BR102020010208A2 - Construção de ácido nucleico, virus influenza recombinante, método para preparar um virus influenza recombinante, composição, e, uso. - Google Patents

Construção de ácido nucleico, virus influenza recombinante, método para preparar um virus influenza recombinante, composição, e, uso. Download PDF

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Ana Paula De Faria Gonçalves
Lídia Paula Faustino
Igor A. Pereira
Ianca Évelyn Silva De Paula
Marcio Sobreira Silva Araújo
Luciana Pádua Tavares
Pedro Augusto Alves
Marcelo Pascoal Xavier
Kimberly Freitas Cardoso
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Abstract

A presente invenção trata de uma construção de ácido nucleico, um vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação que promove a expressão de uma proteína imunomoduladora em um hospedeiro, aplicável ao desenvolvimento de vacinas contra doenças infecciosas, particularmente, aquelas causadas pelo vírus influenza e Coronavírus.

Description

CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VIRUS INFLUENZA RECOMBINANTE, MÉTODO PARA PREPARAR UM VIRUS INFLUENZA RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO, E, USO. Campo da invenção
[001] A presente invenção posiciona-se no campo da vacinologia, descrevendo variante de vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação, aplicável ao desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas contra doenças infecciosas, particularmente aquelas causadas pelo vírus influenza, por coronavírus ou, ainda no campo da pesquisa biomédica, como ferramenta para propiciar a produção de polipeptídeos imunomoduladores nas vias aéreas.
Antecedentes da invenção
[002] Pandemias de gripe são definidas por um aumento global dramático em morbidez e mortalidade devido ao surgimento de vírus influenza antigenicamente inédito (geralmente de um novo subtipo). Diversos fatores combinam-se para modular a gravidade e a extensão de pandemia, incluindo o grau baixo da imunidade na população, a virulência do vírus influenza pandêmico e a eficiência com que o vírus pode ser transmitido entre os seres humanos. O último é geralmente influenciado não apenas pelas características do vírus, mas também pela densidade da população e facilidade de viajar para dentro e para fora dentro de uma região. O vírus responsável pela pandemia é, em geral, uma variante antigênica recentemente emergida com a qual a maioria da população não teve contato anterior e, portanto, tem pouca ou nenhuma imunidade. A capacidade de se multiplicar e ser transmitido eficientemente em seres humanos são pré-requisitos para a disseminação rápida do vírus na população.
[003] A influenza pandêmica espalha-se muito rapidamente e pode ter impacto devastador. A pandemia mais severa no século 20, a pandemia de 1918, matou mais de 500.000 cidadãos americanos e entre 20 a 40 milhões de pessoas por todo mundo. A pandemia pode produzir ondas de doença, com picos de incidência separados por várias semanas a meses. O início e a disseminação relativamente rápidos da influenza pandêmica acarretam diversos problemas para a resposta a um agravo de saúde global desta magnitude e impõem cargas esmagadoras sobre atendentes de emergência e técnicos de cuidado à saúde. A identificação e resposta rápidas para a pandemia emergente são claramente elementos necessários para minimizar seu impacto. Diversos programas estão em andamento pelo mundo inteiro para monitorar o vírus da influenza emergente, incluindo vírus da influenza aviária, que causa infecções esporádicas, porém, majoritariamente letais em seres humanos. Estes dados de vigilância são usados em conjunção com níveis de alerta de pandemia predefinidos de modo a identificar a probabilidade da ameaça e fornecer orientação para uma resposta eficaz.
[004] A vacinação é a medida de saúde pública mais importante para prevenir doença causada tanto pelas epidemias anuais quanto pelas pandemias de influenza. O curto intervalo entre a identificação de um vírus pandêmico e a sua dispersão ao redor do mundo, a exemplo do que ocorreu durante a pandemia de gripe suína em 2009, representa um desafio significante para produção de vacinas específicas para o vírus pandêmico e em quantidade suficiente para proteger um segmento amplo da população. Os tempos de resposta curtos necessários para produzir uma “vacina pandêmica” não permitem processos prolongados de pesquisa e desenvolvimento para fornecer uma resposta eficaz.
[005] Como solução, a técnica de genética reversa permite a rápida expressão e manipulação recombinante de vírus de RNA em cultura de células, para particular aplicação na produção de vacinas. O método envolve transfectar células hospedeiras com uma ou mais construções de expressão que codificam o genoma viral e subsequente recuperação do vírus a partir das células hospedeiras.
[006] Por exemplo, os documentos WO2007002008 e WO2007124327 descrevem um método de genética reversa no qual o RNA genômico de vírus influenza é expresso em células caninas usando o promotor da RNA polimerase I (pol I) canina. Outras fontes relataram a expressão do RNA genômico de influenza em células humanas usando o promotor humano da pol I.
[007] Mais recentemente, o documento WO2010133964 descreveu um método de genética reversa para produzir vírus influenza recombinante em células hospedeiras utilizando um promotor de pol I exógeno, de um organismo de classe taxonômica distinta (por exemplo, utilizando o promotor de pol I humana em células hospedeiras caninas).
[008] No entanto, apesar de técnicas de genética reversa garantirem agilidade à produção de estirpes vacinais do vírus influenza, as estirpes sazonais mudam anualmente conforme previsão de predominância para o período. Então, é altamente desejável que a próxima geração de vacinas contra influenza confira proteção cruzada contra diferentes estirpes e subtipos do vírus influenza gerando, portanto, uma resposta heterosubtípica.
[009] Neste sentido, a presente invenção representa uma vantagem sobre a atual metodologia de produção de vacinas contra infecções causadas pelos diversos subtipos de vírus influenza. Os vírus recombinantes da presente invenção são capazes de gerar respostas heterosubtípicas de longa duração, protegendo contra vírus influenza antigenicamente distintos mesmo dois meses e meio após o tratamento intranasal. A tecnologia em questão possui ainda a vantagem de proteger indivíduos imunizados contra infecções bacterianas secundárias, responsáveis por grande porcentagem dos quadros complicados e óbitos em pacientes infectados com vírus influenza. Portanto, vacinas compreendendo esses vírus recombinantes, tanto como imunógenos quanto como adjuvante, permitirão contornar os problemas relacionados à frequente incompatibilidade antigênica entre os vírus incluídos na formulação vacinal e aqueles circulantes na população, assim como mitigar problemas relacionados a infecções bacterianas secundárias.
[0010] Adicionalmente, a presente invenção pode ser empregada no campo da pesquisa biomédica como ferramenta para propiciar a expressão tópica de polipeptídios imunomoduladores nas vias aéreas. Assim, a invenção permite avaliar o papel das referidas proteínas imunomoduladoras no estabelecimento, progressão e resolução de processos inflamatórios ou infecciosos no trato respiratório, a exemplo daqueles provocados pelos vírus influenza e por coronavírus.
[0011] Kang e colaboradores demonstraram que a administração de proteínas imunomoduladoras pela via intranasal, mais especificamente interleucina-7 (IL-7), é capaz de induzir resposta profilática contra infecção subsequente por vírus influenza em camundongos. Proteção completa é obtida quando o desafio com o vírus influenza ocorre até 14 dias após tratamento nasal dos camundongos com IL-7 fusionada a Fc (Kang et al. "Intranasal introduction of Fc-fused interleukin-7 provides long-lasting prophylaxis against lethal influenza virus infection." Journal of virology 90.5 (2016): 2273-2284).
[0012] Entretanto, o desenvolvimento de uma vacina contra vírus influenza requer obter uma resposta imunológica heterosubtípica de longa duração, de forma a manter um indivíduo protegido contra exposições subsequentes ao agente infeccioso. Kang e colaboradores demonstram que a administração de IL-7-Fc via intranasal é capaz de promover um ambiente imunológico favorável ao combate a infecções respiratórias, através da proliferação e ativação dos leucócitos nos pulmões. Apesar disso, a estratégia utilizada por esses autores não é capaz de gerar resposta de memória, pois não há estímulo antigênico específico e, portanto, não há ativação das células e fatores de transcrição necessários para que ocorra a diferenciação celular. A formação de uma resposta de memória é dependente da apresentação do antígeno por células apresentadoras de antígeno (APC’s) (e.g. células dendríticas e macrófagos) capazes de ativar as células da imunidade adaptativa, tais como linfócitos T e B, responsáveis pela imunidade de memória de longa duração (Devarajan P, et al. New Insights into the Generation of CD4 Memory May Shape Future Vaccine Strategies for Influenza. Front Immunol. 2016;7:136). De fato, a expressiva redução da proteção após 21 e 35 dias demonstra que o estímulo inespecífico local obtido por Kang e colaboradores é transitório, ao contrário do que ocorre na presença do antígeno viral (Jones PD, Ada GL. Influenza virus-specific antibody-secreting cells in the murine lung during primary influenza virus infection. J Virol. 1986;60(2):614-619). Como já demonstrado, o estímulo antigênico viral é fundamental para a formação dos tecidos linfoides associados aos brônquios e/ou à região nasal, BALT e NALT respectivamente, importantes para a manutenção das células de memória por longos períodos (Onodera T, et al. Memory B cells in the lung participate in protective humoral immune responses to pulmonary influenza virus reinfection. PNAS 2012;109(7):2485-2490).
