RS63291B1

RS63291B1 - Sastavi koji sadrže oslabljeni virus njukastl bolesti i postupci upotrebe za tretiranje neoplazije

Info

Publication number: RS63291B1
Application number: RS20220481A
Authority: RS
Inventors: Hong Jin; Danielle Carroll; Matthew Mccourt; Xing Cheng; Mark Galinski
Original assignee: Medimmune Ltd
Priority date: 2013-09-03
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2022-06-30
Also published as: HK1231393A1; AU2019204419B2; RS58332B1; CN106163532A; AU2014317215C1; WO2015032755A1; SI3508209T1; EA201690425A1; LT3508209T; PT3041490T; SI3041490T1; HRP20190250T1; EA202191926A2; KR20210048605A; PL3041490T3; EA202191926A3; ES2708755T3; ME03345B; KR102285894B1; CY1121993T1

Description

Opis

UNAKRSNA REFERENCA NA POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava se nadovezuje na U.S. privremenu prijavu serijski br.61/873,039, koja je podneta 3. septembra 2013.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Virus Njukastl bolesti (NDV) je virus kod ptica koji kod ptica izaziva zaraznu bolest koja pogađa mnogo domaćih i divljih vrsta. Izlaganje ljudi zaraženim pticama (npr., u postrojenjima za obradu živine) može izazvati umereni konjunktivitis i simptome nalik influenci, osim toga NDV ne predstavlja opasnost po zdravlje ljudi i većina ljudi je seronegativno na NDV. Na osnovu virusne patogenosti kod kokošaka, NDV patogenost je klasifikovana kao visoka (velogeni), srednja (mezogeni) i niska (lentogeni) kao što je određeno sa indeksom intracerebralne patogenosti (ICPI) Usled poljoprivrednih problema, mezogeni i velogeni NDV koji ima virulenciju kod kokošaka (ICPI>0.7) klasifikovan je od strane USDA kao „sredstva za biranje“ od 2008. Sredstva za biranje i lista toksina obuhvataju biološka sredstva koja imaju potencijal da predstave ozbiljnu pretnju za ljudsko i životinjsko zdravlje, zdravlje biljaka ili za životinjske ili biljne proizvode.

[0003] Prirodni oblici NDV su bili korišćeni u kliničkim ispitivanjima kao imunoterapeutski i viroterapeutski biologik. NDV pokazuje potencijal kao sredstvo protiv raka zato što virus ima sposobnost da selektivno ubija ćelije ljudskog tumora sa ograničenom toksičnosti za normalne ćelije. Međutim, usled reklasifikacije NDV kao sredstva za biranje, razvoj NDV kao sredstva protiv raka nije uspeo da napreduje. Drugi onkolitički virusi pokazali su značajni potencijal u kliničkim probama. Za olakšavanje razvoja NDV kao terapije za rak, novi oblici virusa su potrebni. Idealno, takvi novi oblici bi zadržali svoju sposobnost da ciljaju ćelije tumora, ali više ne bi izazivali bolest kod ptica.

REZIME PRONALASKA

[0004] Pronalazak je izložen u priloženom skupu zahteva.

[0005] Kao što je opisano ispod, predmetni pronalazak obuhvata sastave i njihovu upotrebu u postupcima za tretiranje neoplazije.

[0006] U jednom aspektu, pronalazak uopšteno pruža oslabljeni virus Njukastl bolesti (NDV) koji ima mesto deljenja F proteina NDV LaSota sorte ili glikoprotein B (gB) ili citomegalovirus (CMV) (S116). Modifikovana sekvenca deljenja F proteina (FPCS) ima jednu od sledećih modifikacija sekvence S116:<111>H-N-R-T-K-S/F<117>; S116K:<111>H-N-K-T-K-S/F<117>;S116M:<111>H-N-R-M-K-S/F<117>;S116KM:<111>H-N-K-M-K-S/F-I<118>;ili R116:<111>H-N-R-T-K-R/F-I<118>. Oslabljeni soj virusa iz pronalaska je modifikovani 73T soj. U još jednom otelotvorenju, oslabljeni NDV virus je r73T-R116 virus. U daljim otelotvorenjima, virus ima povišeni HN-L intergenski region. U još nekim otelotvorenjima, HN-L intergenski region nekodirajuća sekvenca između bar oko 50-300 amino nukleotida u dužini. U daljim otelotvorenjima, ne-kodirajuća sekvenca je izvedena iz paramiksovirusa tipa -1 (APMV-1), respiratornog sincicijskog virusa (RSV) ili nasumična sekvenca. U još jednom otelotvorenju, HN i L intergenska ne-kodirajuća sekvenca je 60, 102, 144, 198, ili 318 nt u dužini. Virus iz pronalaska ima jednu ili više heterolognih polinukleotidnih sekvenci unetih u P-M spoj. U drugim otelotvorenjima, heterologna polinukleotidna sekvenca je transgen koji kodira polipeptid koji poboljšava onkolitička svojstva virusa. U još jednom otelotvorenju, transgen kodira citokin, ligand ćelijske površine i/ili hemokin. U drugim otelotvorenjima, citokin je izabran iz grupe koju čine GM-CSF, IL-2, IL-21, IL-15, IL-12, i IL-12p70. U konkretnim otelotvorenjima, citokin je ljudski GM-CSF. Dalje je obelodanjeno da je heterologna polinukleotidna sekvenca transgen koji kodira detektabilni deo. Opciono, nivo ispoljavanja detektabilnog dela je u vezi sa replikacijom virusa. Dalje je obelodanjeno da su F i HN geni NDV zamenjeni sa odgovarajućim vanćelijskim domenima Parainfluenca virusa 5 (PIV 5) kod pasa ili paramiksovirusa tipa 1 kod golubova (PPMV-1). U drugom konkretnom otelotvorenju, virus je 73T-R116i-hGM-CSF. U drugim otelotvorenjima, oslabljeni virus ima srednju vrednost vremena umiranja u jajima (MDT) veću od 90h ili oko 90-156 sati. U drugom otelotvorenju oslabljeni virus ima indeks intracerebralne patogenosti između oko 00.7. U dodatnim otelotvorenjima, oslabljeni virus ima indeks intracerebralne patogenosti između od oko 0. U još jednom otelotvorenju, oslabljeni virus ima manje od oko 15% citotoksičnosti u HT1080 ćelijama. U daljim otelotvorenjima, oslabljeni virus selektivno ubija ćelije tumora sa efikasnošću ubijanja od bar 10 ili 15%. U drugom otelotvorenju, efikasnost ubijanja ćelija tumora je između oko 75%-100%.

[0007] Drugi aspekt pronalaska generalno obuhvata virus iz pronalaska za upotrebu u postupku za selektivno ubijanje ćelija tumora, koji obuhvata dovođenje ćelije tumora u dodir sa ovde opisanim oslabljenim virusom Njukastl bolesti. U drugom otelotvorenju pronalaska, ćelija tumora je ćelija raka bešike, jajnika, mozga, pankreasa, prostate, sarkoma, pluća, dojke, grlića materice, jetre, glave i vrata, želuca, bubrega, melanoma, limfoma, leukemije, štitne žlezde, debelog creva i ćelije raka melanoma. U drugom otelotvorenju, postupak obuhvata davanje ispitaniku delotvorne količine ovde opisanog oslabljenog virusa Njukastl bolesti. U drugom otelotvorenju, oslabljeni virus Njukastl bolesti se isporučuje sistemski, intraperitonealno ili intratumorno. U daljim otelotvorenjima, virus se daje pri dozi od oko 10<7>pfu do oko 10<9>pfu. U dodatnim otelotvorenjima, virus se daje intravenozno pri dozi od oko 10<9>pfu do oko 10<11>pfu. U daljim otelotvorenjima, ispitanik ima rak izabran iz grupe koju čine rak bešike, jajnika, mozga, pankreasa, prostate, sarkom, pluća, dojke, grlića materice, jetre, glave i vrata, želuca, bubrega, melanom, limfom, leukemija, štitne žlezde i rak melanoma.

[0008] U još jednom aspektu, obelodanjivanje generalno obuhvata postupak za tretiranje neoplazije kod ispitanika koji je razvio anti-NDV imunski odgovor, postupak obuhvata davanje ispitaniku delotvornu količinu ovde opisanog oslabljenog himernog virusa Njukastl bolesti, gde je virus himerni virus koji sadrži F i/ili HN gen Parainfluenca virusa 5 kod pasa (PIV 5) ili paramioksivirus tipa 1 kod golubova (PPMV-1), gde se himerni virus Njukastl bolesti antigenski razlikuje od NDV. U jednom otelotvorenju obelodanjivanja, postupak povećava nivo onkolitičkih virusa prisutnih u ispitaniku relativno u odnosu na nivo onkolitičkih virusa prisutnih u kontrolnom ispitaniku koji je razvio anti-NDV imunski odgovor, ali koji ne prima himerni virus Njukastl bolesti.

Definicije

[0009] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju značenje uopšteno prihvaćeno od strane stručne osobe u struci kojoj ovaj pronalazak pripada. Sledeće reference pružaju stručnjaku opšte definicije više termina koji se koriste u ovom pronalasku: Singleton i dr., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2. izd.

1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker izd., 1988); The Glossary of Genetics, 5. izd., R. Rieger i dr. (ured.), Springer Verlag (1991); i Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Kao što se ovde koristi, sledeći termini imaju značenja pripisana onima ispod, ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0010] „Oslabljeni virus Njukastl bolesti“ označava virus Njukastl bolesti koji selektivno ubija ćelije tumora ali ne predstavlja pretnju za živinu. U jednom otelotvorenju, oslabljeni Njukastl bolesti virus ima ICPI manji od oko 0.4 ili 0.7. U drugim otelotvorenjima, oslabljeni Njukastl bolesti virus ima ICPI između oko 0 ili 0.1.

[0011] Pod „heterolognom polinukleotidnom sekvencom“ podrazumeva se rekombinantni polinukleotid koji nije prisutan u stanju divljeg tipa.

[0012] Pod „detektabilnom oznakom“ podrazumeva se sastav koji kada je povezan sa molekulom od interesa čini potonji detektabilnim, putem spektroskopnih, fotohemijskih, biohemijskih, imunohemijskih ili hemijskih sredstava. Na primer, korisne oznake obuhvataju radioaktivne izotope, magnetna zrna, metalna zrna, koloidne čestice, fluorescentne boje, reagense guste sa elektronima, enzime (na primer, kao što se obično koriste u ELISA), biotin, digoksigenin ili haptene.

[0013] Pod „sredstvom“ podrazumeva se bilo koje hemijsko jedinjenje malih molekula, antitelo, molekul nukleinske kiseline, ili polipeptid ili njegovi fragmenti.

[0014] Pod „izmenjivanjem“ ili „izmenom“ označava se povišenje ili sniženje. Izmenjivanje može biti onoliko malo kao što je 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, ili za 40%, 50%, 60%, ili čak i onoliko za 70%, 75%, 80%, 90%, ili 100%.

[0015] Kao što se ovde koristi, termin „antitelo“ odnosi se na polipeptid ili grupu polipeptida koja se sastoji od bar jednog vezujućeg domena koji je formiran savijanjem polipeptidnih lanaca koji imaju trodimenzione prostore vezivanja sa oblicima unutrašnje površine i distribucijom izmena komplementarnom sa svojstvima antigenske determinante antigena. Antitelo obično ima tetramerni oblik, koji sadrži dva identična dela polipeptidnog lanca, svaki par ima jedan „laki“ i jedan „teški“ lanac. Varijabilni region ili polipeptidi varijabilnog lanca, svakog para lakog/teškog lanca formiranju mesto vezivanja antitela.

[0016] Termin „mAb“ odnosi se na monoklonsko antitelo. Antitela prema obelodanjivanju obuhvataju bez ograničenja cela izvorna antitela, bispecifična antitela; himerna antitela; Fab, Fab’, fragmente jednolančanog V regiona (scFv), fuzione polipeptide i nekonvencionalna antitela.

[0017] Pod „biološkim uzorkom“ podrazumeva se uzorak dobijen iz ispitanika koji obuhvata uzorak porekla iz biološkog tkiva ili tečnosti, dobijen ili sakupljen in vivo ili in situ. U konkretnim otelotvorenjima, biološki uzorak obuhvata bilo koju ćeliju, tkivo, tečnost ili drugi materijal izveden iz organizma.

[0018] Pod „reagensom za hvatanje“ podrazumeva se reagens koji se specifično vezuje za molekul nukleinske kiseline ili polipeptid za odabiranje ili izolovanje molekula nukleinske kiseline ili polipeptida.

[0019] Pod „kliničkom agresivnošću“ podrazumeva se ozbiljnost neoplazije. Agresivna neoplazija ima veću verovatnoću da metastazira od manje agresivne neoplazije. Dok su konzervativni postupci tretiranja odgovarajući za manje agresivnu neoplaziju, agresivnija neoplazija zahteva agresivnije režime tretiranja.

[0020] Kao što se ovde koristi, termini „određivanje“, „procenjivanje“, „ispitivanje“, „merenje“ i „detektovanje“ odnose se na oba, kvantitativno i kvalitativno određivanje, i kao takav, termin „određivanje“ koristi se naizmenično sa „ispitivanje“, „merenje“ i sličnim. Kada je namenjeno kvantitativno određivanje, fraza „određivanje količine“ analiza i slično se koristi. Kada je namenjeno kvalitativno i/ili kvantitativno određivanje, fraza „određivanje nivoa“ analiza ili „detektovanje“ analita se koristi.

[0021] Termin „ispitanik“ ili „pacijent“ odnosi se na životinju koja je objekat tretiranja, praćenja ili eksperimenta. Samo putem primera, ispitanih obuhvata, ali nije ograničen na, sisara, uključujući, ali bez ograničavanja, čoveka ili sisara koji nije čovek, kao što je primat koji nije čovek, miš, govedo, konj, pas, ovca ili mačka.

[0022] Termin „sniziti“ ili „povisiti“ označava negativno ili pozitivno menjanje, respektivno. Izmenjivanje može biti za 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75%, ili čak za 100%.

[0023] Pod „referencom“ podrazumeva se standard za poređenje.

[0024] Pod „periodičnim“ podrazumeva se pri regularnim intervalima. Periodično praćenje pacijenta obuhvata, na primer, raspored testova koji se vrše dnevno, dvo-nedeljno, dvomesečno, mesečno, dva puta godišnje ili godišnje.

[0025] Pod „ozbiljnošću neoplazije“ podrazumeva se stepen patologije. Ozbiljnost neoplazije povećava se, na primer, kako se stadijum ili nivo neoplazije povećava.

[0026] Molekuli nukleinske kiseline koji su od koristi u postupcima iz obelodanjivanja obuhvataju molekul nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptid iz obelodanjivanja ili njegov fragment. Takvi molekuli nukleinske kiseline ne moraju biti 100% identični sa endogenom sekvencom nukleinske kiseline, ali će obično pokazati suštinsku identičnost. Polinukleotidi koji imaju „suštinsku identičnost“ sa endogenom sekvencom su obično u stanju da hibridizuju bar jedan lanac molekula dvolančane nukleinske kiseline. Pod „hibridizovanjem“ podrazumeva se da par formira dvolančani molekul između komplementarnosti polinukleotidnih sekvenci (npr., ovde opisani gen), ili njihovih delova, pod različitim uslovima strogosti. (Videti, npr., Wahl, G. M. i S. L. Berger (1987) Methods Enzymol.

152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol.152:507).

[0027] Na primer, stroga koncentracija soli će obično biti manja od oko 750 mM NaCl i 75 mM trinatrijum citrata, poželjno manja od oko 500 mM NaCl i 50 mM trinatrijum citrata, i još poželjnije manja od 250 mM NaCl i 25 mM trinatrijum citrata. Hibridizacija niske strogosti može biti dobijena u odsustvu organskog rastvarača, npr., formamida, dok se hibridizacija visoke strogosti može dobiti u prisustvu bar oko 35% formamida, i još poželjnije bar oko 50% formamida. Strogi uslovi temperature će obično obuhvatati temperature od bar oko 30° C, još poželjnije od bar oko 37° C, i najpoželjnije od bar oko 42° C. Menjanje dodatnih parametara, kao što su vreme hibridizacije, koncentracija deterdženta, npr., natrijum dodecil sulfat (SDS), i uključenje ili isključenje nosača DNK, dobro je poznatih stručnima u ovoj oblasti. Različiti nivoi strogosti ostvaruju se kombinovanjem ovih različitih uslova po potrebi. U poželjnom otelotvorenju, hibridizacija se vrši pri 30° C u 750 mM NAcl, 75 mM trinatrijum citrata, i 1% SDS. U poželjnijem otelotvorenju, hibridizacija se vrši pri 37° C u 500 mM NAcl, 50 mM trinatrijum citrata, 1% SDS, 35% formamida, i 100 µg/ml DNK denaturisane sperme lososa (ssDNK). U najpoželjnijem otelotvorenju, hibridizacija se vrši pri 42° C u 250 mM NAcl, 25 mM trinatrijum citrata, 1% SDS, 50% formamida, i 200.mu.g/ml ssDNK. Korisne varijacije ovih uslova će jednostavno biti očigledne stručnjaku u ovoj oblasti.

[0028] Za većinu primena, koraci ispiranja koji slede hibridizaciji će se takođe razlikovati u strogosti. Uslovi strogosti ispiranja mogu biti definisane sa koncentracijom soli i sa temperaturom. Kao iznad, strogost ispiranja može biti povišena snižavanjem koncentracije soli ili povišenjem temperature. Na primer, stroga koncentracija soli za korake ispiranja poželjno će biti manja od oko 30 mM NaCl i 3 mM trinatrijum citrata, i najpoželjnije manja od 15 mM NaCl i 1.5 mM trinatrijum citrata. Strogi uslovi temperature za korake ispiranja će obično obuhvatati temperaturu od bar oko 25°C, još poželjnije od bar oko 42° C, i čak još poželjnije od bar oko 68° C U poželjnom otelotvorenju, koraci ispiranja se vrše pri 25° C u 30 mM NaCl, 3 mM trinatrijum citrata, i 0.1% SDS. U poželjnijem otelotvorenju, koraci ispiranja se vrše pri 42° C u 15

nM NaCl, 1.5 mM trinatrijum citrata, i 0.1% SDS. U poželjnijem otelotvorenju, koraci ispiranja se vrše pri 68° C u 15 mM NAcl, 1.5 mM trinatrijum citrata, i 0.1% SDS. Dodatne varijacije ovih uslova će jednostavno biti očigledne stručnjaku u ovoj oblasti. Tehnike hibridizacije dobro su poznate stručnima u ovoj oblasti i opisane su, na primer, u Benton i Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel i dr. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger i Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); i Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

[0029] Pod „suštinski identičnim“ podrazumeva se polipeptid ili molekul nukleinske kiseline koji pokazuje bar 50% identičnosti sa referentnom aminokiselinskom sekvencom (na primer, bilo koja od ovde opisanih aminokiselinskih sekvenci) ili sekvencom nukleinske kiseline (na primer, bilo koja od ovde opisanih sekvenci nukleinske kiseline). Poželjno, takva sekvenca je bar 60%, poželjnije 80% ili 85%, i još poželjnije 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili čak 99% ili više identična sa nivoom amino kiseline ili nukleinske kiseline do sekvence korišćene za poređenje.

[0030] Identičnost sekvence obično se meri upotrebom softvera za analizu sekvence (na primer, Sequence Analysis Software paket od Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis.53705, BLAST, BESTFIT, GAP, ili PILEUP/PRETTYBOX programi). Takvi softveri poklapaju identične ili slične sekvence dodeljivanjem stepena homologije različitim zamenama, brisanjima, i/ili drugim izmenama. Konzervativne zamene obično obuhvataju zamene unutar sledećih grupa: glicin, alanin; valin, izoleucin, leucin; asparginova kiselina, glutaminska kiselina, asparagin, glutamin; serin, treonin; lizin, arginin; i fenilalanin, tirozin. U primernom pristupu za određivanje stepena identičnosti, BLAST program može biti korišćen, sa ocenom verovatnoće između e<-3>i e<-100>što ukazuje na blisko povezanu sekvencu.

[0031] Kao što se ovde koristi, „suštinski čist“ označava da je vrsta od interesa prevashodno prisustva vrsta (tj., na molarnoj osnovi obilnija je od bilo kojih drugih pojedinačnih vrsta u sastavu), i poželjno suštinski prečišćena frakcija je sastav gde ciljane vrste čine bar oko 50 procenata (na molarnoj osnovi) svih prisutnih makromolekularnih vrsta. Uopšteno, suštinski čist sastav sadržaće više od oko 80 procenata svih prisutnih makromolekularnih vrsta u sastavu, poželjnije više od oko 85%, 90%, 95% i 99%. Najpoželjnije, vrste od interesa su prečišćene do suštinske homogenosti (vrste koje su zagađivači ne mogu biti detektovane u sastavu sa konvencionalnim postupcima detekcije) gde se sastav suštinski sastoji od jedne makromolekularne vrste.

[0032] Kao što se ovde koristi, termini „lečenje“, „tretira“, „tretiranje“, i slično odnose se na smanjivanje ili poboljšavanje poremećaja i/ili simptoma povezanih sa njim. Biće prihvaćeno da, iako nije isključeno, tretiranje poremećaja ili stanja ne zahteva da poremećaj, stanje ili simptomi povezani sa njima moraju biti u potpunosti uklonjeni. Stoga, uspešno tretiranje može produžiti preživljavanje pacijenta ili ublažiti nepoželjni simptom.

