BRPI0906354A2 - paramixovírus oncolítico atenuado que codifica citocinas aviárias - Google Patents

Abstract

paramixovírus oncolítico atenuado que codifica citocinas aviárias a invenção refere-se a um vírus da doença de newcastle de rna oncolítico recombinante para o tratamento de uma doença proliferativa, compreendendo, pelo menos um, transgene codificando uma citocina de ave, em que o vírus da doença de newcastle de rna oncolítico recombi-nante é obtido de um vírus da doença de newcastle de rna oncolítico velo-gênico ou mesogênico. a expressão mediada por vírus da citocina nas céluias hospedeiras naturais leva a uma patogenicidade reduzida do vírus para espécies de aves. além disso, o genoma viral pode codificar proteínas de ligação, enzimas conversoras de profármaco e/ou proteases. a expressão seletiva dessas moléculas em células tumorais infectadas com vírus aumen-ta o efeito antitumoral do vírus.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ^MPARÁMÍX0VÍRUS ONCOÚTIÇO ATENUADO QÜE COD1FIGA CITOCINAS AVIÁRIAS*’.

Inftodução

A presente invenção réfere-se a um vírus da Doença de Newcastle) de RNA oncolitioo compreendendo, pelo menos um, transgene codificando uma citocina aviária, em que o vírus da Doença de Newcastle de RNA oncolítico recornbínante é obtenível de) um vírus da Doença de Newcastle de RNA οπαοΓίΙΙοο velogênico ou mesogênico. A expressão mediada per vírus 10 da citocína nas células hospedeiras naturais leva a uma pátogenicídade reduzida do vínjs para ás espécies de aves,

O vírus na presente invenção é adequado para o tratamento de doenças, espècialmenfe para o tratamento de tumores oncoliticos. Virus recornbinantes são produzidos que codificam uma cítocina aviária, em que a 15 patogenicídade do vírus é reduzida para uma espécie de ave que leva a umá toxicidade ambientei diminuída do vírus, A atividade oncolítica do vírus não ê prejudicada pelo método descrito de redução de patogenicídade. O genoma virãl pode codificar transgenes terapêuticos adicionais, preferivelmente proteínas de ligação (anticorpos, moléculas dé repetição dè anquirina., peptí20 deos₍ etc.), enzimas conversoras de pmfãrmaco e/ou proteases. A atividade dessas proteínas de ligação, enzimas conversoras de profármaco e/ou pro teases aumenta o efeito antitumoral do vírus. Além disso, a invenção descreve a produção e o uso de tais vírus modificados para o tratamento do câncer.

.25 Descrição do Estado da Téçniça

Vírus da Doença de Newcastle

Os vírus oncoliticos em geral para o tratamento da tumores são revistos em Chiccca (2002). O Vírus da Doença de Newcastle (NOV) tem sido usado como agente terapêutico experimental por mais de 40 anos, e é 30 revisto por Sinkovics e Horvath (2000). O Virus da Doença de Newcastle, em geral, é ctecrito no livro por Afexander (1908). A cepa de NDV PV7Ô1 está sendo desenvolvida como um tratamento antícéncér pára glioblastoma (Lo fence of a/.< 2003). A oepa de NDV MTH68 tem sido usada como um tratamento de câncer experimental e tem side administrada a seres humanos por mais de 30 anes (Csatery et al, 2004).

No ensaio de Stòjdl et M (2003), ê desoritó que na faixa de 8(M de todas as linhagens celulares tumorais testadas, há um defeito na resposta do interferon após ã infecção com o Virus da Estomatite Vesicular (VSV). Pode se considerar que uma porcentagem similar de linhagens de células turnorais seja suscetível à infecção com NDV porque tanto VSV quanto NDV são membros da ordem dos mononegavirais.. Também foi demonstrado que 10 o mecanismo de replícaçãu seletiva do NDV em células turnorais se baseia em um defeito na resposta do interferon celular contra o vírus (vide, por exemplo, ÜS; 20030044384),

Paramixovírus contêm genomas de RNA de fita única de polaridade negative com genomes de 15 a 19 Kb de comprimento (tipo selvagem) 15 e os genomas contêm de 6 a 10 genes, O envelope viral é formado pelas glicoproteínas de superfície e uma parte da membrana derivada da célula hospedeira, As glícoproteinas de superfície (F e HN ou H ou G) medeiam a entrada e salda do vírus da célula hospedeira, O nücfeàcápsideo esta dentro do envelope n contém c genoma de RNA e a proteína do nucleocapsideo 20 (HP), fosfo (P) e grandes (L) proteínas responsáveis pela transcrição e replicação do vírus interceluiar. A proteína da matriz (M) conecta o envelope viral e o nucleocapsídeo. Além desses genes que codificam proteínas estruturais, Paramyxovfedae pode conter genes adjuvanfes os quais podem ser unidades de transcnçâo adicionais espaçadas com os genes mencionados acima. 25 Os genes adjuvantes são na sua maioria ORFs que se sobrepõem com o gene P da unidade transcrícional. Uma descrição abrangente de parampovindae pode ser encontrada em (I amb. 2001).

NDV é c membro prototípíco do gõnero Avulavirus na família Paramyxovfffeae pertencente à ordem Mononegstw/eS, O genoma viral é 30 um RNA de sentido negativo de fite única que codifica seis proteínas principais: a proteína nucteocapsídeo (NP), fosfoprotéína (P), proteína da mátriz (M), proteína de fusão (F)_t proteína de hemaglutínina (HN) e a proteína polí merase (L), Através da edição do RNAm da proteína P, .uma.oud.uas proteínas adicionais, V (e W) sâo traduzidas.

NOV é detalhadamente caracterizado em A/exander (19SB) e Lamb (2001).

Virus da Doença de Newcastle como urn Patòqeno Aviário

Cepas NOV sác classificadas em relação às suas patogenicidades para galinhas como cepas velogãnicas (altamente: víruleatas) que levam a uma Infecção letal aguda de galinhas de todas as idades, isolados meso·· gênícos (virulência intermediária) que são somente letais em pintlnhos jo~ 10 vens, e cepas lentogõnioas (não-virulentes), manifestadas em uma forma branda o não-aparante da doença. A classificação dos isolados HDV em velogênicus, mesogênicos ou ientogênicos é determinada pelo tempo de morte médio (MDT) do embrião de galinha em ovos embrionados de 9 dias de idade depois da inocuiação com a dose fetal mínima para matar o embrião, üm 15 dos determinantes da virulência de NDV parece ser o sítio de divagem da proteína F precursora.

A primeira eclosão de NDV foi observada nó ano de 1926 em Newcastle- em Tyne₍ Inglaterra, e em Java, Indonésia. Três NDV panzoótícos foram descritos desde a primeira aparição da doença.

NDV é primariamente transmitido por aerossóis ou grandes goticuias que são inaladas por pássaros suscetíveis. Durante o curso da infecção. novas partículas de vírus infecciosas serão espalhadas do trato respiratório infectado ou excretadas nas fezes. Pela ingestão do material contendo vírus por pássaros saudáveis, novas infecções podem ser estabelecidas e o 25 espalhamento viral de um pássaro para o outro pode ser mantido.

NDV como um patògeno aviário é descnto detalhadámente em A/exarrder (1997), Diseases of Poultry.

Vacinação da: Ctoenca de Newcastle

NDV como uma ameaça para a criação de aves e a necessidade 30 de vacinação já foram reconhecidos no inicio do século passado, Iyer e Dobson efetuaram estudos nos anos da década de 1930 sobre a atenuação de cepas NDV víruientas, levando aõ desenvolvimento de algumas cepas de vacina de NDV mesogenicas, O desenvolvimento de vacinas vivas se moveu em direção ao estabelecimento das cepas de vacinas lentogênicas Hltchner Bl e LaSota, as quais são atualmente as vacinas NOV mais amplamente usadas. Outras estratégias de vacinação incluem o uso de vacinas NOV ina5 tivadas (por ewiplo, por formalína, p-propfolactona), administradas juntamente com um adjuvante veículo (hidróxido de alumínio, emulsão em óleo).

A história e 0 estado atual do desenvolvimento de vacinas NDV é demonstrado detalhadamente ém Aféxander(1997) Diseases of Poultry .

As próximas gerações de vacinas para uso veterinário à base de 10 NOV Fecombinante geradas por tecnologia genética reversa são recapituladas em Huang eta/. (2003), e vacinas NDV recombinantes são descritas nas patentes a seguir.

US 6.699 479 B1 descreve um mutante do vírus da doença de Newcastle (NOV) que expressa a sua proteína V em um nivel reduzido e é 15 usada para vacinação de embriões antes dei chocar,

US 2004/0043035 se referem a um mutante de NDV recombinante que não é capaz de expressar um epitope imunodomínante da nucle©proteína (NP) e é adequado como uma cepa de vacina marcadora.

LIS 2003/0224017 descreve um sistema genético reverso para 20 NDV para a produção de uma vacina de NDV recombinante.. Este sistema permite a expressão de transgenés, por exemplo, citocínas aviárias (IL-2 de galinha, IL-4 de galinha) do genoma NDV para gerar cepas de vacina NDV.

EP 1 300 157 refere-se a uma cepa de vírus da doença de Newcastle mutante atenuada adequada para a vacinação m ovo de espécies avi25 árias compreendendo uma mutação nas sequências génicas que codificam as glicoproteinas HN e/ou F,

US 6.719.979 refere-se a um processo para gerar vírus da doença de Newcastle (NDV) infecciosas totalmente a partir de DNAc de comprimento total danado e para o uso de vacinas e ensaios de diagnóstico ge30 radas com e derivados do processo..

WO 2007/025431 descreve um método parà produzir uma cepa

La Sota da doença de Newcastle atenuada recombínante e seu uso na pre paração de vacina para a prevenção das doenças causadas pelo vírus da Doença de Newcastle (NOV).

WO 2000/067780 envolve DNAcs para fear vírus da doença de Newcastle infecciosos e atenuados (NDV). Dentro do escopo da invenção 5 estão vacinas que compreendem NDV infecciosos, atenuados.

Paramyxovirus Recombínànte ^\WW\WWW5^5W,™%,VWWWW«Wrt*WrtV*VWWrtWWrtWWWrtVrt*

EP-A-0 702 080 refere-se aos mufantes de vírus de RNA da fita negativa nâosegmentados repiicantes infecciosos, compreendendo uma inserção e/óu eliminação em uma estrutura de leitura aberta, uma região 10 pseudbgena ou uma região intergéniça do genome veal

WO 99/66045 refere-se aos vírus NDV geneticamente modifica do obtidos a partir de moléculas de DNAc de comprimento total do genoma viral.

WO 00/62735 refere-se a um método de tratamento de tumor 15 compreendendo a administração de um vírus de RNA clonal competente para replicação e sensível ao interferon, por exemplo, NDV.

Em WO 01/20989 (PCT/DSO0/2S116), um método de tratamento de pacientes com tumor com paramixovírus oncolítico meombinante é. descrito. O tumor é reduzido pela administração de um virus AwmjrxwWae 20 competente para replicação. Vários métodos são desentos que podem ser usados para manipular o genoma viral para melhorar as propriedades oncolíticas.

WO 03/005964 retere-se ao VSV recombinants compreendendo um ácido nucléico codificando uma citocina.

US 2004/0170607 refere-se ao tratamento dè melanoma pela administração de um vírus o qual não é um patógenc humano comum.

Manipulação Genética de NDV

NDV pode ser génetícamente manipulado usando a tecnologia genética reversa conforme descrito, por exemplo, em EP-A-0 702 085, Por 30 exemplo, sabe-se como fôzer conefrucips de NDV recombinantes compreendendo ácidos nucleicos adicionais codificando fosfatásé alcalina secretada (Zhao é Pesters, 2003), proteína verde fluorescente (Engel-Herbert ef al,

2003) , proteína VP2 do virus da doença infecciosa da bursa. (Huang of a/.,

2004) , hemaglutinina do virus influenza (Nakaya et a/.,..2001) e dorafeniool ace® transferase (Huang at' at, 2001) (Krtshnamurthy at aA, 2000). Nenhum dessas NDV raçombinantes foram construídos para usd no tratamento da doença humana. Os NDVs recombinanfes foram feitos para estudar ou a virologia básica do NHV o para desenvolver cepas de vacina para aves. Coma cepas de vírus de origem serviram ás cepas lenfegêniuas de NOV. Essas cepas nâo têm propriedades oncoííticas significativas.

