PT2401384E - Genética reversa com recurso a promotores da pol i não endógenos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"GENÉTICA REVERSA COM RECURSO A PROMOTORES NÃO-ENDÓGENOS DA POL I"

Campo da Invenção

Esta invenção inclui-se no campo da genética reversa. Além disso, refere-se ao fabrico de vacinas para protecção contra vários vírus.

Antecedentes da Invenção A genética reversa permite a expressão recombinante e a manipulação de vírus de ARN em culturas de células. Trata-se de uma poderosa ferramenta em virologia e na produção de vacinas pois permite a rápida produção de vírus recombinantes (incluindo recombinantes naturais) e/ou a sua mutação. 0 método envolve a transfecção de células hospedeiras com uma ou mais construções de expressão que codificam o genoma virai e o isolamento do vírus a partir das células. Por exemplo, as referências 1 e 71 2 descrevem um método em que o ARN genómico da gripe é expresso em células caninas com recurso ao promotor da Pol I canino. Outras fontes relataram a expressão do ARN genómico da gripe em células humanas com recurso ao promotor da Pol I humano. A W02004/078912 refere-se a um polinucleótido que apresenta uma actividade promotora da transcrição, vectores que contêm polinucleótido e o respectivo uso para a transcrição de sequências de interesse, tais como a produção de vírus de ARN que não têm a estrutura cap. A divulgação também diz respeito a células hospedeiras, de preferência de origem aviária, que contêm um polinucleótido ou o vector.

Uma desvantagem significativa dos métodos da técnica anterior é que os promotores da Pol I são altamente específicos da espécie. Por exemplo, foi relatado que o 2 promotor da Pol I humano é activo apenas em células de primatas [3], e similarmente que a expressão em células caninas exigiria o promotor da Pol I canino. Assim, tendo em conta que teve de ser cultivado um vírus numa linha celular para a qual o promotor endógeno da Pol I não foi caracterizado, foi necessária a utilização de dois tipos de células diferentes para recuperação e crescimento do vírus. No entanto, é desejável evitar a utilização de linhas celulares múltiplas uma vez que esta tem a vantagem de, por exemplo, poderem ser evitadas pressões de selecção de cultura concorrentes. A utilização de uma única linha celular para todos os passos de produção de vacinas também facilita a aprovação regulamentar. Assim, existe uma necessidade contínua na técnica em proporcionar processos alternativos para a prática da genética inversa.

Resumo das Formas de Invenção Preferidas

Os inventores descobriram agora surpreendentemente que é possível dirigir a expressão de um transgene numa célula hospedeira canina com recurso a um promotor da Pol I de primata.

Numa forma de realização, a invenção proporciona uma célula hospedeira canina que expressa um vírus que compreende uma ou mais construções de expressão que codificam uma molécula de ARN virai, em que a expressão de uma molécula ARN a partir da(s) construção(ões) é controlada por um promotor da Pol I de primata. Estas células hospedeiras podem ser utilizadas em sistemas de expressão da presente invenção.

Numa forma de realização adicional, a invenção proporciona um método para produzir um vírus recombinante, sendo o vírus produzido com recurso a uma célula hospedeira da invenção. A invenção também proporciona um método de preparação de um vírus (por exemplo, para a formulação de uma vacina), que compreende os passos de (i) produção de um vírus 3 recombinante utilizando uma célula hospedeira da invenção, (ii) a infecção de um hospedeiro da cultura com o vírus obtido no passo (i), (iii) a cultura do hospedeiro da cultura do passo (ii) a fim de produzir o vírus; e (iv) a purificação do vírus obtido no passo (iii). Para fornecer um método de preparação de uma vacina, o método pode então incluir o passo adicional de (v) a formulação do vírus numa vacina.

Além do(s) promotor (es) da Pol I não endógenos, que são introduzidos como discutido acima, a célula hospedeira irá incluir promotores da Pol I endógenos. 0(s) promotor(es) não-endógeno(s) da Pol I dirige(m) a expressão do ARN não-endógeno, em particular o ARN virai, na célula. Assim, a invenção proporciona uma célula com pelo menos um promotor endógeno da Pol I que controla a expressão do rRNA endógeno e pelo menos um promotor não-endógeno da Pol I que controla a expressão de um ARN virai ou o seu complemento. Construções de expressão

Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que é possível dirigir a expressão do ARN numa célula com recurso a um promotor da Pol I a partir de um organismo que se encontra numa ordem taxonómica diferente da célula. Assim, o promotor da Pol I não é endógeno a um organismo da mesma ordem taxonómica da qual a célula é derivada. 0 termo "ordem" refere-se à classificação taxonómica convencional, e exemplos dessas ordens são os primatas, os roedores, os carnívoros, os marsupiais, os cetáceos, etc.

Os humanos e os chimpanzés estão na mesma ordem taxonómica (primatas), mas os seres humanos e os cães estão em ordens diferentes (primatas vs. carnívoros).

Assim, num primeiro aspecto, a invenção proporciona uma célula hospedeira canina que compreende uma ou mais construções de expressão, sendo que a expressão de uma molécula de ARN da construção(ções) é dirigida por um promotor da Pol I primata. 4

Numa forma de realização preferida, o promotor da Pol I é um promotor humano e a célula hospedeira é uma célula de canino (por exemplo,uma célula MDCK). Esta forma de realização é preferível uma vez que o promotor da Pol I humano encontra-se bem caracterizado e as células caninas são frequentemente utilizadas para a produção de vacinas.

As construções de expressão utilizadas nas células hospedeiras podem ser construções de expressão unidireccionais ou bidireccionais. Quando uma célula hospedeira expressa mais do que um transgene (quer nas construções de expressão iguais ou diferentes), é possível usar expressões unidireccionais e/ou bidireccionais.

As construções de expressão bidireccionais contêm pelo menos dois promotores que dirigem a expressão em direcções diferentes (isto é, tanto 5' para 3' e 3' para 5') a partir da mesma construção. Pelo menos um dos promotores é um promotor da Pol I não endógeno tal como aqui discutido. Os dois promotores podem estar operacionalmente ligados a diferentes vertentes do mesmo ADN de cadeia dupla. De preferência, um dos promotores é um promotor da Pol I não-endógeno e pelo menos um dos outros promotores é um promotor da Pol II. Isto é útil uma vez que o promotor da Pol I pode ser usado para expressar CRNAs que não têm uma estrutura cap, enquanto que o promotor da Pol II pode ser utilizado para transcrever mRNAs que podem ser subsequentemente traduzidos em proteínas, permitindo assim a expressão simultânea do ARN e da proteína a partir da mesma construção. 0 promotor da Pol II pode ser endógeno ou não-endógeno. Um vez que mais do que uma construção de expressão é utilizada dentro de um sistema de expressão, os promotores podem ser uma mistura de promotores endógenos e não- endógenos, desde que pelo menos um dos promotores seja um promotor da Pol I não-endógeno que possa dirigir a expressão na célula hospedeira . A construção de expressão inclui normalmente uma 5 sequência de terminação da transcrição do ARN. A sequência de terminação pode ser uma sequência de terminação endógena ou uma sequência de terminação que não seja endógena para a célula hospedeira. As sequências de terminação adequadas serão evidentes para os especialistas na área e incluem, mas não estão limitados a, a sequência de terminação da transcrição do ARN da polimerase I, sequência de terminação da transcrição do ARN da polimerase II, e ribozimas. Além disso, as construções de expressão podem conter um ou mais sinais de poliadenilação para os mRNAs, particularmente na extremidade de um gene cuja expressão é controlada por um promotor da Pol II.

Um sistema de expressão pode conter pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze ou, pelo menos doze construções de expressão. Uma construção de expressão pode ser um vector, tal como um plasmideo ou outra construção episomal. Esses vectores compreenderão tipicamente pelo menos uma origem bacteriana e/ou eucariótica de replicação. Além disso, o vector pode compreender um marcador seleccionável que permite a selecção de células procarióticas e/ou eucarióticas. Exemplos desses marcadores seleccionáveis são os genes que conferem resistência a antibióticos, tais como a ampicilina ou a canamicina. 0 vector pode ainda compreender um ou mais locais de clonagem múltipla para facilitar a clonagem de uma sequência do ADN. Como alternativa, uma construção de expressão pode ser uma construção de expressão linear. Essas construções de expressão lineares não irão tipicamente conter quaisquer sequências de amplificação e/ou de selecção. No entanto, podem também ser utilizadas construções lineares que contenham essas sequências de amplificação e/ou de selecção. Um exemplo de um método com recurso a essas construções de expressão lineares para a expressão do vírus 6 da gripe encontra-se descrito na referência 4.

As construções de expressão podem ser geradas com recurso a métodos conhecidos nesta área. Esses métodos foram descritos, por exemplo, na referência 5. Sendo que a construção de expressão é uma construção de expressão linear, é possível linearizá-la antes da sua introdução na célula hospedeira utilizando um único local de enzima de restrição. Em alternativa, é possível excisar a construção de expressão de um vector utilizando pelo menos dois locais de enzimas de restrição. Além disso, também é possível obter uma construção de expressão linear, amplificando-a com recurso a uma técnica de amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, por PCR).

As construções de expressão podem ser introduzidas nas células hospedeiras com recurso a ténica conhecida dos especialistas na área, as construções de expressão podem ser introduzidas nas células hospedeiras através de electroporação, DEAE-dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, lipossomas, micro-injecção ou bombardeamento com micropartículas.

Sendo que o hospedeiro da expressão é uma célula canina, como por exemplo uma linha celular MDCK, podem ser optimizadas regiões de codificação de proteínas, usando, por exemplo, um promotor de um gene canino do tipo selvagem ou de um vírus canino, e/ou com uma utilização de codões mais adequados para células caninas do que para células humanas. Por exemplo, enquanto que os genes humanos favorecem ligeiramente o UUC como o codão para a Phe (54%), nas células caninas, a preferência é mais forte (59%). Da mesma forma, considerando que não há preferência maioritária para os codões Ile em células humanas, 53% dos codões caninos usam AUC para Ile. Os vírus caninos, como por exemplo os parvovírus caninos (um vírus ssDNA), podem igualmente proporcionar uma orientação para a optimização de codões, por exemplo 95% de codões da Phe nas sequências 7 dos parvovírus caninos são UUU (vs. 41% no genoma canino), 68% dos codões Ile são AUU (vs. 32%), 46% dos codões Vai são GUU (vs. 14%), 72% dos codões Pro são CCA (vs. 25%), 87% dos codões Tyr são UAU (vs. 40%), 87% dos codões His são CAU (vs. 39%), 92% dos codões Gin são CAA (vs. 25%), 81% dos codões Glu são GAA (vs. 40%), 94% dos codões Cys são UGU (vs. 42%), apenas 1% dos codões Ser são UCU (vs. 24%), o CCC nunca é usado para a Phe e o UAG nunca é usado como codão de terminação. Assim, os genes codificadores de proteinas podem ser feitos mais de genes, cuja natureza foi já optimizada para a expressão em células caninas, facilitando assim a expressão.

Genética reversa

As construções de expressão e as células hospedeiras acima descritas são particularmente adeguadas para a produção de estirpes de virus recombinantes através de técnicas de genética reversa. As técnicas podem ser usadas para a produção de uma grande variedade de virus ARN, incluindo virus ARN de cadeia positiva [6, 7] , virus ARN de cadeia negativa [8,9] e virus ARN de cadeia dupla [10]. Assim, num aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método para a produção de vírus recombinantes, sendo o vírus produzido com recurso a um sistema de expressão como o acima descrito.

[0023] Os sistemas de genética reversa conhecidos envolvem a expressão de moléculas de ADN que codificam as desejadas moléculas do ARN virai (vARN) a partir de promotores da Pol I, promotores do ARN da polimerase bacteriana, promotores da polimerase de bacteriófago, etc. Além disso, sendo que um vírus requer certas proteínas para formar um vírus infeccioso, os sistemas também fornecem estas proteínas, por exemplo, o sistema compreende ainda moléculas de ADN que codificam as proteínas virais, sendo que a expressão de ambos os tipos de ADN conduz à montagem de um vírus infeccioso completo.

Sendo que a genética reversa é usada para a expressão do vRNA, será evidente para o especialista nesta área que o espaçamento preciso dos elementos de sequência com referência uns aos outros é de importância crucial para a polimerase no sentido de iniciar a replicação. Por conseguinte, é importante que a molécula de ADN que codifica o ARN virai esteja posicionado correctamente entre o promotor da Pol I e a sequência de terminação, mas este posicionamento encontra bem dentro das competências de quem trabalha com sistemas de genética reversa.

Geralmente, a genética reversa é adequada para a expressão de qualquer virus conhecidos para a produção de ARN genómico durante o seu ciclo de vida. Esses virus incluem, mas não estão limitados a, a cadeia positiva e o virus ARN de cadeia negativa, como por exemplo os descritos abaixo. Preferencialmente, o virus é um ortomixovirus, por exemplo um virus da gripe. Os métodos da presente invenção são tão adequados para os virus não-segmentados como para os segmentados.

Sendo que o virus é um virus ARN de cadeia positiva, é muitas vezes suficiente transfectar uma célula com uma construção de expressão que compreenda o genoma virai. Por exemplo, a transfecção de plasmídeos contendo o genoma do poliovirus resultou na recuperação de poliovirus infecciosos [6,7] . A genética reversa para virus ARN de cadeia negativa apresentou mais desafios uma vez que o ARN virai antisentido é geralmente não infeccioso e requer uma ARN-polimerase para completar o ciclo de vida. Assim, deve ser proporcionada uma polimerase virai, quer como proteina ou como um gene para a expressão de proteínas in situ.

Sendo que o vírus requer uma proteína para a infecciosidade, é geralmente preferível utilizar construções de expressão bidireccionais, uma vez que estas irão reduzir o número total de construções de expressão requeridas pela célula hospedeira. Assim, o método da 9 presente invenção pode utilizar pelo menos uma expressão bidireccional, sendo que um gene ou a construção ADNc está localizada entre um promotor da Pol II a montante e um promotor da Pol II não-endógeno a jusante. A transcrição do gene ou do cDNA a partir do promotor da Pol II produz mRNA virai de sentido positivo e com uma estrutura cap, que pode ser traduzida numa proteína, ao passo que a transcrição a partir do promotor da Pol I não-endógeno produz um vRNA de sentido negativo. A construção de expressão bidireccional pode ser um vector de expressão bidireccional. A fim de produzir um vírus recombinante, uma célula deve expressar todos os segmentos do genoma virai que são necessários para a montagem de um virião. 0 ADN clonado nas construções de expressão utilizadas na presente invenção, dispões, de preferência, de todos os ARN virais e proteínas, sendo também possível a utilização de um vírus ajudante para proporcionar algum ARN e proteínas, embora sejam preferidos sistemas que não utilizem um vírus auxiliar. Sendo que o vírus é um vírus não-segmentado, isto pode geralmente ser conseguido pela utilização de uma construção de expressão única no método da presente invenção, ainda que esteja também dentro do âmbito da presente invenção expressar o genoma virai de vírus não-segmentados com recurso a mais de uma construção de expressão. Sendo o vírus é um vírus segmentado, o genoma virai é normalmente expresso utilizando mais do que uma construção de expressão no método da invenção. No entanto, está também concebido para combinar um ou mais segmentos ou mesmo todos os segmentos do genoma virai numa única construção de expressão.

