EA004796B1 - Инфекционные клоны вируса ньюкаслской болезни, вакцины и диагностические анализы - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение касается способа получения инфекционного вируса ньюкаслской болезни (NDV) полностью из клонированной полноразмерной кДНК и применения вакцин и диагностических тестов, полученных с помощью упомянутых способов. Этот способ предоставляет возможность модифицировать геном NDV с помощью генетического модифицирования и позволяет вносить мутации, делеции и/или вставки. Данный способ можно использовать для модификации вирулентности NDV, тем самым получая новые ослабленные живые вакцины с улучшенными свойствами. Этот способ можно использовать для модифицирования антигенного спектра NDV, что позволяет получать живые маркерные NDV-вакцины, которые можно отличать от полевых штаммов NDV по серологическим параметрам.

Description

Настоящее изобретение касается инфекций вируса ньюкаслской болезни домашней птицы.

Вирус ньюкаслской болезни (ΝΌν) является одним из наиболее многообразных и смертельно опасных патогенов птиц. Почти одновременное распространение ньюкаслской болезни как явно новый тип заболевания в различных географических регионах и большое число типов разновидности и опасности заболевания вызвало некоторые проблемы в номенклатуре.

Эту болезнь называют рзспбо Го\\1 рсз1. рзспбо роиИгу р1адис, ау1ап рсз1. ау1ап бШстрсг и ау1аи рпситоспссрНаШк. Значение этой болезни определяется. главным образом. тем. что в XX веке птицеводство превратилось в интенсивно развивающуюся международную отрасль хозяйства, что сопровождается активными торговыми связями между странами.

В целом, считается, что первые вспышки ньюкаслской болезни были зарегистрированы в 1926 г. на острове Ява (Индонезия), а также в г. Ньюкасле-на-Тайне в Англии (КгапсусИ, 1926; Ооу1с, 1927). Название «ньюкаслская болезнь» было дано Дойлом как временное для того, чтобы при описании избежать путаницы по отношению к другим болезням. Позднее стало ясно, что другие менее тяжелые болезни обусловливались вирусами, не отличающимися от ΝΌν. В США относительно легко протекающее респираторное заболевание было названо пневмоэнцефалитом птиц и как было показано, оно вызывалось вирусом ΝΌν (ВсасН, 1944). В течение нескольких лет многочисленные изоляты ΝΌν, которые у домашних кур вызывали очень слабые симптомы или вообще являлись бессимптомными, были описаны для различных районов мира.

Было установлено влияние следующих механизмов на распространение данной болезни: 1) перемещения птиц вообще, диких птиц, дичи, почтовых голубей и одомашненных птиц; 2) перемещение людей и грузов; 3) перемещение продуктов птицеводства; 4) распространение частиц, взвешенных в воздухе; 5) загрязнение кормов для птицеводства; 6) загрязнение воды; 7) не полностью убитые или гетерогенные вакцины. В соответствии с ΟΙΕ, ньюкаслская болезнь представляет заболевание домашней птицы, вызываемое вирусом серотипа-1 парамиксовирусов птиц (ΑΡΜν-1), который характеризуется индексом интрацеребральной патогенности (1СР1) у суточных цыплят на уровне 0,7 или выше. Вирулентность вируса также может быть подтверждена на основании наличия множественных основных аминокислот на С-конце белка Б2 и присутствия Е (фенилаланина) в 117-м положении, являющимся Ν-концом белка Е1. Отсутствие признаков такой аминокислотной последовательности может требовать применения тестов 1СР1. Термин «домашняя птица» обозначает домашних кур, индеек, фазанов, уток, гусей, перепелок, голубей, цесарок, куропаток и нелетающих птиц (страусов и др.), которых выращивают или содержат в неволе для размножения, производства мяса и яиц для потребления или для искусственного воспроизводства природных популяций дичи.

В соответствии с А1схапбсг, 1988, три панзоотии ньюкаслской болезни были идентифицированы после первого описания данной болезни. Первая из них вызывала первые вспышки заболевания и, как считается, возникла в ЮгоВосточной Азии. Отдельные вспышки, такие как вспышка заболевания в Англии в 1926 г., отражали случайные проникновения, опережающие медленно надвигавшиеся через Азию на Европу инфекции.

Вторая панзоотия, как считается, появилась в Средней Азии в конце 60-х годов XX века и достигла большинства стран к 1973 г. Наиболее быстрое распространение второй панзоотии, по-видимому, объясняется настоящей революцией в птицеводстве, сопровождающейся интенсивной международной торговлей.

Третья панзоотия в основном поразила одомашненных птиц, таких как голуби (Ушбсуодс1 & ОисНШск 1988). Эта вспышка заболевания предположительно возникла на Среднем Востоке в конце 70-х годов. К 1981 г. она достигла Европы и затем быстро распространилась в другие районы мира, в основном в результате контакта между птицами во время выставок и соревнований, а также в результате международной торговли такими птицами.

В настоящее время ньюкаслская болезнь весьма широко распространена во многих странах Азии, Африки, обеих Америк и Европы. Только страны Океании относительно свободны от этой болезни (8ргабЬготе, 1988).

Вирус ΝΌν относится к отряду МопопсдаУ1га1с8, семейству парамиксовирусов Рагатухоушбас, подсемейству Рагатухоушпас, роду ВпЬу1ау1гп5. Помимо ΝΌν, обычно называемого парамиксовирусом 1-го типа птиц, восемь других серотипов, обозначенных как парамиксовирусы типов от 2 до 9 птиц, могут быть идентифицированы на основании параметров их антигенного родства, определяемых в тестах на ингибирование гемагглютинации и в тестах на нейтрализацию сыворотки (А1схапбсг, 1993).

Несмотря на стабильность серологической дифференцировки, имеется ряд перекрестных родственных отношений между вирусами, относящихся к различным серотипам.

Геном ΝΌν представлен молекулой одноцепочечной РНК с отрицательной полярностью, комплементарной информационной мРНК, которая кодирует вирусные белки. РНК-геном состоит приблизительно из 15200 нуклеотидов и кодирует следующие генные продукты (перечислены от З'-конца к 5'-концу последовательности геномной РНК): нуклеокапсидный белок (ΝΡ), фосфопротеин (Р), матричный белок (М), белок слияния (Е), гемагглютинин-нейрами нидаза (ΗΝ) и крупный белок с полимеразной активностью (Ь) (СНашЬсгк с1 а1., 1986).

РНК формирует комплекс с белками ΝΡ, Р и Ь с образованием рибонуклеокапсидной частицы (ΚΝΡ), которая окружена оболочкой, выстланной с внутренней стороны белком М. В состав оболочки входят белки Р и ΗΝ, которые участвуют в процессах присоединения к клеткехозяину и проникновения в нее.

Репликация ΝΏν сходна по своим основным параметрам с таковой у других парамиксовирусов. Исходным этапом является прикрепление вируса к рецепторам клетки-хозяина, в котором участвует вирусный белок ΗΝ. Слияние вирусной оболочки с мембраной клетки-хозяина определяется действием как белка ΗΝ, так и белка Р, в результате чего ΒΝΡ высвобождается непосредственно в цитоплазму, где происходит репликация вируса.

Вирусная РНК-зависимая РНК-полимераза (входящая в состав ΒΝΡ) участвует в образовании комплементарных транскриптов, которые выполняют роль мРНК и используются трансляционной системой клетки-хозяина для синтеза вирусных белков. Благодаря накоплению белка ΝΡ, комплекс РНК-полимеразы переключает транскрипцию на репликацию, в результате чего происходит синтез полноразмерных геномных и антигеномных (комплементарных) молекул РНК.

Новосинтезированные ΒΝΡ упаковываются в капсиды на клеточной мембране в результате активности белка М, а также белков Р и ΗΝ, которые накапливаются на клеточной плазматической мембране. Новообразованные вирусные частицы высвобождаются с инфицированной клетки по механизму «почкования». Более подробное описание процессов репликации ΝΏν можно найти у Рсср1ск. 1988. В качестве более поздних обзоров по молекулярной биологии парамиксовирусов см. ЬатЬ & Ко1акоГкку, 1996.

Помимо промышленных домашних птиц (т.е. кур, цесарок, фазанов, индеек, уток, гусей, голубей), очень широкий круг содержащихся в неволе, частично одомашненных видов и диких («свободноживущих») птиц, включая мигрирующих водоплавающих птиц, восприимчивы к ΝΏν и могут являться первичными источниками инфекции (Ка1е1а & ВаИаиГ, 1988).

Патогенность штаммов ΝΏν в значительной степени зависит от вида поражаемого организма. Наиболее устойчивыми видами, повидимому, являются водоплавающие птицы, в то время как наиболее восприимчивыми являются стайные птицы, временами образующие стабильные скопления. Домашние куры характеризуются высоким уровнем восприимчивости, но утки и гуси также могут заражаться, проявляя при этом слабые симптомы болезни или не проявляя их вовсе, даже при заражении штаммами, летальными для кур.

Ньюкаслская болезнь осложнена тем, что различные изоляты и штаммы этого вируса могут индуцировать самую широкую изменчивость тяжести болезни. Штаммы и изоляты ΝΏν были классифицированы (Веагй & Напкоп, 1984) в различные патотипы, характеризующиеся симптомами болезни, которые можно выявить у полностью восприимчивых кур: 1) висцеротропный велогенный ΝΏν, вызывающий острую летальную инфекцию, при которой в кишечнике происходят кровоизлияния; и нейротропный велогенный ΝΏν, который вызывает высокую смертность, обусловливаемую респираторными и нейрологическими симптомами, но без поражения кишечника; 2) мезогенный ΝΏν, который обусловливает низкий уровень смертности, острую респираторную инфекцию и симптомы в нервной системе у отдельных птиц; 3) лентогенный ΝΏν, который вызывает слабую респираторную инфекцию или не вызывает ее вовсе, или даже бессимптомный кишечный ΝΏν, авирулентный вирус, который в основном воспроизводится в клетках пищеварительного тракта. Сообщалось о некотором перекрывании симптомов у разных групп.

Вирус попадает в организм через дыхательные пути или пищеварительный тракт, или через глаза. В трахее вирус распределяется с участием реснитчатого эпителия и по механизму «от клетки к клетке». После исходного размножения в месте проникновения вирус в результате периодов виремии переносится в селезенку, печень, почки и легкие. Вирусы некоторых штаммов достигают жизненно важных органов, таких как печень и почки, очень быстро, поэтому птицы могут погибать еще до того, как у них проявятся визуальные симптомы болезни.

Большинство вирусов достигает центральной нервной системы через кровь до того момента, как начинает вырабатываться достаточное количество антител. Потенциальную угрозу для птицеводства представляет статус длительного бессимптомного носительства, предположительно характерного для попугаев. Долговременное носительство как лентогенного, так и велогенного вируса также может иметь место у кур (Неи8сйе1е & Еайегйау, 1970).

В процессе репликации ΝΏν для того, чтобы он стал инфекционным, необходимо, чтобы гликопротеин-предшественник Ро был расщеплен с образованием Р1 и Р2 (Вой & К1епк, 1988). Такое посттрансляционное расщепление происходит с участием протеаз клеткихозяина. Если такое расщепление отсутствует, то образуются инфекционные вирусные частицы, а репликации вирусов не происходит. Белок Ро вирулентных вирусов может быть расщеплен с участием широкого круга протеаз, однако, белки Ро вирусов, характеризующихся слабой вирулентностью, ограничены по своей восприимчивости к протеазам, поэтому такие вирусы могут ίη νίνο расти только в некоторых типах клеток-хозяев и в принципе не способны расти ίη νίΐτο.

Лентогенные вирусы реплицируются только в участках, имеющих трипсиноподобные ферменты, таких как дыхательный и пищеварительный тракты, в то время как вирулентные вирусы могут реплицироваться в значительном числе тканей и органов, в результате чего развивается фатальная системная инфекция.

Аминокислотное секвенирование предшественника Ео показало, что слабовирулентные вирусы включают единственный остаток аргинина (В) , который соединяет компоненты Е1 и Е2, в то время как у вирулентных вирусов имеются дополнительные основные аминокислоты, которые в сайте расщепления образуют две пары, такие как К/В-Х-К/В-В-Е. Кроме того, пептид Е2 вирулентных штаммов обычно начинается остатком фенилаланина, в то время как у невирулентных штаммов он обычно начинается с лейцина.

У некоторых штаммов ΝΏν белок ΗΝ также вырабатывается в виде предшественника, для биологической активации которого требуется расщепление (Сайеп с1 а1., 1980; МШат с1 а1., 1988).

Помимо расщепления белков Е и ΗΝ, другие вирусные факторы могут участвовать в патогенности. Было показано (Мабапкку & ВгаИ. 1978, 1981а, 1981Б), что изменения в транскрипции и трансляции могут модулировать рост и распространение вируса от клетки к клетке, а также цитопатогенность.

Исходный иммунный ответ на заражение вирусом ΝΏν является клеточным и может быть выявлен, по крайней мере, через 2-3 дня после инфицирования живыми вирусными штаммами. Предположительно это объясняет раннюю защиту от заражения, которая была описана у вакцинированных птиц перед тем, как выявляется измеримое количество антител (боидй & А1ехапбет, 1973).

Примерно через неделю после инъекции циркулирующие антитела могут защищать организм от повторной инфекции. На ранних этапах участвует 1дМ, а после этого 1дС. Титры антител и пики защищенности примерно через 3 недели резко идут на убыль, если отсутствует повторная иммунизация («бустинг»). Это означает необходимость повторных вакцинаций более старых птиц.

Только живые вакцины, вводимые через дыхательную систему, стимулируют появление антител на всех слизистых поверхностях, а также в сыворотке. Инактивированная вакцина, даже при ее внутримышечном введении, не обусловливает локальной респираторной резистентности, даже несмотря на высокое содержание антител в сыворотке.

Это подчеркивает важность живых вакцин, способных доводить вирусный антиген до верхних отделов дыхательного тракта с точки зрения индукции как местного, так и системного иммунитета. Небольшие капли проникают в нижние отделы дыхательной системы, тем самым способствуя в основном выработке гуморального иммунного ответа, в то время как более крупные капли стимулируют местный иммунитет в верхних отделах дыхательного тракта. Следовательно, аэрозоли, содержащие разные по размеру частицы, обусловят наиболее эффективный как местный, так и гуморальный иммунитет.

Однако необходимо отметить, что, несмотря на интенсивную вакцинацию уже существующими в настоящее время вакцинами, обеспечивающими выработку высоких титров антител, тем не менее, вирус может быть выделен со слизистых поверхностей.

Идентификация ньюкаслской болезни в США привела к применению инактивированных вакцин (НоГйаб, 1953). Наблюдения за тем, что некоторые энзоотические вирусы вызывают только слабые симптомы болезни, вначале привели к разработке мезогенной живой вакцины Воакт (Веаибейе еΐ а1., 1949), а после этого к получению ослабленных штаммов Нйсйпет В1 (Нйсйпет & ίοΐιηδοη, 1948) и Ба8о1а (Со1ййаГ1, 1980), которые в настоящее время наиболее широко применяются в качестве живых вакцин.

Живые ΝΏν-вакцины могут быть подразделены на две группы, лентогенные и мезогенные. Мезогенные штаммы пригодны только для повторной вакцинации птиц из-за их достаточно существенной вирулентности. Иммунный ответ усиливается наряду с повышением патогенности живой вакцины. Следовательно, для достижения желательного уровня защиты без существенного проявления болезни в существующих программах вакцинации применяется последовательное использование вакцин с постепенно возрастающей вирулентностью или использование живых вакцин после инактивированных вакцин.

Одно из преимуществ живых вакцин связано с тем, что они могут быть введены с помощью низкозатратных массовых методов. Обычный метод такого введения основан на использовании питьевой воды. Однако использование питьевой воды должно тщательно контролироваться, потому что вирус может утратить активность в результате нагревания или освещения, или действия вирицидных примесей самой воды.

Массовое применение живых вакцин с помощью распылителей или аэрозолей также весьма популярно из-за простоты возможной вакцинации большого числа птиц за короткий период времени. Важным является обеспечение точного размера частиц, для чего применяется контроль условий, при которых эти частицы образуются.

У применяемых в настоящее время живых вакцин имеются некоторые недостатки. Вакцина может вызывать симптомы болезни, что зависит

Ί от условий внешней среды и присутствия осложняющих инфекций. Следовательно, важно для первичной вакцинации использовать максимально ослабленный вирус, и соответственно, требуется проведение неоднократных вакцинаций. Более того, материнские антитела могут предотвращать успех первичной вакцинации с использованием лентогенных живых вакцин.

Инактивированные вакцины обычно получают на материале инфицированной аллантоисной жидкости, которую обрабатывают формалином или β-пропиолактоном для того, чтобы убить вирус, и смешивают с подходящим адъювантом. Инактивированные вакцины вводят путем инъекции, либо внутримышечно, либо подкожно. Инактивированные вакцины в связи с их получением и применением весьма дороги.

Однако инактивированные масляноэмульсионные вакцины не в такой степени подвержены отрицательному влиянию материнского иммунитета, как это происходит в случае живых вакцин, поэтому их можно применять для суточных цыплят. Преимуществами инактивированных вакцин являются низкий уровень неблагоприятных реакций у вакцинированных птиц, высокий уровень защитных антител и значительная продолжительность защиты. Ни одна из указанных выше вакцин не дифференцируется серологически от вируса ΝΏν дикого типа.

Разработка рекомбинантных вирусных вакцин представляла интерес для промышленного птицеводства на протяжении ряда лет. Сутью такого подхода является внесение генов, кодирующих ключевые иммуногенные эпитопы представляющего интерес возбудителя болезни, в несущественные участки генома вируса, служащего вектором. Следовательно, вакцинация рекомбинантным вирусом приводит к иммунизации как против вируса-вектора, так и против анализируемого болезнетворного агента.

Некоторые типы вирусов были оценены в качестве возможных живых вирусных вакцин для птицеводства. Два вируса птиц, которые привлекли наибольшее внимание, представляют вирус куриной оспы (ΕΡν) и герпесвирус индеек (ΗνΤ). Вирус куриной оспы является ДНКвирусом, характеризующимся крупным геномом, следовательно, он весьма вместителен с точки зрения включения чужеродных генов.

После ослабления вирус ΕΡν не вызывает клинической картины болезни и обычно используется в качестве вакцины для домашних кур. Вирус ΗνΤ также является ДНК-вирусом и классифицируется как серотип III семейства вирусов болезни Марека (ΜΌν). ΗνΤ непатогенен для кур, обеспечивает перекрестную защиту от ΜΌν и обычно используется для вакцинации кур против болезни Марека.

Было показано, что защита против ньюкаслской болезни может быть вызвана путем использования рекомбинантных вакцин ΗνΤ или ΕΡν (Могдап е1 а1., 1992, 1993; Неекей е1 а1.,

1996; Воигкпей е1 а1., 1990; Тау1ог е1 а1., 1990).

Однако проявление защиты против ньюкаслской болезни после вакцинации такими рекомбинантными вакцинами, которые экспрессируют либо белок Б вируса ΝΏν, либо оба белка Б и ΗΝ, в значительной степени задерживалось по сравнению с ситуацией при вакцинации стандартной живой или инактивированной вакциной ΝΏν, что, по-видимому, объясняется тем, что рекомбинантные вакцины либо не обеспечивают достаточной широты спектра антигенно активных эпитопов ΝΏν, помимо тех, которые находятся в составе белка ΝΏν, экспрессируемого рекомбинантной вакциной, либо не претерпевают точного презентирования иммунной системе.

Более того, в результате вакцинации птиц рекомбинантыми вакцинами не происходило эффективной индукции местной защиты (для слизистых, дыхательной системы и пищеварительного тракта). Это является серьезным недостатком, так как вакцины, используемые для исходной вакцинации против респираторных заболеваний, должны обеспечивать местный иммунитет для предотвращения инфекции и распространения вирулентных вирусов, которые заражают кур, содержащихся в открытых условиях.

Антитела к ΝΏν, которые способны защищать организм-хозяин, могут быть количественно оценены в тестах на нейтрализацию вирусов. Однако поскольку ответ на нейтрализацию развивается параллельно ответу на подавления гемагглютинации (ΗΙ-реакция), последний из указанных тестов часто применяют для оценки защитного ответа, особенно после проведения вакцинации.

Антитела, специфичные в отношении обоих белков Б и ΗΝ, могут нейтрализовывать ΝΏν. Однако антитела к белку Б, по-видимому, обусловливают более значительную нейтрализацию по сравнению с таковой в случае с антителами к белку ΗΝ в тестах ίη νίνο и ίη νίΐτο (Меи1ешап5 е1 а1., 1986).

Присутствие специфичных антител к ΝΌν в сыворотке птицы дает недостаточную информацию об инфекционном штамме ΝΏν, а следовательно, имеет ограниченное диагностическое значение.

Распространенность лентогенных штаммов ΝΏν у птиц в большинстве стран и практически повсеместное применение живых вакцин, которые невозможно отличать, по крайней мере, при серологическом сравнении от штаммов ΝΌν дикого типа, означает, что простое выявление инфекции редко оказывается адекватным обоснованием для применения мер по борьбе с ней. Поскольку болезнь в естественных условиях может быть неинформативным маркером реальной вирулентности данного вируса, то необхо9 димо дополнительно охарактеризовать обнаруженный вирус.

В настоящее время единственным способом диагностики ньюкаслской болезни, который бы позволял характеризовать инфекционный штамм, является выделение вируса с последующим его патогенетическим анализом. В настоящее время существуют три таких теста, проводимые ίη νίνο: 1) среднее время гибели яиц (тест МОТ); 2) индекс интрацеребральной патогенности (1СР1) у суточных цыплят; 3) индекс внутривенной патогенности (ΐνΡΙ) у 6недельных птиц.

Этим тестам свойственен ряд недостатков, таких как доступность объектов, плохая воспроизводимость результатов и относительно длительное время анализа. Наконец, хотя это не менее важно, указанные тесты не позволяют достаточно просто разграничивать птиц, вакцинированных вакциной или инфицированных штаммом дикого типа, по серологическим параметрам.

В качестве альтернативы тестам ίη νίνο полимеразная цепная реакция (ПЦР) была успешно применена для распознавания вирулентных и невирулентных изолятов (§1аиЬег е! а1., 1995; Кап! е! а1., 1997), однако, с другой стороны, серологическая дифференцировка была невозможна.

Развитие птицеводства и торговли продуктами птицеводства в настоящее время вышло на международный уровень, и часто контролируется транснациональными корпорациями. Угроза ньюкаслской болезни является существенным фактором, ограничивающим развитие такой торговли.

Успешный контроль ньюкаслской болезни будет достигнут только тогда, когда все страны будут сообщать о ее вспышках. Однако достижение международных соглашений не так просто из-за значительного варьирования степени контроля над заболеваемостью в различных странах. Некоторые страны не проводят вакцинацию и отказываются от какого бы то ни было внесения ΝΏν в популяции домашних птиц, поскольку вакцинированных птиц не удается отличить от тех, которые были заражены вирусом ΝΏν дикого типа.

В других странах допускается использование только конкретных живых вакцин, а другие вакцины рассматриваются как неприемлемые и вирулентные. В ряде стран еще сохраняется присутствие циркулирующего высоковирулентного вируса, что, однако, не удается распознать из-за маскировки настоящей болезни последствиями вакцинации.

Во многих странах существуют законодательные акты, позволяющие контролировать вспышки ньюкаслской болезни, которые могут происходить. Государственные мероприятия направлены на предотвращение попадания и распространения возбудителя. В большинстве стран существуют ограничения в торговле продукцией птицеводства, яйцами и живой птицей. В большинстве стран существуют карантинные процедуры для импортной продукции, особенно для попугаев.

В некоторых странах проводится политика искоренения инфекции с принудительным уничтожением зараженных птиц, контактировавших с ними птиц и продуктов. В других требуется профилактическая вакцинация птиц даже при отсутствии вспышек, хотя в ряде стран существует политика «кольцевой вакцинации», проводимой с целью формирования вокруг района вспышки буферной зоны.

Очевидно, что существует насущная потребность в усовершенствованных вакцинах и в усовершенствованных методах диагностики, которые можно применять для контроля ньюкаслской болезни. Обусловленные как значительными различиями в той дозе, которую получают отдельные птицы в случае проведения массовой вакцинации живыми вакцинами, так и изменчивостью в уровнях материнского иммунитета у молодых цыплят, реакции после вакцинации живыми вакцинами оказываются неизбежными. Это является одной из основных причин для недовольства фермеров в тех странах, в которых вакцинация является обязательной.

Более того, многие вакцины представлены смесями субпопуляций. После клонирования эти субпопуляции могут в значительной степени отличаться друг от друга по параметрам иммуногенности и патогенности (Ншъоп. 1988).

