana plasmatica de la celula huesped. Luego el virus maduro es liberado de la celula por germinacion.
Virus oncoliticos
Se sabe que los virus ejercen efectos oncoliticos sobre celulas tumorales y se ha informado el uso de virus oncoliticos como agentes terapeuticos. Se han realizado algunos esfuerzos para usar virus no humanos que presentan una patogenicidad media a alta para sus huespedes naturales en el tratamiento de pacientes con cancer.
La presente divulgacion proporciona metodos para inducir la regresion de tumores en sujetos humanos, los metodos usan una cepa mesogenica modificada del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) con un sitio modificado de escision de la proteina F, que no es patogeno para las aves de corral (lentogenico), pero presenta propiedades oncoliticas. Los metodos descritos proporcionan medios seguros, eficaces y fiables para inducir la regresion de un tumor en un individuo que lo necesite. Estos metodos superan los inconvenientes del uso de cepas patogenas de virus para la terapia humana.
Las presentes descripciones tambien proporcionan un metodo para inducir la regresion de un tumor en un sujeto, el metodo comprende la etapa de administrar al sujeto una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una cepa oncolitica lentogenica de NDV. Tambien se describe en este documento, cuando la cepa oncolitica lentogenica de NDV es NDV r73T-R116.
Los virus oncoliticos son capaces de ejercer un efecto citotoxico o letal in vitro e in vivo sobre celulas tumorales con poco o ningun efecto sobre las celulas normales. El termino "actividad oncolitica" se refiere a la actividad citotoxica o letal de un virus que se dirige a las celulas tumorales. Sin desear estar unido a cualquier mecanismo de accion,
la actividad oncolitica ejercida por una cepa lentogenica de NDV (por ejemplo, r73T-R116), probablemente se deba principalmente a la apoptosis celular y, en menor medida, a la lisis de la membrana plasmatica, esta ultima se acompana de la liberacion de la progenie viable en el medio celular que posteriormente infecta las celulas adyacentes. Sin desear estar ligado a una teoria particular, se cree que el NDV tiene una actividad citolitica directa sobre las celulas cancerosas. Tambien se cree que el NDV es capaz de diferenciar especificamente las celulas cancerosas de las celulas normales y sanas. Los resultados han indicado que varios oncogenes (H-ras, N-ras, y N-myc) que se sabe que confieren un comportamiento maligno a las celulas cancerosas, aumentan la susceptibilidad de las celulas a la muerte por el NDV. Vease Lorence, R. M., Reichard, K. W., Cascino, C. J. et al. (1992) Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 33, 398; Reichard, K. W., Lorence, R. M., Cascino, C. J., et al. (1992) Surg. Forum, 43, 603­ 606. Ademas, se ha observado que el tratamiento de las celulas con acido retinoico (vitamina A) tambien mejora la lisis de las celulas cancerosas por el NDV. Reichard, K. W., Lorence, R. M., Katubig, B. B., et al. (1993) J. Pediatr. Surg., 28, 1221.
Los efectos citotoxicos en condiciones in vitro o in vivo se pueden detectar por diversos medios conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante la inhibicion de la proliferacion celular, detectando el tamano del tumor usando la exploracion con MRI realzada con gadolinio, mediante la radiomarcacion de un tumor, y similares.
Para estudios clinicos, es deseable obtener un virus clonal para asegurar la homogeneidad del virus. El virus clonal se puede producir segun cualquier metodo disponible para el experto en el arte. Por ejemplo, el virus clonal se puede producir limitando la dilucion o mediante la purificacion de la placa.
Cultivo de NDV
El virus descrito en este documento se puede preparar mediante una variedad de metodos. Por ejemplo, el NDV se puede preparar en huevos de pollo fertilizados de 8 a 10 dias (obtenidos de SPAFAS, Inc., Roanoke, 111.). Los metodos para aislar el virus son conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, por Weiss, S. R. & Bratt, M. A. (1974) J. Virol, 13, 1220-1230. Este metodo se describe con mas detalle en el Ejemplo # 1 a continuacion. Usando este metodo de aislamiento, se puede obtener NDV que tiene es una pureza aproximada del 90-95%.
Como alternativa, el virus se puede preparar en un cultivo celular in vitro. Preferiblemente, el cultivo celular comprende celulas de mamifero, y mas preferiblemente, las celulas se pueden usar para la fabricacion de virus tales como celulas Vero. Los virus seran purificados por cromatografia u otros metodos apropiados. Las celulas pueden ser dependientes del anclaje o independientes del anclaje.
Las tecnicas de cultivo celular que se pueden emplear en la preparacion de virus son conocidas en la tecnica y pueden incluir el uso de matraces de cultivo estacionarios con grandes areas de superficie o matraces de tipo cilindro. Preferiblemente, el tipo de sistema de cultivo seleccionado puede soportar un numero relativamente grande de celulas. Para producir una gran cantidad de virus, se implementara un procedimiento de biorreactor mientras que las celulas se cultivan en perlas de microportador para la infeccion y produccion del virus.
Los medios de cultivo celular que se pueden emplear en la produccion de virus son conocidos para los expertos en el arte. El medio por lo general incluye una fuente de nutrientes, antibiotico (s) y albumina o una fuente de suero que contiene factor (es) de crecimiento. Esta dentro de la experiencia en la tecnica seleccionar medios particulares y constituyentes medios apropiados para las celulas empleadas en el cultivo. La tripsina puede o no estar incluida en los medios de crecimiento. Las condiciones de cultivo por lo general incluyen la incubacion a una temperatura deseada (tal como 37 °C), asi como concentraciones seleccionadas de oxigeno y dioxido de carbono. Las condiciones de cultivo particulares seleccionadas se pueden determinar de acuerdo con las celulas empleadas en el cultivo, y la determinacion de tales condiciones esta dentro de la experiencia en la tecnica.
Las celulas se colocan en el recipiente de cultivo y se dejan incubar y crecer en las condiciones de cultivo seleccionadas. Preferiblemente, se permite que las celulas dependientes de anclaje crezcan hasta confluencia o crecimiento maximo. El tiempo requerido para el crecimiento variara dependiendo del tamano del inoculo celular inicial anadido al recipiente de cultivo y del tiempo de duplicacion de la linea celular que se esta empleando. Preferiblemente, aproximadamente 3x103 a aproximadamente 3x105 celulas se siembran por cm2 y se cultivan durante uno a cinco dias. Para la inoculacion de virus del cultivo celular, el medio se elimina de las celulas (para las celulas adherentes, por aspiracion del medio de cultivo; para las celulas cultivadas en suspension, por centrifugacion de la suspension celular y la aspiracion del sobrenadante celular) y el virus (despues de la reconstitucion) se anade a las celulas en un volumen minimo de medio o solucion salina (tal como la solucion salina equilibrada de Hank, Gibco) para prevenir la deshidratacion. Preferiblemente, este volumen varia desde aproximadamente 10 a aproximadamente 2500 microlitros por cm2 de superficie de vaso de cultivo o 105 celulas. La dilucion preferida del inoculo del virus varia desde aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10 unidades infecciosas por celula, dependiendo de la proporcion optima del virus y la linea celular particular. El virus se cultiva luego de desde aproximadamente 1 a 7 dias, el tiempo se determina principalmente por la supervivencia residual de la linea celular. Para el NDV, el tiempo optimo de recoleccion es de 1 a 5 dias despues de la inoculacion del virus.
El virus se puede recoger luego mediante cualquiera la eliminacion del sobrenadante y reemplazandolo con medio fresco o medio fresco con celulas frescas a intervalos de 12 a 48 horas o congelando y descongelando las celulas para liberar el virus en el sobrenadante. El sobrenadante se puede entonces centrifugar.
y ultracentrifugar para recuperar el virus en forma relativamente pura o por metodos de cromatografia. La pureza de la preparacion viral se puede probar por determinacion de proteinas y/o por electroforesis. Luego, el virus se puede anadir a un portador farmaceuticamente aceptable, descrito mas adelante.
Terapia
La terapia se puede proporcionare dondequiera que se realice la terapia contra el cancer: en casa, en el consultorio del medico, en una clinica, en el departamento de pacientes ambulatorios de un hospital o en un hospital. La presente divulgacion tambien proporciona el uso de un virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (por ejemplo, r73T-R116).
El tratamiento generalmente comienza en un hospital para que el medico pueda observar de cerca los efectos de la terapia y hacer los ajustes necesarios. La duracion de la terapia depende del tipo de cancer que se esta tratando, la edad y el estado del paciente, la etapa y el tipo de enfermedad del paciente y la forma en que el cuerpo del paciente responde al tratamiento. La administracion del farmaco se puede realizar a diferentes intervalos (por ejemplo, diaria, semanal o mensualmente). La terapia se puede administrar en ciclos de encendido y apagado que incluyen periodos de descanso para que el cuerpo del paciente tenga la oportunidad de desarrollar nuevas celulas sanas y recuperar su fuerza.
Segun el tipo de cancer y su etapa de desarrollo, la terapia se puede usar para retardar la propagacion del cancer, para retardar el crecimiento del cancer, para matar o detener las celulas cancerosas que pueden haberse propagado a otras partes del cuerpo desde el tumor original, para aliviar los sintomas causados por el cancer, o para prevenir el cancer en primer lugar. El crecimiento del cancer es incontrolado y progresivo, y se produce en condiciones que no provocan, o causan el cese de, la multiplicacion de celulas normales.
Como se describio anteriormente, si se desea, el tratamiento con una composicion descrita en este documento se puede combinar con terapias para el tratamiento de enfermedades proliferativas (por ejemplo, radioterapia, cirugia o quimioterapia).
Formulacion de composiciones farmaceuticas
La administracion de un virus descrito en este documento (por ejemplo, NDV r73T-R116) para el tratamiento de tumores puede ser por cualquier medio apropiado que resulte en una concentracion del agente terapeutico que, combinado con otros componentes, sea eficaz para prevenir, mejorar, o reducir tumores. El agente puede estar contenido en cualquier cantidad apropiada en cualquier sustancia portadora apropiada, y generalmente esta presente en una cantidad de 1-95% en peso del peso total de la composicion. La composicion se puede proporcionar en una forma de dosificacion que es
apropiado para la via de administracion parenteral (por ejemplo, subcutanea, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal). Las composiciones farmaceuticas se pueden formular segun la practica farmaceutica convencional (vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988­ 1999, Marcel Dekker, New York).
Las composiciones farmaceuticas descritas en este documento se pueden formular para liberar el compuesto activo sustancialmente inmediatamente despues de la administracion o en cualquier momento predeterminado o periodo de tiempo despues de la administracion. Los ultimos tipos de composiciones se conocen generalmente como formulaciones de liberacion controlada, que incluyen (i) formulaciones que crean una concentracion sustancialmente constante del farmaco dentro del cuerpo durante un periodo prolongado de tiempo; (ii) formulaciones que despues de un tiempo de retraso predeterminado crean una concentracion sustancialmente constante del farmaco dentro del cuerpo durante un periodo prolongado de tiempo; (iii) formulaciones que mantienen la accion durante un periodo de tiempo predeterminado al mantener un nivel relativamente constante y efectivo en el cuerpo con una minimizacion concomitante de efectos secundarios no deseados asociados con las fluctuaciones en el nivel plasmatico de la sustancia activa (patron cinetico del diente de sierra); (iv) formulaciones que localizan la accion mediante, por ejemplo, la colocacion espacial de una composicion de liberacion controlada adyacente a o en un sarcoma (v) formulaciones que permiten una dosis conveniente, de modo que las dosis se administran, por ejemplo, una vez cada una o dos semanas; y (vi) formulaciones que se dirigen a celulas neoplasicas en proliferacion usando portadores o derivados quimicos para administrar el agente terapeutico a una celula de sarcoma. Para algunas aplicaciones, las formulaciones de liberacion controlada evitan la necesidad de una dosificacion frecuente durante el dia para mantener el nivel de plasma a un nivel terapeutico.