Os métodos da presente invenção são particularmente adequados para a produção de estirpes de vírus recombinantes. A técnica pode usar manipulação in vitro de plasmídeos para gerar conjuntos de segmentos virais, para facilitar a manipulação das sequências codificantes ou não- 10 codificantes nos segmentos virais, para introduzir mutações, etc. A utilização do sistema de expressão para a produção de estirpes de virus recombinantes é preferível, pois pode diminuir significativamente o tempo necessário para se obter um virus semente recombinante, o que é particularmente vantajoso em situações em que a produção rápida de vacinas seja necessária para neutralizar uma epidemia. Assim, é preferível que o método deste aspecto da invenção utilize uma ou mais construções de expressão que expressem genes virais a partir de ou derivados de, pelo menos, dois diferentes estirpes do tipo selvagem.

Em algumas formas de realização, será incluída uma construção de expressão que conduza à expressão de uma proteína acessória na célula hospedeira. Por exemplo, pode ser vantajoso expressar uma serina protease não-viral (por exemplo, tripsina) como parte de um sistema de genética reversa.

Sendo que são usadas construções de expressão para a expressão de segmentos virais da gripe A, é possível gerar a construção de expressão introduzindo o segmento virai da gripe A para uma construção de expressão que compreende um marcador de selecção negativa (por exemplo, ccdB) e as terminações do gene do vírus da gripe A altamente conservado [11]. A vantagem é que não necessários locais de restrição e que pode ser clonado qualquer segmento virai da gripe A, desde que possuam terminações que sejam complementares às terminações do gene na construção de expressão. Células A invenção irá normalmente usar uma linha celular canina, embora, por exemplo, possam ser usadas células caninas primárias como uma alternativa. Podem ser usados vários tipos de células, tais como as células de rim, fibroblastos, células retinais, células do pulmão, etc. As células de cão adequadas são, por exemplo, as células de 11 rim, como as linhas celulares CLDK e MDCK.

As células adequadas estão amplamente disponíveis, por exemplo a partir da colecção American Type Culture Cell (ATCC) [16], a partir do Depósito de Células Coriell [17], ou a partir da Colecção Europeia de Culturas de Células (ECACC). Por exemplo, a ATCC fornece células MDCK com o número de catálogo CCL 34.

As células preferidas (particularmente para o crescimento de vírus da gripe) para uso na invenção são células MDCK [18-20], derivadas de rim canino Madin Darby. As células MDCK originais estão disponíveis a partir da ATCC como CCL 34. É preferível o uso de derivados destas células ou de outras células MDCK. Estes derivados foram descritos, por exemplo, na referência 18, que revela células MDCK que foram adaptadas para crescimento em culturas em suspensão ('MDCK 33016' ou '33016-PF', depositados como DSM ACC 2219; ver também a referência 18). Além disso, a referência 21 divulga células derivdas de MDCK que crescem em suspensão num meio sem soro ('B-702', depositadas como FERM BP-7449). Em algumas formas de realização, a linha celular MDCK usada pode ser tumorigénico. Também está previsto o uso de células MDCK não-tumorigénicas. Por exemplo, a referência 22 revela células MDCK não-tumorigénicas, incluindo 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) e 'MDCK -SF103'(ATCC PTA-6503). A referência 23 revela células MDCK com alta susceptibilidade à infecção, incluindo células 'MDCK.5F1'(ATCC CRL 12042). É possível utilizar uma mistura de mais do que um tipo de célula para a prática dos métodos da presente invenção. Contudo, é preferível que os métodos da invenção sejam praticados com um único tipo de célula, como por exemplo com células monoclonais. De preferência, as células utilizadas nos métodos da presente invenção são de uma única linhagem de células. Além disso, pode ser usada a 12 mesma linha celular para salvar o vírus e para qualquer propaqação ulterior do vírus.

Preferencialmente, as células são cultivadas na ausência de soro, para evitar uma fonte comum de contaminantes. São conhecidos, dos especialistas da área, vários meios isentos de soro para cultura de células eucarióticas (por exemplo, meio de Iscove, meio de CHO ultra (BioWhittaker) ou EX-CELL (JRH Biosciences)) . Além disso, pode também ser usado um meio isento de proteína (por exemplo, PF-CHO (JRH Biosciences)). Caso contrário, as células para replicação podem também ser cultivadas nos habituais meios contendo soro (por exemplo, um meio MEM ou DMEM com 0,5% a 10% de soro fetal de vitelo) . [0037] As células podem estar em cultura aderente ou em suspensão. Triagem para linhas de células caninas adequadas

Estão amplamente disponíveis células adequadas para utilização de acordo com a presente invenção. Da mesma forma, é possível rastrear para novas células caninas com recurso a técnicas conhecidas nesta área. Pode ser necessária uma triaqem de células adequadas, por exemplo, quando um novo promotor da Pol I é identificado e onde é desejável encontrar linhas celulares que suportam a expressão pelo novo promotor. Do mesmo modo, quando uma nova célula é isolada, pode ser necessário confirmar que promotores da Pol I podem dirigir a expressão na mesma.

As técnicas adequadas para células de triagem serão evidentes para os especialistas na área. Por exemplo, um gene repórter pode ser clonado sob o controlo do promotor da Pol I de interesse e a construção pode ser transfectada para a linha de células que está a ser rastreada. Nessas experiências, podem ser usadas com controlo as células transfectadas com uma construção, que contém o gene repórter, mas não tem uma sequência de promotores. Assim, sendo que a expressão do gene numa amostra de teste (por exemplo, células que contêm um transgene sob controlo do 13 promotor da Pol I de interesse) é significativamente mais elevada do que a expressão de controlo (por exemplo, células com o mesmo transgene que numa amostra de teste, sendo que o transgene não contém um promotor para dirigir a expressão do transgene), a linha celular é adequada para uso com esse promotor de acordo com a invenção. A expressão do transgene pode ser medida, por exemplo, por transcrição reversa do ARN do transgene e sujeitando o cDNA obtido a PCR em tempo real. Em alternativa, também é possível clonar um gene repórter (por exemplo, GFP, YFP, luc, etc.) na direcção antisentido sob o controlo do promotor da Pol I. A transcrição a partir dessa construção pode então ser transcrita no mRNA por uma polimerase virai e, subsequentemente, ser traduzida numa proteína. Deste modo, qualquer célula que expresse o gene repórter pode ser facilmente identificada pela presença do produto do gene repórter. soro. É, igualmente, possível adaptar as células, nas quais uma Pol I estranha normalmente não iria dirigir a expressão para a obtenção de células, nas quais o promotor da Pol I, pode dirigir conduzir a expressão. Isto pode ser conseguido, por exemplo, submetendo as células a condições de crescimento que normalmente não seriam apropriadas para elas. Por exemplo, uma linha celular, que normalmente cresce apenas de forma aderente, pode ser mantida artificialmente em suspensão e as células, que continuam a crescer sob estas condições, podem ser propagadas adicionalmente. Em alternativa, é possível cultivar células de forma aderente, que normalmente cresceriam em suspensão, por exemplo, por meio de ligação de vasos de cultura de plástico ou de adição de soro à cultura. Da mesma forma, é possível produzir células que normalmente requerem soro para o seu crescimento sob condições isentas de soro, ou, inversamente, expor células que são adaptadas ao crescimento isento de soro para soro. As células 14 seleccionadas podem então ser testadas quanto a actividade do promotor da Pol I, como descrito anteriormente. Os parâmetros de crescimento adequados adicionais que podem ser alterados desta forma serão evidentes para os especialistas da área e incluem, mas não estão limitados a, temperatura, pH, p02, concentração de soro, etc. Além disso, as células podem ser submetidas a tratamentos físicos ou químicos, como radiação UV ou mutágenos químicos. Da mesma forma, é possível rastrear novas propriedades de células que apenas foram passadas sob condições de cultura normais.

Por exemplo, a referência 18 descreve um método, no qual as células MDCK (usualmente aderente) foram adaptadas para crescimento em suspensão sob condições isentas de soro. As células iniciais foram cultivadas num meio isento de soro em garrafas de e sob condições que são normalmente usadas para cultivar células que crescem em suspensão. Após várias passagens sob estas condições selectivas, foram obtidas várias linhas de células que podem crescer em suspensão num meio isento de soro. Um exemplo é a linha celular 33016 (depositada como DSM ACC 2219). Os inventores demonstraram que um promotor da Pol I humano pode dirigir a expressão de um gene repórter nestas células MDCK. Promotores da ARN-polimerase I A maioria dos métodos de genética reversa utiliza vectores de expressão que compreendem um promotor da ARN-polimerase I (RNA pol I)para dirigir a transcrição do ARN genómico virai. O promotor da Pol I proporciona uma transcrição com terminações 5' e 3' que é necessária para a infecciosidade completa de muitos vírus, como por exemplo o da gripe.

Os promotores naturais da Pol I são bipartidos, compreendendo duas regiões distintas: o promotor nuclear e o elemento do promotor a montante (UPE). Embora esta organização geral seja comum para os promotores da Pol I da 15 maioria das espécies, as sequências reais dos promotores variam amplamente. 0 promotor nuclear rodeia o ponto inicial de transcrição, que se estende desde cerca de -45 a +20, e é suficiente para iniciar a transcrição. O promotor nuclear é geralmente rico em GC. Embora o promotor nuclear, por si só, seja suficiente para iniciar a transcrição, a eficiência do promotor é muito aumentada pelo UPE. O UPE tipicamente estende-se desde cerca de -180 a -107 e também é rico em GC. A actividade do promotor pode ser ainda aumentada pela presença de sequências potenciadoras distais, que podem funcionar por meio da estabilização do complexo de pré-iniciação. A sequência do promotor da Pol I foi identificada numa variedade de espécies, incluindo o humano, o cão e a galinha. A invenção usa um promotor da Pol I primata.

As comparações de sequências, in silico ou experimentais, podem ser utilizadas para confirmar o organismo, a partir do qual determinado promotor da Pol I é derivada, por exemplo a Figura 10 mostra um alinhamento dos promotores da Pol canina e humana até ao local de inicio da transcrição, com <60% de identidade da sequência.

As construções de expressão incluem pelo menos um promotor nuclear; incluem também, de preferência, pelo menos um UPE, e podem também incluir um ou mais elementos potenciadores. É também possível o uso de fragmentos de promotores naturais, desde que estes fragmentos possam iniciar a transcrição. Por exemplo, a Figura 3 mostra a sequência do promotor da Pol I canino (SEQ ID NO: 3) e vários fragmentos que são suficientes para dirigir a a expressão de um transgene (ver também a Figura 4 e as SEQ ID N°: 4 e 5). Além disso, a Figura 2 mostra a sequência do promotor da Pol I humano (SEQ ID N° : 1) e um fragmento do mesmo, que por si só é suficiente para a expressão do transgene na célula hospedeira (ver também a Figura 5 e SEQ ID N°: 2). 16

Um promotor da Pol I humano, que pode ser usado de acordo com a invenção, pode compreender a sequência da SEQ ID N° : 1 ou SEQ ID N° : 2, ou uma variante. Sendo que é usado um promotor canino de acordo com a invenção, este pode compreender a sequência da SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 4 ou SEQ ID N°: 5, ou uma variante. 0 promotor da Pol I pode compreender (i) uma sequência com pelo menos uma sequência de identidade p% das SEQ ID N°s: 1 a 5, e/ou (ii) um fragmento de qualquer SEQ ID N°s: 1 a 5, desde que o promotor tenha capacidade para iniciar e dirigir a transcrição de uma sequência de codificação ARN com ligação operativa num célula hospedeira de interesse. 0 valor de p pode ser 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou maior. O fragmento pode, ele próprio, ser de suficiente comprimento para dirigir a expressão (por exemplo, a SEQ ID N° : 4 é um fragmento da SEQ ID N° : 3) ou o fragmento pode ser adicionado a outras sequências e esta combinação irá dirigir a expressão. A capacidade desses promotores da Pol I em dirigirem a expressão numa numa célula hospedeira de interesse pode ser facilmente avaliada, por exemplo com o recurso aos ensaios acima descritos com um gene repórter antisentido sob o controlo do promotor.

Preparação do vírus

Num aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método de preparação de um vírus para a produção de uma vacina, compreendendo os passos de (i) produção de um vírus recombinante conforme aqui descrito, (ii) infecção de um hospedeiro da cultura com o vírus obtido no passo (i), (iii) cultura do hospedeiro a partir do passo (iii) a fim de produzir o vírus; (iv) purificação do vírus obtido no passo (iii) e (opcionalmente) (v) formulação do vírus numa vacina.

[0050] Sendo que as células são utilizadas como hospedeiras da cultura neste aspecto da invenção, é sabido que as condições de cultura das células (por exemplo, temperatura, 17 densidade celular, valor de pH, etc.) são variáveis ao longo de uma ampla gama sujeita à linha de células e aos virus utilizados, e podem ser adaptadas aos requisitos da aplicação. As informações a seguir representam, assim, apenas linhas de orientação.

[0051] Como mencionado acima, as células são de preferência cultivadas num meio isento de soro ou de proteína. [0052] A multiplicação das células pode ser orientada de acordo com métodos conhecidos dos especialistas na área. Por exemplo, as células podem ser cultivadas num sistema de perfusão utilizando métodos de apoio comuns como centrifugação ou filtração. Além disso, as células podem ser multiplicadas de acordo com a invenção num sistema semi-contínuo antes da infecção. No contexto da presente invenção, um sistema de cultura é referido como um sistema semi-contínuo, no qual as células são inicialmente cultivadas num sistema descontínuo e a depleção de nutrientes (ou parte dos nutrientes) no meio é compensada pela alimentação controlada de nutrientes concentrados. Pode ser vantajoso ajustar o valor do pH do meio durante a multiplicação de células antes da infecção a um valor entre pH 6,6 e pH 7,8 e, especialmente, entre um valor entre pH 7,2 e pH 7,3. A cultura de células ocorre, preferencialmente, a uma temperatura entre 30 e 40°C. No passo (iii), as células são, de preferência, cultivadas a uma temperatura compreendida entre 30°C e 36°C ou entre 32°C e 34°C ou a 33°C. Isto é particularmente preferido, quando o método da invenção é utilizado para a produção de vírus da gripe, tal como foi demonstrado que a incubação das células infectadas neste intervalo de temperatura resulta na produção de um vírus que resulta em eficácia melhorada quando formulado numa vacina [24]. [0053] A pressão parcial de oxigénio pode ser ajustada durante a cultura antes da infecção, de preferência a um valor entre 25% e 95% e, especialmente, a um valor entre 35% e 60%. Os valores para a pressão parcial 18 de oxigénio indicados no contexto da presente invenção baseiam-se na saturação do ar. A infecção das células ocorre a uma densidade celular, preferencialmente, de cerca de 8-25xl05 células/mL no sistema descontinuo ou, preferencialmente, de cerca de 5-20x10 6 células/ml no sistema de perfusão. As células podem ser infectadas com uma dose virai (valor MOI, "multiplicidade de infecção"; corresponde ao número de unidades de virus por célula no momento da infecção) entre 1CT8 e 10, de preferência entre 0,0001 e 0,5. O virus pode ser cultivado em células em cultura aderente ou em suspensão. Podem ser usadas culturas microportadoras. Em algumas formas de realização, as células podem, assim, ser adaptadas para crescimento em suspensão.

