NO329193B1 - Paramyksovirus cDNA for fremstilling av medikamenter mot Newcastle-Disease hos fjaerfe. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår fugleparamyksovirus cDNA som angitt i krav 1, RNA oppnådd fra slikt DNA, fremgangsmåte for fremstilling av infeksjonsdyktig kopi av fugleparamyksovirus som angitt i krav 18, vaksine omfattende slikt virus som angitt i krav 25 samt en fremgangsmåte for å skjelne uvaksinerte dyr fra vaksinerte som angitt i krav 28, hvor dette kan anvendes for å behandle infeksjoner av fjærfe med Newcastle sykdomsvirus.

Necastle sykdomsvirus (NDV) er et av de mest mangfoldige og dødelige patogener for fugler. Den nesten samtidige opp-treden av Newcastle sykdom som en tilsynelatende ny sykdom i flere forskjellige geografiske beliggenheter og den store variasjonen i type og alvorlighet av sykdommen har gitt visse problemer med nomenklatur.

Sykdommen har blitt betegnet pseudo fjærfepest, pseudo fjærfe byllepest, fuglepest, fuglegalskap og fuglepneumoencefalitt. Viktigheten av sykdommen er i hovedsak grunnet utviklingen av fjærfeindustrien i løpet av det 20de år-hundre til en meget effektiv internasjonal industri som er avhengig av intensiv handel mellom land.

Det er generelt antatt at de første utbrutt av Newcastle sykdom fant sted i 1926 på Java, Indonesia, og i Newcastle-upon-Tyne, England (Kraneveld, 1926; Doyle, 11927). Navnet Newcastle sykdom ble gitt av Doyle som et foreløpig navn for å unngå beskrivende navn som kunne bli forvekslet med andre sykdommer. Det ble senere klart at andre mindre al-vorlige sykdommer ble forårsaket av virus som ikke kunne skjelnes fra NDV. I Amerika ble en relativt mild respiratorisk sykdom betegnet fuglepneumoencefalitt og ble vist å være forårsaket av NDV (Beach, 1944) . Innen et par år ble flere NDV isolater som ga ekstrem mild eller ingen sykdom i kyllinger foretatt omkring i verden.

De følgende metoder har blitt implikert i spredningen av sykdommen: 1) bevegelse av levende fugler, rovfugler, byt-tefugler, brevduer og kommersielle fjærfe; 2) bevegelse av folk og utstyr; 3) bevegelse av fjærfeprodukter; 4) lufts-predning; 5) forurenset fjærfefor; 6) forurenset vann; 7) ufullstendige inaktiverte eller heterogene vaksiner. Ifølge OIE er Newcastle sykdom en sykdom hos fjærfe forårsaket av et virus av fugleparamyksovirus serotype 1 (APMV-1) som har en intracerebral patogenisitetsindeks (ICPI) i dagsgamle kyllinger på 0,7 eller større. Virulente virus kan også bli bekreftet ved tilstedeværelsen av flere basiske aminosyrer ved C-terminalen av F2-proteinet og F(fenylanin) ved residu 117 som er N-terminalen av Fl-proteinet. Det å ikke vise denne aminosyresekvens ville kreve karakterisering ved ICPI-tester. Ordet "fjærfe" refererer til tamfjærfe, kalkuner, broilere, ender, gjess, vaktler, duer, fasaner, villduer og strutsefugl som blir odlet og holdt i fangenskap for avl, produksjon av kjøtt eller egg for konsumpsjon, eller for å spe på viltbestanden.

I henhold til Alexander (1988) har tre panzootyper av Newcastle sykdom oppstått siden den første gjenkjennelse av sykdommen. Den første representerte de opprinnelige utbrudd av sykdommen og synes å ha oppstått i Sydøst-Asia. Isolerte utbrudd, så som det i England i 1926 var tilfel-dige introduksjoner før hovedmengden som sakte beveget seg gjennom Asia til Europa.

Et andre panzootisk tilfelle synes å ha startet i Midt-Øs-ten sent på 1960-tallet og nådde de fleste land i 1973. Den raskere spredning av dette andre panzootiske tilfellet var sannsynlig forårsaket av hovedrevolusjonen innen fjærfeindustrien med vesentlig internasjonal handel.

Et tredje panzootisk tilfelle påvirket i hovedsak tamme fugler så som duer og brevduer (Vindevogel og Duchatel, 1988). Sykdommen oppsto tilsynelatende i Midt-Østen sent på 1970-tallet. I 1981 hadde den nådd Europa og spredde seg så raskt til alle deler av verden i hovedsak som et resultat av kontakt mellom fugler ved konkurranser og utstil-linger og den internasjonale handel med slike fugler.

I dag er Newcastle sykdom fremdeles spredd i mange land i Asia, Afrika, Amerika og Europa. Kun landene i Oseania synes å være relativt fri for sykdommen (Spradbrow, 1988) .

NDV tilhører ordenen Mononegavirales, familien Paramyxovi-rida, subfamilien Paramyxovirina, genus Rubulavirus. Ved siden av NDV, generelt kalt fugleparamyxovirus type 1, åtte andre serotyper betegnet fugleparamyxovirus type-2 til -9 blir distingvert på basis av sitt antigene slektskap i he-maglutineringsinhiberingsforsøk og serumnøytraliserings-forsøk (Alexander, 1993).

Til tross for konsistensen av den serologiske gruppering finnes det enkelte kryssforhold mellom virus av de forskjellige serotyper.

Genomet av NDV er et enkeltkjedet RNA-molekyl av negativ polaritet, komplementert til messenger RNA som koder for virusproteiner. RNA-genomet er omtrent 15.200 nt stort og koder for de følgende genprodukter (listet fra 3'-ende til 5'-ende av det genomiske RNA): nukleokapsidprotein (NP), fosfoprotein (P), matriseprotein (M), fusjonsprotein (F), hemagglutinin-neuraminidase (HN), og stort polymerasepro-tein (L) (Chambers et al., 1986).

RNA-materialet er kompleksbundet med NP-, P- og L-proteiner for å danne en ribonukleokapsidpartikkel (RNP) som er om-gitt av en kappe som er foret på innsiden av M-proteinet. Kappen inneholder F- og HN-proteinene som er involvert i festing og en penetrasjon av vertscellen.

Replikasjon av NDV er lik strategien benyttet av andre paramyxovirinae. Det initielle trinn er festing av viruset til vertscellereseptorene skaffet til veie av HN-proteinet. Fusjon av den virale kappe med vertscellemembranen er avhengig av virkningen av både HN- og F-proteinene og resulterer i frigjøringen av RNP i cytoplasma hvor virusreplika-sjonen finner sted.

Den virale RNA-avhengige RNA-polymerase (som er en del av RNP) danner komplementære transkripter som virker som mRNA-forbindelser og blir brukt av cellens translasjonsmaskineri for syntesen av virusproteiner. Grunnet akkumulering av NP-protein skifter RNA-polymerasekomplekset fra transkripsjon til replikasjon, noe som resulterer i syntesen av genomiske og antigenomiske RNA-molekyler av full lengde.

Nylig dannede RNP blir innkapslet ved cellemembranen ved virkningen av M-proteinet og F- og HN-proteinene som har akkumulert i den cellulære plasmamembranen. Nylig dannede viruspartikler blir frigjort fra den infiserte celle med en knoppskytningsmekanisme. For mer detaljert informasjon omkring NDV-replikasjonen, se Peeples (1988). For en nylig oversikt av den molekylære biologi av paramyxovirinae (se Lamb og Kolakofsky (1996)).

Ved siden av kommersielle husfjærfe (dvs. kyllinger, kalkuner, fasaner, broilere, ender, gjess, duer) er en mengde fangede, semitamme og frittlevende fugler innbefattende mi-gratoriske vannfugler, mottakelige for NDV og kan være primære infeksjonskilder (Kaleta og Baldauf, 1988).

Patogenisiteten av NDV-stammer er i stor grad forskjellig fra vert til vert. De mest resistente arter synes å være vannfugler, mens de mest mottakelige er flokkfugler som danner temporære eller permanente flokker. Kyllinger er svært mottakelige, men ender og gjess kan være infisert og vise få eller ingen kliniske tegn, selv med stammer som er dødelige for kyllinger.

Newcastle sykdom er komplisert i at forskjellige isolater og stammer av viruset kan indusere enorm variasjon i alvor-ligheten av sykdommen. Beard og Hanson (19184) grupperte NDV-stammer og isolater i forskjellige patotyper som rela-terer til sykdomstegn som kan bli observert i fullstendige mottakelige kyllinger: 1) viskerotopisk velogenisk NDV som danner akutte dødelige infeksjoner hvor blødningslesjoner er fremtredende i tarmen; og neurotropiske velogene NDV som gir høy dødelighet forløpet av respiratoriske og nevrolo-giske tegn, men ingen tarmlesjoner; 2) mesogent NDV som gir lav mortalitet, akutt respiratorisk sykdom og nervøse tegn i enkelte fugler; 3)lentogent NDV som gir mild eller ikke synlige respiratoriske infeksjoner eller til og med asymptomatisk enterisk NDV, avirulente virus som synes å replikere i hovedsak i tarmkanalen. Noe overlapping mellom teg-nene assosiert med de forskjellige grupper har blitt rap-portert .

Viruset kommer inn i kroppen via luftveiene og tarmkanalen eller via øyet. I trakea blir viruset spredd ved siliær virkning eller ved celle-til-celle-virkning. Etter initial multiplikasjon ved innføringsstedet blir virus ført under episoder av viraemia til lever, nyre og lunger. Virus fra enkelte stammer når vitale organer som lever og nyrer meget raskt, slik at fuglene kan dø før sykdomssymptomer er tyde-lige .

De fleste virus når sentralnervesystemet via blodet før større mengder antistoff eksisterer. En lang asymptomatisk bæretilstand antas å inntreffe i psittasines, utgjør en po-tensiell trussel for fjærfeindustrien. En langtids bæretilstand av både lentogene og velogene virus kan også eks-istere i kyllinger (Heuschele og Easterday, 1970) .

I løpet av replikasjonen av NDV er det nødvendig for prekursor-glykoproteinet Fo å bli spaltet til Fl og F2 for at virusavkommet skal være infeksjonsdyktig (Rott og Klenk, 1988). Denne posttranslasjonelle spaltning blir fremmet av vertscelleproteaser. Dersom spaltning ikke finner sted blir ikke-infeksjonsdyktige viruspartikler dannet og viral replikasjon kan ikke fortsette. Fo-proteinet av de virulente virus kan bli spaltet av en mengde proteaser, men Fo-proteiner i virus av lav virulens er begrenset i sin føl-somhet, og disse virus kan kun vokse in vivo i visse verts-celletyper og kan generelt ikke bli dyrket in vitro.

Lentogene virus replikerer kun i områder med trypsinlig-nende enzymer så som luftveiene og tarmkanalen, mens virulente virus kan replikere i en mengde vev og organer, noe som resulterer i dødelig systemisk infeksjon.

Aminosyresekvensering av Fo-prekursoren har vist at lav-vi-rulensvirus har et enkelt arginin (R) som binder F2 og Fl kildene, mens virulente stammer har ytterligere basiske aminosyrer som danner to par så som K/R-X-K/R-R-F ved spaltningssetet. Videre starter F2-kjeden av virulente stammer generelt med et fenylalaninresiduum mens de ikke-virulente stammer starter generelt med et leucin.

For et par stammer av NDV blir HN-proteinet også fremstilt som en prekursor som krever spaltning for å være biologisk aktivt (Garten et al., 1980; Millar et al., 1988).

Ved siden av spaltbarhet av F- og HN-proteinene kan andre virale faktorer tilføre patogenisitet. Madansky og Bratt (1978, 1981a, 1981b) har vist at endringer i transkripsjon og translasjon kunne modulere vekst og celle-til-celle spredning av viruset og/eller cytopatogenisiteten.

Den initielle immunrespons på infeksjon med NDV er celleme-diert og kan være påviselig så tidlig som 2-3 dager etter infeksjon med levende vaksinestammer. Dette forklarer sannsynligvis den tidlige beskyttelse mot angrep som har blitt funnet i vaksinerte fugler før en målbar antistoffrespons blir funnet (Gough og Alexander, 1973).

Ved omkring 1 uke etter infeksjon kan sirkulerende antistoff beskytte vertsorganismen fra reinfeksjon. I den tidlige fase er IgM involvert, fulgt av IgG. Titre og beskyttelse har en topp etter omkring 3 uker og synker gradvis dersom det ikke er noen forsterkning. Dette betyr at for eldre fugler er revaksineringer nødvendige.

Kun levende vaksiner administrert via respiratorisk rute stimulerer antistoff i alle mukosale overflater så vel som i serum. Inaktivert vaksine, selv når den innføres via in-tr amus ku lær rute fremskaffer ikke lokal resistens i luftveiene til tross for høye konsentrasjoner av antistoff i serum.

Dette uthever viktigheten av levende vaksiner som er i stand til å presentere viralt antigen til de øvrige luftveier for å indusere både lokal og systemisk immunitet. Små dråper trenger inn i de nedre luftveier for derved å fremskaffe en i hovedsak humoral immunrespons, mens store dråper stimulerer lokal immunitet i de øvre luftveier.

Følgelig gir aerosoler med et bredt dråpestørrelsesområde den beste totale lokale og humorale immunitet.

Det bør imidlertid bemerkes at til tross for intens vaksinering med tilgjengelige vaksiner som danner høye nivå av antistofftitre, kan virus fremdeles bli funnet fra mukøse overflater.

Identifiseringen av Newcastle sykdom i USA førte til anven-delsen av inaktiverte vaksiner (Hofstad, 1953). Observasjonen at enkelte av de enzootiske virus ga kun mild sykdom resulterte først i utviklingen av den mesogene levende vaksine Roakin (Beaudette et al., 1949) og etterfølgende, i utviklingen av den mildnere Hitchner Bl (Hitchner og Johnson, 1948) og LaSota (Goldhaft, 1980) stammer som nå er de hyppigst brukte levende vaksiner.

Fra en artikkel av A. Garcia-Sastre (Tibtech, vol. 16, no 5, 1998, s. 230 - 235) er det kjent rekombinante virus med spesifikke mutasjoner i kodende og ikke-kodende regioner i deres genomiske RNA. Videre beskriver N. Ståuber et al (Vaccine, vol. 13, nr 4, 1995, s. 360 - 364) deteksjon av Newcastle dicease-virus, NDV i fjærfevaksiner ved bruk av PCR og direkte sekvensering av amplifisert cDNA. I EP 780475 er det beskrevet metoder i forbindelse med generering av ikke-segmenterte negativt-trådet RNA-virus (paramyksovirus) fra klonet cDNA, og i Journal of General Virology, vol. 67, nr. 3, 1986, s. 475 - 486 beskriver P. Chambers et al, at cDNA til 90% av NDV-genomet har blitt klonet og karakterisert.

NDV levende vaksiner kan bli oppdelt i to grupper, lentogene og mesogene. Mesogene stammer er egnet kun for sekun-dær vaksinering av fugler grunnet deres større virulens. Immunresponsen øker ettersom patogenisiteten av den levende vaksine øker. Følgelig for å oppnå det ønskede beskyttel-sesnivå uten alvorlig reaksjon blir for tiden brukte vaksi-neringsprogrammer benyttet som involverer sekvensiell bruk av progressivt mer virulente vaksiner eller levende vaksiner fulgt av inaktiverte vaksiner.

En av hovedfordelene ved levende vaksiner er at de kan bli administrert med billige masseapplikasjonsteknikker. En vanlig metode for applikasjon er via drikkevannet. Imidlertid må drikkevannsapplikasjon bli nøye overvåket ettersom viruset kan bli inaktivert av høy varme og lys og av virusidale urenheter i vannet.

Masseapplikasjon av levende vaksiner med spray og aerosoler er også meget populært grunnet lettheten som store antall fugler kan bli vaksinert på over en kort tid. Det er viktig å oppnå den korrekte partikkelstørrelse ved å kontrollere betingelsene hvorunder partiklene blir dannet.

For tiden benyttede levende vaksiner har flere ulemper. Vaksinen kan fremdeles gi sykdomstegn avhengig av miljømes-sige betingelser og tilstedeværelsen av kompliserende infeksjoner. Følgelig er det viktig å benytte ekstremt milde virus for primær vaksinering og som et resultat er flere vaksineringer vanligvis nødvendige. Videre kan maternalt avledede antistoff forhindre riktig primær vaksinering med levende lentogene vaksiner.

Inaktiverte vaksiner blir vanligvis dannet fra infeksjonsdyktig allantoinvæske som bli behandlet med formalin eller betapropiolakton for å avlive virusene og blandet med passende adjuvant. Inaktiverte vaksiner blir administrert ved injeksjon, enten intramuskulært eller subkutant. Inaktiverte vaksiner er dyre å fremstille og tilføre.

Imidlertid blir inaktiverte olje-emulsjonsvaksiner ikke så

uheldig påvirket av maternal immunitet som levende vaksiner og de kan bli benyttet i dagsgamle kyllinger. Fordeler med inaktiverte vaksiner er de lave nivå av uheldige reaksjoner i vaksinerte fugler, i høye nivå av beskyttende antistoff,

og den lange varighet av beskyttelsen. Ingen av de ovennevnte vaksiner kan serologisk bli adskilt fra villtype

NDV.

Utviklingen av rekombinante virale vaksiner har vært av interesse for fjærfeindustrien i et antall år. Konseptet er å sette inn gener av kritiske immuniserende epitoper av et sykdomsfremkallende stoff av interesse i et ikke-essensielt gen hos et vektorvirus. Vaksinering med det rekombinante virus resulterer således i immunisering mot både vektorvi-ruset så vel som det sykdomsfremkallende middel av interesse .

Flere typer virus har blitt foreslått som potensielle levende virale vaksiner for fjærfe. To fuglevirus som har stor oppmerksomhet er fuglekoppevirus (FPV) og herpesvirus hos kalkuner (HVT). Fuglekoppevirus er et DNA-virus som har et stort genom og er således betraktet å ha tilstrekkelig rom til å bære fremmede gener.

Når de svekkes forårsaker ikke FPV klinisk sykdom og blir vanlig benyttet som en vaksine i kyllinger. HVT er også et DNA-virus og blir klassifisert som serotype III av Mareks sykdomsviruset (MDV)familien. HVT er ikke-patogent for kyllinger, men kryssbeskyttende mot MDV og blir vanligvis benyttet for å vaksinere kyllinger mot Mareks sykdom.

Det har blitt vist at beskyttelse mot Newcastle sykdom kan bli indusert ved å bruke rekombinante HVT- eller FPV-vaksiner (Morgan et al., 1992, 1993; Heckert et al., 1996; Boursnell et al., 1990; Taylor et al., 1990).

Imidlertid ble igangsettingen av beskyttelse mot Newcastle sykdom etter vaksinering med slike rekombinante vaksiner som uttrykker enten NDV F-proteinet eller både F- og HN-proteinene alvorlig forsinket sammenlignet med den som føl-ger vaksinering med en konvensjonell levende eller inaktivert NDV-vaksine, trolig fordi de rekombinante vaksiner ikke gir et bredt nok immunologisk spektrum av antigent relevante NDV-epitoper andre enn dem funnet på NDV-proteinet som blir uttrykt ved den rekombinante vaksine eller blir ikke tilstrekkelig presentert for immunsystemet.

Videre ble lokal, (mukosal, respiratorisk eller enterisk) beskyttelse ikke effektivt indusert i fugler vaksinert med det rekombinante materiale. Dette er en alvorlig ulempe siden vaksiner benyttet for primær vaksinering mot respiratoriske sykdommer må indusere lokal immunitet for å forhindre infeksjon og spredning av virulente virus som infi-serer kyllinger oppavlet under feltbetingelser.

Antistoff mot NDV som er i stand til å beskytte vertsorganismen kan bli målt i virusnøytraliseringstester. Imidlertid siden nøytraliseringsresponsen synes å være parallell med hemagglutineringsinhiberings(HI)responsen blir sistnevnte test ofte brukt for å undersøke den beskyttende re-spons, spesielt etter vaksinering.

Antistoff mot både F- og HN-proteinene kan nøytralisere NDV. Imidlertid synes antistoff mot F-proteinet å indusere større nøytralisering enn dem rettet mot HN in vivo og in vitro forsøk (Meulemans et al., 1986).

Tilstedeværelsen av spesifikke antistoff mot NDV i serumet hos en fugl gir lite informasjon angående den infiserende stamme av NDV og har følgelig begrensende diagnostisk verdi.

