ES2239336T3 - Cdna correspondiente al antigenoma de virus rna de cadena negativa no segmentada, y proceso para la produccion de tales virus codificantes de proteinas antigenicamente activas adicionales. - Google Patents
Cdna correspondiente al antigenoma de virus rna de cadena negativa no segmentada, y proceso para la produccion de tales virus codificantes de proteinas antigenicamente activas adicionales.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A UNA METODOLOGIA PARA LA GENERACION DE VIRUS DE RNA DE CADENA NEGATIVA NO SEGMENTADOS (PRINGLE, 1991) A PARTIR DE ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO CLONADO (CDNA). TALES VIRUS RESCATADOS SON UTILES PARA SU USO COMO VACUNAS, O ALTERNATIVAMENTE COMO PLASMIDOS EN APLICACIONES DE TERAPIA GENICA SOMATICA. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A MOLECULAS DE CDNA ADECUADAS COMO HERRAMIENTAS EN ESTA METODOLOGIA Y A LINEAS DE CELULAS HELPER QUE PERMITEN EL RESCATE DIRECTO DE DICHOS VIRUS. SE UTILIZA EL VIRUS DEL SARAMPION (MEASLES VIRUS, MV) COMO MODELO PARA OTROS REPRESENTANTES DE LOS MONONEGAVIRALES, EN PARTICULAR LA FAMILIA PARAMYXOVIRIDAE.
Description
cDNA correspondiente al antigenoma de virus RNA
de cadena negativa no segmentada, y proceso para la producción de
tales virus codificantes de proteínas antigénicamente activas
adicionales.
La presente invención se relaciona, en general,
con una metodología para la generación de virus de RNA no segmentado
de cadena negativa (Pringle, 1991) a partir de ácido
desoxiribonucleico clonado (cDNA). Estos virus rescatados son
apropiados para su uso como vacunas, o alternativamente, como
vectores para las aplicaciones de la terapia génica somática. El
virus del sarampión (MV) se usa como modelo para otros virus
representativos de los Mononegavirales, en particular la
familia de los Paramyxoviridae.
La invención proporciona la tecnología para la
construcción de cepas recombinantes de vacunas, en particular para
cepas de vacuna MV que contengan regiones codificantes para la
expresión de epítopos o la proteína entera de otros virus,
bacterias, o parásitos. También demuestra que las cepas MV
quiméricas que contienen proteínas heterólogas en el envoltorio
pueden ser construidas de forma apropiada para ser dirigidas contra
células que no contengan ningún receptor para MV. De esta manera, en
principio, pueden ser construidos plásmidos basados en el genoma de
MV, empaquetados en envueltas que contengan proteínas para que sean
dirigidos contra tipos celulares especiales, codificando productos
génicos ausentes en individuos genéticamente defectivos o tóxicos
para ser dirigidos contra células malignas.
Por medio de la sencilla sustitución de las
líneas celulares ayudantes MV específicas descritas en esta
invención por líneas celulares que expresen proteínas comunes
codificadas por otros representantes de los Mononegavirales
para ser recuperadas, cualquier otro miembro de este Orden viral que
se replique en células de vertebrado puede ser utilizado como vacuna
viva o como vector para la terapia génica en lugar de MV.
MV es un miembro de la familia
Paramyxoviridae. Su información genética se codifica en un
RNA de cadena simple de polaridad negativa, comprendiendo 15894
nucleótidos. El genoma se transcribe de forma secuencial desde el
extremo 3' para dar lugar, además de un RNA leader, 6
especies principales de ácidos ribonucléicos (RNA) mensajeros
poliadenilados encapuchados, cada uno de los cuales codificando una
proteína mayor. El mapa genómico se muestra en la Figura 1, se
indican los genes especificando los productos principales N
(proteína de nucleocápside), P (fosfoproteína), M (proteína de
matriz), F (proteína de fusión), H (hemaglutinina) y L (proteína
grande = polimerasa). Varios RNA adicionales así como especies
proteicas, en parte mencionadas en la tabla de la Fig. 1 complican
esta simple representación, aunque no son relevantes aquí.
MV es la principal causa de enfermedad febril en
bebés y niños de corta edad. De acuerdo con estimaciones de la
Organización Mundial de la Salud (WHO), un millón de niños de corta
edad mueren cada año a causa del sarampión. Este elevado número de
muertes surge especialmente en países en desarrollo, aunque en los
años recientes también en países industrializados como EE.UU. han
sido afectados de nuevo por las epidemias de sarampión,
principalmente a causa de la adherencia incompleta a los programas
de inmunización (Clements y Cutts, 1995). Actualmente, se utilizan
varias cepas de vacunas vivas atenuadas de MV (incluyendo las cepas
Schwarz, Moraten y Edmonston-Zagreb), casi todas
ellas se derivan de la cepa original Edmonston (Enders y Peebles,
1954) por cultivo repetido en células no humanas (Enders, 1962).
Para una discusión reciente sobre las vacunas de MV incluyendo las
tendencias futuras ver Norrby (1995). La vacuna del sarampión se
administra normalmente a la edad de 15 meses o, en los países en
desarrollo, a los 6 meses, y se ha demostrado que es elevadamente
efectiva, proporcionando normalmente una inmunidad para toda la vida
contra la reinfección de MV obtenida de la morbilidad. Hasta la
fecha, las alteraciones genéticas responsables de la atenuación de
estas cepas de vacuna permanecen desconocidas. La comprobada
seguridad de la vacuna del sarampión, combinada con su elevada y
larga eficiencia, la predestina como un plásmido ideal para la
expresión de genes heterólogos. Esta vacuna puede ser probada
respecto a su eficiencia para proporcionar protección inmune contra
otros agentes patógenos así como contra el mismo virus vector. Otro
posible candidato a ser vector de vacunación es el virus de las
paperas, un familiar lejano del MV, el cual es también muy eficaz y
seguro como vacuna viva atenuada.
El estudio del ciclo de replicación de un número
de virus de RNA ha sido facilitado en gran medida por la
disponibilidad de clones de DNA a partir de los cuales estos virus
infecciosos pueden ser rescatados, así permitiendo la aplicación de
la genética reversa. Inicialmente, los bacteriófagos Q\beta
(Taniguchi et al., 1978) y el virus de la polio (Racaniello y
Baltimore, 1981), y posteriormente el virus Sindbis (Rice et
al., 1987) se expresaron a partir de cDNA clonado. Hasta la
fecha, una gran variedad de virus de RNA de cadena positiva, que
principalmente infectan plantas y vertebrados, pueden ser rescatados
a partir del ADN clonado (para una revisión reciente ver Boyer y
Haenni, 1994). Además, el DNA proviral de los retrovirus es
infeccioso. Sin embargo, los intentos para obtener virus infecciosos
a partir de clones de cDNA de virus de RNA de cadena negativa se
han encontrado con grandes dificultades. Esto se debe a dos
propiedades de estos virus (i) ni los RNAs genómicos ni los
antigenómicos son infecciosos, dado que no pueden servir como mRNA;
y (ii) tanto la trascripción como la replicación requieren
ribonucleocápsides, p.ej., los complejos de nucleoproteínas del tipo
vara (RNPs), que contienen el RNA genómico y varias proteínas con
función estructural y/o enzimática.
El rescate a partir de DNA clonado se ha
conseguido hace varios años en el caso del virus de la gripe, un
virus de RNA de cadena negativa que contiene ocho segmentos
genómicos. Sus RNPs que son de tamaño pequeño y poco estructurados
como se reveló por la susceptibilidad del RNA que los compone a la
RNasa, puede ser ensamblado in vitro de a partir de RNA y las
proteínas virales requeridas, y los componentes N y polimerasa.
Inicialmente, se ha utilizado un RNA artificial para transportar
como reportadora la secuencia codificante de la cloranfenicol acetil
transferasa (CAT) embebida en los segmentos terminales no
codificantes de una subunidad del genoma del virus de la gripe
(Luytjes et al., 1989). Más tarde, se usaron subunidades
simples de RNAs genómicos auténticos o alterados transcritas in
vitro a partir de DNA clonado (Enami y Palese, 1991). Los RNPs
ensamblados replicados y transcritos por transfección en células
infectadas por virus de la gripe, como se monitorizó por producción
de CAT y por rescate de virus de la gripe variados, respectivamente.
La purificación de virus que contengan la subunidad introducida a
partir del gran exceso de virus no variados en algunos casos se
puede conseguir por medio de selección, por ejemplo, utilizando un
anticuerpo neutralizante específico dirigido contra la proteína
codificada por la subunidad común del virus ayudante.
En contraste, para los virus con genoma de RNA no
segmentado de cadena negativa, agrupados conjuntamente en el orden
Mononegavirales (Pringle, 1991) con RNPs más largos y mucho
más gruesamente estructurados, conteniendo además de proteína N, la
fosfoproteína cofactor para el ensamblaje y la polimerasa (P) y la
RNA polimerasa viral (proteína grande, L) han resultado refractarios
a la reasociación funcional in vitro. Por tanto, muchos
laboratorios han abordado el rescate de Mononegavirales
representativos empezando a partir de RNAs subgenómicos que
contengan solamente las secciones esenciales de los genomas virales,
utilizando virus para proporcionar las proteínas adyuvantes que se
requieren en la encapsidación intracelular y la replicación de estos
mini-replicones. En primer lugar, se usaron RNAs
subgenómicos surgidos de forma natural, que compiten con la
replicación viral y por lo tanto se conocen como RNAs partícula
interferidores defectivos (DI) (Re, 1991), siendo sustituidos
posteriormente por RNAs DI artificiales que contienen genes
reportadores, transcritos a partir de plásmidos construidos de forma
adecuada. Estos mini-replicones, primeramente
concebidos por el grupo de M. Krystal (Park et al., 1991) de
acuerdo con el replicón utilizado para el modelo inicial de rescate
para el virus de la gripe (Luytjes et al., 1989), llevan una
secuencia codificante para CAT insertada en las regiones terminales
no codificantes virales del virus Sendai (SeV) y se han usado con
éxito también para el virus respiratorio sincitial (Collins et
al., 1993; Collins et al., 1991), el virus 3 de
parainfluenza humano (Dimock y Collins, 1993), el virus de la rabia
(RV) (Conzelmann y Schnell, 1994) y MV (Sidhu et al.,
1995).
En todos estos sistemas, las proteínas adyuvantes
esenciales fueron proporcionadas ya sea por virus homólogos o por el
vector de vacuna vTF7-3 que codifica la RNA
polimerasa del fago T7 (Fuerst et al., 1986) para llevar a
cabo la trascripción específica de T7 de los plásmidos transfectados
que codifican las proteínas N, P y L requeridas tal y como hicieron
por primera vez Pattnaik et al., (1990). Estas
investigaciones utilizando mini-replicones han
permitido importantes avances en la comprensión de las regiones
reguladoras no codificantes de los genomas y antigenomas virales
correspondientes (para una discusión reciente ver Wertz et
al., 1994). Adoptando la misma puesta en marcha experimental, el
rescate de VSV, como RV un miembro de los Rhabdoviridae, ha
sido ahora reportado (Lawson et al., 1995).
Un importante inconveniente de este método (así
como para el método reportado para el rescate de virus RNA de cadena
negativa con un genoma segmentado) es la implicación de un virus
adyuvante el cual tiene que ser separado del virus rescatado y puede
interferir en la replicación del virus a rescatar. Para RV y VSV,
ambos pertenecientes a la los Phabdoviridae rígidamente
estructurados y capaces de replicarse hasta elevadas cantidades,
esto no es un problema importante. Sin embargo, en el caso de los
viriones vagamente estructurados, polimórficos típicos de los
miembros de la familia Paramyxoviridae y en el caso de los
virus que se replican en baja cantidad, la presencia de virus
adyuvantes haría que la recuperación de virus rescatados fuera
difícil y puede impedir totalmente su rescate.