Os métodos de acordo com a invenção também incluem a colheita e o isolamento dos vírus ou das proteínas por ele gerados. Durante o isolamento dos vírus ou das proteínas, as células são separadas do meio de cultura por métodos padrão como filtração, separação ou ultrafiltração. Os vírus ou as proteínas são, então, concentrados de acordo com métodos suficientemente conhecidos pelos especialistas da área, como por exemplo a centrifugação por gradiente, a filtração, a precipitação, a cromatografia, etc., e, em seguida, purificados. É também preferível, de acordo com a invenção, que os vírus sejam inactivos durante ou após a purificação. A inactivação dos vírus pode ocorrer, por exemplo, por β-propiolactona ou formaldeído, ou em qualquer ponto no processo de purificação.

Os vírus isolados no passo (i) podem, igualmente, ser cultivados em ovos no passo (ii). 0 método padrão actual de crescimento do vírus da gripe para vacinas usa ovos de galinha embrionados SPF, sendo o vírus purificado a partir do conteúdo dos ovos (fluido alantóide). Também é possível a passagem de um vírus através de ovos e, subsequentemente, 19 a propagação do mesmo na cultura de células. Vírus

Os métodos da presente invenção pode ser praticados com qualquer virus que possa ser expresso pela genética reversa numa célula. Esses virus podem ser virus segmentados ou não-segmentados. Além disso, o virus pode ser um virus ARN de cadeia positiva ou um virus de cadeia negativa. Numa forma de realização adicional, o virus pode também ser um virus ARN de cadeia dupla.

Sendo que o virus é um virus ARN de cadeia negativa, o virus pode ser de uma familia seleccionada a partir do grupo constituído por Paramyxoviridae, Pneumovirinae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Bornaviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae ou Are-naviridae. Além disso, o virus pode ser um virus de um género seleccionado a partir do grupo constituído por Paramyxovirus, Orthomyxovirus,

Respirovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, Henipaviras, Avulavirus, Pneumovirus, Metapneumovirus, Ve-siculovirus, Lyssavirus, Ephemerovirus, Cytorhabdovirus,

Nucleorhabdovirus, Novirhabdovirus, Marburgvirus , Ebolavirus, Bornavirus, Influenzavirus A, Influenzavirus B, Influenzavirus C, Thogotovirus, Isavirus, Orthobunyavirus Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus, Tospovirus,

Arenavirus, Ophiovirus, Tenuivirus ou Deltavirus. Em formas de realização específicas, o vírus ARn de cadeia negativa é seleccionado a partir do grupo constituído por os seguintes vírus: vírus Sendai, vírus do sarampo, vírus da papeira, vírus Hendra, vírus da doença de Newcastle, vírus respiratório sincicial humano, pneumovirus aviário, vírus da estomatite vesicular indiana, vírus da raiva, vírus da febre efémera bovina, vírus amarelo necrótico da alface, vírus da batata anã amarela, vírus da necrose hematopética infecciosa , Lago Victoria Marburgvirus, Zaire Ebolavirus, vírus da doença boma, vírus da gripe, Thogotovirus, vírus da anemia infecciosa do salmão, vírus Bunyamwera, vírus 20

Hantaan, vírus Dugbe, vírus da febre do Rift Valley, vírus do bronzeamento do tomateiro, vírus da coriomeningite linfocítica, vírus da tristeza dos citrinos, vírus do arroz listra e vírus da hepatite D. Nas formas de realização preferidas, o vírus é um vírus de da gripe (ver abaixo).

Sendo que o vírus é um vírus ARN de cadeia positiva, o vírus pode ser de uma família seleccionada a partir do grupo constituído por Arteriviridae, Coronaviridae, Picornaviridae e Roniviridae. Além disso, o vírus pode ser um vírus de um género seleccionado a partir do grupo constituído por Arterivirius, Coronavirus, Enterovirus, Torovirus, Okavirus, Rhinovirus, Hepatovirus, Cardiovirus, Aphthovirus, Parechovirus, Erbovirus, Kobuvirus e Teschovirus. Em formas de realização específicas, o vírus é seleccionado a partir do grupo constituído pelo vírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS), do vírus da poliomielite, do enterovirus humano A (HEV-A), do enterovirus humano B (VHE-B), do enterovirus humano C, do enterovirus humano D, da hepatite A e o rinovírus humano A e B.

Sempre que o vírus é um vírus ARN de cadeia dupla, o vírus pode ser de uma família seleccionada a partir do grupo constituído por Binaviridae, Cystoviridae, Hypoviridae, Partitiviridae, Reoviridae e Totiviridae. Além disso, o vírus pode ser um vírus de um género seleccionado a partir do grupo constituído por Aquabirnavirus, Avibirnavirus, Entomobimavirus, Cystovirus, Partitivirus, Alphacryptovirus, Betacryptovirus, Aquareovirus, Coltivirus, Cypovirus, Fijivirus, Idnoreovirus, Mycoreovirus, Orbivirus, Orthoreovirus, Oryzavirus, Phytoreovirus, Rotavirus e Seadornavirus. A presente invenção é particularmente adequada para os vírus que são submetidos a mutação rápida e para situações, nas quais a abordagem recombinante permite um isolamento mais rápido do vírus, que pode então ser adicionalmente 21 propagado para a obtenção de vacinas adequadas. Sendo assim, numa forma de realização preferida, o virus é um vírus da gripe (ver abaixo). Vírus da gripe

Os vírus da gripe são particularmente adequados para utilização nos métodos da presente invenção, em especial os vírus da gripe A e os vírus da gripe B, uma vez que a genética reversa para este vírus está já bem caracterizada. Os vírus da gripe são vírus ARN segmentados de cadeia negativa. Os vírus da gripe A e B têm oito segmentos, enquanto que o vírus da gripe C tem sete. 0 vírus requer pelo menos quatro proteínas virais (PB1, PB2, PA e nucleoproteína) para iniciar a replicação e transcrição. A genética reversa para os vírus da gripe A e B pode ser praticada com 12 plasmídeos para expressar as quatro proteínas necessárias e todos os oito segmentos do genoma. Para reduzir o número de construções, pode, no entanto, ser incluída uma pluralidade de cassetes de transcrição da ARN-polimerase I (para a síntese de ARN virai) num único plasmídeo (por exemplo, as sequências que codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos os 8 segmentos vRNA da gripe), e uma pluralidade de regiões de codificação de proteínas com os promotores da ARN-polimerase II em outro plasmídeo (por exemplo, as sequências que codificam 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 transcrições de mARN da gripe) [25] . Também é possível incluir um ou mais segmentos de vRNA da gripe sob o controlo de um promotor da Pol I e uma ou mais regiões de codificação de proteínas da gripe sob o controlo de um outro promotor, em particular um promotor da Pol II, no mesmo plasmídeo. Como descrito acima, isto é de preferência realizado por meio de plasmídeos bidireccionais. Os aspectos preferidos do método da referência 25 envolvem: (a) regiões de codificação do mRNA PB1, PB2 e PA num único plasmídeo, e (b) todos os 8 segmentos de codificação vRNA num único 22 plasmídeo. Incluir os segmentos da neuraminidase (NA) e da hemaglutinina (HA) num plasmídeo e os outros seis segmentos num outro plasmídeo é particularmente preferível, uma vez que as estirpes do vírus da gripe emergentes possuem normalmente mutações nos segmentos da NA e/ou da HA. Portanto, nesta forma de realização, apenas o vector que compreende a sequência da HA e da NA necessita de ser substituído.

Os sistemas de expressão preferidos para o vírus da gripe A codificam os segmentos do genoma derivados de uma pluralidade de diferentes estirpes do tipo selvagem. 0 sistema pode codificar 1 ou mais (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) segmentos do genoma de uma estirpe PR/8/34 (A/ Puerto Rico/8/34), mas em geral este/estes não incluirão o segmento de PR/8/34 HA e geralmente não incluirão o segmento PR/8/34 NA. Assim, o sistema pode codificar, pelo menos, um dos segmentos de NP, M, NS, PA, PB1 e/ou PB2 (possivelmente todos os seis) de PR/8/34.

Outros sistemas de expressão úteis para os vírus da gripe A podem codificar 1 ou mais (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) segmentos do genoma de um vírus da gripe AA/6/60 (A/Ann/Arbor/6/60) , mas normalmente este/estes não incluirão o segmento AA/6/60 HA e, geralmente, não incluirão o segmento AA/6/60 NA. Assim, o sistema pode codificar, pelo menos, um dos segmentos NP, M, NS, PA, PBl e/ou PB2 (possivelmente todos os seis) de AA/6/60. 0 sistema pode codificar 1 ou mais segmentos do genoma de uma estirpe de A/California/4/09, por exemplo, o segmento da HA e/ou o segmento da NA. Assim, por exemplo, o segmento do genoma HA pode codificar uma hemaglutinina Hl, que está mais relacionada com a SEQ ID N°: 6 que com a SEQ ID N° : 7 (i.e., tem uma identidade de sequência de maior grau, quando comparada com a SEQ ID N°: 6 do que com a SEQ ID N° : 7, utilizando o mesmo algoritmo e parâmetros). SEQ ID N°s: 6 e 7 são 80% idênticas. 23

Do mesmo modo, o genoma da NA pode codificar uma neuraminidase NI que está mais estreitamente relacionada com a SEQ ID N°: 8 do que com a SEQ ID N°: 9. SEQ ID N°s: 8 e 9 são 82% idênticas.

Os sistemas de expressão para os vírus da gripe B pode codificar segmentos do genoma derivados de uma pluralidade de diferentes estirpes do tipo selvagem. 0 sistema pode codificar 1 ou mais (por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 ou 6) a partir de segmentos de genoma de um vírus da gripe AA/1/66 (B/Ann Arbor/1/66), mas em geral este/estes não incluirão o segmento AA/1/66 HA, e geralmente não incluirão o segmento AA/1/66 NA. Assim, o sistema pode codificar, pelo menos, um dos segmentos de NP, M, NS, PA, PBl e/ou a partir da AA/1/66 PB2.

Os segmentos e sequências virais das estirpes A/PR/8/34, AA/6/60, AA/1/66, A/Chile/1/83 e A/California/04/09 estão amplamente disponíveis. As suas sequências estão disponíveis nos bancos de dados público, por exemplo GI: 89779337, GI: 89779334, GI:89779332, GI:89779320, GI:89779327, GI:89779325, GI:89779322, GI:89779329.

Um sistema de genética inversa para vírus da gripe pode incluir uma construção de expressão que conduz a expressão de uma proteína acessória na célula hospedeira. Isto pode, por exemplo, ser vantajoso para expressar uma serina protease não-viral (por exemplo, a tripsina).

Vacina O método do terceiro aspecto da presente invenção utiliza vírus produzidos de acordo com o método para a produção de vacinas.

As vacinas (particularmente para o vírus da gripe) são geralmente baseadas tanto em vírus vivos ou em vírus inactivos. As vacinas inactivadas podem ser baseadas em viriões inteiros, viriões "fragmentados" ou antígenos purificados em superfície. Os antígenos podem também ser apresentados sob a forma de virossomas. A invenção pode ser utilizada para a produção de qualquer um destes tipos de vacina.

Sendo que é utilizado um virus inactivado, a vacina pode compreender um virião inteiro, um virião fragmentado ou antígenos purificados em superfície (para a gripe, incluindo a hemaglutinina e, normalmente, também incluindo a neuraminidase). Os meios químicos para a inactivação de um vírus incluem o tratamento com uma quantidade eficaz de um ou mais dos seguintes agentes: detergentes, formaldeído, β-propiolactona, azul de metileno, psoraleno, carboxifullereno (C60), etilamina binária, etilenoimina de acetilo ou respectivas combinações. Os métodos não químicos de inactivação virai são conhecidos da área, como, por exemplo, radiação UV ou gamma.

Os viriões podem ser colhidos a partir de fluidos que contenham o vírus, como, por exemplo, supernadantes de fluido alantóico ou da cultura de células, através de vários métodos. Por exemplo, um processo de purificação pode envolver a centrifugação zonal utilizando uma solução gradiente linear de sacarose, que inclui detergente para romper os viriões. Os antígenos podem ser então purificados, após a diluição opcional, por diafiltração.

Os viriões fragmentados são obtidos através do tratamento de virões purificadoss com detergentes (por exemplo, éter etílico, polissorbato 80, desoxi-colato, tri-N-butil-fosfato, Triton X-100, Triton N101, brometo de cetiltrimetilamónio, Tergitol NP9, etc.) para produzir preparações de subviriões, incluindo o processo de fragmentação 'Tween-éter'. Os métodos de fragmentação do vírus da gripe, por exemplo, são bem conhecidos nesta área, ver, por exemplo referências 26-31, etc. A fragmentação do vírus é normalmente realizada por meio da interrupção ou fragmentação do vírus inteiro, seja infeccioso ou não-infeccioso, com uma concentração de de interrupção de um 25 agente de fragmentação. A interrupção resulta numa solubilização completa ou parcial das proteínas do vírus, alterando a integridade do vírus. Os agentes de fragmentação preferidos são surfactantes não-iónicos e iónicos (por exemplo, catiónicos), por exemplo alquilglicósidos, alquiltioglicósidos, acil-açúcares, sulfobetaínas, betaínas, éteres alquílicos de polioxietileno, N, N-dialquil-glucamidas, Hecameg, alquilfenoxi-polietoxietanóis, NP9, compostos de amónio quaternário, sarcosilo, CTABs (cetil trimetil amónio brometos), tri-N-butil-fosfato, Cetavlon, sais de myristilt-rimetilamónio, lipofectina, lipofectamina, e DOT-MA, os polioxietanóis octil-ou nonilfenoxi (por exemplo, os surfactantes Triton, como o Triton X-100 ou o Triton N101), ésteres de polioxietileno-sorbitano (os surfactantes Tween), éteres de polioxietileno, etc. Um procedimento útil de fragmentação utiliza os efeitos consecutivos do desoxicolato de sódio e do formaldeído, e a fragmentação pode ocorrer durante a purificação inicial do virião (por exemplo, numa solução com gradiente de densidade de sacarose. Assim, um processo de fragmentação pode envolver a clarificação do material contendo viriões (para remover material não-viriãol), a concentração dos viriões colhidos (por exemplo, com recurso a um método de adsorção, como a adsorção de CaHP04), a separação dos virões inteiros do material não-virão, a separação de viriões utilizando uma fase de centrifugação num gradiente de densidade (por exemplo, com recurso a um gradiente de sacarose que contém um agente de fragmentação, como o desoxicolato de sódio), e depois a filtração (por exemplo, a ultrafiltração) para remover os materiais indesejados. A fragmentação de viriões podem ser utilmente ressuspensa numa solução de cloreto de sódio isotónica com tampão de fosfato de sódio. Examplos de vacinas da gripe fragmentadas são os produtos BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ e FLUSHIELD™. 26 0 método da invenção pode também ser utilizado para produzir vacinas vivas. Essas vacinas são normalmente preparadas através da purificação de virões a partir de fluidos contendo viriões. Por exemplo, os fluidos podem ser clarificados por centrifugação, e estabilizados com tampão (por exemplo, contendo sacarose, fosfato de potássio e glutamato de monossódio). Estão disponíveis actualmente várias formas de vacina contra o vírus da gripe (por exemplo, ver os capítulos 17 e 18 da referência 32). As vacinas dos vírus vivos incluem o produto FLUMIST™ da Medlm-mune(vacina do vírus vivo trivalente).

