UA77146C2 - Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic set - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується інфекцій вірусу ньюкаслської хвороби домашнього птиці. 2 Вірус ньюкаслської хвороби (МОМ) є одним з найбільш різноманітних і смертельно небезпечних патогенів птахів. Майже одночасне поширення ньюкаслської хвороби, як явно нового типу захворювання в різних географічних регіонах і велике число типів різновиду і небезпеки захворювання викликало деякі проблеми в номенклатурі.

Цю хворобу називають рзецдо їом/! резі, рзецдо роцшйгу ріадие, аміап резі, аміап адізіетрег і аміап 70 рпешйтоепсернпаїйів. Значення цієї хвороби визначається, головним чином, тим, що в ХХ сторіччі птахівництво перетворилося в міжнародну галузь господарства, що інтенсивно розвивається, яке супроводжується активними торговими зв'язками між країнами.

Загалом, вважається, що перші спалахи ньюкаслської хвороби були зареєстровані в 1926 році на острові Ява (Індонезія), а також в м. Ньюкаслі-на-Тайні в Англії (Кгапемеї4, 1926; ЮОоуїе, 1927). Назва "ньюкаслська 72 Хвороба" була дана Дойлом як тимчасова для того, щоб при описі уникнути плутанини по відношенню до інших хвороб. Пізніше стало ясно, що інші менш важкі хвороби зумовлювалися вірусами, які не відрізнялися від МОМ. У

США респіраторне захворювання, що відносно легко протікало було названо пневмоенцефалітом птахів і як було показано, воно викликалося вірусом МОМ (Веаси, 1944). Протягом декількох років численні ізоляти МОМ, які у домашніх курей викликали дуже слабі симптоми або взагалі були безсимптомними, були описані для різних районів світу.

Був встановлений вплив наступних механізмів на поширення даної хвороби: 1) переміщення птахів взагалі, диких птахів, дичини, поштових голубів і одомашнених птахів; 2) переміщення людей і вантажів;

З) переміщення продуктів птахівництва; с 4) поширення частинок, зважених в повітрі; Ге) 5) забруднення кормів для птахівництва; 6) забруднення води; 7) не повністю убиті або гетерогенні вакцини.

У відповідності з ОІЕ, ньюкаслська хвороба представляє захворювання домашньої птиці, що викликається ке, вірусом серотипу-1 параміксовірусів птахів (АРММ-1), який характеризується індексом інтрацеребральної «Її патогенності (ІСРІ) у добових курчат на рівні 0,7 або вище. Вірулентність вірусу також може бути підтверджена на основі наявності множинних основних амінокислот на С-кінці білка 2 і присутності Е (фенілаланіну) в -- 117-му положенні, що є М-кінцем білка Е1. Відсутність ознак такої амінокислотної послідовності може вимагати застосування тестів ІСРІ. Термін "домашній птах" означає домашніх курей, індичок, фазанів, качок, гусей, 3о перепелиць, голубів, цесарок, куріпок і птахів, що не літають (страусів і ін.), яких вирощують або утримують в в неволі для розмноження, виробництва м'яса і яєць для споживання або для штучного відтворювання природних популяцій дичини.

У відповідності до АІехапаег, 1988, три панзоотії ньюкаслської хвороби були ідентифіковані після першого « опису даної хвороби. Перша з них викликала перші спалахи захворювання і, як вважається, виникла в З

Південно-Східній Азії. Окремі спалахи, такі як спалах захворювання в Англії в 1926 році, відображали с випадкові проникнення, що випереджали інфекції, які повільно насувалися через Азію на Європу.

Із» Друга панзоотія, як вважається, з'явилася в Середній Азії в кінці 60-х років ХХ сторіччя і досягла більшості країн до 1973 року. Найбільш швидке поширення другої панзоотії, мабуть, пояснюється справжньою революцією в птахівництві, що супроводжувалася інтенсивною міжнародною торгівлею.

Третя панзоотія в основному вразила одомашнених птахів, таких як голуби (Міпдемоде! 8 Юиспнаїйеї!, 1988). і Цей спалах захворювання, як вважають, виник на Середньому Сході в кінці 70-х років. До 1981 року воно -І досягло Європи і потім швидко розповсюдилося в інші райони світу, в основному внаслідок контакту між птахами під час виставок і змагань, а також внаслідок міжнародної торгівлі такими птахами. - У цей час ньюкаслська хвороба вельми широко поширена в багатьох країнах Азії, Африки, обох Америк і «їз» 20 Європи. Тільки країни Океанії відносно вільні від цієї хвороби (Зргадьгом, 1988).

Вірус МОМ відноситься до ряду Мопопедамігаіез, сімейства параміксовірусів Рагатухомігідає, підродини щи Рагатухомігіпає, роду Киршамігиз. Крім МОМ, який звичайно називається параміксовірусом 1-го типу птахів, вісім інших серотипів, позначених як параміксовіруси типів від 2 до 9 птахів, можуть бути ідентифіковані на основі параметрів їх антигенної спорідненості, що визначаються в тестах на інгібування гемаглютинації і в 22 тестах на нейтралізацію сироватки (АІехапаег, 1993).

ГФ) Незважаючи на стабільність серологічного диференціювання, є ряд перехресних родинних відносин між юю вірусами, що відносяться до різних серотипів.

Геном МОМ представлений молекулою одноланцюговою РНК з негативною полярністю, комплементарною інформаційною мРНК, яка кодує вірусні білки. РНК-геном складається приблизно з 15200 нуклеотидів і кодує 60 наступні генні продукти (перераховані від 3-кінця до 5-кінця послідовності геномної РНК): нуклеокапсидний білок (МР), фосфопротеїн (Р), матричний білок (М), білок злиття (РЕ), гемаглютинін-нейрамінідаза (НМ) і великий білок з полімеразною активністю (І) |Спатрегз еї а/!., 19861.

РНК формує комплекс з білками МЕР, Р і Г. з утворенням рибонуклеокапсидної частинки (КМР), яка оточена оболонкою, вистеленою з внутрішньої сторони білком М. В склад оболонки входять білки Е і НМ, які беруть бо участь в процесах приєднання до клітини-хазяїна і проникнення в неї.

Реплікація МОМ схожа за своїми основними параметрами з такою ж у інших параміксовірусів. Початковим етапом є прикріплення вірусу до рецепторів клітини-хазяїна, в якому бере участь вірусний білок НМ. Злиття вірусної оболонки з мембраною клітини-хазяїна визначається дією як білка НМ, так і білка Е, внаслідок чого

КМР вивільняється безпосередньо в цитоплазму, де відбувається реплікація вірусу.

Вірусна РНК-залежна РНК-полімераза (що входить в склад КМР) бере участь в утворенні комплементарних транскриптів, які виконують роль мРНК і використовуються трансляційною системою клітини-хазяїна для синтезу вірусних білків. Завдяки накопиченню білка МР, комплекс РНК-полімерази перемикає транскрипцію на реплікацію, внаслідок чого відбувається синтез повнорозмірних геномних і антигеномних (комплементарних) 7/0 молекул РНК.

Новосинтезовані КМР упаковуються в капсиди на клітинній мембрані внаслідок активності білка М, а також білків Е ї НМ, які нагромаджуються на клітинній плазматичній мембрані. Новоутворені вірусні частинки вивільняються з інфікованої клітини за механізмом "брунькування". Більш докладний опис процесів реплікації

МОМ можна знайти у Реоріез, 1988. Як більш пізні огляди з молекулярної біології параміксовірусів |див. ато 8 7/5 Коїакоївку, 1996).

Крім промислових домашніх птахів (тобто курей, цесарок, фазанів, індичок, качок, гусей, голубів), дуже широке коло частково одомашнених видів, що утримуються в неволі, і диких ("свободоживучих") птахів, включаючи мігруючих водоплавних птахів, сприйнятливі до МОМ і можуть бути первинними джерелами інфекції (Каїеїа 5: Ваїдаці, 1988).

Патогенність штамів МОМ значною мірою залежить від вигляду організму, що уражається. Найбільш стійкими видами, мабуть, є водоплавні птахи, в той час як найбільш сприйнятливими є стайні птахи, що інколи створюють стабільні скупчення. Домашні кури характеризуються високим рівнем сприйнятливості, але качки і гуси також можуть заражатися, виявляючи при цьому слабі симптоми хвороби або не виявляючи їх зовсім, навіть при зараженні штамами, летальними для курей. с

Ньюкаслська хвороба ускладнена тим, що різні ізоляти і штами цього вірусу можуть індукувати саму широку мінливість тяжкості хвороби. Штами і ізоляти МОМ були класифіковані (Веага 8: Напзоп, 1984) в різні патотипи, і) що характеризуються симптомами хвороби, які можна виявити у повністю сприйнятливих курей: 1) вісцеротропний велогенний МОМ, що викликає гостру летальну інфекцію, при якій в кишечнику відбуваються крововиливи; і нейротропний велогенний МОМ, який викликає високу смертність, що зумовлюється (ду зо респіраторними і нейрологічними симптомами, але без ураження кишечнику; 2) мезогенний МОМ, який зумовлює низький рівень смертності, гостру респіраторну інфекцію і симптоми в - нервовій системі у окремих птахів; «-

З) лентогенний МОМ, який викликає слабу респіраторну інфекцію або не викликає її зовсім, або навіть безсимптомний кишковий МОМ, авірулентний вірус, який в основному відтворюється в клітинах травного тракту. ї-

Повідомлялося про деяке перекриття симптомів у різних груп. ї-

Вірус попадає в організм через дихальні шляхи або травний тракт, або через очі. У трахеї вірус розподіляється з участю війчастого епітелію і за механізмом "від клітини до клітини". Після початкового розмноження в місці проникнення вірус внаслідок періодів віремії переноситься в селезінку, печінку, нирки і легені. Віруси деяких штамів досягають життєво важливих органів, таких як печінка і нирки, дуже швидко, тому « 70 птахи можуть гинути ще до того, як у них виявляться візуальні симптоми хвороби. в с Більшість вірусів досягає центральної нервової системи через кров до того моменту, як починає вироблятися достатня кількість антитіл. Потенційну загрозу для птахівництва представляє статус тривалого безсимптомного ;» носійства, приблизно характерного для папуг. Довготривале носійство як лентогенного, так і велогенного вірусу також може мати місце у курей (Неизснеїйе 5: Еазіегаау, 1970).

У процесі реплікації МОМ для того, щоб він став інфекційним, необхідно, щоб глікопротеїн - попередник Бо -І був розщеплений з утворенням Е1 і Е2 (Кой «5. КіепК, 1988). Таке посттрансляційне розщеплення відбувається з участю протеаз клітини-хазяїна. Якщо таке розщеплення відсутнє, то утворяться інфекційні вірусні частинки, а

Ш- реплікації вірусів не відбувається. Білок Ро вірулентних вірусів може бути розщеплений з участю широкого кола - протеаз, однак білки Бо вірусів, що характеризуються слабкою вірулентністю, обмежені за своєю сприйнятливістю до протеаз, тому такі віруси можуть іп мімо рости тільки в деяких типах клітин-хазяїв і в ве принципі не здатні рости іп міго.

Ф Лентогенні віруси реплікуються тільки в ділянках, що мають трипсино-подібні ферменти, такі як дихальний і травний тракти, в той час як вірулентний віруси можуть реплікуватися в значному числі тканин і органів, внаслідок чого розвивається фатальна системна інфекція.

Амінокислотне секвенування попередника Бо показало, що слабовірулентні віруси включають єдиний залишок аргініну (К), який сполучає компоненти Е7 і Е2, в той час як у вірулентних вірусів є додаткові

Ф) основні амінокислоти, які в сайті розщеплення утворять дві пари, такі як К/К-Х-К/К-К-Р. Крім того, пептид Е2 ка вірулентних штамів звичайно починається залишком фенілаланіну, в той час як у невірулентних штамів він звичайно починається з лейцину. во У деяких штамів МОМ білок НМ також виробляється у вигляді попередника, для біологічної активації якого потрібне розщеплення |Сагеп еї аї., 1980; МіПаг еї аї., 19881.

Крім розщеплення білків Е і НМ, інші вірусні фактори можуть брати участь в патогенності. Було показано

ІМадапеКу 5 Вгацй, 1978, 1981а, 19815), що зміни в транскрипції і трансляції можуть модулювати ріст і поширення вірусу від клітини до клітини, а також цитопатогенність. 65 Початкова імунна відповідь на зараження вірусом МОМ є клітинною і може бути виявлена, принаймні, через 2-3 дні після інфікування живими вірусними штамами. Приблизно це пояснює ранній захист від зараження, який був описаний у вакцинованих птахів перед тим, як виявляється вимірна кількість антитіл |(боцодп 8 АПехапаег,

Приблизно через тиждень після ін'єкції циркулюючі антитіла можуть захищати організм від повторної інфекції. На ранніх етапах бере участь ІДМ, а після цього, (дО. Титри антитіл і піки захищеності приблизно через З тижні різко йдуть на спад, якщо відсутня повторна імунізація ("бустинг). Це означає необхідність повторних вакцинацій більш старих птахів.

Тільки живі вакцини, що вводяться через дихальну систему, стимулюють появу антитіл на всіх слизових поверхнях, а також в сироватці. Інактивована вакцина, навіть при її внутрішньом'язовому введенні, не зумовлює 7/0 локальної респіраторної резистентності, навіть незважаючи на високий вміст антитіл в сироватці.

Це підкреслює важливість живих вакцин, здатних доводити вірусний антиген до верхніх відділів дихального тракту з точки зору індукції як місцевого, так і системного імунітету. Невеликі краплі проникають в нижні відділи дихальної системи, тим самим сприяючи в основному виробленню гуморальної імунної відповіді, в той час як більш великі краплі стимулюють місцевий імунітет у верхніх відділах дихального тракту. Отже, аерозолі, /5 що утримують різні за розміром частинки, обумовлять найбільш ефективний як місцевий, так і гуморальний імунітет.

Однак необхідно зазначити, що, незважаючи на інтенсивну вакцинацію вже існуючими в цей час вакцинами, що забезпечують вироблення високих титрів антитіл, проте, вірус може бути виділений зі слизових поверхонь.

Ідентифікація ньюкаслської хвороби в США привела до застосування інактивованих вакцин (Ноїзвіай, 1953).

Спостереження за тим, що деякі ензоотичні віруси викликають тільки слабкі симптоми хвороби, спочатку привели до розробки мезогенної живої вакцини Коакіп (Веацдецйе еї аї., 1949), а після цього, до одержання ослаблених штамів Нісппег ВІ (Ніїсппег 5 доппзоп, 1948) і їабоїа (Соідпай, 1980), які в цей час найбільш широко застосовуються як живі вакцини.

Живі МОМ-вакцини можуть бути поділені на дві групи, лентогенні і мезогенні. Мезогенні штами придатні сч ов тільки для повторної вакцинації птахів через їх досить істотну вірулентність. Імунна відповідь посилюється нарівні з підвищенням патогенності живої вакцини. Отже, для досягнення бажаного рівня захисту без істотного і) вияву хвороби в існуючих програмах вакцинації застосовується послідовне використання вакцин з поступово зростаючою вірулентністю або використання живих вакцин після інактивованих вакцин.

Одна з переваг живих вакцин пов'язана з тим, що вони можуть бути введені за допомогою низькозатратних (да зо масових методів. Звичайний метод такого введення заснований на використанні питної води. Однак, використання питної води повинне ретельно контролюватися, тому що вірус може втратити активність внаслідок - нагрівання або освітлення, або дії вірицидних домішок самої води. «-

Масове застосування живих вакцин з допомогою розпилювачів або аерозолів також вельми популярне через простоту можливої вакцинації великого числа птахів за короткий період часу. Важливим є забезпечення точного ї- зв5 розміру частинок, для чого застосовується контроль умов, при яких ці частинки утворяться. ча

У живих вакцин, що застосовуються в цей час є деякі недоліки. Вакцина може викликати симптоми хвороби, що залежить від умов зовнішнього середовища і присутності ускладнюючих інфекцій. Отже, важливо для первинної вакцинації використати максимально ослаблений вірус, і, відповідно, потрібне проведення неодноразових вакцинацій. Більш того материнські антитіла можуть запобігати успіху первинної вакцинації з « використанням лентогенних живих вакцин. в с Інактивовані вакцини звичайно одержують на матеріалі інфікованої алантоїсної рідини, яку обробляють . формаліном або В-пропіолактоном для того, щоб убити вірус, і змішують з відповідним ад'ювантом. Інактивовані и?» вакцини вводять шляхом ін'єкції, або внутрішньом'язово, або підшкірно. Інактивовані вакцини в зв'язку з їх одержанням і застосуванням вельми дорогі.

Однак, інактивовані масляно-емульсійні вакцини не в такій мірі схильні до негативного впливу -І материнського імунітету, як це відбувається у разі живих вакцин, тому їх можна застосовувати для добових курчат. Перевагами інактивованих вакцин є низький рівень несприятливих реакцій у вакцинованих птахів,

Ш- високий рівень захисних антитіл і значна тривалість захисту. Жодна з вказаних вище вакцин не диференціюється - серологічно від вірусу МОМ дикого типу.

Розробка рекомбінантних вірусних вакцин представляла інтерес для промислового птахівництва протягом ве ряду років. Суттю такого підходу є внесення генів, що кодують ключові імуногенні епітопи збудника хвороби,

Ф який представляє інтерес в неістотні ділянки геному вірусу, що служить вектором. Отже, вакцинація рекомбінантним вірусом приводить до імунізації як проти вірусу-вектора, так і проти хвороботворного агента, що аналізується.

Деякі типи вірусів були оцінені як можливі живі вірусні вакцини для птахівництва. Два віруси птахів, які привернули найбільшу увагу, представляють вірус курячої віспи (ЕРМ) і герпесвірус індичок (НМТ). Вірус

Ф) курячої віспи є ДНК-вірусом, що характеризується великим геномом: отже, він вельми місткий з точки зору ка включення чужорідних генів.

Після ослаблення вірус ЕРМ не викликає клінічної картини хвороби і звичайно використовується як вакцина бо для домашніх курей. Вірус НМТ також є ДНК-вірусом і класифікується як серотип ІІІ сімейства вірусів хвороби

Марека (МОМ). НМТ непатогенний для курей, забезпечує перехресний захист від МОМ і звичайно використовується для вакцинації курей проти хвороби Марека.

Було показано, що захист проти ньюкаслської хвороби може бути викликаний шляхом використання рекомбінантних вакцин НМТ або ЕРМ |Могдап еї аї., 1992, 1993; НесКегі еї аі., 1996; ВоишгепеїЇ еї аї., 1990; 65 Тауог еї а!., 1990).

Однак, вияв захисту проти ньюкаслської хвороби після вакцинації такими рекомбінантними вакцинами, які експресують або білок Е вірусу МОМ, або обидва білки Е і НМ, значною мірою затримувався в порівнянні з ситуацією при вакцинації стандартною живою або інактивованою вакциною МОМ, що, мабуть, пояснюється тим, що рекомбінантні вакцини або не забезпечують достатньої широти спектра антигенно активних епітопів МОМ, крім тих, які знаходяться в складі білка МОМ, експресованого рекомбінантною вакциною, або не зазнають точного презентування імунній системі.

Більш того внаслідок вакцинації птахів рекомбінантими вакцинами не відбувалося ефективної індукції місцевого захисту (для слизових, дихальної системи і травного тракту). Це є серйозним недоліком, оскільки вакцини, що використовуються для початкової вакцинації проти респіраторних захворювань, повинні 70 забезпечувати місцевий імунітет для запобігання інфекції і поширення вірулентний вірусів, які, заражають курей, що містяться у відкритих умовах.

Антитіла до МОМ, які здатні захищати організм-хазяїн, можуть бути кількісно оцінені в тестах на нейтралізацію вірусів. Однак, оскільки відповідь на нейтралізацію розвивається паралельно відповіді на пригнічення гемаглютинації (НіІ-реакція), останній з вказаних тестів часто застосовують для оцінки захисної відповіді, особливо після проведення вакцинації.

Антитіла, специфічні відносно обох білків Е і НМ, можуть нейтралізувати МОМ. Однак, антитіла до білка Е, мабуть, зумовлюють більш значну нейтралізацію в порівнянні з такою у випадку з антитілами до білка НМ в тестах іп мімо і іп міго (Мешетавпз еї аї., 1986).

Присутність специфічних антитіл до МОМ в сироватці птиці дає недостатню інформацію про інфекційний штам

МОМ, а, отже, має обмежене діагностичне значення.

Поширеність лентогенних штамів МОМ у птахів у більшості країн і практично повсюдне застосування живих вакцин, які неможливо відрізняти, принаймні, при серологічному порівнянні штамів МОМ дикого типу, означає, що просте виявлення інфекції рідко виявляється адекватним обгрунтуванням для застосування заходів для боротьби з нею. Оскільки хвороба в природних умовах може бути неінформативним маркером реальної сч Вірулентності даного вірусу, то необхідно додатково охарактеризувати виявлений вірус.

У цей час єдиним способом діагностики ньюкаслської хвороби, який би дозволяв характеризувати і) інфекційний штам, є виділення вірусу з подальшим його патогенетичним аналізом. У цей час існують три таких тести, що проводяться іп мімо: 1) середній час загибелі яєць (тест МОТ); «о зо 2) індекс інтрацеребральної патогенності (ІСРІ) у добових курчат;

З) індекс внутрішньовенної патогенності (ІМРІ) у б-тижневих птахів. -

Цим тестам властивий ряд недоліків, таких як доступність об'єктів, погана відтворюваність результатів і «- відносно тривалий час аналізу. Нарешті, хоч це не менш важливо, вказані тести не дозволяють досить просто розмежовувати птахів, вакцинованих вакциною або інфікованими штамом дикого типу, за серологічними - з5 параметрами. ча

Як альтернатива тестам іп мімо полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) була успішно застосована для розпізнавання вірулентних і невірулентних ізолятів (ЗЇаирег еї аі., 1995; Капі еї аї., 1997), однак, з іншого боку, серологічне диференціювання було неможливе.

Розвиток птахівництва і торгівлі продуктами птахівництва в цей час вийшов на міжнародний рівень і часто « Контролюється транснаціональними корпораціями. Загроза ньюкаслської хвороби є істотним фактором, що з с обмежує розвиток такої торгівлі. . Успішний контроль ньюкаслської хвороби буде досягнутий тільки тоді, коли всі країни будуть повідомляти и?» про її спалахи. Однак, досягнення міжнародних угод не так просто через значне варіювання міри контролю над захворюваністю в різних країнах. Деякі країни не проводять вакцинацію і відмовляються від якого б те не було внесення МОМ в популяції домашніх птахів, оскільки вакцинованих птахів не вдається відрізнити від тих, які -І були заражені вірусом МОМ дикого типу.

У інших країнах допускається використання тільки конкретних живих вакцин, а інші вакцини розглядаються як

Ш- неприйнятні і вірулентні. У ряді країн ще зберігається присутність циркулюючого високовірулентного вірусу, - що, однак, не вдається розпізнати через маскування справжньої хвороби наслідками вакцинації.

У багатьох країнах існують законодавчі акти, що дозволяють контролювати спалахи ньюкаслської хвороби, ве які можуть відбуватися. Державні заходи спрямовані на запобігання попадання і поширення збудника. У

Ф більшості країн існують обмеження в торгівлі продукцією птахівництва, яйцями і живими птахами. У більшості країн існують карантинні процедури для імпортної продукції, особливо для папуг.

У деяких країнах проводиться політика викорінювання інфекції з примусовим знищенням заражених птахів, ов птахів, що контактували з ними і продуктів. У інших потрібна профілактична вакцинація птахів навіть при відсутності спалахів, хоч в ряді країн існує політика "кільцевої вакцинації, що проводиться з метою

Ф) формування навколо району спалаху буферної зони. ка Очевидно, що існує насущна потреба у вдосконалених вакцинах і у вдосконалених методах діагностики, яку можна застосовувати для контролю ньюкаслської хвороби. Зумовлені як значними відмінностями в тій дозі, яку бо одержують окремі птахи у разі проведення масової вакцинації живими вакцинами, так і мінливістю в рівнях материнського імунітету у молодих курчат, реакції після вакцинації живими вакцинами виявляються неминучими.