Den totale tilstedeværelse av lentogene NDV-stammer i fugler i de fleste land og den nesten universelle bruk av levende vaksiner som ikke kan bli adskilt, i det minste ikke serologisk fra villtype NDV, betyr at kun påvisningen av infeksjon sjelden er tilstrekkelig årsak for kontrolltiltak å bli satt i gang. Siden feltsykdom kan være et upålitelig mål på den sanne virulens av viruset, er det nødvendig ytterligere å karakterisere som er funnet.

For tiden er den eneste metoden av Newcastle sykdomsdiag-nose som tillater karakterisering av den infiserende

stamme, virusisolasjon fulgt av patogenisitetstesting. For tiden blir tre in vivo-tester benyttet for dette formål: 1) gjennomsnittlig dødstid (MDT) i egg; 2) intracerebral patogenisitetsindeks (ICPI) i dagsgamle kyllinger; 3) intrave-nøs patogenisitetsindeks (IVPI) i 6 uker gamle fugler.

Disse tester lider av et antall ulemper, så som tilgjengeligheten på dyr, dårlig reproduserbarhet og den relativt lange varighet av forsøkene. Sist, men ikke minst tillater ikke disse testene en enkel serologisk identifisering av fjærfe vaksinert med en vaksine eller infisert med en villtype st amme .

Som et alternativ til in vivo tester har polymerase kjede-reaksjonen (PCR) på god måte blitt brukt for å skjelne mellom virulente og ikke-virulente isolater (Ståuber et al., 1995; Kant et al,. 1997), men igjen er serologisk differensiering ikke mulig.

Oppavlingen av fjærfe og handel av deres produkter blir nå organisert på internasjonal basis, ofte under overvåkning av multinasjonale selskaper. Trusselen fra Newcastle sykdom har vist seg som et hemmende moment i slik handel.

Riktig kontroll av Newcastle sykdom vil kun bli oppnådd når alle land rapporterer utbrudd. Imidlertid er internasjonale avtaler ikke enkle grunnet den enorme variasjon i om-fanget av sykdomsovervåkningen i forskjellige land. Enkelte land vaksinerer ikke, og vil ikke ønske noen form for NDV introdusert i hjemlig fjærfe fordi vaksinert fjærfe ikke kan bli skjelnet fra dem infisert med villtype NDV.

Andre tillater kun bruken av spesifikke levende vaksiner og betrakter andre vaksiner som uakseptabelt virulente. Enda andre land har fortsatt tilstedeværelse av sirkulerende høyt virulente virus som ikke er kjent som sådan fordi stor sykdom blir maskert av vaksinering.

I mange land eksisterer lover for å kontrollere utbrudd av Newcastle sykdom som kan oppstå. Nasjonale kontrolltiltak blir rettet mot det å forhindre innføring og spredning. De fleste land har restriksjoner angående handel i fjærfeprodukter, i egg og levende fjærfe. De fleste land har etablert karanteneprosedyrer for import, spesielt for psitta-sine fugler.

Enkelte land har innført avlivningsmetoder med pålagt ned-slakting av infiserte fugler, deres kontakter og produkter. Andre krever profylaktisk vaksinering av fugler, spesielt ved fravær av utbrudd, mens enkelte har en politikk for ringvaksinering omkring utbrudd for å etablere en buffer-sone .

Det finnes klart et behov for bedre vaksiner og for bedre diagnostiske metoder som kan bli brukt for å kontrollere Newcastle sykdom. Grunnet både de store forskjeller i do-sen som blir mottatt av individuelle fugler under massetil-føring av levende vaksiner og variasjonen i nivå av maternal immunitet i unge kyllinger er postvaksineringsreaksjo-ner ved levende vaksiner uunngåelige. Dette er en av ho-vedbekymringene til bønder i land hvor vaksinering er pålagt .

Videre er mange vaksiner blandinger av subpopulasjoner. Når klonet kan disse subpopulasjoner være signifikant forskjellige fra hverandre i immunogenitet og patogenisitet (Hanson, 1988).

Imidlertid er den største ulempen med for tiden benyttede levende vaksiner og inaktiverte vaksiner det faktum at vaksinerte dyr ikke kan bli skjelnet fra infiserte dyr med for tiden benyttede undersøkelsesteknikker så som hemaglutine-ringsinhibering eller virusnøytraliseringsforsøk.

Virulente feltvirus kan fremdeles bli spredd i vaksinerte flokker siden sykdomssymptomer blir maskert av vaksinering. Siden virusisolering og karakterisering av virulens ved in vivo-teknikker ikke er mulige i stor skala, finnes et stort behov for nye og effektive svekkede levende vaksiner som kan bli serologisk skjelnet fra feltvirus.

Slike vaksiner, kalt NDV-markørvaksiner (og medfølgende diagnostiske metoder og sett) som bør gir det størst mulige immunologiske spektrum av antigenisk relevante NDV-epitoper og likevel bør være serologisk distinkt fra villtype NDV er enda ikke tilgjengelige.

Oppfinnelsen fremskaffer et fugleparamyksovirus-cDNA som tillater å danne genetisk modifiserte fugleparamyksovirus og en fugleparamyksovirusmarkørvaksine.

Innføringen av moderne molekylære biologiske teknikker har tillatt genetisk modifikasjon av mange RNA-virus innbefattende negativt kjedede RNA-virus. Denne teknikk blir ofte referert til som "revers genetikk". Det fremskaffes først en (fullengdet) cDNA-kopi av det virale RNA hvorpå dette DNA transkriberes i mottakelige celler for å danne infeksjonsdyktige RNA som igjen kan replikere for å danne infeksjonsdyktige viruspartikler.

Generelt ved foregående modifikasjon av cDNA med standard molekylære biologiske teknikker er det mulig å oppnå et genetisk modifisert RNA-virus. Imidlertid har dette aldri materialisert seg for NDV eller andre fugleparamyksovirus, og det har heller ikke vært mulig å danne minigenomfragmen-ter eller plasmider av fugleparamyksovirus-genomiske fragmenter for å studere replikative hendelser hos fugleparamyksovirus for derved å gi en forståelse av hvordan infeksjonsdyktige kopivirus kan konstrueres.

Overraskende, selv om det i denne beskrivelse det har nå blitt fullstendig etablert at genomet hos fugleparamyksovirus er det minste av alle paramyksovirusgenomer sekven-sert til i dag, er spesielt den 5'-terminale endesekvens av NDV-genomet mye lenger enn hva som tidligere hadde blitt etablert og var ventet ved sammenligning med andre Paramyxoviridae. Oppfinnelsen fremskaffer nå for første gang en full sekvens av et fugleparamyksovirusgenom og gir full-lengdet eller minigenomisk lengdet cDNA av et slikt virus.

Oppfinnelsen fremskaffer herved fugleparamyksovirus-cDNA som angitt i krav 1 og som omfatter minst en nukleinsyresekvens tilsvarende 5'-terminal ende av genomet hov fugleparamyksovirus som tillater å danne infeksjonsdyktig kopi av fugleparamyksovirus hvor nevnte cDNA fortrinnsvis omfatter et fullengdet cDNA. Imidlertid fremskaffer oppfinnelsen også cDNA som omfatter minst en nukleinsyresekvens tilsvarende 5'-terminal ende av genomet hos fugleparamyksovirus for derved å tillate og danne et replikerende fugleparamyksovirus minigenom. Slike minigenomer kan fordelaktig bli brukt for å transkribere RNA og/eller uttrykke protein fra modifiserte nukleinsyresekvenser. Oppfinnelsen fremskaffer et cDNA i henhold til oppfinnelsen som minst delvis er avledet fra Newcastle Disease Virus, for eksempel hvor nevnte Newcastle Disease Virus er et lentogent virus, fortrinnsvis avledet fra en vaksinestamme så som LaSota-stamme ATCC VR-699.

Oppfinnelsen fremskaffer videre et cDNA i henhold til oppfinnelsen ytterligere utstyrt med en modifikasjon så som en delesjon, innsetning, mutasjon, reversering eller annet i en nukleinsyre. For eksempel er et cDNA fremskaffet hvor nevnte modifikasjon omfatter en nukleinsyre som koder for et modifisert protease spaltingssete, for eksempel hvor nevnte spaltingssete er et protease spaltingssete av fusjonsproteinet (F) .

I enda en annen utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen et cDNA i henhold til oppfinnelsen hvor nevnte modifikasjon omfatter en nukleinsyre som koder for et viralt hybridprotein så som et hemaglutinin-neuraminidase (HN) hybridprotein som beskrevet i den eksperimentelle del av oppfinnelsen. Oppfinnelsen fremskaffer også et cDNA i henhold til oppfinnelsen hvor nevnte modifisering omfatter en delesjon i en nukleinsyre som koder for et viralt protein, så som et matriseprotein (M).

Oppfinnelsen fremskaffer ytterligere et cDNA i henhold til oppfinnelsen som i tillegg er utstyrt med en nukleinsyre som koder for et heterologt antigen, fortrinnsvis hvor nevnte antigen er avledet fra et fuglepatogen som, for eksempel, beskrevet nedenfor. Et RNA og protein avledet derav, fremskaffet fra et cDNA i henhold til oppfinnelsen er også fremstilt.

I de senere år har et antall ikke-segmenterte negativt kjedede RNA-virus blitt fullstendig karakterisert, og funda-mentalt arbeid på replikasjonen og ekspresjonen av deres genomer har kulminert i muligheten til å danne infeksjonsdyktige virus fullstendig ved å transfektere celler med klonet cDNA fra nevnte virus (oversikt av Conzelmann, 1996).

Til i dag har infeksjonsdyktige virus av ikke-segmenterte negativt kjedede RNA-virus dannet fra klonet cDNA av for eksempel rabiesvirus (Schnell et al., 1994; Conzelmann; EP0702085A1). (Schnell et al., 1994; EP0702085A1), vesiku-lært stomatitisvirus (Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995), Sendaivirus (Garcin et al., 1995), meslingvirus (Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997; EP0780475A1), humant respiratorisk syncytialvirus (Collins et al., 1995), rinderpestvirus (Baron and Barrett, 1997) , og humant parainfluensavirus type 3 (Hoffman and Banerjee, 1997, Conzelmann; P0702085A1), (Schnell et al., 1994; EP00702085A1).

Imidlertid er alle av de ovennevnte infeksjonsdyktige vi-ruskopier i stand til å vokse både in vivo så vel som in vitro i vertsorganismer, vev eller celler av forskjellig opprinnelse, noe som tillater lett cDNA-transfeksjon og replikasjon og fremstilling av infeksjonsdyktige viruspartikler i en egnet cellelinje.

Slik mulighet eksisterer ikke for NDV og klart ikke for lentogene NDV-stammer som kan danne en vaksine. Virulens av en slik NDV-stamme er assosiert med dets egenskap å replikere i en bred samling celler, noe som er reflektert av det faktum at virulente stammer lett kan replikere in vitro og in vivo, mens vaksinestammer bare kan replikere in vivo.

Således med NDV oppstår en "catch 22"-situasjon. Selv om forsøk på å danne en infeksjonsdyktig kopivirus fra for eksempel infeksjonsdyktig cDNA muligens kan resultere i infeksjonsdyktige virus, er slike virus generelt ikke egnet til bruk som en vaksine fordi de således fremstilte infeksjonsdyktige virus iboende er for virulente til å bli brukt som vaksine; og det faktum at den kan bli dannet og replikert etter transfeksjon av cDNA på en cellelinje reflekte-rer dets lette spaltbarhet av Fo-proteinet til Fl og F2, som diskutert ovenfor, som er kjennetegn for virulens av et

NDV.

Å bruke en vaksinestamme som opphavsmateriale for cDNA-materiale vil ikke løse dette problem idet en vaksinestamme, spesielt av en lentogen type ikke inneholder et lett spalt-bart Fo-protein noe som gjør det umulig for første genera-sjonsvirus å fortsette og replikere. Cellen benyttet for transfeksjon vil ganske enkelt ikke være i stand til å støtte en eller flere replikasjonsrunder av vaksinetypevi-rus med et ikke-spaltet Fo-protein.

Oppfinnelsen fremskaffer nå elegant en løsning for dette problem og gir derved infeksjonsdyktige kopi-NDV, for eksempel for bruk i en vaksine.

Oppfinnelsen fremskaffer en fremgangsmåte for å danne in-feks j onsdyktige kopier av Newcastle Disease Virus omfattende å transfektere celler som er i stand til å uttrykke viral NP-, P- og L-proteiner for kompleksdanning med viralt RNA med klonet fullengdet eller genomisk lengdet cDNA av nevnte virus og som videre omfatter å inkubere nevnte celler i vekstmedium omfattende proteolytisk aktivitet som tillater spalting av Fo-proteinet av nevnte virus.

I Søkers system kan ko-transfeksjon av et plasmid som uttrykker NP bli sløyfet. NP blir sannsynligvis uttrykt fra fullengdet cDNA fordi NP-genet er det første genet etter 5' ende av det antigenomiske RNA. Siden eukaryotisk mRNA vanligvis er monocistronisk blir ekspresjon av distale gener ikke ventet. Imidlertid er det mulig å danne full-lengdet cDNA hvor de relative posisjoner av NDV-genene er endret. Dersom det første gen av et slikt cDNA er P- eller L-genet er det ikke nødvendig å uttrykke det tilsvarende genprodukt fra et ko-transfektert plasmid.

Som et alternativ til å bruke fullengdet cDNA, er det mulig å bruke to eller flere subgenomiske cDNA som danner repli-kas j onskompetente subgenomiske RNA og som sammen uttrykker den fulle mengde av fugleparamyksovirusproteiner. Selv om RNA-delene blir pakket separat, kan de resulterende virus-lignende partikler bli brukt for suksessive replikasjonsrunder ved hjelp av ko-infeksjon og komplementering av gen-funksjoner.

I en foretrukket utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen en fremgangsmåte hvor nevnte proteolytiske aktivitet er avledet fra et enzym, så som et trypsinlingende enzym, eller er avledet fra en blanding omfattende nevnte proteolytiske aktivitet. I en svært foretrukket utførelsesform omfatter nevnte vekstmedium allantoinvæske omfattende proteolytisk aktivitet. Spalting av Fo-proteinet er nødvendig for dannelsen av infeksjonsdyktige virus. Det er mulig å danne infeksjonsdyktige virus fra lentogene stammer uten tilsetning av eksogent proteolytisk aktivitet. Ved å inokulere supernatanten av transfekterte celler i allantoinrommet av embryonerte egg, er den proteolytiske aktivitet som er til stede i allantoinvæsken i stand til å spalte Fo-proteinet for å danne det fusjonskompentente Fl - F2 kompleks. Virioner med et slikt aktivert F-protein er i stand til å infisere mottakelige celler og replikasjon i celler som uttrykker den ønskelige proteolytiske aktivitet gir infeksjonsdyktig avkom. Som et alternativ til å fremskaffe den ønskede proteolytiske aktivitet til supernatanten hos transfekterte celler, er det for eksempel mulig å bruke en celle som er permissiv for NDV og som allerede uttrykker nevnte proteolytiske aktivitet. En slik cellelinje blir brukt for å danne infeksjonsdyktige lentogene NDV uten tilsetning av eksogen proteolytisk aktivitet. En slik cellelinje kan også bli dannet ved stabilt å transfektere en cellelinje med et gen som spesifiserer nevnte aktivitet. Videre er det mulig å danne en stabil transfektert cellelinje som uttrykker villtype F-proteinet i viruskappen for derved å danne infeksjonsdyktige partikler (i seg selv ikke utstyrt med genomisk informasjon som koder for villtype F-protein) med mulighet for å trenge inn i en celle. Innfanging av infeksjonsdyktige lentogene virus er også mulig ved infeksjon av transfekterte celler med et NDV-hjelpevirus. Et essensielt krav for et slikt hjelpevirus vil være at det kan bli selektert mot, for eksempel ved hjelp av nøytrali-serende antistoff som fjerner hjelpeviruset, men som ikke reagerer med det lentogene virus. Endelig er det mulig å konstruere en stabil transfektert cellelinje som uttrykker ett, to eller alle av de tre essensielle NDV-proteiner, NP, P og L. Slike cellelinjer krever ko-ekspresjon av kun et subsett av de tre essensielle proteiner eller ingen ko-ekspresjon i det hele tatt for å støtte dannelse av infeksjonsdyktige kopivirus.

I en foretrukket utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen en fremgangsmåte hvor nevnte celler benyttes for transfeksjon er avledet fra primære eller sekundære kyllingceller eller cellelinjer. Beskrivelsen fremskaffer for eksempel CER-eller CEF-celler, som, som de fleste in vitro- celler generelt mangler de passende proteaser som er nødvendig for å spalte Fo-proteinet av NDV, for eksempel av stamme LaSota. Imidlertid kan celler avledet fra for eksempel andre fugler også bli brukt.

Oppfinnelsen fremskaffer videre en fremgangsmåte for å danne infeksjonsdyktige Newcastle Disease Virus-kopier omfattende å transfektere celler med klonet fullengdet eller genomisk-lengdet cDNA av nevnte virus som for eksempel identifisert i figur 3 og som ytterligere omfatter å inkubere nevnte celler i vekstmedium omfattende proteolytisk aktivitet som tillater spalting av Fo-proteinet av nevnte virus, og som ytterligere omfatter å gjenvinne infeksjonsdyktige virus ved å dyrke nevnte celler og inokulere materiale avledet fra nevnte dyrkede celler i allantoinrommet av embryonerte egg. Slikt materiale omfatter for eksempel (innhøstede eller frysetinte) celler eller celleavfall eller supernatant avledet fra nevnte cellekultur.

For eksempel angir beskrivelsen en fremgangsmåte for å gjenvinne infeksjonsdyktige virus hvor supernatanten av transfekterte CEF monolag ble inokulert inn i allantoinrommet hos embryonerte egg. Fire dager senere ble allantoinvæsken innhøstet, analysert i et hemaglutineringsassay og passert videre i egg.

I tillegg fremskaffer oppfinnelsen en fremgangsmåte som ytterligere omfatter å passere nevnte infeksjonsdyktige kopi av Newcastle Disease Virus ved å innhøste allantoinvæske og re-inokulere embryonerte egg.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er det fremskaffet en fremgangsmåte hvor nevnte virus er et lentogent virus, for eksempel avledet fra et avirulent felt-tilfelle av NDV eller fra en vaksinestamme av NDV, så som LaSota-stammen av NDV. Videre er det fremskaffet en fremgangsmåte for å modifisere et fugleparamyksovirusgenom ved hjelp av genetisk modifikasjon som tillater introduksjonen av en eller flere mutasjoner, delesjoner og/eller innsetninger eller andre modifikasjoner. For eksempel er det mulig å svekke eller modifisere virulensen av fugleparamyksovirus ved å modifisere cDNA, for eksempel som koder for et viralt protein så som V-proteinet, og klone nevnte modifiserte cDNA i cDNA av full lengde og danne infeksjonsdyktige kopivirus fra nevnte fullengdede cDNA, for derved å danne nye NDV-stammer eller nye svekkede levende vaksiner med forbedrede egenskaper.

Ved siden av svekkelse av modifikasjonen av genprodukter, er det også mulig å svekke fugleparamyksovirus ved modifikasjon av nukleotidsekvenser som er involvert i transkripsjon og/eller replikasjon. Slike modifiseringer resulterer i svekkede stammer som uttrykker villtypelignende F-proteiner som er spaltbare både in vitro og in vivo i et bredt område av celler, og er som et resultat mer immunogene enn de klassiske vaksinestammer.

I en foretrukket utførelsesform er det mulig å svekke eller modifisere virulensen av et fugleparamyksovirus så som Newcastle Disease Virus, ved å modifisere et proteasespaltingssete av et viralt protein ved å modifisere cDNA som koder for nevnte spaltingssete, og videre å klone nevnte cDNA i genomisk lengdet cDNA av for eksempel Newcastle Disease Virus og danne infeksjonsdyktige kopier av Newcastle Disease Virus. Nevnte spaltingssete er for eksempel et proteasespaltingssete i F- eller HN-proteinet av Newcastle Disease Virus. Svekkelse er generelt begrenset til reduk-sjon av virulens, men det er nå også mulig å bruke en relativt a-virulent stamme av NDV og fremskaffe avkommet fra en slik stamme med øket virulens, for eksempel ved å utstyre den med en øket tendens til å replikere i en spesiell celletype. Det er nå således mulig å tilegne distinkte virulensattributter til NDV.

Det er også mulig antigent å modifisere fugleparamyksovirus så som et Newcastle Disease Virus omfattende å modifisere cDNA som koder for minst en del av et viralt protein som inneholder minst en immunodominant epitop, og ytterligere å klone nevnte cDNA i genomisk lengdet cDNA av Newcastle Disease Virus og danne infeksjonsdyktige Newcastle Disease Virus.