Однако самым существенным недостатком применяемых в настоящее время живых вакцин и инактивированных вакцин является тот факт, что вакцинированных животных нельзя отличить от зараженных животных, используя современные методы скрининга, такие как тест на подавление гемагглютинации или тест на нейтрализацию вируса.

Соответственно, по-прежнему вирулентный полевой вирус может распространяться среди вакцинированных популяций, поскольку симптомы болезни маскируются вакцинацией. Поскольку выделение вируса и характеристика вирулентности методами ίη νίνο в большом масштабе затруднительна, имеется существенная потребность в новых живых и эффективно ослабленных вакцинах, которые можно было бы отличать от полевых вирусов по серологическим параметрам.

Такие вакцины, названные ΝΏνмаркерными вакцинами (и сопровождающие их способы диагностики и наборы реактивов), которые должны представлять наиболее полный возможный иммунологический спектр эпитопов ΝΏν с соответствующими антигенными свойствами и, кроме того, должны по серологическим признакам отличаться от ΝΏν дикого типа, до сих пор не были доступны.

Настоящее изобретение представляет способ модификации генома парамиксовируса птиц с помощью генетической модификации, представляет генетически модифицированный парамиксовирус птиц и маркерную по парамиксовирусу птиц вакцину.

Развитие современных молекулярногенетических методов позволяет проводить генетическую модификацию многих РНКвирусов, включая вирусы с некодирующими одноцепочечными РНК. Такую стратегию часто называют «обратной генетикой». Сначала создают кДНК-копию (полноразмерную) вирусной РНК, после чего транскрибируют эту ДНК в соответствующих клетках с получением инфекционной РНК, которая вновь может реплицироваться с образованием инфекционных вирусных частиц.

В целом, путем предварительной модификации кДНК с применением стандартных молекулярно-биологических методов возможным оказывается получить генетически модифицированный РНК-вирус. Однако такой подход ни разу ранее не применяли в отношении ΝΌν или других парамиксовирусов и даже еще не было возможным создать минигеномные фрагменты или плазмиды на материале фрагментов генома парамиксовируса птиц с целью изучения процессов репликации парамиксовирусов птиц, тем самым приходя к пониманию того, как сконструировать инфекционную вирусную копию.

Хотя в данном описании теперь полностью установлено, что геном парамиксовируса птиц является самым маленьким среди всех секвенированных к настоящему времени геномов парамиксовирусов, особенно 5'-концевой участок последовательности генома ΝΏν неожиданно оказалась существенно длиннее, чем это ранее было установлено и чего можно было ожидать, исходя из сравнительного анализа других представителей Рагатухоушбае. Настоящее изобретение впервые представляет полную последовательность генома парамиксовируса птиц и представляет полноразмерную или минигеномную кДНК такого вируса.

Настоящее изобретение представляет здесь кДНК парамиксовируса птиц, по крайней мере, включающую нуклеотидную последовательность, соответствующую 5'-концевому участку генома парамиксовируса птиц, позволяющему создавать инфекционную копию парамиксовируса птиц, притом, что предпочтительно кДНК включает полноразмерную кДНК. Однако настоящее изобретение также представляет кДНК, по крайней мере, включающую нуклеотидную последовательность, соответствующую 5'-концевому участку генома парамиксовируса птиц, позволяя тем самым образовывать реплицирующийся минигеном парамиксовируса птиц. Такие минигеномы преимущественно можно использовать для транскрипции РНК и/или экспрессии белка с нуклеиновых кислот с модифи цированной последовательностью. Настоящее изобретение представляет кДНК в соответствии с изобретением, которая, по крайней мере отчасти, является производной от вируса ньюкаслской болезни, например, при том, что указанный вирус ньюкаслской болезни представляет лентогенный вирус, предпочтительно являющийся производным от вакцинного штамма, такого как штамм Ласота (Ьа8о!а), АТСС νΚ699.

Кроме того, настоящее изобретение представляет кДНК в соответствии с изобретением, дополнительно содержащую модификацию, такую как делеция, вставка, мутация, реверсия или иное изменение в нуклеиновой кислоте. Например, представляется кДНК, в составе которой указанная модификация включает нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированный сайт расщепления протеазой, например, когда указанный сайт расщепления является сайтом расщепления протеазой, характерным для слияния белка (Е).

Еще в одном варианте настоящее изобретение представляет кДНК в соответствии с изобретением, в составе которой упомянутая модификация включает нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный вирусный белок, такой как гибридный белок гемагглютининнейраминидазы (ΗΝ), как описано в экспериментальном разделе настоящего изобретения. Также настоящее изобретение представляет кДНК в соответствии с изобретением, в составе которой упомянутая модификация является делецией в нуклеиновой кислоте, кодирующей вирусный белок, такой как матричный белок М.

Кроме того, настоящее изобретение представляет кДНК в соответствии с изобретением, дополнительно включающую нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный антиген, предпочтительно притом, что указанный антиген является производным от патогена птиц, как, например, описано далее. Также представляются РНК и производный от нее белок, полученные из кДНК в соответствии с настоящим изобретением.

Недавно некоторые вирусы с несегментированной некодирующей РНК-цепью были полностью охарактеризованы, а фундаментальные исследования по репликации и экспрессии их геномов обеспечили возможность создания инфекционного вируса полностью с помощью клеток, трансфицируемых клонированной кДНК упомянутого вируса (обзор Оопхейпапп. 1996).

К настоящему времени инфекционные частицы вирусов с несегментированной некодирующей РНК-цепью были получены с использованием клонированной кДНК, например, вируса бешенства (8с1те11 е! а1., 1994; Сои2е1таии, европейская патентная заявка ЕР 0702085 А1), вируса везикулярного стоматита (Ьа^кои е! а1., 1995; \УНе1ап е! а1., 1995), вируса Сендай (Оагсш е! а1., 1995), вируса кори (Кабеске е! а1., 1995;

8сЬпе1бег с1 а1., 1997; европейская патентная заявка ЕР 0780475 А1), респираторносинцитиального вируса человека (СоШпк е1 а1., 1995), вируса чумы рогатого скота (Вагоп & ВаггеП. 1997) и вируса парагриппа человека 3-го типа (Нойтап & Вапег|ее. 1997; Сопхе1тапп. европейская патентная заявка ЕР 0702085 А1) (8сЬпе11 е1 а1., 1994; европейская патентная заявка ЕР 0702085 А1).

Однако все указанные выше инфекционные копии вирусов способны расти как ίη νί\Ό. так и ίη уйго в организмах-хозяевах, тканях или клетках различного происхождения, что обеспечивает простую трансфекцию кДНК, ее репликацию и образование инфекционных вирусных частиц в подходящей линии клеток.

Такая возможность отсутствует в случае с ΝΏν, а, значит и для лентогенных штаммов ΝΏν, используемых в вакцинах. Вирулентность такого штамма ΝΏν опосредована его способностью реплицироваться в широком круге клеток, а это проявляется в том, что вирулентные штаммы могут легко реплицироваться ίη уйго и ίη у1уо, в то время как вакцинные штаммы могут реплицироваться исключительно ίη у1уо.

Таким образом, для ΝΏν характерна парадоксальная ситуация. Хотя попытки создать инфекционную копию вируса, например, с использованием инфекционной кДНК, повидимому, могут дать в результате инфекционный вирус, такой вирус в принципе непригоден для использования в качестве вакцины, поскольку полученный таким образом инфекционный вирус «по умолчанию» слишком вирулентен, чтобы использоваться в качестве вакцины; тот факт, что он может быть образован и реплицирован после трансфекции кДНК клеточной линии, отражает его легкую расщепляемость по белку Ео на Е1 и Е2, что обсуждалось выше в связи с критериями вирулентности ΝΏν.

Используя вакцинный штамм в качестве исходного материала для получения кДНК, невозможно решить данную проблему; вакцинный штамм, особенно лентогенного типа, не содержит легко расщепляемого белка Ео, в результате чего невозможно получить вирус первого поколения, который мог бы реплицироваться. Клетка, используемая для трансфекции, не должна быть способной к поддержанию одного или нескольких циклов репликации вируса вакцинного типа, включающего нерасщепленный белок Ео.

Настоящее изобретение теперь предлагает изящное решение данной проблемы и тем самым представляет инфекционную копию ΝΏν, например, для использования в вакцине.

Настоящее изобретение представляет способ создания инфекционной копии вируса нькаслской болезни, включающий трансфекцию клеток, способных экспрессировать вирусные белки ΝΡ, Р и Ь для образования комплекса с вирусной РНК, с использованием клонирован ной полноразмерной кДНК или кДНК, соответствующей по размеру геному упомянутого вируса, и дополнительно включающий инкубацию упомянутых клеток в питательной среде, проявляющей протеолитическую активность, обеспечивающую расщепление белка Ео упомянутого вируса.

В системе, использованной заявителями, котрансфекцией плазмиды, экспрессирующей ΝΡ, можно пренебречь. По-видимому, ΝΡ экспрессируется с полноразмерной кДНК, так как ген ΝΡ является первым по расположению геном после 5'-концевого участка антигеномной последовательности РНК. Поскольку эукариотические мРНК обычно являются моноцистронными, экспрессии дистально расположенных генов не предполагается. Однако возможным является создание полноразмерной кДНК, в которой относительное расположение генов ΝΏν изменено. Если вначале в кДНК расположен такой ген, как ген Р и Ь, то нет необходимости в экспрессии соответствующего генного продукта с котрансфицируемой плазмиды.

В качестве альтернативы использованию полноразмерной кДНК возможным является использование двух или большего числа субгеномных (по размеру) кДНК, на матрице которых образуются компетентные по репликации субгеномные РНК и которые вместе друг с другом экспрессируют полный комплект белков парамиксовируса птиц. Даже если эти РНК упакованы по отдельности, образующиеся в результате вирусоподобные частицы можно использовать для последовательных циклов репликации путем совместной инфекции и комплементации функций разных генов.

В предпочтительном варианте настоящее изобретение представляет способ, в котором указанная протеолитическая активность обеспечивается ферментом, таким как трипсиноподобный фермент, или обеспечивается композицией, содержащей указанную протеолитическую активность. В наиболее предпочтительном варианте указанная питательная среда содержит аллантоисную жидкость, обладающую протеолитической активностью. Расщепление белка Ео необходимо для образования инфекционного вируса.

Возможным является образование инфекционного вируса на материале лентогенного штамма без добавления внешней протеолитической активности. При инокуляции надосадочным слоем трансфицированных клеток в полость аллантоиса развивающегося яйца протеолитическая активность, характерная для аллантоисной жидкости, будет способна расщеплять белок Ео с образованием компетентного по слиянию комплекса Е1/Е2. Вирионы с таким активированным белком Е способны инфицировать восприимчивые клетки и реплицироваться в клетках, проявляющих желательную протеолитическую активность, с получением инфек15 ционного потомства. В качестве альтернативы внесения желательной протеолитической активности в надосадочный слой трансфицированных клеток можно, например, использовать клетку, которая пермиссивна по ΝΏν и которая уже проявляет указанную протеолитическую активность. Такую клеточную линию используют для получения инфекционного лентогенного ΝΏν без добавления внешней протеолитической активности. Также такая клеточная линия может быть образована с помощью стабильной трансфекции клеточной линии геном, который обеспечивает упомянутую активность. Более того, возможным является создание стабильно трансфицированной клеточной линии, которая экспрессирует белок Б дикого типа в состав вирусной оболочки, тем самым образуя инфекционные частицы (сами они лишены геномной информации, кодирующей белок Б дикого типа), способные проникать в клетку. Спасение инфекционного лентогенного вируса также возможно с помощью инфицирования трансфицированных клеток вирусом-помощником ΝΏν. Важным требованием, предъявляемым к такому вирусу-помощнику, должно быть то, чтобы он подлежал отбору, например, с использованием нейтрализующих антител, которые удаляют вирус-помощник, но которые не взаимодействуют с самим лентогенным вирусом. Наконец, можно сконструировать стабильно трансфицированную клеточную линию, которая бы экспрессировала один, два или все три ключевых белка ΝΏν, ΝΡ, Р и Ь. С точки зрения поддержания образования инфекционных копий вируса для таких клеточных линий необходима коэкспрессия только набора из трех ключевых белков или коэкспрессия вообще не нужна.

В предпочтительном варианте настоящее изобретение представляет способ, в котором указанные клетки, использующиеся для трансфекции, являются производными от первичных или вторичных клеток или клеточных линий цыпленка. В качестве примера в описании приводятся клетки СЕВ или СЕБ, которые, как и большинство клеток ίη νίίτο, в принципе лишены соответствующих протеаз, необходимых для расщепления белка Бо вируса ΝΏν, например, штамма Ба8о1а. Однако также можно использовать клетки, производные, например, от других птиц.

Далее настоящее изобретение представляет способ создания инфекционной копии вируса ньюкаслской болезни, включающий трансфекцию клеток с использованием клонированной полноразмерной кДНК или кДНК геномного размера указанного вируса, например, в соответствии с показанным на фиг. 3, и дополнительно включающий инкубацию указанных клеток в питательной среде, содержащей протеолитическую активность, обеспечивающую расщепление белка Бо указанного вируса, дополнительно включающий выделение инфекционного вируса путем культивирования указанных клеток и инокуляции материала, полученного от указанных культивируемых клеток, в аллантоисную полость развивающегося яйца. Указанный материал, например, содержит клетки (собранные или замороженные-оттаенные) или клеточный дебрис, или надосадочный слой, полученный от указанной клеточной культуры.

Например, в данном тексте описывается способ выделения инфекционного вируса, в котором надосадочный слой трансфицированных монослойных культур клеток СЕБ был инокулирован в аллантоисную полость развивающихся яиц. Через 4 дня собирали аллантоисную жидкость, анализировали ее в гемагглюнатинационном тесте и далее перепрививали в яйца.

Кроме того, настоящее изобретение представляет способ, дополнительно включающий перепрививание указанной инфекционной копии вируса ньюкаслской болезни путем сбора аллантоисной жидкости и повторной инокуляции развивающихся яиц.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения представляется способ, в котором указанный вирус является лентогенным вирусом, например, производным от авирулентного полевого вируса ΝΏν или от вакцинного штамма ΝΏν, такого как штамм ΝΏν Ба8о1а. Более того, представляется способ модификации генома парамиксовируса птиц путем генетического модифицирования, что позволяет вносить одну или несколько мутаций, делеций и/или вставок или иных модификаций. Например, представляется способ ослабления или модифицирования вирулентности парамиксовируса птиц путем модифицирования кДНК, например, кодирующей вирусный белок, такой как белок ν, клонирования указанной модифицированной кДНК в состав полноразмерной кДНК и создания инфекционной копии вируса с указанной полноразмерной кДНК, в результате чего получают новые штаммы ΝΏν или новые ослабленные живые вакцины, обладающие улучшенными свойствами.

Помимо ослабления в результате модификации генных продуктов также возможным является ослабление парамиксовируса птиц с помощью модифицирования нуклеотидных последовательностей, которые вовлечены в транскрипцию и/или репликацию. Такие модификации обусловливают получение ослабленных штаммов, которые экспрессируют близкие к дикому типу белки Б, расщепляемые как ίη νίίτο, так и ίη νίνο в широком круге клеток, а в результате обусловливающие более высокий уровень иммуногенности по сравнению с классическими вакцинными штаммами.

В предпочтительном варианте настоящее изобретение представляет способ ослабления или модифицирования вирулентности парамиксовируса птиц, такого как вирус ньюкаслской болезни, включающий модификацию сайта расщепления протеазой в вирусном белке путем модифицирования кДНК, кодирующей указанный сайт расщепления, дополнительно включающий клонирование указанной кДНК в состав кДНК геномного размера, например, вируса ньюкаслской болезни, с образованием инфекционной копии вируса ньюкаслской болезни. Например, указанный сайт расщепления является сайтом протеазного расщепления в последовательности белка Б или ΗΝ вируса ньюкаслской болезни. В целом, ослабление ограничивается снижением вирулентности, однако, сейчас также возможно использовать относительно авирулентный штамм ΝΏν и получать потомство такого штамма, характеризующееся повышенной вирулентностью, например, путем внесения их для репликации в клетки специфического типа. Так, в настоящее время возможно придать вирусу ΝΏν различные уровни вирулентности.

Настоящее изобретение представляет способ антигенной модификации парамиксовируса птиц, такого как вирус ньюкаслской болезни, включающий модифицирование кДНК, кодирующей по крайней мере часть вирусного белка, несущего по крайней мере один иммунодоминантный эпитоп, дополнительно включающий клонирование указанной кДНК в состав кДНК геномного размера вируса ньюкаслской болезни и создание инфекционной копии вируса ньюкаслской болезни.

Например, настоящее изобретение представляет способ (дополнительного) модифицирования ΝΏν, например, с использованием уже предусмотренного способа создания инфекционной копии ΝΏν (вакцины), т.е. представляется способ получения рекомбинантной ΝΏνмаркерной вакцины, причем маркерная вакцина содержит наиболее полный из возможных или необходимых иммунологический спектр соответствующих антигенных эпитопов ΝΏν, а также серологически отличается от ΝΏν дикого типа за счет того, что с помощью рекомбинантных методов был удален серологически распознаваемый эпитоп или маркер. Настоящее изобретение представляет способ модифицирования антигенного состава парамиксовируса птиц, такого как ΝΏν, тем самым позволяя получить, например, живую ΝΏν-маркерную вакцину, которую серологически можно отличить от полевых штаммов парамиксовирусов птиц.

В одном из вариантов настоящее изобретение представляет инфекционную копию ΝΏν, в которой белок ΗΝ вируса ΝΏν был модифицирован путем рекомбинирования кДНК, кодирующей часть указанного белка ΗΝ, с кДНК, кодирующей часть белка ΗΝ, производного от парамиксовируса птиц, например, 2-го типа или 4-го типа. Указанный гибридный белок ΗΝ выполняет роль серологического маркера для инфекционной копии штамма ΝΏν, полученного таким образом, или может служить для измене ния тропности парамиксовируса птиц в отношении других клеток и(или) тканей. Эти так называемые «маркерные штаммы», представляемые настоящим изобретением, позволяют создавать вакцины, которые являются очень ценным инструментом оценки распространения вируса ΝΏν в коммерческих популяциях птиц в мире. Кроме того, крупномасштабное применение таких маркерных вакцин будет обеспечивать полное искоренение ΝΏν за счет проведения интенсивного скрининга и изъятия зараженных популяций.

Далее, представляется способ создания инфекционной копии штамма ΝΏν, который экспрессирует один или большее число антигенов других патогенов и который можно использовать для вакцинации против нескольких заболеваний. Такая инфекционная копия вируса ΝΏν, например, включает гетерологичную кДНК, кодирующую гетерологичный белок, представляющий, например, вирус гриппа птиц (Αίν) (гемагглютинин Н5 и Н7 и нейраминидаза), вирус лейкоза птиц (АйУ) (белок еп\' (др85)), вирус малокровия кур (САУ) (ΥΡ1 + νΡ2), вирус болезни Марека (ΜΌν) (гликопротеин-В (дВ), дН), вирус инфекционного ларинготрахеита (ΙΏΤ) (дВ, дН, дО), вирус инфекционного синовиита (ΙΒΌν) (νΡ2 и νΡ3), вирус ринотрахеита индеек (ΤΚΤ) (белок слияния Б), парамиксовирусы-2, -3 и -6 птиц (ΡΜν) (белок Б, гемагглютининнейраминидаза [ΗΝ] или другие), вирус инфекционного бронхита (ΙΒν) (пепломерный или антирецепторный белок, нуклеопротеин), реовирусы (σ-белок), аденовирусы, пневмовирусы, сальмонеллу 8а1топе11а еп(епббк Сатру1оЬас1ег )е)ип1. ЕксйепсЫа сой, Вогба1е11а аушт (ранее называемая А1са11депе§ Гаесайк), Ηаетοрй^1и8 рагада1йпагит, Ρа8ΐеи^е11а тиЙоаба, Огш1йоЬас1егшт гЫпойасйеа1е, В1етеге11а (ранее Ρа8ΐеи^е11а) апайрекйГег, микоплазмы-слизевики (Мусор1акта даШкерйсит, М. 8упоу1ае, М. тегеадйбЦ М. ю\гае) или аспергиллы (АкрегдШик йауик, А. Гит1да1и5).

Настоящее изобретение представляет здесь парамиксовирус птиц или производные от него штаммы, которые можно использовать в качестве вакцинного вектора для экспрессии антигенов других патогенов домашних птиц. Некоторые свойства делают вирус ΝΏν идеальным вакцинным вектором для вакцинации против респираторных или кишечных заболеваний. 1) ΝΏν можно легко культивировать до очень высоких титров в развивающихся яйцах. 2) Массовая культура ΝΏν в развивающихся яйцах относительно дешева. 3) ΝΏν-вакцины относительно стабильны и могут быть легко введены методами массовой вакцинации, например, с питьевой водой или путем распыления или образования аэрозоля. 4) Естественным путем заражения ΝΏν является респираторный и/или через пищеварительный тракт, что соответствует естественным путям заражения многими дру гими патогенами домашних птиц. 5) ΝΏν может индуцировать местный иммунитет вне зависимости от присутствия циркулирующего материнского антитела.

Было показано, что ΝΏν проявляет как сильные противоопухолевые, так и иммуностимуляторные свойства (как обзор см. 8сЫггтасйег е( а1., 1998: 8сЫггтасйег ν., Л111ей Т., 81е1пег Н.-Н., Него1й-Мепйе С., СегНагйк В. & Надти11ег Е., 1998, 1ттшн/а1юп уйй νίπικтойШей (итог се11к. 8етшагк ίη Опсо1оду., 25, 677-696). Хотя вирус ΝΏν, по-видимому, не способен продуктивно реплицироваться в нормальных клетках человека, тем не менее, было отмечено избирательное ΝΏν-опосредованное уничтожение раковых клеток человека. После местной ΝΏν-терапии у бестимусных мышей линии пийе было отмечено рассасывание опухоли вирусной природы и полная ремиссия ксенотрансплантатов человеческой опухоли. Это обусловило использование ΝΏν для терапии опухолей. Однако проблема состоит в том, что такое применение может быть ограничено местным применением.

Заражение ΝΏν индуцирует выработку интерферонов, цитокинов и других потенциально важных генных продуктов и придает плейотропные иммуностимуляторные свойства опухолевым клеткам. Данная концепция была использована для выработки аутологичных вакцин с опухолевыми клетками, содержащих свежие функциональные образцы, которые были инфицированы ΝΏν. Вакцину такого типа называют аутологичной опухолевой ΝΏν-вакциной или ΆΤν-ΝΏν (8сЫтгтасйег е( а1., 1998). Клетки, инфицированные ΝΏν, инактивируют γоблучением, что предотвращает клеточные деления, но сохраняет возможность репликации ΝΏν в цитоплазме инфицированных клеток. После введения пациентам вакцины ΆΤν-ΝΏν с участием ΝΏν-индуцированных цитокинов происходит рекрутирование Т-клеток. Некоторые из этих Т-клеток могут экспрессировать Тклеточный рецептор, который может взаимодействовать с пептидами из группы ассоциированных с опухолями антигенов, образующих комплекс с молекулами класса I главного комплекса гистосовместимости, находящийся на поверхности клеток. Это взаимодействие обусловливает индукцию цитотоксического Тклеточного ответа, который обусловливает специфичное уничтожение аутологичных опухолевых клеток.

Настоящее изобретение представляет модулирование репертуара и количества цитокинов и иммуностимуляторных белков, индуцируемых заражением ΝΏν. Настоящее изобретение представляет способ создания рекомбинантного ΝΏν, который модифицирован так, чтобы включать и экспрессировать гетерологичный(ые) ген(ы). Такой рекомбинантный ΝΏν можно использовать для модифицирова ния репертуара и количества иммуностимуляторных белков в инфицированных клетках. В одном из вариантов настоящее изобретение представляет рекомбинантный вирус ΝΏν, который включает и экспрессирует гены, кодирующие интерфероны, цитокины или другие иммуностимуляторные белки человека. Упомянутый рекомбинантный ΝΏν используют для выработки вакцины ΆΤν-ΝΏν, которая является более сильной по сравнению со стандартной ΆΤν-ΝΏν. Например, цитокины ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β, ΤΝΡ-α, 1Ь-1, 1Ь-6; цитокины (хемокины) ΒΑΝΤΕ8, ΙΡ-10; другие гены, такие как Н8Р, АСТН, эндорфин, ίΝΟδ, ΕΡΑ/ΤΙΜΡ, ΝΡκΒ. Плейотропные иммуностимуляторные свойства ΝΏν также могут быть использованы как свойства адъюванта для вакцинации животных и человека против инфекционных заболеваний. В одном из вариантов настоящего изобретения чужеродные гены, кодирующие соответствующий(ие) антиген(ы) инфекционного(ых) агента(ов), вносят в геном ΝΏν, а одновременная экспрессия в инфицированных клетках антигена(ов) и иммуностимуляторных белков может индуцировать мощный иммунный ответ против инфекционного агента. В другом варианте настоящего изобретения иммуностимуляторные свойства ΝΏν могут быть дополнительно усилены путем использования рекомбинантных ΝΏν, которые одновременно экспрессируют антигены и конкретные иммуностимуляторные белки. В предпочтительном варианте настоящее изобретение представляет создание вакцин против СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) с использованием рекомбинантных ΝΏν, которые экспрессируют соответствующие антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) как сами по себе, так и в сочетании с иммуностимуляторными белками.