Se puede seguir cualquiera de una serie de estrategias para obtener una liberacion controlada en la que la tasa de liberacion sea mayor que la tasa de metabolismo del compuesto en cuestion. En un ejemplo, la liberacion controlada se obtiene mediante la seleccion apropiada de diversos parametros e ingredientes de formulacion, que incluyen, por ejemplo, diversos tipos de composiciones y recubrimientos de liberacion controlada. De este modo, el agente terapeutico se formula con excipientes apropiados en una composicion farmaceutica que, al administrarse, libera el agente terapeutico de manera controlada. Los ejemplos incluyen composiciones de comprimidos o capsulas de unidad unica o multiple, soluciones de aceite, suspensiones, emulsiones, microcapsulas, microesferas, complejos moleculares, nanoparticulas, parches y liposomas.
Una composicion descrita en este documento se puede administrar dentro de un diluyente, portador o excipiente farmaceuticamente aceptable, en forma de dosificacion unitaria. Se puede emplear la practica farmaceutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones apropiadas para administrar los compuestos a pacientes que padecen una enfermedad causada por una proliferacion celular excesiva. La administracion puede comenzar antes de que el paciente sea sintomatico.
Se puede emplear cualquier via de administracion apropiada, por ejemplo, la administracion puede ser parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutanea, intratumoral, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftalmica, intraventricular, intrahepatica, intracapsular, intratecal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerosol, supositorio, o administracion oral. Por ejemplo, las formulaciones terapeuticas pueden estar en forma de soluciones o suspensiones liquidas; para administracion oral, las formulaciones pueden estar en forma de comprimidos o capsulas; y para formulaciones intranasales, en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles. Para cualquiera de los metodos de aplicacion descritos anteriormente, una composicion descrita en este documento se administra de forma deseable por via intravenosa o se aplica al sitio del evento de apoptosis necesario (por ejemplo, mediante inyeccion).
Los metodos bien conocidos en la tecnica para hacer formulaciones se encuentran, por ejemplo, en ""Remington: The Science and Practice of Pharmacy" Ed. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2000. Las formulaciones para administracion parenteral pueden, por ejemplo, contener excipientes, agua esteril o solucion salina, polialquilenglicoles tal como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Se pueden usar polimeros de lactida biocompatibles y biodegradables, copolimeros de lactida/glicolida o copolimeros de polioxietileno-polioxipropileno para controlar la liberacion de los compuestos. Otros sistemas de administracion parenteral potencialmente utiles para administrar agentes incluyen particulas de copolimero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmoticas, sistemas de infusion implantables y liposomas. Las formulaciones para inhalacion pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietilen-9-lauril eter, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para administracion en forma de gotas nasales, o como gel.
Las formulaciones se pueden administrar a pacientes humanos en cantidades terapeuticamente eficaces (por ejemplo, cantidades que previenen, eliminan o reducen una afeccion patologica) para proporcionar terapia para una enfermedad o afeccion. La dosis preferida de una composicion descrita en este documento es probable que dependa de variables tales como el tipo y el alcance del trastorno, el estado general de salud del paciente en particular, la formulacion de los excipientes de los compuestos y su via de administracion.
Las cantidades de dosificacion humana para cualquier terapia descrita en este documento se pueden determinar inicialmente extrapolando la cantidad de compuesto usado en ratones, como un experto en el arte reconoce que es habitual en la tecnica modificar la dosis para humanos en comparacion con los modelos animales. Tambien se describe en este documento, cuando la dosis puede variar entre aproximadamente 107 pfu y aproximadamente 1011 pfu; o de aproximadamente 108 pfu a aproximadamente 1010 pfu o de aproximadamente 109 pfu a aproximadamente 1011 pfu. Tambien se describe en este documento, cuando esta dosis puede ser de aproximadamente 107 pfu, 108 pfu, 109 pfu, 1010 pfu, 1011 pfu. Por supuesto, una cantidad de dosis se puede ajustar hacia arriba o hacia abajo, como se hace rutinariamente en dichos protocolos de tratamiento, dependiendo de los resultados de los ensayos clinicos iniciales y las necesidades de un paciente en particular.
Seleccion de un metodo de tratamiento.
Despues de que se diagnostica que un sujeto tiene neoplasia, se selecciona un metodo de tratamiento. En la neoplasia, por ejemplo, una serie de regfmenes de tratamiento estandar estan disponibles. El perfil del marcador de la neoplasia se usa para seleccionar un metodo de tratamiento. En este documento tambien se describen celulas de neoplasia que responden a la muerte celular por NDV (por ejemplo, r73T-R116).
Es probable que una neoplasia menos agresiva sea susceptible a metodos de tratamiento conservadores. Las neoplasias mas agresivas (por ejemplo, neoplasias metastasicas) son menos susceptibles a los metodos de tratamiento conservadores y es probable que se repitan. Cuando los metodos descritos en este documento indican que una neoplasia es muy agresiva, se debe seleccionar un metodo de tratamiento agresivo. Los regfmenes terapeuticos agresivos por lo general incluyen una o mas de las siguientes terapias: reseccion quirurgica, radioterapia o quimioterapia.
Ensayos para medir la viabilidad celular.
Los agentes (por ejemplo, NDV) utiles en los metodos descritos en este documento incluyen aquellos que inducen la muerte celular neoplasica y/o reducen la supervivencia de las celulas neoplasicas, esto es, la viabilidad.
Los ensayos para medir la viabilidad celular son conocidos en la tecnica, y se describen, por ejemplo, por Crouch et al. (J. Immunol. Meth. 160, 81-8); Kangas et al. (Med. Biol.62, 338-43, 1984); Lundin et al., (Meth. Enzymol.133, 27­ 42, 1986); Petty et al. (Comparison of J. Biolum. Chemilum.10, 29-34,.1995); y Cree et al. (AntiCancer Drugs 6: 398­ 404, 1995). La viabilidad celular se puede analizar usando una variedad de metodos, incluyendo MTT (bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazolil) -2,5-difeniltetrazolio) (Barltrop, Bioorg. & Med. Chem.Lett.1: 611, 1991; Cory et al., Cancer Comm. 3, 207-12, 1991; Paull J. Heterocyclic Chem. 25, 911, 1988). Los ensayos para la viabilidad celular tambien estan disponibles comercialmente. Estos ensayos incluyen, pero no se limitan al ensayo de viabilidad celular luminiscente CELLTITER-GLO® (Promega), que usa tecnologfa de luciferasa para detectar ATP y cuantificar la salud o el numero de celulas en cultivo, y el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo®, que es un ensayo de citotoxicidad de la lactato deshidrodigenasa (LDH) (Promega).
Los compuestos candidatos que inducen o aumentan la muerte celular neoplasica (por ejemplo, aumentan la apoptosis, reducen la supervivencia celular) tambien son utiles como agentes terapeuticos antineoplasicos. Los ensayos para medir la apoptosis celular son conocidos para los expertos en el arte. Las celulas apoptoticas se caracterizan por cambios morfologicos caracterfsticos, que incluyen la condensacion de la cromatina, el encogimiento celular y el sangrado de la membrana, que se pueden observar claramente mediante microscopfa optica. Las caracterfsticas bioqufmicas de la apoptosis incluyen la fragmentacion del ADN, la escision de protefnas en ubicaciones especfficas, el aumento de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la aparicion de fosfatidilserina en la superficie de la membrana celular. Los ensayos para la apoptosis son conocidos en la tecnica. Los ensayos de ejemplo incluyen los ensayos TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling), los ensayos de actividad de caspasa (especfficamente caspasa-3) y los ensayos de fas-ligando y anexina V. Los productos disponibles comercialmente para detectar apoptosis incluyen, por ejemplo, Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay, FragEL TUNEL kit (ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS, San Diego, CA), the ApoBrdU DNA Fragmentation Assay (BIOVISION, Mountain View, CA), y the Quick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit (BIOVISION, Mountain View, CA).
Las celulas neoplasicas tienen una propension a hacer metastasis, o propagarse, desde su lugar de origen hasta puntos distantes en todo el cuerpo. Los ensayos para el potencial de metastasis o la invasividad son conocidos para los expertos en el arte. Tales ensayos incluyen ensayos in vitro para la perdida de la inhibicion por contacto (Kim et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101:16251 -6, 2004), aumento de la formacion de colonias de agar suave in vitro (Zhong et al., Int J Oncol. 24(6):1573-9, 2004), modelos de metastasis pulmonares (Datta et al,, in vivo, 16:451-7, 2002) y ensayos de invasion celular basados en Matrigel (Hagemann et al. Carcinogenesis. 25: 1543-1549, 2004). Los metodos de cribado in vivo para la invasion celular tambien son conocidos en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, el cribado de tumorigenicidad en ratones atfmicos desnudos. Un ensayo in vitro comunmente usado para evaluar la metastasis es el ensayo de invasion celular basado en Matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ).
Si se desea, los compuestos candidatos seleccionados usando cualquiera de los metodos de cribado descritos en este documento se analizan para determinar su eficacia usando modelos animales de neoplasia. Tambien se describe en este documento, cuando
los ratones son inyectados con celulas humanas neoplasicas. Los ratones que contienen las celulas neoplasicas se inyectan a continuacion (por ejemplo, por vfa intraperitoneal) con vehfculo (PBS) o compuesto candidato diariamente durante un perfodo de tiempo que se determinara emprncamente. Luego los ratones se someten a eutanasia y los tejidos neoplasicos se recogen y se analizan para determinar los niveles de NDV, polipeptidos de NDV y/o marcadores de NDV (por ejemplo, un transgen que codifica una unidad estructural detectable) usando los metodos descritos en este documento. Se espera que los compuestos que disminuyen el NDV, los polipeptidos del NDV o ARNm de los niveles del marcador del NDV o la expresion de la protefna en relacion con los niveles de control sean eficaces para el tratamiento de una neoplasia en un sujeto (por ejemplo, un paciente humano). Tambien se describe en este documento, cuando se analiza el efecto de un compuesto candidato sobre la carga tumoral en ratones inyectados con una celula neoplasica humana. La celula neoplasica se deja crecer para formar una masa. Los ratones se tratan luego con un compuesto candidato o vehiculo (PBS) diariamente durante un periodo de tiempo que se determinara empiricamente. Los ratones se someten a eutanasia y los tejidos neoplasicos se recogen. La masa del tejido neoplasico en ratones tratados con los compuestos candidatos seleccionados se compara con la masa de tejido neoplasico presente en los ratones de control correspondientes.
Kits
En este documento se describen kits para el tratamiento o la prevencion del sarcoma. Tambien se describe en este documento, cuando el kit incluye una composicion terapeutica o profilactica que contiene una cantidad eficaz de un NDV (por ejemplo, r73T-R116) en forma de dosis unitaria. Tambien se describe en este documento, cuando el kit incluye una composicion terapeutica o profilactica que contiene una cantidad eficaz de NDV (por ejemplo, r73T-R116) en forma de dosis unitaria.
Tambien se describe en este documento, cuando el kit comprende un recipiente esteril que contiene una composicion terapeutica o profilactica; tales recipientes pueden ser cajas, ampollas, botellas, viales, tubos, bolsas, bolsas pequenas, envases tipo blister u otras formas de recipientes apropiadas conocidas en la tecnica. Tales recipientes pueden estar hechos de plastico, vidrio, papel laminado, lamina metalica u otros materiales apropiados para contener medicamentos.
