CN102597246B

CN102597246B - 使用非内源pol I启动子的反向遗传

Info

Publication number: CN102597246B
Application number: CN201080027545.1A
Authority: CN
Inventors: P·道米策; M·弗兰蒂; P·苏帕菲帕特; P·马森; B·基纳; S·克罗塔
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Si Qile
Priority date: 2009-05-21
Filing date: 2010-05-21
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2030-05-21
Also published as: EA021009B1; KR20120028328A; HK1165827A1; AU2010250832B2; AU2010250832A1; EP2401384B1; DK2401384T3; US20190284575A1; WO2010133964A1; JP5836266B2; EP2401384A1; KR101800245B1; JP2015204843A; EP2573184A1; US20120189656A1; SMT201300034B; NZ596432A; JP2012527228A; CA2762802A1; US20160024525A1

Abstract

在宿主细胞中用pol I启动子驱动转基因表达，所述启动子对和衍生所述宿主细胞的分类学目相同的生物是非内源的。

Description

使用非内源pol I启动子的反向遗传

本专利申请要求2009年5月21日提交的美国临时专利申请61/216,919号的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及反向遗传领域。此外，其涉及制造用于保护抵御各种病毒的疫苗。

背景技术

反向遗传可在细胞培养中重组表达和操作RNA病毒。它是病毒学和疫苗制造的有效工具，因为能快速生产重组病毒(包括重排列)和/或其突变型。所述方法涉及用一种或多种编码所述病毒基因组的表达构建体转染宿主细胞和从所述细胞中分离所述病毒。例如，参考文献1和2描述了在犬细胞中用犬pol I启动子表达流感基因组RNA的方法。其他来源报道了在人细胞中用人pol I启动子表达流感基因组RNA。

本方法现有技术的一个显著缺点是pol I启动子高度物种特异。例如，已报道人pol I启动子仅在灵长目细胞中起作用[3]，而相似地，在犬细胞中表达需要犬pol I启动子。因此，需要在所述内源pol I启动子未被识别的细胞系中生长病毒时，必须使用两种不同的细胞型以拯救和培养所述病毒。然而，需要避免使用多重细胞系，因为这样具有例如避免竞争培养物选择压力的优势。疫苗生产中所有步骤使用单一细胞系还有助于监管的批准。因此本领域一直需要提供实施反向遗传的替代方法。

优选实施方式概述

现在本发明人意外发现可在宿主细胞中用pol I启动子驱动转基因表达，所述启动子对与所述宿主细胞相同分类学目的生物中是非内源的。

在一种实施方式中，本发明提供含一种或多种表达构建体的宿主细胞，其中所述构建体的RNA分子表达受所述宿主细胞目的非内源pol I启动子控制。这些宿主细胞可用于本发明的表达系统。

本发明还提供宿主细胞中RNA表达的方法，包括步骤(i)制备由第一生物的pol I启动子驱动表达感兴趣转基因的表达构建体和(ii)将步骤(i)的表达构建体导入宿主细胞，其中所述宿主细胞与所述第一生物的分类学目不同。

在进一步的实施方式中，本发明提供生产重组病毒的方法，其中用本发明的宿主细胞生产所述病毒。

本发明还提供制备病毒(如，用于配制成疫苗)的方法，包括步骤(i)用本发明的宿主细胞生产重组病毒，(ii)用步骤(i)获得的所述病毒感染培养宿主，(iii)培养步骤(ii)的培养宿主以生产病毒；和(iv)纯化步骤(iii)获得的所述病毒。为提供制备疫苗的方法，本方法随后可进一步包括步骤(v)将所述病毒配制成疫苗。

除了如上所述导入的非内源pol I启动子，所述宿主细胞将包括内源polI启动子。所述非内源pol I启动子在细胞内驱动非内源RNA的表达，尤其是所述病毒RNA。因此本发明提供具有至少一种控制内源rRNA表达的内源pol I启动子和至少一种控制病毒RNA或其互补物表达的非内源pol I启动子的细胞。

本发明还提供编码蛋白编码mRNA和病毒RNA的DNA表达构建体，其中(i)所述DNA中用于蛋白编码mRNA的密码子针对犬细胞优化且(ii)所述病毒RNA受到灵长目pol I启动子的控制。所述犬细胞理想地为MDCK细胞且所述灵长目启动子理想地为人pol I启动子。所述蛋白编码mRNA的表达可在针对犬细胞优化的pol I启动子的控制下。

表达构建体

本发明人意外发现可在细胞中用来自与所述细胞不同分类学目的生物的pol I启动子驱动RNA表达。因此所述pol I启动子对于来自衍生所述细胞的同一分类学目的生物中是非内源的。术语“目”指常规分类学分级，目的示例为灵长目、啮齿目、食肉目、有袋目、鲸目等。人和大猩猩在同一分类学目中(灵长目)，但人和狗在不同的目中(灵长目与食肉目)。

因此在第一方面，本发明提供含一种或多种表达构建体的宿主细胞，其中所述构建体的RNA分子表达由所述宿主细胞目的非内源pol I启动子驱动。

在一种实施方式中，所述宿主细胞是非灵长目细胞且所述pol I启动子为灵长目pol I启动子。在具体的实施方式中，所述宿主细胞是非灵长目细胞且所述启动子为人启动子。在进一步的实施方式中，所述宿主细胞是非人细胞且所述pol I启动子为人pol I启动子。在另一个实施方式中，所述pol I启动子为非犬pol I启动子且所述宿主细胞是犬细胞。在优选实施方式中，所述宿主细胞是犬细胞且所述启动子为灵长目pol I启动子。在进一步优选的实施方式中，所述pol I启动子为人启动子且所述宿主细胞是犬细胞(如MDCK细胞)。优选这个实施方式是因为人pol I启动子已充分鉴定且犬细胞常用于生产疫苗。

用在所述宿主细胞中的表达构建体可为单向或双向表达构建体。宿主细胞表达多于一种转基因时(不论在相同或不同表达构建体上)可能使用单向和/或双向表达。

双向表达构建体含从同一构建体中的不同方向(即5′到3′和3′到5′)驱动表达的至少两种启动子。所述启动子至少其一为如本文所述的非内源polI启动子。所述两种启动子可操作性连接同一双链DNA的不同链。优选所述启动子之一非内源pol I启动子且至少一种其他启动子为pol II启动子。这是有利的，因为所述pol I启动子可用于表达非加帽的cRNA而所述pol II启动子可用于转录随后翻译为蛋白质的mRNA，因此同一构建体能同时表达RNA和蛋白质。所述pol II启动子可为内源或非内源。表达系统中使用多于一种表达构建体时，若至少一种所述启动子为可在所述宿主细胞中驱动表达的非内源pol I启动子，所述启动子可为内源和非内源启动子的混合物。

所述表达构建体通常包括RNA转录终止序列。所述终止序列可为内源终止序列或对所述宿主细胞非内源的终止序列。本领域技术人员清楚合适的终止序列且其包括但不限于RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列、和核酶。此外，所述表达构建体可包括针对mRNA的一种或多种聚腺苷酸化信号，尤其在表达受pol II启动子控制的基因的末端。

表达系统可包括至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种或至少12种表达构建体。

表达构建体可为载体，如质粒或其他游离构建体。此类载体通常包括至少一种细菌和/或真核的复制起点。此外，所述载体可包括可在原核和/或真核细胞中筛选的选择性标记。此类选择性标记的示例为对抗生素产生抗性的基因，如氨苄青霉素或卡那霉素。所述载体还可包括一个或多个多克隆位点以方便DNA序列克隆。

