ES2291029T3 - Clones infecciosos del virus de la enfermedad de newcastle, vacunas y analisis diagnosticos. - Google Patents
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Abstract
Un cDNA de paramixovirus aviar que comprende al menos el extremo 5''-terminal del genoma del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) que corresponde al extremo 5''-terminal de NDV como el mostrado en la Figura 6, que permite generar una copia infecciosa de paramixovirus aviar
Description
Clones infecciosos del virus de la enfermedad de
Newcastle, vacunas y análisis diagnósticos.
El invento se refiere a infecciones de aves de
corral por el virus de la enfermedad de Newcastle.
El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV; del
inglés, Newcastle disease virus) es uno de los
patógenos aviares más diversos y mortales. La casi simultánea
aparición de la enfermedad de Newcastle en diversas áreas
geográficas diferentes como una aparente enfermedad nueva y la gran
variación en el tipo y la gravedad de la enfermedad han causado
ciertos problemas con la nomenclatura.
La enfermedad ha sido denominada seudopeste de
las aves de corral, seudoplaga de las aves de corral, peste aviar,
moquillo aviar y neumoencefalitis aviar. La importancia de la
enfermedad se debe principalmente al desarrollo de la industria de
aves de corral durante el siglo XX hasta una industria internacional
muy eficaz que depende de un comercio intensivo entre países.
Se supone generalmente que los primeros brotes
de la enfermedad de Newcastle surgieron en 1926 en Java, Indonedia,
y en Newcastle-upon-Tyne, Inglaterra
(Kraneveld, 1926; Doyle 1927). El nombre "enfermedad de
Newcastle" fue acuñado por Doyle como un nombre temporal para
evitar un nombre descriptivo que pudiera llevar a confusión con
otras enfermedades. Más adelante, quedó claro que virus
indistinguibles del DDV causaban otras enfermedades menos graves.
En EE.UU., una enfermedad respiratoria relativamente benigna fue
denominada neumoencefalitis aviar, y se mostró que era causada por
el NDV (Beach, 1944). En pocos años, se realizaron por todo el mundo
numerosos aislamientos de NDV que causaban una enfermedad muy
benigna en las gallinas o no causaban enfermedad alguna en
ellas.
Se han implicado los métodos siguientes en la
difusión de la enfermedad: 1) movimiento de aves vivas, aves
silvestres, aves de caza, palomas de carreras y aves de corral
comerciales; 2) movimiento de personas y equipos; 3) movimientos de
productos avícolas; 4) difusión aérea; 5) pienso avícola
contaminado; 6) agua contaminada; y 7) vacunas incompletamente
inactivadas o heterogéneas. De acuerdo con la Oficina Internacional
de Epizootias (OIE), la enfermedad de Newcastle es una enfermedad
de aves de corral causada por un paramixovirus aviar de serotipo 1
(APMV-1; del inglés, avian
paramyxovirus 1) que tiene un índice de
patogenicidad intracerebral (ICPI; del inglés,
intracerebral pathogenicity index) de
0,7 o más en polluelos de pocos días de edad. El virus virulento
puede ser también confirmado por la presencia de múltiples
aminoácidos básicos en el extremo C de la proteína F2 y de F
(fenilalanina) en el resto 117 del extremo N de la proteína F1. Un
fallo a la hora de demostrar esta secuencia de aminoácidos exigiría
una caracterización mediante ensayos de ICPI. La frase "aves de
corral" se refiere a aves domésticas, pavos, gallinas de Guinea,
patos, gansos, codornices, palomas, faisanes, perdices y ratites
que son criadas o mantenidas en cautividad para la cría, la
producción de carne o huevos para el consumo, o la reposición de
existencias para la caza.
De acuerdo con Alexander (1988), han tenido
lugar tres zoonosis pandémicas de la enfermedad de Newcastle desde
el primer reconocimiento de la enfermedad. El primero representaba
los brotes iniciales de la enfermedad y parecía haber surgido en el
sudeste asiático. Ciertos brotes aislados, tal como el de Inglaterra
en 1926, fueron introducciones casuales previas a la corriente
principal que se movía lentamente hacia Europa a través de Asia.
Parece que una segunda zoonosis pandémica
comenzó en Oriente Medio a finales de los años 1960 y alcanzó a la
mayoría de los países en 1973. La difusión más rápida de la segunda
zoonosis pandémica fue probablemente causada por la mayor
revolución de la industria avícola, con un considerable comercio
internacional.
Una tercera zoonosis pandémica afectó
esencialmente a aves domésticas tales como palomas y tórtolas
(Vindevogel y Duchatel, 1988). La enfermedad surgió aparentemente
en Oriente Medio a finales de los años 1970. En 1981 había
alcanzado Europa y luego se extendió rápidamente a todas las partes
del mundo, en gran medida como resultado del contacto entre aves en
competiciones y ferias y al comercio internacional con dichas
aves.
Hoy en día, la enfermedad de Newcastle está aún
muy difundida en muchos países de Asia, África, América y Europa.
Sólo los países de Oceanía parecen estar relativamente libres de la
enfermedad (Spradbrow, 1988).
El NDV pertenece al orden
Mononegavirales, familia Paramyxoviridae, subfamilia
Paramyxovirinae, género Rubulavirus. Aparte del NDV,
generalmente llamado paramixovirus aviar de tipo 1, se pueden
distinguir otros ocho serotipos, denominados paramixovirus aviares
de tipos 2 a 8, basándose en su relación antigénica en ensayos de
inhibición de hemaglutinación y ensayos de neutralización sérica
(Alexander, 1993).
A pesar de la consistencia del agrupamiento
serológico, hay ciertas relaciones cruzadas entre virus de los
diferentes serotipos.
El genoma del NDV es una molécula de RNA de
cadena sencilla y polaridad negativa, complementaria de los RNAs
mensajeros que codifican las proteínas virales. El RNA genómico
tiene un tamaño de aproximadamente 15.200 nucleótidos (nt) y
codifica los productos génicos siguientes (enumerados del extremo 3'
al extremo 5' del RNA genómico): proteína de la nucleocápsida (NP;
del inglés, nucleocapsid protein), fosfoproteína (P;
del inglés, phosphoprotein), proteína matricial (M),
proteína de fusión (F), hemaglutinina-neuraminidasa
(HN) y proteína polimerasa grande (L; del inglés, large)
(Chambers et al., 1986).
El RNA está complejado con las proteínas NP, P y
L para formar una partícula de ribonucleocápsida (RNP; del inglés,
ribonucleocapsid protein) que está rodeada por
una envoltura que está interiormente revestida por la proteína M.
La envoltura contiene las proteínas F y HN, que están implicadas en
la fijación y penetración de la célula
huésped.
huésped.
La replicación del NDV es similar a la
estrategia usada por otros paramixovirinae. La fase inicial
es la fijación del virus a los receptores de la célula huésped,
mediada por la proteína HN. La fusión de la envoltura vírica con la
membrana de la célula huésped depende de la acción tanto de la
proteína HN como de la F y da lugar a la liberación de la RNP en el
citoplasma, donde tiene lugar la replicación del virus.
La RNA polimerasa vírica dependiente de RNA (que
es parte de la RNP) produce transcritos complementarios que actúan
como mRNAs y son usados por la maquinaria de traducción de la célula
para la síntesis de proteínas víricas. A causa de la acumulación de
proteína NP, el complejo de RNA polimerasa cambia de transcripción a
replicación para dar lugar a la síntesis de moléculas de RNA
genómico y antigenómico de longitud completa.
Las RNPs recién formadas son encapsidadas en la
membrana celular por la acción de la proteína M y las proteínas F y
HN que se han acumulado en la membrana plasmática celular. Las
partículas virales recién formadas se liberan de la célula
infectada mediante un mecanismo de gemación. Para una información
más detallada acerca de la replicación del NDV, véase Peeples
(1988). Para una revisión reciente de la biología molecular de los
Paramyxovirinae, véase Lamb y Kolakofsky (1996).
Aparte de las aves de corral domésticas
comerciales (es decir, gallinas, pavos, faisanes, gallinas de
Guinea, patos, gansos y palomas), una gran variedad de aves
cautivas, semidomésticas y libres, incluyendo aves acuáticas
migratorias, son sensibles al NDV y pueden ser fuentes de infección
primaria (Kaleta y Baldauf, 1988).
La patogenicidad de las cepas de NDV difiere
mucho con el huésped. Parece que las especies más resistentes son
las aves acuáticas, siendo las más sensibles las aves gregarias que
forman reuniones temporales o permanentes. Las gallinas son muy
sensibles, pero los patos y los gansos pueden resultar infectados y
no mostrar signos clínicos o mostrar unos pocos, incluso con cepas
que resultan letales para las gallinas.
La enfermedad de Newcastle es complicada ya que
diferentes productos de aislamiento y cepas del virus pueden
provocar una enorme variación en la gravedad de la enfermedad. Beard
y Hanson (1984) agruparon cepas y productos de aislamiento de NDV
en diferentes patotipos que están relacionados con los síntomas
morbosos que pueden verse en gallinas totalmente sensibles: 1) NDV
velogénico viscerotrópico, que produce infecciones letales agudas
en que destacan las lesiones hemorrágicas en el intestino; y NDV
velogénico neurotrópico, que produce una elevada mortalidad
precedida de síntomas respiratorios y neurológicos pero sin lesiones
intestinales; 2) NDV mesogénico, que produce una baja mortalidad,
enfermedad respiratoria aguda y síntomas nerviosos en ciertas aves;
3) NDV lentogénico, que produce infecciones respiratorias benignas o
no evidentes, e incluso NDV entérico asintomático, virus no
virulento que parece replicarse principalmente en el tracto
intestinal. Se ha comunicado cierto solapamiento entre los síntomas
asociados con los diferentes grupos.
El virus entra en el organismo a través de los
tractos respiratorio e intestinal o a través del ojo. En la
tráquea, el virus se propaga por acción ciliar y por propagación
célula a célula. Después de la multiplicación inicial en el sitio
de introducción, el virus es llevado al bazo, el hígado, el riñón y
los pulmones durante los episodios de viremia. Los virus de ciertas
cepas alcanzan órganos vitales tales como el hígado y el riñón muy
rápidamente, por lo que las aves pueden morir antes de que los
síntomas morbosos sean evidentes.
La mayoría de los virus alcanzan el sistema
nervioso central a través de la sangre antes de que existan
cantidades significativas de anticuerpo. Un estado portador
asintomático y prolongado, que supuestamente se presenta en la
familia Psittacidae, constituye una amenaza potencial para la
industria avícola. También puede existir un estado portador de
larga duración de virus tanto lentogénico como velogénicos en
gallinas (Heuschele y Easterday, 1970).
Durante la replicación del NDV, es necesario que
la glicoproteína Fo precursora sea escindida en F1 y F2 para que la
progenie vírica sea infecciosa (Rott y Klenk, 1988). Esta escisión
postraduccional es mediada por proteasas de la célula huésped. Si
no tiene lugar la escisión, se producen partículas víricas no
infecciosas y no puede continuar la replicación vírica. La proteína
Fo de los virus virulentos puede ser escindida por una gran variedad
de proteasas, pero las proteínas Fo de los virus de baja virulencia
tienen su sensibilidad restringida, y estos virus sólo pueden
crecer in vivo en ciertos tipos de células huésped y, en
general, no pueden ser cultivados in vitro.
Los virus lentogénicos sólo se replican en zonas
con enzimas de tipo tripsina, tales como los tractos respiratorio e
intestinal, mientras que los virus virulentos se pueden replicar en
una diversidad de tejidos y órganos para dar lugar a una infección
sistémica fatal.
La secuenciación de aminoácidos del precursor Fo
ha mostrado que los virus de baja virulencia tienen una sola
arginina (R) que une las cadenas F2 y F1, mientras que las cepas
virulentas poseen aminoácidos básicos adicionales que forman dos
pares tales como
K/R-X-K/R-R-F
en el sitio de escisión. Además, la cadena F2 de las cepas
virulentas comienza generalmente con un resto de fenilalanina
mientras que la de las cepas no virulentas comienza generalmente con
una leucina.
Para unas pocas cepas de NDV, la proteína HN es
también producida como un precursor que requiere una escisión para
ser biológicamente activa (Garten et al., 1980; Millar et
al., 1988).
Además de la capacidad de escisión de las
proteínas F y HN, otros factores víricos pueden contribuir a la
patogenicidad. Madansky y Bratt (1978, 1981a, 1981b) han mostrado
que alteraciones en la transcripción y la traducción podrían
modular el crecimiento y la propagación célula a célula del virus
y/o la citopatogenicidad.
La respuesta inmune inicial a la infección por
NDV es mediada por células y puede ser detectable en tan sólo
2-3 días después de la infección con vacunas de
cepas vivas. Esto explica probablemente la protección precoz frente
a una estimulación que se ha registrado en aves vacunadas, antes de
que se vea una respuesta mensurable de anticuerpos (Gough y
Alexander, 1973).
Aproximadamente 1 semana después de la
infección, los anticuerpos circulantes pueden proteger al huésped de
una reinfección. En la fase precoz está implicada la IgM, seguida
de IgG. Los títulos y la protección alcanzan el máximo después de
aproximadamente 3 semanas y declinan gradualmente si no hay una
inmunización de refuerzo. Esto significa que son necesarias
revacunaciones para las aves más viejas.
Sólo las vacunas vivas administradas por vía
respiratoria estimulan los anticuerpos en todas las superficies
mucosas así como en el suero. La vacuna inactivada, incluso cuando
se aplica por vía intramuscular, no provoca resistencia local en el
tracto respiratorio a pesar de las altas concentraciones de
anticuerpo en suero.
Esto recalca la importancia de las vacunas vivas
capaces de presentar el antígeno vírico al tracto respiratorio
superior para provocar una inmunidad tanto local como sistémica. Las
gotitas pequeñas penetran en el tracto respiratorio inferior,
provocando por ello una respuesta inmune principalmente humoral,
mientras que las gotitas gruesas estimulan la inmunidad local en el
tracto respiratorio superior.
Por lo tanto, los aerosoles con una gran
variedad de tamaños de gotita generan las mejores inmunidades
locales y humorales globales.
Sin embargo, ha de advertirse que, a pesar de la
vacunación intensiva con las vacunas actuales que crean niveles
elevados de títulos de anticuerpo, el virus puede ser aún recuperado
de superficies mucosas.
La identificación de la enfermedad de Newcastle
en EE.UU. condujo al uso de vacunas inactivadas (Hofstad, 1953). La
observación de que algunos de los virus enzoóticos sólo producía una
enfermedad benigna dio primero lugar al desarrollo de la vacuna
viva mesogénica Roakin (Beaudette et al., 1949) y
posteriormente al desarrollo de las cepas benignas Hitchner B1
(Hitchner y Johnson, 1948) y LaSota (Goldhaft, 1980), que son ahora
las vacunas vivas más utilizadas.
Las vacunas vivas de NDV pueden ser divididas en
dos grupos: lentogénicas y mesogénicas. Las cepas mesogénicas son
solamente adecuadas para la vacunación secundaria de aves a causa de
su mayor virulencia. La respuesta inmune aumenta conforme aumenta
la patogenicidad de la vacuna viva. Por lo tanto, para obtener el
nivel deseado de protección sin una reacción importante, se
utilizan actualmente programas de vacunación que implican el uso
sucesivo de vacunas progresivamente más virulentas, o de vacunas
vivas seguidas de vacunas inactivadas.
Una de las ventajas principales de las vacunas
vivas es que pueden ser administradas mediante técnicas baratas de
aplicación masiva. Un método común de aplicación es a través del
agua potable. Sin embargo, la aplicación por el agua potable debe
ser cuidadosamente controlada ya que el virus puede resultar
inactivado por calor y luz excesivos y por impurezas virucidas
presentes en el agua.
La aplicación masiva de vacunas vivas mediante
composiciones pulverizables y aerosoles es también muy popular a
causa de la facilidad con que pueden vacunarse grandes cantidades de
aves en poco tiempo. Es importante conseguir el correcto tamaño de
partícula controlando las condiciones bajo las cuales se generan las
partículas.
Las vacunas vivas actualmente utilizadas
presentan varias desventajas. La vacuna puede aún causar síntomas
morbosos dependiendo de las condiciones ambientales y de la
presencia de infecciones que compliquen la situación. Por lo tanto,
es importante usar un virus sumamente benigno para la vacunación
primaria, y, como resultado, se necesitan normalmente múltiples
vacunaciones. Además, anticuerpos de origen materno pueden evitar
una vacunación primaria exitosa con vacunas vivas lentogénicas.
Las vacunas inactivadas se producen normalmente
a partir de fluido alantoico infeccioso que es tratado con formol o
beta-propiolactona para matar el virus y es mezclado
con un agente adyuvante adecuado. Las vacunas inactivadas se
administran mediante inyección, sea intramuscular o sea
subcutáneamente. Las vacunas inactivadas son caras de producir y de
aplicar.
Sin embargo, las vacunas inactivadas de emulsión
oleosa no se ven tan negativamente afectadas por la inmunidad
materna como las vacunas vivas y pueden ser utilizadas en polluelos
de pocos días de edad. Las ventajas de las vacunas inactivadas son
el bajo nivel de reacciones negativas en las aves vacunadas, el alto
nivel de anticuerpos protectores y la larga duración de la
protección. Ninguna de las vacunas anteriores puede ser
serológicamente diferenciada del NDV de tipo silvestre.
El desarrollo de vacunas víricas recombinantes
ha sido interesante para la industria avícola durante varios años.
El concepto es insertar genes de epítopos inmunizantes críticos de
un agente morboso de interés en un gen no esencial de un vector
vírico. De este modo, la vacunación con el virus recombinante da
lugar a una inmunización tanto contra el vector vírico como contra
el agente morboso de interés.
Se han evaluado diversos tipos de virus en
cuanto a posibles vacunas víricas vivas para aves de corral. Dos
virus aviares que han recibido mucha atención son el virus de la
viruela aviar (FPV; del inglés, fowlpox virus)
y el herpesvirus de los pavos (HVT; del inglés,
herpesvirus of turkeys). El virus de la viruela
aviar es un virus DNA que tiene un genoma grande y que, en
consecuencia, es considerado por tener un espacio amplio para
llevar genes extraños.
Cuando está atenuado, el FPV no causa enfermedad
clínica alguna y es comúnmente usado en gallinas como una vacuna.
El HVT es también una virus DNA y es clasificado como serotipo III
de la familia del virus de la enfermedad de Marek (MDV; del inglés,
Marek's disease virus). El HVT no es patógeno
para las gallinas pero ejerce protección cruzada frente al MDV y es
comúnmente usado para vacunar gallinas contra la enfermedad de
Marek.
Se ha mostrado que se puede provocar protección
contra la enfermedad de Newcastle al utilizar vacunas de HVT o FPV
recombinantes (Morgan et al., 1992, 1993; Heckert et
al., 1996; Boursnell et al., 1990; Taylor et al.,
1990).
Sin embargo, el inicio de la protección contra
la enfermedad de Newcastle después de la vacunación con dichas
vacunas recombinantes que expresan la proteína F de NDV, o tanto la
proteína F como la HN, resultó gravemente retrasado en comparación
con el inicio después de la vacunación con una vacuna convencional
de NDV vivos o inactivados, posiblemente porque las vacunas
recombinantes no proporcionan un espectro inmunológico
suficientemente amplio de epítopos de NDV antigénicamente
relevantes, distintos de los hallados en la proteína de NDV que es
expresada por la vacuna recombinante, o aquellos no son
apropiadamente presentados al sistema inmune.
Además, no se provocó eficazmente una protección
local (mucosa, respiratoria o entérica) en las aves vacunadas con
las vacunas recombinantes. Esto es un inconveniente grave ya que las
vacunas utilizadas para la vacunación primaria contra enfermedades
respiratorias deben provocar una inmunidad local para evitar la
infección y propagación de los virus virulentos que infectan a las
gallinas criadas bajo condiciones de campo.
Los anticuerpos contra NDV que son capaces de
proteger al huésped pueden ser medidos en ensayos de neutralización
vírica. Sin embargo, puesto que parece que la respuesta de
neutralización va paralela a la respuesta de inhibición de la
hemaglutinación (HI; del inglés, haemagglutination
inhibition), se utiliza frecuentemente el segundo ensayo
para evaluar la respuesta protectora, especialmente después de la
vacunación.
Los anticuerpos tanto contra la proteína F como
contra la HN pueden neutralizar los NDV. Sin embargo, en ensayos
in vivo e in vitro, parece que los anticuerpos contra
la proteína F provocan una mayor neutralización que los dirigidos
contra HN (Meulemans et al., 1986).
La presencia de anticuerpos específicos hacia
NDV en el suero de un ave proporciona poca información sobre la
cepa infectiva de NDV y, por lo tanto, tiene un valor diagnóstico
limitado.
La omnipresencia de cepas de NDV lentogénicas en
aves en la mayoría de los países y el uso casi universal de vacunas
vivas que no pueden ser distinguidas, al menos no serológicamente,
del NDV de tipo silvestre significa que la mera demostración de una
infección es una causa raras veces adecuada para que se impongan
medidas de control. Puesto que la enfermedad de campo puede ser una
medida poco fiable de la verdadera virulencia del virus, es
necesario caracterizar más el virus que se encuentra.
En la actualidad, el único método para
diagnosticar la enfermedad de Newcastle que permite la
caracterización de la cepa infectiva es el aislamiento del virus
seguido del análisis de la patogenicidad. En la actualidad, se
utilizan tres ensayos in vivo con este fin: 1) tiempo medio
de muerte (MDT; del inglés, mean death time)
en los huevos; 2) índice de patogenicidad intracerebral (ICPI) en
gallinas de un día de edad; y 3) índice de patogenicidad
intravenosa (IVPI; del inglés, intravenous
pathogenicity index) en aves de 6 semanas de edad.
Estos ensayos adolecen de diversos
inconvenientes, tales como la disponibilidad de animales, la escasa
reproducibilidad, y la duración relativamente grande de los
ensayos. Finalmente, aunque no por ello menos importante, estos
ensayos no permiten una identificación serológica sencilla de aves
de corral vacunadas con una vacuna o infectadas con una cepa de
tipo silvestre.
Como una alternativa a los ensayos in
vivo, se ha utilizado exitosamente la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain
reaction) para distinguir entre productos de aislamiento
virulentos y no virulentos (Staüber et al., 1995; Kant et
al., 1997); sin embargo, de nuevo no es posible la
diferenciación serológica.
La cría de aves de corral y el comercio de sus
productos están ahora organizados sobre una base internacional,
frecuentemente bajo la dirección de compañías multinacionales. La
amenaza de la enfermedad de Newcastle ha originado una gran
restricción de dicho comercio.
Sólo se abordará el control exitoso de la
enfermedad de Newcastle cuando todos los países comuniquen los
brotes. Sin embargo, los acuerdos internacionales no son sencillos
a causa de la enorme variación en el grado de vigilancia de
enfermedades en los diferentes países. Algunos países no vacunan y
no quieren ninguna forma de NDV introducido en las aves domésticas
de corral porque las aves de corral vacunadas no pueden ser
distinguidas de las infectadas con NDV de tipo silvestre.
Otros sólo permiten el uso de vacunas vivas
específicas y consideran las demás vacunas como inaceptablemente
virulentas. No obstante, otros países tienen la presencia continuada
de virus muy virulentos circulantes, lo que no es reconocido como
tal porque la enfermedad patente está enmascarada por la
vacunación.