Si se desea, se proporciona un anticuerpo descrito en este documento junto con instrucciones para administrar un NDV (por ejemplo, r73T-R116) a un sujeto que tiene o tiene riesgo de desarrollar una neoplasia. Las instrucciones generalmente incluiran informacion sobre el uso de la composicion para el tratamiento o la prevencion de la neoplasia. Tambien se describe en este documento, cuando las instrucciones incluyen al menos uno de los siguientes: descripcion del agente terapeutico; esquema de dosificacion y administracion para el tratamiento o prevencion de neoplasia o sintomas de la misma; precauciones advertencias; indicaciones; contraindicaciones; informacion de sobredosis; reacciones
adversas; farmacologia animal; estudios clinicos; y/o referencias. Las instrucciones pueden imprimirse directamente en el recipiente (cuando este presente), o como una etiqueta aplicada al recipiente, o como una hoja, folleto, tarjeta o carpeta por separado suministrada en o con el recipiente.
La practica de la presente divulgacion emplea, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologia molecular (incluyendo tecnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquimica e inmunologia, que estan dentro del alcance del experto en el arte. Tales tecnicas se explican completamente en la literatura, tal como "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). Estas tecnicas son aplicables a la produccion de los polinucleotidos y polipeptidos descritos en este documento, y, como tales, pueden considerarse al hacer y practicar la divulgacion.
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en el arte una divulgacion y descripcion completas de como hacer y usar el ensayo, el cribado y los metodos terapeuticos descritos en este documento, y no pretenden limitar el alcance de la divulgacion.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Ensamblaje del ADNc del antigenoma de la cepa 73T de NDV.
Seis fragmentos de ADNc subgenomicos generados por RT-PCR de alta fidelidad se ensamblaron en el vector pUC19. El ADNc de longitud completa de NDV 73T se designo como p73T. Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos deducidas del sitio de escision de la proteina F (FPCS) en 73T se modificaron a la de la cepa LaSota del NDV (lentogenica, lenta) o glucoproteina B (gB) del citomegalovirus (CMV) (S116) (Figura 1; doble barra indica el sitio de escision de la proteina F). El ADNc se secuencio completamente para confirmar la secuencia viral. Sitio de escision de la proteina F: Wt: ggg agg aga cag aaa cgc ttt; Lento: ggg ggg aga cag gaa cgc ctt; S116: cat aat aga acg aaa tcc ttt; S116KM: cat aat aaa atg aaa tcc ttt; R116: cat aat aga acg aaa cgc ttt.
Ejemplo 2. Insercion de transgen en el genoma de NDV 73T.
Los transgenes se insertaron en p73T en dos ubicaciones: en las secuencias intergenicas entre P y M o en las secuencias intergenicas entre las uniones HN y L (Figura 2A). Para insertar un casete transgenico unico en las uniones P-M o HNL, se realizo la construccion del ADNc p73T que contiene un transgen en las uniones P-M o HN-L insertando el casete transgenico en los sitios Afel creados entre los genes P y M (nt 3148) o entre los genes HN y L (nt 8231). El casete de genes insertado contiene el extremo del gen (GE; 5’-TTAAGAAAAAA -3’), el nucleotido intergenico (T), la secuencia de inicio del gen (GS; 5’-ACGGGTAGA -3’) y el marco de lectura abierto (ORF) del transgen. Ademas, se insertaron diez nucleotidos (5’- cgccgccacc-3’) corriente arriba del sitio de inicio para introducir una secuencia Kozak. El ADNc de longitud completa (FL) 73T que contiene el transgen en la union P-M o HN-L se designo como p73T-P1 o p73T-HN1, respectivamente. Se construyo ADNc de longitud completa que contenian dos transgenes separados en las uniones P-M y HN-L en un solo genoma y se designo como p73T-P1-HN1 (Figura 2B). Para insertar dos casetes de transgen en la misma union (por ejemplo, P-M), se introdujo un sitio Afel al final de ORF el primer transgen (# 1) (nt 3169). El 2° transgen ORF se amplifico por PCR con cebadores que contienen secuencias GE y GS y se inserto en el sitio Afel. El ADNc antigenomico que contiene dos casetes transgenicos de la union P-M se designo como p73T-P2.
Ejemplo 3. Recuperacion de la cepa infecciosa de NDV recombinante 73T (r73T) con FPCS modificado.
Las proteinas NDV 73T NP, P, L y el ADNc antigenico (p73T-lento o p73T-S116) se clonaron bajo el control del promotor y terminador de la ARN polimerasa de T7. Los cuatro plasmidos se cotransfectaron en una linea celular de ARN polimerasa (Figura 3A). Los virus recuperados se designaron como r73T-lento o r73T-S116. El r73T-lento y el r73T-S116 se pasaron en celulas Vero con medios con y sin suplemento de tripsina. El crecimiento de r73T-lento depende de la tripsina, mientras que r73T-S116 puede crecer en un medio sin el suplemento de tripsina. Secuencias de escision de la proteina F (FPCS) en r73T-S116, con y sin hGM-CSF en la union P-M, se evaluaron. Las cepas 73T-S116 se pasaron adicionalmente por 10 pasajes en celulas Vero y fibrosarcoma humano HT1080 a MOI 0.01 en medio sin suplemento de tripsina. Las mutaciones en el FPCS (R113k y/o Q114M) aparecieron en el pasaje 7. La mutacion S116R se detecto en el pasaje 9. En el pasaje 10, F, h N y el transgen se secuenciaron y no se encontraron mutaciones adicionales.
Ejemplo 4. Caracterizacion de la cepa 73T recombinante con diferentes secuencias de escision de proteinas F.
La cepa 73T recombinante con nuevas secuencias de escision de la proteina F modificada (FPCS) incluyo las siguientes secuencias:
• Lento: 111G-G-R-Q-E-R/L-I118
• S116: 111H-N-R-T-K-S/F117
• S116K: 111H-N-K-T-K-S/F117
• S116M: 111H-N-R-M-K-S/F117
• S116KM: 111H-N-K-M-K-S/F-I118
• R116: 111H-N-R-T-K-R/F-I118
Las cepas 73T recombinantes con diferentes FPCS se caracterizaron con respecto a MDT, ICPI, muerte relativa de celulas HT1080, replicacion en celulas Vero y replicacion en huevos (Figura 4).
La virulencia aviar de NDV se determina principalmente por las secuencias de escision de la proteina F (FPCS). r73T-lento fue disenado para contener el FPCS de la cepa no virulenta LaSota. La replicacion del virus LaSota en los cultivos de tejidos depende de la tripsina, ya que la proteina F no se puede escindir. r73T-lento forma pequenas placas en las celulas Vero sin el suplemento de tripsina, lo que indica que la proteina F no se escinde y el virus no se puede propagar de manera eficiente de una celula a otra. r73-lento se replico a un nivel bajo en celulas Vero (7.5 x 103 pfu/ml), pero de manera eficiente en huevos con enzima endogena tipo tripsina (5.7 x 108 pfu/ml). r73-lento no es virulento en pollos, como lo demuestra por el tiempo medio de muerte (MDT) de los embriones inoculados con el virus (MDT> 156hr) y un indice de patogenicidad intracerebral (ICPI; ICPI = 0.00), y tiene una baja citotoxicidad en las celulas HT1080 (13% de muerte de celulas).
El r73T-S116 puede formar placas relativamente grandes y alcanza un titulo de 4.4 x 106 pfu/ml en celulas Vero. Esto fue comparable a los titulos obtenidos cuando r73T-S116 crecio en celulas Vero suplementadas con tripsina. Estos datos indicaron que el sitio de escision de la proteina de fusion (FPCS) de r73T-S116 se puede escindir sin tripsina exogena en cultivos de tejidos. No fue virulento en pollos y mostro un 31% de muerte de celulas en celulas HT1080. Se examino r73T-S116 para determinar su estabilidad genetica mediante el pasaje de celulas in vitro.
Despues de 10 pasajes en celulas Vero o HT1080, se encontraron sustituciones de aminoacidos en el FPCS: R113K, Q114M y/o S116R. Para eliminar la posibilidad de que se hubiera producido un cambio de secuencia adicional en el genoma viral, se construyeron virus mutantes r73T-S116 recombinantes mediante genetica inversa y se evaluaron. Excepto por r73T-R116, r73T-S116 y sus derivados fueron similares al S116 parental en que estos virus mutantes no eran virulentos en polios y eran capaces de niveles similares de muerte de celulas HT1080. La muerte de celulas HT1080 fue entre 29% y 31% para la mutacion unica y 48% para las mutaciones dobles.
El tamano de la placa de M114 y K113M114 fue significativamente mayor que S116. El mutante r73T-R116 adquirio un cambio de aminoacido en el residuo 116 (S116R) en el FPCS. Se sabe que el R116 junto al sitio de escision es importante para la escision eficaz de la proteina F. r73T-R116 formo grandes placas en celulas Vero, crecio a titulos similares con y sin suplemento de tripsina y mato eficazmente las celulas HT1080 (80%). R116 aumento la virulencia de los pollos como lo muestra el ensayo MDT (72, 80 h). Aunque el valor ICPI (0.65) fue <0.7 en una prueba, es preferible reducir aun mas su virulencia en el pollo.
Ejemplo 5. Los derivados de r73T-R116 tienen una virulencia reducida en el pollo.
El virus se puede disenar para expresar un transgen en la union P-M (1), un 2o transgen en la union HN-L (2) y una region intergenica HN-L aumentada que se extiende por la insercion de una secuencia no codificante (3) (Figura 5A). El mismo diseno para la insercion de un casete transgenico en la union P-M que en la figura 2A se usa en este documento. El segundo casete de transgen contiene la secuencia de inicio del gen L (GS; 5’-ACGGGTAGA -3’), el marco de lectura abierto (ORF) del transgen, las secuencias de la region 3' no traducida del gen L (resaltada en cursiva) y la secuencia final del gen L (GE; 5’-TTAAGAAAAAA -3’). La secuencia no codificante usada para aumentar la union HN-L se tomo de los paramixovirus tipo -1 (APMV-1), el virus sincitial respiratorio (VSR) o la secuencia aleatoria que no tiene homologia con ninguna secuencia conocida. La insercion puede estar en el intervalo de 60-318 nt. La insercion de un 2o transgen en HN-L permitio que el virus expresara dos transgenes, tal como hGM-CSF y GFP. Se enumeran las secuencias insertadas en la union HN-L (Figura 5B).
Ejemplo 6. Modificacion de r73T-R116 y caracterizacion de derivados de r73T-R116.
Para reducir la virulencia de r73T-R116 en pollos, se modifico el virus r73T-R116 para aumentar la secuencia intergenica de HN y L mediante la insercion de secuencias de diversas longitudes. Los derivados de r73T-R116 se evaluaron para determinar su infectividad mediante el examen de la formacion de placa y la replicacion en celulas y huevos; para la patogenicidad aviar mediante el examen de MDT e ICPI, y para la muerte de celulas tumorales (Figura 6A).
Las inserciones intergenicas de 318nt de APMV, 198nt de RSV y 198 secuencias aleatorias efectivamente redujeron la virulencia en pollos, con MDT> 156hr e ICPI de 0.27, 0.0375 y 0, respectivamente. Una insercion larga (198 nt aleatorios) tuvo un efecto mayor en la reduccion de la virulencia que una insercion corta (60 nt aleatorios). La insercion de 144, 102 y 60nt tuvo algo de virulencia en los pollos, pero los tiempos MDT fueron mas cortos. Los valores de ICPI para la insercion de 144, 102 y 60nt fueron 0.74, 0.51 y 0.78, respectivamente. La insercion de una secuencia no viral (198nt aleatoria) redujo mas eficazmente la virulencia que la insercion de una secuencia viral (RSV-198nt). La insercion del 2° casete de transgen (EGFP) en la union HN-L no redujo la virulencia en el pollo (MDT 86hr e ICPI de 0.82). Todas las inserciones redujeron ligeramente la replicacion viral en huevos hasta 4 veces, pero no afectaron la replicacion viral en celulas Vero (~106pfu/ml). Aunque los virus mutantes fueron mas atenuados en el pollo, la funcion de muerte de celulas tumorales no se vio afectada. Todos los derivados de r73T-R116 tenian una eficacia de muerte de celulas tumorales en el intervalo de 75% -86% en el dia 3 de la infeccion.