或者，表达构建体可为线性表达构建体。该线性表达构建体通常不含任何氨苄青霉素和/或选择序列。但是，包含该氨苄青霉素和/或选自序列的线性构建体也在本发明的范围内。使用该线性表达构建体以表达流感病毒的方法示在参考文献4中描述。

本发明的表达构建体可用本领域已知方法产生。例如，参考文献5中描述了此类方法。所述表达构建体为线性表达构建体时，可在导入所述宿主细胞前利用单个限制性酶位点使之线性化。或者，可用至少两种限制性酶位点从载体中切下所述表达构建体。此外，也可通过用核酸扩增技术(如用PCR)扩增获得线性表达构建体。

可利用本领域技术人员已知的任何技术将本发明的表达构建体导入宿主细胞。例如，可通过使用电穿孔、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀、脂质体、微注射、微粒轰击将本发明的表达构建体导入宿主细胞。

表达宿主为犬细胞如MDCK细胞系时，蛋白编码区可针对犬表达优化，如使用来自野生型犬基因或来自犬病毒的启动子，和/或比起人细胞更适于犬细胞的密码子用法。例如，人基因较偏好将UUC用作Phe的密码子(54％)，在犬细胞中该偏好更强(59％)相似地，Ile密码子在人细胞中没有多数偏好，而53％的犬密码子将AUC用于Ile。犬病毒，如犬细小病毒(ssDNA病毒)也可为密码子优化提供指导，如犬细小病毒序列中95％的Phe密码子为UUU(对比犬基因组中的41％)，68％的Ile密码子为AUU(对比32％)，46％的Val密码子为GUU(对比14％)，72％的Pro密码子为CCA(对比25％)，87％的Tyr密码子为UAU(对比40％)，87％的His密码子为CAU(对比39％)，92％的Gln密码子为CAA(对比25％)，81％的Glu密码子为GAA(对比40％)，94％的Cys密码子为UGU(对比42％)，仅1％的Ser密码子为UCU(对比24％)，CCC从不用于Phe且UAG从不用作终止密码子。因此蛋白编码基因可做得更像已为在犬细胞中表达而自然优化的基因，从而方便表达。

反向遗传

上述表达构建体和宿主细胞尤其适于通过反向遗传技术生产重组病毒株。所述技术可用于生产各种RNA病毒，包括正链RNA病毒[6，7]，负链RNA病毒[8，9]和双链RNA病毒[10]。因此，本发明的另一方面提供生产重组病毒的方法，其中所述病毒是用上述表达系统生产的。

已知反向遗传系统包括用pol I启动子、细菌RNA聚合酶启动子、噬菌体聚合酶启动子等表达编码所需病毒RNA(vRNA)分子的DNA分子。此外，病毒需要特定蛋白以形成感染病毒时，系统还提供这些蛋白，例如所述系统还包括编码病毒蛋白的DNA分子从而两种DNA的表达导致完整感染病毒的组装。

反向遗传用于vRNA表达时，本领域技术人员清楚所述序列元素参照彼此的精确间隔对于所述聚合酶启动复制至关重要。因此编码所述病毒RNA的DNA分子正确位于所述pol I启动子和所述终止序列之间很重要，但该定位在反向遗传系统操作人员的能力范围内。

通常，反向遗传适合于表达需要在生命周期中生产基因组RNA的任何病毒。此类病毒包括但不限于正链和负链RNA病毒，如下文所述病毒。所述病毒优选正粘病毒如流感病毒。本发明的方法还适合非节段以及分节段病毒。

所述病毒为正链RNA病毒时，用含所述病毒基因的表达构建体转染细胞通常已足够。例如，转染含脊髓灰质炎病毒基因组的质粒引起传染性脊髓灰质炎病毒的复苏[6，7]。负链RNA病毒的反向遗传更具挑战性，因为所述反义病毒RNA通常无感染性且需要RNA聚合酶来完成生命周期。因此，必须以蛋白或用于原位蛋白表达的基因形式提供所述病毒聚合酶。

所述病毒的传染性需要蛋白质时，通常优选使用双向表达构建体，因为这能减少所述宿主细胞需要的表达构建体总数。因此，本发明方法可利用至少一种双向表达构建体，其中基因或cDNA位于上游pol II启动子和下游非内源pol I启动子之间。从所述pol II启动子转录所述基因或cDNA产生可翻译为蛋白质的加帽正义病毒mRNA，而从所述非内源pol I启动子转录产生负义vRNA。所述双向表达构建体可为双向表达载体。

为了生产重组病毒，细胞必须表达组装病毒粒子所需病毒基因组的所有片段，克隆到本发明表达构建体内的DNA优选提供所述病毒所有RNA和蛋白，但也可使用辅助病毒以提供一些所述病毒和蛋白，尽管优选不使用辅助病毒的系统。所述病毒为非节段病毒时，通常可通过利用本发明方法中的单一表达构建体实现该系统，但使用多于一种表达构建体表达非节段病毒的病毒基因组也在本发明的范围之内。所述病毒为分节段病毒时，通常用本发明方法的多于一种表达构建体表达所述病毒基因组。然而，还考虑在单一表达构建体上组合所述病毒基因组的一种或多种片段或甚至所有片段。

本发明方法尤其适于生产重配病毒株。所述技术可用质粒的体外操控以产生病毒片段的组合、以便于操控病毒片段中的编码序列或非编码序列、以引入突变等。优选使用所述表达系统生产重配病毒株，因为这样可显著减少获得重配种病毒所需的时间，这在需要快速生产疫苗以抵抗流行病的情况中尤其有用。因此本发明本方面的方法优选使用表达来自或源自至少两种不同野生型毒株的病毒基因的一种或多种表达构建体。

一些实施方式中也可包括导致所述宿主细胞内表达辅助蛋白的表达构建体。例如，反向遗传系统部分表达非病毒丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)可具有优势。

本发明的表达构建体用于表达A型流感病毒片段时，可通过将A型流感病毒片段导入含负选择标记(例如ccdB)和高度保守的A型流感病毒基因末端的表达构建体中产生所述表达构建体[11]。其优势在于无需限制性位点且可克隆任何A型流感病毒片段，只要其末端与所述表达构建体上的基因末端互补。

细胞

本发明可用能生产感兴趣病毒的任何原核或真核细胞实施。本发明通常使用细胞系，但例如原代细胞可用作替代细胞。所述细胞通常为哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于仓鼠、牛、灵长类(包括人和猴)，以及犬细胞。可使用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适仓鼠细胞的例子是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞例如，非洲绿猴细胞，如Vero细胞系中的肾细胞[12-14]。合适的犬细胞为例如肾细胞，如CLDK和MDCK细胞系。

其他合适的细胞包括但不限于：CHO；293T；BHK；MRC 5；PER.C6[15]；FRhL2；WI-38；等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)[16]、Coriell细胞库[17]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL81、CCL81.2、CRL1586和CRL-1587，并提供目录号为CCL34的MDCK细胞。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。

本发明使用的细胞优选源自马达二氏(Madin Darby)犬肾的MDCK细胞[18-20]。原始MDCK细胞可以CCL 34获自ATCC。优选使用这些细胞的衍生细胞或其他MDCK细胞。此类衍生细胞如参考文献18所述，其公开了适合悬浮培养的MDCK细胞(′MDCK 33016′或‘33016-PF’，保藏号DSMACC 2219，也可参见参考文献18)。此外，参考文献21公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞(′B-702′，保藏号FERM BP-7449)。在一些实施方式中，所用MDCK细胞系可为致瘤性的。也考虑使用非致瘤性MDCK细胞。例如，参考文献22公开了非致瘤性MDCK细胞，包括′MDCK-S′(ATCC PTA-6500)、′MDCK-SF101′(ATCC PTA-6501)、′MDCK-SF102′(ATCC PTA-6502)和′MDCK-SF103′(PTA-6503)。参考文献23公开了具有高度易感性的MDCK细胞，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCCCRL 12042)。

