JP2023525623A - 核酸構築物、組み換えインフルエンザウイルス、組み換えインフルエンザウイルスを調製するための方法、組成物、および使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、宿主における免疫調節タンパク質の発現を誘導するための、ならびに感染性疾患に対する、特にインフルエンザウイルスおよびコロナウイルスによって引き起こされる感染性疾患に対するワクチンの開発において使用するための、核酸構築物および増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスに関する。TIFF2023525623000002.tif97128
Description
発明の分野
本発明は、ワクチン学の分野に位置付けられるものであり、感染性疾患、特にインフルエンザウイルスやコロナウイルスによって引き起こされる感染性疾患に対する予防用ワクチンおよび治療用ワクチンの開発に適用可能な、または、さらに生物医学研究の分野においても、気道において免疫調節ポリペプチドの産生を促進するためのツールとして適用可能な、増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスのバリアントを記述する。
本発明は、ワクチン学の分野に位置付けられるものであり、感染性疾患、特にインフルエンザウイルスやコロナウイルスによって引き起こされる感染性疾患に対する予防用ワクチンおよび治療用ワクチンの開発に適用可能な、または、さらに生物医学研究の分野においても、気道において免疫調節ポリペプチドの産生を促進するためのツールとして適用可能な、増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスのバリアントを記述する。
発明の背景
インフルエンザのパンデミックは、新規な抗原性のインフルエンザウイルス（通常は新しいサブタイプのもの）の出現に起因する、罹患率および死亡率の世界規模での劇的な増加によって、定義される。いくつかの要因が組み合わさって、パンデミックの重大性および範囲を変化させるが、これは、集団における低レベルの免疫、パンデミックインフルエンザウイルスの病原性、およびウイルスにとって可能な、ヒト間での伝達効率を含む。最後のものは概して、ウイルスの特徴のみならず、人口密度、および領域内への出入りの容易性によっても影響を受ける。パンデミックの原因となるウイルスは、通常、新規に出現した抗原バリアントであり、集団の大半は、該抗原バリアントと以前に接触したことがなく、かつしたがって、該抗原バリアントに対する免疫をほとんどまたは全く有さない。ヒトにおいて効率良く増殖しかつ伝達される、という能力は、集団におけるウイルスの急速な拡散の必要条件である。
インフルエンザのパンデミックは、新規な抗原性のインフルエンザウイルス（通常は新しいサブタイプのもの）の出現に起因する、罹患率および死亡率の世界規模での劇的な増加によって、定義される。いくつかの要因が組み合わさって、パンデミックの重大性および範囲を変化させるが、これは、集団における低レベルの免疫、パンデミックインフルエンザウイルスの病原性、およびウイルスにとって可能な、ヒト間での伝達効率を含む。最後のものは概して、ウイルスの特徴のみならず、人口密度、および領域内への出入りの容易性によっても影響を受ける。パンデミックの原因となるウイルスは、通常、新規に出現した抗原バリアントであり、集団の大半は、該抗原バリアントと以前に接触したことがなく、かつしたがって、該抗原バリアントに対する免疫をほとんどまたは全く有さない。ヒトにおいて効率良く増殖しかつ伝達される、という能力は、集団におけるウイルスの急速な拡散の必要条件である。
パンデミックインフルエンザは、非常に急速に拡散し、かつ破壊的な影響を有し得るものである。20世紀における最も深刻なパンデミックである、1918年のパンデミックは、500,000人超のアメリカ国民を死亡させ、かつ全世界で2000万～4000万人の人々を死亡させた。パンデミックは、数週間～数か月離れた発生ピークを有する、病的状態の急増をもたらし得る。パンデミックインフルエンザの比較的急速な発生および拡散は、この巨大な世界的健康被害への対応に関していくつかの問題を引き起こし、かつ緊急時対応要員および医療従事者に対して多大な負荷をかける。出現したパンデミックの速やかな同定およびそれへの対応は、その影響を最小限に抑えるための明らかな必須事項である。出現するインフルエンザウイルスをモニターするために、いくつかのプログラムが世界中で進行しており、該インフルエンザウイルスには、ヒトにおいて散発性であるが多くが致死性である感染を引き起こす、鳥インフルエンザウイルスも含まれる。危機の起こりやすさを同定するために、かつ効果的な対応のための指針を提供するために、上述の監視データは、事前に定めたパンデミックアラートレベルと組み合わせて使用される。
ワクチン接種は、インフルエンザの毎年のエピデミックおよびパンデミックの両方によって引き起こされる病的状態を予防するための、最も重要な公衆衛生上の手段である。2009年の豚インフルエンザパンデミックの際に起こったように、パンデミックウイルスの同定と、その世界中への拡散との間の間隔が短いことで、パンデミックウイルスに対して特異的でありつつ、かつ集団の大部分を保護するのに十分な量でもあるワクチンを製造することは、著しく困難な課題となる。「パンデミックワクチン」の製造には短い対応時間が要求されるため、効果的な対応を提供するために長期にわたる研究開発プロセスを実施することは、可能ではない。
1つの解決策として、逆遺伝学の技術は、特にワクチン作製への適用のための、細胞培養におけるRNAウイルスの迅速な発現および組み換え操作を可能にする。該方法は、ウイルスゲノムをコードする1種または複数種の発現構築物を、宿主細胞にトランスフェクトすること、およびそれに続く、宿主細胞からのウイルスの回収を伴う。
たとえば文献WO2007002008（特許文献1）およびWO2007124327（特許文献2）は、インフルエンザウイルスのゲノムRNAを、イヌRNAポリメラーゼI（pol I）プロモーターを用いてイヌ細胞において発現させる、逆遺伝学の手法を記載している。他の情報源は、ヒトpol Iプロモーターを用いた、ヒト細胞におけるインフルエンザのゲノムRNAの発現を報告している。
さらに最近、文献WO2010133964（特許文献3）は、宿主細胞において、分類学上のクラスが異なる生物由来の外来pol Iプロモーターを用いて（たとえば、イヌ宿主細胞においてヒトpol Iプロモーターを用いて）組み換えインフルエンザウイルスを産生する、逆遺伝学の手法を記載している。
しかしながら、逆遺伝学の技術はインフルエンザワクチン株作製の機敏性を確保するものではあるが、季節性の株は、その期間について予測される流行の主流によって毎年変わる。そのため、次世代のインフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルスの異なる株および異なるサブタイプに対する交差保護を付与するものであるべきであり、したがって、ヘテロサブタイプ応答を生じさせるものであるべきである。
これに関し、さまざまなサブタイプのインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染に対するワクチンの作製において、本発明は、現行の方法論を上回る利点を示す。本発明の組み換えウイルスは、長時間持続するヘテロサブタイプ応答を引き起こすことが可能であり、鼻腔内処置から2か月半後であってさえも、抗原性が異なるインフルエンザウイルスから保護することが可能である。当該技術はまた、免疫化された個体を二次的細菌感染から保護するという利点をも有しており、ここで二次的細菌感染は、インフルエンザウイルスに感染した患者における合併症および死亡の大部分の原因である。したがって、これらの組み換えウイルスを、免疫原およびアジュバントの両方として含むワクチンは、ワクチン製剤中に含まれるウイルスと、集団中でまん延しているウイルスとの間でしばしば生じる、抗原性の不一致に関連する問題を回避することを可能にし、かつ二次的細菌感染に関連する問題を軽減することを可能にする。
加えて本発明は、生物医学研究の分野において、免疫調節ポリペプチドの気道での局所発現を可能にするためのツールとして適用可能である。したがって本発明は、気道における炎症プロセスまたは感染プロセスの、たとえばインフルエンザウイルスおよびコロナウイルスなどによって引き起こされるそれらの、確立、進行、および解消における、該免疫調節タンパク質の役割を評価することを可能にする。
Kangおよび共同研究者らは、免疫調節タンパク質、特にインターロイキン-7（IL-7）の、鼻腔内経路による投与が、マウスにおいてその後のインフルエンザウイルス感染に対する予防的応答を誘導可能であることを証明した。完全な保護は、Fcを融合させたIL-7を用いてマウスを鼻腔内処置した後、インフルエンザウイルスの負荷が14日以内に行われた場合に得られる（Kang et al. "Intranasal introduction of Fc-fused interleukin-7 provides long-lasting prophylaxis against lethal influenza virus infection." Journal of virology 90.5 (2016): 2273-2284（非特許文献1））。
しかしながら、感染性因子へのその後の曝露から個体を保護し続けるためには、インフルエンザウイルスワクチンの開発には、長時間持続するヘテロサブタイプ免疫応答をもたらすことが要求される。Kangおよび共同研究者らは、IL-7-Fcの鼻腔内投与が、肺において白血球を増殖させかつ活性化することによって、呼吸器官の感染と戦うのに好都合な免疫環境を促進することが可能であることを、証明している。しかしながら、特異的な抗原刺激が存在せず、かつしたがって、細胞の分化が生じるのに必要な、細胞および転写因子の活性化も存在しないため、該文献の著者らが使用した戦略は、記憶応答を引き起こすことができない。記憶応答の生成は、抗原提示細胞（APC）（たとえば、樹状細胞およびマクロファージ）による抗原提示に依存しており、抗原提示細胞は、長時間持続する記憶免疫に関与する、適応免疫の細胞、たとえばTリンパ球およびBリンパ球などを活性化することが可能である（Devarajan P, et al. "New Insights into the Generation of CD4 Memory May Shape Future Vaccine Strategies for Influenza." Front Immunol. 2016;7:136（非特許文献2））。実際、21日後および35日後における、保護の有意な低下は、Kangらによって得られた局所的な非特異的刺激が、ウイルス抗原の存在下で生じるものとは異なり、一過性であることを証明している（Jones PD, Ada GL. "Influenza virus-specific antibody-secreting cells in the murine lung during primary influenza virus infection." J Virol. 1986;60(2):614-619（非特許文献3））。すでに示されているように、メモリー細胞の長期間にわたる維持にとって重要である、気管支関連リンパ組織および／または鼻咽腔関連リンパ組織、これらはそれぞれBALTおよびNALTと呼ばれるが、これらの形成に関して、ウイルス抗原での刺激は重要である（Onodera T, et al. "Memory B cells in the lung participate in protective humoral immune responses to pulmonary influenza virus reinfection." PNAS 2012;109(7):2485-2490（非特許文献4））。