Manipulacap Genética dos Vírus

Métodos para manipular geneticamente vírus de RNA são bem conhecidos conforme estabelecido acima. Além disso, a manipulação genética dos vírus onoolítieos é reçapituiada, por exemplo, em Bell et M (2002)., Os vírus de RNA como agentes de viroterapia são revistos em Russell (2002). O conteúdo de qualquer um desses documentos é aqui incorporado por referência.

Citocinas Aviarias

Citocinas aviárias são recapiftjladas em Staeheli et a/. (2001). Uma análise genõmica das citocinas e quimiocinas de galinha foi descrita em Kaiser et a/. (20Ô5), Resumoda Jnyençãu

Cepas NOV oncoliticas têm sido estudadas desde o início dos anos ê0 como terapias tumorais. A maioria das cepas de virus usadas para terapia de tumor oncolitico pertencem â ciasse de virus mesogênicos que são descritos como patégênos para aves. Para desenvolver um NDV oncolitico como um fãrmaco bioíogico antitumoral, a toxicidade ambientam existente potencial, especialmente a patogenicidade para aves deve ser reduzida. Entretanto, NDVs atenuados para aves devem ter a capacidade prolongada de lisar células tumoraís e manter o seu potencial oncolítico. Estratégias exisfenfes para o desenvolvimento de vacinas podem não ser aplicado, uma vez que eles estão focados na estimulação do sistema imune do pássaro ou pela aplicação de partículas virais completamento ínativadas ou cepas de vírus lentogènicos spatogênioas. Ambos os tipos de vacina não são mais capazes de se replicar em células cancerosas e subsequentemente perderam o potencial para lisar células tumorais.

Na presente invenção, a atenuação do NDV em aves sem diminuir a atividade oncolítica do vírus pode ser alcançada com a ajudar da tec5 nologia genética reversa, NOVs atenuados recombinantes são criados pela inserção de transgenes que codificam dtççinas, partícularmentè dtocinas ímunoestimuíadoras ou antivirals.

Além disso, uma vacina NDV não é adequada para tal abordagem uma vez que o objetivo de uma vacina é induzir uma forte resposta ΙΙΟ mune com uma imunidade de longa duração para proteger o animal contra uma infecção secundária. Na presente invenção, a atenuação descnta de NDV teve o objetivo principal de permitir que um animal controle a infecção primária (indesejada) e, deste modo, reduzir a toxicidade ambiental e aumentar a segurança do vírus quando aplicado em uma terapia de uma doen15 ça proliférativa.

Um assunto da presente invenção é a lise das células tumorais por um vírus onaolitico. Uma indicação de tal abordagem de vírus oncolitico é a terapia do câncer em humanos. Ao contrário, uma vacina NOV para aves, conforme descrito em US 2003/0224017, é aplicada em animais e, des20 te modo, localizada no campo de cuidados com a saúde animal,

Deste modo, um objetive da presente invenção é um vírus da Doença de Newcastle de RNA onoulítico recombinante compreendendo, pelo menos um, transgene codificando uma dtooina aviária, em que o vírus da Doença de Newcastle de RNA oncolltico recombinante é obtenível a partir 25 de um vírus da Doença de Newcastle de RNA oncólítico velogêníco ou mesogênico.

O vírus da presente invenção pode compreender pelo menos outro transgene cem atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral infectada com vírus.

O, pelo menos uni, transgene adicional é parcialmente alogene ou síngene no hospedeiro.

Em outro aspecto dá presente invenção, o vírus da presente invenção pode ser .um vírus atenuado.

Atenuaçàõ bu Atenuado inclui redução da patogenicidade do virus para uma espécie de ave e a redução da patogenicidade em um sistema de ensaio biológico que ê preditiva para espécies de aves (vide Exemplo 5 5).

Um outra aspecto da presente invenção é um viras de RNA uncolítico recumbínante atenuado para aves compreendendo um ácido nuclei· co compreendendo, pelo menos um, transgene codificando uma dtocina. Particularmente o- vírus ê atenuada para galinhas. O transgene codificando 1Ô uma citocina é partícuíarmente ò transgene codificando uma citociná aviária”, conforme aqui descrito,

Além disso, a invenção refere-se ao hucleocapsídeo do vírus recombinante da presente invenção compreendendo RNA viral complexado com proteínas de capsideo. Além disso, a invenção refere-se a um RNA .o 15 qual é RNA do vírus da presente invenção, A invenção também refere-se a um RNA complementar ao RNA do viras da presente invenção.

Além disso, a invenção refere-se a um DNA, por exempla, um DNAc codificando o RNA da presente invenção e/ou um DNA complementar ao RNA da presente invenção.. Além disso, a invenção refere-se á prevenção 20 ou tratamento de doenças tumarafe, câncer e/ou doenças proliferativas,

O RNA e/ou o DNA da presente Invenção pode ser fornecido em uma forma isolada.

Na presente invenção, a citociná codificada pelo transgene conforme descrito aqui pode ser selecionada de uma célula de pássaro infecte25 da pelo vírus da presente invenção e, depois de se ligar ao seu receptor de interferon apropriado na célula vizinha, pude induzir um estado antiviral na célula que carrega o receptor. Consequentemente, a replicação do vírus da presente Invenção na célula de passara estimulada por interferon pude ser Inibida pelo menos paraíalmente. A similaridade entre os interferons de gali30 nha tipo I e os interferons de mamífero tipo I é multo baixa (< de 25¾ de identidade em nível dé àmínoácido) (Steèhelí ef aZ. 20.01 Por esta razão, uma citocina exibindo tal efeito antiviral em uma célula de ave não apresenta essencialmente atividade biologíca em uma célula humana e pode não ter essenctelmente influência na replicação vira! em células tumorais humanas. Além disso, essencíalmente nenhum efeito adverso por assas citocinas são esperados no organismo humano..

A expressão do transgene que codifica uma ciíocina conforma aqui descrita leva a uma pãtogenícidade reduzida do vírus para espécies de aves, especialmente aves domésticas, especialmente galinhas e, deste modo, a uma toxicidade ambiental reduzida. A atividade do transgene que codifica uma citccina, conforme aqui descrito, não tem essencialmente efeito 10 prejudicial no efeito terapêutica do vírus.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas:

Vírus

A invenção refere-se de modo geral aos virus de RNA, preferivelmente aos vírus de RNA de fita negativa, mais preferivèlmenfe tais vírus 15 que têm tanto propriedades oncolíticas e podem ser geneticamente manipulados. Tais ví rus são:

- param ixovírus, preferivelmente vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus do sarampo, vírus dá caxumba, vírus Sendai;

~ oriomíxovírus, preferivelmente virus influenza;

~ rabdovírus, preferivelmente vírus da estcmafíte vesicular.

É preferível que o vírus da presente invenção seja um patógeno aviária, particularmente um patégeno de aves domésticas, mais particularmente um patógeno de galinha.

Também é pmferivel que o virus da presente invenção seja um

2.5 virus de RNA de fita negativa. O vírus de RNA recombinante da presente invenção pode ser um paramixcvirus, preferivelmente um vírus da Doença de Newcastle (NDV). O NDV pode ser uma cepa mesogênica o velogénica. É preferível que o NOV seja um NDV mesogêníco, vírus da presente invenção é obtenível a partir de um vírus da 30 Doença de Newcastle de RNA oncoiitico velcgênico ou mesogênico, particu larmente da cepa MTH68.

□ vírus da presente invenção é preferi velmente competente para replicação,

Q virus da presente invenção pode ter uma patogeniWads reduzida para uma espécte de ave, particularmsnte em relação ao vírus do qual o virus recombinante é obtenível

Ê preferível que no vírus da presente invenção, a redução de patogenícidade seja uma capacidade do vírus de reduzir a fee celular de pássaros em cerca de 48 h depois da infecção corn MC2 (),01 medido pelo aumento da viabilidade celulàr, por maio do que a viabilidade celular é aumentada até pelo menos cerca de 25% (tal como pelo menos cerca de 25% 10 até cerna de 50%) de células sobreviventes, mais preferivelmente àté pelo menos cerca de 50% (tal com© pelo menos cerca de 50% ate cerca de 75%) de células sobreviventes, e mais preferivelmente até pelo menos cerca de 75% (tal como pelo menos cerna de 75%· ate 100%) de células sobreviventes em relação ao virus do qual o vírus recombinant© é obtenível.

Também é preferível que no vírus da presente invenção, a redução de patogenicidade seja uma extensão do tempo de sobrevivência das embriões de galinha infectados com vírus ém ovos embrionadcs com 11 dias de idade medido pela determinação do tempo de morte médio (MDT). por meio do que o MDT é estendido por pelo menos cerca de 15 h (como pelo 20 menos 15 h até cerca de 20 h), mais preferivelmente pelo menos cerca de 20 h (corno pelo menos 20 h ate cerca de 30 h_f e mais preferivelmente por mais de 3Õ h em comparação ao virus do qual o vírus recombinante é obtido.

Em ainda outra modalidade, a atividade oncolítíca do vírus da 25 presente invenção pára células tumoraís humanas é éssencialménte nãbreduzida.

é preferível que no vírus da presente invenção, a atividade oncolítioa do vírus para células tumorars humanas medida pela viabilidade celular depois de 48 h depois da infecção não seja reduzida até mais de .59% em 30 comparação ao vírus do qual o vírus recémbinante é obtenível e, mais preferivelmente, é fôssençialmente não-reduzidà em relação ao vírus do qual .© virus recombinants é obtido.

Cítpcinas

A cítocina codificada por -pelo menos um transgene conforme aqui indicado pode ser uma cítocina. Particularmente, a cítocína pode ser uma citocina capaz dè inibir pelo menos pardalmente a replícação virei em δ uma célula da pássaro, particularmente em células de aves domésticas, mais partícularmente em células de galinha. É preferível que a repllcáção viral seja essendálmente completamente Inibida.

A citocina pode ser uma citocina sem essenoialmenfe atividade biológica em um mamiferOj. particularmente em um ser humano. Neste com 10 texto, '’atividade biológica se refere, particularmente, à oapaadade de uma citocina de inibir pelo menos pardalmente a repimação viral, partícula rmente a replioação de um virus da presente invenção. Atividade biológica também refere-se a qualquer outra atividade que uma citocina pode exibir em uma célula de um nãmmamífero e/ou em um não-mamifero.

A citocina pode ser uma citocina capaz da inibir pelo menos parcialmente a replicaçã© viral em um pássaro, particularmente em uma ave doméstica, mais particularmente em galinhas, e que pode não ter essencl· almente atividade biológica em um mamífero, partícularmente em um ser humano,

A citocina pode ser selecionada a partir de citoclnas aviárias,, particularmente de dtodnas de aves domésticas, mais particularmente de cifocinas de galinha.,

A citocina pode ser selecionada dentre interferons, particularmente de interferons de aves, mais particularmente de interferons de gate 25 nha, mais particularmente de interferons de galinha tipo l.

O interferon pode ser um interferon-beta ou um membro da familía de interferon alfa.

Em uma modalidade preferida, o virus de RHA ònenííticu rommbinante é um NDV compreendendo um ácido nucléico compreendendo um 30 transgena que codifica um ínterferon-alfa de galinha e/ou um interferon-beta de galinha.

Itaosgenes

Um transgene é definido no contexto do gencma NDV corno ácidos nueleícos adicionais que são introduzidos no genome viral Os ácidos nucteicos- podem ser selecionados a partir de diferentes tentes genêmicas (por exemplo, genoma NBV, ciassè de vírus diferente, fontes prócarlõticàs 5 ou eueariôticas, espécies de mamíferos e não-mamWros). Também transgenes fundidos de duas ou mais fontes genomícas diferentes são possíveis. Também transgénes sintéticos baseados na sí ntese cfe ntw de sequências de ácido nucléico pedem ser construídos. Os ácidas nucfeicos devem estar localizados em pêlo menos um cassete de transcrição, Pteferivelmente, o 10 transgene é traduzido em uma proteína na célula infectada. Por esta razão, a sequência transgênica deve incluir um códon de inicio e um de parada de tradução.