[0013] Em camundongos, considera-se que a definição de memória imunológica é aquela mensurada após 50 dias após a inoculação (Hye Mee Joo et al. Broad dispersion and lung localization of virus-specific memory B cells induced by influenza pneumonia; Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A virus infection. PNAS 2008, 105 (9) 3485-3490). No entanto, não é possível comparar diretamente a duração da imunidade em humanos com aquela avaliada no modelo animal (camundongo), considerando principalmente as diferenças no tempo de vida e população/fenótipo celular entre ambos, os quais interferem na cinética e duração da resposta imune (Boyden, A.W., Frickman, A.M., Legge, K.L. et al. Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A virus infection. Immunol Res 59, 73-80 (2014)).
[0014] Não há relatos na literatura sobre qual seria a duração propícia da resposta heterosubtípica em humanos, porém diversos estudos demonstram que a pré-existência de linfócitos T (CD4+ e/ou CD8+) em indivíduos com ausência de anticorpos de resposta cruzada está relacionada com a redução dos sintomas da doença, da difusão viral e consequentemente, do agravamento da doença. Estas células reconhecem principalmente antígenos internos altamente conservados entre diferentes subtipos de influenza, tais como NB, PB1, M1 e M2 e, embora não sejam capazes de neutralizar a partícula viral, limitam sua replicação nas vias aéreas, reduzindo a morbidade associada à doença e o risco de morte (Wilkinson, T., Li, C., Chui, C. et al. Preexisting influenza-specific CD4+ T cells correlate with disease protection against influenza challenge in humans. Nat Med 18, 274-280 (2012); Sridhar, et al. Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza. Nat Med 19, 1305-1312 (2013).; Hayward AC, et al. Natural T Cell-mediated Protection against Seasonal and Pandemic Influenza. Results of the Flu Watch Cohort Study. Am J Respir Crit Care Med. 2015;191(12):1422-1431). Um estudo recente (2019) utilizou furões, modelo padrão-ouro para infecção por influenza humana, para análise da resposta cruzada induzida por uma infecção prévia. Os autores demonstraram que os animais infectados com uma baixa dose de influenza A H1N1 (100 PFU) foram parcialmente protegidos frente ao desafio com um isolado heterosubtípico H3N2 após 28 dias, com redução dos sintomas e da difusão viral, sugerindo uma proteção mediada por linfócitos T de memória, uma vez que não foram detectados anticorpos neutralizantes anti-H3N2 (Gooch KE, et al. Heterosubtypic cross-protection correlates with cross-reactive interferon-gamma-secreting lymphocytes in the ferret model of influenza. Sci Rep. 2019;9(1):2617). Em outro estudo que propõe o desenvolvimento de uma vacina universal contra o influenza, os autores utilizaram um vírus recombinante codificando diferentes proteínas do vírus e o gene da citocina IL-15 como adjuvante e relataram significativa proteção cruzada contra outros subtipos de influenza 21 dias após a terceira dose da vacinação subcutânea (Valkenburg et al. Protection by universal influenza vaccine is mediated by memory CD4 T cells. Vaccine, 2018, 4198-4206).
[0015] De qualquer maneira, a duração propícia da resposta vacinal heterosubtípica em humanos para desenvolvimento de uma vacina contra influenza deveria ser no mínimo de 2-4 meses, de forma a garantir maior proteção durante a temporada de maior circulação do vírus, que ocorre logo após as campanhas de vacinação.
[0016] O carreamento da proteína imunomoduladora Il-7 por um vírus influenza, como alcançado pela presente invenção, possibilita a produção da referida proteína diretamente nas células infectadas, de forma transiente e localizada, resultando na geração de resposta imune heterosubtípica de memória. Assim, é possível obter proteção contra vírus influenza antigenicamente distintos daquele utilizado na vacinação. Ao contrário dos resultados de Kang et al., a proteção obtida na presente invenção se mantém mesmo quando o desafio com o vírus é realizado dois meses e meio após a inoculação intranasal, demonstrando que há indução de memória imunológica. O vírus recombinante FluIL-7 se mostrou seguro e incapaz de causar doença nos camundongos inoculados, não há necessidade de revacinação e a proteção heterosubtípica foi observada em tempos mais tardios (30 e 60 dias após a imunização) que os estudos acima mencionados.
[0017] Finalmente, é de grande relevância o fato de que a imunização com vírus influenza codificando a IL-7 foi capaz de conferir proteção contra infecção bacteriana secundária causada por Streptococcus pneumoniae. Infecções bacterianas secundárias, sobretudo aquelas causadas por S. pneumoniae, são responsáveis pelas complicações mais graves dos quadros de influenza, resultando em pior prognóstico, sobretudo em crianças e idosos. Um outro aspecto marcante da presente invenção consiste na atuação das proteínas imunomoduladoras em processos inflamatórios ou infecciosos provocados por coronavírus.
[0018] A invenção passará a ser apresentada com maiores detalhes abaixo.
Breve descrição da invenção
[0019] A invenção é, em sua essência, um vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação que expressa uma proteína imunomoduladora.
[0020] Em uma modalidade da invenção, a referida proteína imunomoduladora pode ser uma quimiocina ou uma citocina. Preferencialmente, a dita proteína é uma citocina da classe das interleucinas, particularmente, a interleucina 7 (IL-7).
[0021] Em uma forma particular da invenção, o vírus influenza recombinante é obtido a partir de uma construção de ácido nucleico que compreende um gene da neuraminidase (NA) truncado pela remoção de sua porção medial e na qual foi inserida a sequência que codifica a proteína imunomoduladora.
[0022] Em outra modalidade, a construção de ácido nucleico compreende adicionalmente uma região promotora e uma região terminadora heterólogas. Ainda, em uma modalidade da invenção, a referida região promotora é a região promotora da RNA Polimerase I (Pol I) humana.
[0023] Em outra modalidade, a construção de ácidos nucleicos de que trata a invenção é aquela descrita pela SEQ ID NO: 1 correspondente ao plasmídeo pPRNA166x178.
[0024] Ainda, em uma de suas modalidades, a construção de ácido nucleico de que trata a invenção compreende a sequência terminadora da ribozima do vírus da hepatite delta; seguida de (i) um promotor truncado da Pol I humana; (ii) sequência codificadora dos primeiros 166 nucleotídeos da neuraminidase, em que todas as trincas ATG foram mutadas; (iii) sequência codificadora dos últimos 178 nucleotídeos da neuraminidase (iv) promotor 3’ da neuraminidase; (v) repetição dos últimos 42 nucleotídeos da ORF da neuraminidase; e (vi) promotor truncado da RNA Pol I humana; em que uma sequência codificando uma proteína imunomoduladora está inserida entre os primeiros 166 e os últimos 178 nucleotídeos da neuraminidase.
[0025] Outra modalidade da invenção prevê um vírus influenza recombinante que compreende um gene da neuraminidase truncado, no qual foi inserida a sequência nucleotídica correspondente ao gene de uma proteína imunomoduladora.
[0026] Em uma modalidade, nucleotídeos correspondentes às porções 3’ e 5’ do gene da neuraminidase flanqueiam o gene que codifica uma proteína imunomoduladora de SEQ ID NO: 5.
[0027] Em outras modalidades, nucleotídeos correspondentes às porções 3’ e 5’ do gene da neuraminidase flanqueiam o gene que codifica uma proteína imunomoduladora de SEQ ID NOs: 6 ou 7.
[0028] Uma modalidade adicional compreende um método para preparar um vírus influenza recombinante que, por sua vez, compreende as etapas de (i) preparar a construção de ácido nucleico compreendendo o gene de neuraminidase truncado e o gene da proteína imunomoduladora; (ii) expor células hospedeiras, concomitantemente, à construção da etapa (i) e a um ou mais plasmídeos codificando os segmentos NP, PA, PB1, PB2, M1, NS e HA do vírus influenza; (iii) recuperar vírus influenza recombinante a partir do sobrenadante.
[0029] Em uma forma particular da invenção, os referidos plasmídeos da etapa (ii) acima codificam cDNA que codificam pelo menos sete segmentos de RNA viral do vírus influenza A/PR8/34 (PR8).
[0030] Em outra modalidade, os referidos plasmídeos da etapa (ii) acima codificam o número mínimo de segmentos de RNA viral necessário para a síntese de partículas virais. Sendo o referido número mínimo de segmentos de RNA viral pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6 ou pelo menos 7.
[0031] Ainda, em outra modalidade, o método de preparar o vírus influenza recombinante compreende as etapas adicionais de infectar um substrato com o vírus influenza recombinante recuperado na etapa (iii) acima e purificar o vírus do substrato.
[0032] Outra modalidade da invenção se refere a uma composição imunogênica compreendendo o vírus influenza recombinante e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0033] A referida composição imunogênica é, em uma modalidade alternativa, capaz de induzir resposta imune heterosubtípica de longa duração. Ainda, tal composição é preferivelmente administrada pela via intranasal.