免疫学的記憶の定義は、マウスにおいては接種から50日後に測定されたものであるとみなされている（Hye Mee Joo et al. "Broad dispersion and lung localization of virus-specific memory B cells induced by influenza pneumonia; Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A virus infection." PNAS 2008, 105 (9) 3485-3490（非特許文献5））。しかしながら、ヒトと動物モデル（マウス）との間の、寿命の差異、および細胞集団／細胞表現型の差異、これらは免疫応答のキネティクスおよび持続期間に干渉するが、これらの差異を主として考慮すれば、ヒトにおける免疫の持続期間を、動物モデル（マウス）において評価されたものと直接的に比較することはできない（Boyden, A.W., Frickman, A.M., Legge, K.L. et al. "Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A virus infection." Immunol Res 59, 73-80 (2014)（非特許文献6））。
ヒトにおけるヘテロサブタイプ応答の好ましい持続期間がどのようなものかについて、文献による報告は存在しないが、いくつかの研究は、交差応答抗体が存在しない個体において、Tリンパ球（CD4+および／またはCD8+）があらかじめ存在している点が、疾患症状の低減、ウイルス拡散の低減に関連しており、かつ結果的に疾患の深刻化の低減に関連していることを、示している。これらの細胞は、異なるインフルエンザサブタイプの間で高度に保存された内部抗原、たとえばNB、PB1、M1、およびM2などを主として認識しており、かつこれらの細胞は、ウイルス粒子を中和することはできないものの、気道においてウイルスの複製を制限し、疾患に関連する病的状態を低減させ、かつ死亡リスクを低減させる（Wilkinson, T., Li, C., Chui, C. et al. "Preexisting influenza-specific CD4+ T cells correlate with disease protection against influenza challenge in humans." Nat Med 18, 274-280 (2012)（非特許文献7）；Sridhar, et al. "Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza." Nat Med 19, 1305-1312 (2013)（非特許文献8）；Hayward AC, et al. "Natural T Cell-mediated Protection against Seasonal and Pandemic Influenza. Results of the Flu Watch Cohort Study." Am J Respir Crit Care Med. 2015;191(12):1422-1431（非特許文献9））。ある最近の研究（2019）は、以前の感染によって誘導される交差応答を解析するために、ヒトのインフルエンザ感染のゴールドスタンダードモデルであるフェレットを使用した。該文献の著者らは、低用量のインフルエンザA H1N1（100 PFU）に感染させた動物は、28日後の、ヘテロサブタイプのH3N2分離株の負荷から部分的に保護されて、症状およびウイルス拡散が減少したことを証明しており、これは、抗H3N2中和抗体が検出されなかったことから見て、メモリーTリンパ球が媒介する保護を示唆する（Gooch KE, et al. "Heterosubtypic cross-protection correlates with cross-reactive interferon-gamma-secreting lymphocytes in the ferret model of influenza." Sci Rep. 2019; 9(1): 2617（非特許文献10））。インフルエンザウイルスに対するユニバーサルワクチンの開発を提案する別の研究において、該文献の著者らは、異なるウイルスタンパク質、およびアジュバントとしてサイトカインIL-15の遺伝子をコードする組み換えウイルスを使用し、そして皮下ワクチン接種の3回目の投与の21日後の、他のサブタイプのインフルエンザからの有意な交差保護を報告している（Valkenburg et al. "Protection by universal influenza vaccine is mediated by memory CD4 T cells." Vaccine, 2018, 4198-4206（非特許文献11））。
いずれの例においても、ワクチン接種キャンペーンの直後に生じる、ウイルスのまん延が最大である時期の間に、最大の保護を確保するためには、インフルエンザワクチンの開発にあたり、ヘテロサブタイプワクチン応答のヒトにおける最適な持続期間は少なくとも2～4か月である必要がある。
本発明によって達成されるように、免疫調節タンパク質であるIl-7をインフルエンザウイルスに輸送させると、一過性であってかつ局在性である様式で、感染細胞において直接的に該タンパク質を産生させることが可能になり、その結果、ヘテロサブタイプ記憶免疫応答が引き起こされる。このようにして、ワクチン接種において使用されたものとは異なる抗原性のインフルエンザウイルスからの保護が、達成される。Kangらの結果とは対照的に、鼻腔内接種から2か月半後にウイルスの負荷が実施された場合でさえも、本発明において得られた保護は維持されており、これは、免疫学的記憶の誘導が存在することを証明する。組み換えウイルスFlu IL-7は、接種を受けたマウスにおいて、安全であってかつ疾患を引き起こすことができないことが示され、また、再度ワクチン接種する必要はなく、かつヘテロサブタイプ保護は、上述の研究よりも後の時点で（免疫化から30日後および60日後）観察された。
最後に、IL-7をコードするインフルエンザウイルスを用いた免疫化が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）によって引き起こされる二次的細菌感染からの保護を付与可能であったという事実は、非常に好ましいものである。二次的細菌感染、特にS. ニューモニエによって引き起こされる二次的細菌感染は、インフルエンザ病態の最も重い合併症の原因であり、これは結果的に、特に子どもおよび高齢者における予後不良をもたらす。本発明の、別の傑出した局面は、コロナウイルスによって引き起こされる炎症プロセスまたは感染プロセスに対して作用する、免疫調節タンパク質からなる。
本発明は、以下においてより詳細に記載される。
Kang et al. "Intranasal introduction of Fc-fused interleukin-7 provides long-lasting prophylaxis against lethal influenza virus infection." Journal of virology 90.5 (2016): 2273-2284
Devarajan P, et al. "New Insights into the Generation of CD4 Memory May Shape Future Vaccine Strategies for Influenza." Front Immunol. 2016;7:136
Jones PD, Ada GL. "Influenza virus-specific antibody-secreting cells in the murine lung during primary influenza virus infection." J Virol. 1986;60(2):614-619
Onodera T, et al. "Memory B cells in the lung participate in protective humoral immune responses to pulmonary influenza virus reinfection." PNAS 2012;109(7):2485-2490
Hye Mee Joo et al. "Broad dispersion and lung localization of virus-specific memory B cells induced by influenza pneumonia; Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A virus infection." PNAS 2008, 105 (9) 3485-3490
Boyden, A.W., Frickman, A.M., Legge, K.L. et al. "Primary and long-term B-cell responses in the upper airway and lung after influenza A virus infection." Immunol Res 59, 73-80 (2014)
Wilkinson, T., Li, C., Chui, C. et al. "Preexisting influenza-specific CD4+ T cells correlate with disease protection against influenza challenge in humans." Nat Med 18, 274-280 (2012)
Sridhar, et al. "Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemic influenza." Nat Med 19, 1305-1312 (2013)
Hayward AC, et al. "Natural T Cell-mediated Protection against Seasonal and Pandemic Influenza. Results of the Flu Watch Cohort Study." Am J Respir Crit Care Med. 2015;191(12):1422-1431
Gooch KE, et al. "Heterosubtypic cross-protection correlates with cross-reactive interferon-gamma-secreting lymphocytes in the ferret model of influenza." Sci Rep. 2019; 9(1): 2617
Valkenburg et al. "Protection by universal influenza vaccine is mediated by memory CD4 T cells." Vaccine, 2018, 4198-4206
発明の簡単な説明
本発明は、本質的には、免疫調節タンパク質を発現する増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスである。
本発明は、本質的には、免疫調節タンパク質を発現する増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスである。