O virus oncolítieõ recombínante da presente invenção pode compreender um ácido nucléico codificando, pelo menos um, outro transge15 ne independentemente selecionado dentre os transgenes que codificam proteínas de ligação, enzimas conversoras de promedicamentos e proteases.

O, pelo menos um, transgene adicional codifica prefenvelmente uma proteína de ligação que tem atividade terapêutica quando expressa pela célula tumoral infectada por vírus.

Em outra modalidade preferida, o, pelo menos um, transgene adicional codifica uma enzima conversora de profármaco que tem atividade terapêutica quando expressa pela célula tumoral infectada com vírus.

Em ainda outra modalidade preferida, o, pelo menos um, transgene adicmnaí codifica uma protease que tem atividade terapêutica quando 25 expressa pela célula tumoral infectada por vims.

Se não for indicado de outra forma, “transgene ou “pelo menos um transgene”, conforme aqui utilizado, refere-se a um transgene codificando uma citocina de ave, ou pelo menos um outro transgene com atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral infectada por vírus, ou 3Ü uma combinação desses, Esta definição de ’transgene” se aplica particularmente na posição de uma variedade de transgenes no genoma viral, conforme aqui descrito, se não for indicado de outra forma..

O virus de RNA, o genome, antigenoma, nuoleocapsideo e/ou molécula de DNA da presente invenção pode compreender o transgene, conforme deserto aqui, o qual pode estar localizado no cassete de transem ção, conforme deserto aqui

O vírus oncqlítw recombinants da presente invenção pode compreender pele menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco ácidos nucleicos, cada um compreendendo um transgene, conforme aqui descrito O vírus oncolíticc recombinante da presente invenção pode compreender no máximo cinco ácidos nucléico, cada um compreen10 dend^um^:Uan^ene conforme aqui descrito, Partícutanpente, vírus gncolíticos recombinantes da presente invenção compreendem um, dois, três, quatro ou cinco ácidos nucleícos, cada um compreendendo um transgene, conforme aqui descrito. Se o vírus recombinants da presente invenção compreender pelo menos dois transgenes. eles podem ser idênticos ou diferentes.

O ácido nucléico compreendendo, pelo menos um, transgene pode estar localizado em qualquer posição entre as estruturas de leitura dos genes virais. Particularmente, o ácido nucléico compreendendo, pelo menos um, transgene pode estar localizado 5’ do N gene, entre o gene Neo P, entre o gene P e o M, entre o gene M e o F, entre o gene F e o NH< entre o ge20 ne HN e L e/ou a 3' do gene L. É preferível que o ácido nucléico esteja localizado em uma posição mais 5’ do gene? N, entre o gene N eo P e/ou entre o gene P e o M, uma vez que tal local leva a uma expressão melhorada em comparação com um locai mais 30

Preferivelmente, o vírus da presente invenção exibe uma ínfec25 ção tumor-seletiva que leva a uma expressão tumor-seletiva do transgene conforme aqui descrito.

O virus de ARMA recombinante da presente invenção pode compreender no total ate cinco transgenes:, até quatro transgenes, ou até três transgenes.

Na presente invenção, o transgene que codifica uma ctocina de ave, ou pelo menos um outro transgene com abvidade terapêutica quando expressa por uma célula tumoral infectada por vírus, ou uma combinação desses ê preferivelmente heterólego na vírus de RNA oncolífico no qual o virus de RIMA rocombinante da presente invenção é baseado, O termo heterótogo’·, conforme aqui utilizado, refere-se ao gene completo ou a uma parte sua, a qual pode ser a região codificadora do gene eu uma parte sua,

O ácido nucléico heterólogo pede ser um ácido nucléico artificial ou pode ser obtido a partir de fontes naturais ou por reeombinaçâo de pelo menos dois ácidos nucteicos obtidos d© fontes naturais e/ou ácidos nucleicos artificiais, ’’Fontes naturais” Inclui animais como mamíferos, plantas, fungos e microorganismos oomo bactérias, protozoanes e vírus, os quais pelt) dem ser diferentes dos vírus de RNA oncoliticos da presente invenção.

O transgene pede também codificar uma proteína de fusão.

Em outra modalidade da presente invenção, a transgene que codifica uma eifocina de ave e pelo menos um transgene adicional com atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral infectada por vilo rua pode estar localizado em pelo menos duas unidades de transcrição separadas..

Pelo menos uma unidade de transcrição compreendendo o ácido nucléico compreendendo, pelo menos um, transgene codificando uma citocina de ave pode também ser transcrita em uma célula tumoral, conforme aqui 20 descrito.

Pelo menos uma unidade de transcrição compreendendo o áoido nucléico compreendendo, pelo menos um, segundo transgene com atividade terapêutica quando expresso por um tumor infectado por vírus pode ser também transcrito em uma célula de pássaro, confonw aqui descrito,

Pelo menos cada uma das duas unidades de transcrição separadas podem ser transcritas em uma célula tumoral, conforme aqui descrito, e em uma célula de pássaro, conforme aqui descrito.

Em uma modalidade alternativa preferida, pelo menos um transgene codificando uma citooína de ave e pele menos um outro transgene com 30 atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral infectada por vírus são traduzidos em uma célula tumoral, conforme descrito aqui e em uma célula de pássaro, conforme aqui descrita.

'Proteínas de Ligação

No vírus de RNA reoombinanfe oncóíítico da presente invenção, o, pelo menos um, transgene adicional com atividade terapêutica quando expresse per urna célula túmórál infectada por vírus pode codificar uma pro5 teína de ligação.

Consequentemente, o assunte da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um vírus oncoiífiçp reeombfeante da presente invenção, um genome viral da presente invenção, um antigenema viral da presente invenção e/ou uma molécula de DNA da presente ín~ 10 venção com um ingrediente ativo opcionalmente junto com veículos, diluentes e/ou adjuvantes farmaceutiuamente aceitáveis, cujo vírus, genoma viral, antigenoma e/ou molécula de ONA compreende pelo menos um outro transgene com atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral codificando uma proteína de ligação.

proteínas de ligação são proteínas as quais, guando expressas em uma oeiute-alvOj são capazes de se ligar a um componente da referida célula e/ou uma célula vizinha. Preferivelmente, as proteínas de ligação são proteínas as quais se ligam aos componentes intracelulares,

Em uma modalidade preferida, uma proteína de ligação é sele20 cipnada do seguinte grupo consistindo de um iigante natural, um Iigante geneticamente modificado, um dOminio solúvel reuurWinãnte de um receptor natural e uma versão modificada sua, um ligaste peptidiou. um Iigante polipeptidico, uma molécula de anticorpo e fragmentos e derivados seus, e uma molécula tipo anticorpo como uma proteína de repetição de anqumna e 25 fragmentes e derivados seus.

Uma recapstuiação incxMnpletâ de estruturas de ligação de alta afinidade é dada por Ladner e Ley (2001)

As proteínas de ligação, conforme aqui desonto, podem ser de ungem humana, murína ou intimamente relacionada, ou uma versão quimé30 rica, isto é, uma proteína a qual pode ser uma proteína de fusão compreendendo sequências de diferentes espécies, por exemplo, humana e de mundo.

As moléculas de ligação reçombinantes com base na descrição acima podem ser monoméricas, diméricas, triméricas, tetraméricas ou mulAmericas. As moléculas de ligação recombinantes com base na descrição ac tma podem ser monoespecifícas, bíespecificas ou multiespeclficas.

As proteínas de ligação preferidas são selecionadas dentre as proteínas de ligação com atividade terapêutica,

Um ligante natural, conforme aqui descrito, pode ser um fator de crescimento ou um peptídeo, Um ligante gérietíoãménte modificado pode ser um análogo de um fator de crescimento de ocorrência natural eu peptídeo.

Domínios solúveis recombinantes de um receptor natural ou versões modificadas dele, conforme aqui descrito, são domínio extracelulares solúveis recombinantemente expresses de um receptor de superfície celular e/ou fragmentos dele, um domínio extracelular solúvel recombinantemente expresso de uma molécula de adesão celular e/ou de fragmentos seus.

Moléculas de anticorpo, conforme mencionado acima, podem ser anticorpos de ímunoglobulina monoolonais de qualquer especificidade e isotipo conhecidos, fragmentos seus e/ou fragmentos seus fundidos com as proteínas efeioras. As moléculas de anticorpo podem ser anticorpos quimèricos, humanizado ou seres humanos. Fragmentos de anticorpo contém pelo 20 menos um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo. Fragmentos de anticorpo foram descritos extensivamente na literatura (recapítuíado, por exernplo. em Allen (2002), aqui incorporado por referência). Exemplos preferidos são fragmentos Fv de cadeia única, fragmentas Fab, F(ab2p versões eliminadas de dominie chamadas de minicorpos e outras porções imunoati25 vas, fragmentos, segmentos e outras estruturas de anticorpo parcial menores ou maiores, em que a ultima possui propriedades de direcionamento sufíCientes ou atividade irrmnolégíoa estímulatória ou inlbitòria de modo a ser terapeutícamente útil nos métodos da presente invenção.

Tass anticorpos podem ser derivados de experimentos de dona30 gem de hibridoma pelo uso de camundongos transgênicos ou de seleções de exibição da lagos, seleções de exibição de ribossorno ou varredura de filtre dê colônia de bibliotecas de anticorpos contendo sequências de ante corpos humanas ou metodologias relacionadas.

Proteínas de ligação com propriedades tipo anticorpo conforme aqui descritas podem ser proteínas geneticamente rood fcadas ou domínios das quais, nas quais uma ou mais alças de peptídeos são aleatorizadas nu 5 nível dos amínoácidos de tal modo que moléculas de ligação de alta afinidade com alta especificidade podem ser enriquecidas contra qualquer antlgeno das bibliotecas de tais moléculas por exibição de fago< exibição de ribcsso mo, varredura de filtro de colônia ou metodologias relacionadas. As proteínas selecionadas geralmente têm elevada estabilidade térmica ou termed ΙΙΟ nârmca e são bem expressas em sistemas de expressão recombínantes como, por exemplo, sistemas de expressão de £ co< levedura, inseto e mamí fero. Exemplos para tais proteínas de ligação com propriedades tipo antkfer. po são proteínas de repetição de anquirina conforme descrito em Bínz Ma£ (2004), as lipocalinas conforme descrito em Skérra (2000), as gama15 cristalinas conforme descrito em DE 199 32 688.6, a estrutura da proteína A modificada (aficorpos) conforme descrito em Hogbom M al (2Ó03) ou Nord ef a/. (2000) ou a estrutura de fibrónectina é outras. Moléculas tipo anticorpo podem ser moléculas monoméricas ou repetitivas, ou construídas como moléculas de cadeia única ou como moléculas com múltiplas cadeias, em que a 20 molécula tipo anticorpo possui propnedades de direcionamento satisfatórias ou atividade imunolúgíça estímulatoria ou inibiforia de modo a se? terapeuticamente útil nus método da presente invenção.

Outro assunto da presente invenção è um método para o tratamento de uma doença proliferative, particularmenfe de uma doença hiper2S proliferafiva, como um tumor uu câncer, compreendendo a administração em uma quantidade farmaceuticanronte eficaz a urn indivíduo necessitado disso de um virus oncolitico recombinante da presente invenção, um genoma viral da presente invenção, um antigenoma viral da presente invenção e/ou uma molécula de DNA da presente invenção que compreende pelo menos um 30 outro transgene com atividade terapêutica quando expressa por uma célula tumoral infectada por viras que codifica uma proteína de ligação conforme aqui descrito.

Moléculas de Ligação com Função Adicional

A proteína de ligação pede ser uma proteína de fusão compreendendo, pelo menos um, domínio de ligação, por exemplo, de um anticorpo, e pelo menos um domínio heterôlogo, ’‘Heteróiogo'· tem o signifcado, 5 conforme discutido acima, no contexto dos genes heterólogos.