[0034] Por fim, a invenção também inclui o uso do vírus influenza para preparar uma composição imunogênica para prevenir ou tratar infecções causadas por vírus influenza, por coronavírus e infecções bacterianas secundárias, para ser utilizado como adjuvante em vacinas, ou como ferramenta para propiciar a expressão tópica de polipeptídios imunomoduladores nas vias aéreas.
Breve descrição das figuras
[0035] FIGURA 1: Representação esquemática da construção do plasmídeo pPRNA166x178 e pPRNA166-IL-7-178 (A) O plasmídeo pPRNA166x178 é derivado do plasmídeo pPR-NA, o qual contém o cDNA do segmento completo da NA em orientação negativa sob o controle do promotor truncado da polimerase I humana e da ribozima do vírus da hepatite delta. Para obtenção de pPRNA166x178, primeiramente foram introduzidos um promotor 3’ adicional e um sítio de clonagem XhoI/NheI nesse plasmídeo. Os últimos 42 nucleotídeos da ORF da NA (quadrado branco) foram então duplicados, para conservar a integridade da extremidade 5’ da neuraminidase ao longo dos seus últimos 70 nucleotídeos, resultando no plasmídeo pPR-NA38. A truncagem da NA se deu pela substituição da ORF presente no plasmídeo pelos primeiros 169 nucleotídeos e os últimos 178 nucleotídeos do segmento da NA, flanqueando o sítio múltiplo de clonagem e removendo os nucleotídeos 170-1232. Os primeiros 166 nucleotídeos da NA foram então substituídos por uma sequência contendo todas as trincas ATG (nucleotídeos 20-22; 62-64; 115-117; 163-165) mutadas para a trinca CTA. (B) pPRNA166-IL-7-178 foi obtido a partir da clonagem da sequência heteróloga da interleucina 7 murina (IL-7), construída sob a forma de um gene sintético utilizando a sequência do cDNA correspondente, no sítio de clonagem reconhecido pelas enzimas de restrição XhoI/NheI.
[0036] FIGURA 2: Genética reversa do vírus influenza. Os vírus recombinantes foram obtidos por genética reversa segundo a metodologia descrita por Kawaoka e colaboradores (Fujii Y, Goto H, Watanabe T, Yoshida T, Kawaoka Y. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Feb 18;100(4):2002-7), com modificações. Assim, co-culturas de células HEK 293T e MDCK (cultivadas em meio de cultura DMEM com antibióticos e suplementada com 10% SFB) foram co-transfectadas com o plasmídeo codificando um segmento da NA recombinante contendo ou não IL-7 (pPRNA166-IL-7-178 e pPRNA166x178, respectivamente) e outros sete plasmídeos codificando os demais segmentos do vírus influenza PR8 (NP, PA, PB1, PB2, M1, NS e HA). Foi utilizado 250 ng de cada plasmídeo em 12 μl de Fugene HD (Promega), permitindo a reconstituição de 8 complexos ribonucleoprotéicos funcionais in vivo e, desta forma, a transcrição e a replicação dos segmentos virais. Vinte e quatro horas após a transição, o meio de cultura foi substituído por meio de cultura DMEM com antibióticos e suplementado com tripsina TPCK (SIGMA) e neuraminidase de Vibrio cholerae (SIGMA). Os sobrenadantes foram coletados 72 horas após a transfecção. Após uma etapa de amplificação em células MDCK, os vírus transfectantes foram clonados e posteriormente amplificados em células MDCK. Os vírus influenza recombinantes carreando o segmento NA166x178 serão doravante denominados Flu-CT (vírus controle), enquanto os vírus carreando o segmento NA166-IL7-178 serão doravante chamados de Flu-IL7.
[0037] FIGURA 3: Caracterização dos vírus influenza recombinantes carreando o gene da interleucina 7 em cultura celular. Os vírus influenza recombinantes defectivos para a multiplicação carreando a sequência da IL-7 murina (Flu-IL7), construídos por genética reversa, foram avaliados quanto à capacidade de produzir IL-7 em cultura celular. Monocamadas de células MDCK foram infectadas com vírus Flu-IL7 ou Flu-CT (m.o.i = 0,001), ou PBS (Mock) na presença de tripsina TPCK e neuraminidase do Vibrio cholerae. A infecção das células MDCK foi realizada na MOIs diferentes: 0,01. O sobrenadante da cinética foi coletado 8h, 24h, 48h, 72h para mensuração de IL-7 por reação enzimática através do ELISA. Os resultados estão representados em gráfico de barras, onde estão plotadas as médias e o erro padrão da média de produção da citocina em cada tempo. No eixo x estão representados os tempos avaliados em horas e no eixo y a produção de citocina em pg/mL. As diferenças estatisticamente significativas (p <0,05) estão representadas por asterisco (*). (A). Macrófagos murinos derivados de monócitos de medula óssea foram infectados com PBS (Mock) ou com o vírus Flu-IL7 ou Flu-CT (m.o.i = 0,1 e 0,01) (B). Em tempos previamente determinados, os sobrenadantes das culturas de células MDCK e dos macrófagos foram coletados, clarificados por centrifugação à baixa velocidade e congelados a -80°C. A produção da IL-7 foi avaliada pela técnica de ELISA em ambos os casos.
[0038] FIGURA 4: Cinética da produção da citocina IL-7 nos pulmões e no lavado bronco-alveolar (BALF) dos camundongos infectados. Camundongos C57BL/6 foram anestesiados e inoculados com diferentes doses de vírus recombinante Flu-IL7 (102-104 pfu/animal pela via intranasal) ou Flu-CT (104 pfu/animal pela via intranasal) em 25 μl de PBS. Animais do grupo mock foram inoculados somente com 25 μl de PBS. Os animais foram eutanasiados em tempos previamente determinados (12, 24, 48 e 72 horas após a infecção) para a coleta do lavado broncoalveolar e pulmões e quantificação da citocina IL-7 pela técnica de ELISA. Os resultados dos níveis da IL-7 nos pulmões (A) e no lavado bronco-alveolar (B) estão representados.
[0039] FIGURA 5: Vírus influenza recombinantes carreando genes de citocinas murinas como ferramenta para avaliação do seu papel na imunopatogênese: inoculação do 0,01 LD50 do vírus PR8. Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos que foram inoculados via intranasal com PBS (Mock), 102 PFU de PR8 ou co-infectados com 102 PFU de PR8 e Flu-CT ou Flu-IL7, diluídos em PBS no volume de 20μL (inóculo). Os animais foram acompanhados por 17 dias para avaliação do peso. Perda de peso total (A). Os resultados estão representados em gráficos Box plot, em que estão plotadas as medianas, 1° e 3° quartis e valores mínimo e máximo para cada grupo. Perda de peso por tempo (B). Os resultados estão representados em gráficos de símbolos e linhas, em que estão plotadas as médias e erro padrão da média para cada grupo/tempo. A análise estatística foi realizada entre os grupos coinfectados e o grupo que recebeu apenas PR8. As diferenças estatisticamente significativas (p <0,05) estão representadas por letras que associam a significância com determinado grupo: (a) Mock, (b) PR8, (c) Flu-CT+ PR8, (d) Flu-IL7 + PR8.
[0040] FIGURA 6: Vírus influenza recombinante Flu-IL7 como ferramenta para o desenvolvimento de vacina capaz de conferir proteção heterosubtípica. Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos que foram inoculados via intranasal com: (i) PBS; (ii) 104 PFU do vírus Flu-CT; (iii) 104 PFU do vírus Flu-IL7 ou (iv) com uma dose sub-letal (250 PFU) de um vírus influenza de subtipo H3N2. Dois meses e meio após a primo-inoculação, os animais foram desafiados com 250 PFU do vírus de subtipo H3N2 ou inoculados com PBS (Mock). Os animais foram acompanhados por 16 dias para avaliação do peso. Perda de peso total (A). Os resultados estão representados em gráficos Box plot, em que estão plotadas as medianas, 1° e 3° quartis e valores mínimo e máximo para cada grupo. Perda de peso por tempo (B). Os resultados estão representados em gráficos de símbolos e linhas, em que estão plotadas as médias e erro padrão da média para cada grupo/tempo. Em ambos os gráficos as diferenças estatisticamente significativas (p <0,05) estão representadas por letras que associam a significância com determinado grupo: (a) PBS - PBS, (b) PBS - H3N2, (c) H3N2 -H3N2 (d) Flu-CT - H3N2, (e) Flu-IL7 - H3N2.
[0041] FIGURA 7: Vírus influenza recombinante Flu-IL7 e proteção contra infecções bacterianas secundárias. Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos (8 animais) que foram imunizados via intranasal (40μL/animal) com 102 PFU/animal de PR8 (dose subletal), PBS 1x (Mock) ou coinoculados com 102 PFU/animal de PR8 e 104 PFU/animal de Flu-IL-7 ou de Flu-Ct. Dez dias após a infecção os camundongos foram desafiados com uma dose de 102 CFU/animal de bactérias (gram-positivas) Streptococcus pneumoniae sorotipo ATCC6303. Quarenta e oito horas após o desafio os animais foram eutanasiados e tiveram seus pulmões coletados em ambiente estéril para determinação da carga bacteriana por titulação em placa ágar-sangue. O experimento foi realizado em triplicata. Os dados estão plotados em diagrama de caixa, nos quais estão representadas as medianas e valores mínimo e máximo para cada grupo no eixo x e no eixo y os valores da titulação bacteriana (UFC/pulmão). Diferenças estatisticamente significativas estão representadas por barras e asteriscos, conforme o grau de significância: (*) p=0,01 - 0,05, (**) p= 0,001 - 0,01 e (***) p< 0.001.