Вирус ΝΏν также используют в качестве адъюванта при вакцинации животных и человека против инфекционных заболеваний. В одном варианте настоящего изобретения гетерологичные или чужеродные гены, кодирующие соответствующий(ие) антиген(ы) инфекционного(ых) агента(ов), встраивают в геном вируса ΝΏν, а одновременная экспрессия инфицированными клетками антигена(ов) и иммуностимуляторных белков может индуцировать мощный иммунный ответ против инфекционного агента. В другом варианте настоящего изобретения иммуностимуляторные свойства ΝΏν дополнительно усиливают, используя рекомбинантные ΝΏν, которые одновременно экспрессируют антигены и конкретные иммуностимуляторные белки. В предпочтительном варианте настоящее изобретение представляет создание вакцин против СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) с использованием рекомбинантных ΝΏν, которые экспрессируют соответствующие антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) как сами по себе, так и в сочетании с иммуностимуляторными белками.

Также представляется способ создания условно-летального делеционного мутанта ΝΏν, который можно использовать в качестве самоограничивающейся нетрансмиссивной вакцины«носителя».

Делеционный мутант ΝΏν создают таким образом, чтобы он не был способен экспрессировать матричный белок М, участвующий в «почковании» ΝΏν на внутренней поверхности клеточной мембраны. Например, настоящее изобретение представляет фенотипически комплементированный штамм ΝΏν, который не способен экспрессировать белок М, но который тем не менее способен инфицировать клетки и распространяться по механизму передачи «от клетки к клетке». Однако мутантный вирус не способен создавать инфекционное потомство в некомплементированных клетках. Это показывает, что фенотипически комплементированные делеционные мутанты ΝΏν можно использовать в качестве безопасных самоограничивающихся вакцин, которые не способны распространяться в окружающую среду. Такая нетрансмиссивная вакцина объединяет наиболее важное свойство живых вакцин, а именно эффективность, и самое важное преимущество убитых вакцин, а именно, безопасность.

Настоящее изобретение представляет вирус ньюкаслской болезни или производные от него штаммы, например, получаемые путем пассирования или дополнительного культивирования развивающихся яиц или подходящих клеток, которые являются производными от инфекционной копии вируса, получаемой с помощью способа, представляемого настоящим изобретением.

Например, представляется ΝΏν, который был модифицирован, по крайней мере, какимлибо одним путем с целью создания инфекционной копии вируса ныокаслской болезни, который ослаблен, модифицирован по уровню вирулентности, модифицирован по антигенным свойствам, экспрессирует гетерологичный антиген или является нетрансмиссивным, или их сочетания.

Настоящее изобретение представляет здесь ΝΏν-вакцины, например, характеризующиеся наличием отличающихся факторов вирулентности или отличающимися антигенными параметрами, предназначенные для целей получения маркерных вакцин и/или для экспрессии гетерологичных антигенов, производных от других патогенов, находящиеся в трансмиссивной и/или нетрансмиссивной форме.

Такая вакцина может быть убитой или живой вакциной. Предпочтительно такая вакцина является живой вакциной, однако, убитые вакцины, представляемые настоящим изобретением, имеют преимущества в тех вариантах, в которых живые вакцины неприменимы или при менимы лишь в слабой степени, например, при ограничениях в торговле или при других условиях, определяемых подходами в борьбе с соответствующим заболеванием.

Также настоящее изобретение представляет способ диагностики и соответствующий тестнабор, предназначенные для выявления антител, специфичных в отношении указанных соответствующих иммунодоминантных эпитопа или маркера, тем самым предусматривая способы и подходы в осуществлении способа контроля и/или искоренения ΝΏν и/или других заболеваний домашних птиц. Настоящее изобретение представляет новые эффективные вакцины, которые по серологическим критериям можно отличить от полевых вирусов и уже существующих вакцин. Такие новые вакцины, называемые маркерными ΝΏν-вакцинами, обеспечивают наиболее полный из возможного иммунологический спектр соответствующих антигенных эпитопов ΝΏν, а также серологически отличаются от ΝΏν дикого типа при применении прилагающихся диагностических способов и наборов.

Настоящее изобретение представляет способ идентификации невакцинированных животных или животных, вакцинированных ΝΏνвакциной по настоящему изобретению, по сравнению с животными, инфицированными ΝΏν дикого типа или вакцинированных немодифицированным мезогенным или лентогенным вакцинным штаммом ΝΏν, включающий взятие у указанного животного по крайней мере одного минимального образца (такого как сыворотка, кровь, яйца или глазная жидкость) и определение в указанном образце присутствия антител, специфичных в отношении иммунодоминантного эпитопа или маркера, экспрессируемого указанным дикого типа или немодифицированным вирусом ΝΏν, но не вакциной по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение представляет способ, в котором указанные антитела специфичны в отношении белка ΗΝ или белка Р вируса ΝΏν, например, гибридного белка, как описано в экспериментальном разделе настоящей заявки. Например, настоящее изобретение представляет способ диагностики, в котором указанное животное выбирают из группы, которая включает домашних птиц, предпочтительно домашних кур.

Также настоящее изобретение представляет диагностический набор для использования в способе серологической идентификации животных. В одном варианте настоящего изобретения простой и быстрый тест на подавление гемагглютинации (ΗΙ) используют для разграничения вакцинированных животных и инфицированных животных. Животные, вакцинированные маркерной вакциной, в которой глобулярная «головка» белка ΗΝ вируса ΝΏν полностью заменена соответствующей частью белка ΗΝ вируса другого серотипа, не вырабатывают антитела к ΗΝ ΝΏν, а следовательно, не подавляют агглютинацию эритроцитов с участием вирионов ΝΏν.

С использованием вирионов маркерной вакцины в тесте ΗΙ детектируют антитела, специфичные в отношении гибридного белка ΗΝ, которые можно использовать в качестве меры эффективности вакцинации. В качестве альтернативы, для определения эффективности вакцинации используют метод ЕЬ18А, в котором детектируют антитела к белку Е вируса ΝΏν.

Помимо теста ΗΙ метод ΕΏΙ8Α может быть использован для определения присутствия антител к ΗΝ ΝΏν. Антигеном, предназначенным для использования в таком тесте, является, например, белок ΗΝ вируса ΝΏν, который экспрессирован с помощью методов рекомбинантной ДНК, или консервативный пептид из ΗΝ ΝΏν.

Также может быть использован метод блокирующего ΕΏΙ8Α. В этом случае одно или большее число моноклональных антител, специфичных в отношении консервативных эпитопов ΗΝ ΝΏν, используют для определения присутствия в образце, взятом у вакцинированного животного, конкурирующих антител. Тесты ЕЫ8А преимущественно могут быть использованы в том случае, когда маркерная вакцина содержит только гибридный белок ΗΝ или когда несколько эпитопов в последовательности ΗΝ ΝΏν заменены.

Далее настоящее изобретение поясняется в экспериментальном разделе данного описания, который ничем не ограничивает настоящее изобретение.

Экспериментальный раздел

Материалы и методы.

Стандартные процедуры клонирования были осуществлены в соответствии с руководством 8атЬгоок с! а1. (1989), за исключением специально оговариваемых случаев. Все конструкции, включающие фрагменты ДНК, полученные посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), проверяли путем прямого секвенирования. В последовательностях праймеров, приводимых ниже, подчеркнуты нуклеотиды, соответствующие последовательностям ΝΏν, а также определены положения в геноме ΝΏν. Нуклеотидная последовательность рестрикционных сайтов, которые использовали для клонирования, выделена полужирным шрифтом.

Клетки и вирусы.

Клетки СЕК (8пЩ11 с! а1., 1976) культивировали в среде 6МЕМ/ЕМЕМ (1:1), содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки (ЕС8) и 2% смеси антибиотиков, включая 1000 ед./мл пенициллина, 1000 мкг/мл стрептомицина, 20 мкг/мл фунгизона, 500 мкг/мл полимиксина-В и 10 мг/мл канамицина. Клетки ОТ35 (Мозсо\зс1 с! а1., 1977; СНо, 1982) культивировали в среде, полученной в соответствии с 61ЬсоВКЬ/Ь1£с

Тсс11по1од1сз (№ по каталогу 041-91536, композиция, запатентованная Еой Ообдс), дополненной 5% ЕС8 и 2% смеси антибиотиков. Клетки ОМ5 (Апйп & ОгбаЫ, 1991) культивировали в среде М199, дополненной 10% триптовофосфатного бульона, 10% ЕС8 и 2% смеси антибиотиков.

Штамм Ласота (Ьа8о!а) вируса ΝΌν получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС УК-699) и пассировали дважды через развивающиеся куриные эмбрионы. Перед началом конструирования и клонирования кДНК вирус очищали в бляшках в трех циклах очистки в бляшках в линии первичных фибробластов куриного эмбриона (СЕЕ). С этой целью вирус титровали на клетках СЕЕ, культивируемых в среде 6МЕМ/ЕМЕМ (1:1), содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки, 2% смеси антибиотиков, 5% аллантоисной жидкости, 30 мМ МдС1₂, 200 мкг/мл ^ΕΑΕ-декстрана (81дта) и 0,8% агара №Ьс1 (ГОЕсо). Вирус из третьего цикла очистки в бляшках (обозначенный как клон Е13-1) культивировали в развивающихся яйцах и через 4 дня после инокуляции аллантоисную жидкость собирали и хранили при -70°С в виде аликвот. Рекомбинантный вирус куриной оспы £рЕЕЬТ7ро1 (ВгШоп с! а1., 1996; здесь и далее обозначаемый ЕРУ-Т7), который экспрессирует РНК-полимеразу фага Т7, был любезно предоставлен д-ром Михаэлем Скиннером (М. 8к1ппсг) и этот вирус культивировали на клетках РТ35.

Выделение вирусной РНК.

Все манипуляции осуществляли в свободной от РНКаз стеклянной или пластиковой посуде, а все растворы приготавливали с использованием свободной от РНКаз воды, которую обрабатывали 1%-ным диэтилпирокарбонатом (ГОЕРС) и стерилизовали автоклавированием. Вирус осаждали центрифугированием из аллантоисной жидкости при 21000 об./мин в течение 70 мин в бекмановской центрифуге 8\У40 при 4°С. Осадок ресуспендировали в гомогенизаторном буфере (50 мМ Трис-ИС1, рН=7,5, 50 мМ №С1, 5 мМ ЭДТА, 0,5% 8Ό8) и обрабатывали протеиназой-К (200 мкг/мл) в течение 90 мин при 37°С при постоянном перемешивании. Полученный лизат дважды экстрагировали равными объемами смеси фенол/хлороформ (1:1), рН=5,4, и один раз равным объемом хлороформа. Вирусную РНК осаждали из водной фракции добавлением 0,1 объема 3М №1ОАс φΗ=5,3) и 2,5 объемов 100%-ного этанола. Преципитат собирали центрифугированием, 1 раз промывали 70%-ным этанолом, ресуспендировали в воде и хранили в аликвотах при -70°С.

Обратная транскрипция.

Вирусную РНК (1,5 мкг) смешивали с 500 нг праймера в объеме 12 мкл и инкубировали в течение 10 мин при 70°С. Добавляли 4 мкл обратнотранскриптазного буфера 5х (250 мМ

Трис-ИС1, рН=8,3, 375 мМ КС1, 15 мМ МдС1₂;

61ЬсоВВЬ/Ь1Ге Тесйпо1од1е8), 2 мкл 0,1 М дитиотреитола (ΌΤΤ) и 2 мкл 10 мМ 6ΝΤΡ (2,5 мМ каждого дезоксирибонуклеотида) и полученную смесь инкубировали в течение 2 мин при 42°С. Обратную транскрипцию осуществляли в конечном объеме 20 мкл добавлением 200 ед. обратной транскриптазы (Зирегкспр! II; С1ЬсоВВЬ/Ь1Ге Тесйпокщек) с последующей инкубацией в течение 60 мин при 42°С.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Все реакции ПЦР, которые использовали для определения 3'- и 5'-концов генома вируса ΝΏν (см. ниже), проводили с использованием ДНК-полимеразы Тас.| (Регкш Е1тег). Для клонирования отдельных генов ΝΏν или крупных субгеномных кДНК использовали либо корректирующую ДНК-полимеразу Ρ\\ό, либо смеси полимераз Тас.| и Ρ\\ό (Ехрапб Нщй Е1бе1йу КН или Ехрапб Ьопд Тешр1а1е Кй) в соответствии с инструкциями поставщика (Воейппдег МаппНенп). Все образцы инкубировали в течение 2 мин при 94°С перед началом указанного числа циклов ПЦР. После проведения указанного числа циклов ПЦР образцы инкубировали при температуре достройки цепи в течение времени по крайней мере втрое более длительного по сравнению со временем достройки в самом цикле ПЦР. ПЦР-фрагменты очищали непосредственно с использованием набора Нщй Риге РСВ Ргобис! РипйсаИоп Кй (Воейппдег МаппНепп) или после проведения электрофореза в агарозном геле с использованием набора для экстракции О|аех11 (О|адеп) по существу, как описано у поставщиков.

Секвенирование.

Все последовательности были определены с использованием набора реактивов РВ18М Веабу Веасйоп Иуе Иеоху ТепшпаЮг Сус1е 8ес.|иепстд Кй (Регкш Е1тег). Реакционные смеси (5 мкл) включали в 25 циклов линейной амплификации (10 с при 94°С, 5 с при 50°С и 4 мин при 60°С) с использованием амплификатора СепеАтр 2400. После этого реакционные смеси осаждали этанолом, 1 раз промывали 70%-ным этанолом, ресуспендировали в 15 мкл буфера Т8В (Регкш Е1тег) и нагревали в течение 2 мин при 94°С перед загрузкой в автоматический секвенатор модели АВ310 (Аррйеб ВюкукЮтк).

Нуклеотидные последовательности праймеров, которые были использованы для секвенирования полноразмерного генома вируса ΝΏν штамма Ьа8о1а, являлись либо производными от опубликованных последовательностей, либо от последовательностей, установленных в ходе осуществления описываемого здесь секвенирования. Праймеры показаны в табл. 1.

Клонирование и секвенирование 3'- и 5'концов генома ΝΏν штамма Ьа8о1а.

Нуклеотидную последовательность 3'- и 5'концов генома ΝΏν определяли с использованием процедур ВАСЕ (метод быстрой амплификации концов кДНК). РНК ΝΏν использовали в реакции обратной транскрипции в конечном объеме 20 мкл с праймером р360 (5'СССОАТОТААТСАОССТАОТОСТТ-3'; нуклеотиды 14756-14779), который является производным от опубликованной последовательности гена Ь вируса ΝΏν (УикоГГ е1 а1., 1987). Одноцепочечную кДНК (2,5 мкл обратнотранскриптазной смеси) добавляли к 8 пкмоль «якорного» праймера АЬ63 (5'-САССААТТСАСТАТССАТ ТСТССАТССТТС-3') и лигировали в течение ночи при комнатной температуре в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-НС1, рН=8,0, 10 мМ МдС1₂, 10 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 25% полиэтиленгликоля 1 мМ НСС, 20 мкМ АТФ и 10 ед. РНКлигазы фага Т4 (Ыете Епд1апб В1о1аЬк), как описано у Текыег е1 а1., 1986. По 1 мкл лигационной реакции использовали в качестве матрицы в реакции ПЦР с праймерами р375 (5'СААТСААТТСАААССАТАТТАСАОТААСТ3'; нуклеотиды 14964-14983) и АЬ64 (5'6АА66АТССА6ААТС6АТА6-3'). Последний из этих праймеров комплементарен «якорному» праймеру АЬ63. Условия ПЦР (40 циклов) были следующими: 1 мин при 94°С, 1 мин при 55°С и 2 мин при 72°С. Полученные ПЦРпродукты очищали и клонировали в Т-вектор рВ1ие8спрШ-Т8К (1сЫйага & Кигока^а, 1993). С другой стороны, очищенные ПЦР-продукты обрабатывали фрагментом Кленова ДНКполимеразы I с получением тупых концов и клонировали по Ншб1-сайту в плазмиду р6ЕМ42 (Рготеда). Тринадцать независимых клонов (8 в рВ1ие8спрШ-Т8К и 5 в р6ЕМ42) секвенировали для установления нуклеотидной последовательности 5'-конца генома ΝΏν штамма Ьа8о1а. Нуклеотидную последовательность 3'-конца определяли двумя независимыми методами. В методе I праймер АЙС3 лигировали на 3'-конец вирусной РНК с использованием РНК-лигазы Т4, как описано у 8с1ш1хе е1 а1., 1995. Реакционная смесь (при конечном объеме 10 мкл) содержала 2,5 мкг РНК ΝΏν, 100 пкмоль АЬ63, 1 мкл 10х РНК-лигазного Т4 буфера (500 мМ Трис-НС1, рН=7,8, 100 мМ МдС1₂, 100 мМ ЭТТ, 10 мМ АТФ), 1 мкл ДМСО, 1 мкл 10 мкМ гексаминкобальтхлорида, 1 мкл В№кш (Рготеда) и 10 ед. РНК-лигазы Т4 (№\ν Епд1апб В1о1аЬк). Смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре и 5 мкл реакционной смеси лигирования использовали в качестве матрицы в обратнотранскриптазной (ОТ) реакции, в которой АЙС4 использовали в качестве праймера. По 1 мкл обратнотранскриптазной реакции использовали в реакции ПЦР с праймерами АЙС4 и р376 (5'-САОССТТААОСАОСТО СТССТАСТСАТС-3'; нуклеотиды 137-164), которые являются производными от опубликованной последовательности 3'-конца ΝΏν (Шпйа е1 а1., 1986). Условия ПЦР были такими же, как описано выше для 5'-ВАСЕ. В методе II 3'- и 5'концы РНК вируса ΝΏν лигировали друг на друга с использованием РНК-лигазы Т4 в тех же условиях, которые были описаны выше для метода I. По 5 мкл лигационной смеси использовали в качестве матрицы для реакции обратной транскрипции с праймером р360. По 1 мкл обратнотранскриптазной реакции использовали в реакции ПЦР с праймерами р375 и р376 и в условиях ПЦР, описанных выше для 5'-КАСЕ. Полученные ПЦР-продукты обрабатывали фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I с получением тупых концов и клонировали по Н1ис11сайту плазмиды ρ6ΕΜ4Ζ (Рготеда). Десять независимых клонов (4 по способу I и 6 по способу II) секвенировали для определения нуклеотидной последовательности 3'-конца генома ΝΟν штамма Ьа8о1а.

Конструирование транскрипционного вектора.

Низкокопийный транскрипционный вектор конструировали, используя плазмиду рОК12 (У1ейа & Меккшд, 1991) в качестве исходного репликона. Плазмиду рОК12 расщепляли рестриктазой РуиЛ и выделяли ДНК-фрагмент, содержащий источник репликации и ген резистентности к канамицину. Этот ДНК-фрагмент лигировали на Есо47Ш/АЙП-фрагмент (сайт расщепления АЙП затупляли по концам фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I) из состава транскрипционного вектора 2.0 (любезно предоставлен д-ром Эндрю Боллом; Райиа1к е! а1., 1992). Из состава полученной в результате плазмиды удаляли ХЬайШейфрагмент с целью удаления как можно большего числа уникальных рестрикционных сайтов. Полученную в результате плазмиду обозначили рОЬТУ5 (фиг. 1). Транскрипционный вектор ρΟΕΤν5 включает промотор ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7, после которого находятся уникальные рестрикционные 8!и!- и 8 та [-сайты, автокаталитический рибозим вируса Ό-гепатита (НОУ) и сигнал терминации транскрипции нечетного фага Т7. ДНК-фрагменты, клонированные между рестрикционными 8ШЕ и 8та]-сайтами, могут быть транскрибированы либо 1и уйго, либо 1и у1уо с использованием РНК-полимеразы Т7. После транскрипции 5'-конец получаемых в результате транскриптов включает два остатка С, кодируемых плазмидой. Благодаря автокаталитической активности рибозима ΗΟν, 3'-конец этих транскриптов соответствует точному концевому нуклеотиду клонированного ДНКфрагмента (Райиа1к е! а1., 1992).

Конструирование минигеномных плазмид.

С целью установления факторов, необходимых для репликации и транскрипции ΝΟν, были сконструированы минигеномные плазмиды, которые включают 3'- и 5'-концевые участки генома ΝΟν, фланкирующие ген-репортер, которым замещали все гены самого ΝΟν (фиг. 2). ДНК-фрагменты, соответствующие 3'- и 5'концевым участкам генома ΝΟν, формировали с помощью ПЦР с использованием ДНК полимеразы Р\то (30 циклов: 15 с при 94°С, 30 с при 50°С и 30 с при 72°С) и с использованием в качестве матриц плазмид, включающих фрагменты 3'-КАСЕ и 5'-КАСЕ (см. выше). 3'Участок (нуклеотиды 1-119) был образован с использованием праймеров 3ЫТ (5'-АСС АААСАСАСААТССОТОАОТТАСОА-3'; нуклеотиды 1-27) и 8ЕАР3 (5'-АТССАТАСТ ΟΟΤСАΟСАΤΟСΤΟΟСАΟРАΟΟСΤIΤСΤСΟ-3': нуклеотиды 102-119). 5'-Участок (нуклеотиды 14973-15186) образовывали с использованием праймеров 8ЕАР5 (5'-ОСАТОСТОАССАОТА ТС6АТАТТАСАСТААСТСТСАСТ-3'; нуклеотиды 14973-14990) и 5Νθν (5'-АССАААСАА АСАТТТСОТОААТОАСОА-3'; нуклеотиды 15158-15186). Два ДНК-фрагмента соединяли методом ПЦР с перекрывающимися праймерами (участки перекрывания показаны курсивом в приведенных выше последовательностях праймеров) с использованием праймеров 3ЫТ и 5Νθν. Полученный в результате ДНКфрагмент, представляющий собой химеру 3'- и 5'-концов ΝΟν, разделенных 20 нуклеотидами, фосфорилировали путем обработки полинуклеотидкиназой Т4 и клонировали в обеих ориентациях в состав транскрипционной плазмиды рОБТУ5 (фиг. 1), которую расщепляли рестриктазами 81Ш и 8таI и дефосфорилировали с использованием кишечной фосфатазы теленка (Воейпидег Маиийе1т). Наконец, ген 8ЕАР (кодирует секретируемую щелочную фосфатазу) выделяли из состава плазмиды р8ЕАР-Вак1с (С1ои!есй) путем расщепления рестриктазами 8рЫ и СШ и клонировали между 8рЫ- и С1аН сайтами, находящимися между 3'- и 5'-концами ΝΟν. Полученные в результате плазмиды обозначили рОЬТУ535 и рОЬТУ553 соответственно. В результате транскрипции 1и у1уо или 1и уйго с использованием РНК-полимеразы Т7 с плазмиды рОЬТУ535 получают антигеномную РНК ([+]-РНК), в то время как в результате транскрипции плазмиды рОЬТУ553 получают геномную РНК ([-]-РНК).

Плазмиды рОЕГУ535ЙЮ до рОЕТУ535Ы5 и плазмиды рОБТУ553М) до рОЕТУ553Ы5 получали путем встраивания самокомплементарных олигонуклеотидов в СШ-сайте, находящемся между геном 8ЕАР и 5'-концом генома вируса ΝΟν в составе рОЬТУ535 и рОЬТУ553 соответственно (см. фиг. 2). Были использованы такие олигонуклеотиды: Ν0, 5'-С6С6А6СТС6-3'; Ν1, 5'-С6С6А68СТС6-3'; Ν2, 5'-С6С6А6 СССТСС-3'; Ν3, 5'-С6С6А6С№6СТС6-3'; Ν4, С6С6А6САТ6СТС6-3'; Ν5, 5'-С6С6А6СА8 Т6СТС6-3' (№ = А или Т; 8 = С или С).

Модификация промотора Т7 в плазмидах рОЬТУ535 и рОЬТУ553.

Для получения транскриптов ш уйго или 1и

У1уо, включающих аутентичные 5'- и 3'концевые участки ΝΟν, промотор Т7 плазмид

РОЬТУ535 и рОЬТУ553 модифицировали таким образом, чтобы транскрипция начиналась с пер29 вого нуклеотида 3'- и 5'-концевых участков ΝΏν.