En muchos países, existe una legislación para
controlar los brotes de enfermedad de Newcastle que se puedan
producir. Las medidas de control nacionales están dirigidas a la
prevención de la introducción y la propagación. La mayoría de los
países tienen restricciones sobre el comercio de productos avícolas,
huevos y aves de corral vivas. La mayoría de los países han
establecido procedimientos de cuarentena para la importación,
especialmente para aves de la familia Psittacidae.
Algunos países han adoptado políticas de
erradicación con sacrificio obligatorio de aves infectadas, las
materias con que han entrado en contacto, y sus productos. Otros
exigen la vacunación profiláctica de aves incluso en ausencia de
brotes, mientras que algunos tienen una política de vacunación
anular alrededor de los brotes para establecer una zona de
regulación.
Es evidente que existe la necesidad de mejores
vacunas y mejores métodos diagnósticos que se puedan utilizar para
controlar la enfermedad de Newcastle. Debido tanto a las grandes
diferencias en la dosis que reciben las aves individuales durante
la aplicación masiva de vacunas vivas como la variación en los
niveles de inmunidad materna en las gallinas jóvenes, son
inevitables las reacciones posteriores a la vacunación con vacunas
vivas. Ésta es una de las principales preocupaciones de los
granjeros en los países donde la vacunación es obligatoria.
Además, muchas vacunas son mezclas de
subpoblaciones. Cuando se clonan, estas subpoblaciones pueden
diferir significativamente entre sí en cuanto a inmunogenicidad y
patogenicidad (Hanson, 1988).
Sin embargo, el mayor inconveniente de las
vacunas inactivadas y vacunas vivas actualmente utilizadas es el
hecho de que, con las técnicas de exploración actualmente usadas,
tales como los ensayos de inhibición de la hemaglutinación y de
neutralización vírica, los animales vacunados no pueden ser
distinguidos de los animales infectados.
El virus de campo virulento puede aún propagarse
en conjuntos animales vacunados ya que los síntomas de la
enfermedad están enmascarados por la vacunación. Puesto que el
aislamiento del virus y la caracterización de la virulencia
mediante técnicas in vivo no son factibles a gran escala,
existe la gran necesidad de nuevas y eficaces vacunas vivas
atenuadas que puedan ser serológicamente discriminadas de los virus
de campo.
Dichas vacunas, llamadas vacunas marcadoras de
NDV (y los sistemas y métodos diagnósticos que les acompañan), que
deberían proporcionar el más completo espectro inmunológico posible
de epítopos de NDV antigénicamente relevantes y que, no obstante,
deberían ser serológicamente distintas del NDV de tipo silvestre, no
están aún disponibles.
El invento proporciona un método para modificar
un genoma de paramixovirus aviar mediante modificación genética y
proporciona un paramixovirus aviar genéticamente modificado y una
vacuna marcadora de paramixovirus aviar.
La aparición de las técnicas modernas de
biología molecular ha permitido la modificación genética de muchos
virus RNA, incluyendo virus RNA de cadena negativa. A esta técnica
se hace a menudo referencia como "genética inversa". Primero
se obtiene un cDNA copia (longitud completa) del RNA vírico, después
de lo cual se transcribe este DNA en células sensibles para
producir un RNA infeccioso que puede replicarse de nuevo para
producir partículas víricas infecciosas.
En general, mediante la modificación previa del
cDNA con técnicas de biología molecular estándares, es posible
obtener un virus RNA genéticamente modificado. Sin embargo, esto
nunca se ha materializado para NDV ni para otros paramixovirus
aviares, y ni siquiera ha sido posible aún generar fragmentos
minigenómicos ni plásmidos de fragmentos genómicos de paramixovirus
aviar para estudiar los procesos replicativos del paramixovirus
aviar, para crear con ello un conocimiento de cómo construir una
copia vírica infectiva.
Sorprendentemente, aunque en esta descripción se
ha establecido ahora completamente que el genoma del paramixovirus
aviar es el más pequeño de todos los genomas paramixovirales
secuenciados hasta la fecha, especialmente la secuencia del extremo
5'-terminal del genoma de NDV es mucho más larga que
la que previamente había sido establecida y se esperaba por
comparación con la de otros Paramyxoviridae. El invento
proporciona, ahora por vez primera, una secuencia completa del
genoma de un paramixovirus aviar y proporciona el cDNA de longitud
completa o longitud minigenómica de dicho virus.
El presente invento proporciona un cDNA de
paramixovirus aviar que comprende al menos el extremo
5'-terminal del genoma de NDV que corresponde al
extremo 5'-terminal de NDV como el mostrado en la
Figura 6, que permite generar una copia infecciosa de paramixovirus
aviar, comprendiendo preferiblemente dicho cDNA un cDNA de longitud
completa. Sin embargo, el invento también proporciona un cDNA que
comprende al menos el extremo 5'-terminal del
genoma de NDV que corresponde al extremo 5'-terminal
de NDV como el mostrado en la Figura 6, que permite generar un
minigenoma replicante de paramixovirus aviar. Dichos minigenomas
pueden ser ventajosamente utilizados para transcribir RNA y/o
expresar proteína a partir de secuencias de ácido nucleico
modificadas. El invento proporciona un cDNA, acorde con el invento,
al menos parcialmente derivado del virus de la enfermedad de
Newcastle, en que, por ejemplo, dicho virus de la enfermedad de
Newcastle es un virus lentogénico, preferiblemente derivado de una
cepa de vacuna, tal como la cepa LaSota ATCC
VR-699.
El invento proporciona además un cDNA de acuerdo
con el invento, provisto adicionalmente de una modificación, tal
como una deleción, inserción, mutación, reversión u otra
modificación, en un ácido nucleico. Por ejemplo, se proporciona un
cDNA en que dicha modificación comprende un ácido nucleico que
codifica un sitio de escisión por proteasas modificado; por
ejemplo, en que dicho sitio de escisión es un sitio de escisión por
proteasas de la proteína de fusión (F).
En aún otra realización, el invento proporciona
un cDNA de acuerdo con el invento en que dicha modificación
comprende un ácido nucleico que codifica una proteína vírica
híbrida, tal como una proteína híbrida de
hemaglutinina-neuraminidasa como la descrita en la
parte experimental el invento. El invento también proporciona un
cDNA de acuerdo con el invento en que dicha modificación comprende
una deleción en un ácido nucleico que codifica una proteína vírica,
tal como una proteína matricial (M).
El invento proporciona además un cDNA de acuerdo
con el invento provisto adicionalmente de un ácido nucleico que
codifica un antígeno heterólogo, en que dicho antígeno procede
preferiblemente de un patógeno de aves de corral, tal como, por
ejemplo, se describe más adelante. También se proporciona un RNA
obtenido de un cDNA de acuerdo con el invento, y una proteína
derivada de aquél.
En los últimos años, se han caracterizado
totalmente diversos virus RNA de cadena negativa y no segmentados,
y el trabajo fundamental sobre la replicación y expresión de sus
genomas ha culminado en la capacidad para generar un virus
infeccioso mediante la transfección completa de células con cDNA
clonado de dicho virus (revisión de Conzelmann, 1996).
Hasta la fecha, el virus infeccioso procedente
de virus RNA de cadena negativa y no segmentados ha sido generado a
partir de cDNA clonado de, por ejemplo, virus de la rabia (Schnell
et al., 1994; Conzelman; Documento EP0702085A1), virus de la
estomatitis vesicular (Lawson et al., 1995; Whelan et
al., 1995), virus Sendai (Garcin et al., 1995), virus
del sarampión (Radecke et al., 1995; Schneider et al.,
1997; Documento EP0780475A1), virus respiratorio sincitial humano
(Collins et al., 1995), virus de la peste bovina (Baron y
Barrett, 1997) y parainfluenzavirus humano de tipo 3 (Hoffman y
Banerjee, 1997; Conzelman; Documento EP0702085A1) (Schnell et
al., 1994; Documento EP0702085A1).
Sin embargo, todas las anteriores copias víricas
infecciosas son capaces de desarrollarse tanto in vivo como
in vitro en huéspedes, tejidos o células de diverso origen,
lo que permite unas sencillas transfección y replicación de cDNA y
la generación de partículas víricas infecciosas en una línea celular
adecuada.
Dicha posibilidad no existe para el NDV, desde
luego no para cepas de NDV lentogénicas que puedan proporcionar una
vacuna. La virulencia de dicha cepa de NDV está asociada con su
capacidad para replicarse en una gran variedad de células, lo que
viene reflejado por el hecho de que las cepas virulentas pueden
replicarse fácilmente in vitro e in vivo mientras que
las cepas de vacuna sólo pueden replicarse in vivo.
Por lo tanto, con el NDV es evidente la
situación de doble vínculo. Aunque los intentos para generar una
copia vírica infecciosa a partir de, por ejemplo, cDNA infeccioso
puede dar posiblemente lugar a un virus infeccioso, dicho virus no
es en general adecuado para uso como vacuna porque el virus
infeccioso así generado es, por defecto, demasiado virulento para
ser usado como vacuna; el hecho de que se pueda generar y replicar
después de la transfección de una línea celular con el cDNA refleja
su capacidad para escindir fácilmente la proteína Fo en F1 y F2, un
sello característico de la virulencia de un NDV, como se discutió
anteriormente.
El uso de una cepa de vacuna como material
originario para el cDNA no resolvería este problema; una cepa de
vacuna, especialmente de un tipo lentogénico, no contiene una
proteína Fo fácilmente escindible, lo que haría imposible que el
virus de la primera generación continuara replicándose. Realmente,
la célula utilizada para la transfección no será susceptible de
soportar uno o más ciclos de replicación del virus de tipo vacuna
con una proteína Fo no escindida.
El invento proporciona ahora elegantemente una
solución a este problema y proporciona con ella una copia infecciosa
de NDV para, por ejemplo, uso en una vacuna.
El invento proporciona un método para generar
una copia infecciosa del virus de la enfermedad de Newcastle, que
comprende transfectar células, capaces de expresar las proteínas NP,
P y L víricas para complejación con el RNA vírico, con cDNA clonado
de longitud completa o longitud genómica de dicho virus, y que
comprende además incubar dichas células en un medio de cultivo que
comprende una actividad proteolítica que permite la escisión de la
proteína Fo de dicho virus.
En el presente sistema, se podría omitir la
cotransfección de un plásmido que expresa NP. La NP se expresa
probablemente a partir del cDNA de longitud completa porque el gen
de NP es el primer gen después del extremo 5' del RNA antigenómico.
Puesto que los mRNAs eucarióticos son normalmente monocistrónicos,
no se espera la expresión de genes distales. Sin embargo, es
posible generar un cDNA de longitud completa en que estén cambiadas
las posiciones relativas de los genes del NDV. Si el primer gen de
dicho cDNA es el gen P o L, no es necesario que se exprese el
correspondiente producto génico a partir de un plásmido
cotransfectado.
Como una alternativa al uso de cDNA de longitud
completa, es posible utilizar dos o más cDNAs subgenómicos que
generen RNAs subgenómicos competentes en cuanto a la replicación, y
que expresen conjuntamente el complemento completo de las proteínas
del paramixovirus aviar. Incluso si los RNAs están separadamente
empaquetados, las partículas de tipo vírico resultantes pueden ser
utilizadas para ciclos sucesivos de replicación por medio de
coinfección y complementación de funciones génicas.
En una realización preferida, el invento
proporciona un método en que dicha actividad proteolítica procede
de una enzima, tal como una enzima de tipo tripsina, o procede de
una composición que comprende dicha actividad proteolítica. En la
realización muy preferida, dicho medio de cultivo comprende fluido
alantoico que comprende actividad proteolítica. Para la generación
del virus infeccioso se requiere la escisión de la proteína Fo. Es
posible generar un virus infeccioso a partir de una cepa lentogénica
sin la adición de actividad proteolítica exógena. Al inocular el
sobrenadante de células transfectadas en la cavidad alantoica de
huevos fecundados, la actividad proteolítica que está presente en
el fluido alantoico es capaz de escindir la proteína Fo para
generar el complejo F1-F2 competente en cuanto a la
fusión. Los viriones con dicha proteína F activada pueden infectar
células sensibles, y la replicación en las células que expresan la
actividad proteolítica deseada produce una progenie infecciosa.
Como una alternativa al hecho de proporcionar la actividad
proteolítica deseada al sobrenadante de células transfectadas, es
posible utilizar, por ejemplo, una célula que sea tolerante al NDV
y que ya exprese dicha actividad proteolítica. Dicha línea celular
es utilizada para producir NDV lentogénico infeccioso sin la
adición de actividad proteolítica exógena. Dicha línea celular puede
ser también generada al transfectar establemente una línea celular
con un gen que especifica dicha actividad. Además, es posible
generar una línea celular transfectada estable que exprese la
proteína F de tipo silvestre en la envoltura del virus,
proporcionando por ello partículas infecciosas (que en sí no están
provistas de información genómica que codifique la proteína F de
tipo silvestre) con medios para entrar en una célula. También es
posible el rescate de un virus lentogénico infeccioso mediante la
infección de las células transfectadas, con un virus auxiliar de
NDV. Un requisito esencial para dicho virus auxiliar sería que
pudiera ser retroseleccionado, por ejemplo, por medio de
anticuerpos neutralizantes que eliminarán el virus auxiliar pero que
no reaccionaran con el virus lentogénico. Finalmente, se puede
construir una línea celular establemente transfectada que exprese
una, dos o las tres proteínas esenciales de NDV: NP, P y L. Dichas
líneas celulares requieren la coexpresión de sólo un subgrupo de
las tres proteínas esenciales o ninguna coexpresión en absoluto para
soportar la generación de una copia vírica infecciosa.
En una realización preferida, el invento
proporciona un método en que dichas células utilizadas para la
transfección proceden de líneas celulares o células primarias o
secundarias de gallina. La descripción proporciona, por ejemplo,
células CER o CEF, que, como generalmente la mayoría de las células
in vitro, carecen de las apropiadas proteasas que son
necesarias para escindir la proteína Fo de NDV, por ejemplo, de la
cepa LaSota. Sin embargo, también se pueden utilizar células
procedentes de, por ejemplo, otras aves.
El invento proporciona además un método para
generar una copia infecciosa del virus de la enfermedad de
Newcastle, que comprende transfectar células con cDNA clonado de
longitud completa o longitud genómica de dicho virus como, por
ejemplo, el identificado en la Figura 3, y que comprende además
incubar dichas células en un medio de cultivo que comprende una
actividad proteolítica que permite la escisión de la proteína Fo de
dicho virus, y que comprende además recuperar el virus infeccioso
cultivando dichas células e inoculando en la cavidad alantoica de
huevos fecundados el material procedente de dichas células
cultivadas. Dicho material comprende, por ejemplo, células o
fragmentos celulares o el sobrenadante procedente de dicho cultivo
celular (recolectados o
congelados-descongelados).
Por ejemplo, la descripción describe un método
para recuperar un virus infeccioso, en que el sobrenadante de
monocapas de CEF transfectadas fue inoculado en la cavidad alantoica
de huevos fertilizados. Cuatro días más tarde, el fluido alantoico
fue recolectado, analizado en un ensayo de hemaglutinación y
sometido a pases adicionales por huevos.
Además, el invento proporciona un método que
comprende someter adicionalmente dicha copia infecciosa de virus de
la enfermedad de Newcastle a pases recogiendo el fluido alantoico y
volviéndolo a inocular en huevos fecundados.
En una realización preferida del invento, se
proporciona un método en que dicho virus es un virus lentogénico
procedente, por ejemplo, de un caso virulento de NDV de campo o de
una cepa de vacuna de NDV, tal como la cepa LaSota de NDV. Además,
se proporciona un método para modificar un genoma de paramixovirus
aviar por medio de una modificación genética que permite la
introducción de una o más mutaciones, deleciones y/o inserciones u
otras modificaciones. Por ejemplo, se proporciona un método para
atenuar o modificar la virulencia de un paramixovirus aviar al
modificar el cDNA que, por ejemplo, codifica una proteína vírica,
tal como la proteína V, y clonar dicho cDNA modificado en cDNA de
longitud completa y generar una copia vírica infecciosa a partir de
dicho cDNA de longitud completa, generándose de este modo nuevas
cepas de NDV o nuevas vacunas vivas atenuadas con propiedades
mejoradas.
Aparte de la atenuación por modificación de
productos génicos, también es posible atenuar un paramixovirus
aviar por modificación de secuencias de nucleótidos que están
implicadas en la transcripción y/o replicación. Dichas
modificaciones dan lugar a cepas atenuadas que expresan proteínas F,
similares a las del tipo silvestre, que son escindibles in
vitro e in vivo en una gran variedad de células y, como
resultado, son más inmunogénicas que las clásicas cepas de
vacuna.
En una realización preferida, el invento
proporciona un método para atenuar o modificar la virulencia de un
paramixovirus aviar tal como un virus de la enfermedad de Newcastle,
que comprende modificar un sitio de escisión por proteasas de una
proteína vírica al modificar el cDNA que codifica dicho sitio de
escisión, y que comprende además clonar dicho cDNA en cDNA de
longitud genómica de, por ejemplo, virus de la enfermedad de
Newcastle y generar una copia infecciosa de virus de la enfermedad
de Newcastle. Dicho sitio de escisión es, por ejemplo, un sitio de
escisión por proteasas en la proteína F o HN del virus de la
enfermedad de Newcastle. En general, la atenuación se limita a la
reducción de la virulencia; sin embargo, también es posible ahora
utilizar una cepa relativamente avirulenta de NDV y obtener la
progenie de dicha cepa con una virulencia aumentada, por ejemplo,
obteniéndola con una tendencia aumentada a replicarse en un tipo
celular especificado. Por lo tanto, ahora es posible comunicar
distintos atributos de virulencia al NDV.
El invento proporciona un método para modificar
antigénicamente un paramixovirus aviar tal como un virus de la
enfermedad de Newcastle, que comprende modificar un cDNA que
codifica al menos una parte de una proteína viral que contiene al
menos un epítopo inmunodominante, y que comprende además clonar
dicho cDNA en cDNA de longitud genómica de virus de la enfermedad
de Newcastle y generar una copia infecciosa de virus de la
enfermedad de Newcastle.
Por ejemplo, el invento proporciona un método
para modificar (adicionalmente) un NDV usando, por ejemplo, un
método para producir una copia infecciosa de NDV (vacuna) que se ha
proporcionado; se proporciona un método para producir una vacuna
marcadora recombinante de NDV, una vacuna marcadora que contiene el
más completo espectro inmunológico posible o necesario de epítopos
de NDV antigénicamente relevantes y que, no obstante, es
serológicamente distinta del NDV de tipo silvestre porque, mediante
técnicas recombinantes, se ha eliminado un bien definido marcador o
epítopo serológicamente relevante. El invento proporciona un método
para modificar la composición antigénica de un paramixovirus aviar
tal como el NDV, lo que permite la generación de, por ejemplo, una
vacuna marcadora viva de NDV que puede ser serológicamente
distinguida de las cepas de campo de paramixovirus aviar.
En una realización, el invento proporciona una
copia infecciosa de NDV en que la proteína HN de NDV ha sido
modificada al recombinar cDNA que codifica una parte de dicha
proteína HN con cDNA que codifica una parte de una proteína HN
procedente de un paramixovirus aviar de, por ejemplo, tipo 2 o tipo
4. Dicha proteína HN híbrida sirve como un marcador serológico para
la copia infecciosa de cepa de NDV así obtenida o puede servir para
cambiar el tropismo del paramixovirus aviar hacia otras células y/o
tejidos. Estas así llamadas cepas marcadoras como las
proporcionadas por el invento permiten la generación de vacunas que
son una herramienta inestimable para evaluar la incidencia de NDV
en conjuntos animales comerciales por todo el mundo. Además, la
aplicación de dichas vacunas marcadoras a gran escala conducirá a la
erradicación completa del NDV mediante un procedimiento de
exploración intensiva y eliminación de conjuntos animales
infectados.
Además, se proporciona un método para generar
una copia infecciosa de cepa de NDV que exprese uno o más antígenos
de otros patógenos y que pueda ser utilizada para vacunar contra
múltiples enfermedades. Dicha copia infecciosa de virus NDV
comprende, por ejemplo, un cDNA heterólogo que codifica una proteína
heteróloga obtenida de, por ejemplo, virus de la influenza aviar
(AIV; del inglés, avian influenza virus)
[hemaglutinina (H5 y H7) y neuraminidasa], virus de la leucosis
aviar (ALV; del inglés, avian leukosis virus)
[proteína env (gp85)], virus de la anemia de los pollos (CAV; del
inglés, chicken anemia virus) (VP1 + VP2),
virus de la enfermedad de Marek (MDV) [glicoproteína B (gB), gH],
virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILT; del inglés,
infectious laringotracheitis) (gB, gH, gD),
virus de la bursitis infecciosa (IBDV; del inglés, infectious
bursal disease virus) (VP2 y VP3), virus de la
rinotraqueitis del pavo (TRT; del inglés, turkey
rhinotracheitis) [proteína de fusión (F)],
paramixovirus aviar 2, 3, 6 (PMV; del inglés,
paramyxovirus) [proteína F,
hemaglutinina-neuraminidasa (HN) u otras], virus de
la bronquitis infecciosa (IBV; del inglés, infectious
bronchitis virus) (proteína peplómera,
nucleoproteína), reovirus (proteína sigma), adenovirus, neumovirus,
Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni,
Escherichia coli, Bordetella avium (previamente
Alcaligenes faecalis), Haemophilus paragallinarum,
Pasteurella multocida, Ornithobacterium
rhinotracheale, Riemerella (previamente
Pasteurella) anatipestifer, bacterias del género
Mycoplasma (M. gallisepticum, M. synoviae,
M. meleagridis, M. iowae) u hongos del género
Aspergillus (A. flavus, A. fumigatus).
El presente invento proporciona un paramixovirus
aviar, o cepas del mismo, que se pueden utilizar como un vector de
vacuna para la expresión de antígenos procedentes de otros patógenos
de aves de corral. Diversas propiedades hacen que el NDV sea un
vector de vacuna ideal para la vacunación contra enfermedades
respiratorias o intestinales: 1) el NDV puede ser fácilmente
cultivado hasta títulos elevadísimos en huevos fecundados; 2) el
cultivo masivo de NDV en huevos fecundados es relativamente barato;
3) las vacunas de NDV son relativamente estables y pueden ser
simplemente administradas mediante métodos de aplicación masiva
tales como por el agua potable o por pulverización o formación de
aerosoles; 4) la vía natural de infección del NDV son los tractos
respiratorio y/o intestinal, que son también las principales vías
naturales de infección de muchos otros patógenos de aves de corral;
y 5) el NDV puede provocar inmunidad local a pesar de la presencia
de anticuerpos maternos circulantes.