Descrição detalhada da invenção
[0042] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. As técnicas convencionais de biologia molecular e imunologia são bem conhecidas de um técnico no assunto. O relatório descritivo também provê definições de termos para auxiliar na interpretação daquilo que é aqui descrito e das reivindicações. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo “cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.
DEFINIÇÕES
[0043] Os termos “ácido nucleico, polinucleotídeo, sequência de polinucleotídeo” e “sequência de ácido nucleico” referem-se a polímeros de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo de filamento único ou de filamento duplo ou quimeras ou análogos destes. A menos que de outro modo indicado, uma sequência particular de ácido nucleico desta invenção abrange sequências degeneradas e sequências complementares, além da sequência explicitamente indicada.
[0044] O termo “gene” é amplamente usado para se referir a qualquer polinucleotídeo que codifica uma instrução relativa a uma função biológica. De modo geral, genes compreendem sequências codificadoras e podem, ainda, conter regiões não codificadoras, que regulam a expressão da porção codificadora. O termo “gene” aplica-se a uma sequência genômica específica, a um RNA mensageiro (mRNA) codificado por uma sequência genômica e a um DNA complementar (cDNA) a um mRNA.
[0045] As regiões não codificadoras de genes podem incluir um ou mais segmentos que, por exemplo, formam sequências de reconhecimento para outras proteínas. Tais segmentos não codificadores incluem “promotores” e “amplificadores,” para que as proteínas reguladoras tais como fatores de transcrição se liguem, resultando na transcrição de sequências adjacentes ou vizinhas.
[0046] “Promotor” ou “sequência promotora” refere-se a uma sequência de DNA cuja função é regular a expressão de um gene, iniciando a transcrição de uma sequência de ácido nucleico ao qual está funcionalmente ligado. A regulação de expressão do gene pode ser determinada de forma temporal, espacial e/ou fisiológica.
[0047] O termo “construção” denota uma sequência polinucleotídica contendo pelo menos um gene funcionalmente ligado a pelo menos um promotor. “Por funcionalmente ligado” entende-se que um promotor está posicionado em relação a uma sequência codificadora de tal forma que o promotor dirija ou regule a expressão do ácido nucleico. A referida construção pode ser posteriormente introduzida em um vetor de expressão. Tanto a construção em si quanto o vetor de expressão podem ser subsequentemente introduzidos em uma célula hospedeira para promover a expressão de um ou mais genes.
[0048] Um “vetor de expressão” é um vetor, tal como um plasmídeo, que é capaz de promover a expressão, por exemplo, transcrição, de uma sequência de polinucleotídeos codificante incorporada nele. Os vetores de expressão podem ser de replicação autônoma ou que não replicam de modo autônomo. Tipicamente, a sequência do polinucleotídeo a ser expresso é “funcionalmente ligado” a um promotor e/ou amplificador que regula sua transcrição.
[0049] O termo “introduzido”, quando referente a um gene heterólogo ou polinucleotídeo isolado, refere-se à incorporação de um polinucleotídeo em uma célula eucariótica ou procariótica onde o ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, DNA cromossômico, plasmídico, plastídeo ou mitocondrial), convertido em um replicon autônomo ou transitoriamente expresso (por exemplo, mRNA transfectado). O termo inclui tais métodos como “infecção,” “transfecção,” “transformação” e “transdução.” No contexto da invenção, uma variedade de métodos pode ser utilizada para introduzir polinucleotídeos em células eucarióticas, incluindo eletroporação, transfecção mediada por lipídeo (lipofecção), microinjeção, transferência mediada por vírus, etc.
[0050] O termo “codificar,” como aqui usado, refere-se à propriedade de um ácido nucleico, por exemplo, ácido desoxirribonucleico (DNA), para transcrever um ácido nucleico complementar, incluindo um ácido nucleico que pode ser traduzido em um polipeptídeo. Por exemplo, um DNA pode codificar um ácido ribonucleico (RNA) que é transcrito a partir daquele DNA. Similarmente, o DNA pode codificar um polipeptídeo traduzido a partir de um RNA transcrito do DNA.
[0051] O termo “truncado”, conforme usado ao longo do presente relatório, denota a interrupção de uma cadeia polinucleotídica ou polipeptídica, impedindo o funcionamento fisiológico esperado da referida sequência truncada. Por exemplo, um gene de neuraminidase truncado, conforme aqui descrito, corresponde a sequência polinucleotídica que codifica uma neuraminidase que foi interrompida pela remoção de um fragmento medial da sequência nativa.
[0052] O termo “célula hospedeira” significa uma célula no qual um ácido nucleico foi introduzido, tal como um vetor, e inclui também a progene desta célula que também possua este ácido nucleico. As células hospedeiras podem ser células procarióticas, como células bacterianas, ou eucarióticas, como, por exemplo, células de levedura, de inseto, de anfíbios, de aves ou de mamíferos.
[0053] O termo “recombinante” indica que o material (por exemplo, um ácido nucleico ou proteína) foi artificial ou sinteticamente (não naturalmente) modificado pela intervenção humana. Especificamente, quando da referência a um vírus, por exemplo, um vírus da influenza, o vírus é recombinante quando o mesmo é produzido pela expressão de um ácido nucleico recombinante.
[0054] O termo “composição imunogênica” denota uma preparação que contém uma substância capaz de induzir uma resposta imunológica, humoral e/ou celular, de memória contra uma ou mais doenças. De modo geral, a substância indutora de resposta, comumente denominada de “antígeno”, costuma ser parte ou o todo do agente causador da doença da qual se deseja proteger.
[0055] A capacidade de um antígeno induzir uma resposta imunológica é dita “imunogenicidade”. Por exemplo, composição imunogênica contra infecções causadas pelos diversos tipos de vírus influenza podem ser produzidas a partir de proteínas estruturais do(s) subtipo(s) viral(virais) contra os quais se deseja proteção. Alternativamente, as referidas vacinas podem ser produzidas com vírus íntegros, porém, inativados ou com capacidade infecciosa atenuada.
[0056] A resposta imunológica gerada por um antígeno pode ser específica para um agente causador de doença ou pode ser capaz conferir proteção contra mais de um agente. Particularmente no caso de composições imunogênicas contra o vírus influenza, cada antígeno pode gerar uma resposta contra uma única estirpe viral. Quando um único antígeno é capaz de gerar resposta imunológica contra diversas estirpes de outros subtipos de vírus influenza, a resposta imunológica é então denominada “heterosubtípica”.
[0057] A resposta heterosubtípica de longa duração é definida como uma resposta que ativa memória imunológica, protegendo contra vírus influenza antigenicamente distintos 2 meses ou mais após o tratamento.
[0058] A resposta imunológica a um antígeno pode se tornar mais eficaz quando a composição imunogênica contém um ou mais adjuvantes. No presente contexto, adjuvantes são substâncias de origem sintética, orgânica ou inorgânica, ou biológica que aumentam a eficácia de uma resposta imunológica quando administradas juntamente com um antígeno.
[0059] Ainda, proteínas imunomoduladoras podem fazer parte de uma composição imunogênica capaz de induzir resposta imune heterosubtípica da presente invenção. Neste contexto, o termo “proteína imunomoduladora” denota um polipeptídeo com atividade biológica regulatória sobre o funcionamento de células do sistema imunológico.
[0060] Portanto, uma proteína imunomoduladora pode ser empregada para restaurar o equilíbrio natural ou para intensificar a atividade do sistema imunológico de um paciente. Conforme desejável na presente invenção, a proteína imunomoduladora aumenta a atividade do sistema imunológico, contribuindo para a resposta gerada contra o antígeno. A grosso modo, proteínas imunomoduladoras incluem quimiocinas e citocinas como, por exemplo, MIP-1 (Macrophage Inflammatory Protein), MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein), G-CSF (Granulocyte-colony stimulating factor), GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor), TNF-α (Tumor Necrosis Factor), interferons e interleucinas.
[0061] Composições imunogênicas podem ser formuladas para qualquer maneira de administração incluindo, por exemplo, oral, intranasal ou parenteral. O termo parenteral, conforme usado aqui, inclui injeção subcutânea, intradérmica, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular, espinhal, intracraniana, intratecal e intraperitoneal, bem como qualquer técnica de injeção ou infusão similar. Em certas modalidades, a administração por via intranasal pode ser preferida.
MODALIDADES
[0062] A presente invenção representa um avanço sobre o estado da arte ao fornecer um vírus influenza recombinante, defectivo para multiplicação, capaz de gerar resposta imunológica heterosubtípica de longa duração.