Праймеры конструировали так, чтобы они включали 1) рестрикционный Вд11-сайт, 2) последовательность промотора Т7 (показана курсивом), который модифицировали таким образом, чтобы два нуклеотида О на конце промотора Т7 были заменены нуклеотидами А, и 3) 3'(нуклеотиды 1-21) или 5'-конец (нуклеотиды 15164-15186) вируса ΝΏν. Праймеры ВОЬ3Е2 (5 '-ОАТАТ6ОССАТТСАО6СТТААТАСОАС ТСАСТАТААССАААСАОАОААТССОТОАО3') и 8ЕАР3 (см. выше) использовали для получения ДНК-фрагмента, включающего модифицированный промотор Т7 и полноразмерный 3'концевой участок ΝΏν вплоть до начала гена 8ЕАР в составе РОБТУ535. Аналогичным образом получали ДНК-фрагмент, который включал модифицированный промотор Т7 и полноразмерный 3'-концевой участок ΝΏν вплоть до начала гена 8ЕАР в составе РОБТУ553 с использованием праймеров ВСБ5Е2 (5'-ОАТ АТССССАТТСАСССТТААТАССАСТСАСТА ТА АССАААСАААОАТТТООТОААТО-3') и 8ЕАР5. Полученные в результате фрагменты расщепляли рестриктазами Вд11 и 8рЫ (3'конец) или рестриктазами Вд11 и С1а1 (5'-конец), соответственно, и использовали для замещения Вд11/8рЫ-фрагмента в составе рОЬТУ535 или Вд11/С1а1-фрагмента в составе рОЬТУ553. Полученные в результате плазмиды обозначили РОЬТУ735 и рОЬТУ753 соответственно. Плазмиды рОЬТУ735Ы3 и рОЬТУ753Ы3 получали путем встраивания самокомплементарного олигонуклеотида (5'-С6С6А6С№6СТСО-3'; V = А или Т) по С1а1-сайту, находящемуся между геном 8ЕАР и 5'-концом генома ΝΏν в составе плазмид рОЬТУ735 и рОЬТУ753 соответственно.

Конструирование 8ЕАР-репортерных плазмид.

Плазмиду рС1псо8ЕАР конструировали путем клонирования Х1о1/С1а1-фрагмента (С1а1сайт затупляли с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I), включающего ген 8ЕАР, производный от плазмиды р8ЕАР-ВаЧс (С1оп1ссй), между Х1ю1- и 8та1-сайтами эукариотического экспрессионного вектора рСЧпео (Рготеда). Последняя из указанных плазмид включает промотор цитомегаловируса человека (йСМУ) в дополнение к промотору фага Т7. С целью оценки и количественного определения 8ЕАР по транскриптам, контролируемым только промотором Т7, была сконструирована другая плазмида, в которой промотор НСМУ отсутствовал. Для этой цели промотор НСМУ делетировали из состава рСЧпео путем частичного расщепления рестриктазой ΗίηάΙΙΙ с последующим полным расщеплением рестриктазой Вд1 II. ДНК-фрагмент (нуклеотиды 756-5469 в соответствии с нумерацией СбоШесЬ), из состава которого делетировали промотор йСМУ, был выде лен и обработан ДНК-полимеразой Т4 с целью затупления концов и вновь замкнут в кольцо с помощью ДНК-лигазы Т4. Полученную в результате плазмиду обозначили рСЧпео Э. Наконец, ген 8ЕАР выделяли из состава плазмиды р8ЕАР-ВаЧс в виде М1и1/Асс1-фрагмента и клонировали в состав рСЧиеоЭ между М1и1- и С1а1сайтами. Полученную в результате плазмиду обозначили рСЧпеоО-8ЕАР.

Трансфекция.

Клетки высевали в 24-луночные планшеты для культивирования, выращивали в течение ночи до стадии 60-80%-ного слияния и инфицировали при МО1=1 с ЕРУ-Т7 в течение 1 ч при 37°С. Клетки трансфицировали 0,5 мкг минигеномной ДНК-плазмиды с использованием 3 мкл липофектамина и ОрйМет, по существу, как описано у производителя (61ЬсоВКЕ/Е1£е Тес1по1о§1С8). После инкубации в течение 4 ч (клетки СЕК) или 16 ч (клетки ОМ5) при 37°С клетки либо инфицировали ΝΏν (голландский вирулентный изолят, близкий к 152608; 200 мкл на 1 лунку) в течение 1 ч при МО1=5, либо оставляли неинфицированными. Инокулят отсасывали и заменяли 1 мл полной культуральной среды, после чего клетки далее инкубировали при 37°С. Для котрансфекции клетки культивировали в 6-луночных культуральных чашках и инфицировали ЕРУ-Т7, как описано выше. Клетки котрансфицировали 0,25 мкг минигеномной ДНК-плазмидой, 0,4 мкг рСШеоМР, 0,2 мкг рС1псоР и 0,2 мкг рС1псоЬ(с) или рС1псо путем использования либо 8 мкл липофектамина или 9 мкл Ευ6€η€™6 (Воейгтдег Μπηηΐκίιη). С целью получения инфекционного вируса минигеномную плазмиду заменяли транскрипционной плазмидой, которая включала полноразмерную кДНК вируса ΝΏν.

Количественный анализ активности 8ЕАР.

Количество 8ЕАР, которое секретировалось в культуральную среду трансфицированными клетками, измеряли на свободных 96луночных планшетах с использованием теста на хемолюминесценцию репортеров РНохрНаЫдЫ™ с набором реактивов для выявления секретируемой щелочной фосфатазы (Тгор1х), по существу, как описано у производителя. Количественный анализ хемолюминесценции проводили с использованием счетчика сцинтилляций в жидкости (^а11ас 1450 тюгоЬе!а РЬИ8).

Клонирование и секвестрование кДНК, охватывающих полный геном ΝΏν штамма Ьа8о1а.

Для клонирования и секвенирования полноразмерного генома ΝΏν штамма Ба8о1а крупные субгеномные клоны кДНК образовывали с помощью ПЦР с ревертированием и клонировали в состав плазмиды рОЕМ-Т. Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием праймера 3И1Т, как описано выше, и 1 мкл обратнотранскриптазной реакции использовали в реакции ПЦР с набором Е.храмб Бонд Тетр1а1е

РСВ к11 (Воейгшдег Μαηηΐιοίιη). ПЦР включала 5 циклов по 10 с при 94°С, 30 с при 58°С и 6 мин при 68°С с последующими 10 циклами по 10 с при 94°С, 30 с при 58°С и 6 мин при 68°С, в которых время достройки цепи при 68°С увеличивалось на 20 с в каждом последующем цикле. Полученные ПЦР-фрагменты клонировали в состав рСЕМ-Т с использованием набора рСЕМ-Т С1ошп§ кН (Рготеда), по существу, как описано у производителя. Лигационные смеси использовали для трансформации клеток Е. со1 ί штамма 8ИВЕ II (§1га1аде1'1е). Проводили две независимые ПЦР с ревертированием (А и В) и в каждой из них получали аналогичный набор клонов кДНК. Нуклеотидную последовательность субгеномных клонов кДНК определяли с использованием ΝΏν-специфичных праймеров (табл. 1) и праймеров, фланкирующих данные вставки. После сравнения нуклеотидных последовательностей групп А и В полученных клонов оставшиеся неопределенности разрешали путем секвенирования соответствующих участков в третьей независимой группе кДНК (серия С). Нуклеотидная последовательность вируса ΝΏν штамма Ьа8о1а показана на фиг. 3.

Конструирование полноразмерного геномного клона кДНК вируса ΝΏν.

Полноразмерную кДНК ΝΏν встраивали в состав транскрипционной плазмиды ρΟΕΤν5, используя в качестве исходной плазмиду рОБТУ535. ДНК-фрагменты соединяли по участкам перекрывания с использованием обычных рестриктаз, что подробно отображено на фиг. 4В. В ряду этапов клонирования конструировали плазмиду (обозначенную ρ535-ΏΙ), включающую нуклеотиды 1-3521 и 12355-15186, разделенные рестрикционным С1а1-сайтом, которая была образована путем соединения С1а1-сайтов по положениям 3521-го и 12355-го нуклеотидов. В другом ряду этапов клонирования была сконструирована плазмида (обозначенная рСЕМ-В), которая охватывает часть генома ΝΏν, включая нуклеотиды 3521-12355 (С1а1-фрагмент). Для облегчения клонирования последний из названных С1а1-фрагмент помечали геном резистентности к хлорамфениколу (Ст), производным от плазмиды рАСУС184 (Оишд & СоНеи 1978). Для этой цели ген Ст выделяли из плазмиды рАСУС184 с помощью ПЦР, с использованием праймера САТ-Б (5'-ОСОТАСОТСТАОАСТ ООТОТС ССТОТТОАТАССОО-3') и САТ-В (5'ОСТСТАОАСОТАСОАСССТОСССТОААССО АСО-3'). ПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы Ртео на протяжении 30 циклов по 30 с при 94°С, 45 с 60°С и 60 с при 72°С. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазой В κί^νΐ и клонировали по уникальному Βδί^Ι-сайту в состав рОЕМ-В с получением плазмиды рОЕМ-В (САТ). С1а1-фрагмент из состава рОЕМ-В (САТ) клонировали по уникальному С1а1-сайту Η535-ΏΙ с получением плазмиды рХОБЬ(САТ). Наконец, ген Ст удаляли из этой плазмиды путем расщепления рестриктазой В μ VI с последующим религированием и трансформированием клеток Е. сой штамма ЭН5а. Полученную в результате плазмиду обозначили рХОБЬ+: она включала полноразмерную последовательность кДНК ΝΏν, клонированную между промотором Т7 и рибозимом ΗΏν в составе транскрипционной плазмиды рОБТУ5.

Клонирование и экспрессия отдельных генов ΝΏν.

ДНК-фрагменты, включающие каждый из генов ΝΏν штамма Ьа8о1а, были получены с помощью ПЦР с ревертированием и клонированы в состав рС'Чиео. После клонирования все фрагменты секвенировали с использованием праймеров, фланкирующих вставки, и генспецифичных праймеров. Для гена ΝΡ: праймер 386 (5'-ОАОСААТСОААОТСОТАСОООТАО ААООТО-3': нуклеотиды 40-69) использовали для обратной транскрипции. Праймеры 365 (5'ОТОТОААТТССОАОТОСОАОСССОААО-3': нуклеотиды 77-94) и 892 (5'-ТТОСАТОСС ТОСАООТСАОТАСССССАОТС-3': нуклеотиды 1577-1593) использовали для ПЦР с ДНКполимеразой Ртео. Были использованы следующие условия ПЦР (30 циклов): 30 с при 95°С, 40 с при 65°С и 45 с при 72°С. Полученный в результате ДНК-фрагмент расщепляли рестриктазой ЕсоВ1 и клонировали в состав рСЧиео между ЕсоВ1- и 8та1-сайтами. Экспрессию ЯР проверяли с помощью теста иммунопероксидазного монослоя (1РМА), как описано у Реекегз е! а1., 1992 с использованием моноклонального антитела 38 (Виззе11 е! а1., 1983).

Для гена Р: праймер рВТ1 (5'-САА АОААТТСАОААААААОТАСОООТАО АА-3': нуклеотиды 1794-1814) использовали для обратной транскрипции. Праймеры рВТ1 и р2 (5'ОСАОТСТАОАТТАОССАТТСАСТОСААОО СОС-3': нуклеотиды 3053-3071) использовали для ПЦР с ДНК-полимеразой Ртео. Использовали следующие условия ПЦР (30 циклов): 30 с при 95°С, 40 с при 65°С и 60 с при 72°С. Полученный в результате ДНК-фрагмент расщепляли рестриктазами ЕсоВ1 и ХЬа1 и клонировали в состав рС'Чнео между ЕсоВ1- и ХЬа1-сайтами. Экспрессию Р проверяли с помощью теста 1РМА с использованием моноклонального антитела 688 (Виззе11 е! а1., 1983).

Для гена М: праймер 3И1Т (5'АССАААСАОАОААТССОТОАОТТАСОА-3', нуклеотиды 1-27) использовали для обратной транскрипции. Праймеры НЭУ5М (5'-ООО ТОСТАОСООАОТОССССААТТОТОССАА-3', нуклеотиды 3268-3288) и ЫЭУ3М (5'-ТСТ ССССООООСАОСТТАТТТСТТААААООАТ3', нуклеотиды 4368-4389) использовали для ПЦР с набором реактивов Ехраиб Ηφΐι Б1бе1йу кй. ПЦР проводили на протяжении 10 циклов по 15 с при 95°С, 30 с при 55°С и 2 мин при 68°С с последующими 15 циклами, в которых время достройки цепи при 68°С увеличивали на 20 с за каждый цикл. Полученный в результате ДНКфрагмент обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 для затупления концов, расщепляли рестриктазой ΝΙιοΙ и клонировали в состав рС1пео между М1с1- и 8таГ-сайтами. Экспрессию белка М проверяли в тесте ΙΡΜΑ с использованием моноклонального антитела 424 (Йи88е11 е! а1., 1983).

Для гена Р: праймер 3И1Т (см. выше) использовали для обратной транскрипции. Праймеры ΝΏν5Ρ (5'-АСССССТАСССАТТСТСС АТСССССТТСС-3': нуклеотиды 4508-4526) и ΝΌν3Ρ (5'-АСТАССССССАААССТТССТТ ССТСАТ-3': нуклеотиды 6212-6231) использовали для ПЦР с набором реактивов Ехрапб Нщ11 Р1бе1йу кй с использованием тех же условий, которые описаны выше для гена М. Полученный в результате ДНК-фрагмент обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 для затупления концов, расщепляли рестриктазой Ш1е1 и клонировали в состав рС1пео между ΝΙκΙ- и 8таГ-сайтами. Экспрессию белка Р проверяли в тесте 1РМА с использованием моноклонального антитела 8Е12А8С3 (Ш-ЭЙО, Пер!. Ау1ап νίτο1.).

Для гена ΗΝ: праймер 3И1Т использовали для обратной транскрипции. Праймеры ΝΌν5ΗΝ (5'-СТАСССТАССААСАСАССССС ССССТСААТ-3'; нуклеотиды 6335-6354) и ΝΌν3ΗΝ (5'-ССАССССССССССССАТТ СССТТТСАТТСТТС-3'; нуклеотиды 8205-8227) использовали для ПЦР с набором реактивов Ехрапб Ηί§Η Е1бе1йу кй при тех же условиях, которые описаны выше для гена М. Полученный в результате фрагмент ДНК обрабатывали ДНК-полимеразой Т4 для затупления концов и после расщепления рестриктазой Хта1 его клонировали в состав рС1пео между затупленным (с помощью фрагмента Кленова) №еГ-сайтом и Хта1-сайтом. Экспрессию белка ΗΝ проверяли в тесте 1РМА с использованием моноклонального антитела 86 (йиккей е! а1., 1983).

Для гена Ь: ген Ь был выделен из кДНК клона рСЕМ-Ь7а (фиг. 4А) путем расщепления рестриктазами 8асП и 8ай. Перед расщеплением рестриктазой 8а11 8асП-сайт затупляли путем обработки ДНК-полимеразой Т4. Полученный в результате фрагмент клонировали в рС1пео между затупленным (с помощью фрагмента Кленова) ΝΙκΙ-сайтом и 8а11-сайтом. 5'-Нетранслируемый участок между промотором Т7 и старткодоном АТС в последовательности гена Ь включает два внерамочных кодона АТС, которые могут помешать нормальной экспрессии белка Ь. Следовательно, была сконструирована новая плазмида, в которой первый кодон АТС был пропущен и в которой второй кодон АТС был изменен на ААС путем ПЦР-мутагенеза в соответствии со следующим. Праймеры 5ЬЕ(Е) (5'-СААТССААТТСААСССААААСАССТСА АССТАААТААТАСССС-3'; нуклеотиды 83328374) и 3ЬЕ(Е) (5'-СТСААТСТАСААТССССС

АТСССТАССААТСС-3'; нуклеотиды 88478870) использовали в реакции ПЦР, в которой плазмида рСЕМ-Ь7а (фиг. 4) служила матрицей. ПЦР проводили с использованием ДНКполимеразы Ρ\\ό в режиме 30 циклов по 30 с при 94°С, 45 с при 60°С и 60 с при 72°С. Полученный в результате ДНК-фрагмент расщепляли рестриктазами ЕсоШ и ХЬа1 и клонировали в состав рС1пео между ЕсоШ- и ХЬа1-сайтами, формируя плазмиду рС1пеой(Х). После этого В51\У1/8а11-фрагмент из состава рСЕМ-Ь7а, который включает оставшуюся часть гена Ь (нуклеотиды 8852-15046), клонировали в рС1пеой(Х) между Βδί^Ι- и 8а11-сайтами, получая в результате плазмиду рС1пеой(с). Поскольку антитела, специфичные в отношении белка Ь пока недоступны, проверить экспрессию Ь иммуноцитохимическими методами нельзя.

Внесение генетической метки в ген Р.

Для того чтобы недвусмысленно показать, что инфекционный вирус может быть получен из клонированной полноразмерной кДНК, генетическую метку вносили в состав гена Р посредством ПЦР-опосредованного мутагенеза. Для этой цели ген Р клонировали с использованием двух перекрывающихся ПЦР-фрагментов. Первый ПЦР-фрагмент получали с использованием праймера Νϋν5Ρ (см. выше) и праймера Р5Й (У-ААЛСССССвСТСТСТССТСССТССАСА ТСТАСТСАС-3': нуклеотиды 4859-4894). Выделенные полужирным шрифтом нуклеотиды соответствуют изменениям, которые были внесены в этот праймер с целью изменения аминокислотной последовательности сайта протеолитического расщепления между последовательностями Р1 и Р2, чтобы «перейти» от ΝΌν штамма Ьа8о!а (ССКЦСРДЬ) К консенсусному сайту расщепления, характерному для вирулентных штаммов ΝΌν (СККЦККФР). Второй ПЦР-фрагмент был получен с использованием праймеров Р3Р (5'-ССАССАСАСАСССССССГ ТТАТАССССССАТТАТТСС-3'; нуклеотиды

4875-4911) и ГУ09 (5'-СТСТСТССАСАСАСА СТАССАСААСТТТСАС-3'; нуклеотиды 62466266). ПЦР проводили с ДНК-полимеразой Ρ\\ό в 25 циклах по 15 с при 94°С, 30 с при 55°С и 2 мин при 72°С. Два перекрывающихся ПЦРфрагмента (перекрывание в последовательностях праймеров выделено курсивом) соединяли во второй реакции ПЦР с использованием праймеров Νϋν5Ρ и Ιν09 и в тех же условиях проведения реакции. Полученный в результате фрагмент, который включает полную кодирующую рамку гена Р и который кодирует вирулентный консенсусный сайт расщепления, обрабатывали рестриктазами ΝΙκΙ и 8ай и клонировали в состав рСГпео между Ше1- и 8а11сайтами, получая плазмиду рСГпеоР*, 8ш1-№Пфрагмент (нуклеотиды 4646-4952) из состава рСГпеоР* использовали для замещения соответствующего фрагмента в плазмиде р535-8, кото35 рая была сконструирована путем встраивания С1а1/8са1-фрагмента (нуклеотиды 35211-10311) из состава рОЕМ-В в ρ535-ΌΙ между С1а1- и 8еа1-сайтами (см. фиг. 4С). Полученную в результате плазмиду обозначили р535-8[Р*с]. ПЦР-фрагмент, включающий ген резистентности Ст из состава рАСУС184 (см. выше), клонировали в виде ХЬа1-фрагмента по уникальному ХЬа1-сайту (6172-й нуклеотид последовательности генома ΝΏν) плазмиды р535-8[Р*с], получив плазмиду р535-8[Р*с]Ст. После этого Ст-помеченный Ара1-8ре1-фрагмент (нуклеотиды 2285-8094) из этой плазмиды использовали для замещения соответствующего фрагмента полноразмерной кДНК в плазмиде ]^ОРЪ+. Наконец, ген Ст удаляли из этой плазмиды путем расщепления рестриктазой ХЬа1 с последующим восстановлением кольцевой структуры с помощью ДНК-лигазы Т4. Полученную в результате плазмиду, которая включает генетически помеченную полноразмерную кДНК ΝΏν, обозначили р^ОРЪ+ [Р*].

Образование линий стабильно трансформированных клеток, которые экспрессируют отдельные гены ΝΏν.

Плазмиды рС1пео№, рС1пеоР, рС1пеоМ, рС1пеоР, рСЧпеоР'¹ и ρСIηеоΗN использовали для образования линий стабильно трансформированных клеток, которые экспрессируют эти белки по отдельности. За день до проведения трансфекции клетки СЕК. высевали на 6-см культуральные чашки и инкубировали в течение ночи до достижения уровня слияния 60-80%. Клетки трансфицировали 2 мкг плазмидной ДНК с использованием 12 мкл липофектамина и ОрйМет, по существу, как описано у производителя (С|ЬсоВКЕ/ЫГе Тесйио1од1е8). Через 48 ч клетки обрабатывали трипсином и разведения высевали на 10-см культуральные чашки в среду, содержащую 500 мкг/мл антибиотика 0418 (Воейппдет Маппйепп). Каждые 3 дня культуральную среду заменяли свежей средой, содержащей возрастающее количество (при шаге в 100 мкг/мл) 0418 до достижения концентрации 800 мкг/мл. Клетки выдерживали в среде, содержащей 800 мкг/мл 0418, и через 3 недели после трансфекции отдельные колонии вырезали и переносили на 96-луночные культуральные чашки. Клонированные клеточные линии тестировали по экспрессии соответствующего гена ΝΏν с использованием теста 1РМА, как описано выше для анализа непостоянной экспрессии.

Клеточные линии, которые постоянно экспрессировали белок ΝΡ, Р, М или Р, были идентифицированы и выделены. Однако не удалось образовать клеточные линии, которые бы экспрессировали белок ΗΝ. Предположительно конститутивная экспрессия ΗΝ является токсичной для клеток.

Образование линий стабильно трансформированных клеток, которые экспрессируют РНК-полимеразу Т7.

Ген, кодирующий РНК-полимеразу Т7, был выделен из плазмиды рКТ7ЫТ (Кепе уап Оепшр, ΙΌ-ΏΏΟ, Оерайтеп! оГ Маттайап VIго1о§у) путем обработки рестриктазами ЕсоК1 и 8а11. Полученный в результате фрагмент включает ген РНК-полимеразы Т7, находящийся позади бакуловирусного промотора р10. ДНКфрагмент клонировали в состав плазмиды рС1пеоО между ЕсоК1- и 8а11-сайтами, получив плазмиду рС1пео107. Плазмида рС1пео0 лишена промотора Т7 и была получена из рС1пео путем расщепления рестриктазой ΝΙκΙ с последующим частичным расщеплением 8са1, заполнением «липких концов» с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы и восстановления кольцевой структуры с помощью ДНК-лигазы Т4. Бакуловирусные последовательности удаляли из рС1пео107 путем обработки рестриктазами ЕсоК1 и Рас1 с последующим затуплением концов с помощью обработки ДНК-полимеразой Т4 и восстановлением кольцевой структуры. Полученную в результате плазмиду обозначили рС1пео007. Экспрессию РНК-полимеразы Т7 проверяли путем котрансфекции клеток плазмидами рС1пео007 и рРКй01. Последняя из них включает ген белка Е2 вируса классической лихорадки свиней, клонированный за промотором Т7 и включающий внутренний сайт связывания на рибосоме (Кепе уап Оепшр. персональное сообщение). Экспрессию Е2 тестировали в 1РМА с использованием моноклонального антитела ν4 (№еп5уоог1 е! а1., 1986). Линии стабильно трансформированных клеток СЕК, экспрессирующих РНК-полимеразу Т7, образовывали и выделяли, как описано выше, за исключением того, что использовали 10-см культуральные чашки и клетки трансфицировали 5 мкг плазмиды рС1пео007 и 25 мкл липофектамина. Для анализа отдельных клеточных линий на экспрессию РНК-полимеразы Т7 их трансфицировали плазмидой рРКй01 и экспрессию Е2 (которая зависит от РНК-полимеразы Т7) определяли в тесте 1РМА с использованием моноклонального антитела ν4. Было идентифицировано несколько клеточных линий, которые экспрессировали РНК-полимеразу Т4. Для последующих экспериментов использовали одну из этих клеточных линий, обозначенную СЕК-С9.

Клонирование и экспрессия генов ΗΝ и гибридных генов ΗΝ.

Праймер 3И1Т использовали для синтеза одноцепочечной кДНК ΝΏν и серотипов 2 и 4 парамиксовируса птиц (АРМV2 и АРМV4), как описано выше. Все последующие ПЦР проводили в 25 циклах по 15 с при 94°С, 30 с при 55°С и 2 мин при 72°С.