Se ha mostrado que el NDV tiene unas potentes
propiedades antineoplásicas así como inmunoestimulantes [para una
revisión, véase Schirrmacher et al., 1998 (V. Schirrmacher,
T. Ahlert, H. H. Steiner, C. Herold-Mende, R.
Gerhards y E. Hagmüller, 1998, "Immunization with
virus-modified tumor cells", Seminars in Oncology
25: 677-696]. Aunque no parece que el NDV sea capaz
de replicarse productivamente en células humanas normales, se
advirtió una muerte selectiva de células cancerosas humanas mediada
por NDV. En ratones con sistema inmune suprimido, después de una
terapia local con NDV se observaron oncolisis viral y remisiones
completas de xenoinjertos de tumores humanos. Esto ha conducido al
uso de NDV para terapia tumoral. Sin embargo, un problema es que
dicha aplicación puede estar restringida a un tratamiento local.
La infección por NDV induce interferones,
quimiocinas y otros productos génicos potencialmente importantes, e
introduce propiedades pleiotrópicas inmunoestimulantes en las
células tumorales. Este concepto ha sido usado para la producción
de vacunas de células tumorales autólogas que consisten en muestras
operativas frescas que han sido infectadas con NDV. Este tipo de
vacuna es llamada vacuna de tumor autólogo-NDV o
ATV-NDV (del inglés, autologous tumor
vaccine-NDV) (Schirrmacher et al.,
1988). Las células infectadas con NDV son inactivadas mediante
irradiación gamma, que evita la división celular pero aún permite la
replicación del NDV en el citoplasma de las células infectadas.
Después de la inoculación del ATV-NDV en los
pacientes, se reclutan células T por medio de quimiocinas inducidas
por NDV. Algunas de estas células T pueden expresar un receptor de
células T que puede interaccionar, en la superficie celular, con
péptidos de antígenos tumoralmente asociados en complejo con
moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I.
Esta interacción da lugar a la inducción de una respuesta de
células T citotóxicas que da lugar a la muerte específica de las
células tumorales autólogas.
El invento proporciona la modulación del
repertorio y la cantidad de quimiocinas y proteínas
inmunoestimulantes, inducidas por la infección con NDV. El presente
invento proporciona un método para generar un NDV recombinante que
ha sido modificado para que lleve incorporado(s) y exprese
un(os) gen(es) heterólogo(s). Dicho NDV
recombinante puede ser utilizado para modificar el repertorio y la
cantidad de proteínas inmunoestimulantes en las células infectadas.
En una realización, el invento proporciona un NDV recombinante que
lleva incorporados y expresa genes que codifican interferones,
quimiocinas u otras proteínas inmunoestimulantes humanas. Dicho NDV
recombinante es utilizado para la producción de un
ATV-NDV que es más potente que el
ATV-NDV convencional (por ejemplo, las citocinas
IFN-\alpha y -\beta,
TNF-\alpha, IL-1 e
IL-6; las quimiocinas RANTES e
IP-10; u otros genes tales como HSP, ACTH,
endorfina, iNOS, EPA/TIMP y NF\kappaB). Las propiedades
inmunoestimulantes pleiotrópicas del NDV pueden ser también
utilizadas como un agente adyuvante para la vacunación de animales y
seres humanos contra enfermedades infecciosas. En una realización
del invento, se introducen genes extraños que codifican
un(os)
antígeno(s) relevante(s) de un(os) agente(s) infeccioso(s) en el genoma de NDV, y la expresión simultánea del(de los)
antígeno(s) y las proteínas inmunoestimulantes por las células infectadas puede inducir una potente respuesta inmune contra el agente infeccioso. En otra realización del invento, las propiedades inmunoestimulantes del NDV pueden ser adicionalmente potenciadas al usar recombinantes de NDV que expresan simultáneamente antígenos y proteínas inmunoestimulantes específicas. En una realización preferida, el invento es utilizado para generar una vacuna contra el sida (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) al usar recombinantes de NDV que expresan antígenos relevantes del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), solos o en combinación con proteínas inmunoestimulantes.
antígeno(s) relevante(s) de un(os) agente(s) infeccioso(s) en el genoma de NDV, y la expresión simultánea del(de los)
antígeno(s) y las proteínas inmunoestimulantes por las células infectadas puede inducir una potente respuesta inmune contra el agente infeccioso. En otra realización del invento, las propiedades inmunoestimulantes del NDV pueden ser adicionalmente potenciadas al usar recombinantes de NDV que expresan simultáneamente antígenos y proteínas inmunoestimulantes específicas. En una realización preferida, el invento es utilizado para generar una vacuna contra el sida (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) al usar recombinantes de NDV que expresan antígenos relevantes del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), solos o en combinación con proteínas inmunoestimulantes.
El NDV es también usado como un agente adyuvante
para la vacunación de animales y seres humanos contra enfermedades
infecciosas. En una realización del invento, se introducen genes
heterólogos o extraños que codifican un(os)
antígeno(s) relevante(s) de un(os)
agente(s) infeccioso(s) en el genoma del NDV, y la
expresión simultánea del(de los) antígeno(s) y las
proteínas inmunoestimulantes por las células infectadas puede
inducir una potente respuesta inmune contra el agente infeccioso.
En otra realización del invento, las propiedades inmunoestimulantes
del NDV son adicionalmente potenciadas al usar recombinantes de NDV
que expresan simultáneamente antígenos y proteínas
inmunoestimulantes específicas. En una realización preferida, el
invento es utilizado para generar una vacuna contra el sida
(síndrome de inmunodeficiencia adquirida) al usar recombinantes de
NDV que expresan antígenos relevantes del virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH), solos o en combinación con proteínas
inmunoestimulantes.
Además, se proporciona un método para generar un
mutante condicional letal de NDV por deleción que puede ser usado
como vacuna autolimitada no transmisible (portadora). Se generó un
mutante de NDV por deleción que es incapaz de expresar la proteína
matricial (M) que está implicada en la gemación del NDV en el
interior de la membrana celular. El invento proporciona, por
ejemplo, una cepa de NDV fenotípicamente complementada que es
incapaz de expresar la proteína M y que aún es capaz de infectar
células y de propagarse por medio de una transmisión de célula a
célula. Sin embargo, el virus mutante es incapaz de generar una
progenie infecciosa en células no complementarias. Esto demuestra
que los mutantes de NDV por deleción fenotípicamente complementados
pueden ser usados como vacunas autolimitadas seguras que son
incapaces de propagarse por el medio ambiente. Dicha vacuna no
transmisible combina la ventaja más importante de las vacunas vivas,
es decir, la eficacia, con la ventaja más importante de las vacunas
muertas, es decir, la seguridad.
El invento proporciona un virus de la enfermedad
de Newcastle, o cepas derivadas del mismo, mediante, por ejemplo,
el pase o el cultivo adicional en huevos fecundados o células
apropiadas, que procede de una copia vírica infecciosa obtenible
mediante un método proporcionado por el invento.
Por ejemplo, se proporciona un NDV que ha sido
modificado de al menos un modo para generar una copia infecciosa
del virus de la enfermedad de Newcastle que está atenuada, está
modificada en cuanto a la virulencia, está antigénicamente
modificada, expresa un antígeno heterólogo o no es transmisible, o
combinaciones de estas propiedades.
El presente invento proporciona vacunas de NDV
caracterizadas, por ejemplo, por poseer distintos atributos de
virulencia o distintas características antigénicas, sean con fines
de vacunas marcadoras y/o para expresar antígenos heterólogos
procedentes de otros patógenos, estén en forma transmisible y/o en
forma no transmisible.
Dicha vacuna puede ser una vacuna muerta o una
vacuna viva. Preferiblemente, dicha vacuna es una vacuna viva; sin
embargo, vacunas muertas como las proporcionadas por el invento son
beneficiosas bajo aquellas circunstancias en que una vacuna viva no
es aplicable o es sólo poco aplicable a causa de, por ejemplo,
restricciones comerciales u otras condiciones dispuestas por las
autoridades que controlan las enfermedades.
El presente invento también proporciona un
método diagnóstico para detectar anticuerpos contra dicho marcador
o epítopo inmunodominante serológicamente relevante, proporcionando
con él métodos y medios para ejecutar un método para el control y/o
la erradicación del NDV y/o otras enfermedades de las aves de
corral. El invento proporciona vacunas nuevas y eficaces que pueden
ser serológicamente discriminadas de los virus de campo y las
vacunas de tipo antiguo. Dichas nuevas vacunas, llamadas vacunas
marcadoras de NDV, proporcionan el más completo espectro
inmunológico posible de epítopos de NDV antigénicamente relevantes
y, no obstante, son serológicamente distinguidas del NDV de tipo
silvestre mediante la aplicación de los métodos diagnósticos
adjuntos.
El invento proporciona un método para distinguir
animales no vacunados o animales vacunados con una vacuna de NDV de
acuerdo con el invento, de los animales infectados con NDV de tipo
silvestre o vacunados con una cepa de vacuna de NDV mesogénica o
lentogénica no modificada, que comprende tomar al menos una muestra
(tal como suero, sangre, huevos o fluido ocular) de dicho animal y
determinar en dicha muestra la presencia de anticuerpos dirigidos
contra un marcador o epítopo inmunodominante expresado por dicho NDV
de tipo silvestre o no modificado pero no por una vacuna de acuerdo
con el invento.
El invento proporciona un método en que dichos
anticuerpos se dirigen contra la proteína HN o F del NDV, tal como,
por ejemplo, una proteína híbrida como la descrita en la parte
experimental de esta descripción. El invento proporciona, por
ejemplo, un método diagnóstico en que dicho animal es seleccionado
del grupo que comprende aves de corral, preferiblemente
gallinas.
En una realización del invento, se usa un ensayo
de hemaglutinación-inhibición sencillo y rápido para
distinguir entre animales vacunados y animales infectados. Los
animales vacunados con una vacuna marcadora en que el cabecero
globular completo de la HN de NDV ha sido sustituido por la parte
correspondiente de HN de otro serotipo no generarán anticuerpos
hacia HN de NDV y, por lo tanto, no inhibirán la hemaglutinación de
eritrocitos por viriones de NDV.
Al utilizarse viriones de vacuna marcadora en el
ensayo de HI, los anticuerpos contra la proteína HN híbrida son
detectados y pueden ser utilizados como una medida de la eficacia de
la vacunación. Como una alternativa, para medir la eficacia de la
vacunación se utiliza un ensayo de inmunoabsorción con enzimas
ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked
immunosorption assay), que detecta anticuerpos contra
la proteína F de NDV.
Aparte del ensayo de HI, se puede utilizar un
ELISA para determinar la presencia de anticuerpos contra HN de NDV.
El antígeno que se va utilizar en dicho ensayo es, por ejemplo, HN
de NDV que se expresa mediante técnicas de DNA recombinante o un
péptido conservado de HN de NDV.
También se puede utilizar un ELISA de bloqueo.
En este caso se utilizan uno o más anticuerpos monoclonales contra
epítopos conservados de HN de NDV para determinar si en las muestras
de animales vacunados están presentes anticuerpos competidores. Los
ensayos ELISA pueden ser ventajosamente utilizados si la vacuna
marcadora sólo contiene una proteína HN quimérica o cuando están
sustituidos unos pocos epítopos de HN de NDV.
El invento es adicionalmente explicado en la
parte experimental de esta descripción sin que el invento se imite a
ella.
A menos que se afirme otra cosa, se llevaron a
cabo procedimientos de clonación estándares de acuerdo con Sambrook
et al. (1989). Todas las construcciones en que estaban
implicados fragmentos de DNA, que fueron generadas por medio de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), fueron verificadas por
análisis de secuencias. En las secuencias de cebador indicadas más
adelante, los nucleótidos subrayados corresponden a secuencias de
NDV y se indica la posición en el genoma del NDV. La secuencia de
nucleótidos de los sitios de restricción que se utilizaron para la
clonación se indican en letra negrita.
Se cultivaron células CER (Smith et al.,
1976) en medio GMEM/EMEM (1:1) que contenía suero de ternera fetal
(FCS; del inglés, foetal calf serum) al 5% y 2%
de una mezcla de antibióticos que contenía 1000 U/ml de penicilina,
1000 \mug/ml de estreptomicina, 20 \mug/ml de fungizona, 500
\mug/ml de polimixina B y 10 mg/ml de kanamicina. Se cultivaron
células QT35 (Moscovici et al., 1977; Cho, 1982) en medio
suministrado por GibcoBRL/Life Technologies (nº
041-91536 del catálogo; composición registrada de
Fort Dodge), complementado con FCS al 5% y mezcla de antibióticos
al 2%. Se cultivaron células QM5 (Antin y Ordahl) en medio M199
complementado con caldo de fosfato-triptosa al 10%,
FCS al 10% y mezcla de antibióticos al 2%.
La cepa LaSota de NDV se obtuvo de la ATCC (ATCC
VR-699) y fue hecha pasar dos veces por huevos
fecundados. Antes de comenzar con la construcción y clonación de
cDNA, el virus fue purificado en placas mediante tres ciclos de
purificación sobre fibroblastos de embrión de gallina (CEF; del
inglés, chicken embryo fibroblasts) primarios.
Con este fin, el virus fue titulado en células CEF cultivadas en
GMEM/EMEM (1:1) que contenía suero de ternera fetal al 5%, mezcla
de antibióticos al 2 por ciento, fluido alantoico al 5%, MgCl_{2}
30 mM, 200 \mug/ml de DEAE-dextrano (Sigma) y
agar Nobel (Difco) al 0,8%. El virus procedente del tercer ciclo de
purificación en placas (designado clon E13-1) fue
cultivado en huevos fecundados, y, cuatro días después de la
inoculación, el fluido alantoico fue recolectado y fue guardado a
-70ºC en partes alícuotas. El virus recombinante fpEFLT7pol de la
viruela (Britton et al., 1996; más adelante llamado
FPV-T7), que expresa RNA polimerasa de T7, fue un
amable obsequio del Dr. Michael Skinner y fue cultivado en células
QT35.
Todas las manipulaciones fueron llevadas a cabo
en material de plástico o vidrio exento de RNasa, y todas las
disoluciones se prepararon con agua, exenta de RNasa, que fue
tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC) al 1% y fue
esterilizada por tratamiento en autoclave. El virus fue recogido del
fluido alantoico como sedimento de una centrifugación a 21.000 rpm
durante 70 minutos en un rotor Beckman SW40 a 4ºC. El sedimento fue
resuspendido en tampón de homogeneización [Tris-HCl
50 mM, pH de 7,5, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, dodecilsulfato sódico (SDS;
del inglés, sodium dodecyl sulfate) al 0,5%] y
fue tratado con proteinasa K (200 \mug/ml) durante 90 minutos a
37ºC con agitación constante. El lisado fue sometido dos veces a
extracción con un volumen igual de fenol/cloroformo (1:1), pH 5,4,
y una vez con un volumen igual de cloroformo. El RNA vírico fue
precipitado de la fase acuosa mediante la adición de 0,1 volúmenes
de NaOAc 3 M, pH 5,3, y 2,5 volúmenes de etanol al 100%. El
precipitado fue recogido por centrifugación, lavado una vez con
etanol al 70%, resuspendido en agua y almacenado en partes alícuotas
a -70ºC.
Se mezcló RNA vírico (1,5 \mug) con 500 ng de
cebador en un volumen de 12 \mul y se incubó la mezcla durante 10
minutos a 70ºC. Se añadieron 4 \mul de tampón RT 5x
(Tris-HCl 250 mM, pH de 8,3, KCl 375 mM, MgCl_{2}
15 mM; GibcoBRL/Life Technologies), 2 \mul de DTT 0,1 M y 2 \mul
de dNTPs 10 mM (cada uno 2,5 mM) y se incubó la mezcla durante 2
minutos a 42ºC. La transcripción inversa fue llevada a cabo en un
volumen final de 20 \mul mediante la adición de 200 unidades de
transcriptasa inversa (Superscript II; GibcoBRL/Life Technologies),
lo que fue seguido de una incubación a 42ºC durante 60 minutos.
Todas las reacciones PCR que se utilizaron para
determinar los extremos 3' y 5' del genoma de NDV (véase más
adelante) fueron llevadas a cabo usando DNA polimerasa Taq (Perkin
Elmer). Para la clonación de genes de NDV individuales o de cDNAs
subgenómicos grandes, se usaron DNA polimerasa Pwo con actividad
correctora de errores o mezclas de Taq y Pwo ("Expand High
Fidelity Kit" o "Expand Long Template Kit") de acuerdo con
las instrucciones del proveedor (Boehringer Mannheim). Todas las
muestras fueron incubadas durante 2 minutos a 94ºC antes del inicio
del número indicado de ciclos de PCR. Después del número indicado de
ciclos de PCR, las muestras fueron incubadas a la temperatura de
elongación durante al menos 3 veces la duración del tiempo de
elongación del ciclo de PCR. Los fragmentos de la PCR fueron
directamente purificados usando el "High Pure PCR Product
Purification Kit" (Boehringer Mannheim) o, después de una
electroforesis en gel de agarosa, usando el sistema de extracción
Qiaex II (Qiagen), esencialmente del modo descrito por los
proveedores.
Todas las secuencias fueron determinadas
utilizando el sistema "PRISM Ready Reaction" (Perkin Elmer)
para secuenciación cíclica con didesoxiterminadores marcados con
colorantes. Las mezclas de reacción (5 \mul) se sometieron a 25
ciclos de multiplicación lineal (10 segundos a 94ºC, 5 segundos a
50ºC, y 4 minutos a 60ºC) en un termociclador GeneAmp 2400.
Posteriormente, las mezclas de reacción fueron sometidas a
precipitación con etanol, lavadas una vez con etanol al 70%,
resuspendidas en 15 \mul de tampón TSR (Perkin Elmer) y calentadas
durante 2 minutos a 94ºC antes de ser cargadas en un secuenciador
automático Applied Biosystems AB310.
Las secuencias nucleotídicas de los cebadores
que se utilizaron para secuenciar el genoma completo de la cepa
LaSota de NDV procedían de secuencias publicadas o de secuencias
establecidas durante este proyecto de secuenciación. Los cebadores
se muestran en la Tabla 1.
Se determinó la secuencia nucleotídica de los
extremos 3' y 5' del genoma de NDV utilizando procedimientos de
multiplicación rápida de extremos de cDNA (RACE; del inglés,
rapid amplification of cDNA ends). Se
utilizó el RNA de NDV en una reacción de transcripción inversa (RT;
del inglés, reverse transcription) en un volumen
final de 20 \mul usando el cebador p360
(5'-GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT-3'; nt
14.756-14.779), que procedía de la secuencia
publicada del gen L de NDV (Yusoff et al., 1987). Se añadió
el cDNA de cadena sencilla (2,5 \mul de la mezcla de RT) a 8
picomoles del cebador de anclaje ALG3
(5'-CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3')
y se llevó a cabo la ligación durante la noche a temperatura
ambiental en 20 \mul de una mezcla de reacción que contenía
Tris-HCl 50 mM, pH de 8,0, MgCl_{2} 10 mM, 10
\mug/ml de albúmina sérica bovina, PEG al 25%, HCC 1 mM, ATP 20
\muM y y 10 unidades de RNA ligasa de T4 (New Englands Biolabs),
del modo descrito por Tessier et al. (1986). 1 \mul de la
mezcla de reacción de ligación fue usado como molde en una reacción
PCR usando los cebadores p375
(5'-CAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT-3'; nt
14.964-14.983) y ALG4
(5'-GAAGGATCCAGAATCGATAG-3'). El
segundo cebador es complementario del cebador de anclaje ALG3. Las
condiciones de la PCR (40 ciclos) fueron las siguientes: 1 minuto a
94ºC, 1 minuto a 55ºC y 2 minutos a 72ºC. Los productos de PCR
fueron purificados y clonados en el vector T pBluescript
II-TSK (Ichihara y Kurosawa, 1993).
Alternativamente, los productos de PCR purificados fueron tratados
con DNA polimerasa I de Klenow para crear extremos romos y fueron
clonados en el sitio HincII del plásmido pGEM4Z (Promega). Se
secuenciaron trece clones independientes (pBluescript
II-TSK 8x y pGEM4Z 5x) para determinar la secuencia
de nucleótidos del extremo 5' del genoma de la cepa LaSota de NDV.
La secuencia de nucleótidos del extremo 3' fue determinada mediante
dos métodos independientes. En el método I, el cebador ALG3 fue
ligado al extremo 3' del RNA vírico usando RNA ligasa de T4 del modo
descrito por Schütze et al. (1995). La mezcla de reacción
(volumen final de 10 \mul) contenía 2,5 \mug de RNA de NDV, 100
picomoles de ALG3, 1 \mul de tampón 10x para RNA ligasa de T4
(Tris-HCl 500 mM, pH de 7,8, MgCl_{2} 100 mM, DTT
100 mM, ATP 10 mM), 1 \mul de DMSO, 1 \mul de
hexamina-cloruro de cobalto 10 \muM, 1 \mul de
RNasin® (Promega) y 10 unidades de RNA ligasa de T4 (New Englands
Biolabs). Se incubó la mezcla durante la noche a temperatura
ambiental y se utilizaron 5 \mul de la mezcla de reacción de
ligación como molde en una reacción de transcripción inversa,
utilizando ALG4 como cebador. Se utilizó 1 \mul de la mezcla de la
reacción de RT en una reacción PCR utilizando los cebadores ALG4 y
p376
(5'-GAGCCTTAAGGAGCTGCTCGTACTGATC-3'; nt
137-164), que procedía de la secuencia publicada del
extremo 3' de NDV (Ishida et al., 1986). Las condiciones de
la PCR fueron como las descritas anteriormente para la RACE 5'. En
el método II, los extremos 3' y 5' del RNA vírico de NDV fueron
ligados entre sí utilizando RNA ligasa de T4 y empleando unas
condiciones iguales a las anteriormente descritas para el método I.
Se utilizaron 5 \mul de la mezcla de ligación como molde en una
reacción de transcripción inversa usando el cebador p360. Se utilizó
1 \mul de la mezcla de la reacción de RT en una reacción PCR
usando los cebadores p375 y p376 y las condiciones de PCR
anteriormente descritas para la RACE 5'. Los productos de la PCR
fueron tratados con DNA polimerasa I de Klenow para crear extremos
romos y fueron clonados en el sitio HincII del plásmido pGEM4Z
(Promega). Se secuenciaron diez clones independientes (4 del método
I y 6 del método II) para determinar la secuencia de nucleótidos del
extremo 3' del genoma de la cepa LaSota de NDV.
Se construyó un vector de transcripción de bajo
número de copias utilizando el plásmido pOK12 (Vieira y Messing,
1991) como replicón básico. Se sometió el plásmido pOK12 a digestión
con PvuII y se aisló el fragmento de cDNA que contenía el origen de
replicación y el gen de resistencia a la kanamicina. Este fragmento
de DNA fue ligado a un fragmento Eco47III-AflII (el
sitio AflII había sido hecho romo usando DNA polimerasa I de
Klenow) del vector 2.0 de transcripción (un generoso obsequio del Dr
Andrew Ball; Pattnaik et al., 1992). Del plásmido resultante
se suprimió un fragmento XbaI-NheI para eliminar el
mayor número posible de sitios de restricción únicos. El plásmido
resultante fue denominado pOLTV5 (Figura 1). El vector de
transcripción pOLTV5 contiene el promotor de RNA polimerasa de T7
dependiente de DNA, seguido de los sitios de restricción únicos
StuI y SmaI, la ribozima autocatalítica del virus delta de la
hepatitis (HDV; del inglés, hepatitis delta
virus) y la señal de terminación de transcripción procedente
del bacteriófago T7. Los fragmentos de DNA clonados entre los
sitios de restricción StuI y SmaI pueden ser transcritos in
vitro o in vivo usando RNA polimerasa de T7. Después de
la transcripción, el extremo 5' de los transcritos resultantes
contiene dos restos G codificados por el plásmido. A causa de la
acción autocatalítica de la ribozima de HDV, el extremo 3' de los
transcritos corresponde al nucleótido terminal exacto del fragmento
de DNA clonado (Pattnaik et al., 1992).