[0063] Sem qualquer intenção de limitar a amplitude inferencial dos fenômenos aqui representados experimentalmente, os inventores demonstraram que a expressão de IL-7 concomitantemente à exposição ao vírus influenza in vivo em um indivíduo confere proteção de longa duração contra outros subtipos do referido vírus e contra infecções bacterianas secundárias, podendo ser utilizada também no tratamento de infecções causadas por coronavírus, como, por exemplo, os coronavírus associados a síndromes respiratórias agudas graves (SARS-CoV e SARS-CoV-2).
[0064] A expressão concomitante de IL-7 foi alcançada pela introdução de um gene codificando tal citocina entre segmentos que codificam as porções 3’ e 5’ da neuraminidase viral. Devido à truncagem do gene da neuraminidase pela remoção de sua porção medial, o vírus influenza recombinante tornou-se defectivo para multiplicação sendo, portanto, incapaz de se multiplicar in vivo.
[0065] Outras estratégias podem ser exploradas para o desenvolvimento de vírus influenza recombinantes defectivos para a multiplicação. Isto inclui a mutação de sequências do NS responsáveis pelo processamento do RNA mensageiro em NS1 e NS2 (Wolschek, M. et al. Establishment of a chimeric, replication-deficient influenza A virus vector by modulation of splicing efficiency. J Virol 85, 2469-2473, 2011), deleção da sequência codificadora da proteína da hemaglutinina (HA) (Watanabe, T., Watanabe, S., Noda, T., Fujii, Y. & Kawaoka, Y. Exploitation of nucleic acid packaging signals to generate a novel influenza virus-based vector stably expressing two foreign genes. J Virol77, 10575-10583, 2003) ou da proteína PB2 (Uraki, R. et al. A Bivalent Vaccine Based on a PB2-Knockout Influenza Virus Protects Mice From Secondary Pneumococcal Pneumonia. J Infect Dis 212, 1939-1948, 2015). Nestes casos, faz-se necessário o uso de linhagens celulares, constitutivamente transfectadas para produzirem a HA ou PB2 virais ou de células que não produzem interferon (em se tratando do vírus influenza com segmento NS modificado).
[0066] Um técnico no assunto compreenderá que os experimentos aqui descritos são representativos de um conceito que engloba (i) uma construção de ácido nucleico compreendendo um gene da neuraminidase truncado no qual foi inserida a sequência que codifica uma proteína imunomoduladora; (ii) um vírus influenza recombinante compreendendo a construção de ácidos nucleicos (i); um método para preparar o vírus influenza recombinante; (iii) uma composição imunogênica; e (iv) o uso do vírus influenza recombinante, como imunógeno ou adjuvante, para preparar uma vacina para prevenir infecções causadas por vírus influenza e infecções bacterianas secundárias ou como ferramenta para propiciar a expressão tópica de polipeptídios imunomoduladores nas vias aéreas. Adicionalmente, a invenção também engloba o uso do vírus influenza recombinante no preparo de uma vacina terapêutica em infecções causadas por coronavírus.
[0067] Em certas formas de realização, o vírus é um vírus da influenza do tipo A ou B, tendo segmentos de RNA viral (vRNA) derivados de um ou mais do que um vírus percursor. Em certas formas de realização, o vírus influenza recombinante é um vírus defectivo para multiplicação.
[0068] Em certas formas de realização, o vírus influenza recombinante é defectivo para multiplicação por possuir uma neuraminidase truncada, que não é funcional. Ainda, a neuraminidase do vírus influenza recombinante não é funcional devido à remoção de sua porção medial (nucleotídeos 170-1232).
[0069] Em algumas formas de realização, a proteína heteróloga produzida pelo vírus é uma proteína imunomoduladora. Nestas modalidades, a referida proteína imunomoduladora pode ser uma quimiocina. Em formas alternativas, a proteína imunomoduladora pode ser uma citocina. Preferencialmente, a proteína imunomoduladora é uma interleucina (IL) como, por exemplo, IL-15, IL-17, IL-4, IFN-G e, particularmente, IL-7.
[0070] Para os fins desta invenção, a sequência nucleotídica que codifica a IL-7 origina, preferencialmente, uma IL-7 de mesma origem biológica que o indivíduo que se deseja proteger ou tratar de uma infecção por vírus influenza ou por coronavírus. Por exemplo, para proteger um indivíduo humano, a sequência nucleotídica que codifica a IL-7 utilizada na construção da invenção codifica uma IL-7 humana. Da mesma forma, para a proteção de porcos, utiliza-se IL-7 suína. Ilustrativamente, a aplicação da construção descrita é exemplificada adiante utilizando o homólogo murino da IL-7, pois, em fase experimental de desenvolvimento da tecnologia, sua eficácia foi avaliada em modelo murino de infecção por vírus influenza. Neste sentido, será evidente para o técnico no assunto a utilização da sequência nucleotídica que codifica a IL-7 adequada à construção desejada.
[0071] Sequências nucleotídicas que codificam IL-7 humana ou homólogos, por exemplo, de camundongo (murina), suínos, equinos, rato ou macaco rhesus são conhecidas do técnico no assunto. Em algumas espécies (ex. humanos e camundongos), há relatos de que o produto transcrito do gene da IL-7 está sujeito a processamentos pós-transcricionais (splicing) alternativos, resultando em mais de uma variante. A despeito das variações, as sequências correspondentes podem ser encontradas em repositórios públicos, como, por exemplo, no GenBank, sob os números de acesso NM_000880.4 (Homo sapiens; variante de transcrição 1; SEQ ID NO: 2), NM_214135.2 (Sus scrofa domesticus; SEQ ID NO 3), NM_008371.5 (Mus musculus; variante de transcrição 1; SEQ ID NO: 4), NM_013110 (Ratus novergicus), NM_001032846 (Macaca mulatta) e XM_519820 (Pan troglodytes; variante de transcrição 1).
[0072] Os polipeptídeos derivados das sequências nucleotídicas que codificam IL-7 também estão disponíveis em bancos de dados públicos e são conhecidos do técnico no assunto. Por exemplo, a variante de transcrição 1 do gene da IL-7 humana, quando traduzida, produz uma proteína de 177 aminoácidos, sendo que os aminoácidos 1-25 da porção N-terminal compõem um peptídeo sinal que é clivado durante o processamento pós-traducional da proteína. Assim, o polipeptídeo maduro da IL-7 corresponde a uma sequência de 152 aminoácidos (SEQ ID NO: 5).
[0073] O técnico no assunto compreenderá que o componente do efeito técnico da presente invenção atribuído à IL-7 está centrado na capacidade da IL-7 se ligar ao receptor de IL-7 (IL-7R) e transduzir um sinal através do referido receptor. Portanto, será evidente para o técnico no assunto que a sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína imunomoduladora, particularmente uma IL-7, pode ser uma sequência que codifique qualquer polipeptídeo capaz de, neste caso, interagir com e ativar o IL-7R.
[0074] A presente invenção engloba moléculas de ácidos nucleicos contendo porções que codificam uma IL-7, em que as ditas porções são sequências de ácidos nucleicos com pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas às sequências de ácidos nucleicos descritas pelas SEQ ID NO: 2, 3 ou 4. As moléculas de ácidos nucleicos que são pelo menos 95% idênticas àquela representada pela SEQ ID NO: 2 são particularmente preferidas.
[0075] Em outra forma de realização, a invenção faz uso de sequências de ácido nucleico que codificam uma IL-7 que são pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas às sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 5, 6 ou 7.
[0076] Em certa modalidade da invenção, a sequência nucleotídica que codifica uma proteína imunomoduladora, preferencialmente uma IL-7, é introduzida em um vetor de expressão compreendendo a sequência correspondente ao gene de neuraminidase viral truncado. De modo geral, a sequência que codifica a proteína imunomoduladora, preferencialmente uma IL-7, é introduzida entre sequências nucleotídicas correspondentes às regiões 3’ e 5’ do gene da neuraminidase. Particularmente, a sequência que codifica a proteína imunomoduladora, preferencialmente uma IL-7, é introduzida imediatamente após o 166° nucleotídeo, sentido 3’-5’, da sequência que codifica a neuraminidase.
[0077] Particularmente, o vetor que codifica a neuraminidase truncada é o pPRNA166x178 (SEQ ID NO: 1). O referido vetor contém a ORF da referida neuraminidase em orientação negativa. A expressão da neuramidase está impossibilitada devido à remoção de sua porção medial (nucleotídeos 170-1232) e substituição de todas as trincas ATG dos primeiros 166 nucleotídeos para a trinca CTA (nucleotídeos 20-22; 62-64; 115-117; 163165). Um técnico no assunto reconhecerá que a sequência nucleotídica que codifica uma proteína imunomoduladora, preferencialmente uma IL-7, pode ser introduzida no plasmídeo pPRNA166x178 através de técnicas de DNA recombinante, com apoio das enzimas de restrição XhoI/NheI.
[0078] Assim, em uma modalidade particular da invenção, o vetor pPRNA166x178, no qual uma sequência nucleotídica que codifica uma IL-7 foi introduzida imediatamente após o 166° nucleotídeo, sentido 3’-5’, da sequência que codifica a neuraminidase do vírus WSN, denominado pPRNA166-IL-7-178, corresponde à SEQ ID NO: 9.