本発明の1つの態様において、前記免疫調節タンパク質は、ケモカインまたはサイトカインであり得る。好ましくは該タンパク質は、インターロイキンクラスのサイトカインであり、特にインターロイキン7（IL-7）である。
本発明の特定の形態において、組み換えインフルエンザウイルスは、ノイラミニダーゼ（NA）遺伝子を含む核酸構築物から得られ、ここで該ノイラミニダーゼ遺伝子は、その中間部分を除去することによって短縮化されており、かつその中に、免疫調節タンパク質をコードする配列が挿入されている。
別の態様において、核酸構築物は、異種のプロモーター領域およびターミネーター領域をさらに含む。また、本発明の1つの態様において、該プロモーター領域は、ヒトRNAポリメラーゼI（Pol I）のプロモーター領域である。
別の態様において、本発明による核酸構築物は、プラスミドpPRNA166x178に対応するSEQ ID NO: 1に記載されるものである。
さらに、その態様のうちの1つにおいて、本発明の核酸構築物は、デルタ肝炎ウイルスのリボザイムターミネーター配列を含み；これには以下が続く：(i) ヒトPol Iの短縮型プロモーター；(ii) 全てのATGトリプレットが変異している、ノイラミニダーゼの最初の166ヌクレオチドをコードする配列；(iii) ノイラミニダーゼの最後の178ヌクレオチドをコードする配列、(iv) ノイラミニダーゼの3'プロモーター；(v) ノイラミニダーゼORFの最後の42ヌクレオチドの複製物；および(vi) ヒトRNA Pol Iの短縮型プロモーター；ここで、ノイラミニダーゼの最初の166ヌクレオチドと最後の178ヌクレオチドとの間には、免疫調節タンパク質をコードする配列が挿入されている。
本発明の他の態様は、短縮型ノイラミニダーゼ遺伝子を含む組み換えインフルエンザウイルスを提供し、該短縮型ノイラミニダーゼ遺伝子には、免疫調節タンパク質の遺伝子に対応するヌクレオチド配列が挿入されている。
1つの態様において、ノイラミニダーゼ遺伝子の3'部分に対応するヌクレオチドおよび5'部分に対応するヌクレオチドは、SEQ ID NO: 5の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子の隣に配置されている。
別の態様において、ノイラミニダーゼ遺伝子の3'部分に対応するヌクレオチドおよび5'部分に対応するヌクレオチドは、SEQ ID NO: 6または7の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子の隣に配置されている。
さらなる態様は、組み換えインフルエンザウイルスを調製するための方法を含み、該方法は、順に以下の段階を含む：(i) 短縮型ノイラミニダーゼ遺伝子および免疫調節タンパク質遺伝子を含む核酸構築物を、調製する段階；(ii) 宿主細胞を、段階(i)の構築物、ならびにインフルエンザウイルスのNP、PA、PB1、PB2、M1、NS、およびHAセグメントをコードする1種または複数種のプラスミドに、同時に曝露する段階；(iii) 上清から組み換えインフルエンザウイルスを回収する段階。
本発明の特定の形態において、上述の段階(ii)のプラスミドは、インフルエンザウイルスA/PR8/34（PR8）の少なくとも7個のウイルスRNAセグメントをコードするcDNAを、コードする。
別の態様において、上述の段階(ii)における前述のプラスミドは、ウイルス粒子の合成に必要な、最小限の数のウイルスRNAセグメントをコードする。ここで、ウイルスRNAセグメントの最小限の数とは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、または少なくとも7である。
また、別の態様において、組み換えインフルエンザウイルスを調製する方法は、上述の段階(iii)において回収された組み換えインフルエンザウイルスを基体に感染させる段階、および基体からウイルスを精製する段階という、追加の段階をさらに含む。
本発明の別の態様は、組み換えインフルエンザウイルスと、薬学的に許容されるビヒクルとを含む免疫原性組成物に関する。
別の態様において、前記免疫原性組成物は、長時間持続するヘテロサブタイプ免疫応答を誘導することが可能である。また、そのような組成物は、好ましくは鼻腔内投与される。
最後に、本発明はまた、インフルエンザウイルスやコロナウイルスによって引き起こされる感染、および二次的細菌感染を予防もしくは治療する免疫原性組成物を調製するための、インフルエンザウイルスの使用、ワクチンにおいてアジュバントとして使用するための、インフルエンザウイルスの使用、または免疫調節ポリペプチドの気道における局所発現を提供するツールとしての、インフルエンザウイルスの使用を含む。
発明の詳細な説明
別途定義されていない場合、本明細書において使用される技術用語および科学用語の全ては、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるものと、同じ意味を有する。分子生物学および免疫学における通常の技術は、当業者に周知である。本明細書はまた、本明細書および特許請求の範囲に記載されるものの解釈を補助するために、用語の定義をも提供する。別途指定されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される、量、パーセンテージ、および割合、ならびに他の数値を表現する数字はすべて、どのような場合でも、「約」との用語によって修飾されているものと理解されるべきである。したがって、別途指定されない限り、本明細書および特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、入手しようとする特性に応じて変動し得る、近似値である。
別途定義されていない場合、本明細書において使用される技術用語および科学用語の全ては、本発明が属する技術分野の当業者によって理解されるものと、同じ意味を有する。分子生物学および免疫学における通常の技術は、当業者に周知である。本明細書はまた、本明細書および特許請求の範囲に記載されるものの解釈を補助するために、用語の定義をも提供する。別途指定されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される、量、パーセンテージ、および割合、ならびに他の数値を表現する数字はすべて、どのような場合でも、「約」との用語によって修飾されているものと理解されるべきである。したがって、別途指定されない限り、本明細書および特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、入手しようとする特性に応じて変動し得る、近似値である。
定義
「核酸、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」との用語は、1本鎖または2本鎖の、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの重合体、またはそれらのキメラもしくはアナログを指す。別途指定されない限り、本発明の特定の核酸配列は、明示的に指定される配列に加えて、縮重配列および相補配列を含む。
「核酸、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」との用語は、1本鎖または2本鎖の、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの重合体、またはそれらのキメラもしくはアナログを指す。別途指定されない限り、本発明の特定の核酸配列は、明示的に指定される配列に加えて、縮重配列および相補配列を含む。
「遺伝子」との用語は、生物学的な機能に関する指示をコードする、任意のポリヌクレオチドを指すために、広く使用される。一般的には、遺伝子はコーディング配列を含んでおり、かつ、該コーディング部分の発現を調節するノンコーディング領域をも含み得る。「遺伝子」との用語は、特定のゲノム配列、ゲノム配列によってコードされるメッセンジャーRNA（mRNA）、およびmRNAに相補的なDNA（cDNA）に適用される。
遺伝子のノンコーディング領域は、たとえば、他のタンパク質のための認識配列を形成する、1つまたは複数のセグメントを含み得る。そのようなノンコーディングセグメントは、調節タンパク質、たとえば転写因子などが結合して、隣接するかまたは近接する配列の転写を引き起こす、「プロモーター」および「アンプリファイア」を含む。
「プロモーター」または「プロモーター配列」とは、DNA配列であって、その機能が、それに機能的に連結された核酸配列の転写を開始することによって、遺伝子の発現を調節することである、DNA配列を指す。遺伝子発現の調節は、時間的な、空間的な、および／または生理学な様式で決定され得る。
「構築物」との用語は、少なくとも1つのプロモーターに機能的に連結された少なくとも1つの遺伝子を含む、ポリヌクレオチド配列を意味する。「によって機能的に連結される」とは、プロモーターが核酸の発現を制御または調節するように、コーディング配列に対してプロモーターが位置していることを意味する。該構築物はその後、発現ベクターに導入され得る。構築物それ自体、および発現ベクターは両方とも、その後、1つまたは複数の遺伝子の発現を促進するために、宿主細胞に導入され得る。
「発現ベクター」とは、それに組み込まれたコーディングポリヌクレオチド配列の発現を、たとえば転写を、促進することが可能であるベクター、たとえばプラスミドなどである。発現ベクターは、自己複製型であってよく、または自己複製型でなくてもよい。典型的には、発現させようとするポリヌクレオチド配列は、その転写を調節するプロモーターおよび／またはエンハンサーに「機能的に連結されている」。
異種の遺伝子または単離されたポリヌクレオチドに言及する場合、「導入」との用語は、真核細胞または原核細胞へのポリヌクレオチドの組み込みを指し、ここで核酸は、細胞のゲノム（たとえば、染色体の、プラスミドの、プラスチドの、またはミトコンドリアのDNA）に組み込まれ得、自律的にまたは一過性に発現するレプリコン（たとえば、トランスフェクトされたmRNA）に変換され得る。該用語は、「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」、および「形質導入」といったような方法を包含する。本発明に関し、真核細胞へとポリヌクレオチドを導入するために、さまざまな方法が使用可能であり、これは、エレクトロポレーション、脂質媒介型のトランスフェクション（リポフェクション）、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介型の導入等を含む。
本明細書において使用される場合、「コードする」との用語は、相補的な核酸、これはポリペプチドへと翻訳されることが可能な核酸を含むが、そのような核酸を転写するという、核酸の、たとえばデオキシリボ核酸（DNA）の、特性を指す。たとえばDNAは、該DNAから転写されるリボ核酸（RNA）を、コードし得る。同様にDNAは、該DNAから転写されるRNAから翻訳されるポリペプチドを、コードし得る。
「短縮型」との用語は、本明細書全体を通して使用されるように、短縮されようとする該配列について予想される生理的機能を妨げる、ポリヌクレオチド鎖またはポリペプチド鎖の中断を意味する。本明細書において記載されるように、たとえば短縮型ノイラミニダーゼ遺伝子とは、天然配列の中間の断片を除去することによって中断されているノイラミニダーゼをコードする、ポリヌクレオチド配列に対応する。
「宿主細胞」との用語は、核酸が、たとえばベクターなどが、その中に導入されている細胞を意味し、かつ該用語はまた、該核酸を有する、当該細胞の子孫をも含む。宿主細胞は、原核細胞であってよく、これはたとえば細菌細胞などであり、または真核細胞であってもよく、これはたとえば、酵母、昆虫、両生類、鳥類、もしくは哺乳動物の細胞である。