For eksempel er det mulig (ytterligere) å modifisere NDV, for eksempel å fremstille en infeksjonsdyktig kopi av NDV (vaksine) som har blitt beskrevet, hvor det fremstilles en rekombinant NDV markørvaksine, en markørvaksine som inneholder mest mulige eller nødvendige immunologiske spektrum av antigent relevante NDV-epitoper, og likevel er serologisk distinkt fra villtype NDV fordi en distinkt, serologisk relevant epitop eller markør har blitt fjernet ved rekombinante teknikker. Det er således mulig å modifisere den antigene struktur av fugleparamyksovirus så som NDV for således å tillate fremstilling av for eksempel en levende NDV-markørvaksine som kan bli serologisk adskilt fra fugleparamyksovirus feltstammer.

I en utførelsesform fremstilles infeksjonsdyktige NDV-kopier hvor HN-proteinet av NDV har blitt modifisert ved å rekombinere cDNA som koder for en del av nevnte HN-protein med cDNA som koder for en del av HN-protein avledet fra et fugleparamyksovirus, for eksempel type 2 eller type 4. Nevnte hybrid HN-protein virker som en serologisk markør for den infeksjonsdyktige NDV kopistamme således fremstilt eller kan virke til å endre tropien av fugleparamyksoviru-set eller andre celler og/eller vev. Disse såkalte markør-stammer tillater fremstilling av vaksiner som er et uunn-værlig verktøy for å påvise prevalensen av NDV i kommersielle flokker omkring i verden. Videre vil applikasjonen i stor skala av slike markørvaksiner føre til fullstendig ut-ryddelse av NDV ved en prosess av intensiv utvelgelse og fjerning av infiserte flokker.

Videre er det mulig å danne en infeksjonsdyktig NDV kopistamme som uttrykker ett eller flere antigener fra andre patogener og som kan bli brukt for å vaksinere mot flere sykdommer. Et slikt infeksjonsdyktig NDV kopivirus, som for eksempel omfatter et heterologt cDNA som koder for et heterologt protein fremstilt fra for eksempel fugleinflu-ensa (AI) (Hemaglutinim (H5 og H7) og Neuraminidase). Fugleleukosevirus (ALV) (env protein (gp85)), kyllinganemi-virus (CAV)(VP1+VP2), Mareks sykdomvirus (MDV)(glykoprotein B (gB), (gH), infeksjonsdyktige laringotrakeitisvirus (ILT)(gB, gH, gD), infeksjonsdyktige bursalsykdomvirus (IBDV)(VP2 og VP3), kalkunrinotrakeitisvirus (TRT)(fusjon (F)protein), fugleparamyksovirus -2, -3, -6 (PMV)(F-protein, hemaglutinin neuraminidase (HN) eller andre infeksjonsdyktige bronkittvirus (IBV)(peplomerprotein, nukleoprotein), reovirus (sigmaprotein), adenovirus pneumo-virus, salmonella enteritidis, kampylobakter jejuni, Esche-richia coli, Bordetella avium (tidligere Alcaligenes faeca-lis), Haemphilus paragallinarum, Pasteurelle multocida, Or-nithobacterium rhinotracheale, Riemerella (tidligere Pa-steurella) anatipestifer, Mycoplasmata (M. gallisepticum, M synoviae, M. mereagridis, M. iowae), eller Aspergilli (A. flavus, A. fumigatus).

Det kan herved dannes fugleparamyksovirus eller stammer avledet derav som kan bli brukt som en vaksinevektor for ekspresjonen av antigener fra andre fuglepatogener. Flere egenskaper gjør NDV til en ideell vaksinevektor for vaksinering mot respiratoriske eller intestinale sykdommer. 1) NDV kan lett bli dyrket til meget høye titre i embryonerte egg. 2) Massedyrking av NDV i embryonerte egg er relativt billig. 3) NDV-vaksiner er relativt stabile og kan enkelt bli administrert ved hjelp applikasjonsmetoder så som via drikkevannet eller ved spraying eller aerosolformulering 4) Den naturlige infeksjonsrute av NDV er via luftveiene og/eller tarmkanalen som også er de naturlige hovedruter for infeksjon av mange andre fuglepatogener. 5) NDV kan indusere lokal immunitet til tross for tilstedeværelsen av sirkulerende maternal antistoff.

Det har blitt vist at NDV har kraftige antineoplastiske så vel som immunstimulerende egenskaper (for en oversikt se Schirrmacher et al., 1998) [Schirrmacher, V., Ahlert, T., Steiner, H. -H., Herold-Mende, C, Gerhards, R. og Hagmtil-ler E. (1998) Immunization with virus-modified tumor cells. Seminars in Oncology 25: 677-696]. Selv om NDV ikke synes å være i stand til å replikere produktivt i nor-male humane celler, ble en selektiv NDV-mediert avliving av humane kreftceller merket. Etter lokal NDV-terapi ble viral onkolyse og fullstendige remisjoner av humane tumor-xenografter observert i nakne mus. Dette har ført til bruken av NDV for kreftterapi. Imidlertid er det et problem at slik applikasjon kan være begrenset til lokal behandling.

NDV-infeksjon induserer interferoner, kjemokiner og andre potensielt viktige genprodukter, og introduserer pleiotro-piske immunstimulatoriske egenskaper i tumorceller. Dette konsept har blitt brukt for fremstillingen av autologe tu-morcellevaksiner som består av ferskt opererte prøver som har blitt infisert med NDV. Denne type vaksine blir kalt autolog tumorvaksine-NDV eller ATV-NDV (Schirrmacher et al., 1998). De NDV-infiserte celler blir inaktivert med gammastråling, noe som forhindrer celledeling, men som likevel tillater replikasjon av NDV i cytoplasma hos infiserte celler. Etter inokulering av pasienter med ATV-NDV blir T-celler rekruttert via NDV-induserte kjemokiner. Enkelte av disse T-celler kan uttrykke en T-cellereseptor som kan reagere med peptider fra tumorassosierte antigener i kompleks med hovedhistokompatibilitetskompleks klasse 1 molekyler ved celleoverflaten. Denne interaksjon resulterer i induksjonen av en cytotoksisk T-cellerespons som resulterer i spesifikk dreping av autologe tumorceller.

Det er således mulig at repertoaret og mengden av kjemokiner og immunstimulatoriske proteiner indusert av NDV-infeksjon blir modulert. Det er således mulig å fremstille rekombinant NDV som har blitt modifisert for å inkorporere og uttrykke (a) heterologe gen(er). Slikt rekombinant NDV kan bli brukt for å modifisere repertoaret og mengden av immunstimulatoriske proteiner i infiserte celler. Slikt rekombinant NDV kan inkorporere og uttrykke gener som koder for humane interferoner, kjemokiner eller andre immunstimulatoriske proteiner. Nevnte rekombinante NDV kan bli brukt for fremstilling av ATV-NDV som er kraftigere enn konvensjonell ATD-NDV. For eksempel: cytokiner IFN-a,—p\ TNF-a, IL-1, IL-6; kjemokiner RANTES, IP-10; andre gener så som HSP, ACTH, endorfin, iNOS, EPA/TIMP, NFkB). De pleiotrope immunstimulatoriske egenskaper av NDV kan også bli brukt som en adjuvant for vaksinering av dyr og mennesker mot infeksjonsdyktige sykdommer.

I tillegg er det gitt en metode for å danne en kondisjonalt dødelig NDV delesjonsmutant som kan bli brukt som en selv-begrenset ikke-overførbar (bærer)vaksine. En NDV delesjonsmutant ble dannet som er ute av stand til å uttrykke matriseproteinet (M) som er involvert i knoppskyting av NDV ved den indre cellemembranen. Oppfinnelsen gir for eksempel en fenotypisk komplementert NDV-stamme som er ute av stand til å uttrykke M-proteinet som fremdeles er i stand til å infisere celler og spre seg ved hjelp av celle-til-celle-overføring. Imidlertid er mutantviruset ute av stand til å danne infeksjonsdyktig avkom på ikke-komplementerende celler. Dette viser at fenotypisk komplementerte NDV delesjonsmutanter kan bli brukt som sikre selvbegrensende vaksiner som er ute av stand til å spre seg inn i miljøet. En slik ikke-overførbar vaksine kombinerer den viktigste fordel, dvs. effektivitet med den viktigste fordel ved avlivede vaksiner, dvs. sikkerhet.

Oppfinnelsen gir Newcastle Disease Virus eller stammer avledet derav, for eksempel ved å passere eller ytterligere dyrke i embryonerte egg eller passende celler som er avledet fra infeksjonsdyktige kopivirus som kan oppnås ved fremgangsmåte gitt av oppfinnelsen.

For eksempel er NDV fremskaffet som har blitt modifisert i det minste på en måte for å danne infeksjonsdyktige Newcastle Disease Virus kopier som er svekket, modifisert i virulens, antigenisk modifisert, som uttrykker et heterologt antigen eller er ikke-overførbare eller kombinasjoner derav.

Med dette gir oppfinnelsen NDV-vaksiner som er særpreget for eksempel ved å bære distinkte virulensattributter eller distinkte antigene karakteristika, det være seg for markør-vaksineformål og/eller for å uttrykke heterologe antigener avledet fra andre patogener, det være seg i overførbar og/eller ikke-overførbar form.

En slik vaksine kan være en avlivet eller en levende vaksine. Foretrukket er en slik vaksine en levende vaksine, men avlivede vaksiner som gitt ved oppfinnelsen er gunstige under de forhold hvor en levende vaksine ikke er, eller er kun litt anvendbar, for eksempel på grunn av handelsbe-grensninger eller andre tilstander satt av sykdomskontrol-lerende myndigheter.

Oppfinnelsen gir nye og effektive vaksiner som kan bli serologisk adskilt fra feltvirus og andre gamle virustyper. Slike nye vaksiner, kalt NDV-markørvaksiner gir det størst mulige immunologiske spektrum av antigent relevante NDV-epitoper og er likevel serologisk distinkte fra villtype NDV ved å anvende medfølgende diagnostiske metoder og sett.

Oppfinnelsen gir en mulighet for å distingvere uvaksinerte dyr eller dyr vaksinert med en NDV-vaksine i henhold til oppfinnelsen fra dyr som er infisert med villtype NDV eller vaksinert med en umodifisert mesogen eller lentogen NDV-vaksinestamme omfattende å ta minst en prøve (så som serum, blod, egg eller øyevæske) fra nevnte dyr og bestemme i nevnte prøve tilstedeværelsen av antistoff rettet mot en immunodominant epitop eller markør uttrykt av nevnte villtype eller umodifiserte NDV, men ikke av en vaksine i henhold til oppfinnelsen.

Det kan benyttes antistoff som er rettet mot HN- eller F-proteinet av NDV, for eksempel et hybridprotein som beskrevet i den eksperimentelle del av foreliggende beskrivelse.

Det er eksempelvis mulig å benytte en enkel og rask hemag-lutineringsinhibering (HI)test benyttet for å skjelne mellom vaksinerte dyr og infiserte dyr. Dyr vaksinert med en markørvaksine hvor det fullstendige globulare hode av HN av NDV har blitt erstattet med den tilsvarende del av HN av en annen serotype vil ikke indusere antistoff mot HN av NDV og vil følgelig ikke inhibere hemaglutinering av erytocytter

med NDV-virioner.

Ved å bruke markørvaksinevirioner i HI-testen blir antistoff mot det hybride HN-protein påvist og kan bli brukt som et mål på effektiviteten av vaksinering. Som et alternativ blir en ELISA som påviser antistoff mot F-proteinet av NDV benyttet for å måle vaksineringseffektiviteten.

Ved siden av HI-testen kan et ELISA bli brukt for å bestemme tilstedeværelsen av antistoff mot HN av NDV. Anti-genet som skal benyttes i et slikt forsøk, er for eksempel HN av NDV som er uttrykt ved rekombinante DNA-teknikker eller et konservert peptid fra HN av NDV.

Et blokkerende ELISA kan også bli brukt. I dette tilfelle blir ett eller flere monoklonale antistoff mot konserverte epitoper av HN av NDV benyttet for å bestemme hvorvidt kon-kurrerende antistoff er til stede i prøver fra vaksinerte dyr. ELISA-testene kan fordelaktig bli brukt dersom mar-kørvaksinen inneholder et kimerisk HN-protein alene eller når et par epitoper av HN av NDV er erstattet.

Oppfinnelsen er ytterligere forklart i den eksperimentelle del av foreliggende beskrivelse.

EKSPERIMENTELL DEL

MATERIALER OG METODER

Standard kloningsprosesser ble utført ifølge Sambrook et al. (1989), hvis intet annet er nevnt. Alle konstruksjoner omfattende DNA-fragmenter som ble generert ved bruk av polymerase-kjedereaksjon (PCR), ble verifisert ved sekvensanalyse. I primersekvensene som oppgis i det følgende, tilsvarer de understrekede nukleotider NDV-sekvenser, og posi-sjonen i NDV-genomet oppgis. Nukleotidsekvensen med restriksjonsstillinger som ble brukt for kloning, oppgis med fet skrift.

Celler og viruser

CER-celler (Smith et al., 1976) ble dyrket i GMEM/EMEM (1:1) som inneholdt 5% føtalt kalveserum og 2% av en antibiotikablanding som inneholdt 1000 U/ml Penicillin, 1000 u.g/ml Streptamycin, 20 u.g/ml Fungizone, 500 u.g/ml Polymixin B og 10 mg/ml Kanamycin. QT35-celler (Moscovici et al., 1977; Cho, 1982) ble dyrket i medium levert av Gib-coBRL/Life Technologies (katalog-nr. 041-91536; patentert sammensetning fra Fort Dodge) supplementert med 5% FCS og 2% antibiotikablanding. QM5-celler (Antin og Ordahl, 1991) ble dyrket i M199-medium supplementert med 10% tryptosefos-fatkraft, 10% FCS og 2% antibiotikablanding.

NDV-stammen LaSota ble ervervet fra ATCC (ATCC VR-699), og ble passert to ganger i embryonerte egg. Før vi startet med konstruksjonen og kloningen av cDNA, ble viruset plakk-renset ved tre runder med plakkrensning på primære kyllingem-bryofibroblaster (CEF). Med dette formål ble viruset tit-rert på CEF-celler dyrket i GMEM/EMEM (1:1) som inneholdt 5% føtalt kalveserum, 2% antibiotikablanding, 5% allantoinvæske, 30 mM MgCl2, 200 u.g/ml DEAE-dekstran (Sigma) og 0,8% agar Nobel (Difco). Virus fra den tredje runde med plakk-rensing (benevnt klon E13-1) ble dyrket i embryonerte egg, og fire dager etter innpodingen, ble allantoinvæsken samlet og lagret i alikvoter ved -70°C. Rekombinant fjærfekopper-virus fpEFLT7pol (Britton et al., 1996; heretter benevnt FPV-T7), som uttrykker T7-RNA-polymerase, var en velvillig gave fra Dr. Michael Skinner, og ble dyrket på QT35-celler.

Isolasjon av viralt RNA

Alle manipulasjoner ble utført i RNase-frie glass- eller plastvarer, og alle oppløsninger ble dannet med RNase-fritt vann som var blitt behandlet med 1% dietylpyrokarbonat (DEPC) og sterilisert ved autoklavbehandling. Virus ble pelletisert fra allantoinvæske ved sentrifugering ved 21.000 rpm i 70 minutter i en Beckman SW40-rotor ved 4°C. Pelleten ble gjensuspendert i homogensiert buffer (50 rtiM Tris-HCl pH 7,5; 50 mM NaCl; 5 mM Edta; 0,5% SDS) og behandlet med Proteinase K (200 u,g/ml) i 90 minutter ved 37°C under konstant bevegelse. Lysatet ble ekstrahert to ganger med et likt volum fenol/kloroform (1:1) pH 5,4 og én gang med et likt volum kloroform. Det virale RNA ble felt fra den vandige fase ved tilsetning av 0,1 volumer 3M NaOAc pH 5,3 og 2,5 volumer 100% etanol. Felningen ble samlet ved sentrifugering, vasket én gang med 70% etanol, gjensuspendert i vann og lagret i alikvoter ved -70°C.

Revers transkripsjon

Viralt RNA (1,5 u.g) ble blandet med 500 ng primer i et volum på 12 u.1 og inkubert i 10 minutter ved 70°C. 4 u.1 5xRT-buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3; 375 mM KC1, 15 mM MgCl2; GibcoBRL/Life Technologies), 2 u.1 0,1M DTT og 2 u.1 10 mM dNTP'er (2,5 mM hver) ble satt til, og blandingen ble inkubert i 2 minutter ved 42°C. Revers transkripsjon ble utført i et endelig volum på 20 u-l ved tilsetning av 200 enheter revers transkriptase (Superscript II; GibcoBRL/Life Technologies) fulgt av inkubasjon i 60 minutter ved 42°C.

Polymerasekjedereaksjon ( PCR)

Alle PCR-reaksjoner som ble brukt for å bestemme 3'- og 5'-ende av NDV-genomet (se nedenfor) ble utført ved bruk av Taq-DNA Polymerase (Perkin Eimer). For kloning av enkelte NDV-gener eller store subgenomiske cDNAer ble enten korrek-turlesende DNA-polymerase PWo eller blandinger av Taq og Pwo (Expand High Fidelity Kit eller Expan Long Template Kit) brukt ifølge leverandørens anvisninger (Boehringer Mannheim). Alle prøvene ble inkubert i 2 minutter ved 94°C før starten av det oppgitte antall PCR-sykluser. Etter det angitte antall PCR-sykluser ble prøvene inkubert ved for-lengelsestemperaturen i minst 3x varigheten av forlengelsestiden av PCR-syklusen. PCR-fragmenter ble renset direkte ved bruk av High Pure PCR Product Purification Kit

(Boehringer Mannheim) eller etter agarosegelelektroforese ved bruk av QiaexlI-ekstraksjonssett (Qiagen) i det vesentlige som beskrevet av leverandørene.

Sekvensanalyse

Alle sekvenser ble bestemt ved bruk av PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Eimer). Reaksjonsblandinger (5 u.1) ble underkastet 25 sykluser med lineær amplifikasjon (10 sek. ved 94°C, 5 sek. ved 50°C og 4 min. ved 60°C) i en GeneAmp2400-termosykliserer. Deretter ble reaksjonsblandingene felt med etanol, vasket én gang med 70% etanol, gjensuspendert i 15 u-l TSR-buffer, vasket én gang med 70% etanol, gj ensuspendert i 15 u-l TSR-buffer (Perkin Eimer) og oppvarmet i 2 minutter ved 94°C før de ble fylt på en Applied Biosystems AB310 automatisk sekven-sierer.

Nukleotidsekvensene av primerne som ble brukt for å sekvensiere det fullstendige genom av NDV-stammen LaSota, ble enten avledet fra publiserte sekvenser eller fra sekvenser som ble fastslått under dette sekvensieringsprosjekt. Primerne vises i tabell 1.