As vacinas purificadas de antígenos de superfície do vírus da gripe compreendem hemaglutinina de antígenos de superfície e, normalmente, também neuraminidase. Os processos para preparação destas proteínas na forma purificada são bem conhecidas nesta área. Os produtos FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ e INFLUVAC™ são vacinas de subunidades da gripe.

Uma outra forma do antígeno inactivo é o virossoma [33] (partículas de lipossomas semelhantes a vírus e isentas de ácido nucleico). Os virossomas podem ser preparados por solubilização do vírus com um detergente, seguida da remoção do nucleocapsídeo e da reconstituição da membrana que contém as glicoproteínas virais. Um método alternativo para a preparação de virossomas envolve a adição de membraneglicoproteínas virais em quantidades excessivas de fosfolípidos, para proporcionar lipossomas com proteínas virais na sua membrana. 0 vírus pode ser atenuado. 0 vírus pode ser sensível à temperatura. 0 vírus pode ser adaptado ao frio. Estas três características são particularmente úteis quando se utiliza o vírus vivo como um antígeno. A HA é o principal imunogénio nas actuais vacinas de gripe inactivadas, e as doses de vacina são normalizadas por referência aos níveis de HA, normalmente medidos por 27 SRID. As vacinas existentes contêm tipicamente cerca de 15mg de HA por estirpe, embora possam ser usadas doses mais baixas, por exemplo, para as crianças, ou em situações de pandemia, ou quando for usado um adjuvante. Foram usadas doses fraccionadas como © (i.e. 7,5mg de HA por estirpe), assim como doses mais elevadas (por exemplo, doses 3x ou 9x [34,35]). Assim, as vacinas podem incluir entre 0,1 e 150mg de HA por estirpe de gripe, preferencialmente entre 0,1 e 50mg, por exemplo 0,l-20mg, 0,l-15mg, 0,l-10mg, 0,l-7,5mg, 0,5-5mg, etc. Determinadas doses incluem, por exemplo cerca de 45, cerca de 30, cerca de 15, cerca de 10, cerca de 7, 5, cerca de 5, cerca de 3,8, cerca de 3,75, cerca de 1, 9, cerca de 1,5, etc. por estirpe. Para as vacinas vivas, a dosagem é medida pela dose infecciosa média da cultura de tecido (TCID50) em vez do teor de HA, e é tipico um TCID50 de entre 106 e 108 (de preferência entre 106'5-107'5) por estirpe.

As estirpes da gripe usadas com a invenção podem ter uma HA natural, como a encontrada num virus do tipo selvagem, ou numa HA modificada. Por exemplo, sabe-se que modifica a HA para remover determinantes (por exemplo, em regiões hiper-básicas em torno do local de clivagem HA1/HA2) que fazem com que um vírus seja altamente patogénico em espécies de aves. O uso da genética reversa facilita essas modificações.

As estirpes do vírus da gripe para uso em vacinas mudam de estação para estação. Em períodos interpandémicos, as vacinas normalmente incluem duas estirpes da gripe A (HlNl e H3N2) e uma estirpe da gripe B, sendo típicas vacinas trivalentes. A invenção pode também utilizar estirpes virais pandémicas (ou seja, estirpes em que o receptor da vacina e a população humana em geral são imunologicamente naives, em particular do vírus da gripe A), como as estirpes dos subtipos H2, H5, H7 ou H9, e as vacinas da gripe de estirpes pandémicas podem ser 28 monovalentes ou podem basear-se numa vacina trivalente normal, suplementada por uma estirpe pandémica. Dependendo da estação e da natureza do antigeno incluído na vacina, a invenção pode proteger contra um ou mais dos subtipos de HÁ: Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H 13, H 14, Hl5 ou H16. A invenção pode proteger contra um ou mais dos subtipos de NA do vírus da gripe A: Nl, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 OU N9.

Para além de ser adequado para a imunização contra as estirpes interpandémicas, as composições são particularmente úteis para a imunização contra estirpes pandémicas ou potencialmente pandémicas. As características de uma estirpe da gripe que lhe proporcionam o potencial de causar uma pandemia são: (a) contém a nova hemaglutinina em comparação com as hemaglutininas nas estirpes humanas actualmente em circulação, i.e. aquela que não tenha sido evidente na população humana durante mais de uma década (por exemplo, H2), ou que não tenha sido anteriormente observada em todos na população humana (por exemplo, H5, H6 ou H9, que foram geralmente encontradas somente em populações de aves), aquela a que a população humana é imunologicamente naíve à hemaglutinina da estirpe, (b) é capaz de ser transmitida horizontalmente na população humana, e (c) é patogénica para o ser humano. Um vírus do tipo hemaglutinina H5 é o preferido para a imunização contra a gripe pandémica, como a estirpe H5N1. Outras estirpes possíveis incluem a H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 e H7N7, e quaisquer outras estirpes pandémicas potecialmente emergentes. A invenção é particularmente adequada para a protecção contra estirpes de vírus potencialmente pandémicas que podem se espalhar (ou se espalharam) de uma população animal não-humana para os seres humanos, por exemplo, uma estirpe da gripe H1N1 de origem suína. A invenção é, em seguida, adequada para a vacinação de seres humanos, bem como de animais não-humanos. 29

Outras estirpes, cujos antígenos podem, de forma útil, ser incluídas nas composições são as estirpes resistentes à terapia antiviral (por exemplo, resistentes ao oseltamivir [36] e/ou ao zanamivir), incluindo estirpes pandémicas resistentes [37] .

As composições podem incluir antígeno(s) a partir de uma ou mais (por ex. 1, 2, 3, 4 ou mais) estirpes do vírus da gripe, incluindo o vírus da gripe A e/ou o vírus da gripe B. Sendo que uma vacina inclui mais de uma estirpe da gripe, as diferentes estirpes são normalmente cultivadas em separado e misturadas após o vírus ter sido colhido e os antígenos preparados. Assim, um processo da presente invenção pode incluir o passo de mistura de antígenos a partir de mais do que uma estirpe da gripe. É comum uma vacina trivalente, incluindo antígenos de duas estirpes do vírus da gripe A e uma estirpe do vírus da gripe B. Uma vacina tetravalente é também útil [38], incluindo antígenos de duas estirpes do vírus da gripe A e duas estirpes do vírus da gripe B, ou três estirpes do vírus da gripe A e uma estirpe do vírus da gripe B.

Composições farmacêuticas

As composições da vacina produzidas de acordo com a presente invenção são farmaceuticamente aceitáveis. Geralmente incluem componentes para além dos antígenos, por exemplo, incluem tipicamente um ou mais veículos e/ou excipientes farmacêuticos. Como descrito abaixo, podem também ser incluídos adjunvantes. Uma discussão completa desses componentes está disponível na referência 39.

As composições da vacina estarão geralmente na forma aquosa. No entanto, algumas vacinas podem estar na forma seca, por exemplo na forma de sólidos injectáveis ou de preparações secas ou polimerizadas sobre um adesivo.

As composições da vacina podem incluir conservantes como tiomersal ou 2-fenoxietanol. É, no entanto, preferível que a vacina se encontre substancialmente isenta de (ou 30 seja, menos de 5mg/ml) material mercurial, por exemplo livre de tiomersal [30,40]. São preferidas as vacinas que não contenham mercúrio. Pode ser incluido, como alternativa aos compostos de mercúrio, α-tocoferol succinato [30]. São preferidas as vacinas livres de conservantes.

Para controlar a tonicidade, é preferível incluir um sal fisiológico, como um sal de sódio. É preferível cloreto de sódio (NaCl), que pode estar presente entre 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem o cloreto de potássio, o di-hidrogenofosfato de potássio, o fosfato dissódico desidratado, o cloreto de magnésio, o cloreto de cálcio, etc.

As composições da vacina terão geralmente uma osmolalidade entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, de preferência entre 240-360 mOsm/kg, e mais preferivelmente dentro do intervalo de 290-310 mOsm/kg. A osmolalidade foi previamente relatada por não ter qualquer impacto sobre a dor causada pela vacinação [41], mas é preferível, no entanto, manter a osmolalidade nesse intervalo.

As composições da vacina podem incluir um ou mais tampões. Os tampões típicos incluem: um tampão de fosfato; um tampão de Tris; um tampão de borato; um tampão de succinato; um tampão de histidina (em particular, com um adjuvante de hidróxido de alumínio); ou um tampão de citrato. Os tampões serão tipicamente incluídos na gama de 5-20 mM. O pH de uma composição da vacina será geralmente entre 5,0 e 8,1, e mais tipicamente entre 6,0 e 8,0, por exemplo. 6,5 e 7,5, ou entre 7,0 e 7,8. Um processo da presente invenção pode, portanto, incluir um passo de ajuste do pH da vacina a granel antes da embalagem.

Preferencialmente, a composição de vacina é estéril. A composição da vacina é de preferência não-pirogénica, por exemplo, contendo <1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose, e de preferência <0,1 EU por dose. A 31 composição da vacina é de preferência livre de glúten.

As composições da vacina podem incluir, por exemplo surfactantes de éster de sorbitano de polixietileno (conhecidos como "Tweens"), um octoxinol (por exemplo, octoxinol-9 (Triton X-100) ou t- octilfenoxipolietoxietanol) , um brometo de amónio de cetil trimetil ('CTAB'), ou desoxicolato de sódio, em especial para uma fragmentação ou uma vacina do antígeno de superfície. 0 detergente pode estar presente apenas em guantidades vestigiais. Assim, a vacina pode incluir menos de lmg/ml de octoxinol-10 e polissorbato 80. Outros componentes residuais em quantidades vestigiais podem ser antibióticos (por exemplo, Neomicina, canamicina, polimixina B).

Uma composição da vacina pode incluir material para uma única imunização, ou pode incluir material para múltiplas imunizações (ou seja, um kit de 'multidose'). A inclusão de um agente de conservação é preferível em regimes de doses múltiplas. Como alternativa (ou adicionalmente) a inclusão de um conservante em composições multidose, as composições podem estar contidas num recipiente que tem um adaptador asséptico para a remoção de material.

As vacinas antigripais são tipicamente administradas num volume de dosagem de cerca de 0,5 ml, apesar de poder ser administrada, em crianças, metade da dosagem (isto é, cerca de 0,25mL).

As composições e os kits são preferencialmente armazenados entre 2°C e 8°C. Devem ser congeladas. Devem estar idealmente longe da luz solar directa.

Célula hospedeira do ADN

Sendo que o vírus foi isolado e/ou cultivado numa linha celular, é prática padrão minimizar a quantidade de ADN da linha celular residual na vacina final, no sentido de minimizar qualquer actividade oncogénica do ADN. 32

Assim, as composições da vacina preparada de acordo com a presente invenção contêm preferencialmente menos de lOng (preferencialmente menos de lng, e mais preferencialmente menos de 100 pg) do ADN da célula hospedeira residual por dose, embora possam estar presentes quantidades vestigiais. É preferível que o comprimento médio de qualquer ADN da célula hospedeira residual seja de menos de 500bp, por exemplo 400bp, menos de 300bp, menos de 200bp, menos de lOObp, etc. O ADN contaminante pode ser removido durante a preparação da vacina com recurso a procedimentos padrão de purificação, por exemplo cromatografia, etc. A remoção do ADN da célula hospedeira residual pode ser melhorada por tratamento de nuclease, por exemplo com recurso a DNase.

Um método conveniente para a redução da contaminação do ADN da célula hospedeira é descrito nas referências 42 e 43, envolvendo um tratamento de duas etapas, primeiro usando um DNase (por exemplo, Benzonase) , que pode ser usado durante o crescimento virai, e, em seguida, um detergente catiónico (por exemplo, CTAB), que pode ser usado durante a interrupção virai. O tratamento com um agente de alquilação, como β-propiolactona, também pode ser usado para remover o ADN da célula hospedeira, e, vantajosamente, pode ser utilizado para inactivar os viriões [44]. Adjuvantes

As composições podem, vantajosamente, incluir um adjuvante, que pode funcionar de modo a aumentar as respostas imunes (humoral e/ou celular) suscitadas num sujeito que recebe a composição. Os adjuvantes preferidos incluem emulsões óleo-em-água. São conhecidos vários adjuvantes, e estes incluem tipicamente pelo menos um óleo e pelo menos um surfactante, sendo o(s) óleo(s) e surfactante(s) biodegradáveis (metabolizáveis) e biocompatíveis. As gotículas de óleo na emulsão têm 33 geralmente menos de 5mm de diâmetro, e de preferência um diâmetro submicrónicas, sendo estas pequenas dimensões alcançadas com um microfluidizer para proporcionar emulsões estáveis. São preferíveis gotículas com um tamanho inferior a 220nm, uma vez que estas podem ser submetidas a esterilização de filtragem. A emulsão pode compreender óleos como os de origem animal (como peixe) ou de origem vegetal. As fontes de óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos. 0 óleo de amendoim, o óleo de soja, o óleo de coco e o azeite de oliva, os mais comummente disponíveis, são exemplos dos óleos de frutos secos. 0 óleo de jojoba pode ser utilizado, por exemplo a partir do feijão de jojoba. Os óleos de sementes incluem óleo de cártamo, óleo de semente de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de sementes de sésamo e semelhantes. No grupo dos grãos, o óleo de milho é o mais facilmente disponíveis, mas o óleo de outros grãos de cereais, como o trigo, aveia, centeio, arroz, teff, triticale e outros semelhantes também podem ser usados. Os ésteres de ácidos gordos de carbono 6-10 de glicerol e 1,2-propanodiol, embora não ocorram naturalmente em óleos de sementes, podem ser preparados por hidrólise, separação e esterificação dos materiais adequados com origem nos óleos de nozes e de sementes. As gorduras e os óleos do leite de mamíferos são metabolizáveis e podem, portanto, ser utilizados na prática da presente invenção. Os procedimentos para separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para a obtenção de óleos puros de origem animal são bem conhecidos nesta área. A maior parte dos peixes contém óleos metabolizáveis que podem ser rapidamente recuperados. Por exemplo, o óleo de fígado de bacalhau, os óleos de fígado de tubarão e o óleo de baleia como espermacete exemplificam vários dos óleos de peixe que podem ser usados aqui. Uma série de óleos de cadeia ramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades de 34 isopreno de carbono 5 e são geralmente referidos como terpenóides. 0 óleo de fígado de tubarão contém terpenóides insaturados e ramificados conhecidos como esgualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaene, que é particularmente preferido aqui. O esqualano, o análogo saturado de esqualeno, também é um óleo preferido. Os óleos de peixe, incluindo o esqualeno e o esqualano, estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodos conhecidos na área.