「組み換え」との用語は、物質（たとえば、核酸またはタンパク質）が、ヒトの介入によって、人工的に、または合成により（非天然的に）、改変されていることを示す。具体的には、ウイルスに、たとえばインフルエンザウイルスに言及する場合、該ウイルスは、それが組み換え核酸の発現によって産生される場合に、組み換え、とされる。
「免疫原性組成物」との用語は、1種または複数種の疾患に対する、液性および／または細胞性の記憶免疫応答を誘導することが可能な物質を含む、調製物を意味する。一般的には、概して「抗原」と呼ばれる、応答を誘導する物質は、通常、それからの保護が望まれる疾患の原因物質の、一部または全てである。
免疫応答を誘導する抗原の能力は、「免疫原性」と呼ばれる。たとえば、異なるタイプのインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染に対する免疫原性組成物は、それからの保護が望まれる1つまたは複数のサブタイプのウイルスの、構造タンパク質から作製され得る。あるいは、該ワクチンは、インタクトであるが不活性化されているウイルスか、または感染能力が弱められているウイルスを用いて作製され得る。
抗原によって引き起こされる免疫応答は、疾患を引き起こす因子に対して特異的であり得、または複数の因子からの保護を付与することが可能であり得る。特に、インフルエンザウイルスに対する免疫原性組成物の場合、それぞれの抗原は、1種類のウイルス株に対する応答を引き起こすことが可能である。1種類の抗原が、インフルエンザウイルスの他のサブタイプのうちのいくつかの株に対して免疫応答を引き起こすことが可能である場合、該免疫応答は「ヘテロサブタイプ」免疫応答と呼ばれる。
長時間持続するヘテロサブタイプ応答は、免疫学的記憶を活性化する応答として定義されるものであり、これは、処置後2か月またはそれ以上、異なる抗原性のインフルエンザウイルスからの保護をもたらす。
抗原に対する免疫応答は、免疫原性組成物が1種または複数種のアジュバントを含む場合に、より効果的なものとなり得る。これに関し、アジュバントとは、合成物質、有機物質もしくは無機物質、または生物起源の物質であって、抗原とともに投与された場合に免疫応答の有効性を増大させる、物質である。
さらに、免疫調節タンパク質は、ヘテロサブタイプ免疫応答を誘導することが可能な本発明の免疫原性組成物の、一部であり得る。これに関し、「免疫調節タンパク質」との用語は、免疫系の細胞の機能を調節する生物学的活性を有するポリペプチドを意味する。
したがって、免疫調節タンパク質は、患者の免疫系の天然のバランスを回復させるために、または患者の免疫系の活性を強化するために、利用され得る。本発明において望まれるように、免疫調節タンパク質は、免疫系の活性を増強して、抗原に対して引き起こされる応答に寄与する。大まかに言えば、免疫調節タンパク質は、ケモカインおよびサイトカインを含み、これらはたとえば、MIP-1（マクロファージ炎症性タンパク質）、MCP-1（単球走化性タンパク質）、G-CSF（顆粒球コロニー刺激因子）、GM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、TNF-α（腫瘍壊死因子）、インターフェロン、およびインターロイキンなどである。
免疫原性組成物は、たとえば、経口投与、鼻腔内投与、または非経口投与を含む、任意の様式の投与用に製剤化することが可能である。非経口との用語は、本明細書において使用される場合、皮下、皮内、血管内（たとえば静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、髄腔内、および腹腔内への注入を含み、かつ任意の同様の注射および注入の技術を含む。ある態様においては、鼻腔内投与が好ましい場合がある。
態様
本発明は、長時間持続するヘテロサブタイプ免疫応答を引き起こすことが可能な増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスを提供する点において、当技術分野の現状からの進展を示す。
本発明は、長時間持続するヘテロサブタイプ免疫応答を引き起こすことが可能な増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスを提供する点において、当技術分野の現状からの進展を示す。
本明細書において実験によって示される現象の、推論の範囲を限定する意図は一切ないが、本発明者らは、個体においてインビボで、インフルエンザへの曝露と同時にIL-7を発現させると、該ウイルスの他のサブタイプへの感染、および二次的細菌感染からの、長時間持続する保護が付与されること、ならびにこれは、コロナウイルスによって、たとえば重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoVおよびSARS-CoV-2）などによって引き起こされる感染の治療にも使用可能であることを、証明した。
IL-7の同時発現は、そのようなサイトカインをコードする遺伝子を、ウイルスのノイラミニダーゼの3'部分をコードするセグメントと5'部分をコードするセグメントとの間に導入することによって、達成された。その中間部分を除去することによる、ノイラミニダーゼ遺伝子の短縮化に起因して、組み換えインフルエンザウイルスは増殖欠損型となっており、かつしたがって、インビボで増殖することができない。
増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスを開発するために、他の戦略が探索され得る。これは以下を含む：NS1およびNS2へのメッセンジャーRNAのプロセシングに関与するNS配列の変異（Wolschek, M. et al. "Establishment of a chimeric, replication-deficient influenza A virus vector by modulation of splicing efficiency." J Virol 85, 2469-2473, 2011）、ヘマグルチニン（HA）タンパク質をコードする配列の欠失（Watanabe, T., Watanabe, S., Noda, T., Fujii, Y. & Kawaoka, Y. "Exploitation of nucleic acid packaging signals to generate a novel influenza virus-based vector stably expressing two foreign genes." J Virol77, 10575-10583, 2003）、またはPB2タンパク質をコードする配列の欠失（Uraki, R. et al. "A Bivalent Vaccine Based on a PB2-Knockout Influenza Virus Protects Mice From Secondary Pneumococcal Pneumonia." J Infect Dis 212, 1939-1948, 2015）。これらの戦略においては、ウイルスのHAもしくはPB2を産生させるために恒常的にトランスフェクトされる細胞株か、またはインターフェロンを産生しない細胞（改変されたNSセグメントを有するインフルエンザウイルスの場合）を使用することが必要である。
当業者は、本明細書において記載される実験が、以下を包含する概念の代表例であることを、理解するであろう：(i) 免疫調節タンパク質をコードする配列が挿入されている短縮型ノイラミニダーゼ遺伝子を含む、核酸構築物；(ii) (i)の核酸構築物を含む組み換えインフルエンザウイルス；組み換えインフルエンザウイルスを作製するための方法；(iii) 免疫原性組成物；ならびに(iv) インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染、および二次的細菌感染を予防するワクチンを調製するための免疫原もしくはアジュバントとしての、組み換えインフルエンザウイルスの使用、または免疫調節ポリペプチドの気道における局所発現を促進するためのツールとしての、組み換えインフルエンザウイルスの使用。加えて、本発明はまた、コロナウイルスによって引き起こされる感染に対する治療ワクチンの調製における、組み換えインフルエンザウイルスの使用をも包含する。
ある実施形態において、ウイルスは、1種または複数種の前駆ウイルスに由来するウイルスRNA（vRNA）セグメントを有する、A型またはB型のインフルエンザウイルスである。ある実施形態において、組み換えインフルエンザウイルスは増殖欠損型ウイルスである。
ある実施形態において、組み換えインフルエンザウイルスは、非機能的な短縮型ノイラミニダーゼを有するために、増殖欠損型である。さらに、増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスのノイラミニダーゼは、その中間部分（ヌクレオチド170～1232位）が除去されていることに起因して、機能的ではない。
いくつかの実施形態において、ウイルスによって産生される異種タンパク質は、免疫調節タンパク質である。これらの態様において、該免疫調節タンパク質はケモカインであり得る。代替形態において、免疫調節タンパク質はサイトカインであり得る。好ましくは、免疫調節タンパク質はインターロイキン（IL）であり、これはたとえば、IL-15、IL-17、IL-4、IFN-G、および特にIL-7である。
本発明の目的に関して、IL-7をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、インフルエンザウイルスもしくはコロナウイルスの感染から保護されようとする、または該感染についての治療を受けようとする個体と同じ生物学的起源のIL-7を生じさせる。たとえば、ヒト対象を保護することを目的とする場合、本発明の構築物において使用される、IL-7をコードするヌクレオチド配列は、ヒトIL-7をコードする。同様に、ブタを保護することを目的とする場合、ブタIL-7が使用される。一例として、記載される構築物の適用は、IL-7のマウスホモログを使用して以下に例示されるが、これは、技術開発の実験段階においては、インフルエンザウイルス感染のマウスモデルにおいて、該構築物の有効性が評価されたためである。これに関し、所望の構築物に適したIL-7をコードするヌクレオチド配列が使用されることは、当業者にとって明らかである。
ヒトIL-7をコードする、またはホモログをコードする、たとえば、マウス（ネズミ）、ブタ、ウマ、ラット、もしくはアカゲザル由来のホモログをコードする、ヌクレオチド配列は、当業者に公知である。いくつかの種（たとえばヒトおよびマウス）においては、IL-7遺伝子の転写物は、選択的転写後プロセシング（スプライシング）を受けることが報告されており、これは複数のバリアントをもたらす。バリエーションにかかわらず、対応する配列を、公共リポジトリにおいて見いだすことが可能であり、たとえばGenBankにおいて、以下のアクセッション番号の下に見いだすことが可能である：NM_000880.4（ホモ・サピエンス（Homo sapiens）；転写バリアント1；SEQ ID NO: 2）、NM_214135.2（スス・スクロファ・ドメスティクス（Sus scrofa domesticus）；SEQ ID NO: 3）、NM_008371.5（ムス・ムスクルス（Mus musculus）；転写バリアント1；SEQ ID NO: 4）、NM_013110（ラツス・ノルベギクス（Ratus novergicus））、NM_001032846（マカカ・ムラタ（Macaca mulatta））、およびXM_519820（パン・トログロダイテス（Pan troglodytes）；転写バリアント1）。