Це є однією з основних причин для невдоволення фермерів в тих країнах, в яких вакцинація є обов'язковою.

Більш того багато які вакцини представлені сумішами субпопуляцій. Після клонування ці субпопуляції можуть значною мірою відрізнятися одна від одної за параметрами імуногенності і патогенності (Напзоп, 1988). 65 Однак, самим істотним недоліком живих вакцин, що застосовуються в цей час і інактивованих вакцин є той факт, що вакцинованих тварин не можна відрізнити від заражених тварин, використовуючи сучасні методи скринінгу, такі як тест на пригнічення гемаглютинації або тест на нейтралізацію вірусу.

Відповідно, як і раніше вірулентний польовий вірус може розповсюджуватися серед вакцинованих популяцій, оскільки симптоми хвороби маскуються вакцинацією. Оскільки виділення вірусу і характеристика вірулентності методами іп мімо у великому масштабі скрутна, є істотна потреба в нових живих і ефективно ослаблених вакцинах, які можна було 6 відрізняти від польових вірусів за серологічними параметрами.

Такі вакцини, названі МОМ-маркерними вакцинами (і супроводжуючі їх способи діагностики і набори реактивів), які повинні представляти найбільш повний можливий імунологічний спектр епітопів МОМ з відповідними антигенними властивостями і, крім того, повинні за серологічними ознаками відрізнятися від МОМ 7/0 дикого типу, які досі не були доступні.

Даний винахід представляє спосіб модифікації геному параміксовірусу птахів за допомогою генетичної модифікації, представляє генетично модифікований параміксовірус птахів і маркерну за параміксовірусом птахів вакцину.

Розвиток сучасних молекулярно-генетичних методів дозволяє провести генетичну модифікацію багатьох 7/5 РНЕ-вірусів, включаючи віруси з некодуючими одноланцюговими РНК. Таку стратегію часто називають "зворотною генетикою". Спочатку створюють кКДНК-копію (повнорозмірну) вірусної РНК, після чого транскрибують цю ДНК у відповідних клітинах з одержанням інфекційної РНК, яка знову може реплікуватися з утворенням інфекційних вірусних частинок.

Загалом, шляхом попередньої модифікації кКДНК із застосуванням стандартних молекулярно-біологічних методів можливим виявляється одержати генетично модифікований РНК-вірус. Однак, такий підхід ні разу раніше не застосовували у відношенні МОМ або інших параміксовірусів і навіть ще не було можливим створити мінігеномні фрагменти або плазміди на матеріалі фрагментів геному параміксовірусу птахів з метою вивчення процесів реплікації параміксовірусів птахів, тим самим приходячи до розуміння того, як сконструювати інфекційну вірусну копію. сч

Хоча в даному описі тепер повністю встановлено, що геном параміксовірусу птахів є самим маленьким серед всіх секвенованих до теперішнього часу геномів, параміксовірусів, особливо 5'-кінцева ділянка послідовності і) геному МОМ несподівано виявилася істотно довшою, ніж це раніше було встановлено і чого можна було чекати виходячи з порівняльного аналізу інших представників Рагатухомігідає. Даний винахід уперше представляє повну послідовність геному параміксовірусу птахів і представляє повнорозмірну або мінігеномну кДНК такого Ге зо Вірусу.

Даний винахід представляє тут кКДНК параміксовірусу птахів, принаймні, включаючи нуклеотидну - послідовність, відповідну 5'-кінцевій ділянці геному параміксовірусу птахів, що дозволяє створювати «- інфекційну копію параміксовірусу птахів, при тому, що переважно кКДНК включає повнорозмірну кДНК. Однак, даний винахід також представляє кКДНК, принаймні, включаючи нуклеотидну послідовність, відповідну 5'-кінцевій в. ділянці геному параміксовірусу птахів, дозволяючи тим самим утворювати мінігеном параміксовірусу птахів, що ї- реплікується. Такі мінігеноми переважно можна використати для транскрипції РНК і/або експресії білка з нуклеїнових кислот з модифікованою послідовністю. Даний винахід представляє кКДНК відповідно до винаходу, яка, принаймні, частково є похідною від вірусу ньюкаслської хвороби, наприклад, при тому, що вказаний вірус ньюкаслської хвороби представляє лентогенний вірус, що переважно є похідним від вакцинного штаму, такого як « штам Ласота (Газоїа), АТСС Мі-699. з с Крім того, даний винахід представляє кКДНК відповідно винаходу, що додатково містить модифікацію, таку як . делеція, вставка, мутація, реверсія або інша зміна в нуклеїновій кислоті. Наприклад, представляється кКДНК, в и?» складі якої вказана модифікація включає нуклеїнову кислоту, що кодує модифікований сайт розщеплення протеазою, наприклад, коли вказаний сайт розщеплення є сайтом розщеплення протеазою, характерним для

Злиття білка(Р). -І Ще в одному варіанті даний винахід представляє кКДНК відповідно винаходу, в складі якої згадана модифікація включає нуклеіїнову кислоту, що кодує химерний вірусний білок, такий як химерний білок

Ш- гемаглютинін-нейрамінідази (НМ), як описано в експериментальному розділі даного винаходу. Також даний - винахід представляє КДНК відповідно винаходу, в складі якої згадана модифікація є делецією в нуклеїновій Киспоті, що кодує вірусний білок, такий як матричний білок М. пи Крім того, даний винахід представляє КкКДНК відповідно винаходу, додатково включаючи нуклеїнову кислоту,

Ф що кодує гетерологічний антиген, переважно при тому, що вказаний антигенний є похідним від патогена птахів, як, наприклад, описано далі. Також представляються РНК і похідний від неї білок, одержані з кДНК відповідно до даного винаходу.

Недавно деякі віруси з несегментованим некодуючим РНК-ланцюгом були повністю охарактеризовані, а фундаментальні дослідження з реплікації і експресії їх геномів забезпечили можливість створення інфекційного

Ф) вірусу повністю за допомогою клітин, трансфікованих клонованою кДНК згаданого вірусу (огляд СопгеІтапп, ка 1996).

До теперішнього часу інфекційні частинки вірусів з несегментованим некодуючим РНК-ланцюгом були бо одержані з використанням клонованої кДНК, наприклад, вірусу сказу |Зсипеї! еї аї., 1994; СопгеІтапп, європейська патентна заявка ЕРО70О20О85А1), вірусу везикулярного стоматиту | амузоп еї аї., 1995; МУпеїап еї аї., 1995), вірусу Сендай |Сагсіп еї аїЇ., 1995), вірусу кору |Кадеске еї аїЇ.,, 1995; Зсппеїдег еї аї., 1997; європейська патентна заявка ЕРО780475А1), респіраторно-синцитіального вірусу людини (Соїйп5 еї аї!., 1995), вірусу чуми рогатої худоби |Вагоп 4 Ваїтей, 1997) і вірусу парагрипу людини 3-го типу |Ноїйтап 45 Вапегіее, 65 1997; Соплеітапп, європейська патентна заявка ЕРО7020О85А11, |ЗсппеїЇ еї аї.,, 1994; європейська патентна заявка ЕРО7020О85А11.

Однак, всі вказані вище інфекційні копії вірусів здатні рости як іп омімо, так і іп мйо в організмах-хазяїнах, тканинах або клітинах різного походження, що забезпечує просту трансфекцію кДНК, її реплікацію і утворення інфекційних вірусних частинок у відповідній лінії клітин.

Така можливість відсутня у випадку з МОМ, а, значить, і для лентогенних штамів МОМ, що використовуються у вакцинах. Вірулентність такого штаму МОМ опосередкована його здатністю реплікуватися в широкому колі клітин, а це виявляється в тому, що вірулентні штами можуть легко реплікуватися іп міго і іп мімо, в той час як вакцинні штами можуть реплікуватися винятково іп мімо.

Таким чином, для МОМ характерна парадоксальна ситуація. Хоча спроби створити інфекційну копію вірусу, 7/0 наприклад, з використанням інфекційної КДНК, мабуть, можуть дати в результаті інфекційний вірус, такий вірус в принципі непридатний для використання як вакцини, оскільки одержаний таким чином інфекційний вірус "за умовчанням" дуже вірулентний, щоб використовуватися як вакцина; той факт, що він може бути утворений і реплікований після трансфекції кДНК клітинної лінії, відображає його легку розщеплюваність за білком Ео на Е1 і 2, що обговорювалося вище в зв'язку з критеріями вірулентності МОМ.

Використовуючи вакцинний штам як початковий матеріал для одержання кКДНК, неможливо вирішити дану проблему; вакцинний штам, особливо лентогенного типу, не містить білка Бо, що легко розщеплюється, внаслідок чого неможливо одержати вірус першого покоління, який міг би реплікуватися. Клітина, що використовується для трансфекції, не повинна бути здатною до підтримки одного або декількох циклів реплікації вірусу вакцинного типу, що включає нерозщеплений білок Бо.

Даний винахід тепер пропонує витончене розв'язання даної проблеми і тим самим представляє інфекційну копію МОМ, наприклад, для використання у вакцині.

Даний винахід представляє спосіб створення інфекційної копії вірусу ньюкаслської хвороби, що включає трансфекцію клітин, здатних експресувати вірусні білки МР, Р їі Ї для утворення комплексу з вірусної РНК, з використанням клонованої повнорозмірної КДНК або кДНК, відповідної за розміром геному згаданого вірусу, і сч об додатково, включаючий інкубацію згаданих клітин в поживному середовищі, що виявляє протеолітичну активність, що забезпечує розщеплення білка Ро згаданого вірусу. і)

У системі, використаній заявниками, котрансфекцією плазміди, експресуючої МР, можна нехтувати. Мабуть,

МР експресується з повнорозмірної КкКДНК, оскільки ген МР є першим за розташуванням геном після 5'-кінцевої ділянки антигеномної послідовності РНК Оскільки еукаріотичні МРНК звичайно є моноцистронними, експресії Ге зо дистально розташованих генів не передбачається. Однак, можливим є створення повнорозмірної кДНК, в якій відносне розташування генів МОМ змінене. Якщо спочатку в КДНК розташований такий ген, як ген Р ії, то немає - необхідності в експресії відповідного генного продукту з котрансфікованої плазміди. «-

Як альтернатива використанню повнорозмірної КДНК можливим є використання двох або більшого числа субгеномних (за розміром) кКДНК, на матриці яких утворяться компетентні за реплікацією субгеномні РНК і які ї- зв разом одна з іншою експресують повний комплект білків параміксовірусу птахів. Навіть якщо ці РНК упаковані ї- окремо, так що утворені, в результаті вірусоподобні частинки можна використати для послідовних циклів реплікації шляхом спільної інфекції і комплементації функцій різних генів.

У переважному варіанті даний винахід представляє спосіб, в якому вказана протеолітична активність забезпечується ферментом, таким як трипсино-подібний фермент, або забезпечується композицією, що містить « вказану протеолітичну активність. У найбільш переважному варіанті вказане поживне середовище містить пт») с алантоїсну рідину, що має протеолітичну активність. Розщеплення білка Бо необхідне, для утворення інфекційного вірусу. Можливим є утворення інфекційного вірусу на матеріалі лентогенного штаму без додання ;» зовнішньої протеолітичної активності. При інокуляції надосадовим шаром трансфікованих клітин в порожнину алантоїсу яйця, що розвивається протеолітична активність, характерна для алантоїсної рідини, буде здатна розщеплювати білок Ро з утворенням компетентного за злиттям комплексу Е1/Е2. Віріони з таким активованим -І білком Е здатні інфікувати сприйнятливі клітини і реплікуватися в клітинах, що виявляють бажану протеолітичну активність, з одержанням інфекційного потомства. Як альтернатива внесення бажаної протеолітичної активності

Ш- в надосадовий шар трансфікованих клітин можна, наприклад, використати клітину, яка пермісивна за МОМ і яка - вже виявляє вказану протеолітичну активність. Таку клітинну лінію використовують для одержання інфекційного бр лентогенного МОМ без додання зовнішньої протеолітичної активності. Також така клітинна лінія може бути ве утворена за допомогою стабільної трансфекції клітинної лінії геном, який забезпечує згадану активність. Більш

Ф того можливим є створення стабільної трансфікованої клітинної лінії, яка експресує білок Е дикого типу до складу вірусної оболонки, тим самим утворюючи інфекційні частинки (самі вони позбавлені геномної інформації, що кодує білок Е дикого типу), здатні проникати в клітину. Порятунок інфекційного лентогенного вірусу також можливий за допомогою інфікування трансфікованих клітин вірусом-помічником МОМ. Важливою вимогою, що пред'являється до такого вірусу-помічника, повинно бути те, щоб він підлягав відбору, наприклад, з

Ф) використанням нейтралізуючих антитіл, які видаляють вірус-помічник, але які не взаємодіють з самим ка лентогенним вірусом. Нарешті, можна сконструювати стабільно трансфіковану клітинну лінію, яка б експресувала один, два або всі три ключові білки МОМ, МР, Р і . З точки зору підтримки утворення інфекційних бо Піків вірусу для таких клітинних ліній необхідна коекспресія тільки набору з трьох ключових білків або коекспресія взагалі не потрібна. У переважному варіанті даний винахід представляє спосіб, в якому вказані клітини, що використовуються для трансфекції, є похідними від первинних або повторних клітин або клітинних ліній курчати. Як приклад в описі приводяться клітини СЕК або СЕР, які, як і більшість клітин іп міо, в принципі позбавлені відповідних протеаз, необхідних для розщеплення білка Бо вірусу МОМ, наприклад, штаму 65 Ї азоїа. Однак, також можна використати клітини, похідні, наприклад, від інших птахів.

Далі даний винахід представляє спосіб створення інфекційної копії вірусу ньюкаслської хвороби, що включає трансфекцію клітин з використанням клонованої повнорозмірної КДНК або кКкДНК геномного розміру вказаного вірусу, наприклад, відповідно до показаного на Фіг.3, і додатково, що включає інкубацію вказаних клітин у поживному середовищі, що містить протеолітичну активність, що забезпечує розщеплення білка Бо вказаного вірусу, що додатково включає виділення інфекційного вірусу шляхом культивування вказаних клітин і інокуляції матеріалу, одержаного від вказаних клітин, що культивуються, в алантоїсну порожнину яйця, що розвивається.

Вказаний матеріал, наприклад, містить клітини (зібрані або заморожені або які розтали) або клітинний дебрис, або надосадовий шар, одержаний від вказаної клітинної культури.

Наприклад, в даному тексті описується спосіб виділення інфекційного вірусу, в якому надосадовий шар /о трансфікованих моношарових культур клітин СЕР був інокульований в алантоїсну порожнину яєць, що розвиваються. Через 4 дні збирали алантоїсну рідину, аналізували її в гемаглюнатинаційному тесті і далі переприщеплювали в яйця.

Крім того, даний винахід представляє спосіб, що додатково включає переприщеплювання вказаної інфекційної копії вірусу ньюкаслської хвороби шляхом збору алантоїсної рідини і повторної інокуляції яєць, що /5 розвиваються.

У переважному варіанті даного винаходу представляється спосіб, в якому вказаний вірус є лентогенним вірусом, наприклад, похідним від авірулентного польового вірусу МОМ або від вакцинного штаму МОМ, такого як штам МОМ Газоїа. Більш того представляється спосіб модифікації геному параміксовірусу птахів шляхом генетичного модифікування, що дозволяє вносити одну або декілька мутацій, делецій і/або вставок або інших модифікацій. Наприклад, представляється спосіб ослаблення або модифікування вірулентності параміксовірусу птахів шляхом модифікування кКДНК, наприклад, що кодує вірусний білок, такий як білок У, клонування вказаної модифікованої кКДНК в склад повнорозмірної КкКДНК і створення інфекційної копії вірусу з вказаної повнорозмірної

КДНК, внаслідок чого одержують нові штами МОМ або нові ослаблені живі вакцини, що мають поліпшені властивості. сч

Крім ослаблення внаслідок модифікації генних продуктів також можливим с ослаблення параміксовірусу птахів за допомогою модифікування нуклеотидних послідовностей, які залучені до транскрипції і/або реплікації. і)

Такі модифікації зумовлюють одержання ослаблених штамів, які експресують близькі до дикого типу білки Е, що розщеплюються як іп міїго, так і іп мімо в широкому колі клітин, а в результаті що зумовлюють більш високий рівень імуногенності в порівнянні з класичними вакцинними штамами. Ге зо У переважному варіанті даний винахід представляє спосіб ослаблення або модифікування, вірулентності параміксовірусу птахів, такого як вірус ньюкаслської хвороби, що включає модифікацію сайта розщеплення - протеазою у вірусному білку шляхом модифікування кДНК, що кодує вказаний сайт розщеплення, що додатково «- включає клонування вказаної кДНК до складу кДНК геномного розміру, наприклад, вірусу ньюкаслської хвороби, з утворенням інфекційної копії вірусу ньюкаслської хвороби. Наприклад, вказаний сайт розщеплення є сайтом ї- зв протеазного розщеплення в послідовності білка Е або НМ вірусу ньюкаслської хвороби. Загалом, ослаблення ї- обмежується зниженням вірулентності, однак, зараз також можливо використати відносно авірулентний штам

МОМ і одержувати потомство такого штаму, що характеризується підвищеною вірулентністю, наприклад, шляхом внесення їх для реплікації в клітини специфічного типу. Так, в цей час можливо надати вірусу МОМ різні рівні вірулентності. «

Даний винахід представляє спосіб антигенної модифікації параміксовірусу птахів, такого як вірус з с ньюкаслської хвороби, що включає модифікування кДНК, що кодує, принаймні, частину вірусного білка, несучого, . принаймні, один імунодомінантний епітоп, що додатково включає клонування вказаної КДНК до складу кДНК и?» геномного розміру вірусу ньюкаслської хвороби і створення інфекційної копії вірусу ньюкаслської хвороби.

Наприклад, даний винахід представляє спосіб (додаткового) модифікування МОМ, наприклад, з

Використанням вже передбаченого способу створення інфекційної копії МОМ (вакцини), тобто представляється -І спосіб одержання рекомбінантної МОМ-маркерною вакцини, причому маркерна вакцина містить найбільш повний з можливих або необхідних імунологічний спектр відповідних антигенних епітопів МОМ, а також серологічно - відрізняється від МОМ дикого типу за рахунок того, що за допомогою рекомбінантних методів був видалений - серологічно розпізнаваний епітоп або маркер. Даний винахід представляє спосіб модифікування антигенного складу параміксовірусу птахів, такого як МОМ, тим самим дозволяючи одержати, наприклад, живу МОМ-маркерну ве вакцину, яку серологічно можна відрізнити від польових штамів параміксовірусів птахів.

Ф У одному з варіантів даний винахід представляє інфекційну копію МОМ, в якій білок НМ вірусу МОМ був модифікований шляхом рекомбінування кКДНК, що кодує частину вказаного білка НМ, з кКДНК, що кодує частину білка НМ, похідного від параміксовірусу птахів, наприклад, 2-го типу або 4-го типу. Вказаний гібридний білок дв НМ виконує роль серологічного маркера для інфекційної копії штаму МОМ, одержаного таким чином, або може служити для зміни тропності параміксовірусу птахів відносно інших клітин і (або) тканин. Ці так звані (Ф) "маркерні штами", що представляються даним винаходом, дозволяють створювати вакцини, які є дуже цінним ка інструментом оцінки поширення вірусу МОМ в комерційних популяціях птахів в світі. Крім того, крупномасштабне застосування таких маркерних вакцин буде забезпечувати повне викорінювання МОМ за рахунок проведення бо інтенсивного скринінгу і вилучення заражених популяцій.

Далі, представляється спосіб створення інфекційної копії штаму МОМ, який експресує один або більше число антигенів інших патогенів і який можна використати для вакцинації проти декількох захворювань. Така інфекційна копія вірусу МОМ, наприклад, включає гетерологічну кКДНК, що кодує гетерологічний білок, що представляє, наприклад, вірус грипу птахів (АІМ) (гемаглютинін Н5 і Н7 і нейрамінідаза), вірус лейкозу птахів 65 (АГУМ) (білок епм (ор85)), вірус недокрів'я курей (САМ) (МР12МР2), вірус хвороби Марека (МОМ) (глікопротеїн-В (98), ОН), вірус інфекційного ларинготрахеїту (ІТ) (98, ОН, 90), вірус інфекційного синовіїту (ІВОМ) (МР і

МРЗ), вірус ринотрахеїту індичок (ТКТ) (білок злиття РЕ), параміксовіруси-2, -3 і -6 птахів (РММ) (білок БЕ, гемаглютиніннейрамінідаза (НМ) або інші), вірус інфекційного бронхіту (ІВМ) (пепломірний або антирецепторний білок, нуклеопротеїн), реовіруси (с-білок), аденовіруси, пневмовіруси, сальмонелу ЗаїЇтопейа епіегійіаїв, Сатруорасіег |е)шпі, ЕзсНегісніа соїї, Вогаа(еМна амішт (раніше звана А|Ісаїдепев Гаесаїїз), Наеторпіїїав рагадайНПіпагит, Равіецгейа тийосіда, Огпіпорасіегішт гпіпоїгаспеаіє, Кіетегейа (раніше Равіешгеїа) апаїїрезійег, мікоплазми-слизовики (Мусоріазта даїйзеріїсцт, М. вупоміае, М. тегеадгідії, М. іожає) або аспергіли (АзрегойШиз Памив, А. Титіда(ив).

Даний винахід представляє тут параміксовірус птахів або похідні від нього штами, які можна використати як /о вакцинний вектор для експресії антигенів інших патогенів домашніх птахів. Деякі властивості наділяють вірус

МОМ ідеальним вакцинним вектором для вакцинації проти респіраторних або кишкових захворювань. 1) МОМ можна легко культивувати до дуже високих титрів в яйцях, що розвиваються. 2) Масова культура МОМ в яйцях, що розвиваються відносно дешева. 3) МОМ-вакцини відносно стабільні і можуть бути легко введені методами масової вакцинації, наприклад, з питною водою або шляхом розпилення або утворення аерозолю. 4) Природним 75 шляхом зараження МОМ є респіраторний і/або через травний тракт, що відповідає природним шляхам зараження багатьма іншими патогенами домашніх птахів. 5) МОМ може індукувати місцевий імунітет незалежно від присутності циркулюючого материнського антитіла.

Було показано, що МОМ виявляє як сильні протипухлинні, так і імуностимуляторні властивості (як огляд див.

Зспігптаснег еї аї!., 1998: Зспіттаснег М., Апіегі Т., З(еіпег Н.-Н., Негоїа-Мепае С, Сепагаз К. 5 НадтшишйПег Е., 1998, "Іттипігайоп м/йй мігов-тодтйей їтог сеїЇв". Зетіпаге іп Опсоіоду., 25, 677-696). Хоча вірус МОМ, мабуть, не здатний продуктивно реплікуватися в нормальних клітинах людини, проте було відмічено виборче

МОМ -опосередковане знищення ракових клітин людини. Після місцевої МОМ-терапії у безтимусних мишей лінії "пиде" було відмічено розсмоктування пухлини вірусної природи і повна ремісія ксенотрансплантатів людської пухлини. Це обумовило використання МОМ для терапії пухлин. Однак, проблема полягає в тому, що таке с

Застосування може бути обмежене місцевим застосуванням.

Зараження МОМ індукує вироблення інтерферонів, цитокінів і інших потенційно важливих генних продуктів і о додає плейотропні імуностимуляторні властивості пухлинним клітинам. Дана концепція була використана для вироблення аутологічних вакцин з пухлинними клітинами, що мають свіжі функціональні зразки, які були інфіковані МОМ. Вакцину такого типу називають аутологічною пухлинною МОМ-вакциною або АТМ-МОМ («о зо (Зспігптаснег еї аЇ., 1998). Клітини, інфіковані МОМ, інактивують Г-опроміненням, що запобігає клітинному розподілу, але зберігає можливість реплікації МОМ в цитоплазмі інфікованих клітин. Після введення пацієнтам в вакцини АТМ-МОМ з участю МОМ -індукованих цитокінів відбувається рекрутування Т-клітин. Деякі з цих Т-клітин «-- можуть експресувати Т-клітинний рецептор, який може взаємодіяти з пептидами з групи асоційованих з пухлинами антигенів, утворюючих комплекс з молекулами класу | головного комплексу гістосумісності, що в

Зз5 знаходиться на поверхні клітин. Ця взаємодія зумовлює індукцію цитотоксичної Т-клітинної відповіді, яка ї- зумовлює специфічне знищення аутологічних пухлинних клітин.