Con objeto de examinar los requisitos para la
replicación y transcripción del NDV, se construyeron plásmidos
minigenómicos que contenían las regiones terminales 3' y 5' de NDV
que flanqueaban un gen informador que sustituía a todos los genes
de NDV (Figura 2). Se generaron fragmentos de DNA que correspondían
a las regiones terminales 3' y 5' de NDV por medio de una PCR en
que se usaba DNA polimerasa Pwo (30 ciclos; 15 segundos a 94ºC, 30
segundos a 50ºC y 30 segundos a 72ºC) y se usaban plásmidos que
contenían los fragmentos RACE 3' y 5' como moldes (véase más
arriba).
Se generó la región 3' (nt
1-119) utilizando los cebadores 3UIT
(5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTAC
GA-3', nt 1-27) y SEAP3 (5'-ATCGATACTGGTCAGCATGC TGGCAGAAGGCTTTCTCG-3', nt 102-119). Se generó la región 5' (nt 14.973-15.186) utilizando los cebadores SEAP5 (5'-GCATGCTGACCAGTATCGAT ATTACAG
TAACTGTGACT-3', nt 14.973-14.990) y 5NDV (5'-ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACGA-3', nt 15.158-
15.186). Los dos fragmentos de DNA fueron unidos en una PCR de solapamiento (el solapamiento se muestra en letra cursiva en las secuencias de cebador anteriormente mostradas) usando los cebadores 3UIT y 5NDV. El fragmento de DNA resultante, que es una fusión de los extremos 3' y 5' de NDV separados por 20 nucleótidos, fue fosforilado por tratamiento con polinucleótido quinasa de T4 y fue clonado en ambas orientaciones en el plásmido de transcripción pOLTV5 (Figura 1), que fue escindido con StuI y SmaI y fue desfosforilado con fosfatasa intestinal de ternera (Boehringer Mannheim). Finalmente, el gen SEAP (que codifica fosfatasa alcalina secretada) fue recuperado del plásmido pSEAP-Basic (Clontech) por digestión con SphI y ClaI y fue clonado entre los sitios SphI y ClaI, entre los extremos 3' y 5' de NDV. Los plásmidos resultantes fueron denominados pOLTV535 y pOLTV553, respectivamente. Usando RNA polimerasa de T7, la transcripción in vivo o in vitro del plásmido pOLTV535 da lugar a RNA antigenómico ([+]-RNA), mientras que la transcripción del plásmido pOLTV553 da lugar a RNA genómico ([-]-RNA).
GA-3', nt 1-27) y SEAP3 (5'-ATCGATACTGGTCAGCATGC TGGCAGAAGGCTTTCTCG-3', nt 102-119). Se generó la región 5' (nt 14.973-15.186) utilizando los cebadores SEAP5 (5'-GCATGCTGACCAGTATCGAT ATTACAG
TAACTGTGACT-3', nt 14.973-14.990) y 5NDV (5'-ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACGA-3', nt 15.158-
15.186). Los dos fragmentos de DNA fueron unidos en una PCR de solapamiento (el solapamiento se muestra en letra cursiva en las secuencias de cebador anteriormente mostradas) usando los cebadores 3UIT y 5NDV. El fragmento de DNA resultante, que es una fusión de los extremos 3' y 5' de NDV separados por 20 nucleótidos, fue fosforilado por tratamiento con polinucleótido quinasa de T4 y fue clonado en ambas orientaciones en el plásmido de transcripción pOLTV5 (Figura 1), que fue escindido con StuI y SmaI y fue desfosforilado con fosfatasa intestinal de ternera (Boehringer Mannheim). Finalmente, el gen SEAP (que codifica fosfatasa alcalina secretada) fue recuperado del plásmido pSEAP-Basic (Clontech) por digestión con SphI y ClaI y fue clonado entre los sitios SphI y ClaI, entre los extremos 3' y 5' de NDV. Los plásmidos resultantes fueron denominados pOLTV535 y pOLTV553, respectivamente. Usando RNA polimerasa de T7, la transcripción in vivo o in vitro del plásmido pOLTV535 da lugar a RNA antigenómico ([+]-RNA), mientras que la transcripción del plásmido pOLTV553 da lugar a RNA genómico ([-]-RNA).
Se generaron los plásmidos pOLTV535N0 a -N5 y
pOLTV553N0 a -N5 al insertar oligonucleótidos autocomplementarios
en el sitio ClaI situado entre el gen SEAP y el extremo 5' de NDV en
pOLTV535 y pOLTV553, respectivamente (véase la Figura 2). Los
oligonucleótidos utilizados fueron: N0,
5'-CGCGAGCTCG-3'; N1,
5'-CGC
GAGSCTCG-3'; N2, 5'-CGCGAGCGCTCG-3'; N3, 5'-CGCGAGCWGCTCG; N4, 5'-CGCGAGCATGCTCG-3'; N5, 5'-CGCGAGCASTGCTCG-3' (W = A o T; S = C o G).
GAGSCTCG-3'; N2, 5'-CGCGAGCGCTCG-3'; N3, 5'-CGCGAGCWGCTCG; N4, 5'-CGCGAGCATGCTCG-3'; N5, 5'-CGCGAGCASTGCTCG-3' (W = A o T; S = C o G).
Para generar transcritos in vitro o in
vivo que contuvieran los auténticos extremos 5'- y
3'-terminales de NDV, se modificó el promotor de T7
en los plásmidos pOLTV535 y pOLTV533 para que la transcripción
comenzara en el primer nucleótido del extremo 3'- o
5'-terminal de NDV.
Se diseñaron cebadores que contenían 1) un sitio
de restricción BglI, 2) la secuencia del promotor de T7 (mostrada
en letra cursiva), que fue modificada para que los dos restos G
situados en el extremo del promotor de T7 fueran sustituidos por un
resto A, y 3) el extremo 3' (nt 1-21) o 5' (nt
15.164-15.186) de NDV. Se usaron los cebadores
BGL3F2
(5'-GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATA A CCAAACAGAGAATCCGTGAG-3')
y SEAP3 (véase más arriba) para generar un fragmento de DNA que
contenía el promotor de T7 modificado y el extremo 3' completo de
NDV hasta el inicio del gen SEAP en pOLTV535. Similarmente, se
generó un fragmento de DNA que contenía el promotor de T7
modificado y el extremo 5' entero de NDV hasta el final del gen SEAP
en pOLTV553 utilizando los cebadores BGL5F2
(5'-GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATA A CCAAA
CAAAGATTTGGTGAATG-3') y SEAP5. Los fragmentos resultantes fueron sometidos a digestión con BglI y SphI (extremo 3') o BglI y ClaI (extremo 5'), respectivamente, y fueron utilizados para sustituir el fragmento BglI-SphI en pOLTV535 o el fragmento BglI-ClaI en pOLTV553. Los plásmidos resultantes fueron denominados pOLTV735 y pOLTV753, respectivamente. Se generaron los plásmidos pOLTV735N3 y pOLTV753N3 al insertar un oligonucleótido autocomplementario (5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; W = A o T) en el sitio ClaI situado entre el gen SEAP y el extremo 5' de NDV en pOLTV735 y pOLTV753, respectivamente.
CAAAGATTTGGTGAATG-3') y SEAP5. Los fragmentos resultantes fueron sometidos a digestión con BglI y SphI (extremo 3') o BglI y ClaI (extremo 5'), respectivamente, y fueron utilizados para sustituir el fragmento BglI-SphI en pOLTV535 o el fragmento BglI-ClaI en pOLTV553. Los plásmidos resultantes fueron denominados pOLTV735 y pOLTV753, respectivamente. Se generaron los plásmidos pOLTV735N3 y pOLTV753N3 al insertar un oligonucleótido autocomplementario (5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; W = A o T) en el sitio ClaI situado entre el gen SEAP y el extremo 5' de NDV en pOLTV735 y pOLTV753, respectivamente.
Se construyó el plásmidopCIneoSEAP clonando un
fragmento XhoI-ClaI (el sitio ClaI fue hecho romo
utilizando DNA polimerasa I de Klenow) que contenía el gen SEAP del
plásmido pSEAP-Basic (Promega) entre los sitios XhoI
y SmaI del vector de expresión eucariótica pCIneo (Promega). El
segundo plásmido contiene el promotor del citomegalovirus humano
(hCMV) además del promotor del bacteriófago T7. Con objeto de
examinar y cuantificar la expresión de SEAP por los transcritos
generados sólo a partir del promotor de T7, se construyó otro
plásmido que carecía del promotor de hCMV. Con este fin, el
promotor de hCMV fue suprimido de pCIneo mediante digestión parcial
con HindIII seguida de digestión completa con BglII. El fragmento de
DNA (nt 756-5469 de acuerdo con la numeración de
Clontech) a partir del cual se suprimió el promotor de hCMV fue
aislado, tratado con DNA polimerasa de T4 para generar extremo
romos, y hecho de nuevo circular utilizando DNA ligasa de T4. El
plásmido resultante fue denominado pCIneoD. Finalmente, el gen SEAP
fue recuperado de pSEAP-Basic como un fragmento
MluI-AccI y fue clonado en pCIneoD entre los sitios
MluI y ClaI. El plásmido resultante fue denominado pCIneoD SEAP.
Se sembraron células en placas de cultivo de 24
pocillos, se cultivaron durante la noche hasta una confluencia de
60-80% y se infectaron con FPV-T7,
con una multiplicidad de infección de 1, durante una hora a 37ºC.
Las células fueron transfectadas con 0,5 \mug de DNA de plásmido
minigenómico usando 3 \mul de LipofectAMINE^{TM} y OptiMem
esencialmente del modo descrito por el proveedor (GibcoBRL/Life
Technologies). Después de una incubación durante 4 horas (células
CER) o 16 horas (células QM5) a 37ºC, las células fueron infectadas
con NDV (producto virulento de aislamiento holandés, nº 152608; 200
\mul por pocillo) durante 1 hora con una multiplicidad de
infección de 5 o fueron dejadas sin infectar. El inoculo fue
aspirado y fue sustituido por 1 ml de medio completo, y las células
fueron adicionalmente incubadas a 37ºC. Para las cotransfecciones,
las células fueron cultivadas en placas de cultivo de 6 pocillos y
fueron infectadas con FPV-T7 del modo anteriormente
descrito. Las células fueron cotransfectadas con 0,25 \mug de DNA
de plásmido minigenómico, 0,4 \mug de pCIneoNP, 0,2 \mug de
pCIneoP y 0,2 \mug de pCIneoL(c) o pCIneo utilizando 8
\mul de LipofectAMINE o 9 \mul de FuGene 6 (Boehringer
Mannheim). Con objeto de generar el virus infeccioso, el plásmido
minigenómico fue sustituido por un plásmido de transcripción que
contenía el cDNA de NDV de longitud completa.
La cantidad de SEAP que fue secretada al medio
de cultivo de las células transfectadas fue medida en placas
desechables de 96 pocillos utilizando el ensayo
Phospha-Light de genes informadores por
quimioluminiscencia para el sistema de fosfatasa alcalina
secretada, esencialmente del modo descrito por el proveedor
(Tropix). La quimioluminiscencia fue cuantificada usando un
contador de centelleo para muestras líquidas (Wallac 1450
Microbeta
PLUS).
PLUS).
Para clonar y secuenciar el genoma completo de
la cepa LaSota de NDV, se generaron clones de cDNA subgenómico
grandes por medio de RT-PCR y se clonaron en
pGEM-T. La síntesis del cDNA de la primera cadena
fue llevada a cabo usando el cebador 3UIT del modo anteriormente
descrito, y se usó 1 \mul de la mezcla de la reacción RT en una
reacción PCR usando el sistema Expand (Boehringer Mannheim) de PCR
con molde largo. La PCR consistía en 5 ciclos de 10 segundos a
94ºC, 30 segundos a 58ºC y 6 minutos a 68ºC, seguidos de 10 ciclos
de 10 segundos a 94ºC, 30 segundos a 58ºC y 6 minutos a 68ºC en que
el tiempo de elongación a 68ºC era aumentado 20 segundos por ciclo.
Los fragmentos de la PCR fueron clonados en pGEM-T
usando el sistema de clonación pGEM-T esencialmente
del modo descrito por el proveedor (Promega). Se transformó la cepa
SURE II de E. coli (Stratagene) con las mezclas de ligación.
Se llevaron a cabo dos reacciones RT-PCR
independientes (A y B) y cada una produjo un conjunto similar de
clones de cDNA. Se determinó la secuencia nucleotídica de los clones
de cDNA subgenómico usando cebadores específicos para NDV (Tabla 1)
y mediante cebadores que flanqueaban los insertos. Después de la
comparación de las secuencias nucleotídicas de las series A y B de
clones, las ambigüedades que quedaban fueron resueltas al
secuenciar regiones relevantes de una tercera serie independiente de
cDNAs (serie C). En la Figura 3 se muestra la secuencia
nucleotídica de la cepa LaSota de NDV.
El cDNA de longitud completa de NDV fue
ensamblado en el plásmido de transcripción pOLTV5 usando
pOLTV535 como plásmido de partida. Los fragmentos de DNA fueron unidos en solapamientos usando enzimas de restricción comunes, como se detalla en la Figura 4B. En una serie de operaciones de clonación, se construyó un plásmido (denominado p535-DI) que contenía los nucleótidos 1-3521 y 12.355-15.186 separados por un sitio ClaI que fue generado al unir los sitios ClaI en las posiciones 3521 y 12.355. En otra serie de operaciones de clonación, se construyó un plásmido (denominado pGEM-B) que contenía parte del genoma de NDV, incluyendo los nucleótidos 3521-12.355 (fragmento ClaI). Para facilitar la clonación, el último fragmento ClaI fue marcado con el gen de resistencia al cloranfenicol (Cm), procedente del plásmido pACYC184 (Chang y Cohen, 1978). Con este fin, el gen Cm fue recuperado de pACYC184 por medio de una PCR usando los cebadores CAT-F (5'-GCG-TACGTC
TAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG-3') y CAT-R (5'-GCTCTAGACGTA-CGACCCTGCCCTGAACCGACG-3'). La PCR fue llevada a cabo con DNA polimerasa Pwo y consistía en 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 60ºC y 60 segundos a 72ºC. El fragmento de PCR resultante fue sometido a digestión con BsiWI y fue clonado en el sitio BsiWI único de pGEM-B para producir pGEM-B(CAT). El fragmento ClaI de pGEM-B(CAT) fue clonado en el sitio ClaI único de p535-DI para producir pNDFL(CAT). Finalmente, el gen Cm fue eliminado de este plásmido por digestión con BsiWI, lo que fue seguido de nueva ligación y transformación de la cepa DH5a de E. coli. El plásmido resultante fue denominado pNDFL+ y contiene la secuencia entera de cDNA de NDV clonada entre el promotor de T7 y la ribozima de HDV en el plásmido de transcripción pOLTV5.
pOLTV535 como plásmido de partida. Los fragmentos de DNA fueron unidos en solapamientos usando enzimas de restricción comunes, como se detalla en la Figura 4B. En una serie de operaciones de clonación, se construyó un plásmido (denominado p535-DI) que contenía los nucleótidos 1-3521 y 12.355-15.186 separados por un sitio ClaI que fue generado al unir los sitios ClaI en las posiciones 3521 y 12.355. En otra serie de operaciones de clonación, se construyó un plásmido (denominado pGEM-B) que contenía parte del genoma de NDV, incluyendo los nucleótidos 3521-12.355 (fragmento ClaI). Para facilitar la clonación, el último fragmento ClaI fue marcado con el gen de resistencia al cloranfenicol (Cm), procedente del plásmido pACYC184 (Chang y Cohen, 1978). Con este fin, el gen Cm fue recuperado de pACYC184 por medio de una PCR usando los cebadores CAT-F (5'-GCG-TACGTC
TAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG-3') y CAT-R (5'-GCTCTAGACGTA-CGACCCTGCCCTGAACCGACG-3'). La PCR fue llevada a cabo con DNA polimerasa Pwo y consistía en 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 60ºC y 60 segundos a 72ºC. El fragmento de PCR resultante fue sometido a digestión con BsiWI y fue clonado en el sitio BsiWI único de pGEM-B para producir pGEM-B(CAT). El fragmento ClaI de pGEM-B(CAT) fue clonado en el sitio ClaI único de p535-DI para producir pNDFL(CAT). Finalmente, el gen Cm fue eliminado de este plásmido por digestión con BsiWI, lo que fue seguido de nueva ligación y transformación de la cepa DH5a de E. coli. El plásmido resultante fue denominado pNDFL+ y contiene la secuencia entera de cDNA de NDV clonada entre el promotor de T7 y la ribozima de HDV en el plásmido de transcripción pOLTV5.
Se generaron fragmentos de DNA, cada uno de los
cuales contenía los genes LaSota de NDV, por medio de
RT-PCR y se clonaron en pCIneo. Después de la
clonación, todos los fragmentos fueron secuenciados utilizando
cebadores que flanqueaban los insertos y mediante cebadores
génicamente específicos.
Gen NP: se usó el cebador 386
(5'-GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAGGTG-3', nt
40-69) para la transcripción inversa. Se usaron los
cebadores 365
(5'-GTGTGAATTCCGAGTGCGAGCCCGAAG-3': nt
77-94) y 892
(5'-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC-3'; nt
1577-1593) para la PCR usando DNA polimerasa Pwo. Se
utilizó el siguiente perfil de PCR (30 ciclos): 30 segundos a 95ºC,
40 segundos a 65ºC y 45 segundos a 72ºC. El fragmento de DNA
resultante fue sometido a digestión con EcoRI y fue clonado en
pCIneo entre los sitios EcoRI y SmaI. La expresión de NP fue
verificada en un ensayo de inmunoperoxidasa en monocapa (IPMA; del
inglés, immunoperoxidase monolayer assay) como
el descrito por Peeters et al. (1992), utilizando el
anticuerpo monoclonal 38 (Russell et al., 1983).
Gene P: se usó el cebador pRT1
(5'-CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGGGTAGAA-3': nt
1794-1814) para la transcripción inversa. Se usaron
los cebadores pRT1 y p2
(5'-GCAGTCTAGATTAGCCATTCACTGCAAGGCGC-3'; nt
3053-3071) para la PCR usando DNA polimerasa Pwo.
Se utilizó el siguiente perfil de PCR (30 ciclos): 30 segundos a
95ºC, 40 segundos a 65ºC y 60 segundos a 72ºC. El fragmento de DNA
resultante fue sometido a digestión con EcoRI y XbaI y fue clonado
en pCIneo entre los sitios EcoRI y XbaI. La expresión de P fue
verificada mediante un IPMA usando el anticuerpo monoclonal 688
(Russell et al., 1983).
Gen M: se utilizó el cebador 3UIT
(5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3' nt 1-27)
para la transcripción inversa. Se utilizaron los cebadores NDV5M
(5'-GGGTGCTAGCGGAGTGCCCCAATTGTGCCAA-3'; nt
3268-3288) y NDV3M
(5'-TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTTAAAAGGAT-3'; nt
4368-4389) para la PCR utilizando el sistema
"Expand High Fidelity". La PCR consistió en 10 ciclos de 15
segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC y 2 minutos a 68ºC, seguidos de
15 ciclos en que el tiempo de elongación a 68ºC fue aumentado 20
segundos por ciclo. El fragmento de DNA resultante fue tratado con
DNA polimerasa de T4 para crear extremos romos, sometido a
digestión con NheI y clonado en pCIneo entre los sitios NheI y
SmaI. La expresión de la proteína M fue verificada mediante un IPMA
usando el anticuerpo monoclonal 424 (Russell et al.,
1983).
Gen F: se utilizó el cebador 3UIT (véase más
arriba) para la transcripción inversa. Se usaron los cebadores
NDV5F (5'-ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGTTGG-3';
nt 4508-4526) y NDV3F
(5'-ACTACCCGGGAAACCTTCG
TTCCTCAT-3': nt 6212-31) para la PCR utilizando el sistema "Expand High Fidelity" y usando las condiciones anteriormente descritas para el gen M. El fragmento de DNA resultante fue tratado con DNA polimerasa de T4 para crear extremos romos, sometido a digestión con NheI y clonado en pCIneo entre los sitios NheI y SmaI. La expresión de la proteína F fue verificada mediante un IPMA usando el anticuerpo monoclonal 8E12A8C3 (ID-DLO; departamento de Virología Aviar).
TTCCTCAT-3': nt 6212-31) para la PCR utilizando el sistema "Expand High Fidelity" y usando las condiciones anteriormente descritas para el gen M. El fragmento de DNA resultante fue tratado con DNA polimerasa de T4 para crear extremos romos, sometido a digestión con NheI y clonado en pCIneo entre los sitios NheI y SmaI. La expresión de la proteína F fue verificada mediante un IPMA usando el anticuerpo monoclonal 8E12A8C3 (ID-DLO; departamento de Virología Aviar).
Gen H: se utilizó el cebador 3UIT para la
transcripción inversa. Se utilizaron los cebadores NDV5HN
(5'-GTAGGC
TAGCAAGAGAGGCCGCCCCTCAATG-3'; nt 6335-6354) y NDV3HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTT
GATTCTTG-3': nt 8205-8227) para la PCR utilizando el sistema "Expand High Fidelity" y usando las condiciones anteriormente descritas para el gen M. El fragmento de DNA resultante fue tratado con DNA polimerasa de T4 para crear extremos romos y, después de una digestión con XmaI, fue clonado en pCIneo entre el sitio NheI hecho romo (DNA polimerasa de Klenow) y el sitio XmaI. La expresión de la proteína HN fue verificada mediante un IPMA usando el anticuerpo monoclonal 86 (Russell et al., 1983).
TAGCAAGAGAGGCCGCCCCTCAATG-3'; nt 6335-6354) y NDV3HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTT
GATTCTTG-3': nt 8205-8227) para la PCR utilizando el sistema "Expand High Fidelity" y usando las condiciones anteriormente descritas para el gen M. El fragmento de DNA resultante fue tratado con DNA polimerasa de T4 para crear extremos romos y, después de una digestión con XmaI, fue clonado en pCIneo entre el sitio NheI hecho romo (DNA polimerasa de Klenow) y el sitio XmaI. La expresión de la proteína HN fue verificada mediante un IPMA usando el anticuerpo monoclonal 86 (Russell et al., 1983).