[0079] Em certas formas de realização, os métodos da invenção compreendem introduzir uma pluralidade de vetores, cada um dos quais incorpora uma porção de um vírus influenza em uma população de células hospedeiras capazes de suportar a replicação viral. As células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições permissíveis para o crescimento viral, e o vírus influenza pode ser recuperado.
[0080] Em certas formas de realização, um método de produzir vírus recombinantes compreendendo um genoma de RNA segmentado é fornecido, método este que compreende as etapas de: a) introduzir em um ou mais vetores de expressão contendo o cDNA viral correspondente a cada gene no genoma viral; b) introduzir os referidos vetores de expressão em uma célula hospedeira ou uma população de células hospedeiras; c) incubar referidas células hospedeiras; e d) isolar uma população de vírus influenza recombinante.
[0081] A introdução do ácido nucleico em uma célula ou população de células hospedeiras resulta na transcrição do RNA genômico do vírus influenza, e, na presença de proteínas adequadas da influenza, o transcrito de RNA pode ser empacotado em um vírus da influenza recombinante defectivo para multiplicação.
[0082] Em algumas formas de realização, a célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste de células Vero, células Per.C6, células BHK, células PCK, células MDCK, células MDBK, células 293 (por exemplo, células HEK 293T, e células COS. Em algumas formas de realização, emprega-se uma população de células hospedeiras obtida através do co-cultivo de uma mistura de pelo menos duas destas linhagens celulares, por exemplo, uma combinação de células HEK 293T e MDCK.
[0083] Em certas formas de realização, os vetores de expressão são transfectados nas células por eletroporação. Em certas formas de realização, os vetores de expressão são introduzidos nas células pela transfecção em células na presença de um reagente de transfecção lipossômica ou por meio da precipitação de fosfato de cálcio. Em certas formas de realização, os vetores de expressão são plasmídeos.
[0084] Em certas formas de realização, os vetores de expressão compreendem um vetor de expressão para a expressão de todos os segmentos de RNA genômico necessários para a síntese de particulas virais deficientes para multiplicação, vetores de expressão que codificam separadamente cada segmento de RNA genômico necessários para a síntese de particulas virais deficientes para multiplicação, ou os RNAs mensageiros correspondentes. Em certas formas de realização, a expressão de cada segmento de RNA genômico ou RNA codificado está sob o controle de uma sequência promotora derivada de um promotor de Pol I humana.
[0085] Em algumas formas de realização dos métodos descritos acima, os vírus influenza recombinantes podem ser recuperados da cultura das células hospedeiras que incorporam os plasmídeos do genoma da influenza. Em algumas formas de realização, a recuperação dos vírus recombinantes envolve a exposição das células hospedeiras a condições de lise celular. Em modalidades adicionais, as condições de lise celular compreendem a adição de enzimas digestivas e/ou uma neuraminidase exógena funcional. Ainda, a enzima digestiva pode ser tripsina e a neuraminidase funcional pode ser derivada de Vibrio cholerae.
[0086] Os métodos podem compreender adicionalmente uma etapa de infectar um substrato com o vírus influenza recombinante recuperado e purificar o vírus do substrato.
[0087] Em uma forma de realização, um ou mais vetores de expressão que codificam segmentos de RNA viral do vírus influenza necessários para a síntese de partículas virais deficientes para multiplicação são transfectados em células hospedeiras adequadas concomitantemente à construção de ácidos nucleicos da presente invenção.
[0088] Em uma forma particular da invenção, os referidos vetores de expressão compreendem cDNA que codifica o número mínimo de segmentos de RNA viral necessário para a síntese de partículas virais.
[0089] Em uma forma de realização, vetores de expressão que compreendem cDNA que codifica pelo menos sete segmentos de RNA viral do vírus influenza (isto é, NP, PA, PB1, PB2, M1, NS e HA) são transfectados em células hospedeiras adequadas concomitantemente à construção de ácidos nucleicos da presente invenção.
[0090] Em uma forma particular da invenção, os referidos vetores de expressão codificam cDNA que codifica pelo menos sete segmentos de RNA viral do vírus influenza A/PR8/34 (PR8), conforme descrito por de Wit et al (de Wit, E. et al. Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments. Virus research, v. 103, n. 1-2, p. 155161, 2004).
[0091] A invenção também prevê o uso de um vírus obtido pelos métodos de qualquer uma das modalidades descritas acima para preparar uma composição imunogênica para prevenir infecções causadas por vírus influenza e infecções bacterianas secundárias ou tratar infecções causadas por coronavírus, tanto como imunógeno quanto como adjuvante em combinação com outro imunógeno ou fármaco com atividade antiviral. Além do referido vírus influenza recombinante, as composições imunogênicas ora requeridas também podem incluir excipientes e/ou veículos.
[0092] Tipicamente, o veículo ou excipiente é aquele farmaceuticamente aceitável, que, de modo exemplificativo, porém, não limitado, pode ser: água estéril, solução salina aquosa, soluções salinas aquosas tamponadas, soluções aquosas de dextrose, soluções aquosas de glicerol, etanol, fluído alantóico de ovos de galinhas não infectadas (isto é, fluido alantóico normal “NAF”) ou combinações destes. A preparação de tais soluções que garantem a esterilidade, pH, isotonicidade e estabilidade é efetuada de acordo com protocolos estabelecidos na técnica.
[0093] Opcionalmente, a formulação para a administração do vírus da influenza ou subunidades deste, também contém um ou mais adjuvantes para realçar a resposta imune aos antígenos da influenza. O arsenal de adjuvantes conhecidos do técnico versado na arte inclui: saponina, géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas na superfície celular tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas ou de hidrocarboneto, bacilo Calmette-Guerin (BCG) e Corynebacterium parvum.
[0094] Em certas modalidades, as composições imunogênicas estarão geralmente em forma aquosa. No entanto, algumas composições podem estar na forma seca e na forma de sólidos injetáveis ou preparações secas ou polimerizadas em um adesivo. As composições imunogênicas podem incluir conservantes tais como tiomersal ou 2-fenoxietanol.
[0095] Em certas modalidades, as composições imunogênicas podem incluir um ou mais tampões. Tampões típicos incluem: tampão fosfato, Tris, tampão borato, tampão succinato, tampão histidina (particularmente com um adjuvante de hidróxido de alumio), ou tampão citrato. O pH de uma composição imunogênica estará, geralmente, entre 5,0 e 8,1, e mais tipicamente entre 6,0 e 8,0 e. 6,5 e 7,5, ou entre 7,0 e 7,8. Um método da invenção pode, portanto, incluir uma etapa de ajuste do pH da composição imunogênica a granel antes da embalagem.
[0096] A composição imunogênica pode ser uma composição terapêutica ou, alternativamente, uma vacina profilática sistemicamente administrada ou utilizada como imunoterápico, por exemplo, pela injeção subcutânea ou intramuscular usando uma agulha e seringa ou um dispositivo de injeção sem agulha. Alternativamente, a formulação de vacina é administrada intranasalmente, por gotas, aerossol de partícula grande (mais do que cerca de 10 micrometros) ou pulverização no trato respiratório superior. Embora qualquer uma das vias acima de liberação resulte em uma resposta imune sistêmica, a administração intranasal confere o benefício adicional de evocar imunidade de mucosa no local de entrada do vírus da influenza.
[0097] No geral, os vírus influenza recombinantes da invenção são administrados em uma quantidade suficiente para estimular uma resposta imune específica para um ou mais subtipos do vírus da influenza. Preferencialmente, a administração do vírus da influenza evoca uma resposta imune heterosubtípica protetora.
[0098] Ainda, os vírus influenza recombinantes da invenção podem ser administrados em uma quantidade suficiente para estimular uma resposta imune terapêutica contra infeção por Coronavírus.
[0099] Dosagens e métodos para evocar uma resposta imune protetora contra uma ou mais estirpes de vírus influenza são conhecidos por aqueles de habilidade na técnica.
[00100] A presente invenção é descrita pelos exemplos não limitantes abaixo, que são meramente ilustrativas. Várias modificações e variações das concretizações são evidentes ao técnico no assunto, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS VÍRUS INFLUENZA RECOMBINANTES
[00101] O plasmídeo pPRNA166x178 codifica um segmento truncado da neuraminidase em que todos as trincas ATG dos primeiros 166 nucleotídeos da região 3ʼ (nucleotídeos 20-22; 62-64; 115-117; 163-165) foram mutadas para a trinca CTA. Esse segmento é seguido por um sítio múltiplo de clonagem e pelos últimos 178 nucleotídeos da região 5ʼdo segmento da neuraminidase. A sequência codificadora da citocina murina IL-7 foi construída sob a forma de um gene sintético pela empresa GENSCRIPT (Hong Kong) baseado na sequência de cDNA, tendo sido otimizada para a expressão em células murinas (SEQ ID NO: 8), sem alteração nos aminoácidos codificados pela sequência (SEQ ID NO: 6). A sequência otimizada foi clonada no plasmídeo pPR166x178 no sítio múltiplo de clonagem, dando origem ao vetor pPRNA166-IL-7-178 (SEQ ID NO: 9). Esse tipo de construção permite a produção da citocina IL-7 na sua forma nativa dentro da célula infectada, haja vista que as mutações no segmento da neuraminidase acima descritas fazem com que não ocorra a produção de qualquer peptídeo oriundo dessa proteína.