可使用多于一种细胞类型的混合物以实施本发明的方法。但本发明的方法优选用单一细胞类型如用单克隆细胞实施。本发明方法所用细胞优选来自单一细胞系。此外，同一细胞系可用于拯救所述病毒和所述病毒的任何后续繁殖。

所述细胞优选在无血清中培养以避免常见污染源。本领域技术人员已知用于真核细胞培养的各种无血清培养基(如伊可夫氏(Iscove′s)培养基、超CHO培养基(BW公司(BioWhittaker))、EX-CELL(JRH生物科学公司(JRH Biosciences)))。此外，可用无蛋白培养基(如PF-CHO(JRH生物科学公司))。另外，用于复制的细胞也可在常规含血清培养基中(如含0.5％-10％胎牛血清的MEM或DMEM培养基)培养。

所述细胞可贴壁培养或悬浮。

筛选合适细胞系

依本发明使用的合适细胞广泛可得。此外，可用本领域周知的技术筛选其他细胞。例如，鉴定新pol I启动子和需要寻找支持所述新启动子表达的细胞系时可能需要筛选合适的细胞。同样，分离出新细胞时，可能需要确定哪种pol I启动子可以在其内驱动表达。

本领域技术人员清楚筛选细胞的合适技术。例如，可将报告基因克隆在感兴趣的pol I启动子控制下且所述构建体可转染入待筛选的细胞系中。在此类实验中，转染有含所述报告基因但缺少启动子序列的构建体的细胞可用作对照。因此，测试样品(如，所含转基因受感兴趣pol I启动子控制的细胞)中所述基因的表达显著高于对照(如，含与所述测试样品相同转基因的细胞，但所述转基因不含驱动其表达的启动子)时，所述细胞系适于使用本发明所述启动子。例如，可通过反向转录所述转基因RNA和对所得的cDNA进行实时PCR来测量所述转基因的表达。或者，也可在所述polI启动子控制下以反义方向克隆报告基因(如GFP、YFP、luc等)。该构建体的转录物之后可通过病毒聚合酶转录为mRNA并随后翻译为蛋白。因此，表达所述报告基因的任何细胞可由存在报告基因产物而容易地鉴定。

还可调整外源pol I通常不驱动表达的细胞以获得所述pol I启动子可驱动表达的细胞。例如，这可通过将细胞置于其通常不适合的生长条件下实现。例如，通常仅贴壁生长的细胞系可人工置于悬浮中且可进一步繁殖在这些条件下持续生长的细胞。或者，可贴壁培养通常悬浮生长的细胞，如通过使用高结合塑料培养管或通过向所述培养物中添加血清。相似地，可在无血清条件下培养通常需要血清用于其生长的细胞，或相反地，将适于无血清生长的细胞暴露于血清中。然后可如前所述检测所选细胞分析所述pol I启动子活性。本领域技术人员清楚可以此方式改变的其他合适生长参数，包括但不限于温度、pH、pO2、血清浓度等。此外，所述细胞可经过物理或化学处理，如UV辐射或化学突变。同样，可筛选细胞的新特性，所述细胞仅在正常培养条件下传代。

例如，参考文献18描述将MDCK细胞(通常贴壁)调整为在无血清条件下悬浮培养的方法。起始细胞在通常用于培养悬浮生长细胞的条件下，在滚瓶中培养于无血清培养基中。在这些选择的条件下传数代后，获得可在无血清培养基中悬浮生长的数种细胞系。一个示例为33016细胞系(保藏号DSM ACC 2219)。本发明人已证明人pol I启动子可在这些MDCK细胞中驱动报告基因表达。

RNA聚合酶I启动子

大多数反向遗传方法使用含RNA聚合酶I(RNA pol I)启动子驱动病毒基因组RNA转录的表达载体。所述pol I启动子产生的转录物具有许多病毒如流感病毒完全感染性所必须的未修饰5′和3′末端。

天然pol I启动子为二分式，具有两个分离的区域：核心启动子和上游启动子元件(UPE)。尽管大多数物种的pol I启动子都常见该常规结构，但是启动子的实际序列有很大不同。所述核心启动子围绕转录起始点，从约-45延伸至+20，且足以起始转录。所述核心启动子通常富含GC。尽管所述核心启动子单独足以起始转录，但UPE能大幅提高所述启动子的效率。所述UPE通常从约-180延伸至-107且也富含GC。所述启动子的活性可由远端存在的增强子样序列进一步增强，所述增强子样序列可通过稳定预启动复合物来行使功能。

已在各物种包括人、狗和鸡中鉴定所述pol I启动子的序列。本发明所用的pol I启动子对所述宿主细胞同一分类学目的生物是非内源的。因此术语“内源”和“非内源”用于指所述宿主细胞和存在于表达构建体中的polI启动子。pol I启动子的物种间序列变化意味着容易确定细胞内任何特定pol I启动子是内源还是非内源。因此本发明可将人、狗或鸡pol I启动子用于宿主细胞内RNA表达，所述细胞不是源于所述pol I启动子的同一分类学目(如灵长类pol I启动子用于犬宿主细胞中)。可用计算机或实验的序列比对确定任何特定的pol I启动子源于哪种生物，如图10显示犬和人pol启动子直到转录起始位点的比对，其序列同一性＜60％。

本发明的表达构建体包括至少一种核心启动子；优选还包括至少一种UPE，且还可包括一种或多种增强子元件。也可用天然启动子的片段，只要这些片段可以起始转录。例如，图3显示全长犬pol I启动子的序列(SEQID NO：3)和足够驱动转基因表达的各种片段(也可参见图4和SEQ ID NO：4和5)。此外，图2显示人pol I启动子序列(SEQ ID NO：1)和其能单独在所述宿主细胞中表达转基因的片段(也参见图5和SEQ ID NO：2)。

可依本发明使用的人pol I启动子可包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列或其变体。依本发明使用犬启动子时，其可包括SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示序列或其变体。

所述pol I启动子可包括(i)具有与SEQ ID NO：1-5中任一项的序列同一性至少为p％的序列，和/或(ii)SEQ ID NO：1-5中任一项的片段，只要在感兴趣的宿主细胞内所述启动子能起始并驱动转录操作性连接的RNA编码序列。p值可为75、80、85、90、95、96、97、98、99或更多。所述片段自身可具有足够的长度以驱动表达(如SEQ ID NO：4是SEQ ID NO：3的片段)或所述片段可连接其他序列且这种组合会驱动表达。此类pol I启动子在感兴趣的宿主细胞内驱动表达的能力可容易地评估，如用上述试验使用所述启动子控制下的反义报告基因。

病毒制备

另一方面，本发明提供疫苗制造所用病毒的制备方法，包括步骤(i)如本文所述生产重组病毒(ii)用步骤(i)获得的所述病毒感染培养宿主，(iii)培养步骤(ii)的宿主以生产病毒；和(iv)纯化步骤(iii)获得的所述病毒和(任选地)(v)将所述病毒配制入疫苗。

本发明此方面中用细胞作培养宿主时，已知细胞培养条件(如温度、细胞密度、pH值等)根据所用细胞系和病毒在较宽的范围内变化且可根据应用需求调整。因此下述信息仅代表指南。