[0033] Kao što se ovde koristi, termini „sprečiti“, „sprečava“, „sprečavanje“, „profilaktičko tretiranje“ i slično odnose se na smanjivanje verovatnoće od razvijanja poremećaja ili stanja kod ispitanika, koji nema, ali je pri riziku od podložnosti za razvijanje poremećaja ili stanja.

[0034] Doza se odnosi na pojedinačno davanje terapeutskog sastava. Doza se odnosi na količinu terapeutski aktivnog molekula u dozi. Režim tretiranja odnosi se na doziranje, raspored i režim davanja jedne ili više doza. Ciklus se odnosi na ponovljivu jedinicu jedne ili više doza unutar režima tretiranja. U nekim režimima tretiranja doziranja su uniformna za svaku dozu. U drugim režimima tretiranja, doziranja ne moraju biti uniformna. Na primer, jedna ili više doza za punjenje može biti korišćena za povišenje koncentracije terapeutskog molekula do željenog nivoa kod pacijenta. Doze za punjenje mogu biti praćene sa jednom ili više poza za održavanje, koje uopšteno sadrže niže doze (na primer jedna polovina ili manje od doze za punjenje) koje su dovoljne za održavanje željene koncentracije terapeutskog molekula u pacijentu. Jedna ili više sužena doza može biti korišćena za postepeno smanjenje koncentracije terapeutskog molekula u pacijentu.

[0035] Pod „specifično se vezuje“ podrazumeva se jedinjenje (npr., antitelo) koje prepoznaje i vezuje molekul (npr., polipeptid), ali koje suštinski ne prepoznaje i ne vezuje se za druge molekule.

[0036] Ukoliko nije naročito naznačeno ili očigledno iz konteksta, kao što se ovde koristi, termin „oko“ prihvaćen je kao unutar opsega normalne tolerancije u tehnici, na primer unutar 2 standardne devijacije u odnosu na srednju vrednost. Oko se može shvatiti kao unutar 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, ili 0.01% navedene vrednosti. Ukoliko u suprotnom nije jasno iz konteksta, sve ovde date numeričke vrednosti su modifikovane sa terminom oko.

[0037] Ovde dati opsezi prihvaćeni su da budu stenografski za sve vrednosti unutar opsega. Na primer, opseg od 1 do 50 je prihvaćen da obuhvata bilo koji broj, kombinaciju brojeva, ili pod-opseg iz grupe koju čine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50.

[0038] Bilo koja jedinjenja, sastavi ili ovde dati postupci mogu biti kombinovani sa jednim ili više od drugih sastava i ovde datih postupaka.

[0039] Kao što se ovde koristi, oblici jednine „a“, „an“ i „the“ uključuju oblike množine ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Stoga, na primer, referenca na „biomarker“ obuhvata referencu na više od jednog biomarkera.

1

[0040] Ukoliko nije naročito naznačeno ili očigledno iz konteksta, kao što se ovde koristi, termin „ili“ je shvaćen kao da je uključen.

[0041] Termin „uključujući“ ovde se koristi da označi, i korišćen je naizmenično sa frazom „uključujući ali ne ograničavajući se na.“

[0042] Kao što se ovde koristi, termini „obuhvata“, „obuhvatajući“, „sadrži“, „ima“ i slično mogu imati značenje njima pripisano u patentnom pravu SAD i mogu označavati „obuhvata“, „koji obuhvata“ i slično; „sastoji se suštinski od“ ili „suštinski sadrži“ slično ima značenje pripisano u patentnom pravu SAD i termin je otvoren, omogućujući prisustvo više od onoga što je navedeno sve dok osnovne ili nove karakteristike navedenog nisu izmenjene prisustvom više od jednog navedenog, ali izdvaja otelotvorenja prethodnog stanje tehnike.

SEKVENCE

[0043] Primerna nukleotidna sekvenca NDV virusa 73T pune dužine je:

�

[0044] Primerna nukleotidna sekvenca proteina wt F je, gde podvučena sekvenca označava nukleotidnu sekvencu mesta deljenja F proteina:

1

[0045] Primerna amino kiseline sekvenca F proteina divljeg tipa gde podvučena sekvenca označava aminokiselinsku sekvencu mesta deljenja F proteina:

[0046] Primerna nukleotidna sekvenca mišjeg GM-CSF je:

[0047] Primerna aminokiselinska sekvenca mišjeg GM-CSF je:

[0048] Primerna nukleotidna sekvenca ljudskog GM-CSF je:

[0049] Primerna aminokiselinska sekvenca ljudskog GM-CSF je:

1

KRATAK OPIS SLIKA

[0050]

Slika 1 prikazuje konstruisanje NDV 73T antigenomskog cDNK soja 73T. NDV sekvence u GenBank poravnate su kako bi se dobile konsenzusne sekvence radi dizajniranja DNK oligonukleotida za RT-PCR virusne RNK. Šest podgenomskih cDNK fragmenata stvorenih sa RT-PCR visoke tačnosti je sklopljeno u pUC19 vektor. cDNK pune dužine od NDV 73T je označena kao p73T. Nukleotid i zaključene aminokiselinske sekvence mesta deljenja F proteina (FPCS) u 73T su modifikovani do onih od NDV LaSota soja (lentogeni, lento) i gB od citomegalovirusa (CMV) (S116). Dupla linija ukazuje na mesto deljenja F proteina. Dodatno, 73T soj cDNK plazmida (p73T) sadrži 27 nukleotida (nt) T7 RNK polimeraze promotera na 5’ kraju i 189 nt koji sadrže HDV antigenomsku ribozomsku sekvencu i T7 RNK polimeraze transkripcioni terminalni signal na 3’ kraju. Za stvaranje ne-virusnog NDV, kodiranje sekvence mesta deljenja proteaze fuzionog proteina izmenjeno je mutagenezom upravljanom na mestu do onih za ne-virusni NDV LaSota soj (lentogeni, lento) ili glikoprotein B (gB) citomegalovirusa (S116). Slike 2A i 2B prikazuju unošenje transgenske kasete u NDV 73T genom. Slika 2A prikazuje unošenje transgena na P-M spoju. AfeI mesto ograničenja uvedeno je na 3148 u podklonu plazmida koji sadrži SacII-Pm1I fragment. cDNK koje kodiraju kodon-optimizovani ljudski ili mišiji granulocit-makrofag stimulirajući za koloniju faktor (GM-CSF) ili interleukin 2 (IL-2). Uneta genska kaseta sadrži kraj gena (GE; 5'-TTAAGAAAAAA -3'), intergenski nukleotid (T), sekvencu početka gena (GS; 5'-ACGGGTAGA -3'), i otvoreni okvir za čitanje (ORF) transgena. Dodatno, deset nukleotida (5'- cgccgccacc-3') je uneto uzvodno od mesta započinjanja radi uvođenja Kozak sekvence. SacII-PmlI fragment dobijenog plazmida je pomešan u plazmid r73T i nazvan kao p73T-P1. Dodatno, Slika 2A prikazuje unošenje transgena u HN-L spoj između HN ORF i sekvence signala kraja gena (GE) od HN, AfeI mesto ograničenja je uvedeno pri nt 8231 u plazmidu koji je sadržao AgeI-XbaI fragment. Genska kaseta stvorena je sa PCR upotrebom para fosfat smisao i antismisao primera (Tabela 3) u uneta je u AfeI mesto. AgI-XbaI fragmenti iz dobijenog plazmida su pomešani u plazmid p73T, dajući p73T-HN1. Pune dužine (FL) 73T cDNK koja

1

sadrži transgen na P-M ili HN-L spoju označena je kao p73T-P1 ili p73T-HN1, respektivno. Slika 2B prikazuje unošenje dve transkripcione kasete na P-M spoju. AfeI mesto je uvedeno na kraju ORF od GM-CSF (nt 3619). IL-2 ORF je pojačan upotrebom para fosfatnih smisao i antismisao primera koji sadrže GE i GS sekvence i uneti su na AfeI mestu. SacII-PmlI fragmenti iz dobijenih plazmida uključujući GM-CSF i IL-2 transkripcione kasete su zamenjeni nazad u plazmid r73T, dajući p73T-P2. Slike 3A-3c prikazuju dobijanje infektivnog rekombinantnog NDV soja 73T (r73T) sa modifikovanim FPCS i prikazuju deljenje F proteina i aktivnost spajanja in vitro. Slika 3A prikazuje kako su NDV 73T NP, P, L i antigenska cDNK (p73T-lento ili p73T-S116) klonirani pod kontrolom T7 RNK promotera i terminatora polimeraze. Četiri plazmida su zajedno transfektovana u ćelijsku liniju koja ispoljava RNK polimerazu. Dobijeni virusi označeni su kao r73T-lento ili r73T-S116. r73T-lento i r73T-S116 su pušteni u Vero ćelije sa podlogom sa i bez tripsin suplementa. Rast r73T-lento je zavistan od tripsina gde r73T-S116 može rasti u podlozi bez tripsin suplementa. Za procenjivanje genetske stabilnosti FPCS u r73T-S116 i transgenu, r73T-S116 sa i bez hGM-CSF pri P-M spoju dalje je pušten kroz 10 prolaza u Vero i ljudske fibrosarkom HT1080 ćelije pri MOI 0.01 u podlozi bez suplementa tripsina. Mutacije (R113K i/ili Q114M) u FPCS pojavile su se pri prolazu 7 i S116R mutacija detektovana je pri prolazu 9. Pri prolazu 10, F, HN i transgen su sekvencirani i dodatne mutacije nisu pronađene. Slike 3B i 3C prikazuju uticaj mutacije mesta deljenja F proteina (FPCS) na spajanje ćelije i deljenja proteina in vitro. Za konstruisanje plazmida koji zajedno ispoljava dva transgena, GFP i NDV F ili HN gene, otvoreni okviri za čitanje proteina od NDV ili HN gena pojačani su sa PCR i klonirani u plazmid pVitro2-neo-MCS (Invitrogen) pod kontrolom citomegalovirus (CMV) promotera.293T ćelije raspoređene su pri 5 ×10<5>ćelija/udubljenju na ploči sa 6 udubljenja za transfekciju sledećeg dana. Slika 3B prikazuje ćelije transfektovane sa 2 µg NDV F plazmidne DNK u trajanju od jednog dana i sakupljene su u puferu proteinske lize za Western blot analizu upotrebom anti-NDV F specifični poliklonalni antiserum. NDV F protein sa lentogenim mestom deljenja i S116 nije podeljen, samo je F0 detektovano. F proteini R116 i S116-KM delimično su podeljeni kao što je ukazano prikazom na F1 proteinskoj vezi. Slika 3C prikazuje ćelije koje su zajedno transfektovane sa različitim F plazmidom sa wt HN plazmidom koji je ispitan za formiranje veze sa fluorescentnim mikroskopom. wt F protein je bio najefikasniji pri formiranju veze.

1

Slika 4 je tabela koja rezimira karakteristike r73T-lento i r73T-S116 derivate.<a>Svi virusi sadrže hGM-CSF pri P-M spoju.<b>Amino kiseline u FPCS koje su različite od FPCS-S116 su podvučene.<c>Formiranje plaka u Vero ćelijama bez tripsina u preklopljenom sloju na 36 h inkubacije i prikazano pod ×10 uvećanjem.<d>Srednje vreme umiranja u jajima (MDT).<e>Patogenost NDV u 1 dan starim pilićima bez patogena sa indeksom intracerebralne patogenosti (ICPI). ICPI proba je izvršena u National Veterinary Service Laboratories (NVSL) (Ames, Iowa).<f>Citotoksični efekat virusa na ljudske fibrosarkom HT1080 ćelije nakon infekcije pri multiplicitetima infekcije (MOI) od 0.01 pri 72 h nakon infekcije. Relativni procenat preživljavanja ćelija određen je poređenjem svakog uzorka sa netretiranim ćelijama koje se smatraju 100% održivim. Podaci predstavljeni u tabeli su relativni procenat mrtvih ćelija.<g>Virus koji je rastao u Vero ćelijama nakon infekcije sa MOI od 0.01 i kultivisani u OPTI-MEM bez tripsin suplementa u trajanju od 3-5 dana pri 37 °C.<h>Virus koji je rastao u oplođenim kokošjim jajima.10-11 dana stara oplođena jaja inficirana su sa 1,000 pfu r73T. Amniotička tečnost sakupljena je nakon inkubacije pri 37 °C u trajanju od 72 h. Infektivni virusni titar određen je u Vero ćelijama probom plaka. Slike 5A i 5B prikazuju strategije za oslabljenje r73T-R116 virusne virulencije kod kokošaka. Slika 5A prikazuje unošenje transgena pri P-M spoju (1) i HN-L spoju (2), i produženje HN-L intergenskog regiona unošenjem ne-kodirajuće sekvence (3). Unošenje transgenske kasete na P-M spoju je isto kao što je prikazano na Slici 2A.2. transgenska kaseta sadrži sekvencu početka L gena (GS; 5'-ACGGGTAGA -3'), otvoreni okvir za čitanje (ORF) transgena, sekvence od 3' neprevedenog regiona L gena (u kurzivu) i sekvencu kraja L gena (GE; 5'-TTAAGAAAAAA-3').

Nekodirajuće sekvence korišćene za povećavanje HN-L spoja uzete su iz paramiksovirusa tipa-1 (APMV-1), respiratornog sinicijalnog virusa (RSV) ili nasumične sekvence koja nema homologiju sa bilo kojom poznatom sekvencom. Unošenje sekvence može biti u opsegu od 60-318 nt. Unošenje 2. transgena pri HN-L omogućilo je virusu da izrazi dva transgena, (npr., hGM-CSF i GFP). Slika 5B prikazuje sekvence koje su unete pri HN-L spoju.

Slika 6A je tabela koja rezimira karakteristike r73T-R116 derivata.<a>Svi virusi sadrže hGM-CSF pri P-M spoju.<b>Sekvence unete pri HN-L spoju kao što je prikazano na Slici 5B.<c>Formiranje plaka u Vero ćelijama bez tripsina u preklopljenom sloju na 36 h inkubacije i prikazano pod ×10 uvećanjem.<d>Srednje vreme umiranja u jajima (MDT).<e>Patogenost NDV u 1 dan starim pilićima bez patogena sa indeksom

2

intracerebralne patogenosti (ICPI). ICPI proba je izvršena u National Veterinary Service Laboratories (NVSL) (Ames, Iowa).<f>Citotoksični efekat virusa na ljudske fibrosarkom HT1080 ćelije nakon infekcije pri multiplicitetima infekcije (MOI) od 0.01 pri 72 h nakon infekcije. Relativni procenat preživljavanja ćelija određen je poređenjem svakog uzorka sa netretiranim ćelijama koje se smatraju 100% održivim. Podaci predstavljeni u tabeli su relativni procenat mrtvih ćelija.<g>Virus koji je rastao u Vero ćelijama nakon infekcije sa MOI od 0.01 i kultivisani u OPTI-MEM bez tripsin suplementa u trajanju od 3-5 dana pri 37 °C.<h>Virus koji je rastao u oplođenim kokošjim jajima. 10-11 dana stara oplođena jaja inficirana su sa 1,000 pfu r73T.

Amniotička tečnost sakupljena je nakon inkubacije pri 37 °C u trajanju od 72 h.

Infektivni titar određen je u Vero ćelijama probom plaka.

Slike 6B-6E su dijagrami koji prikazuju kinetiku rasta rekombinantnog NDV u DF-1 i Vero ćelijama. DF-1 i Vero ćelije u pločama sa šest udubljenja inficirane su pojedinačnim ukazanim virusom pri multiplicitetima infekcije (m.o.i.) od 5.0 (jedan ciklus, Slike 6B i 6C) ili 0.001 (više ciklusa, Slike 6C i 6D). Inficirani supernatanti ćelijske kulture sakupljeni su pri intervalima od 10 sati do 50 sati nakon infekcije, i virusni titri su određeni probom plaka.

Slike 6F i 6G prikazuju sintezu virusne RNK i proteina u DF-1 ćelijama. DF-1 ćelije su inficirane sa svakim virusom kao što je ukazano pri m.o.i od 5.0, inkubirane u trajanju od 20 h, ukupna intracelularna RNK je izvađena za Northern blot analizu (Slika 6F) i drugi komplet inficiranih ćelija ispitan je za sintezu proteina sa Western blot analizom (Slika 6G). RNK su odvojene elektroforezom u formaldehid agaroza gelu, prenete su na membrane od nitroceluloze, i hibridizovane sa biotin označenim RNK sondama specifičnim za HN, NP, P i L gene. Pozitivna RNK sonda u L genu korišćena je za detektovanje virusne genomske RNK. Ukupni proteini odvojeni su na SDS-PAGE i blotovani sa anti-NP, F, HN i L serumom. Ukupni proteini postavljeni na gel detektovani su sa aktin-specifičnim antitelom. Rekombinantni NDV R116i sa 198 nt unošenjem između HN i L intergenske sekvence imao je ukupno smanjenu sintezu RNK i proteina u DF-1 ćelijama.

Slike 6H i 6I prikazuju sintezu virusne RNK i proteina u Vero ćelijama. Slika 6H prikazuje Northern blot analizu RNK sinteze. Viro ćelije inficirane su sa virusom pri m.o.i od 5.0, inkubirane su 20 h, ukupna intracelularna RNK je izvađena. RNK su odvojene elektroforezom u formaldehid agaroza gelu, prenete su na membrane od nitroceluloze, i hibridizovane sa biotin označenim RNK sondama specifičnim za HN, NP, P i L gene ili RNK pozitivnog smisla L gena za detektovanje genomske RNK. Sika 6I prikazuje Western blot analizu sinteze virusnog proteina u inficiranim Vero ćelijama. Ukupni proteini odvojeni su na SDS-PAGE, preneti na membranu od nitroceluloze i blotovani sa anti-NP, F, HN i L serumom. Ukupni proteini postavljeni na gel detektovani su sa aktin-specifičnim antitelom. R116i virusi sa 198nt unošenjem imali su smanjenu genomsku RNK, ali su u velikom povećali NP mRNK u poređenju sa S116 i wt NDV. L mRNK nivo je bio previše nizak da bi se mogla napraviti razlika. Proteini uzvodno od L gena su regulisani na gore ali je nivo L proteina bio redukovan u Vero ćelijama.

Slike 6J i 6K pokazuju poređenje sinteze proteina u inficiranim DF-1 i Vero ćelijama pri niskom multiplicitetu infekcije sa Western blot analizom. DF-1 i Vero ćelije su inficirane sa svakim virusom kao što je ukazano pri m.o.i od 0.001, inkubirane su 72 h i sakupljene u puferu za lizu proteina. Ukupni proteini odvojeni su na SDS-PAGE, preneti na membranu od nitroceluloze i blotovani sa anti-NP, F, HN i L serumom. Proteini postavljeni na gel detektovani su sa aktin-specifičnim antitelom. Nivo L proteina smanjen je u obe ćelijske linije, međutim, proteini uzvodno od L gena su regulisani na dole u DF-1 ćelijama ali su regulisani na gore u Vero ćelijama.

Slike 6L prikazuju sintezu virusnog proteina u inficiranim ljudskim ćelijama u poređenju sa DF-1 ćelijama. Ljudske HT1080, Hela ćelije i DF-1 ćelije su inficirane sa svakim virusom kao što je ukazano pri m.o.i od 5.0, inkubirane su 20 h i sakupljene u puferu za lizu proteina. Proteini su odvojeni na SDS-PAGE, preneti na membranu od nitroceluloze i blotovani sa anti-HN i anti-L serumom. Ispoljavanje HN proteina kod R116i sa 198 unošenjem između HN i L spoja je povećano kod HT1080 i Hela ćelija, ali je smanjeno kod DF-1 ćelija. L protein je smanjen u sve tri ćelijske linije inficirane sa R116i-198 ili 198RSV.

Slika 7 su dijagrami koji prikazuju kinetiku rasta r73T virusa u oplođenim kokošjim jajima. Za određivanje uslova rasta za r73T viruse, ispitivanja kinetike rasta izvršena su na jajima. Oplođena kokošja jaja inficirana su sa 100, 1000, 10,000 ili 100,000 PFU/jajetu ukazanog virusa i inkubirana su 2, 3 ili 4 dana (73T wt, gore levo; R116, gore desno; R116i-318, u sredini levo; R116i-198-RSV, u sredini desno; R116i-198-nasumično, dole levo; S116-KM, dole desno). Alantoična tečnost je sakupljena i virusni titri su određeni sa FFA. Inokulacija 100 FFU/jajetu imalo je niži titar na dan 1, ali je dostiglo maksimalni titar na dan 2. Uopšteno, većina virusa je dostiglo maksimalne titre od ~ 8 log/mL na Dan 2 bez obzira na to da li su doze inokulata korišćene. R116i-198 je imao najniži titar, niska doza inokuluma stvorila je najveći prinos na dan 2, ukazujući da tu može postojati akumulacija defektivnih čestica. R116i-318-APMV unošenje takođe je imalo niski maksimalni titar od ~7 log. R116i-198-RSV je dostigao maksimalni titar od 7.5 log. S116 ponovo izveden reverznom genetikom nije imao redukciju u virusnoj proizvodnji u jajima. Stoga, među R116 derivatima, virus sa RSV-198nt unošenjem je bio najbolji kandidat za onkolitički virus u pogledu svojstava rasta u jajima.

Slika 8 su dijagrami koji prikazuju kinetiku rasta r73T virusa u Vero ćelijama. Virusi takođe procenjeni u klonu vero ćelije 51D11 bez seruma, vlasnička ćelijska linija stvorena od strane MedImmune. Svi virusi su se slično dobro replicirali pod oba moi uslova (0.001, gore; 0.0001, dole). Modifikacija 73T FPCS i intergenskog unošenja u HN-L spoj R116 nije uticalo na rast virusa u Vero ćelijama.