[00102] O plasmídeo pPRNA166x178 foi construído a partir do plasmídeo pPR-NA. pPR-NA é um plasmídeo de transferência contendo o cDNA que codifica o segmento selvagem da neuraminidase do vírus WSN. Sua construção foi descrita previamente (Machado, A., N. Naffakh, S. van der Werf, and N. Escriou. 2003. Virology 313:235-249). Este plasmídeo contém o segmento da neuraminidase clonado em orientação negativa no plasmídeo de transferência pPR7 entre a sequência truncada do promotor da polimerase I humana (pol I) e a sequência da ribozima do vírus da hepatite delta. Este tipo de construção permite a síntese de uma molécula de RNA viral sintética nas células transfectadas.
[00103] pPR-NA foi modificado sucessivamente até resultar no plasmídeo pPRNA166x178: (i) Primeiramente, a região promotora 3ʼ da neuraminidase foi amplificada e inserida após a ORF da neuraminidase presente no plasmídeo, juntamente com um sítio múltiplo de clonagem XhoI / Nhel; (ii) A seguir, para conservar a integridade da extremidade 5ʼ da neuraminidase ao longo dos seus últimos 70 nucleotídeos, os últimos 42 nucleotídeos da ORF da neuraminidase foram amplificados e inseridos na extremidade 5 ʼda neuraminidase já clonada no plasmídeo, resultando no plasmídeo pPR-NA38 (Vieira Machado A, et al. Recombinant influenza A viruses harboring optimized dicistronic NA segment with an extended native 5' terminal sequence: induction of heterospecific B and T cell responses in mice. Virology. 2006 Feb 5;345(1):73-87) (iii) A neuraminidase do plasmídeo pPR-NA38 foi então substituída por uma neuraminidase truncada (devido à remoção dos nucleotídeos 170-1232). Para tanto, os primeiros 169 nucleotídeos da região 3ʼ e dos últimos 178 nucleotídeos da região 5ʼ do segmento da neuraminidase foram amplificados a partir da sequência de neuraminidase presente no plasmídeo pPR-NA. Esses dois produtos de amplificação foram sucessivamente clonados, substituindo a ORF da neuraminidase previamente clonada e flanqueando o sítio múltiplo de clonagem previamente introduzido; (iv) para impedir a expressão dos peptídeos codificados pelos 169 nucleotídeos da região 3ʼ da neuraminidase, um gene sintético com todos as trincas ATG dos primeiros 166 nucleotídeos da região 3ʼ da neuraminidase mutadas (nucleotídeos 20-22; 62-64; 115-117; 163-165), construído pela empresa GENSCRIPT (Hong Kong), foi clonado no sítio múltiplo de clonagem do plasmídeo acima descrito, substituindo a região 3’ da neuraminidase previamente clonada no plasmídeo, resultando finalmente no plasmídeo pPRNA166x178.
[00104] Os plasmídeos codificando os demais segmentos do vírus A/PR8/34 (PR8) foram gentilmente fornecidos pelo Dr. Ron Fouchier do Instituto Erasmus de Rotterdam (Holanda) mediante acordo de transferência de material.
[00105] Os vírus influenza recombinantes foram obtidos por genética reversa de acordo com a técnica mostrada na figura 2 e descrita previamente por Kawaoka e colaboradores (Fujii Y et al, Selective incorporation of influenza virus RNA segments into virions. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Feb 18;100(4):2002-7). Resumidamente, co-culturas de monocamadas subconfluentes de células HEK 293T e células MDCK cultivadas em meio de Dulbecco modificado (DMEM) em presença de 10% de soro fetal bovino e antibióticos foram co-transfectadas com: 1) o plasmídeo codificando um segmento recombinante da neuraminidase, com ou sem IL-7 (pPRNA166-IL-7-178 e pPRNA166x178, respectivamente) e 2) os plasmídeos codificando os demais (sete) segmentos do vírus influenza, PR8. Desta forma, oito complexos ribonucleoproteicos foram reconstituídos in vitro, permitindo a transcrição e a replicação de todos os segmentos virais e a síntese de novas partículas virais. Vinte horas após a transfecção, o meio de cultura foi substituído por DMEM suplementado com lμg/ml de tripsina TPCK (SIGMA) e 300 μU/ml de neuraminidase do Vibrio cholerae (a qual supre a falta da neuraminidase viral, permitindo a liberação das partículas virais neoformadas). Após 72 horas de incubação a 37°C, os sobrenadantes das células transfectadas foram coletados. Os vírus recombinantes obtidos carreando o gene da IL-7 (Flu-IL7) e o respectivo vírus controle, sem IL-7 (Flu-CT) foram amplificados e purificados duas vezes por diluição limite (maior diluição na qual observamos efeito citopático) em células MDCK, antes de serem submetidos a uma amplificação final nesta mesma linhagem celular. Todos os estoques virais assim obtidos tiveram o seu título infeccioso determinado por titulação por placa de lise sob agarose em células MDCK. O genótipo dos vírus recombinantes foi avaliado por PCR e sequenciamento e não evidenciaram qualquer deleção ou mutação no genoma viral.
[00106] A produção da IL-7 nas células infectadas pelo vírus Flu-IL7 foi avaliada pela técnica de ELISA. Para esse fim, monocamadas de células MDCK foram infectadas com o vírus Flu-IL7 ou Flu-CT na multiplicidade de infecção (M.O.I) de 1/1000. Os sobrenadantes das culturas celulares foram coletados em diferentes tempos após a infecção. Conforme mostrado na figura 3A, foi possível detectar a produção da IL-7 nas células infectadas a partir de 48 horas após a infecção; o pico de produção dessa citocina foi detectado 72 horas após a infecção, sendo da ordem de 800 pg/ml.
[00107] Os macrófagos exercem importante papel como células apresentadoras de antígeno no trato respiratório, além de produzirem mediadores inflamatórios importantes na defesa antiviral. A fim de avaliarmos a capacidade do vírus Flu-IL7 em infectar macrófagos, monócitos murinos presentes na medula óssea foram diferenciados em macrófagos e infectados com a M.O.I 0,1 ou 0,01 de vírus recombinante, na presença de neuraminidase. Conforme mostrado na figura 3B, a produção da IL-7 nos macrófagos foi detectada 24 horas após a infecção com o vírus Flu-IL7 utilizando a M.O.I 0,1. Esses resultados evidenciam a capacidade do vírus Flu-IL7 de infectar os macrófagos, nos quais são capazes de expressar a citocina IL-7.
EXEMPLO 2: AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DA IL-7 EM CAMUNDONGOS INFECTADOS COM O VÍRUS FLU-IL7
[00108] Camundongos C57BL/6/C machos entre 8 e 10 semanas de idade foram anestesiados e inoculadas pela via intranasal com 102, 103 ou 104 PFU do vírus Flu-IL7 ou 104 PFU Flu-CT diluídos em 25 μl de PBS. O grupo Mock foi inoculado somente com PBS. Nos tempos de 12, 24, 48 ou 72 horas após a inoculação, os animais foram eutanasiados para coleta dos pulmões e do lavado bronco-alveolar (BALF). A produção da IL-7 foi avaliada pela técnica de ELISA. Conforme mostrado na figura 4A, foi possível detectar níveis significativamente aumentados de IL-7 nos pulmões dos animais inoculados com Flu-IL7 na dose de 104 PFU, nos tempos 24 e 48 horas após a infecção, enquanto no BALF, o pico de expressão dessa citocina ocorreu mais tardiamente: 48 e 72 horas após a infecção (Figura 4B). Não foram detectados níveis significativos da IL-7 no soro dos animais infectados em qualquer tempo após a infecção (dados não mostrados). O conjunto desses dados demonstra a capacidade do vírus influenza infectar camundongos e expressar a sequência da IL-7, a qual é produzida de forma local e transitória.
EXEMPLO 3: VÍRUS INFLUENZA RECOMBINANTES COMO FERRAMENTAS PARA O ESTUDO DA IMUNOPATOGÊNESE DA INFECÇÃO PELO VÍRUS INFLUENZA
[00109] Os diversos estudos que avaliam a imunopatogênese da infecção pelo vírus influenza apresentam o inconveniente de utilizarem camundongos knockouts ou se valerem da inoculação sistêmica de citocinas, o que muito provavelmente não reflete o que ocorre durante uma infecção transitória e localizada ao nível do trato respiratório, a qual é a característica da infecção pelo vírus influenza. Desta forma, a presente invenção permite a utilização de uma estratégia inédita, a qual consiste na construção de vírus influenza recombinantes defectivos para a replicação carreando os genes de citocinas murinas, a fim de avaliar o papel dessas moléculas imunomoduladoras quando elas são produzidas de forma transitória e localizadas, durante a infecção pelo vírus influenza.