如上所述，细胞优选培养在无血清或无蛋白的培养基中。

所述细胞的繁殖可按照本领域技术人员已知的方法进行。例如，所述细胞可在使用常规支持方法如离心或过滤的灌注系统中培养。而且，所述细胞可按照本发明于感染前在分批进料系统中繁殖。在本发明的内容中，培养系统指分批进料系统，其中所述细胞初始培养于分批系统中且通过控制浓缩营养的补料来补偿培养基中营养的消耗(或部分消耗)。在感染前的细胞繁殖期间将培养基的pH值调节在pH 6.6-pH 7.8之间，特别是pH7.2-pH 7.3之间是有利的。细胞培养优选在30-40℃的温度进行。在步骤(iii)中，所述细胞优选在30℃-36℃或32℃-34℃或33℃培养。这在使用本方法生产流感病毒时特别优选，因为已显示在此温度范围内孵育感染细胞能生产配入疫苗时功效改善的病毒[24]。

感染前培养期的氧分压优选调节为25％-95％且特别为35％-60％。本发明内容中的氧分压值基于空气饱和度。在分批系统中细胞浓度优选约8-25x10⁵细胞/mL时或在灌注系统中优选约5-20x10⁶细胞/mL时进行细胞感染。所述细胞可用10^-8-10，优选0.0001-0.5的病毒剂量(MOI值，“感染复数”，相当于感染时每细胞的病毒单位数量)感染。

可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。可采用微载体培养。在一些实施方式中，细胞可能适合悬浮培养。

本发明所述方法还包括收获和分离病毒或其产生的蛋白。分离病毒或蛋白期间，通过标准方法如分离、过滤或超过滤从所述培养基中分离所述细胞。之后按照本领域技术人员充分已知的方法如梯度离心、过滤、沉淀、层析等浓缩所述病毒或所述蛋白，然后纯化。按照本发明优选在纯化期间和之后灭活所述病毒。可在所述纯化过程中任何点用例如β-丙内酯或甲醛进行病毒灭活。

步骤(i)中分离的病毒也可在步骤(ii)中在蛋上培养。目前培养疫苗用流感病毒的标准方法采用含胚的SPF鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。也可用蛋传代病毒并随后在细胞培养物中繁殖。

病毒

本发明方法可用能在细胞中通过反向遗传表达的任何病毒实施。所述病毒可是分节段或非分段的病毒。此外，所述病毒可为正链RNA病毒或负链病毒。在进一步实施方式中，所述病毒也可为双链RNA病毒。

所述病毒为负链RNA病毒时，所述病毒可来自选自下组的科：副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、纤丝病毒科(Filoviridae)、博尔纳病毒科(Bornaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、本扬病毒科(Bunyaviridae)、或沙粒病毒科(Arenaviridae)。此外，所述病毒可来自选自下组的属：副粘病毒属(Paramyxovirus)、正粘病毒属(Orthomyxovirus)、呼吸道病毒属(Respirovirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)、亨尼病毒属(Henipaviras)、禽副粘病毒属(Avulavirus)、肺炎病毒属(Pneumovirus)、偏肺病毒属(Metapneumovirus)、水泡病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)、短暂热病毒属(Ephemerovirus)、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)、核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)、粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus)、马堡病毒属(Marburgvirus)、埃博拉病毒属(Ebolavirus)、博尔纳病毒属(Bornavirus)、A型流感病毒(Influenzavirus A)、B型流感病毒(Influenzavirus B)、C型流感病毒(Influenzavirus C)、托高土病毒属(Thogotovirus)、鲑传贫病毒属(Isavirus)、正本雅病毒属(Orthobunyavirus)、汉坦病毒属(Hantavirus)、内罗病毒属(Nairovirus)、白蛉病毒属(Phlebovirus)、番茄斑萎病毒属(Tospovirus)、沙粒病毒属(Arenavirus)、蛇形病毒属(Ophiovirus)、纤细病毒属(Tenuivirus)、或δ病毒属(Deltavirus)。在具体实施方式中，所述负链RNA病毒选自下组：仙台病毒(Sendai virus)、麻疹病毒(Measles virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、亨德拉病毒(Hendravirus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、人呼吸道合胞病毒(Humanrespiratory syncytial virus)、禽肺病毒(Avian pneumovirus)、水泡性口炎印第安那病毒(Vesicular stomatitis Indiana virus)、狂犬病病毒(Rabiesvirus)、牛暂时热病毒(Bovine ephemeral fever virus)、莴苣坏死黄化病毒(Lettuce necrotic yellows virus)、马铃薯黄矮病毒(Potato yellow dwarfvirus)、传染性造血组织坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus)、维多利亚湖马尔堡病毒(Lake Victoria marburgvirus)、扎伊尔埃波拉病毒(Zaire ebolavirus)、博纳病病毒(Borna disease virus)、流感病毒(Influenzavirus)、托高土病毒(Thogoto virus)、鲑传染性贫血病毒(Infectious salmonanemia virus)、布尼安维拉病毒(Bunyamwera virus)、汉坦病毒(Hantaanvirus)、达格毕病毒(Dugbe virus)、裂谷热病毒(Rift Valley fever virus)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus)、柑桔鳞皮病毒(Citrus psorosisvirus)、水稻条纹病毒(Rice stripe virus)、和丁型肝炎病毒(Hepatitis deltavirus)。在优选实施方式中，所述病毒为流感病毒(如下)。

所述病毒为正链RNA病毒时，所述病毒可来自选自下组的科：动脉炎病毒科(Arteriviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)和杆套病毒科(Roniviridae)。此外，所述病毒可为选自下组的属的病毒：动脉炎病毒属(Arterivirius)、冠状病毒属(Coronavirus)、肠道病毒属(Enterovirus)、环曲病毒属(Torovirus)、头甲病毒属(Okavirus)、鼻病毒属(Rhinovirus)、肝病毒属(Hepatovirus)、心病毒属(Cardiovirus)、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)、副肠孤病毒属(Parechovirus)、马鼻病毒属(Erbovirus)、嵴病毒属(Kobuvirus)和捷申病毒属(Teschovirus)。在具体实施方式中，所述病毒选自下组：严重急性呼吸道综合症病毒(severeacute respiratory syndrome(SARS)virus)、脊髓灰质炎病毒(polio virus)、A型人肠病毒(Human enterovirus A)(HEV-A)、B型人肠病毒(Humanenterovirus B)(HEV-B)、C型人肠病毒(Human enterovirus C)、D型人肠道病毒(Human enterovirus D)、A型肝炎病毒(Hepatitis A)和A型与B型人鼻病毒(Human rhinovirus)。

所述病毒为双链RNA病毒时，所述病毒可来自选自下组的科：双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、囊病毒科(Cystoviridae)、减毒病毒科(Hypoviridae)、分体病毒科(Partitiviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)和整体病毒科(Totiviridae)。此外，所述病毒可为选自下组的属的病毒：水生双RNA病毒属(Aquabirnavirus)、禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)、昆虫双RNA病毒属(Entomobirnavirus)、囊状病毒属(Cystovirus)、分病毒(Partitivirus)、α潜隐病毒属(Alphacryptovirus)、β潜隐病毒属(Betacryptovirus)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)、科罗拉多壁虱热病毒属(Coltivirus)、质型多角体病毒属(Cypovirus)、斐济病毒属(Fijivirus)、虫源呼肠孤病毒属(Idnoreovirus)、苍蝇呼肠病毒属(Mycoreovirus)、环状病毒属(Orbivirus)、正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)、水稻病毒属(Oryzavirus)、植物呼肠病毒属(Phytoreovirus)、轮状病毒属(Rotavirus)和东南亚十二RNA病毒属(Seadornavirus)。