Даний винахід представляє модулювання репертуару і кількості цитокінів і імуностимуляторних білків, що індукуються зараженням МОМ. Даний винахід представляє спосіб створення рекомбінантного МОМ, який модифікований так, щоб включати і експресувати гетерологічний(ії) ген(и). Такий рекомбінантний МОМ можна « використати для модифікування репертуару і кількості імуностимуляторних білків в інфікованих клітинах. У шщ с одному з варіантів даний винахід представляє рекомбінантний вірус МОМ, який включає і експресує гени, що й кодують інтерферони, цитокіни або інші імуностимуляторні білюи людини. Згаданий рекомбінантний. МОМ «» використовують для вироблення вакцини АТМ-МОМ, яка є більш сильною в порівнянні з стандартною АТМ-МОМ.

Наприклад, цитокіни ІЕМ-А, ІБМ-В, ТМЕ-А, 1-1, 1/-6; цитокіни (хемокіни) КАМТЕЗ5, ІР-10; інші гени, такі як НЗР/ АСТН, ендорфін, ІіМО5, ЕРАЛІМР, пікЬ. Плейотропні імуностимуляторні властивості МОМ також можуть -і бути використані як властивості ад'юванту для вакцинації тварин і людини проти інфекційних захворювань. У одному з варіантів даного винаходу чужорідні гени, що кодують відповідний(ії) антиген(и) інфекційного(их)

Ше агента(ів) вносять в геном МОМ, а одночасна експресія в інфікованих клітинах антигену(ів) і - імуностимуляторних білків може індукувати могутню імунну відповідь проти інфекційного агента. У іншому 5о варіанті даного винаходу імуностимуляторні властивості МОМ можуть бути додатково посилені шляхом ть використання рекомбінантних МОМ, які одночасно експресують антигенні і конкретні імуностимуляторні білки. У

Ф переважному варіанті даний винахід представляє створення вакцин проти СНІД (синдром придбаного імунодефіциту) з використанням рекомбінантних МОМ, які експресують відповідні антигени вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) як самі по собі, так і в поєднанні з імуностимуляторними білками.

Вірус МОМ також використовують як ад'ювант при вакцинації тварин і людини проти інфекційних захворювань.

У одному варіанті даного винаходу гетерологічні або чужорідні гени, що кодують відповідний(ії) антиген(и) іФ) інфекційного(их) агента(ів), вбудовують в геном вірусу МОМ, а одночасна експресія інфікованими клітинами ко антигену(ів) і імуностимуляторних білків може індукувати могутню імунну відповідь проти інфекційного агента.

У іншому варіанті даного винаходу імуностимуляторні властивості МОМ додатково посилюють, використовуючи бо рекомбінантні МОМ, які одночасно експресують антигенні і конкретні імуностимуляторні білки. У переважному варіанті даний винахід представляє створення вакцин проти СНІД (синдром придбаного імунодефіциту) з використанням рекомбінантних МОМ, які експресують відповідні антигени вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) як самі по собі, так і в поєднанні з імуностимуляторними білками.

Також представляється спосіб створення умовно-летального делеційного мутанта МОМ, який можна б5 Використати як самообмежену нетрансмісивну вакцину- носій". Делеційний мутант МОМ створюють таким чином, щоб він не був здатний експресувати матричний білок М, що бере участь в "брунькуванні" МОМ на внутрішній поверхні клітинної мембрани. Наприклад, даний винахід представляє фенотипічно комплементований штам

МОМ, який не здатний експресувати білок М, але який проте здатний інфікувати клітини і розповсюджуватися за механізмом передавання "від клітини до клітини". Однак, мутантний вірус не здатний створювати інфекційне потомство в некомплементованих клітинах. Це показує, що фенотипічно комплементовані делеційні мутанти

МОМ можна використати як безпечні самообмежені вакцини, які не здатні розповсюджуватися в довкілля. Така нетрансмісивна вакцина об'єднує найбільш важливу властивість живих вакцин, а саме ефективність, і найбільш важливу перевагу убитих вакцин, а саме, безпеку.

Даний винахід представляє вірус ньюкаслської хвороби або похідні від нього штами, наприклад, що 7/0 одержують шляхом пасирування або додаткового культивування яєць, що розвиваються або відповідних клітин, які є похідними від інфекційної копії вірусу, що одержують за допомогою способу, що представляється даним винаходом.

Наприклад, представляється МОМ, який був модифікований, принаймні, яким-небудь одним шляхом з метою створення інфекційної копії вірусу ньюкаслської хвороби, який ослаблений, модифікований за рівнем /5 Вірулентності, модифікований за антигенними властивостями, експресує гетерологічний антиген або є нетрансмісивним, або їх поєднання.

Даний винахід представляє тут МОМ-вакцини, наприклад, що характеризуються наявністю факторів вірулентності, які відрізняються або антигенними параметрами, які відрізняються, призначені для цілей одержання маркерних вакцин і/або для експресії гетерологічних антигенів, похідних від інших патогенів, що 2о Знаходяться в трансмісивній і/або нетрансмісивній формі.

Така вакцина може бути убитою або живою вакциною. Переважно така вакцина є живою вакциною, однак убиті вакцини, що представляються даним винаходом, мають переваги в тих варіантах, в яких живі вакцини непридатні або застосовні лише в слабкій мірі, наприклад, при обмеженнях в торгівлі або при інших умовах, що визначаються підходами в боротьбі з відповідним захворюванням. сч

Також даний винахід представляє спосіб діагностики і відповідний тест-набір, призначений для виявлення антитіл, специфічних у відношенні вказаних відповідних імунодомінантних епітопу або маркера, тим самим і) передбачаючи способи і підходи в здійсненні способу контролю і/або викорінювання МОМ і/або інших захворювань домашніх птахів. Даний винахід представляє нові ефективні вакцини, які за серологічними критеріями можна відрізнити від польових вірусів і вже існуючих вакцин. Такі нові вакцини, звані маркерними Ге зо МОМ -вакцинами, забезпечують найбільш повний, з можливого імунологічний спектр відповідних антигенних епітопів МОМ, а також серологічно відрізняються від МОМ дикого типу при застосуванні діагностичних способів, « що додаються і наборів. «-

Даний винахід представляє спосіб ідентифікації ревакцинованих тварин або тварин, вакцинованих

МОМ -вакциною за даним винаходом, в порівнянні з тваринами, інфікованими МОМ дикого типу або вакцинованих ї- немодифікованим мезогенним або лентогенним вакцинним штамом МОМ, що включає взяття у вказаної тварини, ї- принаймні, одного мінімального зразка (такого як сироватка, кров, яйця або очна рідина) і визначення у вказаному зразку присутності антитіл, специфічних у відношенні імунодомінантного епітопу або маркера, експресованого вказаним дикого типу або не модифікованим вірусом МОМ, але не вакциною за даним винаходом. «

Даний винахід представляє спосіб, в якому вказані антитіла специфічні відносно білка НМ або білка ЕР з с вірусу МОМ, наприклад, химерного білка, як описано в експериментальному розділі даної заявки. Наприклад,

Й даний винахід представляє спосіб діагностики, в якому вказану тварину вибирають з групи, яка включає и? домашніх птахів, переважно домашніх курей.

Також даний винахід представляє діагностичний набір для використання в способі серологічної ідентифікації тварин. У одному варіанті даного винаходу простий і швидкий тест на пригнічення гемаглютинації (НІ) -І використовують для розмежування вакцинованих тварин і інфікованих тварин. Тварини, вакциновані маркерною вакциною, в якій глобулярна "голівка" білка НМ вірусу МОМ повністю замінена відповідною частиною білка НМ

Ш- вірусу іншого серотипу, не виробляють антитіла до НМ МОМ, а, отже, не пригнічують аглютинацію еритроцитів з - участю віріонів МОМ.

З використанням віріонів маркерної вакцини в тесті НІ детектують антитіла, специфічні відносно химерного ве білка НМ, які можна використати як міру ефективності вакцинації. Як альтернатива, для визначення ефективності

Ф вакцинації використовують метод ЕП І5А, в якому детектують антитіла до білка Е вірусу МОМ.

Крім тесту НІ метод ЕПІЗА може бути використаний для визначення присутності антитіл до НМ МОМ.

Антигеном, призначеним для використання в такому тесті, є, наприклад, білок НМ вірусу МОМ, який експресований за допомогою методів рекомбінантної ДНК, або консервативний пептид з НМ МОМ.

Також може бути використаний метод блокуючий ЕГІЗА. У цьому випадку одне або більше число (Ф) моноклональних антитіл, специфічних по відношенню до консервативних епітопів НМ МОМ, використовують для ка визначення присутності в зразку, взятому у вакцинованої тварини, конкуруючих антитіл. Тести ЕГІЗА переважно можуть бути використані в тому випадку, коли маркерна вакцина містить тільки химерний білок НМ або коли во декілька епітопів в послідовності НМ МОМ замінені.

Далі даний винахід пояснюється в експериментальному розділі даного опису, який нічим не обмежує даний винахід.

Експериментальний розділ

Матеріали і методи 65 Стандартні процедури клонування були здійснені відповідно до посібника |ЗатргооК еї аїЇ. (1989)|), за винятком випадків, що спеціально оговорюються. Всі конструкції, що включають фрагменти ДНК, одержані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), перевіряли шляхом прямого секвенування. У послідовностях праймерів, що приводяться нижче, підкреслені нуклеотиди, відповідні послідовностям МОМ, а також визначені положення в геномі МОМ. Нуклеотидна послідовність рестрикційних сайтів, які використали для клонування, виділена напівжирним шрифтом.

Клітини і віруси

Клітини СЕК |Зтійй еї аї., 1976) культивували в середовищі ЗОМЕМ/ЕМЕМ (1:11), що містить 595 фетальної телячої сироватки (ЕС) і 295 суміші антибіотиків, включаючи 1000од./мл пеніциліну, 100Омкг/мл стрептоміцину, 2Омкг/мл фунгізону, 50Омкг/мл поліміксину-В і 10 мг/мл канаміцину. Клітини ОТЗ35 |Мовзсомісі еї аї!., 1977; Спо, 70 1982) культивували в середовищі, одержаному у відповідності з сірсоВкКІ// Ме Тесппоіодіез |Мо за каталогом 041-91536, композиція, запатентована Рогі Юоддеї|, доповненої 595 ЕС5 і 295 суміші антибіотиків. Клітини ОМ5

ІАпііп 5: Огаанйі, 1991) культивували в середовищі М199, доповненому 1095 триптово-фосфатного бульйону, 1090

ЕС і 2965 суміші антибіотиків.

Штам Ласота (І азоїа) вірусу МОМ отримували з Американської колекції типових культур (АТОС МК-699) і /5 пасирували двічі через курячі ембріони, що розвиваються. Перед початком конструювання і клонування кДдНК вірус очищали в бляшках в трьох циклах очищення в бляшках в лінії первинних фібробластів курячого ембріона (СЕР). З цією метою вірус титрували на клітинах СЕРЕ, що культивуються в середовищі ЗОМЕМ/ЕМЕМ (1:1), що містить 595 фетальної телячої сироватки, 290 суміші антибіотиків, 590 алантоїсної рідини, ЗОММ МОСІ 5, 200мкг/мл ОЕАЕ-декстрана (бідта) і 0,895 агару Мобеї (Оїїсо). Вірус з третього циклу очищення в бляшках (позначений як клон Е13-1) культивували в яйцях, що розвиваються і через 4 дні після інокуляції алантоїсну рідину збирали і зберігали при -702С у вигляді аліквот. Рекомбінантний вірус курячої віспи ТРЕРІ Т7рої! (Вгійоп еї а! 1996; тут і ЕРМ-Т7, що далі позначається), який експресує РНК-полімеразу фага Т7, був люб'язно наданий Д-ром Міхаєелем Скінером (М. ЗКіппег) і цей вірус культивували на клітинах ОТ35.

Виділення вірусної РНК с

Всі маніпуляції здійснювали у вільному від РНКаз скляному або пластиковому посуді, а всі розчини приготовляли з використанням вільної від РНКаз води, яку обробляли 195-вим діетилпірокарбонатом (ОЕРС) і о стерилізували автоклавуванням. Вірус осаджали центрифугуванням з алантоїсної рідини при 21000о6./хв. протягом 70 хвилин в бекманівській центрифузі ЗМУ40 при 42С. Осад ресуспендували в гомогенізаторному буфері (50ММ Трис-НСІ, рН-7,5, 50ММ Май, мМ ЕДТА, 0,595 505) і обробляли протеїназою-К (200мкг/мл) (Се) протягом 90 хвилин при 37 2С при постійному перемішуванні. Одержаний лізат двічі екстрагували рівними об'ємами суміші фенол/хлороформи (1:1), рН-5,4 і один раз рівним об'ємом хлороформу. Вірусну РНК осаджали З з водної фракції доданням 0,1 об'єму ЗМ МабАс (рнН-5,3) і 2,5 об'ємів 10096-вого етанолу. Преципітат збирали ч-- центрифугуванням, 1 раз промивали 7090-вим етанолом, ресуспендували у воді і зберігали в аліквотах при -7020. Зворотна транскрипція ї-

Вірусну РНК (1,5мкг) змішували з 50Онг праймера в об'ємі 12мкл і інкубували протягом 10 хвилин при 7026. і -

Додавали 4мкл зворотнотранскриптазного буфера 5х (250мММ Трис-НСІ, рН-8,3, 375мММ КСІ, 15мМ Моасі»; бірсовВКІ// Же Тесппоіодіев), мкл 0,1М дитіотретолу (017) і 2мкл л7О0мМ амтТР (2,5мММ кожного дезоксирибонуклеотиду) і одержану суміш інкубували протягом 2 хвилин при 42 2С. Зворотну транскрипцію « здійснювали в кінцевому об'ємі 20мкл доданням 200од. зворотної транскриптази (Зирегзогірі ІІ; «зірсоВвкіІ ЛІ бе З

Тесппоіодієв) з подальшою інкубацією протягом 60 хвилин при 422С. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) с Всі реакції ПЛР, які використали для визначення 3'- і 5-кінців геному вірусу МОМ (див. нижче), проводили "з з використанням ДНК-полімерази Тад (Регкіп ЕІтег) Для клонування окремих генів МОМ або великих субгеномних кКДНК використали або коректуючу ДНК-полімеразу Ржмо, або суміші полімераз Тад і Ржо (Ехрапа

Нідн Ріаеїйу Кії або Ехрапа Гопод Тетріайе Кі) відповідно до інструкцій постачальника (Воепгіпдег МаппНеїт). 75 Всі зразки інкубували протягом 2 хвилин при 94 2С перед початком вказаного числа циклів ПЛР. Після їм проведення вказаного числа циклів ПЛР зразки інкубували при температурі добудови ланцюга протягом часу, -і принаймні, утроє більший за тривалий в порівнянні з часом добудування в самому циклі ПЛР. ПЛР-фрагменти - очищали безпосередньо з використанням набору Нідпй Риге РСК Ргодисі Ригійсайоп Кії (Военгіпдег МаппНпеїт) або після проведення електрофорезу в агарозному гелі з використанням набору для екстракції Оіаехі! (Оіадеп) ї 50 по суті, як описано у постачальників.

Ф Секвенування

Всі послідовності були визначені з використанням набору реактивів РКІЗМ Кеаду Кеасіоп ЮОуе ЮОеоху

Тептіпаг Сусіе Зедцепсіпу Кі (Регкіп ЕІтег). Реакційні суміші (мкл) включали в 25 циклів лінійної ампліфікації (10 секунд при 94922, 5 секунд при 5092С і 4 хвилини при 602С) з використанням ампліфікатора

СепеАтр 2400. Після цього реакційні суміші осаджали етанолом, 1 разів промивали 7095-вим етанолом, (Ф) ресуспендували в 15бмкл буфера ТК (Регкіп ЕІтег) і нагрівали протягом 2 хвилин при 94 9С перед

ГІ завантаженням в автоматичний секвенатор моделі АВЗ10 (Арріїєд Віозузіетв).

Нуклеотидні послідовності праймерів, які були використані для секвенування повнорозмірного геному вірусу во МОМ штаму ГГ азогйа, були або похідними від опублікованих послідовностей, або від послідовностей, встановлених в ході здійснення секвенування, що описується тут. Праймери показані в таблиці 1.

Клонування і секвенування 3 - і 5-кінців геному МОМ штаму І азоїа

Нуклеотидну послідовність 3- і 5-кінців геному МОМ визначали з використанням процедур КАСЕ (метод швидкої ампліфікації кінців КДНК). РНК МОМ використали в реакції зворотної транскрипції в кінцевому об'ємі 65 20мкл з праймером рз3бо (5-3 СОАТОТААТСАСССТАСТОСТТ-3": нуклеотиди 14756-14779), який є похідним від опублікованої послідовності гена і! вірусу МОМ (ЖМизой ей аїЇ., 1987). Одноланцюгову кДНК (2,5мкл зворотнотранскриптазної суміші) додавали до 8впкмоль "якірного" праймера А! 3 (5-САСОСААТТСАСТАТСОАТТСТОСАТССТТО-3) і лігували протягом ночі при кімнатній температурі в 20мкл реакційній суміші, що містить 5ХОММ Трис-НСІ, рНн-8Д 10мМ Масі», 1Омкг/мл бичачого сировоточного альбуміну (БСА), 2595 поліетиленгліколю їмММ НСС, 20мМмкМ АТФ і Тбод. РНК-лігази фага Т4 (Мем/ Епдіапа Віоіабзв), як описано у Теззіег еї а!., 1986. По мкл лігаційної реакції використали як матрицю в реакції ПЛР з праймерами рз75 (5-СААТОААТТСАААОСАТАТТАСАСТААСТ- 3; нуклеотиди 14964-14983) і А! 4 (5-СААДОЗАТССАСААТСОАТАС-37). Останній з цих праймерів комплементарний "якірному" праймеру АГ 3.

Умови ПЛР (40 циклів) були наступними: 1 хвилина при 942С, 1 хвилина при 552С і 2 хвилини при 7220. Одержані 7/0 ПЛР-продукти очищали і клонували в Т-вектор рВішевсгірії-ТЗК (Іспінага 5 Кигозамжа, 1993). З іншого боку, обчищені ПЛР-продукти обробляли фрагментом Кленова ДНК-полімерази | з одержанням тупих кінців і клонували за НіпсіІ-сайтом в плазміду РОЕМА47 (Рготеда). Тринадцять незалежних клонів (8 в рВіоезсгірнІ-ТеК і 5 в рРОЕМА7) секвенували для встановлення нуклеотидної послідовності 5-кінця геному МОМ штаму ГІ азоїа.

Нуклеотидну послідовність 3'-кінця визначали двома незалежними методами. У методі І праймер АГ 3 лігували 75 на 3-кінець вірусної РНК з використанням РНК-лігази Т4, як описано (у Зспціге еї а!., 1995). Реакційна суміш (при кінцевому об'ємі 1Омкл) містила 2,5мкг РНК МОМ, 100пкмоль АГ ОЗ, їмкл 10х РНК-лігазного Т4 буфера (5Б00ММ Трис-НСІ, рнН-7,8, л00МмМ МосСі», л00мМ ОТТ, л70ММ АТФ), їмкл ДМСО, лмкл 1ОмкМ гексамінкобальтхлориду, їмкл КМавіп (Рготеда) і бод. РНК-лігази Т4 (Мем Епдіапа Віоїарв). Суміш інкубували протягом ночі при кімнатній температурі і бмкл реакційної суміші літування використали як матрицю в зворотнотранскриптазній (ЗТ) реакції, в якій АГ 4 використали як праймер. По мкл зворотнотранскриптазної реакції використали в реакції ПЛР з праймерами АГ 4 і р376 (З-ВСАОССТТААООАОсСТОСТоОТАСТОАТО-3"; нуклеотиди 137-164), які є похідними від опублікованої послідовності 3З-кінця МОМ (Івпіда еї аї., 1986).

Умови ПЛР були такими ж, як описано вище для 5-КАСЕ. У методі ІІ 3"- і 5-кінці РНК вірусу МОМ лігували один на інший з використанням РНК-лігази Т4 в тих же умовах, які були описані вище для методу І. По бмкл Га 285 лігаційної суміші використали як матрицю для реакції зворотної транскрипції з праймером р3ЗбО. По Тмкл зворотнотранскриптазної реакції використали в реакції ПЛР з праймерами р375 і р376 і в умовах ПЛР, описаних і) вище для 5-КАСЕ. Одержані ПЛР-продукти обробляли фрагментом Кленова ДНК-полімерази І з одержанням тупих кінців і клонували за Ніпсіі-сайтом плазміди рРОЕМА7 (Рготеда). Десять незалежних клонів (4, за способом

І ї 6 за способом ІІ) секвенували для визначення нуклеотидної послідовності 3'-кінця геному МОМ штаму І азоїа. Ге)

Конструювання транскрипційного вектора

Низькокопійний транскрипційний вектор конструювали, використовуючи плазміду рОК12 (Мівіга 55 Меззіпо, З 1991) як початковий реплікон. Плазміду РОК12 розщеплювали рестриктазою Руці! і виділяли ДНК-фрагмент, що -- містить джерело реплікації і ген резистентності до канаміцину. Цей ДНК-фрагмент лігували на Есо47 Ш/АЄ

Ш-фрагмент (сайт розщеплення АТ затупляли по кінцях фрагментом Кленова ДНК-полімерази І) з складу - транскрипційного вектора 2.0 (люб'язно наданий Д-ром Ендрю Боллом; РайгпаїкК еї а!., 1992). З складу одержаної в результаті плазміди видаляли Храї/МПпеіІ-фрагмент з метою видалення як можна більшого числа унікальних рестрикційних сайтів. Одержану в результаті плазміду визначили рої! ТМ5 (Фіг.1). Транскрипційний вектор рОГТМ5 включає промотор ДНК-залежної РНК-полімерази фага Т7, після якого знаходяться унікальні « рестрикційні ЗіцІ- і ЗтаїЇ-сайти, автокаталітичний рибозим вірусу О-гепатиту (НОМ) і сигнал термінації транскрипції непарного фага 7. ДНК-фрагменти, клоновані між рестрикційними 5ішІ- і Зтаі-сайтами, можуть щ-й с бути транскрибовані або іп міо, або іп мімо з використанням РНК-полімерази 77. Після транскрипції ц 5-кінець, що одержують в результаті транскриптів включає два залишки С, що кодуються плазмідою. Завдяки "» автокаталітичній активності рибозиму НОМ, 3-кінець цих транскриптів відповідає точному кінцевому нуклеотиду клонованого ДНК-фрагмента (РайпаїкК еї а/., 1992). Конструювання мінігеномних плазмід

З метою встановлення факторів, необхідних для реплікації і транскрипції МОМ, були сконструйовані -І мінігеномні плазміди, які включають 3- і 5-кінцеві ділянки геному МОМ, фланкуючі ген-репортер, яким заміняли всі гени самого МОМ (Фіг.2). ДНК-фрагменти, відповідні 3- і 5--кінцевим ділянкам геному МОМ, формували за допомогою ПЛР з використанням ДНК-полімерази Рмжо (30 циклів: 15 секунд при 942С, 30 секунд - при 502 і 30 секунд при 722С) і з використанням як матриць плазмід, що включають фрагменти 3-КАСЕ і їх 50 5-КАСЕ (див. вище). 3- Ділянка (нуклеотиди 1-119)- була утворена з використанням праймерів ЗШІТ (5-АССАДАСАСАСААТССОТОАСТТАСОА-3; нуклеотиди 1-27) і ЗЕАР З (-АТССАТАСТОСТСАССА?ОСТООС 4) АСААСОСТТТСТСО- 3" нуклеотиди 102-119). 5-Ділянку (нуклеотиди 14973-15186) утворювали з використанням, праймерів ЗЕАРБ (5-«ССАТОСТОАССАСТАТСОАТАТТАСАСТААСТОТОАСТ-3; нуклеотиди 14973-14990) і БХМОМ (5-АССАДАСАДАСАТТТООСТОААТОАСОА-3; нуклеотиди 15158-15186). Два ДНК-фрагменти з'єднували методом ПЛР з праймерами (ділянки перекриття показані курсивом в приведених вище послідовностях о праймерів), що перекриваються з використанням праймерів ЗТ ії 5МОМ. Одержаний в результаті

ДНК-фрагмент, що являє собою химеру 3'- і 5-кінців МОМ, розділену 20 нуклеотидами, фосфорилували шляхом їмо) обробки полінуклеотидкіназою Т4 і клонували в обох орієнтаціях до складу транскрипційної плазміди ро! ТУ5 (фіг. 1), яку розщеплювали рестриктазами ші і Зтаї і дефосфорилували з використанням кишкової фосфатази 60 теляти (Военгіпдег МаппПпеїт). Нарешті, ген ЗЕАР (кодує секретовану лужну фосфатазу) виділяли з складу плазміди, РОЕАР-Вавзіс (Сіопіеспл) шляхом розщеплення рестриктазами ри! і Сіаї і клонували між р і

СіІаІ-сайтами, що знаходяться між 3- і 5''кінцями МОМ. Одержані в результаті плазміди визначили ро! ТМУ535 і ро ТМ553, відповідно. Внаслідок транскрипції іп мімо або іп мйго з використанням РНК-полімерази Т7 з плазміди ро! ТМ535 одержують антигеномну РНК (14- РНК), в той час як внаслідок транскрипції плазміди 65 ро ТМ553 одержують геномну РНК |-І- РНК). Плазміди ро! ТуУ535МО до ро! ТУ535М5 і плазміди рої ТУ553МО до ро! ТМ553М5 одержували шляхом вбудування самокомплементарних олігонуклеотидів в СіаЇ-сайті, що знаходиться між геном ЗЕАР і 5!-кінцем геному вірусу МОМ в складі ро! ТМ535 і ро! ТМ553, відповідно (див.