IL-7をコードするヌクレオチド配列に由来するポリペプチドもまた、公共のデータベース上で利用可能であり、かつ当業者に公知である。たとえばヒトIL-7遺伝子の転写バリアント1は、翻訳された場合に177アミノ酸のタンパク質を産生し、これは、タンパク質の翻訳後プロセシングの間に切断されるシグナルペプチドを構成する、N末端部分のアミノ酸1～25位を有する。したがって、成熟IL-7ポリペプチドは152アミノ酸の配列に対応する（SEQ ID NO: 5）。
本発明の技術的効果のうちのIL-7に起因する要素は、IL-7受容体（IL-7R）に結合し、そして該受容体を介してシグナルを伝達するIL-7の能力に集中していることを、当業者は理解するであろう。したがって、本発明において、免疫調節タンパク質、特にIL-7をコードするヌクレオチド配列が、IL-7Rと相互作用することが可能な、およびIL-7Rを活性化することが可能な任意のポリペプチドをコードする配列であり得ることは、当業者にとって明白であろう。
本発明は、IL-7をコードする部分を含む核酸分子を包含し、ここで該部分は、SEQ ID NO: 2、3、または4に記載される核酸配列に対して少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である、核酸配列である。SEQ ID NO: 2に示される核酸配列に対して少なくとも95%同一である核酸分子が、特に好ましい。
別の実施態様において、本発明は、SEQ ID NO: 5、6、または7のアミノ酸配列に対して少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一である、IL-7をコードする核酸配列を使用する。
本発明のある態様において、免疫調節タンパク質、好ましくはIL-7をコードするヌクレオチド配列は、ウイルスの短縮型ノイラミニダーゼ遺伝子に対応する配列を含む発現ベクターに、導入される。通常、免疫調節タンパク質、好ましくはIL-7をコードする配列は、ノイラミニダーゼ遺伝子の、3'領域に対応するヌクレオチド配列と5'領域に対応するヌクレオチド配列との間に導入される。具体的には、免疫調節タンパク質、好ましくはIL-7をコードする配列は、ノイラミニダーゼをコードする配列の、3'-5'センスで166番目のヌクレオチドの直後に導入される。
具体的には、短縮型ノイラミニダーゼをコードするベクターは、pPRNA166x178である（SEQ ID NO: 1）。該ベクターは、該ノイラミニダーゼのORFを逆向きに含む。該ノイラミニダーゼの発現は、その中間部分（ヌクレオチド170～1232位）の除去、および最初の166ヌクレオチドにおける全てのATGトリプレットのCTAトリプレットへの置換（ヌクレオチド20～22位；62～64位；115～117位；163～165位）のために、妨げられている。当業者は、免疫調節タンパク質、好ましくはIL-7をコードするヌクレオチド配列が、制限酵素XhoI／NheIを活用する組み換えDNA技術によって、プラスミドpPRNA166x178へと導入され得ることを、認識するであろう。
したがって、本発明の特定の態様において、pPRNA166x178ベクターにおいて、WSNウイルスのノイラミニダーゼをコードする配列の、3'-5'センスで166番目のヌクレオチドの直後に、IL-7をコードするヌクレオチド配列が導入されているものは、pPRNA166-IL-7-178と呼ばれ、SEQ ID NO: 9に対応する。
ある実施形態において、本発明の方法は、そのそれぞれがインフルエンザウイルスの一部分を組み込んでいる、複数のベクターを、ウイルスの複製を支援することが可能な宿主細胞集団へと、導入することを含む。宿主細胞は、ウイルスの増殖が許容される条件下で培養され得、そしてインフルエンザウイルスが回収され得る。
ある実施形態において、分割されたRNAゲノムを含む組み換えウイルスを作製する方法が提供され、該方法は以下の段階を含む：a) ウイルスゲノムにおける各遺伝子に対応するウイルスcDNAを含む1種または複数種の発現ベクターへと導入する段階；b) 該発現ベクターを、宿主細胞または宿主細胞集団に導入する段階；c) 該宿主細胞をインキュベートする段階、およびd) 組み換えインフルエンザウイルスの集団を単離する段階。
宿主細胞または宿主細胞集団への核酸の導入は、インフルエンザウイルスのゲノムRNAの転写を引き起こし、そして、適切なインフルエンザタンパク質の存在下で、RNA転写物は増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスにパッケージングされ得る。
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ベロ細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞（たとえばHEK 293T細胞、およびCOS細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、これらの細胞株の少なくとも2種類の混合物を共培養することによって得られる宿主細胞集団が利用され、これはたとえば、HEK 293T細胞とMDCK細胞との組み合わせである。
ある実施形態において、発現ベクターは、エレクトロポレーションによって、細胞内へとトランスフェクトされる。ある実施形態において、発現ベクターは、リポソーム性のトランスフェクト試薬の存在下でのトランスフェクションによって、またはリン酸カルシウムと沈殿させることによって、細胞内に導入される。ある実施形態において、発現ベクターはプラスミドである。
ある実施形態において、発現ベクターは、増殖欠損型ウイルス粒子の合成に必要なゲノムRNAセグメントの全てを発現するための、1つの発現ベクターか、増殖欠損型ウイルス粒子の合成に必要なゲノムRNAセグメントのそれぞれを別々にコードする複数の発現ベクターか、または対応するメッセンジャーRNAを含む。ある実施形態において、ゲノムRNAまたはコードされるRNAの、各セグメントの発現は、ヒトPol Iプロモーターに由来するプロモーター配列の制御下にある。
上述の方法のいくつかの実施形態において、組み換えインフルエンザウイルスは、インフルエンザゲノムのプラスミドが組み込まれている宿主細胞の培養物から、回収され得る。いくつかの実施形態において、組み換えウイルスの回収は、宿主細胞を、細胞が溶解される条件に曝露することを伴う。追加の態様において、細胞が溶解される条件は、消化酵素および／または機能的な外来のノイラミニダーゼを添加することを含む。さらに、消化酵素はトリプシンであり得、かつ機能的なノイラミニダーゼはビブリオ・コレラエ由来であり得る。
該方法は、回収された組み換えインフルエンザウイルスを基体に感染させ、かつ基体からウイルスを精製する段階を、さらに含み得る。
1つの実施態様において、インフルエンザウイルスの、増殖欠損型ウイルス粒子の合成に必要なウイルスRNAセグメントをコードする、1種または複数種の発現ベクターは、本発明の核酸構築物とともに、適切な宿主細胞へとトランスフェクトされる。
本発明の特定の形態において、前記発現ベクターは、ウイルス粒子の合成に必要な、最小限の数のウイルスRNAセグメントをコードする、cDNAを含む。
1つの実施態様において、インフルエンザウイルスのウイルスRNAセグメントを少なくとも7個（すなわち、NP、PA、PB1、PB2、M1、NS、およびHA）コードするcDNAを含む発現ベクターは、本発明の核酸構築物とともに、適切な宿主細胞へとトランスフェクトされる。
本発明の特定の形態において、前記発現ベクターは、de Witらに記載されるように、インフルエンザウイルスA/PR8/34 （PR8）の、少なくとも7個のウイルスRNAセグメントをコードするcDNAを、コードする（de Wit, E. et al. "Efficient generation and growth of influenza virus A/PR/8/34 from eight cDNA fragments." Virus research, v. 103, n. 1-2, p. 155-161, 2004）。
本発明はまた、別の免疫原または抗ウイルス活性を有する薬剤との組み合わせにおける、免疫原またはアジュバントのいずれかとしての、上述の態様のいずれかの方法によって得られたウイルスの使用であって、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染、および二次的細菌感染を予防するための、またはコロナウイルスによって引き起こされる感染を治療するための免疫原性組成物を、調製するためのウイルスの使用も提供する。該組み換えインフルエンザウイルスに加えて、本明細書において必要とされる免疫原性組成物は、賦形剤および／またはビヒクルをも含み得る。
典型的には、担体または賦形剤は薬学的に許容されるものであり、例として以下のものであり得るが、これらに限定されない：滅菌水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、未感染の鶏卵からの尿膜腔液（すなわち正常な尿膜腔液、「NAF」）、またはそれらの組み合わせ。無菌性、pH、等張性、および安定性が保証されているそのような溶液の調製は、当技術分野において確立しているプロトコルにしたがって、実施される。
任意で、インフルエンザウイルスまたはそのサブユニットを投与するための製剤はまた、インフルエンザ抗原に対する免疫応答を強化する、1種または複数種のアジュバントをも含む。当業者に公知のアジュバントの例は、サポニン、たとえば水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、たとえばリゾレシチンなどの細胞表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルションまたは炭化水素エマルション、バチルス・カルメット－ゲラン（bacillus Calmette-Guerin）（BCG）、およびコリネバクテリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）を含む。
ある態様において、免疫原性組成物は一般的には水溶液の形態である。しかしながら、いくつかの組成物は、乾燥した形態、および注入可能な固体もしくは乾燥調製物の形態であってよく、または粘着性物質において重合されていてもよい。免疫原性組成物は保存剤を含み得、これはたとえば、チメロサールまたは2-フェノキシエタノールなどである。
ある態様において、免疫原性組成物は、1種または複数種の緩衝液を含み得る。典型的な緩衝液は、リン酸塩緩衝液、Tris、ホウ酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントとともに）、またはクエン酸塩緩衝液を含む。免疫原性組成物のpHは、一般的には5.0～8.1であり、かつより典型的には6.0～8.0であり、たとえば6.5～7.5または7.0～7.8である。したがって、本発明の方法は、包装に先立って、バルクの免疫原性組成物のpHを調整する段階を含み得る。
免疫原性組成物は、たとえば、針およびシリンジを用いるかまたは無針注射装置を用いる皮下または筋肉内への注入によって、全身投与されるかまたは免疫療法薬として使用される、治療用組成物または予防用ワクチンであり得る。あるいは、ワクチン製剤は、液滴や大粒子のエアロゾル（約10ミクロンよりも大きい）またはスプレーによって、上気道へと鼻腔内投与される。上述の送達経路はいずれも、全身性の免疫応答を引き起こすが、鼻腔内投与により、インフルエンザウイルスの進入部位において粘膜免疫が引き起されるという、追加の恩恵が付与される。