Ejemplo 7. Cinetica de crecimiento de virus r73T en huevos y celulas Vero.
Para determinar las condiciones de crecimiento para los virus r73T, se realizaron estudios de crecimiento cinetico en huevos (Figura 7) y celulas Vero (Figura 8). Los huevos embrionados de pollo se infectaron con 100, 1000, 10,000 o 100,000 FFU/huevo de los virus indicados y se incubaron durante 2, 3 o 4 dias. Se recogio el fluido alantoico y se determinaron los titulos viricos mediante FFA. Como se muestra en la figura 7, 100 FFU/huevo tuvieron un titulo bajo en el dia 1, pero alcanzaron el titulo maximo en el dia 2. En general, la mayoria de los virus alcanzaron titulos maximos de ~8 logs/mL en el dia 2, independientemente de la dosis de inoculacion usada. R116i-198 tuvo el titulo mas bajo, la dosis baja de inoculo genero el mayor rendimiento en el dia 2, lo que indica que podria haber acumulacion de particulas defectuosas. La insercion R116i-318-APMV tambien tuvo un titulo maximo mas bajo de ~7 logs. R116i-198-RSV alcanzo un titulo maximo de 7.5 logs. El S116 construido por genetica inversa no tuvo reduccion en la produccion de virus en los huevos. Por lo tanto, entre los derivados de R116, el virus con insercion RSV-198nt fue el principal candidato del virus oncolitico en terminos de propiedades de crecimiento en los huevos.
Los virus tambien se evaluaron en el clon 51D11 de celulas Vero sin suero, una linea celular patentada generada por Medlmmune. Todos los virus se replicaron bien en ambas condiciones de MOI (0.001 y 0.0001) (Figura 8). La modificacion de 73T FPCS y la insercion intergenica en la union HN-L de R116 no afectaron el crecimiento del virus en las celulas Vero.
Ejemplo 8. Muerte celular selectiva de r73T y derivados en celulas cancerosas en comparacion con las celulas normales.
rT3T y sus derivados se evaluaron para determinar su muerte de celulas en el fibrosarcoma humano HT1080 en comparacion con las celulas CCD1122Sk de fibroblastos de piel humana normales, en relacion con las celulas de control sin tratar (Figuras 9A y 9B). Los datos se obtuvieron posteriores a la infeccion con derivados de r73T a diferentes dosis que oscilaron entre 1 y 100,000 PFU durante 72 h. En las celulas cancerosas HT1080, el virus con FPCS lentogenico tuvo la menor muerte, el S116 en el FPCS fue intermedio, y el virus con R116 en el FPCS tuvo una muerte celular tan eficiente como el virus r73T wt. En las celulas CCD1122SK normales, la muerte de celulas de todos los virus no fue tan eficaz como la de las celulas cancerosas. La reduccion en la eficiencia de matanza fue de ~ 100 veces. Independientemente de las secuencias FPCS, todos los virus tenian una eficacia de muerte similar en las celulas normales. La eficiencia de muerte de celulas en las celulas cancerosas y normales se expreso como una concentracion eficaz del 50% (EC50) interpolada desde la curva de respuesta a la dosis usando Prism 6.0 (Figura 9C). El derivado de R116 tenia un valor de EC50 similar a r73T wt con EC50 de 10 PFU, lo que indica que la modificacion de FPCS no afecto la replicacion del virus y la eficiencia de muerte de celulas en las celulas cancerosas. La replicacion de estos virus en las celulas HT1080 y CCD1122SK a MOI 0.01 se determino el dia 3 posteriores a la infeccion (Figura 9D). Todos los virus se replicaron preferentemente en las celulas cancerosas sobre las celulas normales, con una diferencia de aproximadamente 1.5-2.0 logs.
Ejemplo 9 Los derivados de r73T tenian actividad antitumoral in vivo cuando se administraban ya sea sistemicamente o por via intratumoral a ratones inmunodeficientes que portaban xenoinjertos de tumores humanos.
Para evaluar la actividad oncolitica in vivo, se establecio el modelo de xenoinjerto HT1080 inyectando las celulas HT1080 a una concentracion de 5 x 106 celulas/0.1 ml por via subcutanea en ratones atimicos Balb/C a la edad de 5­ 6 semanas. Como hGMCSF no tiene reactividad cruzada en ratones, este estudio no estaba orientado a evaluar el efecto transgenico, sino la capacidad oncolitica de diversas construcciones de r73T. R116-318i-hGM-CSF se administro por via intratumoral (it) o intravenosa (iv) y la tasa de crecimiento del tumor se comparo entre los grupos de tratamiento y de control (Figura 10A).
Los ratones se aleatorizaron en grupos (N = 10) como se indico cuando el volumen del tumor alcanzo aproximadamente 65 mm3. Los ratones recibieron una dosis unica de PBS o 2 x 107 Pfu de r73T-hGM-CSF-R116i-198 administrados por via intratumoral (IT) o 1 x 108 PFU administrados por via intravenosa (IV) mediante inyeccion en la vena de la cola. El tamano del tumor se midio cada 3-4 dias. Como se presenta en la figura 10A, r73T-R116i podria inducir una regresion tumoral significativa cuando se administro por IV o por IT. La cantidad de regresion del tumor inducida por las dos rutas fue comparable y fue significativamente diferente del grupo de control.
Las actividades oncoliticas de los derivados de r73T se compararon en los xenoinjertos HT1080 mediante inyeccion IT de 1 x 108 PFU (Figura 10B). Los ratones se asignaron al azar en grupos (n = 7) cuando el volumen del tumor alcanzo aproximadamente 180 mm3. Los ratones recibieron PBS o 1 x 108 p Fu de r73T-hGM-CSF-lento (lento) o r73T-hGM-CSF-S116K113M114 (S116 KM) o r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N (R116i) o r73T-hGM-CSF (r73T wt). El tamano del tumor se midio cada 3-4 dias (* P <0.05, prueba T de Student no emparejada). Dos dosis de derivados de r73T fueron capaces de inducir una regresion significativa del tumor, aunque con diferencias en la efectividad. r73T-lento fue el menos efectivo, mientras que r73T wt fue el mas efectivo en la regresion del tumor. r73T-lento tuvo un efecto similar al del virus S116, aunque el virus S116 tuvo una EC50 mas baja 10 veces para la muerte de celulas in vitro (Figura 9A). r73T-R116i-318 fue tan potente como 73T wt en la inhibicion del crecimiento tumoral hasta 9 dias despues de la 2a dosis (dia 19 despues de la implantacion del tumor), el tumor volvio a crecer en ratones tratados con R116i, pero no en el grupo tratado con 73T wt. Estos datos mostraron que los derivados de r73T tenian actividad antitumoral in vivo cuando se administraban sistemicamente o por via intratumoral a ratones inmunodeficientes que portaban xenoinjertos de tumores humanos. La escision eficaz de la proteina F es importante para la replicacion del virus in vitro e in vivo. Los virus con el R116 en el FPCS fueron mas potentes en la muerte de celulas in vitro e in vivo.
Ejemplo 10. Biodistribucion tisular del derivado r73T despues de la administracion intravenosa.
Para determinar si el virus NDV oncolitico se replica de manera selectiva en los tejidos tumorales y la eliminacion viral, se determino la distribucion del virus en diferentes organos. Se trataron ratones atimicos desnudos con tumores HT1080 subcutaneos con un tamano de ~ 250 mm3 con R116i (r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N) a una dosis de 1 x 108 PFU por via intravenosa y se sacrificaron el dia 1, 4, o 8 (n = 3 por punto de tiempo). Se recogieron suero, pulmones, bazo, ovarios y tumor.
La presencia de virus se cuantifico mediante un ensayo de placa en celulas Vero, y la expresion del transgen hGM­ CSF se midio mediante un ensayo ELISA. La replicacion del virus en el tumor y los organos se evaluo el dia 1,4 y 8 posteriores a la infeccion. El virus solo se detecto en los organos el dia 1 (no se detecto ningun virus en el ovario en todos los puntos de tiempo) y la carga de virus en los tejidos tumorales fue 100 veces mas alta que en los pulmones y bazos (Figura 11A). La presencia del virus en el tumor persistio durante al menos 8 dias, lo que indica que el virus se replico selectivamente en los tejidos tumorales. De acuerdo con los datos de replicacion viral, el nivel de hGMCSF fue el mas alto y duro mas de 8 dias (Figura 11B). Estos datos demostraron que el virus NDV puede replicarse eficazmente en el tejido tumoral y administrar el transgen al tejido tumoral local de manera eficaz.
Ejemplo 11. ADNc de antigenoma de 73T que contiene el gen F y/o HN quimerico.
Las glucoproteinas de la superficie viral son antigenos importantes para la inmunogenicidad y la virulencia en polios. Se exploraron estrategias para reemplazar los genes F y HN de NDV por los correspondientes dominios extracelulares (ecto) de otros paramixovirus que no son virulentos en pollos individualmente o en combinacion. El virus de la parainfluenza 5 (PIV 5) es un paramixovirus canino y no causa enfermedades en humanos. Se ha demostrado que el paramixovirus de paloma tipo 1 (PPMV-1) no es virulento en pollos con un ICPI de 0.025, como se informo anteriormente, y es antigenicamente distinto del NDV (Dortmans et al, Veterinary Microbiology, 2010, vo.
143, pages 139-144.) Existen dos variantes geneticamente relacionadas del paramixovirus de paloma tipo 1 (PPMV-1) con sitios de escision de la proteina de fusion velogenica identicos, pero con una virulencia fuertemente contrastante (Veterinary Microbiology, 2010, 143:139-144). Se generaron ADNc antigenomicos de longitud completa de NDV 73T en los que se intercambiaron el ectodominio de glucoproteina F y/o HN con el de PPMV-1 y/o PIV5 (Figura 12A). Las secuencias de NDV, PIV5 y PPMV-1 se indican con recuadros de colores como azul, purpura o verde, respectivamente).
Se indican las longitudes de aminoacidos de proteinas individuales o dominios de proteinas. La formacion de placa en Vero, la muerte de celulas HT1080 relativa y MDT se realizaron como se describio anteriormente (Figura 12B). Los virus quimericos, a excepcion de PIV-5 F-HN, se recuperaron y fueron capaces de crecer en las celulas en ausencia de tripsina exogena. Los tres virus formaron placas de buen tamano, que mostraron una propagacion eficiente de celula a celula. Los virus quimericos PPMV-1 F-HN o F tuvieron valores de MDT de 79 y 84 h, respectivamente, lo que indica una posible virulencia en pollos. Ambas quimeras PPMI-1 mataron las celulas HT1080 de manera eficiente a niveles de 71 y 61%. La quimera PIV5-F no crecio en los huevos y no fue virulenta en los pollos y mato las celulas HT1080 al 47%. La reactividad cruzada del suero entre las quimeras NDV y PPMV-1 o PIV5 se examino mediante un ensayo de neutralizacion usando el suero recogido de ratones que recibieron dos dosis intravenosas de 1 x 108 PFU de r73T-R116i. El virus r73T se neutralizo con el suero infectado con NDV (titulo 960) mientras que las quimeras PPMV-1 y PIV5 no se neutralizaron (titulo <4). Este resultado confirmo que no hubo reactividad cruzada entre NDV y PPMV-1 o PIV5. Los virus quimericos con distintas antigenicidades tienen el potencial de servir como un refuerzo de los virus oncoliticos para los pacientes que han desarrollado respuestas inmunes anti-NDV durante el tratamiento previo de NDV.
