PL197722B1 - cDNA ptasiego paramiksowirusa, RNA, sposób wytwarzania infekcyjnej kopii ptasiego paramiksowirusa, infekcyjna kopia ptasiego paramiksowirusa, szczepionka, sposób rozróżniania zwierząt i zestaw diagnostyczny - Google Patents

Abstract

1. cDNA ptasiego paramiksowirusa, znamienny tym, ze wspomniany cDNA obejmuje co naj- mniej sekwencj e kwasu nukleinowego odpowiadaj ac a ko ncowi 5' genomu ptasiego paramiksowirusa umo zliwiaj ac a wytwarzanie infekcyjnej kopii ptasiego paramiksowirusa. 17. Sposób wytwarzania infekcyjnej kopii ptasiego paramiksowirusa, znamienny tym, ze trans- fekuje si e co najmniej jedn a komórk e przy u zyciu cDNA jak zdefiniowano w zastrz. 1. 24. Szczepionka, znamienna tym, ze zawiera infekcyjna kopi e ptasiego paramikrowirusa jak zdefiniowanego w zastrz. 23. 27. Sposób rozró zniania zwierz at nieszczepionych lub zwierz at szczepionych szczepionk a NDV jak zdefiniowano w zastrz. 26 od zwierz at zaka zonych NDV dzikiego typu lub szczepionych niezmody- fikowanym mezogenicznym lub lentogenicznym szczepem NDV, znamienny tym, ze pobiera si e co najmniej jedn a próbk e ze zwierz ecia i okre sla si e w niej obecno sci przeciwcia l skierowanych przeciw- ko immunodominuj acemu epitopowi lub markerowi wytwarzanym przez NDV dzikiego typu lub NDV niezmodyfikowanego lecz nie wytwarzanym przez omawian a szczepionk e. 46. Sposób wytwarzania infekcyjnej kopii ptasiego paramiksowirusa, znamienny tym, ze obej- muje transfekcj e co najmniej jednej komórki przy u zyciu cDNA jak zdefiniowano w zastrz. 31. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cDNA ptasiego paramiksowirusa, RNA, sposób wytwarzania infekcyjnej kopii ptasiego paramiksowirusa, infekcyjna kopia ptasiego paramiksowirusa, szczepionka, sposób rozróżniania zwierząt i zestaw diagnostyczny.

Ogólnie wynalazek odnosi się do infekcji drobiu wirusem choroby Newcastle. Wirus choroby Newcastle (NDV) jest jednym z najbardziej zmiennych i śmiertelnych ptasich patogenów. Prawie jednoczesne pojawianie się w wielu różnych miejscach geograficznych choroby Newcastle jako oczywistej, nowej choroby oraz duża zmienność typu i ostrości choroby spowodowały pewne problemy w nazewnictwie.

Chorobę nazwano pseudo fowl pest (nazwa polska rzekomy pomór drobiu), pseudo poultry plague, avian pest, avian distemper oraz avian pneumoencephalitis. Do rozwoju tej choroby przyczyniło się przede wszystkim rozwinięcie przemysłu drobiowego w XX wieku w wysoko wydajny, międzynarodowy przemysł zależny od intensywnego handlu pomiędzy krajami.

Zasadniczo przypuszcza się, że pierwsze wybuchy choroby Newcastle pojawiły się w 1926 na Jawie, w Indonezji i Newcastle-upon-Tyne, Anglia (Kraneveld, 1926; Doyle, 1927). Nazwę choroba Newcastle wymyślił Doyle jako tymczasową, pozwalającą na uniknięcie opisowej nazwy, która mogłaby być pomylona z innymi chorobami. Później stało się jasne, że inne mniej ostre choroby wywołane były wirusami nieodróżnialnymi od NDV. W USA stosunkowo łagodna choroba oddechowa została nazwana avian pneumoencephalitis i wykazano, że jest ona wywoływana przez NVD (Beach, 1944). W ciągu kilku lat, z kurcząt na całym świecie zebrano szereg izolatów NVD, które wywołują niezwykle łagodną chorobę lub nie wywołują jej wcale.

Do rozprzestrzenienia się choroby przyczyniło się: 1) przemieszczanie się żywych ptaków, dzikich ptaków, ptaków stadnych, gołębi wyścigowych oraz handlowego drobiu; 2) przemieszczanie się ludzi i sprzętu; 3) przemieszczanie się produktów drobiowych; 4) rozprzestrzenianie drogą lotniczą; 5) zanieczyszczone pasze drobiowe; 6) zanieczyszczona woda; 7) nie całkowicie zinaktywowane lub heterogenne szczepionki. Zgodnie z OIE, choroba Newcastle jest chorobą drobiu wywołaną wirusem ptasiego paramiksowirusa o serotypie 1 (APMV-1), posiadającym wskaźnik wewnątrzmózgowej patogeniczności (ICPI) u jednodniowych kurczaków 0,7 lub wyższy. Obecność wirulentnego wirusa można także potwierdzić dzięki obecności wielu zasadowych aminokwasów na końcu C białka F2 oraz F (fenyloalaniny) w reszcie 117 końca N białka F1. Przy braku możliwości wykazania tej sekwencji aminokwasowej wymagana jest charakterystyka poprzez testy ICPI. Słowo drób odnosi się do ptactwa domowego, indyków, perliczek, kaczek, gęsi, przepiórek, gołębi, bażantów, kuropatw i bezgrzebieniowych, które są hodowane lub trzymane w niewoli w celach hodowlanych, produkcji mięsa czy jaj do konsumpcji lub dla odnawiania zapasów stada.

Zgodnie z Alexander (1988), od czasu pierwszego rozpoznania choroby pojawiły się trzy panzoocje choroby Newcastle. Pierwszą stanowią pierwotne wybuchy epidemii choroby i wydaje się, że pochodziła ona z południowo-wschodniej Azji. Odizolowane wybuchy epidemii, takie jak ten w Anglii w 1926, zachodziły przypadkowo przed głównym nurtem epidemii, który przemieszczał się powoli przez Azję do Europy.

Wydaje się, że druga panzoocja, miała swój początek na Środkowym Wschodzie w późnych latach 1960 i dosięgła większość krajów do 1973. Szybsze rozprzestrzenianie się drugiej panzoocji prawdopodobnie było spowodowane rewolucją w przemyśle drobiowym, w którym ważną rolę odegrał handel międzynarodowy.

Trzecia panzoocja pierwotnie zaatakowała ptactwo domowe takie jak różne gatunki gołębi (Vindevogel i Duchatel, 1988). Choroba najwyraźniej wyrosła na Środkowym Wschodzie w późnych latach 1970. Do 1981 osiągnęła Europę a następnie rozprzestrzeniła się błyskawicznie do wszystkich części świata, w większości jako wynik kontaktów pomiędzy ptakami w czasie wyścigów i na pokazach oraz dzięki międzynarodowemu handlowi tymi ptakami.

Obecnie, choroba Newcastle jest nadal rozpowszechniona w wielu krajach Azji, Afryki, obu Ameryk i Europy. Jedynie kraje Oceanii wydają się być stosunkowo wolne od tej choroby (Spradbrow, 1988).

NDV należy do rzędu Mononegavirales, rodziny Paramyxoviridae, podrodziny Paramyxovirinae, rodzaju Rubulavirus. Oprócz NDV, nazywanym zazwyczaj ptasim paramiksowirusem, typu-1 można rozróżnić osiem innych serotypów oznaczonych jako ptasi paramiksowirus typu-2 do -9 na podstawie antygenowego pokrewieństwa w testach hamowania hemaglutynacji oraz w testach neutralizacji surowicy (Alexander, 1993).

PL 197 722 B1

Pomimo ich jednoznaczności grupowania serologicznego istnieją pewne krzyżowe pokrewieństwa pomiędzy wirusami o różnych serotypach.

Genomem NDV jest jednoniciową cząsteczką RNA o negatywnej polarności, komplementarną do informacyjnych RNA kodujących białka wirusowe. Genom RNA ma wielkość około 15200 nukleotydów (nt) i koduje następujące produkty genów (wymienione od końca 3' do końca 5' genomowego RNA): białko nukleokapsydu (NP), fosforoproteina (P), białko matriks (M), białko fuzyjne (F), hemaglutynino-neuraminidaza (HN) oraz białko dużej polimerazy (L) (Chambers et al., 1986).

RNA występuje w kompleksie z białkami NP, P i L i tworzy cząsteczkę rybonukleokapsydu (RNP), która jest otoczona otoczką, od wewnątrz wyściełaną przez białko M. Otoczka zawiera białka F i HN, które są wymagane przy przyłączaniu i wnikaniu do komórki gospodarza.

Strategia replikacji NDV jest podobna do używanej przez inne paramyxovirinae. Pierwszym etapem jest przyłączenie wirusa do receptorów komórki gospodarza, za pośrednictwem biała HN. Fuzja otoczki wirusowej z błoną komórki gospodarza zależy od działania obu białek HN i F i w jej wyniku RNP zostaje uwolniony do cytoplazmy, gdzie zachodzi replikacja wirusa.

Wirusowa polimeraza RNA zależna od RNA (która jest częścią RNP) wytwarza transkrypty komplementarne, które działają jako cząsteczki mRNA i są wykorzystywane przez maszynerię translacyjną komórki do syntezy wirusowych białek. Wraz z akumulacją białka NP, kompleks polimerazy RNA przełącza się z transkrypcji na replikację w wyniku czego zachodzi synteza genomu o pełnej długości oraz cząsteczek antygenomowego RNA.

Nowo wytworzone RNP są pakowane w kapsyd na błonie komórkowej dzięki działaniu białka M oraz białek F i HN, które są gromadzone w plazmie błony komórkowej. Nowo utworzone cząsteczki wirusów są uwalniane z zainfekowanych komórek poprzez pączkowanie. Bardziej szczegółowe informacje na temat replikacji NDV podano w Peeples (1988). Najnowszy przegląd biologii molekularnej paramyxoviridae podano w Lamb i Kolakofsky (1996).

Oprócz handlowego udomowionego drobiu (np. kurczaki, indyki, bażanty, perliczki, kaczki, gęsi, gołębie) szeroki zakres ptaków żyjących w niewoli, półudomowionych i wolno żyjących, włączając wędrowne ptaki wodne, wrażliwy jest na NDV i ptaki te mogą stanowić pierwotne źródła infekcji (Kaleta i Baldauf, 1988).

Patogeniczność szczepów NDV różni się znacząco w zależności od gospodarza. Najbardziej opornym gospodarzem wydaje się ptactwo wodne, podczas gdy najbardziej podatne są ptaki stadne tworzące czasowe lub stałe gromady. Bardzo wrażliwe są kurczaki, ale zainfekowane mogą być też kaczki oraz gęsi mimo, że wykazują niewielkie lub brak oznak klinicznych, nawet jeśli są zainfekowane szczepami, które są letalne dla kurczaków.

Choroba Newcastle jest skomplikowana ze względu na to, że różne izolaty i szczepy wirusa mogą indukować ogromne zróżnicowanie pod względem ciężkości choroby. Beard i Hanson (1984) pogrupowali szczepy i izolaty NDV na różne fenotypy, w odniesieniu do objawów choroby, które obserwuje się dla w pełni podatnych kurczaków: 1) welogeniczny NDV z powinowactwem do trzewi, wytwarzający ostre letalne infekcje, w których uszkodzenia krwotoczne są uwydatnione w jelicie; oraz welogeniczny NDV z powinowactwem do układu nerwowego, który daje wysoką śmiertelność poprzedzoną objawami oddechowymi i neurologicznymi przy braku uszkodzeń jelita; mezogeniczny NDV, dający niską śmiertelność, ostrą chorobę oddechową oraz objawy układu nerwowego u niektórych ptaków; 3) lentogeniczny NDV, który wytwarza łagodne lub niewidoczne infekcje oddechowe lub nawet bezobjawowe jelitowe NDV, awirulentne wirusy, które okazuje się, ulegają replikacji pierwotnie w przewodzie pokarmowym. Donoszono o przypadkach pokrywania się niektórych objawów związanych z różnymi grupami.

Wirusy dostają się do organizmu poprzez układ oddechowy i przewód pokarmowy oraz przez oczy. W tchawicy wirus rozprzestrzenia się dzięki ruchowi rzęsek oraz z komórki do komórki. Po wstępnym namnożeniu w miejscu wprowadzenia, wirus jest przenoszony podczas wiremii do śledziony, wątroby, nerki i płuc. Wirusy niektórych szczepów osiągają pożądane organy jak wątroba czy nerka bardzo szybko, tak że ptaki mogą umrzeć zanim ujawnią się objawy choroby.

Większość wirusów osiąga system nerwowy poprzez krew, zanim pojawi się znacząca ilość przeciwciał. Długi, bezobjawowy stan nosicielstwa przypuszczalnie pojawiający się u papuzich stanowi potencjalne zagrożenie dla przemysłu drobiowego. Długoterminowy stan nosicielstwa zarówno wirusów lentogenicznych i welogenicznych może także istnieć u kurczaków (Heuschele i Easterday, 1970).

Podczas replikacji NDV, dla uzyskania infekcyjności, konieczne jest przecięcie prekursorowej glikoproteiny Fo do F1 i F2 wirusa potomnego (Rott i Klenk, 1988). To posttranslacyjne cięcie zacho4

PL 197 722 B1 dzi za pośrednictwem proteaz gospodarza. Jeżeli nie zajdzie cięcie, wytwarzane są nieinfekcyjne cząsteczki wirusa i nie może zachodzić replikacja wirusa. Białko Fo wirulentnego wirusa może być cięte szeregiem różnorodnych proteaz, lecz białka Fo wirusów o niskiej wirulencji mają ograniczoną wrażliwość i te wirusy można hodować in vivo w pewnych typach komórek a zasadniczo nie można hodować in vitro.

Wirusy lentogeniczne replikują się tylko w obszarach z enzymami typu trypsyny, takich jak układ oddechowy i przewód pokarmowy, podczas gdy wirusy wirulentne można replikować w szeregu tkanek i organów co daje śmiertelną infekcję ogólnoustrojową.

Zsekwencjonowanie aminokwasów prekursorowego Fo pokazało, że wirusy o niskiej wirulencji mają pojedynczą argininę (R), która łączy łańcuchy F2 i F1, podczas gdy szczepy wirulentne posiadają dodatkowe zasadowe aminokwasy tworzące dwie pary takie jak K/R-X-K/R-R-F w miejscu cięcia. Ponadto, łańcuch F2 szczepów wirulentnych zasadniczo zaczyna się od reszty fenyloalaniny, podczas gdy ze szczepów niewirulentnych zaczyna się leucyną.

W kilku szczepach NDV również białko HN jest wytwarzane jako prekursor wymagający cięcia, tak aby stać się biologicznie aktywny (Garten et al., 1980; Millar et al., 1988).

Oprócz cięcia białek F i HN inne wirusowe czynniki mogą brać udział w patogeniczności. Madansky i Bratt (1978, 1981a, 1981b) wykazali, że zmiana transkrypcji czy translacji może modulować wzrost i rozprzestrzenianie się wirusa z komórki do komórki i/lub cytopatogeniczność.

Pierwotna odpowiedź immunologiczna na infekcję NDV odbywa się za pośrednictwem komórek i można ją wykryć najwcześniej 2-3 dni po infekcji szczepionką z żywych szczepów. Wyjaśnia to przypuszczalnie wczesną obronę przed infekcją, którą zarejestrowano u szczepionych ptaków zanim obserwowano mierzalny poziom przeciwciał (Gough i Alexander, 1973).

W około 1 tydzień po infekcji krążące przeciwciała mogą chronić gospodarza przed ponowną infekcją. We wczesnej fazie wymagane są IgM, a następnie IgG. Miano i obrona osiąga szczyt po około 3 tygodniach i stopniowo opada, jeśli nie jest wzmacniane. Oznacza to, dla starszych ptaków, konieczność ponownego szczepienia.

Jedynie żywe szczepionki, podawane drogą oddechową, stymulują przeciwciała na wszystkich powierzchniach śluzówkowych jak i w surowicy. Inaktywowane szczepionki, nawet jeśli podawane są drogą dośluzówkową, nie wywołują miejscowej odpowiedzi w układzie oddechowym, pomimo wysokiego stężenia przeciwciał w surowicy.

Wskazuje to na ważną rolę żywych szczepionek, zdolnych do prezentowania antygenów wirusowych w górnych partiach układu oddechowego celem zaindukowania odporności, zarówno miejscowej jak i ogólnoustrojowej. Małe kropelki penetrują dolne partie układu oddechowego, pobudzając tym samym główną, humoralną, odpowiedź immunologiczną, podczas gdy duże krople stymulują odpowiedź miejscową w górnych partiach układu oddechowego.

Zatem, aerozole o szerokim zakresie rozmiarów kropel wytwarzają najlepszą odpowiedź obejmującą miejscową i humoralną.

Jednakże należy zwrócić uwagę, że pomimo intensywnego szczepienia, aktualnymi szczepionkami wytwarzającymi wysokie poziomy miana przeciwciał, wirus nadal może uwalniać się z powierzchni śluzówki.

Zidentyfikowanie choroby Newcastle w USA doprowadziło zastosowania inaktywowanych szczepionek (Hofstad, 1953). Zaobserwowanie, że pewne enzootyczne wirusy wywołują jedynie łagodną formę choroby doprowadziło po raz pierwszy do powstania mezogenicznej, żywej szczepionki Roakin (Beaudette et al., 1949) a następnie do rozwoju łagodniejszych szczepów Hitchner B1 (Hitchner i Johnson, 1948) oraz LaSota (Goldhaft, 1980), które są obecnie najpowszechniej stosowanymi żywymi szczepionkami.

Żywe szczepionki NDV można podzielić na dwie grupy lentogeniczną i mezogeniczną. Szczepy mezogeniczne są stosowne jedynie do powtórnego szczepienia ptaków ze względu na ich większą wirulencję. Odpowiedź immunologiczna wzrasta wraz ze wzrostem patogeniczności żywej szczepionki. Zatem, w celu uzyskania żądanego poziomu obrony bez poważnych reakcji, aktualnie stosowane są programy szczepienia, które wymagają następującego po sobie użycia progresywnie bardziej wirulentnych szczepionek lub żywych szczepionek po szczepionkach inaktywowanych.

Jedną z głównych zalet żywych szczepionek jest ta, że można je podawać stosując niedrogie masowe techniki podawania. Powszechny sposób podawania odbywa się przez picie wody. Jednakże, podawanie wody do picia musi być uważnie monitorowane jako, że wirusy mogą być inaktywowane zbyt wysoką temperaturą lub światłem oraz wirusobójczymi zanieczyszczeniami występującymi w wodzie.

PL 197 722 B1

Także bardzo popularne jest podawanie masowe żywych szczepionek poprzez spraye i aerozole, ze względu na łatwość z jaką można zaszczepić dużą liczbę ptaków w krótkim czasie. Istotne jest osiągnięcie właściwej wielkości cząstek poprzez kontrolowanie warunków w jakich cząstki te są wytwarzane.

Stosowane ostatnio żywe szczepionki mają kilka niekorzystnych właściwości. Szczepionka może w dalszym ciągu wywoływać objawy choroby, w zależności od warunków środowiskowych i obecności skomplikowanych infekcji. Zatem, ważne jest użycie wyjątkowo łagodnych wirusów dla pierwotnego szczepienia oraz, w wyniku tego, wymagane są zazwyczaj wielokrotne szczepienia. Ponadto, przeciwciała pochodzące od matki mogą z powodzeniem zapobiegać skutkom pierwotnego szczepienia żywymi szczepionkami lentogenicznymi.

Zinaktywowane szczepionki są zazwyczaj wytwarzane z zakaźnego płynu omoczniowego, który poddawany jest działaniu formaliny lub betapropiolaktonu celem zabicia wirusa oraz mieszany z odpowiednim adjuwantem. Zinaktywowane szczepionki podawane są poprzez wstrzyknięcie domięśniowo lub podskórnie. Zinaktywowane szczepionki są drogie w produkcji i podawaniu.

Jednakże, działanie zinaktywowanych szczepionek w oleistych emulsjach nie jest tak zaburzane przez matczyną odpowiedź immunologiczną jak u żywych szczepionek i mogą one być stosowane u jednodniowych kurczaków. Przewagą inaktywowanych szczepionek jest niski poziom niepomyślnych reakcji u zaszczepionych ptaków, wysoki poziom obronnych przeciwciał oraz długi czas trwania obrony. Żadnej z powyższych szczepionek nie można rozróżnić serologicznie od NDV dzikiego typu.

Od wielu lat istnieje zainteresowanie rozwojem zrekombinowanych szczepionek wirusowych ze strony przemysłu drobiowego. Koncepcja polega na wprowadzeniu genów, z krytycznymi epitopami immunizującymi interesującego czynnika chorobotwórczego, do nieistotnego genu wirusa wektorowego. Szczepienie zrekombinowanym wirusem daje immunizację przeciwko zarówno wirusowi wektorowemu jak i interesującemu czynnikowi chorobotwórczemu.

Wiele typów wirusów oszacowano jako potencjalne żywe wirusowe szczepionki dla drobiu. Dwa ptasie wirusy, które zwróciły większą uwagę to wirus ptasiej ospy (FPV) oraz wirus opryszczki indyków (HVT). Wirus ptasiej ospy jest wirusem DNA, który posiada duży genom zatem uważa się, że ma dużo miejsca do przenoszenia obcego DNA.

Po atenuacji FPV nie wywołuje chorób klinicznych i jest powszechnie używany jako szczepionka dla kurczaków. HVT jest także wirusem DNA i jest zaklasyfikowany jako serotyp III rodziny wirusów choroby Mareka (MDV). HVT jest niepatogeniczny dla kurczaków choć wywołuje obronę krzyżową przeciwko MDV i jest powszechnie stosowany do szczepienia kurczaków przeciw chorobie Mareka.

Pokazano, że obrona przed chorobą Newcastle może być zaindukowana przy użyciu zrekombinowanych szczepionek HVT lub FPV (Morgan et al., 1992, 1993; Heckert et al., 1996; Boursnell et al., 1990; Taylor et al., 1990).

Jednakże, początek obrony przed chorobą Newcastle po szczepieniu tak zrekombinowaną szczepionką, która wytwarza białko F z NDV albo oba białka F i HN był mocno opóźniony w porównaniu z tym, który następował po szczepieniu tradycyjną żywą lub inaktywowaną szczepionką NDV, co jest możliwe ze względu na to, że zrekombinowane szczepionki nie dostarczają wystarczająco szerokiego immunologiczne spektrum epitopów NDV posiadających znaczenie antygenowe inne od tych, które znaleziono na białku NDV, które jest wytwarzane poprzez zrekombinowaną szczepionkę lub nie są one właściwie prezentowane systemowi immunologicznemu.

Ponadto, obrona miejscowa (śluzówkowa, układu oddechowego czy jelitowa) nie była wydajnie indukowana w ptakach szczepionych szczepionkami zrekombinowanymi. Jest to poważna wada, ponieważ szczepionki stosowane do pierwotnego szczepienia przeciwko chorobom układu oddechowego muszą indukować miejscową odpowiedź dla zapobiegania infekcji i rozprzestrzeniania się wirulentnych wirusów, które infekują kurczaki hodowane w terenie.