Полноразмерный кодирующий участок гена ΗΝ серотипа АРМV2 выделяли с помощью

ПЦР с использованием праймеров Ιν03 (5'ОООООААТТССССАТТСААТОААОООТС

ТАС-3') и Ιν05 (5'-ОАТССССОООТСТТА

ААССАООСТТСОСААТО-3'), которые являют37 ся производными от последовательности гена ΗΝ ΑΜΡν2 (СепВапк, депозитарный № Ό14030). Полноразмерный кодирующий участок гена ΗΝ серотипа ΑΡΜν4 выделяли с помощью ПЦР с использованием праймеров ΐν06 (5'СССССААТТСТССТАСССТССССААССТ АСС-3') и ΐν08 (5'-АТТССССССССССТА АСТААТСАССАТСТСАС-3'), которые являются производными от последовательности гена ΗΝ ΑМΡV4 (СепВапк, депозитарный № Ό14031). Полученные в результате ПЦРфрагменты расщепляли (либо сразу, либо после клонирования в рСЕМ-Т) рестриктазами ЕсоКГ и Хта1 и клонировали в рС1пео между ЕсоКГ- и Хта1-сайтами. Полученные в результате плазмиды обозначили ρϋ^οΗΝ2 и рОпеоИМ соответственно.

Химеры между геном ΗΝ ΝΌν штамма Ьа8о!а и генами ΗΝ штаммов АРМУ2 и АРМУ4 были сконструированы с помощью ПЦР с перекрывающимися праймерами следующим образом. Ν-концевой участок (кодирующий аминокислоты 1-141) гена ΗΝ ΝΌν штамма Ьа8о1а амплифицировали с использованием ДНКполимеразы Ρ\\ό с праймерами ΐν01Β (5'СТАССААТТСААСАСАСССССССССТС ААТ-3'; нуклеотиды 6325-6354) и ΐν10 (5'ААТСАСТТСТТТСССТАТСССССС-3'; нуклеотиды 6811-6834). С-концевую часть гена ΗΝ ΑΡМV2 (кодирует аминокислоты 142-580) амплифицировали с использованием ДНКполимеразы Ρ\\ό с праймерами ΐν11Β (5'ссссссатасссааа саастсаттсаассаСАТССАТСТССАССС-3') и ΙΥ05. Полученные ПЦР-фрагменты соединяли методом ПЦР с перекрывающимися праймерами (участки перекрывания выделены курсивом) с использованием праймеров ΐν01Β и ΐν05 и набора ферментов Ехрап! Ηίβΐι Р1йе1йу кй. Полученный в результате ПЦР-фрагмент расщепляли (либо сразу, либо после субклонирования в рСЕМ-Т) рестриктазами ЕсоКГ и XтаI и клонировали в состав рСГпео между ЕсоКГ- и ХтаГ-сайтами. Полученную плазмиду, включающую гибридный ген ΗΝ, кодирующий аминокислоты 1-141 ΝΌν и аминокислоты 142-580 ΑΡΜν2, обозначили ρСIηеοΗN1/2¹⁴¹.

С-концевую часть гена ΗΝ ΑΡΜν4 (кодирует аминокислоты 143-569) амплифицировали с использованием праймеров ΐν14Β (5'ссссссатасссаасаастсаттстасатс АТССАТСТССАССССТАААТТТСС-3') и ΐν08. Этот фрагмент соединяли с Ν-концевой частью гена ΗΝ ΝΌν (см. выше) методом ПЦР с перекрывающимися праймерами с использованием праймеров ΐν01Β и ΐν08. Полученный в результате ПЦР-фрагмент расщепляли (либо сразу, либо после субклонирования в рСЕМ-Т) рестриктазами ЕсоК! и XтаI и клонировали в состав рСГпео между ЕсоК!- и ХтаГ-сайтами. Полученную плазмиду, включающую гибридный ген ΗΝ, кодирующий аминокислоты 1-141 ΝΌν и аминокислоты 143-569 ΑΡΜν4, обозначили ρСIηеοΗN1/4¹⁴¹.

Аналогично конструкциям, описанным выше, были образованы гибридные гены ΗΝ, кодирующие аминокислоты 1-143 ΝΌν и аминокислоты 144-580 ΑΡΜΥ2 или кодирующие аминокислоты 1-143 ΝΌν и аминокислоты 145569 ΑΡΜΥ4. Для получения этих конструкций ПЦР-фрагменты получали с использованием следующих пар праймеров: аминокислоты 1-143 ΝΌν, праймеры ΙΥ01Β и ΐν13 (5'АТСТАСААТСАСТТСТТТСССТАТС-3'; нуклеотиды 6816-6840); аминокислоты 144-580 ΑΡΜν2, праймеры 1У14В (5'-СССССС

АТАСССАААСААСТСАТТС ТА САТСАТССА ТСТССАССССТАААТГТСС-3 ') и ΐν05; аминокислоты 145-569 ΑΡΜν4, праймеры I ν 15В (5'ССССССАТАСССААА СААСТСАТТСТАСАТС АААСАССТСАСТАСАСАССАС-3') и ΐν08. Полученные ПЦР-фрагменты расщепляли (либо сразу, либо после субклонирования в рСЕМ-Т) рестриктазами ЕсоКГ и XтаI и клонировали в состав рСГпео между ЕсоКГ- и XтаI-сайтами. Полученные в результате плазмиды обозначили рС1пео1/2¹⁴³ и рС1пео1/4¹⁴³ соответственно. Для анализа экспрессии белков ΗΝ клетки СЕК или клетки СМ5 инфицировали ΡΡν-Τ7 в течение 1 ч при МО1=1, трансфицировали плазмидами ρСIηеοΗN, ρСIηеοΗN2, ρСIηеοΗN4, ρСIηеοΗN1/2¹⁴¹, ρСIηеοΗN1/2¹⁴³, ρСIηеοΗN1/4¹⁴¹ и ρСIηеοΗN1/4¹⁴³ и через 24 ч после трансфекции монослойные культуры покрывали 1%-ной суспензией куриных эритроцитов в ФСБ в течение 45 мин при комнатной температуре. После этого монослои тщательно промывали 3 раза ФСБ и прилипание эритроцитов к трансфицированным клеткам анализировали под микроскопом. Для анализа индукции слияния клеток после одновременной экспрессии белков ΗΝ и Р клетки СЕК или клетки ЦМ5 котрансфицировали плазмидой рСТпеоЕ'¹ вместе с одной из плазмид ρСIηеοΗN1, ρСIηеοΗN2, ρСIηеοΗN4, ρСIηеοΗN1/2¹⁴¹, ρСIηеοΗN1/4¹⁴¹, ρСIηеοΗN1/2¹⁴³ и ρСIηеοΗN1/4¹⁴³. После инкубации в течение 23 дней монослойные культуры промывали в ФСБ, окрашивали в течение 15 мин раствором Гимза (1:30 разведение в воде) и анализировали под микроскопом.

Клонирование гибридных генов ΗΝ в полноразмерную кДНК генома ΝΌν.

Синтетический линкер, обозначенный ΗΝ12, был встроен между ΝοΐΙ- и 8реГ-сайтами плазмиды рСЕМ-Т (йготеда) с использованием олигонуклеотидных праймеров ΗN12а (5'ССССССАТАТТСТАСАСТТААССАСТТА-3') и КЫ12Ь (5'-СТАСТААСТССТТААСТСТАС ААТАТСС-3').

Синтетический линкер, обозначенный

ΗΝ14, был встроен между ΝοΐΙ-и 8реГ-сайтами плазмиды рСЕМ-Т с использованием олигонуклеотидных праймеров ΗN14а (5'-СССССС

АТАТТСТАСАСТТААССА-3') и КЫ14Ь (5'39

СТАОТСОТТААСТСТАОААТАТОС-3'). Полученные в результате плазмиды обозначили ρΟΕΜ-ΗΝ12 и ρΟΕΜ-ΗΝ14 соответственно. Эти плазмиды расщепляли рестриктазами ΝοΐΙ и ХЬа1 и использовали для клонирования №П/8ре1-фрагмента (нуклеотиды 3390-7488) из состава плазмиды р535-8|Е'‘с|С.’т. Полученные в результате плазмиды обозначили ρΟΕΜΗΝ1/2Ν8 и ρΟΕΜ-ΗΝ1/4Ν8 соответственно. Гены ΗΝ из этих плазмид заменяли гибридными генами ΗΝ из плазмид ρΟΙικοΗΝ1/2¹⁴³ и ρΟΙικοΗΝ1/4¹⁴³ соответственно (см. раздел «Клонирование и экспрессия генов ΗΝ и гибридных генов ΗΝ»). Для этой цели плазмиды ρΟΙικοΗΝ1/2¹⁴³ и ρΟΙικοΗΝ1/4¹⁴³ расщепляли рестриктазами ΝΙκΙ и 8та1 и полученные фрагменты (включающие гибридные гены ΗΝ1/2¹⁴³ и ΗΝ1/4¹⁴³) клонировали между ΝΙκΙ- и ΗραΙсайтами плазмид ρΟΕΜ-ΗΝ1/2Ν8 и ρΟΕΜΗΝ1/4Ν8 с получением плазмид ρΟΕΜ+ΗΝ12 и ρΟΕΜ+ΗΝ14 соответственно. Последние плазмиды использовали для внесения гибридных генов ΗΝ в полноразмерную геномную кДНК вируса ΝΏν. Для этого плазмиды ρΟΕΜ+ΗΝ12 и ρΟΕΜ+ΗΝ14 расщепляли рестриктазами ΝοΐΙ и 8ρеI и полученный фрагмент, включающий либо ген ΗΝ12, либо ген ΗΝ14, использовали для замещения соответствующего фрагмента в составе ρΝΏΕΕ+, получая тем самым ρΝΟΕΕ+ΗΝ1/2^Ι43Οιη и ρ\Ι)ΕΕ·\111/4¹⁴³Сп1 соответственно. Ген Ст удаляли из состава этих плазмид путем обработки рестриктазой восстановлением кольцевой структуры с помощью ДНК-лигазы Т4. С целью соответствия «правилу шести» линкер встраивали по уникальному 8ρеI-сайту в составе этих плазмид с использованием самокомплементарных олигонуклеотидов. Линкер Н2 (5'-СТАОСОАОСОСТСО-3') был встроен в плазмиду ρΝΏΕΕ+ΗΝ1/2¹⁴³, а линкер Н3 (5'-СТАОСОАОС№ОСТСО-3') был встроен в плазмиду ρΝΏΕΕ+ΝΗ1/4¹⁴³, в результате чего получали плазмиды ρΝΏΕΕ+ΗΝ1/2¹⁴³ (Η2) и ρΝΏΕΕ+ΝΗ1/4¹⁴³ (Н3) соответственно.

Удаление специфичного эпитопа из белка ΗΝ ΝΏν штамма Ε;·ι8οΙ;·ι.

Специфичный эпитоп, т.е. аминокислоты 346-354 (ΡΟΕΡΟΥΡΙΚ) в последовательности белка ΗΝ вируса ΝΏν штамма Ε;·ι8οΙ;·ι. который распознается моноклональным антителом 4Ώ6 (Бщ-щ е! а1., 1986; Μеи1етаη8 е! а1., 1986), удаляли путем замещения этой последовательности на соответствующую последовательность белков ΗΝ либо АΡΜV2 (Ν^ΙΏ^Ή), либо АΡΜV4 (РЭРЕрэрШ). Для этого плазмиду ρΟ^οΗΝ (см. раздел «Клонирование и экспрессия отдельных генов ΝΏν») использовали в качестве матрицы для создания перекрывающихся ПЦР-фрагментов. Для последовательности АΡΜV2 первый ПЦР-фрагмент получали с использованием праймера ΐν01 (5'-ОТАОАС ОСОТААОАОАООССОССССТСААТ-3') и праймера 2ΗΝ2 (5'-ОАТАОТТТОСТОТАТ

АТСАОТССОАТТОСАТОТОТСАТТОТАТСО СТТОТАТАТСАС-3'). Второй ПЦР-фрагмент получали с использованием праймеров 5ΗΝ2 (5'-ААТСООАСТОАТАТАСАОСАААСТАТСА ТООССААОТСТТСОТАТААОССТООАОСС3') и ΝΏν3-ΗΝ (5'-СОАОСССОООССООСАТТ СООТТТОАТТСТТО-3').

Полученные в результате фрагменты объединяли и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с праймерами ΐν01Β (5'ОТАООААТТСААОАОАООССОССССТС ААТ-3') и ΝΏν3-ΗΝ. Для последовательности АΡΜV4 первый ПЦР-фрагмент получали с использованием праймера ΐν01 и праймера 3ΗΝ4 (5'-ТААОАТСТОАТСТТОСАОСОООТСАОО ОСАТОТОТСАТТОТАТСОСТТОТАТАТСАС3'). Второй ПЦР-фрагмент получили с использованием праймеров 5ΗΝ4 (5'-ССТОАС СОСТОСААОАТСАОАТСТТААТООССААОТ СТТСОТАТААОССТООАОСС-3') и ΝΏν3-ΗΝ. Полученные в результате фрагменты объединяли и использовали в качестве матрицы для третьей ПЦР с использованием праймеров ΐν01Β и ΝΏν3-ΗΝ. Праймеры 3ΗΝ2/5ΗΝ2 и 3ΗΝ4/5ΗΝ4 отчасти комплементарны и включают генетические коды для последовательности ΗΝ2 (НКТЭ1РРТ1) и для последовательности ΗΝ4 (РОРБрэрШ) соответственно. Реакции ПЦР проводили с использованием набора реактивов Εxρаηά Εοη§ Тетρ1аΐе РСК кй (Βοейппдет Μаηηйе^т). ПЦР включала 30 циклов по 10 с при 94°С, 30 с при 58°С и 2 мин при 68°С с последующим 1 циклом в течение 4 мин при 68°С. ПЦР-фрагменты расщепляли рестриктазами Ε^ΚΙ и В§и361 и клонировали между БссКЬ и В8и361-сайтами в плазмиду ρΟ^οΗΝ. Полученные в результате плазмиды обозначили ρСIηеοΗN1(ΗN2е) и ρСIηеοΗN1(ΗN4е) соответственно. Анализ перемежающейся экспрессии показал, что модифицированные белки ΗΝ точно экспрессируются и переносятся на поверхность клетки, на что указывает анализ гемоадсорбции на материале куриных эритроцитов. Более того, моноклональное антитело 6Ώ4, которое специфично в отношении линейного эпитопа ΗΝ ΝΏν, который состоит из аминокислот 346-354 (или, по крайней мере, включает их), не реагирует с модифицированными белками ΗΝ.

Плазмиды ρСIηеοΗN1(ΗN2е) и ρСIηеοΗN1(ΗN4е) расщепляли рестриктазами ΝπγΙ и 8ρеI и фрагменты, включающие модифицированные гены ΗΝ, клонировали между ΝηΗи 8ρеI-сайтами плазмид ρΟΕΜ-ΗΝ1/2Ν8 и ρΟΕΜ-ΗΝ1/4Ν8 соответственно. Полученные в результате плазмиды, обозначенные ρΟΕΜΗN1(ΗN2е) и ρΟΕΜ-ΗN1(ΗN4е), расщепляли рестриктазами ΝοΐΙ и 8ρеI и использовали для замещения NοΐI/8ρеI-фрагмента в составе ρΝΏΕΕ+. Полученные в результате плазмиды обозначили ρN^Ε^-ΗN(ΗN2е)Ст и ρΝΏΕΕΗN(ΗN4е)Ст соответственно. Ген Ст удаляли из этих плазмид расщеплением рестриктазой

ХЬа1с последующим религированием. Полученные в результате плазмиды обозначили ρΝΏΕΕΗΝ(ΗΝ2ο) и ρΝΌΕΕ-ΗΝ(ΉΝ4ο) соответственно.

Результаты

Нуклеотидная последовательность 3'- и 5'концевых участков генома ΝΏν штамма Ьа8о!а.

Нуклеотидная последовательность предполагаемого 3'-конца генома ΝΏν опубликована (Шиба е! а1., 1986), хотя и на материале иного штамма ΝΌν (Ώ26), чем тот, который использовался в данной работе (Ъа8о!а). Опубликована (УикоГГ е! а1., 1987) последовательность гена Ь и относительно крупного некодирующего участка за геном Ь вируса ΝΏν штамма Веаибейе-С. Однако, как здесь показано, данная последовательность не включает полную 5'-концевую часть вирусного генома, что делает невозможным создание инфекционной копии ΝΏν. 3'- и 5'-Концевые участки генома вирусов с некодирующими одноцепочечными РНК играют ключевую роль в репликации и транскрипции (ЬатЬ & Ко1акоГкку, 1996). Таким образом, с целью получения полноразмерной кДНК генома ΝΏν, которую можно было бы использовать для получения инфекционного вируса методами обратной генетики (Соп7е1тапп, 1996), совершенно необходимо включить в вирусный геном точные 3'- и 5'-концевые участки. Следовательно, авторами была определена точная нуклеотидная последовательность обоих 3'- и 5'-концов геномной РНК вируса ΝΏν штамма Ьа8о!а с использованием метода 3'- и 5'-КАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК). 5'-Концевой участок был выделен с помощью ПЦР после лигирования одноцепочечного якорного праймера (АЬО3) на одноцепочечную кДНК, которую получали путем обратной транскрипции 5'концевого сегмента геномной РНК. С использованием праймера АЬО4, комплементарного якорному праймеру, и ΝΏν-специфичного праймера были получены ПЦР-продукты, которые включали 5'-концевой участок.

Для клонирования 3'-участка ΝΏν одноцепочечный якорный праймер АЕО3 лигировали на 3'-конец вирусной РНК с использованием РНК-лигазы Т4 и амплифицировали методом ПЦР с праймером АЬ64 и ΝΏν-специфичным праймером (способ I). С другой стороны, 3'- и 5'-концевые участки РНК ΝΏν лигировали друг на друга с использованием РНК-лигазы Т4 и полученный в результате РНК-конкатенат использовали в ПЦР с ревертированием с ΝΏνспецифичными праймерами, которые фланкируют точку лигирования (способ II). Продукты реакций 3'- и 5'-КАСЕ клонировали в Т-вектор рВ1ие5СпрШ-Т8К ЦсЫйата & Китока^а, 1993) или в ρΟΕΜ4Ζ с последующим выделением и секвенированием нескольких независимых клонов. Полученные результаты обобщены в табл. 2. Для проведения прямого сравнения 3'- и 5'концевых участков нуклеотидные последовательности показаны в виде ДНК, а 3'-конец ге номной цепи представлен как 5'-конец антигеномной цепи. На уровне геномной РНК последовательность 3'-конца читается как 3'-иОО иииОиСиСииАО-5', в то время как последовательность 5'-конца читается как 3'-иии АОАААСАААССА-5'. Последовательность 3'конца почти полностью совпадает с опубликованной 3'-концевой последовательностью ΝΏν штамма Ώ26 (Шиба е! а1., 1986). Однако последовательность 5'-конца указывает на то, что ΝΏν штамма Ьа8о!а включает 64 дополнительных нуклеотида по сравнению с опубликованной последовательностью гена Ь ΝΏν штамма Веаибейе-С (УнюГГ е! а1., 1987) (фиг. 6).

Репликация минигеномов ΝΏν с участием вируса-помощника.

Для установления того, функциональны ли 3'- и 5'-концевые участки ΝΏν по репликации и транскрипции, были сконструированы минигеномы, которые включали 3'-участок ΝΏν (нуклеотиды 1-119), ген-репортер, кодирующий секретируемую щелочную фосфатазу (8ЕАР), и 5'конец ΝΏν (нуклеотиды 14973-15186) (фиг. 2). Указанные минигеномы клонировали в обеих ориентациях в транскрипционный вектор рОЬТУ5, получая в результате плазмиды ρΘΕΤν535 и ρΟΕΤν553, соответственно (подробнее о конструировании см. раздел «Материал и методы»). Плазмида ρΟΕΤν5 включает (фиг. 1) промотор РНК-полимеразы Т7 с нижерасположенными уникальными рестрикционными 8й11- и 8та1-сайтами, автокаталитический рибозим вируса гепатита-Ώ (ΗΏν) и сигнал терминации транскрипции нечетного фага Т7 (Райпшк е! а1., 1992). В результате транскрипции ίη у1уо или ш уйго плазмиды ρΟΕΤν535 с использованием РНК-полимеразы Т7 образуется антигеномная РНК (т.е. [+]-РНК), в то время как при транскрипции плазмиды ρΟΕΤν553 образуется геномная РНК (т.е. [-]-РНК) (фиг. 5).

Для анализа того, может ли минигеномная РНК, образованная плазмидами ρΟΕΤν535 и ρΟΕΤν553, реплицироваться и экспрессироваться с участием ΝΏν, выполняющего роль вируса-помощника, авторы использовали клетки СЕК, которые экспрессируют РНК-полимеразу Т7 либо по конститутивному типу (клетки СЕКС9: см «Материалы и методы»), либо после инфицирования рекомбинантным вирусом куриной оспы ГρΕΕ^Τ7ρо1 (Впйоп е! а1., 1995; здесь и далее обозначается как ΕΡν-Τ7), который экспрессирует РНК-полимеразу Т7. Клетки СЕКС9 и клетки СЕК, инфицированные ΕΡν-Τ7, трансфицировали минигеномными плазмидами ρΟΕΤν535 или ρΟΕΤν553 и после инкубации в течение 3 ч при 37°С клетки либо инфицировали ΝΏν в течение 1 ч, либо оставляли неинфицированными. Приблизительно через 24 ч после трансфекции образец отбирали из культуральной среды и оценивали активность 8ЕАР. Полученные результаты показали, что экспрессия 8ЕАР была очень высокой в клетках, инфици43 рованных ЕРУ-Т7 и трансфицированных плазмидой рОЬТУ535. Это неудивительно потому, что транскрипция под контролем РНКполимеразы Т7 образует антигеномную [+]РНК, копируемую ферментами куриной оспы, которая эффективно транслируется в клеткехозяине. В клетках, трансфицированных рОЬТУ553, транскрипция с участием РНКполимеразы Т7 образует геномную [-]-РНК, которая для того, чтобы транслировать белок 8ЕАР, должна предварительно конвертироваться в [+]-РНК с участием вируса-помощника (сравн. с фиг. 5). В обоих случаях в клетках, инфицированных ИЭУ, по сравнению с неинфицированными клетками, не обнаруживается увеличение экспрессии 8ЕАР. С другой стороны, экспрессия 8ЕАР в ИЭУ-инфицированных клетках была стабильно примерно вдвое ниже по сравнению с неинфицированными клетками (данные не включены). В случае с клетками, трансфицированными рОЬТУ535, это можно объяснить уже имеющимся очень высоким уровнем экспрессии 8ЕАР с транскриптов, образованных с участием РНК-полимеразы Т7. Однако в клетках, трансфицированных рОЬТУ553, в которых эффективная экспрессия зависит от конверсии геномной [-]-РНК в антигеномную [+]-РНК или мРНК с участием полимеразного комплекса, можно было бы ожидать увеличения экспрессии 8ЕАР после инфицирования ИЭУ.

Авторы предположили существование двух причин, по которым минигеномы не способны экспрессировать и реплицироваться с участием ИЭУ. Во-первых, размер минигеномных РНК не удовлетворяет так называемому «правилу шести» (Са1аш & Коих, 1993; Ко1ако£§ку е! а1., 1998). Согласно этому правилу, геномы парамиксовирусов эффективно реплицируются только тогда, когда их длина кратна 6 нуклеотидам. Во-вторых, два дополнительных нуклеотида 6, которые располагаются на 5'-конце минигеномных РНК, могут мешать точной репликации и/или транскрипции с участием вирусного полимеразного комплекса. Для оценки того, действительно ли репликация геномов зависит от «правила шести», авторы внесли по уникальному С1а1-сайту плазмид рОЬТУ535 и РОЬТУ553 серию коротких самокомплементарных олигонуклеотидов, которые увеличивали длину на 1 нуклеотид (фиг. 2). Полученные в результате плазмиды (рОЬТУ535 от N0 до N5 и рОЬТУ553 от N0 до N5) различаются по размеру на 1-6 нуклеотидов, следовательно, один из них должен образовать минигеномную РНК, которая удовлетворит «правилу шести». Эти плазмиды использовали для трансфекции клеток СЕК или клеток СЕК-С9, инфицированных РРУ-Т7, как описано выше. Полученные результаты показали, что только плазмиды рОЬТУ535№ и рОБТУ553№3 обусловливали усиление активности 8ЕАР после НЭУ инфицирования. Длина минигеномных РНК, полученных с этих плазмид с участием РНК-полимеразы Т7, была определена как 6п+2. Поскольку на 5'-конце указанных минигеномных РНК присутствуют два «лишних» нуклеотида С, то эти данные подтверждают, что только размер последовательности РНК, расположенной между аутентичными 3'- и 5'-концами минигеномных РНК, является существенным для «правила шести». Это проверяли путем конструирования минигеномных плазмид, в составе которых старт-сайт транскрипции РНКполимеразы Т7 изменяли так, что первый нуклеотид, который встраивается в РНК, был первым нуклеотидом 3'- или 5'-конца НЭУ (см. «Материалы и методы»). Трансфекция этими плазмидами показала, что только те минигеномные РНК, которые происходили от плазмид рОЬТУ535№ и РОЕТУ553№3. реплицируются с участием вируса-помощника (данные не включены). Установление данного факта дополнительно указывает на то, что репликация МОУ жестко ограничена «правилом шести». Более того, эти данные указывают на то, что присутствие двух «лишних» нуклеотидов С на 5'-конце минигеномных РНК не мешает точной репликации. Аналогичные результаты были получены на материале минигеномных плазмид (или плазмид ΏΙ) других парамиксовирусов (Райпа1к е! а1., 1992; Найу & Ра1е§е, 1995).