Kloning og sekvensiering av 3'- og 5'- termini av genomet av NDV- stammen LaSota

Nukleotidsekvensen av 3'- og 5'-termini av NDV-genomet ble bestemt ved bruk av RACE-prosesser (rask amplifikasjon av cDNA-ender). NDV-RNA ble brukt i en revers transkripsjonsreaksjon i et endelig volum på 20 u-l ved bruk av primer p360 (5'- GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT-3'; nt 14756-14779) som ble avledet fra den publiserte sekvens av L-genet av NDV (Yusoff et al., 1987). Det enkeltkjedede DNA (2,5 ul av RT-blandingen) ble satt til 8 pmol ankerprimer ALG3 (5'-CACGA-ATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3') og ligert over natten ved romtemperatur i 20 u-l reaksjonsblanding som inneholdt 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM MgCl2, 10 ug/ml BSA, 25% PEG, 1 mM HCC, 20 U.M ATP og 10 enheter T4-RNA-ligase (New England Biolabs) som beskrevet av Tessier et al. (1986) . 1 [il av ligeringsreaksjonsproduktet ble brukt som sjablone i en PCR-reaksjon ved bruk av primerne p375 (5'-CAATGAAT TCAAAG-GATATTACAGTAACT-3'; nt 14964-14983) og ALG4 (4'-GAAGGATCCA-GAATCGAATAG-3'). Sistnevnte primer er komplementær med ankerprimeren ALG3. PCR-betingelsene (40 sykluser) var som følger: 1 min. ved 94°C; 1 min. ved 55°C; og 2 min. ved 72°C. PCR-produktene ble renset og klonet i T-vektor pBluescriptll-TSK (Ichihara og Kurosawa, 1993). Alternativt ble de rensede PCR-produkter behandlet med Klenow DNA-polymerase I for å danne butte ender, og klonet inn i HincII-stillingen av plasmidet pGEM4Z (Promega). 13 uavhengige kloner (8x pBluescriptll-TSK og 5x pGEM4Z) ble sekvensiert for å bestemme nukleotidsekvensen av 5'-ende av genomet av NDV-stammen LaSota. Nukleotidsekvensen av 3'-ende ble bestemt ved to uavhengige metoder. I metode I ble primeren ALG3 ligert til 3'-ende av det virale DNA ved bruk av T4-RNA-ligase som beskrevet av Schutze et al. (1995). Reak-sjonsblandingen (endelig volum 10 u.1) inneholdt 2,5 u.g NDV-RNA, 100 pmol ALG3, 1 u.1 10x T4-RNA-ligasebuf f er (500 mM Tris-HCl, pH 7,8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP), 1 u-l DMSO, 1 u-l 10 u-M heksaminkoboltklorid, 1 u,l RNasin (Promega) og 10 enheter T4-RNA-ligase (New England Biolabs). Blandingen ble inkubert over natten ved romtemperatur, og 5 U-l av ligeringsreaks jonsproduktet ble br8kt som sjablone i en revers transkripsjonsreaksjon ved bruk av ALG4 som primer. 1 u-l av RT-reaksj onsproduktet ble brukt i en PCR-reaksjon ved bruk av primerne ALG4 og p37 6 (5'-GAGCCTTA AGGAGCTGC TCGTACTG ATC-3'; nt 137-164), som ble avledet fra den publiserte sekvens av 3'-ende av NDV (Ishida et al., 1986). PCR-betingelsene var som beskrevet ovenfor for 5'-RACE. I metode II ble 3'- og 5'-ende av det virale NDV-RNA ligert med hverandre ved bruk av T4-RNA-ligase ved bruk av de samme betingelser som beskrevet ovenfor for metode I.

5 u-l av ligeringsblandingen ble brukt som sjablone i en revers transkripsjonsreaksjon ved bruk av primeren p360. 1 u-l av RT-reaksjonsproduktet ble brukt i en PCR-reaksjon ved bruk av primerne p375 og p376 og PCR-betingelsene som ble beskrevet ovenfor for 5'-RACE. PCR-produktene ble behandlet med Klenow-DNA-polymerase I for å danne butte ender og klonet inn i HincII-stillingen av plasmidet pGEM4Z (Promega). 10 uavhengige kloner (4 fra metode I og 6 fra metode II) ble sekvensiert for å bestemme nukleotidsekvensen av 3'-ende av genomet av NDV-stammen LaSota.

Konstruksjon av en transkripsjonsvektor

En transkripsjonsvektor med lavt kopitall ble konstruert ved bruk av plasmidet pOK12 (Vieira og Messing, 1991) som grunnleggende replikon. Plasmidet pOK12 ble spaltet med PvuII, og DNA-fragmentet som inneholdt replikasjonsopphavet og Kanamycin-resistens-genet, ble isolert. Dette DNA-fragment ble ligert til et Eco47III-Af111-fragment (Aflll-stillingen ble gjort butt ved bruk av Klenow-DNA-polymerase I) fra transkripsjonsvektor 2,0 (en snill gave fra Dr. Andrew Ball; Pattnaik et al., 1992). Fra det dannede plasmid slettet man et Xbal-Nhel-fragment for å eliminere så mange ensartede restriksjonsstillinger som mulig. Det dannede plasmid ble benevnt pOLTVS (fig. 1). Transkripsjonsvektoren pOLTV5 inneholder den T7-DNA-avhengige RNA-polymerasepromoter fulgt av ensartede Stul- og Smal-restriksjonsstillinger, det autokatalytiske ribozym fra hepatitis delta-virus (HDV) og transkripsjonstermineringssignalet fra bakterio-fagen T7. DNA-fragmenter som er klonet mellom Stul- og Smal-restriksjonsstillingene, kan transkriberes enten in vitro eller in vivo ved bruk av T7-RNA-polymerase. Etter transkripsjonen inneholder 5'-ende av de dannede transkripter to G-residuer som kodes for av plasmidet. Grunnet den autokatalytiske virkning av HDV-ribozymet tilsvarer 3'-ende av transkriptene det nøyaktige terminale nukleotid av det klonede DNA-fragment (Pattnaik et al., 1992).

Konstruksjon av minigenomplasmider

For å undersøke kravene til replikasjon og transkripsjon av NDV, ble minigenom-plasmider konstruert som inneholdt 3'-og 5'-terminale partier av NDV som flankerte et reportergen som erstattet alle NDV-gener (fig. 2). DNA-fragmenter som tilsvarte 3'- og 5'-terminale partier av NDV, ble generert ved hjelp av PCR ved bruk av Pwo-DNA-polymerase (30 sykluser; 15 sek. ved 94°C, 30 sek. ved 50°C og 30 sek. ved 72°C) og ved bruk av plasmider som inneholdt de ovennevnte 3'- og 5'-RACE-fragmenter som sjabloner (se ovenfor).

3'-parti (ntl-119) ble generert ved bruk av primerne 3UIT (5'- ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3', nt 1-27) og SEAP3 (5'-ATCGATACTGGTCAGCATG CIGGCAGAAGGCTIICICGS ' , nt 102-119). 5'-parti (nt 14973-15186) ble generert ved bruk av primerne SEAP5 (5'- GCATGCTGACCAGTATCGA TAT1ACAG1AACTG1GAC1 - 3', nt 14973-14990) og 5NDV (5'- ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACGA-3', nt 15158-15186). De to DNA-fragmenter ble sammenføyd i en overlappende PCR (overlappingen vises med kursive bokstaver i de ovenfor viste primersekvenser) ved bruk av primerne 3UIT og 5NDV. Det dannede DNA-fragment, som er et fusjons-produkt av 3'- og 5'-ende av NDV adskilt med 20 nukleotider, ble fosforylert ved behandling med T4-polynukleotid kinase og klonet i begge retninger inn i transkripsjonsplasmidet pOLTV5 (fig. 1), som ble spaltet med Stul og Smal, og defosforylert med kalvetarmfosfatase (Boehringer Mannheim). Til slutt ble SEAP-genet (som kodet for utsondret alkalifosfatase) isolert fra plasmidet pSEAP-Basic (Clontech) ved spaltning med SphI og Clal, og klonet mellom SphI- og Clal-stillingene mellom 3'- og 5'-ende av NDV. De dannede plasmider ble benevnt henholdsvis pOLTV535 og pOLTV553. In vivo- eller in vitro-transkripsjon ved bruk av T7-RNA-polymerase av plasmidet pOLTV535 gir opphav til antigenomisk RNA ([+]-RNA), mens transkripsjon av plasmidet pOLTV553 gir opphav til genomisk RNA ([-]-RNA).

Plasmidene pOLTV535N0 til -N5 og pOLTV553N0 til -N5 ble generert ved å innføre selvkomplementære oligonukleotider i Clal-stillingen plassert mellom SEAP-genet og 5'-ende av NDV i henholdsvis pOLTV535 og pOLTV553 (se fig. 2). Oligonukleotidene som ble brukt, var: NO: 5'-CGCGAGCTCG-3'; NI: 5'-CGCGAGSCTCG-3'; N2: 5'-CGCGAGCGCTCG-3'; N3: 5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; N4: 5'-CGCGAGCATGCTCG-3'; N5: 5'-CGCGAG-CASTGCTCG-3' (W = A eller T; S = C eller G).

Modifikasjon av T7- promoter i plasmidene pOLTV535 og pOLTV553

For å generere in vitro- eller in vivo-transkripter som inneholder de autentiske 5'- og 3'-terminale ender av NDV, ble T7-promoter i plasmidene pOLTV535 og pOLTV553 modifisert slik at transkripsjonen ville starte ved det første nukleotid av 3'- eller 5'-terminal ende av NDV.

Primere ble utviklet som inneholdt 1) en Bgll-restriksjons-stilling, 2) sekvensen av T7-promoter (vist i kursiv) som var modifisert slik at de to G-residuer i enden av T7-promoter var erstattet med et A-residuum, og 3) 3'- (nt 1-21) eller 5'-ende (nt 15164-15186) av NDV. Primerne BGL3F2 (5'-GATATGGCCATTCAGGCrTAArACGACTCACrATA ACCAAACAGAGAATCCGTGAG-3') og SEAP3 (se ovenfor) ble brukt for å generere et DNA-fragment som inneholdt den modifiserte T7-promoter og hele 3'-ende av NDV opptil starten av SEAP-genet i pOLTV535. På lignende måte ble et DNA-fragment generert som inneholdt den modifiserte T7-promoter og hele 5'-ende av NDV opptil enden av SEAP-genet i pOLTV553, ved bruk av primerne BGL5F2

(5'-GATATGGCCATTCAGGCrTAATACGACrCACTATA ACCAAACAAAGATTTGGT-GAATG-3') og SEAP5. De dannede fragmenter ble spaltet med henholdsvis Bgll og SphI (3'-ende) eller Bgll og Clal (5'-ende) og brukt til å erstatte Bgll-Sphl-fragmentet i pOLTV535 eller Bgll-Clal-fragmentet i pOLTV553. De dannede plasmider ble benevnt henholdsvis pOLTV735 og pOLTV753. Plasmidene pOLTV735N3 og pOLTV753N3 ble generert ved å inn-føre et selvkomplementært oligonukleotid (5'-CGCGAGCWGCTCG-

3'; W = A eller T) i Clal-stillingen plassert mellom SEAP-genet og 5'-ende av NDV i henholdsvis pOLTV735 og pOLTV753.

Konstruksjon av SEAP- reporterplasmider

Plasmidet pCIneoSEAP ble konstruert ved å klone et Xhol-Clal-fragment (Clal-stillingen ble gjort butt ved bruk av

Klenow-DNA-polymerase I) som inneholdt SEAP-genet fra plasmidet pSEAP-Basic (Clontech) mellom Xhol- og Smal-stillingene av den eukaryotiske ekspresjonsvektor pCIneo (Promega). Det sistnevnte plasmid inneholder humant cytomegalovirus

(hCMV)-promoter i tillegg til bakteriofag T7-promoter. For å undersøke og kvantifisere SEAP-ekspresjonen av transkripter generert fra kun T7-promoter, ble et annet plasmid konstruert, som manglet hCMV-promoter. Med denne hensikt ble hCMV-promoter slettet fra pCIneo ved delvis spaltning med Hindlll, fulgt av en fullstendig spaltning med Bglll. DNA-fragmentet (nt 756-5469 ifølge Clontech's nummerering) fra hvilket hCMV-promoter var blitt slettet, ble isolert, behandlet med T4-DNA-polymerase for å generere butte ender, og gjensirkularisert ved bruk av T4-DNA-ligase. Det dannede plasmid ble benevnt pCIneoD. Til slutt ble SEAP-genet isolert fra pSEAP-Basic i form av et MluI-AccI-fragment og klonet inn i pCIneoD mellom Mlul- og Clal-stillingene. Det dannede plasmid ble benevnt pCIneoD-SEAP.

Transfeksj oner

Celler ble podet i 24-brønners kulturskåler, dyrket over natten til 60-80% konfluens og infisert med en m.o.i. på 1 med FPV-T7 i 1 time ved 37°C. Cellene ble transfisert med 0,5 u.g minigenomplasmid-DNA ved bruk av 3 u.1 "LipofectAMINE" og OptiMem i det vesentlige som beskrevet av leve-randøren (GibcoBRL/Life Technologies). Etter inkubasjon i 4 timer (CER-celler) eller 16 timer (QM5-celler) ved 37°C ble cellene enten infisert md NDV ("Dutch" virulent isolat nr. 152608; 200 u-l pr. brønn) i 1 time med en m.o.i. på 5, eller latt være uinfisert. Podestoffet ble sugd ut og erstattet med 1 ml fullstendig medium, og cellene ble ytterligere inkubert ved 37°C.

For kotransfeksjoner ble celler dyrket i 6-brønners kulturskåler og infisert med FPV-T7 som beskrevet ovenfor. Cellene ble kotransfisert med 0,25 u.g minigenomplasmid-DNA, 0,4 u.g pCIneoNP, 0,2 u.g pCIneoP og 0,2 u.g pCIneoL(c) eller pCIneo ved bruk av enten 8 u.1 LipofectAMINE eller 9 u-l Fu-Gene6 (Boehringer Mannheim). For å generere infiserende virus, ble minigenomplasmidet erstattet med et transkrip-sjonsplasmid som inneholdt fullengdet NDV-cDNA.

Kvantifisering av SEAP- aktiviteten

Mengden SEAP som ble utsondret i mediet av transfiserte celler, ble målt i éngangs 96-brønners plater ved bruk av "Phospha-Light Chemiluminescent Reporter Assay for Secreted Alkaline Phosphatase"-settet i det vesentlige som beskrevet av leverandøren (Tropix). Kjemiluminescensen ble kvantifi-sert ved bruk av en væskescintillasjonsteller (Wallac 1450 mikrobeta PLUS).

Kloning og sekvensiering av cDNA' er som strakk seg over hele genomet av NDV- stammen LaSota

For å klone og sekvensiere hele genomet av NDV-stammen LaSota, ble store subgenomiske cDNA-kloner generert ved hjelp av RT-PCR og klonet inn i pGEM-T. Første kjedes cDNA-syn-tese ble utført ved bruk av primeren 3UIT som beskrevet ovenfor, og 1 u-l av RT-reaks jonsproduktet ble brukt i en PCR-reaksjon ved bruk av Expand Long Template PCR-settet (Boehringer Mannheim). PCR bestod av 5 sykluser med 10 sek. ved 94°C, 30 sek. ved 58°C og 6 min. ved 68°C, fulgt av 10 sykluser med 10 sek. ved 94°C, 30 sek. ved 58°C og 6 min. ved 68°C, hvor forlengelsestiden ved 68°C ble hevet med 20 sek. pr. syklus. PCR-fragmentene ble klonet i pGEM-T ved bruk av pGEM-T-klonesettet i det vesentlige som beskrevet av leverandøren (Promega). Ligeringsblandinger ble trans-formert inn i E. coli-stammen SURE II (Stratagene). To uavhengige RT-PCR-reaksjoner (A og B) ble utført, og hver gav et lignende sett cDNA-kloner. Nukleotidsekvensen av de sub-genomiske cDNA-kloner ble bestemt ved bruk av NDV-spesifikke primere (tabell 1) og ved hjelp av primere som flankerte innføyelsene. Etter sammenligning av nukleotidsekvensen av A- og B-rekken av kloner, ble gjenværende tvetydigheter løst opp ved sekvensiering av de relevante partier av en tredje uavhengig rekke cDNA'er (C-serien). Nukleotidsekvensen av NDV-stammen LaSota vises på fig. 3.

Konstruksjon av en fullengdet genomisk cDNA- klon av NDV

Full-lengdet NDV-cDNA ble satt sammen i transkripsjonsplasmidet pOLTVS ved bruk av pOLTV535 som utgangsplasmid. DNA-fragmentene ble føyd sammen ved overlappende partier ved bruk av vanlige restriksjonsenzymer som vist på fig. 4B. I en rekke klonetrinn ble et plasmid (benevnt p535-DI) konstruert som inneholdt nukleotidene 1-3521 og 12355-15186 holdt adskilt med en Clal-stilling som ble generert ved å føye sammen Clal-stillingene i posisjon 3521 og 12355. I en annen rekke kloningstrinn ble et plasmid (benevnt pGEM-B) konstruert som inneholdt deler av NDV-genomet omfattende nukleotidene 3521-12355 (Clal-fragment). For å forenkle kloningen ble det sistnevnte Clal-fragment merket med Chloramphenicol-resistens (Cm)-genet fra plasmidet pACYC184 (Chang og Cohen, 1978). Med denne hensikt ble Cm-genet isolert fra pACYC184 ved hjelp av PCR ved bruk av primerne

CAT-F (5'-GCGTACGTCTAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG-3') og CAT-R

(5'-GCTCTAGACGTACGACCCTGCCCTGAACCGACG-3'). PCR ble utført med Pwo-DNA-polymerase, og bestod av 30 sykluser med 30 sek. ved 94°C, 45 sek. ved 60°C og 60 sek. ved 72°C. Det dannede PCR-fragment ble spaltet med BsiWI og klonet inn i den ensartede BsiWI-stilling av pGEM-B, hvilket gav pGEM-B(CAT). Clal-fragmentet fra pGEM-B(CAT) ble klonet inn i den ensartede Clal-stilling av p535-DI, hvilket gav pNDFL(CAT). Til slutt ble Cm-genet fjernet fra dette plasmid ved spaltning med BsiWI fulgt av gjenligering og trans-

formasjon av E. coli-stammen DH5a. Det dannede plasmid ble benevnt pNDFL+ og inneholder hele NDV-cDNA-sekvensen klonet inn mellom T7-promoter og HDV-ribozymet i transkripsjonsplasmidet pOLTV5.

Kloning og ekspresjon av enkelte NDV- gener

DNA-fragmenter som inneholdt hver av NDV-LaSota-genene, ble generert ved hjelp av RT-PCR og klonet inn i pCIneo. Etter kloningen ble alle fragmenter sekvensiert ved bruk av primere som flankerte innføyelsene, og av genspesifikke primere. NP-gen: primer 386 (5'- GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAG-GTG-3', nt 40-69) ble brukt for revers transkripsjon. Primere 365 (5'-GTGTGAATTC CGAGTGCGAGCCCGAAG-3', nt 77-94) og 892 (5'-TTGCATGCCTGCA GGTCAGTACCCCCAGTC-3' , nt 1577-1593) ble brukt for PCR ved bruk av Pwo-DNA-polymerase. Den føl-gende PCR-profil (30 sykluser) ble brukt: 30 sek. ved 95°C, 40 sek. ved 65°C og 45 sek. ved 72°C. Det dannede DNA-fragment ble spaltet med EcoRI og klonet inn i pCIneo mellom EcoRI- og Smal-stillingene. Ekspresjon av NP ble verifisert i et immunoperoksidase-enkeltsjiktsassay (IPMA) som beskrevet av Peeters et al. (1992), ved bruk av monoklonalt antistoff 38 (Russell et al., 1983). P-gen: primer pRTl (5'-CA-AAGAATTC AGAAAAAAGTACGGGTAGAA-3', nt 17 94-1814) ble brukt for revers transkripsjon. Primerne pRTl og p2 (5'-GCAGTCTA-GA TTAGCCATTCACTGCAAGGCGC-3', nt 3053-3071) ble brukt for PCR ved bruk av Pwo-DNA-polymerase. Den følgende PCR-profil (30 sykluser) ble brukt: 30 sek. ved 95°C, 40 sek. ved 65°C og 60 sek. ved 72°C. Det dannede DNA-fragment ble spaltet med EcoRI og Xbal og klonet inn i pCIneo mellom EcoRI- og Xbal-stillingene. Ekspresjon av P ble verifisert i et IPMA ved bruk av monoklonalt antistoff 688 (Russell et al., 1983).

M-gen: primeren 3UIT (5'- ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3', nt 1-27) ble brukt for revers transkripsjon. Primerne NDV5M (5'-GGGTGCTAGC GGAGTGCCCCAATTGTGCCAA-3', nt 3268-3288) og NDV3M (5'-TCTCCCCGGG GCAGCTTATTTCTTAAAAGGAT-3', nt 4368-4389) ble brukt for PCR ved bruk av Expand High Fidelity-settet. PCR bestod av 10 sykluser med 15 sek. ved 95°C, 30 sek. ved 55°C og 2 min. ved 68°C, fulgt av 15 sykluser hvor forlengelsesperioden ved 68°C ble hevet med 20 sek. pr. syklus. Det dannede DNA-fragment ble behandlet med T4-DNA-polymerase for å danne butte ender, spaltet med Nhel og klonet inn i pCIneo mellom Nhel- og Smal-stillingene. Ekspresjon av M-proteinet ble verifisert i et IPMA ved bruk av monoklonalt antistoff 424 (Russell et al., 1983).

F-gen: primeren 3UIT (se ovenfor) ble brukt for revers transkripsjon. Primerne NDV5F (5'-ACGGGCTAGC GATTCTGGATCCCG-GTTGG-3', nt 4508-4526) og NDV3F (5'-ACTACCC GGGAAACCTTCGTT-CCTCAT-3', nt 6212-6231) ble brukt for PCR ved bruk av Expand High Fidelity-settet ved bruk av betingelsene som ble beskrevet ovenfor for M-genet. Det dannede DNA-fragment ble behandlet med T4-DNA-polymerase for å danne butte ender, spaltet med Nhel og klonet inn i pCIneo mellom Nhel-og Smal-stillingene. Ekspresjon av F-proteinet ble verifisert i et IPMA ved bruk av monoklonalt antistoff 8E12A8C3 (ID-DLO, avdeling av Avian Virology).