Przeciwciała przeciwko NDV, które są zdolne do obrony gospodarza można badać testami neutralizacji wirusa. Jednakże, dopóki odpowiedź neutralizacyjna występuje wraz z równoległą odpowiedzią hamowania hemoaglutynacji (HI) ten ostatni test jest często stosowany dla oszacowania odpowiedzi obronnej, w szczególności po szczepieniu.

Przeciwciała przeciwko obu białkom F i HN mogą neutralizować NDV. Jednakże, przeciwciała przeciwko białku F wydają się indukować większą neutralizację niż te skierowane przeciwko HN w testach in vivo i in vitro (Meulemans et al., 1986).

Obecność i swoistość przeciwciał przeciwko NDV w surowicy ptaków daje niewiele informacji na temat infekującego szczepu NDV, a zatem ma ograniczoną wartość diagnostyczną.

PL 197 722 B1

Wszechobecne szczepy lentogenicznych NDV u ptaków w większości krajów i prawie uniwersalne stosowanie żywych szczepionek, które nie mogą być rozróżnialne, przynajmniej nie serologicznie od NDV dzikiego typu, oznacza, że samo wykazanie infekcji jest niezwykle odpowiednią podstawą do nakazania przeprowadzania badań kontrolnych. Ponieważ choroba terenowa może być niepewną miarą prawdziwej wirulencji wirusa konieczne jest dalsze scharakteryzowanie znalezionego wirusa.

Obecnie, jedyną metodą diagnozowania choroby Newcastle, pozwalającą na scharakteryzowanie szczepu infekcyjnego jest izolacja wirusa a następnie testowanie patogeniczności. W tym celu stosowane są aktualnie trzy testy in vivo: 1) średni czas śmierci (MDT) w jaju; 2) wskaźnik wewnątrzmózgowej patogeniczności (ICPI) u jednodniowych kurczaków; 3) wskaźnik patogeniczności dożylnej (IVPI) w sześciodniowych ptakach.

Testy te mają szereg wad, takich jak dostępność zwierząt, słaba stałość i stosunkowo długi czas trwania testów. I na koniec, choć to nie ostatnia wada, testy te nie pozwalają na prostą identyfikację serologiczną drobiu zaszczepionego szczepionką lub zainfekowanego szczepem dzikiego typu.

Jako alternatywne testy in vivo, pomyślnie była zastosowana reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) dla rozróżnienia pomiędzy wirulentnymi a niewirulentnymi izolatami (Stauber et al., 1995; Kant et al., 1997), jakkolwiek znowu nie jest tu możliwe zróżnicowanie serologiczne.

Rozwój hodowli drobiu oraz handlu ich produktami jest obecnie zorganizowany na bazie międzynarodowej, często pod zarządem wielonarodowych kompanii. Groźba choroby Newcastle okazała się dużym ograniczeniem tego handlu.

Pomyślna kontrola choroby Newcastle będzie osiągnięta jedynie wtedy, kiedy wszystkie kraje będą informować o wybuchach epidemii. Jednakże międzynarodowe porozumienia nie są proste ze względu na ogromne zróżnicowanie w rozmiarze nadzoru nad chorobą w różnych krajach. Niektóre kraje nie szczepią i nie chciałyby jakiejkolwiek formy wprowadzania NDV do drobiu domowego, ponieważ szczepionego drobiu nie można odróżnić od drobiu zainfekowanego NDV dzikiego typu.

Inne pozwalają jedynie na stosowanie swoistych żywych szczepionek i uważają inne szczepionki za niedopuszczalnie wirulentne. Jeszcze inne kraje posiadają ciągle obecny krążący wysoko wirulentmy wirus, który nie jest rozpoznawany jako taki ponieważ jawna choroba jest maskowana przez szczepienie.

W wielu krajach istnieje ustawodawstwo kontrolujące wybuchy epidemii, które mogą się pojawić. Narodowe badania kontrolne skierowane są na zapobieganie wprowadzenia i rozprzestrzeniania się chorób. Większość krajów posiada ograniczenia w handlu produktami drobiowymi, jajami oraz żywym drobiem. Większość krajów posiada ustalone procedury kwarantanny dla importu, w szczególności dla ptaków papuzich.

Niektóre kraje przyjęły politykę wytępienia z obowiązkowym pozbyciem się zainfekowanych ptaków, przedmiotów ich styczności oraz produktów. Inne wymagają profilaktycznych szczepień ptaków, nawet przy braku wybuchów epidemii, podczas gdy niektóre stosują politykę szczepienia w okręgu wokół obszaru objętego epidemią dla utworzenia strefy buforowej.

Jasne, że istnieje zapotrzebowanie na lepsze szczepionki i lepsze metody diagnostyczne, które można by zastosować do kontrolowania choroby Newcastle. Ze względu na zarówno duże różnice w dawce, otrzymywanej przez pojedyncze ptaki podczas masowego podawania żywych szczepionek oraz zróżnicowanie w poziomach odmatecznej odporności u młodych kurczaków, nieuniknione są rekcje po szczepieniu żywymi szczepionkami. Stanowi to jeden z głównych problemów farmerów w krajach, gdzie szczepienie jest obowiązkowe.

Ponadto, wiele szczepionek jest mieszaninami subpopulacji. Kiedy są sklonowane, te subpopulacje mogą różnić się znacząco jedna od drugiej swoją immunogenicznością i patogenicznością (Hanson, 1988).

Jednakże największą wadą stosowanych obecnie żywych szczepionek i szczepionek inaktywowanych jest fakt, że zaszczepione zwierzęta nie mogą być odróżniane od zainfekowanych zwierząt przy użyciu aktualnych technik przeszukiwania takich jak testy hamowania hemaglutynacji lub neutralizacji wirusa.

Wirulentne wirusy terenowe mogą nadal się rozprzestrzeniać w szczepionych stadach, ponieważ objawy choroby są maskowane szczepieniem. Ponieważ nie jest możliwa do przeprowadzenia na dużą skalę izolacja wirusa oraz charakterystyka wirulencji poprzez techniki in vivo istnieje ogromne zapotrzebowanie na nowe i skuteczne atenuowane żywe szczepionki, które można odróżnić serologicznie od wirusów dzikiego typu.

Takie szczepionki, nazwane szczepionkami markerowymi dla NDV (a także towarzyszące im metody diagnostyczne oraz zestawy), które powinny dostarczać możliwe najpełniejsze immunologiczPL 197 722 B1 ne spektrum epitopów NDV posiadających znaczenie antygenowe, a oprócz tego dawać możliwość serologicznego rozróżnienia od NDV dzikiego typu nie są jeszcze dostępne.

Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu modyfikowania genomu ptasiego paramiksowirusa poprzez genetyczną modyfikację, dostarcza genetycznie zmodyfikowanego ptasiego paramiksowirusa oraz szczepionkę markerową dla paramiksowirusa.

Nastanie nowoczesnych technik biologii molekularnej pozwoliło na genetyczną modyfikację wielu wirusów RNA, włączając wirusy z negatywną nicią RNA. Technika ta jest często nazywana odwrotną genetyką. Najpierw dostarczana jest (pełnej długości) kopia cDNA wirusowego RNA, a następnie prowadzona jest transkrypcja z DNA w pozwalających na to komórkach dla wytworzenia infekcyjnych RNA, które znowu ulegają replikacji tworząc infekcyjne cząstki wirusowe.

Zasadniczo, dzięki wcześniejszej modyfikacji cDNA, standardowymi technikami biologii molekularnej, możliwe jest otrzymanie genetycznie zmodyfikowanego wirusa RNA. Jednakże, nigdy tego nie uzyskano dla NDV czy innych ptasich paramiksowirusów, nie było nawet możliwe wytworzenie minigenomowych fragmentów czy plazmidów z genomowych fragmentów ptasich paramiksowirusów dla przeprowadzenia badań nad przebiegiem replikacji ptasich paramiksowirusów, co pozwoliłoby na zrozumienie jak konstruować infekcyjną kopię wirusa.

I co jest zadziwiającym, chociaż w tym opisie w pełni wykazano, że genom ptasiego paramiksowirusa jest najmniejszym z wszystkich zsekwencjonowanych do tej pory genomów paramiksowirusów, to szczególnie sekwencja końca 5' z genomu NDV jest znacznie dłuższa niż wcześniej ustalono i jakiej spodziewano się na podstawie porównania z innymi Paramyxoviridae. Wynalazek po raz pierwszy dostarcza sekwencję pełnej długości genomu ptasiego paramiksowirusa oraz dostarcza cDNA, o pełnej długości lub długości minigenomowej, tego wirusa.

Przedmiotem wynalazku jest cDNA ptasiego paramiksowirusa, który to cDNA obejmuje co najmniej sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą końcowi 5' genomu ptasiego paramiksowirusa umożliwiającą wytwarzanie infekcyjnej kopii ptasiego paramiksowirusa.

Przedmiotem wynalazku jest również cDNA ptasiego paramiksowirusa, który to wspomniany cDNA obejmuje co najmniej sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą końcowi 5' genomu ptasiego paramiksowirusa umożliwiającą replikację minigenomu ptasiego paramiksowirusa.

Korzystnymi wykonaniami w obu przedmiotach wynalazku, jest takie cDNA, które może jest cDNA o pełnej długości, oraz może korzystnie co najmniej częściowo pochodzić z wirusa choroby Newcastle. Jeszcze bardziej korzystnie, cDNA może pochodzić z wirusa choroby Newcastle, który jest wirusem lentogenicznym, ewentualnie pochodzącym ze szczepu stosowanego w szczepionkach. W najlepszym rozwiązaniu cDNA pochodzi ze szczepu stosowanego w szczepionkach, który jest szczepem LaSota ATCC VR-699.

Także korzystnie, cDNA jest dostarczony z modyfikacją w kwasie nukleinowym, która to modyfikacja obejmuje kwas nukleinowy kodujący zmodyfikowane miejsce cięcia dla proteazy, a bardziej korzystnie, miejsce cięcia jest miejscem cięcia dla proteazy białka fuzyjnego (F). Zgodnie z korzystnym wykonaniem wynalazku modyfikacja obejmuje także kwas nukleinowy kodujący hybrydowe białko wirusowe. Białko to korzystnie jest hemaglutynino-neuramidazą (HN).

Modyfikacja może także korzystnie dotyczyć delecji w kwasie nukleinowym kodującym białko wirusowe, przy czym również korzystnie białko wirusowe może być białkiem matriks (M).

cDNA według wynalazku, korzystnie jest ponadto dostarczony z kwasem nukleinowym kodującym heterologiczny antygen. Antygen korzystnie może pochodzić z patogenu drobiu, cDNA według wynalazku, może być ponadto dostarczony z kwasem nukleinowym kodującym białko stymulujące układ immunologiczny lub jego część.

Przedmiotem wynalazku jest również RNA wytworzony w oparciu o cDNA według wynalazku jak zdefiniowanego powyżej w odniesieniu do obu przedstawionych rozwiązań wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania infekcyjnej kopii ptasiego paramiksowirusa, polegający na tym, że obejmuje transfekcję co najmniej jednej komórki przy użyciu cDNA według wynalazku jak zdefiniowanego powyżej w odniesieniu do obu przedstawionych rozwiązań wynalazku.

Korzystnie w sposobie według wynalazku, komórka zdolna jest do wytwarzania wirusowego neurokapsydu (NP), fosforo-(P) lub białka dużej polimerazy (L). Ponadto w sposobie według wynalazku umożliwione jest cięcie białka fuzyjnego omawianego wirusa. Można też korzystnie prowadzić inkubację komórki w pożywce hodowlanej zawierającej aktywność proteolityczną, przy czym pożywka hodowlana obejmuje płyn omoczniowy zawierający aktywność proteolityczną, a omawiana komórka może być pochodną komórki kurczaka.

PL 197 722 B1

Przedmiotem wynalazku jest także infekcyjna kopia ptasiego paramiksowirusa, która uzyskana jest sposobem według wynalazku.

Następnie, przedmiotem wynalazku jest szczepionka, która zawiera infekcyjną kopię ptasiego paramikrowirusa według wynalazku. Korzystnie szczepionka ta jest żywą szczepionką, a jeszcze bardziej korzystnie infekcyjna kopia ptasiego paramiksowirusa, co najmniej częściowo jest pochodną wirusa choroby Newcastle (NDV).

Przedmiotem wynalazku jest także sposób rozróżniania zwierząt nie szczepionych lub zwierząt szczepionych szczepionką NDV według wynalazku, od zwierząt zakażonych NDV dzikiego typu lub szczepionych niezmodyfikowanym mezogenicznym lub lentogenicznym szczepem NDV, polegający na tym, że dokonuje się pobrania co najmniej jednej próbki ze zwierzęcia i określa się w niej obecności przeciwciał skierowanych przeciwko immunodominującemu epitopowi lub markerowi wytwarzanym przez NDV dzikiego typu lub NDV niezmodyfikowanego lecz nie wytwarzanym przez omawianą szczepionkę. Korzystnie w sposobie tym, przeciwciała mogą być skierowane przeciwko białku HN lub F z NDV, bardziej korzystnie zwierzę jest wyselekcjonowane z grupy złożonej z drobiu, korzystnie kurczaków.

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw diagnostyczny do użycia w sposobie według wynalazku.

W ostatnich latach szereg niesegmentowanych wirusów z negatywną nicią RNA zostało w pełni scharakteryzowanych i fundamentalna praca nad replikacją i ekspresją ich genomów zakończyła się możliwością wytworzenia całych wirusów infekcyjnych za pomocą transfekcji sklonowanego cDNA omawianych wirusów (artykuł przeglądowy Colnzelmann, 1996).

Do tej pory, wirusy infekcyjne z niesegmentowanych wirusów z negatywną nicią RNA zostały wytworzone ze sklonowanych cDNA przykładowo z wirusa wścieklizny (Schnell et al., 1994, Conzelmann; EP070285A1), (Schnell et al., 1994; EP070285A1), wirusa vesicular stomatitis (Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995) wirusa Sendai (Garcin et al., 1995), wirusa odry (Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997; EP0780475A1), ludzkiego wirusa oskrzelowego (Collins et al., 1995), wirusa zarazy bydlęcej (Baron i Barrett, 1997) oraz ludzkiego wirusa parainfluenzy typu 3 (Hoffman i Banerjee, 1997, Conzelmann; P0702085A1), (Schnell et al., 1994; EP070285A1.

Jednakże, wszystkie z powyższych infekcyjnych kopii wirusów są zdolne do rozwoju in vivo jak in vitro w gospodarzach, tkankach czy komórkach różnego pochodzenia, co umożliwia łatwą transfekcję cDNA oraz replikację i wytwarzanie infekcyjnych cząstek wirusowych w odpowiedniej linii komórkowej.

Możliwość taka nie istnieje dla NDV, zwłaszcza dla szczepów lentogenicznych NDV, które dostarczają szczepionkę. Wirulencja takiego szczepu NDV jest związana z jego zdolnością do replikacji w szerokim zakresie komórek, co odzwierciedlane jest przez fakt, że szczepy wirulentne mogą z łatwością replikować się in vitro oraz in vivo, podczas gdy szczepy szczepionkowe mogą tylko replikować się in vivo.

Zatem, w odniesieniu do NDV, oczywistym jest, że z takiej sytuacji nie ma wyjścia. Ponieważ próby wytworzenia infekcyjnej kopii wirusa z przykładowo infekcyjnego cDNA mogą dać wirusy infekcyjne, taki wirus jest zasadniczo nie odpowiedni do zastosowania jako szczepionki ponieważ tak wytworzony infekcyjny wirus jest ze względu na braki zbyt wirulentny aby być szczepionką; fakt, że może być wytworzony i replikowany po transfekcji cDNA do komórek odzwierciedla łatwość z jaką białko Fo jest cięte do F1 i F2, co jak omawiano powyżej jest oznaką wirulencji NDV.

Stosowanie szczepu szczepionkowego jako materiału rodzicielskiego dla cDNA nie rozwiązałoby problemu; szczep szczepionkowy, szczególnie typu lantogenicznego nie zawiera łatwo ciętego białka Fo, co czyni go niemożliwym do utworzenia pierwszej generacji wirusa kontynuującego replikację. Komórka użyta do transfekcji po prostu nie będzie pozwalała na jedną lub kilka rund replikacji wirusa typu szczepionki, z nie przeciętym białkiem Fo.

Niniejszy wynalazek dostarcza jednak rozwiązania tego problemu, a z nim dostarcza infekcyjną kopię NDV, przykładowo do użycia w szczepionce.

Wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania infekcyjnej kopii wirusa choroby Newcastle polegającego na tym, że obejmuje, stransfekowane komórki zdolnej do wytwarzania wirusowych białek NP, P i L, tworzących kompleksy z wirusowym RNA sklonowanym pełnej długości lub o długości genomu cDNA omawianego wirusa oraz ponadto obejmującego inkubację omawianych komórek w pożywce hodowlanej zawierającą aktywność proteolityczną pozwalającą na cięcie białka Fo z omawianego wirusa.

W systemie tym, kotransfekcja plazmidem umożliwiającym wytwarzanie NP może być pominięta. NP jest prawdopodobnie wytwarzany na podstawie cDNA o pełnej długości, ponieważ gen NP jest pierwszym genem za końcem 5' antygenomowego RNA. Ponieważ cząsteczki eukariotycznych mRNA są zazwyczaj monocistronowe, nie jest oczekiwana ekspresja dystalnych genów. Jednakże jest możPL 197 722 B1 liwe wytworzenie cDNA o pełnej długości, w których odpowiednie pozycje genów NDV są zmienione. Jeśli pierwszym genem takiego cDNA jest gen P lub L, nie jest konieczne wytworzenie odpowiedniego produktu genu z kotransekowanego plazmidu.

Zamiast użycia cDNA o pełnej długości możliwe jest zastosowanie dwóch lub więcej subgenomowych cDNA, dzięki którym wytwarzane są zdolne do replikacji cząsteczki subgenomowych RNA i które razem umożliwiają wytworzenie pełnego kompletu białek ptasiego paramiksowirusa. Nawet jeśli RNA są pakowane oddzielnie, wytworzone cząstki typu wirusa można stosować do pomyślnych rund replikacji dzięki koinfekcji oraz komplementacji funkcji genów.

W korzystnym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposobu polegającego na tym, że proteolityczna aktywność pochodzi z enzymu takiego jak enzym typu trypsyny lub pochodzi z kompozycji, która zawiera taką aktywność proteolityczną. W bardziej korzystnym wykonaniu omawiana pożywka hodowlana obejmuje płyn omoczniowy zawierający aktywność proteolityczną. Dla wytworzenia infekcyjnego wirusa wymagane jest cięcie białka Fo. Możliwe jest wytworzenie infekcyjnego wirusa ze szczepu lentogenicznego bez dodawania egzogennej aktywności proteolitycznej. Dzięki inokulacji nadsączu ze stransfekowanych komórek do jamy omoczni jaj zarodkowych aktywność proteolityczna obecna w płynie omoczniowym jest w stanie ciąć białko Fo wytwarzając dostateczny dla fuzjj kompleks F1-F2. Wiriony z tak aktywowanym białkiem F są zdolne do infekowania podatnych komórek i replikacji w komórkach wytwarzających pożądaną aktywność proteolityczną, co daje infekcyjne potomstwo. Alternatywą do dostarczania pożądanej aktywności proteolitycznej do nadsączu stransfekowanych komórek jest przykładowo możliwość użycia komórki, która jest permisywna dla NDV i która już wytwarza aktywność proteolityczną. Taka linia komórkowa jest stosowana do wytwarzania infekcyjnego lentogenicznego NDV bez dodawania egzogennej aktywności proteolitycznej. Taka linia komórkowa może także być wytworzona poprzez stabilne stransfekowanie linii komórkowej genem nadającym taką aktywność. Ponadto, możliwe jest wytworzenie stabilnie stransfekowanej linii komórkowej wytwarzającej białko F dzikiego typu w otoczce wirusowej, dostarczając cząstki infekcyjne (same nie dostarczane w informacji genomowej kodującej białko F dzikiego typu), które wchodzą do komórki. Odzyskanie infekcyjnego wirusa lentogenicznego jest także możliwe poprzez infekcję stransfekowanych komórek wirusem pomocniczym dla NDV. Istotnym wymaganiem dla takiego wirusa pomocniczego jest to, aby był on selekcjonowany przez, przykładowo, neutralizujące przeciwciała, które eliminują wirusa pomocniczego, a które nie reagują z wirusem lentogenicznym.

W końcu można skonstruować stabilnie stransformowaną linię komórkową wytwarzającą jedno, dwa lub wszystkie trzy konieczne białka NDV, NP, P i L. Takie linie komórkowe wymagają wspólnego wytwarzania podzestawu z trzech koniecznych białek lub w ogóle nie wymagają wspólnego wytwarzania w celu utrzymania wytwarzania infekcyjnej kopii wirusa.

W korzystnym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposobu polegającego na tym, że komórki użyte do transfekcji pochodzą z pierwotnych lub wtórnych komórek lub linii komórkowych kurczaków. Opis dostarcza przykładowo komórki CER czy CEF, które jak większość komórek hodowanych in vitro zasadniczo nie posiadają odpowiednich proteaz wymaganych do cięcia białka Fo z NDV, przykładowo ze szczepu LaSota. Jednakże, można także użyć komórki pochodzące przykładowo z innych ptaków.

Wynalazek dostarcza dalej sposobu wytwarzania infekcyjnej kopii wirusa choroby Newcastle, polegającego na tym, że obejmuje dostarczenie komórki stransfekowanej sklonowanym cDNA o pełnej długości lub długości genomu omawianego wirusa, przykładowo zidentyfikowanego na Fig. 3 i ponadto, i ewentualnie obejmuje inkubowanie omawianych komórek w pożywce hodowlanej obejmującej aktywność proteolityczną pozwalającą na cięcie białka Fo omawianego wirusa, a następnie odzyskiwanie infekcyjnego wirusa poprzez hodowanie omawianych komórek i inokulacji materiału pochodzącego z omawianych hodowanych komórek do jamy omoczni jaj zarodkowych. Omawiany materiał przykładowo obejmuje (świeżo zebrane lub zamrożone-rozmrożone) komórki lub szczątki komórkowe czy nadsącz pochodzący z omawianej hodowli komórek.

Przykładowo, opis omawia sposób odzyskiwania infekcyjnego wirusa, polegający na tym, że nadsącz stransfekowanych jednowarstwowych CEF inokulowano do jamy omoczni jaj zarodkowych. Po czterech dniach zbierano płyn omoczniowy i analizowano testem hemaglutynacji i pasażowano w jajach.

Ponadto, wynalazek dostarcza sposobu dodatkowo obejmującego pasażowanie omawianej infekcyjnej kopii wirusa choroby Newcastle przez zbieranie płynu omoczniowego i ponowne zaszczepianie jaj zarodkowych.

PL 197 722 B1

W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku, omawiany wirus jest wirusem lentogenicznym, przykładowo pochodzącym z awirulentnego terenowego NDV lub ze szczepu szczepionkowego NDV, takiego jak szczep LaSota NDV.