Slike 9A-9D prikazuju da se r73T virusi selektivno repliciraju u ćelijama tumora i imaju citotoksičnost za ćelije tumora, u poređenju sa ne-neoplastičnim ćelijama. Podaci su dobijeni nakon inficiranja sa r73T derivatima pri različitim dozama u rasponu od 1 do 100,000 PFU u trajanju od 72 h. Slika 9A je dijagram koji prikazuje procenjivanje rT3T i njegovih derivata za ćelijsko ubijanje kod ljudskog fibrosarkoma HT1080 relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. U HT1080 ćelijama raka, virus sa lentogenim FPCS imao je najmanje ubijanje S116 pri FPCS imao je srednje a virus sa R116 i FPCS imao je ćelijsko ubijanje efikasno kao i r73T wt virus. Slika 9B je dijagram koji prikazuje procenjivanje rT3T i njegovih derivata za ćelijsko ubijanje kod normalnih ljudskih ćelija fibroblasta kože CCD1122Sk relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije. Kod normalnih CCD1122SK ćelija, virusi nisu ubili sve ćelije podjednako efikasno kao ćelije raka, sa smanjenjem efikasnosti ubijanja od ~100-puta. Bez obzira na FPCS sekvence, svi virusi su imali slično ubijanje kod normalnih ćelija, što je verovatno usled replikacije u jednom ciklusu (bez širenja virusa). Slika 9C je tabela koja prikazuje efikasnost ubijanja ćelija kod ćelija raka i normalnih ćelija ispoljena je kao 50% efektivne koncentracije (EC50) što je interpolisano iz krive odgovora na dozu upotrebom Prism 6.0. R116 derivat je imao sličnu EC50vrednost kao r73T wt sa EC50od 10 PFU, što ukazuje da modifikacija FPCS nije uticala na replikaciju virusa i efikasnost ubijanja ćelija kod ćelija raka. Slika 9D je dijagram koji prikazuje replikaciju virusa u HT1080 i CCD1122SK ćelijama pri MOI 0.01 na dan 3 nakon infekcije. Svi virusi poželjno su se replicirali u ćelijama raka u odnosu na normalne ćelije, sa razlikom od oko 1.5-2.0 log.

2

Slike 10A i 10B su dijagrami koji prikazuju da su r73T derivati efikasni pri regresiji tumora nakon lokalnog i sistemskog davanja. Za procenjivanje onkolitičke aktivnosti in vivo, HT1080 ksenograft model uspostavljen je ubrizgavanjem HT1080 ćelija pri koncentraciji od 5 × 10<6>ćelija/0.1ml subkutano u Balb/C atimički gole miševe pri starosti od 5-6 nedelja. Slika 10A je dijagram koji prikazuje efekat R116i-318-hGM-CSF datog intratumorski (it) ili intravenozno (iv). Ovi podaci pokazali su da su R116i-318-hGM-CSF derivati imali anti-tumorsku aktivnost in vivo kada su isporučeni ili sistemski ili intratumorski u imunodeficijentne miševe koji nose ljudske tumorske ksenografte. Brzina rasta tumora je upoređena između tretiranih i kontrolnih grupa. Regresije tumora uzrokovana sa dva načina davanja obe su bile značajno različite od kontrolne grupe. Miševi su nasumično podeljeni u grupe (n=10) kao što je ukazano kada je zapremina tumora dostigla približno 65 mm<3>. Miševi su primili pojedinačnu dozu ili PBS ili 2 × 10<7>Pfu r73T-hGM-CSF-R116i-198 datu intratumorski (it) ili 1 × 10<8>PFU datu intravenozno (IV) putem injekcije u repnu venu. ∗ P< 0.05, studentski T test sa nezavisnim uzorcima. Slika 10B je dijagram koji poredi onkolitičke aktivnosti r73T derivata u HT1080 ksenograftima sa IV injekcijom od 1 × 10<8>PFU. Dve doze r73T derivata bile su u stanju da uzrokuju značajnu regresiju tumora iako su imale razlike u efikasnosti. r73T-lento je bio najmanje efikasan dok je r73T wt bio najefikasniji pri regresiji tumora. r73T-lento je imao sličan uticaj kao S116 virus iako je S116 virus imao 10-puta nižu EC50za in vitro ćelijsko ubijanje (videti Sliku 9A). r73T-R116i-318 je bio potentan kao 73T wt pri suzbijanju rasta tumora do 9 dana nakon 2. doze (dan 19 nakon implantacije tumora), tumor je opet rastao kod miševa tretiranih sa R116i, ali ne kod grupe tretirane sa 73T wt. Miševi su nasumično podeljeni u grupe (N=7) kada je zapremina tumora dostigla približno 180 mm<3>. Miševi su primili ili PBS ili 1 × 10<8>PFU r73T-hGM-CSF-lento (lento) ili r73T-hGM-CSF-S116K113M114 (S116 KM) ili r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N (R116i) ili r73T-hGM-CSF (r73T wt) dato IV. Veličina tumora je merena svakih 3-4 dana. ∗ P< 0.05, studentski T test sa nezavisnim uzorcima. Podaci pokazuju da su r73T derivati imali anti-tumorsku aktivnost in vivo kada su isporučeni ili sistemski ili intratumorski u imunodeficijentne miševe koji nose ljudske tumorske ksenografte. Efikasno deljenje F proteina je značajno za replikaciju virusa in vitro i in vivo. Virusi sa R116 pri FPCS su potentniji pri ćelijskom ubijanju in vitro i in vivo. Slike 11A-G prikazuju biodistribucija tkiva r73T derivata nakon intravenozne isporuke i uticaj mišijeg u poređenju sa ljudskim GM-CSF na suzbijanje rasta tumora.

Za određivanje ukoliko se NDV virus selektivno replicira u tkivu tumora i virusnog klirensa, određena je distribucija virusa u različitim organima. Atimički goli miševi koji nose subkutane HT1080 tumore sa veličinom od ~ 250 mm<3>tretirani su sa R116i (r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N) pri dozi od 1 × 10<8>PFU intravenozno i žrtvovani su na dan 1, 4, ili 8 (n=3 po vremenskoj tački). Serum, pluća, slezina, jajnici i serum su sakupljeni i prisustvo virusa je kvantifikovano. Virusna replikacija u tumoru i organima procenjena je na dane 1, 4 i 8 nakon infekcije. Slika 11A je dijagram koji prikazuje kvantifikaciju virusa u tkivima probom plaka u Vero ćelijama. Virus je detektovan u organima samo na dan 1 (virus nije detektovan u jajnicima ni u jednoj vremenskoj tački) i virusno opterećenje u tkivu tumora je ~100-puta veće nego u plućima i slezinama. Prisustvo virusa u tumoru trajalo je bar 8 dana, ukazujući da se virus selektivno replicirao u tkivima tumora.

Slika 11B je dijagram koji prikazuje kvantifikaciju GM-SCF ispoljenu od virusa u tkivima sa ELISA probom hGM-CSF transgenskog ispoljavanja. Dosledno sa podacima o replikaciji virusa podaci dobijeni probom plaka, nivo, nivo hGM-CSF je bio najviši i trajao je više od 8 dana u tikvu tumora. Ovi podaci demonstrirali su da se NDV virus može efikasno replicirati u tkivu tumora i isporučiti transgen do lokalnog tkiva tumora efikasno.

Slika 11C prikazuje dijagrame koji prikazuju uticaj mGM-CSF ispoljavanja na suzbijanje rasta tumora kod HT1080 ksenograft modela za tumor kod miševa.

Atimički goli miševi pri starosti od 5-6 nedelja u grupama od sedam su dobili subkutano (s.c.) 5 × 10<6>HT1080 ćelija u desni bok. Kada su tumori dostigli zapreminu od 110 mm<3>(dan 6), tumor je ubrizgan sa jednom dozom 1 × 10<8>pfu rNDV, R116i-198RSV sa mGM-CSF ili hGM-CSF. Veličina tumora je merena svakih 3-4 dana. R116i-198RSV sa mGM-CSF je bio manje potentan pri suzbijanju rasta tumora nego hGM-CSF transgen. Međutim, nije primećena razlika u suzbijanju rasta tumora za S116 ili sa hGM-CSF ili mGM-CSF.

Slika 11 D prikazuje dijagrame koji prikazuju uticaj mGM-CSF na klirens virusa iz tumora kod HT1080 ksenograft modela za tumor kod miševa. Atimički goli miševi u grupama od tri su dobili subkutano (s.c.) 5 × 10<6>HT1080 ćelija u desni bok. Kada su tumori dostigli zapreminu od 180 mm<3>(dan 10), miševi su intravenozno tretirani sa jednom dozom 1 × 10<8>pfu za R116i-198RSV ili S116KM. Tumori su sakupljeni na dan 4 ili 7 i virusni titri u tkivu tumora su određeni probom plaka. Oba, R116i-198RSV i S116KM sa ili mGM-CSF ili hGM-CSF su imali uporedivi titar na dan 4.

2

Na dan 7, R116i-198RSV sa mGM-CSF je značajno smanjen u poređenju sa R116i-198RSV sa hGM-CSF. Kao poređenje, titri S116 mGM-CSF sa hGM-CSF su uporedivi.

Slika 11E prikazuje dijagram koji prikazuje uticaj R116i-198RSV ili S116KM infekcije na infiltraciju imunskih ćelija u tumore kod HT1080 ksenograft modela za tumor kod miševa. Atimički goli miševi u grupama od tri su dobili subkutano (s.c.) 5 × 10<6>HT1080 ćelija u desni bok. Kada su tumori dostigli zapreminu od 180 mm<3>(dan 10), miševi su intravenozno tretirani sa jednom dozom 1 × 10<8>pfu virusa kao što je ukazano. Tumori su sakupljeni na dan 4 i tkiva su procesirana za obeležavanje sa neutrofilnim NK ćelijama i makrofagima sa FACS analizom. R: R116i-198-RSV, S: S116-KM. R116i-198RSV sa mGM-CSF je imao veću infiltraciju imunskih ćelija. Slika 11F prikazuje tabelu koja prikazuje da su citokini i hemokini bili regulisani na gore kod HT1080 ksenograft modela za tumor kod miševa. Atimički goli miševi u grupama od tri su dobili subkutano (s.c.) 5 × 10<6>HT1080 ćelija u desni bok. Kada su tumori dostigli zapreminu od 180 mm<3>(dan 10), miševi su intravenozno tretirani sa jednom dozom 1 × 10<8>pfu R116i-198RSV ili S116KM sa hGM-CSF ili mGM-CSF. Tumori su sakupljeni na dan 4 i tkiva su procesirana za nivoe citokina i hemokina sa Lumineks analizom. Virusna infekcija je uzrokovala proizvodnju citokina i hemokina u lokalnom tkivu tumora, njihovi nivoi su varirali na osnovu glavnog lanca virusa i ljudskog ili mišijeg GM-CSF.

Slika 11G prikazuje dijagram koji prikazuje da su R116i-198RSV-hGM-CSF i R116i-318APMV-hGM-CSF bili uporedivi pri suzbijanju rasta tumora kod HT1080 ksenograft modela za tumor kod miševa. Atimički goli miševi u grupama od sedam su dobili subkutano (s.c.) 5 × 10<6>HT1080 ćelija u desni bok. Kada su tumori dostigli zapreminu od približno 110 mm<3>(dan 6), jedna doza virusa pri 1 × 10<8>pfu je ubrizgana intratumorski. Veličina tumora je merena svakih 3-4 dana i predstavljena grafički. Dužina unošenja od 198 i 318nt nije uticala na onkolitičku aktivnost R116i. Slika 12A i Slika 12B prikazuju konstruisanje antigenoma cRNK 73T koji sadrži himerne F i/ili HN gene i njihovu karakterizaciju a Slika 12C poredi funkcije aktivnosti kompleksa RNK polimeraze. Virusni površinski glikoproteini značajni su antigeni za imunogenicitet i virulenciju kod kokošaka. F i/ili HN geni NDV zamenjeni su sa odgovarajućim ekstracelularnim (ekto) domenima ili drugim paramiksovirusa koji nisu virusni kod kokošaka pojedinačno ili u kombinaciji.

Parainfluenca virus 5 (PIV 5) je paramiskovirus kod pasa koji ne izaziva bolesti kod

2

ljudi, a paramiskovirus tipa 1 kod golubova (PPMV-1) je pokazan da nije virusan kod kokošaka. Slika 12A prikazuje da su ektodomeni F i/ili HN glikoproteina pune dužine antigenomske NDV 73T cDNK zamenjeni sa onima od PPMV-1 i/ili PIV5. NDV, PIV5 i PPMV-1 sekvence su ukazane sa obojenim kutijama kao plavo, ljubičasto ili zeleno, respektivno. Aminokiselinske dužine pojedinačnih proteina ili proteinskih domena su ukazane. Slika 12B je tabela koja prikazuje karakterizaciju 73T derivata koji sadrže himerne F i/ili HN gene. Formiranje plaka kod Vero, relativnim HT1080 ćelijskim ubijanjem i MDT izvršeno je kao što je prethodno opisano. Himerni virusi, osim za PVI-5 F-HN, su dobijeni i rasli su u ćelijama u odsustvu egzogenog tripsina. Sva tri virusa formirala su velike plakove, pokazujući efikasno širenje od ćelije do ćelije. PPMV-1 F-HN ili F himerni virusi imali su MDT vrednosti 79 i 84 h, respektivno, ukazujući na potencijalnu virulenciju kod kokošaka. Oba PPMI-1 i himerni virusi su ubili HT1080 ćelije efikasno pri nivoima od 71 i 61%. PIV5-F himerni nisu rasli u jajima i nisu bili virusni kod kokošaka, ali su ubili HT1080 ćelije pri 47%. Unakrsna aktivnost seruma između NDV i PPMV-1 ili PIV5 himernih je ispitana probom neutralizacije upotrebom seruma sakupljenog iz miševa koji su IV primili 2 doze od 1 × 10<8>PFU od r73T-R116i. r73T virus može biti neutralisan sa NDV-inficiranim serumom (titar 960) dok PPMV-1 i PIV5 himerni nisu neutralisani (titar <4), što potvrđuje da ne postoji unakrsna reaktivnost između NDV i PPMV-1 ili PIV5. Himerni virusi sa različitim antigenicitetom mogli bi biti za pojačavanje onkoloških virusa kod pacijenata čiji su se anti-NDV imunski odgovori razvili za vreme trajanja prethodnog NDV tretiranja.

Slika 12C prikazuje poređenje aktivnosti NDV RNK polimeraze sa drugim paramiksovirusima sa probom mini-genoma. Ćelije koje ispoljavaju T7 transfektovane su sa tri plazmida koji ispoljavaju NP, P, L proteine i plazmid koji kodira NDV anti-minigenomsku cDNK koja kodira GFP gen upotrebom Lipofektamina 200, ili plazmide koji kodiraju N, P, L gene virusa morbile (MV) ili respiratornog sinicijalnog virusa (RSV) i respektivnim RSV ili MV GFP anti minigenomskim cDNK plazmidom. Dva ili tri dana nakon transfekcije, minigenomska replikacija kao što je ukazano ispoljavanjem GFP proteina ispitana je pod fluorescentnim mikroskopom. NDV je imao najjaču aktivnost polimeraze u poređenju sa virusom morbila i RSV.

Slike 13 A i B prikazuju osetljivost ćelijske linije raka na rNDV varijante. Ćelijske linije raka porekla iz različitog tkiva inficirane su sa NDV S116 ili NDV R116i pri

2

MOI od 0.1 i ćelijska održivost je procenjena 72h nakon infekcije upotrebom Cell Titre Glo. Osetljivost na NDV definisana je kao veća od 30% ćelijskog ubijanja 27h nakon infekcije. Slika 13A prikazuje dijagram procenta NDV osetljivih ljudskih ćelijskih linija raka za minimum 16 širokih indikacija. Broj ćelijskih linija u svakoj grupi ukazan je numerički i u tabeli. Slika 13B prikazuje dijagram osetljivosti 22 ćelijske linije raka na NDV varijante. % ćelijskog ubijanja određen je kao procenat netretiranih kontrolnih ćelija.

Slika 14 su dijagrami koji prikazuju dopustivost ćelijskih linija raka do recNDV<GM-CSF>. Ćelijsko ubijanje R116i-GM-CSF u reprezentativnim ćelijskim linijama tumora predstavljeno je na Slici 14. Maksimalni % ćelijskog ubijanja određen je 3 dana nakon infekcije ćelijskih linija tumora relativno u odnosu na neinficiranu kontrolu pri MOI od 0.1. Iako su određene ćelijske linije izvedene iz istog tipa tumora, kao što su rakovi bešike, želuca, prostate, melanom, dojke, jajnika, pankreasa i pluća, pokazali su različitu ozbiljnost na virusno ubijanje. Više ćelijskih linija iz svakog ukazanog tumora koji može biti ubijen sa R116i-GM-CSF pri stepenu od >50% rezimirano je u Tabeli 1.

Slike 15A-F su dijagrami koji prikazuju da NDV derivati suzbijaju rast tumora kod različitih modela raka kod miševa. Slike 15A i 15B su dijagrami koji prikazuju da recNDV<GM-CSF>sojevi suzbijaju rast tumora u sinergičkim mišijim modelima za melanom (B16F10 AP3).73T-R116i-hGM-CSF (Slika 15A levo) i R116i-mGM-CSF (Slika 15A desno) su procenjeni za svoj onkolitički efekat u B16 modelu melanoma u probnom ispitivanju. Kako se procenjuje tolerantnost na virus kod B16 miševa, veličina grupe je bila mala (n=3). Svaki virus je doziran intravenozno (i.v) pri 2×10<7>pfu dva puta na dane 11 i 14; intraperitonealno (i.p) pri 2×10<7>pfu dva puta na dane 11 i 14; ili intratumorski (i.t) jednom pri 1,1×10<7>pfu na dan 11. Grupe tretirane sa R116-hGM-SCF ili mGM-SCF sa tri načina davanja imale su sporiji rast tumora u poređenju sa netretiranom grupom. Brzina suzbijanja tumora je statistički značajnija nego za kontrolnu grupu.

Slika 15B prikazuje ispitivanje efikasnost kod sinergičkog mišijeg modela melanoma B16F10 sa intratumorskim davanjem 1× 10<8>pfu S116 NDV varijanti. Suzbijanje rasta tumora prikazano je na levom panelu a pojedinačna merenja prikazana su u srednjem panelu i dijagram preživljavanja prikazan je sa desne strane.

Slika 15C prikazuje da NDV ima potentnu anti-tumorsku aktivnost u imunskom kompetentnom mišijem CT26 modelu kolorektalnog tumora. Naročito Slika 13C

2

pruža ispitivanje efikasnost kod sinergičkog mišijeg kolorektalnog modela CT26 sa intratumorskim davanjem 1x 10<8>pfu R116 NDV varijante koja kodira GM-CSF. Suzbijanje rasta tumora pokazano je na desnom panelu i IHC analiza preostalog tumora prikazana je sa desne strane sa H&E i NDV obeležavanjem. Nekrotične površine, dokaz sincitije sa više nukleusa i održive površine tumora su ukazane. Slike 15D-F prikazuju suzbijanje rasta tumora u ksenograft modelu jajnika. Atimički goli miševi su dobili subkutano (s.c.) Ovcar4 ćelije u desni bok. Kada su tumori dostigli zapreminu od 100 mm<3>miševi su nasumično podeljeni u grupe za tretiranje. Uspostavljeni tumori ubrizgani su jednom nedeljno sa 2,5× 10<7>pfu rNDV, R116i-318 sa mGM-CSF ili hGM-CSF. Krive rasta tumora (Slika 15D) i histološke analize tumora (Slika 15E i Slika 15F) su prikazane.

Slika 16 je tabela koja rezimira karakteristike NDV konstrukata. Formiranje plaka u Vero ćelijama bez tripsina u preklapanju nakon 36 h inkubacije i prikazano je pod x10 uveličanjem. Citotoksični efekat virusa na ljudske fibrosarkom HT1080 ćelije nakon infekcije pri multiplicitetima infekcije (MOI) od 0.01 pri 72 h nakon infekcije.

Relativni procenat preživljavanja ćelija određen je poređenjem svakog uzorka sa netretiranim ćelijama koje se smatraju 100% održivim. Podaci predstavljeni u tabeli su relativni procenat mrtvih ćelija. Patogenost NDV u 1 dan starim pilićima bez patogena sa indeksom intracerebralne patogenosti (ICPI). ICPI proba je izvršena u National Veterinary Service Laboratories (NVSL) (Ames, Iowa).

Slika 7 je dijagram koji prikazuje da NDV proizvedeni iz jaja i ljudskih ćelijskih linija ispoljavaju različitu osetljivost na deaktivaciju posredovanu sa komplementom.

Ljudski serum sa potvrđenom komplementarnom (C') aktivnosti (Sigma, St. Louis, MO) je serijski razblažen sa PBS i inkubiran sa 100 pfu NDV u trajanju od 1 sat na 37°C pre inficiranja Vero ćelijama za probu plaka. Nakon inkubacije pri 37°C u trajanju od 6 dana, plakovi su prikazani kristalnim ljubičastim označavanjem i ocenjeni. Virus koji je rastao u oplođenim kokošjim jajima je bio uglavnom neaktiviran razblaženjem sa serumom pri 1:10 do 1:40. Virus koji je rastao u 293 je bio otporniji na C' od virusa koji je rastao u jajima, približno 40% neefikasnosti je zadržano pri koncentraciji seruma od 1:40. Međutim, virusi koji su rasli u Hela su bili najotporniji na C’ posredovanu virusnu deaktivaciju. Približno 90% živih virusa je inficirano pri koncentraciji seruma od 1:40.