Упаковка минигеномов НЭУ с участием вируса-помощника.

Для установления того, могут ли минигеномные РНК быть упакованы с участием вируса-помощника НЭУ, культуральную среду трансфицированных клеток переносили на свежие монослои и после часовой адсорбции монослойные культуры трижды промывали ФСБ и дополнительно инкубировали в полной среде. После инкубации в течение 24 ч измеряли активность 8ЕАР в культуральной среде. Полученные результаты показали, что активность 8ЕАР присутствовала только в клетках, которые были обработаны культуральной средой, взятой от клеток, трансфицированных минигеномной плазмидой рОБТУ553№3 (табл. 4). Эти данные указывают на то, что минигеномные РНК могут быть упакованы в оболочки ИОУ и что полученные вирусные частицы способны инфицировать клетки. Более того, эти данные показывают, что упаковка зависит от репликации, а это говорит о том, что только те молекулы РНК, которые образуют комплекс с вирусными белками №, Р и Ь, упаковываются в вирусоподобные частицы.

Репликация минигеномов НЭУ с участием плазмид, экспрессирующих белки №, Р и Ь.

Для определения того, могут ли минигеномные РНК также реплицироваться с участием плазмид, кодирующих ключевые белки №, Р и

Ь, были проведены эксперименты по котрансфекции клеток, инфицированных ЕРУ-Т7. Клет45 ки трансфицировали путем сочетания плазмид, включающих минигеномную плазмиду и плазмиды рС1пео№, ρСIηеοΡ и рС1пеоЬ(с) соответственно. В качестве негативного контроля плазмиду рС1пеоЬ(с), которая кодирует ключевой белок Ь, заменяли векторной плазмидой рС1пео. Полученные результаты (табл. 5) показали, что действительно плазмиды, кодирующие белки ΝΡ, Ρ и Ь, способны обеспечивать репликацию минигеномных РНК. Также эти результаты показывают, что аналогичным образом с репликацией минигеномов с участием вирусапомощника, репликация с участием белков ΝΡ, Ρ и Ь также является зависимой от «правила шести».

Нуклеотидная последовательность полного генома ΝΏν штамма Ьа8о1а.

Субгеномные фрагменты кДНК, охватывающие полный геном ΝΏν, были сконструированы с применением ПЦР с ревертированием (фиг. 4). Для минимизации ошибок при ПЦР смесь ферментов, обладающих корректирующей активностью (Ехрапй Ьопд Τетр1аΐе кй: Воейппдег Маппйет), использовали в сочетании с ограниченным числом циклов ПЦР (15 циклов). Праймер 3ΏΙΤ, комплементарный 3'-концу РНК ΝΏν, использовали для обратной транскрипции, а ген-специфичные праймеры использовали для ПЦР. Для идентификации возможных ошибок при ПЦР были проведены три независимые реакции ПЦР, в результате которых получали три независимых набора субгеномных кДНК. Эти кДНК, размер которых варьировался от 4 до 7 тысяч пар нуклеотидов, клонировали в рСЕМ-Τ. Нуклеотидную последовательность двух наборов кДНК определяли с использованием праймеров, которые были либо установлены по параметрам опубликованных последовательностей ΝΏν, либо являются производными от последовательности ΝΏν, определенной в ходе данного исследования (табл. 1). Остававшиеся неопределенности разрешали путем секвенирования соответствующих участков на материале третьего набора клонов кДНК. Геном ΝΏν штамма Ба8о1а состоит из 15186 пар нуклеотидов (фиг. 3), что делает его наименьшим среди геномов всех парамиксовирусов, для которых к настоящему времени установлена полная геномная последовательность (Ко1акоГкку е( а1., 1998).

Конструирование клона полноразмерной кДНК ΝΏν в транскрипционной плазмиде рОБГУ5.

Для конструирования полноразмерного клона кДНК вируса ΝΏν штамма Ба8о1а перекрывающиеся клоны кДНК, охватывающие полный геном ΝΏν, соединяли друг с другом по общим рестрикционным сайтам в соответствии с подходом, отображенным на фиг. 4. Полную кДНК ΝΏν собирали в минигеномной плазмиде рОЬЕУ535 (см. выше), которая является производной от транскрипционной плазмиды

ΡΟΕΤν5.

Как можно видеть на фиг. 4В, последним этапом данной сборки полной кДНК ΝΏν было клонирование СЫ-фрагмента длиной примерно 8,8 тысяч пар нуклеотидов (нуклеотиды 352112355) из состава рСЕМ-В в плазмиду р535Юф которая включает последовательности ΝΏν, фланкирующие СЫ-сайт по обеим сторонам от него (т.е. нуклеотиды 1-3521 и 12355-15186 соответственно). Этот этап, как оказалось, является весьма трудным, т. к. заявителям в течение нескольких раз не удавалось образовать точные клоны. Следовательно, СЫ-фрагмент плазмиды рСЕМ-В был помечен геном резистентности к хлорамфениколу (Ст) из плазмиды рАСУС184. Включающий ген Ст СЫ-фрагмент был выделен и клонирован по СЫ-сайту р535-О!, а полученные трансформанты отбирали по резистентности к Ст. Поскольку трансформанты характеризовались слабым ростом, отбор с антибиотиками проводили при снижении концентрации до 15 мкг/мл Ст и 10 мкг/мл канамицина, а температуру инкубации снижали с 37 до 32°С. Наконец, ген Ст удаляли из данной плазмиды путем обработки рестриктазой ΕκίΧνΙ с последующим восстановлением кольцевой структуры с помощью ДНК-лигазы Т4. После трансформации клеток Е. сой клетки, несущие желательную плазмиду, идентифицировали по их фенотипу с помощью скрининга на резистентность к Кт и на чувствительность к Ст. Полученную в результате плазмиду, которая включает полноразмерную кДНК ΝΏν, клонированную между 8таЕ и ЗЫ-сайтами транскрипционной плазмиды, обозначили рХОЕБ+.

Создание инфекционного ΝΏν на материале полноразмерной кДНК.

Для создания инфекционного ΝΏν полностью из клонированной кДНК плазмиду рХОЕБ+ использовали в экспериментах по котрансфекции с плазмидами рСШео№, рСIηеοΡ и рСШеоЬ^), как описано выше для минигеномных плазмид. Трансфекцию клеток СЕВ и СЕР контролировали с использованием минигеномной плазмиды рОЬЕУ553№ и путем измерения уровня экспрессии 8ΕΑΡ. В качестве негативного контроля использовали замену рОпеоЬ(с) на рС'Чпео. После котрансфекции клетки инкубировали в течение 3-6 дней в среде, содержащей 5% аллантоисной жидкости. Добавление аллантоисной жидкости необходимо потому, что клетки СЕВ или СЕР лишены подходящих протеаз, которые обеспечивают расщепление белка Р вируса ΝΏν штамма Ьа8о1а. Расщепление белка Р является абсолютно необходимым для распространения от клетки к клетке генерации инфекционного вируса. После инкубации в течение 3 дней проводили иммунологическое окрашивание фиксированных монослойных культур с использованием моноклонального антитела, специфичного в отношении белка Е. Полученные результаты показали, что клетки, которые окрашивались этим антителом, присутствуют только в тех монослоях, которые были котрансфицированы плазмидами ρΝΏΕΕ(+), ρί,ΊηοοΝΡ. рС1пеоР и рС1пеоЕ(с). Эти результаты указывают на то, что в этих клетках происходит репликация генома и экспрессия. Не было выявлено окрашенных клеток тогда, когда в экспериментах по котрансфекции рС1пеоЬ(с) заменяли плазмидой рС1пео.

Для выделения инфекционного вируса надосадочный слой трансфицированных монослоев СЕЕ инъецировали в аллантоисную полость развивающихся куриных яиц. Через 4 дня аллантоисную жидкость собирали, анализировали в гемагглютинационном тесте и вновь пассировали в яйца. Полученные результаты показали, что только надосадочный слой клеток, трансфицированных сочетанием плазмид ρΝΏΕΕ(+), рСЧпеоЖ, рС1пеоР и рС1пеоЬ(с), обусловливал положительную реакцию в тесте на гемагглютинацию. Аллантоисную жидкость, которая характеризовалась положительной реакцией гемагглютинации, после этого анализировали в тесте на подавление гемагглютинации с использованием моноклональных антител 7В7, 8С11, 5А1, 7Ό4 и 4Ό6 (Ьопд е1 а1., 1986), которые можно использовать для дифференцировки разных штаммов ΝΏν. Результаты данного теста показали, что штамм ΝΏν, который был выделен из инокулированных яиц, характеризовался тем же уровнем реактивности, что и исходный штамм Ьа8о1а. Вирус, который выделили из инокулированных яиц, обозначили ΝΏΕΕ, чтобы обособить его от исходного штамма Ьа8о1а.

Создание генетически модифицированного ΝΏν на материале полноразмерной кДНК.

Для того чтобы недвусмысленно показать, что котрансфекцию можно использовать для выделения инфекционного вируса на материале клонированной полноразмерной кДНК ΝΏν, в плазмиду рНЭЕЕЧ+) вносили генетическую метку. Для этой цели аминокислотную последовательность сайта расщепления протеазой в последовательности белка Ео изменяли от таковой штамма Ьа8о1а (ССКрСК/Ь) на консенсусную последовательность вирулентных штаммов ΝΏν (СЕЕОЕЕ/Е) с применением ПЦРмутагенеза (подробности см. раздел «Материал и методы»). Полученную в результате плазмиду, ]:>ΝΟΕΕ+ [Е*], использовали для создания вируса с использованием котрансфекционной системы, описанной выше. Инфекционный вирус, обозначенный НЭЕк [Е*], выделяли из аллантоисной жидкости развивающихся яиц, которые были инокулированы культуральной средой от котрансфицированных клеток СЕЕ. В тесте на подавление гемагглютинации все моноклональные антитела, включая 7Ώ4, которое специфично для штамма Ьа8о1а, проявляли такую же реактивность в отношении новообразованного вируса, как и в отношении исходного штамма Ьа8о1а. Нуклеотидную последовательность участка, кодирующего сайт расщепления протеазой белка Е, определяли с помощью ПЦР с ревертированием. Полученные результаты показали, что нуклеотидная последовательность включает точные нуклеотидные изменения, которые были внесены в мутагенный праймер, использовавшийся для модифицирования исходной последовательности Ьа8о1а. Эти данные показывают, что вирус происходил от плазмиды рХОЕЕ+|Е'‘|· и показывают, что генетически модифицированный ΝΏν может быть создан полностью на материале клонированной полноразмерной кДНК ΝΏν.

Сайт расщепления протеазой белка Ео вируса ΝΏν является ключевым детерминантом вирулентности.

В целом считается, что аминокислотная последовательность сайта расщепления протеазой в белке Ео является ключевым детерминантом вирулентности у различных штаммов ΝΏν. Создание генетически модифицированного штамма Ьа8о1а, у которого аминокислотная последовательность сайта расщепления протеазой была заменена с лентогенной (невирулентной) на таковую от велогенного (вирулентного) штамма ΝΏν, предоставляет уникальную возможность проверить данное предположение. Следовательно, определяли индекс интрацеребральной патогенности (1СР1) новообразованного вируса ХЭЕк [Е*] и сравнивали его с индексами штамма КЭЕк и исходного штамма Ьа8о1а (клон Е13-1). Полученные результаты показали, что 1СР1 штамма N^Ε^[Ε*] составил 1,3, что существенно превосходит значение для штаммов \1)1Ч. (1СР1 = 0,0) и клона Е13-1 (1СР1 = 0,3). Эти данные показывают, что, как и ожидалось, вирулентность ΝΏν в значительной степени определяется аминокислотной последовательностью сайта расщепления протеазой в белке Ео.

Внесение серологического маркера.

Оболочечные гликопротеины Е и ΗΝ ΝΏν являются наиболее сильными иммуногенными белками данного вируса. После заражения как белок Е, так и белок ΗΝ вызывают мощный ответ в виде выработки нейтрализующих антител. Индукция такого ответа по нейтрализующим антителам является основой для успешной вакцинации с использованием невирулентных штаммов ΝΏν (таких как широко применяемый штамм Ьа8о1а). Однако ответ по выработке антител на вакцинные штаммы ΝΏν не может быть распознан по сравнению с ответом по выработке антител на вирулентные полевые штаммы ΝΏν. Следовательно, инфекции вирулентным полевым вирусом не могут быть прослежены с помощью серологических методов. Такая ситуация нежелательна потому, что заражение полевым вирусом маскируется вакцинацией, а клинические признаки, вызываемые по левыми штаммами, могут просматриваться или даже приписываться данной вакцине. Поскольку успешная дифференцировка между вакцинацией и инфекцией существенна для искоренения ΝΏν, авторы имели намерение разработать генетически модифицированные штаммы ΝΏν, которые можно было использовать для вакцинации и которые были бы серологически отличимы от полевых штаммов ΝΏν (так называемые «маркерные вакцины»). С целью разработки маркерных ΝΏν-вакцин вирус должен быть генетически модифицирован таким образом, чтобы один или несколько иммунодоминантных эпитопов одного из (основных) антигенов был либо делетирован, либо модифицирован. Делеция части(ей) ключевого белка может приводить к утрате биологической функции данного белка. Следовательно, один из иммунодоминантных белков оболочки ΝΏν заявители выбрали для модифицирования таким образом, чтобы биологическая функция этого белка сохранялась, в то время как репертуар антител, специфичных в отношении модифицированного белка, отличался от такового, специфичного в отношении исходного белка. С точки зрения резонов, о которых говорится ниже, в одном варианте настоящего изобретения заявители выбрали для модифицирования белок ΗΝ вируса ΝΏν. Инфекция ΝΏν инициируется слиянием оболочки вириона с плазматической мембраной клетки-хозяина. Для этой цели необходимы как белок Б, так и белок ΗΝ. Было показано, что белки Б и ΗΝ физически взаимодействуют, и это взаимодействие необходимо для слияния мембран фепд е1 а1., 1995). Более того, было показано, что такое взаимодействие является типоспецифичным, т.е. белки Б и ΗΝ должны происходить от одного и того же вируса для того, чтобы проявить активность по слиянию. Взаимодействующий домен белка ΗΝ вируса ΝΏν был картирован в так называемом «стеблевом» или «стволовом» сегменте данного белка, состоящем из первых 92 аминокислотных остатков в составе эктодомена белка ΗΝ (Оепд е1 а1., 1995). Гибридные белки ΗΝ, включающие аминокислоты 1-141 ΝΏν и аминокислоты 141572 вируса парагриппа человека 3-го типа (1ιΡΐν3), как было показано, сохраняют активность по слиянию в случае коэкспрессии с белком Б ΝΏν. Эти данные подтверждают, что жизнеспособными могут быть генетически модифицированные штаммы ΝΏν, которые несут гибридный белок ΗΝ, включающий «стеблевой» участок ΝΌν с последующим глобулярным сегментом («головкой») белка ΗΝ отличающегося серотипа парамиксовируса птиц. Более того, такие штаммы будут вызывать ответ в виде антител к ΗΝ, который отличается от таковых, специфичных для ΝΏν. Поскольку ответ по нейтрализующим антителам на белок Б достаточен для достижения эффективной защиты против исходной вирусной инфекции, то такие генетически модифицированные штаммы ΝΌν объединяют в себе два ключевых свойства маркерной вакцины, а именно защиту от заболевания и серологическую дифференцировку.

Были сконструированы гибридные гены ΗΝ, составленные слиянием либо аминокислот 1-141 ΝΏν и аминокислот 142-580 парамиксовируса птиц 2-го типа (ΑΡΜV2) (обозначена ΗΝ1/2¹⁴¹), либо аминокислот 1-143 ΝΏν и аминокислот 144-580 ΑΡΜV2 (обозначена ΗΝ1/2¹⁴³). Аналогичным образом были сконструированы гибридные гены ΗΝ, составленные слиянием либо аминокислот 1-141 ΝΏν и аминокислот 143-569 ΑΡΜV4 (обозначена ΗΝ1/4¹⁴¹), либо аминокислот 1-143 ΝΏν и аминокислот 145-569 ΑΡΜV4 (обозначены ΗΝ1/4¹⁴³). Эти гибридные гены были клонированы в эукариотический экспрессирующий вектор рС1пео и их использовали в экспериментах по котрансфекции наряду с плазмидой, несущей белок Б ΝΏν. Для этого белок Б модифицировали таким образом, чтобы аминокислотная последовательность сайта расщепления протеазой между Б2 и Б1 изменялась с последовательности, характерной для Ьа8о1а, на ту, которая является консенсусной последовательностью вирулентных штаммов ΝΏν (Б¹: см. раздел «Материалы и методы»). Эксперименты по котрансфекции клеток СЕВ и клеток фМ5 показали, что как ΗΝ1/2¹⁴¹ и ΗΝ1/2¹⁴³, так и ΗΝ1/4¹⁴¹ и ΗΝ1/4¹⁴³ индуцировали слияние клеток в варианте коэкспрессии с белком Б¹. Полученные данные показали, что комплексы между гибридными белками ΗΝ и белком Б биологически активны. Гибридные белки ΗΝ1/2¹⁴³ и ΗΝ1/4¹⁴³ использовали для замещения исходного гена ΗΝ в составе полноразмерного клона кДНК рN^Б^+, получая тем самым плазмиды рN^Б^ΗΝ1/2¹⁴³ и рN^Б^-ΗN 1/4¹⁴³. Последние две плазмиды были после этого использованы для получения инфекционных вирусов с использованием описанной выше котрансфекционной системы. Жизнеспособные рекомбинантные вирусы (обозначенные ΝΏΡΕ-ΗΝ1/2¹⁴³ и ΝΏΡΕΗΝ1/4¹⁴³) могут быть выделены из аллантоисной жидкости развивающихся яиц, которые были инокулированы надосадочной фракцией трансфицированных монослоев.

Присутствие гибридного гена ΗΝ в каждом из двух рекомбинантов проверяли с помощью ПЦР с ревертированием. Тесты на подавление гемагглютинации показали, что моноклональные антитела и поливалентные антисыворотки против ΝΏν были неспособны подавлять агглютинацию куриных эритроцитов рекомбинантными вирусами ΝΏΡΕ-ΗΝ1/2¹⁴³ и ΝΏΡΕΗΝ1/4¹⁴³. Эти данные показывают, что штаммы ΝΏΡΕ-ΗΝ1/2¹⁴³ и ΝΟΡΊ.-11Ν 1/4¹⁴³ можно использовать в качестве таких вакцин, которые по серологическим признакам отличаются от стандартных вакцин против ΝΏν.

Экспрессия гетерологичного белка рекомбинантным ΝΏν.

Для анализа того, могут ли чужеродные гены встраиваться в геном ΝΏν, заявители сконструировали рекомбинантный вирус, который несет репортерный ген 8ЕАР. Ген 8ЕАР происходил от плазмиды рОЬТУ535 и его модифицировали так, чтобы он включал типичные сайты инициации и остановки транскрипции из ΝΌν. ДНК-фрагмент, включающий ген 8ЕАР с последующими транскрипционными стоп- и старт-сайтами, встраивали по XтηI-сайту (109-й нуклеотид) плазмиды рN^Е^+[Е^ν*]. Инфекционный вирус, обозначенный N^Е^-ΑΡ, был получен с использованием котрансфекционной системы, а присутствие гена 8ЕАР проверяли с помощью ПЦР с ревертированием. Клетки, инфицированные штаммом N^Е^-ΑΡ, экспрессировали очень высокие уровни белка 8ЕАР. Используя специфическую активность белка 8ЕАР, заявители подсчитали, что Х% белков, экспрессируемых клетками, инфицированными ΝΏΕΕ-АР, приходится на белок 8ЕАР. Эти данные показывают, что гетерологичные гены могут быть экспрессированы рекомбинантными ΝΏν на очень высоких уровнях.

Образование делеционного мутанта ΝΏν в транс-комплементирующей клеточной линии.

С целью исключения экспрессии белка М ΝΏν большую часть гена М делетировали путем расщепления плазмиды рN^Е^+[Е^ν*] рестриктазой ВзаА1 (3087-й нуклеотид) с последующим частичным расщеплением рестриктазой ЩпбШ (4252-й нуклеотид). После заполнения Η^ηάIII-образованных концов с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы полученный фрагмент рециркулизовали с использованием ДНК-лигазы Т4 и использовали для трансформации клеток Е. со11. Полученную в результате плазмиду, обозначенную рНВЕЕ+ |Ρ^ν1| 6М, использовали для получения вируса с применением котрансфекционной системы в транс-комплементирующих клетках СЕК-М, которые экспрессируют белок М ΝΏν. Надосадочную фракцию трансфицированных монослоев трижды пассировали через клетки СЕК-М и анализировали на присутствие вируса. Получение вируса подтверждается тем фактом, что культуральная надосадочная фракция после третьего пересева давала положительные результаты в тестах на гемагглютинацию (НА) и на подавление гемагглютинации (ΗΙ). Вирус обозначили ΝΏΡΈ-бМ. Когда ΝΏΡΈ-бМ использовали для инфицирования монослоев клеток СЕЕ, вирус был способен к распространению по механизму от клетки к клетке, на что указывают данные теста 1РМА при использовании моноклонального антитела к белку Е. Как ожидалось, экспрессия белка М не может быть выявлена в тесте 1РМА при использовании моноклональных антител, специфичных в отношении белка М. Когда надосадочную фракцию использовали для инфицирования либо клеток СЕЕ, либо клеток СЕК-М, в тесте 1РМА не удавалось продемонстрировать присутствие реплицирующегося вируса в этих монослойных культурах. Эти данные указывают на то, что инфекционный вирус не может быть получен в некомплементирующих клетках СЕЕ. Эти результаты были подтверждены обнаружением того, что инокуляция развивающихся яиц надосадочной фракцией от инфицированных клеток СЕЕ не приводит к образованию вирусного потомства при анализе в тестах НА и ΗΙ.

Необходимость в улучшенных ΝΏνвакцинах и особенно нужда в маркерных вакцинах против ΝΏν побудили заявителей разработать обратно-генетическую систему, которая бы позволила генетически модифицировать ΝΏν. В настоящей заявке описано создание инфекционного ΝΏν полностью из клонированной полноразмерной кДНК. Заявители показали, что вирулентность ΝΏν может быть резко изменена путем модифицирования только трех нуклеотидов, которые определяют специфичность сайта расщепления протеазой белка Е. В этом случае сайт расщепления протеазой изменяли из характерного для штамма Ьа8о!а на консенсусный сайт расщепления у вирулентных штаммов ΝΏν. Путем создания такого генетически модифицированного штамма ΝΏν заявители получили доказательство того, что расщепляемость белка Е является ключевым детерминантом (хотя и не единственным детерминантом) вирулентности ΝΏν. Путем использования того же обратно-генетического подхода сайт расщепления может быть модифицирован по желанию в любую иную аминокислотную последовательность. В результате может быть создана серия штаммов ΝΏν, которая образует диапазон уровней вирулентности.

1п у1уо.

Как уже отмечалось выше, было показано, что помимо расщепляемости белков Е и ΗΝ в патогенности могут играть роль и другие вирусные факторы. Изменения в транскрипции и трансляции могут модулировать рост и распространение по механизму от клетки к клетке вируса и/или цитопатогенность. Доступность инфекционной кДНК ΝΏν позволяет проводить систематическую модификацию последовательностей, которые вовлечены в транскрипцию и репликацию. Это может приводить к созданию новых ΝΏν-вакцин, которые придают оптимальный уровень иммуногенности виртуально несуществующей вирулентности.