本发明特别适于经历快速突变的病毒和所述重组方法使所述病毒更快分离的情况，所述病毒然后可进一步繁殖以获得合适的疫苗。因此，在优选的实施方式中所述病毒为流感病毒。

流感病毒

流感病毒特别适于在本发明方法中使用，尤其是A型流感病毒和B型流感病毒，因为该病毒的反向遗传已被充分鉴定。流感病毒为分段负链RNA病毒。A型和B型流感病毒具有8个片段，而C型流感病毒有7个。所述病毒需要至少4种病毒蛋白(PB1、PB2、PA和核蛋白)来起始复制和转录。

A型和B型流感病毒的反向遗传可用12种质粒实施以表达所需的4种蛋白和所有八种基因组片段。然而为减少所需的构建体数量，将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)包含入单一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感vRNA片段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子包含入另一个质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感mRNA转录物的序列)上[25]。也可将一种或多种流感vRNA片段纳入pol I启动子的控制下并将一种或多种流感蛋白编码区纳入同一质粒的另一启动子控制下，特别是pol II启动子。如上所述，这优选通过使用双向质粒完成。参考文献25方法的优选方面包括：(a)在单一质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编码区域；和(b)在单一质粒上的所有8种vRNA编码片段。特别优选在一种质粒上包括神经氨酸酶(NA)和细胞凝集素(HA)片段并在另一质粒上包括六种其他片段，因为新出现的流感病毒株系通常在所述NA和/或HA片段具有突变。因此，在此实施方式中，只需替换包含所述HA和NA序列的载体。

优选A型流感病毒的表达系统编码衍生自多种不同野生型株系的基因组片段。所述系统可编码PR/8/34株系(A/Puerto Rico/8/34)的1或多个(如1、2、3、4、5或6个)基因组片段，但通常这/这些片段不包括所述PR/8/34HA片段且通常不包括PR/8/34NA片段。因此所述系统可编码PR/8/34的NP、M、NS、PA、PB 1和/或PB2中至少一个片段(可能全部六个)。

A型流感病毒的其他有用的表达系统可编码AA/6/60流感病毒(A/AnnArbor/6/60)的1或多个(如1、2、3、4、5或6个)基因组片段，但通常这/这些片段不包括所述AA/6/60HA片段且通常不包括AA/6/34NA片段。因此所述系统可编码AA/6/60的NP、M、NS、PA、PB1和/或PB2中至少一个片段(可能全部六个)。

所述系统可编码A/California/4/09株系的一或多个基因组片段，如所述HA片段和/或所述NA片段。因此例如HA基因片段可编码H1血凝素，所述血凝素与SEQ ID NO：6比与SEQ ID NO：7更紧密相关(即使用相同算法和参数，与SEQ ID NO：6相比的序列相同性比与SEQ ID NO：7相比更高)。SEQ ID NO：6和7有80％同一性。相似地，所述NA基因可编码N1神经氨酸苷酶，其与SEQ ID NO：8比与SEQ ID NO：9更紧密相关。SEQ IDNO：8和9有82％同一性。

B型流感病毒的表达系统可编码衍生自多种不同野生型株系的基因组片段。所述系统可编码AA/1/66流感株系(B/Ann Arbor/1/66)的1个或多个(如1、2、3、4、5或6个)基因组片段，但通常这/这些片段不包括所述AA/1/66HA片段且通常不包括AA/1/66NA片段。因此所述系统可编码AA/1/66的NP、M、NS、PA、PB1和/或PB2中至少一个片段。

A/PR/8/34、AA/6/60、AA/1/66、A/Chile/1/83和A/California/04/09株系的病毒片段和序列广泛可得。其序列可在公共数据库上获得，如GI：89779337、GI：89779334、GI：89779332、GI：89779320、GI：89779327、GI：89779325、GI：89779322、GI：89779329。

流感病毒的反向遗传系统可包括导致所述宿主细胞中表达辅助蛋白的表达构建体。例如，表达非病毒丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)可具有优势。

疫苗

本发明第三方面的方法利用本方法生产的病毒制备疫苗。

疫苗(特别是流感病毒)通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、裂解病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。抗原也可以病毒体形式存在。可使用本发明制造任意这些类型的疫苗。

采用灭活病毒时，所述疫苗可包含完整的病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(对于流感，包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或其组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或γ射线辐射。

可通过各种方法由含病毒液体如尿囊液或细胞培养物上清收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用含有去污剂以破坏病毒颗粒的线性蔗糖梯度溶液进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。

用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通X100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、特吉托NP9等)处理纯化的病毒颗粒以获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制品，包括‘吐温-醚’裂解方法。例如本领域熟知裂解流感病毒的方法，参见参考文献26-31等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解所述病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、脂质转染胺试剂(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间(例如在蔗糖密度梯度溶液中)进行。因此，裂解过程可包括：澄清含病毒颗粒的材料(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩所收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHPO₄吸附)，从将全病毒颗粒与非病毒颗粒材料分离，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。裂解流感疫苗的示例有BEGRIVAC^TM、FLUARIX^TM、FLUZONE^TM和FLUS HIELD^TM产品。

本发明的方法也可用于生产活疫苗。此类疫苗通常通过从含病毒颗粒的液体中纯化病毒颗粒来制备。例如，所述液体可通过离心澄清并用缓冲液(例如含蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)稳定。目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗(例如参见参考文献32的第17和18章)。活病毒疫苗包括医学免疫公司(MedImmune)的FLUMIST^TM产品(三价活病毒疫苗)。

纯化的流感病毒表面抗原疫苗包含表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备这些蛋白质纯化形式的方法是本领域熟知的。FLUVIRIN^TM、AGRIPPAL^TM和INFLUVAC^TM产品是流感亚基疫苗。

另一种形式的灭活抗原是病毒体[33](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。病毒体可通过用去污剂溶解病毒，然后去除核衣壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。另一种制备病毒体的方法包括：加入病毒膜糖蛋白至磷脂过量，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。

所述病毒可被减毒。所述病毒可为温度敏感型。所述病毒可为冷适应性病毒。使用活病毒作为抗原时这三种特征特别有用。

HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，且参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15μg HA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如儿童或大流行情况下，或者是使用佐剂时。分数剂量如1/2(即7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8已有应用，更高剂量的(如3x或9x剂量也有使用[34，35])。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，每株约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约3.75、约1.9、约1.5等。

对于活疫苗，利用组织培养感染剂量中值(TCID₅₀)而非HA含量来衡量剂量，且TCID₅₀一般为10⁶-10⁸(优选为10^6.5-10^7.5)/毒株。

本发明所用的流感株系可以具有野生型病毒中的天然HA，或具有修饰HA。例如，已知修饰HA以去除使病毒在禽类动物中具有高致病性的决定簇(如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域(hyper-basic region))。反向遗传学的应用促进这类修饰。

用于疫苗的流感病毒株随季节而变。在大流行间期，疫苗一般包括两种A型流感株系(H1N1和H3N2)和一种B型流感株系，且一般为三价疫苗。本发明也可采用大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群没有与其发生过免疫接触的毒株，特别是A型流感病毒)，如H2、H5、H7或H9亚型毒株，且大流行株系的流感疫苗可以是单价疫苗或者可以基于补充有大流行株系的正常三价疫苗。然而，根据季节和疫苗中所含抗原的特性，本发明可保护抵御HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16中的一种或多种。本发明可保护抵御A型流感病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中的一种或多种。

与针对大流行间期株系的免疫相同，本发明组合物特别有助于免疫抵御大流行或潜在大流行株系。可能引起大流行爆发的流感毒株的特征是：(a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即十年来在人群中未见的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，以至于人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群中水平传播；和(c)它对人有致病性。优选用含H5血凝素类型的病毒免疫以抵御大流行流感，如H5N1毒株。其它可能的株系包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出现的大流行株系。本发明特别适于保护抵御可或已经从非人动物群体传播给人类的潜在大流行毒株，如猪源H1N1流感株系。因此本发明适于给人类以及非人动物接种疫苗。