Фіг.2). Були використані такі олігонуклеотиди: МО, 5-СОСОАОСТСО-3; МІ, 5-СОбССАСБСТСО-3; М2, 5-сСвСвАоСОоСстТоо-3;; МЗ, 5-СвБСвАОСМОСстТоо-3;; Ма, СОСОАССАТОСТСО-3;; М5, 5-СОСОСАССАЗТОСТОСО-3 (М/-А або Т; 5-С або 5).

Модифікація промотору 17 в плазмідах ро! ТМ535 і ро! туУ553

Для одержання транскриптів іп мійго або іп мімо, тих, що включають аутентичні 5- і 3'-кінцеві ділянки

МОМ, промотор Т7 плазмід ро! ТУ535 і ро! ТМ553 модифікували таким чином, щоб транскрипція починалася з першого нуклеотиду 3'- і 5'-кінцевих ділянок МОМ. 70 Праймери конструювали так, щоб вони включали 1) рестрикційний ВаїІ-сайт, 2) послідовність промотору 17 (показана, курсивом), який модифікували таким чином, щоб два нуклеотиду (з на кінці промотору Т7 були замінені нуклеотидами А, і 3) 3-(нуклеотиди 1-21) або 5-кінець (нуклеотиди 15164-15186) вірусу МОМ.

Праймери ВОІЗЕ2 (5-ЗАТАТОСССАТТСАСОСТТААТАСОАСТСАСТАТААССАААСАСАСААТССОТОАО-3)). і

ЗЕАРЗ (див. вище) використали для одержання ДНК-фрагмента, що включає модифікований промотор 17 і 75 повнорозмірну З'--кінцеву ділянку МОМ аж до початку гена ЗЕАР в складі рОІ ТУ535. Аналогічним чином одержували ДНК-фрагмент, який включав модифікований промотор 17 і повнорозмірну 3'-кінцеву ділянку МОМ аж до початку гена ЗЕАР в складі роОЇТМ553 з використанням праймерів ВО 5Е2 (5-ВСАТАТООССАТТСАООСТТААТАСОАСТСАСТАТААССААДАСАААСАТТТООСТОААТО-З3)) і ЗЕАРБ. Одержані в результаті фрагменти розщеплювали рестриктазами Ва! і ри! (3'і--кінець) або рестриктазами Ваї і Сіа! (5-кінець), відповідно, і використали для заміщення Во /ЗрпІ-фрагмента в складі рОІТМ535 або

ВаПп/СіаІ-фрагмента в складі рОЇ! ТМ553. Одержані в результаті плазміди визначили РОЇ ТМ7З5 і ро! ТМ753, відповідно. Плазміди ро! ТМ735М3 ії ро! ТМ753М3 одержували шляхом вбудування самокомплементарного олігонуклеотиду (5-СОСОдОСУуСсСтТоОо-3; МУ-А або Т) за СіаІ-сайтом, що знаходиться між геном ЗЕАР і 5-кінцем геному МОМ в складі плазмід роОЇ ТУ735 і рої! ТМ753, відповідно. Га

Конструювання 5ЕАР-репортерних плазмід

Плазміду рСіпеоЗЕАР конструювали шляхом клонування Хпо1/СІаІ-фрагмента (СіаІ-сайт затупляли з і9) використанням фрагмента Кленова ДНК-полімерази І), що включає ген ЗЕАР, похідний від плазміди рРЗЕАР-Вазвзіс (Сіопіесп), між ХпоІ- і ЗтаІ-сайтами еукаріотичного експресійного вектора рСіпео (Рготеда). Остання з вказаних плазмід включає промотор цитомегаловірусу людини (ПСМУМ) в доповнення до промотору фага 7. З «о метою оцінки і кількісного визначення 5ЕАР за транскриптами, що контролюються тільки промотором 17, була сконструйована інша плазміда, в якої промотор НСММ був відсутній. Для цієї мети промотор НСММ делегували з М складу рСіпео шляхом часткового розщеплення рестриктазою Ніпаї І з подальшим повним розщепленням «ч- рестриктазою ВОНІ. ДНК-фрагменг (нуклеотиди 756-5469 відповідно до нумерації Сіопіесп), з складу якого делегували промотор АЯСМУ, був виділений і оброблений ДНК-полімеразою Т4 з метою затуплення кінців і знову - був замкнений в кільце з допомогою ДНК-лігази -Т4. Одержану в результаті плазміду визначили рСіпеоО. ра

Нарешті, ген 5ЕАР виділяли з складу плазміди роЕАР-Вазвгіс у вигляді МіІш/АссіІ-фрагмента і клонували в склад рСіІпеоО між Міш!- і СіаІ-сайтами. Одержану в результаті плазміду визначили рСіпеоО-ЗЕАР.

Трансфекція «

Клітини висівали в 24-луночні планшети для культивування, вирощували протягом ночі до стадії 60-8095-вого

Злиття і інфікували при МОЇІ-1 з ЕРМ-Т7 протягом 1 години при 372С. Клітини трансфікували 0,Б5мкг мінігеномної с ДНК-плазміди з використанням Змкл ліпофектаміну і ОріїМет, по суті, як описано у виробника ((сірсоВкї / їе ц Тесппоіодіев). Після інкубації протягом 4 годин (клітини СЕК) або 16 годин (клітини ОМ5) при 372С клітини або ,» інфікували МОМ (голландський вірулентний ізолят, близький до 152608; 200мкл на 1 лунку) протягом 1 години при МО1І-5, або залишали неінфікованими. Інокулят відсмоктували і замінювали тмл повного культурального середовища, після чого клітини далі інкубували при 372С. Для котрансфекції клітини культивували в б-луночних - культуральних чашках і інфікували ЕРМ-Т7, як описано вище. Клітини котрансфікували 0,25мкг мінігеномної -1 ДНК-плазміди, 0,4мкг рСІпеоМР, 0,2мкг рСіІпеоРр і 0,2мкг рСіІпео! (с) або рСІпео шляхом використання або мкл ліпофектаміну або Умкл Рибепетмб (Воепгіпдег Мапппеійт). З метою одержання інфекційного вірусу мінігеномну - плазміду замінювали транскрипційною плазмідою, яка включала повнорозмірну кДНК вірусу МОМ. їз 20 Кількісний аналіз активності ЗЕАР

Кількість ЗЕАР, яке секретувалося в культуральне середовище трансфікованими клітинами, вимірювали на ії; вільних 9б-луночних планшетах з використанням тесту на хемолюмінесценцію репортерів Рпозрпа-іГ ідпі тм з набором реактивів для виявлення секретованої лужної фосфатази (Тгоріх), по суті як описано у виробника.

Кількісний аналіз хемолюмінесценції проводили з використанням лічильника сцинтиляцій в рідині (У/аПас 1450 29 тістореїа РІ ОВ).

ГФ) Клонування і секвенування кКДНК, що охоплюють повний геном МОМ штаму І абоїа

Для клонування і секвенування повнорозмірного геному МОМ штаму І абЗоїа великі субгеномні клони кКДНК де утворювали з допомогою ПЛР з ревертуванням і клонували в склад плазміди рРОЕМ-Т. Синтез першого ланцюга

КДНК здійснювали з використанням праймера ЗИЇТ, як описано вище, і їмкл зворотнотранскриптазної реакції 60 використали в реакції ПЛР з набором Ехрапа Гопд Тетріаїе РСЕ Кії (Воейгіпдег Мапппеїт). ПЛР включала 5 циклів по 10 секунд при 942С, 30 секунд при 582С і 6 хвилин при 682С з подальшими 10 циклами по 10 секунд при 942С, 30 секунд при 582С і 6 хвилин при 682С, в яких час добудування ланцюга при 682 збільшувався на 20 секунд в кожному подальшому циклі. Одержані ПЛР-фрагменти клонували в склад рОЕєЕМ-Т з використанням набору рОЕМ-Т Сіопіпуд КИ (Рготеда), по суті як описано у виробника. Лігаційні суміші використали для бо трансформації клітин Е. соїї штаму ЗОКЕ ПІ (Зігаїадепе). Проводили дві незалежні ПЛР з ревертуванням (А і В)

і в кожній з них одержували аналогічний набір клонів КДНК. Нуклеотидну послідовність субгеномних клонів КДНК визначали з використанням МОМ-специфічних праймерів (таблиця 1) і праймерів, фланкуючих дані вставки.

Після порівняння нуклеотидних послідовностей груп А і В одержаних клонів, невизначеність, що залишилася розділяли шляхом секвенування відповідних ділянок в третій незалежній групі КДНК (серія С). Нуклеотидна послідовність вірусу МОМ штаму І абоїа показана на Фіг.3.

Конструювання повнорозмірного геномного клону кКДНК вірусу МОМ

Полнорозмірну КДНК МОМ вбудовували в склад транскрипційної плазміди ро! ТМ5, використовуючи як початкову плазміду ро! ТУ535. ДНК-фрагменти з'єднували по ділянках перекриття з використанням звичайних /о рестриктаз, що детально відображено на Фіг.АЮВ. Серед етапів клонування конструювали плазміду (позначену ро35-ОІ), що включає нуклеотиди 1-3521 і 12355-15186, розділені рестрикційним СіаІ-сайтом, яка була утворена шляхом з'єднання СіаІ-сайтів за положеннями 3521-го і 12355-го нуклеотидів. У іншому ряді етапів клонування була сконструйована плазміда (позначена рОєМ-В), яка охоплює частину геному МОМ, включаючи нуклеотиди 3521-12355 (СіІаІ-фрагмент). Для полегшення клонування останній з названих СіаІ-фрагмент позначали геном /5 резистентності до хлорамфеніколу (Ст), похідним від плазміди рАСУС184 (Спапо 8 Сопеп, 1978). Для цієї мети ген Ст виділяли з плазміди рАСУС184 з допомогою ПЛР, з використанням праймера САТ-Е (5-ВССОТАСОТСТАСАСТОСТОТС ССТОТТОАТАССОО-3) і САТ-К (5-ВОСТСТАСАСОТАСОАСССТОСССТОАДАССОАСО-3). ПЛР проводили з використанням ДНК-полімерази Румо протягом ЗО циклів по ЗО секунд при 942, 45 секунд 602С і 60 секунд при 722С. Одержаний ПЛР-фрагмент го розщеплювали рестриктазою Ввіму! і клонували за унікальним ВвімуІ-сайтом в склад рОЕМ-В з одержанням плазміди рОЕМ-В(са). СіІаі-фрагмент з складу рОЕМ-В(САТ) клонували за унікальним СіаІі-сайтом 535-011 з одержанням плазміди рРМОРІ| (САТ). Нарешті, ген Ст видаляли з цієї плазміди шляхом розщеплення рестриктазою ВвімуІ з подальшим релігуванням і трансформуванням клітин Е. соїї штаму ОНба. Одержану в результаті плазміду позначили РМОРЇ к: вона включала повнорозмірну послідовність КДНК с

МОМ, клоновану між промотором 17 і рибозимом НОМ в складі транскрипційної плазміни ро! тмУ5. о

Клонування і експресія окремих генів МОМ

ДНК-фрагменти, що включають кожний з генів МОМ штаму Габоїа, були одержані з допомогою ПЛР з ревертуванням і клоновані в склад рСіпео. Після клонування всі фрагменти секвенували з використанням праймерів, фланкуючих вставки, і ген-специфічних праймерів. Для гена МР: праймер 386 Ге) (5-БАССААТСОААОСТООТАСОООСТАСААдОооТо-3: нуклеотиди 40-69) використали для зворотної транскрипції.

Праймери 365 (5-СТОТОААТТССО АСТОСОАССССОААС-3: нуклеотиди 77-94) і 892 Ж (6-- ЄСАТОССТОСАООСТСАСТАСССССАЄСТО-3: о нуклеотиди 1577-1593) використали для ПЛР з «--

ДНК-полімеразою Ру. Були використані наступні умови ПЛР (30 циклів): ЗО секунд при 9592С, 40 секунд при 6590 і 45 секунд при 722С. Одержаний в результаті ДНК-фрагмент розщеплювали рестриктазою Есокі і -

Кклонували в склад рСіпео між ЕсоКіІ- і ЗтаІ-сайтами. Експресію МР перевіряли за допомогою тесту ї- імунопероксидазного моношару (ІРМА), (як описано у Рееїгегз еї аі., 1992) з використанням моноклонального антитіла 38 ІКигвзеї! еї аї., 1983).

Для гена Р: праймер рКкТІ (5-САААСААТТСАСААААДААСТАСОСОТАСАА-3: нуклеотиди 1794-1814) « використали для зворотної транскрипції. Праймери рАТтІ і р2 (5-ВСАСТСТАСАТТАОССАТТСАСТОСАдДООССОС-3: нуклеотиди 3053-3071) використали для ПЛР з - с ДНК-полімеразою Ржо. Використали наступні умови ПЛР (30 циклів): ЗО секунд при 952С, 40 секунд при 659С і и бО секунд при 722С. Одержаний в результаті ДНК-фрагмент розщеплювали рестриктазами ЕсокКіІ і Хваї і » клонували в склад рОІпео між ЕсокКіІ- і ХраІ-сайтами. Експресію Р перевіряли за допомогою тесту ІРМА з використанням моноклонального антитіла 688 ІКизвеї! еї аї., 19831.

Для гена М: праймер ЗТ (-АССААДААСАСАСААТССОТОАСТТАСОА-3. нуклеотиди 1-27) використали для - зворотної транскрипції. Праймери МОМ5М (5-ВБОБТОСТАвСОБАСТОССССААТТОТОССАА-3, нуклеотиди -1 3268-3288) ії МОМЗМ (5-ТСТОСССООООСАССТТАТТТСТТАААДАСОАТ-3, нуклеотиди 4368-4389) використали для ПЛР з набором реактивів Ехрапа Нідп Рідеїйу КІ. ПЛР проводили протягом 10 циклів по 15 секунд при 959С, - ЗО секунд при 552С і 2 хвилини при 682С з подальшими 15 циклами, в яких час добудування ланцюга при 682 їз 20 збільшували на 20 секунд за кожний цикл. Одержаний в результаті ДНК-фрагмент обробляли ДНК-полімеразою

ТА для затуплення кінців, розщеплювали рестриктазою МнНеї і клонували в склад рСіпео між МнНе!- і Зта!-сайтами. щи Експресію білка М перевіряли в тесті ІРМА з використанням моноклонального антитіла 424 ІКиззеї! еї а!., 19831.

Для гена РЕ: праймер ЗШІТ (див. вище) використали для зворотної транскрипції. Праймери МОМ5БЕ (5-АСВСОСТАССОАТТСТОСАТСССОСТТОО-3": нуклеотиди 4508-4526) і МОМЗЕ (Б-АСТАСССООСАААССТТООТТССТСАТ-3": нуклеотиди 6212-6231) використали для ПЛР з набором реактивів

ГФ) Ехрапа Ніоп Ріаеїйу Кії з використанням тих же умов, які описані вище для гена М. Одержаний в результаті

ДНК-фрагмент обробляли ДНК-полімеразою 74 для затуплення кінців, розщеплювали рестриктазою Мнеї і ді клонували в склад рСіпео між МнНеї!- і Зта!І-сайтами. Експресію білка Е перевіряли в тесті ІРМА з використанням моноклонального антитіла ЗВЕ12А8С3 (10-01 0, Оері. Аміап Мігої!.). 60 Для гена НМ: праймер ЗШІТ використали для зворотної транскрипції Праймери МОУБнНМ (Б-СТАВОСТАССААСАСАвОССОССССТСААТ-З: нуклеотиди 6335-6354) і МОМЗНМ (Б-СВАвСССОООССООСАТТСООСТТТОАТТСТТО-3"; нуклеотиди 8205-8227) використали для ПЛР з набором реактивів Ехрапа Нідп Рідеїйу Кі при тих же умовах, які описані вище для гена М. Одержаний в результаті фрагмент ДНК обробляли ДНК-полімеразою Т4 для затуплення кінців і після розщеплення рестриктазою Хтаї бо його клонували в склад рСіпео між затупленим (за допомогою фрагмента Кленова) Мпе!-сайтом і Хтаї!-сайтом.

Експресію білка НМ перевіряли в тесті ІРМА з використанням моноклонального антитіла 86 ІКизвзеї! еї а/!., 1983).

Для гена І: ген І був виділений з кКДНК клону рОЕМ-1 7а (Фіг.4А) шляхом розщеплення рестриктазами засі! і зЗаїї. Перед розщепленням рестриктазою Заї! БЗасі-сайт затупляли шляхом обробки ДНК-полімеразою Т4.

Одержаний в результаті фрагмент клонували в рСіпео між затупленим (за допомогою фрагмента Кленова)

Мпе!-сайтом і Заї-сайтом. 5іІ-Нетрансльована ділянка між промотором 17 і старт-кодоном АТО в послідовності гена Ї. включає два позарамкових кодона АТО, які можуть заважати нормальній експресії білка І. Тому, була сконструйована нова плазміда, в якій перший кодон АТО був пропущений і в якій другий кодон АТО був змінений на ААО шляхом ПЛР-мутагенезу в відповідності з наступним. Праймери 5І Е(Е) 70. (5-СААТОСААТТСААООСААААСАССТСААООТАААТААТАСОСО-3; нуклеотиди 8332-8374) і З'Е(Е) (5-СТОААТСТАСААТОССОСАТССОТАСОААТОС-3; нуклеотиди 8847-8870) використовували в реакції ПЛР, в якій плазміда РОЕМ-1І 7а (Фіг.4) використовувалася як матриця. ПЛР проводили с використанням ДНК-полімерази

Рмжо в режимі 30 циклів по ЗО секунд при 942С, 45 секунд при 602С і 60 секунд при 7220. Одержаний в результаті

ДНК-фрагмент розщепляли рестриктазами ЕсокіІ і Хваї і клонували в склад рСіІпео між Есокі- і ХраІ-сайтами, 75 формуючи плазміду рСіІпео|! (М). Після цього ВзіммІ/ЗаіІ-фрагмент з складу РОЕМ-І 7а, який включає частину гена

Ї, яка залишилася (нуклеотиди 8852-15046), клонували в рСіІпео! (М) між ВвіммІ- і ЗаїЇ-сайтами, одержуючи в результаті плазміду рСіпеоі! (с). Оскільки, антитіла, специфічні по відношенню до білка | поки недоступні, перевірити експресію ГІ. імуноцитохімічними методами не можливо.

Внесення генетичної мітки в ген Е

Для того щоб недвозначно показати, що інфекційний вірус може бути одержаний з клонованої повнорозмірної

КДНК, генетичну мітку вносили в склад гена Е шляхом ПЛР-опосередкованого мутагенезу. Для цієї мети ген ЕР клонували з використанням двох ПЛР-фрагментів, що перекриваються. Перший ПЛР-фрагмент одержували з використанням праймера МОМ5Е (див. вище) і праймера ЕК (5-АААОСОССОСсСтТОТСстТоСтТоСсСТоСАСАТОТАСТСАС-3: нуклеотиди 4859-4894). Виділені напівжирним сєч шрифтом нуклеотиди відповідають змінам, які були внесені в цей праймер з метою зміни амінокислотної о послідовності сайта протеолітичного розщеплення між послідовностями РЕ1 і Е2, щоб "перейти" від МОМ штаму.

ГазЗоїа (ЗОКОСК)І) до консенсусного сайта розщеплення, характерного для вірулентних штамів МОМ (СЕКОКБК). Другий ПЛР-фрагмент був одержаний З використанням праймерів ЕЗЕ (БОБАОБСАСАСАОСООСОСТТ ТАТА СОССАТТАТТОО-3": нуклеотиди 4875-4911) і мо о (5-СТСТОТСОАСАСАСАСТАССАСААСТТТСАС-31; нуклеотиди 6246-6266). ПЛР проводили з ДНК-полімеразою «

Рмжо в 25 циклах по 15 секунд при 942С, 30 секунд при 5590 і 2 хвилин при 722С. Два ПЛР-фрагменти, що перекриваються (перекриття в послідовностях праймерів виділене курсивом) з'єднували в другій реакції ПЛР з -- використанням праймерів МОМБЕ і МО9 і в тих же умовах проведення реакції. Одержаний в результаті фрагмент, їм який включає повну кодуючу рамку гена Е і який кодує вірулентний консенсусний сайт розщеплення, обробляли рестриктазами Мнеї і Заї і клонували в склад рСіпео між МНеї!- і Заї-сайтами, одержуючи плазміду рСІпеоє УТ, -

ВІШІ-Мой-фрагмент (нуклеотиди 4646-4952) з складу рСіІпеоЕ У! використали для заміщення відповідного фрагмента в плазміді ро35-3, яка була сконструйована шляхом вбудування Сіаі/ЗсаІ-фрагмента (нуклеотиди 35211-10311) з складу РОЕМ-В в р535-01І між Сіа!- і ЗеаІ-сайтами (див. Фіг.4С). Одержану в результаті плазміду « 20 визначили р535-5(ЕМ/Тс|. ПЛР;-фрагмент, що включає ген резистентності Ст з складу рАСУС184 (див. вище), з с клонували у вигляді ХраІ-фрагмента за унікальним ХбраїЇ-сайтом (6172-й нуклеотид послідовності геному МОМ) плазміди р535-5 |(ЕМ/Тс|, одержавши плазміду р535-5ІЕ"Тс|Ст. Після цього Ст-помічений Ара!-ЗреІ-фрагмент :з» (нуклеотиди 2285-8094) з цієї плазміди використали для заміщення відповідного фрагмента повнорозмірної к ДНК в плазміді РМОРІ ї. Нарешті, ген Ст видаляли з цієї плазміди шляхом розщеплення рестриктазою Хваї з подальшим відновленням кільцевої структури за допомогою ДНК-лігази Т4. Одержану в результаті плазміду, яка -І включає генетично помічену повнорозмірну КДНК МОМ, визначили РМОБЇ ЧЕМ,

Утворення ліній стабільно трансформованих клітин, які експресують окремі гени МОМ - Плазміди рСіІпеоМР, рСіІпеоР, рСіІпеоМ, рСіпеобєб, рСіІпеог 7 і рСіпеоНМ використали для утворення ліній - стабільно трансформованих клітин, які експресують ці білки окремо. За день до проведення трансфекції клітини

СЕК висівали на 6-см культуральні чашки і інкубували протягом ночі до досягнення рівня злиття 60-8095. Клітини е трансфікували 2мкг плазмідною ДНК з використанням 12мкл ліпофектаміну і ОріїМет, по суті як описано у 4) виробника (СірсоВкі ЛІ Ше Тесппоіодіев). Через 48 годин клітини обробляли трипсином і розведення висівали на 10-см культуральні чашки в середовище, що містить 500мкг/мл антибіотику 5418 (Воейгіпдег Маппеїт). Кожні З дні культуральне середовище замінювали свіжим середовищем, що містить зростаючу кількість (при кроці в ООмкг/мл) (3418 до досягнення концентрації 80Омкг/мл. Клітини витримували в середовищі, що містить 8ООмкг/мл (3418, і через З тижні після трансфекції окремі колонії вирізали і переносили на 9б-луночні і) культуральні чашки. Клоновані клітинні лінії тестували за експресією відповідного гена МОМ з використанням ко тесту ІРМА, як описано вище для аналізу непостійної експресії.