Una comparacion de la actividad de la ARN polimerasa del NDV con otros paramixovirus mediante un ensayo minigenoma (Figura 12C). Las celulas que expresan T7 se transfectaron con los tres plasmidos que expresan las proteinas NP, P, L del NDV y el plasmido que codifica el ADNc antiminigenomico del NDV que codifica el gen GFP usando Lipofectamine 2000, o los plasmidos que codifican los genes N, P, L del virus del sarampion (MV) o virus sincitial respiratorio (RSV) y respectivo plasmido de ADNc antiminigenoma GFP RSV o MV. Dos o tres dias despues de la transfeccion, la replicacion del minigenoma como se indica mediante la expresion de proteinas GFP se examino bajo un microscopio fluorescente. El NDV tuvo la actividad de polimerasa mas fuerte en comparacion con el virus del sarampion y el RSV.
Ejemplo 12. Las celulas cancerosas sensibles a NDV se identificaron por seleccion de panel celular.
Para entender que tipos de tumores pueden ser sensibles a la oncolisis del NDV, se analizaron 180 lineas celulares de cancer que cubren una amplia gama de tipos de tumores e indicaciones para la sensibilidad al NDV recombinante y sus variantes. Las lineas celulares se obtuvieron de American Type Tissue Collection (Manassas, VA) o the European Collection of cell cultures (ECACC) y se cultivaron en medios y en las condiciones recomendadas por el proveedor. Se sembraron 10,000 lineas celulares de cancer en placas de 96 pocillos y se infectaron 6 horas despues con un virus. Las concentraciones de virus oscilaron entre MOI 10- 0.0001 (o 1 a 100,000 pfu por pocillo). La viabilidad celular se determino 48-96 horas posteriores a la infeccion. La sensibilidad se determino usando un corte de > 30% de muerte de celulas a las 72 horas posteriores a la infeccion con el virus a una MOI de 0.1. Las figuras 13A y 13B proporcionan una vision general de la sensibilidad por tipo de tumor. Las lineas celulares de cancer hematologico (leucemia y linfoma) fueron relativamente insensibles a la oncolisis del NDV, mientras que la mayoria de las lineas celulares de melanoma, ovario y pancreas analizadas fueron sensibles al NDV. Aproximadamente el 58% de todas las lineas celulares de cancer humano analizadas fueron sensibles al NDV R116i en FPCS en relacion con el 4% de las lineas celulares analizadas fueron sensibles al virus basado en S. Esto fue mas probable debido a la escision de la proteina F por las proteasas. El virus R116i es mas probable que se escinda por las proteasas ubicuas de tipo furina, mientras que la proteasa que probablemente escinda la proteina F S116 no esta definida y es probable que se exprese de manera menos ubicua. La variante rederivada de S16-KM produjo un tamano de placa mas grande y una potencia oncolitica mejorada en relacion con la variante original de S116.
Para probar esto adicionalmente, se infecto un panel mas pequeno de 22 lineas celulares de cancer que se habia determinado que tenian un intervalo de sensibilidad al virus NDV R116 con variantes que expresaban GFP y se determino la viabilidad celular a las 72 horas posteriores a la infeccion. Usando el mismo corte de sensibilidad que se describio anteriormente, el 41% de las lineas celulares analizadas fueron sensibles a R116i, el 4% sensible a S116 y el SKM rederivado es mas potente que el S116 NDV con un 27% de las lineas celulares analizadas como sensibles.
Tabla 4. Resumen de sensibilidad de celula cancerosa para matar el virus mediante R11f>-hGM-CSF
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Las celulas derivadas de los tejidos de cancer indicados se examinaron para determinar la muerte de celulas mediante NDV 73T recombinante con R116 en el FPCS y el GM-CSF humano. Se indica el numero de celulas que mostraron una muerte de mas del 50% por la infeccion del virus a una moi de 0.1 y el total de lineas celulares analizadas.
Ejemplo 13. Los derivados de r73T teni'an actividad de inhibicion del crecimiento tumoral y/o tumoral en el modelo de melanoma singenico.
Despues del refinamiento del modelo tumoral, se ensayo la eficacia del S-116-RD NDV que codifica GM-CSF humano o murino en el modelo singenico de B16F10 refinado (Figura 15A y 15B). 1x 108 pfu se infecto por via intratumoral para 3 dosis y hubo un minimo de 8 ratones por grupo. La inhibicion significativa del crecimiento tumoral se demuestra con > 80% de inhibicion del crecimiento tumoral (Figura 15B). La regresion tumoral a corto plazo se logro con la dosis intratumoral (i.t.) repetida, lo que tambien condujo a un aumento significativo en el tiempo de supervivencia de 18 dias para el control en relacion con 42 dias en el grupo tratado. El cese del tratamiento despues de 3 dosis fue seguido por un nuevo crecimiento del tumor. Un solo animal sin evidencia de tumor residual en el grupo S116-mGM-CSF a los 50 dias se volvio a estimular mediante la implantacion de celulas tumorales B16F10 en el flanco alternativo. El crecimiento del tumor se retraso pero no se inhibio, lo que sugiere en este modelo que no se logro una respuesta de memoria inmune completa dentro de este animal unico.
Con el fin de evaluar los efectos oncoliticos e inmunitarios sobre el crecimiento tumoral, las variantes de NDV R116i y S116 que codifican hGM-CF o mGM-CSF respectivamente se probaron para determinar su eficacia en el modelo de tumor colorrectal CT26 singenico inmune competente del raton. A cada virus se le administro 1x108 PFU del virus por via intratumoral para 4 dosis. Los tumores tenian un minimo de 100 mm3 antes de comenzar la dosificacion. Todos los animales tratados con virus demostraron una potente actividad antitumoral como monoterapia. Con 11/12 animales libres de tumores despues del tratamiento con R116 que codifica GM-CSF humano, que es una tasa de respuesta completa del 92%. El virus S116-KM con derivacion menos litica tuvo una inhibicion del crecimiento tumoral reducida que alcanzo un 53% de TGI y una tasa de respuesta completa del 36%. Sin embargo, en presencia de GM-CSF murino que, a diferencia del GM-CSF humano, estara activo en el modelo de raton, esta tasa de respuesta aumento a 54% con una inhibicion del crecimiento tumoral del 75%. De este modo, es probable que dotar el virus S116 con GM-CSF pueda aumentar la actividad antitumoral.
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Los tumores que permanecian se tomaron para el analisis histologico y se tineron con hematoxilina y tincion con eosina (H y E) y se usaron metodos de inmunohistoquimica para la deteccion del NDV (Figura 15C). Existe una clara evidencia de la expresion de NDV y esto parece estar concentrado alrededor de las areas necroticas del tumor, lo que sugiere que el NDV esta contribuyendo a la muerte y necrosis de las celulas tumorales. Tambien hay evidencia clara de infiltracion de celulas inmunes en el tumor y areas necroticas. En areas que tienen una fuerte tincion para la formacion de sincitios de celulas multinucleadas de NDV tambien se puede observar. Adicionalmente, parece que hay un tumor viable remanente muy minimo, lo que indica que los datos de inhibicion del crecimiento del tumor pueden subestimar la actividad de NDV dentro de este modelo.
La figura 15C muestra que el NDV tiene una potente actividad antitumoral en el modelo de tumor colorrectal CT26 de raton inmunocompetente. Con el fin de evaluar los efectos oncoliticos e inmunes sobre el crecimiento tumoral, las variantes del NVD (R116i y S116 que codifican hGMCF o mGM-CSF, respectivamente, se probaron para determinar su eficacia en el modelo de tumor colorrectal CT26 competente singenico inmune de raton. Cada virus fue administrado con 1x108 PFU de virus por via intratumoral para 4 dosis. Los tumores tenian un minimo de 100 mm3 antes de comenzar la dosificacion. Todos los animales tratados con virus demostraron una potente actividad antitumoral en monoterapia. Con 11/12 animales libres de tumores despues del tratamiento con R116 que codifica GM-CSF humano, que es una tasa de respuesta completa del 92%. El virus S116-KM con rederivacion menos litica tuvo una inhibicion del crecimiento tumoral reducida que alcanzo un 53% de TGI y una tasa de respuesta completa del 36%. Sin embargo, en presencia de GM-CSF murino, que a diferencia del GM humano CSF estara activo en el modelo de raton; esta tasa de respuesta se aumento a 54% con una inhibicion del crecimiento tumoral del 75%. De este modo, dotar el virus S116 con GM-CSF aumenta la actividad antitumoral.
Las figuras 15D-F muestran que la dosificacion multiple con rNDV R116i causo la inhibicion del crecimiento tumoral e impulso el reclutamiento de celulas inmunes en el modelo de xenoinjerto de cancer de ovario (OVCAR4). Para evaluar adicionalmente la actividad oncolitica de rNDV in vivo, se uso un modelo de xenoinjerto de cancer de ovario humano (OVCAR4). Este modelo es de crecimiento lento y tiene una patologia macroscopica que recuerda a los tumores ovaricos humanos con una morfologia celular poco diferenciada y grandes areas llenas de liquido como el ascetico. Una vez que los tumores alcanzaron los 100 mm3, los ratones se asignaron al azar para recibir 8 dosis de R116i NDV que codifica GM-CSF de raton o humano o PBS como control. Solo el producto de la secuencia del gen murino seria bioactivo en el modelo de raton. Se inyectaron 2.5 x 107 pfu por via intratumoral en un volumen de menos de 50 ml una vez a la semana. Las curvas de crecimiento tumoral se muestran en la figura 15D. Inhibicion tumoral a largo plazo lograda en animales con tumores tratados con cualquier variante de NDV. Tambien hubo pruebas de que el genoma viral uso RT-PCR dentro del tumor al final del estudio (24 horas despues de la ultima dosis). Tras el analisis histologico, existe una clara evidencia de infiltrado inmune, asi como otros cambios histologicos en el tumor residual (Figuras 15E y F). Los tumores tratados son mucho menos diferenciados que los animales tratados con control y parecen tener menos areas llenas de liquido ascitico. Un alto nivel de infiltrado inflamatorio encontrado en el numero de tumores tratados adyacentes al tumor remanente y el analisis de inmunohistoquimica (IHC) revela que estos infiltrados inmunes son positivos para la proteina del NDV. Existe un fuerte grado de reclutamiento de celulas inmunes innatas en los tumores en los grupos tratados con NDV. Estos datos demuestran una potente eficacia antitumoral en un modelo de cancer de ovario morfologicamente relevante que puede ser causado a traves de la oncolisis directa y el reclutamiento inmune innato y la activacion.
Ejemplo 14: los virus del NDV indujeron la regresion tumoral.
Se evaluo el efecto oncolitico de 73T-R116i-hGM-CSF y 73T-R116i-mGM-CSF en el modelo de melanoma B16. El estudio evaluo la tolerabilidad del virus en el raton B16. Cada virus se dosifico a 2x107 pfu dos veces en los dias 11 y 14 por via intravenosa (i.v) o intraperitoneal (i.p), o una vez en el dia 11 a 1.1x107 pfu por via intratumoral (i.t). Los grupos tratados con R116-hGM-SCF o mGM-SCF por tres vias diferentes de administracion tuvieron una tasa de crecimiento tumoral mas lenta en comparacion con el grupo no tratado (Figura 15A). Cada grupo incluia 3 ratones. Las tasas de inhibicion del tumor fueron estadisticamente significativas en el grupo control. De este modo, los derivados de r73T descritos en este documento tienen ventajosamente baja patogenicidad aviar, alta actividad oncolitica y se replican en titulos altos en huevos de pollo. En base a estos resultados, los virus descritos en este documento son utiles para inducir la regresion del tumor y mejorar los resultados del tratamiento del paciente con cancer (Figura 16).