Ponadto, dostarczany jest sposób modyfikowania genomu ptasiego paramiksowirusa za pomocą modyfikacji genetycznej, który pozwala na wprowadzenie jednej lub więcej mutacji, delecji i/lub insercji czy innych modyfikacji. Przykładowo, dostarczany jest sposób atenuacji czy modyfikacji wirulencji ptasiego paramiksowirusa poprzez zmodyfikowany cDNA, przykładowo kodujący białko wirusowe, takie jak białko V i klonowanie takiego zmodyfikowanego cDNA do cDNA o pełnej długości oraz wytwarzanie infekcyjnej kopii wirusa z omawianego cDNA o pełnej długości, wytwarzając tym samym nowe szczepy NDV lub nowe atenuowane żywe szczepionki o ulepszonych właściwościach.

Oprócz atenuacji poprzez modyfikację produktów genowych, możliwa jest także atenuacja ptasiego paramiksowirusa poprzez modyfikację sekwencji nukleotydowej, co jest wymagane w transkrypcji i/lub replikacji. Modyfikacje takie dają atenuowane szczepy, które wytwarzają białka F dzikiego typu, cięte zarówno in vitro jak i in vivo w szerokim zakresie komórek i w rezultacie czego są bardziej immunogenne niż klasyczne szczepy szczepionkowe.

W korzystnym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposobu atenuowania lub modyfikowania wirulencji ptasiego paramiksowirusa takiego jak wirus choroby Newcastle, polegający na tym, że obejmuje modyfikowanie miejsca cięcia przez proteazę wirusowego białka poprzez modyfikowanie cDNA kodującego omawiane miejsce cięcia, i klonowanie omawianego cDNA do cDNA o genomowej długości np. wirusa choroby Newcastle i wytwarzanie infekcyjnych kopii wirusa choroby Newcastele. Omawiane miejsce cięcia jest przykładowo miejscem cięcia dla proteazy w białku F lub HN wirusa choroby Newcastle. Atenuacja jest zasadniczo ograniczona do redukcji wirulencji, jakkolwiek obecnie możliwe jest także użycie względnie awirulentnego szczepu NDV i dostarczenie potomstwa takiego szczepu z podniesioną wirulencją, przykładowo poprzez dostarczanie takiego szczepu, który ma podniesioną tendencję do replikacji w wyspecjalizowanych typach komórek. Jest zatem obecnie możliwe nadanie różnych cech wirulencji wirusowi NDV.

Wynalazek dostarcza sposobu antygenowe zmodyfikowanego ptasiego paramiksowirusa, jak wirus choroby Newcastle, charakteryzującego się tym, że dostarcza się zmodyfikowany cDNA kodujący co najmniej część białka wirusowego niosącego co najmniej jeden immunodominujący epitop, ponadto, obejmuje klonowanie omawianego cDNA w genomowej długości cDNA wirusa choroby Newcastle i wytwarzanie infekcyjnej kopii wirusa choroby Newcastle.

Przykładowo, wynalazek dostarcza też sposobu (dodatkowej) modyfikacji NDV, przy użyciu dostarczonego sposobu do wytwarzania infekcyjnej kopii NDV (szczepionka), dostarczany jest sposób wytwarzania zrekombinowanej markerowej szczepionki NDV, szczepionka markerowa zawierająca możliwie najpełniejsze lub konieczne immunologiczne spektrum epitopów NDV posiadających znaczenie antygenowe oraz jest serologicznie odróżnialna od NDV dzikiego typu, ponieważ różne, posiadające znaczenie serologiczne, epitopy czy markery zostały usunięte przy pomocy technik rekombinacyjnych. Wynalazek dostarcza sposobu modyfikowania składu antygenowego ptasiego paramiksowirusa takiego jak NDV, co pozwala na wytwarzanie np. żywej markerowej szczepionki NDV, która będzie rozróżnialna sereologicznie od szczepu terenowego ptasiego paramiksowirusa.

W jednym wykonaniu, wynalazek dostarcza infekcyjnej kopii NDV, charakteryzującej się tym, że białko HN z NDV zostało zmodyfikowane poprzez rekombinację cDNA kodującego część omawianego białka z cDNA kodującym część białka HN pochodzącego z ptasiego paramiksowirusa, przykładowo typu 2 lub typu 4. Omawiane hybrydowe białko HN służy jako marker serologiczny dla szczepu infekcyjnej kopii NDV, w ten sposób wytworzonej lub, może służyć do zmiany tropizmu ptasiego paramiksowirusa do innych komórek i/lub tkanek. Te, tak zwane, szczepy markerowe jak wprowadzone według niniejszego wynalazku pozwalają na wytwarzanie szczepionek, które są bezcennym narzędziem w szacowaniu rozpowszechnienia NDV w handlowych stadach na całym świecie. Ponadto, zastosowanie na dużą skalę takich szczepionek markerowych doprowadzi do całkowitego wytępienia NDV poprzez proces intensywnego przeszukiwania i likwidowania zainfekowanych stad.

Ponadto dostarczany jest sposób wytwarzania szczepu infekcyjnej kopii NDV, w którym wytwarzany jest jeden lub więcej antygenów z innych patogenów i który może być użyty do szczepienia przeciwko wielu chorobom. Taka infekcyjna kopia wirusa NDV przykładowo obejmuje heterologiczny cDNA kodujący heterologiczne białko pochodzące przykładowo z wirusa ptasiej influenzy (AI) (hemaglutynina (H5 i H7) oraz neuraminidaza), wirusa ptasiej białaczki (ALV) (białko env (gp85)), wirusa anemii kurczaków (CAV) (VP1+VP2), wirusa choroby Mareka (MDV) (glikoproteina B (gpB), gH), inPL 197 722 B1 fekcyjnego wirusa zapalenia krtanio-tchawicy (ILT) (gB, gH, gD), infekcyjnego wirusa choroby kaletkowej (IBDV) (VP2 i VP3), wirusa nieżytu noso-tchawicy (TRT) (fuzja białkowa (F)), ptasiego paramiksowirusa-2, -3, -6 (PMV) (białko F, hemaglutynina-neuraminidaza (HN) czy inne), infekcyjnego wirusa zapalenia oskrzeli (IBV) (białko peplomer, neuroproteina) reowirusów (białko sigma), adenowirusów, pneumowirusów, Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Bordetella avium (dawniej Alcaligenes faecalis), Haemophilus paragallinarum, Pasteurella multocida, Ornithobacterium rhinotracheale, Riemerella (dawniej Pasteurella) anatipestifer, Mycoplasmata (M. gallisepticum, M. synoviae, M. mereagridis, M. iowae) lub Aspergilli (A. flavus, A. fumigatus).

Wynalazek wraz z tym dostarcza ptasiego paramiksowirusa lub pochodzące z niego szczepy, które można użyć jako wektor szczepionkowy dla wytworzenia antygenów z innych patogenów drobiu. Kilka cech stanowi o tym, że NDV jest idealnym wektorem szczepionkowym do szczepienia przeciwko chorobom układu oddechowego lub jelit. 1) NDV można z łatwością namnażać do bardzo wysokich mian w jajach zarodkowych. 2) masowa hodowla NDV w jajach zarodkowych jest stosunkowo tania. 3) Szczepionki NDV są stosunkowo stabilne i można je prosto podawać poprzez masowe sposoby podawania, jak picie wody czy przez spryskiwanie, lub w formie aerozolu. 4) Naturalne zakażenie wirusem NDV zachodzi drogą oddechową i/lub przez przewód pokarmowy, które są także naturalnymi drogami zakażeń dla wielu innych patogenów drobiu. 5) NDV może indukować miejscową odpowiedź immunologiczną niezależnie od obecności krążących przeciwciał odmatecznych.

Pokazano, że NDV posiada silne właściwości antyneoplastyczne jak również stymulujące układ immunologiczny (jako artykuł przeglądowy patrz Schirrmacher et al., 1998) [Schirrmacher V., Ahlert T., Steiner H.-H., Herold-Mende C., Gerhards R. i Hagmuller E. (1998) Immunization with virus-modified tumor cells. Seminars in Oncology 25: 677-696]. Chociaż nie wydaje się aby NDV mógł ulegać wydajnej replikacji w normalnych ludzkich komórkach, wyselekcjonowane, zabijane za pośrednictwem NDV ludzkie komórki nowotworowe, były opisane. U nagich myszy, po miejscowej terapii z NDV obserwowano wirusową onkolizę i całkowitą remisję przeszczepów ludzkiego nowotworu. Umożliwiło to użycie wirusa NDV w terapii nowotworowej. Jednakże problem stanowi fakt, że podawanie ograniczone jest do stosowania miejscowego.

Infekcja NDV indukuje interferony, chemokiny i inne potencjalnie ważne produkty genowe oraz wprowadza plejotropowe właściwości stymulujące układ odpornościowy do komórek nowotworowych. Zostało to wykorzystane do wytwarzania szczepionek z autologicznych komórek nowotworowych składających się ze świeżych skutecznych próbek, które były zainfekowane NDV. Tego typu szczepionkę nazwano nowotworową szczepionką autologiczną z NDV lub ATV-NDV (ang. autologous tumor vaccine-NDV, Schirrmacher et al., 1998). Komórki zainfekowane NDV są inaktywowane promieniowaniem gamma, co uniemożliwia podziały komórkowe, lecz pozwala na replikację NDV w cytoplazmie zainfekowanych komórek. Po zaszczepieniu pacjenta ATV-NDV, rekrutowane są limfocyty T za pośrednictwem chemokin indukowanych przez NDV. Niektóre z tych limfocytów T mogą wytwarzać receptor limfocytów T, który oddziałuje z peptydami antygenów związanych z nowotworem w kompleksie z cząsteczkami klasy I głównego kompleksu zgodności tkankowej na powierzchni komórki. W wyniku tych oddziaływań zachodzi indukcja odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T, w wyniku czego zostają zabite autologiczne komórki nowotworowe.

Wynalazek dostarcza możliwości modulowania repertuaru i ilości chemokin oraz białek stymulujących odpowiedź immunologiczną indukowanych przez infekcję NDV. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania zrekombinowanego NDV, który został zmodyfikowany tak aby wprowadzać i eksprymować (a) heterologiczny gen(y). Taki zrekombinowany NDV można użyć do modyfikowania repertuaru i ilości chemokin oraz białek stymulujących odpowiedź immunologiczną w zainfekowanych komórkach. W jednym wykonaniu, wynalazek dostarcza zrekombinowany NDV, który wprowadza i umożliwia ekspresję genów kodujących ludzkie interferony, chemokiny lub inne białka stymulujące odpowiedź immunologiczną. Omawiany zrekombinowany NDV jest stosowany do wytwarzania ATVNDV, która jest silniejsza od konwencjonalnej ATV-NDV. (Przykładowo: cyfokiny IFN-α, β, TNF-α, IL-1, IL-6; chemokiny RANTES, IP-10; inne geny takie jak HSP, ACTH, endorfina, iNOS, EPA/TIMP, NFkB). Plejotropowe właściwości NDV do stymulacji układu immunologicznego można także zastosować jako adjuwanty do szczepienia zwierząt i ludzi przeciwko chorobom zakaźnym. W jednym wykonaniu według wynalazku, obce geny kodujące istotny antygen (antygeny) czynnika infekcyjnego (czynników infekcyjnych) wprowadzane są do genomu NDV, a równoczesne wytworzenie antygenu (antygenów) oraz białek stymulujących układ immunologiczny przez zainfekowane komórki może indukować silną odpowiedź immunologiczną przeciwko czynnikowi infekcyjnemu. W innym wykonaniu

PL 197 722 B1 według wynalazku właściwości wirusa NDV do stymulowania układu immunologicznego można dodatkowo wzmocnić poprzez użycie rekombinantów NDV, które równocześnie wytwarzają antygeny i swoiste białka stymulujące układ immunologiczny. W korzystnym wykonaniu wynalazek jest zastosowany do wytworzenia szczepionki przeciwko AIDS (zespół niedoboru odpornościowego nabytego) przy użyciu rekombinantów NDV wytwarzających istotne antygeny wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV), same lub w kombinacji z białkami stymulującymi układ immunologiczny.

NDV jest także użyty jako adjuwant do szczepienia zwierząt i ludzi przeciwko chorobom zakaźnym. W jednym wykonaniu według wynalazku, heterologiczne lub obce geny kodujące istotny antygen (antygeny) czynnika infekcyjnego (czynników infekcyjnych) wprowadzane są do genomu NDV a równoczesne wytworzenie antygenu (antygenów) oraz białek stymulujących układ immunologiczny przez zainfekowane komórki może indukować silną odpowiedź immunologiczną przeciwko czynnikowi infekcyjnemu. W innym wykonaniu według wynalazku właściwości wirusa NDV do stymulowania układu immunologicznego są dodatkowo wzmocnione poprzez użycie rekombinantów NDV, które równocześnie wytwarzają antygeny i swoiste białka stymulujące układ immunologiczny. W korzystnym wykonaniu wynalazek jest zastosowany do wytworzenia szczepionki przeciwko AIDS (zespół niedoboru odpornościowego nabytego) przy użyciu rekombinantów NDV wytwarzających istotne antygeny wirusa ludzkiego niedoboru odporności (HIV), same lub w kombinacji z białkami stymulującymi układ immunologiczny.

Także dostarczany jest sposób wytwarzania warunkowo letalnych delecyjnych mutantów NDV, które można użyć jako samoograniczających, nie przekazywanych (nośnikowych) szczepionek. Wytworzono mutanta delecyjnego NDV, który nie jest zdolny do wytwarzania białka (M) matriks, wymaganego do pączkowania NDV na wewnętrznej błonie komórki. Wynalazek dostarcza przykładowo szczep NDV fenotypowo skomplementowany, który jest zdolny do wytwarzania białka M, i jest w stanie infekować komórki i rozprzestrzeniać się z komórki do komórki. Jednakże, zmutowany wirus nie jest zdolny do wytwarzania infekcyjnego potomstwa w niekomplementujących komórkach. Pokazuje to, że fenotypowo komplementujące delecyjne mutanty NDV można zastosować jako bezpieczne samoograniczające się szczepionki, które nie są zdolne do rozprzestrzeniania się w środowisku. Taka nie przekazywana szczepionka łączy najważniejszą zaletę żywych szczepionek tzn. skuteczność z najważniejszą zaletą zabitych szczepionek tzn. bezpieczeństwem.

Wynalazek dostarcza wirusa choroby Newcastle lub jego pochodnych szczepów przykładowo poprzez pasażowanie lub dalsze hodowanie w jajach zarodkowych czy odpowiednich komórkach, który jest pochodnym infekcyjnej kopii wirusa wytwarzanego sposobem dostarczanym według wynalazku.

Przykładowo, dostarczany jest NDV, który został zmodyfikowany na co najmniej jednej drodze wytwarzania infekcyjnej kopii wirusa choroby Newcastle, który jest atenuowany, o zmodyfikowanej wirulencji, zmodyfikowany antygenowo, wytwarza heterologiczny antygen lub nie jest przekazywany czy posiada kombinacje powyższych cech.

Niniejszy wynalazek dostarcza szczepionki NDV charakteryzujące się przykładowo tym, że niosą różne właściwości wirulencji lub różne własności antygenowe służące celom szczepionki markerowej i/lub do wytwarzania heterologicznych antygenów pochodzących z innych patogenów, w formie, która ulega przeniesieniu i/lub nie ulega przeniesieniu.

Szczepionka taka może być zabitą lub żywą szczepionką. Korzystnie szczepionka taka jest żywą szczepionką, jakkolwiek, zabite szczepionki dostarczane według wynalazku są korzystne w tych okolicznościach, gdzie żywa szczepionka nie jest odpowiednia lub jest odpowiednia tylko w niewielkich ilościach, przykładowo ze względu na handlowe ograniczenia lub inne warunki postawione przez władze kontrolujące chorobę.

Wynalazek dostarcza także sposobu diagnozowania oraz odpowiednie zestawy testów dla wykrywania przeciwciał przeciwko omawianemu serologicznie istotnemu immunodominującemu epitopowi czy markerowi, dostarczając metody i sposoby przeprowadzenia sposobu kontrolowania i/lub wytępienia NDV i/lub innych chorób drobiu. Wynalazek dostarcza nowe i skuteczne szczepionki, które mogą być rozróżniane serologicznie od wirusów terenowych i szczepionek starego typu. Takie nowe szczepionki nazwane markerowymi szczepionkami NDV, dostarczają możliwe najpełniejsze immunologiczne spektrum epitopów NDV posiadających znaczenie antygenowe, i są serologicznie rozróżniane od NDV dzikiego typu dzięki zastosowaniu dołączonych metod i zestawów diagnostycznych.

Wynalazek dostarcza sposobu rozróżniania zwierząt nie szczepionych lub zwierząt zaszczepionych szczepionką NDV według wynalazku od zwierząt zakażonych NDV dzikiego typu lub zaszczepionych szczepionką z niezmodyfikowanego szczepu mezogenicznego lub lentogenicznego NDV, polegający na tym, że obejmuje pobranie co najmniej jednej próbki (jak osocze, krew, jaja lub płyn

PL 197 722 B1 z oka) od omawianego zwierzęcia i ustalenie w omawianej próbce obecności przeciwciał skierowanych przeciwko immunodominujacemu epitopowi lub markerowi wytwarzanemu przez omawianego wirusa dzikiego typu lub niezmodyfikowanego NDV lecz nie wytwarzanemu przez szczepionkę według wynalazku.

Wynalazek dostarcza sposobu, gdzie omawiane przeciwciała są skierowane przeciwko białku HN lub F z NDV, przykładowo hybrydowemu białku jakie opisano w części eksperymentalnej tego opisu. Wynalazek dostarcza przykładowo, sposobu diagnozowania, który polega na tym, że omawiane zwierzę jest wyselekcjonowane z grupy złożonej z drobiu, korzystnie kurczaków.

Wynalazek dostarcza także zestawu diagnostycznego do użycia w sposobie serologicznego rozróżniania zwierząt. W jednym wykonaniu według wynalazku prosty i szybki test hamowania hemoaglutynacji (HI) stosowany jest do rozróżniania pomiędzy zaszczepionymi zwierzętami a zainfekowanymi zwierzętami. Zwierzęta zaszczepione szczepionką markerową, w której cała globularna głowa HN z NDV została zamieniona odpowiadającą częścią z HN innego serotypu nie będzie indukować przeciwciał przeciw HN z NDV a zatem nie będzie hamować hemoaglutynacji erytrocytów przez wiriony NDV.

Poprzez użycie wirionów szczepionek markerowych w teście HI, przeciwciała przeciwko hybrydowemu białku HN są wykrywane i można ich użyć do mierzenia wydajności szczepienia. Alternatywnie do mierzenia wydajności szczepienia stosowany jest test ELISA, który wykrywa przeciwciała przeciwko białku F z NDV.

Oprócz testu HI, można użyć testu ELISA do określania obecności przeciwciał przeciwko HN z NDV. Antygenem do zastosowania w takim teście jest przykładowo HN z NDV, który jest wytwarzany dzięki technikom rekombinacji DNA lub jest konserwowana peptyd z HN z NDV.

Można także użyć blokowanego testu ELISA. W tym przypadku jedno lub kilka monoklonalnych przeciwciał przeciwko konserwowanym epitopom z HN z NDV użyto do określenia czy kompetycyjne przeciwciała są obecne w próbkach z zaszczepionych zwierząt. Testy ELISA mogą korzystnie być używane, jeśli szczepionka markerowa zawiera jedynie chimerowe białka HN lub kiedy kilka epitopów HN z NDV jest zamienionych.

Wynalazek jest dalej wyjaśniany w części doświadczalnej tego opisu, która nie ogranicza niniejszego wynalazku.

Część doświadczalna

Materiały i metody

Standardowe procedury klonowania prowadzono zgodnie z Sambrook et al. (1989) o ile nie podano inaczej. Wszystkie konstrukty wymagające fragmentów DNA, które wytwarzano przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) potwierdzano poprzez analizę sekwencji. W sekwencjach starterów podanych poniżej podkreślono nukleotydy odpowiadające sekwencjom NDV i zaznaczono pozycje w genomie NDV. Sekwencję nukleotydową miejsc restrykcyjnych, których używano do klonowania zaznaczono pogrubionym drukiem.

Komórki i wirusy

Komórki CER (Smith et al., 1976) hodowano w pożywce GMEM/EMEM (1:1), zawierającej 5% płodową surowicę cielęcą oraz 2% mieszaninę antybiotyków zawierającą 1000 jedn./ml Penicyliny, 1000 pg/ml Streptomycyny, 20 pg/ml Fungizonu, 500 pg/ml Polimiksyny B oraz 10 mg/ml Kanamycyny. Komórki QT35 (Moscovici et al., 1977; Cho, 1982) hodowano w pożywce dostarczanej przez GibcoBRL/Life Technologies (nr kat. 041-91536; właściwości kompozycji z Fort Dodge) uzupełnionej 5% FCS oraz 2% mieszanina antybiotyków. Komórki QM5 (Antin i Ordahl, 1991) hodowano w pożywce M199 uzupełnionej 10% podłoże z fosforanem tryptozy, 10% FCS oraz 2% mieszaniną antybiotyków.

Szczep NDV LaSota otrzymano z ATCC (ATCC VR-699) i pasażowano dwa razy w jajach zarodkowych. Przed rozpoczęciem tworzenia konstruktów i klonowaniem cDNA, wirusy oczyszczano przez łysinki, stosując trzy rundy oczyszczania przez łysinki na pierwotnych embrionowych fibroblastach kurzych (CEF). Na końcu określano miano wirusa na komórkach CEF hodowanych w pożywce GMAM/EMAM (1:1), zawierającej 5% płodową surowicę cielęcą oraz 2% mieszaninę antybiotyków, 5% płyn omoczniowy, 30 mM MgCl₂, 200 pg/ml dekstranu DEAE (Sigma) oraz 0.8% agar Nobel (Difco). Wirusa z trzeciej rundy oczyszczania przez łysinki (oznaczonego jako klon E13-1) hodowano w jajach zarodkowych i cztery dni po zaszczepieniu zbierano płyn omoczniowy i przechowywano w porcjach w -70°C. Zrekombinowany wirus ptasiej ospy fpEFLT7pol (Britton et al., 1996; dalej nazywany FPV-T7), wytwarzający polimerazę RNA T7, otrzymano od Dr. Michael Skinner i hodowano na komórkach QT35.

Izolacja wirusowego RNA

Wszystkie czynności prowadzono w wolnym od RNaz szklanych lub plastykowych naczyniach a wszystkie roztwory sporządzano na wolnej od RNaz wodzie, którą traktowano 1% eterem dietylo14

PL 197 722 B1 wym kwasu pirowęglowego (DEPC) i sterylizowano przez autoklawowanie. Wirusy osadzano z płynu omoczniowego przez wirowanie przy 21 000 rpm przez 70 min. w rotorze SW40 firmy Beckman w 4°C. Osad zawieszano w buforze do homogenizacji (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% SDS) i poddawano działaniu Proteinazy K (200 pg/ml) przez 90 min. w 37°C stosując stałe wytrząsanie. Lizaty poddawano dwukrotnej ekstrakcji wobec równej objętości mieszaniny fenol/chloroform (1:1) pH 4,5 i jednokrotnej wobec równej objętości chloroformu. Wirusowy RNA wytrącano z wodnej fazy poprzez dodanie 0,1 objętości 3M NaOAc pH 5,3 i 2,5 objętości 100% etanolu. Precypitat osadzano przez wirowanie, płukano jednokrotnie 70% etanolem, zawieszano w wodzie i przechowywano w porcjach w -70°C.