Gen L: el gen L fue recuperado del clon
pGME-L7a de cDNA (Figura 4A) por digestión con SacII
y SalI. Antes de la digestión con SalI, el sitio SacI fue hecho
romo mediante tratamiento con DNA polimerasa de T4. El fragmento
resultante fue clonado en pCIneo entre el sitio NheI hecho romo (DNA
polimerasa de Klenow) y el sitio SalI. La región no traducida 5'
situada entre el promotor de T7 y el codón ATG de inicio del gen L
contenía 2 codones ATG fuera de marco que podían interferir en la
expresión correcta de la proteína L. Por lo tanto, se construyó un
nuevo plásmido en que el primer ATG estaba ausente y en que el
segundo ATG había sido cambiado por AAG mediante una mutagénesis
por PCR, del modo siguiente. Se utilizaron los cebadores
5LE(E) 5'-CAATGGAATTCAAGG
CAAAACAGCT A A G GTAAATAATACGGG-3'; nt 8332-8374) y 3LE(B) 5'-GTGAATCTAGAATGCCGGATCCG
TACGAATGC-3'; nt 8847-8870) en una reacción PCR utilizando el plásmido pGEM-L7a (Figura 4) como molde. La PCR fue llevada a cabo usando DNA polimerasa Pwo y consistía en 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 60ºC y 60 segundos a 72ºC. El fragmento de DNA resultante fue sometido a digestión con EcoRI y XbaI y fue clonado en pCIneo entre los sitios EcoRI y XbaI para generar el plásmido pCIneoL(N). Posteriormente, el fragmento BsiWI-SalI de pGEM-L7a, que contiene la parte restante del gen L (nt 8852-15.046), fue clonado en pCIneoL(N) entre los sitios BsiWI y SalI para generar el plásmido pCIneoL(c). Puesto que no se dispone de anticuerpos contra la proteína L, no se pudo comprobar la expresión de L por inmunoquímica.
CAAAACAGCT A A G GTAAATAATACGGG-3'; nt 8332-8374) y 3LE(B) 5'-GTGAATCTAGAATGCCGGATCCG
TACGAATGC-3'; nt 8847-8870) en una reacción PCR utilizando el plásmido pGEM-L7a (Figura 4) como molde. La PCR fue llevada a cabo usando DNA polimerasa Pwo y consistía en 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 60ºC y 60 segundos a 72ºC. El fragmento de DNA resultante fue sometido a digestión con EcoRI y XbaI y fue clonado en pCIneo entre los sitios EcoRI y XbaI para generar el plásmido pCIneoL(N). Posteriormente, el fragmento BsiWI-SalI de pGEM-L7a, que contiene la parte restante del gen L (nt 8852-15.046), fue clonado en pCIneoL(N) entre los sitios BsiWI y SalI para generar el plásmido pCIneoL(c). Puesto que no se dispone de anticuerpos contra la proteína L, no se pudo comprobar la expresión de L por inmunoquímica.
Para mostrar inequívocamente que se puede
generar un virus infeccioso a partir de cDNA clonado de longitud
completa, se introdujo una etiqueta genética en el gen F mediante
mutagénesis por PCR. Con este fin, el gen F fue clonado utilizando
dos fragmentos de PCR solapantes. El primer fragmento de PCR fue
generado utilizando el cebador NDV5F (véase más arriba) y el
cebador F5R
(5'- AA A GCGCC G CTGTCTCC T CCC TCCAGATGTAGTCAC-3':
nt 4859-4894). Los restos mostrados en letra
negrita son cambios que se introdujeron en el cebador con objeto de
cambiar la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión
proteolítica entre F1 y F2, de la de la cepa LaSota de NDV
(GGRQGR| L)
a la del sitio de escisión de consenso para cepas de NDV virulentas (GRRQRR| F). El segundo fragmento de PCR fue generado usando los cebadores F3F (5'- GG A GGAGACAG C GGCGC T TT ATAGGCGCCATTATTGG-3'; nt 4875-4911) e IV09 (5'-CTCTGTCGACACAGACTACCAGAACTTTCAC-3'; nt 6246-6266). La PCR fue llevada a cabo con DNA polimerasa Pwo y consistía en 25 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 2 minutos a 72ºC. Los dos fragmentos de PCR solapantes (el solapamiento se muestra con letra cursiva en las secuencias de cebador) fueron unidos en una segunda PCR usando los cebadores NDV5F e IV09 y usando las mismas condiciones de PCR. El fragmento resultante, que contiene el marco de lectura abierto entero del gen F y que codifica un sitio de escisión virulento de consenso, fue sometido a digestión con NheI y SalI y fue clonado en pCIneo entre los sitios NheI y SalI para producir pCIneoF^{wt}. Se usó el fragmento StuI-NotI (nt 4646-4952) de pCIneoF^{wt} para sustituir el fragmento correspondiente en el plásmido p535-S que había sido construido al insertar el fragmento ClaI-ScaI (nt 3521-10311) de pGEM-B en p535DI, entre los sitios ClaI y ScaI (véase la Figura 4C). El plásmido resultante fue denominado p535-S[F^{wt}C]. Un fragmento de PCR que contenía el gen de resistencia a Cm de pACYC184 (véase más arriba) fue clonado como un fragmento XbaI en el sitio XbaI único (posición 6172 en la secuencia del NDV) del plásmido p535-S[F^{wt}C] para producir el plásmido p535-S[F^{wt}C]Cm. Posteriormente, el fragmento ApaI-SpeI marcado con Cm (nt 2285-8094) de este plásmido fue utilizado para sustituir el correspondiente fragmento del clon pNDFL+ de cDNA de longitud completa. Finalmente, el gen Cm fue eliminado de este plásmido por digestión con XbaI, seguida de recircularización usando DNA ligasa de T4. El plásmido resultante, que contiene el cDNA de NDV de longitud completa y genéticamente marcado, fue denominado pNDFL+[F^{wt}].
a la del sitio de escisión de consenso para cepas de NDV virulentas (GRRQRR| F). El segundo fragmento de PCR fue generado usando los cebadores F3F (5'- GG A GGAGACAG C GGCGC T TT ATAGGCGCCATTATTGG-3'; nt 4875-4911) e IV09 (5'-CTCTGTCGACACAGACTACCAGAACTTTCAC-3'; nt 6246-6266). La PCR fue llevada a cabo con DNA polimerasa Pwo y consistía en 25 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 2 minutos a 72ºC. Los dos fragmentos de PCR solapantes (el solapamiento se muestra con letra cursiva en las secuencias de cebador) fueron unidos en una segunda PCR usando los cebadores NDV5F e IV09 y usando las mismas condiciones de PCR. El fragmento resultante, que contiene el marco de lectura abierto entero del gen F y que codifica un sitio de escisión virulento de consenso, fue sometido a digestión con NheI y SalI y fue clonado en pCIneo entre los sitios NheI y SalI para producir pCIneoF^{wt}. Se usó el fragmento StuI-NotI (nt 4646-4952) de pCIneoF^{wt} para sustituir el fragmento correspondiente en el plásmido p535-S que había sido construido al insertar el fragmento ClaI-ScaI (nt 3521-10311) de pGEM-B en p535DI, entre los sitios ClaI y ScaI (véase la Figura 4C). El plásmido resultante fue denominado p535-S[F^{wt}C]. Un fragmento de PCR que contenía el gen de resistencia a Cm de pACYC184 (véase más arriba) fue clonado como un fragmento XbaI en el sitio XbaI único (posición 6172 en la secuencia del NDV) del plásmido p535-S[F^{wt}C] para producir el plásmido p535-S[F^{wt}C]Cm. Posteriormente, el fragmento ApaI-SpeI marcado con Cm (nt 2285-8094) de este plásmido fue utilizado para sustituir el correspondiente fragmento del clon pNDFL+ de cDNA de longitud completa. Finalmente, el gen Cm fue eliminado de este plásmido por digestión con XbaI, seguida de recircularización usando DNA ligasa de T4. El plásmido resultante, que contiene el cDNA de NDV de longitud completa y genéticamente marcado, fue denominado pNDFL+[F^{wt}].
Se usaron los plásmidos pCIneoNP, pCIneoP,
pCIneM, pCIneoF, pCIneoF^{wt} y pCIneoHN para la generación de
líneas celulares establemente transformadas que expresaran
individualmente estas proteínas. El día anterior a la transfección,
se sembraron células CER en placas de cultivo de 6 cm y se incubaron
durante la noche para obtener una confluencia de
60-80%. Las células fueron transfectadas con 2
\mug de DNA plasmídico usando 12 \mul de LipofectAmine y
OptiMem, esencialmente del modo descrito por el proveedor
(GibcoBRL/Life Technologies). Después de 48 horas, se trataron las
células con tripsina y se sembraron diluciones en placas de cultivo
de 10 cm, en un medio que contenía 500 \mug/ml de G418
(Boehringer Mannheim). Cada 3 días, el medio fue sustituido por
medio fresco que contenía cantidades crecientes (en pasos de 100
\mug/ml) de G418 hasta que se alcanzó una concentración de 800
\mug/ml. Se mantuvieron las células en el medio que contenía 800
\mug/ml de G418 y, tres semanas después de la transfección, se
recogieron colonias individuales y se transfirieron a placas de
cultivo de 96 pocillos. Las líneas celulares clonadas fueron
examinadas en cuanto a la expresión del respectivo gen de NDV
usando un IPMA del modo anteriormente descrito para los estudios de
expresión transitoria.
Las líneas celulares que expresaban
constitutivamente NP, P, M o F pudieron ser identificadas y
aisladas. Sin embargo, no fue posible generar líneas celulares que
expresaran la proteína HN. Quizás, la expresión constitutiva de HN
sea tóxica para las células.
El gen que codifica RNA polimerasa de T7 fue
recuperado del plásmido pRT7NT (René van Gennip,
ID-DLO, "Department of Mammalian Virology")
por digestión con EcoRI y SalI. El fragmento resultante contiene el
gen de RNA polimerasa de T7 situado detrás del promotor p10
baculovírico. El fragmento de DNA fue clonado en el plásmido pCIneo0
entre los sitios EcoRI y SalI para generar el plásmido pCIneo107.
El plásmido pCIneo0 carece del promotor de T7 y fue obtenido de
pCIneo por escisión con NheI seguida de escisión parcial con ScaI,
compleción de los extremos pegajosos con DNA polimerasa de Klenow y
recircularización utilizando DNA ligasa de T4. Las secuencias
baculovirales fueron separadas de pCIneo107 por digestión con EcoRI
y PacI, lo que fue seguido de un tratamiento con DNA polimerasa de
T4 para generar extremo romos, y recircularización. El plásmido
resultante fue denominado pCIneo007. La expresión de la RNA
polimerasa de T7 fue verificada mediante la cotransfección de
células con pCIneo007 y pPRh01. El segundo plásmido contiene la
proteína E2 del virus de la fiebre porcina clásica, clonada detrás
de un promotor de T7, y contiene un sitio interno de entrada al
ribosoma (Renné van Gennip; comunicación personal). La expresión de
E2 fue determinada mediante un IPMA usando el anticuerpo monoclonal
V4 (Wensvoort et al., 1986). Líneas celulares CER
establemente transformadas que expresaban RNA polimerasa de T7
fueron generadas y aisladas del modo anteriormente descrito salvo
porque se usaron placas de cultivo de 10 cm y se transfectaron las
células con 5 \mug de DNA de pCIneo007 y 25 \mul de
LipofectAmine. Para examinar las líneas celulares individuales en
cuanto a la expresión de RNA polimerasa de T7, se transfectaron con
el plásmido pPRh01 y se determinó la expresión de E2 (que depende
de la RNA polimerasa de T7) mediante un IPMA usando el anticuerpo
monoclonal V4. Se identificaron diversas líneas celulares que
expresaban RNA polimerasa de T7. Se usó una línea celular,
denominada CER-C9, en experimentos
subsiguientes.
Se utilizó el cebador 3UIT para sintetizar cDNA
de cadena sencilla de NDV y paramixovirus aviar de serotipos 2 y 4
(APMV2 y APMV4) del modo anteriormente descrito. Todas las
reacciones PCR subsiguientes fueron llevadas a cabo utilizando 25
ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 2 minutos a 72ºC.
La región de codificación entera del gen HN de APMV2 fue recuperada
por medio de una PCR usando los cebadores IV03
(5'-GGGGGAATTCCCCATTCAATGAAGGGTCTAC-3') e IV05
(5'-GATCCCCGGGTCTTAAACCAGGCTTCG
CAATG-3') que procedían de la secuencia del gen HN de APMV2 (GenBank, número de acceso: D14030). La región de codificación entera del gen HN de APMV4 fue recuperada por medio de una PCR usando los cebadores IV06 (5'-GGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3') e IV08 (5'-ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCAGGATCT
CAG-3') que procedían de la secuencia del gen HN de APMV4 (GenBank, número de acceso: D14031). Los fragmentos de PCR resultantes fueron sometidos a digestión (directamente o después de una subclonación en pGEM-T) con EcoRI y XmaI y fueron clonados en pCIneo entre los sitios EcoRI y XmaI. Los plásmidos resultantes fueron denominados pCIneoHN2 y pCIneoHN4, respectivamente.
CAATG-3') que procedían de la secuencia del gen HN de APMV2 (GenBank, número de acceso: D14030). La región de codificación entera del gen HN de APMV4 fue recuperada por medio de una PCR usando los cebadores IV06 (5'-GGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3') e IV08 (5'-ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCAGGATCT
CAG-3') que procedían de la secuencia del gen HN de APMV4 (GenBank, número de acceso: D14031). Los fragmentos de PCR resultantes fueron sometidos a digestión (directamente o después de una subclonación en pGEM-T) con EcoRI y XmaI y fueron clonados en pCIneo entre los sitios EcoRI y XmaI. Los plásmidos resultantes fueron denominados pCIneoHN2 y pCIneoHN4, respectivamente.
Se construyeron híbridos entre el gen HN de la
cepa LaSota de NDV y los genes HN de APMV2 y APMV4 por medio de una
PCR de solapamiento, del modo siguiente. La parte
N-terminal (aa 1-141) del gen HN de
la cepa LaSota de NDV fue multiplicada con DNA polimerasa Pwo
usando los cebadores IV01B (5'-GTAGGAATTCAA
GAGAGGCCGCCCCTCAAT-3': nt 6325-6354) e IV10 (5'- AATGAGTTCTTTGCCTATCCCCCC -3'; nt 6811-6834). La parte C-terminal del gen HN de APMV2 (aa 142-580) fue multiplicada con DNA polimerasa Pwo utilizando los cebadores IV11B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATT CAAGGAGATGCATCTGCAGGC-3') e IV05. Los fragmentos de PCR resultantes fueron unidos en una PCR de solapamiento (el solapamiento se muestra en letra cursiva) usando los cebadores IV01B e IV05 y usando la mezcla enzimática "Expand High Fidelity". El fragmento de PCR resultante fue sometido a digestión (directamente o después de una subclonación en pGEM-T) con EcoRI y XmaI y fue clonado en pCIneo entre los sitios EcoRI y XmaI. El plásmido resultante, que contiene un gen HN híbrido que consiste en los aminoácidos 1-141 de NDV y los aminoácidos 142-580 de APMV2, fue denominado pCIneoHN1/2^{141}.
GAGAGGCCGCCCCTCAAT-3': nt 6325-6354) e IV10 (5'- AATGAGTTCTTTGCCTATCCCCCC -3'; nt 6811-6834). La parte C-terminal del gen HN de APMV2 (aa 142-580) fue multiplicada con DNA polimerasa Pwo utilizando los cebadores IV11B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATT CAAGGAGATGCATCTGCAGGC-3') e IV05. Los fragmentos de PCR resultantes fueron unidos en una PCR de solapamiento (el solapamiento se muestra en letra cursiva) usando los cebadores IV01B e IV05 y usando la mezcla enzimática "Expand High Fidelity". El fragmento de PCR resultante fue sometido a digestión (directamente o después de una subclonación en pGEM-T) con EcoRI y XmaI y fue clonado en pCIneo entre los sitios EcoRI y XmaI. El plásmido resultante, que contiene un gen HN híbrido que consiste en los aminoácidos 1-141 de NDV y los aminoácidos 142-580 de APMV2, fue denominado pCIneoHN1/2^{141}.
La parte C-terminal del gen HN
de APMV4 (aa 143-569) fue multiplicada usando los
cebadores IV14B
(5-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATT GTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3')
e IV08. Este fragmento fue unido con la parte
N-terminal del gen HN de NDV (véase más arriba) en
una PCR de solapamiento utilizando los cebadores IV01B e IV08. El
fragmento de PCR resultante fue sometido a digestión (directamente
o después de una subclonación en pGEM-T) con EcoRI y
XmaI y fue clonado en pCIneo entre los sitios EcoRI y XmaI. El
plásmido resultante, que contiene un gen HN híbrido que consiste en
los aminoácidos 1-141 de NDV y los aminoácidos
143-569 de APMV4, fue denominado
pCIneoHN1/4^{141}.
Por analogía con las construcciones
anteriormente descritas, se construyeron genes HN híbridos que
consistían en los aminoácidos 1-143 de NDV y los
aminoácidos 144-580 de APMV2, o los aminoácidos
1-143 de NDV y los aminoácidos
145-569 de APMV4. Para estas construcciones, se
obtuvieron fragmentos de PCR usando los siguientes pares de
cebadores. Aminoácidos 1-143 de NDV: cebadores IV01B
e IV13 (5'-ATCTACAATGAGTTCTTTGCCTATC-3'; nt
6816-6840); aminoácidos 144-580 de
APMV2: cebadores IV14B
(5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTA GAT
GATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') e IV05; aminoácidos 145-569 de APMV4: cebadores IV15B (5'-GGGG GGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGAT CAAACAGCTGACTACACAGCAG-3') e IV08. Los fragmentos de PCR fueron sometidos a digestión (directamente o después de una subclonación en pGEM-T) con EcoRI y XmaI y fueron clonados en pCIneo entre los sitios EcoRI y XmaI. Los plásmidos resultantes fueron denominados pCIneo1/2^{143} y pCIneo1/4^{143}, respectivamente. Para examinar la expresión de las proteínas HN, se infectaron células CER o células QM5 con FPV-T7 durante 1 hora, con una multiplicidad de infección de 1, y se transfectaron con los plásmidos pCIneoHN, pCIneoHN2, pCIneoNH4, pCIneoNH1/2^{141}, pCIneoNH1/2^{143}, pCIneoNH1/4^{141} y pCIneoNH1/4^{143}, y, 24 horas después de la transfección, las monocapas fueron cubiertas con una suspensión de eritrocitos de gallina al 1% en disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline), durante 45 minutos a temperatura ambiental. Posteriormente, se lavaron cuidadosamente las monocapas tres veces con PBS y se examinó microscópicamente la adhesión de los eritrocitos a las células transfectadas. Para examinar la inducción de la fusión celular después de la coexpresión de las proteínas HN y F, se cotransfectaron células CER o células QM5 con pCIneoF^{wt} junto con pCIneoHN1, pCIneoHN2, pCIneoNH4, pCIneoNH1/2^{141}, pCIneoNH1/4^{141}, pCIneoNH1/2^{143} o pCIneoNH1/4^{143}. Después de una incubación durante 2 ó 3 días, las monocapas fueron lavadas con PBS, teñidas durante 15 minutos con una disolución de Giemsa (dilución 1:30 en agua) y examinadas microscópicamente.
GATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') e IV05; aminoácidos 145-569 de APMV4: cebadores IV15B (5'-GGGG GGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGAT CAAACAGCTGACTACACAGCAG-3') e IV08. Los fragmentos de PCR fueron sometidos a digestión (directamente o después de una subclonación en pGEM-T) con EcoRI y XmaI y fueron clonados en pCIneo entre los sitios EcoRI y XmaI. Los plásmidos resultantes fueron denominados pCIneo1/2^{143} y pCIneo1/4^{143}, respectivamente. Para examinar la expresión de las proteínas HN, se infectaron células CER o células QM5 con FPV-T7 durante 1 hora, con una multiplicidad de infección de 1, y se transfectaron con los plásmidos pCIneoHN, pCIneoHN2, pCIneoNH4, pCIneoNH1/2^{141}, pCIneoNH1/2^{143}, pCIneoNH1/4^{141} y pCIneoNH1/4^{143}, y, 24 horas después de la transfección, las monocapas fueron cubiertas con una suspensión de eritrocitos de gallina al 1% en disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline), durante 45 minutos a temperatura ambiental. Posteriormente, se lavaron cuidadosamente las monocapas tres veces con PBS y se examinó microscópicamente la adhesión de los eritrocitos a las células transfectadas. Para examinar la inducción de la fusión celular después de la coexpresión de las proteínas HN y F, se cotransfectaron células CER o células QM5 con pCIneoF^{wt} junto con pCIneoHN1, pCIneoHN2, pCIneoNH4, pCIneoNH1/2^{141}, pCIneoNH1/4^{141}, pCIneoNH1/2^{143} o pCIneoNH1/4^{143}. Después de una incubación durante 2 ó 3 días, las monocapas fueron lavadas con PBS, teñidas durante 15 minutos con una disolución de Giemsa (dilución 1:30 en agua) y examinadas microscópicamente.
Se insertó un conector sintético, denominado
HN12, entre los sitios NotI y SpeI de pGEM-T
(Promega) usando los oligonucleótidos HN12a
(5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGACTTA-3')
y HN12b (5'-CTAGTAAGTCGT
TAACTCTAGAATATGC-3'). Se insertó un conector sintético, denominado HN14, entre los sitios NotI y SpeI de pGEM-T usando los oligonucleótidos HN14a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3') y HN14b (5'-CTAGTC
GTTAACTCTAGAATATGC-3'). Los plásmidos resultantes fueron denominados pGEM-HN12 y pGEM-HN14, respectivamente. Estos plásmidos fueron sometidos a digestión con NotI y XbaI y fueron utilizados para clonar el fragmento NotI-SpeI (nt 3390-7488) del plásmido p535-S[F^{wt}c]Cm. Los plásmidos resultantes fueron denominados pGEM-HN1/2NS y pGEM-HN1/4NS, respectivamente. Los genes HN de estos plásmidos fueron sustituidos por los genes HN híbridos de los plásmidos pCIneoHN1/2^{143} y pCIneoHN1/4^{143}, respectivamente (véase la sección "Clonación y expresión de genes HN y genes HN híbridos"). Con este fin, se sometieron pCIneoHN1/2^{143} y pCIneoHN1/4^{143} a digestión con NheI y SmaI y se clonaron los fragmentos resultantes (que contenían los genes HN1/2^{143} y HN1/4^{143} híbridos) entre los sitios NheI y HpaI de los plásmidos pGEM-HN1/2NS y pGEM-HN1/4NS para dar lugar a pGEM+HN12 y pGEM+HN14, respectivamente. Los últimos plásmidos fueron utilizados para introducir los genes HN híbridos en el clon de cDNA genómico de longitud completa de NDV. Con este fin, se sometieron los plásmidos pGEM+HN12 y pGEM+HN14 a digestión con NotI y SpeI y se utilizó el fragmento que contenía el gen HN12 o HN14 para sustituir el correspondiente fragmento de pNDFL+, para producir pNDFL+HN1/2^{143} Cm y pNDFL+HN1/4^{143} Cm, respectivamente. Se eliminó el gen Cm de estos plásmidos por digestión con XbaI, seguida de recircularización usando DNA ligasa de T4. Con objeto de cumplir la "regla del seis", se insertó un conector en el sitio SpeI único de estos plásmidos usando oligonucleótidos autocomplementarios. Se insertó el conector H2 (5'-CTAGCGAGCGCTCG-3') en el plásmido pNDFL+HN1/2^{143} y se insertó el conector H3 (5'-CTAGCGAGCWGCTCG-3) en pNDFL+HN1/4^{143} para obtener los plásmidos pNDFL+HN1/2^{143}(H2) y pNDFL+HN1/2^{143}(H3), respectivamente.