概して、本発明の組み換えインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスの1種または複数種のサブタイプに対して特異的な免疫応答を刺激するのに十分な量で、投与される。好ましくは、インフルエンザウイルスの投与は、保護的なヘテロサブタイプ免疫応答を引き起こす。
さらに、本発明の組み換えインフルエンザウイルスは、コロナウイルス感染に対する治療的免疫応答を刺激するのに十分な量で投与され得る。
インフルエンザウイルスの1種または複数種の株に対する保護的な免疫応答を引き起こすための投薬量および方法は、当業者に公知である。
本発明は以下の非限定的な実施例によって説明されるが、これらは単なる例示である。本発明の精神および範囲から逸脱しない、態様のさまざまな改変およびバリエーションは、当業者に明らかである。
実施例1：組み換えインフルエンザウイルスの構築および特徴付け
プラスミドpPRNA166x178は、短縮型ノイラミニダーゼセグメントをコードしており、該セグメントにおいては、3'領域の最初の166ヌクレオチドにおける全てのATGトリプレット（ヌクレオチド20～22位；62～64位；115～117位；163～165位）がCTAトリプレットに変異している。このセグメントには、マルチクローニングサイト、およびノイラミニダーゼセグメントの5'領域の最後の178ヌクレオチドが続く。マウスのサイトカインIL-7のコーディング配列は、GENSCRIPT社（香港）によって、cDNA配列に基づいて合成遺伝子として構築されたが、これは、該配列によってコードされるアミノ酸（SEQ ID NO: 6）を変化させることなしに、マウス細胞における発現用に最適化されている（SEQ ID NO: 8）。最適化された配列は、マルチクローニングサイトにおいて、プラスミドpPR166x178へとクローニングされて、ベクターpPRNA166-IL-7-178（SEQ ID NO: 9）が作り出された。このタイプの構築物は、上述のノイラミニダーゼセグメントにおける変異が該タンパク質からのいかなるペプチドの産生も防止するために、感染細胞内において、天然型でのサイトカインIL-7の産生を可能にする。
プラスミドpPRNA166x178は、短縮型ノイラミニダーゼセグメントをコードしており、該セグメントにおいては、3'領域の最初の166ヌクレオチドにおける全てのATGトリプレット（ヌクレオチド20～22位；62～64位；115～117位；163～165位）がCTAトリプレットに変異している。このセグメントには、マルチクローニングサイト、およびノイラミニダーゼセグメントの5'領域の最後の178ヌクレオチドが続く。マウスのサイトカインIL-7のコーディング配列は、GENSCRIPT社（香港）によって、cDNA配列に基づいて合成遺伝子として構築されたが、これは、該配列によってコードされるアミノ酸（SEQ ID NO: 6）を変化させることなしに、マウス細胞における発現用に最適化されている（SEQ ID NO: 8）。最適化された配列は、マルチクローニングサイトにおいて、プラスミドpPR166x178へとクローニングされて、ベクターpPRNA166-IL-7-178（SEQ ID NO: 9）が作り出された。このタイプの構築物は、上述のノイラミニダーゼセグメントにおける変異が該タンパク質からのいかなるペプチドの産生も防止するために、感染細胞内において、天然型でのサイトカインIL-7の産生を可能にする。
プラスミドpPRNA166x178は、プラスミドpPR-NAから構築された。pPR-NAは、野生型WSNウイルスのノイラミニダーゼセグメントをコードするcDNAを含む、トランスファープラスミドである。その構築は以前に記述されている（Machado, A., N. Naffakh, S. van der Werf, and N. Escriou. 2003. Virology 313:235-249）。このプラスミドは、トランスファープラスミドpPR7において、短縮型ヒトポリメラーゼI（pol I）プロモーター配列とデルタ肝炎ウイルスのリボザイム配列との間に、逆向きにクローニングされたノイラミニダーゼセグメントを含む。このタイプの構築物は、トランスフェクトされた細胞において、合成ウイルスRNA分子の合成を可能にする。
pPR-NAは、プラスミドpPRNA166x178が得られるまで、連続的に改変された：(i) 最初に、ノイラミニダーゼの3'プロモーター領域が増幅され、そして増幅物が、プラスミドに存在するノイラミニダーゼORFの後ろに、マルチクローニングサイトXhoI／NheIとともに挿入された；(ii) 次に、その最後の70ヌクレオチド全体を通しての、ノイラミニダーゼの5'末端の完全性を維持するため、ノイラミニダーゼORFの最後の42ヌクレオチドが増幅され、そして増幅物が、該プラスミドにすでにクローニングされているノイラミニダーゼの5'末端に挿入され、その結果、プラスミドpPR-NA38が得られた（Vieira Machado A, et al. "Recombinant influenza A viruses harboring optimized dicistronic NA segment with an extended native 5' terminal sequence: induction of heterospecific B and T cell responses in mice." Virology. 2006 Feb 5;345(1):73-87）(iii) プラスミドpPR-NA38のノイラミニダーゼは次に、短縮型（ヌクレオチド170～1232位の除去のため）のノイラミニダーゼによって置換された。そうするために、ノイラミニダーゼセグメントの、3'領域の最初の169ヌクレオチド、および5'領域の最後の178ヌクレオチドが、pPR-NAプラスミドに存在するノイラミニダーゼ配列から増幅された。これらの2種類の増幅産物は、連続的にクローニングされ、これらは、すでにクローニングされているノイラミニダーゼのORFと置換され、そして、すでに導入されているマルチクローニングサイトの隣に配置された；(iv) ノイラミニダーゼの3'領域の169ヌクレオチドによってコードされるペプチドの発現を防止するため、ノイラミニダーゼの3'領域の最初の166ヌクレオチドにおける全てのATGトリプレット（ヌクレオチド20～22位；62～64位；115～117位；163～165位）を変異させた合成遺伝子が、GENSCRIPT社（香港）によって構築され、これは、上述のプラスミドのマルチクローニングサイトへとクローニングされ、プラスミドにすでにクローニングされているノイラミニダーゼの3'領域と置換されて、最終的に、プラスミドpPRNA166x178が得られた。
A/PR8/34（PR8）ウイルスの残りのセグメントをコードするプラスミドは、物質移動合意書の下で、Erasmus Institute Rotterdam（オランダ）のRon Fouchier博士の好意により提供された。
組み換えインフルエンザウイルスは、図2に示され、かつKawaokaおよび共同研究者らによって以前に記述された技術（Fujii Y et al, "Selective incorporation of influenza virus RNA segments into virus." Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Feb 18;100(4):2002-7）にしたがった、逆遺伝学によって取得された。手短に述べると、10% ウシ胎児血清および抗生物質の存在下で改変ダルベッコ培地（DMEM）中で増殖させた、HEK 293T細胞およびMDCK細胞のサブコンフルエントな単層の共培養物には、以下がコトランスフェクトされた：1) IL-7を有するかまたはIL-7を有さない、ノイラミニダーゼの組み換えセグメントをコードするプラスミド（それぞれ、pPRNA166-IL-7-178およびpPRNA166x178）、ならびに2) インフルエンザウイルスPR8の他の（7個の）セグメントをコードするプラスミド。このようにして、8個のリボヌクレオタンパク質複合体がインビトロで再構成され、これにより、全てのウイルスセグメントの転写および複製、ならびに新しいウイルス粒子の合成が可能となった。トランスフェクションから24時間後、培地は、1 μg/mlのTPCKトリプシン（SIGMA）、および300 μU/mlのビブリオ・コレラエのノイラミニダーゼ（これは、ウイルスノイラミニダーゼの欠如を補うものであり、新規に形成されたウイルス粒子の放出を可能にする）を添加されたDMEMに交換された。37℃での72時間のインキュベーション後、トランスフェクトされた細胞からの上清が回収された。得られた、IL-7遺伝子を保持する組み換えウイルス（Flu-IL7）、およびIL-7を有さない、その対照ウイルス（Flu-CT）は、MDCK細胞において増殖させ、そして限界希釈（本発明者らが細胞変性効果を観察したよりも高希釈）によって2回精製され、その後、この同じ細胞株において、最終的な増殖を行わせた。このようにして得られた全てのウイルスストックについて、アガロース下MDCK細胞におけるプラーク溶解力価測定により、それらの感染力価を決定した。組み換えウイルスの遺伝子型はPCRおよび配列決定によって評価され、かつ該遺伝子型は、ウイルスゲノムにおいて欠失や変異を一切示さなかった。
Flu-IL7ウイルスに感染させた細胞におけるIL-7の産生は、ELISA技術によって評価された。この目的のため、MDCK細胞の単層に、1/1000の感染多重度（M.O.I）で、Flu-IL7ウイルスまたはFlu-CTウイルスを感染させた。細胞培養物の上清は、感染後、異なる時点で回収された。図3Aに示されるように、感染細胞においては、感染の48時間後から、IL-7の産生が検出可能であった；このサイトカインの産生のピークは、感染から72時間後に、およそ800 pg/mlであることが検出された。
マクロファージは、ウイルスに対する防御において重要な炎症性メディエーターを産生することに加え、気道における抗原提示細胞として重要な役割を果たしている。Flu-IL7ウイルスの、マクロファージに感染する能力を評価するため、骨髄中に存在するマウス単球をマクロファージに分化させ、そしてこれに、ノイラミニダーゼの存在下で、0.1または0.01のM.O.Iで組み換えウイルスを感染させた。図3Bに示されるように、マクロファージにおけるIL-7の産生は、0.1のM.O.Iを用いたFlu-IL7ウイルスの感染から24時間後に検出された。これらの結果は、Flu-IL7ウイルスがそこにおいてサイトカインIL-7を発現可能であるマクロファージに感染するという、Flu-IL7ウイルスの能力を証明する。
実施例2：Flu-IL7ウイルスに感染させたマウスにおけるIL-7産生の評価
8～10週齢の雄のC57BL/6/Cマウスは麻酔され、そして25 μlのPBS中に希釈された、102、103、もしくは104 PFUのFlu-IL7ウイルスか、または104 PFUのFlu-CTの鼻腔内接種を受けた。モック群は、PBSのみの接種を受けた。肺および気管支肺胞洗浄液（BALF）を採取するため、接種の12時間後、24時間後、48時間後、または72時間後に、動物を安楽死させた。IL-7の産生は、ELISA技術によって評価された。図4Aに示されるように、104 PFUの用量でFlu-IL7の接種を受けた動物の肺においては、感染から24時間後および48時間後に、IL-7のレベルの有意な上昇を検出することが可能であったが、一方でBALFにおいては、このサイトカインの発現のピークは遅れて生じた：感染から48時間後および72時間後（図4B）。感染後のどの時点においても、感染動物の血清においては、有意なレベルのIL-7は検出されなかった（データは示さない）。これらデータの一式は、マウスに感染し、かつ、局所性かつ一過性に産生されるIL-7配列を発現する、該インフルエンザウイルスの能力を証明する。