[00110] A fim de se demonstrar o potencial do vírus Flu-IL7 no estudo da imunopatogênese da infecção pelo vírus influenza, foi utilizada a seguinte abordagem:
[00111] Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos que foram inoculados via intranasal com diferentes vírus. Alguns grupos foram inoculados com somente um vírus na dose de 102 PFU (dose subletal a qual, não obstante, é capaz de resultar em pneumonia nos animais inoculados),enquanto outros animais foram coinfectados com 104 PFU de PR8 e 104 de Flu-CT ou Flu-IL7 e 104 PFU de PR8, diluídos em PBS no volume de 20μL (inóculo). A perda de peso e a mortalidade foram acompanhadas durante três semanas. Conforme mostrado na figura 5A, o grupo de animais co-infectado com os vírus Flu-IL7 + PR8 apresentou uma menor perda de peso total do que o grupo que recebeu apenas PR8 (Figura 5A) e uma menor perda de peso em tempos específicos com relação ao grupo PR8 e o grupo co-infectado com Flu-CT + PR8, além de terem recuperado o peso inicial mais precocemente do que os animais do grupo controle (Flu-CT+PR8; Figura 5B). No seu conjunto, nossos resultados sugerem um papel protetor da citocina IL-7 e demonstram a viabilidade do vírus que construímos como uma ferramenta a ser utilizada no estudo da imunopatogênese da infecção pelo vírus influenza.
EXEMPLO 4: PROTEÇÃO CONTRA INFECÇÕES BACTERIANAS SECUNDÁRIAS APÓS IMUNIZAÇÃO COM O VÍRUS FLU-IL7
[00112] Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas, foram anestesiados por via subcutânea com uma mistura de Ketamina (100mg/kg) e Xilazina (10mg/kg) e divididos em grupos (8 animais) que foram imunizados via intranasal (40μL/animal) com 102 PFU/animal de PR8 (dose subletal) ou coinoculados com 102 PFU de PR8 e 104 PFU de Flu-IL7 ou Flu-CT por animal ou PBS 1x (mock). Dez dias após a infecção os camundongos foram desafiados com uma dose de 102CFU/animal de bactérias (gram-positivas) Streptococcus pneumoniae sorotipo ATCC6303. Quarenta e oito horas após o desafio os animais foram eutanasiados e tiveram seus pulmões coletados em ambiente estéril para determinação da carga bacteriana por titulação em placa ágar-sangue. O experimento foi realizado em triplicata.
[00113] Para determinação da carga bacteriana nos pulmões, estes foram macerados em peneira de filtro para célula (70μm) com 1,5mL de salina (0,5x). Os tubos foram centrifugados a 2000xg por 10min a 4°C, o sobrenadante descartado e o precipitado bacteriano ressuspendido em 200μL de PBS 1x. A suspensão de bactérias foi diluída (razão 1:10) em meio THY (Caldo Todd Hewitt, 5% de extrato de levedura) e 10μL de cada diluição foram aplicados (6 replicatas) em placas de Petri contendo ágar-sangue (BHI-ágar com 5% de sangue de carneio desfibrinado e 8μg/mL de gentamicina). As placas foram mantidas à 37°C sob restrição de oxigênio por 16-18 horas. A carga bacteriana foi determinada pela contagem de colônias que apresentavam α-hemólise (hemólise parcial) na menor diluição em que foi possível separá-las visualmente, média das replicatas, multiplicação pelo fator de correção de diluição e pelo fator de conversão para volume total do órgão macerado (x20).
[00114] O desafio com Streptococcus pneumoniae foi realizado 10 dias após a infecção dos animais e a carga bacteriana pulmonar avaliada 48h após o desafio. Este ensaio evidenciou o papel protetor da citocina IL-7 na infecção pelo vírus influenza. Além de minimizar o agravo causado pelo vírus selvagem, o Flu-IL7 também reduziu a susceptibilidade à uma infecção bacteriana secundária pelo pneumococo. Os animais infectados com PR8 ou coinfectados com Flu-CT (grupo Flu-CT+PR8) apresentaram uma carga bacteriana elevada após o desafio, com cerca de 105 a 107 UFC/pulmão. Por outro lado, nos animais coinoculados com Flu-IL7 (grupo Flu-IL7+PR8) a carga bacteriana mediana foi de 102 UFC/pulmão (Figura 6).
EXEMPLO 5: VÍRUS FLU-IL7 COMO FERRAMENTA PARA A INDUÇÃO DE RESPOSTA IMUNE DE ESPECTRO AMPLIADO (RESPOSTA HETEROSUBTÍPICA)
[00115] Camundongos C57BL/6, machos, de 8 a 12 semanas foram anestesiados e imunizados com 104 PFU dos vírus recombinantes (Flu-CT ou Flu-IL7) ou com uma dose sub-letal de 250 PFU do vírus selvagem subtipo H3N2. Cerca de setenta e cinco dias após a imunização, quando já há o estabelecimento da resposta imune de memória, os animais foram desafiados com 500 PFU de um vírus influenza de subtipo H3N2.
[00116] Conforme esperado, os animais previamente inoculados com vírus influenza H3N2 e desafiados com esse mesmo vírus (grupo H3N2-H3N2) não apresentaram perda de peso significativa, evidenciando a presença da proteção homosubtípica (contra a mesma estirpe viral da primeira imunização), prevista após a vacinação. Os animais instilados com PBS e desafiados com o vírus H3N2 (Mock-H3N2) foram aqueles que apresentaram maior perda de peso (média de 28,0% de perda de peso total), o que é esperado por não possuírem imunidade prévia. O grupo de animais imunizados com o vírus Flu-CT apresentou uma média de 20,5% de perda de peso total após o desafio com o vírus H3N2 (grupo Flu-CT-H3N2), enquanto que no grupo vacinado com o vírus Flu-IL7 e desafiado com o vírus H3N2 (Flu-IL7-H3N2), a perda de peso foi menor (média de 6,3% de perda de peso) (Figura 7A).
[00117] Os animais imunizados com Flu-CT e desafiados com o vírus influenza de subtipo H3N2 (grupo Flu-CT-H3N2) apresentaram maior perda de peso, em quase todos os tempos avaliados, quando comparado aos animais imunizados com Flu-IL7 e desafiados com o vírus influenza de subtipo H3N2 (grupo Flu-IL7-H3N2) (Figura 7B). Portanto, a imunização com um vírus influenza recombinante carreando a hemaglutinina do vírus PR8 (subtipo H1N1) foi capaz de conferir proteção frente ao desafio com um vírus influenza de subtipo H3N2, demonstrando que Flu-IL7 é capaz de conferir proteção heterosubtípica. Ademais, o fato de essa proteção ter sido detectada mais de 50 dias após a vacinação, demonstra que há indução de resposta imune de memória.

Claims (13)

  1. Construção de ácido nucleico caracterizada por compreender um gene da neuraminidase truncado e um gene que codifica uma proteína imunomoduladora.
  2. Construção, de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de que a proteína imunomoduladora é uma interleucina-7.
  3. Construção, de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma região promotora e uma região terminadora heterólogas.
  4. Construção de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelo fato de compreender
    • (i) promotor truncado da polimerase I humana;
    • (ii) duplicação do promotor 3’ da neuraminidase;
    • (iii) duplicação dos últimos 42 nucleotídeos da ORF da neuraminidase;
    em que
    • (a) as trincas ATG dos primeiros 166 nucleotídeos da região 3’ do gene da neuraminidase foram substituídas por CTA; e
    • (b) uma sequência codificando uma proteína imunomoduladora inserida entre os primeiros 166 e os últimos 178 nucleotídeos do gene da neuraminidase truncado.
  5. Vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação caracterizado por expressar uma proteína imunomoduladora.
  6. Vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína imunomoduladora é uma interleucina-7.
  7. Método para preparar vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação como definido na reivindicação 5 caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:
    • (i) preparar construção de ácido nucleico compreendendo gene de neuraminidase truncada e gene de proteína imunomoduladora;
    • (ii) expor células hospedeiras, concomitantemente, à construção da etapa (i) e plasmídeos codificando os segmentos NP, PA, PB 1, PB2, M1, NS e HA do vírus influenza;
    • (iii) recuperar vírus influenza recombinante a partir do sobrenadante.
  8. Método, de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma etapa de infectar um substrato com o vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação recuperado na etapa (iii) e purificar o vírus do substrato.
  9. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de que compreende um vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação como definido na reivindicação 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  10. Composição, de acordo com a reivindicação 9 caracterizada pelo fato de que induz resposta imune heterosubtípica de longa duração.
  11. Composição, de acordo com a reivindicação 9 ou 10 caracterizada pelo fato de ser administrada pela via intranasal.
  12. Uso de um vírus influenza recombinante defectivo para multiplicação como definido na reivindicação 5 caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição imunogênica para prevenir ou tratar infecções causadas por vírus influenza ou por SARS-CoV-2, infecções bacterianas secundárias ou para ser utilizado como adjuvante.
  13. Uso, de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelo fato de que a composição imunogênica é capaz de induzir resposta imune heterosubtípica de longa duração e proteção ou tratamento contra infecções por vírus influenza, por e infecções bacterianas secundárias.
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