其抗原可有用地包含在所述组合物中的其它株系是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[36]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行株系[37]。

本发明组合物可包含来自一种或多种(如1、2、3、4或更多)流感病毒株系，包括A型流感病毒和/或B型流感病毒的抗原。疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收获病毒后将它们混合在一起，然后制备抗原。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。通常为三价疫苗，其包含来自两种A型流感病毒毒株和一种B型流感病毒毒株的抗原。也可用四价疫苗[38]，其包含来自2种A型流感病毒毒株和2种B型流感病毒毒株、或者3种A型流感病毒毒株和一种B型流感病毒毒株的抗原。

药物组合物

如本发明所述制备的疫苗组合物是药学上可接受的。它们通常还包含抗原外的其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。如下所述，也可包含佐剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献39。

疫苗组合物通常是水性形式。然而，一些疫苗可为干燥形式，如可注射固体或贴片上的干燥或聚合制品的形式。

疫苗组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗应优选基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞[30，40]。更优选无汞的疫苗。可包含琥珀酸α-生育酚以替代含汞化合物[30]。特别优选不含防腐剂的疫苗。

为了控制张度，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可为1-20mg/ml。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。

疫苗组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选240-360mOsm/kg，更优选290-310mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[41]，但仍优选将渗透压保持在此范围内。

疫苗组合物可含有一种或多种缓冲剂。缓冲剂一般包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。

疫苗组合物的pH通常为5.0-8.1，更一般为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调整散装疫苗pH的步骤。

所述疫苗组合物优选无菌。所述疫苗组合物优选无热原，如每剂量含有＜1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量＜0.1EU。所述疫苗组合物优选不含谷蛋白。

本发明疫苗组合物可包含去污剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(称为‘吐温’)、辛苯聚醇(如辛苯聚醇-9(曲通X100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲铵(‘CTAB’)或脱氧胆酸钠，特别用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污剂可仅以痕量存在。因此，疫苗中辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80各自的含量可以小于1mg/ml。其它痕量残留组分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。

疫苗组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，所述组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。

流感疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。

组合物和药盒优选储存于2℃-8℃。其不应冷冻。理想地，其应避直射光保存。

宿主细胞DNA

用细胞系分离和/或培养病毒时，标准实践是最小化最终疫苗中残留的细胞系DNA含量，以最小化该DNA的致癌活性。

因此，按照本发明制备的疫苗组合物优选含有每剂量低于10ng(优选低于1ng，更优选低于100pg)残留的宿主细胞DNA，但可能存在痕量宿主细胞DNA。

任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。

在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如层析法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如DNA酶处理来提高对残留宿主细胞DNA的清除效果。参考文献42和43公开了一种减少宿主细胞DNA污染的方便方法，该方法包括两步处理，先使用DNA酶(如Benzonase)处理，这一步可以在病毒生长过程中使用，然后使用阳离子去污剂(如CTAB)处理，这一步可以在病毒颗粒破坏过程中使用。也可利用烷化剂如β-丙内酯处理来去除宿主细胞DNA，其也可宜用于灭活病毒颗粒[44]。

佐剂

本发明组合物宜包含佐剂，其作用是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。优选的佐剂包含水包油乳液。已知各种这类乳液，其通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5μm，理想情况下具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。

所述乳液可以包含如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的代表例子。可以使用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草(teff)、黑小麦(triticale)等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程在本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的代表例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯，其为本文特别优选。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。鱼油，包括鲨烯和鲨烷，易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其他优选的油为α-生育酚(如下)。

可以使用油的混合物。

表面活性剂可以通过其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)来分类本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX^TM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的表面活性剂优选吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

优选的表面活性剂的含量(重量％)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。

所述疫苗含裂解病毒时，其水相中优选不含表面活性剂。这是有益的，因为无表面活性剂可在所述抗原上产生‘切割效果’，因此破坏否则可能存在的任何未切割病毒颗粒和/或病毒颗粒聚集体。这可改善切割比高浓度疫苗的安全性[45]。

乳液优选平均液滴大小为＜1μm，例如≤750nm、≤500nm、≤400nm、≤300nm、≤250nm、≤220nm、≤200nm或更小。可通过诸如微流化等技术方便地获得这些液滴尺寸。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[46-48]，参考文献49的第10章和参考文献50的第12章有更详细的描述。所述MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·鲨烯、DLα生育酚和聚山梨酯80(吐温80)的乳液。所述乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。它也可含有司盘85(如1％)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，且鲨烯∶生育酚的重量比优选＜1，因为这能使乳液更稳定。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2，或者重量比约为11∶5。可通过下述方法制备一种此类乳液：将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后微流体化该混合物。得到的乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。所述乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3d-MPL)。此种类型的另一有用乳液可包含(每人剂量)0.5-10mg鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80[51]。

·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。

·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，且这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含角鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。

·鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“Pluronic^TM L121”)的乳液。所述乳液可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与“SAF-I”佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％普流罗尼克(Pluronic)L121和0.2％聚山梨酸酯80)中的苏氨酰基-MDP[52]一起使用。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用“AF”佐剂(5％鲨烯、1.25％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)[53]。优选微流体化。

·含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳剂优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)小于200nm[54]。该乳液也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。该乳液可包含TLR4激动剂[55]。这类乳液可冻干。

·角鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[56]。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5％鲨烯、4％泊洛沙姆-105(普流罗尼多元醇)和2％Abil-Care 85(双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。

·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献57述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献58所述)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N，N-二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[59]。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[60]。

·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(如乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[60]。

在一些实施方式中，可在递送时临时将乳液与抗原混合，因此所述佐剂和抗原可单独地保存在包装或分销的疫苗中，以便在使用时配制成最终制剂。在其它实施方式中，在生产过程中将乳液与抗原混合，因此所述组合物以液体佐剂形式包装。所述抗原通常是水性形式，从而最终通过混合两种液体制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。上述对具体乳液的说明给出组分浓度时，这些浓度通常用于非稀释组合物，因此与抗原溶液混合后浓度降低。

包装疫苗组合物

适用于本发明组合物(或药盒组分)的容器包括药瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻喷雾等。这些容器应无菌。

组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免胶乳过敏患者的问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。所述药瓶可包含单一剂量的疫苗，或者可以包含一个以上剂量(‘多剂量’药瓶)，如10个剂量。药瓶优选由无色玻璃制成。

药瓶可以有适合的帽(如Luer锁)，从而预填装注射器可插入该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中复溶冻干物质)，并可以将药瓶的内容物吸回注射器中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶可装有允许无菌地取出其内含物的瓶帽。

某组分包装到注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。优选安全性针头。一般是1-英寸23-号、1-英寸25-号和5/8-英寸25-号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有抑止装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，所述顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选装有丁基橡胶护罩。优选的注射器是以商品名“Tip-Lok”^TM销售的注射器。

容器可标注显示半剂量体积，例如以利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可标有0.25ml体积的标记。

采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。

可将药盒或组合物与宣传页包装在一起(在同一个盒子中)，所述宣传页包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警告，例如准备好肾上腺素溶液以防疫苗接种后发生过敏反应等。

治疗方法和所述疫苗给予

本发明提供按本发明制备的疫苗。这些疫苗组合物适合给予人类或非人动物对象如猪，且本发明提供了引起对象免疫应答的方法，该方法包括将本发明组合物给予所述对象的步骤。本发明还将本发明组合物用作药物，并提供本发明组合物在生产引起对象免疫应答药物的应用。