As proteínas de ligação descritas acima são capazes de distribuir uma carga util a um sitio especifico da doença (por exemplo, um tumor) como o chamado infracorpo o como urna proteína de ligação disponível extracelular. A carga útil fornecida pode ser um domínio heterologo, por exem10 pio, uma toxina como a RNAse humana (De Lorenzo et aí, 2094) (Zewe et aí, 1â97), exatoxina de Pseudomonas (Chaudhary êt aí , 1989) (Kreitman e Fasten, 1995) (Batra et aí, 1992), toxina difterica (Rreítoan et aí, 1993) (Chaudhary et aí , 1999) (Batra et aí, 1991) ou uma enzima como uma betagalactosidase, beta-glícuronldase (Roffer et aí, 1991) (Wang al at, 1992) 15 (Bosslet ét Μ, 1992), béta^gfcosidàsé (Rówliósón-Busza, 1992), carboxípeptidase (Antoniw st aí, 1990), (Bagshawe et aí, 1988), beta-lactemase com eficácia terapêutica ou uma proteína imuncestimulatéría com atividade de citocina como 1L-2, íL-12, TNF-alfa, iFN-beta ou GM-QSF (vide, por exemplo, a revisão da Alien (2002),

Em outro exemplo, as proteínas de ligação descritas acima têm por sí só eficácia antagonistica ou agonisfca, a qual é terapeuticamenté util. Exemplos para proteínas dé ligação antagonístícas/de bloqueio são o anticorpo inibítòrío VEGF Avastína (Ferrara et a/., 2094), o anticorpo de bloqueio de receptor HER2/neu herceptina (Noorfoerg e Benz, 2900), ou o anticorpo 25 de bloqueio de receptor EGF efoitux (Herbst e Langer, 20Q2), Proteínas de ligação ágomstícãs podem ser proteínas de ligação as quais incluem, por exempfo, apoptese (Georgakís M aí , 2905) ou que têm atividade regulatória no DNA, RHA ou proteínas (por exempla, induzem a transcrição, estabilizam proteínas). A rovisâo de (Adams e Weiner, 2905) descreve vários anticorpos 30 terapêuticos que também poderíam ser Incorporados em um virus oneolitica.

Enzimas Conversoras de Profármaco

No virus de RNA recombínante oncolitico da presente invenção, o, peb menos um, outro transgene com atividade terapêutica guando expresso por uma célute tumoral infectada por virus pode codificar uma enzima conversora de profármaco.

Um profármaco é um derivado ou precursor de um composto S terapeuticamente ativo, o qual pode ser enzímatícamente convertido no composto ativo. Enzimas conversoras de profàrmaco são enzimas capazes de converter um profãmiacc no fermaco terapeutiçamente ativo.

Consequentemente, é assunte da presénte Invenção uma camposição ferrnaçêufca compreendendo um vírus oncolltico recombinante da 10 presente invenção, um genoma viral da presente invenção, um antigenoma viral da presente Invenção e/ou uma molécula de ΠΝΑ da presente invenção como um ingrediente ativo opcionalmente junto com veículos, diluentes e/ou adiuvant.es farmaceuticamente aceitáveis, cujo virus, genoma viral, amigenoma e/ou molécula de ONA compreende pelo menos um outro transgene 15 com atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral infectada por vírus que codifica uma enzima conversora de profarmaco.

A composição farmacêutica pode ainda compreender um profármaco o qual pode ser convertido em um composto terapeuticamente ativo pela enzima conversora de profármaco codificada pelo virus, genome viral 20 antigenoma e/ou molécula de DNA. A composição farmacêutica pode ser adequada para o tratamento e/ou alívio de um distúrbio proliferativo.

O profármaco pode ser formulado em uma única composição com o vírus oncolitico recombinante da presente invenção, um genorna viral da presente invenção, um antigenoma viral da presente invenção e/ou uma 25 molécula de DNA da presente invenção como um ingrediente ativo, ou pude ser formulada em urna composição distinta da formulação de vírus cncolítico.

Se u vírus de RNA recombinante oncolitico da presente invenção codificar uma enzima conversora de profármaco, o vírus oncolittce da 30 presente invenção causa a expressão seletiva da enzima conversora de profármaco em uma célula-àlvu infectada per vírus (particulãrmente uma célula tumoral), a qual geralmente não expressa ou não expressa de modo sufid ente a enzima conversora de prefârmaco. Deste mede, durante o tratamento dê um indivíduo necessitado disso, o profármaco é específicarnente convertido no composto farmacêutico ativo em uma céluia-alVo, partícularmente em uma célula tumoral, porém pode êssencialmente não ser convertido no com· 5 posto terapeutícamente ativo em uma célula nâo-alvo, particularmente em uma célula saudável do indivíduo a ser tratado. Deste modo, os efeitos cola terais índesejados do composto terapeuticamente ativo sâo reduzidos em comparação ao tratamento do composto terapeuticamente ativo sozinho.

No contexto da presente invenção, c profármaco pode ser um derivado ou um precursor de um composto terapeuticamente ativo adequado para o tratamento e/ou alivio de um dístórbic proliferative, tumor e/ou câncer, cujo profármaco pode ser convertido por uma enzima conversora de profármaco. O profármaco pode ser um composto conhecido por uma pessoa versadas na técnica. Derivados e/ou precursores são conhecsdos por uma ροδί 5 soa versada na técnica.

É preferível que o profármaco seja esseneiaimente farmaceuticamente inativo e/ou não-tòxico.

Exempms de enzimas conversoras de profármaco da presente invenção são beta-ghcuromdase, bet-gaiactosídase, beta-glicosidase, carbo20 xipeptidasé, beta-lactamase, D-aminoáddo oxidase. Outros exemplos são conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

É preferível que a enzima conversora de profármaco ç@|a essencialmente nãorexpressa em células não tumorais.

A enzima conversora de profármaco pode ser obtida de um or25 ganismo selecionado dentre mamíferos, plantas, fungos e microorganismos como bactérias, protozoárius e vírus.

Uma combinação mais preferida da enzima conversora de profármaco e um profármaco é uma beta-glfeuronidase de E cofi e um profarmaco o qual pode ser convertido pela beta-gliouranidase em um composto 30 cítotõxico ativo. Um exemple è o HMR1826 (doxorrubícina-glicuronideo) c qual pode ser convertido em doxorrubicina, o qual é um composto conhecido para o tratamento da câncer.

Outro assunta da presente invenção é um método para o traíamenta de uma doença proliferative, particularmenté uma doença híperprolifemtiva, como um tumor ou câncer, compreendendo a administração em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. a um indivíduo necessitado disso de 5 um vírus oncõótiuo recombinante da presente invenção, um genorna viral da presente invenção, um antigenoma viral da presente invenção e/ou uma molécula de DNA da presente invenção compreendendo, peto menos um, outro transgené codificando uma enzima conversora de profàrmaco conforme aqui descrito,

Particutennente, é um assunto da pmsentc invenção um método para o tratamento de uma doença proliferative, partiçularmçnte uma doença hiperpmliferativa, como um câncer, compreendendo a administração em uma quantidade farmaceuticamente ebeaz a um indivíduo necessitado disso.

(i) um vírus oncoiítico recombinante da presente invenção, um genoma viral da presente invenção, um antigenoma viral da presente invenção e/ou uma molécula de DNA da presente invenção compreendendo, pele menos um, transgene codificando uma enzima conversora de profàrmaco, e (ii) um profàrmaco adequado para o tratamento da doença proliferative. cujo profàrmaco pode ser convertido em um composto farmaoeutí- camente ativo peia enzima conversora de profàrmaco de (i),

Q método pode compreender a administração de uma única composição farmacêutica compreendendo ambos os componentes (i) e(íi), ou pode compreender a administração de duas composições farmacêuticas distintas, uma das quais compreendendo o componente (i) e a outra com· 25 preendendc (ii).

Proteases

No virus de RNA recombinante onoolitloo da presente invenção, pelo menos um outro transgene com atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral infectada por vírus pode codificar uma protease.

Deste modo, é assunto da presente invenção uma composição farmacêutica compreendendo um virus oncolitico recombinants da presente invenção, um genoma viral da presente invenção, um antigenoma vital da presente invenção e/ou uma molécula de DNA da presente invenção como um ingrediente atíw, opcíonalmente junto com veículos, díluentes e/ou adjuvantes farmaceutícamente aceitáveis, cujos vírus, genoma viraí, antígenema e/ou molécula de ONA compreende pelo menos um outro transgene com 5 atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral infectada por vírus que codifica uma protease. A composição farmacêutica pôde ser adequada para o tratamento e/ou alívio de um distúrbio proliferative.

Se o vírus de DNA recombinante oncolítico da presente invenção codificar uma protease, ç vírus oacolítico da presente invenção pode 10 causar a expressão seletiva da protease em uma eélula-alvo infetada por vírus (particularmente uma célula tumoral) a qual comumente não expressa ou não expressa sufictentemente a proteasé. Deste modo, durante o tratamento de urn indivíduo necessitado disso, a protease pode írreversiveimente clivar um poíipeptidee-alvo em uma célula-alvo, deste modo inibindo a prnli15 feráçãc e/ou crescimento da célula-alvo ou morte da célula-alvo, porém pode essencialmente não clivar a molécula-alvo em uma célula não-alvo, particularmente em uma célula saudável do indivíduo a ser tratado. Por esta estratégia, efeitos colaterais indesejados do tratamento com protease são reduzidos.

É preferível que a protease seja uma protease de sequência específica. Mais preferivelmente, ê uma protease que diva especificamente um pclipeptídeo-alvo. A protease pede ser ou de origem natural e pode ser derivada de qualquer espécie, ou ela pode ser manipulada. SEquências de amínoãcídos adequadas para uma divagem específica de um pdípaptideo-aivo 25 predeterminado podem ser determinadas per urna pessoa versada na técnica, por exemplo, com base nos bancos de dados de sequências publicamente disponlyels. US 2605-0175581 e US 2004-007227S descrevem a geração de proteases pmteina-manipuladas com uma especificidade de substrato predeterminada. Esses dois documentos são aqui incluídos por referência.

A molécula-alvo da profease pode ser qualquer molécula-alvo conforme descrito abaixo pára alvos de proteínas de ligação.

Outro assunto da presente invenção é um método para o tratamento de uma doença proliferative, particularmente de uma doença hiperproliferative, como um tumor ou câncer, compreendendo a administração em uma quantidade farmaceuticamente eficaz a um indivíduo necessitado disso da um vírus onaoíitico recombinante da presente invenção, um genoma viral 5 da presente invenção, um antigenoma viral da presente invenção e/ou uma molécula de DNA da presente invenção compreendendo, pelo menos um, outro transgene com atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral infectada por vírus para urna protease.

O transgene da presente invenção pode codificar uma proteína 10 de fusão de uma enzima conversora de profármaco conforme definido acima, uma molécula de ligação conforme definido acima efou urna protease, conforme definido acima. É especíalmente pretenda uma proteína de fusão de uma enzima conversora de profármaco é uma molécula dè ligação ou uma proteína de fusão de uma protease e de uma molécula de ligação.

Aplicações Xerapêutíças

A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica a qual compreende como um ingrediente ativo um vírus, conforme descrito aqui, um nucleocapsideo do vírus, urn genoma do vírus ou uma molécula de DNA codificando o genoma e/ou um antígenoma do vírus, opcionalmente 20 juntamente com veículos, diluentes e/ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.

A composição fermanêutica pode ser fornecida como uma solução, suspensão, um iiofilisato ou em qualquer outra forma adequada. Alèm do ingrediente ativo, a composição pude compreender veículos, tampões.

tenseatívos efou adjuvantes, conforme ê conhecido na teçnlcã, A composição pode ser administrada, pqr exemplo, ora Imente, fopicamente, nasalmente, pulmonarmente ou por injeção localmente ou intravençsamente. A composição farmacêutica é administrada em uma quantidade feanaeeufícarnente eficaz dependendo do tipo de distúrbio, da condição e peso do paciente, da via de administração, etc. Prefenvelmente de 10® a 10'* partículas virais, de TO⁸ a W* a 10¹®, ou 10^§ a 10^s partículas virais são administradas por aplicação. A terapia oncdlítíCa pode ser opoionalmenté combinada com ou tras terapias turnorais como cirurgia, radiação e/ou quimioterapia como tratamento com oiclofesfamida e/ou tratamento com hípertermia.