Клітинні лінії, які постійно експресували білок МР, Р, М або Е, були ідентифіковані і виділені. Однак, не 60 вдалося утворити клітинні лінії, які б експресували білок НМ. Приблизно конститутивна експресія НМ є токсичною для клітин. Утворення ліній стабільно трансформованих клітин, які експресують РНК-полімеразу Т7

Ген, кодуючи РНК-полімеразу 17, був виділений з плазміди рКТ7МТ (Кепе мап Сеппір, І0-ОГ 0, Оерагітепі ої

Маттаїіап Мігоіоду) шляхом обробки рестриктазами Есокі і ЗаїЇ. Одержаний в результаті фрагмент включає ген

РНК-полімерази 17, що знаходиться позаду бакуловірусного промотору Р 10. ДНК-фрагмент клонували в склад 65 плазміди рСіпеоО між ЕсокіІ- і Зай-сайтами, одержавши плазміду рСіпеоюЮ?7. Плазміда рСІпеоО позбавлена промотору Т7 і була одержана з рСіпео шляхом розщеплення рестриктазою Мпеі з подальшим частковим розщепленням беаі, заповненням "липких кінців за допомогою фрагмента Кленова ДНК-полімерази і відновлення кільцевої структури з допомогою ДНК-лігази Т4. Бакуловірусні послідовності видаляли з рСІпео107 шляхом обробки рестриктазами ЕсоК!І і Расі з подальшим затупленням кінців за допомогою обробки

ДНК-полімеразою Т4 і відновленням кільцевої структури. Одержану в результаті плазміду визначили рСІпео007.

Експресію РНК-полімерази Т7 перевіряли шляхом котрансфекції клітин плазмідами рСіІпео007 і рРРКНО1. Остання з них включає ген білка Е2 вірусу класичної лихоманки свиней, клонований за промотором Т7 і включаючий внутрішній сайт зв'язування на рибосомі (Кепе мап Сеппір, персональне повідомлення). Експресію Е2 тестували в ІРМА з використанням моноклонального антитіла 4 |(М/епзмоогі еї а!., 1986). Лінії стабільно трансформованих 7/0 Клітин СЕК, експресуючих РНК-полімеразу 17, утворювали і виділяли, як описано вище, за винятком того, що використали 10-см культуральні чашки і клітини трансфікували 5мкг плазміди рСіІпео007 і 25мкл ліпофектаміну.

Для аналізу окремих клітинних ліній на експресію РНК-полімерази Т7 їх трансфікували плазмідою рРЕНОЇ, і експресію Е2 (яка залежить від РНК-полімерази Т7) визначали в тесті ІРМА з використанням моноклонального антитіла М4. Було ідентифіковано декілька клітинних ліній, які експресували РНК-полімеразу Т4. Для подальших /5 експериментів використали одну з цих клітинних ліній, позначену СЕК-С9. Клонування і експресія генів НМ і химерних генів НМ

Праймер ЗШІТ використали для синтезу одноланцюгової КДНК МОМ і серотипів 2 і 4 параміксовірусу птахів (АРММ2 і АРММА4), як описано вище. Всі подальші ПЛР проводили в 25 циклах по 15 секунд при 942С, 30 секунд при 552С і 2 хвилини при 7296.

Повнорозмірну кодуючу ділянку гена НМ серотипу АРММ2 виділяли з допомогою ПЛР з використанням праймерів моз (5-СВССООБААТТССССАТТСААТОАДАСОСТСТАС-3)) і ІммОо5 (5-САТССССОООТСТТАААССАСОСТТСОСААТО-3). які є похідними від послідовності гена НМ АМРМ2 (СепВапк, депозитарний Моб14030). Повнорозмірну кодуючу ділянку гена НМ серотипу АРММА4 виділяли з допомогою ПЛР з використанням праймерів ІМО6 (5-СОСООСААТТСТООТАвООТООООААОСтТАСС-3) і ІМО8 Га (5-АТОСССОООООСТААСТААТСАССАТСТСАС-3), які є похідними від послідовності гена НМ АМРМУ4 (СепВапк, депозитарний Мо014031). Одержані в результаті ПЛР-фрагменти розщеплювали (або відразу, або о після клонування в рІЕМ-Т) рестриктазами ЕсокіІ і Хтаї! і клонували в рСіпео між ЕсоКіІ- і Хтаї!-сайтами.

Одержані в результаті плазміди визначили рСіІпеоНіМ2 і рСІпеоНМа4, відповідно.

Химери між геном НМ МОМ штаму Габоїа і генами НМ штамів АРММ2 і АРММ4 були сконструйовані з «о допомогою ПЛР з праймерами, що перекриваються таким чином. М-кінцева ділянка (що кодує амінокислоти 1-141) гена НМ МОМ штаму ГазЗоїа ампліфікували з використанням ДНК-полімерази Ро з праймерами ІМО1В З (5-СТАССААТТСААСАСАООССОССССТСААТ-У; нуклеотиди 6325-6354) і ЇМО че (Б-ААТСАСТТСТТТОССТАТСССССС-3, "нуклеотиди 6811-6834). С-кінцеву частину гена НМ АРММ2 (кодує амінокислоти 142-580) ампліфікували з використанням ДНК-полімерази Рмжо з праймерами ІМ118 - (5-ВСБООБАТАООСАААСААСТСАТТСААООСАСАТОСАТСТОСАСОС-3) і ІМО5. Одержані ПЛР-фрагменти їж. з'єднували методом ПЛР з праймерами (ділянки перекриття виділені курсивом), що перекриваються з використанням праймерів ІМО1В і ІМО5 і набору ферментів Ехрапа Нідй Рідаеїйу КИ Одержаний в результаті

ПЛР-фрагмент розщеплювали (або відразу, або після субклонування в рОєМ-Т) рестриктазами Есокі і Хтаї і « клонували в склад рСіпео між Есокі|- і Хта!-сайтами. Одержану плазміду, що включає химерний ген НМ, і кодує амінокислоти 1-141 МОМ і амінокислоти 142-580 АРММ2, визначили рСІпеоНМ1/2141. - с С-кінцеву частину гена НМ АРММА (кодує амінокислоти 143-569) ампліфікували з використанням праймерів ц ЇІМ148 (5-ВСбОБООбАТАООСАААСААСТСАТТОТАСАТОАТОСАТСТОСАСОССТАААТТТСС-3) і МО8. Цей "» фрагмент з'єднували з М-кінцневою частиною гена НМ МОМ (див. вище) методом ПЛР з праймерами, що перекриваються з використанням праймерів ІМО18 і ІМО8. Одержаний в результаті ПЛР-фрагмент розщеплювали (або відразу, або після субклонування в рОєМ-Т) рестриктазами Есокі і Хтаї і клонували в склад рСіпео між -і Есокі- і Хта!І-сайтами. Одержану плазміду, що включає химерний ген НМ, що кодує амінокислоти 1-141 МОМ і -1 амінокислоти 143-569 АРММА, визначили рСіІпеонМ1/4771,

Аналогічно конструкціям, описаним вище, були утворені химерні гени НМ, що кодують амінокислоти 1-143 - МОМ їі амінокислоти 144-580 АРММ2 або кодуючі амінокислоти 1-143 МОМ і амінокислоти 145-569 АРММ4. Для ї» 50 одержання цих конструкцій ПЛР-фрагменти одержували з використанням наступних пар праймерів: амінокислоти 1-143 МОМ, праймери ІМО1В і ІМ13 (5-АТСТАСААТОАСТТСТТТОССТАТО-3; нуклеотиди 4; 6816-6840); амінокислоти 144-580 АРММ2, праймери ІМм148 (5-ВОССОООБАТАООСААДАСААСТСАТТОТАСАТОАТОСАТСТОСАСОССТАААТТТСОС-3) і ІМО5; амінокислоти 145-569 АРММА4, праймери ІМ158 (5-ВбБООБАТАООСААДАСААСТСАТТОТОАТСААДАСАОСТОАСТАСАСАССАО-3) і мов. Одержані о ПЛР-фрагменти розщеплювали (або відразу, або після субклонування в рРОєМ-Т) рестриктазами Есокі і ХтаїЇ і клонували в склад рСіпео між Есові- і Хта!-сайтами. Одержані в результаті плазміди визначили рСіІпео//27733 і о рСіІпеоі/4773, відповідно. Для аналізу експресії білків НМ клітини СЕК або клітини ОМ5 інфікували ЕРМ-Т7 протягом 1 години при МОІ-1, трансфікували плазмідами рСіІпеоНМ, рСІпеонМ2, рСІпеонМ4, рСІпеонМ1/2 77, 60 рСІпеонМ1/2 773, рСІпеонНМ1/4771 ї рСІпеонМ1/4773 ії через 24 години після трансфекції моношарові культури покривали 195-вою суспензією курячих еритроцитів в ФСБ протягом 45 хвилин при кімнатній температурі. Після цього моношари ретельно промивали З рази ФСБ і прилипання еритроцитів до трансфікованих клітин аналізували під мікроскопом. Для аналізу індукції злиття клітин після одночасної експресії білків НМ ії Є 65 клітини СЕК або клітини ОМ5 котрансфікували плазмідою рСІпео"/! разом з однією з плазмід рСІпеонмі, рСіІпеонМ2, рСіІпеонНМ4, рСІпеонМ1/2771,. рСІпеонМ1/4771,. рСІпеонМ1/2723 ї рСІпеонМ1/4773, Після інкубації протягом 2-3 днів моношарові культури промивали в ФСБ, забарвлювали протягом 15 хвилин розчином Гімза (1:30 розведення у воді) і аналізували під мікроскопом.

Клонування химерних генів НМ в повнорозмірну КДНК геному МОМ

Синтетичний лінкер, позначений НМ12, був вбудований між Мої!- і ЗреІ-сайтами плазміди РОЕМ-Т (Рготеда) з використанням олігонуклеотидних праймерів НМ12а (5-ЗОССОСАТАТТСТАСАСТТААСОАСТТА-3) і НМ126 (5-СТАСТААСТСОТТААСТСТАСААТАТОС-3). Синтетичний лінкер, позначений НМ14, був вбудований між Мой-і

Зре!-сайтами плазміди рРОЕМ-Т з використанням олігонуклеотидних праймерів нМл14а (5-СОССОСАТАТТСТАСАСТТААСОА-3) і НМ 146 (5-СТАСТСОТТААСТСТАСААТАТОС-3). Одержані в 7/о результаті плазміди визначили роеєМ-НМІ12 ії РОСЕМ-НМ14, відповідно. Ці плазміди розщеплювали рестриктазами

Мой і ХвраІ і використали для клонування Мой/реІ-фрагмента (нуклеотиди 3390-7488) з складу плазміди р535-5ЦЕ М Тс| Ст. Одержані в результаті плазміди визначили РзЕМ-НМ1/2М5 і РЕМ-НМ1/4М8, відповідно. Гени

НМ з цих плазмід замінювали химерними генами НМ з плазмід рСІпеонНМ1/2773 ї рСІпеонМ1/4773, відповідно (див. розділ "Клонування і експресія генів НМ і химерних генів НМ"). Для цієї мети плазміди рСіпеоНМ1/2 773 75 рСіпеонМ1/4773 розщеплювали рестриктазами Мпеі і та! і одержані фрагменти (включаючи химерні гени

НМ1/2143 ї НМ1/4773)), клонували між МнНеї!- і НраІ-сайтами плазмід РОЕМ-НМ1/2М5 і РСЕМ-НМ1/4МЗ з одержанням плазмід РОЕМАНМІ12 і рРОЕМНМ14, відповідно. Останні плазміди використали для внесення химерних генів НМ в повнорозмірну геномну кКДНК вірусу МОМ. Для цього плазміди РОЕМАНМ12 Її РОСЕМАНМІ14 розщеплювали рестриктазами Мої! і Зреї, і одержаний фрагмент, що включає або ген НМ12, або ген НМ14, використовували для 720 заміщення відповідного фрагмента в складі рМОБЇ -, одержуючи тим самим рМОБІ -НМ1/2 73 Ст і рімоОгснмнт/А азс, відповідно. Ген Ст видаляли з складу цих плазмід шляхом обробки рестриктазою Хваї з подальшим відновленням кільцевої структури з допомогою ДНК-лігази Т4. З метою відповідності "правилу шести" лінкер вбудовували за унікальним ЗреіІ-сайтом в складі цих плазмід з використанням саме комплементарних с Оолігонуклеотидів. Лінкер Н2 (Х-СТАОСОАОСОСТОО-3) був вбудований в плазміду РМОБЇ -НМ1/2773, а лінкер

НЗ (Б-СТАВСОдОСУОСТСО-3) був вбудований в плазміду рРМОРІ «МНІ1/4773, внаслідок чого одержували о плазміди РМОБЇ «НМ1/275(Н2) і РМОРІ 4МН1/4773 (Н3З), відповідно.

Видалення специфічного епітопу з білка НМ МОМ штаму І абоїа

Специфічний епітоп, тобто амінокислоти 346-354 (РОБОЮМ ОІВ) в послідовності білка НМ вірусу МОМ штаму

І азоїа, який розпізнається моноклональним антитілом 406 | опо еї аї!., 1986; Мешетавпз еї а/!., 1986), видаляли « шляхом заміщення цієї послідовності на відповідну послідовність білків НМ або АРММ2 (МАКТОІООТІ), або АРММ4 (РОРГОБОЇЇ). Для цього плазміду рСіпеоНМ |див. розділ "Клонування і експресія окремих генів. МОМ" «- використали як матрицю для створення ПЛР-фрагментів, що перекриваються. Для послідовності АРММ2 перший їм

ПЛР-фрагмент одержували з використанням праймера ІМО1 (Х-СТАСАСОСОТААСАСАСОСсСОСсССсСТСААТ-З) і праймера 2НМ2 (5-ЗАТАСТТТОСТОТАТАТСАСТОСОСАТТОСАТОТОТСАТТО-3). Другий ПЛР-фрагмент ї- одержували з використанням праймерів 5нМ2 (5-ААТСОСАСТОАТАТАСАССАААСТАТСАТООССААСТСТТОО-3) і МОМЗ3-НМ (Б-СВАвСССОООССООсСАТТСОСТТТОАТТСТТО-3). Одержані в результаті фрагменти об'єднували (і « використали як матриці для третьої ПЛР з праймерами ІМО18 (5-СТАСОААТТСААСАСАСОСсСОСССсСТСААТ-3) 1 МОМЗ3-НМ. Для послідовності АРММ4 перший ПЛР-фрагмент одержували з використанням праймера ІМО1 і ші с праймера ЗНМ4 (5-ТААСАТСТСАТСТТССАСССССТСАССССАТСТСТСАТТО-3). Другий ПЛР-фрагмент м одержали з використанням праймерів ЗНМА (5-ССТОАССОСТОСААСАТСАСАТСТТААТООСССААСТСТТСОТ-3) я ії МОМ3-НМ. Одержані в результаті фрагменти об'єднували і використали як матрицю для третьої ПЛР з використанням праймерів ІМО1В ії МОМЗ3-НМ. Праймери ЗНМ2/5НМ2 їі ЗНМА/5НМА частково комплементарні і включають генетичні коди для послідовності НМ2 (МКТОІООТІ) Її для послідовності НМА (РОРГОБОЇ, - відповідно. Реакції ПЛР проводили з використанням набору реактивів Ехрапа І опд Тетріайе РСК Кії (Военгіпдег -1 Мапппеїйт). ПЛР включала ЗО циклів по 10 секунд при 942С, 30 секунд при 5892С і 2 хвилини при 6890 з подальшим 1 циклом протягом 4 хвилин при 682С. ПЛР-фрагменти розщеплювали рестриктазами Есокі і Взиз361 - і клонували між ЕсоКіІ- і Взи36б1-сайтами в плазміду рСіпеоНМ. Одержані в результаті плазміди визначили їх 20 рсіпеонм1(НМ2е) і рСіпеонм1 (Не), відповідно. Аналіз експресії, що перемежається показав, що модифіковані білки НМ точно експресуються і переносяться на поверхню клітини, на що вказує аналіз гемоадсорбції на м. матеріалі курячих еритроцитів. Більш того моноклональне антитіло 604, яке специфічне по відношенню до лінійного епітопу НМ МОМ, який складається з амінокислот 346-354 (або принаймні включає їх), не реагує з модифікованими білками НМ. 59 Плазміди рСІпеонМ1(НМ2е) і рСіпеоНнМ1(НМа4е) розщеплювали рестриктазами Маг! і Зреї, і фрагменти, що

ГФ) включають модифіковані гени НМ, клонували між Магі- і ЗреІ-сайтами плазмід РІЕМ-НМ1/2М5 і рєМ-НМ1/4М5, відповідно. Одержані в результаті плазміди, позначені РОСЕМ-НМ1(НМ2е) і РрОЕМ-НМІ(НМ4е), розщеплювали де рестриктазами Мой і ре! і використали для заміщення МойШ/ЗреІ-фрагмента в складі РМОРІ к. Одержані в результаті плазміди визначили РМОРІ-НМ(НМ2е)Ст їі РМОРІ-НМ(НнМ4е)Ст, відповідно. Ген Ст видаляли з цих 60 плазмід розщепленням рестриктазою Хра! з подальшим релігуванням. Одержані в результаті плазміди визначили РМОРІ -НМ(НМ2е) і РМОРІ-НМ(НМае), відповідно.

Результати

Нуклеотидна послідовність 3'-і 5'-кінцевих ділянок геному МОМ штаму І азоїа

Нуклеотидна послідовність передбачуваного 3-кінця геному МОМ опублікована (Ізпіда еї аї., 1986), хоча і бо на матеріалі іншого штаму МОМ (026), ніж, який використовувався в даній роботі (І аЗоїа). Опублікована (Мизоїї еї аї,, 1987| послідовність гена | і відносно великої некодуючої ділянки за геном | вірусу МОМ штаму

Веашйдецне-С. Однак, як тут показано, дана послідовність не включає повну 5-кінцеву частину вірусного геному, що робить неможливлим створення інфекційної копії МОМ. 3'- і 5'-кінцеві ділянки геному вірусів з некодуючими одноланцюговими РНК відіграють ключову роль в реплікації і транскрипції Шатр й КоїаКоївКу, 1996). Таким чином, з метою одержання повнорозмірної КДНК геному МОМ, яку можна було б використати для одержання інфекційного вірусу методами зворотної генетики |(СопгеІтапп, 1996), абсолютно необхідно включити у вірусний геном точні 3- і 5'-кінцеві ділянки. Отже, авторами була визначена точна нуклеотидна послідовність обох 3- і 5-кінців геномного РНК вірусу МОМ штаму ГІ абоїа з використанням методу 3- і 5 --АСЕ (швидка ампліфікація 7/о кінців КДНК). 5- Кінцева ділянка була виділена з допомогою ПЛР після літування одноланцюгового якірного праймера (А! 3) на одноланцюгову кКДНК, яку одержували шляхом зворотної транскрипції 5'-кінцевого сегмента геномної РНК. З використанням праймера А! 04, комплементарного якірного праймера, і МОМ-специфічного праймера були одержані ПЛР-продукти, які включали 5'-кінцеву ділянку.

Для клонування 3'-ділянки МОМ одноланцюговий якірний прайм ер АГ ОЗ лігували на 3'-кінець вірусної РНК з /5 Використанням РНК-лігази ТА і ампліфікували методом ПЛР з праймером А! 4 і МОМ-специфічним праймером (спосіб І). З іншого боку, 3- і 5-кінцеві діллнки РНК МОМ лігували одна на одну з використанням РНК-лігази

Т4 і одержаний в результаті РНК-конкатенат використали в ПЛР з ревертуванням з МОМ-специфічними праймерами, які фланкують точку лігування (спосіб ІІ). Продукти реакцій 3- і 5-КАСЕ клонували в Т-вектор рВіпезсгірнІ-ТеК (Іспінага 8 Кигозама, 1993) або в рОЕМ4А7 з подальшим виділенням і секвенуванням декількох 2о незалежних клонів. Одержані результати узагальнені в табл. 2. Для проведення прямого порівняння 3'- і 5-кінцевих ділянок нуклеотидні послідовності показані у вигляді ДНК, а 3-кінець геномного ланцюга представлений як 5-кінець антигеномного ланцюга. На рівні геномної РНК послідовність 3'-кінця читається як

З-ОвООвБООСОСООАС-5, в той час як послідовність 5--кінця читається як 3-О00ОАСАДАСАААССА-5.

Послідовність 3і-кінця майже повністю співпадає з опублікованою 3'-кінцдевою послідовністю МОМ штаму 026 сч

Івпіда еї аї., 1986). Однак, послідовність 5-кінця вказує на те, що МОМ штаму І абоїа включає 64 додаткових нуклеотидів в порівнянні з опублікованою послідовністю гена | МОМ штаму Веайдейце-С ГМизгої еї а/!., 19871 (Фіг.б). і)

Реплікація мінігеномів МОМ з участю вірусу-помічника

Для встановлення того, чи функціональні 3'- і 5'-кінцеві ділянки МОМ за реплікацією і транскрипцією, були сконструйовані мінігеноми, які включали 3'-ділянку МОМ (нуклеотиди 1-119), ген-репортер, що кодує секретовану Ге зо лужну фосфатазу (ЗЕАР), і 5--кінець МОМ (нуклеотиди 14973-15186) (Фіг.2). Вказані мінігеноми клонували в обох орієнтаціях в транскрипційний вектор ро! ТМ5, одержуючи в результаті плазміди ро! ТМ535 і рої! ТУ553, - відповідно |детальніше про конструювання див. розділ "Матеріал і методи"). Плазміда рої! ТУ5 включає (Фіг.1) «- промотор РНК-полімерази Т7 з нижчерозташованими унікальними рестрикційними 5їшцІ- і Зтаї!-сайтами, автокаталітичний рибозим вірусу гепатиту-О (НОМ) і сигнал термінації транскрипції непарного фага 17 |Ранпаїк ї- еї а!., 19921. Внаслідок транскрипції іп мімо або іп міго плазміди ро! ТМ535 з використанням РНК-полімерази ї-

Т7 утвориться антигеномна РНК (тобто |(4-РНК), в той час як при транскрипції плазміди ро! ТУ553 утвориться геномна РНК (тобто |-І-РНК) (Фіг.5).