De acuerdo con esto, el problema técnico que
subyace en la presente invención fue proporcionar medios y métodos
útiles para la generación de RNA no segmentado de cadena negativa,
preferiblemente de la familia Paramyxoviridae y
preferiblemente del virus del sarampión y un sistema para la
recuperación de estos virus con una eficiencia razonable. La
solución de este problema técnico se proporciona con las
realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Así, la presente invención se relaciona con un
método para la producción de un virus de RNA no segmentado de cadena
negativa de la familia Paramyxoviridae que comprenda (a) la
introducción de una molécula de cDNA contenida en un plásmido, donde
esta molécula de cDNA comprenda la secuencia de la cadena (+)-
completa del mencionado virus de RNA de cadena negativa ligado de
forma operativa con una secuencia de control de expresión, la cual
permita la síntesis de transcritos de RNA antigenómico que lleven la
el extremo 3' auténtico, y donde la mencionada molécula de cDNA este
formada por un número de nucleótidos múltiplo de seis, en una célula
adyuvante que exprese una RNA polimerasa, preferiblemente una RNA
polimerasa de T7, una proteína N y una proteína P, preferiblemente
del virus a ser rescatado, y, además, una proteína L,
preferiblemente del virus a ser rescatado, codificados por un cDNA
de forma transitoria o bien estable introducido en la mencionada
célula; y (b) recubriendo el virus ensamblado infeccioso de RNA no
segmentado de cadena negativa.
De acuerdo con esto, la presente invención se
relaciona con un método para la producción de cualquier virus de RNA
de cadena negativa de la familia Paramyxoviridae.
Preferiblemente los mencionados transcritos de RNA antigenómico
también llevan el extremo 5' auténtico.
Como además se ha descubierto de acuerdo con la
presente invención, la producción efectiva del virus del sarampión
el cual es un virus de RNA de cadena negativa de la familia
Paramyxoviridae, se obtiene solamente si los replicones
especificados por la mencionada molécula de cDNA están formados por
un número múltiplo de seis nucleótidos. Este fenómeno será también
referido como la "regla del seis" a lo largo de esta
aplicación. Las moléculas de cDNA de la presente invención pueden
ser utilizadas de forma conveniente para el rescate de virus de ARN
de cadena negativa de la familia Paramyxoviridae.
En una realización preferible de la presente
invención, en dicha molécula de cDNA, la secuencia para el control
de la expresión es un promotor de RNA polimerasa.
El plásmido es capaz de propagarse y
preferiblemente también de expresar la molécula de cDNA de la
invención como un RNA antigenómico.
En una realización preferible, el mencionado
plásmido contiene un fragmento de DNA expresable el cual sustituye
preferiblemente una región de DNA homóloga de la mencionada molécula
de cDNA, o proporciona una información genética adicional.
Como también se ha descubierto de acuerdo con la
presente invención, en el caso de replicones basados en MV la regla
del seis debe de ser seguida, si un fragmento expresable de DNA
foráneo homólogo o heterólogo se inserta en el plásmido que contiene
el cDNA de la invención. En otras palabras, cualquier nuevo replicón
especificado por moléculas de cDNA construidas de forma apropiada
será solamente capaz de proporcionar cantidades razonables del
producto deseado, si sigue la regla del seis.
En una realización más preferible del método de
la invención, este plásmido se caracteriza por que el fragmento
expresable de DNA está insertado dentro o en una región adyacente
del mencionado cDNA codificante para la proteína viral, esta
inserción realizada de forma que se mantenga la pauta de lectura
para crear una proteína de fusión y permitiendo la expresión de este
fragmento de DNA bajo el control de secuencias señal de la
mencionada proteína viral. De acuerdo con la presente invención se
anticipa que en varios casos las extensiones
C-terminales adecuadas de las proteínas virales no
interferirán con su funcionalidad.
Como una variación de la realización preferible
descrita más arriba y también comprendida dentro de la presente
invención, el fragmento expresable de DNA se expresa posteriormente
a la región codificante de la proteína viral para evitar la
formación de la proteína de fusión, pero sin embargo permitir la
expresión de la secuencia codificante posterior ya sea por medio de
un mecanismo de paro/reinicio donde el último residuo A del triplete
de terminación anterior coincide con el del codón de inicio de la
región codificante posterior, o por el posicionamiento de un lugar
de entrada de ribosoma (IRES) entre las dos regiones codificantes;
ver el ejemplo 12, segundo párra-
fo.
fo.
En una realización más preferible del método de
la invención, el mencionado plásmido se caracteriza porque el
fragmento expresable de DNA está insertado en una región no
codificante del mencionado cDNA y flanqueado por secuencias señal
virales o señales heterólogas que controlen la expresión del
fragmento de RNA especificado por el mencionado fragmento de DNA;
ver ejemplo 12, primer párrafo.
De forma más preferible, el fragmento expresable
de DNA está localizado previamente al gen N. Como se ha descubierto
de acuerdo con la presente invención, el posicionamiento del
mencionado fragmento expresable de DNA en el extremo 5' de la
secuencia MV resulta en una expresión particularmente fuerte del
mismo; ver también el Ejemplo 14.
Ejemplos de esta realización, creando unidades de
trascripción adicionales se proporcionan por los plásmidos que
especifican MVs que expresan la pauta de lectura CAT heteróloga
mostrada en la Figura 10.
Otra realización preferible de la invención se
relaciona con un plásmido que comprenda una secuencia genómica de
ribozima inmediatamente adyacente al nucleótido del extremo 3'
terminal de la mencionada molécula de cDNA y opcionalmente posterior
de la mencionada secuencia genómica de ribozima al menos un
terminador, preferiblemente el terminador de T7.
La inclusión de una secuencia de ribozima en el
plásmido de la invención lleva a la fiel digestión del tránscrito de
RNA, de esta manera potenciando en gran medida la producción de
tránscritos que llevan el extremo 3' correcto el cual, en el caso de
MV, debe de seguir la regla del seis.
Los que son entendidos en la materia,
naturalmente, son capaces de concebir otros medios que den lugar a
la generación de extremos 3' auténticos. Tales medios incluyen el
uso o la incorporación de dianas de restricción a nivel de DNA, o
DNAs de triple hélice.
En una realización más preferible del plásmido de
la invención, la mencionada secuencia genómica de ribozima es la
secuencia genómica del ribozima del virus de la hepatitis delta.
El método de la invención utiliza en una
realización preferible un plásmido que lleva el mencionado cDNA el
cual es capaz de replicarse en un huésped procariota. Un ejemplo
preferible de tal huésped procariota es E. coli.
Ilustraciones de este ejemplo preferible son todos los constructos
de cDNA que dan lugar a MVs modificados como se expone en las
Figuras 2 y 10 que muestran plásmidos que se replican a un número
elevado de copias en in E. coli.
De forma adicional, el método de la presente
invención en una realización preferible se relaciona con un plásmido
que lleva el mencionado cDNA(s) el cual es capaz de
replicarse en un huésped eucariota.
La invención prevé la replicación y la expresión
(p. ej. trascripción, seguida de traducción de los transcritos
formados) de los vectores rescatados, p. ej. las partículas de RNA
empaquetadas (RNPs), en cualquier célula huésped eucariota
apropiada, preferiblemente de vertebrado. Las células huésped
preferibles son aquellas que tengan una alta capacidad de
replicación y expresión. Son más preferibles aquellas células
huésped que permitan una recuperación sencilla de los virus
rescatados para una posterior replicación y subsiguiente formulación
de vacunas.
El método de la invención se relaciona en otra
realización preferible con un plásmido donde el mencionado fragmento
expresable de DNA es un fragmento de DNA que es homólogo o
heterólogo respecto al virus de RNA de cadena negativa y codifica
como mínimo un epítopo inmunogénico.
En otra realización preferible de la presente
invención en el mencionado plásmido el mencionado fragmento
expresable de DNA codifica como mínimo un epítopo inmunogénico de
cómo mínimo un patógeno, preferiblemente una proteína del
envoltorio, como mínimo un producto de un gen que falte en
individuos genéticamente defectivos o tóxico para células
malignas.
Esta realización preferible de la invención
permite la construcción de plásmidos como base para vacunas que
inducen de forma efectiva una respuesta inmune contra uno o
preferiblemente varios patógenos diferentes. En el caso de que el
fragmento expresable de DNA codifique una proteína del envoltorio de
un virus diferente al virus del sarampión o de otro patógeno, un
plásmido basado en el virus del sarampión puede ser utilizado para
dirigir hacia tipos celulares específicos usualmente no reconocidos
por el virus del sarampión. Los mencionados tipos celulares pueden
ser una diana selectiva para los virus rescatados especificados por
el plásmido de la invención y conferir al mencionado tipo celular,
por ejemplo una molécula que necesite el mencionado tipo celular o
una toxina, si el mencionado tipo celular tiene que ser eliminado.
Naturalmente, la mencionada molécula o toxina es también codificada
por el mencionado plásmido. Los que sean expertos en esta materia
serán capaces de idear más aplicaciones de este principio básico por
el que el plásmido de la invención puede ser utilizado.
También, el mencionado plásmido puede codificar
un producto que sea ausente en individuos genéticamente defectivos.
El virus rescatado puede entonces ser usado para la terapia génica
de los mencionados individuos genéticamente defectivos.
Además, las células malignas pueden ser dianas
selectivas de los virus rescatados los cuales se basan en el
plásmido de la invención y moléculas tóxicas para las mencionadas
células malignas pueden ser liberadas.
En otra realización preferible de la presente
invención, en el mencionado plásmido el mencionado fragmento
expresable de DNA es derivado a partir de un virus, una bacteria, o
un parásito.
Otra realización preferible del método de la
presente invención se relaciona con un plásmido en el que el
mencionado fragmento expresable de DNA codifica un epítopo
inmunogénico que es capaz de inducir una respuesta inmune
protectora.
En otra realización preferible, la molécula de
cDNA o los plásmidos de acuerdo con la invención se basan en un RNA
vírico el cual procede del virus del sarampión o un virus de las
paperas.
También se describe aquí una célula huésped
procariota o eucariota transformada con un plásmido. Las células
huésped previstas han sido comentadas más arriba.
Adicionalmente, también se describe aquí una
célula adyuvante capaz de expresar un replicón de RNA a partir de
una molécula de cDNA de la invención, la molécula de cDNA mencionada
está contenida en el plásmido de la invención o en un plásmido que
contenga una molécula de cDNA para la producción de un virus de RNA
de cadena negativa de la familia del orden Mononegavirales el
cual no es un miembro de la familia de los Paramyxoviridae,
la molécula de cDNA mencionada que comprende la secuencia entera de
la cadena (+)-, ligada de forma operativa a una secuencia de control
de la expresión, y opcionalmente un fragmento expresable de DNA el
cual sustituya preferiblemente una región de DNA homóloga de la
mencionada molécula de cDNA o proporcione una información genética
adicional, el mencionado fragmento de DNA expresable que codifica
preferiblemente como mínimo un epítopo inmunogénico de al menos un
patógeno, el cual, preferiblemente sea capaz de provocar una
respuesta inmune, la mencionada célula después es capaz de expresar
proteínas necesarias para la trascripción, encapsidación y
replicación del mencionado RNA.
Aparte de las características de descritas más
arriba, la molécula de cDNA para la producción de virus de RNA de
cadena negativa de la familia del orden Mononegavirales el
cual no es un miembro de la familia de los Paramyxoviridae
puede también presentar en ciertas realizaciones las características
de la molécula de cDNA de la invención que han sido discutidas aquí
más arriba, opcionalmente en conjunción con los plásmidos de la
invención.
En vista de los problemas que surgieron
primeramente en este campo a la hora de rescatar virus de RNA de
cadena negativa no segmentada, se desarrollaron de acuerdo con la
presente invención líneas celulares paradigmáticas que proporcionan
funciones adyuvantes RNA polimerasa T7 y proteínas MV, N y P. El
rescate de MVs puede ser directamente monitorizado después de la
transfección con plásmidos que especifican RNAs antigenómicos y MV L
mRNA. En principio, líneas celulares adyuvantes análogas pueden ser
generadas para cualquiera de estos virus; así esta aproximación al
rescate es aplicable a todos los Mononegavirales que se
repliquen en células de vertebra-
dos.
dos.
Las proteínas de las células adyuvantes previstas
para la encapsidación, trascripción y replicación del mencionado RNA
son una RNA polimerasa, preferiblemente RNA polimerasa T7 y
opcionalmente RNA polimerasa T3, y proteínas N y P, preferiblemente
del virus a ser rescatado. De acuerdo con la presente invención, las
mencionadas proteínas son expresadas a partir de plásmidos de
expresión transfectados de forma estable, de ahora en adelante
definidas como expresión genómica.