这些方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护水平的方法为本领域熟知。人类研究表明，对人流感病毒血凝素的抗体效价与保护作用相关联(约30-40的血清样品血凝反应-抑制效价给出对同源病毒感染产生约50％保护作用)[61]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散(SRID)和/或单径向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。

可以各种方式给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[62-64]、口服[65]、皮内[66，67]、经皮、透皮[68]等。

可用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄大于6个月的儿童和成年人免疫。因此，人类对象可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选对象是老年人(例如≥50岁、≥60岁，优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁)、住院对象、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病对象、免疫缺陷对象、在接受该疫苗前7天接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的对象、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，可用于更广泛的人群。对于大流行株系，优选给予所有年龄的人。

本发明优选组合物满足1、2或3级CPMP功效标准。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：(1)≥70％血清保护；(2)≥40％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2.5倍。在老年人(＞60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护；(2)≥30％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。

可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同的途径如胃肠道外起始、粘膜加强，粘膜起始、胃肠道外加强等给予多个剂量。给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别可用于免疫未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于免疫接种新的HA亚型(如大流行爆发中的亚型)。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。

可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或访问期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗等基本同时给药。在老年患者中特别有用的是与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本同时给药。

相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(在对健康护理专业人员进行的同一用药咨询或访问期间)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括其酯(如乙酯)和其盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸，乙酯和磷酸盐(1∶1)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLU^TM)。

概述

术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

术语“基本”不排除“完全”，如“基本不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可以从本发明定义中删去术语“基本”。

与数值x相关的术语“约”是任选的并表示例如x±10％。

除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将合并组分再与第三种组分合并等。

将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源物质的条件下培养细胞。

在将化合物作为组合物的一部分给予人体时，该化合物可被合适的前药所替代。

附图简要说明

图1显示用萤光素酶报告基因分析pol I启动子活性所用的表达构建体。

图2显示全长(FL)人pol I启动子序列(SEQ ID NO：1)。所述全长序列中的pHW2000人Pol I启动子序列(SEQ ID NO：2；“短”人pol I启动子)用下划线字体表示。箭头表示转录起始位点。

图3显示全长(FL)犬pol I启动子序列(NW_878945；SEQ ID NO：3)。所述全长启动子内的SHORT启动子序列用下划线大写字体表示(SEQ IDNO：5)；所述全长启动子序列内的MID启动子用下划线大写字体和粗体小写字体表示(SEQ ID NO：4)；

图4显示MDCK细胞中的犬pol I启动子活性。实心灰色柱显示所述FL犬pol I启动子的结果，斜纹柱显示所述MID犬启动子的结果，点柱显示所述SHORT犬pol I启动子的结果。“A”表示LUC和病毒聚合酶，“B”表示LUC和感染(MOI＝0.05)，“C”表示LUC，“D”为无DNA。y轴表示相对光单位(RLU)。

图5显示MDCK 33016细胞中的人pol I启动子活性。实心灰色柱显示所述人pol I启动子的结果，斜纹柱显示所述FL犬pol I启动子的结果，点柱显示所述MID犬pol I启动子的结果，直条柱显示SHORT犬pol I启动子的结果。“A”表示LUC和病毒聚合酶，“B”表示LUC和感染(MOI＝0.05)，“C”表示LUC。y轴表示相对光单位(RLU)。

图6显示MDCK细胞33016细胞中所述FL和SHORT人pol I启动子和所述全长犬pol I启动子的活性对比。实心灰色柱显示所述全长人启动子的结果，斜纹柱显示所述全长犬启动子的结果，点柱显示所述人pol I短启动子的结果。A表示LUC+聚合酶，B表示LUC+感染，C显示仅LUC。y轴表示相对光单位(RLU)。

图7显示MDCK 33016细胞中(图7A)和MDCK ATCC细胞中(图7B)人pol I启动子(点柱)和犬pol I启动子(斜线柱)的活性。A表示LUC+聚合酶，B表示LUC+感染，C显示仅LUC。y轴表示相对光单位(RLU)。

图8显示病毒拯救后细胞裂解物中M和NP蛋白的western印迹分析。

图9显示用感染反向遗传构建体的细胞的上清进行的集落形成试验。

图10显示人和犬pol I启动子(分别为SEQ ID NO 1和3)的DNA序列比对。

图11A显示在MDCK ATCC、MDCK 33016-PF和293T细胞中人pol I(hPolI)启动子或犬pol I(cPolI)启动子控制下报道转基因的表达水平。黑色柱代表293T细胞的结果，白色柱显示MDCK 33016-PF的结果，斜线柱代表MDCK ATCC细胞的结果；图11B比较了人和犬细胞的转染效率。两图中的y轴都表示相对光单位(RLU)。

图12显示存在(白色柱)和不存在(黑色柱)TMPRSS2辅助质粒时以及添加(黑色柱)和不添加(白色柱)饲养细胞(12B)时在MDCK ATCC、MDCK 33016-PF和293T细胞中通过基于人pol I启动子的反向遗传对A/Puerto Rico/8/34流感株系的拯救。y轴代表病毒效价(ffu/mL)

图13比较MDCK 33016-PF细胞中人或犬pol I驱动的反向遗传对A/Puerto Rico/8/34流感株系的拯救。黑色柱显示没有TMPRSS2辅助质粒的结果，白色柱显示存在TMPRSS2辅助质粒的结果。y轴代表病毒效价(ffu/mL)

序列表简述

SEQ ID NO：1为全长(FL)人pol I启动子序列

SEQ ID NO：2为pHW2000人Pol I启动子序列

SEQ ID NO：3为全长(FL)犬pol I启动子序列

SEQ ID NO：4为MID犬pol I启动子序列

SEQ ID NO：5为SHORT犬pol I启动子序列

SEQ ID NO：6为来自A/California/04/09的HA序列。

SEQ ID NO：7为来自A/Chile/1/1983的HA序列。

SEQ ID NO：8为来自A/California/04/09的NA序列。

SEQ ID NO：9为来自A/Chile/1/1983的NA序列。

实施本发明的方式

人pol I启动子在人以及犬细胞中激活。

为了评估pol I启动子在非内源宿主细胞中的活性，用487bp人pol I启动子片段或犬pol I启动子的各种片段(如图3所示)控制下反义表达萤光素酶(luc)RNA的表达构建体转染MDCK细胞。表达的RNA可被病毒聚合酶转录为mRNA并随后被翻译为luc蛋白。因此，表达所述转基因的细胞可通过检测荧光素酶活性而被容易的鉴别。为使所述试验发挥作用，需要提供病毒聚合酶。这可通过用编码所述病毒聚合酶的表达构建体共转染所述细胞或用辅助病毒感染所述转染的细胞来实现。所述试验如图1所示。

图11A显示人pol I启动子能犬pol I启动子的相同效率驱动MDCKATCC细胞和MDCK 33016-PF细胞中所述转基因的表达。在MDCK ATCC细胞中用人pol I启动子的转基因表达水平甚至高于人293T细胞中所观察到的水平。为证实所测细胞类型的转染效率相当，用含CMV启动子控制下的荧光素酶基因的构建体转染这些细胞。测量荧光素酶活性水平。结果见图11B且证实所测细胞的转染效率相当。

图4显示犬pol I启动子的所有检测片段都可驱动所述luc转基因在MDCK细胞中表达。此外，图5证明所述全长人pol I启动子能驱动所述转基因在MDCK细胞中表达且比犬pol I启动子更有效。