8～10週齢の雄のC57BL/6/Cマウスは麻酔され、そして25 μlのPBS中に希釈された、102、103、もしくは104 PFUのFlu-IL7ウイルスか、または104 PFUのFlu-CTの鼻腔内接種を受けた。モック群は、PBSのみの接種を受けた。肺および気管支肺胞洗浄液（BALF）を採取するため、接種の12時間後、24時間後、48時間後、または72時間後に、動物を安楽死させた。IL-7の産生は、ELISA技術によって評価された。図4Aに示されるように、104 PFUの用量でFlu-IL7の接種を受けた動物の肺においては、感染から24時間後および48時間後に、IL-7のレベルの有意な上昇を検出することが可能であったが、一方でBALFにおいては、このサイトカインの発現のピークは遅れて生じた：感染から48時間後および72時間後（図4B）。感染後のどの時点においても、感染動物の血清においては、有意なレベルのIL-7は検出されなかった（データは示さない）。これらデータの一式は、マウスに感染し、かつ、局所性かつ一過性に産生されるIL-7配列を発現する、該インフルエンザウイルスの能力を証明する。
実施例3:インフルエンザウイルス感染の免疫学的病態形成を研究するためのツールとしての、組み換えインフルエンザウイルス
気道レベルでの一過性かつ局所性の感染は、インフルエンザウイルス感染の特徴であるが、インフルエンザウイルス感染の免疫学的病態形成を評価するさまざまな研究は、ノックアウトマウスの使用、またはサイトカインの全身性の接種の使用に関して、該感染の間に起きることを反映していない可能性が非常に高いという不都合を有している。したがって、マウスのサイトカイン遺伝子を保持する増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスの構築からなる、前例のない戦略を、インフルエンザウイルス感染の間にこれらの免疫調節分子を一過性かつ局所性に産生させた際の該免疫調節分子の役割を評価するという目的のために使用することを、本発明は可能にするものである。
気道レベルでの一過性かつ局所性の感染は、インフルエンザウイルス感染の特徴であるが、インフルエンザウイルス感染の免疫学的病態形成を評価するさまざまな研究は、ノックアウトマウスの使用、またはサイトカインの全身性の接種の使用に関して、該感染の間に起きることを反映していない可能性が非常に高いという不都合を有している。したがって、マウスのサイトカイン遺伝子を保持する増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスの構築からなる、前例のない戦略を、インフルエンザウイルス感染の間にこれらの免疫調節分子を一過性かつ局所性に産生させた際の該免疫調節分子の役割を評価するという目的のために使用することを、本発明は可能にするものである。
インフルエンザウイルス感染の免疫学的病態形成の研究における、Flu-IL7ウイルスの潜在能力を証明するため、以下のアプローチが使用された：
8～12週齢の雄のC57BL/6マウスは、ケタミン（100 mg/kg）およびキシラジン（10 mg/kg）の混合物を用いて皮下麻酔され、そして群に分割されて、該群は異なるウイルスの鼻腔内接種を受けた。いくつかの群は、体重減少率を評価するため、102 PFU（亜致死量ではあるが、接種を受けた動物において肺炎を引き起こすことが可能である）の用量で野生型ウイルス（PR8）の接種を受け、一方で他の動物には、死亡率を評価するため、104 PFUのPR8を感染させた。組み換えウイルスとの共接種は、20 μLの量のPBS中に希釈された、104 PFUの用量のFlu-CTまたはFlu-IL7（接種原）を用いて実施された。体重減少率および死亡率が、3週間にわたり追跡された。図5Aにおいて、本発明者らは、高用量（104 PFU）の複製可能ウイルス（PR/8）を用いた場合に、PR/8の接種を受けた群において、全ての動物が発病し、高い体重減少率（約25%）および高い死亡率を示すことを、観察可能である。一方、FluIL-7との共接種を受けた動物は、PR/8ウイルスの接種を受けた他の群におけるものよりも有意に長い生存時間を有していた。さらに、高くはあったものの、FluIL-7との共接種において死亡率は、FluCtとの共接種よりも、統計学的に有意に低かった。図5Bに示されるように、Flu-IL7 + PR8ウイルスを共感染させた動物群は、PR8のみの投与を受けた群よりも低い総体重減少率を示し（図5B）、かつ、PR8群、およびFlu-CT + PR8を共感染させた群と比較して、個々の時点においてより低い体重減少率を有し、かつ、対照群における動物よりも早く、その当初の体重に回復した（Flu-CT+PR8；図5C）。総合すると、本発明者らの結果は、サイトカインIL-7の保護的役割を示唆し、かつ、インフルエンザウイルス感染の免疫学的病態形成の研究において使用されるツールとしての、本発明者らが構築したウイルスの有用性を証明する。
実施例4：Flu-IL7ウイルスを用いて免疫化された後の、二次的細菌感染からの保護
8～12週齢の雄のC57BL/6マウスは、ケタミン（100 mg/kg）およびキシラジン（10 mg/kg）の混合物を用いて皮下麻酔され、そして群（動物8匹）に分割されて、102 PFU／動物のPR8（亜致死量）か、または動物1匹あたり、102 PFUのPR8と、104 PFUのFlu-IL7もしくはFlu-CTとの共接種か、またはPBS 1x（モック）を用いて、鼻腔内において免疫化された（40 μL／動物）。感染から10日後、マウスは、102 CFU／動物の用量の細菌（グラム陽性）、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型ATCC6303の負荷を受けた。負荷から48時間後に動物を安楽死させ、そして、血液寒天プレートにおける力価測定によって細菌量を決定するため、無菌環境において動物の肺が採取された。実験は3連で実施された。
8～12週齢の雄のC57BL/6マウスは、ケタミン（100 mg/kg）およびキシラジン（10 mg/kg）の混合物を用いて皮下麻酔され、そして群（動物8匹）に分割されて、102 PFU／動物のPR8（亜致死量）か、または動物1匹あたり、102 PFUのPR8と、104 PFUのFlu-IL7もしくはFlu-CTとの共接種か、またはPBS 1x（モック）を用いて、鼻腔内において免疫化された（40 μL／動物）。感染から10日後、マウスは、102 CFU／動物の用量の細菌（グラム陽性）、ストレプトコッカス・ニューモニエ血清型ATCC6303の負荷を受けた。負荷から48時間後に動物を安楽死させ、そして、血液寒天プレートにおける力価測定によって細菌量を決定するため、無菌環境において動物の肺が採取された。実験は3連で実施された。
肺における細菌量を決定するため、肺は、セルストレーナー（70 μm）上で1.5 mLの生理食塩水（0.5x）を用いて浸軟させた。チューブは2000xg、4℃で10分間遠心分離され、上清は破棄され、そして細菌沈殿物が、200 μLの1x PBSに再懸濁された。細菌懸濁液は、THY培地（トッド－ヒューイットブロス、5% 酵母エキス）中に希釈され（1:10の比率）、そして10 μLの希釈物それぞれは、血液寒天（5% ヒツジ脱線維血液、および8 μg/mL ゲンタマイシンを含有するBHI寒天）を含むペトリ皿に添加された（反復物6個）。プレートは、37℃、酸素制限下で16～18時間維持された。細菌量は、目視で区別可能である最低限の希釈において、α溶血（不完全溶血）を起こしたコロニーを計数し、反復物を平均化し、希釈補正係数を乗算し、そして浸軟させた臓器の全量への変換係数（x20）を乗算することによって、決定された。
動物の感染から10日後に、ストレプトコッカス・ニューモニエの負荷が実施され、そして負荷から48時間後に肺の細菌量が評価された。このアッセイは、インフルエンザウイルス感染におけるサイトカインIL-7の保護的役割を証明するものであった。野生型ウイルスによって引き起こされる不都合を最小限に抑えることに加えて、Flu-IL7はまた、ニューモコッカス（pneumococcus）による二次的細菌感染への感受性を低減させた。PR8を感染させた動物、またはFlu-CTをも共感染させた動物（Flu-CT+PR8群）は、負荷後に細菌量の増加を示し、これは約105～107 CFU／肺であった。一方で、Flu-IL7をも共感染させた動物（Flu-IL7+PR8群）においては、細菌量の中央値は102 CFU／肺であった（図6）。
実施例5：特異性拡張型免疫応答（ヘテロサブタイプ応答）を誘導するためのツールとしてのFlu-IL7ウイルス
8～12週齢の雄のC57BL/6マウスは麻酔され、そして104 PFUの組み換えウイルス（Flu-CTもしくはFlu-IL7）か、または亜致死量である102 PFU のサブタイプH3N2の野生型ウイルスを用いて免疫化された。免疫化から約75日後、記憶免疫応答がすでに確立している時点で、動物は、5x102 PFUのサブタイプH3N2のインフルエンザウイルスの負荷を受けた。
8～12週齢の雄のC57BL/6マウスは麻酔され、そして104 PFUの組み換えウイルス（Flu-CTもしくはFlu-IL7）か、または亜致死量である102 PFU のサブタイプH3N2の野生型ウイルスを用いて免疫化された。免疫化から約75日後、記憶免疫応答がすでに確立している時点で、動物は、5x102 PFUのサブタイプH3N2のインフルエンザウイルスの負荷を受けた。
予想されたように、インフルエンザウイルスH3N2の接種を以前に受け、そしてそれと同じものの負荷を受けた動物（H3N2-H3N2群）は、有意な体重減少を示さなかったが、これは、ワクチン接種後に予想されるものである、ホモサブタイプ保護（最初の免疫化と同じウイルス株に対するもの）の存在を示す。PBSの注入を受け、そしてH3N2ウイルスの負荷を受けた動物（モック-H3N2）は、最大の体重減少率（平均28.0%の総体重減少率）を示した動物であったが、これは、それら動物が事前の免疫を有さないことから予想されるとおりである。Flu-CTウイルスを用いて免疫化された動物の群は、H3N2ウイルスの負荷後に、平均20.5%の総体重減少率を示した（Flu-CT-H3N2群）。対照的に、Flu-IL7ウイルスを用いたワクチン接種を受け、そしてH3N2ウイルスの負荷を受けた群（Flu-IL7-H3N2）においては、体重減少率はより低かった（平均6.3%の体重減少率）（図7Aおよび7B）。
Flu-CTを用いて免疫化され、そしてサブタイプH3N2のインフルエンザウイルスの負荷を受けた動物（Flu-CT-H3N2群）は、Flu-IL7を用いて免疫化され、そしてサブタイプH3N2のインフルエンザウイルスの負荷を受けた動物（Flu-IL7-H3N2群）と比較した場合に、評価されたほぼ全ての時点において、より高い体重減少率を示した（図7B）。このように、PR8ウイルス（サブタイプH1N1）のヘマグルチニンを保持する組み換えインフルエンザウイルスを用いて免疫化を行うと、サブタイプH3N2のインフルエンザウイルスの負荷からの保護を付与することが可能であったが、これは、Flu-IL7がヘテロサブタイプ保護を付与可能であることを証明する。さらに、この保護が、ワクチン接種から50日後を過ぎても検出されたという事実は、記憶免疫応答の誘導が存在することを証明する。