HN-gen: primeren 3UIT ble brukt for revers transkripsjon. Primerne NDV5HN (5'-GTAGGCTAGC AAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3', nt 6335-6354) og NDV3HN (5'-CGAGCCCGGG CCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3', nt 8205-8227) ble brukt for PCR ved bruk av Expand High Fidelity-settet ved bruk av betingelsene som ble beskrevet ovenfor for M-genet. Det dannede DNA-fragment ble behandlet med T4-DNA-polymerase for å danne butte ender, og etter spaltning med Xmal ble det klonet inn i pCIneo mellom den butt-gjorte (Klenow-DNA-polymerase) Nhel-stilling og Xmal-stillingen. Ekspresjon av HN-proteinet ble bekreftet i et IPMA ved bruk av monoklonalt antistoff 86 (Russell et al., 1983).

L-gen: L-genet ble isolert fra cDNA-klon pGEM-L7a (fig. 4A) ved spaltning med SacII og Sali. Før spaltning med Sali ble SacII-stillingen gjort butt ved behandling med T4-DNA-polymerase. Det dannede fragment ble klonet inn i pCIneo mellom den butt-gjorte (Klenow-DNA-polymerase) Nhel-stilling og Sall-stillingen. 5'-ikke-translatert parti mellom T7-promoter og ATG-startkodonet av L-genet inneholdt 2 ATG-kodoner utenfor rammen som eventuelt kunne forstyrre en riktig ekspresjon av L-proteinet. Derfor ble et nytt plasmid konstruert, hvor det første ATG manglet og hvor det andre ATG ble forandret til AAG ved PCR-mutagenese, som følger. Primerne

5LE(E) (5'- CAATGGA ATT CAAGGCAAAACAGCTCAA GGTAAATAATACGGG-3',

nt 8332-8374) og 3LE(B) (5'-GTGAATCT AGAATGCCGGATCCGTACGAA-TGC-3', nt 8847-8870) ble brukt i en PCR-reaksjon ved bruk av plasmidet pGEM-L7a (fig. 4) som sjablone. PCR ble utført ved bruk av Pwo-DNA-polymerase, og bestod av 30 sykluser med 30 sek. ved 94°C, 45 sek. ved 60°C og 60 sek. ved 72°C. Det dannede DNA-fragment ble spaltet med EcoRI og Xbal og klonet inn i pCIneo mellom EcoRI- og Xbal-stillingene, hvorved man dannet plasmidet pCIneoL(N). Deretter ble BsiWI-Sall-fragmentet fra pGEM-L7a, som inneholder resten av L-genet (nt 8852-15046), klonet inn i pCIneoL(N) mellom BsiWI- og Sall-stillingene, hvorved man genererte plasmidet pCIneoL(c). Fordi antistoffer mot L-proteinet ikke er til-gjengelig, kunne man ikke kontrollere ekspresjonen av L ved immunokj emi.

Innføring av en genetisk markør i F- genet

For å utvetydig vise at smittende virus kan genereres fra klonet fullengdet cDNA, ble en genetisk markør innført i F-genet ved hjelp av PCR-mutagenese. Med denne hensikt ble F-genet klonet ved bruk av to overlappende PCR-fragmenter. Det første PCR-fragment ble generert ved bruk av primerne NDV5F (se ovenfor) og primer F5R (5'- AAAGCGCCGCTGTCTCC - TCCCTCCAGATGTAGTCAC-3', nt 4859-4894). Residuene som vises med fet skrift, er endringer som ble innført i primeren for å forandre aminosyresekvensen av den proteolytiske spaltningsstilling mellom Fl og F2 fra stillingen som foreligger i NDV-LaSota-stammen (GGRQGR | L) til konsensusspaltnings-stillingen for virulente NDV-stammer (GRRQRR I F). Det andre PCR-fragment ble generert ved bruk av primerne F3F (5'-GGAGGAGACAGCGGCGCTTTATAGGCGCCA1TA1TGG - 3', nt 4875-4 911) og IV09 (5'-CTCTGTCGAC ACAGACTACCAGAACTTTCAC-3', nt 6246-6266). PCR ble utført med Pwo-DNA-polymerase, og bestod av 25 sykluser med 15 sek. ved 94°C, 30 sek. ved 55°C og 2 min. ved 72°C. De to overlappende PCR-fragmenter (overlappingen vises med kursive bokstaver i primersekvensen) ble føyd sammen i en andre PCR ved bruk av primerne NDV5F og IV09 og ved bruk av de samme PCR-betingelser. Det dannede fragment, som inneholder hele ORF av F-genet og som koder for en virulent konsensspaltningsstilling, ble spaltet med Nhel og Sali og klonet inn i pCIneo mellom Nhel- og Sall-stillingene, hvilket gav pCIneoF<wt>. StuI-Notl-fragmentet (nt 4646-4952) fra pCIneoF<wt> ble brukt for å erstatte det tilsvarende fragment i plasmidet p535-S, som var blitt konstruert ved å innføre Clal-Scal (nt 3521-10311) fra pGEM-B i p535-DI mellom Clal- og Scal-stillingene (se fig. 4C). Det dannede plasmid ble benevnt p535-S[Fwtc] . Et PCR-fragment som inneholdt Cm-resistensgenet fra pACYC184 (se ovenfor), ble klonet som et Xbal-fragment inn i den ensartede Xbal-stilling (posisjon 6172 i NDV-sekvensen) av plasmid p535-S [Fwtc] , hvilket gav plasmidet p535-S [Fwtc] Cm. Deretter ble det Cm-merkede Apal-Spel-fragment (nt 2285-8094) av dette plasmid brukt til å erstatte det tilsvarende fragment av fullengdet cDNA-klon pNDFL+. Til slutt ble Cm-genet fjernet fra dette plasmid ved spaltning med Xbal fulgt av resirkulasjon ved bruk av T4-DNA-ligase. Det dannede plasmid, som inneholder det genetisk merkede fullengdet NDV-cDNA, ble benevnt pNDFL+ [Fwt] .

Generering av stabilt transformerte cellelinjer som uttrykker enkelte NDV- gener

Plasmidene pCIneoNP, pCIneoP, pCIneoM, pCIneoF, pCIneoF<wt >og pCIneoHN ble brukt for å generere stabilt transformerte cellelinjer som uttrykker disse proteiner hver for seg. Da-gen før transfeksjonen ble CER-celler podet i 6 cm kulturskåler og inkubert over natten for å gi en konfluens på 60-80%. Cellene ble transfisert med 2 u.g plasmid-DNA ved bruk av 12 u.1 LipofectAmine og OptiMem i det vesentlige som beskrevet av leverandøren (GibcoBRL/Life Technologies). Etter 48 timer ble cellene trypsinbehandlet, og fortynninger ble podet i 10 cm kulturskåler i medium som inneholdt 500 U-g/ml G418 (Boehringer Mannheim). Hver 3. dag ble mediet erstattet med ferskt medium som inneholdt stigende (i trinn på 100 u.g/ml) mengder av G418, inntil man nådde en konsen-trasjon på 800 u.g/ml. Cellene ble holdt i medium som inneholdt 800 u-g/ml G418, og tre uker etter transfeksjonen, ble enkelte kolonier valgt og overført til 96-brønners kulturskåler. De klonede cellelinjer ble undersøkt for ekspresjon av det aktuelle NDV-gen ved bruk av et IPMA som beskrevet ovenfor for forbigående ekspresjonsundersøkelser.

Cellelinjer med egenekspresjon av NP, P, M eller F kunne identifiseres og isoleres. Vi klarte imidlertid ikke å generere cellelinjer som uttrykte HN-protein. Kanskje en iboende ekspresjon av HN er toksisk for cellene.

Generering av stabilt transformerte cellelinjer som uttrykker T7- RNA- polymerase

Genet som koder for T7-RNA-polymerase, ble isolert fra plasmidet pRT7NT (René van Gennip, ID-DLO, Department of Mammalian Virology) ved spaltning med EcoRI og Sali. Det dannede fragment inneholder T7-RNA-polymerasegen plassert bak bakulovirus-plO-promoter. DNA-fragmentet ble klonet inn i plasmidet pCIneoO mellom EcoRI- og Sall-stillingene, hvorved man genererte plasmidet pCIneol07. Plasmidet pCIneoO mangler T7-promoter, og ble avledet fra pCIneo ved spaltning med Nhel fulgt av en delvis spaltning med Seal, fylling av de klebrige ender med Klenow-DNA-polymerase og resirkularisasjon ved bruk av T4-DNA-ligase. Baculovirus-sekvensene ble fjernet fra pCIneol07 ved spaltning med EcoRI og PacI, fulgt av T4-DNA-polymerasebehandling for å generere butte ender, og resirkularisasjon. Det dannede plasmid ble benevnt pCIneo007. Ekspresjon av T7-RNA-polymerase ble verifisert ved kotransfeksjon av celler med pCIneo007 og pPRhOl. Det sistnevnte plasmid inneholder E2-protein av klassisk svinefebervirus klonet bak en T7-promoter og inneholdende en intern ribosominntredenstilling (René van Gennip, personlig meddelelse). Ekspresjon av E2 ble bestemt i et IPMA ved bruk av monoklonalt antistoff V4 (Wensvoort et al., 1986). Stabilt transformerte CER-cellelinjer som uttrykker T7-RNA-polymerase, ble generert og isolert som beskrevet ovenfor, unntatt at man brukte 10 cm kulturskåler og at cellene ble transfisert med 5 u.g pCIneo007-DNA og 25 u.1 LipofectAmine. For å undersøke enkelte cellelinjers ekspresjon av T7-RNA-polymerase, ble de transfisert med plasmidet pPRhOl, og ekspresjonen av E2 (som er avhengig av T7-RNA-polymerase) ble bestemt i et IPMA ved bruk av monoklonalt antistoff V4. Flere cellelinjer som uttrykte T7-RNA-polymerase, ble identifsert. Én cellelinje, som man nevnte CER-C9, ble brukt for påfølgende eksperimen-ter.

Kloning og ekspresjon av HN- gener og hybrid- HN- gener

Primeren 3UIT ble brukt for å syntetisere enkeltkjedet cDNA av NDV og fjærfe-paramyxovirus-serotype 2 og 4 (APMV2 og APMV4) som beskrevet ovenfor. Alle påfølgende PCR-reaksjoner ble utført ved bruk av 25 sykluser med 15 sek. ved 94°C, 30 sek. ved 55°C og 2 min. ved 72°C.

Hele det kodende parti av HN-genet av APMV2 ble isolert ved hjelp av PCR ved bruk av primerne IV03 (5'- GGGGGAATTC CCCAT-TCAATGAAGGGTCTAC-3') og IV05 (5'-GATCCCCGGG TCTTAAACCAGGCTT-CGCAATG-3'), som ble avledet fra sekvensen av HN-genet av APMV2 (GenBank-tilgangsnummer D14030). Hele det kodende parti av HN-genet av APMV4 ble isolert ved PCR ved bruk av primerne IV06 (5'-GGGGGAATTC TGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3') og IV08 (5'-ATTGCCCGGG GGGTAACTAATCAGGATCTCAG-3') som var avledet fra sekvensen av HN-genet av APMV4 (GenBank-tilgangsnummer D14031). De dannede PCR-fragmenter ble spaltet (enten direkte eller etter delkloning inn i pGEM-T) med EcoRI og Xmal og klonet inn i pCIneo mellom EcoRI- og Xmal-stillingene. De dannede plasmider ble benevnt henholdsvis pCIneoHN2 og pCIneoHN4.

Hybrider mellom HN-genet av NDV-stammen LaSota og HN-genene av APMV2 og -4 ble konstruert ved hjelp av overlappings-PCR som følger. Det N-terminale parti (aa 1-141) av HN-genet fra NDV-stammen LaSota ble amplifisert med Pwo-DNA-polymerase ved bruk av primerne IV01B (5'- GTAGGAATTC AAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3', nt 6325-6354) og IV10 (5'- AATGAGTTCTTTGCCTATC - CCCCC- <3>\ nt 6811-6834). Det C-terminale parti av HN-genet av APMV2 (aa 142-580) ble amplifisert med Pwo-DNA-polymerase ved bruk av primerne IV11B (5'- GGGGGGATAGGCAAAGAACTCA-T TCAAGGAGATGCATCTGCAGGC-3') og IV05. De dannede PCR-fragmenter ble føyd sammen i en overlappings-PCR (overlappingen vises med kursiv) ved bruk av primerne IV01B og IV05 og ved bruk av Expand High Fidelity-enzymblandingen. Det dannede PCR-fragment ble spaltet (enten direkte eller etter delkloning inn i pGEM-T) med EcoRI og Xmal og klonet inn i pCIneo mellom EcoRI- og Xmal-stillingene. Det dannede plasmid, som inneholder et hybrid-HN-gen som består av 1-141 av NDV og aa 142-580 av APMV2, ble benevnt pCIneoHNl/2<141>.

Det C-terminale parti av HN-genet av APMV4 (aa 143-569) ble amplifisert ved bruk av primerne IV14B (5'- GGGGGGATAGGCAAA-GAACrCAr TGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') og IV08. Dette fragment ble føyd til det N-terminale parti av HN-genet av NDV (se ovenfor) i en overlappings-PCR ved bruk av primerne IV01B og IV08. Det dannede PCR-fragment ble spaltet (enten direkte eller etter delkloning inn i pGEM-T) med EcoRI og Xmal og klonet inn i pCIneo mellom EcoRI- og Xmal-stillingene. Det dannede plasmid, som inneholder et hybrid-HN-gen som består av aa 1-141 av NDV og aa 143-569 av APMV4, ble benevnt pCIneoHNl/4<141>.

Analogt med de ovenfor viste konstruksjoner, ble hybride HN-gener konstruert som bestod av aa 1-143 av NDV og aa 144-580 av APMV2, eller aa 1-143 av NDV og aa 145-569 av APMV4. For disse konstruksjoner ble PCR-fragmenter erholdt ved bruk av de følgende primerpar: NDV aa 1-143: primere IV01B og IV13 (5'- ATCTACAATGAGTTCTTTGCCTATC - 3', nt 6816-6840); APMV2 aa 144-580: primer IV14B (5'- GGGGGGATAGGCAAA-GAACTCATTGTAGA TGA1GCATC1GCAGGCCTAAA111CC - 3') og IV05; APMV4 aa 145-569: primer IV15B (5'- GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGA-TCAAACAGCTGACTACACAGCAG-3') og IV08. PCR-fragmentene ble spaltet (enten direkte eller etter delkloning inn i pGEM-T) med EcoRI og Xmal og klonet inn i pCIneo mellom EcoRI- og Xmal-stillingene. De dannede plasmider ble benevnt henholdsvis pCIneol/2<143> og pCIneol/4<143>. For å undersøke ekspresjonen av HN-proteinene, ble CER-celler eller QM5-celler infisert med FPV-T7 i 1 time ved en m.o.i. på 1, transfisert med plasmidene pCIneoHN, pCIneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHN1/2<141>, pCIneoHNl/2<143>, pCIneoHNl/4<143> og pCIneoHNl/4<143>, og 24 timer etter transfeksjonen ble monosjiktene dekket med en 1% suspensjon av kylling-erytrocytter i PBS i 45 minutter ved romtemperatur. Deretter ble monosjiktene forsiktig vasket tre ganger med PBS, og adhesjonen av erytrocytter til transfiserte celler ble undersøkt mikroskopisk. For å undersøke induksjonen av cellefusjon etter koekspresjon av HN- og F-protein, ble CER-celler eller QM5-celler kotransfisert med pCIneoF<wt> sammen med enten pCIneo-HNl, pCneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHNl/2<141>, pCIneoHNl/4141, pCIneoHNl/2<143> eller pCIneoHNl/4<143>. Etter inkubasjon i 2-3 dager, ble monosj iktene vasket med PBS, farget i 15 minutter med en Giemsa-oppløsning (1:30 fortynning i vann) og undersøkt mikroskopisk.

Kloning av hybrid- HN- gener i fullengdet genomisk NDV- cDNA

Et syntetisk bindeledd benevnt HN12 ble innført mellom Noti- og Spel-stillingene av pGEM-T (Promega) ved bruk av oligonukleotidene HN12a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGACTTA-3') og HN12b (5'-CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3'). Et syntetisk bindeledd benevnt HN14 ble innført mellom Noti- og Spel-stillingene av pGEM-T ved bruk av oligonukleotidene HN14a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3') ogHN14b (5'-CTAGTC-GTTAACTCTAGAATATGC-3'). De dannede plasmider ble benevnt henholdsvis pGEM-HN12 og pGEM-HN14. Disse plasmider ble spaltet med Noti og Xbal og brukt til å klone Notl-Spel-fragmentet (nt 3390-7488) fra plasmidet p535-S[Fwtc] Cm. De dannede plasmider ble benevnt henholdsvis pGEM-HNl/2NS og pGEM-NHl/4NS. HN-genene av disse plasmider ble erstattet med hybrid-HN-genene fra henholdsvis plasmid pCIneoHNl/2<143 >og pCIneoHNl/4<143> (se avsnitt "Kloning og ekspresjon av HN-gener og hybride HN-gener"). Med denne hensikt ble pCIneoHNl/2<143> og pCIneoHNl/4<143> spaltet med Nhel og Smal, og de dannede fragmenter (som inneholdt hybrid HN1/2<143-> og hybrid HNl/4<143->gen) ble klonet inn mellom Nhel- og Hpal-stillingen av plasmidene pGEM-HNl/2NS og pGEM-HNl/4NS, hvorved man

dannet henholdsvis pGEM+HNl2 og pGEM+HNl4. De sistnevnte

plasmider ble brukt til å innføre de hybride HN-gener inn i fullengdet genomisk cDNA-klon av NDV. Med denne hensikt ble plasmidene pGEM+HN12 og pGEM+HN14 spaltet med Noti og Spel, og fragmentet som inneholdt enten HN12- eller HN14-gen, ble brukt for å erstatte det tilsvarende fragment av pNDFL+, hvilket gav henholdsvis pNDFL+HNl/2<143->Cm og pNDFL+HNl/4143-Cm. Cm-genet ble fjernet fra disse plasmider ved spaltning med Xbal, fulgt av resirkularisasjon ved bruk av T4-DNA-ligase. For å oppfylle "rule-of-six", ble et bindeledd inn-ført i den ensartede Spel-stilling av disse plasmider ved bruk av selvkomplementære oligonukleotider. Bindeleddet H2 (5'-CTAGCGAGCGCTCG-3') ble innført i plasmid pNDFL+HNl/2<143>, og bindeledd H3 (5'-CTAGCGAGCWGCTCG-3') ble innført i pNDFL+HNl/4<143>, hvilket gav henholdsvis plasmidet pNDFL+HNl/2143 (H2) og pNDFL+NHl/4<143> (H3) .