为进一步限定驱动所述转基因表达必需的人pol I启动子区域，用图2所示的人pol I启动子片段(“短”pol I)重复所述实验。发现尽管全长polI启动子更活跃，但是所述全长以及所述短的人pol I启动子在MDCK细胞中都活跃(图6)。

含人和犬pol I启动子序列的构建体还转染到ATCC的MDCK和MDCK 33016细胞[18]中以检测人pol I启动子的活性是否局限于特定细胞系。如图7所示，人pol I启动子能在两种细胞类型中驱动所述转基因的表达，但该表达在MDCK 33016细胞中更有效。用人pol I启动子从MDCK细胞拯救流感病毒

在MDCK和293T细胞中比较用人pol I启动子拯救流感病毒的效率。将所述流感病毒基因组克隆到pHW2000表达载体中[69]。该载体含在MDCK细胞中显示有活性的人pol I启动子片段(见图5)。具体地，使用以下载体：pHW-WSN PA(0.534μg/μl)；pHW-WSN PB1(0.432μg/μl)；pHW-WSN PB2(0.357μg/μl)；pHW-WSN NP(0.284μg/μl)；pHW-WSN NS(0.217μg/μl)；pHW-WSN M(0.232μg/μl)；pHW-WSN HA(0.169μg/μl)；pHW-WSN NA(0.280μg/μl)和pcDNA-TMPRSS(0.775μg/μl；编码丝氨酸蛋白酶)。蛋白编码基因由巨细胞病毒(CMV)启动子控制。

为拯救所述病毒，将293T细胞以5x10⁶细胞/孔的密度接种在含2ml加有10％FCS的Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)的6孔板中。MDCK细胞以0.3x10⁶细胞/孔接种入含2ml培养基的6孔板中。所述细胞在37℃孵育过夜并在其融合度达到50-80％时转染。

分别用FuGENE 6转染试剂(罗氏公司(Roche)目录号11988387001)和Lipofectamine LTX Plus(英杰公司(Invitrogen)目录号15338-100)试剂转染293T和MDCK细胞。用1μg各载体按以下实验方案转染所述细胞。对于FuGENE 6，将试剂(3μl FuGENE/μg DNA)稀释到73μl无血清培养基(无抗生素)中，温和混合并在室温孵育5分钟。然后将所述DNA加入稀释的FuGENE中，温和混合并在室温孵育至少15分钟。所述DNA/FuGENE复合物逐滴加入293T细胞中而不移除生长培养基，并将所述细胞在37℃孵育24小时。

对于用脂质转染胺试剂的转染，所述试剂(25μl)稀释入500μl无血清培养基中并在室温孵育5分钟。添加所述DNA并将该混合物在室温孵育30分钟。孵育后，在细胞脱离生长培养基后将500μl无血清培养基逐滴加入转染试剂。随后37℃孵育该细胞24小时。转染24小时后，更换培养基。

感染两天后，1000rpm离心5分钟收集所述细胞的上清。所述上清中收集的病毒用于集落形成试验。此外，裂解所述感染细胞并用于Western印迹分析。

Western印迹分析

裂解293T和MDCK细胞并按照标准实验方案进行Western印迹分析。用抗M和NP蛋白的抗体检测膜上的这些蛋白。抗S6的抗体用作加样对照。标记为‘WSN’的泳道加有来自所述拯救病毒的蛋白。标记‘M’和‘NP’的泳道含重组M和NP蛋白作为对照。由于这些重组蛋白表达自不同基因，它们在凝胶中迁移较慢。

所述分析结果见图8，其表明人pol I启动子控制下的表达构建体可在293T以及MDCK细胞中拯救病毒。

集落形成试验

未感染的MDCK细胞以6.25x10⁴细胞/孔的密度接种入含500μl加有10％FCS的DMEM的48孔板中。第二天用病毒在100-150μl体积中37℃感染细胞2小时。从而所述细胞被各种稀释度的所述病毒感染。感染2小时后吸弃培养基并每孔加入含10％FCS的500μl DMEM。细胞37℃孵育到第二天。

感染24小时后，吸弃培养基并用PBS清洗所述细胞一次。每孔加入500μl冰冷的溶于PBS的80％丙酮然后4℃孵育30分钟。吸弃丙酮混合物并用PBST(PBS+0.1％吐温)清洗所述细胞一次。每孔加入500μl溶于PBS的2％BSA然后室温(RT)孵育30分钟。将500μl 1∶6000稀释的抗NP加入封闭缓冲液然后室温孵育2小时。吸弃抗体溶液并用PBST清洗所述细胞两次。二抗(山羊抗小鼠)以1∶2000稀释在500μl封闭缓冲液中，并将所述板RT孵育2小时。吸弃抗体溶液并用PBST清洗所述细胞三次。每孔加入500μl KPL True Blue并孵育10分钟。通过吸弃True-Blue停止反应并用dH₂O清洗一次。吸弃水并晾干所述细胞。

所述试验结果见图9，清楚证明从293T细胞以及MDCK细胞获得感染性病毒。

如参考文献70所述还在MDCK ATCC、MDCK 33016-PF和293T细胞中测试使用人pol I反向遗传系统的A/Puerto Rico/8/34流感株系的病毒拯救。进行存在或不存在编码丝氨酸蛋白酶的辅助质粒TMPRSS2时拯救所述病毒的实验。此外，在病毒诊救24小时后，添加或不添加饲养细胞进行病毒拯救。结果见图12所示，证明可在MDCK细胞中用人pol I启动子在各种条件下实现有效的病毒拯救。

为比较用人pol I启动子在MDCK 33016-PF中病毒拯救的效率是否与用犬pol I启动子的所述拯救相当，如参考文献70所述用人pol I RG系统或犬pol I RG系统转染所述细胞。在存在和不存在所述TMPRSS辅助质粒时进行所述实验。结果(图13)证明使用人pol I系统时，A/Puerto Rico/8/34株系的拯救效率与犬pol I系统相当。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可进行修改而仍在本发明的范围和精神内。

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Claims

1.一种生产重组病毒的方法，所述方法包括培养包含至少一种编码病毒RNA分子的表达构建体的MDCK细胞的步骤，在表达所述病毒RNA分子的条件下所述构建体的病毒RNA分子表达受灵长类pol I启动子控制，所述pol I启动子与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的同一性达100%。

2.一种制备病毒的方法，所述方法包括步骤：(i)如权利要求1所述的方法生产重组病毒；(ii)用获自步骤(i)的病毒感染培养宿主；(iii)培养来自步骤(ii)的宿主以生产更多病毒；和(iv)纯化获自步骤(iii)的病毒。

3.一种制备疫苗的方法，包括步骤(a)用权利要求2所述的方法制备病毒和(b)从所述病毒制备疫苗。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞为细胞系MDCK33016（DSM ACC2219）。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞包括至少一种双向表达构建体。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞为细胞系MDCK33016（DSM ACC2219）。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞包括至少一种双向表达构建体。

8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述表达构建体为表达载体或线性表达构建体。

9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒为分节段病毒。

10.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒为非分段病毒。

11.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒为负链RNA病毒。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述病毒为流感病毒。

13.一种生产病毒的MDCK宿主细胞，其特征在于，所述细胞包含至少一种编码病毒RNA分子的表达构建体，其中所述构建体的所述病毒RNA分子的表达由灵长类pol I启动子控制，所述灵长类pol I启动子与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的同一性达100%。

14.一种生产病毒的MDCK细胞，其特征在于，所述细胞具有至少一种内源pol I启动子和至少一种非内源灵长类pol I启动子，所述内源pol I启动子控制内源rRNA的表达，所述非内源灵长类pol I启动子控制病毒RNA或其互补物的表达，所述非内源灵长类pol I启动子与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示序列的同一性达100%。