é ainda outro aspecto um método para p tratamento de uma do ença proliferative e/ou câncer, compreendendo a administração em uma 5 quantidade farmaceuticamente eficaz a um indivíduo necessitado disso de um vírus oncolítico reoombinante compreendido conforme aqui descrito, um nucléocapèideo do vírus, úm genoma do virus ou uma molécula de DNA co dificando o genoma e/ou um antigenoma do vírus, opoionãlmente junte mente com veículos; díluentés e/ou adjúvantes farmaceutícamente aceitáveis,

1Ô De acorde com a presente invenção, um paramixovírus onoolrte co recombinante pode expressar uma proteína de ligação solúvel uma enzima conversora de profármaco e/ou uma protease que pode permanecer ou na célula infectada ou pode ser secretado, como um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma proteína de repetição de anquírina ou outra molécula de ligação conforme especificado abaixo.

Como um NDV exemplar, a cepa MTH68 foi escolhida na presente aplicação porque ela tem uma propriedade oncoíitíca inerente com dados promissores a partir de tratamentos clinicas experimentais dos pacientes (Sinkovics e Horvath, 2000). Entretanto, a principio, a maioria das oe20 pas NDV com sitias de divagem de proteína de fusão multíbásica pode ser usada como agentes oncoliticos para o tratamento de tumores. A tecnologia genética reversa è aplicável a todas as cepas.

Proteínas de ligação, conforme aqui descritas, foram demonstradas como sendo de alto potencial terapêutico.

2S A combinação cte NDV oncolítico com as proteínas de ligação terapêuticas, enzimas conversoras de profármaco e/ou proteases das propriedades descritas acima terá uma eficácia adicional ou até mesmo sinergísticã de dois principies terapêuticos. O vírus autorrsplioante oncolltioo almeja o fármaoo da proteína de ligação, a enzima conversara de profármaco 3Q ateu a protease áq sítio preferido de ação, onde ele é expresso M s/te em altas concentrações locais. Espera-se que tal expressão de proteína seja multo seletiva e a proteína de ligação, a enzima conversora de profármaco e/ou a protease com o seu respectivo medo de ação seja adicionada à atividade oncolítica terapêutica intrínseca do NDV. Com base na natureza competente de repíicaçào do vírus usado e da replicação seletiva em células tumorais, espera-se que a quantidade de transgene expresso [proteína de li5 gação, a enzima conversora de profármaco e/ou protease] seja aproximadamente proporcional á massa tumoral.

Moléculas de anticorpo ou moléculas tipo anticorpo ou derivados seus são proteínas de ligação ideais a serem usadas com o sistema NDV. Moléculas de anticorpo foram à assunto de pesquisa intensiva e tecnologias 1Ô são atualmente disponíveis para gerar mòlêculas de anticorpo, as quais são não-imunogênicas, muito seletivas e de alta afinidade, A expressão local das moléculas de anticorpo ern altas concentrações leva a uma eficácia agonística ou antagonistíca muito significativa ou ao direcionamento eficiente das moléculas efetoras com perfil de toxicidade reduzido em comparação com a 15 terapia padrão.

Espera-se que o uso de moléculas tipo anticorpo no sistema

NDV seja ainda maior. Essas moléculas são manipuladas para ligação de alta afinidade seletiva com estabilidade térmica e rendimento muita altos em comparação a anticorpos normais. No caso de moléculas tipo anticorpo cam 20 base em anquirina. a natureza repetitiva da molécula pode ser ajustada de acordo com o respectivo alvo para direcionamento, ligação, inibição ou ativação otimizada. Também diferentes especificidades de ligação podem ser combinadas com uma molécula de anquirina, explorando a possibilidade de unir em uma molécula de repetição de anquirina várias unidades com dite25 rentes especificidades de ligação. Esta estrutura modular permite a ligação multivalente de superficies proteicas maiores do que é possível para os anticorpos, o que pode ser extremamente importante no bloqueio das interações proteina-proieína. A estrutura modular pode se? também explorada para bloquear varies efetoras com somente uma única proteína bloqueadora de re30 petição de anquirina,

Tendo em vista que as moléculas de repetição de anquirina são extremamente estáveis mesmo sob condições redutoras, essas moléculas podem ser man ipu ladas para tratar proteínas dentro da célula (intracorpo'’),

E também possível o uso de bibliotecas de sequências codificaderas de proteínas de ligação com NDV para a identificação do alvo fo wm

Alvos possíveis pára as moléculas de ligação e/ou proteases podem ser todas as estruturas de uma célula-ãlvo ou da matriz extracelular ao redor da céluía-alvo, as quais podem ser reconhecidas pelas proteínas e>u proteases de ligação descritas e as quais são relevantes para um certo tipo de fenótipo patõlogico, Essas podem ser proteínas éstruturais^euzimas, fatores de crescimento, receptores do fator de crescimento, íntegrínas, fato10 rés de transcrição, etc.

Até mesmo alvos que não são afetados com medicamentos por moléculas pequenas (interações proíeína-proteína, ligação de DNA, etc.) podem ser endereçados por esta invenção.

A combinação do NDV oncoHtíco e das proteínas de ligação te15 rapêuticas, enzimas conversoras de profãrmaco e/ou proteases, conforme aqui descrito, é considerada para o tratamento de doenças ínflamatõnas, por exemplo, dé artrite reumatoidee de câncer.

Para o tratamento dç câncer, todas as víàs as quais contribuem para o desenvolvimento do câncer podem ser dírecionadãs. Essas vias são; 20 autossufíciêncía em s leais de crescimento, insensibilidade aos sinais in íbitbnos de crescimento (anticresólnientu), evasão da apoptose, potencial replicative ilimitado, angiogênese sustentada e invasão e metâstase tecidual. Um resume dessas vias é dado em (Hanahan e Weinberg, 2000). As vias de sinalização que são envolvidas nu processo de tumorgênese e podem ser di25 récionadas pela abordagem descrita são a via do receptor da tirosina quinase (RTK), via RB e p53, via da apoptuse, via ARC, via HIF1, via GLI, vía PI3K e a via SMAD. Uma descrição detalhada dessas vias dê sinalização são dadas em Vogelstein e Kinzíer (2004),

Outras via de sinalização onde as proteínas do ligação descries 30 podariam interferir são as vias ras_sWnt e Hedgehog onde, por exemplo, interações proteina-proteína podem ser bloqueadas.

Exemplos de proteínas de ligação que intervém beneficamente nas vias descritas acima em células .cancerosas.são:·

- proteínas de bloqueto de receptores, do fator de crescí mento ativo autônomo (por exemplo, EGFR, Met)

- íigantes competitivos para fatores de crescsmento (antegonís- tas)

- proteínas de bloqueio para RMosforilação

- proteínas cfe bloqueio para a transcrição dependente de E2F

- estabilizadores para p53 « íigantes antagonistas para proteínas antíapoptoticas (por e~ xemplo. Bd-2) ~ íigantes antagonístícos para ciclinas ~ íigantes antagonístícos para efetores Ras (por exemplo, GEFs) » íigantes antagomstioas para proteínas índutoras de hípóxia (por exemplo. HIFIu)

- inibidores dos fatores de transcrição que interferem com a di~ merização, ligação do DNA e/ou ligação do cofator (por exemplo, Myc/Max)

- indutores de diferenciação

- inibidores de sinalização/translooação smad

- inibidores de interações de adesão celular (caderínas, integri-

2Q nas, por exemplo. α50ΐ, ονβ3) inibidores de enzimas que degradam a matriz eztracelular (por exemplo, MMPs)

- íigantes antagonístícos para íigantes prô~angíogõnicos (por e~ xemplo, VEGF-R solúvel)

- inibidores de quinases mitôticas (por exemplo, Plk~1)

- íigantes antagonístícos para receptores pró-angiogênlcos

- inibidores da formação do complexo de estrutura (por exemplo, KSR/Ras)

- inibidores da iniciação de tradução (eíF4E, EIF2a)

A protease da presente Invenção, a enzima conversora de profãrmaco e/ou os compostos terapeutícamente ativos derivados dos promedícamentos da presente invenção pela enzima conversora de profármaco podem também- intervir beneficamente nas vias descritas acima das células cancerosas.

Virus Recambinante

Vírus recombínante significa um vírus que tem uma alteração definida manipulada na sua sequência de RNA gentaica. Este alteração pode ser uma ou mais inserções, eliminações, mutações pontuais eu combinações suas.

Um vírus de RNA reccmbsnante da presente Invenção pode compreender a sequência genômíca total de um vírus de RNA natural (nãomodiricado) ou uma sequência derivada dela e pode adicionaímente compreender pelo menos um cassete de transcrição recumbinante. o, pelo menos um, cassete de transcrição pode estar localizado entre dois ganes (unidades de transcrição) do genoma viral. Neste caso, o, pelo menos um, cassete de transcrição é flanqueado pelas sequências de inicio e parada de transcrição. O, pelo menos urn, cassete de? transcrição pude também estar localizada em uma unidade de transcrição do genoma viral. Neste caso, nenhuma sequência de inicie ou parada de transcrição adicional é necessária.

O, pelo menos um, cassete de transcriçãò pode compreender sítio de restrição, como Pact e/ou Ascl, o qual pode ser único. Se dois cassetes de transcrição estiverem presentes, eles podem compreender diferentes sírios de restrição.

É preferível que o virus de RNA da presente invenção compreenda um o dois cassetes de transcrição recombinantes.

Em, pelo menos um, cassete de transcrição da presente invenção, existe urn transgene localizado, o qual pode codificar uma proteína de ligação, uma enzima conversora de profármaco e/ou uma protease, conforme aqui descrito.

Qualquer região intergênica entre cada um dos dois genes (unidades dé transcrição) do genoma virei é adequada para introduzir pelo menos um cassete de transcrição recombinante. Se mais de um cassete de transcrição recombinante estiver presente, eles põdém estar localizados na mesma ou em diferentes regiões intergènicas. É preferível que pelo menos um cassete de transcrição recombinante esteja localizado entre os genes F e HN vírais, partinularmente se o vírus de RNA da presente invenção for um vírus da doença de Newcastle recombinante,

Não e conhece limite superior para o tamanho do genoma e Pa5 ramixoviridae. Consequentemente, não há limite superior para a quantidade e tamanho dos transgenss introduzidos no vírus de RNA recombinaate da presente invenção, έ preferível que o transgene (transgene codificando uma cítcfeina de ave, ou pela menos um outre transgene com atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral infectada por vírus, ou uma 10 combinação desses, conforme aqui descrito) tenha índependentemenfe um tamanho de ate cerna de 10 Kb₍ mais preferivelmente de até cerca de 5 Kb. mais preferivelmente de até cerca de 2 Kb,,

Na expressão (incluindo a transcrição do RNA viral em RNAm e a tradução do RNAm) do transgene. conforme aqui descrito, as sequências 15 de controle de expressão como as sequências de início e parada de transchçào e as sequências que controlam a tradução são usadas. As sequências de controle de expressão de um vírus de RNA podem ser usadas, as quais podem ter o vírus de RNA, no qual o vírus de RNA recombínante da presente invenção está baseado. Partícu|armente_s as sequências de inicio ©de pa20 rada de transcrição podem ser obtidas de um vírus de RNA. As sequências de controle de expressão podem também ser obtidas de uma céluía-alvo. particularmente de sequências que controlam a tradução e/ou transporte de proteína.

Revido ao mecanismo de replícação do Paramixovirídae, os 25 RNAs genômicos nu antigenômlces geralmente não aparecem como RNAs nus. Os RNAs genômiçns ,e antigenômicos são montados com á nucleoprotelna, Consequentemente, um outro objetivo da^;pre^einte Invento é um nm cfeocapsideo de um vírus de RNA oncnlitíéo moombinante da presente invenção. Q nucteocapsídeo compreende a molécula de RNA que codifica õ 30 genoma e/ou o antigeaoma do vírus tio RNA e a proteína do nucleocapsídeo. O nucleocapsideõ pode também compreender a proteína L pqlimerase e/ou a fnsfoprotelna R.

Ê também assunto da presente invenção 0 antigenoma do genome da presente invenção, conforme aqui descrito.

ê um outro aspecto da presente invenção uma molécula de DNA qué codifica 0 gengma e/ou o antigenoma de um vírus de RNA oncolítico recumbínante da presente invenção. A molécula de DNA pude ser um plasmldeo. A molécula de DNA da presente invenção pode ser usada para manipular geneticamente 0 vírus de RNA da presente invenção. Além disso, ã molécula de DNA pode ser usada para produzir o vírus de RNA da presente invenção, Deste modo; a molécula de DNA pode ser operativa mente ligada a uma sequência de controle de transcrição, por exemplo, uma sequência de controle de transcrição proçanótica nu euuariótica.