Odwrotna transkrypcja

Wirusowy RNA (1,5 pg) mieszano z 500 ng startera w objętości 12 pl i inkubowano przez 10 min. w 70°C. Dodawano 4 pl 5x buforu RT (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCL2, GibcoBRL/Life Technologies) 2 pl 0,1 M DTT oraz 2 pl 10 mM dNTP (po 2,5 mM każdy) i mieszaninę inkubowano przez 2 min. w 42°C. Odwrotną transkrypcję prowadzono w końcowej objętości 20 pl poprzez dodanie 200 jedn. odwrotnej transkryptazy (Superscript II; GibcoBRL/Life Technologies) i inkubację przez 60 min. w 42°C.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

Wszystkie reakcje PCR stosowane do określenia końca 3' i 5' genomu NDV (patrz poniżej) prowadzono przy użyciu polimerazy DNA Taq (Perkin Elmer). Do klonowania poszczególnych genów z NDV czy dużych subgenomowych cząsteczek cDNA, stosowano zgodnie z zaleceniami dostawcy (Boehringer Mannheim) albo korektorską polimerazę DNA Pwo albo mieszaninę Taq i Pwo (Expand High Fidelity Kit lub Expand Long Templete Kit). Wszystkie próbki inkubowano przez 2 min. w 94°C przed rozpoczęciem wskazanej liczby cykli PCR. Po zakończeniu wskazanej liczby cykli PCR, próbki inkubowano w temperaturze elongacyjnej przez co najmniej 3 krotny czas trwania fazy elongacji w cyklu PCR. Fragmenty PCR oczyszczano bezpośrednio przy pomocy zestawu High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) lub po rozdziale elektroforetycznym w żelu agarozowym przy użyciu zestawu Qiaex II extraction kit (Qiagen) zasadniczo według opisu producenta.

Analiza sekwencji

Wszystkie sekwencje określano przy użyciu zestawu do sekwencjonowania PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer). Mieszaniny reakcyjne (5 pl) poddawano 25 cyklom liniowej amplifikacji (10 sek. 94°C, 5 sek. 50°C i 4 min. 60°C) w termocyklerze GeneAmp2400. Następnie mieszaniny reakcyjne wytracano etanolem, przepłukiwano 70% etanolem, zawieszano w 15 pl buforu TSR (Perkin Elmer) i grzano przez 2 min. w 94°C przed naniesieniem do automatycznego sekwensera Applied Biosystems AB310.

Sekwencje nukleotydowe starterów użytych do sekwencjonowania całego genomu NDV szczepu LaSota były albo pochodziły z opublikowanych sekwencji lub z sekwencji ustalonych podczas tego projektu sekwencjonowania. Startery przedstawiono w Tab. 1.

Klonowanie i sekwencjonowanie końców 3' i 5' z genomu NDV szczepu LaSota

Sekwencja nukleotydowa końców 3' i 5' genomu NDV została określona przy użyciu procedur RACE (szybka amplifikacja końców cDNA). RNA z NDV użyto w reakcji odwrotnej transkrypcji prowadzonej w końcowej objętości 20 pl przy użyciu startera p360 (5'-GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT-3'; nt 14756-14779), który pochodził z opublikowanej sekwencji genu L z NDV (Yusoff et al., 1987). Jednoniciowy cDNA (2,5 pl mieszaniny RT) dodawano do 8 pmoli startera kotwiczącego ALG3 (5'-CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3') i ligowano przez noc w temperaturze pokojowej w 20 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgC); 10 pg/ml BSA, 25% PEG, 1 mM HCC, 20 pM ATP oraz 10 jedn. ligazy RNA T4 (New England Biolabs) jak opisano w Tessier et al. (1986). Jeden pl z reakcji ligacji użyto jako matrycy w reakcji PCR ze starterami p375 (5'-CAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT-3'; nt 14964-14984) i ALG4 (5'-GAAGGATCCAGAATCGATAG-3'). Ostatni starter jest komplementarny do startera kotwiczącego ALG3. Warunki reakcji PCR (40 cykli) były następujące: 1 min. 94°C, 1 min. 55°C oraz 2 min. 72°C. Produkty PCR oczyszczano i klonowano w wektorze T pBluescriptll-TSK (Ichihara i Kurosawa, 1993). Alternatywnie, oczyszczone produkty PCR poddawano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA dla stworzenia tępych końców i klonowano w miejscu HincII plazmidu pGEM4Z (Promega). Trzynaście niezależnych klonów (8x pBluescriptll-TSK i 5x pGEM4Z) zsekwencjonowano w celu określenia sekwencji nukleotydowej końca 5' genomu NDV szczepu LaSota. Sekwencja nukleotydowa końca 3' została określona przy pomocy dwóch niezależnych metod. W metodzie I, starter ALG3 ligowano z końcem 3' wirusoPL 197 722 B1 wego RNA przy użyciu ligazy RNA T4 jak opisano w Schutze et al. (1995). Mieszanina reakcyjna (końcowa objętość 10 μΙ zawierała 2,5 pg RNA z NDV, 100 pmoli ALG3, 1 μΙ 10x buforu dla ligazy RNA T4 (500 mM Tris-HCl, pH 7,8, 100 mM MgCI₂, 100 mM DTT, 10 mM ATP), 1 pl RNazyny (Promega) i 10 jedn. ligazy RNA T4 (New England Biolabs). Mieszaninę inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej i 5 pl z reakcji ligacji użyto jako matrycy w reakcji odwrotnej transkrypcji przy użyciu startera ALG4. Jeden pl z reakcji RT użyto w reakcji PCR przy użyciu starterów ALG4 i p376 (5'-GAGCCTTAAGGAGCTGCTCGTACTGATC-3'; nt 137-164), który pochodził z opublikowanej sekwencji końca 3' NDV (Ishida et al., 1986). Warunki reakcji PCR były takie jak opisano powyżej dla reakcji 5'RACE. W metodzie II, końce 3' i 5' RNA wirusa NDV ligowano ze sobą przy użyciu ligazy RNA T4 stosując te same warunki jak opisano powyżej w metodzie I. Pięć pl mieszaniny ligacyjnej użyto jako matrycy w reakcji odwrotnej transkrypcji przy użyciu startera p360. Jeden pl reakcji RT użyto w reakcji PCR przy użyciu starterów p375 i p376 i warunków PCR opisanych powyżej dla reakcji 5'RACE. Produkty PCR poddawano działaniu fragmentu Klenowa polimerazy I dla stworzenia tępych końców i klonowano w miejscu HincII plazmidu pGEM4Z (Promega). Dziesięć niezależnych klonów (4 uzyskane metodą I i 6 metodą II) zsekwencjonowano w celu określenia sekwencji nukleotydowej końca 3' genomu NDV szczepu LaSota.

Konstrukcja wektora transkrypcyjnego

Skonstruowano wektory transkrypcyjne o niskiej liczbie kopii przy użyciu plazmidu pOK12 (Vieira i Messing, 1991) jako podstawowego replikonu. Plazmid pOK12 trawiono PvuII i izolowano fragment DNA zawierający start replikacji oraz gen oporności na kanamycynę. Fragment DNA ligowano z fragmentem Eco47III-AflII (miejsce AfIII było wytępione przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I) z wektora transkrypcyjnego 2.0 (dar od Dr Andrew Ball; Pattnaik et al., 1992). Z wytworzonego plazmidu wydeletowano fragment XbaI-NheI w celu wyeliminowania tak dużo unikatowych miejsc restrykcyjnych jak tylko możliwe. Wytworzony plazmid oznaczono jako pOLTV5 (Fig. 1). Wektor transkrypcyjny pOLTV5 zawiera promotor polimerazy RNA zależnej od DNA z faga T7 za którym występują unikatowe miejsca restrykcyjne Stul i Smal, autokatalltyczny rybozym z wirusa żółtaczki typu delta (HDV) oraz sygnał terminacji transkrypcji z bakteriofaga T7. Fragmenty DNA sklonowane pomiędzy miejscami Stul i Smal mogą ulegać transkrypcji zarówno in vitro jak i in vivo przy użyciu polimerazy RNA T7. Po transkrypcji koniec 5' wytworzonych transkryptów zawiera dwie reszty G kodowane przez plazmid. Ze względu na autokatalityczne działanie rybozymu HDV koniec 3' transkryptów odpowiada dokładnie końcowemu nukleotydowi sklonowanego fragmentu DNA (Pattnaik et al., 1992).

Konstrukcja plazmidów minigenomowych

W celu zbadania wymagań replikacyjnych i transkrypcyjnych wirusa NDV, skonstruowano plazmidy minigenomowe, które zawierały regiony końców 3' i 5' z NDV flankujące gen reporterowy, który wymienił wszystkie geny z NDV (Fig. 2). Fragmenty DNA odpowiadające regionom końcowym 3' i 5' z NDV wytworzono za pomocą PCR przy użyciu polimerazy DNA Pwo (30 cykli: 15 sek. 94°C, 30 sek. 50°C oraz 30 sek. 72°C) i używając plazmidów zawierających fragmenty 3' i 5' RACE jako matryce (patrz powyżej).

Region 3' (nt 1-119) wytworzono przy użyciu starterów 3UIT (5'-ACCAAACAGAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3'; nt 1-27) i SEAP3 (5'-ATCGATACTGGTCAGCATGCTGGCAGAAGGCTTTCTCG-3'; nt 102-119) Region 5' (nt 14973-15186) wytworzono przy użyciu starterów SEAP5 (5'-GCATGCTGACCAGTATCGATATTACAGTAACTGTGACT-3'; NT 14973-14990) i 5NDV (5'-ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACGA-3'; nt 15158-15186). Dwa fragmenty DNA połączono przy pomocy „zachodzącego PCR (sekwencja zachodząca jest zaznaczona kursywą w sekwencjach starterów pokazanych powyżej) stosując startery 3UIT i 5NDV. Wytworzony fragment DNA będący fuzją końca 3' i 5' z NDV oddzielonych przez 20 nukleotydów fosforylowano przez działanie kinazy polinukleotydowej T4 i sklonowano w obu orientacjach w plazmidzie transkrypcyjnym pOLTV5 (Fig. 1), który przecięto Stul i Smal i defosforylowano cielęcą fosfatazą z jelita (Boehringer Mannheim). W końcu gen SEAP (kodujący wydzielaną alkaliczną fosfatazę) odzyskiwano z plazmidu pSEAP-Basic (Clontech) poprzez trawienie Sphl i ClaI i klonowanie pomiędzy miejscami Sphl i ClaI pomiędzy końcami 3' i 5' z NDV. Powstałe plazmidy oznaczono odpowiednio jako pOLTV535 i pOLTV553. Transkrypcja in vivo i in vitro przy użyciu polimerazy RNA T7 z pOLTV535 dawała antygenomowy RNA ([+]-RNA), podczas gdy transkrypcja z pOLTV553 dawała genomowy RNA ([-]-RNA).

Plazmidy pOLTV535N0 do -N5 oraz pOLTV553N0 do -N5 wytwarzano poprzez wprowadzenie komplementarnych do siebie oligonukleotydów w miejsce ClaI położone pomiędzy genem SEAP a końcem 5' z NDV, odpowiednio w pOLTV535 i pOLTV553 (patrz Fig. 2). Użyto następujących oligo16

PL 197 722 B1 nukleotydów: N0, 5'-CGCGAGCTCG-3'; N1, 5'-GCGGAGSCTCG-3'; N2, 5'-CGCGAGCGCTCG-3'; N3, 5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; N4, 5'-CGCGAGCATGCTCG-3'; N5, 5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; N4, 5'-CGCGAGCATGCTCG-3'; N5, 5'-CGCGAGCASTGCTCG-3' (W = A lub T; S= C lub G).

Modyfikacja promotora T7 w plazmidach pOLTV535 i pOLTV553

Do wytworzenia in vivo i in vitro transkryptów zawierających prawdziwe końce 5' i 3' z NDV, zmodyfikowano promotor T7 w plazmidach pOLTV535 i pOLTV553 tak, że transkrypcja mogła zaczynać się w pierwszym nukleotydzie końca 3' i 5' z NDV.

Zaprojektowano startery, które zawierały, 1) miejsce restrykcyjne Bgll, 2) sekwencję promotora T7 (pokazana kursywą), która była zmodyfikowana tak, że reszty G na końcu promotora T7 były zamienione resztą A oraz koniec -3' (nt 1-21) lub 5' (nt 15164-15186) z NDV. Do wytworzenia fragmentu DNA zawierającego zmodyfikowany promotor T7 oraz cały koniec 3' z NDV do miejsca startu genu SEAP w pOLTV535 użyto starterów BGL3F2 (5'-GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTAACCAAACAGAGAATCCGTGAG-3') oraz SEAP3 (patrz powyżej). Podobnie wytworzono fragment DNA zawierający zmodyfikowany promotor T7 oraz cały koniec 5' z NDV do miejsca końca genu SEAP w pOLTV553 przy użyciu starterówBGL5F2 (5'-GATATGGCCATTCAGGATTAATACGACTCACTATAACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3') oraz SEAP5. Wytworzone fragmenty trawiono odpowiednio Bgll i Sphl (koniec 3') lub Bgll i ClaI (koniec 5') i użyto do wymiany fragmentu Bgll-Sphl w pOLTV535 lub fragmentu Bgll-Clal w pOLTV553. Powstałe plazmidy oznaczono odpowiednio jako pOLTV735 i pOLTV753. Plazmidy pOLTV735N3 oraz pOLTV753N3 wytwarzano poprzez wprowadzenie komplementarnego do siebie oligonukleotydu (5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; W = A lub T) w miejsce ClaI położone pomiędzy genem SEAP a końcem 5' z NDV, odpowiednio w pOLTV735 i pOLTV753.

Konstrukcja plazmidów z reporterem SEAP

Plazmid pCIneoSEAP skonstruowano poprzez sklonowanie fragmentu XhoI-ClaI (miejsce Clal zostało wytępione przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I) zawierającego gen SEAP z plazmidu pSEAP-Basic (Clontech) pomiędzy miejsca Xhol i Smal eukariotycznego wektora ekspresyjnego pCIneo (Promega). Ten ostatni plazmid zawiera promotor ludzkiego cytomegalowirusa (hCMV) dodatkowo do promotora z bakteriofaga T7. W celu przetestowania i ilościowej ekspresji SEAP poprzez transkrypty wytwarzane tylko z promotora T7, skonstruowano inny plazmid, taki który nie miał promotora hCMV. W tym celu z pCIneo został usunięty promotor hCMV poprzez częściowe trawienie Hindll a następnie całkowite trawienie Bglll. Fragment DNA (nt 756-5469) zgodnie z numeracją Clontech) z którego usunięto promotor hCMV został wyizolowany, poddany działaniu polimerazy DNA T4 dla wytworzenia tępych końców i zamknięty w kółko przy użyciu ligazy DNA T4. Powstały plazmid oznaczono jako pCIneoD. W końcu, gen SEAP odzyskano z pSEAP-Basic w postaci fragmentu MluI-AccI i sklonowano w pCIneoD pomiędzy miejscami Mlul i Ciał. Wytworzony plazmid oznaczono jako pCIneoD SEAP.

Transfekcje

Komórki umieszczano w 24-studzienkowych szalkach do hodowli, hodowano przez noc do 60-80% zlania i infekowano FPV-T7 przy m. o. i. 1 przez 1 godz. w 37°C. Komórki transfekowano 0,5 pg minigenomowego plazmidu DNA przy użyciu 3 μΙ LipofectAMINE oraz OptiMem, zasadniczo zgodnie z opisem dostawcy (GibcoBRL/Life Technoligies). Po inkubacji przez 4 godz. (komórki CER) lub 16 godz. (komórki QM5) w 37°C komórki albo infekekowano NDV (wirulentny izolat Dutch nr 152608; 200 pl na studzienkę) przez 1 godz. przy m.o.i. 5 albo pozostawiano nie zainfekowane. Inokulum wsysano i wymieniano 1 ml pożywki kompletnej i komórki dalej inkubowano w 37°C.

Do kotransfekcji komórki hodowano w 6-studzienkowych szalkach do hodowli i infekowano FPV-T7 jak opisano powyżej. Komórki kotransfekowano 0,25 pg minigenomowego plazmidu DNA, 0,4 pg pCIneoNP, 0,2 pg pCIneoP oraz 0,2 pg pCIneoL(c) lub pCIneo poprzez dodanie 8 pl LipofectAMINE lub 9 pl FuGene6 (Boehringer Mannheim). W celu wytworzenia wirusa minigenowy plazmid wymieniano plazmidem transkrypcyjnym zawierającym pełnej długości cDNA NDV.

Pomiar ilościowy aktywności SEAP

Ilość SEAP, która była wydzielana do pożywki ze stransfekowanymi komórkami mierzono w 96-studzienkowych płytkach do jednorazowego użytku przy użyciu zestawu Phospha-Light Chemiluminescent Reporter Assay for Secreted Alkaline Phosphatase kit zasadniczo zgodnie z opisem producenta (Tropix). Chemiluminescencję określano przy użyciu licznika scyntylacyjnego płynu (Wallac 1450 microbeta PLUS).

Klonowanie i sekwencjonowanie cząsteczek cDNA pokrywających cały genom szczepu NDV LaSota

W celu sklonowania i zsekwencjonowania całego genomu NDV szczepu LaSota, wytworzono klony z dużym subgenomowym cDNA przy użyciu RT-PCR i klonowania w pGEM-T. Syntezę pierwPL 197 722 B1 szej nici cDNA przeprowadzono przy użyciu startera 3UIT jak opisano powyżej i 1 μΙ z reakcji RT użyto w reakcji PCR przy użyciu zestawu Expand Long Template PCR kit (Boehringer Mannheim). Reakcję PCR stanowiło 5 cykli o profilu: 10 sek. 94°C, 30 sek. 58°C oraz 6 min. 68°C, po których następowało 10 cykli o profilu 10 sek. 94°C, 30 sek. 58°C oraz 6 min. 68°C, w których czas elongacji w 68°C wzrastał o 20 sek. na cykl. Fragmenty PCR klonowano w pGEM-T przy użyciu zestawu pGEM-T cloning kit zasadniczo zgodnie z opisem producenta (Promega). Mieszaninę ligacyjną transformowano E.coli szczep SURE II (Stratagee). Przeprowadzono dwie niezależne reakcje RT-PCR (A i B) i każde dały podobny zestaw klonów cDNA. Sekwencje nukleotydową klonów subgenomowego cDNA określono przy użyciu starterów specyficznych do NDV (Tab. 1) i starterów flankujących wstawki. Po porównaniu sekwencji nukleotydowej klonów z serii A i B pozostające niejasności były rozwiązane poprzez sekwencjonowanie odpowiednich regionów z trzeciej niezależnej serii cząsteczek cDNA (seria C). Sekwencja nukleotydowa NV szczepu LaSota jest przedstawiona na Fig. 3. Konstrukcja klonu cDNA o pełnej długości genomu z NDV

Pełnej długości cDNA NDV został włączony do plazmidu transkrypcyjnego pOLTV5 przy użyciu pOLTV535 jako plazmidu wyjściowego. Fragmenty DNA łączono na zakładkę przy użyciu powszechnie dostępnych enzymów restrykcyjnych jak wyszczególniono na Fig. 4B. W serii etapów klonowania skonstruowano plazmid (oznaczony jako p535-DI), który zawiera nukleotydy 1-3521 i 12355-15186 oddzielone przez miejsce Clal, wytworzone poprzez połączenie miejsc Clal w pozycji 3521 i 12355. W innej serii etapów klonowania wytworzono plazmid (oznaczony jako pGEM-B), który zawiera część genomu NDV obejmującą nukleotydy 3521-12355 (fragment Clal). Dla udogodnienia klonowania ostatni fragment Clal wyznakowano znacznikiem w postaci genu oporności na chloramfenikol (Cm) z plazmidu pACYC184 (Chang i Cohen, 1978). W tym celu z pACYC184 odzyskano gen Cm za pomocą reakcji PCR stosując startery CAT-F (5'-GCGTACGTCTAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG-3') oraz CAT-R (5'-GCTCTAGACGTACGACCCTGCCCTGAACCGACG-3'). Reakcję PCR przeprowadzono z użyciem polimerazy DNA Pwo w 30 cyklach o profilu: 30 sek. 94°C, 45 sek. 60°C oraz 60 sek. 72°C. Powstałe fragmenty DNA trawiono BsiWI i klonowano w unikatowym miejscu BsiWI w pGEM-B, tworząc pGEM-B(CAT). Fragment ClaI z pGEM-B(CAT) sklonowano w unikatowym miejscu Clal z p535-DI, tworząc pNDFL(CAT). W końcu gen CM usunięto z plazmidu poprzez trawienie BsiWI, religację i transformację E.coli szczep DH5a. Powstały plazmid oznaczony jako pNDFL+ zawiera całą sekwencję cDNA NDV sklonowaną pomiędzy promotorem T7 i rybozymem HDV w plazmidzie transkrypcyjnym pOLTV5.

Klonowanie i ekspresja poszczególnych genów z NDV

Fragmenty DNA zawierające poszczególne geny z NDV szczep LaSota wytwarzano za pomocą reakcji RT-PCR i klonowano w pCIneo. Po klonowaniu, wszystkie fragmenty sekwencjonowano przy użyciu starterów flankujących wstawki oraz starterów specyficznych dla genu.

Gen NP: do odwrotnej transkrypcji użyto startera 386 (5'-GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAGGTG-3'; nt 40-69). Startery 365 (5'-GTGTGAATTCCGAGTGCGAGCCCGAAG-3'; nt 77-94) oraz 892 (5'-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC-3'; nt 1577-1593) były użyte do reakcji PCR z Pwo polimerazą DNA. Zastosowano następujący profil PCR (30 cykli): 30 sek. 95°C, 40 sek. 65°C oraz 45 sek. 72°C. Powstały fragment DNA trawiono EcoRI i klonowano w pCIneo pomiędzy miejscami EcoRI i Smal. Ekspresję NP potwierdzano testem z immunologicznym z peroksydazą (IPMA) jak opisano przez Peeters et al. (1992) przy użyciu przeciwciała monoklonalnego 38 (Russell et al., 1983).

Gen P: do odwrotnej transkrypcji użyto startera pRTl (5'-CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGGGTAGAA-3'; nt 1794-1814). Startery pRTl oraz p2 (5'-GCAGTCTAGATTAGCCATTCACTGCAAGGCGC-3'; nt 3053-3071) były użyte do reakcji PCR z polimerazą DNA Pwo. Zastosowano następujący profil PCR (30 cykli): 30 sek. 95°C, 40 sek. 65°C oraz 60 sek. 72°C. Powstały fragment DNA trawiono EcoRI i Xbal i klonowano w pCIneo pomiędzy miejscami EcoRI i Xbal. Ekspresję P potwierdzano testem IPMA przy użyciu przeciwciała monoklonalnego 688 (Russell et al., 1983).