Dado que el sistema de rescate está ahora
desarrollado, en contraste con el utilizado para el rescate de RV
(Schnell et al., 1994), VSV (Lawson et al., 1995) y
muy recientemente también para el SeV (D. Kolakofsky, comunicación
personal), no depende de ningún virus adyuvante, no es necesario
separar el virus rescatado a partir del elevado exceso de cualquier
virus adyuvante. La eliminación del virus de la viruela a partir del
virus rescatado se consigue por un simple paso de filtración en el
caso de los viriones rígidamente estructurados de
Rhabdoviridae aunque implica esquemas de purificación más
complejos en el caso de los Paramyxoviridae pleomórficos,
particularmente aquellos que se replican a altas cantidades tales
como MV. Además, para los virus dañados en su replicación y/o en
ciernes para el virus de la viruela, el rescate utilizando el
sistema previo podría fallar completamente. Otro posible
inconveniente del sistemas previos basados en un virus adyuvante de
la vacuna es la elevada frecuencia de recombinaciones del DNA que
tienen lugar en el citoplasma de las células infectadas por el virus
de la viruela la cual pueda causar la recombinación del plásmido que
lleva la secuencia antigenómica con los plásmidos que codifican las
proteínas N, P y L que se requieren para la función adyuvante; esto
puede llevar al rescate del virus que contengan secuencias N, P y L
derivadas a partir de los plásmidos adyuvantes más que de a partir
del plásmido que lleva la secuencia antigenómica. El sistema de la
célula adyuvante solventa todos estos problemas y debe de ser en
principio aplicable para el rescate de cualquiera de los
Mononegavirales que se repliquen en células de
vertebrados.
El establecimiento de una línea celular adyuvante
que exprese las proteínas comunes N y P (además de la polimerasa T7)
no es necesario para el rescate de cualquier representante simple de
los Mononegavirales. Los constructos mini replicones que
contienen las regiones no codificantes terminales (NCTs) del virus
del moquillo canino (CDV) el cual es como el MV un morbilivirus, que
se diferencia de MV en un 35% de los nucleótidos en los NCTs, se
replican en las células adyuvantes específicas para MV con una
eficiencia cercana a la de los mini replicones homólogos MV. Así,
CDV podría ser posiblemente rescatado con las células
293-3-46, las cuales fueron
desarrolladas de acuerdo con la presente invención y de forma más
general, con cualquier línea celular adyuvante puede ser posible el
rescate de varios Mononegavirales no muy cercanamente
relacionados. Esto dependerá probablemente de las proteínas
obtenidas por el virus relacionado, se ha demostrado que este no es
el caso para N y P específicas de SeV y L específica de PIV3 (Curran
y Kolakofsky, 1991).
Para el establecimiento de nuevas líneas
celulares adyuvantes para otros virus que son también previstos por
la presente invención, las siguientes consideraciones pueden ser de
ayuda. La expresión constitutiva de la RNA polimerasa T7 y de las
proteínas N y P de MV no perjudicó la estabilidad a largo plazo de
la línea celular 293-3-46, tal y
como se ha mencionado en los ejemplos aquí adjuntos. Así, la
expresión inducible de estas proteínas, por ejemplo, por medio de
las aproximaciones descritas por el grupo de Bujard (para una
revisión ver Gossen et al., 1993) probablemente no será
necesario, aunque no se puede descartar que las proteínas N y P de
otros virus sean más deletéreas para el crecimiento de la célula que
las de MV. La titulación de los plásmidos utilizada para la
transfección se mostró esencial, mostrando que una proporción de
cerca de 1:1000 de plásmido L-codificante y plásmido
productor de antigenoma, respectivamente, fue la óptima, de acuerdo
con el efecto deletéreo de la elevada expresión de L de VSV en la
replicación de VSV detectada por Schubert et al. (1985). Un
modo alternativo de proporcionar L de forma transitoria, utilizando
un plásmido que contenga un promotor/potenciador de CMV y un intrón
de forma anterior a la región codificante de L más que posterior a
la región codificante de L para permitir alguna exportación del mRNA
largo de L a partir del núcleo, resultó también exitoso en el
rescate, aunque la eficiencia no fue mejor que con el método
estándar de expresión citoplasmática de L dependiente de T7 y más de
cien veces más óptimo para el rescate de plásmido codificante para
L. A la vista de estas experiencias, la decisión de no incluir un
plásmido que codifique L para la generación de células adyuvantes,
permitiendo así la expresión de L en tasas ajustables, fuera
probablemente ventajoso. Sin embargo, se debe mencionar que una
línea celular que exprese de forma estable las proteínas N, P y L
derivadas de SeV que median la replicación a largo plazo de los Dis
de SeV ha sido descrita (Willenbrink y Neubert, 1994). Es importante
resaltar que esta línea celular se diferencia de forma fundamental
de las células adyuvantes identificadas en la presente invención por
su falta de polimerasa T7. Como consecuencia, no es posible el
rescate de un virus y menos todavía de un mini replicón a partir de
DNA clonado con esta línea celular.
La mencionada célula adyuvante puede ser
transfectada con al menos uno de los plásmidos mencionados más
arriba, conteniendo estos plásmidos variantes del cDNA antigenómico
de un representante de los Mononegavirales, y que es
adicionalmente transfectado de forma estable con un plásmido que
contiene un DNA codificante para la proteína viral L común.
Así, en lugar de la selección de una célula
adyuvante que también codifique por si misma la polimerasa viral
(proteína L), la mencionada proteína L se transfecta en la
mencionada célula adyuvante en un plásmido diferente,
preferiblemente por cotransfección. Más adelante, los que son
expertos en esta materia utilizando las enseñanzas de la presente
invención serán capaces de crear una línea celular adyuvante
adecuada también para la expresión de proteína L, en este caso no
sería necesaria la cotransfección.
En la célula adyuvante, los genes que codifican
las mencionadas proteínas N, P y L pueden derivar de los virus del
sarampión o de las paperas.
Las mencionadas células adyuvantes pueden ser
derivadas de la línea celular de riñón embrionario 293 (ATCC CRL
1573). Un ejemplo preferible de tal célula es el clon
2933-46 descrito en los ejemplos.
También se describe aquí una cepa de virus
infecciosos de RNA de cadena negativa que pertenecen al orden de los
Mononegavirales aislados a partir de la célula adyuvante.
Debe de ser recordado que hace cinco años, en una
cuenta errónea fue informado un rescate de MV en nuestro laboratorio
(Ballart et al., 1990 y EP-A 0 440 219),
utilizando el mismo principio básico. Hasta ese momento, los
experimentos se basaron en la microinyección de complejos de
iniciación, que consistían en RNA polimerasa T7 y plásmidos que
especificaban genomas o antigenomas MV, en una línea celular
particular que contenía genomas MV defectuosos aunque capaces de
replicarse. Sin embargo, el rescate por experimentos de
microinyección, desafortunadamente llevados a cabo por solamente un
colaborador, no pudo repetirse, y todos los virus que aparentemente
se habían rescatado no contenían la etiqueta genética, tal y como se
resumió en un comentario de este extremadamente lamentable y
devastador acontecimiento (Aldhous, 1992). Ahora está claro que el
rescate de MV no debe de ser esperado con esta puesta a punto
experimental por muchas razones, en particular debido a los
nucleótidos adicionales a ambos extremos de los RNAs generados y
debido los errores de clonación que dan lugar a RNA incompatible
con la regla del seis (Calain y Roux, 1993; la presente
invención).
La eficiencia del rescate, en comparación con el
rescate de virus de RNA de cadena positiva (Perrotta y Been, 1990),
es baja, dado que solamente de 1 a 6 de cada 10^{6} células
transfectadas, cada una de ellas expuestas a una media de cerca de
2,5 x 10^{5} moléculas de plásmido antigenómico y de 80 a 800
moléculas de plásmido codificante L, desencadenó la formación de
sincitios. Sin embargo, en comparación con el método de rescate
descrito para RV y VSV, en los que cerca de 2 x 10^{7} células son
transfectadas para obtener un suceso de rescate (Lawson et
al., 1995; Schnell et al., 1994), el rescate de MV se
compara bien, particularmente en vistas del hecho de que el tamaño
del genoma de MV es cercano a un tamaño de 4,5 kb y por lo tanto en
principio es más difícil de rescatar. De forma importante, la baja
eficiencia no debe de constituir una dificultad para el rescate de
variantes MV que se repliquen solamente en cantidades algunos
ordenes de magnitud por debajo de las cepas Edmonston B; dado que el
cuello de botella del rescate se encuentra muy probablemente en un
acontecimiento temprano. Es importante resaltar que en las células
fijadas a diferentes tiempos después de la transfección, la
inmunofluorescencia que indica la expresión del gen H o el gen M se
monitorizó exclusivamente en sincitios y no hubo indicación de que
el rescate estuviera confinado a las células simples. Cuando el
rescate es visible de forma directa por la formación de sincitios,
ya han surgido miles de genomas MV de la progenie; las variantes
víricas dañadas y de esta manera con una replicación más lenta
pueden no formar sincitios visibles inicialmente, aunque deberían de
ser reveladas por medio de la disgregación del cultivo celular
transfectado o por medio del siembra en células Vero frescas.
También descrito aquí se encuentra un método para
la producción de un virus infeccioso de RNA de cadena negativa
perteneciente al orden de los Mononegavirales, comprendiendo
los pasos de
(a) transfección de la célula adyuvante de la
invención con cualquiera de los plásmidos descritos más arriba y
comprendiendo DNA obtenido a partir de a virus que pertenecen al
orden de los Mononegavirales (primer vector) y de forma
opcional un plásmido que comprenda un DNA que codifique la proteína
viral L (segundo vector);
y
y
(b) recuperación de los virus infecciosos de RNA
de cadena negativa ensamblados.
La transfección con el segundo vector no es
necesaria si la célula adyuvante expresa en su genoma la proteína
viral L.
En una realización preferible del método de la
invención la proporción entre el primer vector y el segundo vector
está cerca de 1000:1.
De acuerdo con la presente invención se ha
mostrado que la proporción mostrada arriba es óptima para la
eficiencia de la transfección.
En otras realizaciones preferibles del método de
la invención, el mencionado rescate se realiza directamente en el
cultivo de células adyuvantes transfectadas después de la formación
de sincitios o después de la mezcla de las células adyuvantes
separadas con cualquiera otras células competentes para ser
infectadas y repliquen los virus de RNA ensamblados.
También descrito aquí se encuentra una vacuna que
comprende el virus de acuerdo con la invención que opcionalmente es
obtenible por el método de la invención descrito más arriba,
opcionalmente en combinación con un portador farmacéuticamente
aceptable.
Las ventajas de la vacuna serán brevemente
discutidas más abajo.
En el pasado, una variedad de virus de DNA y de
RNA de cadena positiva han sido utilizados como portadores para
dirigir la expresión de genes heterólogos o segmentos de genes en
células huésped, principalmente con la finalidad de dar lugar a una
protección inmune contra el patógeno a partir del cual el material
genético heterólogo se derivó. La principal ventaja del uso de tales
vacunas vivas es su capacidad para multiplicarse y típicamente
infectar una variedad de diferentes tipos celulares, dando lugar a
los antígenos de interés intracelularmente los cuales por lo tanto
pueden ser presentados de forma eficiente al sistema inmune, de esta
manera facilitando la inducción tanto de las células T helper
como de la citotoxicidad. En contraste, las vacunas inactivadas o
las proteínas fabricadas mediante tecnología de DNA recombinante son
mucho menos eficientes, aún por administración en varias formas
particuladas de desarrollo reciente, las cuales son más eficientes
que los adyuvantes utilizados de forma tradicional. Además, estas
vacunas de forma típica no inducen la inmunidad mucosal, la cual es
muy importante para la protección contra los patógenos que entran
por vía respiratoria o intestinal. El fallo en la inducción de la
inmunidad mucosal también es típico de la inmunización a través de
inyección del DNA desnudo que codifica los antígenos.