Ademas de GM-CSF, se pueden insertar varios transgenes (Tabla 2) en la cepa NDV 73T para mejorar la muerte del tumor. Estos transgenes incluyen lo siguiente:
(1) Citoquinas o variantes de ingenieria de citoquinas, tales como GM-CSF, IL-2, IL-21, IL-15, IL-12 y IL-12p70
(2) Ligandos y quimioquinas de la superficie celular, incluidos OX40L, CD40L, ICOSL, Flt3:, B.1 (CD80), CD137L, CXCL10 (IP-10), CCL5, CXCL9. (3) Inhibidor de Myc: Omomyc. (4) Transgenes para fines de toma de imagenes in vivo, tal como la radioviroterapia mediada por el simportador de yoduro de sodio (NIS) para la radioviroterapia. (5) Moduladores adicionales de la supervivencia de las celulas tumorales para mejorar la muerte del tumor, incluidos, pero no se limitan a, inhibidores de la progresion del ciclo celular, inhibicion de proteinas antiapoptoticas, potenciacion de proteinas proapoptoticas, inhibicion de conductores oncogenicos clave de la transformacion maligna. Estos pueden incluir la administracion transgenica de proteinas luego de la replicacion selectiva de NDV en celulas tumorales, la produccion de ARNip selectivo o de actividad amplia, la administracion de miARN o la inhibicion de miARN seleccionado (6) Antigenos tumorales tal como E6, E7, antigenos de testiculos de cancer, antigenos oncofetales, proteinas artificiales o sobreexpresadas como nuevos antigenos tumorales ya sea solos o en combinacion con otros transgenes. (7) Anticuerpos o proteinas de fusion recombinantes que se dirigen a las proteinas inmunomoduladoras ya sea para bloquear la regulacion negativa o proporcionar una senal agonista para mejorar la funcion de las celulas T. El ejemplo de tales anticuerpos puede incluir, pero no se limita a; PD-L1, CTLA4, CD-137 (4-1BB), OX40, GITR, TIM-3, CD73, PD-1, HVEM, y LIGHT. (8) Aumento de la actividad farmacodinamica/farmacocinetica de recNDV mediante ingenieria o expresion de recNDV en celulas que transfieren proteinas a recNDV para reducir la eliminacion por complemento o para disminuir la respuesta inmunitaria adaptativa al NDV.
Tabla 5. Transgenes para la insercion potencial en NDV 73T y sus actividades biologicas
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Ejemplo 15. Terapia contra el cancer que implica la administracion de NDV oncoliticos en combinacion con mAb modulador inmune.
El virus oncolitico NDV se puede administrar de forma concurrente o secuencialmente con anticuerpos terapeuticos o proteinas de fusion agonistas cuando sea apropiado (por ejemplo, anti-PD-Ll, anti-CTLA4, anti-OX40, anti-GITR, anti-TIM-3, anti-PD-1 y anti-ICOS). Se generan datos preclinicos que establecen la dosis y la programacion mas eficaces de las moleculas que mejoran la actividad del NDV en modelos de tumores en combinacion con las nuevas construcciones de NDV descritas en este documento. Los transgenes se pueden insertar en NDV recombinante para la expresion, ya sea individualmente o en combinacion, para administrar multiples modos de actividad, por ejemplo, para mejorar la muerte celular del tumor inducida por las nuevas variantes de NDV. El aumento de la liberacion de antigenos de celulas tumorales combinado con un enfoque inmunomodulador tiene el potencial de aumentar la respuesta inmune adaptativa a estos antigenos de tumores liberados.
Ejemplo 16. La eficiencia de escision de la protei'na F y la actividad de fusion se redujeron en la protei'na F con mutacion R, S o S-KM en el sitio de escision de la protei'na F.
Para entender si la diferencia en el sitio de escision de la proteina F afecta la escision de la proteina F en las celulas infectadas y su impacto en la actividad de fusion, el plasmido de la proteina F se transfecto en celulas 293 para examinar la escision de la proteina F. Ademas, los plasmidos F y HN se cotransfectaron para examinar la actividad de fusion en el ensayo transitorio, ya que tanto las proteinas F como HN son necesarias para la formacion de fusion (Figuras 3B y 3C). La proteina WtF se escindio mediante la proteasa huesped mas eficazmente que la proteina F con la mutacion R, S o S-KM en el sitio de escision de la proteina F, se detecto muy poco producto de escision de la proteina F (F1) en F con el sitio de escision S y no se detecto producto de escision en celulas transfectadas con plasmido F lentogenico. La proteina F de la construccion R y S tiene un sitio de glicosilacion unido a N (NXT) en el sitio de escision, lo que resulta en una movilidad de migracion mas lenta en la SDS-PAGE que en la lento y la S-KM, ya que la mutacion Km elimino el sitio de glicosilacion. Estos datos demostraron que las mutaciones R y S en el sitio de escision de la proteina F afectaron a la escision de la proteina F y que la S-KN es mas eficiente que la S. Dado que el gen F y HN se clonaron en el vector pVitro2-neo-MCS que codifica un gen EGFP, la formacion sincicial puede ser visualizada por las celulas verdes fusionadas. Se observo una gran formacion sincicial en las celulas 293 transfectadas con el plasmido wt F y HN. Todos los mutantes F con residuos R, S o S-KM en los sitios de escision de la proteina F dieron como resultado una formacion sincicial muy reducida.
Ejemplo 17. El virus r73T-R116i con insercion de 198 nt mostro un crecimiento mas lento y un perfil diferencial de sintesis de ARN y proteinas en celulas DF-1 en comparacion con las celulas Vero.
El virus R116i con 198 nt insertado entre la union HN-L mostro una cinetica de crecimiento mas lento en celulas DF-1 de pollo en condiciones de moi alto, como se muestra en las figuras 6B y 6D. La diferencia de crecimiento de R116i con la insercion de 198nt se redujo en comparacion con el virus wt y el virus R que no tiene la insercion inergenica en los puntos de tiempo mas tempranos de la infeccion (10-20 h). En las celulas Vero, la diferencia de crecimiento entre estos virus no era muy evidente (Figuras 6C y 6E). Para comprender si la insercion inergenica en los virus R116i afecto la transcripcion y la replicacion del ARN viral, se examinaron el ARN viral y la sintesis de proteinas en celulas DF-1 infectadas mediante analisis de transferencia Northern y Western, respectivamente (Figuras 6F y 6G). La sintesis de ARN y proteinas de R116i con insercion de 198 nt se redujo en gran medida en las celulas DF-1 infectadas. Por el contrario, en las celulas Vero infectadas, la transcripcion del gen corriente arriba, como el ARNm de NP, aumento considerablemente en las celulas infectadas con R118i-198 o 198RSV, mientras que los ARN genomicos de estos dos virus se redujeron. El nivel de la proteina L de estos dos virus se redujo, pero los otros productos de proteinas virales aumentaron, tal como NP, F y HN, como se muestra en las figuras 6H y I. Los datos obtenidos en las figuras 6F-I se realizaron a condicion alta de moi (moi = 5). La sintesis de ARN y proteinas se evaluo adicionalmente en condiciones bajas de moi (moi = 0.001). Nuevamente, R116i-198 o 198RSV tuvieron un perfil de sintesis de ARN y proteina diferencial en celulas DF-1 y Vero. La sintesis de ambos ARN y proteinas de R116i-198 o 198RSV se redujo en celulas DF-1 de pollo (Figuras 6J). En contraste, el ARN y la proteina de la corriente superior aumentaron en las celulas Vero, pero el nivel de ARNm L y la proteina L se redujeron debido a la insercion intergenica de la secuencia 198nt (Figura 6K). El ARN viral y la sintesis de proteinas se compararon en lineas celulares humanas, fibrosarcoma humano HT1080 y celulas Hela, y celulas DF-1 (Figura 6L). Estos datos confirmaron que R116i-198 o 198RSV tenian expresion diferencial, la sintesis de proteinas y de ARN corriente arriba aumentaba mientras que la expresion de la proteina L tenia inhibida la expresion. Estos datos explicaron por que los virus R116i-198 o 198RSV se replicaron bien en lineas celulares de mamiferos como celulas Vero, humanas HT1080 y Hela, pero no crecieron bien en huevos de pollo embrionados y celulas DF-1 de pollo. Tambien proporciono una base de reduccion de la patogenicidad de los pollos de estos virus R116i, como lo demuestra su bajo valor de indice de patogenicidad intracerebral (ICPI).
Ejemplo 18. La expresion del transgen del GM-CSF del raton tuvo una eficacia de inhibicion del crecimiento tumoral mas baja que la expresion del transgen del GM-CSF humano en R116i-198RSV, pero no en S116-KM.
La figura 11C comparo la contribucion del mGM-CSF con la expresion del transgen hGM-CSF en la actividad oncolitica de R116i-198RSV y S116-KM en el modelo de tumor de raton con xenoinjerto HT1080. El transgen hGM-CSF no reacciona de forma cruzada con mGM-CSF y por lo tanto, fue usado como el control. El transgen mGM-CSF en R116i-198 administrado por via intratumoral tuvo una eficacia menor en la inhibicion del crecimiento tumoral en comparacion con hGM-CSF. Se observo una inhibicion similar del crecimiento tumoral de mGMCSF y hGM-CSF para el virus S116. Los titulos viricos en tumores tratados con virus se determinaron mediante un ensayo de placa (Figura 11D). En el dia 4 posterior a la inyeccion del tumor, se detecto un titulo similar para el R116i-198RSV y S116-KM con los pares mGMCSF o hGM-CSF. Sin embargo, en el dia 7 posterior a la inyeccion, R116i-198RSV con mGM-CSF no se detecto, mientras que R116i-198RSV con hGM-CSF todavia tenia un titulo viral de aproximadamente 4.5 logs/g de tejido. No hubo diferencia en los titulos viricos de S116 con hGM-CSF o mGM-CSF. Estos datos indican que la expresion de mGM-CSF por R116i facilito la eliminacion viral.
Se examino la infiltracion de celulas inmunes en tejidos tumorales infectados con virus (Figura 11E). R116i-198RSV con mGMCSF tenia el mayor numero de celulas de neutrofilos, NK y macrofagos en los tumores tratados en comparacion con R116-198RSV con hGM-CSF y el par S116 hGM-CSF y mGM-CSF. Las citoquinas y las qimioquinas en el tumor tratado con virus se determinaron mediante el ensayo luminex (Figura 11F). Los cuatro virus estimularon la produccion de citoquinas y quimioquinas en muchos pliegues en comparacion con los tejidos tumorales no tratados. La expresion de mGM-CSF por R116i es aproximadamente 10 veces mas alta que S116 (106.7 vs 9.9 veces).
La figura 11G mostro una actividad de inhibicion del crecimiento tumoral similar de R116i con 198 o 318 nt insertados entre la union HN-L que contiene el mismo transgen hGM-CSF en el modelo de tumor de raton con xenoinjerto HT1080. La insercion de 318 nucleotidos en la union HN-L no redujo la actividad del virus oncolitico viral.
Ejemplo 19. Evaluacion de la inactivacion del NDV mediada por el complemento y el papel de las proteinas reguladoras en la evasion del complemento.