Gen M: do odwrotnej transkrypcji użyto startera 3UIT (5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3'; nt 1-27). Do reakcji PCR zastosowano startery NDV5M (5'GGGTGCTAGCGGAGTGCCCCAATTGTGCCAA-3'; nt 3268-3288) oraz NDV3M (5'-TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTTAAAAGGAT-3'; nt 4368-4389) i reakcje prowadzono przy użyciu zestawu Expand High Fidelity kit. Reakcję PCR stanowiło 10 cykli o profilu: 15 sek. 95°C, 30 sek. 55°C oraz 2 min. 68°C, po których następowało 15 cykli, w których czas elongacji w 68°C wzrastał o 20 sek. na cykl. Powstały fragment DNA poddawano działaniu polimerazy DNA T4 celem wytworzenia tępych końców, trawiono Nhel i klonowano

PL 197 722 B1 w pCIneo pomiędzy miejscami Nhel i Smal. Ekspresję białka M potwierdzano testem IPMA przy użyciu przeciwciała monoklonalnego 424 (Russell et al., 1983).

Gen F: do odwrotnej transkrypcji użyto startera 3UIT (patrz powyżej). Do reakcji PCR zastosowano startery NDV5F (5'-ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGTTGG-3'; nt 4508-4526) oraz NDV3F (5'-ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCTCAT-3' ; nt 6212-31) i reakcję prowadzono przy użyciu zestawu Expand High Fidelity kit stosując warunki opisane powyżej dla genu M. Powstały fragment DNA poddawano działaniu polimerazy DNA T4 celem wytworzenia tępych końców, trawiono Nhel klonowano w pCIneo pomiędzy miejscami Nhel i Smal. Ekspresję białka F potwierdzano testem IPMA przy użyciu przeciwciała monoklonalnego 8E12A8C3 (ID-DLO Department of Avian Virology).

Gen HN: do odwrotnej transkrypcji użyto startera 3UIT. Do reakcji PCR zastosowano startery NDV5HN (5'-GTAGGCTAGCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3'; nt 6335-6354) oraz NDV3HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3'; nt 8205-8227) i reakcję prowadzono przy użyciu zestawu Expand High Fidelity kit stosując warunki opisane powyżej dla genu M. Powstały fragment DNA poddawano działaniu polimerazy DNA T4 celem wytworzenia tępych końców i po trawieniu Xmal klonowano w pCIneo pomiędzy wytępionym (fragment Klenowa polimerazy I) miejscem Nhel i miejscem Xmal. Ekspresję białka HN potwierdzano testem IPMA przy użyciu przeciwciała monoklonalnego 86 (Russell et al., 1983).

Gen L: Gen L odzyskiwano z klonu cDNA pGEM-L7a (Fig. 4A) przez trawienie SacII i Sall. Przed trawieniem Sall, miejsce SacII tępiono działając polimerazą DNA T4. Powstały fragment klonowano w pCineo pomiędzy wytępionym (fragment Klenowa polimerazy I) miejscem Nhel i miejscem Sali. Nie ulegający translacji region 5' pomiędzy promotorem T7 i kodonem start ATG genu L zawierał nie występujące w fazie kodony ATG, które mogły zaburzać prawidłowe wytwarzanie białka L. Zatem skonstuowano nowy plazmid w którym pierwszy kodon ATG opuszczono i w którym drugi kodon ATG zamieniono w AAG za pomocą mutagenezy wykorzystującej PCR. W reakcji PCR wykorzystującej jako matryce plazmid pGEM-L7a (Fig. 4) użyto następujące startery 5LE(E) (5'-CAATGGAATTCAAGGCAAAACAGCTCAAGGTAAATAATACGGG-3'; nt 8332-8374) oraz 3LE(B) (5'-GTGAATCTAGAATGCCGGATCCGTACGAATGC-3'; nt 8847-8870). Reakcję PCR prowadzono przy użyciu polimerazy DNA Pwo i zastosowaniu następujących. Zastosowano następujący profil PCR (30 cykli): 30 sek. 94°C, 45 sek. 60°C oraz 60 sek. 72°C. Powstały fragment DNA trawiono EcoRI i Xbal i klonowano w pCIneo pomiędzy miejscami EcoRI i Xbal wytwarzając plazmid pCIneoL(N). Następnie fragment BsiWI-Sall z pGEM-L7a zawierający pozostałą część genu L (nt 8852-15046) sklonowano w pCIneo pomiędzy miejscami BsiWI i Sall, tworząc plazmid pCIneoL(c). Ponieważ nie są dostępne przeciwciała przeciwko białku L, wytwarzania białka L nie można było sprawdzić za pomocą technik immunochemicznych.

Wprowadzenie genetycznego znacznika do genu F

Aby wykazać jednoznacznie, że można wytworzyć infekcyjnego wirusa z klonu cDNA o pełnej długości wprowadzono genetyczny znacznik do genu F poprzez mutągenezą wykorzystującą reakcję PCT. W tym celu sklonowano gen F przy użyciu dwóch zachodzących na siebie fragmentów PCR. Pierwszy fragment PCR wytworzono przy użyciu starterów NDV5F (patrz powyżej) oraz startera F5R (5'-AAAGCGCCGCTGTCTCCTCCCTCCAGATGTAGTCAC-3'; nt 4859-4894).

Reszty zaznaczone grubym drukiem są zmianami wprowadzonymi w starterze w celu zmiany sekwencji aminokwasowej miejsca proteolitycznego cięcia pomiędzy F1 i F2 z NDV szczepu LaSota (GGRQGR | L) do konsensusu miejsca cięcia z wirulentnej formy szczepów NDV (GRRQRR | F). Drugi fragment PCR wytworzono przy użyciu starterów F3F (5'-GGAGGAGACAGCGGCGCTTTATATAGGCGCCATTATTGG-3'; nt 4875-4911) oraz IV09 (5'-CTCTGTCGACACAGACTACCAGAACTTTCAC-3' ; nt 6246-6266). Reakcję PCR prowadzono przy użyciu polimerazy DNA Pwo i zastosowano 25 cykli o następującym profilu: 15 sek. 94°C, 30 sek. 55°C oraz 2 min. 72°C. Dwa zachodzące na siebie fragmenty PCR (sekwencja zachodząca jest zaznaczona kursywą w sekwencjach starterów) łączono przy użyciu drugiej reakcji PCR ze starterami NDV5F oraz IV09 w tych samych warunkach PCR. Powstały fragment, który zawiera cały ORF dla genu F kodujący miejsce cięcia o konsensusie dla formy wirulentnej trawiono Nhel i Sall i klonowano w pICneo pomiędzy miejscami Nhel i Salh tworz^ąc ^pCIneo^wt. ^Fra^gmen^t ^u^oh (n^{t 4646}-⁴⁹⁵²) z ^pCIneo^w u^żyto ^do w^ymfon^y opowiadającego mu fragmentu z plazmidu p535-S, który skonstruowano poprzez wprowadzenie fragmentu Clal-Scal (nt 3521-10311) z pGEM-B w p535-DI pomiędzy miejsca ClaI i Scal (patrz Fig. 4C). Wytworzon^y pdazmfo oznaczono jako ^p535-^S [^Fwtc]. ^Fra^gmen^{t PCR} zawforaj^ąc^{y g}en o^porno^ścⁱ na cMoramfenikol (Cm) z pACYC184 (patrz powyżej) sklonowano jako fragment Xbal w unikatowe miejsce ^Xba^l (^poz^ycja ⁶¹⁷² w se^kwencj^{i NDV}) z pdazmfou ^p535-^S[^Fwtc] ^tworz^ąc pdazmfo ^p535-^S [^Fwtc] Cm.

PL 197 722 B1

Następnie fragment Apal-Spel wyznakowany Cm (nt 2285-8094) z tego plazmidu użyto do wymiany z odpowiadającym mu fragmentem klonu cDNA o pełnej długości z pNDFL+. W końcu gen Cm usuwano z tego plazmidu poprzez trawienie Xbal, po którym plazmid ponownie zamykano przy użyciu ligazy T4. Powstały plazmid, zawierający genetycznie wyznakowany pełnej długości cDNA NDV oznaczono ja^ko ^pNDFL+[^Fwt].

Wytworzenie stabilnie transformowanych linii komórkowych eksprymujacych poszczególne geny NDV

Do wytworzenia stabilnie transformowanych linii komórkowych wyrażających poszczególne ^bia^łka u^żyto ^plazm^idów pCtaeoNP, ^pCIneoP ^pClneoM^, piCIneoR ^pClneo^Fwt oraz ^pClneoH^N. Dzⁱe^ń przed transfekcją komórki wysiewano na 6 cm szalki i inkubowano przez noc do osiągnięcia 60-80% zlania. Komórki transfekowano 2 pg DNA plazmidu przy użyciu 12 μΙ LipofectAmine i OptiMem według zaleceń producenta (GibcoBRL/Life Technologies). Po 48 godzinach komórki trypsynizowano i wysiewano rozcieńczając na 10 cm szalkach hodowlanych w pożywce zawierającej 500 pg/ml G418 (Boehringer Mannheim). Co trzy dni pożywkę wymieniano świeżą pożywką zawierającą wzrastające ilości (w krokach co 100 pg/ml) G418 do osiągnięcia stężenia 800 pg/ml. Komórki hodowano w pożywce zawierającej 800 pg/ml G418 i trzy tygodnie po transfekcji pojedyncze kolonie izolowano i przenoszono do 96-studzienkowej szalki hodowlanej. Klonowane linie komórkowe badano pod względem ekspresji odpowiedniego genu NDV przy pomocy testu IPMA, jak to opisano powyżej dla badań przejściowej ekspresji.

Linie komórkowe wytwarzające konstytutywnie NP, P, M lub F można było zidentyfikować i wyodrębnić. Nie byliśmy jednak w stanie wytworzyć linii komórkowej wyrażającej białko HN. Być może konstytutywne wyrażanie HN jest dla komórek toksyczne.

Wytworzenie stabilnie transformowanych linii komórkowych eksprymujących polimerazę T7

Gen kodujący polimerazę RNA T7 uzyskano z plazmidu pRT7NT (Rene van Gennip, ID-DLO, Department of Mammalian Virology) przez trawienie EcoRI i Sall. Powstały fragment zawiera gen polimerazy RNA T7 umieszczony pod promotorem p10 bakulowirusa. Fragment wklonowano do plazmidu pCIneo pomiędzy miejsca ciecia EcoRI i Sall, tworząc plazmid pCIneo107. Plazmid pCIneo0 nie posiada promotora T7 i został otrzymany z pCIneo poprzez przecięcie Nhel, a następnie częściowe przecięcie Scal, wypełnienie lepkich końców przy pomocy fragmentu Klenowa polimerazy DNA i cyrkularyzację przy użyciu ligazy DNA T4. Sekwencje bakulowirusa usunięto z pCIneo107 przez trawienie EcoRI i PacI, a następnie utworzenie tępych końców i recyrkularyzację przy pomocy polimerazy DNA T4. Powstały fragment oznaczono pCIneo007. Wyrażanie polimerazy RNA T7 sprawdzano kotransfekując komórki pCIneo007 i pRh01. Ten ostatni plazmid koduje białko E2 wirusa typowej gorączki świńskiej wklonowane za promotorem T7 i posiadające wewnętrzne miejsce wiązania do rybosomu (Rene van Gennip, inf. ustna). Wyrażanie E2 określano testem IPMA przy użyciu monoklonalnego przeciwciała V4 (Wensvoort et al., 1986). Wytworzono stabilnie transformowane linie komórkowe wyrażające polimerazę RNA T7 i izolowano jak opisano powyżej, wyjąwszy to, że użyto 10 cm szalek hodowlanych i komórki transfekowano 5 pg DNA pCIneo007 i 25 pl LipofectAmine. Aby sprawdzić poszczególne linie komórkowe pod względem ekspresji polimerazy RNA T7, transfekowano je plazmidem pRh01, a ekspresję E2 (która jest niezależna od polimerazy RNA T7) określano testem IPMA przy użyciu monoklonalnego przeciwciała V4. Zidentyfikowano kilka linii wyrażających polimerazę RNA T7. Jedna z nich, oznaczona jako CER-C9, została użyta do kolejnych doświadczeń.

Klonowanie i ekspresja genów HN i genów hybrydowych z HN

Do syntezy jednoniciowego cDNA NDV użyto startera 3UIT i serotypów 2 i 4 (APMV2 i APMV4) ptasiego paramiksowirusa jak opisano powyżej. Wszystkie kolejne reakcje PCR przeprowadzano stosując 25 cykli po 15 s w 94°C, 30s w 55°C i 2 min w 72°C. Cały obszar kodujący genu HN wirusa APMV2 otrzymano przy pomocy PCR stosując startery IV03 (5'-GGGGGAATTCCCCATTCAATGAAGGGTCAC-3') i IV05 (5'-GATCCCCGGGTCTTAAACCAGGCTTCGCAATG-3') otrzymane na podstawie sekwencji genu HN APMV2 (numer D 14030 w bazie danych GenBank). Cały obszar kodujący genu HN wirusa APMV4 otrzymano przy pomocy PCR stosując startery IV06 (5'-GGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3') i IV08 (5'-ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCAGGATCTCAG-3') otrzymane na podstawie sekwencji genu HN APMV4 (numer D 14031 w bazie danych GenBank). Powstałe fragmenty trawiono (bezpośrednio bądź po subklonowaniu w pGEM-T) EcoRI i Xmal, a następnie wklonowywano do pCIneo miedzy miejsca cięcia EcoRI i Xmal. Uzyskane plazmidy oznaczono odpowiednio pCIneoHN2 i pCIneoHN4.

Hybrydy genów HN szczepu NDV LaSota i genów HN APMV2 i APMV4 otrzymano zachodzącymi na siebie reakcjami PCR jak następuje. Część N-końcową (aminokwasy 1-141) genu HN szcze20

PL 197 722 B1 pu NDV LaSota amplifikowano polimerazą DNA Pwo stosując startery IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3'; nukleotydy 6325-6354) i IV10 (5'-AATGAGTTCTTTGCCTATCCCCCC-3'; nukleotydy 6811-6834). Część C-końcową genu HN APMV2 (aminokwasy 142-580) amplifikowano polimerazą DNA Pwo stosując startery IV11B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTCAAGGAGATGCATCTGCAGGC-3') i IV05.

Powstałe fragmenty połączono przez PCR „na zakładkę (zachodzące na siebie fragmenty zaznaczono kursywą) przy użyciu starterów IV01B i IV05 i mieszaniny enzymów Expand High Fidelity. Powstałe w wyniku PCR fragmenty trawiono (bezpośrednio bądź po subklonowaniu w pGEM-T) EcoRI i Xmal, a następnie wklonowywano do pCIneo miedzy miejsca cięcia EcoRI i Xmal. Uzyskany plazmid zawierający hybrydowy gen HN składający się z aminokwasów 1-141 NDV i aminokwasów 142-580 ^APMV2 oznaczono ^pCIneo^HN1/2141.

Część C-końcową genu HN APMV4 (aminokwasy 143-569) amplifikowano przy użyciu starterów IV14B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') oraz IV08. Fragment ten połączono z N-końcową częścią genu HN NDV (patrz powyżej) w PCR na zakładkę przy zastosowaniu starterów IV01B i IV08. Powstałe w wyniku PCR fragmenty trawiono (bezpośrednio bądź po subklonowaniu w pGEM-T) EcoRI i Xmal, a następnie wklonowywano do pCIneo pomiędzy miejsca cięcia EcoRI i Xmal. Uzyskany plazmid zawierający hybrydowy gen HN składający się z aminokwasów 1-141 NDV i aminokwasów 143-569 APMV4 oznaczono pCIneoHN1/4 .

Analogicznie do opisanych powyżej konstruktów, wytworzono geny hybrydowe HN składające się z aminokwasów 1-143 NDV i 144-580 APMV2 lub 1-143 NDV i 145-569 APMV4. Te konstrukty otrzymano przy użyciu następujących par starterów; NDV aminokwasy 1-143, startery IV01B i IV13 (5'-ATCTACAATGAGTTCTTTGCCTATC-3') NT 66816-6840); APMV4 aminokwasy 144-580, starter IV14b (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') i IV05; APMV4 aminokwasy 145-569, starter IV15b (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATCAAACAGCTGACTAGAGAGCAG-3') i IV08. Powstałe w wyniku PCR fragmenty trawiono (bezpośrednio bądź po subklonowaniu w pGEM-T) EcoRI i Xmal, a następnie wklonowywano do pCIneo

143 miedzy miejsca cięcia EcoRI i Xmal. Uzyskane plazmidy nazwano odpowiednio pCIneoHN1/2 i ^pCIneoHN1/4¹⁴³. W ce^lu ziarna e^ks^presj^{i bi}ate^{k HN} tomórld C^{ER l}u^b Q^M5 mfekowano ^PPV-T7 przez godzinę przy m.o.i. 1, transfekowano plazmidami pCIneoHN, pCIneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHN1/2¹⁴¹, pCIneoHN1/2143, pCIneoHN1/4141 i pCIneoHN1/4143; 24 godziny po transfekcji jednowarstwowe hodowle pokrywano 1% zawiesiną erytrocytów kurczęcia w PBS i pozostawiano na 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, hodowle przemywano trzykrotnie PBS i badano mikroskopowo adhezję erytrocytów do transfekowanych komórek. Aby sprawdzić indukcję fuzji komórek po koeks^presj^{i bi}a^łka ^{HN i} F tomórld C^{ER i} Q^M5 ko^ansfekowano ^pCIneo^{Fwt i pCI}neo^{HN bądź pCI}neo^HN2, pCIneoHN4, pCIneoHN1/2¹⁴¹, pCIneoHN1/2^M3, pCIneoHN1/4141 lub pCIneoHN1/4^w Po inkubacji przez 2 do 3 dni jednowarstwowe hodowle przemywano PBS, barwiono barwnikiem Giemzy (rozcieńczonym 1:30 w wodzie) i badano mikroskopowo.

Klonowanie genów hybrydowych HN z pełnej długości genomowego cDNA NDV

Pomiędzy miejscami cięcia Not1 i Spel w wektorze pGEM-T (Promega) umieszczono za pomocą oligonukleotydów HN12a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGACTTA-3') i HN12b (5'-CTAGTAAGTCGTAACTCTAGAATATGC-3') syntetyczny linker nazwany HN12. Syntetyczny linker nazwany HN14 umieszczono pomiędzy miejscami cięcia Not1 i Spel w wektorze pGEM-T za pomocą oligonukleotydów HN14a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3') oraz HN14b (5'-CTAGTCGTTAACTCTAGAA-TATGC-3'). Otrzymane plazmidy nazwano odpowiednio pGEM-HN12 i pGEM-HN14. Plazmidów tych, po trawieniu Not1 i Xbal, użyto do klonowania fragmentu Notl-Spel (nukleotydy 33907488) z ^plazmidu ^p535-S [F^wc] Cm. ^Powstate ^plazm^idy nazwano o^owtedrno ^pGEM-^HN1/2NS i pGEM-HN1/4NS. Geny HN w tych plazmidach zastąpiono hybrydowymi genami z plazmidów odpowiednio pCIneoHN1/2143 i pCIneoHN1/4^w (patrz rozdział klonowanie i ekspresja genów HN i genów h^ybr^ydow^ych HN). W t^ym celu ^pCIneoHN1/2^{143 i pCI}neo^HN1/4143 frawtono ^Nhe^{l i S}ma^{l i p}owsta^łe ^fra^gmen^ty (zawteraj^ące ^hybry^dowe ^gen^{y HN1/2143 i HN1/4143}) zostaty wWonowane ^pom^iędz^y mtejsca Nhel i Hpal plazmidów pGEM-HN1/2NS i pGEM-HN1/4NS, dając odpowiednio plazmidy pGEM +NH12 i pGEM +NH14. Ostatniego plazmidu użyto do wprowadzenia hybrydowych genów HN do pełnej długości klonu genomowego cDNA NDV. W tym celu plazmidy pGEM +NH12 i pGEM +NH14 trawiono Notl i Spel i odcinek zawierający gen HN12 bądź HN14 został użyty do zastąpienia odpowiedniego ^fra^gmen^tu pND^FL+, ^daj^ąc odpowiednio ^pNDFL+ ^HN1/2¹⁴³Cm ^{i pNDFL}+^HN1/4143 Cm. ^Gen Cm usun^ięto z plazmidów przez trawienie Xbal, a następnie recyrkularyzację przy użyciu ligazy DNA T4. Aby

PL 197 722 B1 spełnić zasadę sześciu linker włączono korzystając z unikatowego miejsca Spel tych plazmidów przy użyciu komplementarnych do samych siebie oligonukleotydów. Linker H2 (5'-CTAGCGAGCGCTCG-3') umieszczono w ^plazmidzie ^pNDFL+ HN1/2¹⁴³ Cm, a Hnter ^H3 (⁵'-^CTAGCGAGW^GCTCG-³¹) w prtazmktóe pNDFL+HN1/4¹⁴³ Cm, tworząc odpowiednio plazmidy pNDFL+ HN1/21⁴³(H2) i pNDFL+HN1/4^M3 (H3).

Usuniecie specyficznego epitopu w białku HN LaSota NDV

Specyficzny epitop tj. aminokwasy 346-354 (PDEQDYQIR) białka HN LaSota NDV, rozpoznawany przez przeciwciało monoklonalne 4D6 (Long et al., 1986; Meulemans et al.. 1986) usunięto przez zastąpienie tej sekwencji przez odpowiednią sekwencję białek HN bądź APMV-2 (NRTDIQQTI), bądź APMV-4 (PDPLQDQIL). W tym celu, plazmidu pCIneoHN (patrz rozdział: Klonowanie i ekspresja poszczególnych genów NDV) użyto jako matrycy do stworzenia zachodzących na siebie produktów PCR. Dla APMV-2 pierwszy fragment wytworzono przy pomocy starterów IV01 (5'-GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') oraz 3HN2 (5'-GATAGTTTGCTGTATATCAGTCCCGATTGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATATCAC-3'). Drugą reakcję PCR przeprowadzono przy pomocy starterów 5HN2 (5'-AATCGGACTGATATACAGCAAACTATCATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') oraz NDV3-HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3').