É outro aspecto da presente invenção um método para a produção de um virus de RNA oncolítico reçombinante expresso de uma molécula de DNA codificando 0 genoma e/ou o antigenoma de um virus oncolítico reçombinante da presente invenção, partícularmente o NDV oncolítico recombinante da presente invenção.

É outro aspecto da presente invenção uma célula compreendendo o vírus oncolítico reçombinante da presente invenção, um genome viral da presente invenção, um antigenoma viral da presente invenção e/ou uma molécula de DNA da presente invenção. A célula pode ser uma célula p rocariôticà ou uma célula eucaríética. A célula pode ser uma linhagem celular, particulamiente uma linhagem de célula de mamífero mais particuianneme uma linhagem celular humana óu rnunna. A célula pode ser usada no método da presente invenção para produzir o vírus de RNA da presente invenção. Sistemas adequados para transcrever uma molécula de DNA são conhecidos por uma pessoa versada na técnica, por exemplo, em sistemas procariOticos como, por exemplo, E. coll ou sistemas eucariòticos, cor?? Hela ou CHO

Em ainda outro aspecto está um vires de RNA oncolítico, um genome o antigenoma seu o uma molécula de DNA compreendendo o grupo total de genes de Paramixoviudae ou um grupo de genes de Param ixovíridae no qual pelo menos um gene ou região intergênica é geneticamente modif?

cada, e ainda aompreendendó, pela manas uni cassete de transcrição recornbínánte conforme aqui deserto. Tal vírus, genoma ou antigenoma ou molécula de DNA pode ser usada para a produção de um medicamento e/ou tratamento da câncer. Tal vírus de RNA, genoma, antigenoma ou molécula 5 de DNA è adequada para construir um vírus Paramixovindae meombinante, particularmente um virus da doença de Newcastle recombinanté por técnicas de engenharia genética para introduzir uma sequência recombinante nç cassete de transcrição, Para este fim, pelo menos um cassete de transcrição pode compreender um sítib de restrição. Se mais de um cassete de transem 10 Çâo estiver presente, os únicos sítios de restrição dós cassetes de transcrição podem ser diferentes, Um exemplo é o plasmídeo pfiMTH6B„ Asc Pac da figura 1 do WO 2006/050984. a descoberta do qual sendo aqui incluídá por referência. Outro exemplo é a IgG ED8- de murino pflMTHBS conforme revelado na figura 2 do WO 2006/050984, a descoberta da qual sendo aqui 15 incluída por referência.

Relevância Terapêutica

O tratamento de dfeoer e/ou de um tumor inclui a inibição do crescimento tumoral, preferivelmente da morte das células tumórais ou do bloqueio ou proliferação em um intervalo de tempo por infecção, NDV se 20 replica setetlvamente em células tumurais.

O Vírus da presente invençãó pode ser usado para tratar distúrbios proliferativos, particuiarmente distúrbios hiperproliferativos. Preferivelmente neoplasmas podem ser tratados com o virus descrito, preferivelmente cânoeres do grupo consistindo de câncer de pulmão, cólon, próstata, mama 25 e cérebro podem ser furtados.

Mais preferivelmente, um tumor sólido pode ser tratado.

Ma^s ureferivelmente, um tumor com baixa taxa de proliferação pode ser tratado. Exemplos de tumores com baixa taxa de proliferação são câncer de próstata ou câncer de mama,

Mais preferivelmente, um tumor cerebral pode ser tratado.

Mais preferivelmente, um glioblastoma pode ser tratado. Mamíferos incluem seres humano,camundongos e ratos.

Produção do vírus tfe RNA recombinante

O vírus de RNA recombinante da presente invenção, particular» mente do NOV recombinante, pode ser construído conforme descrito em Romer-Oberdcrfer ef M (1999). A construção das novas sequências de áei5 do nucléico está no nivel do DNAc, o qual é então traduzido em RNA na célula eucariótica usando es seguintes plasmideos de inicio: pCITE P, ρΟΠΈ N, pClTE L. pX8ÕT fINDV.

NDV pode ser qualquer cepa do vírus da doença de Newcastle, mais preferivelmente uma cepa que è cncnlítica na sua forma tipo selvagem.

G plasm ideo pXBST é descrito ná EP 0 702 085 (Çqòzelmann

W

Q vírus de RNA recombmante da presente invenção, particularmente o NDV recombinante, pode ser recuperado iniciaimente de células expressando a T7 poiímerase, por exemplo, células ΒΗΚ T7 cu temporarta15 mente com células GHO transfectadas T7 polirnerase. Ele pode ser amplificado em células tipo 293, CEC32, HT29 ou A431. Ele também pode ser amplificado em fluido àlantoico de ovos de -galinha embrionados,

O vírus de RNA recombinants, particularmente o NDV recombinante, é armazenado sob as seguintes condições; O vírus de RNA recombí20 nante, particularmente NDV, é estável em D-manitol 5%/L.-lisina 1 % (p/v)/pH 8.0 ou em meio de cultura de céiulas-padrào.

A - 20X por afo um mês.

A -80^eC por até 10 anos.

O vírus de RNA recombinante da presente invenção pude ser 25 produzido usando um vírus tipo selvagem ou um virus recombinante como material de partida. Também um ácido nucléico. tal com QNA. incluindo tal sequência tipo selvagem ou recombinante, pode ser usado. Por exemplo, o virus de RNA e/ou a molécula de DNA recombinante, conforme descrita no WO 2006/050984, pode ser utilizada como material de partida. Um exemplo 30 é o plasmídeo ptlMTHOS Asc_Pac da figura 1 do WO 2006/050984. Outro exemplo ê a IgG EDB de murino püMTH68 da figura 2 do WO 2006/050984. A descoberta do WO 2006/050984 está aqui incluída per referência. Parties33 lartnenW, a descoberta do WO 2090/950984 sabre os virus de RNA oncolite cos recombinantes e a sua construção ê incluída aqui por referência. yM^QOV Recumbinante epmg um Medicamento

O vírus de RNA recombinant© da presente invenção, particular* mente o NDV recombinants purificado de acordo com a invenção, pode ser usado como medicamento, uma vez que apresenta efeitos farmacolôgicos.

O virus de RNA recombinante, particularmente c NDV da invenção, o genoma viral, antigenoma, nucleocapsideo e/ou molécula de DNA da presente invenção pode ser usado para a produção de um medicamento especialmente para prevenção, alívio e/ou tratamento do câncer, um tumor e/ou uma doença prpiiferativa, especialmente para prevenção, alívio e/ou tratamento de câncer, como câncer de pulmão, câncer de préstatã, câncer de cérebro, câncer de cólon, câncer de mama,

A composição farmacêutica da presente mvenção opoibóelmente compreendo veículo e diluentes farmaceutioamente aceitáveis. Tal veiculo e diiuentes são descritos em Remington's Pharmaceutical Science, 15^a ed. Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980), Os titulus virais usados na composição farmacêutica e/ou aplicados no método de tratamen to dá presente invenção podem estar na faixa de 10^s a TO¹² ufp (unidade formadora de placa) por dose, em uma faixa de 1(Pa 10ⁿ ufp, em uma faixa de 10' a 10^:V ufp ou em urna faixa de 10^ÍJa10^ ufp dependendo da indicação do tratamento.

A composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada para a prevenção e/ou tratamento de urn distúrbio proliferative, como câncer.

A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender uma emulsão do vírus de RNA oncolitíco recombinants da presente invenção, particularmente o NDV da invenção, e pode ser administrada por inalação, infusão intrávenosa, injeção subcutãneá, injeção intraperitoneal ou injeção intratumoral.

Nu método da presente invenção para a prevenção e/ou tratamento de um distúrbio proliferative, particularmente câncer, uma quantidade farmaceutioamente eficaz é um título do vírus de RNA oncolftíco da present© invenção, particu fermente o NDV da presente invenção, o genoma viral da presente invenção ou a molécula de DNA da presente invenção a qual prevíne, alivia e/ou suprime a doença.

5' Para efeito terapêutico, a dose aceiiovei pode depender, por e~ xemplo, do cónWucto, do paciente, das vias de administração e do tipo de câncer.

É preferiveí que o indivíduo (o paciente) seja urn mamífero, mais preferivelmente um paciente humano.

A presente invenção é ainda ilustrada pela seguintes Figuras e

Exemplos,

Legendas da Figura

Figura 1 descreve o plasmídeo pflMTH68 ChlFN-aifa que compreende o genome total de NDV è um cassete de transcrição que compre15 ende O transgene de interferon-alfa de galinha (Ch IFN-alfa),

Figura 2 descreve o plasmídeo pflMTHSS ChíFN-beta que compreende o genoma total de NDV e um cassete de transcrição que compreende o transgene de interferon-beta de galinha (ChIFN-beta).

Figura 3a demonstra que a linhagem celular CECF32 de ave é 20 parcíalmente protegida da líse 48 h depois da Infecção com NDV-OhlFN-alfa e fortemente protegida depois da infecção com NDV-ChIFN-beta. Infecção com um NDV que expressa GFP completamante destròi com a monocamada OEC-32. Ao contrário, nenhuma diferença no efeito lítico entre os três vírus NDV-GFP, NDV-OhlFN-alfa e NDV-ChlFN-betâ é observada depois da 25 infecção da hnhagem celular Hela tumorgênica. Independentemente do virus usado, a monocamada de células Hela é 48 h depois da infecção completamente destruída.

Figura 3b mostra uma quantificação da sobrevivência celular de células CEC-32 e de Hela 48 h apôs a infecção com 0 vírus NDVGFP, NDV30 ChlFHrelfá e hlDV-ChlFN-beta. Depois da infecção com NDV-GFP, a morte quase completa das células ÇEC-32 é observada, somente 3%· das células são viáveis, A infecção das células de uodomíz com NDV-ChlFN-alfa man35 térn 26% das células infectadas vivas. A melhor proteção é observada depois da infecção corn o vírus NDV-ChlFhbbeta, '96% das células CEC-32 são viáveis, Ao contrario, 48 h depois dá injeção, a viabilidade das células Haia tumorgêniças é reduzida para menos de 10% independentemente do NDV 5 reçombín ante usado,

Figura 4 mestra que uma grande janela terapêutica existe depois da injeção do tumor e de células de fibroblasto oom NDV-ChIFN-alfa e NDVChlFN-beta, A inibição de proliferação dos vírus oncolíticos NDV-ChIFN-alfa e NDV-ChIFN-beta é muito forte em células tumorais a, ao contrario, quase 10 nenhuma inibição e crescimento é observada depois da injeção das células de fibrohíasto primarias, especialmente em baixas MOIs corno 0,1 e MÓI 0,01.

Figura 5a demonstra as curvas de crescimento de ovo de galinha embrionários infectado com NDV com os quatro vírus NDV-GFP, NDV15 ChIFN-alfa, NDV-ChlFN-beta e a cepa apatogênioa LaSota, Embriões de galinha infectados com NDV-GhlFN-alfa ou NDV ChlFN-beta sobrevivem por mais tempo do que os embriões infectados com NDWSFP. As curvas são modificadas cíàramente na direção da curva de sobrevivência ria cepa LaSota de NOV lentpgênica,

Figura 5b a partir dos resultados das curvas de sobrevivência, o

MDT (tempo de morte médio) é calculado para cada grupo de Infecção. O MDT aumenta para o vírus NDV-ChIFN-alfa e NDV-ChiFN-beta em comparação com NDV-GFP. O MDT mais alto foi observado com a capa apatogênica LaSota.

Exemplo 1:

Geração de um NDV recombinants com um transgena derivado de ave que leva á expressão de umacítocínà de galinha

A cepa oncolítica MTH68 de NOV feí usada para obter RNA viral.

Usando RT-PCR, várias fragmentos de DNAc foram obtidos e. em um pro39 cedímenfe de clonagem de múltiplas etapas eles foram montados em um

DNAc de genoma total que foi clonado no vetor pX88T (Schnell et a/., 1994} produzindo o plasmídeo pfíMTHõS. Este vetor pode ser usado para transfec

OU çãs para resgatar o vírus reoombinante de uma linhagem çeiular expressando a T7~polimerãss.