TAACTCTAGAATATGC-3'). Se insertó un conector sintético, denominado HN14, entre los sitios NotI y SpeI de pGEM-T usando los oligonucleótidos HN14a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3') y HN14b (5'-CTAGTC
GTTAACTCTAGAATATGC-3'). Los plásmidos resultantes fueron denominados pGEM-HN12 y pGEM-HN14, respectivamente. Estos plásmidos fueron sometidos a digestión con NotI y XbaI y fueron utilizados para clonar el fragmento NotI-SpeI (nt 3390-7488) del plásmido p535-S[F^{wt}c]Cm. Los plásmidos resultantes fueron denominados pGEM-HN1/2NS y pGEM-HN1/4NS, respectivamente. Los genes HN de estos plásmidos fueron sustituidos por los genes HN híbridos de los plásmidos pCIneoHN1/2^{143} y pCIneoHN1/4^{143}, respectivamente (véase la sección "Clonación y expresión de genes HN y genes HN híbridos"). Con este fin, se sometieron pCIneoHN1/2^{143} y pCIneoHN1/4^{143} a digestión con NheI y SmaI y se clonaron los fragmentos resultantes (que contenían los genes HN1/2^{143} y HN1/4^{143} híbridos) entre los sitios NheI y HpaI de los plásmidos pGEM-HN1/2NS y pGEM-HN1/4NS para dar lugar a pGEM+HN12 y pGEM+HN14, respectivamente. Los últimos plásmidos fueron utilizados para introducir los genes HN híbridos en el clon de cDNA genómico de longitud completa de NDV. Con este fin, se sometieron los plásmidos pGEM+HN12 y pGEM+HN14 a digestión con NotI y SpeI y se utilizó el fragmento que contenía el gen HN12 o HN14 para sustituir el correspondiente fragmento de pNDFL+, para producir pNDFL+HN1/2^{143} Cm y pNDFL+HN1/4^{143} Cm, respectivamente. Se eliminó el gen Cm de estos plásmidos por digestión con XbaI, seguida de recircularización usando DNA ligasa de T4. Con objeto de cumplir la "regla del seis", se insertó un conector en el sitio SpeI único de estos plásmidos usando oligonucleótidos autocomplementarios. Se insertó el conector H2 (5'-CTAGCGAGCGCTCG-3') en el plásmido pNDFL+HN1/2^{143} y se insertó el conector H3 (5'-CTAGCGAGCWGCTCG-3) en pNDFL+HN1/4^{143} para obtener los plásmidos pNDFL+HN1/2^{143}(H2) y pNDFL+HN1/2^{143}(H3), respectivamente.
Se eliminó un epítopo específico, es decir, los
aminoácidos 346 a 354 (PDEQDYQIR) de la proteína HN de NDV LaSota,
que es reconocido por el anticuerpo monoclonal 4D6 (Long et
al., 1986; Meulemans et al., 1986), al sustituir esta
secuencia por la correspondiente secuencia de la proteína HN de
APMV-2 (NRTDIQQTI) o APMV-4
(PDPLQDQIL). Con este fin, se usó el plásmido pCIneoHN (véase la
sección "Clonación y expresión de genes individuales de NDV")
como molde para crear fragmentos de PCR solapantes. Para la
secuencia de APMV-2, se generó el primer fragmento
de PCR al usar los cebadores IV01
(5'-GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3')
y 3HN2
(5'-GATAGTTTGCTGTATATCAGTCCGATTGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3').
Se generó el segundo fragmento de PCR al usar los cebadores 5HN2
(5'-AATCGGACTGATATACAGCAAACTATCATGGC
CAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') y NDV3-HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3'). Los fragmentos resultantes fueron combinados y fueron usados como molde para una tercera PCR usando los cebadores IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') y NDV3-HN. Para la secuencia de APMV-4, se generó el primer fragmento de PCR al usar los cebadores IV01 y 3HN4 (5'-TAAGATCTGATCTTGCAGCGGGT
CAGGGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3'). Se generó el segundo fragmento de PCR al utilizar los cebadores 5HN4 (5'-CCTGACCGCTGCAAGATCAGATCTTAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') y NDV3-HN. Los fragmentos resultantes fueron combinados y fueron usados como molde para una tercera PCR usando los cebadores IV01B y NDV3-HN. Los cebadores 3HN2/5HN2 y 3HN4/5HN4 son parcialmente complementarios y contienen los códigos genéticos para la secuencia HN2 (NRTDIQQTI) y la secuencia HN4 (PDPLQDQIL), respectivamente. Las reacciones PCR fueron llevadas a cabo usando el sistema Expand (Boehringer Mannheim) de PCR con molde largo. La PCR consistía en 30 ciclos de 10 segundos a 94ºC, 30 segundos a 58ºC y dos minutos a 68ºC, seguidos de un ciclo de 4 minutos a 68ºC. Los fragmentos de PCR fueron sometidos a digestión con EcoNI y Bsu36I y fueron clonados entre los sitios EcoNI y Bsu36I de pCIneoHN. Los plásmidos resultantes fueron denominados pCIneoHN1(HN2e) y pCIneoHN1(HN4e), respectivamente. Estudios sobre expresión transitoria indicaban que las proteínas HN modificadas eran correctamente expresadas y transportadas a la superficie celular, según se juzgaba por estudios de hemoadsorción usando eritrocitos de gallina. Además, el anticuerpo monoclonal 6D4, que se dirige contra un epítopo lineal de HN de NDV que consiste en (o al menos incluye) los aminoácidos 346-354, no reaccionó con las proteínas HN modificadas.
CAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') y NDV3-HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3'). Los fragmentos resultantes fueron combinados y fueron usados como molde para una tercera PCR usando los cebadores IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') y NDV3-HN. Para la secuencia de APMV-4, se generó el primer fragmento de PCR al usar los cebadores IV01 y 3HN4 (5'-TAAGATCTGATCTTGCAGCGGGT
CAGGGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3'). Se generó el segundo fragmento de PCR al utilizar los cebadores 5HN4 (5'-CCTGACCGCTGCAAGATCAGATCTTAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') y NDV3-HN. Los fragmentos resultantes fueron combinados y fueron usados como molde para una tercera PCR usando los cebadores IV01B y NDV3-HN. Los cebadores 3HN2/5HN2 y 3HN4/5HN4 son parcialmente complementarios y contienen los códigos genéticos para la secuencia HN2 (NRTDIQQTI) y la secuencia HN4 (PDPLQDQIL), respectivamente. Las reacciones PCR fueron llevadas a cabo usando el sistema Expand (Boehringer Mannheim) de PCR con molde largo. La PCR consistía en 30 ciclos de 10 segundos a 94ºC, 30 segundos a 58ºC y dos minutos a 68ºC, seguidos de un ciclo de 4 minutos a 68ºC. Los fragmentos de PCR fueron sometidos a digestión con EcoNI y Bsu36I y fueron clonados entre los sitios EcoNI y Bsu36I de pCIneoHN. Los plásmidos resultantes fueron denominados pCIneoHN1(HN2e) y pCIneoHN1(HN4e), respectivamente. Estudios sobre expresión transitoria indicaban que las proteínas HN modificadas eran correctamente expresadas y transportadas a la superficie celular, según se juzgaba por estudios de hemoadsorción usando eritrocitos de gallina. Además, el anticuerpo monoclonal 6D4, que se dirige contra un epítopo lineal de HN de NDV que consiste en (o al menos incluye) los aminoácidos 346-354, no reaccionó con las proteínas HN modificadas.
Se sometieron los plásmidos
pCIneoHN1(HN2e) y pCIneoHN1(HN4e) a digestión con NarI
y SpeI, y los fragmentos que contenían los genes HN modificados
fueron clonados entre los sitios NarI y SpeI de
pGEM-HN1/2NS y pGEM-HN1/4NS,
respectivamente. Los plásmidos resultantes, denominados
pGEM-HN1(HN2e) y
pGEM-HN1(HN4e), fueron sometidos a digestión
con NotI y SpeI y fueron usados para sustituir el fragmento
NotI-SpeI en pNDFL+. Los plásmidos resultantes
fueron denominados pNDFL-HN(HN2e)Cm y
pNDFL-HN(HN4e)Cm, respectivamente. El
gen Cm fue eliminado de estos plásmidos por digestión con XbaI,
seguida de religación. Los plásmidos resultantes fueron denominados
pNDFL-HN(HN2e) y
pNDFL-HN(HN4e), respectivamente.
Se ha publicado la secuencia de un supuesto
extremo 3' del genoma de NDV (Ishida et al., 1986), aunque de
una cepa (D26) de NDV distinta a la aquí usada (LaSota). Yusoff
et al. (1987) han publicado una secuencia del gen L y de una
región no codificadora relativamente grande situada detrás del gen L
de la cepa Beaudette C de NDV. Sin embargo, como se muestra aquí,
esta secuencia no incluía el extremo 5'-terminal
completo del genoma vírico, lo que hace imposible generar una copia
infecciosa de NDV. Los extremos 3'- y 5'-terminales
del genoma de virus RNA de cadena negativa desempeñan una función
esencial en la replicación y la transcripción (Lamb y Kolakofsky,
1996). Por lo tanto, para generar un cDNA de NDV de longitud
completa que pueda ser utilizado para generar un virus infeccioso
por medio de genética inversa (Conzelmann, 1996), es absolutamente
esencial incluir los extremos 3' y 5' correctos del genoma vírico.
Por consiguiente, se determinó la secuencia nucleotídica exacta de
ambos extremos, 3' y 5', del RNA genómico de la cepa LaSota de NDV
usando procedimientos RACE (multiplicación rápida de extremos de
cDNA) 3' y 5'. El extremo 5' fue recuperado por medio de una PCR
después de la ligación de un cebador de anclaje (ALG3) de cadena
sencilla a un cDNA de cadena sencilla que fue generado por
transcripción inversa del extremo 5' del RNA genómico. Al utilizar
un cebador (ALG4) que es complementario del cebador de anclaje y un
cebador específico de NDV, se generaron productos de PCR que
contenían el extremo 5'.
Para clonar el extremo 3' de NDV, el cebador de
anclaje ALG3 de cadena sencilla fue ligado al extremo 3' del RNA
vírico utilizando RNA ligasa de T4 y fue multiplicado por medio de
una PCR en que se usó el cebador ALG4 y un cebador específico de
NDV (método I). Alternativamente, los extremos 3' y 5' del RNA de
NDV fueron ligados entre sí utilizando RNA ligasa de T4, y el RNA
concatenado resultante fue utilizado en RT-PCR
usando cebadores específicos de NDV que flanqueaban el punto de
ligación (método II). Los productos de RACE 3' y 5' fueron clonados
en el vector T pBluescript II-TSK (Ichihara y
Kurosawa, 1993) o en pGEM4Z, y se aislaron y secuenciaron varios
clones independientes. Los resultados están compilados en la Tabla
2. Para permitir la comparación directa de los extremos 3'- y
5-terminales, las secuencias se muestran en forma de
cDNA y el extremo 3' de la cadena genómica es representado como
extremo 5' de la cadena antigenómica. A nivel de RNA genómico, la
secuencia del extremo 3' se lee 3'-UGGUUUGUCUCUUAG
mientras que la secuencia del extremo 5' se lee
UUUAGAAACAAACCA-5'. La secuencia del extremo 3' es
casi similar a la secuencia 3'-terminal publicada de
la cepa D26 de NDV (Ishida et al., 1986). Sin embargo, la
secuencia del extremo 5' mostró que la cepa LaSota de NDV contiene
64 nucleótidos adicionales en comparación con la secuencia
publicada del gen L de la cepa Beaudette C de NDV (Yusoff et
al., 1987) (Figura 6).
Para determinar si los extremos 3' y 5' de NDV
son funcionales en cuanto a la replicación y la transcripción, se
construyeron minigenomas que consistían en el extremo 3' de NDV (nt
1-119), un gen informador que codificaba fosfatasa
alcalina secretada (SEAP), y el extremo 5' de NDV (nt
14.973-15.186) (Figura 2). Estos minigenomas fueron
clonados en ambas orientaciones en el vector de transcripción pOLTV5
para generar los plásmidos pOLTV535 y pOLTV553, respectivamente
(para detalles acerca de la construcción, véase "Materiales y
Métodos"). El plásmido pOLTV5 (Figura 1) contiene el promotor de
RNA polimerasa de T7 seguido de sitios de restricción StuI y SmaI
únicos, la ribozima autocatalítica del virus delta de la hepatitis
(HDV), y la señal de terminación de la transcripción del
bacteriófago T7 (Pattnaik et al., 1992). Usando RNA
polimerasa de T7, la transcripción in vivo o in vitro
del plásmido pOLTV535 da lugar a RNA antigenómico (o
[+]-RNA), mientras que la transcripción del
plásmido pOLTV553 da lugar a RNA genómico (o
[-]-RNA) (Figura 5).
Para examinar si los RNAs minigenómicos
generados por los plásmidos pOLTV535 y pOLTV553 podían replicarse y
expresarse usando NDV como virus auxiliar, se utilizaron células CER
que expresaban RNA polimerasa de T7, ya fuera constitutivamente
(células CER-C9; véase "Materiales y Métodos")
o ya fuera después de una infección con fpEFLT7pol recombinante de
viruela aviar (Britton et al., 1995; en adelante llamado
FPV-T7) que expresa RNA polimerasa de T7. Las
células CER-C9 y las células CER infectadas con
FPV-T7 fueron transfectadas con el plásmido
minigenómico pOLTV535 o pOLTV553 y, después de una incubación
durante 3 horas a 37ºC, las células fueron infectadas con NDV
durante 1 hora o fueron dejadas sin infectar. Aproximadamente 24
horas después de la transfección, se extrajo una muestra del medio
y se analizó la actividad SEAP. Los resultados mostraron que la
expresión de SEAP era muy elevada en las células infectadas con
FPV-T7 que fueron transfectadas con pOLTV535. Esto
no es sorprendente ya que la transcripción por RNA polimerasa de T7
genera [+]-RNA antigenómico que es terminalmente
rematado por enzimas del virus de la viruela aviar y que es
eficazmente traducido por la célula huésped. En las células
transfectadas con pOLTV553, la transcripción por RNA polimerasa de
T7 genera [-]-RNA genómico que debe ser convertido
en [+]-RNA por el virus auxiliar para que sea
traducido en una proteína SEAP (véase la Figura 5). En ambos casos,
no se pudo observar un aumento de expresión de SEAP en las células
infectadas con NDV en comparación con las células no infectadas. Por
el contrario, la expresión de SEAP en las células infectadas con
NDV fue consistentemente cerca de dos veces menor que en las células
no infectadas (resultados no mostrados). Para las células
transfectadas con pOLTV535, esto puede explicarse por el ya
elevadísimo nivel de expresión de SEAP por los transcritos
generados por RNA polimerasa de T7. Sin embargo, en las células
transfectadas con pOLTV553, donde la expresión eficaz de SEAP
depende de la conversión de [-]-RNA genómico en
[+]-RNA antigenómico o mRNA por el complejo de
polimerasa vírico, se había esperado un aumento de la expresión de
SEAP después de la infección con NDV. Se podía pensar en dos razones
por las que los minigenomas no podían ser expresados y replicados
por NDV. En primer lugar, el tamaño de los RNAs minigenómicos no se
ajusta a la llamada "regla del seis" (Calain y Roux, 1993;
Kolakofsky et al., 1998). De acuerdo con esta regla, los
genomas de paramixovirus sólo se replican eficazmente cuando tienen
una longitud de 6n nucleótidos. En segundo lugar, los dos restos G
extra que están presentes en el extremo 5' de los RNAs minigenómicos
podrían interferir en la replicación y/o transcripción correctas
por el complejo de polimerasa vírica. Para averiguar si la
replicación de los genomas dependía de la regla del seis, se
insertó una serie de oligonucleótidos autocomplementarios cortos,
con un tamaño creciente en 1 nt, en el sitio ClaI único de los
plásmidos pOLTV535 y pOLTV553 (Figura 2). Los plásmidos resultantes
(pOLTV535-N0 a -N5 y pOLTV553-N0 a
-N5) tenían un tamaño que difería en de 1 a 6 nt y, por lo tanto,
uno de ellos debería generar un RNA minigenómico que se ajustara a
la regla del seis. Los plásmidos fueron utilizados para transfectar
células CER o células CER-C9 infectadas con
FPV-T7 del modo anteriormente descrito. Los
resultados mostraron que sólo los plásmidos pOLTV535N3 y pOLTV553N3
daban lugar a una actividad SEAP aumentada después de la infección
con NDV. Se calculó que la longitud de los RNAs minigenómicos
generados por RNA polimerasa de T7 a partir de estos plásmidos era
6n+2. Puesto que están presentes dos restos G extra en el extremo
5' de los RNAs minigenómicos, estos resultados sugieren que, para la
regla del seis, sólo es relevante el tamaño de la secuencia de RNA
que está situada entre los extremos 3' y 5' auténticos de los RNAs
minigenómicos. Esto fue verificado construyendo plásmidos
minigenómicos en que el inicio de la transcripción de la RNA
polimerasa de T7 fue cambiado para que el primer nucleótido que se
incorporara al RNA fuera el primer nucleótido del extremo 3' o 5'
de NDV (véase "Materiales y Métodos"). La transfección con
estos plásmidos indicó que sólo los RNAs minigenómicos generados por
los plásmidos pOLTV735N3 y pOLTV753N3 se replican mediante un virus
auxiliar (resultados no mostrados). Estos hallazgos indican de nuevo
que la replicación de NDV depende estrictamente de la regla del
seis. Además, estos hallazgos indican que la presencia de dos
restos G extra en el extremo 5' de los RNAs minigenómicos no
interfiere en la correcta replicación. Se han obtenido resultados
similares con plásmidos minigenómicos (o plásmidos DI) procedentes
de otros Paramyxoviridae (Pattnaik et al., 1992; Harty y
Palese, 1995).
Para determinar si un virus auxiliar podía
empaquetar RNAs minigenómicos, el medio de las células transfectadas
fue transferido a monocapas frescas y, después de 1 hora de
adsorción, las monocapas fueron lavadas tres veces con PBS y fueron
adicionalmente incubadas en medio completo. Después de 24 horas de
incubación, se midió la actividad SEAP en el medio. Los resultados
mostraron que sólo estaba presente actividad SEAP en las células
que habían sido tratadas con el medio procedente de células
transfectadas con el plásmido minigenómico pOLTV553N3 (Tabla 4).
Este hallazgo indica que RNAs minigenómicos pueden resultar
empaquetados en envolturas de NDV y que estas partículas son
capaces de infectar células. Además, estos resultados muestran que
el empaquetamiento depende de la replicación, lo que indica que
sólo las moléculas de RNA que están complejadas con las proteínas
NP, P y L virales resultan empaquetadas en partículas de tipo
viral.
Para determinar si los RNAs minigenómicos
también se podían replicar mediante plásmidos que codificaran las
proteínas esenciales NP, P y L, se llevaron a cabo experimentos de
cotransfección en células infectadas con FPV-T7.
Las células fueron transfectadas con una combinación de plásmidos
que consistía en el plásmido minigenómico y los plásmidos
pCIneo-NP, -P y -L(c), respectivamente. Como
testigo negativo, se sustituyó pCIneoL(c), que codifica la
proteína esencial L, por el vector plasmídico pCIneo. Los resultados
(Tabla 5) indican que, en efecto, los plásmidos que codifican NP, P
y L son capaces de replicar RNAs minigenómicos. Los resultados
muestran además que, similarmente a la replicación de minigenomas
por un virus auxiliar, la replicación por las proteínas NP, P y L
también depende de la regla del seis.
Por medio de RT-PCR, se
construyeron fragmentos de cDNA subgenómicos que abarcaban el genoma
entero de NDV (Figura 4). Para mantener el número de errores de la
PCR en un valor mínimo, se utilizó una mezcla enzimática con
actividad correctora de errores ("Expand Long Template";
Boehringer Mannheim), en combinación con un número limitado de
ciclos de PCR (15 ciclos). Para la transcripción inversa se utilizó
el cebador 3UIT, que es complementario del extremo 3' del RNA de
NDV, y, para la PCR, se utilizaron cebadores génicamente
específicos. Para identificar posibles errores en la PCR, se
llevaron a cabo tres reacciones RT independientes que se utilizaron
para generar tres conjuntos independientes de cDNAs subgenómicos.
Los cDNAs, cuyo tamaño variaba de aproximadamente 4 a 7 kb, fueron
clonados en pGEM-T. La secuencia nucleotídica de los
dos conjuntos de cDNAs fue determinada utilizando cebadores que se
dedujeron de secuencias de NDV publicadas, o mediante cebadores
derivados de la secuencia de NDV que se dedujo durante este
proyecto de secuenciación (Tabla 1). Las ambigüedades restantes
fueron resueltas secuenciando las regiones relevantes del tercer
conjunto de clones de cDNA. El genoma de la cepa LaSota de NDV
consiste en 15.186 nucleótidos (Figura 3), lo que le convierte en el
más pequeño de todos los genomas paramixovíricos para los que se ha
establecido la secuencia entera hasta la fecha (Kolakofsky et
al., 1998).
Para construir un clon de cDNA de longitud
completa de la cepa LaSota de NDV, clones de cDNA solapantes que
abarcaban el genoma entero de NDV fueron unidos en sitios de
restricción compartidos de acuerdo con la estrategia mostrada en la
Figura 4. El cDNA de NDV entero fue ensamblado en el plásmido
minigenómico pOLTV535 (véase más arriba), que procede del plásmido
de transcripción pOLTV5. Como se puede ver en la Figura 4B, en el
ensamblaje del cDNA de NDV completo, la última operación fue la
clonación de un fragmento ClaI de aproximadamente 8,8 kb (nt
3521-12.355) procedente de pGEM-B en
p535-DI que contenía las secuencias de NDV que
flanquean el sitio ClaI en ambos lados (es decir, nt
1-3521 y 12355-15186,
respectivamente). Se vio que esta operación era bastante difícil ya
que se falló repetidamente a la hora de generar los clones
correctos. Por lo tanto, el fragmento ClaI de
pGEM-B fue marcado con el gen de resistencia al
cloranfenicol (Cm) procedente del plásmido pACYC184. El fragmento
ClaI que contiene el gen Cm fue aislado y fue clonado en el sitio
ClaI de p535DI, y los transformantes fueron seleccionados en cuanto
a la resistencia frente a ambos Cm. Puesto que los transformantes
crecían mal, se redujo la selección por antibióticos a 15 \mug/ml
de Cm y 10 \mug/ml de Km y se redujo la temperatura de
incubación, de 37ºC a 32ºC. Finalmente, el gen Cm fue eliminado de
este plásmido por digestión con BsiWI, lo que fue seguido de
recircularización utilizando DNA ligasa de T4. Después de la
transformación de E. coli, las células que contenían el
plásmido deseado fueron fenotípicamente identificadas explorando la
resistencia a Km y la sensibilidad a Cm. El plásmido resultante,
que consistía en el cDNA de NDV de longitud completa clonado entre
los sitios SmaI y StuI del plásmido de transcripción pOLTV5, fue
denominado pNDFL+.