Podem ser usadas misturas de óleos.

Os surfactantes podem ser classificados pelo seu 'HLB' (equilíbrio hidrófilo/lipófilo). Os surfactantes preferidos têm um HLB de pelo menos 10, de preferência pelo menos 15, e mais preferivelmente pelo menos 16. A invenção pode ser utilizada com surfactantes incluindo, mas não se limitando a: surfactantes de ésteres de sorbitano de polioxietileno (geralmente referidos como os Tweens), especialmente polisorbato 20 e polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) e/ou óxido de butileno (BO), vendidos sob o nome comercial DOWFAX™, como copolímeros lineares de blovo EO/PO; octoxinóis, que podem variar no número de repetição de grupos de etoxi (oxi-1,2-etanodiilo), com octoxinol-9 (Triton X-100, ou t-octilfenoxipolietox ietanol), sendo de particular interesse; (octilfenoxi) polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, como a série Tergitol NP™; éteres gordos de polioxietileno derivados de lauril, cetil, estearil e álcoois de oleil (conhecidos como surfactantes de Brij), como o éter de trietilenoglicol monolauril (Brij 30); e ésteres de sorbitano (comummente conhecidos como os Spans), como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolauratos de sorbitano. Os tensioactivos não iónicos são os preferidos. São preferidos surfactantes não-iónicos. Os surfactantes preferidos para incluir na emulsão são os 35 seguintes: Tween 80 (monoestearato de polioxietileno sorbitano), Span 85 (sorbitano trioleato), lecitina e Triton X-100.

Podem ser usadas misturas de surfactantes, por exemplo misturas Tween 80/Span 85. É também adequada uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitano, como monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80) e um octoxinol, como t-octilfenoxipol ietoxietanol-(Triton X-100). Uma outra combinação útil inclui laureth 9 mais um éster de polioxietileno-sorbitano e/ou um octoxinol.

As quantidades preferidas de surfactantes (% em peso) são: ésteres de polioxietileno-sorbitano (por exemplo, Tween 80) 0,01 a 1%, em particular cerca de 0,1%; polioxietanóis octil-ou nonilfenoxi (como Triton X-100, ou outros detergentes na série Triton) 0,001% a 0,1%, em particular 0,005-, 02%; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) 0,1 a 20%, de preferência 0,1 a 10% e em particular 0,1 a 1% ou cerca de 0,5%.

Sendo que a vacina contém um vírus fragmentado, é preferível que contenha surfactante livre na fase aquosa. Isto é vantajoso, uma vez que o surfactante livre pode exercer um 'efeito de fragmentação' do antígeno, interrompendo assim qualquer virão não-fragmentado e/ou agregados de viriões que, de outra forma, poderiam estar presentes. Isto pode melhorar a segurança de vacinas de vírus fragmentados [45]. São preferíveis emulsões que tenham gotas de dimensão média de <lmm, por exemplo, <750nm, <500nm, <400nm, <300nm, <250nm, ^220nm, <200nm ou menor. Estas dimensões de gotas podem, de forma conveniente, ser atingidas através de técnicas como a microfluidização.

Os adjuvantes específicos de óleo-em-água da emulsão úteis com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a: • A emulsão submicrónica de esqualeno, Tween 80, Span 85 e. 36 A composição da emulsão, em volume, pode ser de cerca de 5% de esqualeno, cerca de 0,5% de polissorbato 80 e cerca de 0,5% de Span 85. Em termos de peso, essas proporções são 4,3% de esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 e 0,48% de Span 85. Este adjuvante é conhecido como 'MF59' [46-48], como descrito em mais pormenor no capítulo 10 da referência 49 e capítulo 12 da referência. A emulsão MF59 inclui, vantajosamente, iões de citrato, por exemplo um tampão de citrato de sódio de lOmM. • Uma emulsão de esqualeno, DL-a-tocoferol e polissorbato 80 (Tween 80) . A emulsão pode incluir uma solução salina tamponada com fosfato. Também pode incluir Span 85 (por exemplo, a 1%) e/ou lecitina. Estas emulsões podem ter de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de tocoferol e de 0,3 a 3% de Tween 80, e a proporção de peso de esqualeno:tocoferol é preferencialmente ^1 uma vez que esta proporciona uma emulsão mais estável. Podem estar presentes esqualeno e Tween 80 na proporção de volume de cerca de cerca de 5:02, ou numa proporção de peso de cerca de 11:5. Uma emulsão dessas pode ser feita através da dissolução de Tween 80 em PBS para proporcionar uma solução a 2%, misturando, de seguida, 90 ml desta solução com uma mistura de (5g de DL-cx-tocoferol e 5ml de esqualeno) , e microfluidizando, de seguida, a mistura. A emulsão resultante pode ter gotículas submicrométricas de óleo, por exemplo com um diâmetro médio de 100 a 250nm, de preferência cerca de 180 nm. A emulsão pode também incluir um 3-de-O-acilado monofosforil lípido A (3D-MPL). Outra emulsão útil deste tipo pode compreender, por dose humana, 0,5-10mg de esqualeno, 0,5-llmg de tocoferol e 0,1-4 mg de polissorbato 80 [51]. • Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão pode também incluir um 3d-MPL (ver abaixo). A emulsão pode conter um tampão de fosfato. • Uma emulsão compreendendo um polisorbato (por exemplo, 37 polissorbato 80), um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, α-tocoferol succinato). A emulsão pode incluir estes três componentes numa proporção de massa de cerca de 75: 11:10 (por exemplo, 750mg/ml de polissorbato 80, llOmg/ml de Triton X-100 e lOOmg/ml α-tocoferol succinato), e as concentrações utilizadas devem incluir gualquer contribuição destes componentes a partir de antigenos. A emulsão pode também incluir esqualeno. A emulsão pode também incluir um 3d-MPL (ver abaixo) . A fase aquosa pode conter um tampão de fosfato. • Uma emulsão de esqualano, polissorbato 80 e poloxamer 401 ('Pluronic™ L121'). A emulsão pode ser formulada numa solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4. Esta emulsão é um veículo útil para a administração de dipéptidos de muramil, e tem sido utilizada com treonil-MDP no adjuvante 'SAF-1' [52] (0,05-1% de Thr-MDP, 5% de esqualano, 2,5% de Pluronic L121 e 0,2% de polissorbato 80). Também pode ser utilizada sem o Thr-MDP, como no adjuvante 'AF' [53] (5% de esqualano, 1,25% de Pluronic L121 e 0,2% de polissorbato 80). É preferível a microfluidização. • Uma emulsão compreendendo esqualeno, um solvente aquoso, um surfactante não-iónico hidrófilo de polioxietileno alquil éter (por exemplo, polioxietileno (12) éter cetostearilico) e surfactante não-iónico hidrófobo (por exemplo, éster de sorbitano ou um éster de mannide, como monoleato de sorbitano ou 'Span 80'). A emulsão é preferencialmente termorreversível e/ou tem, pelo menos, 90% das gotículas de óleo (por volume) com uma dimensão inferior a 200nm [54]. A emulsão pode também incluir um ou mais: alditol, um agente crioprotector (por exemplo, um açúcar, como dodecilmaltoside e/ou sacarose); e/ou alquilpoliglicosídeos. A emulsão pode incluir um agonista de TLR4 [55]. Estas emulsões podem ser liofilizadas. • Uma emulsão de esqualeno, poloxamer 105 e Abil-Care [56], 38 A concentração final (peso) destes componentes em vacinas adjuvantessão de 5% de esqualeno, 4% de poloxamer 105 (polióis plurónicos) e 2% de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicerideos caprílicos/cápricos). • Uma emulsão contendo 0,5-50% de um óleo, 0,1-10% de um fosfolipido e 0,05-5% de um surfactante não-iónico. Como descrito na referência 57, os componentes de fosfolipidos preferidos são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatidico, cardiolipina e esfingomielina. As dimensões das gotículas submicrónicas são vantajosas. • A emulsão submicrónica óleo-em-água de um óleo não metabolizável (como um óleo mineral leve) e pelo menos um surfactante (como lecitina, Tween 80 ou Span 80). Podem ser incluídos aditivos, como saponina QuilA, colesterol, um conjugado saponina-lipófilo (como GPI-0100, descrito na referência 58, produzido por adição de amina alifática a desacilsaponina através do grupo carboxilo de ácido glucurónico), brometo de dimetildioctadecilamónio e/ou N, N-diocta-decilo-N, N-bis (2-hidroxietil) propanodiamina. • Uma emulsão, na qual uma saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) são associados como micelas helicoidal [59]. • Uma emulsão compreendendo um óleo mineral, um álcool etoxilado lipofílico gordo não-iónico e um surfactante hidrófilo não-iónico (por exemplo, um álcool gordo etoxilado e/ou copolímero de bloco polioxietileno-polioxipropileno) [60] . • Uma emulsão compreendendo um óleo mineral, um álcool etoxilado hidrofílico gordo não-iónico e um surfactante lipofílico não-iónico (por exemplo, um álcool gordo etoxilado e/ou copolímero de bloco polioxietileno-polioxipropileno) [60].

Em algumas formas de realização, pode ser misturada 39 uma emulsão com o antígeno extemporaneamente, no momento da administração, e, assim, o adjuvante e o antígeno podem ser mantidos em separado numa vacina embalada ou distribuída, pronta para a formulação final, na altura da utilização. Noutras formas de realização, uma emulsão é misturada com o antígeno durante a produção, e, assim, a composição é embalada numa forma líquida adjuvante. 0 antígeno estará, geralmente, em forma aquosa, de tal forma que a vacina é, por fim, preparada através da mistura de dois líquidos. A proporção de volume dos dois líquidos para a mistura pode variar (por exemplo, entre 5:1 e 1:5), mas é geralmente de cerca de 1:1. Sendo que as concentrações dos componentes são dadas nas descrições acima de emulsões específicas, estas concentrações são tipicamente para uma composição não-diluída, e a concentração após a mistura com uma solução de antígeno irá, assim, diminuir.

Embalagem de composições da vacina

Os recipientes adequados para as composições (ou os componentes do kit) incluem frascos, seringas (por exemplo, seringas descartáveis), sprays nasais, etc. Estes recipientes devem ser estéreis.

Sendo que está localizada num frasco uma composição/ componente, o frasco é, de preferência, de um vidro ou de material plástico. 0 frasco é preferencialmente esterilizado antes de a composição ser adicionada. Para evitar problemas com pacientes sensíveis a látex, os frascos são de preferência vedados com uma rolha de látex, sendo preferível a ausência de látex em todo o material de embalagem. 0 frasco pode incluir uma dose única de vacina, ou pode incluir mais de uma dose (um frasco ' multidose' ) , por exemplo, 10 doses. Os frascos preferidos são feitos de vidro incolor.

Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, um Luer lock) adaptada de tal forma que uma seringa pré-cheia pode ser inserida na tampa, o conteúdo da seringa pode ser 40 expelido para dentro do frasco (por exemplo, para reconstituir o material ai liofilizado), e o conteúdo do frasco pode ser removido de volta para a seringa. Após a remoção da seringa do frasco, pode ser fixada uma agulha e a composição pode ser administrada a um paciente. A tampa encontra-se, de preferência, localizada dentro de um selo ou cobertura, de modo a que o selo ou cobertura tenham de ser removidos antes de a tampa poder ser acedida. Um frasco pode ter uma tampa que permita a remoção asséptica do seu conteúdo, particularmente para frascos de múltiplas doses.

Sendo que o componente é embalado na seringa, a seringa poderá ter uma agulha adicionada. Se não se encontrar adicionada uma agulha, pode ser fornecida uma agulha em separado para montagem e uso. Essa agulha pode ser embainhada. São preferidas agulhas de segurança. São típicas as agulhas de 1 polegada de calibre 23, 1 polegada de calibre 25 e 578 polegadas de calibre 25. As seringas podem ser proporcionadas com etiquetas adesivas em que o número de lote, estação da gripe e a data de validade do conteúdo podem ser impressos para facilitar a manutenção de registos. O êmbolo da seringa tem, de preferência, um batente para impedir que o êmbolo seja acidentalmente removido durante a aspiração. As seringas podem ter uma tampa de borracha e/ou um êmbolo em látex. As seringas descartáveis contêm uma dose única de vacina. A seringa terá, geralmente, uma tampa de ponta para selar a ponta antes da fixação de uma agulha, e a tampa de ponta é, de preferência, de uma borracha de butilo. Se a seringa e a agulha forem embaladas separadamente, a agulha encontra-se, de preferência, equipada com um escudo em borracha de butilo. As seringas preferidas são as comercializadas com o nome comercial "Tip-Lok"™.

Os recipientes podem ser marcados para mostrar um volume de meia dose, por exemplo para facilitar a administração em crianças. Por exemplo, uma seringa com 41 0,5ml da dose pode ter uma marcação mostrando 0,25ml do volume.

Sendo que é usado um recipiente de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco), é preferível utilizar um recipiente feito de um vidro de borossilicato em vez de um vidro de cal de soda.

Um kit ou composição pode ser embalada (por exemplo, na mesma caixa) com um folheto informativo, incluindo detalhes das instruções, por exemplo para a administração de vacinas, detalhes dos antígenos na vacina, etc. As instruções podem também conter, por exemplo, avisos de como manter um solução de adrenalina prontamente disponível em caso de reacção anafilática após a vacinação, etc. Métodos de tratamento e administração da vacina A divulgação proporciona uma vacina produzida de acordo com a invenção. Estas composições da vacina são adequadas para administração a sujeitos animais humanos ou não humanos, tais como porcos, e a invenção proporciona um método para aumentar uma resposta imune num sujeito, compreendendo o passo de administração de uma composição da presente invenção ao sujeito. A divulgação também proporciona uma composição para utilização como um medicamento, e fornece a utilização de uma composição para a produção de um medicamento para aumentar uma resposta imunitária num sujeito. A resposta imunitária suscitada por estes métodos e utilizações incluirão geralmente uma resposta de anticorpos, de preferência, uma resposta de anticorpos protectores. São bem conhecidos métodos para avaliar respostas de anticorpos, capacidade de neutralização e protecção após vacinação do vírus da gripe. Estudos em humanos têm demonstrado que os títulos de anticorpos contra a hemaglutinina do vírus humano da gripe estão correlacionados com a protecção (um título de hemaglutinação-inibição da amostra do soro de cerca de 30- 42 40 dá para cerca de 50% de protecção contra a infecção por um vírus homólogo) [61]. As respostas dos anticorpos são tipicamente medidas pela inibição da hemaglutinação, por microneutralização, por imunodifusão radial simples (SRID) e/ou por hemólise radial simples (HRS). Estas técnicas de ensaio são bem conhecidas na área.

As composições podem ser administradas de várias formas. A via de imunização mais preferida é por injecção intramuscular (por exemplo, no braço ou perna), mas outras vias disponíveis correspondem a injecção subcutânea, intranasal [62-64], oral [65], intradérmica [66, 67], transcutânea, transdérmica [ 68], etc.