Eliminering av en spesifikk epitop i HN- proteinet av NDV-LaSota

En spesifikk epitop, nemlig aminosyrene 346-354 (PDEQDY-QIR), i HN-proteinet av NDV-LaSota som gjenkjennes av MAb 4D6 (Long et al., 1986; Meulemans et al., 1986), ble elimi-nert ved å erstatte denne sekvens med den tilsvarende sekvens av HN-proteinene av enten APMV-2 (NRTDIQQTI) eller APMV-4 (PDPLQDQIL). Med denne hensikt ble plasmidet pCIneoHN (se avsnitt "Kloning og ekspresjon av enkelte NDV-gener) brukt som sjablong for å danne overlappende PCR-fragmenter. For APMV-2-sekvensen ble det første PCR-fragment generert ved bruk av primerne IV01 (5'-GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCA-AT-3') og primer 3HN2 (5'-GATAGTTTGCTGTATATCAGTCCGATTGCATG-TGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3'). Det andre PCR-fragment ble generert ved bruk av primerne 5HN2 (5'-AATCGGACTGATATACAGC-AAACTATCATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') og NDV3-HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3'). De dannede fragmenter ble slått sammen og brukt som sjablone for et tredje PCR-fragment ved bruk av primerne IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGAGG-CCGCCCCTCAAT-3') og primer NDV3-HN. For APMV-4-sekvensen ble det første PCR-fragment generert ved bruk av primerne IV01 og primer 3NH4 (5'-TAAGATCTGATCTTGCAGCGGGTCAGGGCATGTG-TCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3'). Det andre PCR-fragment ble generert ved bruk av primerne 5HN4 (5'-CCTGACCGCTGCAAGATCA-GATCTTAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') og NDV3-HN. De dannede fragmenter ble slått sammen og brukt som sjablong for et tredje PCR-fragment ved bruk av primerne IV01B og NDV3-HN. Primerne 3HN2/5HN2 og 3HN4/5HN4 er delvis komplementære, og inneholder den genetiske kod for henholdsvis HN2-sekvensen (NRTDIQQTI) og HN4-sekvensen (PDPLQDQIL). PCR-reaksjonene ble utført ved bruk av Expand Long Template-PCR-settet (Boehringer Mannheim). PCR bestod av 30 sykluser med 10 sek. ved 94°C, 30 sek. ved 58°C og 2 min. ved 68°C, fulgt av 1 syklus med 4 min. ved 68°C. PCR-fragmentene ble spaltet med EcoNI og Bsu36l og klonet inn mellom EcoNI- og Bsu36l-stillingene av pCIneoHN. De dannede plasmider ble benevnt henholdsvis pCIneoHNl(HN2e) og pCI-neoNl(HN4e). Forbigående ekspresjonsundersøkelser tydet på at de modifiserte HN-proteiner ble uttrykt riktig og trans-portert til celleflaten, ifølge bedømmelser av hemadsorp-sjonsstudier ved bruk av kyllingerytrocytter. Videre rea-gerte Mab 6D4, som er rettet mot en lineær epitop av HN av NDV og som består av (eller i det minste omfatter) aminosyrene 346-354, ikke med de modifiserte HN-proteiner. Plasmidene pCIneoHNl(HN2e) og pCIneoHNl(HN4e) ble spaltet med Narl og Spel, og fragmentene som inneholdt de modifiserte HN-gener, ble klonet inn mellom Narl- og Spel-stillingen av henholdsvis pGEM-HNl/2NS og pGEM-HNl/4NS. De dannede plasmider, benevnt pGEM-HNl(HN2e) og pGEM-HNl(HN4e), ble spaltet med Noti og Spel og brukt til å erstatte Notl-og Spel-fragmentet i pNDFL+. De dannede plasmider ble benevnt henholdsvis pNDFL-HN(HN2e)Cm og pNDFL-HN(HN4e)Cm. Cm-genet ble fjernet fra disse plasmider ved spaltning med Xbal fulgt av gjenligering. De dannede plasmider ble benevnt henholdsvis pNDFL-HN(HN2e) og pNDFL-HN(HN4e).

RESULTATER

Nukleotidsekvens av 3'- og 5'- terminal ende av genomet av NDV- stammen LaSota

Sekvensen av en tenkt 3'-ende av NDV-genomet er blitt publisert (Ishida et al., 1986), selv om denne stammet fra en annen NDV-stamme (D26) enn den som ble brukt her (LaSota). Yusoff et al. (1987) har publisert en sekvens av L-genet og et relativt stort ikke-kodende parti bak L-genet av NDV-stammen Beaudette C. Imidlertid, slikt det vises heri, om-fattet denne sekvens ikke hele den terminale 5'-ende av det virale genom, hvilket gjør det umulig å generere smittende kopi-NDV. 3'- og 5'-terminale ender av genomet av negativ-kjede-RNA-viruser ivaretar en vesentlig funksjon ved replikasjon og transkripsjon (Lamb og Kolakofsky, 1996) . Dermed er det for å generere et fullengdet NDV-cDNA som kan brukes for å generere smittende virus ved hjelp av revers genetikk (Conzelmann, 1996), absolutt nødvendig å innlemme de riktige 3'- og 5'-ender av det virale genom. Derfor bestemte vi den nøyaktige nukleotidsekvens av både 3'- og 5'-ende av genomisk RNA av NDV-stammen LaSota ved bruk av 3'- og 5'-RACE-prosedyrer (rask amplifikasjon av cDNA-ender). 5'-ende ble isolert ved hjelp av PCR etter ligering av en enkeltkjedet ankerprimer (ALG3) til enkeltkjedet cDNA som var blitt generert ved revers transkripsjon av 5'-ende av genomisk RNA. Ved bruk av en primer (ALG4) som er komplementær med ankerprimeren og en NDV-spesifikk primer, genererte man PCR-produkter som inneholdt 5'-ende.

For å klone 3'-ende av NDV ble den enkeltkjedede ankerprimer ALG3 ligert med 3'-ende av viralt RNA ved bruk av T4-RNA-ligase og amplifisert ved PCR ved bruk av primeren ALG4 og en NDV-spesifikk primer (metode I). Alternativt ble 3'-og 5'-ende av NDV-RNA ligert med hverandre ved bruk av T4-RNA-ligase, og det dannede sammenkjedede RNA ble brukt for RT-PCR ved bruk av NDV-spesifikke primere som flankerte li-geringspunktet (metode II). 3'- og 5'-RACE-produkter ble klonet inn i T-vektor pBluescriptll-TSK (Ichihara og Kurosawa, 1993) eller i pGEM4Z, og flere uavhengige kloner ble isolert og sekvensiert. Resultatene er satt sammen i tabell 2. For å muliggjøre en direkte sammenligning av 3'- og 5'-terminal ende, vises sekvensene i form av DNA, og 3'-ende av den genomiske kjede representeres som 5'-ende av den antigenomiske kjede. På genomis RNA-nivå er sekvensen av 3'-ende 3'-UGGUUUGUCUCUUAG, mens sekvensen av 5'-ende er UUUA-GAAACAAACCA-5'. Sekvensen av 3'-ende er nesten lik den publiserte 3'-terminale sekvens av NDV-stammen D26 (Ishida et al., 1986). Imidlertid viste sekvensen av 5'-ende at NDV-stammen LaSota inneholder 64 ytterligere nukleotider sammenlignet med den publiserte sekvens av L-genet av NDV-stammen Beaudette C (Yusoff et al., 1987) (fig. 6).

Replikasjon av NDV- minigenomer ved hjelp av hjelpervirus

For å bestemme om 3'- og 5'-ende av NDV er funksjonelle ved replikasjon og transkripsjon, ble minigenomer konstruert som bestod av 3'-ende av NDV (nt 1-119), et reportergen som kodet for utsondret alkalifosfatase (SEAP), og 5'-ende av NDV (nt 14973-15186) (fig. 2). Disse minigenomer ble klonet i begge retninger i transkripsjonsvektoren pOLTV5, hvorved man genererte henholdsvis plasmidet pOLTV535 og pOLTV553 (for detaljer om konstruksjonen, se "Materialer og metoder") . Plasmidet pOLTV5 (fig. 1) inneholder T7-RNA-polymerasepromoter fulgt av ensartede Stul- og Smal-restriksjons-posisjoner, det autokatalytiske ribozym fra hepatitt delta-virus (HDV) og transkripsjonstermineringssignalet fra bak-teriofagen T7 (Pattnaik et al., 1992). In vivo- eller in vitro-transkripsjon ved bruk av T7-RNA-polymerase av plasmidet pOLTV535 fører til antigenomisk RNA (eller [+]-RNA), mens en transkripsjon av plasmidet pOLTV553 gir opphav til genomisk RNA (eller [-]-RNA) (fig. 5).

For å undersøke om minigenom-RNA'ene som genereres av plasmidene pOLTV535 og pOLTV553, kunne replikeres og uttrykkes ved bruk av NDV som hjelpervirus, brukte vi CER-celler som uttrykte T7-RNA-polymerase enten av seg selv (CER-C9-celler, se "Materialer og metoder") eller etter infeksjon med fjærfekopper rekombinant fpEFLT7pol (Britton et al., 1995; heretter benevnt FPV-T7) som uttrykker T7-RNA-polymerase. CER-C9-celler og FPV-T7-infiserte CER-celler ble transfisert med minigenomplasmidene pOLTV535 eller pOLTV553, og etter inkubasjon i 3 timer ved 37°C ble cellene enten infisert med NDV i 1 time, eller fikk forbli uinfiserte. Omtrent 24 timer etter transfeksjonen tok man en prøve fra mediet og testet for SEAP-aktivitet. Resultatene viste at SEAP-ekspresjonen var meget høy i FPV-T7-infiserte celler som ble transfisert med pOLTV535. Dette er ikke overraskende, siden transkripsjon med T7-RNA-polymerase genererer antigenomisk [+]-RNA som er bemantlet med fjærfekopper-enzymer og som virksomt translateres av vertcellen. I celler som er transfisert med pOLTV553, genererer en transkripsjon med T7-RNA-polymerase genomisk [-]-RNA, som må omdannes til [+]-RNA ved hjelp av hjelpervirus for å kunne translateres til SEAP-protein (jfr. fig. 5). I ingen av tilfellene kunne man observere noen hevet SEAP-ekspresjon i NDV-infiserte celler sammenlignet med ikke-infiserte celler. Tvert imot, var SEAP-ekspresjonen i NDV-infiserte celler konsekvent ca.

2 ganger lavere enn i ikke-infiserte celler (resultater ikke vist). For pOLTV535-transfiserte celler kan dette for-klares med det allerede meget høye nivå av SEAP-ekspresjonen som forårsakes av transkripter som er generert av T7-

RNA-polymerase. I pOLTV553-transfiserte celler derimot, hvor en virksom ekspresjon av SEAP er avhengig av det virale polymerasekompleks' omdannelse av genomisk [-]-RNA til antigenomisk [+]-RNA eller mRNA, hadde vi forventet en hevet SEAP-ekspresjon etter NDV-infeksjonen.

Vi kunne tenke oss to grunner til at minigenomene ikke ble uttrykt og replikert av NDV. For det første tilsvarer stør-relsen av minigenom-RNA'ene ikke den såkalte "rule-of-six"

(Calain og Roux, 1993; Kolakofsky et al., 1998). Ifølge denne regel replikeres paramyxovirus-genomer kun virksomt hvis de har en lengde som kan deles med 6 nt. For det andre kan de to ekstra G-residuer som foreligger i 5'-ende av minigenom-RNA 'ene, kanske forstyrre en korrekt replikasjon og/eller transkripsjon ved hjelp av det virale polymerasekompleks. For å finne ut om replikasjonen av genomene var avhengig av "rule-of-six", innføyde vi en rekke korte selvkomplementære oligonukleotider som økte 1 nt i størrelse, i den ensartede Clal-stilling i plasmidene pOLTV535 og pOLTV553 (fig. 2). De dannede plasmider (pOLTV535N0 til -N5 og pOLTV553N0 til -N5) skiller seg i størrelse fra 1 til 6 nt, og derfor burde ett av dem generere et minigenom-RNA som oppfyller "rule-of-six". Plasmidene ble brukt til å transfisere CER-celler eller FPV-T7-infiserte CER-C9-celler som beskrevet ovenfor. Resultatene viste at kun plasmidene

pOLTV535N3 og pOLTV553N3 førte til en forsterket SEAP-aktivitet etter NDV-infeksjon. Lengden av minigenom-RNA'ene som genereres fra disse plasimer med T7-RNA-polymerase, ble beregnet å være 6n+2. Fordi det foreligger 2 ekstra G-residuer i 5'-ende av minigenom-RNA'ene, tyder disse resultater at bare størrelsen av RNA-sekvensen som ligger mellom den autentiske 3'- og 5'-ende av minigenom-RNA'ene, er relevant for "rule-of-six". Dette ble verifisert ved å konstruere minigenomplasmider hvor transkripsjonsstarten av T7-RNA-polymerase ble endret slik at det første nukleotid som ble innlemmet i RNA, var det første nukleotid av 3'- eller 5'-ende av NDV (se "Materialer og metoder"). Transfeksjon av disse plasmider viste at kun minigenom-RNA'er generert med

plasmidene pOLTV735N3 og pOLTV753N3 replikeres av hjelper-viruset (resultater ikke vist). Disse funn tyder igjen på at replikasjonen av NDV er strengt avhengig av "rule-of-six". Videre tyder disse funn på at nærværet av to ekstra G-residuer i 5'-ende av minigenom-RNA'ene ikke forstyrrer en korrekt replikasjon. Lignende resultater er blitt erholdt med minigenomplasmider (eller DI-plasmider) fra andre paramyxoviridae (Pattnaik et al., 1992; Harty og Palese, 1995).

Innpakking av NDV- minigenomer med hjelpervirus

For å bestemme om minigenom-RNA'er kunne innpakkes med NDV-hjelpervirus, ble mediet av de transfiserte celler overført til ferske monosjikt, og etter 1 times adsorpsjon ble monosj iktene vasket tre ganger med PBS og ytterligere inkubert i fullstendig medium. Etter 24 timers inkubasjon ble SEAP-aktiviteten i mediet målt. Resultatene viste at SEAP-aktivitet kun forelå i celler som var blitt behandlet med mediet fra celler som var blitt transfisert med minigenomplasmidet pOLTV553N3 (tabell 4). Dette funn tyder på at minigenom-RNA 'ene kan pakkes inn i NDV-omhyllinger, og at disse partikler har evnen til å infisere celler. Videre viser disse resultater at innpakkingen er uavhengig av replikasjon, hvilket viser at kun RNA-molekyler som er komplek-sert med virale NP-, P- og L-proteiner, pakkes inn i virus-lignende partikler.

Replikasjon av NDV- minigenomer med plasmider som uttrykker NP-, P- og L- protein

For å bestemme om minigenom-RNA'er også kunne replikeres med plasmider som koder for de vesentlige NP-, P- og L-proteiner, utførte vi kotransfeksjonseksperimenter i celler som var infisert med FPV-T7. Celler ble transfisert med en kombinasjon av plasmider omfattende minigenomplasmidet og henholdsvis plasmid pCIneoNP, -P og -L(c). Som negativkontroll ble pCIneoL(c), som koder for det vesentlige L-protein, erstattet med vektorplasmidet pCIneo. Resultatene (tabell 5) viser at plasmider som koder for NP, P og L, faktisk har evnen til å replisere minigenom-RNA'er. Resultatene viser også at på lignende måte som minigenomreplika-sjonen med hjelpervirus, er også replikasjonen med NP-, P-og L-proteiner avhengig av "rule-of-six".

Nukleotidsekvens av det fullstendige genom av NDV- stammen LaSota

Sub-genomiske cDNA-fragmenter som strekker seg over hele NDV-genomet, ble konstruert ved hjelp av RT-PCR (fig. 4). For å holde antallet PCR-feil på et minimum, brukte man en korrekturlese-enzymblanding (Expand Long Template; Boehringer Mannheim) i kombinasjon med et begrenset antall PCR-sykluser (15 sykluser). Primeren 3UIT, som er komplementær med 3'-ende av NDV-RNA, ble brukt for revers transkripsjon, og genspesifikke primere ble brukt for PCR. For å identifi-sere mulige PCR-feil, ble tre uavhengige RT-reaksjoner ut-ført og brukt for å generere tre uavhengige sett subgenomiske cDNA'er. cDNA'ene, som hadde varierende størrelse fra ca. 4 til 7 kb, ble klonet inn i pGEM-T. Nukleotidsekvensen av to sett cDNA'er ble bestemt ved bruk av primere som enten ble avledet fra publiserte NDV-sekvenser, eller av primere avledet fra NDV-sekvensen som ble avledet under foreliggende sekvensieringsprosjekt (tabell 1). Gjenværende tvetydigheter ble løst opp ved sekvensiering av de relevante partier av det tredje sett cDNA-kloner. Genomet av NDV-stammen LaSota består av 15186 nt (fig. 3), hvilket gjør det til det minste av alle paramyxovirusgenomer som hele sekvensen er blitt bestemt for til idag (Kolakofsky et al., 1998).

Konstruksjon av fullengdet NDV- cDNA- klon i transkripsjonsplasmidet pOLTV5

For å konstruere fullengdet cDNA-klon av NDV-stammen LaSota, ble overlappende cDNA-kloner som strakk seg over hele

NDV-genomet, føyd sammen i felles restriksjonsstillinger i henhold til strategien som vises på fig. 4. Hele NDV-cDNA ble satt sammen i minigenomplasmidet pOLTV535 (se ovenfor), som er avledet fra transkripsjonsplasmidet pOLTV5. Slik det fremgår av fig. 4B, var det siste trinn i sammenføyningen av fullstendig NDV-cDNA en kloning av et ca. 8,8 kb stort Clal (nt 3521-12355) fragment fra pGEM-B inn i p535-DI som inneholdt NDV-sekvenser som flankerte Clal-stillingen på hver side (dvs. henholdsvis nt 1-3521 og 12355-15186). Dette trinn viste seg å være nokså vanskelig fordi vi gjen-tatte ganger feilet i å generere de riktige kloner. Derfor ble Clal-fragmentet av pGEM-B merket med kloramfenikolre-sistens (Cm)-gen fra plasmidet pACYC184. Clal-fragmentet som inneholdt Cm-genet, ble isolert og klonet inn i Clal-stillingen av p535-DI, og transformanter ble valgt for resistens mot begge Cm. Fordi transformantene vokste dårlig, ble det antibiotiske utvalg redusert til 15 u.g/ml Cm og 10 u.g/ml Km, og inkubas jonstemperaturen ble nedsatt fra 37 °C til 32°C. Til slutt ble Cm-genet fjernet fra dette plasmid ved spaltning med BsiWI fulgt av resirkularisasjon ved bruk av T4-DNA-ligase. Etter transformasjon av E. coli, ble celler som inneholdt det ønskede plasmid, identifisert fenotypisk ved testing for Km-resistens og Cm-følsomhet. Det dannede plasmid, som bestod av fullengdet NDV-cDNA klonet inn mellom Smal- og Stul-stillingene av transkripsjonsplasmidet pOLTV5, ble benevnt pNDFL+.

Generering av smittende NDV fra full- lengdet cDNA

For å generere smittende NDV utelukkende fra klonet cDNA, ble plasmidet pNDFL+ brukt i kotransfeksjonseksperimenter med pCIneoNP, -P og -L(c) som beskrevet ovenfor for minigenomplasmidene. Transfeksjon av CER- og CEF-celler ble overvåket ved bruk av minigenomplasmidet pOLTV553N3 og ved å måle SEAP-ekspresjonen. Som negativkontroll ble pCIneoL(c) erstattet md pCIneo. Etter kotransfeksjonen ble cellene inkubert i 3-6 dager i medium som inneholdt 5% allantoinvæske. Tilsetningen av allantoinvæske er nødvendig fordi CER- eller CEF-celler mangler de egnede proteaser som er nødvendig for å spalte F-proteinet av NDV-stammen LaSota. Spaltning av F-proteinet er absolutt nødvendig for en spredning fra celle til celle og for generering av smittende virus. Etter 3 dagers inkubasjon utførte vi en immunologisk farging av de festede monosjikt ved bruk av et monoklonalt antistoff mot F-proteinet. Resultatene viste at celler som ble farget med antistoffet, kun forelå i monosjiktene som var blitt kotransfisert med pNDFL(+), pCIneoNP, -P og -L(c). Disse resultater tyder på at genomre-plikasjon og -ekspresjon forekom i disse celler. Ingen far-gede celler ble observert når pCIneoL(c) ble erstattet med pCIneo i kotransfeksjonseksperimentene.

For å isolere smittende virus, ble supernatanten av transfiserte CEF-monosjikt injisert inn i allantoinhulrommet av embryonerte egg. Fire dager senere ble allantoinvæsken samlet, analysert i et hemagglutinasjonsassay og passert videre i egg. Resultatene viste at kun supernatanten av celler som var blitt transfisert med en kombinasjon av pNDFL+ og pCIneoNP, -P og -L(c), gav en positiv reaksjon i hema-gglutinas j onsassayet . Allantoinvæske som viste en positiv hemagglutinasjonsreaksjon, ble deretter analysert i et he-magglutinas jonsinhibisjonsassay ved bruk av monoklonale antistoffer 7B7, 8C11, 5A1, 7D4 og 4D6 (Long et al., 1986), som kan brukes for å skjelne mellom forskjellige NDV-stammer. Resultatene av dette assay tydet på at NDV-stammen som ble isolert fra de podede egg, oppviste samme reaktivitet som den opprinnelige LaSota-stamme. Viruset som ble isolert fra de podede egg, ble benevnt NDLV for å skjelne det fra den opprinnelige LaSota-stamme.