Por otra parte, muchas de las vacunas replicantes
constituyen una amenaza, aunque no sean proliferativas, como es el
caso de los vectores avipox en humanos (Baxby y Paoletti, 1992). Los
vectores virales complejos (p.ej. basados en el virus de la viruela
y otros poxvirus relacionados, adenovirus de herpesvirus) y vectores
bacterianos (p.ej. basados en derivados de los agentes causantes de
la tuberculosis o el cólera) de forma inherente dan lugar a muchas
respuestas inmunes laterales, innecesarias y/o no deseadas. Además,
la integración de DNA en el genoma de las células infectadas o
transfectadas conlleva como mínimo de forma potencial una
transformación maligna. Valoraciones realizadas por varios autores
acerca de varios tipos de vacunas se han publicado de forma reciente
(vaccines and public health; Internat. J. de techn. Ass. in Health
care 10, 1-196 1994; Science 265,
1371-1451, 1994), a partir de las cuales los
particulares son evidentes los beneficios de las vacunas vivas
basadas en RNA pequeño.
Se han descrito varios virus de RNA de cadena
positiva diseñados para su uso potencial como vectores con
finalidades de inmunización; Los ejemplos más tempranos incluyen el
poliovirus (Burke et al., 1988) y el virus Sindbis (Xiong
et al., 1989) y varios más recientes, que implican fragmentos
polipeptídicos de mayor tamaño expresados a partir de varios
representantes de los Picornaviridae, uno se menciona aquí
(Andino et al., 1994).
Sin embargo, debe decirse que el uso de virus de
RNA como vectores con vistas a la vacunación depende de forma
crucial de la estabilidad del material genético externo durante la
replicación del virus. Este no es un problema trivial, porque estos
virus dependen de una polimerasa desprovista de actividad
correctora. El mencionado problema ha sido solventado de forma
ventajosa por la presente invención: en comparación con los vectores
de vacuna basados en virus de RNA de cadena positiva como se ha
mencionado más arriba, la vacuna de la invención como se ha
ejemplificado por las vacunas bivalentes o polivalentes basadas en
MV muestran varias ventajas importantes que en principio son válidas
para cualquier otro miembro de los Paramyxoviridae tales como
el virus de las paperas. Primero, el tamaño de los insertos no esta
limitado a priori por el requerimiento de encajar en una
cápside proteica eicosahédrica. Segundo, la gruesa encapsidación de
los genomas de los Mononegavirales obvia la estructura
secundaria del RNA la cual es muy importantes en el caso de los
virus de RNA de cadena positiva por encima de la longitud total del
genoma para permitir una correcta replicación sin que se de
anillamiento del producto a la cadena de RNA plantilla; los
segmentos de RNA que codifican los antígenos foráneos no han
evolucionado para cumplir estos requerimientos. Tercero, dada la
organización modular del genoma, diferentes lugares de inserción y
modos de expresión, así como unidades de trascripción adicionales o
de elongación unidades de trascripción existentes, expresando las
pautas abiertas de lectura insertadas insertadas más abajo por
parada/reinicio o por un lugar interno para la entrada de ribosomas
puede ser ideado, permitiendo así un amplio rango de diferentes
niveles de expresión de acuerdo con la posición en el gradiente de
trascripción de MV. Cuarto, dada la extremadamente baja frecuencia
de recombinación, en los Mononegavirales se puede esperar que
retengan material genético no esencial de forma mucho más estable
que los virus de RNA de cadena positiva. Finalmente, la regla del
seis, válida para MV tal y como se ha descubierto de acuerdo con la
presente invención y para otros Paramyxovirinae (Calain y
Roux, 1993), pero conocida a partir de los mini y midi replicones
comunes, no para Rhabdoviridae (Conzelmanin y Schnell, 1994)
o para Pneumovirinae (Collins et al. 1993), deberán
incrementar aún más la fiel retención de regiones codificantes
foráneas insertadas en Paramyxovirinae en comparación a otros
Mononegavirales. Esta estabilidad genética adicional puede
ser prevista porque solamente una de cada seis grandes deleciones
ocurridas y no las pequeñas inserciones de 1 a 5 nucleótidos en una
región no esencial para la replicación viral se espera que lleven a
una progenie viable.
Adicionalmente, el conocimiento de la secuencia
de nucleótidos de las variantes que confieren la atenuación
permitirá cambiar las secuencias codificantes que no están
implicadas en las propiedades atenuantes de acuerdo con la evolución
del virus a lo largo de los años permitiendo así la
"actualización" de las vacunas sin incurrir en el peligro de
perder la calidad de la atenuación.
También se describe aquí el uso del plásmido
arriba descrito en terapia génica somática.
Dado que las proteínas de la envuelta vírica
pueden ser cambiadas entre los diferentes representantes de los
Mononegavirales, tal y como se muestra aquí por medio de
recambio de las proteínas de la envuelta de MV por las glucoproteína
de VSV, parece ser factible dirigir el replicón basado en la
maquinaria de replicación de los Mononegavirales hacia un
particular tipo celular; así, pueden ser ideadas ciertas
aplicaciones en terapia somática. Las ventajas respecto a los
vectores existentes para la terapia génica incluyen su pequeño
tamaño, de esta forma limitan las reacciones del antígeno hacia
varias proteínas, y su completa incapacidad para integrarse en el
DNA y así transformar las células.
Adicionalmente, se describe el uso del plásmido
de la invención para dirigirlo hacia tipos celulares especiales. Un
esbozo de estos esquemas de direccionamiento y sus aplicaciones se
han proporcionado más arriba.
También se describe aquí el uso del plásmido de
la invención para la evaluación funcional de las mutaciones que se
encuentran de forma típica en las variantes de MV que son
responsables de la panencefalitis esclerótica subaguda fatal o para
la identificación de mutaciones responsables de la atenuación de las
cepas de Paramyxoviridae, preferiblemente de las cepas del
virus del sarampión.
Finalmente, se considera una composición para
diagnóstico que incluya como mínimo una molécula de cDNA y/o como
mínimo un plásmido descrito aquí.
Figura 1: Mapa genómico del virus del
sarampión
Figura 2: Vectores plásmidos que especifican RNAs
con terminaciones específicas de MV correctas. Los números de abajo
del plásmido indican la longitud en nucleótidos de los RNAs
generados después de la auto digestión por ribozima. El sentido
genómico o antigenómico de los RNAs especificados se indica con (-)
y (+), respectivamente. Se hace notar que las secuencias de
nucleótidos de MV presentes en estos plásmidos derivan en 30
posiciones del número de acceso EMBL K01711, de forma más notable
por una deleción de un residuo A en la posición 30, compensada por
una inserción de una A en la posición 3402. Para una revisión
comentada de la secuencia consenso de MV ver Radecke y Billeter
(1995).
Figura 3: Western blot que muestra la
expresión de proteínas MV, N y P en células 293 infectadas por MV,
células 293 no infectadas y en los clones de línea celular
293-3-46 y
293-3-64, respectivamente. Las
flechas indican la posición de las proteínas estructurales MV,N y P
así como de la proteína no estructural V que surge a partir de la
edición del tránscrito del gen P de MV.
Figura 4: Visión general de los componentes
experimentales y de los procedimientos para el rescate. A: rescate
de un mini replicón, implicando la transfección de un RNA transcrito
in vitro y la coinfección con MV, proporcionando proteínas
adyuvantes N, P y L (y para estadios posteriores también M, F y H,
así como las proteínas no estructurales C y V). B: rescate de MV,
implicando la transfección de plásmido de DNAs en las células
adyuvantes mediando tanto la trascripción artificial T7 como las
funciones N y P. Para la explicación de más símbolos ver Figura 2.
El plásmido codificante de L pEMC-La contiene un
lugar interno para la entrada de ribosomas derivado del virus de la
encefalomiocarditis (ovalo punteado, EMC IRES), fusionado con la
región codificante L de tal forma que el iniciador AUG del EMCV y L
coincidan; un segmento poli dA posterior (cerca de 40 dAs) se indica
como pdA. Estos dos aparatos aseguran la estabilidad del tránscrito
así como una traducción eficiente a partir de los tránscritos
generados en el citoplasma.
Figura 5: Ensayo de actividad CAT obtenido en las
células adyuvantes 293-3-46 por
transfección del plásmidos constructos pl07MV(-):CAT y
p107MV(-):CAT, especificando mini replicones, y constructo
p(+)NP:CAT, especificando un midireplicón. La estructura del
plásmido pT7P2lacZ es similar a la que se describe en Pelletier y
Sonenberg (1988). La pauta de lectura de CAT del plásmido original
esta sustituida por la pauta de lectura de lacZ.
Figura 6: Visualización de los sincitios formados
en células adyuvantes 293-3-46. A:
experimento de rescate, visto a través de microscopio de contraste
de fase 4 días después de la transfección. B, C: Células que han
crecido en placas de cristal cubiertas, fijadas tres días después de
la transfección y vistas por contraste de fase (B) o por microscopía
de inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo monoclonal
dirigido contra la proteína M de MV (C). Resultados similares se
obtuvieron con un anticuerpo contra H. La longitud de la barra
representa 100\mum.
Figura 7: determinación de la secuencia de los
virus purificados a partir de las placas, desarrollada por
RT-PCR seguida de secuenciación cíclica como se
describe en los ejemplos. Los carriles de la izquierda del área
relevante reproducida a partir del gel de secuenciación se
relacionan con la cepa Edmonston B de nuestro laboratorio, los
carriles de la derecha con los virus rescatados. Las posiciones de
los nucleótidos indicados corresponden con los que se encuentran en
la secuencia consenso de MV tal y como se define en la Figura 2.
Figura 8: Comportamiento de la replicación de los
virus purificados a partir de las placas, evaluado por una técnica
de revestimiento descrita en los Ejemplos. Los derivados de los
experimentos de rescate, las etiquetas EdB del MV estándar y la el
mutante MV\Delta5F EdB son comparados con un clon a partir de la
cepa del virus Edmonston B de nuestro laboratorio. Se muestran los
resultados de dos experimentos independientes utilizando un clon
representativo de cada especie de virus.
Figura 9: Northern blots revelando los
mRNAs de los MV rescatados derivados a partir de p(+)MV, y el
mutante de MV por deleción derivado a partir de p(+)MV\Delta5F
(Figura 2). Las especies de mRNA monocistrónicas F, M y H
(triángulos abiertos) y los mRNA bicistrónicos MF y FH (triángulos
negros) son reveladas por sondas específicas M, F, y H. Los RNA
F-específicos mono- y bicistrónicos inducidos por el
mutante deleccionado son claramente más pequeños que los
correspondientes RNA inducidos por el MV estándar rescatado
(\DeltaF, 1869 en lugar de los 2372 nt. calculados, sin considerar
colas de poli A; M\DeltaF, 3338 en lugar de 3842 nt., y
\DeltaFH, 3830 en lugar de 4334 nt.).
Figura 10(a) Plásmidos para la producción
de MV estándar y deleccionado e híbridos de MV que contienen genes
adicionales o proteínas de la cubierta intercambiadas.
Nótese que dos clones quiméricos MV recuperados a
partir de p (+) MPCATV y a partir de p (+) MHCATV después de 10
ciclos de infección aún expresaban actividad CAT codificada por la
unidad de trascripción adicional en cada uno de los 10 clones
tomadas a partir del décimo ciclo analizado.
Figura 10(b) Plásmidos para la producción
de virus del sarampión Edmonston B estándar y variante.
p(+)MV: La RNA polimerasa proporciona RNA MV
antigenómico con dos marcadores de secuencia en las posiciones 1702
(A) y 1805(AG).
p(+)MV C: El RNA antigenómico corresponde a aquél
obtenible a partir de p(+)MV con la excepción que el ORF de la
proteína C se transforma en no-funcional por la
introducción de dos mutaciones puntuales en las posiciones 1830 (C)
y 1845 (A).
p(+)MV V^{-}: El RNA antigenómico corresponde a
aquél obtenible a partir de p(+)MV con la excepción de que el ORF de
la proteína V se transforma en no-funcional mutando
el "lugar de edición" conservado.
p(+)MV \DeltaM: El RNA antigenómico corresponde
a aquél obtenible a partir de p(+)MV con la excepción que el ORF
completo del gen M (\Delta320 aminoácidos) con la excepción de 15
aminoácidos han sido deleccionados.
p(+)MV \Delta5F: El RNA antigenómico
corresponde a aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción
que una delección de 504 nucleótidos (nucleótidos
4926-5429 están ausentes) se ha introducido en el
gen F.
p(+)MV F\Deltacyt: El RNA antigenómico
corresponde a aquél obtenible a partir de p(+)MV con la excepción
que la secuencia codificante de la parte citoplasmática de la
proteína F ha sido intercambiada por un fragmento diferente
codificante de la parte citoplasmática de la proteína F proteína
derivado a partir de un caso SSPE. Un codón de parada prematuro
resulta en un mutante deleccionado que tienen una delección en el
dominio citoplasmático de la proteína
F.