As vacinas preparadas de acordo com a invenção podem ser usadas para tratar crianças e adultos. As vacinas da gripe são actualmente recomendadas para uso em imunização pediátrica e adulta, a partir da idade de 6 meses. Assim, um sujeito humano pode ser inferior a 1 ano de idade, 1-5 anos, 5-15 anos, 15-55 anos ou pelo menos 55 anos de idade. Os sujeitos preferidos para receber as vacinas são os idosos (por exemplo, ^50 anos, >60 anos de idade e, de preferência, >65 anos), os jovens (por exemplo, <5 anos de idade), os indivíduos hospitalizados, trabalhadores da área da saúde, serviço armado e militares, mulheres grávidas, doentes crónicos, indivíduos imunodeficientes, indivíduos que tomaram um composto antiviral (por exemplo, um composto de oseltamivir ou zanamivir, ver abaixo) nos 7 dias antes de receber a vacina, pessoas com alergias a ovo e pessoas de viagem para o exterior. As vacinas não são adequadas apenas para estes grupos, no entanto, podem ser utilizadas, de modo mais geral, numa população. Para as estirpes pandémicas, a administração de todos os grupos de idade é a preferida. sao:

As composições preferidas satisfazem 1, 2 ou 3 dos critérios para a eficácia do CPMP. Em adultos (18-60 anos), estes critérios são: (1) seroprotecção >70%, (2) 43 soroconversão Ú40% e/ou (3) aumento de GMT de á2,5 vezes. Nos idosos (>60 anos), estes critérios são: (1) seroprotecção >60%, (2) soroconversão >30% e/ou (3) aumento de GMT de >2 vezes. Estes critérios são baseados em estudos abertos, com pelo menos 50 pacientes. O tratamento pode ser administrado com um programa de uma única dose ou de múltiplas doses. Podem ser usadas doses múltiplas num programa de imunização primária e/ou num programa de imunização de reforço. Num plano de doses múltiplas, as várias doses podem ser administradas por vias iguais ou diferentes, por exemplo um reforço principal parentérico e das mucosas, um reforço principal das mucosas e parentérico, etc. A administração de mais de uma dose (geralmente duas doses) é particularmente útil em pacientes imunologicamente naives, por exemplo, em pessoas que nunca receberam uma vacina contra a gripe anteriormente, ou para a vacinação contra um subtipo de HA novo (como num surto de pandemia). As doses múltiplas são tipicamente administradas com um intervalo de pelo menos 1 semana (por exemplo, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 16 semanas, etc.)

As vacinas produzidas pela presente invenção podem ser administradas a pacientes substancialmente ao mesmo tempo que (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional de saúde ou centro de vacinação) com outras vacinas, por exemplo, substancialmente ao mesmo tempo que uma vacina contra o sarampo, vacina contra a papeira, vacina da rubéola, vacina MMR, vacina da varicela, vacina de MMRV, vacina de difteria, vacina contra o tétano, vacina da tosse convulsa, vacina DTP, vacina conjugada H. Influenzae do tipo b, vacina de poliovirus inactivado, vacina da hepatite por vírus B, vacina conjugada meningocócica (como uma vacina de AC-W135-Y tetravalente) , vacina contra o vírus respiratório sincicial, vacina 44 conjugada pneumocócica, etc. A administração substancialmente ao mesmo tempo que uma vacina contra o pneumococo e/ou uma vacina meningocócica é particularmente útil em pacientes idosos.

Do mesmo modo, as vacinas podem ser administradas a pacientes substancialmente ao mesmo tempo que (por exemplo, durante a mesma consulta médica ou visita a um profissional de cuidados de saúde) um composto antiviral, e em particular, um composto antiviral activo contra o virus da gripe A (por exemplo oseltamivir e/ou zanamivir) . Estes antivirais incluem inibidores da neuraminidase, como o ácido (3R, 4R, 5S)-4-acetilamino-5-amino-3 (1-etilpropoxi)-1-ciclo-hexeno-l-carboxílico ou o ácido 5-(acetilamino)-4-[(ami-noiminometil)-amino]-2,6-anhidro-3,4,5-trideoxi-D-glicero-D-galactonon-2-enónico, incluindo os seus ésteres (por exemplo, os ésteres de etilo) e os respectivos sais (por exemplo, os sais de fosfato). Um antiviral preferido é (3R, 4R, 5S)-4-acetilamino-5-amino-3 (1-etilpropoxi)-1- ciclo-hexeno-l-carboxílico, éster etílico, éster de fosfato (1:1), também conhecido como oseltamivir fosfato (TAMIFLU™).

Generalidades 0 termo "compreendendo" engloba "incluindo" bem como "consistindo" por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo X + Y. 0 termo "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Sempre que necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção. 0 termo "cerca de" relativamente a um valor númerico x é opcional e significa, por exemplo, x610%. 0129] A menos que especificado em contrário, um processo que compreende uma etapa de mistura de dois ou mais componentes não requer 45 nenhuma ordem específica de mistura. Assim, os componentes podem ser misturados de acordo com qualquer ordem. Sendo que existem três componentes, dois componentes podem ser combinados um com o outro, e, em seguida, a combinação pode ser combinada com o terceiro componente, etc. [0130] Quando são usados, na cultura de células, materiais de origem animal (e particularmente bovina), estes devem ser obtidos de fontes que sejam livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET), e em particular livres de encefalopatias espongiformes bovinas (BSE). Em termos gerais, é preferível cultivar células com ausência total de materiais de origem animal.

Quando um composto é administrado no corpo como parte de uma composição, o composto pode, alternativamente, ser substituído por um pró-fármaco adequado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra a construção de expressão que foi utilizada para testar a actividade de promotor da Pol I com um repórter de luciferase. A Figura 2 mostra a sequência do promotor da Pol I humano de comprimento total (FL) humano(SEQ ID N°: 1). A sequência do promotor da Pol I humano pHW2000 (SEQ ID N° : 2; o promotor da Pol I humano "curto")) no interior da sequência de comprimento total é apresentado de forma sublinhada. A seta indica o local de início da transcrição. A Figura 3 mostra a sequência do promotor da Pol I canino de comprimento total (FL) (NW_878945; SEQ ID N°: 3) . A sequência do promotor SHORT dentro da sequência do promotor de comprimento total é apresentada em maiúsculas sublinhadas (SEQ ID N°: 5), a sequência do promotor de MID dentro da sequência do promotor de comprimento total é apresentada em maiúsculas sublinhadas e a negrito (SEQ ID N°: 4) . A Figura 4 mostra a actividade do promotor da Pol I canino em células MDCK. As colunas em cinza sólido mostram os 46 resultados com o promotor da Pol I canino FL, as colunas a tracejado mostram os resultados com o promotor MID canino e as colunas pontilhadas mostram os resultados com o promotor da Pol I canino CURTO canino. "A" indica LUC e polimerase virai, "B" indica LUC e infecção (MOI = 0,05), "C" indica LUC e "D" não é ADN. O eixo y indica unidades de luz relativa (RLU). A Figura 5 mostra a actividade do promotor da Pol I canino em células MDCK 33016. As colunas de cinzas sólidas mostram os resultados com o promotor da Pol I humano, as colunas a tracejado mostram os resultados com o promotor da Pol I canino FL, as colunas pontilhadas mostram os resultados com o promotor da Pol I canino MID e as colunas verticais mostram os resultados com o promotor da Pol I canino CURTO. "A" indica LUC e polimerase virai, "B" indica LUC e infecção (MOI = 0,05) e "C" indica LUC. O eixo y indica unidades de luz relativa (RLU). A Figura 6 mostra uma comparação da actividade do promotor da Pol I humano FL e CURTO e o promotor da Pol I canino de comprimento total em células MDCK 33016. As colunas a cinza sólido mostram os resultados obtidos com o promotor humano de comprimento total, colunas tracejadas mostram os resultados com o promotor canino de comprimento completo e as colunas a tracejado mostram os resultados obtidos com o promotor da Pol I humano curto. A indica LUC+polimerase, B indica LUC+infecção e C mostra apenas LUC. O eixo y indica unidades de luz relativa (RLU). A Figura 7 mostra uma comparação da actividade do promotor da Pol I humano (colunas pontilhadas) e o promotor da Pol I canino (colunas a tracejado) em células MDCK 33016 (Figura 7A) e em células MDCK ATCC (Figura 7B) . A indica LUC+polimerase, B indica LUC+infecção e C mostra apenas LUC. O eixo y indica unidades de luz relativa (RLU). A Figura 8 apresenta uma análise por Western blot das proteínas M e Np, em lisates celulares após o resgate do 47 vírus . A Figura 9 apresenta os resultados de um ensaio de formação do foco com recurso a supernatantes de células infectadas com construções da genética reversa. A Figura 10 mostra um alinhamento de sequências de ADN de promotores da Pol I humanos e caninos (SEQ ID N°s 1 e 3, respectivamente). A Figura 11A mostra os níveis de expressão de um transgene repórter sob o controlo do promotor da Pol I humano (hPolI) ou do promotor da Pol I canino (cPolI) em células MDCK ATCC, MDCK 33016-PF e 293T. As colunas a preto representam os resultados obtidos com as células 293T, as colunas a branco mostram os resultados com MDCK 33016-PF e as colunas a tracejado representam os resultados com células MDCK ATCC; A Figura 11B compara a eficiência de transfecção em células de humanas e caninas. O eixo y em ambos os gráficos indicam as unidades de luz relativa(RLUs). A Figura 12 mostra a recuperação da estirpe da gripe A/Puerto Rico/8/34 pela genética reversa com base no promotor da Pol I humano em células MDCK ATCC, MDCK 33016-PF e 293T na presença (colunas a branco) e ausência (colunas a preto) do plasmídeo ajudante TMPRSS2 e com (colunas a preto) ou sem (colunas a branco) adição de células de alimentação (12B). O eixo y representa o título do vírus (ffu/mL). A Figura 13 compara a recuperação da estirpe da gripe A/Puerto Rico/8/34 pela genética reversa da Pol I humana ou canina em células MDCK 33016-PF. As colunas a preto mostram os resultados na ausência do plasmídeo ajudante TMPRSS2 e as barras a branco mostram o resultado da presença do plasmídeo ajudante TMPRSS2. O eixo y representa o título do vírus (ffu/mL).

BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID N° : 1 é a sequência do promotor da Pol I humano de 48 comprimento total (FL) SEQ ID N°: 2 é a sequência do promotor da Pol I humano SEQ ID N° : 3 é a sequência do promotor da Pol I canino de comprimento total (FL) SEQ ID N°: 4 é a sequência do promotor da Pol I canino SEQ ID N°:

5 é a sequência do promotor da Pol I canino CURTO SEQ ID N°: 6 é a sequência de HA de A/California/04/09 SEQ ID N°: 7 é a sequência de HA de A/Chile/1 /1983 SEQ ID N°: 8 é a sequência de NA de A/Calif ornia/04/09 SEQ ID N°: 9 é a

sequência de NA de A/Chile/1/1983 FORMAS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO O promotor da Pol I humano é activo em células humanas e caninas.

A fim de avaliar a actividade do promotor da Pol I em células hospedeiras não endógenas, as células MDCK foram transfectadas com uma construção de expressão que permite a expressão de um ARN de luciferase (luc) em direcção antisense sob o controlo de um fragmento com 487bp do promotor da Pol I humano ou vários fragmentos do promotor da Pol I canino (como apresentado na Figura 3) . 0 ARN expresso pode ser transcrito no mARN por uma polimerase virai e, subsequentemente, ser traduzido numa proteína luc. Assim, as células que expressam o transgene podem ser facilmente identificadas através do ensaio para a actividade da luciferase. Para que o ensaio funcione, é necessário fornecer a polimerase virai. Isto pode ser conseguido por co-transfecção da célula com as construções de expressão que codificam a polimerase virai ou, em alternativa, infectando a célula transfectada com um vírus auxiliar. 0 ensaio encontra-se ilustrado na Figura 1. A Figura 11A mostra que o promotor da Pol I humano poderá dirigir a expressão do transgene em células MDCK ATCC e também em células MDCK 33016-PF com a mesma eficiência que o promotor da Pol I canino. Os níveis de expressão do transgene com o promotor da Pol I humano em células MDCK ATCC são ainda mais elevados do que os 49 observados em células 293T. A fim de confirmar que a eficiência da transfecção dos tipos de células testadas é comparável, estas foram transfectadas com uma construção contendo um gene de luciferase sob o controlo de um promotor CMV. 0 nível de actividade da luciferase foi medida. Os resultados são apresentados na Figura 11B e confirmam que a eficiência da transfecção das células testadas é comparável. A Figura 4 mostra que todos os fragmentos testados do promotor da Pol I canino podem dirigir a expressão do transgene luc em células MDCK. Além disso, a Figura 5 demonstra que o promotor da Pol I humano de comprimento total consegue dirigir a expressão do transgene em células MDCK e ainda mais eficiente que o promotor da Pol I canino. A fim de definir ainda mais a região do promotor da Pol I humano que é necessário para dirigir a expressão do transgene, a experiência foi repetida com um fragmento do promotor da Pol I humano, como apresentado na Figura 2 (Pol I "curta"). Foi observado que, enquanto o promotor da Pol I de comprimento total, os promotores da Pol I humanos de comprimento total e curto são activos em células MDCK (Figura 6).

As construções contendo as sequências do promotor da Pol I humano e canino foram ainda transfectadas para células MDCK a partir de células ATCC e MDCK 33016 [18], a fim de determinar se a actividade do promotor da Pol I humano é restrita a uma linha celular específica. Como mostrado na Figura 7, o promotor da Pol I humano conseguiu dirigir a expressão do transgene em ambos os tipos de células, mas a expressão foi mais eficiente em células MDCK 33016. A recuperação do vírus da gripe das células MDCK com recurso ao promotor da Pol I humano. A eficiência da recuperação do vírus da gripe com recurso ao promotor da Pol I humano foi comparada em células MDCK e 293T. O genoma virai da gripe foi clonado em 50 vectores de expressão pHW2000 [69]. Este vector contém um fragmento do promotor da Pol I humano, que se mostrou activo em células MDCK (ver Figura 5). Em particular, foram utilizados os seguintes vectores: PHW-WSN PA (0,534mg/ml); PHW-WSN PB1 (0,432mg/ml); PHW-WSN PB2 (0,357mg/ml); PHW-WSN NP (0,28 4mg / ml); PHW-WSN NS (0,217mg/ml); PHW-WSN M (0,232mg/ml); PHW-WSN HA (0,169mg/ml); PHW-WSN NA (0,280mg/ml) e pcDNA-TMPRSS (0,775mg/ml; que codifica serina protease). Os genes que codificam proteínas foram controlados por um promotor de citomegalovírus (CMV).

Para a recuperação do vírus, as células 293T foram semeadas a uma densidade de células 5xl06/poço em placas de 6 poços, com 2ml do Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de FCS. As células MDCK foram plaqueadas a 0,3xl06 célula/poço em 6 poços plaqueados com 2ml do meio. As células foram incubadas durante a noite a 37°C e foram transfectadas quando atingiram uma confluência de 50-80%.