Powstałe fragmenty połączono i użyto jako matrycy do trzeciego PCR przy pomocy starterów IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') i NDV3-HN. Dla sekwencji APMY-4 pierwszy fragment PCR wytworzono ze starterami IV01 i 3HN4 (5'-TAAGATCTGATCTTGCAGCGGGTCAGGGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3'). Drugi PCR przeprowadzono ze starterami 5HN4 i NDV3-HN. Powstałe fragmenty połączono i użyto ich jako matrycy do trzeciego PCR ze starterami IV01B i NDV3-HN. Starter 3HN2/5HN2 oraz 3HN4/5HN4 są częściowo komplementarne i kodują odpowiednio sekwencje APMY-2 (NRTDIQQTI), bądź APMV-4 (PDPLQDQIL). Reakcje PCR przeprowadzano przy pomocy zestawu Expand Long Template (Boehringer Mannheim) i składała się z 30 cykli 10 sek. 94°C, 30 sek. 58°C i 2 min. 68°C, a następnie jednego cyklu 68°C. Produkty PCR strawiono EcoNI i Bsu36l i wklonowano między miejsca EcoNI i Bsu36I plazmidu pCIneoHN. Powstałe plazmidy nazwano odpowiednio pCIneoHN1(HN2e) i pCIneoHN1(HN4e). Badanie przejściowej ekspresji wykazało, że zmienione białka są prawidłowo wyrażane i transportowane na powierzchnię komórki, jak pokazało badanie hemoadsorbcji przy użyciu erytrocytów kurczęcych.

Co więcej, przeciwciało monoklonalne 6D4, skierowany przeciw liniowemu epitopowi HN wirusa NDV i składający się (lub przynajmniej obejmujący, aminokwasy 346-354) nie oddziałuje ze zmienionymi białkami HN.

Plazmidy pCIneoHN1(HN2e) i pCIneoHN1(HN4e) trawiono NarI i Spel i fragmenty zawierające zmienione geny HN wklonowano między miejsca NarI i Spel odpowiednio, pGEM-HN1/2NS i pGEMHN1/4NS. Powstałe plazmidy nazwano odpowiednio pNDFL-HN(HN2e)Cm i pNDFL-HN (HN4e)Cm. Gen Cm usunięto z nich przez cięcie Xbal i ponowną ligację. Utworzone plazmidy nazwano odpowiednio pNDFL-HN(HN2e) i pNDFL-HN(HN4e).

Wyniki

Sekwencja nukleotydowa końców 3' i 5' genomu szczepu NDV LaSota.

Sekwencję prawdopodobnego końca 3' genomu NDV opublikowano (Ishida et al., 1986) dla innego szczepu NDV (D26) niż użyty tutaj (LaSota). Yusoff et al. (1987) opublikował sekwencję genu L i względnie dużego odcinka niekodującego za genem L szczepu NDV Beaudette C. Jednakże, jak to pokazuje niniejsza praca, ta sekwencja nie obejmuje w całości końca 5' genomu wirusa, co uniemożliwia wytworzenie infekcyjnej kopii wirusa. Końce 3' i 5' genomu wirusów RNA posiadających ujemną nić RNA odgrywają kluczową rolę w replikacji i transkrypcji (Lamb i Kolakofsky, 1996). Zatem, aby otrzymać cDNA NDV pełnej długości, którego z wykorzystaniem metod odwrotnej genetyki można użyć do wytworzenia zakaźnych wirusów, (Conzelmann, 1996) jest niezbędne otrzymanie poprawnych końców 3' i 5' genomu wirusowego. Zatem określiliśmy dokładną sekwencję nukleotydową genomu RNA szczepu LaSota przy pomocy metody 3' i 5' RACE (rapid amplification of cDNA ends, szybka amplifikacja końców cDNA). Koniec 5' otrzymano przez PCR po ligacji jednoniciowego startera zakotwiczonego (ALG3) do jednoniciowego cDNA, uzyskanego z odwrotnej transkrypcji końca 5' genomowego RNA. Używając starterów: komplementarnego do startera zakotwiczonego (ALG4) oraz specyficznego wobec NDV, otrzymano produkt PCR zawierający koniec 5'.

Aby sklonowąć koniec 3' NDV, jednoniciowy starter zakotwiczony ALG3 został zligowany do końca 3' wirusowego RNA przy pomocy ligazy RNA T4 i zamplifikowany PCR przy użyciu startera ALG4 i specyficznego wobec NDV (metoda I). Alternatywnie, końce 3' i 5' NDV RNA zligowano ze sobą ligazą RNA T4 i powstałe konkatamerowe RNA wykorzystano jako matrycę do RT-PCR z wyko22

PL 197 722 B1 rzystaniem starterów specyficznych wobec NDV oskrzydlających miejsce ligacji (metoda II). Produkty 3' i 5' Race wklonowano do wektora T pBluescriptll-TSK (Ichikira i Kurosawa, 1993) albo do pGEM4Z, po czym uzyskano i zsekwencjonowano wiele niezależnych klonów. Wyniki przedstawia tabela 2. Aby umożliwić bezpośrednie porównanie końców 3' i 5', sekwencje pokazano jako DNA i koniec 3' nici genomowej jest przedstawiony jako koniec 5' nici antygenomowej. Na poziomie genomowego RNA sekwencja 3' końca jest 3'-UGGUUUGUCUUAG, gdy sekwencja 5' końca jest UUUAGAAACAAACCA-5'. Sekwencja końca 3' jest niemal identyczna z opublikowaną sekwencją 3' szczepu NDV D26 (Ishida et al., 1986). Natomiast sekwencja 5' końca wykazuje, że szczep NDV LaSota zawiera 64 dodatkowe nukleotydy w porównaniu z opublikowaną sekwencją genu L szczepu Beaudette C (Yusoff et al., 1987). Fig. 6.

Replikacja minigenomów NDV przez wirusa pomocniczego

Aby określić czy końce 3' i 5' NDV działają w replikacji i transkrypcji, skonstruowano minigenomy składające się z końca 3' NDV (nukleotydy 1-119), genu reporterowego kodującego wydzielaną fosfatazę alkaliczną (SEAP, secreted alkaline phosphatase) i koniec 5' NDV (nukleotydy 1497315186) (Fig. 2). Takie genomy wklonowano w obu orientacjach do wektora transkrypcyjnego pOLTV5, tworząc plazmidy odpowiednio pOLTV535 i pOLTV553 (szczegóły dotyczące konstrukcji w Materiałach i metodach). Plazmid pOLTV5 (Fig. 1) zawiera promotor dla polimerazy RNA T7, a za nim pojedyncze miejsca restrykcyjne dla Stul i Smal, autokatalityczny rybozym z wirusa zapalenia wątroby delta (HDV) oraz sygnał terminacji transkrypcji z bakteriofaga T7 (Pattnaik et al., 1992). Transkrypcja plazmidu pOLTV535 in vivo lub in vitro przy pomocy polimerazy RNA T7 powoduje powstanie antygenomowego RNA (czyli [+]-RNA), gdy transkrypcja plazmidu pOLTV553 powoduje powstanie genomowego RNA (czyli [-]-RNA). (Fig. 5).

Aby zbadać, czy minigenomy RNA wytworzone przy pomocy plazmidów pOLTV535 i pOLTV553 mogą być replikowane i ulegać ekspresji przy NDV jako wirusie pomocniczym, użyliśmy komórek CER, eksprymujących polimerazę RNA T7 bądź konstytutywnie (komórki CER-C9, patrz Materiały i Metody), bądź po infekcji rekombinowanym wirusem ptasiej ospy FPEFLT7pol (Britton et al., 1995; od tej pory nazywane FPV-T7) wyrażającym polimerazę RNA T7. Komórki CER-C9 oraz komórki CER zainfekowane FPV-T7 transfekowano minigenomowymi plazmidami pOLTV535 lub pOLTV553 i po inkubacji przez 3 godziny w 37°C infekowano je NDV bądź pozostawiano niezainfekowane. Około 24 godziny po infekcji pobierano próbkę pożywki i badano na aktywność SEAP. Wyniki pokazują, że ekspresja SEAP w komórkach zainfekowanych FPV-T7 i transfekowanych pOLTV535 była bardzo wysoka. Nie jest to zaskakujące, ponieważ transkrypcja przez polimerazę RNA T7 powoduje powstanie antygenomowego [+]-RNA, któremu czapeczkę dodają enzymy ptasiej ospy i które ulega wydajnej translacji w komórkach gospodarza. W komórkach transfekowanych pOLTV553 transkrypcja przez polimerazę RNA T7 powoduje powstanie genomowego [-]-RNA, które musi być przekształcone w [+]-RNA przez wirusa pomocniczego, aby mogło dojść do translacji na białko SEAP (Fig.5). W obu przypadkach nie obserwowano wzrostu ekspresji w komórkach zainfekowanych NDV w porównaniu z komórkami nieinfekowanymi NDV. Przeciwnie, ekspresja SEAP w komórkach zainfekowanych NDV była stale niższa około dwukrotnie niż w komórkach nieinfekowanych (wyniki nieprzedstawione). Dla komórek transfekowanych pOLTV535 można to tłumaczyć bardzo wysokim początkowym poziomem ekspresji przez transkrypt powstający dzięki polimerazie RNA T7. Jednakże dla komórek transfekowanych pOLTV553, przy skuteczności ekspresji SEAP zależnej od przekształcenia genomowego [-]-RNA w antygenomowe [+]-RNA lub mRNA przez kompleks wirusowej polimerazy, oczekiwalibyśmy wzrostu ekspresji SEAP po infekcji NDV.

Sądzimy, że z dwóch powodów minigenomy mogą nie być eksprymowane i replikowane przez NDV. Po pierwsze, rozmiar RNA minigenomów nie spełnia tzw. „zasady sześciu (Calain i Roux, 1993; Kolakofsky et al., 1998). Zgodnie z tą zasadą genomy paramiksowirusów są replikowane wydajnie jedynie, gdy ich długość jest wielokrotnością 6 nukleotydów. Po drugie, dwie dodatkowe reszty G obecne na 5' końcu minigenomów RNA mogą przeszkadzać w poprawnej replikacji i/lub transkrypcji przez kompleks wirusowej polimerazy. Aby sprawdzić, czy replikacja genomów zależy od zasady sześciu, wklonowaliśmy serię krótkich, autokomplementarnych oligonukleotydów o długości zwiększającej się o 1 nukleotyd w pojedyncze miejsce ClaI plazmidów pOLTV535 i pOLTV553 (Fig. 2). Powstałe plazmidy (pOLTV535N0 do-N5 i pOLTV553N0 do-N5) różnią się rozmiarem co 1 nukleotyd, zatem jeden z nich powinien dać genom RNA mogący spełnić zasadę sześciu. Plazmidami transfekowano CER-C9 oraz komórki CER zainfekowane FPV-T7 jak opisano powyżej. Wyniki pokazują, że jedynie plazmidy pOLTV535N3 i pOLTV553N3 powodują wzrost aktywności SEAP po infekcji NDV. Długość

PL 197 722 B1 minigenomów RNA wytworzonych przez te plazmidy obliczono na 6n+2. Ponieważ dwie dodatkowe reszty G są obecne na końcu 5' minigenomowych RNA, wynik taki sugeruje, że jedynie wielkość sekwencji RNA znajdującej się między prawdziwymi końcami 3' i 5' minigenomowego RNA ma znaczenie w zasadzie sześciu. Zostało to zweryfikowane przez konstrukcję plazmidów minigenomowych, w których początek transkrypcji polimerazy RNA T7 został zmieniony tak, że pierwszy nukleotyd włączany do RNA był pierwszym nukleotydem 3' lub 5' końca NDV (patrz Materiały i Metody). Transfekcja takimi plazmidami pokazała, że jedynie RNA minigenomowe wytwarzane przez plazmidy pOLTV535N3 i pOLTV553N3 jest replikowane przez wirusa pomocniczego (wyniki nie przedstawione). Te odkrycia wskazują, że replikacja NDV ściśle zależy od zasady sześciu. Co więcej, wskazuje to, że obecność dwóch dodatkowych reszt G na 5' końcu minigenomowych RNA nie przeszkadza prawidłowej replikacji. Podobne wyniki otrzymano dla plazmidów minigenomowych (lub plazmidów DI) dla innych paramyxoviridae (Pattnaik et al., 1992; Harty i Palese, 1995).

Pakowanie minigenomów NDV przez wirusy pomocnicze

Aby określić czy RNA minigenomowe może być pakowane przez wirusa pomocniczego NDV, pożywkę z transfekowanych komórek przeniesiono na świeże hodowle jednowarstwowe i po adsorpcji przez 1 godz., hodowle przemyto trzykrotnie PBS i inkubowano w pełnej pożywce. Po 24 godz. inkubacji mierzono aktywność SEAP pożywki. Wyniki pokazują, że aktywność SEAP była obecną jedynie w komórkach potraktowanych pożywką z komórek transfekowanych pOLTV553N3 (Tab. 4). Wskazuje to, że RNA minigenomowe może być pakowane w otoczki NDV i tak powstałe cząstki mogą zarażać komórki. Dalej, wynik wskazuje, że pakowanie zależy od replikacji i jedynie cząsteczki RNA w kompleksie z wirusowymi białkami NP, P i L są pakowane w cząstki wirusopodobne.

Replikacja minigenomów NDV przez plazmidy wyrażające białka NP, P i L

Aby określić czy minigenomowe RNA mogą być replikowane również przez plazmidy kodujące podstawowe białka NP, P i L, dokonywaliśmy kotransfekcji w komórkach infekowanych FPV-T7. Komórki transfekowano kombinacją plazmidów składająca się z plazmidu minigenomowego i plazmidów odpowiednio pCIneoNP, -P i -L(c). Jako kontrola negatywna plazmid pCIneoL(c), kodujący niezbędne białko L, został zastąpiony wektorem plazmidem pCIneo. Wyniki (tabela 5) pokazują, że rzeczywiście plazmidy kodujące białka NP, P i L są zdolne replikować minigenomowe RNA. Dalej, wyniki pokazują, że podobnie jak przy replikacji minigenomów przez wirusa pomocniczego, replikacja przez białka NP, P i L jest zależna od zasady sześciu.

Sekwencja nukleotydowa całkowitego genomu NDV szczepu Lasota

Subgenomowe odcinki cDNA pokrywające cały genom NDV otrzymano przy pomocy RT-PCR (Fig. 4). Aby ograniczyć do minimum liczbę błędów PCR, zastosowano mieszaninę enzymów z własnością korygującą (Expand Long Template, Boehringer Mannheim) w połączeniu z niewielka liczbą cykli PCR (15 cykli). Starter 3UIT, komplementarny do 3' końca RNA NDV został wykorzystany do odwrotnej transkrypcji, a do PCR użyto starterów specyficznych wobec genu. Aby zidentyfikować możliwe błędy PCR przeprowadzono trzy niezależne reakcje i użyto ich produktów do wytworzenia trzech niezależnych zestawów subgenomowego cDNA. Wahające się długością od około 4 do 7 k cDNA wklonowano do pGEM-T. Sekwencje nukleotydową dwóch zestawów określono przy użyciu starterów uzyskanych na podstawie publicznie dostępnej sekwencji NDV, lub zaprojektowanych na podstawie sekwencji NDV ustalonej podczas realizacji tego projektu sekwencjonowania (Tab. 1). Pozostałe miejsca budzące wątpliwości określono przez sekwencjonowanie trzeciego zestawu klonów cDNA. Genom szczepu LaSota NDV składa się z 15186 nukleotydów (Fig. 3), co czyni go najmniejszym ze wszystkich genomów paramiksowirusów których pełna sekwencja została ustalona do wtedy (Kolakofsky et al., 1998).

Konstrukcja pełnej długości klonu cDNA NDV na plazmidzie transkrypcyjnym pOLTV5

Aby skonstruować pełnej długości klon cDNA NDV szczepu LaSota, zachodzące na siebie klony cDNA pokrywające cały genom NDV połączono we wspólnych miejscach restrykcyjnych, zgodnie ze strategią przedstawioną na fig. 4. Cale cDNA NDV połączono w minigenomowy plazmid pOLTV535 (patrz powyżej) otrzymany z plazmidu transkrypcyjnego pOLTV5.

Jak można zauważyć na fig. 4B, ostatnim krokiem w łączeniu pełnego cDNA NDV było klonowanie około 8,8 kb odcinka ClaI z pGEM-B na p535-DI zawierający sekwencje NDV oskrzydlające miejsce Clal z obu stron (tj. odpowiednio nukleotydy 1-3521 i 12355-15186). Ten krok okazał się być dość trudny, gdyż wielokrotnie nie udawało nam się otrzymać prawidłowych klonów. Zatem fragment ClaI pGEM-B zaopatrzono w marker gen oporności na chloramfenikol (Cm) z plazmidu pACYC184. Fragment Clal posiadający gen Cm wyizolowano i wklonowano w miejsce Clal p535-DI, a transformanty selekcjonowano na oporność na oba Cm. Ponieważ transformanty słabo rosły, selekcję anty24

PL 197 722 B1 biotykową zmniejszono do 15 pg/ml Cm i 10 pg/ml Km, a temperaturę inkubacji obniżono z 37°C do 32°C. Wreszcie, gen Cm usunięto z plazmidu przez trawienie BsiWI a następnie recyrkularyzację za pomocą ligazy DNA T4 Powstały plazmid składający się z pełnej długości cDNA NDV wklonowanego między miejsca Smal i Stul plazmidu transkrypcyjnego pOLTV5 nazwano pNDFL+.

Wytworzenie infekcyjnego NDV z cDNA o pełnej długości

Aby wytworzyć infekcyjny NDV całkowicie ze sklonowanego cDNA plazmidu pNDFL+ użyto do kotransfekcji z plazmidami pCIneoNP, -P, -L(c), tak jak to opisano powyżej dla plazmidów minigenomowych. Transfekcje komórek CER i CEF kontrolowano przez użycie minigenomowego plazmidu pOLTV553N3 i pomiar ekspresji SEAP. Dla kontroli negatywnej pCIneoL(c) zastąpiono pCIneo. Po kotransfekcji komórki inkubowano przez 3 do 6 dni w pożywce zawierającej 5% płynu omoczniowego. Dodatek płynu omoczniowego jest niezbędny, gdyż komórki CER i CEF nie posiadają proteaz wymaganych do cięcia białka F szczepu LaSota. Cięcie białek F jest wymagane do rozprzestrzeniania się z komórki do komórki wirusa i powstawania wirusów infekcyjnych. Po trzech dniach inkubacji wykonaliśmy barwienie immunologiczne utrwalonych hodowli jednowarstwowych przy pomocy monoklonalnego przeciwciała przeciw białku F. Wyniki pokazały, że komórki barwione przeciwciałem były obecne jedynie w hodowlach kotransfekowanych pNDFL(+), pCIneoNP, -P, -L(c). Wskazuje to, że w tych komórkach dochodziło do replikacji i ekspresji genomu. Nie obserwowano barwienia dla komórek, w których pCIneoL(c) zastąpiono w transfekcji pCIneo.

Aby odzyskać zakaźne wirusy, nadsącz z transfekowanych hodowli CEF wstrzykiwano do jamy omoczni zarodkujących jaj. Po czterech dniach zbierano płyn owodniowy, badano w teście hemaglutynacji i przepasażowane do jaj. Wyniki pokazują, że jedynie nadsącz z komórek transfekowanych połączeniem pNDFL(+), pCIneoNP, -P, -L(c) dał pozytywną reakcję w teście hemaglutynacji. Płyn owodniowy o dodatnim wyniku testu hemaglutynacji badano następnie w teście inhibicji hemaglutynacji przy pomocy monoklonalnych przeciwciał 7B7, 8C11,5A1, 7D4 oraz 4D6 (Long et al., 1986), który można zastosować do odróżniania szczepów NDV. Wyniki testu wskazują, że szczep NDV odzyskany z inokulowanych jaj wykazywał tę sama reaktywność co wyjściowy szczep LaSota. Wirus odzyskany z inokulowanych jaj został dla odróżnienia od wyjściowego szczepu LaSota nazwany NDFL.

Wytworzenie genetycznie zmienionych NDV z cDNA o pełnej długości

Aby wykazać jednoznacznie, że układ kotransfekcji można wykorzystać do odzyskiwania infekcyjnego wirusa z klonowanych pełnej długości cDNA NDV, do plazmidu pNDFL(+) wprowadzono znacznik genetyczny. W tym celu sekwencje aminokwasową miejsca cięcia dla proteazy w białku Fo zmieniono z charakterystycznej dla szczepu LaSota (GRRQGR | L) na konsensusową sekwencje wirulentnych szczepów NDV (GRRQROR | F) przez PCR-mutagenezę (szczegóły - patrz Materiały i Metody). Powstały plazmid, pNDFL+^w], został użyty do wytworzenia wirusa przy pomocy wyżej opisanego systemu kotransfekcji. Infekcyjny wirus, nazwany NDFLjF'⁷'] został odzyskany z płynu omoczniowego zarodkujących jaj do których został zaszczepiony przy pomocy kotransfekowanych komórek CEF. W teście HI wszystkie przeciwciała monoklonalne, włączając 7D4, specyficzne dla szczepu LaSota, wykazywały tę samą reaktywność dla nowo wytworzonego wirusa, co wyjściowego szczepu LaSota. Sekwencja nukleotydowa odcinka kodującego miejsce cięcia dla proteazy białka F została określona przez RT-PCR. Wyniki pokazują, że sekwencja nukleotydowa zawiera dokładnie te same zmiany nukleotydowe, co wprowadzone mutagenizującym starterem zastosowanym do wprowadzenia zmiany w wyjściowej sekwencji LaSota. Pokazuje to, że wirus został otrzymany z plazmidu pNDFL+[F''j oraz, że NDV (genetycznie zmieniony) może zostać uzyskany całkowicie ze sklonowanego pełnej długości cDNA NDV.

Miejsce cięcia dla proteazy w białku Fo NDV jest kluczowym determinantem wirulencji

Jest ogólnie uznane, że sekwencja aminokwasowa miejsca cięcia dla proteazy w białku Fo jest kluczowym determinantem wirulencji różnych szczepów NDV. Utworzenie genetycznie zmodyfikowanego szczepu LaSota, w którym sekwencja aminokwasowa miejsca cięcia dla proteazy została zmieniona z typowej dla lentogenicznego (niewirulentnego) na typową dla wielogenicznego (wirulentnego) szczepu NDV daje jedyną możliwość sprawdzenia tego przypuszczenia. Określiliśmy zatem wskaźnik wewnątrzmózgowej patogeniczności (ICPI) nowo wytworzonego wirusa NDFL[F''''] i porównaliśmy go ze wskaźnikiem dla NDFL i wyjściowego szczepu LaSota (klon E13-1). ICPI szczepu NDFL[F''''] wyniosło 1,3, co jest daleko powyżej wartości dla szczepów NDFL (ICPI=0,0) czy klonu E13-1 (ICPI=0,3). Te wyniki wskazują, że jak spodziewano się, wirulencja NDV jest w dużej mierze określana przez sekwencję aminokwasową miejsca cięcia dla proteazy w białku Fo.

PL 197 722 B1

Wprowadzenie markera serologicznego

Glikoproteiny otoczki NDV, F i HN, są najbardziej immunogennymi białkami wirusa. Po infekcji zarówno F jak i HN, wywołują silną odpowiedź neutralizującą przeciwciała. Wywołanie takiej odpowiedzi neutralizującej przeciwciała jest podstawą skuteczności szczepienia niewirulentnymi szczepami NDV (jak popularnie używany szczep LaSota).