Для аналізу того, чи може мінігеномна РНК, утворена плазмідами ро! ТМ535 і ро! ТМ553, реплікуватися і експресуватися з участю МОМ, що виконує роль вірусу-помічника, автори використали клітини СЕК, які « експресують РНК-полімеразу 77 або за конститутивним типом (клітини СЕК-С9: див. "Матеріали і методи"), або пт») с після інфікування рекомбінантним вірусом курячої віспи ТрРЕРІ Т7ро! (ІВгійоп еї аї., 19951; тут і далі . означається як ЕРМУ-17), який експресує РНК-полімеразу 17. Клітини СЕК-С9О і клітини СЕК, інфіковані ЕРМ-17, и?» трансфікували мінігеномними плазмідами ро! ТУ535 або рої ТУ553 і після інкубації протягом З годин при 372 клітини або інфікували МОМ протягом 1 години, або залишали неінфікованими. Приблизно через 24 години після трансфекції зразок відбирали з культурального середовища і оцінювали активність ЗЕАР. Одержані результати -і показали, що експресія ЗЕАР була дуже високою в клітинах, інфікованих ЕРМУ-17 і трансфікованих плазмідою ро! ТУ535. Це недивно тому, що транскрипція під контролем РНК-полімерази Т7 утворить антигеномну Г(4-РНК,

Ше кеповану ферментами курячої віспи, яка ефективно транслюється в клітині-хазяїні. У клітинах, трансфікованих - ро! тМ553, транскрипція з участю РНК-полімерази 17 утворить геномну (І-І-РНК, яка, для того, щоб транслювати білок БЕАР, повинна заздалегідь конвертуватися в Г(4-РНК з участю вірусу-помічника (порів. з Фіг.5). У обох те випадках в клітинах, інфікованих МОМ, в порівнянні з неінфікованими клітинами, не виявляється збільшення

Ф експресії ЗЕАР. З іншого боку, експресія ЗЕАР в МОМ-інфікованих клітинах була стабільно приблизно вдвічі нижчою в порівнянні з неінфікованими клітинами (дані не включені). У випадку з клітинами, трансфікованими ро! ТУ535, це можна пояснити дуже високим рівнем експресії, що вже є 5ЕАР з транскриптів, утворених з участю

РНК-полімерази Т7. Однак, в клітинах, трансфікованих ро! ТМ553, в яких ефективна експресія залежить від конверсії геномної І-І-РНК в антигеномну І--РНК або мРНК з участю полімеразного комплексу, можна було б іФ) чекати збільшення експресії ЗЕАР після інфікування МОМ. ко Автори передбачили існування двох причин, за якими мінігеноми не здатні експресувати і реплікуватися з участю МОМ. По-перше, розмір мінігеномних РНК не задовольняє так званому "правилу шести" |СаїЇаійп 5 Коих, бо 1993; КоїакоїзКу еї а!., 1998). Згідно з цим правилом, геноми параміксовірусів ефективно реплікуються тільки тоді, коли їх довжина кратна б нуклеотидам. По-друге, два додаткових нуклеотиди с, які розташовуються на 5-кінці мінігеномних РНК, можуть заважати точній реплікації і/або транскрипції з участю вірусного полімеразного комплексу. Для оцінки того, чи дійсно реплікація геномів залежить від "правила шести", автори внесли за унікальним Сіаі-сайтом плазмід рО!/ТМ535 і роОІ/ТМ553 серію коротких, самокомплементарних 65 Оолігонуклеотидів, які збільшували довжину на 1 нуклеотид (Фіг.2). Одержані в результаті плазміди (рОГТУ535 від МО до М5 і ро! ТУ553 від МО до М5) розрізнюються за розміром на 1-6 нуклеотидів, отже, один з них повинен утворити мінігеномну РНК, яка задовольнить "правилу шести". Ці плазміди використали для трансфекції клітин

СЕК або клітин СЕК-С9, інфікованих ЕРМ-Т7, як описано вище. Одержані результати показали, що тільки плазміди ро! ТУ5З35МІЗ і ро! тТуУ553МЗ зумовлювали посилення активності ЗЕАР після МОМ-інфікування. Довжина мінігеномних РНК, одержаних з цих плазмід з участю РНК-полімерази 17, була визначена як бп1-2. Оскільки на 5-кінці вказаних мінігеномних РНК присутні два "зайвих" нуклеотиди С, то ці дані підтверджують, що тільки розмір послідовності РНК, розташованої між аутентичними 3- і 5--кінцями мінігеномних РНК, є істотним для "правила шести". Це перевіряли шляхом конструювання мінігеномних плазмід, в складі яких старт-сайт транскрипції РНК-полімерази Т7 змінювали так, що перший нуклеотид, який вбудовується в РНК, був першим 7/0 Нуклеотидом 3- або 5-кінця МОМ (див. "Матеріали і методи"). Трансфекція цими плазмідами показала, що тільки ті мінігеномні РНК, які походили від плазмід рої Ту535М3 і ро! ТтУ553М3, реплікуються з участю вірусу-помічника (дані не включені). Встановлення даного факту додатково вказує на те, що реплікація МОМ жорстко обмежена "правилом шести". Більш того ці дані вказують на те, що присутність двох "зайвих" нуклеотидів С на 5'-кінці мінігеномних РНК не заважає точній реплікації. Аналогічні результати були одержані на матеріалі мінігеномних 7/5 плазмід (або плазмід 0) інших параміксовірусів |РакнаїкК еї а!., 1992; Напу 4 Раїезе, 1995).

Упакування мінігеномів МОМ з участю вірусу-помічника

Для встановлення того, чи можуть мінігеномні РНК бути упаковані з участю вірусу-помічника МОМ, культуральне середовище трансфікованих клітин переносили на свіжі моношари і після 1-годинної адсорбції моношарові культури тричі промивали ФСБ і додатково інкубували в повному середовищі. Після інкубації протягом 24 годин вимірювали активність ЗЕАР в культуральному середовищі. Одержані результати показали, що активність ЗЕАР була присутньою тільки в клітинах, які були оброблені культуральним середовищем, взятим від клітин, трансфікованих мінігеномною плазмідою ро! ТУ553М3 (таблиця 4). Ці дані вказують на те, що мінігеномні РНК можуть бути упаковані в оболонки МОМ і що одержані вірусні частинки здатні інфікувати клітини. Більше того ці дані показують, що упакування залежить від реплікації, а це говорить про те, що сч ов Тільки ті молекули РНК, які утворять комплекс з вірусними білками МР, Р ії І, упаковуються у вірусоподобні частинки. і)

Реплікація мінігеномів МОМ з участю плазмід, експресуючих білки МР, Рі.

Для визначення того, чи можуть мінігеномні РНК також реплікуватися з участю плазмід, що кодують ключові білки МР, Р ї Її, були проведені експерименти по котрансфекції клітин, інфікованих ЕРМ-17. Клітини Ге зо трансфікували шляхом поєднання плазмід, що включають мінігеномну плазміду і плазміди рСіІпеоМР, рСіпеор і рСіІпео! (с), відповідно. Як негативний контроль плазміду рСіІпеоі! (с), яка кодує ключовий білок І, замінювали - векторною плазмідою рСіпео. Одержані результати (табл. 5) показали, що дійсно плазміди, що кодують білки -/-" де

МР, Р ії Ї, здатні забезпечувати реплікацію мінігеномних РНК. Також ці результати показують, що аналогічним чином з реплікацією мінігеномів з участю вірусу-помічника, реплікація з участю білків МР, Р ії Ї також є ї- зв Залежною від "правила шести". ї-

Нуклеотидна послідовність повного геному МОМ штаму І абоїа

Субгеномні фрагменти кКДНК, що охоплюють повний геном МОМ, були сконструйовані із застосуванням ПЛР з ревертуванням (Фіг.4). Для мінімізації помилок при ПЛР суміш ферментів, що мають коректуючу активністю (Ехрапа І опд Тетріайе Кі: Военгіпдег Маппіеїт), використали в поєднанні з обмеженим числом циклів ПЛР (15 « циклів). Праймер ЗШІТ, комплементарний 3-кінцю РНК МОМ, використали для зворотної транскрипції, а з с ген-специфічні праймери використали для ПЛР. Для ідентифікації можливих помилок при ПЛР були проведені три незалежні реакції ПЛР, внаслідок яких одержували три незалежні набори субгеномних кДНК. Ці кКДНК, розмір ;» яких варіювався від 4 до 7 тисяч пар нуклеотидів, клонували в рЕМ-Т. Нуклеотидну послідовність двох наборів

КДНК визначали з використанням праймерів, які були або встановлені за параметрами опублікованих послідовностей МОМ, або є похідними від послідовності МОМ, визначеної в ході даного дослідження (таблиця 1). -І Невизначеність, що залишалася дозволяла шляхом секвенування відповідних ділянок на матеріалі третього набору клонів КДНК. Геном МОМ штаму ІГазЗоїа складається з 15186 пар нуклеотидів (Фіг.3), що робить його ш- найменшим серед геномів всіх параміксовірусів, для яких до теперішнього часу встановлена повна геномна - послідовність ІКоїаКоїзкКу еї аї., 1998).

Конструювання клону повнорозмірної КДНК МОМ в транскрипційній плазміді РОЇ ТУ5 ве Для конструювання повнорозмірного клону кКДНК вірусу МОМ штаму І азЗоїа клони кКДНК, що перекриваються, і

Ф охоплюють повний геном МОМ, з'єднували один з одним за загальними рестрикційними сайтами відповідно до підходу, відображеного на Фіг.4. Повну КДНК МОМ збирали в мінігеномній плазміді ро! ТУ535 (див. вище), яка є похідною від транскрипційної плазміди ро! ТУ5.

Як можна бачити на Фіг.АВ, останнім етапом даного збирання повної КДНК МОМ було клонування

СіІаІ-фрагмента довжиною приблизно 8,8 тисяч пар нуклеотидів (нуклеотиди 3521-12355) з складу рРОЕМ-В в (Ф) плазміду р535-ОІ, яка включає послідовності МОМ, фланкуючі СіаІ-сайт за двома сторонами від нього (тобто ка нуклеотиди 1-3521 і 12355-15186, відповідно). Цей етап, як виявилося, є вельми важким, так як заявникам протягом декількох разів не вдавалося утворити точні клони. Отже, СіІаІ-фрагмент плазміди рОЕМ-В був во помічений геном резистентності до хлорамфениколу (Ст) з плазміди рАСУС184. Включаючий ген Ст

СіІаІ-фрагмент був виділений і клонований за Сіаі-сайтом р535-О0І, а одержані трансформанти відбирали за резистентністю до Ст. Оскільки трансформанти характеризувалися слабим ростом, відбір з антибіотиками проводили при зниженні концентрації до 15мкг/мл Ст і 1Омкг/мл канаміцину, а температуру інкубації знижували з 372 до 3220. Нарешті, ген Ст видаляли з даної плазміди шляхом обробки рестриктазою ВвімІ з подальшим 65 Відновленням кільцевої структури з допомогою ДНК-лігази 14. Після трансформації клітин Е. соїї клітини, несучі бажану плазміду, ідентифікували за їх фенотипом з допомогою скринінгу на резистентність до Кт і на чутливість до Ст. Одержану в результаті плазміду, яка включає повнорозмірну КДНК МОМ, клоновану між Зтаг|- і

ЗІШІ-сайтами транскрипційної плазміди, визначили РМОРІ к.

Створення інфекційного МОМ на матеріалі повнорозмірної КДНК

Для створення інфекційного МОМ повністю з клонованої КДНК плазміду РМОРІ - використали в експериментах з котрансфекції з плазмідами рСіІпеоМР, рСІпеоР і рСіІпео! (с), як описано вище для мінігеномних плазмід.

Трансфекцію клітин СЕК і СЕР контролювали з використанням мінігеномної плазміди рОЇ ТМ553МЗ і шляхом вимірювання рівня експресії ЗЕАР. Як негативний контроль використали заміну рСіпео|! (с) на рСіпео. Після котрансфекції клітини інкубували протягом 3-6 днів в середовищі, що містить 595 алантоїсної рідини. Додання 70 алантоїсної рідини необхідне тому, що клітини СЕК або СЕРЕ позбавлені відповідних протеаз, які забезпечують розщеплення білка Е вірусу МОМ штаму І азоїа. Розщеплення білка Е є абсолютно необхідним для поширення від клітини до клітини генерації інфекційного вірусу. Після інкубації протягом З днів проводили імунологічне фарбування фіксованих моношарових культур з використанням моноклонального антитіла, специфічного відносно білка ЕР. Одержані результати показали, що клітини, які забарвлювалися цим антитілом, присутні тільки /5 В тих моношарах, які були котрансфіковані плазмідами РМОРІ|(к), рСІпеоМР, рСіпеор і рСіпео| (с). Ці результати вказують на те, що в цих клітинах відбувається реплікація геному і експресія. Не було виявлено забарвлених клітин тоді, коли в експериментах з котрансфекції рСІпео! (с) замінювали плазмідою реСіІпео.

Для виділення інфекційного вірусу надосадовий шар трансфікованих моношарів СЕБЕ ін'єкували в алантоїсну порожнину курячих яєць, що розвиваються. Через 4 дні алантоїсну рідину збирали, аналізували в 2о Ггемаглютинаційному тесті і знову пасирували в яйця,. Одержані результати показали, що тільки надосадовий шар клітин, трансфікованих поєднанням плазмід рМОРІ (я, рСІпеоМР, рСіІпеоР і рСіІпео| (с), зумовлював позитивну реакцію в тесті на гемаглютинацію. Алантоїсну рідину, яка характеризувалася позитивною реакцією гемаглютинації, після цього аналізували в тесті на пригнічення гемаглютинації з використанням моноклональних антитіл 787, 8С11, 5А1, 704 і 406 | опо еї аї., 1986), які можна використати для диференціювання різних сч ов штамів МОМ. Результати даного тесту показали, що штам МОМ, який був виділений з інокульованих яєць, характеризувався тим же рівнем реактивності, що і початковий штам іазоїа. Вірус, який виділили з і) інокульованих яєць, визначили МОРІ, щоб відособити його від початкового штаму І азоїа.

Створення генетично модифікованого МОМ на матеріалі повнорозмірної КДНК

Для того щоб недвозначно показати, що котрансфекцію можна використати для виділення інфекційного Ге зо Вірусу на матеріалі клонованої повнорозмірної КДНК МОМ, в плазміду РМОРІ(к) вносили генетичну мітку. Для цієї мети амінокислотну послідовність сайта розщеплення протеазою в послідовності білка Бо змінювали від такої, « штаму Габоїа (СОВОСК)І) вна консенсусну послідовність вірулентних штамів МОМ (СВЕВБОБКІЕ) із «- застосуванням ПЛР-мутагенезу |детально див. розділ "Матеріал і методи"). Одержану в результаті плазміду,

РМОРБІЯЕ МТ, використали для створення вірусу з використанням котрансфекційної системи, описаної вище. -

Інфекційний вірус, позначений МОБ |ЕМ/7), виділяли з алантоїсної рідини яєць, що розвиваються, які були - інокульовані культуральним середовищем від котрансфікованих клітин СЕР. У тесті на пригнічення гемаглютинації всі моноклональні антитіла, включаючи 704, яке специфічне для штаму І азоїа, виявляли таку ж реактивність відносно новоутвореного вірусу, як і у відношенні початкового штаму ІГазоїа. Нуклеотидну « послідовність ділянки, що кодує сайт розщеплення протеазою білка ЕР, визначали з допомогою ПЛР з ревертуванням. Одержані результати, показали, що нуклеотидна послідовність включає точні нуклеотидні зміни, - с які були внесені в мутагенний праймер, що використовувався для модифікування початкової послідовності "» ІаЗоїа. Ці дані показують, що вірус походив від плазміди рМОБІ ЕМ, і показують, що генетично " модифікований МОМ може бути створений повністю на матеріалі клонованої повнорозмірної КДНК МОМ.

Сайт розщеплення протеазою білка Ро вірусу МОМ є ключовим детермінантом вірулентності

Загалом, вважається, що амінокислотна послідовність сайта розщеплення протеазою в білку Го є ключовим - детермінантом вірулентності у різних штамів МОМ. Створення генетично модифікованого штаму І азоїа, у якого -І амінокислотна послідовність сайта розщеплення протеазою була замінена з лентогенної (невірулентної) на таку від велогенного (вірулентного) штаму МОМ, надає унікальну можливість перевірити дане припущення. Отже, - визначали індекс інтрацеребральної патогенності (ІСРІ) новоутвореного вірусу МОЕЦЕ"М ТІ і порівнювали його з ї» 20 індексами штаму МОРГ. і початковим штамом І азЗоїа (клон Е13-1). Одержані результати показали, що ІСРІ штаму

Ф МОЕЦЕМТ становив 1,3, що істотно перевершує значення для штамів МОРІ. (ІСРІ-О,0) і клону Е13-1 (ІСРІ-О,3).

Ці дані показують, що, як і очікувалося, вірулентність МОМ значною мірою визначається амінокислотною послідовністю сайта розщеплення протеазою в білку Го.

Внесення серологічного маркера 59 Оболонкові глікопротеїни Б і НМ МОМ є найбільш сильними імуногенними білками даного вірусу. Після

ГФ) зараження як білок РЕ, так і білок НМ викликають могутню відповідь у вигляді вироблення нейтралізуючих т антитіл. Індукція такої відповіді за нейтралізуючими антитілами є основою для успішної вакцинації з використанням невірулентний штамів МОМ (таких як штам І абоїа, що широко застосовується ). Однак, відповідь на вироблення антитіл на вакцинні штами МОМ не може бути розпізнана в порівнянні з відповіддю на вироблення 60 антитіл на вірулентні польові штами МОМ. Отже, інфекції вірулентним польовим вірусом не можуть дослідитися за допомогою серологічнох методів. Така ситуація небажана тому, що зараження польовим вірусом маскується вакцинацією, а клінічні ознакию, що викликаються польовими штамами, можуть переглядатися або навіть приписуватися даній вакцині. Оскільки успішне диференціювання між вакцинацією і інфекцією істотне для викорінювання МОМ, автори мали намір розробити генетично модифіковані штами МОМ, які можна було бо використати для вакцинації і які б серологічно відрізнялися від польових штамів МОМ (так звані "маркерні вакцини"). З метою розробки маркерних МОМ-вакцин вірус повинен бути генетично модифікований таким чином, щоб один або декілька імунодомінантних епітопів одного з (основних) антигенів був або делетований, або модифікований. Делеція частини(ин) ключового білка може приводити до втрати біологічної функції даного білка.

Отже, один з імунодомінантних білків оболонки МОМ заявники вибрали для модифікування таким чином, щоб біологічна функція цього білка зберігалася, в той час як репертуар антитіл, специфічних відносно модифікованого білка, відрізнявся від такого, специфічного відносно початкового білка. З точки зору резонів, про які говориться нижче, в одному варіанті даного винаходу заявники вибрали для модифікування білок НМ вірусу МОМ. Інфекція МОМ ініціюється злиттям оболонки віріону з плазматичною мембраною клітини-хазяїна. Для 70 цієї мети необхідні як білок ЕР, так і білок НМ. Було показано, що білки Е і НМ фізично взаємодіють, і ця взаємодія необхідна для злиття мембран ІОепа еї аї!., 1995). Більш того було показано, що така взаємодія є типоспецифічною, тобто білки Е ії НМ повинні походити від одного і того ж вірусу для того, щоб виявити активність за злиттям. Взаємодіючий домен білка НМ вірусу МОМ був картирований в так званому "стебловому" або "стовбуровому" сегменті даного білка, що складається з перших 92 амінокислотних залишків в складі /5 ектодомену білка НМ |Оепоу еї аї., 1995). Гібридні білки НМ, що включають амінокислоти 1-141 МОМ і амінокислоти 141-572 вірусу парагрипу людини 3-го типу (ПРІМЗ), як було показано, зберігають активність за злиттям у випадку коекспрессії з білком Е МОМ. Ці дані підтверджують, що життєздатними можуть бути генетично модифіковані штами МОМ, несучі гібридний білок НМ, що включає "стеблову" ділянку МОМ з подальшим глобулярним сегментом ("голівкою") білка НМ, який відрізняється від серотипу параміксовірусу птахів. Такі го штами будуть викликати відповідь у вигляді антитіл до НМ, яка відрізняється від таких, специфічних для МОМ.

Оскільки відповідь за нейтралізуючими антитілами на білок Е достатня для досягнення ефективного захисту проти початкової вірусної інфекції, то такі генетично модифіковані штами МОМ об'єднують в собі дві ключові властивості маркерної вакцини, а саме захист від захворювання і серологічне диференціювання.

Були сконструйовані гібридні гени НМ, складені злиттям або амінокислот 1-141 МОМ і амінокислот 142-580 сч ов параміксовірусу птахів 2-го типу (АРММ2) (позначена НМ1/2"77), або амінокислот 1-143 МОМ ії амінокислот 144-580 АРММ2 (позначена НМ1/2773), Аналогічним чином були сконструйовані гібридні гени НМ, складені о злиттям або амінокислот 1-141 МОМ і амінокислот 143-569 АРММА (позначена НМ1/4777), або амінокислот 1-143

МОМ і амінокислот 145-569 АРММА (позначені НМ1/4773), Ці гібридні гени були клоновані в еукаріотичний експресруючий вектор рСіпео і їх використали в експериментах з котрансфекції поряд з плазмідою, несучої ісе) 30 білок Е МОМ. Для цього білок Е модифікували таким чином, щоб амінокислотна послідовність сайта розщеплення «г протеазою між 2 і Е1 змінювалася з послідовності, характерної для Габоїа, на ту, яка є консенсусною послідовністю вірулентних штамів МОМ (ЕМУ/Т: див. розділ "Матеріали і методи"). Експерименти з котрансфекції -- клітин СЕК і клітин ОМ5 показали, що як НМ1/2 171, ії НМ1/2773, так і НМ1/4", і НМ1/4743 індукували злиття їм» 35 клітин у варіанті коекспрессії з білком ЕТ, Одержані дані показали, що комплекси між гібридними білками НМ і їч- білком Е біологічно активні. Гібридні білки НМ1/2 73 ї НМ1/473 використали для заміщення початкового гена НМ в складі повнорозмірного клону кДНК рМОБЇ ж, одержуючи отим самим плазміди рМОБІ-НМ1/2773 і

РМОРІ-НМ1/4773, Останні дві плазміди були після цього використані для одержання інфекційних вірусів з « використанням описаної вище котрансфекційної системи. Життєздатні рекомбінантні віруси (позначені 40. МОБІ-НМ1/2743 Її МОРІ -НМ1/4723) можуть бути виділені з алантоїсної рідини яєць, що розвиваються, які були т с інокульовані надосадовою фракцією трансфікованих моношарів. ч Присутність гібридного гена НМ в кожному з двох рекомбінантів перевіряли з допомогою ПЛР з » ревертуванням. Тести на пригнічення гемаглютинації показали, що моноклональні антитіла і полівалентні антисироватки проти МОМ були нездатні пригнічувати аглютинацію курячих еритроцитів рекомбінантними 45 вірусами МОБІ-НМ1/2773 ї МОРІ -НМ1/4775, Ці дані показують, що штами МОРІ -НМ1/2773 ї МОРІ -НМ1/4773 можна ш- використати як вакцини, які за серологічними ознаками відрізняються від стандартних вакцин проти МОМ. -І Експресія гетерологічного білка рекомбінантним МОМ

Для аналізу того, чи можуть чужорідні гени вбудовуватися в геном МОМ, заявники сконструювали - рекомбінантний вірус, який несе репортерний ген ЗЕАР. Ген 5ЕАР плходить від плазміди ро! ТМ535 і його їх 20 Ммодифікували так, щоб він включав типові сайти ініціації і зупинки транскрипції з МОМ. ДНК-фрагмент, що включає ген ЗЕАР з подальшими транскрипційними стоп- і старт-сайтами, вбудовували за Хтпі-сайтом (109-й с нуклеотид) плазміди РМОБЇ ЧЕМ. Інфекційний вірус, позначений МОРІ -АР, був одержаний з використанням котрансфекційної системи, а присутність гена ЗЕАР перевіряли з допомогою ПЛР з ревертуванням. Клітини, інфіковані штамом МОРІ -АР, експресували дуже високі рівні білка ЗЕАР. Використовуючи специфічну активність білка ЗЕАР, заявники підрахували, що Хо білків, експресованих клітинами, інфікованими МОРІ -АР, припадає на

ГФ) білок ЗЕАР. Ці дані показують, що гетерологічні гени можуть бути експресовані рекомбінантними МОМ на дуже високих рівнях. іме) У не й пе пешщя творення делеційного мутанта МОМ в транс-комплементуючій клітинній лінії

З метою виключення експресії білюа М МОМ велику частину гена М делегували шляхом розщеплення 60 плазміди рМОРІ ЕМ рестриктазою Ввад! (3087-й нуклеотид) з подальшим частковим розщепленням рестриктазою Ніпаїїї (4252-й нуклеотид). Після заповнення Ніпаїї-утворених кінців за допомогою фрагмента

Кленова ДНК-полімерази одержаний фрагмент рециркулювали з використанням ДНК-лігази ТА і використали для трансформації клітин Е. сої. Одержану в результаті плазміду, позначену РМОБІ ЧЕМ ам, використали для де одержання вірусу із застосуванням котрансфекційної системи в транс-комплементуючих клітинах СЕК-М, які експресують білок М МОМ. Надосадову фракцію трансфікованих моношарів тричі пасирували через клітини

СЕК-М їі аналізували на присутність вірусу. Одержання вірусу підтверджується тим фактом, що культуральна надосдкова фракція після третього пересівання давала позитивні результати в тестах на гемаглютинацію (НА) і на пригнічення гемаглютинації (НІ). Вірус визначили МОРІ -ЯМ. Коли МОРІ -ЯМ використали для інфікування моношарів клітин СЕР, вірус був здатний до поширення за механізмом від клітини до клітини, на що вказують дані тесту ІРМА при використанні моноклонального антитіла до білка ЕР. Як очікувалося, експресія білка М не може бути виявлена в тесті ІРМА при використанні моноклональних антитіл, специфічних відносно білка М. Коли надосадову фракцію використали для інфікування або клітин СЕР, або клітин СЕК-М, в тесті ІРМА не вдавалося продемонструвати присутність реплікованого вірусу в цих моношарових культурах. Ці дані вказують на те, що 70 інфекційний вірус не може бути одержаний в некомплементуючих клітинах СЕР. Ці результати були підтверджені виявленням того, що інокуляція яєць, що розвиваються надосадовою фракцією від інфікованих клітин СЕЕ не приводить до утворення вірусного потомства при аналізі в тестах НА і НІ.