As células 293T e MDCK foram transfectadas com recurso ao Reagente de Transfecção FuGENE 6 (Roche Cat.#11988387001) e o Reagente Lipofectamina LTX Plus(Invitrogen Cat.#15338-100) , respectivamente. As células foram transfectadas com lmg de cada vector de acordo com os seguintes protocolos. Para o Fugene 6, o reagente (3ml de FuGENE/mg de ADN) foi diluído em 73ml de meio isento de soro (sem antibióticos), misturado suavemente e incubado à temperatura ambiente durante 5 minutos. Em seguida, o ADN foi adicionado ao FuGENE diluído, misturado suavemente e incubado à temperatura ambiente durante pelo menos 15 minutos. O complexo ADN/FuGENE foi adicionado gota a gota às células 293T sem remover o meio de crescimento e as células foram incubadas a 37°C durante 24 horas.

Para a transfecção com lipofectamina, o reagente (25ml) foi diluído em 500ml de meio isento de soro, misturado suavemente e incubado à temperatura ambiente 51 durante 5 minutos. 0 ADN foi adicionado e a mistura foi incubada à temperatura ambiente durante pelo menos 30 minutos. Após a incubação, 500 ml de meio isento de soro foram adicionados gota a gota ao reagente de transfecção após o meio de crescimento ter sido removido das células. As células foram subsequentemente incubadas a 37°C durante 24 horas. O meio foi alterado 24 horas após a transfecção.

Dois dias após a infecção, o supernadante das células foi recolhido por centrifugação a 1000 rpm durante 5 minutos. O vírus recolhido no supernadante foi usado para os Ensaios de Formação do Foco. Além disso, as células infectadas foram lisadas e usadas para a análise por Western Blot.

Análise por Western Blot

As células 293T e MDCK foram lisadas e sujeitas à análise por Western Blot. Os anticorpos contra a proteína M e NP foram usados para detectar estas proteínas na membrana. Foram usados anticorpos contra S6 como controlo de carga. As pistas marcadas como 'WSN' foram carregadas com proteínas do vírus recuperado. As pistas marcadas com 'M' e 'NP' contêm proteínas M e NP recombinantes como um controlo. Como estas proteínas recombinantes foram expressas a partir de um gene diferente, estas migram ligeiramente mais devagar no gel.

Os resultados da análise são apresentados na Figura 8, onde é evidente que a construção de expressão sob o controlo do promotor da Pol I humano permite uma recuperação virai em células 293T e MDCK.

Ensaios de Formação do Foco

As células MDCK não-infectadas foram plaqueadas a uma densidade de 6.25xl04 células/poço em placas de 48 poços em 500 ml de DMEMwith FCS a 10%. As células do dia seguinte foram infectadas com vírus num volume de 100-150ml durante 2 horas a 37°C. As células foram assim infectadas com várias diluições do vírus. Duas horas após a infecção, o 52 meio foi aspirado e foram adicionados a cada poço 500ml de DMEM com FCS a 10%. As células foram incubadas a 3 7°C até ao dia seguinte. O meio foi aspirado e as células lavadas uma vez com PBS, 24 horas após a infecção. Foram adicionados, a cada poço, 500ml de acetona a 80% em gelo em PBS, seguindo-se a incubação a 4o C durante 30 minutos. A mistura de acetona foi aspirada e as células lavadas uma vez com PBST (PBS + 0,1% Tween). Foram adicionados, a cada poço, 500ml de BSA a 2% em PBS, seguindo-se incubação à temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos. Foram adicionados, no tampão de bloqueio, 500ml de uma diluição 1:6000 de anti-NP, seguindo-se incubação à temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de anticorpos foi aspirada e as células lavadas duas vezes com PBST. O anticorpo secundário (ratinho anti cabra) foi adicionado a uma diluição de 1:2000 em 500ml de tampão de bloqueio 5 e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de anticorpos foi aspirada e as células lavadas três vezes com PBST. 500ml de KPL True Blue foram adicionados a cada poço e incubados durante 10 minutos. A reacção foi parada por aspiração de True-Blue e lavada uma vez com dH20. A água foi aspirada e as células foram deixadas a secar.

Os resultados do ensaio são mostrados na Figura 9, que apresenta claramente que o virus foi obtido a partir de células 293T, bem como de células MDCK.

[0149] A recuperação do virus da estirpe da gripe A/Puerto Rico/8/34 com recurso a um sistema da genética reversa da Pol I humana foi também testada em células MDCK ATCC, MDCK 33016-PF e 293T, como descrito na referência 70. As experiências foram realizadas, tendo o virus sido recuperado na presença e na ausência do plasmideo auxiliar TMPRSS2 que codifica uma protease de serina. Além disso, a recuperação virai foi realizada com e sem a adição de células de alimentação, 24 horas após a recuperação virai. 53

Os resultados são mostrados na Figura 12 e demonstram que a recuperação virai eficiente pode ser alcançada em células MDCK sob várias condições, utilizando o promotor da Pol I humano.

Para comparar se a eficiência da recuperação virai em MDCK 33016-PF com recurso a um promotor da Pol I humano é comparável com a recuperação com recurso a um promotor da Pol I canino, as células são transfectadas com um sistema da Pol I RG humano ou canino, conforme descrito na referência 70. As experiências foram realizadas na presença e ausência do plasmídeo ajudante TMPRSS. Os resultados (Figura 13) demonstram que a estirpe A/Puerto Rico/8/34 foi resgatada com uma eficiência comparável à do sistema da Pol I canina quando foi usado o sistema da Pol I humana.

Percebe-se que a invenção foi descrita como forma de exemplo apenas e que as modificações foram efectuadas no âmbito da invenção.

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LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> NOVARTIS AG DORMITZER Philip FRANTI Michael SUPHAPHIPHAT Pirada MASON Peter KEINER Bjoern CROTTA Stephania <120> GENÉTICA REVERSA COM RECURSO A PROMOTORES DA POL I NÃO ENDÓGENOS"

<130> P054792WO <140> PCT/IB2010/ <141> 21-05-2010 <150> US61/216.919 <151> 21-05-2009 <160> 9 <170> Seqwin99, versão 1.02

<210> 1 <211> 499 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 60 120 180 240 300 360 420 480 499 tttccgagtc cccgtgggga gccggggacc gtcccgcccc cgtcccccgg gtgccgggga gcggtccccg ggccgggccg cggtccctct gccgcgatcc tttctggcga gtccccgtgc ggagtcggag agcgctccct gagcgcgcgt gcggcccgag aggtcgcgcc tggccggcct tcggtccctc gtgtgtcccg gtcgtaggag gggccggccg aaaatgcttc cggctcecgc tctggagaca cgggccggcc ccctgcgtgt ggcacgggcg gccgggaggg cgtccccggc ccggcgctgc tcccgcgtgt gtcctggggt tgaccagagg gccccgggcg ctccgtgtgt ggctgcgatg gtggcgtttt tggggacagg tgtccgtgtc gcgcgtcgcc tgggccggcg gcgtggtcgg tgacgcgacc tcccggcccc gggggaggta tatctttcgc tccgagtcgg cattttgggc cgcccgggt

<210> 2 <211> 219 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 57 gccgggaggg cgtccccggc ccggcgctgc gccccgggcg ctccgtgtgt ggctgcgatg gcgcgtcgcc tgggccggcg gcgtggtcgg tatctttcgc tccgagtcgg cattttgggc tcccgcgtgt gtcctggggt tgaccagagg gtggcgtttt tggggacagg tgtccgtgtc tgacgcgacc tcccggcccc gggggaggta cgcccgggt 60 120 180 219 <210> 3 <211> 1814 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> 1647 <223> N = A, C, T ou <400> 3 agcgtgagca ggagaattct ggagaaacag aagaaagaaa gaaagagaaa atccttatgt agttcctctt ccacgacctc ttctcattca gtcaggtccc agacgcttaa agggtggaag caccgtcctc tccagcgcct ttggttcaaa tccttcgtct tataaatata taaataaaat attgtgttat aagaaagaaa gaaagaaaga tctttgagcc tcccctcccc cccagaattg acccaataga caagtatttg gggggggggg tgaaagtggt gcgggggaag ggggggggca cctccttcgt gacctccctc cctccctccc cctaaagaaa aagaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 120 180 240 300 360 aaaggaagga cacgagaaaa aacggtgcat ttcggctcta cgttccctcc ctgacctcgg cgcggcgagc gcgaccccct ttccgggcgg ggacgggttt tccaaggctc ccccgccccg gtgtgctccc ggggccctcc gccgtccccg cggcctcgcc gcccggatct gtcccgctgt cggccgcttt tatagagcgt gtcccctccg tttggtgtcg gtttcccggg gccgagttcc ggctgtcgcc ggggcctcgg cgcgcgatgc gagggagtgt cgccgtcgcc gctgtcgccg ccgtgcgggc cgcctgggtg ggtcgaccag cggaccgacc tgggccgcct cgggggcggg ggctccgggc gatcttcggg ccttccttcc cctggcgacg gggaccggtc tgagcctgga ggctgcgggc acgtgtgggg gtcccgggcg gcccgctgcg gaggtgggtc ccgggcggtc cgtccgttcg ggcgtccggc cccggtggcg ggccctccac ctcccctggc ccgagccggg ctgagggccg cgggggacgg cctccgcacg ttcaaagtct cctcccggag atcactggcg cgtggcgtct ccaccgaccg cgtatcgccc tggggcgacc agaaagccct gggggcnggg gtggggcagg ttttgggtac agttggccgt tggctggtcc ccgccggcag gcgcggttat ccaggtaggt gctg ccgttgccgt cctaagagtc ctcgcctggt aaacgtgcct gagtcgtccc gggagccccg cagcgggccc ggacggacgg acggacggac ggaggacggg ggttcgcgcg gtgcgcggcc ggccgagagg cgagatccga ggcgccctga cgttcgcgcc ggttgtcggg tgccacctgg gaggctcggc ggcgacaggc aaggaacagc aggaggaggg cggctccggc gcgagcgtcc gctcgccgga gattggacct ccggagctgc ctgtcgcctc cgcctcgctc ccggaggagg cacccgccgg tggctcctcc tccgeecgeg ggacagggtg tgtcccgccg tccgtcctgt gtgtcactcg gttgtctccc gtggtcacgc ggggaagccc gtgggtggcg cgacagaccc tcggacgcga ttttctcccc ttgttccgag ggaccgggtg ccacgcgggg gtgggcgggc attcccggtg aggctgcctc tgccgcgcgt gttggggacg gcggtaggca cggggcggtc gtgcctgcct ccggagaact ttgatgattt tggcggcgtg gcggcgtggc ggcgtggcgg ctcctcaccc cccccccccc ccgggttacc ggctccgtgg ggtgggggtg ggggggcgcc gtcacggtcc cgggaggtcg cggtgacctg tttcttgccc gaaatgaaca ttttttgttg 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1814 <210> 4 <211> 474 <212> ADN <213> Canis spec. <220> <221> misc_feature 58 <222> 307 <223> Ν = A, Τ, C ou G <400> 4 60 120 180 240 300 360 420 474 cccggtggcg attcccggtg aggctgeetc tgccgcgcgt ggccctccac ctcccctgge ccgagccggg gttggggacg gcggtaggca cggggcggte ctgagggccg cgggggacgg cctccgcacg gtgcctgcct ccggagaact ttgatgattt ttcaaagtet cctcccggag atcactggcg tggcggcgtg gcggcgtggc ggcgtggcgg cgtggcgtct ccaccgaccg cgtatcgccc ctcctcaccc cccccccccc ccgggttacc tggggcgacc agaaagccct gggggcnggg ggctccgtgg ggtgggggtg ggggggcgcc gtggggcagg ttttgggtac agttggccgt gtcacggtcc cgggaggtcg cggtgacctg tggctggtcc ccgccggcag gcgcggttat tttcttgccc gaaatgaaca ttttttgttg ccaggtaggt gctg <210> 5 <211> 288 <212> ADN <213> Canis spec. <220> <221> misc_ feature <222> 121 <223> N = A , C, T <400> 5 60 120 180 240 288 ggcgtggcgg cgtggcggcg tggcggcgtg gcggcgtggc gtctccaccg accgcgtatc gcccctcctc accccccccc ccccccgggt tacctggggc gaccagaaag ccctgggggc ngggggctcc gtggggtggg ggtggggggg cgccgtgggg caggttttgg gtacagttgg ccgtgtcacg gtcccgggag gtcgcggtga cctgtggctg gtccccgccg gcaggcgcgg ttattttctt gcccgaaatg aacatttttt gttgccaggt aggtgctg

<210> 6 <211> 566 <212> PRT <213> Vírus da gripe A <400> 6 59

Met 1 Lys Ala Ile Leu 5 val val Leu Leu Tyr 10 Thr Phe Ala Thr Ala 15 Asn Ala Asp Thr Leu 20 Cys ile Gly Tyr His 25 Ala Asn Asn ser Thr 30 Asp Thr Vai ASP Thr 35 Vai Leu Glu Lys Asn 40 Val Thr val Thr His 45 Ser val Asn Leu Leu 50 Glu Asp Lys His Asn 55 Gly Lys Leu Cys Lys 60 Leu Arg Gly val Ala 65 Pro Leu His Leu Gly 70 Lys Cys Asn Ile Ala 75 Gly Trp Ile Leu Gly 80 Asn Pro Glu cys Glu 85 ser Leu Ser Thr Ala 90 Ser ser Trp ser Tyr 95 ile vai Glu Thr pro 100 Ser ser Asp Asn Gly 105 Thr cys Tyr pro Gly 110 Asp Phe lie Asp Tyr 115 Glu Glu Leu Arg Glu 120 Gin Leu Ser ser val 125 ser Ser Phe Glu Arg 130 Phe Glu lie phe pro 135 Lys Thr Ser Ser Trp 140 Pro Asn His Asp ser 145 Asn Lys Gly val Thr 150 Ala Ala cys Pro His 155 Ala Gly Ala Lys Ser 160 Phe Tyr Lys Asn Leu 165 ile Trp Leu val Lys 170 Lys Gly Asn Ser 3S Pro Lys Leu Ser Lys 180 ser Tyr Ile Asn ASO 185 Lys Gly Lys Glu Val 190 Leu Val Leu Trp Gly 195 Ile His His pro ser 200 Thr ser Ala Asp Gin 205 Gin ser Leu Tyr Gin 210 Asn Ala Asp Thr Tyr 215 Val Phe val Gly Ser 220 Ser Arg Tyr Ser Lys 225 Lys Phe Lys Pro Glu 230 ile Ala ile Arg pro 235 Lys Val Arg Asp Gin 240 Glu Gly Arg Met Asn 24S Tyr Tyr Trp Thr Leu 250 Val Glu Pro Gly Asp 255 cys ile Thr Phe Glu 260 Ala Thr Gly Asn Leu 265 val val pro Arg Tyr 270 Ala Phe Ala Met Glu 275 Arg Asn Ala Gly Ser 280 Gly Ile ile ile Ser 285 ASp Thr Pro Vai His 290 Asp cys Asn Thr Thr 295 cys Gin Thr pro Lys 300 Gly Ala Ile Asn Thr 305 ser Leu pro Phe Gin 310 Asn Ile His pro Ile 315 Thr Ile Gly Lys cys 320 pro Lys Tyr vai Lys 325 ser Thr Lys Leu Arg 330 Leu Ala Thr Gly Leu 335 Arg Α5Π Ile pro ser 340 Ile Gin ser Arg Gly 345 Leu phe Gly Ala ile 350 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 60 35S 360 365 HÍS HÍS Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala ASp Leu Lys Ser 370 375 380 Thr Gin Asn Ala Ile Asp Glu ile Thr Asn Lys vai Asn ser val ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Vai Gly Lys Glu Phe Asn HÍS 405 410 415 Leu Glu Lys Arg lie Glu Asn Leu Asn Lys Lys val ASp Asp Gly phe 420 425 430 Leu ASp He Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu vai Leu teu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Tyr HÍS ASp Ser Asn vai Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys vai Arg ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu phe Tyr HÍS Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr ASP Tyr Pro Lys Tyr ser Glu Glu Ala Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Glu He ASp Gly vai Lys Leu Glu Ser Thr Arg ile Tyr 515 520 525 Gin ile Leu Ala He Tyr ser Thr Vai Ala Ser ser Leu Val Leu val 530 535 540 Vai ser Leu Gly Ala Ile ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gin Cys Arg lie Cys 565 lie