Jednakże, odpowiedź humoralna na szczepy NDV używane do szczepionek jest nie do odróżnienia od odpowiedzi humoralnęj na wirulentne szczepy NDV ze środowiska. Zatem infekcje wirulentnym wirusem z otoczenia nie mogą być śledzone metodami serologicznymi. Taka sytuacja jest niekorzystna, gdyż infekcje wirusem z otoczenia są maskowane przez szczepionkę i objawy kliniczne powodowane przez wirusa z otoczenia mogą być przeoczone lub nawet przypisane szczepionce. Ponieważ skuteczne odróżnianie szczepienia od infekcji jest kluczowe dla likwidacji NDV, postanowiliśmy utworzyć genetycznie modyfikowane szczepy NDV, mogące służyć jako szczepionka i możliwe do serologicznego odróżnienia od szczepów NDV z otoczenia (tak zwane szczepionki markerowe). Aby powstała szczepionka markerowa, wirus musi zostać genetycznie zmieniony tak, by jeden lub kilka immunodominujących epitopów jednego z (głównych) antygenów zostały usunięte bądź zmienione. Usunięcie ważnej części (jednej lub wielu) białka może doprowadzić do utraty biologicznej funkcji tego białka. Zatem postanowiliśmy zmienić jedno z głównych immunogennych białek otoczki NDV w taki sposób, by została utrzymana biologiczna funkcja białka, przy zmienionym wobec wyjściowego repertuarze przeciwciał odpowiadających na zmienione białko. Z powodów wyszczególnionych poniżej, wybraliśmy jako jedno z wykonań wynalazku modyfikację białka HN NDV. Infekcja NDV rozpoczyna się fuzją otoczki wirionu z błoną plazmatyczną komórki gospodarza. Do tego procesu wymagane są białka F i HN. Wykazano, że białka F i HN oddziałują fizycznie ze sobą i że to oddziaływanie jest wymagane do fuzji z błoną (Deng et al., 1995). Dalej, wykazano, że oddziaływanie jest specyficzne względem typu, to jest białka F i HN musza pochodzić z tego samego wirusa aby wykazywać aktywność fuzyjną. Oddziałujące domeny białka HN NDV zostały zlokalizowane w tak zwanym obszarze rdzeniowym białka, zawierającym pierwsze 92 aminokwasy zewnętrznej domeny białka HN (Deng et al., 1995).

Dla hybrydowych białek składających się z aminokwasów 1-141 NDV i aminokwasów 141-572 3 typu wirusa ludzkiej grypy rzekomej (hPIV3) wykazano zachowywanie aktywności fuzyjnej przy koekspresji z białkiem F NDV. Sugeruje to, że genetycznie zmienione szczepy NDV posiadające hybrydowe białko HN, składające się z rdzeniowego obszaru NDV i globularnej główki białka HN różnych ptasich paramiksowirusów mogą być żywotne. Dalej, takie szczepy wywołają powstanie przeciwciał anty-HN, odmienna od odpowiedzi na NDV. Ponieważ neutralizująca odpowiedź humoralna przeciw białku F wystarcza do skutecznej ochrony przed prowokowaną infekcją wirusową, takie zmienione genetycznie szczepy NDV spełniają dwa podstawowe wymagania szczepionki markerowej, to jest ochrona przed chorobą i rozróżnianie serologiczne.

Skonstruowano hybrydowe geny HN, składające się z fuzji bądź aminokwasów 1-141 NDV ^{i 142}-⁵80 ^ptasⁱe^go piaram^sowkusa ^typu ² (A^PMV2) (oznaczone HN1/2¹⁴¹), ^lu^b aminokwasów Ί-¹⁴³ NDV i 144-580 APMV2 oznaczone HN1/2¹⁴³). Podobnie skonstruowano geny hybrydowe HN, składające się z fuzji bądź aminokwasów 1-141 NDV i 142-569 ptasiego paramiksowirusa typu 4 (APMV4) (oznaczone HN1/4¹⁴¹)^{, l}u^b aminokwasów Ί-^{143 NDV i 144}-⁵⁸⁰ A^PMV4 oznaczone ^HN1/4143). ^Hybr^ydowe geny wklonowano na eukariotyczne wektory ekspresyjne pCIneo i użyto do kotransfekcji z plazmidem kodującym białko F NDV. W tym celu białko F zmieniono w taki sposób, że sekwencja aminokwasowa miejsca cięcia dla proteazy między białkami F1 i F2 została zmieniona z charakterystycznej dla szczepu LaSota na konsensusową dla wirulentnych szczepów NDV (F^wl, patrz Materiały i metody). Doświadczenia z kotransfekcją w komórkach CER i QM5 wskazały, że zarówno HN1/2”1 jak HN1/2^143, ja^k rówmeż ^{HN1/4141 i HN1/4143,} bukowato ^fuzj^{ę p}o^dczas ^koe^ks^presjⁱ z ^Fwt. ^Ten w^yn^ik wskazuje, że kompleksy hybrydowych białek HN i białka F mają aktywność biologiczną. Hybrydowych białek HN1/2¹⁴³ i HN1/4¹⁴¹ użyto do zastąpienia oryginalnego genu HN w pełnej długości klonie cDNA ^pNDFL+^, co dało ^pNDFL-HN1/2^{143 i pNDFL}-^HN1/4143. ^Ostatmch ^dw^óc^{h pl}azm^idów u^żywano nas^tępme do wytworzenia infekcyjnych wirusów przez użycie systemu kotransfekcji opisanego powyżej. Żywotne wⁱrus^y re^kom^binowane (oznaczone ^NDFL- ^HN1/2141 oraz ^NDFL-^HN1/4143) mo^żna w^yizotowa^ć z ^płynu omoczni zarodkujących jaj zainokulowanych wcześniej nadsączem z transfekowanych hodowli.

Obecność genu hybrydowego HN w obu rekombinantach została sprawdzona za pomocą RTPCR. Test inhibicji hemaglutynacji pokazał, że przeciwciała monoklonalne i poliwalentne surowice odpornościowe przeciw NDV nie były w stanie hamować hemaglutynacji erytrocytów kurczęcych ^przez wirus^y NDFL-HN1/2^{143 i NDFL}- ^HN1/4143. ^Wyn^iki te wstezują ^że szcze^{py NDFL}-^HN1/2143

PL 197 722 B1 i NDFL- HN1/4¹⁴³ mogą zostać użyte jako szczepionki i by serologicznie rozróżniane od klasycznych szczepionek NDV.

Ekspresja białka heterologicznego ze zrekombinowanego NDV

Aby zbadać czy można wstawić obce geny do genomu NDV, skonstruowaliśmy rekombinowanego wirusa niosącego gen reporterowy SEAP. Gen SEAP został otrzymany z plazmidu pOLTV535 i został zmieniony tak, aby zawierać typowe transkrypcyjne miejsca start i stop dla NDV. Fragment DNA zawierający gen SEAP oraz położone za nim transkrypcyjne miejsca start i stop został wstawiony w miejsce restrykcyjne dla Xmnl (nukleotyd 109) na plazmidzie pNDFL+[Fw]. Infekcyjny wirus, oznaczony jako NDFL-AP, został utworzony przy pomocy systemu kotransfekcji, a obecność genu SEAP sprawdzono przy pomocy RT-PCR. Komórki infekowane szczepem NDFL-AP wyrażały białko SEAP na wysokim poziomie. Korzystając ze specyficznej aktywności białka SEAP, obliczyliśmy że x% białek wyrażanych w komórkach infekowanych NDFL-AP stanowiło białko SEAP. Wyniki te pokazują, że geny heterologiczne mogą być wyrażane na bardzo wysokim poziomie przez rekombinowane NDV.

Utworzenie mutanta delecyjnego NDV w trans-komplementujacej linii komórkowej

Aby zlikwidować ekspresję białka M NDV dużą część genu M usunięto przez trawienie pNDFL+[Fw] BsaAI (nukleotyd 3087), a następnie częściowe trawienie Hindlll. Po wypełnieniu przy pomocy fragmentu Klenowa polimerazy DNA końca powstałego po przecięciu Hindlll, fragment recyrkularyzowano przy pomocy ligazy T4 Dna i użyto do transformacji E.coli. Powstały plazmid, nazwany pNDFL+[Fw]dM, został użyty do utworzenia wirusa przez system kotransfekcji w transkomplementujących komórkach CER-M, wyrażających białko M NDV. Nadsącz z transfekowanych hodowli pasażowano trzykrotnie na komórkach CER-M i badano na obecność wirusa. Wirus otrzymano, czego dowodem były pozytywne wyniki testów hemaglutynacji (HA) i inhibicji hemaglutynacji (IH) dla nadsączu z hodowli trzeciego pasażu. Wirusa nazwano NDFL-dM. Przy infekowaniu hodowli komórek CER NDFL-dM, wirus wciąż był zdolny przenosić się z komórki do komórki, jak wykazał test IPMA z przeciwciałem monoklonalnym przeciw białku F. Jak oczekiwano, nie można było wykazać wyrażania białka M testem IPMA z przeciwciałem monoklonalnym przeciw białku M. Kiedy nadsączu używano do infekowania komórek CEF lub CER-M, nie byliśmy w stanie wykazać obecności replikującego się wirusa w hodowlach za pomocą IPMA. Wskazuje to, że infekcyjny wirus nie może powstać w niekomplementujacych komórkach. Zostało to potwierdzone przez obserwację, że inokulacja zarodkującego jaja nadsączem z zainfekowanych komórek CEF nie powoduje powstania wirusów potomnych wykrywalnych testami HA lub HI. Zapotrzebowanie na lepsze szczepionki NDV, a zwłaszcza szczepionki markerowe skłoniła nas do rozwinięcia systemu odwrotnej genetyki, pozwalającego na wprowadzanie zmian genetycznych do NDV. W tym dokumencie opisujemy wytworzenie infekcyjnych NDV w całości z klonowanego pełnej długości cDNA. Pokazujemy, że wirulencja NDV może zostać dramatycznie zmieniona przez zmianę jedynie 3 nukleotydów determinujących specyficzność miejsca cięcia dla proteazy w białku F. W tym przypadku miejsce cięcia dla proteazy zostało zmienione z charakterystycznego dla szczepu LaSota na konsensusowe dla miejsca cięcia w wirulentnych szczepach NDV. Tworząc ten genetycznie zmieniony szczep NDV dostarczamy formalnego dowodu, że możliwość cięcia białka F jest kluczowa determinantą (ale nie jedyną) wirulencji NDV. Przy pomocy tego samego podejścia odwrotnej genetyki, można zmieniać miejsce cięcia wedle woli w każdej innej sekwencji aminokwasowej. Może to doprowadzić do wytworzenia serii szczepów NDV wykazujących całe spektrum poziomów wirulencji, in vivo.

Jak już wspomniano powyżej, wykazano, że poza cięciem białek HN i F, również inne czynniki wirusowe mogą wpływać na jego patogenność. Zmiany w transkrypcji i translacji mogą modulować powstawanie i rozprzestrzenianie się miedzy komórkami wirusa i/lub cytotoksyczność. Dostępność infekcyjnego cDNA NDV pozwala na systematyczne wprowadzanie zmian sekwencji zaangażowanych w transkrypcję i replikację. Może to doprowadzić do zaprojektowania nowych szczepionek NDV, łączących optymalną immunogenność z niemal brakiem wirulencji.

Bezpieczeństwo jest jedną z najważniejszych cech żywych szczepionek. Jednakże, dla wielu żywych szczepionek, włączając NDV, immunogenność jest często w odwrotnej proporcji do wirulencji. Zatem, dalsza atenuacja żywych szczepionek bez utraty immunogenności jest jedną z najbardziej pożądanych zmian do których można użyć modyfikacji genetycznej.

Mając to na uwadze, warto wspomnieć że wykazano, że eliminacja ekspresji białka V wirusa Sendai powodowała znacznie obniżoną patogenność in vivo u myszy (Kato et al., 1997). Podobnie jak wirus Sendai, NDV również wytwarza białko V w mechanizmie zwanym redagowaniem RNA (Steward

PL 197 722 B1 et al., 1993). Można przewidywać, że usunięcie ekspresji białka V NDV może również spowodować atenuację fenotypu in vivo.

Oprócz zmiany wirulencji NDV, okazaliśmy, że można zmienić obraz antygenowy NDV w sposób pozwalający na tworzenie szczepów serologicznie odróżnialnych od szczepów NDV z otocznią. Te tak zwane szczepionki markerowe są nieocenionym narzędziem do ustalenia liczby przypadków NDV w stadach na całym świecie. Co więcej, zastosowanie na szeroką skalę takich szczepionek markerowych może w końcu doprowadzić do całkowitego usunięcia NDV w procesie intensywnych badań przesiewowych i pozbywanie się zainfekowanych stad. W tym opisie pokazujemy, że do genomu NDV można wprowadzić obce geny. Te obce geny mogą być wyrażane na bardzo wysokim poziomie w zainfekowanych komórkach. Pokazuje to, że NDV może mieć zastosowanie jako wektor szczepionkowy do ekspresji antygenów innych (drobiowych) patogenów. Kilka właściwości czyni NDV idealnym wektorem dla szczepionki do szczepień przeciw chorobom układu oddechowego czy jelit. 1) NDV można łatwo hodować do wysokiego miana w jajach zarodkowych. 2) masowa hodowla NDV w jajach zarodkowych jest względnie tania. 3) szczepionki NDV są względnie stabilne i mogą być łatwo podawane przez metody masowego podawania takie jak dodatek do wody pitnej lub rozpylanie w postaci aerozolu. 4) naturalną drogą infekcji NDV jest układ pokarmowy lub oddechowy, podobnie jak dla wielu innych patogenów drobiu. 5) NDV może powodować miejscową immunizację pomimo obecności krążących przeciwciał matczynych.

Wreszcie, okazujemy ze można tworzyć żywotne mutanty delecyjne NDV przez użycie transkomplementujących linii komórkowych. Utworzono mutanta delecyjnego NDV niezdolnego do wyrażania białka macierzy (M), biorącego udział w pączkowaniu NDV z wnętrza błony komórkowej. Pokazujemy, że fenotypowo komplementujący szczep NDV nie będący w stanie wyrażać białka M wciąż może infekować komórki i rozprzestrzeniać się z komórki do komórki. Jednakże zmutowany wirus nie jest zdolny do tworzenia infekcyjnych wirusów potomnych w niekomplementujących komórkach. Wskazuje to, że fenotypowo komplementujące mutanty delecyjne NDV mogą zostać użyte jako bezpieczne samoograniczające się szczepionki, nie mogące rozpowszechniać się w środowisku. Taka nie podlegająca transmisji szczepionka łączy najważniejszą zaletę żywych szczepionek, to jest skuteczność, z najważniejszą zaletą martwych szczepionek, to jest bezpieczeństwem.

Krótki opis rysunków

Figura 1

Wektor transkrypcyjny pOLTV5 jest pochodną wektora transkrypcyjnego opisanego przez Pattnaik et al. (1992). Szczegóły konstrukcji w tekście. Plazmid zawiera promotor zależnej od DNA polimerazy RNA T7 (zaznaczony wytłuszczonym drukiem) i położone za nim unikatowe miejsca restrykcyjne dla Stul i Smal oraz autokatalityczny rybozym z wirusa zapalenia wątroby delta (HDV). Fragmenty DNA można wklonować między miejsca Stul i Smal i można je transkrybować in vitro bądź in vivo za pomocą polimerazy T7. Koniec 5' powstających transkryptów zawiera dwie dodatkowe reszty G nie kodowane przez wstawkę. Dzięki aktywności rybozymu, koniec 3' transkryptów odpowiada dokładnie ostatniemu nukleotydowi wstawki.

Figura 2

Budowa plazmidów minigenomowych pOLTV535 (Fig. 2A) i pOLTV553 (Fig. 2B). Plazmidy minigenomowe są oparte na plazmidzie transkrypcyjnym pOLTV5 (cf. Fig. 1) i zawierają obszar 3' (nukleotydy 1-119) lub 5' (nukleotydy 14970-15186) szczepu NDV LaSota, oskrzydlające gen kodujący wydzielaną fosfatazę alkaliczną (SEAP). Transkrypcja pOLTV535 przez polimerazę RNA T7 powoduje powstanie antygenomowego RNA (lub [+]RNA), gdy transkrypcja pOLTV553 powoduje powstanie genomowego RNA (lub [-]-RNA). Zaznaczono miejsca startu (S) i końca (E) transkrypcji. Podkreślono kodon start genu SEAP. Pokazano również sekwencję wstawek (N0-N5) w miejsce ClaI, dające plazmidy minigenomowe różniące się od siebie o 1 nukleotyd na długość (odpowiednio pOLTV535N0-N5 oraz pOLTV553N0-5).

Figura 3

Sekwencja aminokwasowa genomu NDV szczepu LaSota i stworzona na jej podstawie sekwencja aminokwasowa genów NDV. Pokazana sekwencja odpowiada nici antygenomowej i jest pokazana w kierunku 5'-3' w postaci ssDNA. Na rysunku przedstawiono sekwencje konsensusową określoną po całkowitym zsekwencjonowaniu dwóch niezależnych zestawów częściowo pokrywających się subgenomowych cDNA zajmujących całe cDNA genomu NDV. Pozostające niejednoznaczności (wynikłe prawdopodobnie z błędu PCR) rozstrzygnięto sekwencjonując odpowiednie obszary trzeciego niezależnego zestawu klonów. Sekwencja pełnej długości klonu cDNA pNDFL+ złożonej z częściowo

PL 197 722 B1 na siebie zachodzących subgenomowych klonów cDNA (patrz fig. 4) różni się od konsensusowej sekwencji NDV w następujących pozycjach (sekwencja konsensusowa w nawiasie): nukleotyd (nt) 1755, G (A); nt 3766, A(G); nt 5109, G (A); nt 6999, T (C); nt 7056, G (A); nt 9337, G (A); nt 9486, A (T); nt 10195, T (C); nt 13075, A (G). Te zmiany powodują trzy zmiany aminokwasów (sekwencja konsensu^{sowa w naw}i^asi^e): bi^ałk^o F ^- R¹⁸⁹(Q) białko HN - S²⁰⁰ (P) białko L - N³⁶⁹ (I).

Figura 4 (A) ogólna strategia stosowana do składania pełnej długości genomowego cDNA z subgenomowych częściowo na siebie zachodzących klonów. cDNA zostało złożone na plazmidzie pOLTV535 już posiadającym końce 3' i 5' szczepu NDV LaSota (cf. fig. 2). Powstały plazmid, oznaczony pNDFL+, został użyty do wytworzenia infekcyjnego NDV.

(B) proced ura klonowa nia w składaniu pełnej długości geno moweg o cDNA z su bgenomowych częściowo na siebie zachodzących klonów. Cm oznacza gen oporności na chloramfenikol czasowo wprowadzony jako marker fenotypowy (szczegóły w tekście opisu).

(C) szczegółowa procedura klonowania zastosowana w tworzeniu genetycznie zmienionego pełnej długości cDNA NDV. Zmiana polega na trzech zmianach nukleotydowych wprowadzonych do genu F, które powodują zmianę sekwencji aminokwasowej miejsca proteolizy białka F (szczegóły w tekście opisu).

Figura 5 (A) seria plazmidów pOLTV535

Transkrypcja przez polimerazę RNA T7 powoduje powstanie antygenomowego RNA (czyli [+]RNA), które może w komórce ulegać bezpośredniej translacji na białko SEAP. Po transfekcji komórek wirusem pomocniczym (lub kotransfekcji plazmidami kodującymi NP, P, L), antygenomowe RNA jest wykorzystywane przez kompleks wirusowej polimerazy do syntezy genomowego RNA (czyli [-]-RNA). Genomowe RNA jest następnie wykorzystywane przez kompleks wirusowej polimerazy do syntezy zarówno mRNA (przy użyciu specyficznych miejsc startu [S] i końca [E] transkrypcji), jak i antygenomowego RNA.

(B) seria plazmidów pOLTV553

Transkrypcja przez polimerazę RNA T7 powoduje powstanie genomowego RNA (czyli [-]-RNA), które nie może ulegać translacji na białko SEAP. Po transfekcji komórek wirusem pomocniczym (lub kotransfekcji plazmidami kodującymi NP, P, L), genomowe RNA jest wykorzystywane przez kompleks wirusowej polimerazy do syntezy zarówno mRNA (przy użyciu specyficznych miejsc startu [S] i końca [E] transkrypcji), jak i antygenomowego RNA.

Figura 6.

Przyrównanie sekwencji kwasów nukleinowych 5' końca szczepu NDV LaSota i innych paramiksowirusów jako porównanie sekwencji NDV z czterema przedstawicielami rodzaju Rubulavirus, trzema przedstawicielami rodzaju Paramyxovirus, oraz trzema przedstawicielami rodzaju Morbillivirus. Sekwencje przedstawiono od końca genu L do 5' końca (3'-5' CDNA).

NDV, wirus choroby Newcastle; hPIV2, wirus ludzkiej grypy rzekomej typu 2, MuV, wirus świnki; SV5 i SV41, odpowiednio małpi wirus 5 i 41; SeV, wirus Sendai; bPIV3 i hPIV3 odpowiednio krowi i ludzki wirus grypy rzekomej; CDV, wirus psiej nosówki; MeV, wirus odry; RPV, wirus księgosuszu. Sekwencje nukleotydowe pełnych genomów zostały otrzymane następująco (numer dostępu): NDV(AF077761); hPIV2(x57559); MuV(AB000388); SV5 (AF052755); SV41(X64275);

bPIV3(D84095); hPIV3(Z11575), CDV(L13194); MeV(X16565); RPV(Z30697).

PL 197 722 B1

Literatura

Alexander, D.J. (1993) Paramyxovirus infections. In virus infections of birds. McFerran, J.B. and McNulty, M.S. (eds), pp 321-340, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam.

Antin, P.B. and Ordahl, C.P. (1991) Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Dev. Biol. 143: 111-121.

Baron, M.D. and Barrett, T. (1997) Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J. Virol, 71: 1265-1271.

Beach, J.R. (1944) The neutralization in vitro of avian pneumoencephalitis virus by Newcastle disease immune serum. Science 100: 361-362.

Beard, C.W. and Hanson, R.P. (1984) Newcastle disease. In M.S. Hofstad et al. (eds) Disease of Poultry, 8th Ed., pp. 452-470. Iowa State University Press, Ames. Beaudette, F.R., Bivins, J.A. and Miller, B.R. (1949) Newcastle disease immunization with live virus. Cornell Vet. 39: 302-334.

Boursnell, M.E.G., Green, P.F., Samson, A.C.R., Campbell, J.I.A., Deuter, A., Peters, R.W., Millar, N.S., Emmerson, P.T. and Binns, M.M. (1990) A recombinant fowlpox virus expressing the hemagglutinin-neuraminidase gene of Newcastle disease virus (NDV) protects chickens against challenge by NDV. Virology 178: 297-300.

Britton, P., Green, P., Kottier, S., Mawditt, K.L.. Penzes, Z., Cavanagh, D. and Skinner, M. (1996) Expression of bacteriophage T7 RNA polymerase in avian and mammalian cells by a recombinant fowlpox virus. J. Gen. Virol. 77: 963-967.