F.
p(+)MV Fxc SeV: El RNA antigenómico corresponde a
aquél obtenible a partir de p(+)MV con la excepción que la secuencia
codificante para el dominio citoplasmático de la proteína F ha sido
sustituido por la correspondiente secuencia a partir del virus
Sendai.
p(+)MV H\Deltacyt: El RNA antigenómico
corresponde a aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción
que la secuencia codificante para el dominio citoplasmático de la
proteína H ha sido sustituido por un fragmento que lleva una
delección.
Figura 10(c) Plásmidos para la producción
de quimeras del virus del sarampión Edmonston B y vectores.
p(+) M GFPNV: El RNA antigenómico corresponde a
aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que se
incorpora un cistrón adicional corriente arriba del
N-ORF MV que permite la expresión MV dependiente del
gen marcador codificante de la proteína de fluorescencia verde;
dicho ORF está insertado en un sitio de clonaje múlti-
ple.
ple.
p(+)MPCATV: El RNA antigenómico RNA corresponde a
aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que un cistrón
adicional ha sido incorporado corriente abajo del ORF P permitiendo
la expresión del gen CAT.
p(+) MPGFPV: El constructo corresponde a
p(+)MPCATV con la excepción que la secuencia de codificación CAT ha
sido sustituida por la secuencia de codificación GFP que es, otra
vez, clonada en el sitio de clonaje múltiple.
p(+) MHCATV: El RNA antigenómico RNA corresponde
a aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que un
cistrón adicional ha sido introducido corriente abajo del ORF H que
permite la expresión del gen CAT.
p(+)MG/FV: El RNA antigenómico corresponde a
aquél obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que los genes
MV F y H han sido sustituidos por un gen que codifica una proteína G
VSV, la parte citoplasmática de la cual ha sido sustituida por la
parte citoplasmática de la proteína F MV.
p(+)MGV: El RNA antigenómico corresponde a aquél
obtenible a partir de p (+) MV con la excepción que los genes MV F y
H han sido sustituidos por un gen codificante de la proteína G
VSV.
Figura 11: Microscopia electrónica de células BHK
infectadas con agente de replicación rescatado a partir de
p(+)MGV.
Una gran colección de RNP típicos para células
infectadas MV son visibles, mostrando capacidad de replicación
inalterada del RNA viral quimérico.
Figura 12: Microscopia electrónica de células BHK
infectadas con agente de replicación rescatado a partir de
p(+)MGV.
Se forman partículas pleomórficas parecidas a
viriones MV a pesar del hecho que en estos cultivos de células
infectadas exclusivamente se detectó proteína G VSV y no sin restos
de proteínas F y H de la cápsula de MV por Western Blotting.
Figura 13: Microscopia electrónica de células BHK
infectadas con VSV: partículas viriónicas VSV.
Los típicos viriones VSV con forma de bala
difieren completamente de las partículas pleomórficas tipo MV
mostradas en la Fig. 12.
Los ejemplos ilustran la invención:
Las células se mantuvieron como monocapas en
medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 5%
suero de ternera fetal (FCS) para células Vero (riñón de mono verde
africano), con 10% FCS para células 293 (riñón embriónico humano) y
con 10% FCS y 1,2 mg/ml G418 para los clones celulares derivados de
293 transfectados de forma estable.
Para crecer reservas de virus MV que alcancen
títulos de alrededor de 10^{7} pfu/ml, los virus recombinantes se
propagaron en células Vero, y la vacuna de la cepa Edmonston B se
creció en células Vero o 293. Se llevó a cabo una ronda de
purificación en placa transfiriendo un sincitio a un cultivo de
células Vero de 35 mm que se expandió en un plato de 175 cm^{2}.
Las reservas de virus se hicieron a partir de cultivos de 175
cm^{2} en dónde la producción de sincitios era pronunciada. Las
células se rasparon en 3 ml de OptiMEM I (GIBCO BRL) seguido de una
ronda de congelación y descongelación. La titulación de virus se
llevo a cabo en cultivos de 35 mm de células Vero. Después de
2-3 h de adsorción vírica, se eliminó el inóculo y
las células se cubrieron con 2 ml de DMEM que contiene FCS 5% y
agarosa SeaPlaque 1%. Después de 4-5 días, los
cultivos se fijaron con 1 ml de TCA 10% durante 1h, luego se hizo
entrecruzamiento UV durante 30 min. Después de retirar la capa de
agarosa, las monocapas de células se tiñeron con cristal violeta
diluido en etanol 4%, y se contaron las placas.
Antes de la transfección, todos los plásmidos se
linealizaron por digestión con SfiI y se esterilizaron por
precipitación con etanol. Las células se sembraron en un pocillo de
35 mm para la transfección durante 13 h como se describe más
adelante. La mezcla de transfección contenía 5 \mug de
pSC6-N, 4 \mug de pSC6-P, y 1
\mug de pSC6-T7-NEO. Luego, las
células se lavaron una vez con 2 ml de salino tamponado con fosfato
(PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8 mM Na_{2}HPO_{4}, 1,5 mM
KH_{2}P0_{4}), y se añadió DMEM que contenía 10% FCS. Después de
2 días en cultivo, las células del pocillo de 35 mm se separaron en
dos placas de 75 cm^{2}, y se empezó la selección bajo 1,2 mg/ml
G418 cambiando el medio cada dos días. Después de ^{\sim}2
semanas, los primeros clones de un total de ^{\sim}100 clones se
transfirieron a pocillos de 5 mm. Cuando un clon se hubo expandido a
un pocillo de 21 mm - o 35 mm, se sembraron las células para el
cribaje. La expresión de las proteínas MV N y P se analizó por
Western blotting (ver también más adelante) utilizando ^{\sim}1/3
a 1/10 del lisado total de un confluente de pocillo de 21 mm. Para
monitorizar la funcionalidad de la RNA polimerasa T7, un cultivo de
células de 35 mm se transfectó con 4 \mug de
pEMC-Luc (Deng et al., 1991), y la actividad
luciferasa en 1/125 del lisado total clarificado (protocolo Promega;
recoger 1 día después de la transfección) se midió en un
luminómetro. Los clones expresando las proteínas MV N y P
comparables con el mismo número de células 293 infectadas con MV y
mostrando una actividad RNA polimerasa T7 tan alta como sea posible
se escogieron para evaluar su funcionamiento permitiendo a los RNA
MV DI expresar CAT. Aquí, se transfectaron 5 \mug de los plásmidos
p107MV(+):CAT, pl07MV(-):CAT, o p(+)NP:CAT con o sin 100 ng de
pEMC-La. Después de 1 día, las células se lisaron, y
1/4 de los lisados clarificados se ensayaron para actividad CAT.
Todos los procedimientos de clonaje fueron
básicamente como se describen en Sambrook et al. (1989). Las
amplificaciones por PCR se llevaron a cabo utilizando la corrección
de prueba Pfu DNA polimerasa (Stratagene) y los cebadores con un
enlace fosforotioato 3' terminal en lugar de un enlace fosfodiéster
(Skerra, 1992). Las secuencias DNA de los oligonucleótidos
sintéticos son dadas en pocos casos para nucleótidos
no-MV y en más casos para los nucleótidos MV; se
subrayan secuencias con sitios de reconocimiento por endonucleasas
de restricción relevantes. La construcción del plásmido
pl07MV(-):CAT se puede encontrar en Sidhu et al., 1995. El
plásmido p107MV(+):CAT es el análogo del plásmido p107MV(-):CAT. La
región intercistrónica adicional de p (+) NP:CAT que es similar a la
del límite intergénico N-P se construyó insertando
(5'-ctaGCCTACCCTCCATCATTGTTATAAAAAACTTAGG
AACCAGGTCCACACAGCCGCAGCCCATCAACgcgtatcgcgata-3', MV(+) 1717-1782) y el oligonucleótido complementario internamente al sitio SpeI del gen P. La región codificante CAT amplificada por PCR se insertó como se ilustra en la Figura 2.
AACCAGGTCCACACAGCCGCAGCCCATCAACgcgtatcgcgata-3', MV(+) 1717-1782) y el oligonucleótido complementario internamente al sitio SpeI del gen P. La región codificante CAT amplificada por PCR se insertó como se ilustra en la Figura 2.
La descripción del ensamblaje del primer DNA MV
de longitud completa, la fuente de nucleótidos MV
2044-14937 en versiones posteriores de clones de
longitud completa tales como peuT7MV(-) (ver más adelante), se da en
Ballart et al., 1990. Las principales características del
plásmido p(+)MV (Figura 2) son como siguen: El promotor T7 permite
la síntesis del RNA antigenómico de MV de forma precisa empezando
por el primer nucleótido. El ribozima genómico del virus delta de la
hepatitis (\delta) libera bajo
auto-fraccionamiento (auto-cleavage)
el nucleótido 3' terminal MV correcto. Directamente corriente abajo
del ribozima \delta, el terminador T\oslash de la RNA polimerasa
T7 detiene la mayoría de polimerasas de transcripción. Esto asegura
que las secuencias adyacentes derivadas a partir del esqueleto del
vector no interferirán con la actividad de fraccionamiento
(cleavage). El clonaje de p(+)MV empezó por hibridación de dos
oligonucleótidos complementarios internamente #191
(5'-ggggaaccatcgatggataagaatgcggccgcaggtac-3')
y #192
(5'-ctgcggccgcattcttatccatcgatggttccccgc-3')
proporcionando un polienlazante corto que lleva los sitios de
restricción para SacII, ClaI, NotI, y
KpnI. Este nuevo polienlazante reemplazó el fragmento
SacII-KpnI en pBloT7 derivado a partir de pBluescript
KS (+) (Stratagene) conteniendo el promotor T7 fusionado con el
sitio NsiI (Kaelin, 1989) así formando el plásmido
pB1oT7NSCNK. Para clonar en el 5'-terminal 2041 pb
del antigenoma MV (hasta el sitio SacII), una digestión
NsiI se siguió con tratamiento con la polimerasa Klenow en
presencia de todos los cuatro dNTP. Esto creó un sitio de clonaje de
extremo romo limpiando la parte no transcrita de la secuencia del
promotor T7. Un fragmento MV conteniendo nucleótidos
1-2078 se generó a partir del fragmento de 3351 pb
PvuI de peuMV(-) por amplificación en PCR utilizando los
cebadores #182
(5'-ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGATAG-3',
MV(+) 1-25), y #183
(5'-CAGCGTCGTCATCGCTCTCTCC-3 MV(-)
2077-2056). Nótese que el residuo A adicional en
posición MV(+) 30 (Sidhu et al., 1995) derivado a partir de
la secuencia MV de peuMV(-) se suprimió posteriormente por PCR
mutacional. Después de tratamiento con SacII, el fragmento MV
se ligó en el vector para proporcionar pT7MV (+) 5'. A continuación,
el extremo 3' del antigenoma se unió a la secuencia de \delta
seguido corriente abajo por T\oslash. El fragmento 3' MV
(nucleótidos 14907-15894) se generó a partir del
fragmento PvuI de 14046 pb de peuMV(-) por amplificación con PCR
utilizando los cebadores #186
(5'-GAGAAGCTAGAGGAATTGGCAGCC-3';
MV(+) 14907-14930) y #187
(5'-ttctgaagactcACCAGACAAAGCTGGG-3',
MV(-) 15894-15879). Otra amplificación por PCR en el
plásmido peu3a\deltaT\oslash con los cebadores #184
(5'-ataagaatgcggccgcatccggatatagttcctcc-3')
y #FR4
(5'-ttctgaagactcTGGTggccggcatggtcccag-3',
MV(+) 15891-15894) proporcionó el ribozima genómico
HDV unido al T\oslash. Ambos cebadores #FR4 y #187 contienen
próxima a su extremo 5' la secuencia de reconocimiento para
BbsI que crea un extremo cohesivo en ambos fragmentos
comprendiendo los cuatro nuclótidos MV 3'-terminales
(MV(+) TGGT). Después de las digestiones del fragmento 3' MV con
ClaI y BbsI, del fragmento \delta/T\oslash con
BbsI y NotI, y de pT7MV (+) 5' con ClaI y
NotI, una ligación de tres vías proporcionó el plásmido
pT7MV(+)5'3'\deltaT\oslash. El último paso para generar p(+)MV
fue rellenar los nucleótidos 2044-14937 MV
antigenómico restantes con una ligación a tres vías. El fragmento
SacII-PacI (nucleótidos
MV(+)2044-7242) y el fragmento
PacI-ClaI (nucleótidos MV 7243-14937
se liberaron del plásmido peuT7MV (-). Estos dos fragmentos se
ligaron en el pT7MV(+)5'3'\deltaT\oslash del cual se había
retirado el polienlazante restante (SacII-ClaI). El
plásmido p(-)MV (Figura 2) se construyó de forma similar. La
actividad de auto-fraccionamiento de \delta se
demostró detectando los fragmentos pequeños 3' esperados in
vitro hechos RNA en un gel de 5% poliacrilamida/7M urea. Para
generar p(+)MV\Delta5F que lleve una delección en el
nt-504 (MV (+)4926-5429) en la
región no codificante 5' del gen F, primero se hizo una PCR del
plásmido pAeFl (Huber, 1993) utilizando los cebadores #88
(5'-CcGAATCAAGACTCATCCAATGTCCATCATGG-3',
MV(+) 5430-5461) y #89
(5'-AGAGAGATTGCCCCAATGGATTTGACCG-3',
MV(-) 5550-5523). El fragmento PCR digerido con
HpaI reemplazó el fragmento NarI-HpaI en pAeFl.