Slike 18A i 18B su Western blot analize koje prikazuju poređenja RCA proteinskih nivoa kod 293 i Hela ćelija i u virusima proizvedenim iz ove dve ćelijske linije. Za

2

Sliku 18A jednaka količina 293 i Hela S3 ćelija je postavljena na SDS-PAGE za Western blot. Hela ćelije sadržale su više nivoe hCD46, hCD55 i hCD59 proteina od 293 ćelija. Slika 18B je pokazuje Western blot koji je izvršen radi ispitivanja količina proteina u virusu iz inficiranih 293 ili Hela ćelija. Neinficirane ćelije (imitacija) služile su kao kontrola. Tri CD molekula detektovana su u virusima iz inficiranih Hela ćelija pri nivoima višim od onih za 293 ćelije.

Slika 19 prikazuje procenjivanje proteina C' regulatora vezanih za membranu (RCA) u C' posredovanoj virusnoj deaktivaciji. cDNK koja kodira hCD55, hCD59 i hCD46 sintetisana je sa Origene (Rockville, MD) ili Genscript (Piscataway, NJ). Svaka genska kaseta uneta je u P-N intergenski region NDV antigenomske cRNK i rekombinantni virusi su stvoreni reverznom genetikom. Rekombinantni virusi su pojačani u jajima i prečišćeni sa 15-60% sukroznim gradijentom i virusna veza je peletirana ultracentrifugiranjem. Ispoljavanje svakog RCA proteina rekombinantnim NDV potvrđena je Wester blot analizom.

Slika 20 je grafik koji prikazuje da je CD55 glavni RCA protein za sprečavanje C' deaktivacije NDV. NDV sa hCD46, hCD55 ili hCD59 je pojačan kod jaja, prečišćen sa sukroznim gradijentom, inkubiran sa ljudskom plazmom razblaženom od 1:10 do 1:40 u trajanju od 1 sata i virusna neefikasnost je ispitana probom plaka u Vero ćelijama. NDV sa hCD55 proizvedenim u jajima je imao sličnu otpornost na C’ u poređenju sa NDV proizvedenim u Hela ćelijama, približno 65% održivih virusa pri koncentraciji plazme od 1:20 i ~80% održivih virusa pri koncentraciji plazme od 1:40. hCD46 pokazuje da blago ili marginalno poboljšava virusnu otpornost na C' posredovanu deaktivaciju, približno 20% više održivih virusa kada se inkubira sa 1:40 razblaženom ljudskom plazmom u poređenju sa NDV kontrolom. Razlika nije detektovana pri nižim razblaženjima plazme.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0051] Pronalazak obuhvata sastave koji sadrže oslabljeni virus Njukastl bolesti i postupke upotrebe tog virusa za tretiranje neoplazije.

[0052] Nasumično upućivanje na postupke za lečenje ljudskog ili životinjskog organizma putem hirurgije ili terapije i dijagnostičkih postupaka koji se praktikuju na ljudskom ili životinjskom organizmu ne treba tumačiti kao zahtev za zaštitu tog postupka kao takvog, već ih treba tumačiti kao zahteve vezane za proizvode, naročito supstance ili sastave, za upotrebu u bilo kom od ovih postupaka.

[0053] Pronalazak je zasnovan, bar delom, na otkriću onkolitičkog NDV sa smanjenom virulencijom kod kokošaka. Kao što je naznačeno detaljnije ispod, NDV 73T soj je izveden iz NDV MK-107, što je komercijalna vakcina za živinu (mezogeni) prvi put postavljena na tržište 1948. NDV MK-107 soj je održava kroz 73 prolaza u 73 Ehrlich ascites ćelijama tumora (Cassel i dr., Cancer.1965 Jul;18:863-8). NDV MK-107 je korišćen u nizu Ph I i Ph II kliničkih ispitivanja u 1970-im godinama. NDV MK-107 je takođe korišćen 1980-ih kao imunoterapeutik za tretiranje pacijenata sa melanomom u kasnoj fazi (Cassel i dr., Cancer. 1983 1;52:856-860; Murray i dr., Cancer.1977. 40:680-686).

[0054] U cilju stvaranja onkolitičkog NDV sa smanjenom virulencijom kod kokošaka, rekombinantni NDV 73T soj obuhvata određene genetske modifikacije. Naročito, sekvenca deljenja F proteina izmenjena je i dužina HN-L intergenske sekvence je povećana . Pogodno, modifikovani virus može biti korišćen za izražavanje transgena od interesa. U jednom otelotvorenju, NDV 73T soj obuhvata transgen koji kodira polipeptid koji pojačava onkolitička svojstva rekombinantnog NDV. U drugom otelotvorenju, NDV 73T soj obuhvata transgen koji kodira biomarker koji pruža očitavanje korisno za praćenje replikacije virusa. Ukoliko je poželjno, soj 73T NDV može biti modifikovan kako bi obuhvatio dodatne genetske informacije koje prekidaju normalni transkripcioni polaritet standardnog genoma i očekuje se da dalje smanji virulenciju virusa kod kokošaka. U skladu sa time, pronalazak pruža rekombinantni virus Njukastl bolesti (NDV) stvoren upotrebom reverzne genetike kako bi mu se smanjila patogeneza kod kokošaka dok se održava sposobnost selektivnog ubijanja ćelija raka, i postupke za proizvodnju takvog virusa. Obelodanjivanje takođe pruža konstruisanje i upotrebu NDV kao virusnog vektora za isporučivanje i ispoljavanje heterolognih genskih proizvoda za pojačano tretiranje raka. Transgeni koji kodiraju primerna terapeutska sredstva koja mogu biti isporučena sa NDV opisani su ispod. U radnim primerima opisanim ovde ispod, novi NDV virusni konstrukti koji ispoljavaju stimulativni faktor granulocit makrofag-kolonije (GM-CSF) selektivno je ubio ćelije raka, ali nije ubio normalne ćelije. Ovaj efekat ubijanja ćelija raka primećen je kod više linija ćelija raka, kao i in vivo kada je testirano u ksenograft HT1080 modelu tumora. Efikasnost i selektivnost rekombinantnog oslabljenog virusa Njukastl bolesti (NDV) takođe su demonstrirani u modelu melanoma gde je primećena regresija tumora. Kad se sabere, pronalazak pruža unošenje

1

specifičnih transgena u rekombinantni oslabljeni NDV vektor i obelodanjivanje pruža efikasno ispoljavanje kodiranog proteina u okruženju tumora.

Virus Njukastl bolesti

[0055] Virus Njukastl bolesti (NDV) je obmotani virus koji sadrži linearni, jednolančani, nesegmentirani, RNK genom negativnog smisla. Jednolančani genom NDV negativnog smisla kodira RNK upravljanu RNK polimerazu, fuzioni (F) protein, hemagglutininneuraminidaze (HN) protein, protein matrice, fosfoprotein i nukleoprotein. Genomska RNK sadrži gene u sledećem redosledu: 3'-NP-P-M-F-HN-L.

Organizacija NDV RNK genoma je opisana detaljnije ovde ispod. Genomska RNK takođe sadrži vodeću sekvencu na 3’ kraju.

[0056] Strukturni elementi virusa obuhvataju virusni omotač koji je lipidni dvostruki sloj izveden iz membrane ćelijske plazme. Glikoprotein, hemagglutinin-neuraminidaza (HN), prostiru se od omotača omogućujući virusu da sadrži oba, hemagglutinin i neuraminidaze aktivnosti. Fuzioni glikoprotein (F), koji je integralni protein membrane, prvo je proizveden kao neaktivni početni materijal, zatim je podeljen post-translatorno kako bi se proizvela dva disulfidno povezana polipeptida. Aktivni protein F je uključen u prodiranju NDV u ćelije domaćina stvaranjem fuzije virusnog omotača sa membranom ćelijske plazme domaćina. Protein matrice (M), uključen je u virusni sklop, i interaguje sa oba, virusnom membranom kao i sa nukleokapsidnim proteinima.

[0057] Glavna podjedinica proteina nukleokapsida je nukleokapsidni protein (NP) koji dodeljuje helikoidnu simetriju kapsidu. U vezi sa nukleokapsidom su P i L proteini.

Fosfoprotein (P) koji je predmet fosforilacije, smatra se da ima regulatornu ulogu u transkripciji, i može takođe biti uključen u metilaciju, fosforilaciju i poliadenilaciju. L gen, koji kodira RNK-zavisnu RNK polimerazu, potreban je za virusnu RNK sintezu zajedno sa P proteinom. L protein, koji zauzima skoro polovinu kapaciteta kodiranja virusnog genoma, najveći je od virusnih proteina, i ima značajnu ulogu u oba, transkripciji i replikaciji.

[0058] Replikacija svih negativno-lančanih RNK virusa, uključujući NDV, komplikuje se odsustvom ćelijskog mehanizma potrebnog za replikaciju RNK. Dodatno, negativno-lančani genom ne može biti preveden direktno u protein, ali mora prvo biti transkribovan u pozitivno-

2

lančanu (mRNK) kopiju. Stoga, nakon ulaska u ćeliju domaćina, genomska RNK samostalno ne može sintetisati potrebnu RNK-zavisnu RNK polimerazu. L, P i NP proteini moraju ući u ćeliju zajedno sa genomom nakon infekcije.

[0059] Bez ograničenja na teoriju, postavljena je hipoteza da se većina ili svi od virusnih proteina koji transkribuju NDV mRNK takođe nose replikaciju. Mehanizam koji reguliše alternativne upotrebe (tj., transkripciju ili replikaciju) istog komplementa proteina nije jasno identifikovan. Neposredno nakon prodiranja virusa, transkripcija se započinje od strane L proteina upotrebom RNK negativnog smisla u nukleokapsidu kao šablonu. Virusna RNK sinteza regulisana je tako da proizvodi monocistronske mRNK za vreme trajanja transkripcije. Nakon transkripcije, replikacija genoma virusa je drugi događaj koji se javlja nakon infekcije ćelije sa negativno-lančanim RNK virusima. Kao i kod drugih negativnolančanih RNK

virusa, replikacija virusnog genoma virusa Njukastl bolesti (NDV) posredovana je sa proteinima specifičnim za virus. Prvi proizvodi replikativne RNK sinteze su komplementarne kopije (tj., plus-polaritet) NDV genoma RNK (cRNK). Ove plus-lančane kopije (antigenomi) razlikuju se od plus-lanca mRNK transkripta u strukturi njihovog terminusa. Za razliku od mRNK transkripta, anti-genomske cRNK nemaju kapu i nisu metilisane na 5’ terminusu, i nisu skraćene i poliadenilisane na 3’ terminusu. cRNK su koterminalne sa svojim negativnim lančanim šablonima i sadrže sve genetske informacije u svakom genomskom RNK segmentu u komplementarnom obliku. cRNK služe kao šabloni za sintezu NVM negativno lančanih virusnih genoma (vRNK).

[0060] Oba, NDV negativno lančani genomi (vRNK) i antigenomi (cRNK) su obuhvaćeni sa nukleokapsidnim proteinima; jedine neobuhvaćene RNK vrste su virusne mRNK. Za NDV, citoplazma je mesto virusne RNK replikacije, kao što je i mesto za transkripciju. Sklop virusnih komponenti verovatno zauzima mesto u membranu ćelijske plazme domaćina. Zreli virus zatim se oslobađa iz ćelije sa zrnima.

Onkolitički virusi

[0061] Virusi su poznati da vrše onkolitička dejstva na ćelije tumora i upotreba onkolitičkih virusa kao terapeutskih sredstava je zabeležena. Određeni napori su izvršeni za upotrebu neljudskih virusa koji pokazuju srednju do visoku patogenost za svoje prirodne domaćine za tretiranje raka kod pacijenata. Predmetno obelodanjivanje se odnosi na postupke za uzrokovanje regresije tumora kod ljudskih ispitanika, postupci koriste modifikovane mezogene sojeve virusa Njukastl bolesti (NDV) sa modifikovanim mestom deljenja F proteina, koji nije patogen za živinu (lentogeni), ali pokazuje onkolitička svojstva.

Obelodanjeni postupci pružaju bezbedne, delotvorne i pouzdane načine za uzrokovanje regresije tumora kod pojedinaca koji imaju potrebu za time. Ovi postupci prevazilaze nedostatke upotreba patogenih sojeva virusa za terapiju kod ljudi.

[0062] U skladu sa jednim aspektom, predmetno obelodanjivanje pruža postupak za obuhvatanje regresije tumora kod ispitanika, postupak obuhvata korak davanja ispitaniku farmaceutskog sastava koji sadrži terapeutski delotvornu količinu lentogenog onkolitičkog soja NDV. U skladu sa jednim otelotvorenjem, lentogeni onkolitički soj NDV je NDV r73T-R116.

[0063] Onkolitički virusi su u stanju da vrše citotoksični ili efekat ubijanja in vitro ili in vivo ćelija tumora sa mali ili bez uticaja na normalne ćelije. Termin „onkolitička aktivnost“ odnosi se na citotoksičnu ili aktivnost ubijanja virusa koji cilja ćelije tumora. Bez želje za vezivanjem za bilo koji mehanizam delovanja, onkolitička aktivnost koja se vrši od strane lentogenog soja nDV (npr., r73T-R116), verovatno je primarna usled ćelijske apoptoze i usled manjeg obima do lize membrane plazme, kasnije je praćena oslobađanjem održivim potomstvom u ćelijskoj sredini koja posle toga inficira susedne ćelije. Bez želje za ograničavanjem na bilo koju naročitu teoriju, vezuje se da NDV ima direktnu citolitičku aktivnost na ćelijama raka. Takođe se veruje da je NDV u stanju da specifično diferencira ćelije raka iz normalnih, zdravih ćelija. Rezultati su ukazali da nekoliko onkogena (H-ras, N-ras i N-myc) koji su poznati da dodeljuju maligno ponašanje ćelijama raka, pojačavaju podložnost ćelija da budu ubijene od strane NDV. Videti, Lorence, R. M., Reichard, K. W., Cascino, C. J. i dr. (1992) Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 33, 398; Reichard, K. W., Lorence, R. M., Cascino, C. J., i dr. (1992) Surg. Forum, 43, 603-606. Dodatno, primećeno je da tretiranje ćelija sa retinoinskom kiselinom (vitamin A) takođe poboljšava lizu ćelija raka sa NDV. Reichard, K. W., Lorence, R. M., Katubig, B. B., i dr. (1993) J. Pediatr. Surg., 28, 1221.

[0064] Citotoksična dejstva pod in vitro ili in vivo uslovima može biti detektovana različitim načinima kao što je poznato u struci, na primer, suzbijanjem ćelijske proliferacije

4

detektovanjem veličine tumora upotrebom gadolinijum pojačanog MRI skeniranja, radio obeležavanjem tumora, i slično.

[0065] Za klinička ispitivanja, poželjno je dobiti klonski virus tako da se omogući homogenost virusa. Klonski virus može biti proizveden u skladu sa bilo kojim postupkom dostupnim stručnjaku. Na primer, klonski virus može biti proizveden ograničenim razblaživanjem ili sa prečišćavanjem plaka.

NDV kultura

[0066] Virus koji je korišćen u obelodanjivanju može biti pripremljen sa različitim postupcima. Na primer, NDV može biti pripremljen u oplođenim kokošjim jajima starim 8 do 10 dana (dobijeno od SPAFAS, Inc., Roanoke, 111.). Postupci za izolovanje virusa poznati su u strci i opisani su, na primer, od strane Weiss, S. R. & Bratt, M. A. (1974) J. Virol, 13, 1220-1230. Ovaj postupak je dalje opisan u Primeru #1 ispod. Upotrebom ovog postupka za izolovanje, NDV se može dobiti koji je oko 90-95% čist.

[0067] Alternativno, virus može biti pripremljen u in vitro ćelijskoj kulturi. Poželjno, ćelijska kultura obuhvata ćelije sisara, a poželjnije, ćelije mogu biti korišćene za proizvodnju virusa kao što su Vero ćelije. Virus će biti prečišćeni hromatografom ili drugim odgovarajućim postupcima. Ćelije mogu biti uslovljene vezivanjem za podlogu ili ne moraju biti uslovljene vezivanjem za podlogu.

[0068] Tehnike ćelijske kulture koje mogu biti iskorišćene za pripremanje virusa poznate su u struci i mogu obuhvatati upotrebu boca sa stacionarnom kulturom sa velikim površinama ili boca nalik valjka. Poželjno, izabrani tip sistema kulture može podržavati relativno veliki broj ćelija. Za proizvodnju velikih količina virusa, razviće se proces u bio reaktoru gde su ćelije razbijene u mikronosećim zrnima za inficiranje virusom i proizvodnju.

[0069] Podloge za kultivisanje ćelija koje mogu biti iskorišćene za proizvodnju virusa poznate su stručnjacima u ovoj oblasti. Podloga obično obuhvata nutritivni izvor, antibiotike i albumin ili izvor seruma koji sadrži faktore rasta. U okviru je struke odabir određenih podloga i konstituenta podloge pogodnih za ćelije iskorišćene u kulturi. U određenim otelotvorenjima, tripsin je uključen u podlogu za rast. U drugim otelotvorenjima, tripsin nije uključen.

[0070] Uslovi kulture obično obuhvataju inkubiranje pri željenoj temperaturi (kao što je 37° C), kao i izabrane koncentracije kiseonika i ugljen dioksida. Naročiti ćelijski uslovi koji su izabrani mogu biti određeni u skladu sa iskorišćenim ćelijama u kulturi, i određivanje takvih odnosa je u okviru struke u ovoj oblasti.

[0071] Ćelije su postavljene u sud kulture i ostavljene da se inkubiraju i rastu pod izabranim uslovima kulture. Poželjno, ćelije uslovljene vezivanjem za podlogu omogućene su da rastu do spajanja ili maksimalnog rasta. Vreme potrebno za rast zavisiće od veličine početnog ćelijskog inokuluma dodatog u sud kulture i čineći vreme za koje je ćelijska linija korišćena dupli dužim. Poželjno, oko 3×10<3>do oko 3×10<5>ćelija je postavljeno po cm<2>i rasle su jedan do pet dana. Za virusnu inokulaciju ćelijske kulture, podloga je uklonjena od ćelija (za susedne ćelije, aspiracijom podloge kulture; za ćelije koje su rasle u suspenziji, centrifugiranjem ćelijske suspenzije i aspiracijom ćelijskog supernatanta) i virus (nakon rekonstitucije) je dodat u ćelije u minimalnoj zapremini podloge ili slanog rastvora (kao što je Hank-ov uravnoteženi slani rastvor, Gibco) radi sprečavanja dehidracije. Poželjno, ova zapremina je u opsegu od oko 10 do oko 2500 mikrolitara po cm<2>površine suda za kulturu ili 10<5>ćelija. Poželjno razblaženje inokuluma virusa je u opsegu od oko 0.001 do oko 10 infektivnih jedinica po ćeliji, optimalni odnos zavisni od naročitog virusa i ćelijske linije. Virus je zatim rastao od oko 1 do 7 dana, vreme trajanja je primarno određeno sa preostalim preživljavanjem ćelijske linije. Za NDV, optimalno vreme sakupljanja je 1 do 5 dana nakon inokulacije virusa.

[0072] Virus može biti sakupljen ili uklanjanjem supernatanta i zamenjivanjem sa svežom podlogom ili svežom podlogom sa svežim ćelijama pri intervalima od 12 do 48 sati ili zamrzavanjem-odmrzavanjem ćelija radi oslobađanja virusa u supernatantu. Supernatant zatim može biti centrifugiran i ultracentrifugiran kako bi se dobio virus u relativno čistom obliku ili sa hromatografskim postupcima. Čistoća virusnog pripremanja može biti testirana određivanjem proteina i/ili sa elektroforezom. Virus može zatim biti dodat u farmaceutski prihvatljiv nosač, dalje opisan ispod.

Terapija

[0073] Terapija može biti pružena bez obzira da li je terapija raka izvršena: kod kuće, u ordinaciji doktora, klinici, u ambulantnom odeljenju bolnice ili u bolnici. U jednom otelotvorenju, pronalazak pruža upotrebu virusa Njukastl bolesti (NDV) (npr., r73T-R116).

[0074] Tretiranje obično počinje u bolnici tako da doktor može primetiti uticaje terapije iz blizine i izvršiti podešavanja koja su potrebna. Trajanje terapije zavisi od vrste raka koji se tretira, starosti i stanja pacijenta, stadijuma i tipa bolesti pacijenta i načina na koji telo pacijenta reaguje na tretiranje. Davanje leka može biti izvršeno pri različitim intervalima (npr., dnevno, nedeljno ili mesečno). Terapija može biti data u ciklusima sa i bez koji obuhvataju periode odmaranja tako da telo pacijenta ima šansu za izgradi nove zdrave ćelije i povrati svoju snagu.

[0075] U zavisnosti od tipa raka i njegovog stadijuma razvijenost, terapija može biti korišćena za usporavanje širenja raka, za usporavanje rasta raka, za ubijanje ili onemogućavanje ćelija raka koje su se raširile na druge delove tele od originalnog tumora, za olakšavanje simptoma izazvanih od strane raka, ili za sprečavanje raka prvenstveno. Rast raka je nekontrolisan i progresivan, i javlja se pod uslovima koji ne bi izazvali, ili bi izazvali prekid, multiplikacije normalnih ćelija.