Calain, P. and Roux, L. (1993) The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67: 4822-4830.

Chambers, P., Millar, N.S., Bingham, R.W. and Emmerson, P.T. (1986) Molecular cloning of complementary DNA to Newcastle disease virus and nucleotide sequence analysis of the junction between the genes encoding the haemagglutinin-neuraminidase and the large protein. J. Gen. Virol. 67: 475-486

Chang, A.C.Y. and Cohen, S.N. (1978) Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol. 134: 1141-1156.

Cho, B.R. (1982) Cytopathic effects and focus formation by reticuloendotheliosis viruses in a quail fibroblast cell line. Avian Diseases 27: 261

Collins, P.L., Hil, M.G., Camargo, E., Grosfeld, H., Chanock, R.M. and Murphy, B.R. (1995) Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for transcription elongation factor from the 5' proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567.

Conzelmann, K.-K. (1996) Genetic manipulation of non-segmented negative-strand RNA viruses. J. Gen. Virol. 77: 381-389.

Cowen, B.S. and Braune, M.O. (1988) The propagation of avian viruses in a continuous cell line (QT35) of Japanese quail origin. Avian Diseases 32: 282-297.

Deng, R., Wang, Z., Mirza, A.M. and lorio, R.M. (1995) Localization of a domain on the paramyxovirus attachment protein reguired for the promotion of cellular fusion by its homologous fusion protein spike. Virology 209: 457-496.

Doyle, T.M. (1927) A hitherto unrecorded disease of fowls due to a filter-passing virus. J. Comp. Pathol. Ther. 40: 144-169.

Garcin, D., Pelet, T., Calain, P., Roux, L., Curran, J. and Kolakofsky, D. (1995) A highly recombinogenic system for the recovery of infectious Sendai paramyxovirus from cDNA: generation of a novel copy-back non-defective interfering virus. EMBO J. 14: 6087-6094.

Garten, W., Berk, W., nagai. Y., Rott, R. and Klenk, H.D. (1980) Mutational changes of the protease suceptibility of glycoprotein F of Newcastle disease virus: Effects on pathogenicity. J. Gen. Virol. 50: 135-147.

Goldhaft, T.M. (1980) Historical note on the origin of the LaSota strain of Newcastle disease virus. Avian Dis. 24: 297-301.

Gough, R.E. and Alexander. D.J. (1973) The speed of resistance to challenge induced in chickens vaccinated by different routes with a B1 strain of live NDV. Vet. Rec. 92: 563-564.

Hanson, R,P. (1988) Heterogeneity within strains of Newcastle disease virus: key to survival. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Diseass, pp. 113-130. Kluwer Academic Publ., Boston.

Harty, R.N. and Palese, P. (1995) Mutations within noncoding terminal sequences of model RNA's of Sendai virus: Influence on reporter gene expression. J. Virol. 69: 5128-5131.

PL 197 722 B1

Heckert, R.A., Riva, J., Cook, S., McMillen, J. and Schwartz, R.D. (1996) Onset of protective immunity in chicks after vaccination with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing Newcastle disease virus fusion and hemagglutinatinin-neuraminidase antigens. Avan Dis, 40: 770-777.

Heuschele, W.P. and Easterday, B.C. (1970) Local immunity and persistence of virus in the tracheas of chickens following infection with Newcastle disease virus. II. Immunofluorescent and histopathological studies. J. Inf. Dis. 121: 497-504.

Hitchner, S.B. and Johnson, E.P. (1948) A virus of Iow virulence for immunizing fowls against Newcastle disease (avian pneumoencephalitis). Vet. Med. 43: 525-530.

Hoffman, M.A. and Banerjee, A.K. (1997) An infectious clone of human parainfluenza virus type

3. J.WoL 71:44222-427.

Hofstad, M.S. (1953) Immunization of chickens against newcastle disease by formalininactivated vaccine. Am. J. Vet. Res. 14: 586-589,

Ichihara, Y., and Kurosawa, Y. (1993) Construction of new T vectors for direct cloning of PCR products. Gene 130: 153-154.

Ishida, N., Taira, H., Omata, T., Mizumoto, K., Hattori, S., Iwasaki, K. and Kawakita, M. (1986) Sequence of 2617 nucleotides from the 3' end of Newcastle disease virus genome RNA and the predicted amino acid sequence of the viral NP protein. Nucl. Acids Res. 14: 6551-6564.

Kaleta, E.F. and Baldauf, C. (1988) Newcastle Disease in free-living and pet birds. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 197-246. Kluwer Academic Publ., Boston.

Kant, A., Koch, G., van Roozelaar, D.J., balk, F, and ter Huurne, A. (1997) Differentiation of virulent and non-virulent strains of Newcastle disease virus within 24 hours by polymerase chain reaction. Avian Pathol. 26: 837-849.

Kolakofsky, D., Pelet, T., Garcin, D. Hausmann, S., Curran, J. and Roux, L. (1998) Paramyxovirus RNA synthesis and the requirement for hexamer genome length: the rule of six revisited. J. Virol. 72: 891-899.

Kraneveld, F.C. (1926) A poultry disease in the Dutch East Indies. Ned. Indisch Bl. Diergeneesk. 38: 448-450.

Lamb, R.A. and Lolakofsky. D. (1996) Paramyxoviridae: the viruses and their replication. in.- Fundamental Virology (Fields et al., eds), Chapter 20, p577-604, Lipincott-Raven Publishers, Philadelphia.

Lawson, N.D., Stillman, E.A., Whitt, M.A. and Rose, J.K. (1995) Recombinant vesicular stomatitis virus from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481.

Long, L., Portetelle, D, Ghysdael, J., Gonze, M., Burny, A. and Meulemans, G. (1986) Monoclonal antibodies to haemagglutinin-neuraminidase and fusion glycoproteina of Newcastle disease virus: relationship between glycosylation and reactivity. J. Virol. 57_: 1198-1202.

Madansky, C.H. and Bratt, M.A. (1978) Noncytopathic mutants of Newcastle disease virus.J. Virol. 26: 724-729.

Madansky, C.H. and Bratt, M.A. (1981a) Noncytopathic mutants of Newcastle disease virus are defective in virus-specific RNA synthesis. J. Virol. 37: 317-327.

Madansky, C.H. and Bratt, M.A. (1981b) Relationships among virus spread, cytopathogenicity, and virulence as revealed by the noncytopathic mutants of Newcastle disease virus.J. Virol. 40: 691-702.

Meulemans, G., Gonze, M., Carlier, M.C., Petit, P., Burny, A. and Long, L. (1986) Protective effects of HN and F glycoprotein-specific monoclonal antibodies on experimental Newcastle disease. Avian Pathol. 15: 761-768.

Millar, N.S., Chambers, P. and Emmerson, P.T. (1988) Nucleotide sequence of the fusion and haemagglutinin-neuraminidase gene of Newcastle disease virus, strain Ulster: Molecular basis for variations in pathogenicity between strains. J. Gen. Virol. 69: 613-620.

Morgan, R.W., Gelb Jr., J., Schreurs, C.S., Lutticken, D., Rosenberger, J.K. and Sondermeijer. P. (1992) Protection of chickens from Newcastle and Marek's diseases with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fusion protein. Avian Dis. 36: 858-870.

Morgan, R.W., Gelb Jr., J., Pope, C.R, and Sondermeijer, P. (1993) Efficacy in chickens of a herpesvirus of turkeys recombinant vaccine containing the fusion gene of Newcastle disease virus: onset of protection and effect of. maternal antibodies.

Moscovici, C., Moscovici, M.G., Jimenez, H., Lai, M.M., Haymann, M. J. and Vogt, P.K. (1977) Continuous tissue culture cell lines derived from chemically induced tumors of Japanese quail. Cell 11: 95-103.

Pattnaik, A.K., Ball, L.A., LeGrone, A.W. and Wertz, G.W. (1992) Infectious defective interfering particles of VSV from transcripts of a cDNA clone. Cell 69: 1011-1020.

PL 197 722 B1

Peeples, M.E. (1988) Newcastle disease virus replication. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 45-78. Kluwer Academic Publ., Boston.

Peeters, B., N. de Wind, M. Hooisma, F. Wagenaar, A. Gielkens, and R. Moormann. (1992) Pseudorabies virus envelope glycoproteins gp50 and gIl are essential for virus penetration, but only gIl is involved in membrane fusion. J. Virol. 66: 894-905.

Radecke, F., Spielhofer, P., Schneider, H., Kaelin, K., Huber, M., Dotsch, C., Christiansen, G. and Billeter, M.A. (1995) Rescue of measles virus from cloned DNA. EMBO J. 14: 5773-5784.

Roct, R. and Klenk, H.-D. (1988) Molecular basis of infectivity and pathogenicity of Newcastle disease virus. In D.J. Alexander (ed,), Newcastle Disease, pp. 98-112. Kluwer Academic Publ., Boston.

Russell, P.H., Griffiths, P.C., Goswami, K.K.A., Alexander, D.J., Cannon, M.J. and Russell, W.C. (1983) The characterization of monoclonal antibodies to Newcastle disease virus. J. Gen. Virol. 64: 2069-2072.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY.

Schneider, H., Spielhofer, P., Kaelin, K., Dotsch, C., Radecke, F., Sutter, G. and Billeter, M.A. (1997) Rescue of measles virus using a replication-deficient vaccinia-T7 vector. J. Virol. meth. 64: 57-64.

Schnell. M.J., Mebatsion, T. and Conzelmann, K.-K. (1994) Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13: 4195-4203.

Schutze, H., Enzmann, P.-J., Kuchling, R., Mundt., E., Niemann, H. and Mettenleiter, T.C. (1995) Complete genomic sequence of the fish rhabdovirus infectious haematopoietic necrosis virus. J, Gen. Virol. 76: 2519- 2527.

Smith, A.L., Tignor, G.H., Mifune, K., and Motohashi, T. (1977) Isolation and assay of rabies serogroup viruses in CER cells. Intervirlogy 8: 92-99.

Spradbrow, p.B. (1988) Geographical distribution, In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 247-255. Kluwer Academic Publ., Boston.

Stauber, N., Brechtbuhl, K., Bruckner, L. and Hofmann, M.A. (1995) Detection of Newcastle disease virus in poultry vaccines using the polymerase chain reaction and direct sequencing of amplified DNA. Vaccine 13: 360-364.

Steward, M., Vipond, I.B,, Millar, N.S. and Emmerson, P.T. (1993) RNA editing in Newcastle disease virus. J. Gen. Virol. 74: 2539-2547.

Taylor, J., Edbauer, C., Rey-Senelonge, A., Bouquet, J., Norton, E., Goebel, S., Desmectre, P. and Paoletti, E. (1990) Newcastle disease virus fusion protein expressed in a fowlpox virus recombinant confers protection in chickens. J. Virol. 64: 1441-1450.

Tessier, D.C., Brousseau, R., and Vernet, T. (1986) Ligation of single-stranded oligodeoxyribonucleotides by T4 RNA ligase. Anal. Biochem. 158: 171-178.

Vieira, J., and Messing, J. (1991) New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. Gene 100: 189-194.

Vindevogel, H. and Duchatel, J.P. (1988) Panzootic Newcastle disease virus in pigeons. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 184-196. Kluwer Academic Publ., Boston.

Whelan, S.P.J., Ball, L.A., Barr, J.N. and Wertz, G.T.W. (1995) Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392.

Wensvoort, G., Terpstra, C., Bonstra, J., Bloemraad, M. and Van Zaane, D. (1986) Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet. Microbiol. 12: 101-108.

Yusoff, K., Millar, N.S., Chambers, P., and Emmerson, P.T. (1987) Nucleotide sequence analysis of the L gene of Newcastle disease virus: homologies with Sendai and vesicular stomatitis viruses. Nucl. Acids Res. 15: 3961-3976.

Claims (59)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. cDNA ptasiego paramiksowirusa, zznmieenn tym, że wspomniany cDNA obejmuje co najmniej sekwencję Swnos nsSIeinbweob odpowiadającą Sbńoowi 5' genomu otasieoo ananmiSobwiason smoeliwiającą wytwnaznnie infekcyjnej kooii atnsieob ananmiksbwiassn.
2. 2. cNAA wedłso znstaz. 1, znamienny tym, że beejmsje cNAA o aełnej dłsobści.
3. 3. cDNA wweług zzasrz. 1 I ub 2, zznmieenntym. że cc nyjmniejcczęśiows cabcobdiz wiruss choaoey Aewcnstle.
4. 4. ccNA wseługzzstrz.3,z znmieenntym. że wirus ccorobe Zewscstlej jes wirugom I egtobOj nicznym, kbazystnie abchbdzącym ze szczeas stbsbwnneob w szczeaibnknch.
5. 5. ccNA wseług zzss^:u.4,zznmieeny tym, że sozczestosowssyw sozczeionysnCj ees sszcze aem LnSbtn ATCC VR-699.
6. 6. ccNA wseługzzstrz. T zznmieenytym. że panynło ddstarccznyj jes z mnbdfksnjąw kwsj sie nskleinbwym.
7. 7. ccNA wseługzzstrz.6, zznmieenytym. że nmbdfikknja obejmnjekwssnngleinywsksbujecc zmbdyfikbwnne miejsce cięcin dln aubtenzy.
8. 8. cdNA wseług zaasrz. 7, zznmieenytym. że miejsoccięęiajjes miejsocm cięęiadlaptoreenz einłkn fszyjneob (F).
9. 9. ccNA wseługzzstrz.6, zznmieenytym. że mnbdfiksnja obejmujekwssnngleinywsksbującc hyeaydbwe einłkb wiassbwe.
10. 10. cNAA wedłso znstaz. 9, znamienny tym, ee einłkb jest hemnolstyninb-nesanmidnzą (HA).
11. 11. ccNA wseług zzasrz. 6,zznmieenytym. że mnbdfkscje obejmnjeddleejew kwssiennglej inbwym kbdsjącym einłkb wiassbwe.
12. 12. cNAA wedłso znstaz. 6, znamienny tym, ee einłkb wiassbwe jest einłkiem mntaiks (M).
13. 13. cDNA wseług z czasru. Ż1 zznmieenn tt^n^, że ρο^^ο j jes Cdstaraczny z Zwssom nnglej inbwym kbdsjącym heteablboiczny nntyoen.
14. 14. cNAA wedłso znstaz. 13, znamienny tym, ee nntyoen abchbdzi z antboens dabeis.
15. 15. cONAwseług ozstrz. 1 Slusi 4, z znmieenn yym, że wsoamniasy ccNAjeet p ο^,ΚοΟ dstarcczr ny z kwasem nskleinbwym kbdsjącym eiałkb stymslsjące skład immsnblboiczny lse jeor część.
16. 16. RAA wytwoazbny w bonacis o cNAA jak zdefiniowano w znstaz. 1.
17. 17. Ssooób wsfwsrzzsiai nyegscjnejksoii ptasieeoporamikkowirugo,zznmieenynym. że e ranns feksje się co najmniej jedną kombakę oazy seycis cNAA jak zdefiniowano w znstaz. 1.
18. 18. Ssooób wseług żzasrZi ż 1, ttyn, że żsmnrUs żZdlnyj jes żd wsfwsrazsia wirasoweoo nesaoknosyds (AP), fosfoao-(P) lse einłkn dseej aolimeanzy (L).
19. 19. SsooObwseługzzsSrz. Ż1 I us Ż1, zznmieenytym. że conynło nmnOliwia cóę cięęia żiaałk fszyjneoo omnwinneoo wiassn.
20. 20. Ssooób wseług zzsSra. 11, zznmieeny ttm, że ρο^^ο ptawwndi sóę ir^^kibenjj ksmnrUi w aoeywce hodowlanej znwieaąjącej aktywność oaoteolityczną.
21. 21. Ssoo0bwseługzzsSrz.22, zznmieenynym. że po0ewSs hoOdwlasyoOejmujjpOm Dombcniowy zawieanjący aktywność aaoteolityczną.
22. 22. SsosObwseługzzsSrz. 11, zznmieenytym. że omnąiasy nsmnrUsj jes cobCobnyksmnrUi ksaczaka.
23. 23. Inyegscfny kkbia ptοsieeo poramikkowirugo, cznmieenn ttm, że ugzsSssy j ees noosobem zdefiniowanym w znstaz. 17.
24. 24. Sszczeionys, zznmieenn t^yn, że zzwiega ż ryegscfny kkbię ptοsieeo poramiksawirugo j ja zdefiniowaneob w znstaz. 23.
25. 25. Szczeoibnkn wedłso znstaz. 24, znamienna tym, ee jest eywą szczeoibnką.
26. 26. SszczeionyswseługzzsSrz.22 I us 25, z znmieenntym. że i nyegscfnyksbiaptasieeo caran miksowiassa, co najmniej częściowo jest aochodną wiassn choaoey Newcnstle (ANV).
27. 27. Ssosśb 1Ob-óbniasiazwiegzztniegozczeionyyCI ugzwiegzztsozczeionyyCsozczeionysNDV jak zdefiniowano w znstaz. 26 od zwieaząt zakneonych ANV dzikieoo tyas lse szczeaibnych niezmodyfikowanym mezooenicznym lse lentooenicznym szczeoem ANV, znamienny tym, ee ooeiean się co najmniej jedną oabekę ze zwieazęcin i okaeśla się w niej oeecności oaaeciwciał skieabwnnych oazeciwko immsnodominsjącems eoitoaowi lse maakeaowi wytwnazanym oazez ANV dzikieoo tyas lse ANV niezmodyfikowaneob lecz nie wytwnazanym oazez omawianą szczeaibnkę.

    PL 197 722 B1
28. 28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że przeciwciała skierowane są przeciwko białku HN lub F z NDV.
29. 29. SSpośóweeług zzatrz.22lub 22, zznmieenntym. żż zwierzz jeet wyssleecjoonwannz grupy złożonej z drobiu, korzystnie kurczaków.
30. 30. Zestaw diagnostyczny do użycia w sposobie jak zdefiniowano w zastrz. 27.
31. 31. cDNA ptasiego paramiksowirusa, znamienny tym, że wspomniany cDNA obejmuje co najmniej sekwencję kwasu nukleinowego odpowiadającą końcowi 5' genomu ptasiego paramiksowirusa umożliwiającą replikację minigenomu ptasiego paramiksowirusa.
32. 32. cDDA weeług zzas^ 31 ,znnmieenytynn. żż cc najmniercczęcioweppohoOdi z wirugachoroby Newcastle.
33. 33. cCNN weeług zzntrz.33,z znmieenntym. żż wiruu ccoroob ZAwecnSler ess wiruuem I entogenicznym, korzystnie pochodzącym ze szczepu stosowanego w szczepionkach.
34. 34. cDNA weeług z^^sr^. 33, znamienny że szccep stosowany w seccepionkach szczepem LaSota ATCC VR-699.
35. 35. cDNA według zaas^. 35, znamienny tym, że jess ponadto dostarcconn z modyfikacją w kwasie nukleinowym.
36. 36. cCNN weeług z8^^33, zznmieenytym. żż moOdSkaaja oOeimujekwennngleinowekoOujący zmodyfikowane miejsce cięcia dla proteazy.
37. 37. cDDN weeług zzasz· C1 znnmieenytym. cż ηιίθ^ϋ dędajjes πίθ^^ιι cięda dla pru-er azy białka fuzyjnego (F) .
38. 38. cCDN weeług czakz^, zznmieenytym. dż moOdSkaaje ^^Γηο^ dwen dngleinowe doOujący hybrydowe białko wirusowe.
39. 39. cDNA według zastrz. 38, znamienny tym, że białko jest hemaglutynino-neuramidazą (HN).
40. 40. cDNA według zastrz. 35, znamienny tym, że modyfikacja obejmuje delecję w kwasie nukleinowym kodującym białko wirusowe.
41. 41. cDNA według zastrz. 35, znamienny tym, że białko wirusowe jest białkiem matriks (M).
42. 42. cDNA według z zastrz. 31, znamienny tym, że ponadto jest dostarczany z kwasem nukleinowym kodującym heterologiczny antygen.
43. 43. cDNA według zastrz. 42, znamienny tym, że antygen pochodzi z patogenu drobiu.
44. 44. cDNA według zastrz. 42 lub 43, znamienny tym, że ponadto jest dostarczany z kwasem nukleinowym kodującym białko stymulujące układ immunologiczny lub jego część.
45. 45. RNA wytworzony w oparciu o cDNA jak zdefiniowano w zastrz. 31.
46. 46. Sposób wytwarzania infekcyjnej kopii ptasiego paramiksowirusa, znamienny tym, że obejmuje transfekcję co najmniej jednej komórki przy użyciu cDNA jak zdefiniowano w zastrz. 31.
47. 47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że komórka jest zdolna do wytwarzania wirusowego neurokapsydu (NP), fosforo-(P) lub białka dużej polimerazy (L).
48. 48. Sposób według zastrz. 46 lub 47, znamienny tym, że ponadto umożliwia się cięcie białka fuzyjnego omawianego wirusa.
49. 49. Spcosó weeług dzntrz. 331 tirni, żż ppsaato i n^uu^u^^ cię komórn w ppożywc hodowlanej zawierającej aktywność proteolityczną.
50. 50. Sppseóweeługzzntrz. 49, znnmieenytym. żż dP0żweo ho0dwlanao0eimó-e cC/s omóocniowy zawierający aktywność proteolityczną.
51. 51. Sppseóweeługzzntrz. 3T znnmieenytym. żż omówiana domórUoj jes dPoDoOną domórUi kurczaka.
52. 52. ^Ιο^θ kooia pCaaieeg ppjzmikkewiruge, cnnmieenn ttm, żż ugzsSona j e^ss dePse0bm jak zdefiniowano w zastrz. 46.
53. 53. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera wirusa jak zdefiniowanego w zastrz. 52.
54. 54. Szczepionka według zastrz. 53, znamienna tym, że jest żywą szczepionką.
55. 55. Szczepionka według zastrz. 53 lub 54, znamienna tym, że infekcyjna kopia ptasiego paramiksowirusa, co najmniej częściowo jest pochodną wirusa choroby Newcastle (NDV).
56. 56. Sposób rozróżniania zwierząt nieszczepionych lub zwierząt szczepionych szczepionką NDV zdefiniowano w zastrz. 55 od zwierząt zakażonych NDV dzikiego typu lub szczepionych niezmodyfikowanym mezogenicznym lub lentogenicznym szczepem NDV, znamienny tym, że pobiera się co najmniej jedną próbkę ze zwierzęcia i określa się w niej obecności przeciwciał skierowanych przeciwko immunodominującemu epitopowi lub markerowi wytwarzanym przez NDV dzikiego typu lub NDV niezmodyfikowanego lecz nie wytwarzanym przez omawianą szczepionkę.

    PL 197 722 Β1
57. 57. Sposób według zastrz. 56, znamienny tym, że przeciwciała skierowane są przeciwko białku HN lub F z NDV.
58. 58. Sposób według zastrz. 56 lub 57, znamienny tym, że zwierzę jest wyselekcjonowane z grupy złożonej z drobiu, korzystnie kurczaków.
59. 59. Zestaw diagnostyczny do użycia w sposobie jak zdefiniowano w zastrz. 56.