El fragmento NarI-PacI de este vector luego reemplazo
el correspondiente fragmento en p(+)MV.
El esqueleto del vector pEMC-La
está basado en pTM1 (Moss et al., 1990) en el que un sitio
NcoI se sobrepone con un trinucleótido ATG. Utilizando este
ATG como codón de inicio, un marco abierto de lectura insertado en
el sitio NcoI es controlado traduccionalmente por el sitio de
entrada del ribosoma interno (IRES) del virus de la
encefalomiocarditis (EMC). La secuencia de codificación L de MV
unida a una cola de poli(dA) artificial se cogió a partir del
vector pAeL (Huber, 1993) en dos pasos: primero, un fragmento de 450
pb conteniendo los nucleótidos 9234-9530 de MV
generado por PCR utilizando los cebadores #194
(5'-gtggatccATGGACTCGCTATCTGTCAACC-3',
MV(+) 9234-9255) y #195
(5'-AGTTAGTGTCCCTTAAGCATTGGAAAACC-3',
MV(-) 9630-9602); segundo, un fragmento de 6265 pb
comprendiendo los nucleótidos 9572-15835 de la
secuencia del gen L MV unida a la cola de poli(dA) se extirpó
con EcoRI. Después de retirar la parte
NcoI-EcoRI del polilinker en pTM1 y digerir el
fragmento PCR también con NcoI y EcoRI, una ligación
de tres vías incluyendo el fragmento EcoRI de 6265 pb
proporcionó pEMC-La.
Para eliminar el promotor T7 localizado a 5' del
promotor CMV /potenciador en los vectores pSC-N y
pSC-P (Huber et al., 1991),
pSC6-N y pSC6-P se construyeron
sustituyendo un fragmento PvuI-EcoRI con el
correspondiente fragmento de pSP65 (Promega).
pSC6-T7 se generó por intercambio del gen N inserto
en pSC6-N por el fragmento que lleva el gen de la
RNA polimerasa T7 de pAR 1173 (Davanloo et al., 1984).
pSC6-T7-NEO se construyó por
ligación del cassette promotor fosfoglicerolquinasa - resistencia a
neomicina (Soriano et al., 1991) en el único sitio AvrII de
pSC6-T7 utilizando oligodeoxiribonucleótidos de
unión apropiados. Todos los sitios de clonaje se verificaron por
secuenciación.
Las células se sembraron en un pocillo de 35 mm
para conseguir \sim50-70% de confluencia cuando
son transfectados. 3-8 h antes de la transfección,
el medio se reemplazó con 3 ml de DMEM que contenía 10% FCS. G418 se
omitió de aquí en adelante debido a su efecto tóxico durante la
transfección. Todos los plásmidos se prepararon de acuerdo con el
kit de preparación de plásmido QIAGEN. El protocolo para la
coprecipitación Ca^{2+} con fosfato del DNA se adaptó a partir de
Rozenblatt et al. (1979). Los plásmidos (2-10
\mug por pocillo de 35 mm) se diluyeron con 300 \mul de tampón
de transfección 1x (137 mM NaCl, 4,96 mM KCl, 0,7 mM
Na_{2}HPO_{4}, 5,5 mM dextrosa, 21 mM HEPES pH 7,03). Se añadió
solución CaCl_{2} 1M a una concentración final de Ca^{2+} de 125
mM, y la mezcla se incubó a 20ºC durante 30-120 min.
Los coprecipitados se añadieron gota a gota al cultivo y la
transfección se llevó a cabo a 37ºC y CO_{2} 5% durante \sim15
h. Luego, el medio de transfección se reemplazó con 3 ml de DMEM que
contenía 10% FCS. Los productos de los genes marcadores se
recogieron 24-37 h después de la transfección. Las
células se lavaron y se lisaron con tampón de lisis Reporter
(Promega), y se hicieron ensayos CAT y luciferasa siguiendo el
protocolo del proveedor.
Células 293-3-46
preparadas para la transfección como se describe anteriormente se
transfectaron con 5 \mug del plásmido que aloja el DNA MV
antigenómico en presencia o ausencia de 1-100 ng del
plásmido especificando el mRNA L MV. Los primeros sincitios
aparecieron alrededor de los 2-3 días después de la
transfección cuando las células eran aún subconfluentes. Para
permitir que la formación de sincitios progrese más rápidamente,
monocapas de células casi confluentes de cada pocillo de 35 mm se
transfirieron en una placa de 75 cm^{2}. Cuando estos cultivos
alcanzaron la confluencia, las célula se rasparon en el medio y se
sometieron una vez a congelación y descongelación. Los sobrenadantes
clarificados se utilizaron para infectar monocapas de células Vero
ya sea por crecer reservas de virus o para recoger RNA total para
análisis.
Para RT-PCR seguida de
secuenciación, las células Vero se infectaron con suspensiones
víricas clarificadas ya sea recogidas a partir de cultivos de
rescate o a partir de pases posteriores, y el RNA total se aisló de
acuerdo con Chomczynski y Sacchi (1987). 2 \mug de RNA total se
hibridaron primero con 10 pmol o 1 nmol de cebadores hexaméricos al
azar calentando hasta 80ºC durante 1 min y luego rápidamente
enfriados en hielo. Se llevaron a cabo transcripciones reversas con
200 U de MMLV-RT (GISCO BRL) en presencia de dNTP 1
mM en un tampón que contiene Tris-HCl 20 mM pH 8,4,
KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, albúmina de suero bovino 0,1 mg/ml, y
1 U RNAsin (Promega). Las mezclas se mantuvieron a 20ºC durante 10
min, se incubaron a 42ºC durante 1 h, y se terminaron calentando a
95ºC durante 10 min. 1/10 de los volúmenes de reacción se utilizó
como patrón para la amplificación por PCR con los cebadores #59
(5'-ACTCGGTATCACTGCCGAGGATGCAAGGC-3',
MV(+) 1256-1284) y #183
(5'-CAGCGTCGTCATCGCTCTCTCC-3', MV(-)
2077-2056). Después de 40 ciclos, los fragmentos de
822 pb se aislaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick
(QIAGEN). Las reacciones de secuencia se hicieron de acuerdo con el
protocolo de amplificación lineal (Adams y Blakesley, 1991). El
cebador #76 (5'-ctaGCCTACCCTCCAT
CATTGTTATAAAAAACTTAG-3', MV(+)1717-1749) se utilizó para el marcaje de la región 5' no codificante del gen P y el cebador #6 (5'-ccggTTATAACAATGATGGAGGG-3', MV(-)1740-1722) para el marcaje de la región 3' no codificante del gen N.
CATTGTTATAAAAAACTTAG-3', MV(+)1717-1749) se utilizó para el marcaje de la región 5' no codificante del gen P y el cebador #6 (5'-ccggTTATAACAATGATGGAGGG-3', MV(-)1740-1722) para el marcaje de la región 3' no codificante del gen N.
El RNA celular total para análisis Northern blot
se aisló a partir de células Vero utilizando el TRI REAGENT®
(Molecular Research Center, Inc.) y RNA poli(A) se purificó
utilizando cuentas recubiertas de poliestireno paramagnético
super-oligo(dT)25 (Dynal) y un
concentrador de partícula magnética. El RNA se sometió a
electroforesis en un gel de agarosa 1% en formaldehído conteniendo
tampón de desplazamiento 6% y se transfirió a una membrana
Hybond-N^{+} (Amersham) por elusión capilar en 20x
SSC. Los filtros se prehibridaron a 42ºC durante 4 h. La hibridación
se llevó a cabo durante toda la noche a 42ºC en 50% (v/v) formamida,
NaCl 1M, sulfato dextrano 10% (p/v), 1% SDS, tRNA de levadura (0,1
mg/ml) conteniendo 2 x 10^{6} c.p.m./ml de una sonda de DNA
dATP-marcado [\alpha-^{32}P]
preparada con Prime-It II (Stratagene). Los
siguientes fragmentos de DNA se utilizaron para cebar al azar: el
fragmento SalI-BamHI de 1,4 kb a partir de
pSC-M (Huber et al., 1991), el fragmento
HpaI-PacI 1,7 kb a partir de pCG-F, y
el fragmento 1,6 kb SmaI-XbaI a partir de
pSC-H (Huber et al., 1991). pCG, un vector de
expresión eucariota que contiene un origen de replicación SV40 y un
promotor CMV /potenciador, se construyó por delección del gen L así
como el sitio de empalme \beta-globina corriente
abajo de pSC-L. (Huber et al., 1991; Severne
et al., 1988) y subsiguiente inserción del sitio de empalme
\beta-globina (a partir de pSGS Stratagene)
corriente arriba del nuevo polilinker. El plásmido basado en pCG
pCG-F contiene un inserto que consiste en el gen
entero F. Los filtros se lavaron en SSC 2x a 20ºC durante 10 min y
dos veces en SSC 2x, SDS 1% a 65ºC durante 30 min. Las bandas se
visualizaron por autoradiografia.
Para analizar la expresión de las proteínas N y P
de MV por Western blot, las células se lavaron con PBS y los
extractos citoplasmáticos se prepararon utilizando 300 \mul de
tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8, 62,5 mM EDTA,
1% NP-40, 0,40 deoxicolato, 100 \mug/ml
fenilmetilsulfonilfluoruro, y 1 \mug/ml Aprotinina). Alrededor de
1/60 de los lisados totales se corrieron en
SDS-8%PAGE y se transfirieron en membranas
Immobilon-P. Como primeros anticuerpos, se utilizó
ya sea el anticuerpo policlonal de conejo anti-N
#179 (gentilmente aportado por C. Oervell preparado de acuerdo con
los procedimientos estándar) en una dilución de 6000 veces en TBST
(10 mM Tris-HCl pH 7,2-8, 150 mM
NaCl, 0,05 Tween 20) o el anticuerpo anti-P
policlonal de conejo #178 (Oervell y Norrby, 1980) en una dilución
de 3000 veces en TBST. El segundo anticuerpo fue un anticuerpo
porcino anti-conejo acoplado con la peroxidasa del
rábano picante permitiendo la visualización de las bandas por el kit
de quimioluminiscencia potenciada (ECL^{TM} Amersham Life Science,
RPN 2106).
Por microscopia inmunofluorescente, células
293-3-46 se sembraron para un
experimento de rescate en pocillos de 35 mm con cubiertas de cristal
de 24 mm x 24 mm, se cultivaron toda la noche y se transfectaron
como se describe anteriormente. 3 días después de la transfección,
las células permeabilizaron con acetona: metanol (1:1) y se llevó a
cabo inmunofluorescencia indirecta esencialmente como se describe
(Hancock et al., 1990; Oervell y Norrby, 1980), excepto que
el PBS se suplementó con 1 mM MgCl_{2} y 0,8 mM CaCl_{2} y que
se omitió el p-fenilendiamina a partir del mountant.
Proteínas virales M y H se detectaron utilizando anticuerpos
monoclonales murinos anti-M-16BB2 y
anti-H-I29 (Sheshberadaran et
al., 1983) y anticuerpos de conejo anti-IgG
[F(ab')_{2}] de ratón acoplados a rodamina (Pierce,
31666).