Необхідність в поліпшених МОМ-вакцинах і особливо потреба в маркерних вакцинах проти МОМ спонукали заявників розробити зворотно-генетичну систему, яка б дозволила генетично модифікувати МОМ. У даній заявці /5 описане створення інфекційного МОМ повністю з клонованою повнорозмірною кКДНК. Заявники показали, що вірулентність МОМ може бути різко змінена шляхом модифікування тільки трьох нуклеотидів, які визначають специфічність сайта розщеплення протеазою білка Р. В цьому випадку сайт розщеплення протеазою змінювали з характерного для штаму ГабЗоїа на консенсусний сайт розщеплення у вірулентних штамів МОМ. Шляхом створення такого генетично модифікованого штаму МОМ заявники одержали доказ того, що розщеплюваність білка Е є ключовим детермінантом (хоча і не єдиним детермінантом) вірулентності МОМ. Шляхом використання того ж зворотно-генетичного підходу сайт розщеплення може бути модифікований за бажанням в будь-яку іншу амінокислотну послідовність. У результаті може бути створена серія штамів МОМ, яка утворить діапазон рівнів вірулентності.

ЇІп мімо сч

Як вже відмічалося вище, було показано, що, крім расщеплюваності білків Е і НМ, в патогенності можуть грати роль і інші вірусні фактори. Зміни в транскрипції і трансляції можуть модулювати ріст і поширення за і) механізмом від клітини до клітини вірусу і/або цитопатогенністі. Доступність інфекційної КДНК МОМ дозволяє провести систематичну модифікацію послідовностей, які залучені до транскрипції і реплікації. Це може приводити до створення нових МОМ-вакцин, які додають оптимальний рівень імуногенності віртуально неіснуючої Ге зо Вірулентності.

Безпека є однією з найбільш важливих властивостей живих вакцин. Однак, для багатьох живих вакцин, - включаючи МОМ, імуногенність часто негативно корелує з вірулентністю. Отже, подальше ослаблення живих «- вакцин без втрат в імуногенності є одним з найбільш бажаних змін, для досягнення яких може бути застосована генетична модифікація. У зв'язку з цим варто зазначити, що, як було показано, виключення експресії білка М ї- вірусу Сендай зумовлювало істотно знижену патогенність іп мімо відносно мишей ГІКаїо еї аї!., 1997). Як і у ї- випадку з вірусом Сендай, МОМ також утворить білок М за механізмом, відомим як "редагування РНК" |Зіемага еї аІ., 1993). Можна передбачити, що результатом виключення експресії білка М МОМ також може бути ослаблений фенотип іп мімо.

Крім зміни вірулентності МОМ, заявниками показано, що можливою є модифікація антигенної системи МОМ « таким чином, що можуть бути утворені штами, які будуть відрізнятися від польових штамів МОМ за серологічними пла) с ознаками. Ці так звані маркерні вакцини є дуже цінним інструментом для оцінки стрівальності МОМ в промислових популяціях в світі. Більш того крупномасштабне застосування таких маркерних вакцин може ;» зрештою привести до повного викорінювання МОМ шляхом інтенсивного скринінгу їі вилучення заражених популяцій. У даній заявці показано, що чужорідні гени можуть бути вбудовані в геном МОМ. Ці чужорідні гени

Можна експресувати в інфікованих клітинах на дуже високих рівнях. Це показує, що МОМ можна використати як -І вакцинний вектор для експресії антигенів інших патогенів (домашніх птахів). Деякі властивості роблять МОМ ідеальним вакцинним вектором для вакцинації проти респіраторних або кишкових захворювань. 1) МОМ можна

Ш- легко культивувати до дуже високих титрів в яйцях, що розвиваються. 2) Масова культура МОМ в яйцях, що - розвиваються є відносно дешевою. 3) МОМ-вакцини відносно стабільні і можуть бути просто введені методами масового застосування, такими як додання в питну воду або шляхом розпилення або утворення аерозолю. 4) ве Природне зараження МОМ відбувається через дихальний і /або травний тракт, що також представляє основні

Ф природні шляхи зараження багатьма іншими патогенами домашніх птахів. 5) МОМ може індукувати місцевий імунітет, незалежно від присутності циркулюючих материнських антитіл.

Нарешті, заявниками показано, що життєздатні делеційні мутанти МОМ можуть бути утворені з використанням в трансо-комплементуючих клітинних ліній. Делеційний мутант МОМ був утворений так, щоб він не міг, експресувати матричний білок (М), який бере участь в брунькуванні МОМ на внутрішній поверхні клітинної мембрани. (Ф) Заявниками показано, що фенотипічно комплемейтований штам МОМ, який не здатний експресувати білок М, ка проте здатний інфікувати клітини і розповсюджуватися за механізмом передавання від клітини до клітини. Однак, мутантний вірус не здатний утворювати інфекційне потомство в некомплементуючих клітинах. Ці дані показують, бо що фенотипічно комплементовані делеційні мутанти МОМ можуть бути використані як безпечні самообмежуючі вакцини, які не можуть розповсюджуватися в довкілля. Така непередавана вакцина об'єднує саму важливу перевагу живих вакцин, а саме ефективність, і саме важливе достоїнство убитих вакцин, а саме безпеку.

Опис фігур

Фіг1. 65 Транскрипційний вектор ро! ТуМ5 є похідним від транскрипційного вектора, | описаного у РайпаїкК еї аї., 1992: див. докладний опис конструкції в тексті). Ця плазміда включає промотор ДНК-залежної РНК-полімерази 17

(показаний напівжирним шрифтом), за яким знаходяться унікальні рестрикційні 5(шІ- і Зтаї-сайти і автокаталітичний рибозим вірусу гепатиту-О (НОМ). ДНК-фрагменти можуть бути клоновані між зіці- і

Зіпаі-сайтами і можуть бути транскрибовані або іп мійго, або іп мімо з використанням ДНК-полімерази 17. 5-кінець одержаних, в результаті, транскриптів включає два додаткових залишки с, які не кодуються даною вставкою. Завдяки активності рибозиму 3'-кінець транскриптів точно відповідає останньому нуклеотиду даної вставки.

Фіг.2.

Структура мінігеномних плазмід ро! ТУ535 (Фіг.2А) і ро! ТУ553 (Фіг.2У). Мінігеномні плазміди засновуються 70 на транскрипційній плазміді рОГТУ5 (порів. з Фіг.1) і включають Зі-ділянку (нуклеотиди 1-119) і 5'-ділянку (нуклеотиди 14970-15186) геному МОМ штаму І абоїа, фланкуючі генів, що кодує секретовану лужну фосфатазу (ЗЕАР). Транскрипція ро! ТУ535 з участю РНК-полімерази 77 приводить до утворення антигеномної РНК (або

І4-РНК), в той час як транскрипція ро! ТУ553 утворить геномну РНК (або |І-І-РНК). Помічені сайти початку (3) і закінчення (Е) транскрипції, відповідні вірусним сигналам ініціація і термінації транскрипції. Старт-кодон 75 гена ЗЕАР підкреслений. Також показані послідовності вставок (МО-М5) за СіаІ-сайтом, які утворять мінігеномні плазміди, кожна з яких відрізняється в довжину на 1 нуклеотид (відповідно, РОЇ ТМ535МО-М5 і ро! тУ553МО-М5).

Фіг.3.

Нуклеотидна послідовність геному МОМ штаму ГазЗоїа і розшифрована амінокислотна послідовність генів

МОМ. Показана послідовність відповідає антигеномному ланцюгу і показана в напрямі від 5 до 3 у вигляді одноланцюгової ДНК. Послідовність, показана на даній фігурі, є консенсусною послідовністю, яка була визначена шляхом прямого секвенування двох незалежних наборів субгеномних кКДНК, що перекриваються, які охоплюють весь геном вірусу МОМ. Невизначеність (мабуть, що є результатом помилок при ПЛР), що залишається розділяла шляхом секвенування відповідні ділянки в третьому незалежному наборі клонів.

Послідовність повнорозмірного кКДНК-клону рМОРГІ ї-, яка була одержана з субгеномних клонів кДНК, що Га перекриваються (див. Фіг.4), відрізняється від консенсусної послідовності МОМ за наступними положеннями (нуклеотиди консенсусної послідовності в дужках): нуклеотид 1755, З (А); нуклеотид 3766, А (0); нуклеотид і9) 5109, с (А); нуклеотид 6999, Т (С); нуклеотид 7056, б (А); нуклеотид 9337, С (А); нуклеотид 9486, А (Т); нуклеотид 10195, Т (С); нуклеотид 13075, А (0). Ці відмінності зумовлюють три амінокислотні заміни (амінокислоти консенсусної послідовності в дужках): білок Е, 99 (С); білок НМ, 8200 (Р); білок І, МУ99 (|), (Те)

Фіг.4. (А) Базова стратегія, що використовувалася для одержання повнорозмірної КДНК МОМ на матеріалі клонів, З що перекриваються кКДНК. кКДНК формували в плазміді рОЇ ТУ535, яка вже включала 3- і 5-кінці МОМ штаму --

І азоїа (порів. з Фіг.2). Одержану в результаті плазміду, позначену рРМОРІ ї, використали для одержання інфекційного МОМ. - (В) Докладна процедура клонування в процесі одержання повнорозмірної кКДНК МОМ на матеріалі ї- субгеномних клонів КДНК, що перекриваються. Ст означає ген резистентності до хлорамфеніколу, який був тимчасово внесений як фенотипічна мітка (детально див. в тексті). (С) Докладна процедура клонування при одержанні генетично модифікованої повнорозмірної КДНК МОМ. «

Модифікацією є заміна трьох нуклеотидів, які були внесені в послідовність гена Е і які приводять до модифікації амінокислотної послідовності в сайті розщеплення протеазою білка Е (детально див. в тексті). - с Фіг.5. а (А) Серія ро! ТМ535 "» Транскрипція з участю РНК-полімерази 17 приводить до утворення антигеномної РНК (або (4-РНК), яка може бути безпосередньо трансльована клітиною в білок ЗЕАР. Після інфікування клітин вірусом-помічником (або після котрансфекції плазмід, що кодують білки МР, Р і І), антигеномну РНК використовують для синтезу геномної -і РНК (або |І--РНК) з участю вірусного полімеразного комплексу. Потім геномну РНК використовують для синтезу і - МРНК (з використанням специфічних стартового |З) і кінцевого (Е| блоків), і антигеномної РНК з участю вірусного полімеразного комплексу. -й (В) Серія ро! ТУ553 1» 50 Транскрипція з участю РНК-полімерази 77 з одержанням геномної РНК (або |-9-РНК), яка не може бути трансльована в білок ЗЕАР. Після інфікування клітин вірусом-помічником (або після котрансфекції плазмід, що 4) кодують білки МР, Р ї І) геномну РНК використовують для синтезу як мРНК (з використанням специфічних стартових І) і кінцевих (Е) блоків), так і антигеномної РНК з участю вірусного полімеразного комплексу.

Фіг.6.

Зіставлення послідовностей нуклеїнових кислот 5-кінцевих ділянок МОМ штаму іабоїа і інших параміксовірусів проведене як порівняння послідовностей МОМ і чотирьох представників роду Киршамігив, трьох о представників роду Рагатухомігиз і трьох представників роду Могбійймігив. Послідовності представлені від іме) кінцевого блоку гена ГІ. до 5-кінця (КДНК в напрямі 3-5).

МОМ представляє вірус ньюкаслської хвороби; ПРІМ2 представляє вірус парагрипу людини 2-го типу; МОМ 60 представляє вірус свинки; ЗМ5 і 5М41 представляють віруси 5 і 41 мавп, відповідно; Зем представляє вірус

Сендай; БРІМЗ І ПРІМЗ представляють віруси парагрипу бика і людини, відповідно; СОМ представляє вірус собачої чуми; Мем представляє вірус кору; КРМ представляє вірус чуми рогатої худоби. Нуклеотидні послідовності повних геномів були одержані з наступних джерел (депозитарні МоМе): МОМ (АРО77761); пРІМ2 (Х57559); МимМ (АВО00388); ЗМ5 (АРО52755); 5М41 (Х64275); БРІМЗ (084095); пРІМЗ (211575); СОМ (113194); Мем 65 (ХІб565); КРМ (730697).

Бібліографія

АІехапдег, 0. у. (1993) Рагатухомігиз іптес(іопв. по Мігиз іпїесіопе ої Брігав. МесЕетап, .В. апа

МемМику, М.5.(еав), рр.321-340, ЕІвеміег Зсіепсе Рибріїзпеге В.М., Атвіегаат.

Апіп, Р.В апа Огаанпі, сС.Р. (1991) ІвоЇїабоп апа спагасіегігайоп ої ап оаміап туодепіс сеї! |Ііпе. Бем.Віої. 143: 111-121.

Вагоп, М.О. апа Ваїтей, Т. (1997) Кезсце ої гіпдегреві мігиз їот сіопей СОМА. .. Мігої. 71; 1265-1271.

Веаси, Кк. (1944) Тпе пеціга|ійлайоп іп мйго ої аміап рпешптоепсерпаїйів мігив Бу МемусавзЦе аізеазе іттипе зегит. 5с- І епсе 100: 361-362.

Веага, С.МУ. апа Напзоп, К.Р. (1984) МемусазЦе дізеазе. Іп М.5. Ноївіай еї аЇ. (едз) Оівеазе ої Рошігу, 70 8 Еа., рр.452-470. Ісула Зіаїе Опімегейу Ргез5, Атев. ВеацдеЦе, Р.К., Віміпе, УА. апа МіШег, В.К. (1949)

Мем/сазіе дізеазе іттипігакоп мА Іїме мігив. Согпе-О Меї. 39: 302-334.

Воигзпеїї, М.Е.б., Сгееп, Р.Е., Затвгоп, А.С.К., СатрбеїІї, 9.А., Оешег, А., Рейїегв, К.МУ., МіШаг, М.5.,

Еттеггоп, Р.Т. апа Віппз, М.М. (1990) А гесотрбіпапі тожмірох мігиз ехргезвіпд (пе петададішіпіп-пешгатіпідазе депе ої Мем/сазнЦе дізеазе мігиз (МОМ) ргогесів спіскепз адаїпві спайепде бу МОМ. Мігоіоду 178: 297-300.

Вгійоп, Р., Огееп, Р., Коціег, 5., Мамай, К.Ї., Реплев5з, 7., Самапади, О. апа ЗКіппег, М. (1996)

Ехргезвіоп ої расіегіорпаде Т7 КМА роїутегазе іп аміап апа таттаїіап сеїЇв Бу а гесотбіпапі їоулрох мігив. У.

Сеп. Мігоі.77: 963-967.

Саїаіп, Р. апа Коих, Ї. (1993) Те гшіе ої віх, а разіс Теайшге їТог ейісіепі геріїсайоп ої бепааї міги8 детесіїме іпіепегіпд КМА. .). Мігої. 67: 4822-4830.

Спатбрегз, Р., Мійаг, М.5., Віпойат, К.МУ. апа ЕЕттегвоп, Р.Т. (1986) Моїіесшіаг сіопіпд ої сотріетепіагу

ОМА т Мемусазіе дізеазе мігив апа писіеоїде зедцепсе апаїузів ої (Ше |спсіоп рейуееп (Ше депез епсодіпд

Ше паетадаішіпіп-пешгатіпідазе апа (Пе Іагде ргоїеїп. 9. еп. МігоІ.67: 475-486

Спапо, А.С.М. апа Сопеп, 5.М. (1978) Сопвігисіоп апа сНагасіегігайоп ої атрійіаріе тийісору ОМА сіопіпу мепісіез дегімед їот Ше Р15А сгуріїс тіпіріазтіа. 9. Васіегіа|. 134: 1141-1156. сч

Спо. В.М. (1982) Суюраїйіс ейпПесів апа їосивз огтайоп обу гейсціоепаоїпеїйовіз мігиозев іп а амиоаїї

Тргобріаві сеї! пе. Аміап Оізеазез 27: 261 і)

Сопв, Р.І., НІіЇ, М.б., Сатагдо, Е., Оговівеій, Н., Спапоск, Р.М. апа Мигрпу, В.К. (1995) Ргодисіоп ої іптесіоивз Ппитап гезрігаїогу вупсуйаІ мігиз їтот сіопей сСОМА сопіїтвз ап еззепійаІ гоЇїе ог (ігапзсгіріоп еіопоайоп Тасіог їот (Ше 5 ргохіта! ореп геадіпд їате ої Ше М2 тМА іп депе ехргезвіоп апа ргомідеза («о зо сарарішу тог массіпе демеортепі. - Ргос. Май). Асад. за. ОА 92: 11563-11567.

СопгеІтапп, К.-К. (1996) Сепеїйіс тапіршайоп ої поп-зедтепіе!д педайме-зігапа КМА »мігизев. У. беп. -

Мігоі!.77: 381-389. «-

Сомжмеп, 8.5. апа Вгашпе, М.О. (1988) Тпе ргорадайоп ої аміап мігизев іп а сопіїписив сеї! Ппе (0135), ої

Уарапезе адмпаї огідіп. Аміап Оізеазевз 32: 282-297. ї-

Оепд, К., ММапд, 2., Мігга, А.М. апа Іогіо, К.М. (1995) І осаїїгайоп ої а дотаіїпй оп (Ше рагатухомігив ї- ацасптепі ргоївеіп гедцігей бог їйе орготоїйоп ої сеїЇшШаг бивіоп бу йв Потоіодоив Тивіоп ргоїеіп зріке.

Мігоіоду 209: 457-496.

Ооуїе, Т..М. (1927) А йШено ипгесогдей дівеазе ої їомі5 це (йо а Шег-развіпуд оміги8. 3). Сотр.

Раїйої. Тнег. 40: 144-169, «

Сагсіп, О., Реївї, Т., СаЇаіп, Р., Коих, Г., Сипгап, У. апа Коіакоїзку, ОО. (1995) А Підніу гесотріподепіе ет») с зувіет ог іїШе гесомегу ої іпіесісиз бЗепдаії рагатухомігив їот сОМА: депегайоп ої а поме! сору-баск . поп-детесіїме іпіепегіпуд мігив. ЕМВО .). 14: 6087-6094. и? Сапеп. МУ., Вегк, МУ., Мадаї, М., Ко, К. апа Кіепк, Н.-0. (1980) Мшаййопа! спапдез ої (Ше ргоїеазе зисеріїбіїйу ої діусоргоїеіп Е ої Мем/сазіе дізеазе мігив: ЕПесів оп раїйподепісйу. У. еп. МігоІ.50; 135-147.

Соіапай, Т.М. (1980) Нівіогісаї поїе оп (пе огідій ої (йе їабоїа вігаїй ої МемусазЦе адівеазе мігив. -І Аміап бів. 24: 297-301. боцдп, К.Е. апа АїІехапдег, 0О-). (1973) Те звреед, ої гевзівіапсе (0 спаПепде іпдисей іп спісКепв5

Ш- уассіпаєей Бу айтегепі гошез м/йй а В1 вігаїп ої ме МОМ. Меї. Кес. 92: 563-564. - Напвоп, К.Р. (1988) Неї(егодепейу м/йпіп вігаїйз ої Мем/сазЦе дізеазе мігив: Кеу (0 взигмімаЇ. Іп 03.

Мехапаег (еад.), Мем/сазНе Оізеазе, рр. 113-130. КІішмег Асадетіс Рибі., Вовіюоп. ве Напу, К.М. апа Раїезе, Р. (1995) Мшайкйопв м/йпіп попсодіпуд їегтіпа! зедоепсез ої тоде! КМА"5 ої бепааї

Ф мігив: ІпЯШепсе оп геропег депе ехргезвіоп. 9. МігоіІ.69: 5128-5131.

НескКегі, К.А., Кіма, 9У., СоокК, 5., МеМіШеп, У. апа Зспмагіг, К.О. (1996) Опвеї ої ргогесіїме іттипйу іп спіске айег массіпайоп м/йй а гесотбріпапі ПпПегревзмігив ої їшгКеуз массіпе ехргеззіпд Мем/сазЦе аізеазе міги5 дво Тивіоп апа петадодішіпайпіп-пеогатіпідазе апіїдепв. Амап бів. 40: 770-777.

Неизспеїієе, МУР. апа Еавіегаау, В.С. (1970) оса іттипйу апа регвівіепсе ої мігив іп (Ше ігаспеав ої

Ф) спісКепе ТоПоміпуо іпбесіоп о м/йй о МемусавЦе дівзвеазе міги5. ЇЇ. ІттипойЙцогезсепі апа /Пізіораїпоіодісаї ка зіцаїіев. .). Ії. Оів. 121: 497-504.

Ніїсппег, 5.В. апа доппвоп, Е.Р. (1948) А мігиз ої Іом/ мігшепсе ог іттипігіпд томів адаїпві Мемжм/сазЦе бо Зізеазе (амапрпецто епсернаїйів). Меї. Мей. 43: 525-530.

Ноїйтап, М.А. апа Вапегієє, А.К. (1997) Ап іптесіоив сіопе ої питап рагаіїпПепла умігив їуре 3. У".

Мігоі.71: 4272-4277.

Ноївіад, М.5. (1953) Іттипігайоп ої спісКепз адаіїпві пем/усазі(е адізеазе Бу огтаїїп-іпасіїмайейдй массіпе.

Ат. у". Меї. Кев. 14: 586-589. 65 Іспіпага, М., апа Кигозажа, У. (1993) Сопвігисіоп ої пем/ Т месіоге їТог аїгесі сіопіпд ої РСК ргодисів.

Сепе 130: 153-154.

Івпіда, М., Таїга, Н., Отаїйа, Т., Мігитоїйо, К., Найогі, 5., мазакі, К. апа КамжакКіа, М. (1986) бедшиепсе ої 2617 писіеойдевз їот (Ше 3 епі ої Мемусавзіе дізеазе мігиз депоте КМА апа (Ше ргедісеай атіпо асій зедпепсе ої (Пе міга! МР. ргоїеіп. Мисі. Асідз Кев. 14: 6551-6564.

Каїе(а, Е.Р. апа Ваїдаш, С. (1988) Мем/сазЦе Оівеаве іп ігее-Їїміпд апа реї бігав. Іп 0.3). АїІехапаег (ед.), Мем/сазіе Оізеазе, рр. 197-246. Кішмег Асадетіс Рибі., Вовіоп.

Капі, А., Косі, О., мап Коогеїіааг, О.)., раїК, Р. апа Сег Ницигпе, А. (1997) ОіПйегепіайоп ої мігшепі апа поп-мігцшіепі звігаїйв ої МемусазЦе дізеазе мігиз м/йпіп 24 оце Бу роїутегазе спаїп геасіоп. Аміап

Раїйої. 26: 837-849. 70 КоїакоїзКу, О., Реїеї, Т., Сагсіп, О., Найзтапп, 5., Ситап, У. апа Коих, Ї. (1998) Рагатухомігиз КМА зупіпевіз апа (Пе гедциігетепі Тог пехатег депоте Іепдій: (Пе ге ої віх гемізінеай. 9. МігоІ.72: 891-899.