Um çássete tránscrídanal adicional foi clonado no plasmídeo genômico de comprimento total de NDV MTH68 (pflMTH68) entre os genes codificando a proteína F e a proteína HN nu único sítio e restrição Sfíl, Os dois oligonucleotídeos de DNA Sfí normal (SQ^^dtaatteaa^^aatta^aaaaaatac^gtegaapggo^gag-S) SEQ. ID. NO: 1) e

Sfi reverso (5’-aggecgüctacccgtatWcttaagUgtcggttaattaaggcctctc-3’, SEQ.

ID. NO: 2) foram aneladu e subsequentemente ligados no sífío Sfíl de pM~ 10 TH68.

Os dois transgenes de DNA que codificam o ChIFN-alfa (NM_m205427) e o ChIFN-beta (NM„.001024836) foram amplificados por ΡΟΗ. Como moldes para a reação em cadeia da polimerase, os constructor de expressão de ChIFN-alfa e ChIFN-beta descritos em Schultz ef at, 1995 e 15 em Sick et af 1996 foram usados. Para a amplificação do transgene ChlFNalfa, o seguinte pardo inioíador: ChIFN atfa normal {5’“Ccttaatfaaga:aucatggcígtgcctgoasgeou-3^: SEQ. ID NO.3) e ChlFN-alfareverso (5^:~GGttaattaactaagtgugagtgttgaatgtg-3' SEQ. ID NO:4) foi usado e para a amplificação da sequência codificadom de ChIFN-beta os dois iníciadores

Pad ChIFN-beta normal (5^,-ccttaattaacgcaccatgactgcaaaaaataagtctccagg-3^< SEQ. ID NO:5) e ChlFN-beta-reverso (5’-ccftaattaateant.gggtgttgagangttíggatg-3‘ SEQ. ID NO:8) furam usados.

Dais transgenes chIFN taram clonados na sitia Paol do plasm! · doo pflMl HeBPac, respectivamente. O comprimento total do genome foi a25 justado para ser um múltiplo de 6 para seguir a ^í!regra dos seis^!! para o comprimento du genoma viral A identidade de sequência da inserção de ChIFNbeta fui confirmada pelo sequencíamento de nucleotides. Na inserção de ChIFN-alfa de uma troca de nucleotides G para A na posição 8$) em comparação com a sequência NM 205427 for detectada. O virus recombinante? fui 30 resgatado das células expressando 17 traasfectadas oom o plasmídeo genômíco vírais de cumprimento total contendo os genes para ChIFN-alfa (figura 1) ou ChIFN-beta (figura 2) por uma técnica de resgate de vírus padrão. Q vírus expressado o ChlFN-alfa resultante foi designada NDV^ChlFN-alfa e o ÇhIFN-beta expressando NOV foi nomeado NDV-ChlFN-beta. Os vírus foram cultivados ou em cultura tecidual ou no fluído alantoíco de ovos de galinha para produzir elevados títulos.

Exemplqj:

ChlFN-alfa e ChIFN-beta expressos de um NDV recombinante é bioíogicamente ativo.

Materiais e Métodos:

Células CEC-32 (linhagem celular de codorniz aviária) ou células 10 He Ia (linhagem celular de câncer cervical) foram sémèadâs em u ma placa de 6 poços a 1 x 10* céluias/poço. Depois de se tornar aderentes; as células foram infectadas usando um MOi de 0,01 com o vírus de controle de expressão NDV-GFP, NW-ChlFN-alfe, NDV-ChlFN-beta ou MOCK, Oepois de 64 h, os sobrenadantes foram coletados e partículas virais infecciosas foram 15 inativadas por irradiação por UV.

Para demonstrar a atividade biológica de ChIFN-alfa ou ChIFNbeta no sobrenadante das células infectadas por vírus, um bióensaío específico de interferon de gahnha foi usado (Schwarz ef a/, JICR, .2005). O ensaia estã baseado na linhagem de celuía de codorniz transfectada estável CEC20 511 carregando um gene dá luciferase controlado pelo promotor Mx de galinha responsive ao IFN. A atividade da luciferase é induzida quando as células indicadoras CEC-511 foram incubadas com ChlFN-alfa ou ChIFN-beta Para efetuar este ensaio, 15.000 células CEC-511 foram semeadas na placa de 96 poços. 24 h depois da semeadura. as células foram tratadas com o 25 sobrenadante tratado com UV das células Héla ôu CEG-32 infectadas por vírus. As células foram incubadas com 75 pL de uma diluição 1:100 do respectivos sobrenadántes. Como controles positivos. as células foram incuba· das com urna diluição 1:1000 do sobrenadante: das células 293-T transfectedas com um plasmídeo de expressão para ChlFN-alfa ou ChlFN-beta (Sick 30 et a/₅ 1096) ou somente meio. Depois do tempo de incubação de 6 h, o ensaio de luciferase Steady-GIo^ (Promega) foi efetuado, seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. Para determinar valores médios, cada ponto de dado foi medido em triplicate, g®ultadgs:

h após a injeção, os sobrenadantes das células CE.C-32 a

Hela infectadas com NDV-ChlFN-alfa e HOV<Jh!FN-bet.a têm forte atividade δ indutora de luciferase nas células CEC-511 indicando a expressão mediada pur virus de ChlFN-aifa e ChlFN-beta nas células Infectadas. Ao contrário, ο sobrenadante das células infectadas com MOCK ou infectadas com um vírus de controle expressando GFP nâo mostram atividade indutora de luciferase na linhagem celular indicadora de CEC-511. Uma diluição de 1:1090 do so10 brenadante contendo o ChlFN-altà ou ChIFN-béta récombinante também demonstra uma atividade indutora dc promotor Mx dependente de GhIFN Tabela 1: Atividade do interferon no sobrenadante das células CEC-32 e Hela infectadas com NDVs recombinantes expressando ChiFN-alfa ou ChIFNbeta. A resposta de IFN è medida nas células indicadoras que carregam um 15 gene repórter de luciferase controlado pelo promotor Mx. Qs valores medidos são dados em contagens de luciferase relativas.

I CEC-32
	NDV-GFP	NDV-ChIFN alfa	NDV-ChlFN-béta	MOCK
Valor médio	308	11991	8033	.246
Desvio padrão	86	283	423	27

	Heia
	NDV-GFP	NDV-ChIFN-alfa	NDV-ChlFN-beta	MOCK
Valor médio	237	11739	6695	290
Desvio padrão	19	1835	78	39

	ChIFN-alfa	ChIFNbeta	Mejo
i Valor médio	4849	2128	237
ί Desvio padrão	107	15	21

Células de aves, porém sem células tumorais infectadas ccm NDVs recomhínantes expressando ChlFN-alfa ou ChIFN-beta são protegidas da fee viral

Materials e Métodos:

a.) Células CEC-32 (linhagem de célula de eodorniz aviária) eu células Hela (linhagem de célula de cancer cervical) foram semeados ém uma placa de 6 poços em 1 x 10 células/poço. Depois de se tornarem ade5 rentes, as células foram infectadas com MO! de 0,01 com o virus de controle

NDV-GFP, NDV-ChlFN-alfa, NDV-ChiFN-beta ou MOCK Depois de 48 b. as células foram fixadas com solução de formaldeído 4% e marcadas com solução de Giemsa. A subsequente fotodocumentação foi efetuada com um sistema de visualização Zeiss Axtophot

3 b.) Células GEC-32 (linhagem dé célula de codomiz aviária) ou células Hela (linhagem de célula de câncer cervical) foram semeadas em uma placa de 96 poços em 15.000 células/poço. Depois de se tornarem aderentes, as células foram infestadas com MQI de 0,01 com o vírus de controle NDV-GFP, NDV-ChIFN-àlfa, NDV-ChIFN-bete ou MOCK não-mfectadãs).

Depois de 48 h da tempo de incubação, o ensaio de luciferase CeirDter-GIo⁸⁵ (Promega) foi efetuado para medir a viabilidade celular, seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. Para determinar os valores médios, cada ponto de dado foi gerado a partir dè seus valores independentes.

Resultados:

Figura 3, a.) Depois de 48 h. as células CEC-32 de aves são

Usadas pelo NDV expressando GFP (NOV GFP). An contrário, as células infectadas com o vírus que expressa ChIFN-alfe sãoparcialmanto protegidas da lise. A monocamada de CEC-32 infectada sons NDV-ChIFN-alfa è de 2.5 a 50% intacta Uma proteção ainda mais forte é observada com NDV expres25 sandc ÇhlFN-beta. Depois de 48 h». quase 90 a 160% da munoeamada no CEC-32 está intacta e protegida da Use viral. A densidade desfamonçoamadaê comparável com a monocamada das células CEC-32 infectadas MOCK.

Infecção com os três vírus na linhagem celular Hela tumorgênica mostra uma atividade oncolitica comparável entro as vírus NDV-GFP, NDV-30 CfolFlM-alfa e NDV--ChlFN~beta, Depois de 48 h, a monocamada de células Hela infectadas oom NDV-GFP, NDV-DhlFhHIfa ou NDV-ChlFNtoete é quase comptetamente destruída. A monocamada de células de células Hela in fectadas MOCK è intectá, indicado pels ccr azul das células marcadas com Gíemsa.

Figura 3. b) Em um segundo experimento, a viabilidade celular foi quantificada 48 h depois da infecção cem NDVs expressando ChIFN. As 5 células CEC-32 aviárias infectadas oom NDV-GFP apresentaram somente 3% de viabilidade celular remanescente. Nas células CEC-32 infectadas com NDV-ChlFN-alfe, 26% das células remanescentes estão intactas. 48 h depois da infecção por NDV-ChIFN-beta da linhagem celular de codomiz CEC32 94% das células são viáveis e protegidas contra a Use viral.

Ao contrário, quase qualquer diferença na destruição celular pôde ser observada depois da infecção com os três vírus NDV-GFP, NOVChlFN-alfa ou NDV-ChIFN-bela na linhagem de células Hela tumorgénioas.

Depois de 48 h, o valor para as células viáveis é para todos os três vírus entre 3% e 9%_s indicando aproximadamente urna completa destruição de célu15 las tornáreis.

Exempic.4:

Oncélise seletiva das células iumoraís.parém não das células primárias por

NOV recombínante expressando ChlFN-alfa ou ChlFN-beta.

Materiais e Métõdc-s:

5000 células de fibroblasts primário ou 3000 células Hela foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços. 16 h depois da sernea· dura, as diluições virais de NDV-GFP (NDV-GFP), NDV-ChlFN-aifa (NDVChíFN-alfa) e NDV-ChIFN-beta (NDV-ChIFN-beta) foram preparadas. Células de fibmblasto foram infectadas com as concentrações virais indicadas.

Corno controle negativo, as células de fibroblasto foram MQCK infectadas.

Depois de 1 h o ínéculo foi removido, as células foram lavadas com PBS e incubadas com 200 yt de meio de cultura de células por 4 dias no incubador de cultura celular. Depois disso, as células remanescentes foram fixadas com solução dé formaídeído 4% e marcadas com cristal violeta. A mancha 30 foi solubi&ada com ácido acético glacial 10% e a absotvâncis de cada poço foi medida á 595 nm em um leitor de ELISA.