Generering av genetisk modifisert NDV fra full- lengdet cDNA

For å utvetydig demonstrere at kotransfeksjonssystemet kunne brukes til å isolere smittende virus fra klonet full-lengdet NDV-cDNA, ble en genetisk markør innført i plasmidet pNDFL(+). Med denne hensikt ble aminosyresekvensen av proteasespaltningsstillingen i Fo-proteinet endret fra sekvensen i LaSota-stammen (GGRQGR | L) til konsenssekvensen av virulente NDV-stammer (GRRQRR I F) ved hjelp av PCR-mutagenese (for detaljer, se "Materialer og metoder"). Det dannede plasmid, pNDFL+[F<wt>], ble brukt for å generere virus ved bruk av det ovenfor beskrevne kotransfeksjonssy-stem. Smittende virus, benevnt NDFL[F<wt>], ble isolert fra allantoinvæsken av embroynerte egg som var blitt podet med mediet av kotransfiserte CEF-celler. I en HI-test oppviste alle MAb'er, også 7D4, som er spesifikk for LaSota-stammen, den samme reaktivitet med det nylig genererte virus som med den opprinnelige LaSota-stamme. Nukleotidsekvensen av par-tiet som koder for proteasespaltningsstillingen av F-protein, ble bestemt ved hjelp av RT-PCR. Resultatene viste at nukleotidsekvensen inneholdt de nøyaktige nukleotidendringer som ble innført i den mutagene primer som ble brukt for å modifisere den opprinnelige LaSota-sekvens. Dette funn viser at viruset ble avledet fra plasmidet pNDFL+[Fwt], og demonstrerer at (genetisk modifisert) NDV kan genereres fullstendig fra klonet fullengdet NDV-cDNA.

Proteasespaltningsstillingen av Fo- protein av NDV er en bestemmende nøkkelfaktor for virulens

Det antas generelt at aminosyresekvensen av proteasespaltningsstillingen av Fo-proteinet er en nøkkelfaktor som bestemmer virulensen av forskjellige NDV-stammer. Genererin-gen av en genetisk modifisert LaSota-stamme hvor aminosyresekvensen av proteasespaltningsstillingen var endret fra en lentogen (ikke-virulent) til stillingen fra en velogen (virulent) NDV-stamme, gav en ensartet mulighet til å teste denne antakelse. Derfor bestemte vi den intracerebrale patogenisitetsindeks (ICPI) av det nylig genererte virus NDFL[F<wt>] og sammenlignet den med indeksen for stammen NDFL og for den opprinnelige LaSota-stamme (klon E13-1). Resultatene viste at ICPI for stammen NDFL [Fwt] var 1,3, hvilket er langt over verdien for stammene NDFL (ICPI = 0,0) og klonen E13-1 (ICPI=0,3). Disse resultater viser at virulensen av NDV, som ventet, til stor del bestemmes av aminosyresekvensen av proteasespaltningsstillingen av Fo-proteinet .

Innføring av en serologisk markør

Innhyllings-glykoproteinene F og HN av NDV er de mest immunogene proteiner av viruset. Etter infeksjon utløser både F- og HN-protein en sterkt nøytraliserende antistoffrespons. Induksjonen av en slik nøytraliserende antistoffrespons er grunnlaget for en fremgangsrik vaksinasjon med ikke-virulente NDV-stammer (så som den omfattende brukte LaSota-stamme). Imidlertid kan antistoffresponsen mot NDV-vaksinestammer ikke skjelnes fra antistoffresponsen mot virulente NDV-feltstammer. Dermed kan infeksjoner med virulent feltvirus ikke spores ved serologiske metoder. Denne situasjon er uønsket, siden feltvirusinfeksjoner maskeres av en vaksinasjon, og kliniske tegn som forårsakes av feltstammer, kan overses eller t.o.m. skyldes på vaksinen. Fordi en fremgangsrik differensiering mellom vaksinasjon og infeksjon er essensiell for en utrydding av NDV, satte vi i gang med å utvikle genetisk modifiserte NDV-stammer som kan brukes for vaksinasjon og som kan skjelnes serologisk fra NDV-feltstammer (såkalte markørvaksiner). For å utvikle en NDV-markørvaksine, må viruset modifiseres genetisk slik at én eller flere immunodominante epitoper av ett av (hoved-) antigenene enten slettes eller modifiseres. En sletting av én eller flere deler av et essensielt protein kan føre til et tap av dette proteins biologiske funksjon. Derfor valgte vi å modifisere et av de immunodominante omhyllingsprotei-ner av NDV slik at den biologiske funksjon av proteinet ble bevart, mens antistoffrepertoaret mot det modifiserte protein skilte seg fra antistoffene mot det opprinnelige protein. Av grunner som skal oppgis i det følgende, valgte vi for én utførelse av oppfinnelsen å modifisere HN-proteinet av NDV. Infeksjon med NDV initieres ved en fusjon av viri-onomhyllingen med plasmamembranen av vertcellen. For denne prosess er både F-protein og HN-protein nødvendig. Det er blitt vist at F- og HN-proteinet vekselvirker fysisk, og at denne vekselvirkning er nødvendig for en membranfusjon (Deng et al., 1995). Videre er det blitt vist at vekselvirkningen er typespesifikk, dvs. F- og HN-proteinet må stamme fra samme virus for å oppvise fusjonsaktivitet. Den vekselvirkende domene av HN-protein av NDV er blitt lo-kalisert til det såkalte stilk- eller stammeparti av proteinet, omfattende de første 92 aminosyreresiduer av ekto-domene av HN-proteinet (Deng et al., 1995) . Hybride HN-proteiner som består av aa 1-141 fra NDV og aa 141-572 fra humant parainfluensavirus type 3 (hPIV3) viste seg å bevare sin fusjonsaktivitet når de ble kouttrykt sammen med NDV-F-protein. Disse funn tyder på at genetisk modifiserte NDV-stammer som inneholder et hybrid HN-protein som består av stammepartiet fra NDV fulgt av det globulære hode av HN-protein fra en forskjellig fjærfe-paramyxovirus-serotype, kan være levedyktig. Videre ville slike stammer utløse en anti-HN-antistoffrespons som skiller seg fra responsen mot NDV. Fordi den nøytraliserende antistoffrespons mot F-protein er tilstrekkelig for å muliggjøre en virksom beskyttelse mot en utfordring med virusinfeksjon, tilfredsstiller slike genetisk modifiserte NDV-stammer de to vesentlige krav til en markørvaksine, dvs. beskyttelse mot sykdom og serologisk differensiering.

Hybride HN-gener ble konstruert som bestod av en fusjon av enten aa 1-141 fra NDV med aa 142-580 fra fjærfe-paramyxovirus type 2 (APMV2) (benevnt HN1/2<141>) eller aa 1-143 av NDV og aa 144-580 fra APMV2 (benevnt HN1/2143) . På lignende måte ble hybride HN-gener konstruert som bestod av enten aa 1-141 fra NDV og aa 143-569 fra AMPV4 (benevnt HN1/4141) eller aa 1-143 fra NDV og aa 145-569 fra APMV4 (benevnt HN1/4143) . De hybride gener ble klonet inn i den eukaryotiske ekspresjonsvektor pCIneo og brukt i kotransfeksjonseksperimenter med et plasmid som inneholdt NDV-F-protein. Med denne hensikt ble F-proteinet modifisert slik at aminosyresekvensen av den proteolytiske spaltningsstilling mellom F2 og Fl ble endret fra LaSota-sekvensen til hva som foreligger i konsenssekvensen av virulente NDV-stammer (Fwt, se "Materialer og metoder"). Kotransfeksjonseksperimenter i CER-celler og QM5-celler tydet på at både HN1/2<141 >og HN1/2<143> samt HN1/4<141> og HN1/4<143> induserte cellefusjon når de ble kouttrykt med F<wt->protein. Disse resultater tydet på at kompleksene mellom hybride HN-proteiner og F-proteinet var biologisk aktive. De hybride HN-proteiner HN1/2<143> og HN1/4<143> ble brukt for å erstatte det opprinnelige HN-gen i full-lengdet cDNA-klon pNDFL+, hvilket gav pNDFL-HNl/2<143> og pNDFL-HNl/4<143>. De to sistnevnte plasmider ble deretter brukt for å generere smittende virus ved bruk av kotransfeksjonssystemet som ble beskrevet ovenfor. Levedyktige rekombinante viruser (benevnt NDFL-HN1/2<143> og NDFL-HNl/4<143>) kunne isoleres fra allantoinvæsken i embryonerte egg som var blitt podet med supernatanten fra transfiserte monosj ikt.

Nærværet av det hybride HN-gen i hver av de to rekombinan-ter ble verifisert ved bruk av RT-PCR. Hemagglutinasjons-inhibisjonstester viste at monoklonale antistoffer og fler-verdige antisera mot NDV ikke kunne inhibere agglutinasjo-nen av kyllingerytrocytter forårsaket av de rekombinante viruser NDFL-HN1/2<143> og NDFL-HN1/4<143>. Disse resultater tyder på at stammene NDFL-HN1/2<143> og NDFL-HN1/4<143> kan brukes som vaksiner som kan serologisk skjelnes fra klassiske NDV-vaksiner.

Ekspresjon av et heterologt protein fra rekombinant NDV

For å undersøke om fremmede gener kan innføres i NDV-genomet, konstruerte vi et rekombinant virus som bar SEAP-re-portergenet. SEAP-genet var avledet fra plasmidet pOLTV535, og var blitt modifisert for å omfatte de typiske transkripsjonene start- og stopp-bokser av NDV. Et DNA-fragment som inneholdt SEAP-genet fulgt av de transkripsjonene stopp-og start-bokser, ble innført i Xmnl-stillingen (nt 109) i plasmidet pNDFL+[Fwt] . Smittende virus, benevnt DNFL-AP, ble generert ved bruk av kotransfeksjonssystemet, og nærværet av SEAP-genet ble verifisert ved hjelp av RT-PCR. Celler som var infisert med stammen DNFL-AP, uttrykte meget høye mengder SEAP-protein. Ved bruk av den spesifikke aktivitet av SEAP-proteinet, beregnet vi at x% av proteinene som ble uttrykt i celler som var infisert med NDFL-AP, bestod av SEAP-protein. Disse resultater viser at heterologe gener kan uttrykkes i meget høye mengder fra rekombinant

NDV.

Generering av en NDV- delesjonsmutant på en trans- komplementerende cellelinje

For å oppheve ekspresjonen av M-proteinet av NDV, ble en stor del av M-genet slettet ved spaltning av pNDFL+[F<wt>] med BsaAI (nt 3087) fulgt av en delvis spaltning med Hindlll (nt 4252). Etter å ha fylt opp Hindlll-enden med Klenow-DNA-polymerase, ble fragmentet resirkularisert ved bruk av T4-DNA-ligase og brukt til å transformere E. coli. Det dannede plasmid, benevnt pNDFL+[Fwt] dM, ble brukt til å generere virus ved hjelp av kotransfeksjonssystemet i trans-komplementerende CER-M-celler som uttrykte NDV-M-protein. Supernatanten fra transfiserte monosjikt ble passert tre ganger på CER-M-celler og analysert for nærvær av virus. Virus ble erholdt som vist ved at kultursupernatanten av den tredje passasje gav positive resultater i hemagglutina-sjons (HA)- og hemagglutinasjonsinhibisjons (HI)-tester. Viruset ble benevnt NDFL-dM. Når NDFL-dM ble brukt for å infisere monosjikter av CEF-celler, kunne viruset fortsatt spre seg ved transmisjon fra celle til celle, som vist i et IPMA ved bruk av et monoklonalt antistoff mot F-proteinet. Som forventet, kunne man ikke demonstrere noen ekspresjon av M-proteinet i et IPMA ved bruk av monoklonale antistoffer mot M-proteinet. Når supernatanten ble brukt for å infisere enten CEF-celler eller CER-M-celler, kunne vi ikke påvise nærvær av repliserende virus i disse monosjikt ved hjelp av IPMA. Dette funn tyder på at smittende virus ikke kunne genereres i ikke-komplementerende CEF-celler. Dette funn ble bekreftet ved observasjonen at poding av embryonerte egg med supernatant fra infiserte CER-celler ikke førte til noen generering av avkom-virus ifølge HA- eller HI-tester.

Behovet for bedre NDV-vaksiner, og spesielt behovet for NDV-markørvaksiner, beveget oss til å utvikle et reverst genetikksystem som ville muliggjøre en genetisk modifikasjon av NDV. I foreliggende dokument beskriver vi genere-ringen av smittende NDV utelukkende fra klonet full-lengdet cDNA. Vi viser at smittsomheten av NDV kan endres dramatisk ved å modifisere kun 3 nukleotider, som bestemmer spesifi-siteten av F-proteinets proteasespaltningsstilling. I dette tilfelle ble proteasespaltningsstillingen endret fra stillingen i LaSota-stammen til stillingen i konsensspaltnings-stillingen av virulente NDV-stammer. Ved å generere denne genetisk modifiserte NDV-stamme leverer vi formelle bevis på at spaltbarheten av F-proteinet er nøkkelfaktoren (men ikke den eneste bestemmende faktor) for virulensen av NDV. Ved bruk av den samme reverse genetikkfremgangsmåte kan spaltningsstillingen modifiseres etter ønske til hvilken som helst annen aminosyresekvens. Dette kan føre til gene-reringen av en rekke NDV-stammer som oppviser et spektrum av virulensnivåer.

in vivo

Slik det allerede ble nevnt ovenfor, er det blitt vist at foruten spaltbarheten av F- og HN-proteinene, kan andre virale faktorer bidra til patogenisiteten. Endringer av transkripsjonen og translasjonen kan modulere veksten og viru-sets spredning fra celle til celle og/eller cytopatogenisiteten. Tilgjengeligheten av et smittende cDNA av NDV mulig-gjør en systematisk modifikasjon av sekvenser som omfattes innen transkripsjon og replikasjon. Dette kan føre til en utvikling av nye NDV-vaksiner som oppviser en optimal immunogenisitet til nærmeste ikke-eksisterende virulens.

Sikkerhet er én av de viktigste egenskaper av levende vaksiner. Imidlertid står for mange levende vaksiner, også

NDV, immunogenisitet ofte i omvendt forhold til virulensen. Derfor er en ytterligere svekkelse av levende vaksiner uten å tape immunogenisitet, én av de mest ønskede endringer som en genetisk modifikasjon kunne brukes til. I denne hensyn er det verdt å nevne at det er blitt vist at en eliminasjon av ekspresjonen av V-protein av Sendai-virus førte til en betydelig nedsatt in vivo-patogenisitet for mus (Kato et al., 1997). På lignende måte som Sendai-virus, genererer NDV også et V-protein ved en mekanisme som er kjent som RNA-redigering (Steward et al., 1993). Det er forutsigbart at en eliminasjon av ekspresjonen av V-proteinet av NDV også kan føre til en svekket fenotype in vivo.

Foruten å endre virulensen av NDV, viser vi at det er mulig å modifisere den antigene sammensetning av NDV slik at det kan genereres stammer som kan skjelnes serologisk fra NDV-feltstammer. Disse såkalte markørvaksiner er en uvurderlig hjelp for å bedømme forekomsten av NDV i kommersielle flokker rundt omkring i verden. Videre kan en anvendelse i stor skala av slike markørvaksiner til slutt føre til en fullstendig utrydding av NDV ved en prosess med intens testing og utsletting av infiserte flokker. I foreliggende dokument viser vi at fremmede gener kan innføres i genomet av NDV. Disse fremmede gener kan uttrykkes i meget høye nivåer i infiserte celler. Dette viser at NDV kan brukes som vaksinevektor for ekspresjon av antigener fra andre (fjærfe-) patogener. Flere egenskaper gjør NDV til en ideell vaksinevektor for vaksinasjon mot respiratoriske eller intestinale sykdommer: 1) NDV kan lett dyrkes til meget høye titere i embryonerte egg. 2) Massekultur av NDV i embryonerte egg er relativt billig. 3) NDV-vaksiner er relativt stabile og kan lett administreres ved masseapplikasjonsmetoder såsom tilsetning til drikkevann eller ved besprøytning eller aero-soldannelse. 4) Den naturlige infeksjonsrute av NDV er via respirasjonstrakten og/eller mage-tarm-trakten, som også er de naturlige hovedruter for infeksjon med mange andre fjærfe-patogener. 5) NDV kan indusere en lokal immunitet til tross for nærværet av sirkulerende moder-antistoff.

Til slutt viser vi at levedyktige NDV-delesjonsmutanter kan genereres ved bruk av trans-komplementerende cellelinjer. En NDV-delesjonsmutant ble generert som ikke har evnen til å uttrykke matriks-(M)-protein, som er innblandet i spiring av NDV ved den indre cellemembran. Vi viser at en fenotypisk komplementert NDV-stamme som ikke har evnen til å uttrykke M-proteinet, fortsatt har evnen til å infisere celler og spres ved hjelp av transmisjon fra celle til celle. Imidlertid har det mutante virus ikke evnen til å generere smittende avkom på ikke-komplementerende celler. Dette funn viser at fenotypisk komplementerte NDV-delesjonsmutanter kan brukes som sikre selvbegrensende vaksiner som ikke har evnen til å spres ut i miljøet. En slik ikke-overførbar vaksine kombinerer den viktigste fordel av levende vaksiner, nemlig effekt, med den viktigste fordel av drepte vaksiner, nemlig sikkerhet.

Figurtekst

Figur 1.

Transkripsjonsvektor pOLTV5 er et derivat av transkripsjonsvektoren beskrevet av Pattnaik et al. (1992). Se tekst for detaljer ved konstruksjonen. Plasmidet inneholder den T7 DNA-avhengige RNA-polymerasepromoter (vist i ut-hevet skrift) fulgt av enestående Stul og Smal restrik-sjonsseter og det autokatalytiske ribozym fra hepatittdel-tavirus (HDV). DNA-fragmenter kan bli klonet mellom Stul-og Smal-setene og kan bli transkribert enten in vitro eller in vivo ved å bruke T7 RNA-polymerase. Den 5'-ende av de resulterende transkripter inneholder to ekstra G-residuer som ikke blir kodet av innskuddet. Grunnet virkningen av ribosymet tilsvarer den 3'-ende av transkriptet nøyaktig det siste nukleotid av innskuddet.

Figur 2.

Struktur av de minigenome plasmider pOLTV535 (fig. 2A) og pOLTV553 (fig. 2B). De minigenome plasmider er basert på transkripsjonsplasmider pOLTV5 (se fig. 1) og inneholder det 3' området (nt 1-119) og det 5' området (nt 14970-15186) av NDV-stamme LaSota som flankerer genet som koder for utskilt alkalisk fosfat (SEAP). Transkripsjon av pOLTV535 ved T7 RNA-polymerase gir antigenomisk RNA (eller [+)-RNA) mens transkripsjonen av pOLTV553 gir genomisk RNA (eller (-)-RNA). Start (S) og slutt (E) boksene som er virale transkripsjonsinitierings og termineringssignaler er angitt. Startkodonene av SEAP-genet er understreket. Sekvensene for innsetningene (N0-N5) i Clal-setet som danner minigenomplasmider som hver er forskjellige med 1 nt i lengde (pOLTV535N0-N5 og pOLTV553N0-N5) er også vist.

Figur 3

Nukleotidsekvens av genomet av NDV-stamme LaSota og avledet aminosyresekvens for NDV-genene. Sekvensen som er vist tilsvarer den antigenomiske kjede og er vist i 5' til 3' retning i form av ssDNA. Sekvensen som er vist i denne figur er den til konsensussekvensen som ble bestemt ved fullstendig å sekvensere to uavhengige sett av overlappende subgenomiske cDNA som strekker seg over hele NDV-genomet. Gjenværende uoverensstemmelser (sannsynligvis som et resultat av PCR-feil) ble løst ved å sekvensere relevante områder av et tredje uavhengig sett av kloner.

Sekvensen av den fullengdede cDNA-klonen pNDFL+ som ble satt sammen fra overlappende sub-genomiske cDNA-kloner (se figur 4), er forskjellige fra den til konsensus NDV-sekvensen ved de følgende posisjoner (konsensussekvens mellom parenteser) : nt 1755, G (A); nt 3766, A (G); nt 5109, G(A); nt 6999, T (C); nt 7056, G (A); nt 9337, G (A); nt 9486, A (T); nt 10195, T (C); nt 13075, A (G); Disse forskjeller resulterer i 3 aminosyreendringer (konsensussekvens mellom parenteser): F-protein, R<189> (Q) ; HN-protein S<200> (P) L-protein N<369> (I) .

Figur 4.

(A) Total strategi benyttet for sammensetning av full-lengdet NDV cDNA fra subgenomiske overlappende cDNA-kloner. cDNA-materialet ble satt sammen i plasmid pOLTV535 som allerede inneholdt 3' og 5' ender av NDV-stamme LaSota (se fig. 2). Det resulterende plasmid, betegnet pNDFL+ ble benyttet for dannelsen av infeksjonsdyktige NDV. (B) Detaljert kloningsprosedyre for sammensetning av full-lengdet NDV cDNA fra subgenomiske overlappende cDNA-kloner.

Cm betegner kloramfenikol-resistensgenet som temporært ble introdusert som en fenotypisk markør (se tekst for detaljer) .