Кгапемеїа, Г.С. (1926) А рошцігу дізеазе іп (пе ЮОцісп Еазві Іпаїез. Меад. Іпаївзсп В1. Оіегдепеезк. 38: 448-450.

Іатр, К. А. апа ІоіакоїзКу, ОО. (1996) Рагатухомігідаеє: (Ше мігозев апа ІНеїг геріїсайоп, іп: Рипдатепіа!

Мігоіоду (Ріеїдз еї а!., едв). Спаріег 20, р.577-604, І іріпсоб-Камеп РибіїзНегв, Рпїадеїрніа.

Іамвоп, М.О., е(ЩШтап, Е.А., МУпії, М.А. апа Козе, 9У.К. (1995) КесотрБбіпапі мевзісціаг віотаїййів мігив їот ОМА. Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 92: 4477-4481. опо, Ї., РогпіейфеМйе, О, ОСПуздаєї, 9., Сбопле, М., Вигпу, А. апа Мешцетапз, (с. (1986) Мопосіопаї! апіродіез (0 пПаетададішіпіп-пеогатіпідазе апа ївіоп діусоргоївіп5 ої МемусазЦе дівзеазе мігив: геїіакопеПір реїм'єеп діусозуЇайноп апа геасіїмну. 9. МігоІ.57: 1198-1202.

МадапвекКу, С.Н. апа Вгак, М.А. (1978) Мопсуюраїйпіс тшапів ої Мем/сазЦе адізеазе мігив. 9). МігоІ.26: 724-729.

МадапезКу, С.Н. апа Вгай, М.А. (1981828) Мопсуюораїйпіс тшиапів ої Мем/сазіе дізеазе мігиз аге дегесіїме іп мігив-вресіїйс КМА взупіпезів. 9. МігоІ.37: 317-327.

МадапезКу, С.Н. апа Вгай, М.А. (19815) Кеїайопепірв атопо мігиз зргеай, суораїйодепісійу, апа мігшепсе аз гемеаіед Бу (пе попсуїораййіс тшапів ої Мем/сазйЦе адізеаве мігив. У. МігоІ.40; 691-702. сч

Мешетапв5, с., бопле, М., еапіег, М.С., Рей Р., Вигпу, А. апа Гопо, Ї. (1986) Ргоїесіїме епПесів ої

НМ апа Е адіусоргоїеіп-зресіїс топосіопа! апііродіеєв оп ехрегітепіа| Мем/сазіе адізеазе. Аміап Раїйої. 15:761-768. і)

МіМаг, М.5., Спатбрег5, Р. апа Еюттегвоп, Р.Т. (1988) Мисіеоїйде зедцепсе ої (Ше їивіоп апа

Паетаоддішіпіп-пеигатіпідазе депе ої МемусазЦе дізеазе мігив, вігайп ОіІвіег: Моїіесціаг разів ог магіайопв іп раїподепісйу реїмееп звігаїіпв. У). С(зеп. Міго!ї. 69: 613-620. Ге зо Могдап, К.МУ., бер Ог., уУ., Зспгецге, С.5., І шНіскеп, О., Козепрегдег, УК. апа бопадегтеїйег, Р. (1992)

Ргоїесіп ої спіскепе їот Мем/сазЦПе апа Магекз адівеазез м/ййп а гесотбріпапі ПпПегревмігиз ої (ШтКеуз массіпе - ехргезвіпд (йе МемсазйіЦе дізеазе мігив Тивіоп ргоїеіп. Аміап Оів. 36; 858-870. «-

Могдап, К.МУ., Сбеїб г., 9У., Роре, С.К. апйа Бопадегптеїй|ег, Р. (1993) ЕЯПісасу іп спіскепз ої а Пегревуігив ої ШтКкеуз гесотбріпапі массіпе сопіаіїпіпд (Ше Тивіоп депе ої МемусавЦе дізеазе мігив: опзеї ої ргоїесіоп апа ї- епесі ої тагйегпа! апііроадієв. ї-

Мозсомісі, С, Мовзсомісі, М.б., дітепел, Н., Гаї, М.М., Наутапп, М.У. апа Моді, Р.К. (1977) Сопііписив їїввце сииге сеї! Іпез дегімед їот спетісаїІу іпаисед (штогз ої дарапезе дмпаї!. СеїЇ 11:95-103.

Ранпаїк, А.К., ВаїЇ, Г.А., ІГеОгопе, А.МУ. апа УУегпіл, МУ. (1992) Іптесіоивз дегесіїме іпіепегіпд рагісіез ої ММ їгот ігапзстгірів ої а СОМА сіопе. СеїІ 69: 1011-1020. «

Реорієз, М.Е. (1988) МемусазЦе дізеавзе умігиз геріїсайоп. іп 0.3). АїІехапдег (ей.), Мем/сазЦе Оівеаве, пт) с рр.45-78. Кішмег Асадетіс Рибі., Вовіоп. . Реейегв, В., М. де М/іпа, М. Нооізта, ГР. М/адепааг, А. СіеІКепв, апа К. Моогтапп. (1992) Рзецйдогабіев мігив и?» епмеіоре діусоргоїеіпв одрбО апа одоіЇ аге евззепііаІ! Тог мігиз репейгайоп, Биї опіу ді ів іпмоїмей іп тетрбгапе

Тивіоп. 9. МігоІ.66: 894-905.

Кадеске, Р. ЗріеІйоїег, Р., Зсппеїдег, Н., Каеїїп, К., Нибрег, М. Юоївсп, С, СпНгізйапзеп, 0. апа -І ВіШеїег, М.А. (1995) Кезсце ої теавзієв мігиз от сіопеа ОМА. ЕМВО 3. 14: 5773-5784.

Кон, К. апа Кіепк, Н.-О. (1988) Моїесшаг Бравів ої іптесімйу апа раїйодепісйу ої МемусазЦе аізеазе

Ш- мігив. Іп ОЮ.9У. Аіехапаег (ед.), Мем/сазНе Оізеазе, рр. 98-112. Кішмег Асадетіс Рибі., Вовіоп. - КиззеїЇ, Р.Н., сгіййив5, Р.С., бовмжаті, К.К.А., АІехападег, О.)., Саппоп, М.). апа КигвгвзеїІЇ, МУ.С. (1983) 5р Те спагасіегігайоп ої топосіопа! апіїродіез 1 Мему/сазйне дізеазе мігив. у. еп. МігоІ.64: 2069-2072. пи зЗатргоокК, .., Егіївсп, Е, Р., апа Мапіайів, Т. (1989) Моїіесшаг сіопіпу, а Іарогаїогу тапиа). Со Зргіпд

Ф Нагбог І арогаюгіев, Соїй Зргіпд Нагрог, МУ.

Зсппеїдег, Н., ЗріеІпоїег, Р., Каеїїп, К., Ооївси, С, Кадеске, Р. З!цШЩег, с. апа ВіПефег, М.А. (1997)

Кезсие ої теавзієз мігив ивіпд а геріїсайоп-аеєтісіепі массіпіа-Т7 месіог. У. Мігої, тей. 64: 57-64.

ЗсппеїЇї, М.)., Мебаївіоп, Т. апа Соплеітапп, К.-К. (1994) Іптесіоивз гаріез мігизев їот сіопей сОМА.

ЕМВО "-. 13: 4195-4203. (Ф) Зспціге, Н., Еплтапп, Р.-)., Киспіїпо, К., Мипаї Е., Міетапп, Н. апа Мейепіейег, Т.С. (1995) Соптріебе ка депотіс зедцепсе ої (Пе їїзп гпарадомігив іптесіоив паетайороіеїйіс песговів мігив. у). Сеп. Міго!ї. 76:2519-2527.

Зтійй, А.Ї., Тідпог, О.Н., Мійшпе, К., апа Моїіопавзні, Т. (1977) Івоїабйоп апа аззау ої габіеєв зегодгойр бо Мігивез іп СЕК сеїв. Іпіегміподу 8: 92-99.

Зргадбгом, Р.В. (1988) Сеодгарпіса! аівігіршіоп. п 0). АЇІехапдег (еа.), Мем/сазЦе Оівеазе, рр. 247-255.

Кішмег Асадетіс Рибі., Вовіоп. еЗацрег, М.. Вгеспірийі, К., ВгисКпег, Ї. апа Ноїтапп, М.А. (1995) ЮОеїйесіоп ої Мем/сазМЦе аізеазе міги5 іп рошгу массіпез изіпд (пе роїутегазе спаїп геасіоп апа аїгесі зедцепсіпу ої атрійей ОМА. Массіпе 13: 360-364 65 Зіемага, М., Міропа, І.В., Мійаг, М.5. апа ЕЄттегвоп, Р.Т. (1993) КМА еаййіпуд іп Мем/сазЦе аізеазе мігив.

У. беп. Мігої. 74: 2539-2547.

Тауюг, 9., Еарацег, С, Кеу-Зепеопде, А., Воидиеї, у., Могоп, Е., Соере!ї, 5., ЮОезтейцге, Р. апа

Раоіеці, Е. (1990) МемусавіЦе аізеазе мігиз Тивіоп ргоївіп ехргеззей іп а їомрох мігиз гесотбБіпапі сопіеге ргоїесіп іп спісКепв. 9. Міго!. 64: 1441-1450.

Тезвіег, В.С., Вгоиззеацу, К., апіа Мегпеї, Т. (1986) Іідайоп ої віпдіеє-вігапдей оїїдодеохугірописіеовкідев5 ру ТА КМА Іідазе. Апа!. Віоспет. 158: 171-178.

Мівіга, 9У., апа Мезвіпо, У). (1991) Мем риС-дегімей сіопіпд месіоге м/ййп айбегепі зеІесіаріе тагКеге апа

ОМА геріїсайоп огідіпе. Сепе 100: 189-194.

Міпдемодеї, Н. апа Юиснаїйеїії, О.Р. (1988) Рапгооїіс Мем/сазіе аівеавзе мігиз іп рідеопв. Іп 0. АїЇІехапаег 7/0 (еа.), Мем/сазНе Оізеазе, рр. 184-196. КІшуег Асадетіс Рибі., Вовіоп.

МУпеїап, 5.Р.9О., Ваїї, (Г.А. Ват, 9.М. апа МУМУегп;, (.Т.МУ. (1995) ЕпйПісіепі гесомегу ої іпгесіоив мевісціаг віотаїййів мігиз епіігеіу їот СОМА сіопевз. Ргос. Маїй!. Асад. сі. ОБА 92: 8388-8392.

УУепзуоогі, с., Тегравіга, С, Вопвіга, 9., Віоетгаад, М. апа Мап 7аапе, ОЮ. (1986) Ргодисіоп ої топосіопаї апііродієз адаїіпві зм/іпе Темег мігиз апа (Пеїг изе іп Іабогагу аіадповів. Меї. Місгоріої!. 12: 101-108.

Мизвой, К., МіМйаг, М.5., Спатбрегв, Р., апа Еттегвоп, Р.Т. (1987) Мисіеоїйде зедцепсе апаїувзів ої (Ше /. депе ої МемусавзЦе дізеазе мігив: Ппотоіодіез м/йй Зепдаії апа мезісшаг віотаїййів мігивев. Мисі. Асідвз Кезв. 15: 3961-3976. с (8) (Се) « «- ча м. ші с ;» -І -І - їз 50 42)

Ф) іме) 60 б5

І» пи нан «р ЕПОХ п о ВО -5 ПИШНІ ни по. | ще тя м

Ф о) 60 б5

КОД кр й и ків ква ой клі В пе рес

ТЕН Б ст КН МАЯ З Ева ект оо КИНЕ и ОО пе ММ Зк КЕ

Ер и ния м рин еп ВИ У ЛИ р юри и ВИ ТТ МІВ ово пр рати са Ем. г тя пд ак рік Й

Пост ми сх В о "ел ен ан В В ИН Я сни МН Бі й а онук то ни кві іні пеки я: Ей ен а пови в ДИ ИН В В ВИ п ній нат ЕЕ ОВК НИ М хх ев се р кет век вт фл ву ве тай ЗИ пив т: іт Тит пла и а Б пики пла Я

Кий їт ВІ Й ле а ал, зд МЕ ПЕК Кт оте нених й е- пес н В ЩЕ е

ПА 0 ЛЕОНОВ пссоди Консти й по касяр тн Хо МЕ сет в калових кед тя тенту мкл рсе Ш з піні; Пеніс фі ой з подо рикьлк ин кнн ввів ес п х див нава нтвяти піні в фо рт повітів нні с Же пяти ТІНІ Е Лу ау НН дви

Пе нн я

Ж нн В НААН 0. ОМАН

Гео Ст ване пар дим АВ они До я ер Я Ши р подих В нки два шани ст ле ик Я св Й о дна ти ді МИ тремтіння вн шткт Й хакі Два А п ти Не Був І св їй

Плата се МЩ ІБоклт тиви НВ лит ЗХ: рий ві в нні рані р т В нні ні інф і кн тіні КН сс і нс в НІ то

АТ сг ЩЕ пииілачи тим п тах щи: ера ЯН зві З вшлеако, йллх вн в ни НН В ПМС гли ля у т З тІдЕ и я т ве нев у МНН ринки Нови

ЯН 7 кл КЕ Ка сте: СОВИ ее тати ОВ тре

М ие повіка Й ЕЕ пса ню КЕН ссю осо в КН ЕВ планах В покину ші сгсютя ув ріж в в дн тати стр е: Й

ЕНН КК А Ше А В тури и в жалю пола Кол Ки ар Ен вда КТ пп вужі ічнчхи аа в и лен ом пи ов и іван р в а са

ФЕТА НИ ре» ТЯ КИ ле лк лах, Место, ей І РЕЯ о. ніздьно я ми ле З ОН ЕК ин т т сі н АН Ке нні зновов ж ід ее дини ет с «Х НИ м не Пк. В 4 о Я ни

Б нкуіюввняй в нон серія ПН: Те ПАНЕ я й по с пута ОВ свинки с

КДЖ ОН КН вт сет з п ЗІ В тет ит ВК як анти е и ть кл зерен ТТ т места й ве.

Ма и рр ни в

БО пан НН НН КЕКВ ЩА ссьшя ПОМ ЕНО НКЮ дить їв ит алт т уд шт тура ком при ЖІ але кити КІМ ким ди В У т волею тая кй ДНА си ве: ТАМИ ЯН й | | с

Ве оса естарі ; В

Двох ндвввето о В ек ие лк ото нео г ее Я пед: ДІЇ, (о)

В ООН кн Ин нон Ки рН У ЕН и Ві КУ атм си Де. ен и и в ВВА КЛННе | й

Нв од до вя Кат Пи кв вішивідЕ Готові ки ТВ ее ткилася М в и В М скехе хі НОДАНННК Хна ее і оси в і и нн в І нак о ЗНИК В СН соска нов А и пн ія педа

У то я ил ЕЕ Б АК тов са ся Ин ЦІ рр п а ер ОК КЕ КН, міт ОД "й

ВАНЯ Я ми: о ке Ви кинь ОВК сс свсь ВИЩЕ: х (Се) пон данавіна і и КК ин в т Кл кн 3о НИ тза ВИМХ. ОА В зялнетен МЕМ вЕн Щ т сосен й ви с ант У Як ВЕЛО ЕВ в т а МИХ а кв и В Й Вісі, понині ес ие р ун НЕ НВ фр пит о и п она А, «І зт Пай урни ко т ГАЗ педа не НИ БК стан й 15 то, Би я пі ще, 1 Ц

Я ав тха ва мк ль Дек ней ОН и ви квар пи ЗК Диклокну тенти ЕП ВАТА а до пи Й а СЯ, Нав Ка У Ку еК Ва ее ВУ Пас Б НН т лід лІШЙТІК лю крики впли жа Тр ЯТІ дня ко ЛЕ пи т в

ПЕН ЕН Те Тіт НОЯ роста хек іае ТИЙ Тих ЗЕ: у. рокла НАЕК Ве Пар ала и теля пе тля ТАТА ІМ а в вки і езотерика и,

Іа ся аренде и НК Как дет СТЕ Вятй ие па 7

ВЕК в В ИН епі С ЕН - нн НН в о в

Да: В КЛОН а А Я Канни осн ре и Укр ши тет твіти сени ме ШТ НН Е вив М тих пи кін що детят й дати плит ще тн лтмия. ве еител іррляни сте - Га та п Ді дк: Евер вер М І пед шт а хі ЕХ І Ки тА то ям Уа им ЕВ В о КЕ нс и в в ри и и пп п и и и т,

НАВ рве вана шнна и в НВ Б: з ко и « «лу Шик : ек вити Насяенки е НА тер ковій вик Я, й ун н Є х зо ЕЕ ОТ кн і тай ною ою Кос анційв ини и 2

Тахти ле КЕ к тт Е котже и тя ек я ви ж ера утік анти: І

Ван Я. СНЕЙ о ач КК ВИН зве ДИ оте Гея Не: лад ки кірку до в В В Го ск каски т І Я с Неси а р і і т в СС сова, ее лит Ек т жк педитре мк рве пат т; КВН:

НЯ Шия и ку тетЕуєі а Ел ги А, | й ІК НЯ Ж. « " діння А АЙ НОЩ

КЕНЕ нт ВН ДОН,

Ме. АН я

Вени сов та Ти каное ск ст рт ово от ДІ . дз ин НКИ ЗА ія її В):

Щі зіхіе й В с: - І кун века юною зн о Сем кн ні п Водою ст ть пл ть молота ДБ ого ма пня юю сок Б! ' петля с а о ВО нн лю ТЕН ШЕ и: ов Й

ЯН: Кісти шини вв Кк кт ст: оо ЇВ вето Й : нь ДА ло В чари ДИН грек ваЕні ііннян ії т - вт В те А?

Віти Ге З

НН отри НИКА ЗІ у пе ання и Вс і і ЕН о и о ЕК ПОН АВ ЕН ріка ніч и і й п, ї- хек паводку Я сна яра ни ІННИ АКНЕ ї 4) по» ЯК й й І й со «вія плавне Зв ааКЦіЯ р ал СИ ех МГ ідоли. сти,

Таблиця 2

Послідовність 3" і 5і-кінцевих

ГФ) ділянок геному МОМ штаму Газоїа

А. Послідовність 3-кінцевої ділянки (показана як 5-кінцева ділянка антигеномного ланцюга ДНК)

Ї он ослідовність

Спосіб І Кл п бо 28 АССАДАСАСАСААТС ю0000 досласлододаю 0000 осодлодододаю 00000 послоододю 800000 ослслододдтю 00 коню осАодододию

ОО вюяя 00 осот ю воля 00 ооо нн ПС воля 00 ооо 00100010 АССАААСАААСАТТ волю 00 поододлдодтт ів вою 00 одаоотодлодтя ин нс З вв осот ин ос зи 2 вав оолдодлдодту 0 вюлю 00 оододадодтт ин т он 11111110 Кононова ЗАССАААСАААСАТТТ /-/-:-:.-З/ с о

Ф з ч - ча зв в вола 00019825 05 « й з с вотуєвм 000001000002900001000я4в6000100ою :» я - вовна 0000010000890000000000260000100000ол

В роштевана 111тя186010ме -

ЧЕ

4) трансфіковані плазмідами серії РОЇ ТМ553 і які були додатково інфіковані вірусом МОМ (див, таблицю 3) там о ю во

Таблиця 5 б5 рСіпео як негативний контроль) ; то

Claims (1)

1. Формула винаходу 15 й й й шо, й й . . й й

   1. КДНК параміксовірусу птахів, що включає принаймні послідовність нуклеїнової кислоти, що відповідає 5-кінцевій ділянці геному параміксовірусу птахів серотипу 1, що дозволяє одержувати інфекційну копію параміксовірусу птахів, де вказана кКДНК включає послідовність АССАААСАААСАТТТ.

   2. КДНК за п. 1, яка включає повнорозмірну кДНК. 20 З. кКДНК, яка включає принаймні послідовність нуклеїнової кислоти, що відповідає 5'-кінцевій ділянці геному параміксовірусу птахів серотипу 1, що дозволяє утворювати реплікований мінігеном параміксовірусу птахів, де вказана кКДНК включає послідовність АССАААСАААСАТТТ.

   4. КДНК за будь-яким з пп. 1, 2 або 3, яка принаймні частково походить від вірусу ньюкаслської хвороби.

   5. КДНК за п. 4, де вказаний вірус ньюкаслської хвороби є стрічкогенним вірусом, переважно похідним від сч ре Вакцинного штаму.

   6. кДНК за п. 5, де вказаним вакцинним штамом є штам І азоїа, АТСС УкК-699. о

   7. КДНК за будь-яким з пп. 1-6, яка додатково містить модифікацію нуклеїнової кислоти.

   8. КДНК за п. 7, де вказана модифікація включає нуклеїнову кислоту, що кодує модифікований сайт розщеплення протеазою. с 20 9. кДНК за п. 8, де вказаним сайтом розщеплення протеазою є сайт розщеплення протеазою білка злиття (РЕ).

   10. кДНК за п. 7, де вказана модифікація включає нуклеїнову кислоту, що кодує гібридний вірусний білок. «І

   11. кКДНК за п. 10, де вказаним білком є білок гемаглютинін-нейрамінідази (НМ). «-

   12. КДНК за п. 7, де вказана модифікація включає делецію нуклеїнової кислоти, що кодує вірусний білок.

   13. кДНК за п. 12, де вказаним вірусним білком є матричний білок (М). - з 14. кДНК за будь-яким з пп. 1-13, що додатково містить нуклеїнову кислоту, яка кодує гетерологічний антиген. М

   15. кДНК за п. 14, де вказаний антиген є похідним від патогену домашніх птахів.

   16. кКДНК за пп. 14 або 15, що додатково містить нуклеїнову кислоту, що кодує імуностимуляторний білок або його частину.

   17. РНК, одержана на матриці кДНК за будь-яким з пп. 1-16. « 20 18. Спосіб одержання інфекційної копії параміксовірусу птахів, що включає трансфекцію принаймі однієї -в клітини кКДНК за будь-яким з пп. 1-16 і інокуляцію речовини, одержаної із вказаної клітини в алантоїдну с порожнину ембріонального яйця, і одержання інфекційного параміксовірусу із вказаної алантоїдної порожнини. :з» 19. Спосіб за п. 18, де вказана клітина принаймні здатна експресувати вірусний нуклеокапсидний білок (МР), фосфопротеїн (Р) або великий полімеразний білок (І).

   20. Спосіб за пп. 18 або 19, що додатково допускає розщеплення химерного білка вказаного вірусу. -1 35 21. Спосіб за будь-яким з пп. 18-20, що додатково включає інкубацію вказаної клітини в середовищі для росту, що має протеолітичну активність. -і 22. Спосіб за п. 21, де вказане середовище для росту містить алантоїсну рідину, що має вказану - протеолітичну активність. 50 23. Спосіб за будь-яким з пп. 18-22, де вказана клітина є клітиною курки.

   т. 24. Інфекційна копія параміксовірусу птахів, одержана способом за будь-яким з пп. 18-23. Ф 25. Вакцина, що містить вірус за п. 24.

   26. Вакцина за п. 25, що містить живий вірус.

   27. Вакцина за пп. 25 або 26, де вказана інфекційна копія параміксовірусу птахів принаймні частково походить від вірусу ньюкаслської хвороби (МОМ).

   28. Спосіб ідентифікації зразків біологічних рідин невакцинованих тварин або тварин, вакцинованих (Ф) МОМ-вакциною за п. 27, від зразків біологічних рідин тварин, інфікованих МОМ дикого типу або вакцинованих Ге немодифікованим або стрічкогенним штамом МОМ, що передбачає визначення у вказаному зразку присутності антитіл, специфічних по відношенню до імунодомінантного епітопу або маркера, експресованого згаданим МОМ во дикого типу або немодифікованим МОУ, але не згаданою вакциною.

   29. Спосіб за п. 28, де вказані антитіла специфічні відносно білка НМ або Є МОМ.

   30. Спосіб за пп. 28 або 29, де вказану тварину вибирають з групи, яка включає домашю птицю, переважно домашніх курей.

   31. Діагностичний набір для розрізнення вакцинованих тварин та інфікованих тварин, що містить імунодомінантний епітоп або маркер, експресований МОМ вірионом маркерної вакцини, але не МОМ вірионом 65 дикого типу, і засоби визначення антитіл МОМ віриону, і засоби визначення антитіл.