<210> 7 <211> 566 <212> PRT <213> Vírus da gripe a <400> 7 61

Met Lys Ala Lys Leu Leu Vai Leu Leu cys Ala Leu ser Ala Thr Asp 1 5 10 15

Ala Asp Thr Ile Cys ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 val Asp Thr vai Leu Glu Lys Asn vai Thr vai Thr His ser vai Asn 35 40 45

Leu Leu Glu Asp Asn His Asn Gly Lys Leu cys Lys Leu Lys Gly ile 50 55 60

Ala Pro Leu Gin Leu Gly Lys cys Ser ile Ala Gly Trp ile Leu Gly 65 70 75 80

Asn Pro Glu cys Glu Ser Leu Phe Ser Lys Lys Ser Trp Ser Tyr Ile 85 9Ó 95

Ala Glu Thr Pro Asn ser Glu Asn Gly Thr cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 62

Ala Asp Tyr 115 Glu Glu Leu Arg Glu 120 Gin Leu Ser Ser val 125 Ser ser Phe Glu Í58 Phe Glu Ile Phe pro 135 Lys Glu ser ser Trp 140 Pro Lys HÍS Asn Vai Thr Lys Gly Val Thr Ala Ala cys Ser HiS Lys Gly Lys ser Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Asn Leu 165 Leu Trp Leu Thr Glu 170 Lys Asn Gly Ser Tyr 175 Pro Asn Leu ser Lys Ser Tyr val Asn Asn Lys Glu Lys Glu val Leu val 180 185 190 Leu Trp Gly val HÍS HIS pro ser Asn lie Glu Asp Gin Lys Thr Ile 195 200 205 Tyr Arg Lys Glu Asn Ala Tyr val Ser val val Ser Ser His Tyr Asn 210 215 220 Arg Arg Phe Thr pro Glu ile Ala Lys Arg pro Lys val Arg Asn Gin 225 230 235 240 Glu Gly Arg Ile Asn 245 Tyr Tyr Trp Thr Leu 250 Leu Glu Pro Gly ASp 255 Thr lie Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly ser Gly Ile ile Thr ser Asn Ala ser 275 280 285 Met Asp Glu cys Asp Ala Lys Cys Gin Thr Pro Gin Gly Ala lie Asn 290 295 300 Ser Ser Leu Pro Phe Gin Asn val His Pro val Thr He Gly Glu Cys 505 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Arg 325 Ser Thr Lys Leu Arg 330 Met Val Thr Gly Leu 335 Arg Asn ile Pro ser Ile Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gin Lys ser 370 375 380 Thr Gin Asn Ala Ile Asn Gly ile Thr Asn uys val Asn ser Ile ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala val Gly Lys Glu Phe Asn Lys 405 410 415 Leu Glu Lys Arg 420 Met GlU Asn Leu Asn 425 Lys Lys val Asp A5P 430 Gly phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg 450 Thr Leu Asp Phe His 455 ASp Ser Asn val Lys 460 Asn Leu Tyr Glu Lys vai Lys Ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 63 cys Phe Glu Phe I yr His Lys Cys Asn Asn Glu cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr ASp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 SOS 510 Asn Arg Glu Lys ile Asp Gly vai Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr 515 520 525 Gin lie Leu Ala ile Tyr ser Thr Val Ala ser Ser Leu Val Leu Leu 530 535 540 vai Ser Leu Gly Ala lie Ser phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gin Cys Arg ile Cys 565 lie

<210> 8 <211> 469 <212> PRT <213> Vírus da gripe A <400> 8 64

Met Asn Pro Asn Gin Lys ile Ile Thr ile Gly Ser val cys Met Thr 1 5 10 15 ile Gly Met Ala Asn Leu Ile Leu Gin ile Gly Asn Ile ile Ser ile 20 25 30 Trp Ile Ser HIS Ser Ile Gin Leu Gly Asn Gin Asn Gin Ile Glu Thr 35 40 45 Cys Asn Gin Ser val Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gin 50 55 60 Thr Tyr val Asn Ile Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Gin Ser val 65 70 75 80 val Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser ser Leu cys pro val Ser Gly 85 90 95 Trp Ala ile Tyr ser Lys Asp Asn Ser val Arg ile Gly Ser Lys Gly 100 105 110 Asp val Phe val ile Arg Glu Pro Phe ile ser cys ser Pro Leu Glu 115 120 125 Cys Arg Thr Phe phe Leu Thr Gin Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His 130 135 140 Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met ser 145 150 155 160 Cys Pro ile Gly Glu val pro ser Pro Tyr Asn ser Arg Phe Glu Ser 165 170 175 val Ala Trp ser Ala ser Ala Cys Hi s Asp Gly ile Asn Trp Leu Thr ISO 185 190 lie Gly ile Ser Gly pro Asp Asn Gly Ala val Ala val Leu Lys Tyr 195 200 205 Asn Gly Ile ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu 210 215 220

Arg Thr Gin Glu ser Glu Cys Ala Cys Vai Asn Gly Ser Cys Phe Thr 65 225 230 235 240 vai Met Thr Asp Gly 245 Pro Ser Asn Gly Gin 250 Ala Ser Tyr Lys Ile 255 phe Arg ile Glu Lys 260 Gly Lys He vai Lys 265 Ser val Glu Met Asn 270 Ala pro Asn Tyr Hl S 275 Tyr Glu Glu Cys Ser 280 Cys Tyr Pro ASp Ser 285 Ser Glu Ile Thr Cys 290 Vai cys Arg Asp Asn 295 Trp HiS Gly Ser Asn 300 Arg Pro Trp val Ser 305 Phe Asn Gin Asn Leu 310 Glu Tyr Gin Ile Gly 315 Tyr Ile Cys Ser Gly 320 He Phe Gly Asp Asn 325 pro Arg Pro Asn Asp 330 Lys Thr Gly Ser cys 335 Gly pro vai Ser ser 340 Asn Gly Ala Asn Gly 345 Val Lys Gly Phe Ser 350 Phe Lys Tyr Gly Asn 355 Gly vai Trp ile Gly 360 Arg Thr Lys Ser Ile 365 Ser ser Arg Asn Gly 370 Phe Glu Met Ile Trp 375 Asp Pro Asn Gly Trp 380 Thr Gly Thr ASp Asn 385 Asn phe Ser ile Lys 390 Gin ASp Ile val Gly 395 ile Asn Glu Trp ser 400 Gly Tyr ser Gly Ser 405 Phe vai Gin HIS Pro 410 Glu Leu Thr Gly Leu 415 Asp cys lie Arg Pro 420 cys Phe Trp val Glu 425 Leu Ile Arg Gly Arg 430 Pro Lys Glu Asn Thr 435 lie Trp Thr ser Gly 440 Ser ser ile Ser phe 445 cys Gly val Asn ser 450 Asp Thr vai Gly Trp 455 ser Trp Pro ASP Gly 460 Ala Glu Leu Pro phe 465 Thr ile ASp Lys

<210> 9 <211> 470 <212> PRT

<213> Vírus da gripe A <400> 9 66

Met Asn ργο Asn Gin Lys Ile Ile Thr ile Gly Ser ile cys Met Thr 15 10 15 ile Gly ile Ile Ser Leu Ile Leu Gin Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile 20 25 30

Trp val Ser His Ser Ile Gin Thr Gly Ser Gin Asn His Thr Gly Ile 35 40 45

Cys Asn Gin Arg Ile Ile Thr Tyr Glu Asn Ser Thr Trp Val Asn Gin 50 55 60

Thr Tyr val Asn Ile Asn Asn Thr Asn val Val Ala Gly Lys Asp Thr 65 70 75 80 67

Thr Ser val Thr Leu 85 Ala Gly Asn ser ser 90 leu cys pro Ile Arg 95 Gly Trp Ala ile Tyr 100 Ser Lys ASp Asn ser 105 Ile Arg ile Gly ser 110 Lys Gly Asp vai phe 115 Val Ile Arg Glu Pro 120 phe Ile Ser Cys Ser 125 His Leu Glu cys Í3 Thr phe Phe Leu Thr 135 Gin Gly Ala Leu Leu 140 Asn Asp Lys His ser 145 Asn Gly Thr val Lys 150 Asp Arg Ser Pro Tyr 155 Arg Ala Leu Met Ser 160 cys Pro ile Gly Glu 165 Ala Pro Ser pro Tyr 170 Asn ser Arg Phe Glu 175 Ser vai Ala Trp ser 180 Ala ser Ala cys His 185 ASp Gly Met Gly Trp 190 Leu Thr ile Gly ile 195 Sér Gly pro ASp Asp 200 Gly Ala val Ala val 205 Leu Lys Tyr Asn Gly 210 Ile Ile Thr Glu Thr 215 ile Lys ser Trp Arg 220 Lys Arg ile Leu Arg 225 Thr Gin Glu Ser Glu 230 Cys val Cys val Asn 235 Gly Ser cys Phe Thr 240 Ile Met Thr ASp Gly 245 Pro Ser Asn Gly pro 250 Ala Ser Tyr Arg Ile 255 Phe Lys ile Glu Lys 260 Gly Lys Ile Thr Lys 265 Ser Ile Glu Leu Asp 270 Ala Pro Asn ser His 275 Tyr Glu Glu Cys ser 280 Cys Tyr Pro ASp Thr 285 Gly Thr val Met Cys 290 val Cys Arg ASp Asn 295 Trp Hi S Gly Ser Asn 300 Arg Pro Trp Val ser 305 Phe Asn Gin Asn Leu 310 Asp Tyr Gin ile Gly 315 Tyr Ile Cys Ser Gly 320 Vai Phe Gly Asp Asn 325 Pro Arg Pro Lys Asp 330 Gly Lys Gly Ser Cys 335 Asp Pro vai Thr Val 340 Asp Gly Ala Asp Gly 345 val Lys Gly Phe ser 350 Tyr Arg Tyr Gly Asn 355 Gly val Trp Ile Gly 360 Arg Thr Lys ser Asn 365 ser ser Arg Lys Gly 370 Phe Glu Met ile Trp 375 ASP ΡΓΟ Asn Gly Trp 380 Thr Asp Thr Asp Ser 385 Asn Phe Leu Val Lys 390 Gin ASp val val Ala 395 Met Thr Asp Trp ser 400 Gly Tyr Ser Gly ser 405 Phe val Gin Hi s Pro 410 Glu Leu Thr Gly Leu 415 ASp Cys Met Arg pro 420 Cys Phe Trp val Glu 425 Leu Val Arg Gly Arg 430 ΡΓΟ Arg Glu Gly Thr 435 Thr Val Trp Thr Ser 440 Gly Ser ser ile ser 445 phe Cys Gly 68

Vai Asn ser Asp Thr Ala Asn Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu 450 455 460

Pro Phe Thr Ile Asp Lys 465 470 69

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor da presente solicitação de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2004078912 A [0003] • WO 2007002008 A [0152] • WO 2007124327 A [0152] • WO 2009000891 A [0152] • WO 9737000 A [0152] • EP 1260581 A [0152] • WO 0164846 A [0152] • WO 2006071563 A [0152] • WO 2005113758 A [0152] • WO 9737001 A [0152] • WO 0228422 A [0152] • WO 02067983 A [0152] • WO 02074336 A [0152] • WO 0121151 A [0152] • WO 02097072 A [0152] • WO 2005113756 A [0152] • WO 2008068631 A [0152] • EP 0870508 B [0152] • US 5948410 A [0152] • WO 2007052163 A [0152] • WO 2007052061 A [0152] • WO 9014837 A [0152] • WO 2008043774 A [0152] • US 2007014805 A [0152] • US 20070191314 A [0152] • WO 9511700 A [0152] • US 6080725 A [0152] 2 • WO 2005097181 A [0152] • WO 2006113373 A [0152] • US 61216919 B [0153]

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Claims (15)

1. 72 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para produção de vírus recombinantes, consistindo um passo de crescimento de uma célula hospedeira canina com pelo menos uma construção de expressão que codifica uma molécula de ARN virai, em que a expressão da molécula de ARN virai da construção é controlada por um promotor da Pol I de primata sob condições, nas quais uma molécula de ARN virai é expressa para produzir vírus.
2. 2. Um método de produção de um vírus, consistindo nos seguintes passos: (i) produção de um vírus recombinante utilizando o método da reivindicação 1; (ii) infecção de um hospedeiro em cultura com o vírus obtido no passo (i); (iii) a cultura do hospedeiro a partir do passo (ii) a fim de produzir o vírus; e (iv) a purificação do vírus obtido no passo (iii).
3. 3. Um método para preparação de uma vacina, consistindo nos seguintes passos: (a) preparação de um vírus utilizando o método da reivindicação 2 e (b) preparação da vacina a partir do vírus.
4. 4. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o promotor da Pol I é um promotor da Pol I humano.
5. 5. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a célula é uma célula MDCK.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que a célula MDCK é uma linha celular MDCK 33016 (DSM ACC2219).
7. 7. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a célula inclui pelo menos uma construção de 73 expressão bidireccional.
8. 8. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a construção de expressão é um vector de expressão ou uma construção de expressão linear.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, em que o promotor da Pol I humano compreende a sequência da SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 2.
10. 10. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o vírus é um vírus segmentado.
11. 11. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o vírus é um vírus não segmentado.
12. 12. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o vírus é um vírus de ARN de cadeia negativa.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o vírus é o vírus da gripe.
14. 14. Uma célula hospedeira canina produz um vírus, consistindo pelo menos numa construção de expressão que codifica uma molécula de ARN virai, sendo que a expressão da molécula de ARN virai da construção é controlada por um promotor da Pol I de primata.
15. 15. Uma célula canina que produz um vírus, consistindo pelo menos num promotor da Pol I endógeno que controla a expressão do rARN endógeno e pelo menos num promotor da Pol I de primata não endógeno que controla a expressão de um ARN virai ou o respectivo complemento.