(C) Detaljert kloningsprosedyre for fremstillingen av genetisk modifisert fullengdet NDV cDNA. Modifikasjonen består

av 3 nukleotidendringer som ble innført i F-genet og som resulterer i modifikasjonen av aminosyresekvensen av det proteolytiske spaltingssete hos F-proteinet (se tekst for detaljer).

Figur 5.

(A) pOLTV535-serien

Transkripsjon ved hjelp av T7 RNA polymerase gir antigenomisk RNA (eller (+)-RNA) som direkte kan bli translatert til SEAP-protein av cellen. Etter infeksjon av celler med hjelpevirus (eller etter ko-transfeksjon av plasmider som koder for NP-, P-, og L) blir det antigenomiske RNA benyttet av det virale polymeraseskompleks for syntesen av genomisk RNA (eller (-)-RNA). Det genomiske RNA blir så benyttet av det virale polymerasekompleks for syntesen av både mRNA (ved å bruke den spesifike transkripsjonsstart [S] og ende [E] bokser) og antigenomisk RNA.

(B) pOLTV553-serien

Transkripsjon ved hjelp av T7 RNA-polymerase gir genomisk

RNA (eller [-]-RNA) som ikke kan bli translatert til SEAP-proteinen. Etter infeksjon av celler med hjelpevirus (eller etter ko-transfeksjon av plasmider som koder for NP, P, og L) blir det genomiske RNA benyttet av det virale polymerasekompleks for syntesen av både mRNA (ved å bruke den spesifike transkripsjonsstart [S] og ende [E] bokser) og antigenomisk RNA.

Figur 6

Sammenligning av nukleinsyresekvenser 5' terminale ender av NDV LaSota og andre paramyksovirus er gitt som sekvenssam-menligning av NDV og de fire medlemmer av Rubulfavirus slekten, tre medlemmer av Paramyxovirus genus, og tre medlemmer av Morbillivirus slekten. Sekvensene er presentert fra L-gen endeboksen til den 5' ende (3' - 5' cDNA).

NDV, Newcastle sykdomsvirus; hPIV2, human parainfluensavirus 2; MuV, kusmavirus; SV5 og SV41, henholdsvis simmianvi-rus 5 og 41; SeV, sendaivirus; bPIV3 og hPIV3, henholdsvis bovin og human parainfluensavirus; CDV, gnagergalskapvirus; MeV meslingvirus RPV, rinderpestvirus. Nukleotid (nt)sekvenser av de fullstendige genomer ble oppnådd som følger (tilgangsnummer): NDV(AF077761); hPIV2(X57559); MuV(AB000388); SV5(AF052755); SV41(X64275); bPIV3(D84095); hPIV3(Z11575); CDV(L13194); MeV(X16565); RPV(Z30697).

Referanser

Alexander, D.J. (1993) Paramyxovirus infections. In Virus infections of birds. McFerran, J.B. and McNulty, M.S. (eds), pp 321-340, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam.

Ant in, P.B and Ordahl, CP. (1991) Isolat ion and characterization of an avian myogenic cell line. Dev. Biol. 143: 111-121.

Baron, M.D. and Barrett, T. (1997) Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J. Virol. 71: 1265-1271. Beach, J.R- (1944) The neutralization in vitro of avian pneumoencephalitis virus by Newcastle disease immune serum. Science 100: 361-362.

Beard, C.W. and Hanson, R.P. (1984) Newcastle disease. In M.S. Hofstad et al. (eds) Disease of Poultry, 8th Ed., pp. 452-470. Iowa State University Press, Ames. Beaudette, F.R., Bivins, J.A. and Miller, B.R. (1949) Newcastle disease immunization with live virus. Cornell Vet. 39: 302-334.

Boursnell, M.E.G., Green, P.F., Samson, A.C.R., Campbell, J.I.A., Deuter, A., Peters, R.W., Millar, N.S., Emmerson, P.T. and Binns, M.M. (1990) A recombinant fowlpox virus expressing the hemagglutinin-neuraminidase gene of Newcastle disease virus (NDV) protects chickens against challenge by NDV. Virology 178: 297-300.

Britton, P., Green, P., Kottier, S., Mawditt, K.L., Penzes, Z., Cavanagh, D. and Skinner, M. (1996) Expression of bacteriophage T7 RNA polymerase in avian and mammalian cells by a recombinant fowlpox virus. J. Gen. Virol. 77: 963-967.

Calain, P. and Roux, L. (1993) The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA. J. Virol. 67: 4822-4830.

Chambers, P., Millar, N.S., Bingham, R.W. and Emmerson, P.T. (1986) Molecular cloning of complementary DNA to Newcastle disease virus and nucleotide sequence analysis of the junction between the genes encoding the haemagglutinin-neuraminidase and the large protein. J.

Gen. Virol. 67: 475-486

Chang, A.C.Y. and Cohen, S.N. (1978) Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol. 134: 1141-1156.

Cho, B.R. (1982) Cytopathic effeets and focus formation by reticuloendotheliosis viruses in a quail fibroblast cell line. Avian Dieeaees 27: 261

Collins, P.L., Hil, M.G., Camargo, E., Grosfeld, H., Chanock, R.M. and Murphy, B.R. (1995) Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for transcription elongation factor from the 5 1 proximal open reading f rame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine development. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92: 11563-11567.

Conzelmann, K.-K. (1996) Genetic manipulation of non-segmented negative-strand RNA viruses. J. Gen. Virol. 77: 381-389.

Cowen, B.S. and Braune, M.O. (1988) The propagation of avian viruses in a continuous cell line (QT35) of Japanese quail origin. Avian Diseases 32: 282-297.

Deng, R., Wang, Z., Mirza, A.M. and Iorio, R.M. (1995) Localization of a domain on the paramyxovirus attachment protein required for the promotion of cellular fusion by its homologous fusion protein spike. Virology 209: 457-496.

Doyle, T.M. (1927) A hitherto unrecorded disease of fowls due to a filter-passing virus. J". Comp. Pathol. Ther. 40: 144-169.

Garcin, D., Pelet, T., Calain, P., Roux, L., Curran, J. and Kolakofsky, D. (1995) A highly recombinogenic system for the recovery of infectious Sendai paramyxovirus from cDNA: generation of a novel copy-back non-defective interfering virus. EMBO J. 14: 6087-6094.

Garten, W., Berk, W., nagai, Y., Rott, R. and Klenk, H.-D. (1980) Mutational changes of the protease suceptibility of glycoprotein F of Newcastle disease virus: Effeets on pathogenicity. J. Gen. Virol. 50: 135-147.

Goldhaft, T.M. (1980) Historical note on the origin of the LaSota strain of Newcastle disease virus. Avian Dis. 24: 297-301.

Gough, R.E. and Alexander, D.J. (1973) The speed of resistance to challenge induced in chickens vaccinated by different routes with a Bl strain of live NDV. Vet. Ree. 92: 563-564.

Hanson, R.P. (1988) Heterogeneity within strains of Newcastle disease virus: key to.survival. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 113-130. Kluwer Academic Publ., Boston.

Harty, R.N. and Palese, P. (1995) Mutations within noncoding terminal sequences of model RNA<1>s of Sendai virus: Influence on reporter gene expression. J. Virol. 69: 5128-5131.

Heckert, R.A., Riva, J., Cook, S., McMillen, J. and Schwartz, R.D. (1996) Onset of protective immunity in chicks after vaccination with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing Newcastle disease virus fusion and heraagglutinatinin-neuraminidase antigens. Avan Dis. 40: 770-777.

Heuschele, W.P. and Easterday, B.C. (1970) Local intmunity and persistence of virus in the tracheas.'of chickens following infection with Newcastle disease virus. II. Immunofluorescent and histopathological studies. J. Inf. Dis. 121: 497-504.

Hitchner, S.B. and Johnson, E.P. (1948) A virus of low virulence for immunizing fowls against Newcastle disease (avian pneumoencephalitis). Vet. Med. 43: 525-530. Hoffman, M.A. and Banerjee, A.K. (1997) An infectious clone of human parainfluenza virus type 3. J. Virol. 71: 4272-4277.

Hofstad, M.S. (1953) Immunization of chickens against newcastle disease by formalin-inactivated vaccine. Am. J. Vet. Res. 14: 586-589.

Ichihara, Y., and Kurosawa, Y. (1993) Construction of new T vectors for direct cloning of PCR products. Gene 130: 153-154.

Ishida, N., Taira, H., Ornata, T., Mizumoto, K., Hattori, S., Iwasaki, K. and Kawakita, M. (1986) Sequence of 2617 nucleotides from the 3<1> end of Newcastle disease virus genome RNA and the predicted amino acid sequence of the viral NP protein. Nucl. Acids Res. 14: 6551-6564. Kaleta, E.F. and Baldauf, C. (1988) Newcastle Disease in free-living and pet birds. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 197-246. Kluwer Academic Publ., Boston.

Kant, A., Koch, G., van Roozelaar, D.J., balk, F. and ter Huurne, A. (1997) Differentiation of virulent and non-virulent strains of Newcastle disease virus within 24 hours by polymerase chain reaction. Avian Pathol. 26: 837-849.

Kolakofsky, D., Pelet, T., Garcin, D., Hausmann, S., Curran, J. and Roux, L. (1998) Paramyxovirus RNA synthesis and the requirement for hexamer genome length: the rule bf six revisited. J. Virol. 72: 891-899. Kraneveld, F.C. (1926) A poultry disease in the Dutch East Indies. Ned. Indisch Bl. Diergeneesk. 38: 448-450. Larab, R.A. and Lolakofsky, D. (1996) Paramyxoviridae: the viruses and their replication. in: Fundamental

Virology (Fields et al., eds), Chapter 20, p577-604, Lipincott-Raven Publishers, Philadelphia.

Lawson, N.D., Stillman, E.A., Whitt, M.A. and Rose, J.K.

(1995) Recombinant vesicular stomatitis virus from DNA. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92: 4477-4481.

Long, L., Portetelle, D, Ghysdael, J., Gonze, M., Burny, A. and Meulemans, G. (1986) Monoclonal antibodies to haemagglutinin-neuraminidase and fusion glycoproteins of Newcastle disease virus: relationship between glycosylation and reactivity. J. Virol. 57: 1198-1202. Madansky, C.H. and Bratt, M.A. (1978) Noncytopathic mutants of Newcastle disease virus. J. Virol. 26: 724-729. Madansky, C.H. and Bratt, M.A. (1981a) Noncytopathic mutants of Newcastle disease virus are defective in virus-speeific RNA synthesis. J. Virol. 37: 317-327. Madansky, C.H. and Bratt, M.A. (1981b) Relationships among virus spread, cytopathogenicity, and virulence as revealed by the noncytopathic mutants of Newcastle disease virus. J. Virol. 40: 691-702.

Meulemans, G., Gonze, M., Carlier, M.C., Petit, P., Burny, A. and Long, L. (1986) Protective effects of HN and F glycoprotein-specific monoclonal antibodies on experimental Newcastle disease. Avian Pathol. 15: 761-768.

Millar, N.S., Chambers, P. and Emmerson, P.T. (1988) Nucleotide sequence of the fusion and haemagglutinin-neuraminidase gene of Newcastle disease virus, strain Ulster: Molecular basis for variations in pathogenicity between strains. J. Gen. Virol. 69: 613-620.

Morgan, R.W., Gelb Jr., J., Schreurs, C.S., Lutticken,

D., Rosenberger, J.K. and Sonderraeijer, P. (1992) Protection of chickens from Newcastle and Marek's

diseases with a recombinant herpesvirus of turkeys vaccine expressing the Newcastle disease virus fus'iion protein. Avian Dis. 36: 858-870.

Morgan, R.W., Gelb Jr., J., Pope, CR. and Sondermeijer,

P. (1993) Efficacy in chickens of a herpesvirus of

turkeys recombinant vaccine containing the fusion gene of Newcastle disease virus: onset of protection and effect of. maternal antibodies.

Moscovici, C, Moscovici, M.G., Jimenez, H., Lai, M.M., Haymahn, M.J. and Vogt, P.K. (1977) Continuous tissue culture cell lines derived from chemically induced tumors of Japanese quail. Cell 11: 95-103.

Pattnaik, A.K., Ball, L.A., LeGrone, A.W. and Wertz, G.W.

(1992) Infectious defective interfering particles of VSV from transcripts of a cDNA clone. Cell 69: 1011-1020. Peeples, M.E. (1988) Newcastle disease virus replication. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 45-78. Kluwer Academic Publ., Boston. Peeters, B., N. de Wind, M. Hooisma, F. Wagenaar, A. Gielkens and R. Moormann. (1992) Pseudorabies virus envelope glycoproteins gp50 and gli are essential for virus penetration, but only gl I is involved in membrane fusion. J. Virol. 66: 894-905. Radecke, F., Spielhofer, P., Schneider, H., Kaelin, K., Huber, M., Dotsch, C., Christiansen, G. and Billeter,

M.A. (1995) Rescue of measles virus from cloned DNA. EMBO

J. 14: 5773-5784.

Rott, R. and Klenk, H.-D. (1988) Molecular basis of infectivity and pathogenicity of Newcastle disease virus.

In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 98-112. Kluwer Academic Publ., Boston.

Russell, P.H., Griffiths, P.C., Goswami, K.K.A., Alexander, D.J., Cannon, M.J. and Russell, W.C. (1983) The characterization of monoclonal antibodies to Newcastle disease virus. J. Gen. Virol. 64: 2069-2072. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (198"i9) Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY.

Schneider, H., Spielhofer, P., Kaelin, K., Dotsch, C, Radecke, F., Sutter, G. and Billeter, M.A. (1997) Réscue of measles virus using a replication-deficient vaccinia-T7 vector. J. Virol. meth. 64: 57-64.

Schnell, M.J., Mebatsion, T. and Conzelmann, K.-K. (1994) Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13: 4195-4203.

Schutze, H., Enzmann, P.-J., Kuchling, R., Mundt., E., Niemann, H. and Mettenleiter, T.C. (1995) Complete genomic sequence of the fish rhabdovirus infectious haematopoietic necrosis virus. J. Gen. Virol. 76: 2519-2527.

Smith, A.L., Tignor, G.H., Mifune, K., and Motohashi, T.

(1977) Isolation and assay of rabies serogroup viruses in CER cells. Intervirlogy 8: 92-99.

Spradbrow, P.B. (1988) Geographical distribution. In D.J. Alexander (ed.), Newcastle Disease, pp. 247-255. Kluwer Academic Publ., Boston.

Stauber, N. , Brechtbiihl, K. , Bruckner, L. and Hof mann, M.A. (1995) Detection of Newcastle disease virus in poultry vaccines using the polymerase chain reaction and direct sequencing of amplified DNA. Vaccine 13: 360-364 Steward, M., Vipond, I.B., Millar, N.S. and Emmerson, P.T. (1993) RNA editing in Newcastle disease virus. J. Gen. Virol. 74: 2539-2547.

Taylor, J., Edbauer, C., Rey-Senelonge, A., Bouquet, J., Norton, E., Goebel, S., Desmettre, P. and Paoletti, E.

(1990) Newcastle disease virus fusion protein expressed in a fowlpox virus recombinant confers protection in chickens. «J. Virol. 64: 1441-1450.

Tessier, D.C., Brousseau, R., and Vernet, T. (1986) Ligation of single-stranded oligodeoxyribonucleotides by

T4 RNA ligase. Anal. Biochem. 158: 171-178.

Vieira, J., and Messing, J. (1991) New pUC-derived

cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. Gene 100: 189-194.

Vindevogel, H. and Duchatel, J.P. (1988) Panzootic Newcastle disease virus in pigeons. In D.J. Alexander

(ed.), Newcastle Disease, pp. 184-196. Kluwer Academic Publ., Boston.

Whelan, S.P.J., Ball, L.A., Barr, J.N. and Wertz, G.T.W.

(1995) Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92: 8388-8392.

Wensvoort, G., Terpstra, C, Bonstra, J., Bloemraad, M.

and Van Zaane, D. (1986) Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet. Microbiol. 12: 101-108.

Yusoff, K., Millar, N.S., Chambers, P., and Emmerson, P.T.

(1987) Nucleotide sequence analysis of the L gene of Newcastle disease virus: homologies with Sendai and vesicular stomatitis viruses. Nucl. Acids Res. 15: 3 961-3 976.

Claims (30)

1. Fugleparamyksovirus cDNA som minst omfatter en nukleinsyresekvens tilsvarende den 5'-terminale ende av Newcastle-sykdomsvirus som vist i figur 6 og som tillater å danne en infeksjonsdyktig kopi av fugleparamyksovirus.

2. cDNA ifølge krav 1 omfattende fullengdet cDNA.

3. cDNA som minst omfatter en nukleinsyresekvens tilsvarende 5'-terminal ende av genomet av Newcastle-sykdomsvirus som vist i figur 6 og som tillater å danne et replikerende fugleparamyksovirus minigenom.

4. cDNA ifølge kravene 1, 2 eller 3 som er minst delvis avledet fra Newcastle Disease Virus.

5. cDNA ifølge krav 4 hvor nevnte Newcastle Disease Virus er et lentogent virus, fortrinnsvis avledet fra en vaksinestamme .

6. cDNA ifølge krav 5 hvor nevnte vaksinestamme er en LaSota-stamme ATCC VR-699.

7. cDNA ifølge ethvert av kravene 1 til 6 ytterligere utstyrt med en modifikasjon i nukleinsyren valgt fra delesjon, innsetning og mutasjon.

8. cDNA ifølge krav 7 hvor nevnte modifikasjon resulterer i en nukleinsyre som koder for et modifisert proteasespaltingssete.

9. cDNA ifølge krav 8 hvor nevnte spaltingssete er et proteasespaltingssete av fusjons(F)proteinet.

10. cDNA ifølge krav 7 hvor nevnte modifikasjon resulterer i en nukleinsyre som koder for et viralt hybridprotein.

11. cDNA ifølge krav 10 hvor nevnte protein er et hemaglutinin-neuraminidase (HN)-protein.

12. cDNA ifølge krav 7 hvor nevnte modifikasjon omfatter en delesjon i en nukleinsyre som koder for et viralt protein .

13. cDNA ifølge krav 12 hvor nevnte virale protein er et matriseprotein (M).

14. cDNA ifølge ethvert av kravene 1 - 13, ytterligere utstyrt med en nukleinsyre som koder for et heterologt antigen .

15. cDNA ifølge krav 14 hvor nevnte antigen er avledet fra et fuglepatogen.

16. cDNA ifølge krav 14 eller 15 ytterligere utstyrt med en nukleinsyre som koder for et immunstimulatorisk protein eller deler derav.

17. RNA oppnådd fra et cDNA i henhold til ethvert av kravene 1-16.

18. Fremgangsmåte ved fremstilling av infeksjonsdyktig kopi av fugleparamyksovirus omfattende å transfektere minst en celle med cDNA i henhold til ethvert av kravene 1-16.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18 hvor nevnte celle er minst i stand til å uttrykke viralt nukleokapsid (NP), fosfo-(P) eller stort polymerase (L)protein.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 18 eller 19 ytterligere omfattende å tillate spalting av fusjonsproteinet av nevnte virus.

21. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 18 - 20, ytterligere omfattende å inkubere nevnte celle i vekstmedium omfattende proteolytisk aktivitet.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21 hvor nevnte vekstmedium omfatter allantoinvæske omfattende nevnte proteolytiske aktivitet .

23. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 18 til 22 hvor nevnte celle er avledet fra en kyllingcelle.

24. Infeksjonsdyktig kopi av fugleparamyksovirus som uttrykker et heterologt antigen og som kan fremstilles ved en fremgangsmåte i henhold til ethvert av kravene 18 - 23.

25. Vaksine omfattende et virus i henhold til krav 24.

26. Levende vaksine i henhold til krav 25.

27. Vaksine ifølge krav 25 eller 26 hvor nevnte infeksjonsdyktige kopi av fugleparamyksovirus er minst delvis avledet fra Newcastle Disease Virus (NDV).

28. Fremgangsmåte for å skjelne uvaksinerte dyr eller dyr vaksinert med en NDV-vaksine i henhold til krav 27 fra dyr infisert med villtype NDV eller vaksinert med en umodifisert mesogen eller lentogen NDV-stamme omfattende å ta minst en prøve fra nevnte dyr og bestemme i nevnte prøve tilstedeværelse av antistoff rettet mot en immunodominant epitop eller markør uttrykt av nevnte villtype eller umodifisert NDV, men ikke av nevnte vaksine.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 28 hvor nevnte antistoff er rettet mot HN- eller F-protein av NDV.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 28 eller 29 hvor nevnte dyr er valgt fra gruppen omfattende fjærfe, fortrinnsvis kyllinger.