これに関し、FluIL-7ウイルスの、亜致死量のH3N2ウイルスの負荷からの保護を付与する能力が証明されたことから、本発明者らはまた、該組み換えウイルスの、致死量の負荷から動物を保護する能力をも評価した。この目的のため、動物は上述のように免疫化され、そしてワクチン接種から30日後に、致死量（103 PFU）のH3N2ウイルスの負荷を受けた。PBSのみの接種を受けた動物の群（モック）は、負荷後に80%の死亡率を示したが、FluCtウイルスを用いて免疫化された群は、50%の死亡率を示した（図7C）。一方、FluIL-7ウイルスを用いて免疫化された動物、およびPR/8ウイルスを用いて免疫化された動物は両方とも、負荷を生き延びた。これらの結果により、本発明者らが以下の結論に到達することが可能になる。FluIL-7ウイルスを用いた免疫化は、免疫化された動物に、より堅固なヘテロサブタイプ保護を付与するが、対照群（FluCt）の動物は、モック群と比較してより軽い疾患を示した。IL-7は免疫学的記憶の確立を強化し、その結果、負荷を受けた動物における、より長く持続する免疫、および生存率の増加をもたらすように見受けられる。
実施例6：長時間持続するメモリー細胞を誘導することが可能なワクチンを開発するためのツールとしての、組み換えインフルエンザウイルスFlu-IL7。
8～12週齢の雄のC57BL/6マウスは、ケタミン（100 mg/kg）およびキシラジン（10 mg/kg）の混合物を用いて皮下麻酔され、そして群（動物6匹）に分割されて、104 PFUのFluIL-7もしくはFluCtか、または102 PFUのPR/8（亜致死量）か、またはPBS 1x（モック）を用いて、鼻腔内経由で免疫化された（40 μL／動物）。肺細胞の免疫表現型プロファイルは、組み換えFluIL-7ウイルスもしくは組み換えFluCtウイルス、または野生型PR/8ウイルスを用いた免疫化から21日後に評価された。並行して、上述のように、組み換えウイルス（FluCtもしくはFluIL-7）または野生型PR/8ウイルスを用いてあらかじめ免疫化され、そして30日後に亜致死量（102 PFU）のヘテロサブタイプH3N2分離株の負荷を受けた動物は、負荷の2週間後に安楽死させ、そしてそれらの肺は、組織における白血球の免疫表現型プロファイルの特徴付けのために、採取された。このアッセイにより、抗原（H3N2ウイルス）との2回目の接触の直後の、肺における、ワクチン接種によって誘導された記憶応答であって、かつインフルエンザに対して特異的な記憶応答の、評価が可能となる。この様式においては、負荷への応答における、レジデントメモリー集団の拡大を同定することが可能であり、かつ、脾臓および／またはリンパ節から肺へと移動したものについて同定することも可能である。
8～12週齢の雄のC57BL/6マウスは、ケタミン（100 mg/kg）およびキシラジン（10 mg/kg）の混合物を用いて皮下麻酔され、そして群（動物6匹）に分割されて、104 PFUのFluIL-7もしくはFluCtか、または102 PFUのPR/8（亜致死量）か、またはPBS 1x（モック）を用いて、鼻腔内経由で免疫化された（40 μL／動物）。肺細胞の免疫表現型プロファイルは、組み換えFluIL-7ウイルスもしくは組み換えFluCtウイルス、または野生型PR/8ウイルスを用いた免疫化から21日後に評価された。並行して、上述のように、組み換えウイルス（FluCtもしくはFluIL-7）または野生型PR/8ウイルスを用いてあらかじめ免疫化され、そして30日後に亜致死量（102 PFU）のヘテロサブタイプH3N2分離株の負荷を受けた動物は、負荷の2週間後に安楽死させ、そしてそれらの肺は、組織における白血球の免疫表現型プロファイルの特徴付けのために、採取された。このアッセイにより、抗原（H3N2ウイルス）との2回目の接触の直後の、肺における、ワクチン接種によって誘導された記憶応答であって、かつインフルエンザに対して特異的な記憶応答の、評価が可能となる。この様式においては、負荷への応答における、レジデントメモリー集団の拡大を同定することが可能であり、かつ、脾臓および／またはリンパ節から肺へと移動したものについて同定することも可能である。
上記に関し、組織の解離を可能にするため、あらかじめ灌流した肺は、コラゲナーゼIV型（0.5 mg/mL）を用いた処理を受けた（37℃、40分間）。該臓器は次に、セルストレーナー（70 μm）上で5 mLのRPMI（10% SFB）を用いて浸軟させ、そして懸濁液は、800xg、8℃で7分間遠心分離された。上清は破棄され、そして赤血球の溶解は、ボルテックスかくはん、および1mLの10x PBSを用いて補正された等張性の下で、9 mLのタイプIのH2O（20s）を用いて実施された。浸軟物から細胞残屑を除去するため、細胞は、RPMI培地中の40%の等張Percoll（登録商標）（Sigma）の勾配に供された。この溶液は細胞（15 mLチューブ）に添加され（10 mL）、チューブは800xg、8℃で20分間遠心分離され、そして上清が吸引されて破棄された。白血球は、3 mL／チューブのPBS-Washを用いて洗浄され、そして800xg、8℃で7分間遠心分離され、そして洗浄後に残った量に再懸濁された。
細胞生存性染色のため、1x PBSにおいて1:1,000に希釈された、200 μL／チューブの生死判定色素（Live/dead Fixable Aqua Dead Cell Stain、励起405 nm）が添加され、そしてチューブは、遮光下、室温で15分間インキュベートされた。細胞は、PBS-Wash（2 mL／ウェル）を用いて洗浄され、550xg、8℃で7分間遠心分離され、そして上清は破棄された。全量の細胞（細胞約2,106個）は、3個または4個のパネルのそれぞれ（パネル1個につき細胞約5,105個）について、96ウェルプレート（U底）へと分注された（50 μL／ウェル）。10 μL／ウェルの調製された抗体混合物は、力価測定によって事前に標準化された濃度で添加され、そして細胞は、遮光下、室温で30分間インキュベートされた。インキュベーション期間の後で、試料は、タイプIの水で1:10に希釈された、150 μL／ウェルの市販の溶解液（FACS（商標）Lysing Solution、BD）を用いて、20分間、室温で固定された。プレートは、400xg、18℃で10分間遠心分離され、そして標識された細胞は、PBS-Washを用いて2回の洗浄を受けた（180 μL／ウェル）。細胞は100 μLの1x PBSに再懸濁され、そしてFACSチューブに移され、その後、LRSFortessaサイトメーターにおいて読み取られた（100,000イベント）。フローサイトメーターにおいて得られたデータは、FlowJOソフトウェア（BD）において解析された。
さまざまな細胞サブ集団およびメモリー表現型は、蛍光色素をコンジュゲートさせたバイオマーカーの異なる組み合わせを用いて評価された：Tリンパ球（CD3+CD4+またはCD3+CD8+）、エフェクターT細胞（CD44+）、エフェクターメモリーT細胞（CD44+CD62L-CD127+）（TEF）、セントラルメモリーT細胞（CD44+CD62L+）（TCM）、および長期生存セントラルメモリーT細胞（CD44+CD62L+CD127+）（TCMLD）、レジデントメモリーT細胞（CD69+CD103）（TRM）、Bリンパ球（CD19+）、活性化メモリーB細胞（CD62L、CD80、CD27）。
サブタイプH3N2のインフルエンザウイルスを用いた感染は、実験群内において、異なる免疫応答プロファイルをもたらした。FluIL-7ウイルスを用いて免疫化された動物においては、対照のFluCtウイルスまたはPR/8ウイルスを用いて免疫化された動物と比較して、CD4+である、およびCD8+である、セントラルメモリーTリンパ球（CD44+CD62L+）、ならびにCD4+である、およびCD8+である、長期生存セントラルメモリーTリンパ球（CD44+CD62L+CD127+）の、有意な増加を観察することが可能であった。加えて、エフェクターCD8+ T細胞（CD44+）のパーセンテージもまた、FluCtウイルスを用いて免疫化された動物と比較して、FluIL-7ウイルスを用いて免疫化された動物において高かった（図8）。これらの結果は、FluIL-7を用いたワクチン接種が、長時間持続するメモリー細胞（CD127+）の増加を誘導することを証明し、これは、このサイトカインが、長時間持続しかつ維持されるワクチン免疫を確立するように作用することを示唆する。
Claims (13)
- 短縮型ノイラミニダーゼ遺伝子と、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子とを含むことを特徴とする、核酸構築物。
- 前記免疫調節タンパク質がインターロイキン-7であることを特徴とする、請求項1に記載の構築物。
- 異種のプロモーター領域およびターミネーター領域をさらに含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の構築物。
- （i）ヒトポリメラーゼIの短縮型プロモーター；
（ii）ノイラミニダーゼの3'プロモーターの複製物；
（iii）ノイラミニダーゼORFの最後の42ヌクレオチドの複製物；
を含むことを特徴とし、
（a）該ノイラミニダーゼ遺伝子の3'領域の最初の166ヌクレオチドのATGトリプレットがCTAに置換されており；かつ
（b）該短縮型ノイラミニダーゼ遺伝子の最初の166ヌクレオチドと最後の178ヌクレオチドとの間に、免疫調節タンパク質をコードする配列が挿入されている、
請求項3に記載の構築物。 - 免疫調節タンパク質を発現することを特徴とする、増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルス。
- 前記免疫調節タンパク質がインターロイキン-7であることを特徴とする、請求項5に記載の増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルス。
- 請求項5に定義される増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスを調製するための方法であって、
(i) 短縮型ノイラミニダーゼ遺伝子と免疫調節タンパク質遺伝子とを含む核酸構築物を調製する段階；
(ii) 宿主細胞を、段階(i)の構築物、ならびにインフルエンザウイルスのNP、PA、PB1、PB2、M1、NS、およびHAセグメントをコードするプラスミドに、同時に曝露する段階；
(iii) 上清から組み換えインフルエンザウイルスを回収する段階
を含むことを特徴とする、方法。 - 段階(iii)において回収された増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスを基体に感染させて基体からウイルスを精製する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 請求項5において定義される増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスと、薬学的に許容されるビヒクルとを含むことを特徴とする、免疫原性組成物。
- 長時間持続するヘテロサブタイプ免疫応答を誘導することを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 鼻腔内経路によって投与されることを特徴とする、請求項9または10に記載の組成物。
- インフルエンザウイルスもしくはSARS-CoV-2によって引き起こされる感染または二次的細菌感染を予防または治療するための免疫原性組成物、あるいはアジュバントとして使用するための免疫原性組成物を調製するためのものであることを特徴とする、請求項5において定義される増殖欠損型組み換えインフルエンザウイルスの使用。
- 前記免疫原性組成物が、長時間持続するヘテロサブタイプ免疫応答、ならびにインフルエンザウイルス感染、SARS-CoV-2感染、および二次的細菌感染に対する保護または治療を誘導することができることを特徴とする、請求項12に記載の使用。
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