Para generar totalmente NDV infeccioso a partir
de cDNA clonado, se usó el plásmido pNDFL+ en experimentos de
cotransfección con pCIneo-NP, -P y -L(c) del
modo anteriormente descrito para los plásmidos minigenómicos. La
transfección de células CER y CEF fue controlada utilizando el
plásmido minigenómico pOLTV553N3 y midiendo la expresión de SEAP.
Como testigo negativo, se sustituyó pCIneoL(c) por pCIneo.
Después de la cotransfección, las células fueron incubadas durante
un periodo de 3 a 6 días en un medio que contenía fluido alantoico
al 5%. La adición de fluido alantoico es necesaria porque las
células CER o CEF carecen de las apropiadas proteasas que son
necesarias para escindir la proteína F de la cepa LaSota de NDV. La
escisión de la proteína F es absolutamente necesaria para la
propagación de célula a célula y para la generación del virus
infeccioso. Después de 3 días de cultivo, se llevó a cabo una
tinción inmunológica de las monocapas fijadas, utilizando un
anticuerpo monoclonal contra la proteína F. Los resultados
mostraron que las células que resultaron teñidas con el anticuerpo
sólo estaban presentes en las monocapas que habían sido
cotransfectadas con pNDFL(+), pCIneo-NP, -P y
-L(c). Estos resultados indicaban que en estas células se
estaban produciendo replicación y expresión de genoma. Se observaron
células sin tinción cuando, en los experimentos de cotransfección,
se sustituyó pCIneoL(c) por pCIneo. Para recuperar el virus
infeccioso, el sobrenadante de las monocapas de CEF transfectadas
fue inyectado en la cavidad alantoica de huevos fecundados. Cuatro
días más tarde, el fluido alantoico fue recolectado, analizado en un
ensayo de hemaglutinación y sometido a pases adicionales por
huevos. Los resultados mostraron que sólo el sobrenadante de las
células transfectadas con una combinación de pNDFL+ y
pCIneo-NP, -P y -L(c) produjo una reacción
positiva en el ensayo de hemaglutinación. El fluido alantoico que
mostró una reacción de hemaglutinación positiva fue posteriormente
analizado en un ensayo de inhibición de la hemaglutinación
utilizando los anticuerpos monoclonales 7B7, 8C11, 5A1, 7D4 y 4D6
(Long et al., 1986), que pueden ser usados para diferenciar
distintas Cepas de NDV. Los resultados de este ensayo indicaban que
la cepa de NDV que fue recuperada de los huevos que habían recibido
inóculo mostraba la misma reactividad que la cepa LaSota original.
El virus que fue recuperado de los huevos que habían recibido
inóculo fue denominado NDFL para distinguirlo de la cepa LaSota
original.
Para mostrar inequívocamente que el sistema de
cotransfección podía ser utilizado para recuperar un virus
infeccioso a partir de cDNA clonado de NDV, de longitud completa, se
introdujo una etiqueta genética en el plásmido pNDFL(+). Con esta
finalidad, la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión por
proteasas de la proteína Fo fue cambiada, de la secuencia de la
cepa LaSota (GGRQGR| L) a la secuencia de consenso de las cepas
de NDV virulentas (GRRQRR| F) por medio de mutagénesis por PCR
(para detalles, véase "Materiales y Métodos"). El plásmido
resultante, pNDFL+[F^{wt}], fue utilizado para generar el virus
utilizando el sistema de cotransfección anteriormente descrito. El
virus infeccioso, denominado NDFL[F^{wt}], fue recuperado
del fluido alantoico de los huevos fecundados a los que se había
inoculado el medio de células CEF cotransfectadas. En un ensayo de
HI, todos los anticuerpos monoclonales, incluyendo 7D4 que es
específico para la cepa LaSota, mostraron la misma reactividad con
el virus recién generado que con la cepa LaSota original. La
secuencia nucleotídica de la región que codifica el sitio de
escisión por proteasas de la proteína F fue determinada por medio de
RT-PCR. Los resultados mostraron que la secuencia
nucleotídica contenía los cambios nucleotídicos exactos que se
introdujeron en el cebador mutagénico que fue utilizado para
modificar la secuencia original de LaSota. Este hallazgo muestra
que el virus procedía del plásmido pNDFL+[F^{wt}] y demuestra que,
a partir de cDNA clonado de NDV, de longitud completa, se puede
generar completamente el NDV (genéticamente modificado).
Se supone generalmente que la secuencia de
aminoácidos del sitio de escisión por proteasas de la proteína Fo
es un determinante esencial para la virulencia de las diferentes
cepas de NDV. La generación de una cepa LaSota genéticamente
modificada en que la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión
por proteasas estaba cambiada, de la secuencia de una cepa de NDV
lentogénica (no virulenta) a la de una velogénica (virulenta),
ofrecía la oportunidad única para probar esta suposición. Por lo
tanto, se determinó el índice de patogenicidad intracerebral (ICPI)
del virus NDFL[F^{wt}] recién generado y se comparó con el
de la cepa NDFL y con el de la cepa LaSota original (clon
E13-1). Los resultados mostraron que el ICPI de la
cepa NDFL[F^{wt}] era 1,3, el cual está muy por encima del
valor para las cepas NDFL (ICPI = 0,0) y el clon
E13-1 (ICPI = 0,3). Estos resultados muestran que,
como se esperaba, la virulencia del NDV viene determinada en gran
medida por la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión por
proteasas de la proteína Fo.
Las glicoproteínas F y HN de la envoltura del
NDV son las proteínas más inmunogénicas del virus. Después de una
infección, tanto la proteína F como la HN provocan una potente
respuesta de anticuerpos neutralizantes. La inducción de dicha
respuesta de anticuerpos neutralizantes es la base de una vacunación
exitosa mediante cepas de NDV no virulentas (tal como la muy
utilizada cepa LaSota). Sin embargo, la respuesta de anticuerpos
contra las cepas de vacuna de NDV no puede distinguirse de la
respuesta de anticuerpos contra cepas de campo virulentas de NDV.
Por lo tanto, las infecciones con virus de campo virulentos no
pueden ser rastreadas mediante métodos serológicos. Esta situación
es indeseable ya que las infecciones por virus de campo son
enmascaradas por la vacunación, y los síntomas clínicos causados
por las cepas de campo pueden ser pasados por alto o ser incluso
atribuidos a la vacuna. Puesto que una diferenciación exitosa entre
vacunación e infección es esencial para la erradicación del NDV, se
puso en marcha el desarrollo de cepas de NDV genéticamente
modificadas (las llamadas vacunas marcadoras) que pudieran ser
utilizadas para la vacunación y que pudieran ser serológicamente
distinguidas de las cepas de campo de NDV. Con objeto de desarrollar
una vacuna marcadora de NDV, el virus ha de ser genéticamente
modificado de modo que uno o varios epítopos inmunodominantes de uno
de los antígenos (principales) sean suprimidos o modificados. La
supresión de parte(s) de una proteína esencial puede conducir
a la pérdida de la función biológica de esa proteína. Por lo tanto,
se eligió modificar una de las proteínas de envoltura
inmunodominantes del NDV de tal modo que se mantuviera la función
biológica de la proteína en tanto que el repertorio de anticuerpos
contra la proteína modificada difiriera del repertorio contra la
proteína original. Por razones especificadas más adelante, para una
realización del invento se eligió modificar la proteína HN de NDV.
La infección del NDV es iniciada por la fusión de la envoltura del
virión con la membrana plasmática de la célula huésped. Para este
proceso, se requieren tanto la proteína F como la proteína HN. Se
ha mostrado que las proteínas F y HN interaccionan físicamente y que
se necesita esta interacción para la fusión de la membrana (Deng
et al., 1995). Además, se ha mostrado que la interacción es
específica del tipo; es decir, las proteínas F y HN deben proceder
del mismo virus para que presenten actividad de fusión. El dominio
interaccionante de la proteína HN de NDV ha sido localizado en la
llamada región "tallo" o "tronco" de la proteína, que
comprende los primeros 92 restos de aminoácido del ectodominio de la
proteína HN (Deng et al., 1995). Se mostró que las proteínas
HN híbridas que consisten en los aminoácidos 1-141
de NDV y los aminoácidos 141-572 del
parainfluenzavirus humano de tipo 3 (hPIV3) conservan la actividad
de fusión cuando se coexpresan con la proteína F de NDV. Estos
hallazgos sugieren que las cepas de NDV genéticamente modificadas
que contienen una proteína HN híbrida que consiste en la región
tallo de NDV seguida del cabecero globular de la proteína HN de un
diferente serotipo de paramixovirus aviar pueden ser viables.
Además, dichas cepas provocarían una respuesta de anticuerpos
anti-HN que sería diferente de la provocada por el
NDV. Puesto que basta la respuesta de anticuerpos neutralizantes
contra la proteína F para permitir una protección eficaz contra una
infección por el virus estimulador, dichas cepas de NDV
genéticamente modificadas satisfacen los dos requisitos esenciales
de una vacuna marcadora, es decir, protección frente a la enfermedad
y diferenciación serológica.
\newpage
Se construyeron genes HN híbridos que consistían
en una fusión de los aminoácidos 1-141 de NDV y los
aminoácidos 142-580 de paramixovirus aviar de tipo
2 (denominado HN1/2^{141}) o de los aminoácidos
1-143 de NDV y los aminoácidos
144-580 de APMV2 (denominado HN1/2^{143}).
Similarmente, se construyeron genes HN híbridos que consistían en
los aminoácidos 1-141 de NDV y los aminoácidos
143-569 de APMV4 (denominado HN1/4^{141}) o de
los aminoácidos 1-143 de NDV y los aminoácidos
145-569 de APMV4 (denominado HN1/4^{143}). Los
genes híbridos fueron clonados en el vector de expresión
eucariótica pCIneo y fueron utilizados en experimentos de
cotransfección con un plásmido que contenía la proteína F de NDV.
Para este fin, la proteína F fue modificada de modo que la
secuencia de aminoácidos del sitio de escisión proteolítica situado
entre F2 y F1 resultara cambiada, de la secuencia de LaSota a la
secuencia de consenso de cepas virulentas de NDV (F^{wt}; véase la
sección "Materiales y Métodos"). Los experimentos de
cotransfección en células CER y células QM5 indicaron que tanto
HN1/2^{141} como HN1/2^{143}, así como HN1/4^{141} y
HN1/4^{143}, inducían fusión celular cuando se coexpresaban con
la proteína F^{wt}. Estos resultados indicaban que los complejos
entre las proteínas HN híbridas y la proteína F eran biológicamente
activos. Se utilizaron las proteínas HN híbridas HN1/2^{143} y
HN1/4^{143} para sustituir el gen HN original en el clon pNDFL+ de
cDNA de longitud completa, para obtener
pNDFL-HN1/2^{143} y
pNDFL-HN1/4^{143}. Los dos últimos plásmidos
fueron posteriormente utilizados para la generación de un virus
infeccioso utilizando el sistema de cotransfección anteriormente
descrito. Del fluido alantoico de huevos fecundados a los que se
había inoculado el sobrenadante de monocapas transfectadas se
pudieron aislar virus recombinantes viables (denominados
NDFL-HN1/2^{143} y
NDFL-HN1/4^{143}.
La presencia del gen HN híbrido en cada uno de
los dos recombinantes fue verificada por medio de
RT-PCR. Ensayos de inhibición de la hemaglutinación
mostraron que anticuerpos monoclonales y antisueros polivalentes
contra NDV eran incapaces de inhibir la aglutinación de eritrocitos
de gallina por los virus recombinantes
NDFL-HN1/2^{143} y
NDFL-HN1/4^{143}. Éstos resultados indican que se
pueden usar las cepas NDFL-HN1/2^{143} y
NDFL-HN1/4^{143} como vacunas que pueden ser
serológicamente distinguidas de las vacunas de NDV clásicas.
Para examinar si se pueden insertar genes
extraños en el genoma de NDV, se construyó un virus recombinante
que llevaba el gen informador SEAP. El gen SEAP procedía del
plásmido pOLTV535 y fue modificado para que incluyera las típicas
cajas de parada e inicio de la transcripción de NDV. Un fragmento de
DNA que contenía el gen SEAP seguido de las cajas de parada e
inicio de la transcripción fue insertado en el sitio XmnI (nt 109)
del plásmido pNDFL+[F^{wt}]. Se generó un virus infeccioso,
denominado NDFL-AP, por medio del sistema de
cotransfección y se verificó la presencia del gen SEAP por medio de
RT-PCR. Las células infectadas con la cepa
NDFL-AP expresaban niveles elevadísimos de la
proteína SEAP. Utilizando la actividad específica de la proteína
SEAP, se calculó que x% de las proteínas expresadas en células
infectadas con NDFL-AP consistían en la proteína
SEAP. Estos resultados muestran que, a partir de NDV recombinante,
se pueden expresar genes heterólogos en niveles elevadísimos.
Con objeto de anular la expresión de la proteína
M de NDV, una gran parte del gen M fue suprimida por digestión de
pNDFL+[F^{wt}] con BsaAI (nt 3087) seguida de digestión parcial
con HindIII (nt 4252). Una vez rellenado el extremo HindIII con DNA
polimerasa de Klenow, el fragmento fue recircularizado utilizando
DNA ligasa de T4 y fue utilizado para transformar E. coli.
El plásmido resultante, denominado pNDFL+[F^{wt}]dM, fue
usado para generar un virus por medio del sistema de cotransfección
en células CER-M transcomplementarias que expresaban
la proteína M de NDV. El sobrenadante de las monocapas
transfectadas fue sometido a tres pases por células
CER-M y fue analizado en cuanto a la presencia de
virus. Se obtuvo el virus, como evidenció el hecho de que el
sobrenadante de cultivo del tercer pase produjera resultados
positivos en los ensayos de hemaglutinación (HA) y de inhibición de
la hemaglutinación (HI). El virus fue denominado
NDFL-dM. Cuando se utilizó NDFL-dM
para infectar monocapas de células CEF, el virus fue aún capaz de
propagarse por transmisión célula a célula, como se vio en un IPMA
en que se utilizaba un anticuerpo monoclonal contra la proteína F.
Como se esperaba, la expresión de la proteína M no se pudo
demostrar en un IPMA en que se usaban anticuerpos monoclonales
contra la proteína M. Cuando se usó el sobrenadante para infectar
células CEF o CER-M, no se pudo mostrar la presencia
de un virus replicante en estas monocapas por medio de un IPMA.
Este hallazgo indicó que el virus infeccioso no se podía generar en
células CEF no complementarias. Este hallazgo fue confirmado por la
observación de que la inoculación de sobrenadante de células CEF
infectadas, en huevos fecundados, no daba lugar a la generación de
progenie viral cuando se probaba en ensayos HA o HI.
La necesidad de vacunas de NDV mejores, y
especialmente la necesidad de vacunas marcadores de NDV, impulsó el
desarrollo de un sistema de genética inversa que permitiera la
modificación genética del NDV. En este documento se describe la
generación de NDV infeccioso enteramente a partir de cDNA clonado de
longitud completa. Se muestra aquí que la virulencia del NDV puede
ser drásticamente cambiada al modificar sólo 3 nucleótidos que
determinan la especificidad del sitio de escisión por proteasas de
la proteína F. En este caso, el sitio de escisión por proteasas fue
cambiado, del sitio de la cepa LaSota al sitio de escisión de
consenso de cepas virulentas de NDV. Al generarse esta cepa de NDV
genéticamente modificada, se proporciona la prueba formal de que la
capacidad de escisión de la proteína F es el determinante esencial
(aunque no el único determinante) de la virulencia del NDV.
Utilizando el mismo planteamiento de genética inversa, el sitio de
escisión puede ser modificado a voluntad por cualquier otra
secuencia de aminoácidos. Esto puede conducir a la generación de
una serie de cepas de NDV que presenten un espectro de niveles de
virulencia.
Como ya se mencionó anteriormente, se ha
mostrado que, además de la capacidad de escisión de las proteínas F
y HN, otros factores víricos pueden contribuir a la patogenicidad.
Alteraciones en la transcripción y la traducción pueden modular el
crecimiento y la propagación célula a célula del virus y/o la
citopatogenicidad. La disponibilidad de un cDNA infeccioso de NDV
permite la modificación sistemática de secuencias que están
implicadas en la transcripción y la replicación. Esto puede conducir
al diseño de nuevas vacunas de NDV que luzcan una inmunogenicidad
óptima para una virulencia casi inexistente. La seguridad es una de
las propiedades más importantes de las vacunas vivas. Sin embargo,
para muchas vacunas vivas, incluyendo de NDV, la inmunogenicidad
está a menudo inversamente relacionada con la virulencia. Por lo
tanto, una mayor atenuación de las vacunas vivas sin pérdida de
inmunogenicidad es una de las alteraciones más deseadas para las que
se podría utilizar la modificación genética. A este respecto,
merece la pena mencionar que se ha mostrado que la eliminación de
la expresión de la proteína V del virus Sendai daba lugar a una
patogenicidad in vivo notablemente reducida para ratones
(Kato et al., 1997). Similarmente al virus Sendai, el NDV
también genera una proteína V mediante un mecanismo conocido como
edición de RNA (Steward et al., 1993). Es previsible que la
eliminación de la expresión de la proteína V de NDV pueda también
dar lugar a un fenotipo atenuado in vivo. Aparte del cambio
de la virulencia del NDV, se muestra aquí que es posible modificar
la composición antigénica del NDV de tal modo que se puedan generar
cepas que puedan ser serológicamente discriminadas de las cepas de
campo de NDV. Éstas así llamadas vacunas marcadores son una
herramienta inestimable para evaluar la incidencia de NDV en
conjuntos animales comerciales por todo el mundo. Además, la
aplicación de dichas vacunas marcadoras a gran escala puede
conducir finalmente a la erradicación completa del NDV mediante un
procedimiento de exploración intensiva y eliminación de conjuntos
animales infectados. En este documento se muestra que se pueden
insertar genes extraños en el genoma de NDV. Estos genes extraños
se pueden expresar con niveles altísimos en células infectadas.
Esto muestra que el NDV puede ser utilizado como un vector de vacuna
para la expresión de antígenos procedentes de otros patógenos (de
aves de corral). Diversas propiedades hacen que el NDV sea un vector
de vacuna ideal para la vacunación contra enfermedades
respiratorias o intestinales: 1) el NDV puede ser fácilmente
cultivado hasta títulos elevadísimos en huevos fecundados; 2) el
cultivo masivo de NDV en huevos fecundados es relativamente barato;
3) las vacunas de NDV son relativamente estables y pueden ser
simplemente administradas mediante métodos de aplicación masiva
tales como adición al agua potable o mediante pulverización o
formación de aerosoles; 4) la vía natural de infección del NDV son
los tractos respiratorio y/o intestinal, que son también las
principales vías naturales de infección de muchos otros patógenos de
aves de corral; y 5) el NDV puede provocar inmunidad local a pesar
de la presencia de anticuerpos maternos circulantes.
Finalmente, se muestra aquí que se pueden
generar mutantes viables de NDV por deleción, usando líneas
celulares transcomplementarias. Se generó un mutante de NDV por
deleción que es incapaz de expresar la proteína matricial (M) que
está implicada en la gemación del NDV en el interior de la membrana
celular. Se muestra que una cepa de NDV fenotípicamente
complementada que es incapaz de expresar la proteína M es aún capaz
de infectar células y de propagarse por medio de transmisión célula
a célula. Sin embargo, el virus mutante es incapaz de generar una
progenie infecciosa en células no complementarias. Este hallazgo
muestra que se pueden usar mutantes de NDV por deleción,
fenotípicamente complementados, como vacunas autolimitadas seguras
que son incapaces de propagarse por el medio ambiente. Dicha vacuna
no transmisible combina la ventaja más importante de las vacunas
vivas, es decir, la eficacia, con la ventaja más importante de las
vacunas muertas, es decir, la seguridad.
El vector de transcripción pOLTV5 es un derivado
del vector de transcripción descrito por Pattnaik et al.
(1992). Véase el texto para los detalles de la construcción. El
plásmido contiene el promotor de RNA polimerasa de T7 dependiente
de DNA (mostrado en letra negrita), seguido por los sitios de
restricción únicos StuI y SmaI y la ribozima autocatalítica del
virus delta de la hepatitis (HDV). Se pueden clonar fragmentos de
DNA entre los sitios StuI y SmaI y se pueden transcribir in
vitro o in vivo utilizando RNA polimerasa de T7. El
extremo 5' de los transcritos resultantes contiene dos restos G
extra que no son codificados por el inserto. Debido a la acción de
la ribozima, el extremo 3' de los transcritos corresponde
exactamente al último nucleótido del inserto.
Estructura de los plásmidos minigenómicos
pOLTV535 (Figura 2A) y pOLTV553 (Figura 2B). Los plásmidos
minigenómicos se basan en el plásmido de transcripción pOLTV5
(véase la Figura 1) y contiene la región 3' (nt
1-119) y la región 5' (nt
14970-15186) de la cepa LaSota de NDV que flanquean
el gen que codifica fosfatasa alcalina secretada (SEAP). La
transcripción de pOLTV535 por RNA polimerasa de T7 produce RNA
antigenómico (o [+]-RNA), mientras que la
transcripción de pOLTV553 produce RNA genómico (o
[-]-RNA). Se indican las cajas de inicio (S; del
inglés, start) y fin (E; del inglés, end), que son
señales de iniciación y terminación de la transcripción vírica. El
codón de inicio del gen SEAP está subrayado. También se muestran las
secuencias de las inserciones (N0-N5) en el sitio
ClaI que generan plásmidos minigenómicos cuya longitud difiere en 1
nt (pOLTV535N0-N5 y
pOLTV553N0-N5).
Secuencia de nucleótidos del genoma de la cepa
LaSota de NDV y secuencia deducida de aminoácidos de los genes de
NDV. La secuencia mostrada corresponde a la cadena antigenómica y se
muestra en la dirección 5' a 3' en forma de DNA de cadena sencilla.
La secuencia mostrada en esta figura es la secuencia de consenso que
fue determinada al secuenciar completamente dos conjuntos
independientes de cDNAs subgenómicos solapantes que abarcan el
genoma entero del NDV. Las ambigüedades restantes (probablemente
como resultado de errores en la PCR) fueron resueltas secuenciando
regiones relevantes de un tercer conjunto independiente de
clones.
La secuencia del clon pNDFL+ de cDNA de longitud
completa que fue ensamblado a partir de clones subgenómicos
solapantes de cDNA (véase la Figura 4) difiere de la secuencia de
consenso de NDV en las posiciones siguientes (la secuencia de
consenso se muestra entre paréntesis): nt 1755, G (A); nt 3766, A
(G); nt 5109, G (A); nt 6999, T (C); nt 7056, G (A); nt 9337, G
(A); nt 9486, A (T); nt 10195, T (C); nt 13075, A (G). Estas
diferencias dan lugar a 3 cambios de aminoácido (la secuencia de
consenso se muestra entre paréntesis): Proteína F, R^{189} (Q);
proteína HN, S^{200} (P); proteína L, N^{369} (I).
(A) Estrategia global usada para el ensamblaje
del cDNA de NDV de longitud completa a partir de clones subgenómicos
solapantes de cDNA. El cDNA fue ensamblado en el plásmido pOLTV535
que ya contenía los extremos 3' y 5' de la cepa LaSota de NDV
(véase en la Figura 2). El plásmido resultante, denominado pNDFL+,
fue utilizado para la generación de NDV infeccioso.