Безопасность является одним из наиболее важных свойств живых вакцин. Однако для многих живых вакцин, включая ΝΏν, иммуногенность часто отрицательно коррелирует с вирулентностью. Следовательно, дальнейшее ослабление живых вакцин без потерь в иммуногенности является одним из наиболее желательных изменений, для достижения которых может быть применена генетическая модификация. В этой связи стоит отметить, что, как было показано, исключение экспрессии белка ν вируса Сендай обусловливало существенно сниженную патогенность ΐπ у1уо в отношении мышей (Ка!о е! а1., 1997). Как и в случае с вирусом Сендай, ΝΌν также образует белок V по механизму, известному как «редактирование РНК» (8!е^агб е! а1., 1993). Можно предсказать, что результатом исключения экспрессии белка V ΝΌν также может быть ослабленный фенотип 1и у1уо.

Помимо изменения вирулентности ΝΌν, заявителями показано, что возможной является модификация антигенной системы ΝΌν таким образом, что могут быть образованы штаммы, которые будут отличаться от полевых штаммов ΝΌν по серологическим признакам. Эти так называемые маркерные вакцины являются очень ценным инструментом для оценки встречаемости ΝΌν в промышленных популяциях в мире. Более того, крупномасштабное применение таких маркерных вакцин может, в конечном счете, привести к полному искоренению ΝΌν путем интенсивного скрининга и изъятия зараженных популяций. В настоящей заявке показано, что чужеродные гены могут быть встроены в геном ΝΌν. Эти чужеродные гены можно экспрессировать в инфицированных клетках на очень высоких уровнях. Это показывает, что ΝΏν можно использовать в качестве вакцинного вектора для экспрессии антигенов других патогенов (домашних птиц). Некоторые свойства делают ΝΌν идеальным вакцинным вектором для вакцинации против респираторных или кишечных заболеваний. 1) ΝΌν можно легко культивировать до очень высоких титров в развивающихся яйцах. 2) Массовая культура ΝΌν в развивающихся яйцах является относительно дешевой. 3) ΝΌν-вакцины относительно стабильны и могут быть просто введены методами массового применения, такими как добавление в питьевую воду или путем распыления или образования аэрозоля. 4) Естественное заражение ΝΌν происходит через дыхательный и/или пищеварительный тракт, что также представляет основные естественные пути заражения многими другими патогенами домашних птиц. 5) ΝΌν может индуцировать местный иммунитет, независимо от присутствия циркулирующих материнских антител.

Наконец, заявителями показано, что жизнеспособные делеционные мутанты ΝΌν могут быть образованы с использованием транскомплементирующих клеточных линий. Делеционный мутант ΝΌν был образован так, чтобы он не мог экспрессировать матричный белок (М), который участвует в почковании ΝΌν на внутренней поверхности клеточной мембраны. Заявителями показано, что фенотипически комплементированный щтамм ΝΌν, который не способен экспрессировать белок М, тем не менее способен инфицировать клетки и распро страняться по механизму передачи от клетки к клетке. Однако мутантный вирус не способен образовывать инфекционное потомство в некомплементирующих клетках. Эти данные показывают, что фенотипически комплементированные делеционные мутанты ΝΌν могут быть использованы в качестве безопасных самоограничивающих вакцин, которые не могут распространяться в окружающую среду. Такая непередаваемая вакцина объединяет самое важное преимущество живых вакцин, а именно эффективность, и самое важное достоинство убитых вакцин, а именно безопасность.

Описание чертежей

Фиг. 1 - транскрипционный вектор рОЬТУ5 является производным от транскрипционного вектора, описанного у РаИшнк е! а1., 1992: см. подробное описание конструкции в тексте. Эта плазмида включает промотор ДНКзависимой РНК-полимеразы Т7 (показан полужирным шрифтом), за которым находятся уникальные рестрикционные 81Ш- и 8таI-сайты и автокаталитический рибозим вируса гепатита-Ό (НОУ). ДНК-фрагменты могут быть клонированы между 8ΦΌ и 8таI-сайтами и могут быть транскрибированы либо ш уйго, либо 1и у1уо с использованием ДНК-полимеразы Т7. 5'-Конец полученных в результате транскриптов включает два дополнительных остатка С, которые не кодируются данной вставкой. Благодаря активности рибозима 3'-конец транскриптов точно соответствует последнему нуклеотиду данной вставки.

Фиг. 2 - структура минигеномных плазмид рОЬТУ535 (фиг. 2А) и рОЬТУ553 (фиг. 2В). Минигеномные плазмиды основываются на транскрипционной плазмиде рОЬТУ5 (сравн. с фиг. 1) и включают 3'-участок (нуклеотиды 1119) и 5'-участок (нуклеотиды 14970-15186) генома ΝΌν штамма Ьа8о!а, фланкирующие ген, кодирующий секретируемую щелочную фосфатазу (8ЕАР). Транскрипция рОЬТУ535 с участием РНК-полимеразы Т7 приводит к образованию антигеномной РНК (или [+]-РНК), в то время как транскрипция рОЬТУ553 образует геномную РНК (или [-]-РНК). Отмечены сайты начала (8) и окончания (Е) транскрипции, соответствующие вирусным сигналам инициации и терминации транскрипции. Старт-кодон гена 8ЕАР подчеркнут. Также показаны последовательности вставок (Ν0-Ν5) по СЫ-сайту, которые образуют минигеномные плазмиды, каждая из которых отличается в длину на 1 нуклеотид (соответственно, РОЬТУ535К0-И5 и рОйТУ553М)-Н5).

Фиг. 3 - нуклеотидная последовательность генома ΝΌν штамма Ьа8о1а и расшифрованная аминокислотная последовательность генов

ΝΌν. Показанная последовательность соответствует антигеномной цепи и показана в направлении от 5' к 3' в виде одноцепочечной ДНК.

Последовательность, показанная на данной фи55 гуре, является консенсусной последовательностью, которая была определена путем прямого секвенирования двух независимых наборов перекрывающихся субгеномных кДНК, которые охватывают весь геном вируса ΝΏν. Остающиеся неопределенности (по-видимому, являющиеся результатом ошибок при ПЦР) разрешали путем секвенирования соответствующих участков в третьем независимом наборе клонов.

Последовательность полноразмерного кДНК-клона ркВРЬ+, которая была получена из перекрывающихся субгеномных клонов кДНК (см. фиг. 4), отличается от консенсусной последовательности ΝΏν по следующим положениям (нуклеотиды консенсусной последовательности в скобках): нуклеотид 1755, О (А); нуклеотид 3766, А (О); нуклеотид 5109, О (А); нуклеотид 6999, Т (С); нуклеотид 7056, О (А); нуклеотид 9337, О (А); нуклеотид 9486, А (Т); нуклеотид 10195, Т (С); нуклеотид 13075, А (О). Эти различия обусловливают три аминокислотные замены (аминокислоты консенсусной последовательности в скобках): белок Р, К¹⁸⁹ (О); белок ΗΝ, 8²⁰⁰ (Р); белок Ь, Ν³⁶⁹ (I).

Фиг. 4. (А) Базовая стратегия, использовавшаяся для получения полноразмерной кДНК ΝΏν на материале перекрывающихся клонов кДНК. кДНК формировали в плазмиде рОЬТ\535, которая уже включала 3'- и 5'-концы ΝΏν штамма Ьа8о1а (сравн. с фиг. 2). Полученную в результате плазмиду, обозначенную ркВРЬ+, использовали для получения инфекционного ΝΏν.

(B) Подробная процедура клонирования в процессе получения полноразмерной кДНК ΝΏν на материале перекрывающихся субгеномных клонов кДНК. Ст обозначает ген резистентности к хлорамфениколу, который был временно внесен в качестве фенотипической метки (подробности см. в тексте).

(C) Подробная процедура клонирования при получении генетически модифицированной полноразмерной кДНК ΝΏν. Модификацией является замена трех нуклеотидов, которые были внесены в последовательность гена Р и которые приводят к модификации аминокислотной последовательности в сайте расщепления протеазой белка Р (подробности см. в тексте).

Фиг. 5. (А) Серия рОЬ^535. Транскрипция с участием РНК-полимеразы Т7 приводит к образованию антигеномной РНК (или [+]-РНК), которая может быть непосредственно транслирована клеткой в белок 8ЕАР. После инфицирования клеток вирусом-помощником (или после котрансфекции плазмид, кодирующих белки Ν₽, Р и Ь), антигеномную РНК используют для синтеза геномной РНК (или [-]-РНК) с участием вирусного полимеразного комплекса. Затем геномную РНК используют для синтеза и мРНК (с использованием специфичных стартового [8] и конечного [Е] блоков), и антигеномной РНК с участием вирусного полимеразного комплекса.

(В) Серия рОЬТ\553. Транскрипция с участием РНК-полимеразы Т7 с получением геномной РНК (или [-]-₽ΗΚ), которая не может быть транслирована в белок 8ЕАР. После инфицирования клеток вирусом-помощником (или после котрансфекции плазмид, кодирующих белки Ν₽, Р и Ь) геномную РНК используют для синтеза как мРНК (с использованием специфических стартовых [8] и конечных [Е] блоков), так и антигеномной РНК с участием вирусного полимеразного комплекса.

Фиг. 6. Сопоставление последовательностей нуклеиновых кислот 5'-концевых участков ΝΏν штамма Ьа8о1а и других парамиксовирусов проведено как сравнение последовательностей ΝΏν и четырех представителей рода КиЬи1ау1гик, трех представителей рода Рагатухоу1гик и трех представителей рода МогЬй11У1ги8. Последовательности представлены от конечного блока гена Ь до 5'-конца (кДНК в направлении 3'-5').

ΝΏν представляет вирус ньюкаслской болезни; йР№2 представляет вирус парагриппа человека 2-го типа; МиV представляет вирус свинки; 8ν5 и 8ν41 представляют вирусы 5 и 41 обезьян, соответственно; 8еV представляет вирус Сендай; ЬРШ3 И йР1\3 представляют вирусы парагриппа быка и человека, соответственно; Ο'Ών представляет вирус собачьей чумы; МеV представляет вирус кори; Κ₽ν представляет вирус чумы рогатого скота. Нуклеотидные последовательности полных геномов были получены из следующих источников (депозитарные №№): ΝΏν (АР077761); ЙРГУ2 (Х57559); Ми\ (АВ000388); 8ν5 (АР052755); 8ν41 (Х64275); ЬРГУ3 (Ώ84095); ЙРГУ3 (Ζ11575); Γην (Ы3194); МеV (Х16565); Ж (Ζ30697).

Библиография

А1ехапйег, Ώ. 1. (1993) Рагатухоу1гик 1пГесйопк. 1п νίΐΗδ 1пГесйопк оГ Ьййк. МсРеггап, РВ. аиб МсХиЙу, М.8. (ейк), рр 321-340, Е1кеу1ег 8с1епсе РиЫкйегк В.\^;'., Атк1егйат.

Апйп, Р.В апй Огйай1, С.Р. (1991) 1ко1айоп апй сйагас1епха1юп оГ ап ау1аи туодешс се11 1те. 1)е\. Вю1. 143: 111-121.

Вагоп, М.Э. апй Ваггей, Т. (1997) Кексие оГ ппйегрек! У1гик Ггот с1опей сОХА. 1. \1го1. 71; 1265-1271.

Веасй, РК. (1944) Тйе пеиЧайхаЦоп т уйго оГ ау1ап рпеитоепсерйаййк уиик Ьу Ые^сакИе йкеаке 1ттипе кегит. 8аепсе 100: 361-362.

Веагй, С.№. апй Иапкои, К.Р. (1984) №\\сак11е йкеаке. 1п М.8. ИоГк1ай е! а1. (ейк) Океаке оГ РоиЙгу, 8^|й Ей., рр. 452-470. 1о\га 81а1е Ишуегкйу Ргекк, Атек. Веаийейе, Р.К., В1утк, Ι.Ά. апй МШег, В.К. (1949) №\усак11е йкеаке йптишхайоп тейй йуе У1гик. Соте11 Vеΐ. 39: 302-334.

Воигкпей, М.Е.О., Огееп, Р.Р., 8аткоп,

А.С.К., СатрЬе11, РРА., Веи1ег, А., Ре!егк, К.№.,

МШаг, Ν.8., Еттегкоп, Р.Т. апй В1ппк, М.М.

(1990) А гесотЫпап! Го\\'1рох тйик ехргеккшд Не Ьетадд1ийшп-пеигат1шба8е депе оГ №\\'са811е бгаеаке тНга (МОУ) рго1ес1к сЫскепк адашк! сНа11епде Ьу МЭУ. Уйо1оду 178: 297-300.

Впйоп, Р., Сгееп, Р., КоНег, 8., Ма^бИ, К.Ь., Репхек, Ζ., СатападН, Ό. апб 8кшпег, М. (1996) Ехргеккюп оГ Ьас1епорНаде Т7 ВЫА ро1утегаке ш ат1ап апб таттайап се11к Ьу а гесотЬтап! Го\\'1рох у1гцк. I. Сеп. Уйо1. 77: 963-967.

Са1а1п, Р. апб Воих, Ь. (1993) ТНе ги1е оГ к1х, а Ьак1с Геа1иге Гог еГПс1еп1 герйсайоп о£ 8епба1 νίι-ик беГесбте 1п1егГег1пд Κ.ΝΛ. I. Уйо1. 67: 4822-4830.

СНатЬегк, Р., МШаг, Ν.8., ВшдНат, В.^. апб Еттегкоп, Р.Т. (1986) Мо1еси1аг с1ошпд о Г сотр1етеп!агу ЭМА !о №\\'сак11е б1кеаке т1гик апб пис1еойбе кециепсе апа1ук1к о Г Не щпсйоп Ьейусеп Не депек епсобтд Не Наетадд1иНшппеигат1шбаке апб Не 1агде рго1ет. I. Сеп. Уйо1. 67: 475-486.

СНапд, А.С.У. апб СоНеп, 8.Ν. (1978) Сопкйисбоп апб сНагас1епха1юп оГ атрНйаЫе ти1йсору ПЫА с1ошпд те1ис1ек бептеб Ггот Не Р15А сгурйс Ш1шр1акт1б. I. Вас1епо1. 134: 1141-1156.

СНо. В.В. (1982) СуЮрабис еГГес1к апб Госик Гогтайоп Ьу гейси1оепбоНе11ок1к тйпкек т а циай йЬгоЫак! се11 1ше. Ат1ап Э|кеакек 27: 261.

СоШпк, Р.Г, Нб, М.С., Сатагдо, Е., СгокГе1б, Н., СНапоск, В.М. апб МигрНу, В.В. (1995) Ргобисйоп о Г шГесйоик Нитап гекрйаЮгу купсуйа1 т!гпк Гот с1опеб сОЫА сопйгтк ап еккепйа1 го1е Гог йапкспрйоп е1опдайоп Гас!ог Ггот Не 5' ргох1та1 ореп геабшд Ггате о Г Не М2 шВЫА ш депе ехргеккюп апб ргогабек а сараЬбйу Гог тассте бетекртепУ Ргос. №111. Асаб. 8б. И8А 92: 11563-11567.

Соп/екпапп, К.-К. (1996) Сепейс ташри1айоп о Г поп-кедтепкб педайте-кЦапб ВИА νίгикек. I. Сеп. Уйо1. 77: 381-389.

Со^еп, В.8. апб Вгаипе, М.О. (1988) ТНе ргорадайоп о Г агаап тйикек т а сопйпиоик се11 Нпе (ОТ35) о Г крапеке циаб опдш. Ат1ап Э1кеакек 32: 282-297.

Эепд, В., \Уапд, Ζ., Мйга, А.М. апб Ипо, В.М. (1995) Ьосай/айоп оГ а ботат оп Не рагатухотйик айасНтеН рго1ет гес.|шгеб Гог Не рготойоп оГ се11и1аг Гикюп Ьу йк Ното1одоик Гикюп ргокт кр1ке. Уйо1оду 209: 457-496.

Эоу1е, Т.М. (1927) А НйНейо ипгесогбеб б1кеаке о Г Го\г1к бие 1о а ййег-ракктд тйпк. I. Сотр. РаИо1. ТНег. 40: 144-169.

Сагсш, Ό., Ре1е1, Т., Са1аш, Р., Воих, Ь., Сиггап, I. апб Ко1акоГкку, Ό. (1995) А ЫдН1у гесотЬтодешс кук1ет Гог Не гесотегу оГ тГесбоик 8епба1 рагатухотйик Гот сПЫА: депегайоп оГ а поте1 сору-Ьаск поп-беГесбте НиегГеппд тйпк. ЕМВО I. 14: 6087-6094.

Сайеп, Вегк, Ыада1, Υ., Вой, В. апб

К1епк, Н.-Э. (1980) Ми1айопа1 сНапдек о Г Не ргсИеаке кисерйЬбйу оГ д1усоргокш Е оГ Ыетеак!1е б1кеаке т1гпк: ЕГГес1к оп раИодешсйу. I. Сеп. У1то1. 50; 135-147.

Со1бНай, Т.М. (1980) Нга1опса1 пой оп Не опдт о Г Не Ьа8о1а к1га1 п оГ №теак!1е б1кеаке Т1гик. Ат1ап Э1к. 24: 297-301.

СоидН, В.Е. апб А1ехапбег, Ό-Ι (1973) ТНе крееб оГ гек1к1апсе !о сНа11епде шбисеб т сЫскепк тасста1еб Ьу б1ГГегеп1 гои!ек \\ЙН а В1 к1га1п о Г Йте ΝΟν. Уе!. Вес. 92: 563-564.

Напкоп, В.Р. (1988) Не1егодепейу \\ЙНН1 кйатк оГ Ме^сакбе б1кеаке т1гпк: кеу 1о кигтйак Η Ό.Ι А1ехапбег (еб.), №теакЙе О1кеаке, рр. 113-130. К1и\уег Асабетк РиЬ1., Вок!оп.

Найу, В.К апб Ра1еке, Р. (1995) МНайопк \\ЙНН1 попсобшд 1еппта1 кециепсек оГ тобе1 ВЫА'к о Г 8епба1 уйцк: ИЙиепсе оп геройег депе ехргеккюп. I. Уйо1. 69: 5128-5131.

Нескей, В.А., Яка, I., Соок, 8., МсМШеп, I. апб 8сН^аг1х, В.Э. (1996) Опке! оГ рго1ес11те НитипНу ш сЫскк айег хасстабоп νίΗ а гесотЬтап1 Негректйпк оГ (пгкеук гассте ехргеккшд №теак11е б1кеаке νίι-ик Гикюп апб Нетадд1ийпайшп-пеигатйибаке апйдепк. Атап Э1к. 40: 770777.

НеиксНе1е, ^.Р. апб Еакйгбау, В.С. (1970) Ьоса1 пптппйу апб регк1к1епсе оГ νίι-ик т Не 1гасНеак оГ сЫскепк Го11о\\й1д 1пГесйоп \\ЙН №\\сакбе б1кеаке уйцк. II. Iшшиηοйиοгеκсеηΐ апб Ык1ораИо1одюа1 кНб1ек. I. НГ. О1к. 121: 497-504.

Нйсйпег, 8.В. апб ННпкоп, Е.Р. (1948) А νίгик оГ 1о\г т1ги1епсе Гог тппига/тд Го\\'1к адатк! №теакЙе б1кеаке (ат1ап рпеитоепсерНаНик). Ус1. Меб. 43: 525-530.

Но£Гтап, М.А. апб Вапедее, А.К. (1997) Ап 1пГесйоик с1опе оГ Нитап рагатПиепха νίι-ик 1уре

3. I. νΐΐΌ1. 71: 4272-4277.

НоГкгаб, М.8. (1953) Iшшиη^ζаί^οη оГ сЫскепк адатк! петеакЙе б1кеаке Ьу ГогтаНпНасйта1еб тассте. Ат. ί. Ус! Век. 14: 586-589.

КЫНага, Υ., апб Кигока^а, Υ. (1993) Сопкйисбоп оГ пе\у Т тес1огк Гог б1гес! с1ошпд оГ РСВ ргобисН Сепе 130: 153-154.

Шиба, Ν., Тайа, Н., Отага, Т., М^ζитοΐο, К., Найоп, 8., Какаки К. апб Ка^акйа, М. (1986) 8ес.|иепсе о Г 2617 пис1еоибек Ггот !Не 3' епб оГ №теакйе б1кеаке νίι-ик депоте ВЫА апб Не ргебю1еб атто ас1б кециепсе оГ Не νίπ·ι1 № рго1еш. Ыиск Ас1бк Век. 14: 6551-6564.

Ка1е1а, Е.Е. апб Ва1баиГ, С. (1988) №\усак!1е Эгасаке ш Ггее-11т1пд апб ре! ЬНбк. И Ώ.1 А1ехапбег (еб.), Метесакбе Огаеаке, рр. 197-246. К1и\\'ег Асабетте РиЬ1., Вок1оп.

Кап!, А., КосН, С., тап Вοοζе1аа^, Ώ.Ι, Ва1к, Е. апб Сег Ниигпе, А. (1997) 01ГГегеп(1а(1оп оГ тН11еп1 апб поп-тН11еп1 к1га1пк оГ №^сакЙе б1кеаке νίι-ик \\йНт 24 Ноигк Ьу ро1утегаке сНаш геасбоп. Ат1ап РаИо1. 26: 837-849.

Ко1акоГкку, Ό., Ре1е!, Т., Сагст, Ό., Наиктапп, 8., Сиггап, ί. апб Воих, Ь. (1998) Рагатухот-йик ВЫА куШНекга апб Не гес.|шге1пеп1 Гог

Нехатег депоте 1епдИ: !Не ги1е оГ к1х гет1кйеб. ί.

У1го1. 72: 891-899.

КюпсусМ, Е.С. (1926) А рои1Чгу бЧзеазе ίη Не ЭШск ЕазЧ Ι пбЧез. Меб. 1п61ьсН В1. О|егдепеезк. 38: 448-450.

ЬатЬ, К.А. апб Ео1акоГзку, Ό. (1996) Рагатухоушбае: Не у1гпзсз апб Нс1г герксакоп, ίη: Е^батс^^ У1го1о§у (ЕЧе1бз е1 а1., ебз), Скар1ег 20, р577-604, ЫрЧисоЧЧ-Катеп РиЬкзкегз, РкЧ1абе1ркЧа.

Ьаузоп, Ν.Ό., 8ЧШтаи, Е.А., УкЧЧЧ, М.А. апб Козе, ΙΚ. (1995) КесотЬтагИ уе81си1аг зЧотаН15 νίπ.15 Ггот ΩΝΛ. Ргос. ИаИ. Асаб. 8ск И8А 92: 4411-4481.

Ьопд, Ь., РогЧеЧе11е, Ό, Окузбае1, 1., Ооп/е, М., Виту, А. апб Меи1етапз, О. (1986) Мопос1опа1 аиЧЧЬобЧез Ю каетадд1иЧЧпЧп-пеигатЧпЧбазе апб Гизюп д1усоргоЧеЧпз оГ №\усаз11е бЧзеазе νίгиз: ге1аЧЧоп8кЧр ЬеЧуееп д1усозу1аЧЧоп апб геасЧМЧу. 1. У1то1. 57: 1198-1202.

Мабапзку, С.Н. апб ВгаЧЧ, М.А. (1978) ЫопсуЮрабпс тиЧапЧз оГ №\усаз11е бЧзеазе уйпз. к νίϊΌ1. 26: 724-729.

Мабапзку, С.Н. апб ВгаЧЧ, М.А. (1981а) Ыопсу1ора1Ыс тиЧаиЧз оГ №\усаз11е бЧзеазе у1П1з аге беГесШ'с ίη у1гпз-зрсс|Пс КИА зупЧкезЧз. к νίϊΌ1. 37: 317-327.

Мабапзку, С.Н. апб ВгаЧЧ, М.А. (1981Ь) Ке1аЧЧопзкЧрз атопд νίπΐδ зргеаб, суЧораЧкодешску, апб \т11епсе аз ге\'еа1еб Ьу Не попсуЧораЧкЧс тиЧапЧз о Г №\усаз11е бЧзеазе уйпз. к УЧго1. 40: 691-702.

Меи1етаиз, О., Ооп/е, М., Сагкег, М.С., РеЧЧЧ, Р., Виту, А. апб Ьопд, Ь. (1986) РгоЧссЧЧус еГГесЧв о Г НЫ апб Е д1усоргоЧеЧп-зресЧйс топос1опа1 аиЧЧЬобЧез оп ехрейтеп1а1 №\усаз11е бЧзеазе. АуЧ-п РаЧко1. 15: 761-768.

МШаг, Ν.8., СкатЬегз, Р. апб Еттегзоп, Р.Т. (1988) Мискокбе зес.|иепсе о Г 1ке Гизюп апб каетадд1икшп-пеигатЧшбазе депе оГ №\усаз11е бЧзеазе νίΓπδ, з1гат и1зЧег: Мо1еси1аг ЬазЧз Гог тапакопз ίη раЧкодешсЧЧу ЬеЧуееп з1гатз. к Оеп. νίϊΌ1. 69: 613-620.