Resultados:

<Ú*WmXÚMMM>XmMUUM*U·

Quatro dias depois' da injeção, os fibroblasto® primários infectados com os três virus NDV-GFP, NDV-ChlFN-alfa e NDV-ChlFN-beta usando MÓIs entre MQI0,051 até MOI 0,1 quase não mostram a inibição da proliferação (figura 4). Os primeiros sinais de inibição da proliferação são sç5 mente observados em MÓIs onde de 1 ou 10 partículas virais por célula foram usadas para a infecção. Ao contrário, células Hela tumorgênicas infectadas eom MGis entre MÓI 0$Ô1 e MÓ110 mostram uma inibição de proliferação muito fort. Estes resultado indica que os NI.JVs reccmbínantes têm uma janela terapêutica muito boa. especialmenfe em MQis baixos corne MOI 10 0,1 e MOl 0,001, onde quase nenhum efeito íltico é medida nas células primárias, e um efeito Inibitorio de crescimento muito forte é medido nas uêlufes Hela tumorgênicas. Nenhuma diferença no formato da curva de morte nas células turnorais e primárias é observada entre o virus de controle NDV-GFP e os virus NDVChiFN alfa e NDV QhlhN beta expressando GnlfN

Exçmpfo 5:

Tempo de sobrevivência prolongado dos embriões de galinha infectados com NDV recombinante expressando ChIFN-alfa ou ChIFN-beta

Materiais e Métodos:

Grupos de quinze ovos de galinha embrionados com 11 d de 20 idade foram infectados com NDV-ChIFN-aífa, NDV-ChIFN-beta. NDV-GFP ou a cepa NDV LaSota não-patogêmca, respectivamente. Como material infeccioso, o vírus desenvolvido em ovo na fluida alantaioa dduido oom PBS estéril foi usado. Uma dose infecciosa de 4000 PFU em um volume total de 200 pl fui usada, O inúcuío foi injetada na cavidade alanfoica. Depois da 25 injeção, os ovus furam incubado a 37^eC e 50% a 60% de umidade em um breeder de ovos. Qs ovos foram examinados á luz de vela duas vezes por dia nos pontos de tempo indicadas (figura 5) e os embriões foram averiguados para sinais de vitalidade. Eéíe ensaio permite comparar a patogenicidade de diferentes cepas NDV pela comparação do tempo de sobrevivência 30 dos embriões infectados. O método é baseado na determinação dó Tempo de Morte Média da Dose Letal Mínima (MDT/MLDj descrita em R.P. Hanson (1980).. O protocolo foi modificado naquela forma que nenhuma diluição em série du estoque viral foi inuculada nos ovos, ao invés de uma injeção de dose vira! definida eom ume concentração mais alta do que a dose letal minima, Por motivos éticos, esta modificação de ensaio reduz a quantidade de embriões usados para o teste. O MDT é determinado pela seguinte fórmula:

MDT ~ ((quattbdacfe cte mortes em X h) x (X hr) + (qtwfocbde de mortes em y h.) x fy h) efc.J/quantrdade de mortes tofôí

Sesultndqs;

A sobrevivência dos embriões de galinha infectados oom NDVChlFhhafe e NDV-ChlFN-bete é melhorado em comparação eom os emhri10 das infectados por NDV~GFP. Os ovos embnonados infectados por NDVGFP perdem os sinais de vitalidade entre 24 h e 62 h, levando a um MDT (Tempo de Morte Médio) de 50 h. Os embriões infectados com NDV-ChlFN~ beta estão sobrevivendo até 90 h com uma MDT calculada de 69 h. Um tempo de sobrevivênciá comparável com MDT de 74'h émedido nos embri15 cies infectados com NDV-ChIFN-beta. A maior parte dos embriões infectados por NDV-ChIFN-beta mwe entre 48 h e 96 h. A sensibilidade do ensaio é indicada pelo uso da cepa apatogênica ou lentogéníca LaSota. Atè mesmos os ovos embnoriados Inocuiadc-s com a cepa NDV LaSota morrem entre 62 ha 115 h com um MDT calculado de 85 h. Estes experimentos mostra que o 20 MDT do NOV MTH68 lentogânico muda para a cepa NDV lentogênica..

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Claims (37)

1, Virus da doença de Newcastle de RNA cnculítico recornbinan· te compreendendo, pelo menos um, transgene codificando uma citocína de ave, em que o vírus da doença de Newcastle de RNA oncolítico recombínatv

2, Vírus, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo pelo menos m outro transgene com atividade terapêutica quando expresso por uma célula tumoral infectada por vírus.

10

3, Vírus, de acordo com a reivindicação 2,. em que pelo menos urn outro transgene é parcialrnente alogene ou singene para o hospedeiro.

4, Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a patcgenícidade do vírus é reduzida para uma espécie de ave.

5 12, Vírus, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que a proteína de ligação é de um mamífero, por exemplo, uma proteína humana, de murine ou de origem estritamente relacionada ou quimêrica.

5, Vírus, de acordo com a reivindicação 4, em que a patogenicí-

5 te è obtido de um vírus da doença de Newcastle de RNA oncoíltíco velogênico ou mesogénico,

6, Vírus, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que a espécie de ave é selecionada de aves domésticas.

7, Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 á 8,

8, Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, o qual é um patógeno de aves, particularmente um patógeno de aves domésticas, mais particularmente um patógeno de galinha,

9 Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, 25 obtido da copa mesogêníca ΜΪΗ68.

10. Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que pelo menos um outro transgene codifica urna proteína de ligação que tern uma atividade terapêutica quando expressa pela célula tumoral infectada por vírus.

30

11. Viras, de acordo com a reivindicação 10, em que a proteína de ligação é selecionada dc seguinte grupo consistindo de um lígante natural, um lígante geneticamente modificado, um domínio solúvel recombinante de Um receptor natural e uma versão modificada sua, urn iigante de peptideo, um Iigante de polipeptidec, uma molécula de anticorpo a fragmentos e derivados seus, e uma molécula tipo anticorpo eomo uma proteína de repetição de anquírina e fragmentos e derivados seus.

12. em que a proteína de ligação è uma proteína monomènca, dimèríca, tail) mérica, tetramérica ou multimérica,

13, em que a proteína de ligação é mcnuespeclftca, hiespecíficã ou multíespacífica.

13, Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a

14. Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a

15 reivindicação 28 ou 29.

15 medida pela viabilidade celular depois de 48 n após a infecção não è reduzida em mais de 50% em comparação as vírus do qual o virus recornbinante é obtido e, mais preferivelmente, é essenciaimente não reduzida em relação ao virus do qual o vírus recornbinante è obtido.

15 moral infectada por vírus.

15. Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15 14, em que a proteína de ligação é uma proteína de fusão compreendendo, pelo menos urn, domínio de ligação e pelo menos um dominie heterólogo,

15 dado do vírus é reduzida para uma espécie de ave em relação ao virus do qual o vírus recombinante é obtido,

16, Vírus, de acordo com a reivindicação 15, em que a proteins de ligação é uma proteína de fusão compreendendo uma toxina como uma RN Ase humana (exotoxina de pseudomonas, toxina diftérica), ou uma prote-

17. Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a

18. Virus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que pelo menos um outro transgene codifica uma enzima conversora de profármaco que tem atividade terapêutica quando expresse pela célula tu-

19. Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a S, em que pelo menos um outro transgené codifica uma protease que tem atividade terapêutica quando expresso pela célula tumoral infectada por vírus.

20 uma das reivindicações 1 a 25. um genoma viral como definido na reivindicação 27 e/ou uma molécula de DNA como definida na reivindicação 28 ou

20. Virus, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre20 cedentes, em que pelo menos um transgene codificando uma citocina de ave é selecionada dos interferons de galinha.

20 ína de fusão compreendendo uma enzima tipo beta-glícuronidase, betagalactosidase, beta-glicosidase, carbexipeptidase, beta-íactamase ou uma proteína da fusão compreendendo uma proteína imune estímuíatória cem atividade de citociná tipo 11..-2, IL.-12, TNF-alfa, IFN-beta ou GM-CSF.

20 em que a espécie de ave é galinha,

21. em que a redução de patcgenicídade é uma extensão da tempo de sobrevivência dos embriões de galinha infectados com virus em ovos embrio5 nades com 11 dias de idade medido pela determinação do tempo de morte médio (MDT), por meio do que o MDT ê prolongado em pelo menos cerna de 15 h até cerca de 20 h, mais preferivelmente pelo menos cerca de 20 h até cerca de 30 h, e mais preferivelmente mais de 30 h em comparação ao virus do qual o vírus recombinante é obtido.

10

21, em que a redução de pãtogenieidade é ã capacidade do vírus de reduzir a lise de células de pássaros em cerca de 48 h depois da infecção com MOI 0,01 medido pelo aumento da viabilidade celular, por meio do que a viabilidade celular é aumentada até pelo menos cerca de 25% até cerca de 50% 30 das células sobreviventes, mais preferívelmenfe até pelo menos cerca de 50% até cerca de 75% de células sobreviventes e mais preferivelmente até pelo menos çérça de 75% até 100% das células sobreviventés em rélação ao vírus do qual o vírus recombinante é obtenível

21. Vírus, de acordo com a rmvindicação 20, em que pelo menos um transgene codificando uma citocina de ave é selecionada dos interferon de galinha tipo I.

25

22. Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a

23, em que a atividade oncoíítíoa do vírus para as células iumorais humanas

23, em que a atividade onoolitica do vírus para as células fumareis humanas é essenciaimente nao-reduzida.

23, Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a

24. Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

25 das reivindicações 1 a 25.

25. Vírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

25 16, em que a proteína de ligação é selecionada do grupo consistindo de proteínas de bloqueio dos receptores do fator de crescimento ativo autônomo (por exemplo, EGFR, Met), ligantes competitivos para fatores de croscimento (antagonistas), proteínas de bloqueie para a Rb fesforílação, proteínas de bloqueio para a transcrição dependente de E2F/ estabilizadores para p53;

26 Nucleccapsideo de um vírus de RNHA oncolitioo reccmbi20 nante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

27. Genema de um vírus de RNA encolítico recornbinante somo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25.

28. Molécula do DNA codificando o genoma e/ou antigenorna de um vírus de RNA oncolílico recornbinante, corno definido em qualquer uma

29, compreendendo, pela menas um, transgene codificando uma enzima conversora de profármaca, e (íí) um profármaca adequado para o tratamento da doença proli25 ferativa juntamente com o vírus, cuja profármaca pude ser convertido em um composto farmaceuticarnente ativo pela enzima conversara de profármaca de (i).

29. Molécula de DNA, de acordo com a reivindicação 27, operativamente ligado a uma sequência de controle de transcrição.

30 da reivindicação 27 e/ou uma molécula ce DNA como definida na reivindicação 28 ou 29.

30. Célula compreendendo um vírus oncoiítico recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 ,a 25, um genoma viral

30 ligantes ãntagõhístlcos para proteínas antíapoptõticas (por exemplo, Bcl-2)' ligantes anlagonlstícos para cíclicas; ligantes antagonl slices para efetores Rés (por exemplo, GEFs); ligantes antagonístieds para proteínas índutoras de hipéxía (por exemplo, HlFia); inibidores dos fatores de transcrição que interferem bom a dímerízação, ligação de DNA e/ou ligação do cèfator (por exemplo, MycTMax); indutores de diferenciação; inibidores de sinalização/translocação smad: inibidores de interações de adesão celular (caderl5 nas. mtegrinas, por exemplo, οδβ1_: ανβ3): inibidores das enzimas que degradam a matriz extracelular (por exemplo, MMPs); ligantes antagonisticos para os ligantes prú-angiogênicos (por exemplo, VEGF-R solúvel): ligantes antegorwtiobs aos receptores pro-ãngíogêniççs; inibidores de formação do comptexó estruturai (por exemplo, KSR/Ras); inibidores de iniciação de tra10. dução (por exemplo, elF4E, ElF2a); e inibidores das quinases mitõticas (por exemplo, Pik -1).

31. Composição farmacêutica, compreendendo um vírus oncoli- tico recambmante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, um genoma viral como definido na reivindicação 27 e/ou uma molécula de DNA como definido na reivindicação 28 ou 29, como um ingrediente ativo opcionalmente junto com veiculo, díluentes e/ou adjuvantes farmacêutica 5 mente aceitáveis.

32. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 31, compreendendo ainda um protármaco o qual pode ser convertido em um composto terapeuticamente ativo pela enzima conversora de profàmiaco codificada pelo menos por urn transgene adicional

10

33. Método para o tratamento de uma doença proliferative, compreendendo a administração em uma quantidade farmaceutícarr?ente eficaz a um indivíduo necessitado disso de um virus oncolítico recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, um genoma viral como definida na reivindicação 27 e/ou ama molécula de DNA como definido na

34. Método, da acordo com a reivindicação 33, compreendendo a administração em uma quantidade farmaceuticarnente eficaz a um indivíduo necessitaria disso de (í) um vírus oncoiltico recombinante como definido ern qualquer

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 34, em que α mdivfduo é um paciente humana.

30

36 Virus de RNA oncolitico recombinante para aves domésticas, compreendendo um ácido nucléico compreendendo, pelo menos um, transgene que codifica uma citacina.

& * *

37, Vírus, de acorde com a reMrWcaçSo 36, o qual é atenuado para galinha.