(B) Procedimiento de clonación detallado para el
ensamblaje del cDNA de NDV de longitud completa a partir de clones
subgenómicos solapantes de cDNA. Cm se refiere al gen de resistencia
al cloranfenicol, que fue temporalmente introducido como una
etiqueta fenotípica (véase el texto para los detalles).
(C) Procedimiento de clonación detallado para la
generación de cDNA de NDV de longitud completa, genéticamente
modificado. La modificación consiste en 3 cambios de nucleótido que
fueron introducidos en el gen F y que dan lugar a la modificación
de la secuencia de aminoácidos del sitio de escisión proteolítica de
la proteína F (véase el texto para los detalles).
La transcripción por medio de la RNA polimerasa
de T7 produce RNA antigenómico (o [+]-RNA) que puede
ser directamente traducido a proteína SEAP por la célula. Después
de la infección de las células por el virus auxiliar (o después de
la cotransfección con los plásmidos que codifican NP, P y L), el RNA
antigenómico es utilizado por el complejo vírico de polimerasa para
la síntesis de RNA genómico (o [-]-RNA). El RNA
genómico es luego utilizado por el complejo vírico de polimerasa
para la síntesis tanto de mRNA (usando las cajas específicas de
inicio [S] y fin [E] de la transcripción) como de RNA
antigenómico.
La transcripción por medio de la RNA polimerasa
de T7 produce RNA genómico (o [-]-RNA) que no se
puede traducir a proteína SEAP. Después de la infección de las
células por el virus auxiliar (o después de la cotransfección con
los plásmidos que codifican NP, P y L), el RNA genómico es utilizado
por el complejo vírico de polimerasa para la síntesis tanto de mRNA
(usando las cajas específicas de inicio [S] y fin [E] de la
transcripción) como de RNA antigenómico.
Se proporciona la alineación de extremos
5'-terminales de secuencias de ácido nucleico de
LaSota de NDV y otros paramixovirus como comparación de secuencias
de NDV a través de los cuatro miembros del género
Rubulavirus, tres miembros del género Paramyxovirus y
tres miembros del género Morbillivirus. Las secuencias se
presentan desde la caja terminal del gen L hasta el extremo 5' (cDNA
3' - 5').
NDV, virus de la enfermedad de Newcastle; hPIV2,
parainfluenzavirus humano 2; MuV, virus de las paperas; SV5 y SV41,
virus 5 y 41 de simios, respectivamente; SeV, virus Sendai; bPIV3 y
hPIV3, parainfluenzavirus bovino y humano, respectivamente; CDV;
virus del moquillo canino; MeV, virus del sarampión; RPV, virus de
la peste bovina.
Se obtuvieron las secuencias de nucleótidos (nt)
de los genomas completos del modo siguiente (nº de acceso): NDV
(AF077761); hPIV2 (X57559); MuV (AB000388); SV5 (AF052755); SV41
(X64275); bPIV3 (D84095); hPIV3 (Z11575): CDV (L13194); MeV
(X16565); RPV (Z30697).
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<110> Stichting Dienst Landbouwkundig
Onderzoek
\hskip1cm Peeters, Bernardus P.H.
\hskip1cm Leeuw de, Olav S.
\hskip1cm Koch, Guus
\hskip1cm Gielkens, Arnoud L.J.
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<120> Clones infecciosos del virus de la
enfermedad de Newclastle, vacunas y análisis diagnósticos
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<130> P22065PC00
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<140> PCT/NL99/00377
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<141>
1999-06-17
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<150> EP 98202054.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-06-19
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<160> 179
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskipatcgatactg gtcagcatgc tggcagaagg ctttctcg
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador SEAP5"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatgctgac cagtatcgat attacagtaa ctgtgact
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador 5NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaaacaaa gatttggtga atgacga
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Oligonucleótido N0"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgagctcg
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Oligonucleótido N1, en el
que S = C o G"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgagsctc g
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Oligonucleótido N2"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgagcgct cgd
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Oligonucleótido N3, en el
que W = A o T"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgagcwgc tcg
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Oligonucleótido N4"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgagcatg ctcg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Oligonucleótido N5, en el
que S = C o G"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgagcast gctcg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(56)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador BGL3F2"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatatggcca ttcaggctta atacgactca ctataaccaa acagagaatc cgtgag
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador BGL5F2"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatatggcca ttcaggctta atacgactca ctataaccaa acaaagattt ggtgaatg
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador
CAT-F"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtacgtct agactggtgt ccctgttgat accgg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador
CAT-R"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagacg tacgaccctg ccctgaaccg acg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador 386"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcaatcga agtcgtacgg gtagaaggtg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador 365"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtgaattc cgagtgcgag cccgaag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador 892"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgcatgcct gcaggtcagt acccccagtc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador pRT1"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaagaattc agaaaaaagt acgggtagaa
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador p2"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagtctaga ttagccattc actgcaaggc gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador NDV5M"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtgctagc ggagtgcccc aattgtgcca a
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador NDV3M"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctccccggg gcagcttatt tcttaaaagg at
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador NDV5F"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgggctagc gattctggat cccggttgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador NDV3F"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacticccggg aaaccttcgt tcctcat
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<216> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador NDVSHN"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaggctagc aagagaggcc gcccctcaat
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador NDV3HN"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagcccggg ccggcattcg gtttgattct tg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(43)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador
5LE(E)"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatggaatt caaggcaaaa cagctcaagg taaataatac ggg
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador
3LE(E)"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgaatctag aatgccggat ccgtacgaat gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador F5R"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagcgccgc tgtctcctcc ctccagatgt agtcac
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador F3F"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaggagaca gcggcgcttt ataggcgcca ttattgg
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV09"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctgtcgac acagactacc agaactttca c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV03"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggggaattc cccattcaat gaagggtcta c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV05"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccccggg tcttaaacca ggcttcgcaa tg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV06"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggggaattc tggtagggtg gggaaggtag c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV08"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgcccggg gggtaactaa tcaggatctc ag
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV01B"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaggaattc aagagaggcc gcccctcaat
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV10"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatgagttct ttgcctatcc cccc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV11B"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggggatag gcaaagaact cattcaagga gatgcatctg caggc
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV14B"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggggatag gcaaagaact attgtagatg atgcatctgc aggcctaaat ttcc
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV13"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatctacaatg agttctttgc ctatc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV15B"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggggatag gcaaagaact attgtagatc aaacagctga ctacacagca g
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Oligonucleótido conedtor
HN12a"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccgcatat tctagagtta acgactta
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Oligonucleótido conector
HN12b"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtaagtc gttaactcta gaatatgc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Oligonucleótido
HN14a"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccgcatat tctagagtta acga
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Oligonucleótido
HN14b"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagtcgtta actctagaat atgc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1). (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Conector H2"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagcgagcg ctcg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Conector H3, en el que W =
A o T"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagcgagcw gctcg
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Epítopo para MAb
4D6"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paramixovirus aviar 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia de la proteína HN
de APMV-2 que corresponde con la SEQ ID NO
52"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Arg Thr Asp Ile Gln Gln Thr Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Paramixovirus aviar 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia de la proteína HN
de APMV-4 que corresponde con la SEQ ID NO
52"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Asp Pro Leu Gln Asp Gln Ile Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV01"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtagacgcgt aagagaggcc gcccctcaat
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador IV01"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatagtttgc tgtatatcag tccgattgca tgtgtcattg tatcgcttgt atatcac
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador 5HN2"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatcggactg atatacagca aactatcatg gccaagtctt cgtataagcc tggagcc
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador 3HN4"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatcttgca gcgggtcagg gcatgtgtca ttgtatcgct tgtatatcac
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(56)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador 5HN4"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgaccgct gcaagatcag atcttaatgg ccaagtcttc gtataagcct ggagcc
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador 3'UIT, pos.
1-24"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaaacaga gaatccgtga gtta
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P386+, pos.
368-387"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgatgagga accatgttgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P800+, pos.
800-819"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccgcatct tcttggttag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P1201+, pos.
1201-1220"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagacttgga gtagagtacg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> RNA_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="extremo 3' de RNA genómico
de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipugguuugucu cuuag
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> RNA_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="extremo 5' de RNA genómico
de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipuuuagaaaca aacca
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia del sitio de
escisión por proteasa en la proteína Fo de la cepa LaSota"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Arg Gln Arg Arg Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DOMINIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia de consenso de
las cepas de NDV virulentas"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Arg Arg Gln Arg Arg Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P1279+, pos.
1279-1298"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcagcaatg aagggcctgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P1356+, pos.
1356-1375"
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
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\hskip-.1em\dddseqskipaaatcggagt cctcactggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P1683+, pos.
1664-1683"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipctctatatga ccacaccctc
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
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<211> 31
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador PRT1, pos.
1785-1814, (tabla 1)"
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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<223> /nota="Cebador P2357+, pos.
2358-2377"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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2599-2618"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
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2852-2618"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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<223> /nota="Cebador P3496+, pos.
3496-3515"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 75
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\hskip-.1em\dddseqskipgaatgaagaa gccactgtcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 76
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
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<223> /nota="Cebador P3587+, pos.
3589-3608"
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
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4270-4299"
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 77
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
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4733-4752"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagctcctcc cgaatctgcc
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\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P4958+, pos.
4960-4979"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctctgata caagccaaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P5266+ (LS), pos.
267-5286"
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
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\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P5591+ (LS), pos.
5593-5612"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 81
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtaacgttc cctatgtccc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P5616+, pos.
5616-5635"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 82
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<210> 83
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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6166-6190"
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatacccttg atcagatgag agcc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P6693+ (L), pos.
6695-6714"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattgttaaa aactgagacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
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<223> /nota="Cebador P7110+ (L), pos.
7112-7131"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
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\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 86
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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<223> /nota="Cebador P7501+ (L), pos.
7503-7522"
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
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\hskip-.1em\dddseqskiptggtgggaaa cgcatccagc
\hfill20
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<210> 87
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P7900+ (LS), pos.
7902-7921"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagacttaat cctacgtctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P8590+, pos.
8592-8611"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaactcggaag ggcagtacac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador L9000, pos.
9008-9031"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgtcactc ctgaacttgt catt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P9359+, pos.
9361-9380"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaatgatata gcagaatccg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P9371+, pos.
9371-9411"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaatccg tgactcatgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P9390+, pos.
9392-9411"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial; primer
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagctactg tattctctgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P9686+, pos.
9686-9705"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcacacgata tcatgttgag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P9799+, pos.
9801-9820"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaccctaa cgataattgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P10198+, pos.
10200-10219"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipataagaaacg tatcactgac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P10601+, pos.
10603-10622"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgtcgcgtt gcctgtatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P 11006+, pos.
11008-11027"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagacatac tttgactctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P11393+, pos.
11395-11414"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccttattg tctggagtgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P11798+, pos.
11800-11819"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatacgata gaactcgtag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador L12000, pos.
12008-12031"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatatgtcgc cacatgtgaa ggct
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P12373+, pos.
12375-12394"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaccaggac atatgatgag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P12796+, pos.
12798-12817"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgactgttc ttaccaactc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P12978+, pos.
12978-12997"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaccaact tgcagatacg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P13236+, pos.
13238-13257"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtatctac tgtcggatgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P13601+, pos.
13603-13622"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatacttgttc agaggaatag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P13943+, pos.
13946-13965"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacctgacct cagataaagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P14002+, pos.
14004-14023"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatcattgct gcattgtgac
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P14812+, pos.
14812-14831"
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
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\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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<223> /nota="Cebador P230-, pos.
230-211"
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 109
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\hskip-.1em\dddseqskipccgggacttc tacttttaag
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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998-979"
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskiptttggatatc gcctgagagg
\hfill20
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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<223> /nota="Cebador P1898-, pos.
1898-1879"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\hfill20
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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<223> /nota="Cebador P2617-, pos.
2617-2598"
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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<223> /nota="Cebador 3328-, pos.
3330-3311"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagaatcaa agtacagccc
\hfill20
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<210> 114
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
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<223> /nota="Cebador P3610-, pos.
3612-3593"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcttgccaact caacaagatc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
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<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P3990-, pos.
3992-3973"
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattagcata gtatccactg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
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<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P4593-, pos.
4625-4606"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacagatgca actcagtacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P4618- (LS), pos.
4620-4601"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcaactca gtaccagcgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P5390-, pos.
5411-5392"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtagagttac ctgtataccc
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P6710- (LS), pos.
6712-6693"
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcagtttt taacaatgcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P7093- (LS), pos.
7095-7076"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgatggaa cgcagagtag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P5722- (LS), pos.
7524-7505"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctggatg cgtttcccac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
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<222> (1)..(24)
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<223> /nota="Cebador P367, pos.
8692-8666"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagggacctca atactagcca gttc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P9905-, pos.
9907-9888"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctatcaag aggcgattag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P10320-, pos.
10322-10303"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaagacagta cttttgcagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P10684-, pos.
10687-10706"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgcaactg tgtcaacacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P11122-, pos.
11124-11105"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgggcag gagtcagaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P11510-, pos.
11512-11493"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcctccatg atagcatgcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P11903-, pos.
11905-11886"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgcttgga agatggaacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P12717-, pos.
12719-12700"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtcatacac tattatggcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P13141, pos.
13172-13143"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaagagtac cgtgtacaga cagcataacc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P13281-, pos.
13302-13283"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacatgatag agctcacctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P14101-, pos.
14163-14144"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggaatgca tggcaatcag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P14522-, pos.
14524-14505"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcaccaaa ctctctgcac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P14687-, pos.
14709-14690"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggatctgtc tcgtgcactg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P377, pos.
14888-14861"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttccttaag tttggtaata cctaggac
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> unión_cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Cebador P359, pos.
15096-15017"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccaagtcg acaattggcc agaaaaggag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia del extremo 3'
terminal del genoma de la cepa La Sota de NDV de los clones 04, 05,
13, 21, 26, 28, 30, 32 y 33 (representado como extremo 5' de la
cadena de DNA antigenómica)"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaaacaga gaatc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia del extremo 3'
terminal del genoma de la cepa La Sota de NDV del clon 31
(representado como extremo 5' de la cadena de DNA
antigenómica)"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccaaacaga gaatc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia del extremo 5'
terminal del genoma de la cepa La Sota de NDV de los clones
r3101-13, r3101-14,
r3101-15, r2601-17,
r2601-18, r2601-19,
r2601-21, y clones pGEM4Z- (representado como
DNA)"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccaaacaaa gattt
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1). (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia del extremo 5'
terminal del genoma de la cepa La Sota de NDV del clon
r2601-20 (representado como DNA)"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacaaggtga agata
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(43)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Vector de transcripción
pOLTV5"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaatacgac tcactatagg cctggatctt cccgggtcgg cat
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Parte del vector de
transcripción pOLTV535 que incluye el promotor de T7"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaatacgac tcactatagg accaaacaga ga
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Parte del vector de
transcripción pOLTV535 que incluye el sitio de escisión de
ribozima"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctttgtttg gtgggtcggc at
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Parte del vector de
transcripción pOLTV535 que incluye el sitio Sphl"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccttctgcc agcatgctgc tgctgc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Parte del vector de
transcripción pOLTV535 que incluye el sitio ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctgaatt ggaatcgata ttaca
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV535 que incluyen la inserción N0 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctgaatt ggaatccgag ctcg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV535 que incluyen la inserción N1 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctgaatt ggaatccgag sctcg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV535 que incluyen la inserción N2 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctgaatt ggaatccgag cgctcg
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV535 que incluyen la inserción N3 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctgaatt ggaatccgag cwgctcg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV535 que incluyen la inserción N4 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctgaatt ggaatccgag catgctcg
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV535 que incluyen la inserción N5 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgctgaatt ggaatccgag castgctcg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Parte del vector de
transcripción pOLTV553 que incluye el promotor de T7"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaatacgac tcactatagg accaaacaaa ga
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Parte del vector de
transcripción pOLTV553 que incluye el sitio de escisión de
ribozima"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctgtgtttg gtgggtcggc at
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Parte del vector de
transcripción pOLTV553 que incluye el sitio ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaatatcg attccaattc agcgg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Parte del vector de
transcripción pOLTV553 que incluye el sitio SphI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagcagcag catgctggca gaaggc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV553 que incluyen la inserción N0 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaatatcc gagctcg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV553 que incluyen la inserción N1 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaatatcc gagsctcg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV553 que incluyen la inserción N2 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaatatcc gagcgctcg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV553 que incluyen la inserción N3 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaatatcc gagcwgctcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV553 que incluyen la inserción N4 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaatatcc gagcatgctc g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Variantes del vector de
transcripción pOLTV553 que incluyen la inserción N5 en el sitio
ClaI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: plásmido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtaatatcc gagcastgct cg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15186
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(121)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia de nucleótido de
la cepa La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (122)..(1591)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota=" Secuencia de nucleótido de
la cepa La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1592)..(1886)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia de nucleótido de
la cepa La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1887)..(3074)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota=" Secuencia de nucleótido de
la cepa La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3075)..(3289)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia de nucleótido de
la cepa La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3290)..(4384)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia de nucleótido de
la cepa La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4385)..(4543)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia de nucleótido de
la cepa La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4544)..(6205)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Secuencia de nucleótido de
la cepa La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6206)..(6411)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6412)..(8145)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8146)..(8380)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8381)..(14995)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14996)..(15186)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 489
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 163
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 395
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 164
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 165
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 553
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 577
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2204
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Morbillivirus CDV alineado
con La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatacgaaaaa aaacaacggt tattaataag ttatcatacc cagctttgtc tggt
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Morbillivirus CDV alineado
con La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 170
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattaaagaaa actttgaaaa tacgaagttt ctattcccag ctttgtctgg t
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Morbillivirus RDV alineado
con La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 171
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactaaagaaa acttcaaaga tgtgaagttt ctatccccag ctttgtctgg t
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(51)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Paramyxovirus bBIV3
alineado con La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtaagaaaa acatataata tatatatacc aaacagagtt tttctcttgt ttggt
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(55)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Paramyxovirus hPIV3
alineado con La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtaagaaaa acatgtaata tatatatacc aaacagagtt cttctcttgt ttggt
\hfill55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(68)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Paramyxovirus SeV alineado
con La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(124)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Rubulavirus hPIV2 alineado
con La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttaagaaaa acatattgat tttccccttg gt
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Rubulavirus MuV alineado
con La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaagaaaaa attgatttta ctttctcccc ttggt
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Rubulavirus SV41 alineado
con La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaagaaaaa atatccgttc tccccttggt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la enfermedad de
Newcastle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota="Rubulavirus SV5 alineado
con La Sota de NDV"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaagaaaaa agaagaggat taatcttggt tttccccttg gt
\hfill42
Claims (30)
1. Un cDNA de paramixovirus aviar que comprende
al menos el extremo 5'-terminal del genoma del virus
de la enfermedad de Newcastle (NDV) que corresponde al extremo
5'-terminal de NDV como el mostrado en la Figura 6,
que permite generar una copia infecciosa de paramixovirus aviar.
2. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 1,
que comprende un cDNA de longitud completa.
3. Un cDNA que comprende al menos el extremo
5'-terminal del genoma de NDV, que corresponde al
extremo 5'-terminal de NDV como el mostrado en la
Figura 6, que permite generar un minigenoma replicante de
paramixovirus aviar.
4. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 1, 2
ó 3, al menos parcialmente derivado de virus de la enfermedad de
Newcastle.
5. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 4,
en que dicho virus de la enfermedad de Newcastle es un virus
lentogénico, preferiblemente derivado de una cepa de vacuna.
6. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 5,
en que dicha cepa de vacuna es una cepa LaSota ATCC
VR-699.
7. Un cDNA de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 6, provisto además de una modificación en un
ácido nucleico por medio de una modificación genética, cDNA que
comprende el extremo 5'-terminal como el
especificado en la Reivindicación 1.
8. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 7,
en que dicha modificación comprende un ácido nucleico que codifica
un sitio de escisión por proteasas modificado.
9. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 8,
en que dicho sitio de escisión es un sitio de escisión por
proteasas de la proteína de fusión (F).
10. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 7,
en que dicha modificación comprende un ácido nucleico que codifica
una proteína híbrida de envoltura vírica.
11. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 10,
en que dicha proteína es una proteína
hemaglutinina-neuraminidasa (HN).
12. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 7,
en que dicha modificación comprende una deleción en un ácido
nucleico que codifica una proteína vírica.
13. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 12,
en que dicha proteína vírica es una proteína matricial (M).
14. Un cDNA de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 13, provisto además de un ácido nucleico que
codifica un antígeno heterólogo.
15. Un cDNA de acuerdo con la Reivindicación 14,
en que dicho antígeno procede de un patógeno de aves de corral.
16. Un RNA obtenido de un cDNA de acuerdo con
cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 15.
17. Un método para generar una copia infecciosa
de paramixovirus aviar, que comprende transfectar al menos una
célula con cDNA de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 7
a 15.
18. Un método de acuerdo con la Reivindicación
17, en que dicha célula es al menos capaz de expresar la proteína
de la nucleocápsida (NP), la fosfoproteína (P) o la proteína
polimerasa grande (L) víricas.
19. Un método de acuerdo con la Reivindicación
17 ó 18, que comprende además permitir la escisión de la proteína
de fusión de dicho virus.
20. Un método de acuerdo con cualquiera de las
Revindicaciones 17 a 19, que comprende además incubar dicha célula
en un medio de cultivo que comprende actividad proteolítica.
21. Un método de acuerdo con la Reivindicación
20, en que dicho medio de cultivo comprende fluido alantoico que
comprende dicha actividad proteolítica.
22. Un método de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 17 a 21, en que dicha célula procede de una célula
de gallina.
23. Un paramixovirus aviar infeccioso que
comprende un gen heterólogo obtenible mediante un método de acuerdo
con cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 22.
24. Una vacuna que comprende un virus de acuerdo
con la Reivindicación 23.
25. Una vacuna de acuerdo con la Reivindicación
24, que comprende una vacuna viva.
26. Una vacuna de acuerdo con la Reivindicación
24 ó 25, en que dicha copia infecciosa de paramixovirus aviar
procede de un virus de la enfermedad de Newcastle (NDV).
27. Un método para distinguir una muestra de
animales no vacunados o animales vacunados con una vacuna de NDV,
de muestras de animales infectados con NDV de tipo silvestre o
vacunados con una cepa de NDV no modificada o lentogénica, que
comprende determinar en al menos una muestra de dichos animales la
presencia de anticuerpos dirigidos contra un marcador o epítopo
inmunodominante de dicho NDV de tipo silvestre o no modificado pero
no de dicha vacuna, en que dicha vacuna de NDV comprende un virus
que ha sido obtenido al transfectar al menos una célula con cDNA de
acuerdo con la Reivindicación 10 ó 11.
28. Un método de acuerdo con la Reivindicación
27, en que dichos anticuerpos se dirigen contra la proteína HN o F
de NDV.
29. Un método de acuerdo con la Reivindicación
27 ó 28, en que dicho animal es seleccionado del grupo compuesto
por aves de corral, preferiblemente por gallinas.
30. Un paramixovirus aviar infeccioso de acuerdo
con la Reivindicación 23, en que dicho gen heterólogo expresa
proteínas inmunoestimulantes.
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