[0076] Kao što je opisano iznad, ukoliko je poželjno, tretiranje sa sastavima iz pronalaska može biti kombinovano sa terapijama za tretiranje proliferativne bolesti (npr., radioterapija, operacija ili hemoterapija).

Formulacija farmaceutskih sastava

[0077] Davanje virusa iz pronalaska (npr., NDV r73T-R116) za tretiranje tumora može biti putem bilo kog pogodnog sredstva koje se ispoljava u koncentraciji terapeutskog sredstva koja je, u kombinaciji sa drugim komponentama, delotvorna pri sprečavanju, poboljšavanju ili smanjenju tumora. Sredstvo može biti sadržano u bilo kojoj pogodnoj količini u bilo kojoj pogodnoj nosećoj supstanci, i generalno je prisutno u količini od 1-95% po masi ukupne mase sastava. Sastav može biti pružen u oblika za doziranje koji je

pogodan za parenteralni (npr., subkutano, intravenozno, intramuskularno ili intraperitonealno) način davanja. Farmaceutski sastavi mogu biti formulisani u skladu sa konvencionalnom farmaceutskom praksom (videti, npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20. izd.), ured. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 i Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, ured. J. Swarbrick i J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York).

[0078] Farmaceutski sastavi u skladu sa obelodanjivanjem mogu biti formulisani da oslobađaju aktivno jedinjenje suštinski odmah nakon davanja ili u bilo koje prethodno određeno vreme ili vremenski period nakon davanja. Kasniji tipovi sastava uopšteno su poznati kao formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem, koje obuhvataju (i) formulacije koje stvaraju suštinski konstantnu koncentraciju leka unutar tela za vreme produženog vremenskog perioda; (ii) formulacije koje nakon prethodno određenog vremena kašnjenja stvaraju suštinski konstantnu koncentraciju leka unutar tela za vreme produženog vremenskog perioda; (iii) formulacije koje zadržavaju delovanje za vreme prethodno određenog vremenskog perioda održavanjem relativno, konstantnog, delotvornog nivoa u telu sa minimiziranjem zagađivača neželjenih dejstava povezanih sa fluktuacijama u nivou u plazmi aktivne supstance (kinetički šablon zuba testere); (iv) formulacije koje lokalizuju dejstvo, npr., prostornim postavljanjem sastava sa kontrolisanim oslobađanjem susedno ili u sarkomu (v) formulacije koje omogućavaju konvencionalno doziranje, tako da su doze date, na primer, jednom svake ili svake dve nedelje; i (vi) formulacije koje ciljaju proliferirajuće neoplastične ćelije upotrebom nosača ili hemijskih derivata za isporučivanje terapeutskog sredstva ćeliji sarkoma. Za neke primene, formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem uklanjanju potrebu za učestalim doziranjem u toku dana radi održavanja nivoa u plazmi na terapeutskom nivou.

[0079] Bilo koji broj strategija može biti kupljen u cilju dobijana kontrolisanog oslobađanja gde brzina oslobađanja prevazilazi brzinu metabolizma predmetnog jedinjenja. U jednom primeru, kontrolisano oslobađanje dobijeno je odgovarajućim odabirom različitih parametara formulacije i sastojaka, uključujući, npr., različite tipove sastava i obloga sa kontrolisanim oslobađanjem. Stoga, terapeutsko sredstvo je formulisano sa odgovarajućim ekscipijensima u farmaceutski sastav koji, nakon davanja, oslobađa terapeutsko sredstvo na kontrolisani način. Primeri obuhvataju tabletu sa jednom ili dve jedinice ili sastave u kapsulama, uljane rastvore, suspenzije, emulzije, mikrokapsule, mikrosfere, molekularne komplekse, nanočestice, obloge i lipozome.

[0080] Sastav iz obelodanjivanja može biti dat sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem ili ekscipijensom, u jediničnom obliku za doziranje. Konvencionalna farmaceutska praksa može biti iskorišćena za pružanje pogodnih formulacija ili sastava za davanje jedinjenja pacijentima koji boluju od bolesti koja je izazvana prekomernom ćelijskom proliferacijom. Davanje može početi pre nego što pacijent pokaže simptome.

[0081] Bilo koji odgovarajući način davanja može se upotrebiti, na primer, davanje može biti parenteralno, intravenozno, intraarterijalno, subkutano, intratumorski, intramuskularno, intrakranijalno, intraorbitalno, oftalmološko, intraventrikularno, intrahepatsko, intrakapsularno, intraatekalno, intracisternalno, intraperitonealno, intranazalno, aerosol, supozitorije ili oralno davanje. Na primer, terapeutske formulacije mog biti u obliku tečnih rastvora ili suspenzija; za oralno davanje, formulacije mogu biti u obliku tableta ili kapsula; i za intranazalne formulacije, u obliku praškova, nazalnih kapi i aerosoli. Za bilo koji od postupaka davanja opisanih iznad, sastav se poželjno daje intravenozno ili se nanosi na mesto potrebnog događaja apoptoze (npr., injekcijom).

[0082] Dobro poznati postupci u struci za pravljenje formulacija nalaze se, na primer u „Remington: The Science and Practice of Pharmacy“ ured. A. R. Gennaro, Lippincourt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2000. Formulacije za parenteralno davanje mogu, na primer, sadržati ekscipijense, sterilisanu vodu, ili slani rastvor, polialkilen glikole kao što je polietilen glikol, ulja biljnog porekla ili hidrogenisane naftalene. Biokompatibilni, biorazgradivi laktid polimer, laktid/glikolid kopolimer ili polioksietilen-polioksipropilen kopolimeri mogu biti korišćeni za kontrolisanje oslobađanja jedinjenja. Drugi potencijalno korisni parenteralni sistemi za isporučivanje sredstava obuhvataju etilen-vinil acetat kopolimerne čestice, osmotske pumpe, infuzione sistemi koji se mogu ugraditi i lipozome. Formulacije za inhalaciju mogu sadržati ekscipijense, na primer, laktozu, ili mogu biti vodeni rastvori koji sadrže, na primer, polioksiletilen-9-lauril eter, glikoholat i dezoksiholat, ili mogu biti uljani rastvori za davanje u obliku nazalnih kapi, ili kao gel.

[0083] Formulacije mogu biti date ljudskim pacijentima u terapeutski delotvornim količinama (npr., količine koje sprečavaju, uklanjanju ili smanjuju patološko stanje) radi pružanja terapije za bolest ili stanje. Poželjno doziranje sastava iz pronalaska verovatno zavisi od takvih promenljivih kao što su tip i obim poremećaja,

opšte zdravstveno stanje naročitog pacijenta, formulacija ekscipijenasa jedinjenja i način davanja.

[0084] Količine za doziranje kod ljudi za bilo koju ovde opisanu terapiju početno mogu biti određene ekstrapolacijom količina jedinjenja korišćenih kod miševa, kako stručnjak prepoznaje rutinski je u struci modifikovani doziranja za ljude u odnosu na životinjske modele. U određenim otelotvorenjima, predviđeno je da doziranje može varirati između oko 10<7>pfu do oko 10<11>pfu; ili od oko 10<8>pfu do oko 10<10>pfu ili od oko 10<9>pfu do oko 10<11>pfu. U drugim otelotvorenjima, doza može biti oko 10<7>pfu, 10<8>pfu, 10<9>pfu, 10<10>pfu, 10<11>pfu… Naravno, količine doziranja mogu biti podešene na gore ili da dole, kako se rutinski vrši u takvim protokolima tretiranja, u zavisnosti od rezultata početnih kliničkih proba i potreba naročitog pacijenta.

Odabir postupka za tretiranje

[0085] Nakon što je ispitanik dijagnostikovan da ima neoplaziju postupak tretiranja se bira. Kod neoplazije, na primer, više standardnih režima tretiranja je dostupan. Profil markera neoplazije koristi se u odabiru postupka za tretiranje. U jednom otelotvorenju, ćelije neoplazije su responzivne na ćelijsko ubijanje sa NDV (npr., r73T-R116).

[0086] Manje agresivne neoplazije imaju veću verovatnoću da budu podložne konzervativnim postupcima tretiranja. Agresivnije neoplazije (npr., metastatička neoplazija) su manje podložne konzervativnim postupcima tretiranja i imaju veću verovatnoću da se vrate. Kada postupci upotrebe iz pronalaska ukazuju da je neoplazija veoma agresivna, agresivni postupak tretiranja bi trebalo izabrati. Agresivni terapeutski režimi obično obuhvataju jednu ili više od sledećih terapija: hiruršku resekciju, terapiju radijacijom ili hemoterapiju.

Probe za merenje ćelijske održivosti

[0087] Sredstva (npr., NDV) koja su od koristi za postupke iz obelodanjivanja obuhvataju ona koja uzrokuju smrt neoplastičnih ćelija i/ili redukuju preživljavanje neoplastičnih ćelija, tj., održivost.

4

[0088] Testovi za merenje ćelijske održivosti dobro su poznati u struci, i opisani su, na primer, od strane Crouch i dr. (J. Immunol. Meth.160, 81-8);Kangas i dr. (Med. Biol.62, 338-43, 1984); Lundin i dr., (Meth. Enzymol.133, 27-42, 1986); Petty i dr. (Poređenje J. Biolum. Chemilum.10, 29-34, .1995); i Cree i dr. (AntiCancer Drugs 6: 398-404, 1995). Ćelijska održivost može biti ispitana upotrebom različitih postupaka, uključujući MTT (3-(4,5-dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazolijum bromid) (Barltrop, Bioorg. & Med. Chem. Lett.1: 611, 1991; Cory i dr., Cancer Comm. 3, 207-12, 1991; Paull J. Heterocyclic Chem. 25, 911, 1988). Probe za ćelijsku održivost takođe su komercijalno dostupne. Ove probe obuhvataju ali nisu ograničene na CELLTITER-GLO® luminiscentni test održivosti ćelije (Promega), koji koristi tehnologiju luciferaze za detektovanje ATP i kvantifikuje zdravlje ili broj ćelija u kulturi, i CellTiter-Glo® luminiscentni test održivosti ćelije, koji je laktat dehidrogenaza (LDH) test citotoksičnosti (Promega).

[0089] Kandidati za jedinjenja koja uzrokuju ili povećavaju umiranje neoplastičnih ćelija (npr., povećavaju apoptozu, smanjuju ćelijsko preživljavanje) takođe su korisni kao antineoplazmatska terapeutska sredstva. Probe za merenje apoptoze ćelija poznate su stručnjaku. Apoptotske ćelije su okarakterisane sa karakterističnim morfološkim izmenama, uključujući hromatinsku kondenzaciju, ćelijsko sakupljanje i uvođenje mehurova, što se može jasno primetiti upotrebom svetlosne mikroskopije. Biohemijska svojstva apoptoze obuhvataju DNK fragmentaciju, proteinsko deljenje na specifičnim lokacijama, povišenu propusnost mitohondrijske membrane i pojavljivanje fosfatidilserina na površini ćelijske membrane. Probe za apoptozu su poznate u struci. Primerne probe obuhvataju TUNEL (Terminalna deoksinukleoditil transferaza Biotin-dUTP Nik kraj obeležavanje) probe, probe aktivnosti kaspaze(naročito kaspaze-3), i probe za fas-ligand i aneksin V. Komercijalno dostupni proizvodi za detektovanje apoptoze obuhvataju, na primer, Apo-ONE® proba homogene kaspaze-3/7, FragEL TUNEL komplet (ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS, San Diego, CA), ApoBrdU DNK proba fragmentacije (BIOVISION, Mountain View, CA), i brzi komplet za detekciju apoptotske DNK lestvice (BIOVISION, Mountain View, CA).

[0090] Neoplastične ćelije imaju sklonost da metastaziraju, ili da se rašire iz njihovog originalnog lokusa do udaljenih tačaka u telu. Probe za metastatički potencijal ili invazivnost poznate su stručnjaku. Takve probe obuhvataju in vitro probe za gubitak kontaktnog suzbijanja (Kim i dr., Proc Natl Acad Sci U S A.101:16251-6, 2004), povećano formiranje meke agar kolonije in vitro (Zhong i dr., Int J Oncol.24(6):1573-9, 2004), modeli plućne metastaze (Datta i dr., In vivo, 16:451-7, 2002) i Matrigel-zasnovane probe ćelijske invazije (Hagemann i dr. Carcinogenesis.25: 1543-1549, 2004). In vivo postupci skrininga za ćelijsku invazivnost su takođe poznati u struci, i obuhvataju, na primer, skrining tumorigeniciteta kod atimičnih golih miševa. Uobičajeno korišćena in vitro proba za procenjivanje metastaze je Matrigel-zasnovana proba ćelijske invazije (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ).

[0091] Ukoliko je poželjno, kandidati jedinjenja izabrani za bilo koji od ovde opisanih postupaka skrininga testirani su za svoju efikasnost upotrebom životinjskih modela neoplazije. U jednom otelotvorenju,

miševima su ubrizgane ljudske neoplastične ćelije. Miševi koji su sadržali neoplastične ćelije su zatim ubrizgani (npr., intraperitonealno) sa sredstvom za prenošenje (PBS) ili kandidatom jedinjenja dnevno ili za vremenski period koji se empirijski određuje. Miševi su zatim eutanazirani i neoplastična tkiva su sakupljena i analizirana za nivoe NDV, NDV polipeptida, i/ili NDV markera (npr., transgen koji kodira detektabilni deo) upotrebom ovde opisanih postupaka. Jedinjenja koja smanjuju NDV, NDV polipeptide ili mRNK NDV nivoa markera ili ispoljavanje proteina relativno u odnosu na kontrolne nivoe očekuju se da budu efikasna za tretiranje neoplazme kod ispitanika (npr., ljudskog pacijenta). U drugom otelotvorenju, uticaj kandidata jedinjenja na opterećenje tumora je analiziran kod miševa ubrizganih sa ljudskim neoplastičnim ćelijama. Neoplastične ćelije su ostavljene da rastu dok ne formiraju masu. Miševi su zatim tretirani sa kandidatom jedinjenja ili sredstvom za prenošenje (PBS) dnevno ili za vremenski period koji se empirijski određuje. Miševi su eutanazirani i neoplastično tkivo je sakupljeno. Masa neoplastičnog tkiva kod miševa tretiranih sa izabranim kandidatom jedinjenja upoređena je sa masom neoplastičnog tkiva prisutno kod odgovarajućih kontrolnih miševa.

Kompleti

[0092] Obelodanjivanje pruža komplete za tretiranje ili sprečavanje sarkoma. U jednom otelotvorenju, komplet obuhvata terapeutski ili profilaktički sastav koji sadrži delotvornu količinu NDV (npr., r73T-R116) u jediničnom obliku za doziranje. U daljem otelotvorenju, komplet obuhvata terapeutski ili profilaktički sastav koji sadrži delotvornu količinu NDV (npr., r73T-R116) u jediničnom obliku za doziranje.

[0093] U nekim otelotvorenjima, komplet sadrži sterilnu ambalažu koja sadrži terapeutski ili profilaktički sastav; takve ambalaže mogu biti kutije, ampule, flaše, boce, kese, kesice, blister pakovanja ili drugi pogodni oblici ambalaže poznati u struci. Takve ambalaže mogu biti napravljene od plastike, stakla, laminiranog papira, metalne folije ili drugih materijala pogodnih za držanje medikamenata.

[0094] Ukoliko je poželjno antitelo iz obelodanjivanja dato je zajedno sa uputstvima za davanje NDV (npr., r73T-R116) ispitaniku koji ima ili je pri riziku od razvijanja neoplazije. Uputstva će uopšteno obuhvatati informacije o upotrebi sastava za tretiranje ili sprečavanje neoplazije. U drugim otelotvorenjima, uputstva obuhvataju bar jedno od sledećeg: opis terapeutskog sredstva; raspored doziranja i davanja tretiranja ili sprečavanja neoplazije ili njenih simptoma; predostrožnosti; upozorenja; indikacije; kontraindikacije; informacije o prekomernom doziranju; štetne

reakcije; životinjsku farmakologiju; klinička ispitivanja; i/ili reference. Uputstva mogu biti štampana direktno na ambalaži (kada je prisutna), ili kao oznaka primenjena na ambalažu, ili kao odvojeni list, pamflet, kartica, fascikla data u ili sa ambalažom.

[0095] Upotreba predmetnog obelodanjivanja koristi, ukoliko nije drugačije ukazano, konvencionalne tehnike molekularne biologije (uključujući rekombinantne tehnike), mikrobiologije, ćelijske biologije, biohemije i imunologije, koje su dobro poznate u nadležnosti stručnjaka. Takve tehnike objašnjene su u potpunosti u literaturi, kao što je, „Molecular Cloning: A Laboratory Manua“, drugo izdanje (Sambrook, 1989);

„Oligonucleotide Synthesis“ (Gait, 1984); „Animal Cell Culture“ (Freshney, 1987);

„Methods in Enzymology“ „Handbook of Experimental Immunology“ (Weir, 1996); „Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells“ (Miller i Calos, 1987); „Current Protocols in Molecular Biology“ (Ausubel, 1987); „PCR: The Polymerase Chain Reaction“, (Mullis, 1994); „Current Protocols in Immunology“ (Coligan, 1991). Ove tehnike su primenljive za proizvodnju polinukleotida i polipeptida iz pronalaska, i, kao takvi, mogu se razmatrati za pravljenje i izvršavanje pronalaska. Naročito korisne tehnike za konkretna otelotvorenja biće razmotrene u sledećim odeljcima.

[0096] Tehnički podaci koji su dati u nastavku mogu u nekom pogledu ići dalje od obima pronalaska, koji je definisan isključivo priloženim zahtevima. Dodatni tehnički podaci su

4

pruženi kako bi se predmetni pronalazak dao u širem tehničkom kontekstu i kako bi se ilustrovali potencijalni srodni tehnički razvoji.

PRIMERI

Primer 1. Sklop antigenoma cDNK kod NDV soja 73T.

[0097] Šest podgenomskih cDNK fragmenata stvorenih sa RT-PCR visoke tačnosti je sklopljeno u pUC19 vektor. cDNK pune dužine od NDV 73T je označena kao p73T.

Nukleotid i zaključene aminokiselinske sekvence mesta deljenja F proteina (FPCS) u 73T su modifikovani do onih od NDV LaSota soja (lentogeni, lento) ili glikoproteina B (gB) od citomegalovirusa (CMV) (S116) (Slika 1: dupla linija ukazuje na mesto deljenja F proteina). cDNK je potpuno sekvencirana kako bi se potvrdila virusna sekvenca. Mesto deljenja F proteina: Wt: ggg agg aga cag aaa cgc ttt; Lento: ggg ggg aga cag gaa cgc ctt; S116: cat aat aga acg aaa tcc ttt; S116KM: cat aat aaa atg aaa tcc ttt; R116: cat aat aga acg aaa cgc ttt.

Primer 2. Unošenje transgena u NDV 73T genom.

[0098] Transgeni su uneti u p73T na dve lokacije: kod intergenskih sekvenci između P i M ili kod intergenskih sekvenci između HN i L spojeva (Slika 2A). Za unošenje pojedinačne transgenske kasete na P-M ili HN-L spojeve, konstruisanje p73T cDNK koja sadrži transgen pri P-M ili HN-L spojevima je izvršeno unošenjem transgenske kasete u AfeI mesta stvorena između P i M gena (nt 3148) ili između HN i L gena (nt 8231). Uneta genska kaseta sadrži kraj gena (GE; 5'-TTAAGAAAAAA -3'), intergenski nukleotid (T), sekvencu početka gena (GS; 5'-ACGGGTAGA -3'), i otvoreni okvir za čitanje (ORF) transgena. Dodatno, deset nukleotida (5'- cgccgccacc-3') je uneto uzvodno od mesta započinjanja radi uvođenja Kozak sekvence. Pune dužine (FL) 73T cDNK koja sadrži transgen na P-M ili HN-L spoju označena je kao p73T-P1 ili p73T-HN1, respektivno. Pune dužine cDNK koja sadrži dva odvojena transgena na P-M i HN-L spojevima u pojedinačnom genomu konstruisana je i označena kao p73T-P1-HN1 (Slika 2B). Radi unošenja dve transgenske kasete u isti spoj (npr., P-M), AfeI mesto je uvedeno na kraju ORF prvog transgena (#1) (nt 3169).2. transgen ORF je PCR pojačan sa primerima koji sadrže GE i GS sekvence i uneti su na AfeI mestu. Antigenomska cDNK koja sadrži dve transgenske kasete na P-M spojevima označena je kao p73T-P2.

Primer 3. Dobijanje infektivnog rekombinantnog NDV soja 73T (r73T) sa modifikovanim FPCS.

[0099] NDV 73T NP, P, L proteini i antigenska cDNK (p73T-lento ili p73T-S116) klonirana je pod kontrolom T7 RNK promotera i terminatora polimeraze. Četiri plazmida su zajedno transfektovana u ćelijsku liniju koja ispoljava RNK polimerazu (Slika 3A). Dobijeni virusi označeni su kao r73T-lento ili r73T-S116. r73T-lento i r73T-S116 su pušteni u Vero ćelije sa podlogom sa i bez tripsin suplementa. Rast r73T-lento je zavistan od tripsina gde r73T-S116 može rasti u podlozi bez tripsin suplementa. Sekvence deljenja F proteina (FPCS) u r73T-S116 sa i bez hGM-CSF na P-M spoju, su procenjene. 73T-S116 sojevi su dalje pušteni 10 puta u Vero i ljudske fibrosarkom HT1080 ćelije pri MOI 0.01 u podlozi bez suplementa tripsina. Mutacije u FPCS (R113K i/ili Q114M) su se pojavile pri prolazu 7. S116R mutacija detektovana je pri prolazu 9. Pri prolazu 10, F, HN i transgen su sekvencirani i dodatne mutacije nisu pronađene.