El sistema del complemento (C’) es un sistema de defensa importante contra la invasion microbiana en el huesped. Hay alrededor de 30 glucoproteinas diferentes en el sistema del complemento humano, de las cuales 20 actuan en plasma y 10 son reguladores o receptores en las membranas celulares. Los reguladores de C’ unidos a la membrana (RCA) incluyen 4 moleculas bien caracterizadas: hCD46, hCD55, hCD59 y hCD35. Su funcion principal es proteger las celulas humanas contra el ataque autologo del complemento sin afectar el papel de C’ en la eliminacion de agentes extranos. Estas proteinas RCA son especificas de la especie huesped. El NDV usado para terapia viral en el pasado generalmente se producia en huevos de pollo embrionados. Se espera que el virus oncolitico del NDV administrado por inyeccion intravenosa a pacientes con cancer se elimine rapidamente, por lo que se reduce la dosis viral eficaz. Dado que los virus envueltos producidos a partir de celulas humanas incorporan proteinas RCA durante su salida de las celulas infectadas, por lo tanto, es deseable producir NDV en cultivos celulares humanos para reducir la lisis o inactivacion viral mediada por C’.
Se evaluo la sensibilidad de NDV a la inactivacion mediada por C’ examinando el NDV producido en huevos de pollo embrionados, lineas de celulas de suspension humana 293 y Hela S3 (Figura 17). El virus que crecio en los huevos fue sensible a la inactivacion de C', la inhibicion del suero se elimino mediante tratamiento termico (56 °C, durante 30 minutos) del suero. El complemento de cobaya tuvo un nivel similar de efecto de inactivacion viral (datos no mostrados), lo que confirma que la inactivacion viral se debio a C’. Ademas, los virus producidos a partir de celulas Hela fueron mas resistentes a la inactivacion viral mediada por C' humano que las celulas 293 y huevos. De este modo, los datos sugieren que las celulas Hela son mejores que las celulas 293 para la produccion de virus oncoliticos NDV, lo que probablemente resulto en una eliminacion viral mas lenta y, de este modo, aumento el indice terapeutico.
Para explicar por que el NDV producido a partir de las celulas Hela S3 es mas resistente a C’, las lineas celulares de suspension 293 y Hela S se evaluaron para determinar los niveles de las 4 proteinas RCA humanas bien caracterizadas, hCD46, hCD55, hCD59 y hCD35. hCD35 no se detecto en las celulas 293 y Hela por analisis de Western y, por lo tanto, los datos no se muestran en la figura 18. hCD46, hCD55 y hCD59 se detectaron en mayor abundancia en celulas Hela S3 que en celulas 293. De este modo, los niveles de proteinas RCA se correlacionan inversamente con la sensibilidad viral a C’.
Para determinar si las tres proteinas RCA regulan la funcion de C’, se inserto el transgen hCD55, hCD59 o hCD46 en el genoma de NDV mediante genetica inversa y se produjeron virus recombinantes que expresan cada una de las tres proteinas RCA. El analisis de transferencia Western mostro que cada una de estas proteinas RCA se expresaba por virus y se incorporaba en viriones (Figura 19). Se determino que hCD55 es la proteina RCA principal que confiere a la funcion de inactivacion de C’ (Figura 20). El virus que expresa hCD55 producido en huevos con hCD55 incorporado en viriones fue el mas resistente a la inactivacion mediada por C’, que esta muy cerca de los virus producidos en las celulas Hela. En comparacion, la hCD46 tuvo una mejora marginal en terminos de resistencia viral a la inactivacion de C’ y la hCD59 no tuvo un papel detectable en la regulacion de C’.
En conclusion, para reducir la eliminacion viral para la terapia viral oncolitica y para mejorar el indice terapeutico del NDV, las celulas Hela se consideran la linea celular de eleccion para la produccion viral.
Los resultados descritos en este documento se obtuvieron usando los siguientes materiales y metodos.
Celulas y virus.
Se usaron las siguientes lineas celulares y los medios correspondientes: linea celular Vero de rinon de mono verde africano (ATCC) y fibrosarcoma humano (HT1080, ATCC), medio esencial minimo de Eagle (EMEM, Hyclone) con suero bovino fetal al 10% (FBS); linea 51D11 del clon Vero (Medlmmune), medio libre de suero (SFMMegaVir, Hyclone) con glutamina al 1%; las celulas de fibroblastos de piel humana normal (CCD1122Sk, ATCC), medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMEM) con FBS al 10% formulado por ATCC. Los virus de la enfermedad de Newcastle recombinante (NDV) se cultivaron en cavidades alantoicas de huevos de pollo embrionados libres de patogenos especificos (SPF) de 10-11 dias, celulas Vero o 51D11 clon de vero.
Construccion de ADNc antigenomico de NDV y plasmidos de soporte NP, P y L.
El ARN vfrico de la cepa 73T de NDV se obtuvo de Dr. Mark Peeples (Nationwide Children’s Hospital). Las secuencias de NDV (GenBank) se alinearon para obtener secuencias de consenso para disenar oligonucleotidos de ADN para RT-PCR del ARN viral. Se generaron seis fragmentos superpuestos de ADNc subgenomico que abarcan todo el genoma de NDV mediante RT-PCR de alta fidelidad (Figura 1). El vector pUC19 se modifico para incluir un enlazante oligonucleotfdico de 88 nt que contenfa sitios de restriccion introducidos entre los sitios EcoRI y Hindlll para el ensamblaje secuencial de ADNc antigenomico de longitud completa de la cepa NDV 73T. Ademas, el plasmido de ADNc de la cepa 73T (p73T) contiene un promotor de ARN polimerasa T7 de 27 nucleotidos (nt) en el extremo 5’ y un 189 nt que contiene una secuencia de ribozima antigenoma de HDV y una senal de terminacion de la transcripcion de la ARN polimerasa T7 en el extremo 3'. Para generar NDV no virulento, la secuencia que codifica el sitio de escision de la proteasa de la protefna de fusion se modifico mediante mutagenesis dirigida al sitio de la cepa LaSota de NDV no virulenta (lentogenica, lenta) o glucoprotefna B (gB) del citomegalovirus (S116). Para la construccion de plasmidos de expresion NP, P y L, los marcos de lectura abiertos de la protefna (ORF) se amplificaron mediante RT-PCR y se clonaron en el plasmido pCITE2a bajo el control de la ARN polimerasa T7.
Insercion del transgen en el NDV.
Para la insercion de un transgen en la union P-M, se introdujo un sitio de restriccion Afel en nt 3148 en el plasmido subclon que contiene el fragmento Sacll-Pmll (Fig. 2A). El ADNc que codifica el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos de raton o humano (GM-CSF) o interleucina 2 (lL-2) fue optimizado con codones y sintetizado por el ADN 2.0. Un casete de genes contiene el extremo del gen (GE) de N, el inicio del gen (GS) de P y el marco de lectura abierto (ORF) del transgen, que se inserto en el sitio Afel. El fragmento Sacll-Pmll del plasmido resultante se barajo en el plasmido r73T y se nombro como p73T-P1.
Para insertar un transgen en la union HN-L entre HN ORF y la secuencia de la senal de terminacion del gen (GE) de HN, se introdujo un sitio de restriccion Afel en nt 8231 en el plasmido que contiene el fragmento Agel-Xbal (Figura 2A). El casete del gen se genero por PCR usando un par de cebadores antisentido y de sentido de fosfato (Tabla 3) y se inserto en el sitio Afel.
Tabla 3. Secuencias de cebadores oligonucleotfdicos para la insercion de un casete transcripcional de transgen.
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
El fragmento AgI-XbaI del plasmido resultante se barajo en el plasmido p73T, produciendo p73T-HN1. Otra estrategia para insertar la secuencia en la union HN-L fue insertar un casete o secuencias transgenicas de otros paramixovirus entre la senal de terminacion del gen (GE) de la HN y la senal de inicio del gen (GS) de la L (Figura 4) en el sitio AfeI que se introdujo en nt 8359. El plasmido de ADNc de FL se designo p73T-R116i. Dado que la longitud del genoma de NDV tiene que estar en un multiplo de 6 nucleotidos (regla de 6), se hizo que el ADNc antigenomico de diversas construcciones siguiera la regla de 6.
Para insertar dos casetes de transcripcion en la union P-M, se introdujo un sitio AfeI al final del ORF de GM-CSF (nt 3619) (Figura 2B). El ORF de IL-2 se amplifico usando un par de cebadores antisentido y de sentido de fosfato que contenian las secuencias GE y GS y se inserto en el sitio AfeI. El fragmento SacII-PmlI del plasmido resultante, incluidos los casetes transcripcionales de GM-CSF e IL-2, se intercambio de nuevo en el plasmido r73T, produciendo p73T-P2.
Generacion de virus quimericos r73T que contienen ectodominio de otros paramixovirus.
El ADN genomico del NDV quimerico se produjo reemplazando la F y la HN del NDV con las del paramixovirus de paloma 1 (PPMV-1). La secuencia de codificacion C-terminal para la cola citoplasmica y la porcion transmembrana de NDV 73T F (residuos de aminoacidos 503 a 553) se unio con la secuencia de codificacion de la proteina ectodominio F de PPMV-1 (residuos 1 a 502), las secuencias de codificacion N-terminal de NDV HN (residuos de la secuencia de aminoacidos 1 a 45) se fusionaron con la HN (residuos 46 a 577) mediante la superposicion de reacciones de PCR usando el kit GeneArt (Invitrogen). El fragmento amplificado fue digerido y clonado en ADNc de NDV digerido con PmlI-AgeI. El virus de parainfluenza 5 (PIV-5) F o HN se introdujo en el ADNc antigenomico del NDV 73T mediante una estrategia de clonacion similar. El ectodominio PIV5 F (residuos 1 a 486) se fusiono con la transmembrana y la cola citoplasmatica de NDV 73T F (residuos 503 a 553). El NDV HN (residuos 1 a 45) se unio con el ectodominio PIV5 HN (residuos 36 a 565). El fragmento de ADNc se clono en ADNc antigenomico de NDV digerido con PmlI-AgeI.
Recuperacion de NDV recombinante a partir de plasmidos de ADNc transfectados.
La linea celular de mamifero que expresa la ARN polimerasa T7, tal como las celulas BHK-T7, se transfecto con los tres plasmidos que expresan las proteinas NP, P y L del NDV (0.4 mg, 0.4 mg y 0.2 mg por pocillo de una placa de 6 pocillos, respectivamente) y un plasmido que codifica el ADNc antigenomico de NDV (1.6 mg) usando Lipofectamine 2000. Tres dias despues de la transfeccion, el sobrenadante de cultivo celular se inyecto en las cavidades alantoicas de huevos de pollo embrionados SPF de 10 a 11 dias o pasando en celulas Vero para amplificar el virus rescatado. La recuperacion del virus se confirmo mediante un ensayo de hemaglutinacion usando 1% de globulos rojos de pollo (RBC). El rescate de virus tambien se puede realizar por electroporacion de los plasmidos de ADNc antigenomico, NP, P, L, junto con un plasmido que expresa la ARN polimerasa T7 en celulas Vero como se describio anteriormente (Kaur et al., Optimization of plasmid-only rescue of highly attenuated and temperature-sensitive respiratory syncytial virus (RSV) vaccine candidates for human trials. 2008 J. Virol. Methods 153:196-202). El virus recuperado se confirmo mediante secuenciacion de ADNc amplificado por RT-PCR.
Pasaje in vitro para seleccionar virus con sitio estable de escision de la proteina F.
Para examinar si la secuencia de escision de la proteina F (FPCS) era estable y si se podian seleccionar mutaciones estabilizantes despues del pasaje en cultivo de tejidos, r73T-S116 se pasaron en serie 10 veces en celulas Vero y fibrosarcoma humano HT1080 a MOI de 0.01. Despues de cada 2-3 pasajes, se aislo ARN viral de los medios de cultivo, se amplifico el ADNc por RT-PCR y se secuenciaron los genes F y/o HN.
Morfologia de la placa virica en celulas Vero y cuantificacion del titulo por ensayo de placa.