Могдап, К.У., Ое1Ь 1г., 1., 8скгеигз, С.8., Ьийскеп, Ό., КозепЬегдег, Ч.К. апб 8опбегтег)ег, Р. (1992) РгсИескоп оГ скЧскепз Ггот №\усаз11е апб Магек'з бЧзеазез \\кк а гесотЬЧпаиЧ кегрезу'Чгиз оГ 1пгкеуз тассте ехргеззЧпд Чке №\усаз11е бЧзеазе тйиз Гизюп ргоЧеЧп. Όίδ. 36; 858870.

Могдап, К.У., Ое1Ь 1г., 1., Роре, С.К. апб 8опбегте1)ег, Р. (1993) ЕГПсасу ίη скЧскепз оГ а кегрезтйиз оГ Чигкеуз гесотЬЧпапЧ тассте сопЧаЧшпд Чке ГизЧоп депе оГ №\усаз11е бЧзеазе тйиз: опзеЧ оГ ргоЧесЧЧоп апб еГГесЧ оГ таЧегпа1 аиЧЧЬобЧез.

МозсоуЧсЧ, С., МозсоуЧсЧ, М.О., Чипсие/, Н., ЬаЧ, М.М., Наутапп, М.к апб Уо£Ч, Р.К. (1977) СопЧЧпиоиз ЧЧззие сикиге се11 1Чпез бептеб йот скетЧсайу Чпбисеб Читогз оГ Чарапезе диак. Се11 11: 95-103.

РаЧЧпаЧк, А.К., Ва11, Ь.А., ЬеОгопе, А.У. апб ХУеИх, ОЛУ. (1992) ШГескоиз беГесШ'е ЧпЧег

ГегЧпд рагЧЧс1ез оГ νδν йот ЧгапзсйрЧз оГ а сЭНА с1опе. Се11 69: 1011-1020.

Реор1ез, М.Е. (1988) №\усаз11е бЧзеазе уЧгцз герксаЧЧоп. Ιη Ό.4. А1ехапбег (еб.), №\усаз11е ЭЧзеазе, рр. 45-78. К1иуег АсабетЧс РиЬ1., ВозЧоп.

РееЧегз, В., Ν. бе УЧпб, М. НооЧзта, Е. Уадепааг, А. ОЧе1кепз, апб К. Моогтапп. (1992) РзеибогаЬЧез ткиз еп\'е1оре д1усоргоЧеЧпз др50 апб дП аге еззепЧЧа1 Гог тйиз репеЧгаЧЧоп, ЬиЧ оп1у дП Чз ттокеб ίη тетЬгапе ГизЧоп. к УЧго1. 66: 894-905.

Кабеске, Е., 8рЧе1коГег, Р., 8скиеЧбег, Н., Каекп, К., НиЬег, М., ОоЧзск, С, СкгЧзЧЧапзеп, О. апб ВШеЧег, М.А. (1995) Кезсие оГ теаз1ез тйиз Ггот с1опеб ϋΝ! ЕМВО к 14: 5773-5784.

КоЧЧ, К. апб К1епк, Н.-Э. (1988) Мо1еси1аг ЬазЧз оГ ЧиГесДуЧЧу апб раЧкодешсЧЧу оГ №\усаз11е бЧзеазе уЧгиз. Ιη Ό.4. А1ехаибег (еб.), №\усаз11е ПЧзеазе, рр. 98-112. К1иуег АсабетЧс РиЬ1., ВозЧоп.

Киззе11, Р.Н., ОгЧГйЧкз, Р.С., ОозуатЧ, К.К.А., А1ехапбег, Ό.4., Сапиоп, М.Ч. апб Киззе11, \У.С. (1983) Тке скагасЮпхакоп оГ топос1опа1 аиЧЧЬобЧез Чо №\усаз11е бЧзеазе уЧгиз. к Оеп. УЧго1. 64: 2069-2072.

8атЬгоок, к, Егкзск, Е.Е., аиб МапЧаЧЧз, Т. (1989) Мо1еси1аг с1ошпд, а 1аЬогаЧогу таииа1. Со1б 8ргЧпд НагЬог ЬаЬогаЧогЧез, Со1б 8ргЧпд НагЬог, ΝΥ.

8скиеЧбег, Н., 8рЧе1коГег, Р., Каекп, К., ОоЧзск, С., Кабеске, Е., 8иЧЧег, О. апб ВШеЧег, М.А. (1997) Кезсие оГ теаз1ез уЧгиз изЧпд а герксаЧЧоп-бейсЧепЧ уассшЧа-Т7 уесЧог. к УЧго1, теЧк. 64: 57-64.

8ские11, М.к, МеЬаЧзЧоп, Т. аиб Соп/сИнапт К.-К. (1994) [пГескоиз гаЬЧез уЧгизез Ггот с1опеб сОМА. ЕМВО к 13: 4195-4203.

8скиЧ/е, Н., Еп/тапп, Р.-к, Кисккпд, К., МипбЧ., Е., Метаит Н. апб МеЧЧеиЧеЧЧег, Т.С. (1995) Сотр1еЧе депо тис зедпепсе о£ Чке Пзк гкакбоукиз Чпкескоиз каетаЧороЧекс песгозЧз νίгиз. Ч. Оеп. УЧго1. 76: 2519-2527.

8тЧЧк, А.Ь., ТЧдпог, О.Н., Μ^Чиηе, К., аиб МоЧоказкЧ, Т. (1977) Чзо1аЧЧоп апб аззау о£ гаЬЧез зегодгоир уйпзсз Чп СЕК се11з. !п1ег^Чг1оду 8: 9299.

8ргабЬго\\\ Р.В. (1988) ОеодгаркЧса1 бЧзЧпЬиЧЧоп. Ιη Ό.Ε А1ехаибег (еб.), №усазбе ПЧзеазе, рр. 247-255. Ккпгег АсабетЧс РиЬ1., ВозЧоп.

8ЧаиЬег, Ν., В^ескЧЬЧ^кЧ, К., Вгискпег, Ь. аиб Ноктапп, М.А. (1995) ОеЧесЧЧоп о Г №усазбе бЧзеазе уйпз Чп рои1Чгу гасстез изЧпд Чке ро1утегазе скат геасЧЧоп аиб бЧгесЧ зес.|иепстд оГ атркйеб 1)\.У Упссшс 13: 360-364.

8Чеуагб, М., Мропб, кВ., МЧ11аг, Ν.8. апб

Еттегзоп, Р.Т. (1993) РКА ебЧЧЧпд Чп №усазЧ1е бЧзеазе уЧгоз. к Оеп. УЧго1. 74: 2539-2547.

Тау1ог, к, ЕбЬаиег, С., Кеу-8епе1опде, А.,

ВоидиеЧ, к, ХотЧоп, Е., ОоеЬе1, 8., ПезтеЧЧге, Р.

апб Рао1еЧЧЧ, Е. (1990) №усазЧ1е бЧзеазе уйпз ГизЧоп ргоЧеЧп ехргеззеб Чп а Го\\Чрох уйпз гесотЬЧ61 пап! сопГегк ргоксйоп ίη сйэскепк. 1. У1го1. 64: 1441-1450.

Текк1ег, О.С., Вгоиккеаи, К., апб Уегпе!, Т. (1986) Ыдакоп оГ кт§1е-к1гапйей оНдойеохупЬопис1ео!1йек Ьу Т4 КИА Йдаке. Апа1. Вюсйет. 158: 171-178.

У1е1га, 1., апй Мекктд, 1. (1991) №\ν рИСйепуей с1ошпд уескгк \\йй ййТегеп! ке1ес!аЬ1е тагкегк апй ЭкА герйсайоп опдтк. Сепе 100: 189-194.

Утйеуоде1, Н. апй Оисйа1е1, !Р. (1988) Рап/ооЕс №\\'сак11е йкеаке уник ш р1деопк. 1п Ό.Ι А1ехапйег (ей.), №\\'сак11е Океаке, рр. 184196. К1и\\'ег Асайетк РиЬ1., Вок!оп.

Айе1ап, 8.Р.1, Ва11, Ь.А., Вагг, апй Аей/, 6.Т.А. (1995) ЕГПс1еп1 гесоуегу оГ шГесйоик уек1си1аг к1отаШк У1гик епйге1у Ггот сЭкА с1опек. Ргос. №11. Асай. 8сЕ И8А 92: 8388-8392.

Аепкуоой, 6., Тегрк1га, С., Вопк1га, 1., В1оетгаай, М. апй Уап 2аапе, Ό. (1986) Ргойисйоп оГ топос1опа1 апйЬойкк ада1пк! к\\'те Геуег У1гик апй 1йе1г ике ш 1аЬога1огу Шадпокк. Уе1. МкгоЬю1. 12: 101-108.

УикоГГ, К., МШаг, N.8., СйатЬегк, Р., апй Еттегкоп, Р.Т. (1987) №с1еоййе кесщепсе апа1укк оГ 1йе Ь депе оГ №теак!1е йкеаке уйик: йото1одкк νίΐΗ 8епйа1 апй уекки1аг к!ота1йк у1гикек. №с1. Ас1йк Кек. 15: 3961-3976.

Таблица 1

3'υιτ	АССАААСАСАСААТСССТСАСТТА	1-24
Р368·*·	СТСАТСАССААССАТСТТСС	368-387
Р800+	СТССССАТСТТСТТССТТАС	800-819
Р1201+	САСАСТТССАСТАСАСТАСС	1201-1220
Р1279+	АССАССААТСААСССССТСС	1279-1298
Р1356+	АААТСССАСТССТСАСТ6СС	1356-1375
Р1683+	СТСТАТАТСАССАСАСССТС	1664-1683
РНТ1	сааасааттсасааааАастассс СТАСААС	1785-1814
Р2357+	ССАААСАСТСАССАААС^АСС	2358-2377
Р2599+	ТААСТАААСТТОАСТАТСАБ	2599-2618
Р2852+	СССАСТТААТАААСТТТССС	2852-2871
Р3496+	СААТСААСААСССАСТСТСС	3496-3515
Р3587+	СССАСАТСТТСТТСАСТТСС	3589-3608
Р4267+	САТТАТССААССАСОТАССС	4270-4299
ΝΏν5-Κ	АСССССТАСССАТТСТССАТСССС СТТСС	4498-4526
Р4731+(ЪЗ)	ААССТССТССССААТСТССС	4733-4752
Р4958+	АССТСТСАТАСААСССАААС	4960-4979
Р5266+(ЪЗ)	СТССТСССААТАТССАТТАС	5267-5286
Р5591+(ЪЗ)	АСТААСОТТСССТАТСТССС	5593-5612
Р5616+	СТАТТТАТТССТССТТСАСС	5616-5635
Р6000	ААТАСССТТСАТСАСАТСАСАССС	6166-6190
Νϋνδ-ΗΝ	СТАСССТАССААСАСАСССССССС СТСААТ	6325-6354
Р6693+(Ъ)	САТТСТТАААААСТСАСАСС	6695-6714
Р7110+(Ъ)	АТСССААСТСТТССАСТ6ТС	7112-7131
Р7501+(Ъ)	ТССТСССАААСССАТССАСС	7503-7522
Р7900+(ЪЗ)	ААЕАСТТААТССТАСйктС	7902-7921
Р8590+	ААСТСССААССССАСТАСАС	8592-8611
Ъ9000	ТТТСТСАСТССТСААС^ТСТСАТТ	9008-9031
Р9359+	СААТСАТАТАССАСААТССС	9361-9380
Р9371+	ССАСААТСССТСАСТСАТСС	9371-9411
Р9390+	АТАСС ТАСТ СТАТ Т С Т С ТСС	9392-9411
Р9686+	ТСАСАССАТАТСАТСТТСА6	9686-9705
Р9799+	САСАСССТААССАТААТТСС	9801-9820
Р10198+	АТААСАААССТАТСАСТСАС	10200-10219
Р10601+	ТТСТССССТТСССТСТАТСС	10603-10622
Р11006+	ССАСАСАТАСТТТСАСТСТС	11008-11027
Р11393+	ТСССТТАТТСТСТССАСТСС	11395-11414
Ρ1179Θ+	ТСАТАССАТАСААСТССТАС	11800-11819
Ъ12000	САТАТСТССССАСАТСТСААСССТ	12008-12031
Р12373+	СААС САССАСАТ АТ САТ САС	12375-12394
Р12796+	ТССАСТСТТСТТАССААСТС	12798-12817
Р12978+	САСАССААСТТССАСАТАСС	12978-12997
Р13236+	САСТАТСТАСТСТСССАТСС	13238-13257

Способ I

Способ II

Р13601+	АТАСТТСТТСАСАССААТАС	13603-13622
Р13943+	САССТСАССТСАСАТАААСС	13946-13965
Р14002+	ТАТСАТТССТССАТТСТСАС	14004-14023
Р360	ССССАТСТААТСАСССТАСТССТТ	14756-14779
Р14812+	АСТААССАСАТАСТТСААСС	14812-14831
Р230-	СССССАСТТСТАСТТТТААС	230-211
Р998-	ТТТССАТАТССССТСАСАСС	998-979
Р1898-	АААССТССССАТСТТТСТСС	1898-1879
Р2617-	Т САТАС Т СААС Т Т Т АС Т ТАС	2617-2598
Р3328-	ССАеЛАТСАЛАСТАСАЙССС	3330-3311
Р3610-	СТТСССААСТСААСААСАТС	3612-3593
Р3990-	САТТАССАТАСТАТССАСТС	3992-3973
ЫЪУЗ-М	ТСТСССССССССАССТТАТТТСТТ ААААССАТ	4400-4368
Р4593-	САСАСАТССААСТСАСТАСС	4625-4606
Р4618-(ЪЗ)	АТССААСТСАСТАССАСССС	4620-4601
Р5390-	СТАСАСТТАССТСТАТАССС	5411-5392
ЫЪУЗ-Г	АСТАССССССАААССТТССТТССТ САТ	6238-6212
Р6710-(ЪЗ)	ТСТСАСТТТТТААСААТССС	6712-6693
Р7093-(ЪЗ)	СТТСАТССААСССАСАСТАС	7095-7076
Р7522-(ЪЗ)	СТССТССАТСССТТТСССАС	7524-7505
Р367	АСССАССТСААТАСТАСССАСТТС	8692-8666
Р9905-	СТСТАТСААСАССССАТТАС	9907-9888
Р10320-	ТААСАС АСТАСТ Т Т Т ССАСС	10322-10303
Р10684-	САТ ССААСТ СТС Т СААСАСС	10687-10706
Р11122-	ААТТССССАССАСГСАСААС	11124-11105
Р11510-	ТСССТССАТСАТАССАТССС	11512-11493
Р11903-	АТТССТТССААСАТССААСС	11905-11886
Р12717-	ТСТСАТАСАСТАТТАТСССС	12719-12700
Р13141	С АААСАСТ АС С С Т СТАС АСАС АСС АТААСС	13172-13143
Р13281-	САСАТСАТАСАССТСАССТС	13302-13283
Р14101-	АСССААТССАТСССААТСАС	14163-14144
Р14522-	ССТСАССАААСТСТСТССАС	14524-14505
Р14687-	АССАТСТСТСТССТССАСТС	14709-14690
Р377	ТТТССТТААСТТТССТАДТАССТА ССАС	14888-14861
Р359	САССААСТССАСААТТ66ССАСАА ААССАС	15046-15017
5ΝΏΥ	АССАААСАААСАТТТССТСААТСА ССА	15186-15159

Таблица 2 Последовательность 3'- и 5'-концевых участков генома кЭУ штамма Ьа8о!а

А. Последовательность 3'-концевого участка (показана как 5'-концевой участок антигеномной цепи ДНК)

Клон Последовательность

АССАААСАСАСААТС

АССАААСАСАСААТС

АССАААСАСАСААТС

АССАААСАСАСААТС

Клон

Консенсусная

Последовательность

АССАААСАСАСААТС АССАААСАСАСААТС АССАААСАСАСААТС

СССАААСАСАСААТС

АССАААСАСАСААТС АССАААСАСАСААТС АССАААСАСАСААТС

В. Последовательность 5'-концевого участка (показана как ДНК)

Клоны рВ1иезсг1рС11-ТЗК Клон

Г3101-13

Г3101-14

Г3101-15

Г2601-17

Г2601-18

Г2601-19

Г2601-20

Г26О1-21

Последовательность

АС САААСАААСАТТ Т

АССАААСАААСАТТТ

АС САААСАААСАТ Т Т

АС С АААСАААСАТ Т Т

АССАААСАААСАТТ Т

АССАААСАААСАТТТ

ААСААССТСААСАТА

АССАААСАААСАТТТ

Клоны ρΟΕΜ4Ζ

Клон

Г3101-16

Последовательность

АССАААСАААСАТТТ

Таблица 5 Активность 8ЕАР (имп/с) после котрансфекции клеток СЕВ плазмидами серии рОЬТУ553 и плазмидами рСШеоЫР, рСШеоР и рСШеоЦс) (или рС'Чнео в качестве негативного контроля)

Плазмида	ΝΡ, Ρ и Ь	ΝΡ, Ρ и рСТпео	отношение
ρΟΣΤν553ΝΟ	3,1 χ 10*	2,7 χ 103	11,7
ρΟΙ>Τν5 53Ν1	4,1	5,2	7, 9
ρΟΙ,Τν553Ν2	3,1	3,1	10,0
ρΟΠΤν553Ν3	35,9	3, 6	100, 8
ρΟΙιΤν5 53Ν4	1, 9	4,6	4,1
ρΟΣΤν553Ν5	1,0	4, 1	2, 5

Г3101-17

Г3101-18

Г3101-19

Г3101-22

АС САААСАААСАТТ Т АС САААСАААСАТ Т Т АС САААСАААСАТ Т Т АССАААСАААСАТ Т Т

Консенсусная

АС САААСАААСАТ Т Т

Таблица 3 Репликация минигенома с участием вируса-помощника ΝΏν

А. Активность 8ЕАР (имп/с) после трансфекции клеток СЕВ-С9 плазмидами серий рОЬТУ535 и рОЬТУ553

Плазмида	+ΝΏΫ	-ΝΏν	отношение
ρΟΠΤν535Ν0	3,5 χ 10‘	7,1 χ 10*	0,49
ρΟίΤν535Ν1	5, 9	12, 1	0,49
ρΟΏΤν535Ν2	2,4	6, 2	0, 39
ρΟΏΤν535Ν3	7, 6	5,2	1,46
ρΟΣΤν535Ν4	1/ 8	4, 1	0,44
ρΟΏΤν535Ν5	1,5	3, 0	0, 50
ρΟΠΤν553ΝΟ	5,5 χ 10’	9,6 X 10’	0, 57
ρΟΣΤν553Ν1	9, 6	27,6	0, 35
ρΟΠΤν553Ν2	2,4	3,5	0, 68
ρΟΏΤν553Ν3	15,1	9,5	1,59
ρΟΤΤν553Ν4	3, 4	7,9	0,43
ρΟΤΤν553Ν5	2, 9	4, 8	0, 60

В. Активность 8ЕАР (имп/с) после трансфекции клеток СЕВ, инфицированных БРУ-Т7, плазмидами серии рОЬТВУ553

Плазмида	+ΝΏν	-ΝΏν	отношение
ρΟΏΤν553ΝΟ	7,2 X 10*	8,3 χ 104	0,86
ρΟΏΤν553Ν1	8,4	12, 0	0, 70
ρΟΏΤν553Ν2	8,9	12, 6	0, 71
ρΟΏΤν553Ν3	27,4	8, 6	3, 19
ρΟΏΤν553Ν4	9,7	10,4	0, 93
ρΟΏΤΥ553Ν5	8,5	8,1	1,05

Таблица 4 Перенос активности 8ЕАР (имп/с) после обработки клеток СЕВ надосадочной фракцией от клеток СЕВ, инфицированных БРУ-Т7, которые были трансфицированы плазмидами серии рОЬТУ553 и которые были дополнительно инфицированы вирусом ΝΏν (см. табл. 3)

Плазмида

РОЬТУ553Ы0 2,4х10³

РОЬТУ553Ы16,2

РОЬТУ553Ы22,0

РОЬТУ553Ы320,6

РОЬТУ553Ы42,0

РОЬТУ553Ы52,1

Claims (33)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. кДНК парамиксовируса птиц, содержащая, по меньшей мере, последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую 5'концевому участку генома парамиксовируса птиц, позволяющая получать инфекционную копию парамиксовируса птиц.
2. 2. Полноразмерная кДНК парамиксовируса птиц, содержащая, по меньшей мере, последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую 5'-концевому участку генома парамиксовируса птиц, позволяющая получать инфекционную копию парамиксовируса птиц.
3. 3. кДНК, содержащая, по меньшей мере, последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую 5'-концевому участку генома парамиксовируса птиц, позволяющая получать реплицирующийся минигеном парамиксовируса птиц.
4. 4. кДНК по любому из пп.1-3, по меньшей мере частично происходящая от вируса ньюкаслской болезни.
5. 5. кДНК по п.4, где указанный вирус ньюкаслской болезни является лентогенным вирусом, предпочтительно производным от вакцинного штамма.
6. 6. кДНК по п.5, где указанным вакцинным штаммом является штамм Ьа8о1а, АТСС УВ699.
7. 7. кДНК по любому из пп.1-6, дополнительно содержащая модификацию нуклеиновой кислоты указанной кДНК.
8. 8. кДНК по п.7, где указанная модифицированная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий модифицированный сайт расщепления протеазой.
9. 9. кДНК по п.8, где указанным сайтом расщепления протеазой является сайт расщепления протеазой слитого (Б) белка.
10. 10. кДНК по п.7, где указанная модифицированная нуклеиновая кислота кодирует гибридный вирусный белок.
11. 11. кДНК по п.10, где указанным гибридным вирусным белком является белок гемагглютинин-нейраминидаза (ΗΝ).
12. 12. кДНК по п.7, где указанная модификация включает в себя делецию нуклеиновой кислоты, кодирующей вирусный белок.
13. 13. кДНК по п.12, где указанным вирусным белком является матриксный (М) белок.
14. 14. кДНК по любому из пп.1-13, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичный антиген.
15. 15. кДНК по п.14, где указанный антиген является производным от патогена домашних птиц.
16. 16. кДНК по п.14 или 15, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуностимуляторный белок или его часть.
17. 17. РНК, полученная с помощью кДНК по любому из пп.1-16.
18. 18. Способ получения белка с помощью реплицирующегося минигенома парамиксовируса птиц, предусматривающий трансфекцию по меньшей мере одной клетки кДНК по п.3.
19. 19. Способ получения инфекционной копии парамиксовируса птиц, предусматривающий трансфекцию по меньшей мере одной клетки кДНК по любому из пп.1, 2 и 4-16.
20. 20. Способ по п.19, где указанная клетка, по меньшей мере, способна экспрессировать вирусный нуклеокапсидный белок (№), фосфопротеин (Р) или крупный полимеразный белок (Ъ).
21. 21. Способ по п.19 или 20, дополнительно допускающий расщепление белка-предшественника Го указанного вируса.
22. 22. Способ по любому из пп.18-21, дополнительно предусматривающий инкубацию указанной клетки в питательной среде, обладающей протеолитической активностью.
23. 23. Способ по п.22, где указанная питательная среда содержит аллантоисную жидкость, обладающую указанной протеолитической активностью.
24. 24. Способ по любому из пп.18-23, где указанная клетка является производной от клетки курицы.
25. 25. Инфекционная копия парамиксовируса птиц, полученная способом по любому из пп.1923.
26. 26. Вакцина против инфекционных заболеваний и/или злокачественных опухолей, содержащая инфекционную копию парамиксовируса птиц по п.25.
27. 27. Вакцина по п.26, отличающаяся тем, что представляет собой живую вакцину.
28. 28. Вакцина по п.26 или 27, где указанная инфекционная копия парамиксовируса птиц, по меньшей мере частично, происходит от вируса ньюкаслской болезни (ΝΏν).
29. 29. Животное, вакцинированное вакциной по любому из пп. 26-28.
30. 30. Способ определения того, инфицировано ли животное по п.29 штаммом ΝΏν дикого типа или немодифицированным мезогенным или лентогенным штаммом ΝΏν, предусматривающий определение в образце от указанного животного присутствия антител, специфичных в отношении иммунодоминантного эпитопа штамма ΝΏν дикого типа или немодифицированного мезогенного или лентогенного штамма ΝΏν, причем эпитоп не содержится в используемой вакцине.
31. 31. Способ по п.30, где указанные антитела специфичны в отношении белка ΗΝ или Г ΝΏν.
32. 32. Способ по п.30 или 31, где указанное животное выбрано из группы, состоящей из домашней птицы, предпочтительно кур.
33. 33. Применение диагностического набора в способе по любому из пп.30-32, причем указанный набор содержит ΝΏν-специфичный иммунодоминантный эпитоп дикого типа, а указанный эпитоп не содержится в указанной ΝΏνвакцине по любому из пп.26-28, причем указанный набор дополнительно содержит средство для определения наличия антитела, связывающегося с указанным эпитопом.