Primer 4. Karakterizacija rekombinantnog 73T soja sa različitim sekvencama deljenja F proteina.

[0100] Rekombinantni 73T soj sa novim modifikovanim sekvencama deljenja F proteina (FPCS) obuhvatao je sledeće sekvence:

• Lento:<111>G-G-R-Q-E-R/L-I<118>

• S116:<111>H-N-R-T-K-S/F<117>

• S116K:<111>H-N-K-T-K-S/F<117>

• S116M:<111>H-N-R-M-K-S/F<117>

• S116KM:<111>H-N-K-M-K-S/F-I<118>

• R116:<111>H-N-R-T-K-R/F-I<118>

[0101] Rekombinantni 73T sojevi sa različitim FPCS su okarakterisani u vezi sa MDT, ICPI, relativnim HT1080 ćelijskim ubijanjem, replikacijom u Vero ćelijama i replikacijom u jajima (Slika 4).

[0102] Virulencija kod ptica NDV je uglavnom određena sa sekvencama deljenja F proteina (FPCS). r73T-lento je projektovan da sadrži FPCS ne-virusnog soja LaSota. Replikacija LaSota virusa u kulturama tkiva zavisna je od tripsina, kako se F protein ne može deliti.

4

r73T-lento formira male plakove u Vero ćelijama bez tripsinskog suplementa, ukazujući da F protein nije podeljen i da se virus ne može efikasno širiti od ćelije do ćelije. r73-lento se replicirao na nižem nivou u Vero ćelijama (7.5 × 10<3>pfu/ml), ali efikasno u jajima sa endogenim enzimom nalik tripsinu (5.7 × 10<8>pfu/ml). r73-lento nije virusni kod kokošaka kao što je demonstrirano sa srednjim vremenom umiranja (MDT) embriona inokulisanih sa virusom (MDT >156h) i sa indeksom intracerebralne patogenosti (ICPI; ICPI=0.0) i ima nisko citotoksičnost kod HT1080 ćelija (13% ćelijsko ubijanje).

[0103] r73T-S116 može formirati relativno velike plakove, i dostignuti titar od 4.4 × 10<6>pfu/ml u Vero ćelijama. Ovo je uporedivo sa titrima dobijenim kada je r73T-S116 rastao u Vero ćelijama dopunjenim sa tripsinom. Ovi podaci ukazuju da se mesto deljenja fuzionog proteina (FPCS) kod r73T-S116 može podeliti bez egzogenog tripsina u kulturama tkiva. Nije bio virusan kod kokošaka i pokazao je 31% ćelijsko ubijanje kod HT1080 ćelija. r73T-S116 je ispitan za svoju genetsku stabilnost u in vitro prolazu.

[0104] Nakon 10 prolaza u Vero ili HT1080 ćelija, aminokiselinske zamene pronađene su u FPCS: R113K, Q114M, i/ili S116R. Za eliminisanje mogućnosti da su se dodatne izmene sekvence odigrale u virusnom genomu, rekombinantni r73T-S116 mutantni virusi konstruisani su reverznom genetikom i procenjeni su. Osim za r73T-R116, r73T-S116 i njegovi derivati bili su slični roditeljskom S116 u tome što ovi mutirani virusi nisu bili virusni za kokoške i bili su u stanju da imaju slične nivoe HT1080 ćelijskog ubijanja.

HT1080 ćelijsko ubijanje bilo je između 29%-31% za pojedinačnu mutaciju i 48% za dvostruku mutaciju.

[0105] Veličina plaka M114 i K113M114 značajno je veća od S116. Ther73T-R116 mutant je dobio jednu aminokiselinsku izmenu na ostatku 116 (S116R) u FPCS. R116 pored mesta deljenja poznat je da je značajan za efikasno deljenje F proteina. r73T-R116 je formirao velike plakove u Vero ćelijama, dostigao je veličinu sličnu titrima sa i bez tripsinskog suplementa, i efikasno je ubio HT1080 ćelije (80%). R116 je povećao virulenciju kod kokošaka kao što je prikazano sa MDT probom (72, 80 h). Iako je ICPI vrednost (0.65) bila <0.7 u jednom testu, poželjno je dalje smanjiti njegovu virulenciju kod kokošaka.

Primer 5. r73T-R116 derivati imaju smanjenu virulenciju kod kokošaka.

4

[0106] Virus može biti projektovan da izrazi transgen na P-M spoju (1) 2. transgen na HN-L spoju (2) i povećani HN-L intergenski region koji je proširen unošenjem ne-kodirajuće sekvence (3) (Slika 5A). Isti dizajn za unošenje transgenske kasete na P-M spoju kao na Slici 2A je ovde korišćen. 2. transgenska kaseta sadrži sekvencu početka L gena (GS; 5'-ACGGGTAGA -3'), otvoreni okvir za čitanje (ORF) transgena, sekvence od 3' neprevedenog regiona L gena (podvučeno u kurzivu) i sekvencu kraja L gena (GE; 5'-TTAAGAAAAAA -3'). Nekodirajuće sekvence korišćene za povećavanje HN-L spoja uzete su iz paramiksovirusa tipa-1 (APMV-1), respiratornog sinicijalnog virusa (RSV) ili nasumične sekvence koja nema homologiju sa bilo kojom poznatom sekvencom. Unošenje može biti u opsegu od 60-318 nt. Unošenje 2. transgena pri HN-L omogućilo je virusu da izrazi dva transgena, kao što su hGM-CSF i GFP. Unete sekvence na HN-L spoju su izlistane (Slika 5B).

Primer 6. Modifikacija r73T-R116 i karakterizacija r73T-R116 derivata.

[0107] Za smanjivanje r73T-R116 virulencije kod kokošaka, r73T-R116 virus je modifikovan kako bi se povećala HN i L intergenska sekvenca unošenjem sekvence različitih dužina. r73T-R116 derivati procenjeni su za neefektivnost ispitivanjem formiranja plaka i replikacije u ćelijama i jajima; za patogenost kod ptica ispitivanjem MDT i ICPI, i za ubijanje ćelija tumora (Slika 6A).

[0108] Intergensko unošenje 318nt iz APMV, 198nt iz RSV i 198 iz nasumičnih sekvenci zaista je smanjilo virulenciju kod kokošaka, sa MDT >156h i ICPI od 0.27, 0.0375 i 0, respektivno. Dugačko unošenje (nasumično 198 nt) imalo je povišeni uticaj na smanjenje virulencije od kratkog unošenja (nasumično 60 nt). Unošenje 144, 102 i 60nt je imalo određenu virulenciju kod kokošaka, ali MDT puta je bila manja. ICPI vrednosti za unošenje 144, 102 i 60nt su 0.74, 0.51 i 0.78, respektivno. Unošenje ne-virusne sekvence (nasumično 198nt) efikasnije je smanjilo virulenciju od unošenja virusne sekvence (RSV-198nt).

Unošenje 2. transgenske kasete (EGFP) na HN-L spoju nije smanjilo virulenciju kod kokošaka (MDT 86h i ICPI od 0.82). Sva unošenja blago su smanjila virusnu replikaciju u jajima za do 4 puta, ali nisu uticali na virusnu replikaciju u Vero ćelijama (~ 10<6>pfu/ml). Iako su mutantni virusi više oslabljeni kod kokošaka, funkcija ubijanja ćelija tumora nije pogođena. Svi r73T-R116 derivati imali su efikasnost ubijanja ćelija tumora u opsegu od 75%-86% na dan 3 od inficiranja.

4

Primer 7. Kinetika rasta r73T virusa u jajima i Vero ćelijama.

[0109] Za određivanje uslova rasta za r73T viruse, ispitivanja kinetike rasta izvršene su na jajima (Slika 7) i Vero ćelijama (Slika 8). Kokošja jaja sa embrionima inficirana su sa 100, 1000, 10,000 ili 100,000 FFU/jajetu ukazanog virusa i inkubirana su 2, 3 ili 4 dana.

Alantoična tečnost je sakupljena i virusni titri su određeni sa FFA. Kao što je prikazano na Slici 7, 100 FFU/jajetu imalo je niži titar na dan 1, ali je dostiglo maksimalni titar na dan 2. Uopšteno, većina virusa je dostiglo maksimalne titre od ~ 8 log/mL na dan 2 bez obzira na to da li su doze inokulata korišćene. R116i-198 je imao najniži titar, niska doza inokuluma stvorila je najveći prinos na dan 2, ukazujući da tu može postojati akumulacija defektivnih čestica. R116i-318-APMV unošenje takođe je imalo niski maksimalni titar od ~7 log. R116i-198-RSV je dostigao maksimalni titar od 7.5 log. S116 konstruisan reverznom genetikom nije imao redukciju u virusnoj zaštiti u jajima. Stoga, među R116 derivatima, virus sa RSV-198nt unošenjem je bio najbolji kandidat za onkolitički virus u pogledu svojstava rasta u jajima.

[0110] Virusi takođe procenjeni u klonu vero ćelije 51D11 bez seruma, vlasnička ćelijska linija stvorena od strane MedImmune. Svi virusi replicirani su dobro pod oba MOI uslovima (0.001 i 0.0001) (Slika 8). Modifikacija 73T FPCS i intergenskog unošenja u HN-L spoj R116 nije uticalo na rast virusa u Vero ćelijama.

Primer 8. Selektivno ubijanje ćelija r73T i derivata u ćelijama raka u poređenju sa normalnim ćelijama.

[0111] rT3T i njegovi derivati procenjeni su za svoje ubijanje ćelija u ljudskim fibrosarkom HT1080 u poređenju sa normalnim ljudskim kožnim fibroblast CCD1122Sk ćelijama, relativno u odnosu na netretirane kontrolne ćelije (Slike 9A i 9B). Podaci su dobijeni nakon inficirnanja sa r73T derivatima pri različitim dozama u rasponu od 1 do 100,000 PFU u trajanju od 72 h. U HT1080 ćelijama raka, virus sa lentogenim FPCS imao je najmanje ubijanje S116 pri FPCS imao je srednje a virus sa R116 i FPCS imao je ćelijsko ubijanje efikasno kao i r73T wt virus. U normalnim CCD1122SK ćelijama, ćelijsko ubijanje svih virusa nije bilo efikasno kao za ćelije raka. Smanjenje efikasnosti ubijanja bilo je ~100-puta. Bez obzira na FPCS sekvence, svi virusi imali su sličnu efikasnost ubijanja kod normalnih ćelija. Efikasnost ubijanja ćelija kod ćelija raka i normalnih ćelija ispoljena je kao 50%

4

efektivne koncentracije (EC50) što je interpolisano iz krive odgovora na dozu upotrebom Prism 6.0 (Slika 9C). R116 derivat je imao sličnu EC50vrednost kao r73T wt sa EC50od 10 PFU, što ukazuje da modifikacija FPCS nije uticala na replikaciju virusa i efikasnost ubijanja ćelija kod ćelija raka. Replikacija ovih virusa u HT1080 i CCD1122SK ćelijama pri MOI 0.01 određena je na dan 3 nakon infekcije (Slika 9D). Svi virusi poželjno su se replicirali u ćelijama raka u odnosu na normalne ćelije, sa razlikom od oko 1.5-2.0 log.

Primer 9. r73T derivati su imali anti-tumorsku aktivnost in vivo kada su isporučeni ili sistemski ili intratumorski u imunodeficijentne miševe koji nose ljudske tumorske ksenografte.

[0112] Za procenjivanje onkolitičke aktivnosti in vivo, HT1080 ksenograft model uspostavljen je ubrizgavanjem HT1080 ćelija pri koncentraciji od 5 × 10<6>ćelija/0.1ml subkutano u Balb/C atimički gole miševe pri starosti od 5-6 nedelja. Kako hGM-CSF nema unakrsnu reaktivnost kod miševa, ovo ispitivanje nije uspostavljeno da proceni transgenski uticaj, već onkolitičku sposobnost različitih r73T konstrukata. R116-318i-hGM-CSF je dat intratumorski (it) ili intravenozno (iv) i brzina rasta tumora je poređena između tretirane i kontrolne grupe (Slika 10A).

[0113] Miševi su nasumično podeljeni u grupe (N=10) kao što je ukazano kada je zapremina tumora dostigla približno 65 mm<3>. Miševi su primili pojedinačnu dozu ili PBS ili 2 × 10<7>Pfu r73T-hGM-CSF-R116i-198 datu intratumorski (it) ili 1 × 10<8>PFU datu intravenozno (IV) putem injekcije u repnu venu. Veličina tumora je merena svakih 3-4 dana. Kao što je prikazano na Slici 10A, r73T-R116i je mogao da uzrokuje značajnu regresiju tumora kada je dat ili sa IV ili IT. Količina regresije tumora uzrokovana sa dva načina bila je uporediva i značajno različita od kontrolne grupe.

[0114] Onkolitičke aktivnosti r73T derivata poređene su u HT1080 ksenograftima sa IT injekcijom 1 × 10<8>PFU (Slika 10B). Miševi su nasumično podeljeni u grupe (N=7) kada je zapremina tumora dostigla približno 180 mm<3>. Miševi su primili ili PBS ili 1 × 10<8>PFU r73T-hGM-CSF-lento (lento) ili r73T-hGM-CSF-S116K113M114 (S116 KM) ili r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N (R116i) ili r73T-hGM-CSF (r73T wt). Veličina tumora merena je svakih 3-4 dana (∗ P< 0.05 studentski T test sa nezavisnim uzorcima). Dve doze r73T derivata bile su u stanju da uzrokuju značajnu regresiju tumora iako su imale razlike u efikasnosti. r73T-lento je bio najmanje efikasan dok je r73T wt bio najefikasniji pri regresiji

4

tumora. r73T-lento je imao sličan uticaj kao S116 virus iako je S116 virus imao 10-puta nižu EC50za in vitro ćelijsko ubijanje (Slika 9A). r73T-R116i-318 je bio potentan kao 73T wt pri suzbijanju rasta tumora do 9 dana nakon 2. doze (dan 19 nakon implantacije tumora), tumor je opet rastao kod miševa tretiranih sa R116i, ali ne kod grupe tretirane sa 73T wt. Ovi podaci pokazali su da su r73T derivati imali anti-tumorsku aktivnost in vivo kada su isporučeni ili sistemski ili intratumorski u imunodeficijentne miševe koji nose ljudske tumorske ksenografte. Efikasno deljenje F proteina je značajno za replikaciju virusa in vitro i in vivo. Virusi sa R116 pri FPCS su potentniji pri ćelijskom ubijanju in vitro i in vivo.

Primer 10. Biodistribucija tkiva r73T derivata nakon intravenozne isporuke.

[0115] Za određivanje ukoliko se NDV virus selektivno replicira u tkivu tumora i virusnog klirensa, određena je distribucija virusa u različitim organima. Atimički goli miševi koji nose subkutane HT1080 tumore sa veličinom od ~ 250 mm<3>tretirani su sa R116i (r73T-hGM-CSF-R116i-318 nt APMV-N) pri dozi od 1 × 10<8>PFU intravenozno i žrtvovani su na dan 1, 4, ili 8 (n=3 po vremenskoj tački). Tumor, pluća, slezina, jajnici i serum su sakupljeni.

[0116] Prisustvo virusa kvantifikovano je probom plaka u Vero ćelijama, i hGM-CSF transgensko ispoljavanje mereno je sa ELISA probom. Virusna replikacija u tumoru i organima procenjena je na dan 1, 4 i 8 nakon infekcije. Virus je detektovan u organima samo na dan 1 (virus nije detektovan u jajnicima ni u jednoj vremenskoj tački) i virusno opterećenje u tkivu tumora je ~100-puta veće nego u plućima i slezinama (Slika 11A).

Prisustvo virusa u tumoru trajalo je bar 8 dana, ukazujući da se virus selektivno replicirao u tkivima tumora. Dosledno sa podacima o replikaciji virusa, nivo hGM-CSF imao je najviši nivo i trajao je više od 8 dana (Slika 11B). Ovi podaci demonstrirali su da se NDV virus može efikasno replicirati u tkivu tumora i isporučiti transgen do lokalnog tkiva tumora efikasno.

Primer 11. Antigenom cDNK 73T koji sadrži himerni F i/ili HN gen.

[0117] Virusni površinski glikoproteini značajni su antigeni za imunogenicitet i virulenciju kod kokošaka. Istražene su strategije za zamenjivanje F i HN gena NDV sa odgovarajućim ekstracelularnim (ekto) domenima ili drugim paramiksovirusa koji nisu virusni kod kokošaka pojedinačno ili u kombinaciji. Parainfluenca virus 5 (PIV 5) je paramiskovirus kod pasa koji ne izaziva bolesti kod ljudi. Paramiskovirus tip 1 kod golubova (PPMV-1) je pokazan da nije virusan kod kokošaka sa ICPI od 0.025, kao što je prethodno zabeleženo, i antigenetski je različit od (NDV) (Dortmans i dr, Veterinary Microbiology, 2010, vo.143, strane 139-144.) Postoje dve genetski blisko povezane varijante paramiksovirusa tipa 1 kod golubova (PPMV-1) sa identičnim velogenim mestima deljenja fuzionog proteina, ali sa veoma suprotnim virulencijama (Veterinary Microbiology, 2010, 143:139-144). Pune dužine antigenomske od cDNK NDV 73T kod kojih je F i/ili HN glikoproteinski ektodomen zamenjen sa onim od PPMV-1 i/ili PIV5 su stvorene (Slika 12A). NDV, PIV5 i PPMV-1 sekvence su ukazane sa obojenim kutijama kao plavo, ljubičasto ili zeleno, respektivno).

[0118] Aminokiselinske dužine pojedinačnih proteina ili proteinskih domena us ukazane. Formiranje plaka kod Vero, relativnim HT1080 ćelijskim ubijanjem i MDT izvršeno je kao što je prethodno opisano (Slika 12B). Himerni virusi, osim za PIV-5 F-HN, su dobijeni i bili su u stanju da rastu u ćelijama u odsustvu egzogenog tripsina. Sva tri virusa formirala su velike plakove, pokazujući efikasno širenje od ćelije do ćelije. PPMV-1 F-HN ili F himerni virusi imali su MDT vrednosti 79 i 84 h, respektivno, ukazujući na potencijalnu virulenciju kod kokošaka. Oba PPMI-1 i himerni su ubili HT1080 ćelije efikasno pri nivoima od 71 i 61%. PIV5-F himerni nisu rasli u jajima i nisu bili virusni kod kokošaka, i ubili su HT1080 ćelije pri 47%. Unakrsna reaktivnost seruma između NDV i PPMV-1 ili PIV5 himernih je ispitana probom neutralizacije upotrebom seruma sakupljenog iz miševa koji su primili dve intravenozne doze 1 × 10<8>PFU ili r73T-R116i. r73T virus je neutralisan sa NDV-inficiranim serumom (titar 960) dok PPMV-1 i PIV5 himerni nisu neutralisani (titar < 4). Ovaj rezultat je potvrdio da nije postojala unakrsna reaktivnost između NDV i PPMV-1 ili PIV5. Himerni virusi sa različitim antigenicitetima imaju potencijal da služe kao onkolitički virusi za povećavanje kod pacijenata koji imaju razvijene anti-NDV imunske odgovore za vreme prethodnog NDV tretiranja.

[0119] Poređenje aktivnosti NDV RNK polimeraze sa drugim paramiksovirusima sa probom mini-genoma (Slika 12C). Ćelije koje ispoljavaju T7 transfektovane su sa tri plazmida koji ispoljavaju NP, P, L proteine i plazmid koji kodira NDV anti-minigenomsku cDNK koja kodira GFP gen upotrebom Lipofektamina 200, ili plazmide koji kodiraju N, P, L gene virusa morbila (MV) ili respiratornog sinicijalnog virusa (RSV) i respektivnim RSV ili MV GFP anti minigenomskim cDNK plazmidom. Dva ili tri dana nakon transfekcije, minigenomska replikacija kao što je ukazano ispoljavanjem GFP proteina ispitana je pod fluorescentnim

1

mikroskopom. NDV je imao najjaču aktivnost polimeraze u poređenju sa virusom morbila i RSV.

Primer 12. Ćelije raka senzitivne na NDV su identifikovane skriningom panela ćelija.