Las celulas Vero en una placa de 6 pocillos se infectaron con virus diluidos en serie y se incubaron con un 1% de revestimiento de metilcelulosa a 37 °C, durante 3 dias o 6 dias para la morfologia de la placa en presencia de tripsina (TrpyLE™, Invitrogen) para cuantificacion del titulo viral. Las monocapas celulares se fijaron con metanol y se tineron con el anticuerpo policlonal anti-NDV de pollo contra el virus NDV inactivado seguido de la exposicion a anticuerpo anti-pollo conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP) (Dako).
Prueba de patogenicidad del virus de pollo por el tiempo medio de muerte del huevo (MDT) y los ensayos de indice de patogenicidad intracerebral (ICPI).
La patogenicidad de los virus r73T se determino mediante la prueba del tiempo medio de muerte (MDT) en huevos de pollo embrionados SPF de 10 dfas. La prueba ICPI en pollos SPF de 1 dfa se realizo en the USDA’s National Veterinary Service Laboratory (NVSL, Ames, Iowa). Para la prueba MDT, se inocularon 0.1 ml de una serie de dilucion de 10 veces entre 10-6 y 10-9 en las cavidades alantoicas de huevos de 8 a 10 de 9 a 10 dfas por dilucion y se incubaron a 37 °C. Los huevos se examinaron dos veces al dfa durante 7 dfas para registrar el momento de la muerte del embrion. El MDT se calculo como el tiempo medio (h) para la dosis letal mfnima de virus para matar a todos los embriones inoculados. El ensayo MDT proporciona una prediccion razonable de la patogenicidad del virus. Los virus con MDT <60 h son normalmente cepas verogenicas (virulentas); con MDT = 60 a 90 h, cepas mesogenicas (intermedias); > 90 h como cepas letogenicas (avirulentas). Para la prueba ICPI, se inocularon 0.05 ml de una dilucion 1:10 de lfquido alantoico infeccioso nuevo para cada virus en el grupo de 10 pollos SPF de 1 dfa a traves de la vfa intracerebral. Las aves se observaron para los smtomas clfnicos y la mortalidad una vez cada 8 horas durante un perfodo de 8 dfas. En cada observacion, las aves se calificaron de la siguiente manera: 0 si es normal, 1 si esta enfermo y 2 si esta muerto. El ICPI es la media de la puntuacion por ave por observacion durante el perfodo de 8 dfas. Los valores de ICPI van desde 0.0 a 2.0. El bajo virulento (LoND): ICPI <0.7; virulento (vND): ICPI>0.7.
La muerte de las celulas vfricas se evaluo mediante un ensayo de viabilidad celular.
Las celulas se sembraron en placas de 96 pocillos a 5 x 103 celulas/pocillo durante la noche se infectaron con r73T a diversos MOI. La viabilidad celular se determino mediante el kit CellTiter Glo (Promega) segun el manual del fabricante. El porcentaje relativo de celulas supervivientes se determina comparando el nivel de ATP de cada muestra de prueba con el control de muestra no tratada de 100% viable. Los datos presentados en la tabla son el porcentaje relativo de las celulas muertas.
El efecto del NDV en la muerte tumoral se evaluo en el modelo de xenoinjerto subcutaneo HT1080.
Se implantaron subcutaneamente (s.c.) ratones atfmicos desnudos homogeneos de NCR (Taconic) con 5 x 106 celulas HT1080 (en 100 ml de PBS) en un flanco. El tratamiento viral comenzo cuando los tumores alcanzaron un volumen de 65-300 mm3. Se administro 73T recombinante en 100 ml a diferentes niveles de dosis ya sea localmente mediante inyeccion intratumoral (i.t) o sistemicamente mediante inyeccion intratumoral (i.t) en la vena de la cola, respectivamente. Los animales de control se inyectaron solo con 100 ml de PBS. El crecimiento del tumor se midio usando un calibrador digital, y el volumen del tumor se calculo como 0.5 x (altura) x ancho x largo (mm3). Los ratones se sacrificaron cuando el peso corporal se redujo en un 20% del peso corporal original o el volumen del tumor supero los 2000 mm3.
Biodistribucion viral en ratones con xenoinjerto HT1080.
Se inyectaron i.v. nueve ratones desnudos que portaban tumores subcutaneos de xenoinjerto de fibrosarcoma humano HT1080 con 108 pfu de r73T-R116i-hGM-CSF. Tres ratones se terminaron a 1, 4 y 8 dfa (s) despues de la inyeccion. Un raton inyectado con PBS se termino el dfa 8. Se recogieron muestras de tumores, pulmones, bazo, ovarios y suero. El tftulo de virus infeccioso en los homogeneizados de tejido se cuantifico mediante ensayo de placa.
Cuantificacion del nivel de protefna GM-CSF por ELISA.
Los tumores de ratones infectados con NDV e inyectados con PBS se homogeneizaron en PBS usando un disociador de MACS suave (Miltenyi Biotec) segun las instrucciones del fabricante. El sobrenadante de tejidos homogeneizados o suero recogido de ratones se analizo para determinar el nivel de GM-CSF mediante un kit ELISA Duoset (R&D).
Analisis estadfstico
Todos los analisis estadfsticos se realizaron usando el software GraphPad Prism 6.0. La prueba t no pareada se uso para evaluar las diferencias en la regresion del tumor entre los grupos. El software GraphPad Prism tambien se uso para calcular la IC50 de rNDV 73T para la muerte de celulas in vitro en celulas normales y tumorales.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una cepa 73T del virus de la enfermedad de Newcastle atenuado (NDV) en la que se modifica el sitio de escision de la protefna F de tipo salvaje (FPCS) que tiene la secuencia de aminoacidos 111G-R-R-Q-K-R/F117, y en la que la secuencia de escision de la protefna F modificada (FPCS) comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
S116: 111H-N-R-T-K-S/F117;
S116K: 111H-N-K-T-K-S/F117;
S116M: 111H-N-R-M-K-S/F117;
S116KM: 111H-N-K-M-K-S/F-I118; y
R116: 111H-N-R-T-K-R/F-I118.
2. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado de la reivindicacion 1, en el que el FPCS modificada es R116: 111H-N-R-T-K-R/F-I118.
3. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado de la reivindicacion 1 o 2, en el que el virus comprende una region intergenica HN-L aumentada que comprende una secuencia no codificante entre 50 y 300 nucleotidos de longitud.
4. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado de la reivindicacion 3, en el que la secuencia no codificante se deriva de un paramixovirus tipo -1 (APMV-1), un virus sincitial respiratorio (RSV) o una secuencia aleatoria.
5. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado de la reivindicacion 3 o 4, en el que la secuencia no codificante tiene una longitud de 60, 102, 144 o 198 nucleotidos.
6. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el virus comprende una o mas secuencias de polinucleotidos heterologas insertadas en la union P-M.
7. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado de la reivindicacion 6, en el que las secuencias de polinucleotidos heterologas codifican una citoquina, un ligando de la superficie celular y/o una quimiocina.
8. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado de la reivindicacion 7, en el que la citoquina se selecciona del grupo que consiste en GM-CSF, IL-2, IL-21, IL-15, IL-12, y IL-12p70.
9. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado de la reivindicacion 8, en el que la citoquina es GM-CSF humano.
10. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el FPCS modificada es R116: 111H-N-R-T-K-R/F-I118, la secuencia no codificante tiene una longitud de 198 nt, y la secuencia de polinucleotidos heterologa codifica GM-CSF humano.
11. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10 para usar en un metodo de tratamiento del cancer.
12. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado para uso de la reivindicacion 11, en el que el virus mata selectivamente celulas tumorales, en el que el virus contacta con una celula tumoral.
13. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado para uso de la reivindicacion 11, en el que el virus induce la regresion del tumor en un sujeto, en el que el virus entra en contacto con una celula tumoral.
14. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado para uso de las reivindicaciones 11 a 13, en el que el cancer es un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer de vejiga, ovario, cerebro, pancreas, prostata, sarcoma, pulmon, mama, cuello uterino, hueso, hfgado, cabeza y cuello, gastrico, rinon, linfoma, leucemia, tiroides, colon, colorrectal y melanoma.
15. El virus de la enfermedad de Newcastle atenuado para uso de las reivindicaciones 11 a 14, en el que el virus de la enfermedad de Newcastle atenuado se administra por vfa intravenosa, sistemica, intraperitoneal o intratumoral.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2529747T (pt) 2005-12-02 2018-05-09 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
EP2987856B1 (en) 2009-02-05 2018-07-25 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
GEP20196976B (en) 2013-03-14 2019-06-10 Sloan Kettering Cancer Center Memorial Newcastle disease viruses and uses thereof
CA2922071C (en) * 2013-09-03 2022-05-03 Medimmune Limited Compositions featuring an attenuated newcastle disease virus and methods of use for treating neoplasia
EP3441084A1 (en) 2014-02-27 2019-02-13 Viralytics Limited Oncolytic virus and immuno-stimulatory agent for combined use in the treatment of cancer
US10563178B2 (en) * 2015-04-28 2020-02-18 University Of Georgia Research Foundation, Inc. PIV5-based amplifying virus-like particles
EP3246410A1 (en) * 2016-05-19 2017-11-22 Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München Vsv/ndv hybrid viruses for oncolytic therapy of cancer
KR101964610B1 (ko) * 2017-03-13 2019-04-03 대한민국 신규한 종양용해성 바이러스 및 이의 용도
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
CN107254450A (zh) * 2017-07-20 2017-10-17 扬州大学 克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株及构建方法
CN108486279A (zh) * 2017-09-21 2018-09-04 山东省农业科学院家禽研究所 一种基于荧光定量pcr技术检测鸽新城疫病毒的方法
EP3552608A1 (en) * 2018-04-09 2019-10-16 Rapo Yerape B.H. Ltd Increased activity of oncoloytic newcastle disease virus
US20200297787A1 (en) * 2018-07-13 2020-09-24 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Apmv and uses thereof for the treatment of cancer
CN110859968A (zh) * 2019-11-21 2020-03-06 四川安可康生物医药有限公司 激活对肿瘤的系统免疫反应的基因生物药物
CN115197949A (zh) * 2021-04-13 2022-10-18 江苏康缘瑞翱生物医药科技有限公司 一种重组新城疫病毒rNDV-OX40L、其基因组、制备方法及其用途

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7724558B1 (en) * 1999-03-19 2010-05-25 Nec Corporation Magnetic signal transmission line
ATE451835T1 (de) * 1999-09-24 2010-01-15 Mayo Foundation Therapeutische verfahren und zusammensetzungen unter verwendung von viren der rekombinanten familie der paramyxoviridae
KR100801180B1 (ko) * 2006-09-26 2008-02-05 주식회사 고려비엔피 약독화된 재조합 뉴캐슬병 바이러스 및 이를 함유하는뉴캐슬병 백신
EP2085092A1 (en) * 2008-01-29 2009-08-05 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Attenuated oncolytic paramyxoviruses encoding avian cytokines
US20090208495A1 (en) 2008-02-14 2009-08-20 Bayer Schering Pharma Ag Anti-tumor effective paramyxovirus
EP2987856B1 (en) * 2009-02-05 2018-07-25 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
GEP20196976B (en) * 2013-03-14 2019-06-10 Sloan Kettering Cancer Center Memorial Newcastle disease viruses and uses thereof
CA2922071C (en) * 2013-09-03 2022-05-03 Medimmune Limited Compositions featuring an attenuated newcastle disease virus and methods of use for treating neoplasia
CN109099045A (zh) * 2018-10-30 2018-12-28 浙江斯泰新材料科技股份有限公司 防松锁固型螺钉

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Publication number Publication date
AU2014317215A8 (en) 2016-04-21
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KR102285894B1 (ko) 2021-08-04
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WO2015032755A1 (en) 2015-03-12
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