Los constructos plasmídicos utilizados en este
estudio se muestran en la Figura 2. p107MV(-):CAT y p107MV(+): CAT
especifican los RNA sentido genómico y antigenómico,
respectivamente, en los que todas las regiones codificantes MV son
remplazadas de forma precisa por la región codificante CAT. En
células infectadas MV o en células adyuvantes (ver más adelante),
dan lugar a los mini-replicones y al mRNA CAT
poliadenilado y encapuchado comprendiendo la región no codificante
5'N y la 3'L. p(+)NP:CAT, conteniendo además también las regiones
codificantes MV N y P en su contexto de secuencia MV ordinario, da
lugar a los midi-replicones. Los RNA genómicos o
antigenómicos de longitud completa o parcialmente deleccionada están
especificados por p(+)MV\Delta5F, p(+)MV y p(-)MV: Para todos
estos plásmidos, la transcripción con la RNA polimerasa T7
proporcionó RNA conllevando los auténticos nucleótidos del terminal
viral genómico y antigenómico, respectivamente (Sidhu et al.,
1995). La correcta iniciación se consiguió por fusión directa del
promotor T7 (desprovisto de su parte transcrita) con la secuencia
genómica y antigenómica. Empezando todos los transcritos con los
nucleótidos ACC específicos de MV en lugar de GGG específicos de T7
reduce el RNA proporcionado en alrededor de un orden de magnitud,
como se revela en estudios de transcripción in vitro
utilizando constructos plasmídicos precursores. Para mediar la
formación del termini 3' MV correcto, la secuencia del ribozima
genómico del virus hepatitis delta (Perrotta y Been, 1990) se clonó
inmediatamente adyacente a los nucleótidos 3' terminales MV; la
introducción de los terminadores T7 incrementó la eficiencia del
auto-fraccionamiento.
La línea celular 293 de riñón embriónico humano
se escogió porqué es altamente permisiva con MV. Además, estas
células pueden ser eficientemente transfectadas por el método de la
coprecipitación calcio fosfato; del 30 al 60% de las células se
tiñeron de azul a las 24 horas después de la transfección con un
plásmido codificante para \beta-galactosi-
dasa.
dasa.
Siguiendo la cotransfección de células 293 con
pSC6-N, pSC6-P y
pSC6-T7-NEO como se describe en los
Ejemplos, alrededor de 100 colonias se expandieron bajo selección
con neomicina. La expresión de N y P se cribó por Western blot, y la
actividad de la RNA polimerasa T7 se evaluó por transfección con un
plásmido marcador conteniendo la región codificante de la luciferasa
de luciérnaga bajo control de un promotor T7. Muchos clones
expresaron altos niveles de P, pero sólo algunos coexpresaron N
eficientemente. La figura 3 muestra la expresión de N y P de dos
líneas celulares seleccionadas a niveles comparables a los de
células 293 infectadas con MV; la actividad RNA polimerasa T7
detectada en el clon 293-3-46 fue la
más elevada entre todos los otros clones mientras que era alrededor
de 100 veces inferior en el clon
293-3-64 que resultó no rescatar MV.
Una tercera línea celular, 293-3-43,
expresando las tres proteínas a niveles comparables con
293-3-46 también fue activa en el
rescate.
La expresión de los genes introducidos no redujo
la susceptibilidad para la infección MV. La línea celular adyuvante
293-3-46 utilizó principalmente
rescate MV, aunque creciendo a una velocidad 2-3
veces más lenta en comparación con la línea 293 progenitora, que
probó ser muy estable y completamente funcional después de más de 80
divisiones celulares en diluciones 1:4 a 1:8.
El sistema de rescate MV se desarrolló paso a
paso, permitiendo analizar funcionalmente todos los componentes. Por
un lado, MV-dependiente de rescate de mini- y
sucesivamente después midireplicones se verificaron por ensayos
marcadores CAT. Similarmente, por otro lado, la funcionalidad de las
células 293-3-46 se comparó con la
ayuda basada en MV descrita antes (Sidhu et al., 1995).
El test de rescate de
mini-replicones se muestra esquemáticamente en la
Figura 4A. Pequeños transcritos a partir de p107MV(-): CAT,
p107MV(+):CAT (Sidhu et al., 1995) y transcritos más largos
posteriores, p.ej. generados a partir de p(+)NP:CAT (Figura 2), se
comportaron como mini- y midi-replicones,
respectivamente. Se encapsidaron, se transcribieron para producir
CAT, se replicaron y se empaquetaron en partículas viriónicas para
infectar nuevas células. Durante los 2 a 4 primeros ciclos de
infección, se amplificaron masivamente mientras que en los ciclos de
replicación posteriores de ambos MV y
mini-replicones se redujo, como se observa en DI RNA
de aparición natural (Re, 1991). Análisis de los RNA amplificados
mostraron que los replicones encapsidados y los transcritos de CAT
contenían las regiones respectivas terminales específicas MV
diferentes (Sidhu et al., 1995). Lo más importante, resultó
que para una función eficiente, el número total de nucleótidos de
los replicones tenía que ser un múltiple de seis, un requerimiento
-llamado como la norma de los seis- previamente encontrado como
esencial para RNA SeV DI de tipo copia reversa naturales y
ligeramente modificados (Calain y Roux, 1993). La adherencia a esta
norma fue crucial para la construcción de plásmidos especificando
una variedad de mini- y midi-replicones tales como
aquellos mostrados en la Figura 2. Este también fue el caso para
clones de longitud completa.
La función adyuvante de los clones celulares
transfectados de forma estable se analizó con el proceso
representado en la Figura 4B, utilizando sin embargo ya sea el
plásmido p107MV(-):CAT, p107MV(+):CAT o p(+)NP:CAT (Figura 2) en
lugar de p(+)MV. Como se muestra en la Figura 5, la actividad CAT
ascendió en las células transfectadas, aunque en niveles
considerablemente más bajos que en las células 293 infectadas con MV
y cotransfectadas directamente con RNA mini o
midi-replicones. La cotransfección de plásmido
pEMC-La codificante de la proteína L MV fue un
requerimiento absoluto. Como se esperaba, se detectó poca actividad
CAT de fondo cuando se utilizó el constructo replicón de sentido
positivo. Los dos constructos que contienen sólo el marco de lectura
CAT en el sentido más- y menos- evocaron casi cantidades iguales de
actividad CAT; el constructo midi-replicón dio
aumento a aproximadamente 100 veces menos actividad CAT que el
mini-replicón.
El protocolo de transfección se optimizó en
términos de la máxima actividad CAT obtenible, utilizando plásmidos
mini- y midi-replicón. Luego, se analizaron los
constructos de longitud completa p(+)MV y p(-)MV. Alrededor de
10^{6} células contenidas en cada pocillo de 35 mm se
transfectaron y estimamos que alrededor de una decena de éstas
realmente recibieron plásmidos de longitud completa así como los L
codificantes. Normalmente, siguiendo a la cotransfección de p(+)MV y
pEMC-La, de 1 a 6 sincitios se desarrollaron después
de 2 a 3 días en cada pocillo. No se encontraron sincitios cuando el
último se omitió o cuando se utilizó el plásmido p(-)MV. Los
experimentos de rescate se llevaron a cabo por diferentes
experimentadores utilizando diferentes preparaciones de DNA. La
eficiencia fue ligeramente viable, pero como mínimo el 30% de los
pocillos transfectados revelaron rescate. La figura 6 muestra
sincitios típicos formados en estos experimentos, visualizados ya
sea directamente (fase de contraste, 6A) o después de la fijación de
las células crecidas en cubreobjetos (fase de contraste, 6B, o
inmunofluorescencia de la misma área, 6C).
Primero, tiene que ser verificado que el MV
rescatado contiene el marcador genético que ha sido introducido en
los clones plasmídicos de longitud completa MV. El marcador de 3 nt
indicado en la Figura 2 originado a partir de una región limitante
no codificante para el gen N/P una variante de 176 nt (NCGB)
recuperado a partir del MV derivado de SSPE replicando en células
IP-3-Ca (Ballart et al.,
1990). Los virus de rescate se amplificaron en células Vero, ya sea
directamente a partir de las células transfectadas o después de
purificación en placa; los productos recuperados por transcripción
reversa seguida por reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR) se analizaron por secuenciación cíclica. La
figura 7 muestra un ejemplo de estos análisis, revelando que el
marcador AG en lugar de CA en la cepa Edmonston B pasado en nuestro
laboratorio.
No se analizó la secuencia entera de los MV
rescatados para excluir cualquier error introducido ya sea durante
el ensamblaje de los clones plasmídicos antigenómicos o durante la
transcripción de la RNA polimerasa T7 en la fase de rescate. Sin
embargo, pudieron ser detectados mayores cambios nocivos analizando
el comportamiento de replicación de los virus rescatados en
comparación con el de la cepa Edmonston B. La Figura 8 muestra que
tanto la velocidad de replicación así como los títulos finales
conseguidos en experimentos repetidos fueron indistinguibles entre
virus individuales normales purificados en placa (MV EdB) y
rescatados (MV marcado EdB). La distinción aparente al día I después
de la infección no fue una observación consistente. Reservas de
virus no purificados en placa dieron resultados similares.
Como primera aplicación del sistema genético
reverso, nosotros seleccionamos 504 nucleótidos, así generando un
genoma acortado compatible con la norma de los seis mencionada
anteriormente. Esto eliminó casi por entero el segmento gen F de la
enigmática NCGB M/F larga no codificante que es típica para MV y
para otros morbillivirus, mientras que representantes de otros dos
géneros de la subfamilia Paramyxovirinae, paramyxovirus y
rubulavirus, contienen sólo una NCGB corta. Remarcablemente, fue
viable y aún más se replicó en cultivos celulares a una velocidad
indistinguible del de, Edmonston B y la cepa MV rescatada no
deleccionada (Figura 8, MV\Delta5F EdB). Para determinar el tamaño
de RNA derivados del gen F, el mRNA específico de MV inducido por
estos virus purificados en placa se analizó, utilizando sondas
específicas para el gen F y para los genes M y H situados corriente
arriba y corriente abajo de F, respectivamente. Ciertamente, como se
muestra en la Figura 9, el mRNA F así como los RNA bicistrónicos de
MF y FH son consistentemente más cortos en células infectadas con la
variante MV\Delta5F EdB.
Para explorar la factibilidad para expresar
proteínas extrañas a partir de MV modificado, insertamos un marco de
lectura CAT flanqueado por regiones intercistrónicas en la secuencia
de cDNA antigenómica de MV; se analizaron dos posiciones, por un
lado entre la N y la P y por el otro lado entre el gen H y el L
(Figura 10, p(+)MPCATV y p(+)MHCATV, respectivamente). La región
intercistrónica flanqueando el marco de lectura CAT se diseñó de
acuerdo a la región limitante del gen N/P intercistrónica, pero
contiene sitios de restricción únicos en el plásmido entero,
adecuado para posteriores manipulaciones. A partir de estos
constructos, MV recombinantes expresando actividad CAT se rescataron
con casi la misma eficiencia que a partir de los constructos
estándar y los deleccionados p(+)MV y p(+)MV\Delta5F,
respectivamente. Como se esperaba a partir del gradiente de
transcripción natural típico para todos los Mononegavirales,
p(+)MHCATV expresó de alguna forma menos actividad CAT que
p(+)MPCATV. Más importante, la expresión CAT de los virus
recombinantes parece ser remarcablemente estable como se reveló a
partir de los experimentos mencionados en la leyenda de la Figura 12
en la que se consiguió una amplificación global de los virus
recombinantes de cómo mínimo 10^{30}. Nosotros realmente habíamos
esperado que el virus rescatado a partir de p(+)MPCATV sería menos
estable que aquellos a partir de p(+)MHCATV, porque en el primero la
transcripción de todos los genes tras el CAT insertado se esperaba
ser más baja mientras que en el último sólo la transcripción del gen
L debería ser más baja. Aparentemente, la posición del inserto no
afecta de forma importante la viabilidad de los virus rescatados.
Sin embargo, no se han llevado a cabo aún experimentos comparativos
con MV estándar. Además, se espera que los virus recombinantes que
expresan proteínas que interfieren activamente con la replicación MV
resultaran mantener el gen insertado de forma menos estable.