[0120] U cilju razumevanja koji tipovi tumora mogu biti osetljivi na NDV onkolizu, 180 ćelijskih linija raka koje pokrivaju širok opseg tipova tumora i indikacija testirano je za osetljivost na rekombinantni NDV i njegove varijante. Ćelijske linije dobijene od Američke kolekcije tipa tkiva (Manassas, VA) ili Evropske kolekcije ćelijskih kultura (ECACC) su kultivisane u podlozi i pod uslovima preporučenim od dobavljača.10,000 ćelijskih linija raka je raspoređeno u ploče sa 96 udubljenja i inficirano 6 sati kasnije sa virusom. Koncentracije virusa bile su u rasponu od MOI 10- 0.0001 (ili 1 do 100,000 pfu po udubljenju). Održivost ćelija određena je 48-96h nakon infekcije. Osetljivost je određena upotrebom odsecanjem >30% ćelijskog ubijanja 72 h nakon infekcije sa virusom pri MOI od 0.1. Slike 13A i 13B pružaju pregled osetljivosti na osnovu tipa tumora. Ćelijske linije hematološkog raka (leukemija i limfom) relativno su neosetljive na NDV onkolizu gde je većina testiranih ćelijskih linija melanoma, jajnika i pankreasa bila osetljiva na NDV. Približno 58% svih testiranih ljudskih ćelijskih linija raka bilo je osetljivo na NDV R116i pri FPCS relativno u odnosu na 4% testiranih ćelijskih linija osetljivih na S bazirani virus. Ovo je najverovatnije bilo usled deljenja F proteina sa proteazama. R116i virus ima veću verovatnoću da bude podeljen sa sveprisutnim proteazama nalik furinu gde je proteaza koja ima najveću verovatnoću da podeli S116 F protein nedefinisana i najverovatnije manje sveprisutno ispoljena. Ponovo izvedena S116-KM varijanta dala je veći plak i pojačani onkolitički potencijal relativno u odnosu na originalnu S116 varijantu. Za dalje testiranje manji panel od 22 ćelijske linije raka koje su određene da imaju opseg osetljivosti na NDV R116 virus inficirano je sa GFP ispoljavajućim varijantama i ćelijska održivost određena je 72h nakon infekcije. Upotrebom iznad opisanog odsečka sa istom osetljivošću, 41% testiranih ćelijskih linija je bilo osetljivo na R116i, 4% osetljivo na S116 i ponovo izvedeni S-KM je potentniji od S116 NDV sa 27% testiranih ćelijskih linija koje su osetljive.

2

[0121] Ćelije izvedene iz ukazanog tkiva raka ispitano je za ćelijsko ubijanje sa rekombinantnim NDV 73T sa R116 i FPCS i ljudskim GM-CSF. Broj ćelija koji je pokazao veće od 50% ubijanje sa virusnom infekcijom pri moi od 0.1 i ukupne ćelijske linije proverene su ukazane.

Primer 13. r73T derivati su imali aktivnost ubijanja tumora i/ili suzbijanja rasta tumora u singergističkom modelu melanoma.

[0122] Nakon poboljšavanja modela tumora, S116-RD NDV koji kodira ljudski ili mišiji GM-CSF testiran je za efikasnost u poboljšanom B16F10 singergističkom modelu (Slika 15A i 15B).1x 10<8>pfu je inficirano intratumorski u količini od 3 doze i postojalo je minimum 8 miševa po grupi. Značajno suzbijanje rasta tumora pokazano je sa >80% suzbijanjem rasta tumora (Slika 15). Kratkotrajna regresija tumora postignuta je sa ponovljenim intratumorskim (i.t.) doziranjem, što je takođe dovelo do značajnog povećanja u vremenu preživljavanja 18 dana za kontrolu relativno u odnosu na 42 dana kod tretirane grupe. Prekidanje tretiranja nakon 3 doze praćeno je sa ponovnim rastom tumora. Pojedinačna životinja bez dokaza o tome da li ima tumor u S116-mGM-CSF grupi nakon 50 dana ponovo je izazvana ugrađivanjem B16F10 ćelijama tumora u drugom boku. Rast tumora usporen je ali nije suzbijen, što predlaže da u ovom modelu potpuni imunski memorijski odgovor nije postignut kod ove pojedinačne životinje.

[0123] U cilju procenjivanja onkolitičkih i imunskih uticaja na rast tumora, NDV varijante R116i i S116 koji kodiraju hGM-CF ili mGM-CSF respektivno su testirani za efikasnost u mišijem singenetičkom imunskom kompetentnom CT26 modelu kolorektalnog tumora. Svaki virus je doziran sa 1×10<8>PFU virusa intra-tumorski u količini od 4 doze. Tumori su bili minimalni sa 100 mm<3>pre nego što je započeto doziranje. Sve životinje tretirane sa virusom pokazale su potentnu anti-tumorsku aktivnost kao monoterapiju. Sa 11/12 životinja bez tumora nakon tretiranja sa R116 koji kodira ljudski GM-CSF što je 92% stepen potpunog odgovora. Manje litični ponovo izvedeni S116-KM virus imao je smanjeno suzbijanje rasta tumora postižući 53% TGI i potpuni stepen odgovora od 36%. Međutim, u prisustvu mišijeg GM-CSF koji će za razliku od ljudskog GM-CSF biti aktivan u mišijem modelu ovaj stepen odgovora povećaće se do 54% sa suzbijanjem rasta tumora od 75%. Stoga, verovatno je da opremanje S116 virusa sa GM-CSF može pojačati anti-tumorsku aktivnost.

[0124] Tumori koji su preostali uzeti su za histološku analizu i obeleženi sa Hematoksilinom i eosin bojom (H i E) i upotrebom imunohistohemijskih postupaka za NDV detekciju (Slika 15C). Postoji jasni dokaz NDV ispoljavanja i deluje da je koncentrovano oko nekrotičnih oblasti tumora, što predlaže da NDV doprinosi smrti ćelija tumora i nekrozi. Takođe postoje jasno dokazi inflamacije imunskih ćelija u tumoru i nekrotičnih oblasti. U oblastima koje imaju jako obeležavanje za NDV multinuklearne ćelije formiranje sincitije može takođe biti zabeleženo. Dodatno, deluje da postoji minimalno preostalog održivog tumora, što ukazuje da podaci o suzbijanju tumora mogu potcenjivati aktivnost NDV u ovom modelu.

[0125] Slika 15C pokazuje da NDV ima potentnu anti-tumorsku aktivnost u imunskom kompetentnom mišijem CT26 modelu kolorektalnog tumora. U cilju procenjivanja onkolitičkih i imunskih uticaja na rast tumora, NDV varijante (R116i i S116 koji kodiraju

4

hGM-CF ili mGM-CSF respektivno su testirani za efikasnost u mišijem singenetičkom imunskom kompetentnom CT26 modelu kolorektalnog tumora. Svaki virus je doziran sa 1×10<8>PFU virusa intra-tumorski u količini od 4 doze. Tumori su bili minimalni sa 100mm<3>pre nego što je započeto doziranje. Sve životinje tretirane sa virusom pokazale su potentnu anti-tumorsku aktivnost kao monoterapiju. Sa 11/12 životinja bez tumora nakon tretiranja sa R116 koji kodira ljudski GM-CSF što je 92% stepen potpunog odgovora. Manje litični ponovo izvedeni S116-KM virus imao je smanjeno suzbijanje rasta tumora postižući 53% TGI i potpuni stepen odgovora od 36%. Međutim, u prisustvu mišijeg GM-CSF koji će za razliku od ljudskog GM-CSF biti aktivan u mišijem modelu ovaj stepen odgovora povećaće se do 54% sa suzbijanjem rasta tumora od 75%. Stoga, opremanje S116 virusa sa GM-CSF pojačava anti-tumorsku aktivnost.

[0126] Slike 15D-F prikazuju da više doziranja sa rNDV R116i izaziva suzbijanje rasta tumora i navodi sakupljanje imunskih ćelija u ksenograft model raka jajnika (OVCAR4). Za dalje procenjivanje rNDV onkolitičke aktivnosti in vivo ljudski ksenograft model raka jajnika (OVCAR4) je korišćen. Ovaj model sporo raste i ima bruto patologiju koja podseća na ljudske tumore jajnika sa loše diferenciranom ćelijskom morfologijom i velikim površinama ispunjenim sa tečnošću nalik as ascitesu. Kada su tumori dostigli 100mm<3>miševi su nasumično podeljeni kako bi primili 8 doza R116i NDV koji kodira ili mišiji ili ljudski GM-CSF ili PBS kao kontrolu. Samo bi proizvod iz mišije genske sekvence bio bioaktivan kod mišijeg modela. 2.5x 10<7>pfu je ubrizgano intra-tumorski u zapreminu manju od 50 µl jednom nedeljno. Krive rasta tumora prikazane su na Slici 15D. Dugoročno suzbijanje tumora ostvareno je kod životinja koje imaju tumor tretiranih sa bilo kojom NDV varijantom. Nije postojao dokaz virusnog genoma upotrebom RT-PCR sa tumorom na kraju ispitivanja (24 h nakon poslednje doze). Nakon histološke analize postojao je jasan dokaz imunskih infiltrata kao i drugih histoloških izmena u preostalom tumoru (Slike 15E i F). Tretirani tumori su mnogo manje de-diferencirani nego kod kontrolnih tretiranih životinja i deluju da imaju manje površina ispunjenih sa ascites tečnošću. Visok nivo inflamatornog infiltrata pronađen kod više tretiranih tumora susednih preostalom tumoru i imunohistohemijska (IHC) analiza otkrivaju da su ovi imunski infiltrati pozitivni na NDV protein. Postoji visok stepen regrutovanih urođenih imunskih ćelija u tumore kod NDV tretiranih grupa. Ovi podaci demonstriraju potentnu anti-tumorsku efikasnost kod morfološki relevantnog modela raka jajnika koji može biti uzrokovan direktnom onkolizom i urođenom imunskom regrutacijom i aktiviranjem.

Primer 14: Regresija tumora uzrokovana sa NDV virusima.

[0127] 73T-R116i-hGM-CSF i 73T-R116i-mGM-CSF su procenjeni za onkolitički uticaj u B16 modelu melanoma. Ispitivanje je procenilo toleranciju virusa kod B16 miševa. Svaki virus je doziran pri 2×10<7>pfu dva puta na dane 11 i 14 intravenozno (i.v) ili intraperitonealno (i.p), ili jednom na dan 11 pri 1.1×10<7>pfu intratumorski (it.). Grupe tretirane sa R116-hGM-SCF ili mGM-SCF sa tri različita načina ili davanja imale su sporiji rast tumora u poređenju sa netretiranom grupom (Slika 15A). Svaka grupa je obuhvatala 3 miša. Brzina suzbijanja tumora je statistički značajnija nego za kontrolnu grupu. Stoga, r73T derivati iz pronalaska su imali pogodnije manju patogenost kod ptica, veću onkolitičku aktivnost i replicirali su se do visokih titra u kokošjim jajima. Na osnovu ovih rezultata, virusi iz pronalaska su od koristi za uzrokovanje regresije tumora i poboljšavanje ishoda tretiranja pacijenata sa rakom (Slika 16).

[0128] Dodatno GM-CSF, više transgena (Tabela 2) može biti uneto u NDV 73T soj kako bi se pojačalo ubijanje tumora. Ovi transgeni obuhvataju sledeće:

1. (1) Citokine ili uvećane varijante citokina, kao što su GM-CSF, IL-2, IL-21, IL-15, IL-12 i IL-12p70

2. (2) Ligande ćelijske površine i hemokine, uključujući OX40L, CD40L, ICOSL, Flt3:, B.1 (CD80), CD137L, CXCL10 (IP-10), CCL5, CXCL9. (3) Myc inhibitor: Omomyc. (4) Transgene za svrhe in vivo imidžinga, kao što je natrijum jodid simporter (NIS)-posredovana radioviroterapija za radioviroterapiju. (5) Dodatne modulatore preživljavanja ćelija tumora radi poboljšanja ubijanja tumora koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, inhibitore napredovanja ćelijskog ciklusa, inhibitore anti-apoptičnih proteina, pojačivače pro-apoptičnih proteina, inhibitore ključnih onkogenih vodilaca maligne transformacije. Ovo može obuhvatati transgensko isporučivanje proteina nakon selektivne NDV replikacije u ćelijama tumora, proizvodnju selektivne ili široke aktivnosti siRNK, isporučivanje miRNK ili suzbijanje odabrane miRNK (6) Tumorske antigene kao što su E6, E7, antigene raka testisa, onkofetalni antigeni, veštački ili prekomerno ispoljeni proteini kao što su novi tumorski antigeni ili samostalno ili u kombinaciji sa drugim transgenima. (7) Antitela ili rekombinantne fuzione proteine koji ciljaju imunomodulatorne proteine ili za blokiranje negativne regulacije ili za pružanje agonističkog signala za pojačavanje funkcije T ćelija. Primer takvih antitela može obuhvatati ali nije ograničen na; PD-L1, CTLA4, CD-137 (41BB), OX40, GITR, TIM-3, CD73, PD-1, HVEM, i LIGHT. (8) Augmentaciju recNDV farmakodinamičke/farmakokinetičke aktivnosti projektovanjem ili ispoljavanjem recNDV u ćelijama koje prenose proteina na recNDV kako bi se smanjio klirens sa komplementom ili smanjio adaptivni imunski odgovor na NDV.

Tabela 5. Transgeni za potencijalno unošenje u NDV 73T i njihove biološke aktivnosti

Primer 15. Terapija raka koja uključuje davanje onkolitičkog NDV u kombinaciji sa imunskim modulatornim mAb.

[0129] NDV onkolitički virus može biti dat konkurentno ili zajedno sa terapeutskim antitelima ili agonističkim fuzionim proteinima tamo gde je to pogodno (npr., anti-PD-Ll, anti-CTLA4, anti-OX40, anti-GITR, anti-TIM-3, anti-PD-1 i anti-ICOS). Stvoreni su pretklinički podaci koji uspostavljaju najdelotvorniju dozu i redosled molekula koji poboljšavaju aktivnost NDV u modelima tumora u kombinaciji sa novim NDV konstruktima koji su ovde opisani. Transgeni mogu biti uneti u rekombinantni NDV za ekspresiju ili pojedinačno ili u kombinaciji radi isporučivanja više režima aktivnosti, npr., za poboljšavanje smrti ćelija tumora uzrokovane sa novim varijantama NDV. Povećavanje oslobađanja antigena ćelija tumora kombinovanih sa imunomodulatornim pristupom ima potencijal da poveća adaptivni imunski odgovor na ove oslobođene tumorske antigene.

Primer 16. Efikasnost deljenja F proteina i fuziona aktivnost su smanjeni u F proteinu sa R, S ili S-KM mutacijom na mestu deljenja F proteina.

[0130] U cilju shvatanja da li razlike u mestu deljenja F proteina utiču na deljenje F proteina u inficiranim ćelijama i njihov uticaj na aktivnost fuzije, plazmid F proteina je transfektovan u 293 ćelije kako bi se ispitalo deljenje F proteina. Dodatno, F i HN plazmidi su zajedno transfektovani kako bi se ispitala fuziona aktivnost u prolaznoj probi kako su oba F i HN proteini potrebni za formiranje fuzije (Slike 3B i 3C). Wt F protein je podeljen proteazom domaćina efikasnije nego F protein sa R, S ili S-KM mutacije na mestu deljenja F proteina, vrlo malo proizvoda (F1) deljenja F proteina je detektovano u F dok proizvod deljenja na S mestu nije detektovan u lentogenim F plazmidnim transfektovanim ćelijama. F protein od R i S konstrukta ima N-povezano mesto glikozilacije (NXT) na mestu deljenja što se ispoljava u sporijoj mobilnosti migracije do SDS-PAGE od lento i S-KM kako je KM mutacija ukinula mesto glikozilacije. Ovi podaci su demonstrirali da se R i S mutacije na mestu deljenja R proteina pogodile mesto deljenja F proteina i S-KN je efikasniji od S. Kako su F i HN gen pojedinačno klonirani u pVitro2-neo-MCS vektor koji kodira EGFP gen, sincijsko formiranje može biti prikazano sa spojenim zelenim ćelijama. Velike sincijske formacije primećene su u wt F i HN plazmidnim transfektovanim 293 ćelijama. Svi F mutanti sa R, S ili S-KM ostacima na mestu deljenja F proteina ispoljili su se u veoma smanjenom sincijskom formiranju.

Primer 17. r73T-R116i virus sa 198nt unošenjem je pokazao sporiji rast i diferencijalni profil RNK i sinteze proteina u DF-1 ćelijama u poređenju sa Vero ćelijama.

[0131] R116i virus sa 198nt unetim između HN-L spoja pokazao je slabiju kinetiku rasta kod pilećih DF-1 ćelija pod visokim moi uslovom kao što je prikazano na slikama 6B i 6D.

Razlika u rastu R116i sa 198nt unošenjem je smanjena u poređenju sa wt i R virusom koji nema intergensko unošenje u ranijim vremenskim tačkama infekcije (10-20h). Kod Vero ćelija, razlika u rastu između ovih virusa nije bila veoma očigledna (Slike 6C i 6E). Za shvatanje ukoliko je intergensko unošenje u R116i viruse pogodilo virusnu RNK transkripciju i replikaciju, sinteza virusne DNK i proteina u inficiranim DF-1 ćelijama ispitana je sa Northern i Western blot analizama, respektivno (Slike 6F i 6G). Sinteza RNK i proteina za R116i sa 198nt unošenjem je značajno smanjena kod inficiranih DF-1 ćelija. U suprotnosti, kod inficiranih Vero ćelija, gornji transkript gena kao što je NP mRNK je značajno povećan kod R118i-198 ili 198RSV inficiranih ćelija dok su genomske RNK ova dva virusa smanjene. Nivo L proteina ova dva virusa je smanjen, ali su drugi virusni proteinski proizvodi povećani kao što je NP, F i HN kao što je prikazano na Slikama 6H i I.

Podaci dobijeni na Slikama 6F-I sprovedeni su pri visokom moi uslovu (moi=5). Sinteza RNK i proteina dalje je procenjena upotrebom niskog moi uslova (moi=0.001). Opet, R116i-198 ili 198RSV su imali različiti profil sinteze RNK i proteina u DF-1 i Vero ćelijama. Obe, sinteza RNK i proteina za R116i-198 ili 198RSV smanjena je kod DF-1 ćelija kokošaka (Sike 6J). U suprotnosti, uzvodna RNK i protein su povećani kod Vero ćelija ali je nivo L mRNK i L proteina smanjen usled intergenskog unošenja 198nt sekvence (Slika 6K). Sinteza virusne RNK i proteina je dalje poređena u ljudskim ćelijskim linijama, ljudskim fibrosarkom HT1080 i Hela ćelijama, i DF-1 ćelijama (Slika 6L). Ovi podaci su potvrdili da su R116i-198 ili 198RSV imali različito ispoljavanje, uzvodna sinteza RNK i proteina povećala se dok se ispoljavanje L proteina regulisalo na dole. Ovi podaci objašnjavaju zašto se R116i-198 ili 198RSV virusi repliciraju dobro u ćelijskim linijama sisara kao što su Vero, ljudske HT1080 i Hela ćelije ali nisu porasle dobro u oplođenim kokošjim jajima i pilećim DF-1 ćelijama. Takođe je data baza redukovane patogenosti kod kokošaka za ove R116i viruse kao što je demonstrirano sa njihovom niskom vrednosti indeksa intracerebralne patogenosti (ICPI).

Primer 18. Ispoljavanje GM-CSF transgena kod miševa je imalo nižu efikasnost suzbijanja rasta tumora nego ispoljavanje GM-CSF transgena kod ljudi u R116i-198RSV, ali ne u S116-KM.

[0132] Slika 11C je poredila doprinos mGM-CSF sa hGM-CSF transgenskim ispoljavanjem na onkolitičku aktivnost R116i-198RSV i S116-KM kod HT1080 ksenograft modela tumora kod miševa. hGM-CSF transgen ne reaguje unakrsno sa mGM-CSF i stoga je korišćen kao kontrola. mGM-CSF transgen u R116i-198 dat intratumorski je imao nižu efikasnost u suzbijanju rasta tumora u poređenju sa hGM-CSF. Slično suzbijanje rasta tumora mGM-CSF i hGM-CSF primećeno je kod S116 virusa. Virusni titri kod virusnom tretiranih tumora određeni su probom plaka (Slika 11D). Na dan 4 nakon ubrizgavanja tumora, slični titar je detektovan za R116i-198RSV i S116-KM sa mGM-CSF ili hGM-CSF parovima. Međutim, na dan 7 nakon injekcije, R116i-198RSV sa mGM-CSF nije detektovan dok je R116i-198RSV sa hGM-CSF i dalje imao virusni titar od približno 4.5 log/g tkiva. Nije postojala razlika u virusnim titrima za S116 sa hGM-CSF ili mGM-CSF. Ovi podaci ukazuju da je ispoljavanje mGM-CSF sa R116i stvorilo virusni klirens.

[0133] Infiltracija imunskih ćelija kod tkiva tumora inficiranog sa virusom je ispitivana (Slika 11E). R116i-198RSV sa mGM-CSF je imao najveći broj neutrofila, ćelije NK i i makrofaga u

1

tretiranim tumorima u poređenju sa R116-198RSV sa hGM-CSF i S116 hGM-CSF i mGM-CSF parom. Citokini i hemokini kod virusom tretiranih tumora određeni su lumineks probom (Slika 11F). Sva četiri virusa stimulisala su proizvodnju citokina i hemokina za mnogo puta u poređenju sa netretiranim tkivom tumora. Ispoljavanje mGM-CSF od strane R116i je oko 10 puta veće nego za S116 (106.7 vs 9.9-puta).

[0134] Slika 11G pokazuje sličnu aktivnost suzbijanja rasta tumora R116i sa 198 ili 318 nt unetih između HN-L spoja koji sadrži isti hGM-CSF transgen u HT1080 ksenograft modelu tumora kod miševa. Unošenje 318 nukleotida u HN-L spoj nije smanjilo virusnu aktivnost onkolitičkog virusa.

Primer 19. Procenjivanje komplement-posredovane NDV deaktivacije i uloga regulatornih proteina u izbegavanju komplementa.