Debería ser mencionado aquí que la inserción de
una secuencia codificante extraña dentro de los genes de MV
existentes debería ser menos nociva para la replicación viral que
por creación de nuevas unidades de transcripción como en los
constructos discutidos anteriormente. La incapacidad general de la
maquinaria de transcripción eucariótica para expresar más de un
marco de lectura a partir de un mRNA puede en principio ser superada
por (como mínimo) dos dispositivos: el mecanismo de parada/reinicio
y sitios de entrada ribosomales internos (IRES). Ambos mecanismos
son de hecho utilizados en casos especiales para la expresión de
proteínas naturales. Un ejemplo del primero es representado por la
traducción del polipéptido M2 en el virus Influenza B (Horvath,
C.M., Williams, M.A., y Lamb, R. A. (1990) Eukaryotic coupled
translation of tandem cistrons; identification of the Influenza B
virus BM2 polypeptide. EMBO J. 9, 2639-2947). Para
el segundo mecanismo, existen muchos precedentes naturales
reconocidos, el más notable el IRES de Picornaviridae (Sonenberg, N.
(1990) Poliovirus translation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1.61,
23-47), pero también IRES en mRNA celular tal como
aquél especificando BiP (Sarnow, P. (1990) Translation of
glucose-regulated protein 78/immunoglobulin
heavy-chain binding protein mRNA is increased in
poliovirus-infected cells at a time when
capdependent translation of cellular RNA is inhibited). Todos estos
tipos de dispositivos citados han sido explorados en el contexto de
los genes MV N y H, utilizando regiones codificantes corriente abajo
de los marcos de lectura N y H MV aquellos proporcionando CAT y
luciferasa de luciérnaga, respectivamente, como marcadores. Los
constructos bicistrónicos completos se expresaron a partir de
plásmidos de expresión convencional en células de primate y se
obtuvieron rendimientos de las proteínas marcadoras en un rango
entre 10 y 100% en comparación con las proteínas codificadas por el
marco de lectura corriente arriba (Diploma theses, University de
Zürich, composed by A. Cathomen (1991) y O. Peter (1992)).
Para explorar la factibilidad de rescatar
quimeras Mononegavirales genéticamente estables en los que
las proteínas de la cubierta de un virus son reemplazadas por las de
otro virus se construyeron p(+)MGV y pMG/FV (Figura 10). En el
constructo anterior las regiones codificantes enteras F y H de MV
se reemplazaron por aquellas que codifican la proteína G VSV que
satisface una unión a receptor y una función de fusión análogas a
aquellas de les proteínas H y F de MV, respectivamente. El último
constructo se diseñó tal como es creada una proteína de fusión
conteniendo la parte exterior grande y la región transmembrana a
partir de la proteína G VSV fusionada a la cola citoplasmática de la
proteína F MV que se piensa que interacciona específicamente con la
proteína M de MV. Ciertamente, podrían ser recuperados virus
quiméricos a partir de ambos constructos que podrían ser
distinguidos de cada uno sólo por efectos citopáticos ligeramente
diferentes (que son ambos drásticamente diferentes de aquellos
evocados por MV) y por el hecho que en células infectadas por el
virus rescatado a partir del último constructo la proteína de fusión
podría ser revelada por Western blot no sólo por anticuerpos
dirigidos al exodominio G VSV sino también por anticuerpos dirigidos
contra la cola citoplasmática de F MV. Ambas quimeras se replicaron,
como se determinó por diluciones a punto final, hasta títulos
razonablemente altos sólo alrededor de un orden de magnitud menor
que los títulos obtenidos por MV. Además, mostraron las
especificaciones biológicas esperadas: infectan fácilmente células
de roedores (que no expresan receptores MV) tales como BHK (Figuras
11, 12) dónde forman abundantes RNP citoplasmáticos y nucleares
típicos para MV (Figura 11) así como partículas pleomórficas
parecidas a viriones MV (Figura 12) completamente diferentes de
viriones VSV de tipo caparazón o cigarro (Figura 13) que se creen
formados de forma primaria por la proteína M VSV.
Considerando el hecho que MV y VSV son
Mononegavirales sólo relacionados a mucha distancia y además
pertenecen a familias diferentes (Paramyxoviridae y
Rhabdoviridae, respectivamente), parece posible que muchas
quimeras diferentes que impliquen Mononegavirales
relacionados de forma más próxima pueden ser creadas y no parece
inverosimil que también pueden ser desarrolladas quimeras que
contengan proteínas de cubierta con receptores celulares
particulares como diana.
Para demostrar que otros genes aparte del gen CAT
pueden ser expresados en un vector recombinante de acuerdo con la
presente invención, la secuencia codificante para GFP (Chalfie et
al. Science 263 (1994), 802-805) se insertó en
la misma posición que el gen CAT en el vector p(+)MPCATV, resultando
en un vector recombinante p(+)MPGFPV; ver Fig. 10C.
Además, la secuencia codificante GFP se insertó
corriente arriba del gen N dando lugar al vector recombinante
P(+)MGFPNV (Fig. 10C) asegurándose que la norma de los seis no se
violaba y utilizando en principio un segmento tipo gen limitante
como para los constructos CAT. De hecho, de esta forma se consiguió
una expresión particularmente fuerte de la GFP como se detectó por
evaluación visual de la proteína expresada. Fue incluso posible
expresar dos secuencias codificantes extrañas al mismo tiempo en un
constructo recombinante como se ha demostrado con MV expresando dos
copias de GFP en posiciones diferentes.
Adams, S.M. and Blakesley, R.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Suiza. Serum- & Impfininstitut Berna
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Postfach 2707
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Berna
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 3001
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: cDNA correspondiente al antigenoma de virus RNA de cadena negativa no segmentada, y proceso para la producción de tales virus codificantes de proteínas antigénicamente activas adicionales
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMAS: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 95 11 2559.0
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 82 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCGCCTACC CTCCATCATT GTTATAAAAA ACTTAGGAAC CAGGTCCACA CAGCCGCCAG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCATCAACG CGTATCGCGA TA
\hfill82
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGAACCAT CGATGGATAA GAATGCGGCC GCAGGTAC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCGGCCGC ATTCTTATCC ATCGATGGTT CCCCGC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:4
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCAAACAAA GTTGGGTAAG GATAG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucléico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGCGTCGTC ATCGCTCTCT CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:6
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGAAGCTAG AGGAATTGGC AGCC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCGAACTC TCACCAGACA AAGCTGGG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:8
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAAGAATGC GGCCGCATCC GGATATAGTT CCTCC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:9
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCTGAAGAC TCTGGTGGCC GGCATGGTCC CAG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:10
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAATCAAG ACTCATCCAA TGTCCATCAT GG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:11
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAGAGATTG CCCCAATGGA TTTGACCG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:12
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGGATCCAT GGACTCGCTA TCTGTCAACC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:13
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTAGTGTC CCTTAAGCAT TGGAAAACC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:14
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTCGGTATC ACTGCCGAGG ATGCAAGGC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:15
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGCCTACC CTCCATCATT GTTATAAAAA ACTTAG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SEC. Nº:16
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: / desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTETICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID DE SEC Nº: 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGGTTATAA CAATGATGGA GGG
\hfill23
Claims (21)
1. Un método para la producción de un virus
RNA infeccioso de cadena negativa no segmentada de la familia
Paramyxoviridae comprendiendo
(a) introduciendo una molécula de cDNA contenida
en un plásmido, en dónde dicha molécula de cDNA contiene la
secuencia entera de la cadena (+) de dicho virus RNA de cadena
negativa operativamente unido a una secuencia de control de
expresión, que permite la síntesis de transcritos de RNA
anti-genómicos que llevan la terminación 3'
auténtica, y en dónde dicha molécula de cDNA consiste en múltiple
integral de seis nucleótidos, en una célula adyuvante que exprese
una RNA-polimerasa, preferiblemente
RNA-polimerasa T7, una proteína N y una P,
preferiblemente del virus a ser rescatado, y, además, una proteína
L, preferiblemente del virus a ser rescatado, codificado por un cDNA
ya sea introducido transitoriamente o de forma estable en dicha
célula; y
(b) recuperación de virus RNA de cadena negativa
no segmentada infecciosos ensamblados.
2. El método de la reivindicación 1, en dónde la
secuencia de control de expresión de 1(a) es un promotor RNA
polimerasa.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en dónde
dicho plásmido contiene un fragmento de DNA expresable que reemplaza
una región de DNA homóloga de dicha molécula de cDNA.
4. El método de la reivindicación 1 ó 2, en dónde
dicho plásmido contiene un fragmento de DNA expresable que
proporciona información genética adicional.
5. El método de la reivindicación 1 ó 2, en dónde
dicho plásmido contiene un fragmento de DNA expresable que reemplaza
una región de DNA heteróloga DNA de dicha molécula cDNA.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en dónde dicho plásmido es
caracterizado en que el fragmento de DNA expresable es
insertado en una región de dicho cDNA codificante para una proteína
viral, siendo efectuada dicha inserción de forma que se mantenga el
marco de lectura, preferiblemente para crear una proteína de fusión,
y permitiendo la expresión de dicho fragmento de DNA bajo el control
de las secuencias señales de dicha proteína viral.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en dónde dicho plásmido es
caracterizado en que el fragmento de DNA expresable se
expresa de tal manera corriente abajo de una región codificante de
proteína viral para evitar la formación de una proteína de fusión,
pero a pesar de todo permitiendo la expresión de la secuencia
codificante corriente abajo ya sea por un mecanismo parada/reinicio
dónde el último residuo A del triplete de terminación corriente
arriba coincide con aquella del codón de inicio de la región
codificante corriente abajo, o colocando un sitio de entrada
ribosomal interno (IRES) entre las dos regiones codificantes.
8. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, en dónde dicho plásmido es
caracterizado en que el fragmento de DNA expresable es
insertado en una región no codificante de dicho cDNA,
preferiblemente en la región o terminación 5', y flanqueada por
secuencias señales virales o secuencias señales heterólogas
controlando la expresión del fragmento RNA especificado por dicho
fragmento de DNA.
9. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en dónde dicho plásmido comprende una
secuencia ribozima genómica inmediatamente adyacente al nucleótido
terminal 3' de dicha molécula de cDNA y opcionalmente corriente
abajo de dicha secuencia ribozima genómica como mínimo un
terminador, preferiblemente el terminador
T7.
T7.
10. El método de la reivindicación 9, en dónde
dicha secuencia ribozima genómica es la secuencia ribozima genómica
del virus delta de la hepatitis.
11. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en dónde dicho plásmido es capaz de
replicarse en un huésped procariota o eucariota.
12. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 11, en dónde dicho fragmento DNA expresable de
dicho plásmido es un fragmento DNA siendo homólogo o heterólogo con
respecto al virus RNA de cadena negativa y codificante de como
mínimo un epítope inmunogénico.
13. El método de la reivindicación 12, en dónde
dicho fragmento de DNA expresable de dicho plásmido codifica como
mínimo un epítope inmunogénico de como mínimo un patógeno,
preferiblemente una proteína de cubierta, como mínimo un producto
génico carente en individuos defectivos genéticamente o tóxico por
células malignas diana.
14. El método de la reivindicación 13, en dónde
dicho fragmento de DNA expresable de dicho plásmido es un virus, una
bacteria, o un parásito.
15. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 14, en dónde dicho fragmento de DNA expresable
de dicho plásmido codifica un epítope inmunogénico siendo capaz de
promover una respuesta inmune protectiva.
16. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en dónde dicho virus RNA de cadena negativa
es el virus del sarampión o el virus de las paperas.
17. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en dónde dicha célula adyuvante dichos
genes codificantes de las proteínas N, P y L son derivados a partir
del virus del sarampión o de las paperas.
18. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en dónde dicha célula adyuvante es a partir
de la línea celular de riñón embriónico humano 293 (ATCC CRL
1573).
19. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en dónde la proporción del plásmido como se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y el plásmido
que contiene DNA codificante de la proteína viral L es alrededor de
1000:1.
20. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en dónde dicha recuperación de dicho virus
se consigue directamente a partir del cultivo de célula adyuvante
transfectada después de la formación de sincitios.
21. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en dónde dicha recuperación de dicho virus
se consigue después de mezclar la célula adyuvante transfectada con
otras células competentes de ser infectadas y capaces de replicar
dicho virus.
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