[0135] Komplement (C') sistem je glavni odbrambeni sistem protiv mikrobne invazije u domaćinu. Postoji oko 30 različitih glikoproteina u ljudskom sistemu komplementa od kojih 20 deluje u plazmi i 10 su regulatori ili receptori na ćelijskim membranama. C' regulatori vezani za membranu (RCA) obuhvataju 4 dobro okarakterisana molekula: hCD46, hCD55, hCD59 i hCD35. Njihova glavna funkcija je da se zaštite ljudske ćelije protiv autolognog komplementarnog napada bez uticaja na ulogu C' u eliminisanju stranih sredstava. Ovi RCA proteini su specifični za vrste domaćina. NDV koji se koristi za virusnu terapiju u prošlosti uopšteno se proizvodi u oplođenim kokošjim jajima. Očekuje se da NDV onkolitički virus dat sa intravenoznom injekcijom pacijentima koji imaju rak može biti brzo prečistiti, time smanjujući delotvornu virusnu dozu. Kako obuhvaćeni virusi proizvedeni iz ljudskih ćelija uključuju RCA proteina za vreme svog izlaska iz inficiranih ćelija, poželjno je proizvesti NDV u ljudskoj ćelijskoj kulturi kako bi se smanjila C’ posredovana virusna liza ili deaktivacija.

[0136] Osetljivost NDV na C' posredovanu deaktivaciju procenjena je ispitivanjem NDV proizvedenog u oplođenim kokošjim jajima, ljudskim 293 i Hela S3 suspenzivnim ćelijskim linijama (Slika 17). Virus koji je gajen u jajima bio je osetljiv na C' deaktivaciju, serumsko suzbijanje je ukinuto tretiranjem seruma sa toplotom (56°C u trajanju od 30 min).

Komplement od zamorčeta imao je slični nivo uticaja virusne deaktivacije (podaci nisu prikazani), što potvrđuje da je virusna deaktivacija bila usled C'. Dodatno, virusi proizvedeni

2

iz Hela ćelija bili su otporniji na ljudsku C' posredovani virusnu deaktivaciju nego iz 293 ćelija i jaja. Stoga, podaci predlažu da su Hela ćelije bolje od 293 ćelija za NDV onkolitičku proizvodnju virusa, što se najverovatnije ispoljilo u sporijem virusnom klirensu i stoga povećanom terapeutskom indeksu.

[0137] Za objašnjavanje zašto je NDV proizveden iz Hela S3 ćelija otporniji na C', 293 i Hela S suspenziju ćelijske linije su procenjene za nivoe 4 dobro okarakterisana ljudska RCA proteina, hCD46, hCD55, hCD59 i hCD35. hCD35 nije detektovan u 293 i Hela ćelijama sa Western analizom i podaci stoga nisu prikazani na Slici 18. hCD46, hCD55, i hCD59 su detektovani u većem obimu u viHela S3 ćelijama nego u 293 ćelijama. Stoga, nivoi RCA proteina su u inverznoj korelaciji sa virusnom osetljivošću za C'.

[0138] U cilju određivanja ukoliko sva tri RCA proteina regulišu C' funkciju, hCD55, hCD59 ili hCD46 transgen su uneti u NDV genom reverznom genetikom i rekombinantni virusi koji ispoljavaju svaki od tri RCA proteina su proizvedeni. Western blot analiza pokazala je da je svaki od ovih RCA proteina ispoljen od strane virusa i ugrađen u virone (Slika 19). hCD55 je određen da bude glavni RCA protein dodeljujući C' funkciju deaktivacije (Slika 20). Virus koji ispoljava hCD55 proizveden u jajima sa hCD55 ugrađen u virione je bio najotporniji na C' posredovanu deaktivaciju, što je bilo veoma blizu virusima proizvedenim u Hela ćelijama. U poređenju, hCD46 je imao marginalno poboljšanje u pogledu virusne otpornosti na C' deaktivaciju i hCD59 nije imalo detektabilnu ulogu u C' regulaciji.

[0139] U zaključku, kako bi se smanjio virusni klirens za onkolitičku virusnu terapiju i poboljšao terapeutski indeks NDV, Hela ćelije smatraju se ćelijskom linijom od odabira za virusnu produkciju.

[0140] Ovde opisani rezultati dobijeni su upotrebom sledećih materijala i postupaka.

Ćelije i virusi.

[0141] Sledeće ćelijske linije i odgovarajuće podloge su korišćene: Vero ćelijska linija bubrega afričkog zelenog majmuna (ATCC) i ljudski fibrosarkom (HT1080, AZCC), minimalni esencijalni medijum orla (EMEM, Hyclone) sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS); Vero klon 51D11 linija (medImmune), podloga bez seruma (SFMMegaVir, Hyclone) sa 1% glutaminom; normalne firoblastne ćelije ljudske kože (CCD1122Sk, ATCC), ATCC formulisani Iscove modifikovani Dulbecco medijum (IMEM) sa 10% FBS. Rekombinantni virusi Njukastl bolesti (NDV) su rasli u alantoičnim šupljinama 10-11 dana starim specifičnim bez patogena (SPF) oplođenim kokošjim jajima, Vero, ili Vero klon 51D11 ćelijama.

Konstruisanje NDV antigenomske cDNK i podržavanje plazmida NP, P i L.

[0142] Virusna RNK NDV soja 73T je dobijena iz Dr. Mark Peeples (Međunarodna dečija bolnica). NDV sekvence (GenBank) poravnate su kako bi se dobile konsenzusne sekvence radi dizajniranja DNK oligonukleotida za RT-PCR virusne RNK. Šest preklapajućih podgenomskih cDNK fragmenata koji obuhvataju celi NDV genom stvoreni su sa RT-PCR sa visokom tačnošću (Slika 1). pUC19 vektor je modifikovan kako bi obuhvatio 88 nt oligonukleotidni veznik koji sadrži mesta za ograničenje uvedena između EcoRI i HindIII mesta za sekvencijalni sklop pune dužine antigenomske cRNK NDV 73T soja. Dodatno, 73T soj cDNK plazmida (p73T) sadrži 27 nukleotida (nt) T7 RNK polimeraze promotera na 5’ kraju i 189 nt koji sadrže HDV antigenomsku ribozomsku sekvencu i T7 RNK polimeraze transkripcioni terminalni signal na 3’ kraju. Za stvaranje ne-virusnog NDV, kodiranje sekvence mesta deljenja proteaze fuzionog proteina izmenjeno je mutagenezom upravljanom na mestu do onih za ne-virusni NDV LaSota soj (lentogeni, lento) ili glikoprotein B (gB) citomegalovirusa (S116). Za konstruisanje NP, P i L ekspresionih plazmida, otvoreni okviri za čitanje proteina (ORF) pojačani su sa RT-PCR i klonirani u plazmid pCITE2a pod kontrolom T7 RNK polimeraze.

Unošenje transgena u NDV.

[0143] Za unošenje transgena na P-M spoju, AfeI mesto ograničenja je uvedeno pri 3148 u plazmidu podklona koji je sadržao SacII-PmlI fragment (Sl 2A). cRNK koja kodira ljudski ili mišiji granulocit-makrofag stimulirajući za koloniju faktor (GM-CSF) ili interleukin 2 (IL-2) je kodonski optimizovana i sintetisana sa DNK 2.0. Genska kaseta sadrži kraj gena (GE) od N, početak gena (GS) od P i otvoreni okvir za čitanje (ORF) od transgena, koji je unet u AfeI mesto. SacII-PmlI fragment dobijenog plazmida je pomešan u plazmid r73T i nazvan kao p73T-P1.

4

[0144] Za unošenje transgena u HN-L spoj između HN ORF i sekvence signala kraja gena (GE) od HN, AfeI mesto ograničenja je uvedeno pri nt 8231 u plazmidu koji je sadržao AgeI-XbaI fragment (Slika 2A). Genska kaseta stvorena je sa PCR upotrebom para fosfat smisao i antismisao primera (Tabela 3) u uneta je u AfeI mesto.

Tabela 3. Sekvence oligonukleotid primera za unošenje transgenske transkripcione kasete.

[0145] Sekvence kraja gena (GE) i početka gena (GS) su podvučene. Kozak sekvenca je prikazana malim slovima. Sekvence koje odgovaraju 5' ili 3' sekvencama transgena su prikazane kurzivom. Osim EGFP (H-N), svi drugi parovi prajmera mogu da se koriste za inserciju transgena između G-M ili HN-L.hGM-CSF: humani faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga; mGM-CSF: mišji GM-CSF; hIL-2 i mIL-2 odgovaraju humanom, odnosno mišjem interleukinu 2 (IL-2).

[0146] AgI-XbaI fragmenti iz dobijenog plazmida su pomešani u plazmid p73T, dajući p73T-HN1. Druga strategija za unošenje sekvence na HN-L spoju jeste unošenje transgenske kasete ili sekvence iz drugih paramiksovirusa između signala kraja gena (GE) od HN i signala početka gena (GS) od L (Slika 4) pri AfeI mestu koje je uvedeno pri nt 8359. FL cDNK plazmid je označen p73T-R116i. Kako NDV genomska dužina mora biti u više od 6 nukleotida (pravilo od 6), antigenomske cRNK različitih konstrukta su napravljene da prate pravilo od 6.

[0147] Za unošenje dve transkripcione kasete u P-M spoj, AfeI mesto je uvedeno na kraju ORF od GM-CSF (nt 3619) (Slika 2B). IL-2 ORF je pojačan upotrebom para fosfatnih smisao i antismisao primera koji sadrže GE i GS sekvence i uneti su na AfeI mestu. SacII-PmlI fragmenti iz dobijenih plazmida uključujući GM-CSF i IL-2 transkripcione kasete su zamenjeni nazad u plazmid r73T, dajući p73T-P2.

Stvaranje r73T himernih virusa koji sadrže ektodomen drugih paramioksivirusa.

[0148] Himerna NDV genomska DNK proizvedena je zamenjivanjem F i HN od NDV sa onima od paramiksovirusa 1 kod golubova (PPMV-1). C-terminalna kodirajuća sekvenca za citoplazmatski rep i transmembranski deo NDV 73T F (aminokiselinski ostaci 503 do 553) su spojeni sa ektodomenom kodirajuće sekvence F proteina PPMV-1 (ostaci 1 do 502), N-terminalne kodirajuće sekvence NDV HN (ostaci 1 do 45 aminokiselinske sekvence) su spojene sa HN (ostaci 46 do 577) preklapajućim PCR reakcijama upotrebom GeneArt kompletom (Invitrogen). Pojačani fragment je razgrađen i kloniran u PmlI-AgeI razgrađenoj NDV cDNK. Parainfluenca virus 5 (PIV-5) F ili HN je uveden u NDV 73T antigenomsku cDNK sličnom strategijom kloniranja. PIV5 F (ostaci 1 do 486) ektodomen je spojen sa transmembranom i citoplazmatskim repom NDV 73T F (ostaci 503 do 553). NDV Hn (ostaci 1 do 45) su spojeni sa PIV5 HN ektodomenom (ostaci 36 do 565). cDNK fragment je kloniran u PmlI-AgeI razgrađenu NDV antigenomsku cDNK.

Dobijanje rekombinantnog NDV iz transfektovanih cDNK plazmida.

[0149] Ćelijska linija sisara koja ispoljava T7 RNK polimerazu kao što su BHK-T7 ćelije je transfektovana sa tri plazmida koji ispoljavaju NDV NP, P i L proteine (0.4 µg, 0.4 µg, i 0.2 µg po udubljenju od posude sa 6 udubljenja, respektivno) i plazmid koji kodira NDV antigenomsku cRNK (1.6 µg) upotrebom lipofektamina 2000. Tri dana nakon transfekcije, supernatant ćelijske kulture ubrizgan je u alantoične šupljine 10 do 11 dana starih SPF oplođenih kokošjih jaja ili pušten u Vero ćelije radi pojačavanja dobijenog virusa. Dobijanje virusa potvrđeno je testom hemaglutinacije upotrebom 1% crvene krvne ćelije kokošaka (RBC). Dobijanje virusa takođe može biti izvršeno elektroporacijom NP, P, L, antigenomskih cDNK plazmida zajedno sa plazmidom koji ispoljava T7 RNK polimerazu u Vero ćelije kao što je prethodno opisano (Kaur i dr, Optimization of plasmid-only rescue of highly attenuated and temperature-sensitive respiratory syncytial virus (RSV) vaccine candidates for human trials. 2008 J. Virol. Methods 153:196-202). Dobijeni virus je potvrđen sekvenciranjem RT-PCR pojačanim cDNK.

In vitro prolaženje radi odabiranja virusa sa stabilnim mestom deljenja F proteina.

[0150] Za ispitivanje da li je sekvenca deljenja F proteina (FPCS) bila stabilna i ukoliko bilo kakve mutacije za stabilizaciju mogu biti izabrane nakon prolaska u kulturi tkiva, r73T-S116 su serijski pušteni 10 puta u Vero i ljudskim fibrosarkom HT1080 ćelijama pri MOI od 0.01. Nakon svaka 2-3 prolaza, virusna RNK je izolovana iz podloge za kultivisanje, cDNK je pojačana sa RT-PCR i F i/ili HN geni su sekvencirani.

Morfologija plaka virusa u Vero ćelijama i kvantizacija titra sa probom za plak.

[0151] Vero ćelije u pločama sa 6 udubljenja inficirane su sa serijski razblaženim virusom i inkubirane pod 1% metilceluloznom oblogom pri 37° C u trajanju od 3 dana ili 6 dana za morfologiju plaka u prisustvu tripsina (TrpyLE™, Invitrogen) za kvantizaciju virusnog titra. Ćelijski monoslojevi su podešeni sa metanolom i obeleženi sa pilećim anti-NDV poliklonalnim antitelom protiv celog deaktiviranog NDV virusa što je praćeno izlaganjem peroksidazom rena (HRP)- konjugovanom anti-pilećem antitelu (Dako).

Test virusa za patogenost kod kokošaka sa probama srednjeg vremena smrti jaja (MDT) i indeksa intracerebralne patogenosti.

[0152] Patogenost r73T virusa određena je sa testom srednjeg vremena umiranja (MDT) kod 10 dana starih SPF oplođenih kokošjih jaja. ICPI test u 1 dan starim SPF kokoškama je sproveden u laboratoriji Nacionalne veterinarske službe od USDA (NVSL, Ames, Iowa). Za MDT test, 0.1 ml niza 10 puta razblaženog između 10<-6>i 10<-9>je inokulisano u alantoičnim šupljinama 8-10 od 9-10 dana starih jaja po razblaženju i inkubirano pri 37°C. Jaja su ispitana dva puta na dan u trajanju od 7 dana kako bi se zabeležilo vreme smrti embriona. MDT je izračunato kao srednje vreme (h) za minimalnu smrtnu dozu virusa za ubijanje svih inokulisanih embriona. MTD test pruža razumno predviđanje patogenosti virusa. Virusi sa MTD <60 h su obično verogeni (virusni) sojevi; sa MTD = 60 do 90 h mezogeni (srednji) sojevi; >90 h kao letogeni (avirusni) sojevi. Za ICPI test, 0.05 ml 1:10 razblaženja sveže infektivne alantoične tečnosti za svaki virus je inokulisano u grupu od 101 dan starih SPF kokošaka intracerebralnim putem. Ptice su praćene za kliničke simptome i mortalitet jednom svakih 8 h u periodu od 8 dana. Pri svakom posmatranju, ptice su ocenjene kao što sledi: 0 ukoliko je normalna, 1 ukoliko je bolesna i 2 ukoliko je mrtva. ICPI je srednja vrednost rezultata po ptici po posmatranju u periodu od 8 dana. ICPI vrednosti su u opsegu od 0.0 do 2.0. Niski virusni (LoND): ICPI<0.7; virusni (vND): ICPI≥0.7.

Ubijanje ćelija sa virusom procenjeno sa probom održivosti ćelija.

[0153] Ćelije su postavljene u ploče sa 96 udubljenja pri 5 ×10<3>ćelija/udubljenju preko noći inficirane sa r73T pri različitim MOI. Ćelijska održivost određena je sa CellTiter Glo kompletom (Promega) po uputstvu proizvođača. Relativni procenat preživljavanja određen je poređenjem ATP nivoa svakog test uzorka sa netretiranim kontrolnim uzorkom 100% održivosti. Podaci predstavljeni u tabeli su relativni procenat ubijenih ćelija.

Uticaj NDV ubijanja tumora procenjen u subkutanom HT1080 ksenograft modelu.

[0154] Atimički NCR homogeni goli miševi (Taconic) implantirani su subkutano (s.c.) sa 5 × 10<6>HT1080 ćelijama (u 100 µL PBS) u jedan bok. Virusno tretiranje započelo je kada su tumori dostigli zapreminu od 65-300 mm<3>. Rekombinantni 73T u 100 µl je dat pri različitim nivoima doza ili lokalno intratumorskom (i.t) injekcijom ili sistemski sa intratumorskom (i.t) injekcijom u repnu venu, respektivno. Kontrolne životinje ubrizgane su samo sa 100 µL PBS. Rast tumora meren je upotrebom digitalnog kalipera, i zapremina tumora je izračunata kao 0.5 × (visina) × širina× dužina (mm<3>). Miševi su žrtvovani kada je telesna masa opala za 20% u odnosu na originalno telesnu masu ili je zapremina tumora prešla 2000 mm<3>.

Virusna biodistribucija u HT1080 ksenograft miševima.

[0155] Devet golih miševa koji nose HT1080 ljudski fibrosarkom ksenograft subkutane tumore su i.v ubrizgani sa 10<8>pfu r73T- R116i-hGM-CSF. Tri miša su prekinuta 1, 4 i 8 dana nakon ubrizgavanja. Jedan miš ubrizgan sa PBS prekinut je na dan 8. Uzorci tumora, pluća, slezine, jajnika i seruma su sakupljeni. Infektivni virusni titar u tkivu homogenata je kvantifikovan testom plaka.

Kvantizacija nivoa GM-CSF proteina sa ELISA.

[0156] Tumori NDV inficiranih i PBS ubrizganih miševa su homogenizovani u PBS upotrebom blagog MACS disocijatora (Miltenyi Biotec) prema uputstvima proizvođača. Supernatant iz homogenizovanog tkiva ili seruma sakupljenog iz miševa je testiran za nivo GM-CSF sa Duoset ELISA kompletom (R&D).

Statistička analiza

[0157] Sve statističke analize su izvršene upotrebom GraphPad Prism 6.0 softvera. T-test za nezavisne uzorke je korišćen za procenjivanje razlika u regresiji tumora između grupa.

GraphPad Prism softver je takođe korišćen za računanje IC50 rNDV 73T za in vitro ubijanje ćelija kod normalnih i ćelija tumora.

Claims

Patentni zahtevi

1. Virus Njukastl bolesti (NDV) gde je NDV oslabljeni virus iz soja 73T, pri čemu virusni genom NDV sadrži sekvencu mesta deljenja F proteina (FPCS) izabranu iz grupe koju čine:

S116: 111H-N-R-T-K-S/F117;

S116K: 111H-N-K-T-K-S/F117;

S116M: 111H-N-R-M-K-S/F117;

S116KM: 111H-N-K-M-K-S/F-I118; i

R116: 111H-N-R-T-K-R/F-I118,

pri čemu NDV eksprimira jednu ili više sekvenci heterolognog polinukleotida i pri čemu, jedna ili više sekvenci heterolognog proteina je insertovana u P-M spoj.

2. NDV prema patentnom zahtevu 1, gde sekvenca FPCS je R116: 111H-N-R-T-K-R/F-I118.

3. NDV prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde virusni genom sadrži povišeni HN-L intragenski region koji sadrži ne-kodirajuću sekvencu koja je između 50 i 300 nukleotida u dužini, opciono pri čemu je nekodirajuća sekvenca dobijena od paramiksovirusa tipa-1 (APMV-1), respiratornog sincicijalnog virusa (RSV) ili nasumične sekvence.

4. NDV prema patentnom zahtevu 3, gde je HN i L intergena ne-kodirajuća sekvenca 60, 102, 144, ili 198 nukleotida u dužini.

5. NDV prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde heterologne polinukleotidne sekvence kodiraju citokin, ligand površine ćelije i/ili hemokin, opciono gde je citokin izabran iz grupe koju čine GM-CSF, IL-2, IL-21, IL-15, IL-12, i IL-12p70, opciono gde je citokin ljudski GM-CSF.

6. NDV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, gde je FPCS sekvenca: 111H-N-R-T-K-R/F-I118, ne-kodirajuća sekvenca je 198 nukleotida u dužini i heterologna polinukleotidna sekvenca kodira ljudski GM-CSF.

7. NDV prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 za upotrebu u postupku za tretiranje proliferativne bolesti, opciono gde je proliferativna bolest neoplazija, opciono gde je neoplazija rak.

8. NDV za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu, jedna ili više sekvenci heterolognog polinukleotida je eksprimirana u tumorskom okruženju.

9. NDV za upotrebu iz zahteva 7 ili 8, pri čemu NDV selektivno ubija ćelije tumora i gde NDV dolazi u kontakt sa ćelijom tumora.

10. NDV za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 9, gde NDV uzrokuje regresiju tumora kod ispitanika, i gde NDV dolazi u kontakt sa ćelijom tumora.

11. NDV za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 10, gde je rak izabran iz grupe koju čine rak bešike, jajnika, mozga, pankreasa, prostate, sarkom, pluća, dojke, grlića materice, kostiju, jetre, glave i vrata, želuca, bubrega, limfom, leukemija, štitne žlezde, debelog creva, kolorektuma i rak melanoma.

12. NDV za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 11, gde se oslabljeni NDV isporučuje intravenozno, sistemski, intraperitonealno ili intratumorski.

13. In vitro postupak za ubijanje ćelije kancera, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt ćelije kancera sa NDV iz bilo kog od zahteva 1 do 6.

14. In vitro postupak iz zahteva 13, pri čemu je ćelija kancera ćelija iz ćelijske linije kancera.

1